Universidade do Algarve - fctec.ualg.pt · 1.1 – Metabolismo de xenobióticos A maior parte dos...

Universidade do Algarve Faculdade de Ciências e Tecnologia

Isa da Conceição Lopes Cavaco

Faro

Novembro, 2001

Relatório de estágio da Licenciatura em

Bioquímica, da Faculdade de Ciências e

Tecnologia, sob a orientação da Professora

Doutora Vera Ribeiro Marques

I

Agradecimentos

Quero expressar a minha gratidão para com todos aqueles que de alguma forma contribuiram para a

realização deste trabalho, assim como, para a minha formação.

Em especial gostaria de agradecer,

Ao Professor Doutor Manuel Aureliano Alves por todo empenho, dedicação e amizade que tem para

com todos os alunos de Bioquímica.

À Professora Doutora Vera Ribeiro Marques pela possibilidade de realizar o estágio sobre a sua

orientação e também pela sua amizade, permamente disponibilidade, apoio e ensinamentos

transmitidos ao longo deste trabalho.

Ao Professor Doutor José Pedro Gil pela colaboração prestada ao longo de todo o trabalho, assim

como pela amizade e boa disposição sempre presentes.

A todos os docentes da licenciatura em Bioquímica da Universidade do Algarve pelos conhecimentos

transmitidos ao longo destes anos.

À Professora Doutora Leonor Cancela e à Merck Eurolab pelas facilidades técnicas concedidas que

permitiram a realização deste trabalho.

Ao Engenheiro Eduardo Naia, meu professor de técnicas laboratorias de química do secundário, por

ter feito nascer em mim o gosto pelo trabalho em laboratório e pela investigação, e, acima de tudo,

pela amizade e por todos os conselhos que sempre me deu.

Às minhas amigas, colegas de curso e de laboratório, Orquídea e N’zola por tudo aquilo que passámos

ao longo destes cinco anos e pela amizade que nos une.

À Rosinda, minha amiga do coração, que embora por vezes longe, esteve sempre presente com a sua

amizade, e também a todos aqueles que com a sua amizade marcaram a minha vida.

Ao Manuel por ter estado sempre a meu lado, pelo carinho e por tudo o resto.

Por fim, mas em primeiro lugar, aos meus pais por tudo o que sempre fizeram por mim e que me fez

chegar até aqui. Também à minha irmã pela amizade de sempre que nos une.

II

Abreviaturas e simbologia

A maioria das siglas e abreviaturas aqui compiladas estão também definidas ao longo do texto

da tese.

A – Nucleótido contendo adenina

ABC – ATP Binding Cassete*

Bis-acrilamida – N, N’- metileno-bis-acrilamida

bp – pares de bases (base pairs)

C – Nucleótido contendo citosina

CAR – Receptor Constitutivo dos Androstanos (Constitutive Androstane Receptor)

cDNA – DNA complementar ao RNA

CI – intervalo de confiança (Confidence Intervals)

C-terminal – Extremidade da cadeia polipeptídica que apresenta um grupo carboxilo livre

CYP – citocromo P450

df – graus de liberdade (degrees of freedom)

DME – enzima metabolizadora de drogas (Drug Metabolyzing Enzyme)

DNA – Ácido desoxiribonucleico

dNTP – desoxiribonucleótido

EDTA – Ácido (etilenodiamino)tetracético

ER – Receptor de estrogénios

f – frequência

G – Nucleótido contendo guanina

g – Aceleração da gravidade

GR – Receptor dos Glucocorticóides

* Alguns termos técnicos com origem na língua inglesa são utilizados no decorrer do texto desta tese. Não são traduzidos visto que fazem parte de um glossário científico estabelecido na literatura internacional, sendo o seu sentido provavelmente desvirtuado numa tradução literal.

III

MDR – Multidrug Resistance

MRP – Multidrug Resistance Protein ou Multidrug Resistance-Related Protein

NAD(P)H – (Difosfato de) dinucleótido de adenina e nicotinamida, reduzido

N-terminal – Extremidade da cadeia polipeptídica que apresenta um grupo amino livre

p – probabilidade

PAGE – Electroforese em gel de poliacrilamida

PCR – Reacção em cadeia da polimerase de DNA (Polymerase Chain Reaction)

P-gp – P-glicoproteína (P-glycoprotein)

PSA – Persulfato de amónio

PXR – Receptor de Pregnanos (Pregnane X-Receptor)

RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

RXR – Receptor de Retinóides (Retinoid X Receptor)

SD – Desvio Padrão (Standard deviation)

s – segundo

SNP – Single Nucleotide Polymorphism

SXR – Receptor de Esteróides e Xenobióticos (Steroid and Xenobiotic Receptor)

T – Nucleótido contendo timina

Taq – Thermus aquaticus

TEMED – N, N, N’, N’ - tetrametilenodiamina

Tris – tris (hidroximetil) aminometano

Tween 20 – poli-oxietileno sorbitan monolaurato

U – Unidade de actividade enzimática

χ2 – Qui quadrado

Os aminoácidos são indicados pelo código de uma letra ou de três letras.

IV

Índice

Agradecimentos I

Abreviaturas e simbologia II

Índice IV

Índice de Figuras VI

Índice de Tabelas VII

Resumo VIII

Abstract IX

1 – Introdução 1

1.1 – Metabolismo de xenobióticos 1

1.1.1 – Reacções de Fase I 2

1.1.2 – Reacções de Fase II 3

1.1.3 – Fase III – O transporte de xenobióticos 3

1.2 – O sistema citocromo P450 5

1.2.1 – História e bioquímica dos citocromos P450 5

1.2.2 – Nomenclatura 8

1.2.3 – A evolução dos citocromos P450 9

1.2.4 – A estrutura das proteínas CYP 10

1.3 – As enzimas CYP no Homem 12

1.3.1 – A subfamília CYP3A 13

1.3.1.1 – O gene CYP3A4 16

1.3.1.1 – O polimorfismo genético no CYP3A4 19

2 – Objectivos 23

3 – Material e Métodos – análise do gene CYP3A4 24

3.1 – Introdução 24

V

3.2 – Materiais 29

3.2.1 – Material Biológico - Indivíduos 29

3.2.2 – Reagentes 29

3.3 – Métodos 30

3.3.1 – Extracção de DNA genómico – Extracção rápida de DNA 30

3.3.2 – Pesquisa dos alelos do gene CYP3A4 por PCR-RFLP 31

3.3.3 – Detecção dos produtos de digestão 35

3.3.4 – Análise estatística 37

3.3.4.1 – Frequências alélicas 37

3.3.4.2 – Frequências genotípicas 37

3.3.4.3 – Desvios em relação à distribuição de Hardy-Weinberg- Teste χ2 38

4 – Resultados 39

4.1 – Identificação das variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 39

4.2 – Análise estatística dos resultados 40

5 – Discussão dos resultados 43

6 – Conclusão 47

7 – Referências Bibliográficas 48

Anexos 58

VI

Índice de Figuras

Figura 1.1 – Fase III do metabolismo: sistema antiporter 4

Figura 1.2 – O ciclo catalítico dos citocromos P450 7

Figura 1.3 – Árvore filogenética da superfamília dos citocromos P450 9

Figura 1.4 – Estrutura tridimensional das enzimas CYP101, CYP102 e CYP2C5 11

Figura 1.5 – As familías e subfamílias de genes CYP descritas no Homem 12

Figura 1.6 – Contribuição relativa das mais importantes enzimas metabolizadoras de drogas no

fígado humano adulto

13

Figura 3.1 – Exemplo de uma reacção de PCR em que se esquematizam os diferentes passos de

cada ciclo

25

Figura 3.2 – Esquema do gene CYP3A4 e da zona de amplificação de cada par de primers.

Representação esquemática dos padrões de RFLP obtidos para a identificação do CYP3A4*1B,

CYP3A4*2 e CYP3A4*3

36

Figura 4.1 – Caracterização das variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 por PCR-RFLP 39

Índice de Tabelas

VII

Tabela 1.1 – A evolução dos CYPs 10

Tabela 1.2 – Semelhança estrutural na sequência de aminoácidos entre os membros da

subfamília CYP3A

14

Tabela 1.3 – Substratos, indutores e inibidores da isoenzima CYP3A4 17

Tabela 1.4 – Nomenclatura das variantes descritas para o CYP3A4 22

Tabela 3.1 – Oligonucleótidos usados na reacção de PCR para a genotipagem do CYP3A4 33

Tabela 3.2 – Frequências de Hardy-Weinberg geradas pela união ao acaso de dois alelos, A e a,

cujas frequências são p e q, respectivamente

38

Tabela 4.1 – Frequências genotípicas para as variantes do CYP3A4 40

Tabela 4.2 – Frequências alélicas das mutações CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 na

população Caucasiana Portuguesa

41

Tabela 4.3 – Resultados do teste do ajustamento χ2 utilizados na determinação dos desvios às

frequências esperadas pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg numa população de 131 indivíduos

portugueses de origem caucasiana

42

Tabela 5.1 – Frequências alélicas das variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 em

populações Caucasianas

44

Resumo

VIII

Os citocromos P450 (CYP) são vitais para o mecanismo oxidativo e redutor de uma grande

variedade de xenobióticos, carcinógenios e compostos endógenos. As enzimas pertencentes à

subfamília CYP3A são as mais importantes para o metabolismo de drogas, contribuindo para a

biotransformação de pelo menos 50% de todos os fármacos usados no Homem. Vários são os

compostos de uso terapêutico que são substrato para estas enzimas, como é o caso da nifedipina,

midazolam, inibidores de proteases e drogas antimaláricas.

A actividade das enzimas CYP3A humanas pode ser o reflexo da contribuição de quatro

enzimas distintas: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 e CYP3A43. Estudos de fenótipo demonstraram a

existência de uma variabilidade interindividual significativa no metabolismo mediado pelos CYP3A.

No caso da enzima CYP3A4, a forma predominante no fígado adulto, várias mutações foram

recentemente descritas que podem contribuir para a presença de enzimas com actividade variável em

cada indivíduo.

Devido à sua importância na farmacogenética, neste trabalho foram desenvolvidos métodos de

PCR-RFLP para identificar três das variantes do CYP3A4, CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3.

Estes métodos foram depois usados para analisar a população Portuguesa. A frequência alélica

observada foi de 3,8% no caso do CYP3A4*1B, de 4,2% para o CYP3A4*2 e de 12,6% para a variante

CYP3A4*3.

Uma vez que a actividade do CYP3A4 pode determinar a eficácia dos fármacos e/ou a sua

toxicidade, a sua genotipagem pode tornar-se muito útil para a optimização das doses a usar, assim

como para a determinação da susceptibilidade de cada indivíduo à doença. Estes métodos poderão

também contribuir para que haja um melhor conhecimento das variações étnicas e geográficas dos

SNPs do CYP3A4, e para que seja aplicada uma melhor terapêutica individual.

Abstract

IX

Cytochrome P450 (CYPs) are vital for the oxidative and reductive metabolism of a large

variety of xenobiotics, carcinogens and endogenous compounds. CYP3As are the major drug

metabolizing enzymes, accounting for the biotransformation of about 50% of all drugs used in

humans. A wide range of compounds of therapeutical use are known substrates for these enzymes,

including nifedipine, midazolam, protease inhibitors and antimalarial drugs.

Human CYP3A activity may reflect the contribution of four distinct enzymes: CYP3A4,

CYP3A5, CYP3A7 and CYP3A43. Phenotyping studies have demonstrated the existence of

significant inter-individual variability in CYP3A-mediated metabolism. For CYP3A4, the major form

expressed in adult liver, several mutations were recently described, which may account for the

presence of enzymes with variable activity in each individual.

Due to its pharmacogenetic importance, we have developed a PCR-RFLP method to identify

three of the CYP3A4 variants, CYP3A4*1B, CYP3A4*2 and CYP3A4*3, and used it to analyse the

Portuguese population. The allelic frequency observed was 3,8% for CYP3A4*1B, 4,2% for

CYP3A4*2 and 12,6% for the CYP3A4*3 variant.

Since CYP3A4 activity may determine drug efficacy and/or toxicity, CYP3A4 genotyping may

become a useful tool for optimizing drug dosage, as well for assessing individual susceptibility to

disease. These methods may also contribute to a better knowledge of ethnic and geographical

variation in CYP3A4 SNPs, providing a useful tool for the improvement of therapeutic outcome.

INTRODUÇÃO

1

1 – Introdução

No dia-a-dia o corpo humano encontra-se sujeito a um grande número de xenobióticos que

necessitam de ser eliminados do organismo. Para levar a cabo esta tarefa o corpo humano possui um

sistema de destoxificação que tem como função minimizar os potenciais danos dos xenobióticos. Este

sistema de destoxificação é bastante complexo, apresentando grande variabilidade interindividual, e

dependendo de factores como o meio ambiente, estilo de vida e genética individual.

1.1 – Metabolismo de xenobióticos

A maior parte dos compostos farmacologicamente activos, assim como outros xenobióticos,

são compostos lipofílicos, e de modo a serem mais facilmente excretados do organismo estes

compostos têm que sofrer uma transformação enzimática em metabolitos com características mais

hidrofílicas, num processo denominado biotransformação (Di Giulio et al., 1995). Os metabolitos

resultantes deste processo são geralmente menos activos que o composto inicial ou mesmo inactivos,

embora possa também acontecer o caso dos produtos finais apresentarem uma actividade

farmacológica realçada. Porém, o metabolismo de xenobióticos pode produzir produtos reactivos e

tóxicos que podem ser responsáveis por várias formas de toxicidade, incluindo a iniciação e

progressão de tumores (Nelson et al., 1996). Deste modo, a biotransformação resulta normalmente

num aumento da velocidade de excreção dos xenobióticos, o que reduz o risco de acumulação destas

substâncias a níveis tóxicos no organismo, sendo por isso a biotransformação de xenobióticos o

mecanismo principal para a manutenção da homeostase durante a exposição a moléculas estranhas ao

organismo (Klaassen e Watkins, 1999).

O processo de biotransformação é levado a cabo pelas enzimas metabolizadoras de drogas

(DME’s - Drug Metabolizing Enzymes), um grupo diversificado de enzimas responsáveis pela

metabolização de um vasto leque de xenobióticos, incluindo drogas e poluentes ambientais, e

compostos endógenos como os esteróides e as prostaglandinas. As DMEs são usualmente divididas

em dois grupos de enzimas, ou seja, enzimas de Fase I e as enzimas de Fase II. Os produtos gerados

INTRODUÇÃO

2

pelas reacções de fase I são geralmente metabolitos intermediários reactivos e/ou espécies reactivas de

oxigénio, o que pode causar danos nos tecidos. As reacções de fase II envolvem geralmente a

conversão dos metabolitos intermediários da fase I em produtos finais que são depois eliminados. Os

processos da fase I e fase II são, no entanto, independentes e como tal, o composto pode sofrer apenas

reacções de fase I ou de fase II, ou as duas sequencialmente. Embora ambas as fases tenham diferentes

características, é essencial que as suas funções estejam balanceadas entre si para minimizar a presença

de metabolitos intermediários reactivos.

A concentração de compostos exógenos nas células é também condicionada pela presença de

transportadores na membrana da célula, responsáveis pela chamada Fase III do metabolismo de

drogas.

1.1.1 - Reacções de Fase I

O sistema de destoxificação de fase I é geralmente a primeira defesa enzimática contra

compostos estranhos. Os compostos tóxicos são tipicamente compostos não reactivos, e como tal não

contêm sítios reactivos que possam ligar os grupos solúveis em água que são conjugados nas reacções

de fase II. Assim, na fase I os xenobióticos são sujeitos a reacções de funcionalização ou de activação,

onde se introduz ou revela, por reacções de oxidação, redução ou hidrólise, um grupo funcional (-OH,

-NH2, -SH ou -COOH) transformando-os assim em substâncias activas prontas para o processo de fase

II.

As reacções de fase I podem ser catalisadas por diversas enzimas, de que são exemplo as

monooxigenases citocromo P450, as monooxigenases contendo flavina, as hidrolases, as

lipooxigenases, as peroxidases, as oxidases e as reductases (Klaassen e Watkins, 1999; Nebert, 1991).

De todas as famílias de enzimas de fase I a dos citocromos P450 é a mais importante, tanto a nível do

elevado número de xenobióticos que destoxificam, como da versatilidade catalítica que apresentam

(Nebert, 1991). O papel destas enzimas é relevante para o metabolismo oxidativo, peroxidativo e

redutor de numerosos e diversos compostos endógenos e exógenos (Nelson et al., 1996).

INTRODUÇÃO

3

Os metabolitos activados nesta fase podem, em certos casos, ser mais tóxicos que o substrato

original, podendo ser depois conjugados com uma molécula endógena, como o ácido glucurónico, a

glutationa ou o sulfato, nas chamadas reacções de fase II ou de conjugação.

1.1.2. - Reacções de Fase II

As enzimas desta fase participam na biotransformação de certas substâncias lipofílicas que

geralmente resultam das reacções de fase I. Nesta fase, essas moléculas são conjugadas através da

adição de um grupo solúvel em água ao sítio reactivo. As reacções de fase II são mediadas por várias

enzimas que podem pertencer a superfamílias de genes distintas, onde estão incluídas as

sulfotransferases, as transaminases, as acetiltransferases, as metiltransferases, as aciltransferases, as

aldocetoreductases, as carboxilesterases, as glicosilases, as glucuroniltransferases e várias hidrolases e

esterases (Nebert, 1991).

Nos metabolitos conjugados existe normalmente um aumento na hidrofilicidade e como tal

estes compostos são rapidamente excretados na urina e na bilis, que são as principais vias de

eliminação para a maior parte das drogas (Meyer, 1996).

1.1.3. – Fase III – O transporte de xenobióticos

Para além do metabolismo que é levado a cabo pelas enzimas de fase I e de fase II, a

disponibilidade dos medicamentos no organismo pode variar como resultado de diferenças genéticas

no mecanismo de transporte através da membrana plasmática. A esta fase de transporte para o exterior

da célula dos compostos resultantes da acção das enzimas de fase I e fase II é dado o nome de fase

III, sendo esta actividade de transporte um factor importante no metabolismo de xenobióticos (Liska,

1998; Müller, 2000). Associadas à fase III estão várias superfamílias de proteínas, sendo uma delas a

dos transportadores ABC (ATP Binding Cassette), associada aos eucariotas (Van Bambeke et al.,

2000). Esta superfamília de proteínas é responsável pelo transporte de um grande número de

substratos através da membrana celular, nos quais estão incluídos açúcares, aminoácidos, proteínas,

metais, iões orgânicos e inorgânicos e antibióticos (Raggers et al., 2000). Os transportadores ABC

INTRODUÇÃO

4

têm sido associados a diferentes manifestações clínicas no Homem, sendo uma delas a resistência a

várias drogas, onde estão envolvidas a família MDR (Multi Drug Resistance) e a família MRP

(Multidrug Resistance Protein ou Multidrug Resistance-Related Protein) (Raggers et al., 2000; Van

Bambeke et al., 2000). Ambas as famílias estão associadas à resistência das células tumorais a drogas

citotóxicas em cerca de 50% dos cancros humanos (Stavrovskaya, 2000). No entanto, estes genes

podem ser expressos em condições normais, e no caso do MDR, a proteína que é expressa, a P-

glicoproteína (P-gp), está associada à defesa do organismo de lesões tóxicas, tendo funções de

“barreira”, e como tal, protege as células de substâncias perigosas que existem, por exemplo, no cólon

(Stavrovskaya, 2000).

Foi recentemente demonstrada a existência de uma regulação coordenada entre a actividade de

transporte no intestino e a enzima de fase I CYP3A4, pelo que os transportadores podem suportar e

promover a destoxificação. Possivelmente, a sua função de bombear xenobióticos não-metabolizados

para fora da célula e de novo para o lúmen intestinal permite aumentar a probabilidade de que os

metabolitos sejam metabolizados pelas enzimas de fase I antes de voltarem à circulação, tendo sido

atribuído a esta função o nome de Fase 0 (ver figura 1.1) (Liska, 1998).

1.2 – O sistema citocromo P450

As enzimas citocromo P450 (CYP) constituem uma superfamília de proteínas que podem ser

encontradas desde as bactérias até ao Homem, e estão envolvidas no metabolismo de uma grande

Estômago

Enterocito

Fezes

Veiaportapara ofígado

Lúmen dointestino

Figura 1.1 – Fase III do metabolismo: sistema antiporter (adaptado de Liska, 1998).

INTRODUÇÃO

5

variedade de compostos (Nelson et al., 1996). Desde a sua origem há mais de 3,5 mil milhões de anos,

a família dos genes CYP diversificou-se para acomodar o metabolismo de um número crescente de

toxinas ambientais, compostos da dieta e drogas (Nelson et al., 1996; Streetman et al., 2000).

1.2.1. – História e bioquímica dos citocromos P450

A capacidade dos tecidos de mamífero para oxidar xenobióticos hidrófobos já era conhecida

antes do ano de 1950, embora as enzimas responsáveis por esta actividade fossem então

desconhecidas. Em 1955, G.R. Williams e M. Klingenberg num estudo sobre hemoproteínas

microssomais de rato e usando a espectroscopia óptica, identificaram um pigmento celular

especializado que apresentava no seu espectro diferencial um pico de Soret a 450 nm quando

complexado com monóxido de carbono (Nebert e Gonzalez, 1987), posteriormente designado por

citocromo P450 (Omura e Sato, 1964). Estudos posteriores atribuíram funções enzimáticas aos CYP e

mostraram a sua capacidade para metabolizar numerosos substratos.

Como referido, estas enzimas foram inicialmente descritas em tecidos animais, mas

posteriormente foi descrita a sua expressão em vários eucariotas, que incluem os vertebrados,

invertebrados, fungos e plantas, e ainda nos procariotas (Nelson et al., 1996). Estando presente numa

tão grande variedade de espécies, actualmente o número de membros desta superfamília excede já as

1200 isoformas (Lewis e Sheridan, 2001). Uma tão elevada variedade de isoformas traduz-se num

elevado número de substratos metabolizados por estas superfamília que incluem vários compostos

endógenos (esteróides, ácidos biliares, ácidos gordos, prostaglandinas, leucotrienos, retinóides) e

exógenos, como fármacos (debrisoquina, codeína, nifedipina, mefenitoina, ciclosporina), químicos

ambientais (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, nitrosaminas, hidrazinas, arilaminas) e produtos

naturais de plantas (fitoalexinas) (Nelson et al., 1996; Stegeman e Hahn, 1994).

As enzimas CYP são hemoproteínas ligadas a membranas com cerca de 48 a 60 kDa, cada uma

contendo aproximadamente 500 resíduos de aminoácidos (Lewis e Sheridan, 2001). Nos animais, a

maior parte das proteínas CYP encontram-se no retículo endoplasmático liso, embora uma minoria

INTRODUÇÃO

6

possa estar localizada na membrana interior da mitocôndria (Guengerich, 1992; Nebert e Gonzalez,

1987). A expressão das enzimas CYP foi identificada no tecido hepático, assim como nos tecidos

extrahepáticos de que são exemplos o rim, o intestino, o pulmão, as gónadas, a pituitária, a próstata, o

cérebro, a pele, os leucócitos, o baço e o sistema cardiovascular (Celander, 1999).

A maior parte do metabolismo mediado pelos CYPs baseia-se na catálise da transformação

oxidativa de um largo número de substratos, sendo a reacção básica catalisada por estas enzimas a

monooxigenação, na qual um átomo de oxigénio (derivado do O2) é incorporado no substrato, e o

outro átomo é reduzido a água com os equivalentes redutores do NAD(P)H (Josephy, 1997; Klaassen

e Watkins, 1999). Esta reacção pode ser representada pela seguinte equação:

Substrato (RH) + O2 + NAD(P)H + H+ → Produto (ROH) + H2O + NAD(P)+

Dependendo do substrato, diferentes reacções podem ocorrer, incluindo a desalogenação

oxidativa ou redutora, a sulfoxidação, a N-hidroxilação e N- e S-oxidação, a desaminação oxidativa, a

S-, N- e O-desalquilação, a redução de peróxidos e epóxidos e a hidroxilação alifática e aromática. O

ciclo catalítico das enzimas CYP é mostrado na figura 1.2 (Anzenbacher e Anzenbacherová, 2001;

Guengerich, 1999; Lewis e Sheridan, 2001; Roberts, 1999). Este é iniciado quando o substrato se liga

a um sítio perto do grupo heme para interagir com o oxigénio (passo 1). O átomo de ferro é então

reduzido para a forma ferrosa (Fe2+) por intermédio de um electrão transferido do NAD(P)H através

da oxidoredutase, tornando-se capaz de captar uma molécula de oxigénio (passo 2). O oxigénio

molecular liga-se então ao complexo CYP-substrato (passo 3), seguindo-se depois a transferência de

um segundo electrão do NAD(P)H através da oxidoredutase para o complexo (passo 4). Finalmente, o

complexo rearranja com a inserção de um átomo de oxigénio no substrato para dar um produto e água

ou peróxido de hidrogénio (passo 5 e 6).

Fe3+

Ls RH

Fe3+ RH Hs NADPH-P450 reductasered

NADPH P450 d t oxe-

Fe3+ ROH

Ls

- ROH

FeIII

H2O

1

2

6

INTRODUÇÃO

7

Figura 1.2 – O ciclo catalítico dos citocromos P450. RH, substrato; ROH, produto hidroxilado.

(adaptado de Guengerich, 1999).

1.2.2. – Nomenclatura

As evidências iniciais da multiplicidade nos CYPs surgiram cedo através da purificação de

várias enzimas e como CYPs individuais foram identificados em vários laboratórios, vários sistemas

de nomenclatura surgiram baseados nos seus pesos moleculares, especificidade de substratos ou

INTRODUÇÃO

8

mobilidade electroforética. Como tal houve a necessidade de desenvolver um sistema de nomenclatura

universal para a superfamília CYP, tendo este como fundamento a comparação das sequências de

aminoácidos e as relações evolutivas dos genes correspondentes, baseada numa evolução divergente

da superfamília (Nebert et al., 1987).

O novo sistema de nomenclatura foi proposto pela primeira vez em 1987, mas desde essa

altura diversas actualizações foram publicadas à medida que surgiram novas formas desta enzima

(Nebert et al., 1989, 1991; Nelson et al., 1993, 1996). Desde a última publicação a informação é

constantemente actualizada em sites na Internet como -

http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html e http://www.icgeb.trieste.it/p450.

As recomendações para designar um gene citocromo P450 (Nelson et al., 1996) incluem em

primeiro lugar a sigla “CYP” (“Cyp” para murganho e Drosophila), que advém de CYtochrome P450.

Em seguida, as enzimas CYP dentro da mesma família são designadas por um número e partilham

entre si mais de 40% de identidade na sequência de aminoácidos. As famílias são depois divididas em

subfamílias, sendo as enzimas dentro da mesma subfamília designadas pela mesma letra. Genes dentro

da mesma subfamília partilham mais de 55% de identidade na sua sequência de aminoácidos.

Finalmente, um número após a letra denota cada isoenzima individual, e assim um gene individual

designa-se, por exemplo, como CYP3A4. Para ser considerado um novo membro individual, uma

sequência deve diferir de uma outra mais do que 3%. No caso dos genes a notação CYP apresenta-se

em itálico (CYP), enquanto para as proteínas, mRNA e cDNAs a sigla não é apresentada em itálico e

todas as letras são maiúsculas, qualquer que seja a espécie (Nelson et al., 1996).

1.2.3. – A evolução dos citocromos P450

O sistema de classificação baseado na percentagem de homologia entre as sequências dos

CYPs facilita a construção de uma árvore filogenética para esta superfamília de enzimas, que se

encontra representada na figura 1.3.

Superfamília dos genes CYP

INTRODUÇÃO

9

Figura 1.3 – Árvore filogenética da superfamília dos citocromos P450. Em abcissas encontra-se

representada a distância evolutiva, estimada com base na divergência entre as sequências de resíduos

de aminoácidos das proteínas (Gonzalez e Nebert, 1990).

O gene ancestral CYP deverá ter aparecido há cerca de 3500 milhões de anos nas espécies

procariotas, na altura em que a atmosfera sofreu alterações e terá começado a haver oxigénio

disponível para as transformações catalíticas mediadas pelos CYPs (Lewis e Sheridan, 2001). O gene

ancestral terá depois sofrido duplicação há cerca de 1360 milhões de anos, o que deu origem a

citocromos P450 que se encontram em dois organelos celulares diferentes, a mitocôndria e o retículo

endoplasmático. Várias etapas importantes da evolução dos citocromos P450 encontram-se resumidos

na tabela 1.1.

Tabela 1.1 – A evolução dos CYPs (adaptado de Lewis e Sheridan, 2001).

Tempo (milhões de anos)

Divergências na superfamília CYP

2000 CYPs eucariotas e procariotas

1000 CYPs microssomais e mitocôndriais

800 As famílias CYP3 e CYP4 separaram-se dos outros CYPs microssomais

650 Divergência entre CYP3 e CYP4

550 As famílias CYP1 e CYP2 divergiram da CYP17 e CYP21



370 Divergência da subfamília CYP2D da família CYP2

300 A subfamília CYP2D expande-se

250 Divergência da família CYP2

230 Divergência das subfamílias CYP2A e CYP2B, e das CYP2C e CYP2E

120 Divergência entre CYP1A1 e CYP1A2

80 Especialização das famílias e subfamílias CYP

1.2.4. – A estrutura das proteínas CYP

Muitas são as sequências de CYPs conhecidas, mas poucas são as estruturas tridimensionais já

determinadas por cristalografia de raio-X. Até agora, as estruturas tridimensionais mais bem

conhecidas são as estruturas de CYPs de procariotas, de que são exemplo a proteína CYP101

Distância Evolutiva

INTRODUÇÃO

10

(P450cam – ver figura 1.4A) da Pseudomonas putida (Poulos et al., 1987) e a CYP102 (BM-3 – ver

figura 1.4B) do Bacillus megaterium (Ravichandran et al., 1993). Só recentemente foi resolvida uma

estrutura de um cristal de CYP de mamíferos, o CYP2C5 de coelho (ver figura 1.4C) (Williams et al.,

2000).

Nos CYPs existem sequências absolutamente conservadas como as que rodeiam dois resíduos

chave, o resíduo de cisteína C-terminal e o resíduo de treonina na hélice I. O resíduo Cys do C-

terminal faz parte de uma folha β antiparalela que começa com Phe (F) e acaba com Cys (C), parte de

uma sequência consenso altamente conservada F(G/S)XGX(H/R)XCXGX(I/L/F)A, conhecida como o

domínio de ligação ao heme no sítio activo, que pode servir como identificador de uma proteína CYP

(Gonzalez, 1989; Kalb e Loper, 1988). A Thr-252 na hélice I aponta para o sítio activo da enzima e

está envolvida na ligação ao oxigénio. Outras regiões conservadas existem, embora com funções

menos claras, como é o caso da região rica em prolina no N-terminal Pro-Pro-Gly-Pro, que pode

servir para juntar o N-terminal de ligação à membrana com a região globular da proteína.

A B

C

INTRODUÇÃO

11

Figura 1.4 – Estrutura tridimensional das enzimas CYP101 (A), CYP102 (B) e CYP2C5 (C).

1.3. – As enzimas CYP no Homem

No Homem foram descritos até à data 56 genes (Kuehl et al., 2001), inseridos em 17 famílias

(ver figura 1.5), e 21 pseudogenes (Leeder, 1996; Mackinnon, 2000). Os CYPs humanos podem ser

funcionalmente divididos em duas classes, uma em que os genes estão, por exemplo, associados à

biossíntese de esteróides (CYP4, CYP5 e famílias acima destas) e uma outra em que os genes estão

primariamente envolvidos no metabolismo de xenobióticos (CYP1, CYP2 e CYP3) (Leeder, 1996).

Figura 1.5 – As famílias e subfamílias de genes CYP descritas no Homem (adaptado de Leeder, 1996).

Cerca de metade das formas de CYP humanas conhecidas pertencem às famílias 1, 2 e 3, e

como tal estas são as famílias mais importantes do metabolismo hepático de drogas. A contribuição

Citocromos P450 Humanos

1 2 3 19 21 5 7 11 27 4 17 24 26 8 46 51 39

1A1 1A2

1B1 3A4 3A5 3A7

3A43

2A6 2A7 2A13

2B6 2C8 2C9 2C18 2C19

2D6 2E1 2F1 2R1 2J2 2S1 2W1 2V1

5A1

4F2 4F3 4F8

4F11 4F12 4F22

4A11 4A20 4A22

4B1 4V2 4X1

7A1 7B1

8B1 8A1

11A1 11B1 11B2

21A2

26A1 26B1 26C1

27A1 27B1 27C1

39A1

INTRODUÇÃO

12

relativa das enzimas CYP envolvidas na metabolização de drogas no fígado humano adulto está

apresentada na figura 1.6 (Leeder, 1996), sendo aí visível a importância da subfamília CYP3A.

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

CYP3A (30% - 60%)

CYP2C (20% - 25%)

CYP1A2 ~ 13%

CYP2E1~ 7%

CYP2A6 ~4%

CYP2D6 ~2% CYP2B6

< 1% Outros ~2%

Figura 1.6 – Contribuição relativa das mais importantes enzimas metabolizadoras de drogas no fígado

humano adulto (adaptado de Leeder, 1996).

1.3.1 – A subfamília CYP3A

Na família CYP3 apenas está descrita uma subfamília, a CYP3A (Nelson et al., 1996). A

subfamília CYP3A está envolvida no metabolismo de um grande número de compostos endógenos e

exógenos, como o cortisol, a ciclosporina e a nifedipina. Como cerca de 50% de todas as drogas

usadas no Homem são metabolizadas, ao menos parcialmente, pela oxidação mediada pelos CYP3A,

esta parece ser a subfamília mais importante no metabolismo de drogas (Thummel e Wilkinson, 1998;

Wrighton et al., 2000).

Os genes CYP3A estão localizados num cluster no cromossoma 7q21-q22.1, apresentando uma

estrutura exão-intrão altamente conservada, com 13 exões e 12 intrões (Hashimoto et al., 1993;

Nelson et al., 1996; Ourlin et al., 1997). Esta subfamília inclui quatro genes, CYP3A4, CYP3A5,

CYP3A7 (Nelson et al., 1996) e o recentemente identificado, CYP3A43 (Domanski et al., 2001;

Gellner et al., 2001). Os genes que fazem parte desta subfamília apresentam grande semelhança

estrutural tanto em termos do cDNA, como da proteína, como se pode ver tabela 1.2 (Gelner et al.,

2001).

INTRODUÇÃO

13

Tabela 1.2 – Semelhança estrutural na sequência de aminoácidos entre os membros da subfamília

CYP3A (adaptado de Gelner et al., 2001).

CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP3A43

CYP3A4 **** 84,1 88,1 75,8

CYP3A5 **** **** 81,9 75,8

CYP3A7 **** **** **** 71,5

CYP3A43 **** **** **** ****

O citocromo 3A4 é a enzima CYP mais importante para o metabolismo de drogas no Homem,

não só pela quantidade em que existe no fígado (que pode aumentar por indução até mais de 60%),

mas também porque participa no metabolismo da maioria das drogas.

O CYP3A5 é expresso no rim (Schuetz et al., 1992), esófago (Lechvrel et al., 1999), cólon

(Gervot et al., 1996), pulmão (Kivistö et al., 1996), intestino (Kivistö et al., 1996a), glândula

pituitária (Murray et al., 1995) e, polimorficamente, no fígado (Wrighton et al., 1989). A expressão

deste gene é detectada em apenas 10 a 30% dos fígados humanos, sendo o seu nível, quando expresso,

cerca de 25% do nível da enzima CYP3A4 (Guengerich, 1999; Paulussen et al., 2000). Este gene

apresenta variantes alélicas tanto na região do promotor, assim como na região codificante do gene

(Jounaidi et al., 1996; Kuehl et al., 2001). A região do promotor do gene CYP3A5 contém um

elemento funcional de resposta aos glucocorticóides, sendo este o único gene CYP humano que é

directamente induzido pelo receptor dos glucocorticóides (GR) (Schuetz et al., 1996). A sua

regulação, ao contrário de outras enzimas CYP3A, não tem evidências de ser efectuada pelo

PXR/SXR (para pregnane X-receptor/steroid and xenobiotic receptor) (Whighton et al., 2000).

INTRODUÇÃO

14

O CYP3A7 é a isoforma CYP3A dominante no fígado fetal, sendo encontrada a baixos níveis

de expressão no fígado adulto (Yang et al., 1994). Esta enzima é também detectada em pequenas

quantidades na placenta, endométrio, tumores e linhas celulares tumorais (Lacroix et al., 1997;

Pascussi et al., 1999). Recentemente foi descrita a sua expressão em vários orgãos no adulto, como o

rim, pâncreas e pulmão (Finta e Zaphiropoulos, 2000). A enzima CYP3A7, embora

predominantemente fetal, tem as propriedades catalíticas semelhantes às outras enzimas CYP3A,

incluindo a hidroxilação da testosterona na posição 6β. Esta isoforma é induzida por várias

substâncias, sendo esta indução mediada por um receptor nuclear, o receptor nuclear de pregnanos

(PXR), que se liga ao elemento de resposta do PXR no promotor do gene (Kuehl et al., 2001; Pascussi

et al., 1999). Também o CAR (Constitutive Androstane Receptor) parece ter um papel na resposta a

xenobióticos no caso do CYP3A7 (Bertilsson et al., 2001).

A expressão do CYP3A43 foi descrita em vários tecidos, mas na maior parte dos casos a baixos

níveis. A expressão a níveis mais elevados foi detectada na próstata, fígado, rim e pâncreas no adulto,

e ainda no fígado e músculo esquelético fetais (Domanski et al., 2001). Níveis menores de expressão

foram descritos no adulto no coração, cérebro, placenta, cólon, leucócitos, intestino delgado, baço e

testículo (Gellner et al., 2001). A contribuição deste gene para o metabolismo de drogas ainda não foi

esclarecida até à data.

INTRODUÇÃO

15

1.3.1.1 – O gene CYP3A4

A isoenzima CYP3A4 representa cerca de 30% do conteúdo total de enzimas CYP no fígado

adulto (Shimada et al., 1994), mas para além deste órgão é também expressa no intestino delgado

(Kolars et al.,1992; Zhang et al., 1999), cólon e estômago (de Waziers et al., 1990). Cerca de 60% das

drogas metabolizadas pelos CYPs são metabolizadas pelo CYP3A4. Esta enzima cataliza o

metabolismo oxidativo de uma grande variedade de químicos com diferentes características

estruturais,e assim os substratos para esta enzima incluem uma grande variedade de xenobióticos (ver

tabela 1.3), que se distribuem por várias classes como, anticoagulantes, antidepressivos,

antihistamínicos, antimaláricos, bloqueadores dos canais de cálcio, agentes quimioterapêuticos,

imunosupressores, antibióticos macrólidos, e inibidores de proteases (Michalets, 1998; Ducharme e

Farinotti, 1996). O CYP3A4 tem também um papel importante no metabolismo de esteróides

endógenos, como a testosterona, a progesterona, o cortisol e o estradiol.

A sequenciação do gene CYP3A4 mostrou que a região do promotor deste contém uma TATA

box e um elemento básico de transcrição (BTE) (Hashimoto et al., 1993). Para além destes existem

sítios de ligação para diversos factores de transcrição, tais como, a proteína octamérica (Oct-1),

proteína activadora 3 (AP-3), proteína p53, factor hepático nuclear -4 e -5 (HNF-4 e HNF-5), receptor

dos glucocorticóides (GR) e receptor de estrogénios (ER) (Guengerich, 1999; Hashimoto et al., 1993;

Jover et al., 2001). Existe ainda uma sequência na região 5’, o elemento de resposta à nifedipina (-389

a –398), denominado NFSE (P450NF specific element), que poderá estar envolvida na expressão do

CYP3A4, embora não estejam identificados os factores que são capazes de se ligar a este elemento.

INTRODUÇÃO

16

Tabela 1.3 – Substratos, indutores e inibidores da isoenzima CYP3A4 (Mackinnon e Evans, 2000;

Michalets, 1998; Piscitelli e Gallaciano, 2001).

Substratos Alfentanil Alprazolam Amitriptilina Amiodarona Amlodipina Astemizol Atorvastatine Budesonide Buprenorfina Busulfan Canabinóides Carbamazepina Cetoconazol Cisapride Claritromicina Clindamicina Clonazepam Clozapina Cocaína Cortisol Ciclobenzaprina Ciclofosfamida Ciclosporina

Dapsona Dexametasona Dextrometorfano Diazepam Digitoxina Diltiazem Disopiramida Donepezil Doxorubicina Dronabiol Efavirenz Eritromicina Estradiol Estrogénios, Contraceptivos orais Etiniloestradiol Etosuximida Etopósido Felodipina Fentanil Fexofenadina Flutamida Ifosfamida

Imipramina Indinavir Isradipina Lansoprazol Lidocaína Loratadina Losartan Lovastatina Mibefradil Miconazol Midazolam Navelbine Nefazodona Nelfinavir Nicardipina Nifedipina Nimodipina Nisoldipina Omeprazol Ondansetron Paclitaxel Pravastatina Prednisona

Propafenona Quinidina Quinino Ritonavir Saquinavir Sertraline Simvastatina Tacrolimus Tamoxifen Temazepam Tenipósido Terfenadina Testosterona Tetrahidrocanabinol Teofilina Trazadona Triazolam Troleandomicina Verapamil Vinblastina R-warfarina Zileuton

Inibidores Indutores Amiodarone Amprenavir Canabinóides Cetoconazol Cimetidine Claritromicina Clotrimazol Delavindina Diltiazem Efavirenz Eritromicina Fluconazole Fluoxetina Fluvoxamina Indinavir Inibidores de proteases (ritonavir é o mais potente)

Itraconazol Lopinavir Omeprazol Metronidazol Mibefradil Miconazol Nefazodona Nelfinavir Norfloxacina Paroxetina Quinino Saquinavir Sertralina Sumo de Toranja Troleandomicina Zafirlukast

Carbamazepina Dexametasona Etosuximida Fenobarbital Fenitoína Glucocorticóides Nevirapina Primidona Rifabutina Rifampina Rifampicina Sulfadimidina Sulfinpirazona Troglitazona

INTRODUÇÃO

17

O metabolismo de drogas é afectado pela indução e inibição das enzimas. A indução das

enzimas resulta usualmente num aumento da quantidade da enzima, normalmente devido a uma

indução da transcrição, e o período de tempo necessário para a indução da enzima torna-se

clinicamente significativo. Os níveis de CYP3A4 são induzidos pela exposição a vários agentes

estruturalmente diversos (ver tabela 1.3), que incluem a dexametasona, carbamazepina, fenobarbital e

rifampicina (Wrighton et al., 2000). A inibição das enzimas CYP, por sua vez, ocorre rapidamente,

mesmo após uma dose única de inibidor. Para o CYP3A4 existem vários inibidores (ver tabela 1.3), de

que são exemplo o itraconazol ou o indinavir.

O metabolismo de drogas efectuado pelos CYPs humanos é levada a cabo por enzimas

polimórficas que podem apresentar uma actividade reduzida ou aumentada em relação a um dado

substrato. As principais causas para a variação no metabolismo são o polimorfismo genético, a

indução ou inibição devido a terapias com drogas ou factores ambientais, o estado fisiológico e alguns

estados patológicos (Ingelman-Sundberg et al., 1999). Recentemente foi sugerido que 60% a 90% da

variabilidade interindividual nos CYP3A pode ser causada por factores genéticos (Özdemir et al.,

2000). O princípio genético do polimorfismo de enzimas que participam no metabolismo de drogas

reside em mutações no gene que codifica uma enzima em particular. O polimorfismo genético das

enzimas do metabolismo de drogas pode ser caracterizado como consequência da presença de duas ou

mais variantes de enzimas numa população etnicamente homogénea e ocorre quando a variante de

uma enzima em particular está presente em pelo menos 1% da população (≤ 3% de divergência)

(Kohút e Kalina, 1998; Nelson et al., 1996).

A variabilidade na expressão do CYP3A4 pode também ser o resultado da regulação que existe

a nível da transcrição, tanto através das variações que existem nos elementos reguladores upstream,

como nos genes que codificam para os factores de transcrição (Eichelbaum e Burk, 2001). O factor de

transcrição que parece desempenhar um papel central na expressão do CYP3A4 é o receptor orfão

PXR (também chamado de SXR) (Bertilsson et al., 1998; Blumberg et al., 1998; Lehmann et al.,

1998), na forma de heterodímero com o RXR (Retinoid X Receptor) (Waxman, 1999; Moore e

INTRODUÇÃO

18

Kliewer, 2000; Xie et al., 2000). Outros receptores parecem também estar ligados à expressão do

CYP3A4, como é o caso do CAR ou do GR, embora neste último caso a regulação pareça ser

indirecta (Wrighton et al., 2000; P. Maurel, comunicação pessoal).

1.3.1.1.1 – O polimorfismo genético no CYP3A4

O CYP3A4 exibe uma grande variação interindividual nos níveis de expressão que in vitro

pode ir até 50 vezes, enquanto que in vivo a actividade da proteína pode variar até 20 vezes (Shimada

et al., 1994; Özdemir et al., 2000). Embora vários estudos baseados na fenotipagem tenham há muito

demonstrado a existência desta variabilidade interindividual no metabolismo do CYP3A4 só

recentemente foram identificadas variações na sequência do gene que a podem explicar (Rebbeck et

al., 1998; Sata et al., 2000; Hshie et al., 2001; Eiselt et al., 2001).

A primeira evidência da existência de polimorfismo genético no gene CYP3A4 surgiu em 1998

com a descrição de uma variação na região 5’ do gene que consiste numa mutação pontual de uma

adenina para guanina (A-392G) no elemento de resposta específico da nifedipina (Rebbeck et al.,

1998). A esta mutação na região não codificante do gene foi dada a designação de CYP3A4*1B, tendo

sido descrita com maior incidência nos indivíduos negros, menor incidência nos Caucasianos e como

inexistente em populações Asiáticas (Rebbeck et al., 1998). Desde logo foi feita a associação desta

variante com uma actividade proteíca menor, que poderá estar associada ao cancro da próstata

(Rebbeck et al., 1998) e a um menor risco de leucemias relacionadas com o tratamento (Felix et al.,

1998). Outros estudos, no entanto, apresentam resultados que põem em causa os anteriormente

referenciados, uma vez que nestes não são observadas alterações significativas da expressão da

enzima ou da sua actividade catalítica (Ando et al., 1999; Ball et al., 1999; Wandel et al., 2000;

Westlind et al., 1999).

No início do ano 2000 foram descritas as primeiras variantes na região codificante do

CYP3A4, a variante CYP3A4*2 e CYP3A4*3 (Sata et al., 2000).

INTRODUÇÃO

19

A mutação no CYP3A4*2 consiste numa transição T → C que resulta numa alteração

Ser222Pro (Sata et al., 2000). Este SNP (Single Nucleotide Polymorphism) foi descrito na população

Finlandesa e dado como ausente nos sujeitos Chineses e Negros analisados (Sata et al., 2000).

Recentemente, num estudo realizado na população Alemã e Suíça, esta variante não foi detectada pelo

que foi sugerido que esta seria uma variante específica dos Finlandeses (Eiselt et al., 2001). A

expressão do CYP3A4*2 em células de mamífero mostrou que esta mutação leva a uma actividade

catalítica alterada perante o substrato nifedipina (Sata et al., 2000).

A variação T → C que encontramos no caso do CYP3A4*3 leva a uma alteração Met445Thr na

região conservada de ligação ao heme (Sata et al., 2000). Esta mutação quando descrita, foi

encontrada num único indivíduo Chinês, num universo de 72 indivíduos analisados, o que levou à sua

caracterização como sendo um alelo raro (Sata et al., 2000). Um estudo recente na população

Holandesa chegou à conclusão de que este não seria um alelo raro, uma vez que nesta população a

mutação foi descrita com uma incidência superior a 1 %, o que leva a que possa ser designada por

variante polimórfica (van Schaik et al., 2001). Um outro estudo realizado nas populações Alemã e

Suíça também encontrou esta mutação, tendo aqui sido estudadas as consequências funcionais da

mutação (Eiselt et al., 2001). O estudo do efeito da mutação Met445Thr na actividade da proteína

revelou que esta não tinha qualquer efeito a nível da testosterona e progesterona (Eiselt et al., 2001).

Para além destas variantes sobre as quais incidiu este trabalho, outras variantes foram

descritas. Hsieh e seus colaboradores (2001) descreveram, numa população Chinesa, três novas

mutações na região codificante do gene. A primeira variante (CYP3A4*4) consiste numa mutação de

A13989G que resulta numa alteração Ile118Val, o que parece levar a uma alteração da actividade da

enzima in vivo (Hsieh et al., 2001). A outra variante (CYP3A4*5) apresenta uma mutação pontual

C15820G que causa uma alteração Pro218Arg, e que leva à diminuição da actividade da proteína

(Hsieh et al., 2001). A variante CYP3A4*6 consiste na inserção de uma adenina na posição 17776, e

este frameshift devido à inserção cria um codão stop na posição 285, antes do que acontece na

INTRODUÇÃO

20

sequência de referência (Hsieh et al., 2001). Isto origina uma diminuição da actividade a valores

muito inferiores do que o que acontece com as outras variantes descritas no estudo, assim como em

relação à sequência de referência (Hsieh et al., 2001).

Muito recentemente foram descritos mais sete SNPs na região codificante, o CYP3A4*7,

CYP3A4*8, CYP3A4*9, CYP3A4*10, CYP3A4*11, CYP3A4*12 e CYP3A4*13, dos quais apenas o

CYP3A4*11 é expresso a níveis significativamente diferentes em relação à sequência de referência e o

CYP3A4*12 apresenta uma actividade alterada na metabolização da testosterona (Eiselt et al., 2001).

A busca de variantes para este gene já permitiu a localização de mais de 20 alterações na

sequência que se encontram apresentadas na tabela 1.4.

Tabela 1.4 – Nomenclatura das variantes descritas para o CYP3A4.

(adaptado de http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp3a4)

Alelo Alterações na Sequência Efeito Referências

INTRODUÇÃO

21

cDNA Gene

CYP3A4*1A Nenhuma Nenhuma Gonzalez et al., 1988

CYP3A4*1B -392 A>G Rebbeck et al., 1998 Westlind et al., 1999

CYP3A4*1C -444 T>G Kuehl et al., 2001

CYP3A4*1D -62 C>A Kuehl et al., 2001

CYP3A4*1E -369 T>A Dr. H. Hamzeiy

CYP3A4*1F -747 C>G Dr. H. Hamzeiy

CYP3A4*2 S222P Sata et al., 2000

CYP3A4*3 1334 T>C M445T Sata et al., 2000

CYP3A4*4 352 A>G I118V Hsieh et al., 2001

CYP3A4*5 653 C>G P218R Hsieh et al., 2001

CYP3A4*6 831 ins A frameshift Hsieh et al., 2001

CYP3A4*7 167 G>A 6004 G>A G56D Eiselt et al., 2001

CYP3A4*8 389 G>A 13908 G>A R130Q Eiselt et al., 2001

CYP3A4*9 508 G>A 14292 G>A V170I Eiselt et al., 2001

CYP3A4*10 520 G>C 14304 G>C D174H Eiselt et al., 2001

CYP3A4*11 1088 C>T 21867 C>T T363M Eiselt et al., 2001

CYP3A4*12 1117 C>T 21896 C>T L373F Eiselt et al., 2001

CYP3A4*13 1247 C>T 22026 C>T P416L Eiselt et al., 2001

CYP3A4*14 44 T>C 44 T>C L15P Dr. J. Lamba

CYP3A4*15A 485 G>A 14269 G>A R162Q Dr. J. Lamba

CYP3A4*15B - 845 ins ATGGAGTGA;

-392 A>G; 485 G>A

- 845 ins ATGGAGTGA;

-392 A>G; 14269 G>A

R162Q

Dr. H. Hamzeiy

CYP3A4*16 554 C>G 15603 C>G T185S Dr. J. Lamba

CYP3A4*17 566 T>C 15615 T>C F189S Dr. Dai

CYP3A4*18 878 T>C 20072 T>C L293P Dr.Dai

CYP3A4*19 1399 C>T VS10+12 G>A

23237 C>T 20230 G>A

P467S Dr. Dai

OBJECTIVOS

23

2 – Objectivos

Perante a inexistência de métodos de genotipagem para as variantes do CYP3A4, assim como

de informação relativa à população Portuguesa no que respeita à incidência dessas variantes, este

trabalho teve por objectivos principais o desenvolvimento de métodos de genotipagem, baseados em

PCR-RFLP, para a detecção das mutações CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3, assim como a

validação do método através da caracterização das respectivas frequências na população Portuguesa.

MATERIAL E MÉTODOS

24

3 - Material e Métodos – análise do gene CYP3A4

3.1 - Introdução

A abordagem experimental usada para a caracterização das variantes do CYP3A4 teve

como base a amplificação e análise de segmentos específicos de DNA por PCR (Polymerase

Chain Reaction - reacção de amplificação em cadeia da polimerase de DNA termostável) (Mullis e

Faloona, 1987). O PCR é o método experimental indicado para a amplificação exponencial in vitro

de um fragmento específico de DNA, de tamanho e sequência definidos, a partir de quantidades

mínimas de um “molde” de DNA complexo (Mullis e Faloona, 1987; White et al., 1989). De

modo a iniciar a amplificação são necessárias sequências oligonucleotídicas - primers -

complementares às regiões adjacentes (5’ e 3’) de cada uma das cadeias da dupla hélice do DNA

de origem (Sambrook et al., 1989). Os primers flanqueiam o segmento de DNA que se deseja

amplificar, uma vez que as DNA polimerases catalisam reacções de polimerização apenas a partir

de um grupo 3’-OH terminal.

Como o produto da amplificação pode servir de molde para outros primers cada ciclo irá

duplicar a quantidade de fragmentos de DNA produzidos no ciclo anterior, o que resulta numa

acumulação exponencial do fragmento de DNA alvo inicial (cerca de 2n, onde n é o número de

ciclos de amplificação realizados) (Saiki, 1990; White et al., 1989).

A metodologia de amplificação por PCR baseia-se na repetição de uma série de três passos

(ver figura 3.1): (1) desnaturação do DNA molde por aquecimento, (2) hibridação dos primers

com as sequências de DNA complementares por abaixamento da temperatura – passo de

annealing - e (3) elongação da cadeia de DNA a partir dos primers usando a TaqDNA polimerase

(Sambrook et al., 1989).

Os protocolos originais para as reacções de PCR (Mullis e Faloona, 1987) usavam o

fragmento Klenow da polimerase I de DNA de E. coli para catalisar a reacção de extensão dos

primers, e como esta enzima era inactivada durante o passo de desnaturação havia a necessidade

de a adicionar durante cada ciclo (Sambrook et al., 1989). Este problema foi resolvido com a

MATERIAL E MÉTODOS

25

introdução de uma polimerase de DNA termoestável purificada a partir da bactéria termófila

Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase), o que permitiu assim a automatização do método e a

expansão desta técnica (White et al., 1989; Gelfand e White, 1990).

Figura 3.1 – Exemplo de uma reacção de PCR em que se esquematizam

os diferentes passos de cada ciclo.

25 a 50 ciclos de três passos :

Passo 1 : desnaturação

1 minuto a 94º C

Passo 2 : annealing

45 segundos a 54º C

Passo 3 : extensão

2 minutos a 72º C

PCR : Polymerase Chain Reaction

MATERIAL E MÉTODOS

26

No método de PCR geralmente existe a necessidade de optimização do processo, o que

envolve diversos parâmetros (Innis e Gelfand, 1990):

• Primers – Para uma elevada especificidade da reacção é necessária uma baixa concentração de

primers. As altas concentrações de primers podem favorecer o annealing e a produção de

produtos inespecíficos, assim como a formação de dímeros de primers, onde estes em vez de

hibridar com o DNA alvo, hibridam entre si.

• Taq polimerase – Uma alta concentração da enzima Taq polimerase leva a uma redução da

especificidade da reacção, levando à síntese de produtos indesejados. O contrário origina uma

formação ineficiente de produto, o que leva à diminuição do rendimento da reacção.

• dNTPs – Os dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) devem ser usados em concentrações iguais,

para que assim um deles em maior concentração não seja preferencialmente incorporado. Para

aumentar a especificidade da reacção a concentração de dNTPs deve ser reduzida, enquanto

para o aumento da eficiência é necessário um aumento destes.

• Iões magnésio – O Mg++ é um catião divalente e liga-se ao DNA molde, dNTPs, primers e

polimerase. Logo a sua concentração afecta a especificidade do produto, a hibridação dos

primers, a formação de dímeros de primers, a temperatura de dissociação e a actividade e

fidelidade da enzima. Um excesso de Mg++ pode causar reacções inespecíficas, ou seja, a

hibridação inespecífica dos primers com a cadeia molde, o que diminui a fidelidade da

reacção.

• Temperatura de desnaturação – O passo de desnaturação normalmente ocorre entre 92ºC e

96ºC, o que assegura que haja uma desnaturação completa do DNA molde.

MATERIAL E MÉTODOS

27

• Temperatura de hibridação – A temperatura requerida para a hibridação dos primers com o

DNA alvo depende da sua composição em bases, tamanho e concentração. A temperatura de

hibridação é calculada por diversas formas, dependendo do tamanho da cadeia de

oligonucleótidos. A forma mais simples consiste em fazer o somatório dos nucleótidos

contendo adenina e timina e multiplicar por 2ºC e adicionar o somatório dos nucleótidos

contendo guanina e citosina multiplicado por 4ºC:

Tm = 4 ºC x (número de G’s e C’s no primer) + 2 ºC x (número de A’s e T’s no primer)

Para aumentar a especificidade da reacção aumenta-se a temperatura de hibridação, uma vez

que assim é reduzida a possibilidade de hibridações não específicas dos primers e a

consequente amplificação de produtos inespecíficos.

• Número de ciclos de amplificação – A optimização do número de ciclos de amplificação

numa reacção, partindo do princípio que todos os outros parâmetros estão optimizados,

dependerá sobretudo da concentração inicial de DNA molde. Para aumentar a especificidade

da reacção deve reduzir-se o número de ciclos. Se esta diminuição for demasiada irá levar a

uma diminuição do rendimento da reacção.

A detecção de alterações na estrutura do gene CYP3A4 envolvem a digestão dos

fragmentos amplificados com endonucleases de restrição e a análise por separação electroforética

dos fragmentos de restrição do DNA em gel de poliacrilamida.

As endonucleases de restrição são usadas para hidrolisar o DNA de uma maneira precisa

em posições internas. Estas são membros de uma classe de enzimas que têm a propriedade de

quebrar as ligações fosfodiéster que ligam os nucleótidos adjacentes nas moléculas de DNA. As

enzimas de restrição são produzidas por bactérias como mecanismo de defesa contra os

bacteriofagos, e actuam clivando sequências específicas de nucleótidos do DNA, tornando-o então

inactivo (Griffiths et al., 1996).

MATERIAL E MÉTODOS

28

Em relação à electroforese, esta é uma técnica que tem como base a migração de uma

partícula carregada sobre a influência de um campo eléctrico. Muitas moléculas de importância

biológica, incluindo os ácidos nucleicos, possuem grupos ionizáveis e, assim, a um dado pH,

existem em solução como espécies carregadas. Sobre a influência de um campo eléctrico estas

partículas carregadas irão migrar para o cátodo ou ânodo, dependendo da natureza da sua carga. A

electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) utiliza um suporte em que os monómeros de

acrilamida ao polimerizarem formam longas cadeias ligadas entre si por ligações cruzadas

(crosslinking), através dos resíduos de N, N’-metilenobisacrilamida (bisacrilamida) presentes, o

que forma uma malha de tamanho controlável.

A polimerização da acrilamida é um exemplo de catálise por radicais livres iniciada pelo

persulfato de amónio (PSA) e catalisada pelo N, N, N’, N’- tetrametilenodiamina (TEMED). O

TEMED catalisa a decomposição do ião persulfato para dar um radical anião sulfato:

S2O82- + e- → SO4

− • + SO42−

Este radical (SO4− •) reage com o monómero de acrilamida transformando-a num radical

que vai reagir com outra molécula de acrilamida, ou uma de bisacrilamida, dando origem a outro

radical, e assim sucessivamente, o que dá origem ao polímero com ligações cruzadas. O número de

ligações determina o tamanho dos poros do gel, e assim a gama de massas moleculares das

moléculas que podem ser separadas no gel (Walker, 2000).

3.2 - Materiais

MATERIAL E MÉTODOS

29

3.2.1 - Material Biológico - Indivíduos

A população controlo genotipada no presente estudo foi constituída por 131 indivíduos (59

homens, idades 8 – 77, média de idades = 49,88, SD = 18,35; 72 mulheres, idades 13-89, média

de idades = 49,58, SD = 18,50). As amostras de sangue utilizadas foram obtidas em voluntários

Caucasianos normais, não relacionados e saudáveis, que foram assistidos nos Hospitais de Faro e

do Barlavento, no Algarve. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelos Quadros de

Ética dos Hospitais, tendo sido os indivíduos analisados neste estudo recrutados de check-ups

médicos regulares.

As amostras de sangue foram colhidas sob controlo médico e em obediência à legislação e

normas éticas vigentes. As amostras foram colhidas para tubos estéreis com o anticoagulante

K3EDTA a pH8,0, tendo sido depois congeladas a -20ºC, até a extracção de DNA.

3.2.2 - Reagentes

Tris (Riedel-de Haën), ácido bórico (Merck), EDTA (Merck), acrilamida (Pharmacia Biotech,

Riedel-de Haën), N, N’- metileno-bis-acrilamida (Sigma, Riedel-de Haën), Glicerol (Sigma), Azul

de bromofenol (Merck), Xileno cianol (Sigma), Persulfato de amónio (Sigma), TEMED (BDH

Chemicals Ltd), brometo de etídeo (Sigma), Igepal CA-630 (Sigma), Tween 20 (Merck),

Proteinase K (Sigma), cloreto de magnésio (Riedel-de Haën).

A origem de outros reagentes e dos equipamentos usados é mencionada no decorrer do

texto.

3.3 – Métodos

MATERIAL E MÉTODOS

30

3.3.1 - Extracção de DNA genómico – Extracção rápida de DNA

O método de extracção rápida de DNA é usado para extrair o DNA genómico (Innis et al.,

1990), e é um método que não implica passos de purificação, o que faz com que seja

extremamente rápido e económico, evitando o uso de solventes orgânicos.

Após a descongelação da amostra, misturou-se 100 µl de sangue com 750 µl de tampão TE

(pH 8,0)1. A mistura foi agitada no vortex (Heidolph 94323) e seguidamente sujeita a uma

centrifugação a 12000 g (Eppendorf 5415D) durante 1 minuto. Como este passo leva à lise dos

eritrócitos, o sobrenadante foi cuidadosamente removido por aspiração. Este procedimento foi

depois repetido até o sedimento se apresentar livre de hemoglobina. O sedimento de células

nucleadas foi ressuspendido em 100 µl de tampão de lise2 com o objectivo de lisar os leucócitos. A

desproteinização foi feita através da adição de 1 µl de proteinase K (20 mg/ml). Esta mistura foi

depois incubada a 55 ºC durante cerca de 16 horas, e após este tempo foi-lhe adicionado 100 µl de

água MilliQ (Millipore) estéril. A amostra foi então aquecida a 95 ºC por cerca de 15 minutos, de

modo a dar-se a desnaturação proteica, e consequente inactivação da proteínase K. As amostras de

DNA foram mantidas a –20 ºC até utilização para as reacções de PCR.

A avaliação da concentração e pureza do DNA obtido foi efectuada por espectrofotometria

(Shimadzu UV-260), determinando-se a absorvância de uma amostra diluída de DNA (diluição de

1:10) aos comprimentos de onda de 260 e 280 nm (Sambrook et al., 1989).

3.3.2 – Pesquisa dos alelos do gene CYP3A4 por PCR-RFLP

1 Tampão TE (pH 8,0): 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA 2 Tampão de lise: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM MgCl2, Igepal CA-630 (0,45%), Tween 20 (0,45%)

MATERIAL E MÉTODOS

31

O desenvolvimento de métodos de PCR depende do desenho de primers específicos para as

amplificações. Neste processo o primeiro passo consiste na consulta de bases de dados para a

obtenção das sequências dos genes a estudar. Após a localização na sequência do gene das

mutações a estudar, começa o desenho de possíveis primers a usar na reacção de PCR. Aqui é

necessário ter em conta várias regras (Innis e Gelfand, 1990):

♦ os primers devem ter um tamanho de pelo menos entre 17 e 28 nucleótidos, de

modo a minimizar o problema de hibridação secundária;

♦ os primers devem ter uma composição em G /C entre 50 e 60%;

♦ os primers devem ter no terminal 3’ um G ou C, ou CG ou GC, o que aumenta a

eficiência dos primers;

♦ as temperaturas de dissociação entre 55 – 80ºC são as ideais;

♦ os primers não devem apresentar complementaridade interior (palindromas), ou

seja, não devem formar estruturas como hairpins;

♦ os primers não devem conter sequências de nucleótidos complementares entre

elas, uma vez que dímeros serão sintetizados preferencialmente em relação a

outros produtos;

♦ os primers escolhidos devem ter homologia específica com o gene que se quer

amplificar.

No caso do gene CYP3A4 foi necessário assegurar que os primers escolhidos não

hibridassem com formas relacionadas , como é o caso dos genes CYP3A5, CYP3A7 e CYP3A43.

Para o SNP CYP3A4*1B a amplificação foi levada a cabo numa mistura de reacção de 50

µl contendo 3 µl de DNA alvo, 0,6 µM de cada primer (1Bfw e 1Brv, ver tabela 3.1) (Eurogentec),

MATERIAL E MÉTODOS

32

200 µM de cada dNTP (Life Technologies), 1,5 mM de MgCl2 (Promega), tampão para Taq

polimerase3 (1x) (Promega), 2,5 U4 de Taq polimerase (Promega) e H2O estéril.

As condições de amplificação consistiram em um ciclo de 2 min a 94ºC, 30 ciclos de

amplificação que incluiram 45 s de desnaturação a 94 ºC, 45 s de annealing a 59 ºC e 45 s de

extensão a 72 ºC, e ciclo final de 1 min a 72ºC. O termociclador usado foi o Mastercycler personal

5332 (Eppendorf). Os produtos de amplificação obtidos foram mantidos a 4 ºC até serem

submetidos à digestão pelos enzimas de restrição.

O CYP3A4*1B corresponde a uma transição A → G na região 5’ do gene. A verificação da

presença desta mutação baseia-se na introdução de uma base sem emparelhamento (mismatch),

que neste caso é uma citosina assinalada a negrito na sequência do primer 1Bfw (ver tabela 3.1). A

presença deste mismatch, juntamente com a mutação permite a existência de um sítio de restrição

para a enzima Bst NI:

CYP3A4*1A CCAAG Sem sítio de restrição

CYP3A4*1B CCAGG Sequência de restrição Bst NI A

5’- CC↓TGG -3’ 3’- GGA↑CC -5’

T

3 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 a 25ºC), 50 mM KCl e 0,1 % Triton®X-100 4 Uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para catalizar a incorporação de 10 nmoles de dNTPs numa forma ácida, não solúvel, em 30 minutos a 74 ºC, nas seguintes condições: 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 200 µM de dNTPs, 10 µg de DNA de timo de vitela e 0,1 mg/ml de BSA, num volume final de 50 µl (Promega, Madison).

MATERIAL E MÉTODOS

34

Para a análise desta variante foi introduzido um controlo interno através da amplificação, nas

mesmas condições descritas anteriormente, de um fragmento de 211 pares de bases (bp) (primers

1BCfw e 1BCrv, ver tabela 3.1) (Life Technologies), que através de sítios de restrição adicionais para

a Bst NI, que dão origem a fragmentos de 158, 31, 12 e 10 bp, permitem o controlo da eficiência da

digestão e a consequente identificação inequívoca dos homozigotas CYP3A4*1A.

O produto de cada uma das reacções de PCR com 122 e 211 bp, (10 µl de cada produto

amplificado) foi digerido com 5 U5 de Bst NI (Stratagene), num volume total de 30 µl durante 3 horas

a 60 ºC. A restrição do alelo contendo a mutação origina dois fragmentos (95 bp + 27 bp), enquanto

que o CYP3A4*1A manterá o fragmento amplificado de 122 bp (ver figura 3.2B).

No caso do CYP3A4*2 a amplificação foi em tudo semelhante ao descrito anteriormente para o

CYP3A4*1B, excepto nos primers usados (2fw e 2 rv, ver tabela 3.1) (Eurogentec) e na temperatura

de annealing que foi de 45 ºC.

O SNP CYP3A4*2 consiste numa transição T → C na região codificante. A verificação da

presença desta variante baseia-se na introdução de um mismatch, uma guanina assinalada a negrito na

sequência do primer 2fw (ver tabela 3.1). A presença do mismatch e a ausência da mutação permite a

existência de um sítio de restrição Alw26 I:

CYP3A4*1A GTCTC Sequência de restrição Alw26 I

5’- GTCTC↓ -3’ 3’- CAGAG↑ -5’

CYP3A4*2 GTCCC Perda do sítio de restrição

Deste modo, a restrição do produto amplificado (20 µl), com 5 U5 Alw26 I (Promega), num

volume total de 30 µl durante 3 horas a 37 ºC, origina para o caso do CYP3A4*1A dois fragmentos

(123 bp + 28 bp), enquanto que o CYP3A4*2 mantém o fragmento amplificado de 151 bp intacto (ver

figura 3.2C).

5 Definição de unidade: quantidade de enzima necessária para a restrição completa de 1 µg de DNA genómico de bacteriofago λ em condições óptimas de pH e temperatura (Stratagene).

MATERIAL E MÉTODOS

35

A amplificação do CYP3A4*3, usando os primers 3fw e 3rv (ver tabela 3.1) (Life

Technologies), foi realizada como descrito anteriormente, excepto para a temperatura de annealing

que foi de 52ºC. Esta variante consiste na substituição T → C que leva ao desaparecimento de um

sítio de reconhecimento para a enzima de restrição Nla III:

Alelo CYP3A4*1A CATGA Sequência de restrição Nla III

5’- CATG↓ -3’ 3’- ↑GTAC -5’

Alelo CYP3A4*3 CACGA Perda do sítio de restrição

A restrição do produto amplificado (20 µl) com 2,5 U5 de Nla III (New England BioLabs),

num volume total de 30 µl, durante 3h a 37ºC, origina para o CYP3A4*1A dois fragmentos (89 bp +

85 bp), enquanto que no caso da mutação mantêm-se o fragmento amplificado de 174 bp (ver figura

3.2D).

3.3.3 – Detecção dos produtos de digestão

A detecção dos fragmentos de restrição foi realizada em gel de poliacrilamida a 8% utilizando

um sistema de electroforese vertical Hoefer SE600 (Amersham Pharmacia Biotech). A migração

efectuou-se em tampão TBE6 (1x), à temperatura ambiente e a uma voltagem de 25 V/cm, durante

cerca de uma hora, ou em alternativa, overnight a 2 V/cm. Para a preparação da amostra a aplicar

misturou-se 25 µl de produto digerido com 2,5 µl de tampão de aplicação7. Como marcador de pesos

moleculares foram usados o marcador V ou o marcador IX (Roche Biochemicals). Os géis foram

corados numa solução de brometo de etídeo (0,5 µg/ml), visualizados por exposição a luz ultravioleta

e fotografados num sistema Gel Doc 2000 (Bio-Rad).

6 Tampão TBE: 89 mM Tris, 89 mM ácido bórico e 2 mM EDTA (pH 8,0). 7 Tampão de aplicação: 0,25 % xileno cianol e 30 % glicerol ou 0,25% azul bromofenol e 30% glicerol.

MATERIAL E MÉTODOS

36

Os padrões de restrição previstos para as variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 estão

apresentadas na figura 3.2.

(A)

(B) (C)

(D)

Figura 3.2 – Esquema do gene CYP3A4 e da zona de amplificação de cada par de primers (A).

Representação esquemática dos padrões de RFLP obtidos para a identificação do CYP3A4*1B (B),

CYP3A4*2 (C) e CYP3A4*3 (D).

_ Nla III

+ *1A/*3 *3/*3 *1A/*1A

174 bp

89 bp 85 bp

5’

3’ 5’

3’ 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 6

1 *

7 *

12

_ Alw26 I

+ *1A/*2 *2/*2 *1A/*1A

151 bp

123 bp

28 bp

_ Bst NI

+ *1A/*1B *1B/*1B *1A/*1A

211 bp

122 bp 158 bp

95 bp

31 bp 27 bp 12 bp 10 bp

MATERIAL E MÉTODOS

37

3.3.4 – Análise estatística

3.3.4.1 – Frequências alélicas

A frequência alélica representa uma medida do quanto frequente é um alelo numa população,

ou seja, exprime o valor que caracteriza cada população particular de indivíduos do ponto de vista da

natureza genética, permitindo a sua posterior comparação com outras populações.

O cálculo da frequência de um alelo é feita através da contagem dos homozigotas e com a

adição de metade dos heterozigotas. A forma geral para este cálculo é (Griffiths et al., 2000):

p = fA/A + ½ fA/a = frequência de A

q = fa/a + ½ fA/a = frequência de a

em que fA/A , fA/a e fa/a são as proporções dos três genótipos num locus com dois alelos e onde p

corresponde à frequência do alelo A e q à frequência do alelo a.

3.3.4.2 – Frequências genotípicas

A frequência genotípica numa população é a proporção de organismos que têm um genótipo

em particular. O cálculo das frequências genotípicas teóricas efectua-se tendo como base o princípio

de Hardy-Weinberg. Este modelo baseia-se em cinco princípios, ou seja, de que uma população é

grande, de que não existem flutuações de genes entre populações, resultantes de migrações ou de

transferência de gâmetas, de que as mutações são negligenciáveis, de que os indivíduos casam-se

aleatóriamente (população em panmixia) e de que a selecção natural não opera na população. Se todos

estes princípios se verificarem, o genótipo da população e as frequências alélicas permanecerão

inalteradas ao longo de gerações sucessivas, e a população diz-se que se encontra em equilíbrio de

Hardy-Weinberg.

MATERIAL E MÉTODOS

38

O modelo de Hardy-Weinberg baseia-se em duas equações, uma que calcula as frequências

alélicas e outra que calcula as frequências genotípicas. A equação p + q = 1 descreve as frequências

alélicas para um gene com dois alelos (o caso mais simples). Num organismo diplóide com os alelos A

e a num dado locus existem três genótipos possíveis: AA, Aa e aa. Usando o p para representar a

frequência de A e q para representar a frequência de a temos que a equação para a frequência

genotípica é p2 + 2 pq + q2 = 1, uma equação que descreve uma distribuição binomial.

Tabela 3.2 – Frequências de Hardy-Weinberg geradas pela união ao acaso de dois alelos, A e a, cujas

frequências são p e q, respectivamente.

A p

a q

A p

AA P2

Aa pq

a q

Aa pq

aa q2

3.3.4.3 – Desvios em relação à distribuição de Hardy-Weinberg – Teste de χ2

O qui-quadrado é um teste estatístico usado geralmente para comparar resultados observados

com o seu valor esperado, segundo critérios estatísticos. A fórmula usada para calcular o χ2 é (Fowler

e Cohen, 1992):

χ2 ∑ −=

esperadovaloresperadovalorobservadovalor

_)__( 2

Isto é, o χ2 é a soma do quadrado da diferença entre o valor observado e o esperado, dividida pelo

valor esperado.

O teste de χ2 é uma forma simples de quantificar o desvio esperado se uma hipótese se mostrar

verdadeira.

Os resultados foram tratados estatisticamente utilizando o programa informático CIA (Gardner

e Altman, 1989) para o cálculo de frequências e intervalos de confiança.

MATERIAL E MÉTODOS

33

Tabela 3.1 - Oligonucleótidos usados na reacção de PCR para a genotipagem do CYP3A4.

Variantes Sequência dos primers Posição na sequência Tamanho dos fragmentos

de PCR (bp)

CYP3A4*1B

1Bfw: 5’ -AAT GAG GAC AGC CAT AGA GAC AAG GcC A-3’

1Brv: 5’ -CAA TCA ATG TTA CTG GGG AGT CCA AGG G- 3’

788 – 815 a

909 – 882 a

122

1BCfw: 5’ – ACA ATC CAA CAG CCT CAC TGA ATC AC-3’

1BCrv: 5’ – GAA CAG TTA CTC ACA GAT AGA GGA GC-3’

1081 – 1106 a

1292 – 1267 a

211

CYP3A4*2 2fw: 5’ –AGA TTT GAT TTT TTG GAT CCA TTC TTT gTC-3’

2rv: 5’ -CAA ATC ACT GAA CTG TAT ATT TTA AGT GG- 3’

15801 – 15830 b

15951 – 15923 b

151

CYP3A4*3 3fw : 5’ -CCA GAT TCA GCA AGA AGA ACA AGG- 3’

3rv: 5’ -GAC TAA CCT GTG TTT CTT TAC AAG G- 3’

23194 – 23217 b

23367 – 23343 b

174

a Genbank, número de acesso D11131 b Genbank, número de acesso AF209389

RESULTADOS

39

4 – Resultados

4.1 – Identificação das variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3

Um resultado típico da análise por PCR-RFLP das mutações CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e

CYP3A4*3 é mostrado na figura 4.1. Em todas as variantes estudadas apenas foram encontrados

homozigotas CYP3A4*1A/CYP3A4*1A e heterozigotas, não tendo sido encontrado nenhum

homozigota para a mutação.

Figura 4.1 – Caracterização das variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 por PCR-RFLP.

Os produtos amplificados foram analisados em gel de poliacrilamida antes (-) e depois (+) da digestão com a

respectiva enzima de restrição. A. Detecção do CYP3A4*1B usando a Bst NI como enzima de restrição. O

produto de amplificação inclui um fragmento de 122 bp usado para testar a presença do SNP e um fragmento

de 211 bp usado como controlo positivo (C). B. Detecção da variante CYP3A4*2 com a Alw26 I. C. Detecção

do CYP3A4*3 usando a Nla III. M, marcadores do peso molecular V ou IX (Roche Biochemicals).

1A/1A 1A/1B M

+ _ Bst NI

A.

213 bp

124/123 bp

184 bp

104 bp

C

SNP

1A/1A 1A/2 M

+ _ Alw 26 I

B.

124/123 bp

184 bp

104 bp

1A/1A 1A/3 M

+ _

Nla III C.

194 bp

118 bp

RESULTADOS

40

4.2 – Análise estatística dos resultados

Neste trabalho foram genotipados 131 indivíduos da população Caucasiana Portuguesa para os

SNPs CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3.

O genótipo CYP3A4*1A/CYP3A4*1A, correspondente em cada caso à ausência da mutação

estudada, surgiu como sendo a combinação preponderante observada na análise do CYP3A4*1B

(92,4%), CYP3A4*2 (91,6%) e CYP3A4*3 (74,8%) (ver tabela 4.1).

Tabela 4.1 – Frequências genótipicas para as variantes do CYP3A4.

Genótipo Número de indivíduos Frequênciaa

CYP3A4*1A / CYP3A4*1A 121 0,924; 0,864 – 0,963

CYP3A4*1A / CYP3A4*1B 10 0,076; 0,037 – 0,136

CYP3A4*1B / CYP3A4*1B 0 0

Σ 131 1,000

CYP3A4*1A / CYP3A4*1A 120 0,916; 0,855 – 0,957

CYP3A4*1A / CYP3A4*2 11 0,084; 0,043 – 0,145

CYP3A4*2 / CYP3A4*2 0 0

Σ 131 1,000

CYP3A4*1A / CYP3A4*1A 98 0,748; 0,674 – 0,822

CYP3A4*1A / CYP3A4*3 33 0,252; 0,178 – 0,326

CYP3A4*3 / CYP3A4*3 0 0

Σ 131 1,000

a CI = 95%

RESULTADOS

41

Em relação às frequências alélicas encontradas os valores calculados estão apresentados na

tabela 4.2. Entre as variantes estudadas, a variante CYP3A4*3 apresentou-se como sendo a mais

frequente na população Portuguesa (12,6%), isto após a frequência correspondente à sequência de

referência CYP3A4*1A.

Tabela 4.2 – Frequências alélicas das mutações CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 na população

Caucasiana Portuguesa.

CYP3A4*1B CYP3A4*2 CYP3A4*3

A G T C T C

Número de

alelos

252 10 251 11 229 33

Frequência

alélica

(95% CI)

0,962 (0,931 – 0,982)

0,0382 (0,0185 – 0,096)

0,958 (0,926 – 0,979)

0,042 (0,0212 – 0,0739)

0,874 (0,834 – 0,914)

0,126 (0,0858 – 0,166)

O cálculo da frequência genotípica esperada para cada uma das variantes efectuou-se segundo

o princípio de Hardy-Weinberg e os resultados obtidos encontram-se representados na tabela 4.3. Aos

valores obtidos aplicou-se o teste de cqui-quadrado, cujos valores também se encontram apresentados

na tabela 4.3.

O conjunto dos resultados obtidos para as variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3

revela que a população estudada se encontra em equilíbrio de Hardy-Weinberg. O valor de p para o χ2

calculado é p > 0,05 (ver tabela 4.3), pelo que os desvios que possam existir em relação às frequências

esperadas serão devido ao acaso e não a outros factores (mutações, selecção natural, entre outros).

RESULTADOS

42

Tabela 4.3 – Resultados do teste do ajustamento χ2 utilizado na determinação dos desvios às

frequências esperadas pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg numa população de 131 indivíduos

portugueses de origem caucasiana.

Frequência Genotípica

Genótipo Observada Esperada χ2 Graus de

liberdade

p

CYP3A4*1B *1A/*1A 0,924 0,9254

Transição *1A/*1B 0,076 0,0731 1,517 x 10-3 2 0,9993

A → G *1B/*1B 0 0,0014

CYP3A4*2 *1A/*1A 0,916 0,9178

Transição *1A/*2 0,084 0,0805 1,918 x 10-3 2 0,9991

T → C *2/*2 0 0,0018

CYP3A4*3 *1A/*1A 0,748 0,7639

Transição *1A/*3 0,252 0,2202 2,08 x 10-2 2 0,9909

T → C *3/*3 0 0,0159

DISCUSSÃO

43

5 – Discussão dos resultados

O CYP3A4 é o citocromo P450 mais abundante no fígado, apresentando uma grande

variabilidade interindividual atribuída quase na totalidade a factores genéticos. No entanto, só

recentemente, foram descritas variantes polimórficas para o CYP3A4 que podem estar na base das

variações existentes.

Os resultados apresentados constituem os primeiros dados sobre a caracterização da população

Portuguesa no que diz respeito ao gene polimórfico CYP3A4, assim como, representam a validação do

método de PCR-RFLP desenvolvido para as variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3. O

protocolo descrito para o CYP3A4*2 é também o primeiro apresentado até à data que se baseia nesta

aproximação experimental.

No que diz respeito ao CYP3A4*1B os dados obtidos mostram que esta é uma variante que está

presente com uma baixa incidência na população Portuguesa (3,8%). Quando comparamos a

frequência alélica obtida neste estudo com as obtidas noutras populações (ver tabela 5.1) esta

apresenta-se como sendo significativamente menor (p < 0,01) do que a observada numa população

Caucasiana Americana (Rebbeck et al., 1998), mas em relação a outras populações recentemente

caracterizadas a diferença não é estatisticamente significativa (Ball et al., 1999; Westlind et al., 1999;

Sata et al., 2000; Tayeb et al., 2000; van Schaik et al., 2000).

A variante CYP3A4*2 foi observada na população Portuguesa com uma frequência de 4,2%, o

que não é significativamente diferente do observado inicialmente na população Finlandesa (ver tabela

5.1) (Sata et al., 2000). Tendo sido apenas descrita na população Finlandesa, foi sugerido que esta

seria uma mutação específica desta população, uma vez que esta apresenta diferenças em termos de

hereditariedade genética em relação às outras populações (Eiselt et al., 2001). Os dados obtidos para a

população Portuguesa demonstram que esta hipótese não se verifica e estudos futuros noutras

populações poderão também demonstrá-lo.

DISCUSSÃO

44

Tabela 5.1 – Frequências alélicas das variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 em populações

Caucasianas.

Alelos População Número de alelos

Frequência alélica

Referências

US Caucasiansa 188 0,096 (0,058 – 0,147)

Rebbeck et al., 1998

White Americansa 546 0,036 (0,03 – 0,09)

Ball et al., 1999

Hispanic Americansa 376 0,093 (0,070 – 0,012)

Ball et al., 1999

CYP3A4*1B Sueca 78 0,039 (0,008 – 0,108)

Westlind et al., 1999

Finlandesa 118 0,042 (0,014 – 0,096)

Sata et al., 2000

Escocesa 202 0,05 (0,03 – 0,09)

Tayeb et al., 2000

Holandesa 398 0,053 (0,033 – 0,080)

van Schaik et al., 2000

Portuguesa 262 0,038 (0,019 – 0,069)

Este estudo

CYP3A4*2

Finlandesa 110 0,027 (0,006 – 0,078)

Sata et al., 2000

Portuguesa 262 0,042 (0,021 – 0,074)

Este estudo

Holandesa 998 0,011 (0,0056 – 0,020)

van Schaik et al., 2001

CYP3A4*3 Alemã e Suíça 852 0,0047 (0,0012 – 0,012)

Eiselt et al., 2001

Portuguesa 262 0,126 (0,0858 – 0,166)

Este estudo

a As designações “US Caucasians” (Rebbeck et al., 1998), “White Americans” (Ball et al., 1999) e

“Hispanic Americans” (Ball et al., 1999) são mantidas dos artigos originais.

DISCUSSÃO

45

No caso do CYP3A4*3 a frequência alélica obtida foi de 12,6%, um valor significativamente

maior do que aquele que foi obtido para as outras duas mutações nesta população. Quando comparada

com os valores obtidos em estudos na população Holandesa (van Schaik et al., 2001) ou na população

Alemã e Suíça (Eiselt et al., 2001), a frequência obtida na população Portuguesa não apresenta

diferenças significativas (ver tabela 5.1). Este estudo confirma também uma recente sugestão de que

esta mutação representa uma variante polimórfica e não um alelo raro, como havia sido inicialmente

considerado (Sata et al., 2000; van Schaik et al., 2001).

Assim, no conjunto as variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 representam uma

frequência não negligenciável de cerca de 20 – 21% dos SNPs do CYP3A4 encontrados na população

Portuguesa.

No estudo realizado foi observada a existência de indivíduos que se apresentam como sendo

heterozigotas tanto para a mutação CYP3A4*1B, assim como para a CYP3A4*3. Na população

estudada, para o CYP3A4*1B em 10 indivíduos 6 apresentam também a mutação CYP3A4*3. Assim,

como a frequência alélica obtida para o CYP3A4*1B é baixa, a existência, ou não, de uma associação

entre as duas mutações deverá ser verificada através do estudo de uma população em que a incidência

da variante CYP3A4*1B seja maior, como é o caso da população negra. Se nesta população se

verificar a existência de indivíduos com ambas as mutações será necessário confirmar se ambas as

mutações se encontram localizadas no mesmo cromatídio. Isto poderá ser feito se forem encontrados

homozigotas para a mutação em qualquer uma das mutações, existindo assim a certeza de que as duas

mutações estão no mesmo cromatídio.

Deste modo, os métodos desenvolvidos neste estudo, tendo como base a metodologia de PCR-

-RFLP, poderão ser importantes na caracterização de outras populações, assim como poderão

representar ferramentas importantes para um futuro ajustamento da terapêutica, uma vez que as

variantes aqui caracterizadas poderão prejudicar o metabolismo de drogas mediado pelo CYP3A4.

Embora existam resultados contraditórios no que diz respeito ao efeito da mutação CYP3A4*1B na

expressão da proteína (Rebbeck et al., 1998; Westlind et al., 1999), a proteína expressa para o

DISCUSSÃO

46

CYP3A4*2 demonstrou ter um metabolismo alterado em relação à nifedipina (Sata et al., 2000). No

caso da enzima CYP3A4*3, esta apresenta uma actividade enzimática alterada perante a testosterona e

progesterona (Eiselt et al., 2001).

No entanto, não pode ser excluído o efeito destas mutações (S222P, M445T) na metabolização

de outros xenobióticos ou drogas de uso terapêutico. As variantes do CYP3A4 constituem, por outro

lado, potenciais factores para a susceptibilidade à doença. Esta associação a doenças foi já sugerida

para a variante CYP3A4*1B no caso da leucemia (Felix et al., 1998) e do cancro da próstata (Rebbeck

et al., 1998; Walker et al., 1998; Paris et al., 1999).

Deste modo, a genotipagem destes SNPs do CYP3A4 poderão ser uma ferramenta importante

para a optimização da dose de drogas administrada, assim como na determinação da susceptibilidade

de cada indivíduo para a doença.

CONCLUSÃO

47

6 – Conclusão

O polimorfismo genético existente no CYP3A4 poderá contribuir para a variabilidade

interindividual existente em termos de actividade enzimática, pelo que a detecção das variantes

polimórficas é importante para um melhor conhecimento da resposta individual às várias drogas. O

trabalho aqui descrito contribui para um melhor conhecimento desta variação, nomeadamente que:

♦ as variantes CYP3A4*1B, CYP3A4*2 e CYP3A4*3 estão presentes na população Portuguesa,

embora no caso das duas primeiras com baixa incidência (3,8 e 4,2%, respectivamente). A terceira

variante estudada, CYP3A4*3, apresentou-se como sendo a predominante na população

estudada(12,6%), o que confirma o facto desta mutação ser uma variante polimórfica, e não um

alelo raro.

♦ no total, as variantes estudadas representam uma frequência total de cerca de 21% na população

estudada.

♦ os métodos desenvolvidos são válidos e, deste modo, poderão ser usados para estudos noutras

populações, assim como no estudo de patologias.

♦ existe uma possível associação entre a variante CYP3A4*1B e a CYP3A4*3.

Deste modo, uma vez que é provável que as variantes do CYP3A4 possam influenciar a

metabolização de várias drogas, afectando a eficácia, assim como a toxicidade, estes são dados

importantes para o ajustamento da terapêutica.

O trabalho futuro passará pelo estudo da incidência de variantes do CYP3A4 que sejam descritas

como afectando a actividade enzimática ou o metabolismo de compostos exógenos ou endógenos de

modo significativo, e desenvolvimento de métodos para o estudos das mesmas. Outra vertente passará

também pelo estudo de possíveis associações dessas mutações com diversas patologias, sendo aqui

também importante verificar a relação destas patologias com as variações recentemente descritas nos

receptores nucleares que potencialmente regulam a expressão do CYP3A4 (Zhang et al., 2001). Por

fim, existe a necessidade de confirmar a possível associação entre a variante CYP3A4*1B e a variante

CYP3A4*3 numa população em que seja observada uma maior incidência da primeira mutação

(CYP3A4*1B).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7 – Referências Bibliográficas

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Anexo I Sequência do promotor do gene CYP3A4 gfedc 1: D11131. Human cytochrome ...[gi:219569]

LOCUS HUMCYP3A4 1345 bp DNA PRI 14-APR-2000 DEFINITION Human cytochrome P-450IIIA4 gene, partial sequence. ACCESSION D11131 VERSION D11131.1 GI:219569 KEYWORDS P-450 IIIA4; cytochrome P-450. SOURCE Homo sapiens (library: Charon 4A library of T. Maniatis.) adult liver DNA, clone p32B. ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 1345) AUTHORS Hashimoto,H., Toide,K., Kitamura,R., Fujita,M., Tagawa,S., Itoh,S. and Kamataki,T. TITLE Gene structure of CYP3A4, an adult-specific form of cytochrome P450 in human livers, and its transcriptional control JOURNAL Eur. J. Biochem. 218 (2), 585-595 (1993) MEDLINE 94094853 COMMENT Submitted (13-May-1992) to DDBJ by: Hisashi Hashimoto Department of Division of Drug Metabolism Faculty of Pharmaceutical Sciences of Hokkaido University N12 W6, Kitaku Sapporo, Hokkaido 060 Japan Phone: 011-709-6390 Fax: 011-709-6390. FEATURES Location/Qualifiers source 1..1345 /organism="Homo sapiens" /db_xref="taxon:9606" /tissue_type="Liver" /clone_lib="Charon 4A library of T. Maniatis." /dev_stage="Adult" misc_feature 810..819 /note="'P-450NF specific element (NFSE)'" CAAT_signal 843..848 enhancer 1054..1069 /note="'basic transcription element (BTE)'" TATA_signal 1076..1081 exon 1104..1278 /note="'minor'" /number=1 /evidence=experimental exon 1105..1278 /note="'major'" /number=1 /evidence=experimental exon 1106..1278 /note="'minor'" /number=1 /evidence=experimental intron 1279..>1345 /number=1 BASE COUNT 353 a 314 c 356 g 322 t

ORIGIN Chromosome 7. 1 ctgcagtgac cactgcccca tcattgctgg ctgaggtggt tggggtccat ctggctatct 61 gggcagctgt tctcttctct cctttctctc ctgtttccag acatgcagta tttccagaga 121 gaaggggcca ctctttggca aagaacctgt ctaacttgct atctatggca ggacctttga 181 agggttcaca ggaagcagca caaattgata ctattccacc aagccatcag ctccatctca 241 tccatgccct gtctctcctt taggggtccc cttgccaaca gaatcacaga ggaccagcct 301 gaaagtgcag agacagcagc tgaggcacag ccaagagctc tggctgtatt aatgacctaa 361 gaagtcacca gaaagtcaga aggatgcata gcagaggccc agcaatctca gctaagtcaa 421 ctccaccagc ctttctagtt gcccactgtg tgtacagcac cctggtaggg accagagcca 481 tgacagggaa taagactaga ctatgccctt gaggagctca cctctgttca gggaaacagg 541 cgtggaaaca caatggtggt aaagaggaaa gaggacaata ggattgcatg aaggggatgg 601 aaagtgccca ggggaggaaa tggttacatc tgtgtgagga gtttggtgag gaaagactct 661 aagagaaggc tctgtctgtc tgggtttgga aggatgtgta ggagtcttct agggggcaca 721 ggcacactcc aggcataggt aaagatctgt aggtgtggct tgttgggatg aatttcaagt 781 attttggaat gaggacagcc atagagacaa gggcaagaga gaggcgattt aatagatttt 841 atgccaatgg ctccacttga gtttctgata agaacccaga acccttggac tccccagtaa 901 cattgattga gttgtttatg atacctcata gaatatgaac tcaaaggagg tcagtgagtg 961 gtgtgtgtgt gattctttgc caacttccaa ggtggagaag cctcttccaa ctgcaggcag 1021 agcacaggtg gccctgctac tggctgcagc tccagccctg cctccttctc tagcatataa 1081 acaatccaac agcctcactg aatcactgct gtgcagggca ggaaagctcc atgcacatag 1141 cccagcaaag agcaacacag agctgaaagg aagactcaga ggagagagat aagtaaggaa 1201 agtagtgatg gctctcatcc cagacttggc catggaaacc tggcttctcc tggctgtcag 1261 cctggtgctc ctctatctgt gagtaactgt tcaggctcct cttctctgtt tcttggactt 1321 ggggtcgtaa tcaggcctct ctttt // Primers 1Bfw e 1Brv Primers 1BCfw e 1BCrv Sequência do gene CYP3A4

gfedc 1: AF209389. Homo sapiens cyto...[gi:6644371] LOCUS AF209389 26502 bp DNA PRI 26-JUL-2001 DEFINITION Homo sapiens cytochrome P450 IIIA4 (CYP3A4) gene, exons 1 through 13 and complete cds. ACCESSION AF209389 VERSION AF209389.1 GI:6644371 KEYWORDS . SOURCE human. ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 26502) AUTHORS Hsieh,K.P., Lin,Y.Y., Cheng,C.L., Lai,M.L., Lin,M.S., Siest,J.P. and Huang,J.D. TITLE Novel mutations of CYP3A4 in Chinese JOURNAL Drug Metab. Dispos. 29 (3), 268-273 (2001) MEDLINE 21098888 PUBMED 11181494 REFERENCE 2 (bases 1 to 26502) AUTHORS Hsieh,K.P., Cheng,C.L., Lai,M.D. and Huang,J.D. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (30-NOV-1999) Pharmacology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 1 University Road, Tainan, Taiwan 70101, R.O.C. FEATURES Location/Qualifiers source 1..26502 /organism="Homo sapiens" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="7" /map="7q21-q22.1" exon <1..71 /gene="CYP3A4" /number=1 mRNA join(<1..71,4004..4097,6009..6061,11502..11601, 13956..14069,14335..14423,15689..15837,16932..17059, 17744..17810,20166..20326,21912..22138,23198..23360, 25950..>26502) /gene="CYP3A4" /product="cytochrome P450 IIIA4" CDS join(1..71,4004..4097,6009..6061,11502..11601, 13956..14069,14335..14423,15689..15837,16932..17059, 17744..17810,20166..20326,21912..22138,23198..23360, 25950..26045) /gene="CYP3A4" /codon_start=1 /product="cytochrome P450 IIIA4" /protein_id="AAF21034.1" /db_xref="GI:6644372" /translation="MALIPDLAMETWLLLAVSLVLLYLYGTHSHGLFKKLGIPGPTPL PFLGNILSYHKGFCMFDMECHKKYGKVWGFYDGQQPVLAITDPDMIKTVLVKECYSVF TNRRPFGPVGFMKSAISIAEDEEWKRLRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNL RREAETGKPVTLKDVFGAYSMDVITSTSFGVNIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFDFLDP FFLSITVFPFLIPILEVLNICVFPREVTNFLRKSVKRMKESRLEDTQKHRVDFLQLMI DSQNSKETESHKALSDLELVAQSIIFIFAGYETTSSVLSFIMYELATHPDVQQKLQEE IDAVLPNKAPPTYDTVLQMEYLDMVVNETLRLFPIAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGV VVMIPSYALHRDPKYWTEPEKFLPERFSKKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALM NMKLALIRVLQNFSFKPCKETQIPLKLSLGGLLQPEKPVVLKVESRDGTVSGA" gene <1..>26502 /gene="CYP3A4" exon 4004..4097 /gene="CYP3A4" /number=2

exon 6009..6061 /gene="CYP3A4" /number=3 exon 11502..11601 /gene="CYP3A4" /number=4 exon 13956..14069 /gene="CYP3A4" /number=5 exon 14335..14423 /gene="CYP3A4" /number=6 exon 15689..15837 /gene="CYP3A4" /number=7 exon 16932..17059 /gene="CYP3A4" /number=8 exon 17744..17810 /gene="CYP3A4" /number=9 exon 20166..20326 /gene="CYP3A4" /number=10 exon 21912..22138 /gene="CYP3A4" /number=11 exon 23198..23360 /gene="CYP3A4" /number=12 exon 25950..>26502 /gene="CYP3A4" /number=13 BASE COUNT 7293 a 5226 c 5275 g 8708 t ORIGIN 1 atggctctca tcccagactt ggccatggaa acctggcttc tcctggctgt cagcctggtg 61 ctcctctatc tgtgagtaac tgtccaggct cctcttctct gtttccttgg acttggggcg 121 ctaatcacgc ctctctttcc cttatctgga ttgaagatca aaaaagatgt tcaggccggg 181 cgtggtggct tacacctgta atcccagcac tttgggaggc taaggcaagt ggactgcctg 241 aggtcaagag tccaagacca gcctggctaa catggcgata ctctgtctct actaaaaata 301 caaaaattag ctgggcatgg tggtgcacgc ctgtattccc agttacttgg gaggctgagg 361 caggagaatt gcttgaaccc ggcaggcgga ggttgcagtg agctgagatc atgccagtgc 421 acttcagcct gggtgacaga gtgaggctgt cttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagatg 481 ttcaaggagc agtagcttaa gtgttggatg ctacaaacat atagaggtta ttgtagatct 541 tatgcagctc tataaaggaa taaataagca tcttccccat ccatctttag tggcaagaag 601 ggttttggga tagcattgat tgaggatgat ctacttgaca atagtttgga cccaaggagg 661 ataaggaagg aaagtagtga cggatctcat tccaaacttg gctgtggaaa cctggcttct 721 ccttactaaa ctagaatttg gattttacat tttccccttt atgttgcagt agaagaggat 781 gaatcctctc actggtggga tcctgccatc ctagagcagg tagagagaag agtcactccc 841 cactgtgggt agtggaggct tctcacatgt cacatttcac ttctacctca atttcactct 901 tactaagatt tgggaatcat aatgacagga aaatagaaaa tataaacctc attttaattc 961 tttcacagaa aggttagaaa ttcagtgagt tgtggcaaca tattttccat cttctgacct 1021 tttaacacta attgatatgg cttaaattca ttctatttta aaccagattt ttttggagat 1081 agtctatttc caacatgttc cttctaggtg acaaatgagg gctgttagtt cagtatttgt 1141 tacaataaat gtgtgtaaaa taacctcacc tttccagaat catgtcagga atatgaatct 1201 aatgcacaaa tgtataactc tatgacaaga ttgcatatat cttttaaaat ataccttccc 1261 aacgttcatt ttaatacccc tatttcaaac aaacctgctt agcaggttat gttaaacgct 1321 cagggcagag gagtaagcaa gactgtgagc cagtgatgac agcaaaagca tccaggtagg 1381 atcaaaatgg agtaagaaaa tattcctcat ccctcagggt agaactccaa agagatattc 1441 atgggtcctg gccccgtagt ggaggtcact caaaggacaa acatgtttgc atctcatctg 1501 cttgaagcct ggacacagag gcaccatctg tgtcactctg tgtgtggtct gccatgttgt 1561 ggggtggtca ctacagactc acagactagg cagctgggca gacaatacct tagccttaga 1621 tgatgctgat gcagcccagg agtcagaaac tgtagtgcag acaatgccct ccttaggcca 1681 acacaattaa gtgcaataga tgactggctt ttctgttagc ctcttcattg gaaccaaaag 1741 cagcattact ctaccaaaca gaggggagct ggaaagaaac tacacagttt gcccagccta

1801 gcctctgcct tgacacggaa ccatgtgagt ctagacattc acctagatca ttccttgggg 1861 accaatgcta ctgacacatt aactcaatag tttgtcctgg cctgagaggt catgtaactt 1921 gtagaaagtt tagaagcaga gattagtgtc atttatttgc catggctgtg acaacaaagg 1981 aaggaacagg agtgggaaaa cccaaggcca ccctggtttt ggtagatggt gcacacgctt 2041 ccactagctg ttctggggca aagatccaaa tgcactattg ggcctggcta tgctgcttct 2101 gctgggtccc ccaaacatga gcctccacgc catttctcag ttgtatttta ccacatatta 2161 tcacagtcac cggatttgta cagaatattt ggaacctata ctgtcttaag ggctaccctt 2221 taaagaagag aaaacaaggt tttaattcaa ctgtctggaa cattttatgt ttacttatgt 2281 ggaatactac atcttttgtt ataaacagga gggaatgtgg acattcgaag gcccctacct 2341 tttagctaaa agcccatatg aagcatatgg atccatttat acacaccatg cttttcagct 2401 acattttcct aatttgcctc tctggggcca accttgtggg actagcagat tcatggttga 2461 gttgaaggat ggtgacctct tccatcagct tttcttcttc ctccagtctt ccaaccctca 2521 gtaacatcag actgggaagg tcttcagaca tccagaaacc ccagttcggg gagttcatac 2581 atgacccatc aaagatgagt tgcaagcagg cctgccttag ggagcaccag ccttaatggg 2641 ttttcctaca gagatagttg atgggcagat gcaataaact gactgctttg tgattgacca 2701 ccttgagaaa aatagcatgt ctggctatgt tagtcttttc ttgcattgtt ataaagaaat 2761 accagagtct gggtatttat aaagaaaagg gatttaattg tctcatggtt ctgcaggctg 2821 tacagaaagc atagtgactt cttcctctag ggaggtctcg ggaaatttac aatcatggca 2881 gaaggtgaag gagaagcaga cagatcttac atggctggag cagaagcaag agaggctggg 2941 gagaaggcgc cacacattca aaccaccaga tctcataaaa actcattgtc acgaggacaa 3001 cacctaaggc gggatggtgt gaaacgatga gaaactgccc ctaggatcca atcatctcct 3061 accaggcccc acctccagta ttggggattg catttcaaca tgagattttg gtaggggcac 3121 agattcagac catatcactg gcactgtgct aatcagatga atatcaccag ttggaaggct 3181 agattccaca agaggaggaa tgacctggaa attggttctt tagttgtgat tcttctgcac 3241 actgtcattc agggaaatat gagtcaatca tccttcccaa taggtcaaat caaccagatc 3301 atctgatcat agagactgag gtgtagctga aagctgctca catttctatg aggtcaatgg 3361 aagccttgag cacagttgtc aatctgtaga aataaggact ctgtgactcc tccaagacct 3421 ctctgtgaat gacggtttaa gaagaaccag atcctaaaac agggtcagag cttagaggga 3481 agggaaagca taaaagcctc tgagcaaatt ctaaagacag ggtcaccata ggctctcagt 3541 gaccctctgt gactgagtgg ctgcagtgat gcaaaatctc atcatcactg cggaagacaa 3601 aaaaatgtca ccctttctac ctaggatgag aatccccaaa tttggggaga ggccacttac 3661 taaatagacg taaaggaaca aagtgacctg gaagaattcc tgcctgaacc tctcaggatc 3721 attcacattt gagaacattt atcaaatatt cattccagga ctgggaccat gaagacttca 3781 gctgctttga gctaatcatt gtaacttttt ggtgtctcat ggtggaggca ggaaaggacc 3841 tgatgaacaa atataatcat tgccgtcaga gttactgtta ttatttcttg ccttaatgtt 3901 acctcgttct cttgagcatt ccagttcctc agtcaatgac tcatcaaccc ctatatctat 3961 aaagtcacaa tcgctgtgac ttgatttctg tttcactttg tagatatgga acccattcac 4021 atggactttt taagaagctt ggaattccag ggcccacacc tctgcctttt ttgggaaata 4081 ttttgtccta ccataaggtg agtgtttttg agctcactct tttgcttctt atgattgcca 4141 agagcagctt agttccatca gtaaaaatgc ttctcctcag ggggaaggtc tgaagtttta 4201 cactttcaga aacagtgtgt aggcatcacc cagaacatgg caatgtttac ccaagggctc 4261 tcttgctaac tctcaggaac ctcaggtttg cctcagttga acagcccaaa tctcaggtag 4321 atcagcaacc tgatgctcag aacttgatgt gcaaactttg tgagcgcgcc ataaagaagg 4381 ttttcttttt gctctatgca ggttcccagg aaggtacagt catacttagt tagtattaaa 4441 agtaggaaaa ggaccccctg attgtgactt gttatctgtg tacatgagag tcaaactttc 4501 ctctctgtag caagagctct tgagtagcct tttttccctt ccttctggac agctttgaaa 4561 ctcaatttat tagggagccc aggtatttac ctttgggtca tttgcacctg cttcaatcct 4621 ctccgaaaaa tgctaaattc cctgagggta tctccatggc tctaccccag ctcttactcc 4681 ccatgacatc ttttgcagct ttgagagaca gaacaaaggg gttctgcttt atttcttttc 4741 cttcaaaggc tgcaccttat gggtgagact gatcacagac tggatataac tgagatgaga 4801 cagtggtggt caatcaaact cagatattta agcacaaaat gagtttgtgg ggtttttttt 4861 tacacaaagg cggaatcaca tgcaaaatca ctagaaaggg gatgatttga tgaaattatt 4921 aaatatttaa ttttgctgaa tagaatataa tatgtgccac gtggaccgtg aactttggcc 4981 gagcctttgt gcctaaccta gtctgatgct ctgcccaggg tctgggccct ggatggaaaa 5041 ttaggagccc atgtccacat ggccagccgc agcagtcagc tctttggctt acatcatctt 5101 tcccacatac ctgaggcttg tttctcagat tctaattctc tcaggtgagg gctttgttgt 5161 ctaattacta tccaggaatt tcatattttt tccctgtgca aaagcaataa tttccccgcc 5221 accttttcca ggtcaactct ttagtagatg tacccccaag atgcacattc ctgggacctt 5281 tgtttgcaca gttaaaatgt cacccctgaa atgtcgatac aggaaggttt gtttttaagt 5341 ttcagtgaaa actctgagca agtgttgtaa tttgctgtgt ccgatgtgta gaggggacat 5401 tttctcagaa cttccatgtt aagctggaaa actggaaagt gagttcactt tgtcattctg 5461 tcactcgttc attttctcac tcaacaacat gcctcatact tacctaaatc tgctagacta 5521 aaggagttcc ctggtgtctg tactttccaa ttctgctaga actctagagc gagctcatga 5581 aataaatgaa aaggatgaca aagagataaa acactgtgca ttctcttctg atgctaattc 5641 actttccctt ggcctcagtt tccccatgtg cccctggagg tgatcattca gggattcatg

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13501 gcacttcttt ttcacgttgc ccatgctgca ggagaacata aagacagctt gtctgaggca 13561 acatacaatc caccaaagtc acctgcttgt ctgtctccac tccgtctcta cactgcagaa 13621 gtgctaggtc ttgattctgt ttattgtact ggaagaacac attctctacc acgtggataa 13681 tttgcatgta aaagaagact gggatataga ggctggagac gacatcaggg tctcctgaac 13741 actgccgcca cccccccgcc ccgccccaca caaatacatc ccaggacact gggcatctgg 13801 gataaatctc tattgagcat ctagcatagg gcccatcacc cagtagacag tcactaaata 13861 gttgttgaat aagtgttcct gtttaacaca ttttctacaa ccatggagac ctccacaact 13921 gatgtaggac aaaatgtttc tgctttgaac tctagccttt tggtccagtg ggatttatga 13981 aaagtgccat ctctatagct gaggatgaag aatggaagag attacgatca ttgctgtctc 14041 caaccttcac cagtggaaaa ctcaaggagg tatgaaaata acatgagttt taataagaaa 14101 cttaaagaat gaatctggtg gggacaggta taaaataaga tcacagtccc tttccaaggg 14161 gtagtccact gaatttgagc tgcctaaaaa tggtctttta tctttatgta cagaaaacac 14221 atcacaaaat tcattataaa atgtcactta ctgctccatg ctggggaaag ccatgtcctt 14281 ctgggactag agtctgcaca tttaactatg ggtggtgttg tgttttgtgc ttagatggtc 14341 cctatcattg cccagtatgg agatgtgttg gtgagaaatc tgaggcggga agcagagaca 14401 ggcaagcctg tcaccttgaa agagtaagta gaagcgcagc catggggttc tgagctgtca 14461 tgaacccctc cagctgcctg ccatggagct gatattcctg ctgttgggtt attccagtga 14521 ccagacaaaa ggagggctgt ggtaatgcaa cttcaatggg tctcccaaga tggggcagct 14581 ccgatgagga ggtggggcag ctggaggaaa aggatcttct cccctgtgca caggggccag 14641 ggtttacata tccattaaat tgtcaccttg gatattctag aagactaaat atatccttta 14701 gggggaaaaa gtgtgattgt accaaagttt taagcatgga gtgtatggga tggtggaagg 14761 ggaaggcact tggtatctgt tggttggcag tgagtaggtt gggagagtta taatggagaa 14821 cttagaataa ctttgatcat ttcatgtttt tttctgagga tatcagtaga atactaaata 14881 ttaaaattcc taccatttct ttttcctcca gtctcaaaga gagagggtgg taaaaacact 14941 ataggtaggg caagcctatt atttgctatc tacacttatg cagtaaaaac aggtgtaatc 15001 tgagtttgtc ctgggcagac cagggatatg tggtcactca ctatagaaat ttccaaatca 15061 aattttgaga gatttttttt taaccaggac attattggtc attatatttt acaaaaataa 15121 ttctgctgtc agggcaacct cagctcacca cagctgggga tagtggaatt ttccaaagct 15181 tgagcaggga gtatagagaa taaggatgat atttctagga gctcagaaca gggtactgtt 15241 gctttgtaaa gtgctgaaga ggaatcggct ctgggcatag agtctgcagt caggcaatat 15301 cacctgtctt gagcccctta ggaagagtta attattctac tcttgttctg ctgaagcaca 15361 gtgcttaccc atcttgtatc atccacaatc aatacatgct actgtagttg tctgatagtg 15421 ggtctctgtc ttcctatgat gggctccttg atctcagagg taggtctaat tcagttcagt 15481 gtctccatca cacccagcgt agggccagct gcatcactgg cacctgataa caccttctga 15541 tggagtgtga tagaaggtga tctagtagat ctgaaagtct gtggctgttt gtctgtcttg 15601 actggacatg tgggtttcct gttgcatgca tagaggaagg atggtaaaaa ggtgctgatt 15661 ttaattttcc acatctttct ccactcagcg tctttggggc ctacagcatg gatgtgatca 15721 ctagcacatc atttggagtg aacatcgact ctctcaacaa tccacaagac ccctttgtgg 15781 aaaacaccaa gaagctttta agatttgatt ttttggatcc attctttctc tcaataagta 15841 tgtggactac tatttccttt aatttatctt tctctcttaa aaataactgc tttattgaga 15901 tataaatcac catgtaattc atccacttaa aatatacagt tcagtgattt gtagtacatt 15961 tgaagatatg tgtgaccatc atcattttaa actttaaaac tttttttgtc aatctagaga 16021 cctcatacat ttttagctat cagccccctg tcacaaaccc tgtcatcata tgcaaccact 16081 aatcaacttt ctgcttctat ggatttgcct attctggaca cttcatagaa atgatattaa 16141 ttcatcaggg ttttttattc tctagttcat gaatttgtac tttagtctgt atcattttct 16201 ttcttctgct ggcttcaggc ttagtttgcc cttcttcgtt tactatgttg tggcatgaac 16261 atagattact gatttgtgat ttttttgttc ctctaaattt agacattaca gctgtaactt 16321 tccctctgag cacttccttt gctaaatccc atgagattgt ggcctatcac atcttagttt 16381 tgttcacctc aaaacagttt ctatttgccc tttgggtttc tactttgact cattgggtac 16441 ttaaatgttt attatttaac ttccacatat gtgtgagttt ctcaattttc tttcccttat 16501 tgattttatc tttattccat gataggtgac agagatatgc tgtgttattt ctatcttgac 16561 tacctactat ttcttgaaca gcaagattaa ttttgagctt cagattatga tttgggttat 16621 tctaggagac tgtagtccaa tagataaagg caaagagatt agggcattga attttgttcc 16681 ttttatcctt caaaagatgc acaaggggct gctgatctca ctgctgtagc ggtgctcctt 16741 atgcatagac ctgcccttgc tcagccactg gcctgaaaga ggggcaaaag tcatagaagg 16801 aatggcttcc agttgagaac cttgatgtct tttactcttc tggttggtag agaaaactag 16861 aattgctcca ggtaaatttt gcacattcac aatgaatttc tttttctgtt tttgttttgt 16921 ttttcctaca gcagtctttc cattcctcat cccaattctt gaagtattaa atatctgtgt 16981 gtttccaaga gaagttacaa attttttaag aaaatctgta aaaaggatga aagaaagtcg 17041 cctcgaagat acacaaaagg taaaatgtgg tggtagttat aggaggatgt ttagtttttc 17101 ataatttttt agataatata catatgatca gtgcagttac ctgtatgttt ttaaagaatg 17161 cttttaacat gaagactgct catgtttaga gcaagagaat tcatttggta gaaatgcaga 17221 aagtggggtt tggggaagga gatatgagaa tgagtcagag acagcacatg aaatttgata 17281 tcagacacaa caattagtat gccacggcat aaattttatt gagataaaac tttaccactt 17341 tacttccctt caataaattg tcagaggata aacattactg tttggaaata tattttactg

17401 atattatgct ttccccagat cataaattgg taaagactca tttcaagtac aaacctgtta 17461 ttttacacat tctcaaatga aagtccctat caggccacct gctgaagtgt acgtgtgtta 17521 aatttgagcc atctcacatg atagccagat ttgtttcagg aaaacatcct gctttccaag 17581 gatttagaag ggtatgtttt tcactggtga ttcaggcaac atgcatcaga tttctggtct 17641 tcaaggagcc atattctcag aagggagatc aaggaccacg ctgtgattac ttctgacttc 17701 aggagccact ttctgtcagt gaaatttctc tttttgcttc tagcaccgag tggatttcct 17761 tcagctgatg attgactctc agaattcaaa agaaactgag tcccacaaag gtaaccagag 17821 tgtttctgag ggctacttgt ggggcactca gagggaaggc cttgttctga aaatgtgcag 17881 gaagtattcc aggatgatga gaatttctgc cacatagcag aacgacacat gtttgaatgt 17941 tataagtggt agttggaggc actttctaga ggcatgcagg catagatagc catgttctaa 18001 gagtaaaggg caaccctaag caaacctggc atgctagaaa gtcagtctgc ggtctgtgga 18061 tcacctacat cagatcaaat gccaattctc agcctccttc agatccactg aataaaaatt 18121 tctgcctaga aatttattag gttgctgcaa aattaattgt gggtttttcc attactttta 18181 attgcaaaaa aatgcaatta aaagtaatgg caaaaaccac aataactttt gcagctacct 18241 aatacatcta acatccaatc aggagccacg ctgttccaaa ggggtgattt taactggcag 18301 tacttgtgaa agtgtgttca ccaggtaatc tactgcaagt attttcactt tggaatggat 18361 agtaactgtg gggaaaacct ctgagaccgt gtaaatatcc tctttgtctt caatgttcca 18421 cctacgagtt ttacaaccca tgtatgtttt ttactgaagt cactattact atgacagtgg 18481 caaaatgatg accatggtca attacaagcc accaagactt ggcaaccatc tcacaaaatt 18541 cctgaatatt taactattgg ttctagagag caggactggg cttactccag catactgctt 18601 taaatatatc catgtctaca tccacttttg tctgtatgtc tatgtatcta tctatgtatc 18661 tatctagcta tgtatctatc tatctatcta tcatctatct atctatcatc tatccatcta 18721 tcatctatca tttatccatc tatcatctat ctacttatat attatctatc tatcatctaa 18781 ctattcatct atctatccca atataacttg ctgtgataaa ggaaatagtc tattgtttta 18841 ctgtttcata tagaaatcac tagacacata tggctattga gcactggata tgtggctagt 18901 gccattgaag atcaatttta aatggtattt cagtttaatt taataaaatt tgattttaaa 18961 tagccactag tgggtagtgg ctaccatatt ggacagcaga gctctaaact ttgagattat 19021 agttcaattt cacatcagta tcatcaggtt catgataact gaatactatg attaggtagt 19081 tgaatttact tataactgca tcacagaagt cttcactggt aaatcacagc tctgtcgacc 19141 tttctcacac tcctttcata ttggttttgg ttgtgaatta catggttgga gcaggcatta 19201 tatttatttc tatgttccag gtctctaaag gtcctaatcc agtcctgatc aaacagacca 19261 gtgatggacc atcctgagct tctctcagga gagaaatcaa gaggggccca acttgtaatc 19321 ataggagctt atgctatttt aatgccatcc atcagactac aatcaattac cactcatcta 19381 gctttttgtc catctctcat tcttgtacat cctgagatag tcaattctga gaactgtagc 19441 ctagatctat cacctgatgc ctctcaaaga tataatccgt gcttctcaag ctaggctatg 19501 cacacaaatc actgcatctt gtgaaagttc agattttgaa tcagtagttc aagggtgggg 19561 tttgagattt tgcatttcta aatgagctct caagatgctt ctgacccatg gaccacactt 19621 tgaataccaa gaagtggtct gtagaccaat attggtccct taagttccct caaacatatc 19681 ttcgggaaac gtcctttgat tttccctaca tttaaccatt agtgttgcaa attctctcaa 19741 agtttgtcaa gatatattgt agctaaaata aattacattt ttcttggggg agagtactac 19801 ctcatattaa cttacaataa agtactttta ggatcattca aggaacacac ccataacact 19861 gagtatgtta tgcggaaatg ctctctctgg aaattacaca gctgtgcagg tggcgggggt 19921 ggcatgagga ggagtggatg gcccacattc tcgaagacct tggggaaaac tggattaaaa 19981 tgatttgcct tattctggtt ctgtaagata cacatcagaa tgaaaccacc cccagtgtac 20041 ctctgaattg cttttctatt cttttccctt agggatttga gggcttcact tagatttctc 20101 ttcatctaaa ctgtgatgcc ctacattgat ctgatttacc taaaatgtct ttcctctcct 20161 ttcagctctg tccgatctgg agctcgtggc ccaatcaatt atctttattt ttgctggcta 20221 tgaaaccacg agcagtgttc tctccttcat tatgtatgaa ctggccactc accctgatgt 20281 ccagcagaaa ctgcaggagg aaattgatgc agttttaccc aataaggtga gtggatggta 20341 catggagaag gagggaggag gtgaaacctt agcaaaaatg cctcctcacc acttcccagg 20401 agaattttta taaaaagcat aatcactgat tctttcactg actctatgta ggaaggctct 20461 gaaaagaaaa agaaagaaac atagcaaatg gttgctactg gcagaagcgt aagatctttg 20521 taaaacgtgc tggctctggt tcatctgctt tctattacta caataatgct aagtaaaaaa 20581 cctccaaaaa cctcagtggc atctaacaat aagcatttgt tgctcacact catttcaatt 20641 ggttttggtt gtgaattaca tgtttgcagc aggcaccata gtggtgtgtg atgtcccctt 20701 agctgtatcc acatatggac acaggaattg gctcttttta tctcttttta ttttcttggt 20761 tacagacatg tgactttttt ttttgaaagg taacaatcac tttctcatat gttatttgat 20821 gctagtggtc atagcctata gtcacatttg tttcaatgag aaagaaaaac cagtacacgg 20881 ttatgctaag gatttcagtc cctggggtga gagccgtctc gaatgtctcc ccacttcata 20941 actcctccac acatcatagt tggatagtga gctctgctga tattggcagg acttgctctg 21001 gtctggctgt agtctgacgg agcctggccc tgggtgtgct gtgcaggctg actcagctct 21061 ccccacacct atctcatgtt ccagtcaggc agtaactggt gaagaagcca agctaggaac 21121 caggatatct ggctcctgag ctaaagtctt aaaacactat catattgcct tccaaatata 21181 acaccaaata ctaggtgcat atcaccctca ctgttttcag acctctgcca aaattgggat 21241 tctttgtggt atgaagagac acggctttgg ggctggcccg gctgtgacag tgaggtgaac

21301 acaaagggat gttcttcaga gattacagtc cagccctgaa gcaacaacta ggagactgat 21361 tgagcaagtg aggacagggc tgtgtggggt tctatcctct ttataacttc cactagcact 21421 gaaatcgtgt tctctggtta catccaacca gagccttctt tgtcattttt gggatagaaa 21481 gggactagtt tatcctcaaa ttatttatgg agattttata taatatagtg tttctctcca 21541 cattttctgt atataacaaa agtcctcctt ttagtgtgtg tatacacata tatatacaca 21601 tatatatgtg tgtgtgtatg tgtgtgtgta tatatatata cacatatata cacggttatg 21661 ctaaggattt cagtccctgg ggtgagagcc ttcccgaatg cttcccacct tcataactcc 21721 tccacacatc tcagtgggcc actgagcaca gcaatgggca tgacagttat taaaacactt 21781 tataaatgct tcgatccttt accagtatga gttagtctct ggagctccta atacttcatt 21841 agtactgcat ggactgagtt aaaagttaat tcaaaatctc aatttatcca aatctgtttc 21901 gttctttcca ggcaccaccc acctatgata ctgtgctaca gatggagtat cttgacatgg 21961 tggtgaatga aacgctcaga ttattcccaa ttgctatgag acttgagagg gtctgcaaaa 22021 aagatgttga gatcaatggg atgttcattc ccaaaggggt ggtggtgatg attccaagct 22081 atgctcttca ccgtgaccca aagtactgga cagagcctga gaagttcctc cctgaaaggt 22141 acaaggcccc tgggaaggga gccctccctg aaccagcctg gttcaagcat attctgcctc 22201 tcttaatcta caggacagtc atgtggttgt ataattattt gcttgtattt ttatatttag 22261 agattttttt aatcatcaaa ttgattattg tcacacttta caaaccatag actagaaaaa 22321 agaaaactac agtcatccac aattccaaca acttacgatg aaggtcatca gttatgtcct 22381 tatgggtcat cagtgtccaa aatgtaagga ctcttttaaa aacacatgat cacaatgcta 22441 ttattatgtc ccccaaatga atattttttt cataaatata atcaaatatt taggaataac 22501 attttaataa aaaacatgca tctaatcttc aaagaatttt atagcttact ggaacagata 22561 gacaaagaaa gcagggatga tactgcatta catcggtaca gtagcatcat atgcctgtgt 22621 aaattatctg acttcaacta ttctatggag gtgtggggga gaaagaggga gagatggaga 22681 gaagaagaag gaggagaagg agggagaaga caaggtaagg aggagaagga ggagaattag 22741 aaaaacaaga gaggagatga gaaggaaagt gcaaaataac aattttgaaa tagtacaaga 22801 caatttcccc ttctccttcc tcatgaccaa tgtaagtgtg acttgaggca ggaacctact 22861 tttccatcag tcagtcccat cacttatgtg ccttttatag tgtggacaca tcaccaccct 22921 gaatataatt tcagtgttta gaaataagta ttctttgcaa cactatttat ctcatctcaa 22981 caagactgaa agctcctata gtgtcaggag agtagaaagg atctgtagct tacaattctc 23041 atagcaaaat aagcatagca ggatttcaat gaccagccca caaaagtatc ctgtgtacta 23101 ctagttgagg ggtggcccct aagtaagaaa ccctaacatg taactcttag gggtattatg 23161 tcattaactt tttaaaaatc taccaacgtg gaaccagatt cagcaagaag aacaaggaca 23221 acatagatcc ttacatatac acaccctttg gaagtggacc cagaaactgc attggcatga 23281 ggtttgctct catgaacatg aaacttgctc taatcagagt ccttcagaac ttctccttca 23341 aaccttgtaa agaaacacag gttagtcaat tttctataaa aataatgttg tattaataat 23401 tcttttaact gagtggtctg tattttttaa aaagaatatg cttgtttaat cttttactaa 23461 tttgttctct gggccaaaga atcaattagg cccatctgtg atctttaagg gtgcttcagt 23521 tctggagttc aaaagctgta gcatcaaaaa catcatgtaa agcccatgta gattagcatg 23581 gcataattat ctgcagtctc cttgaacttg agcaaagtta cattcatttc aagtcgattg 23641 gaaagatggg gaagtatttt tgcacagtca tgaagtgtaa tgattacctt gttgtgactt 23701 ttgaatgctg ctcttcccaa ccagaacttg gagaagcttt ctcatgagag tggctcccaa 23761 ccactagctg tacattggaa tcaccaggga gctttaaaaa ttcatgatgt ctgggatatc 23821 acagaaattc taaactaatt tgcccagagt gtggctttaa aagcttcccc attgcttctc 23881 atgtgaagcc aaggttgaga atgactaatt taaggcattt ctggtggata taaaggacta 23941 ccacagtcca aggccatcct gactgacctc accttccagg tgcctagctc catccagctg 24001 ggctcctttt caacccaatt ataactctat taatgttgtt cccagccagg catggtggct 24061 catgcctgta atcccagcac tttgggaggc cgaagcaggc ggatcatgag gtcaggagat 24121 cgagaccatc ctggctaaca cggtgaaacc ccgtctctac taaaaataca aaaaattacc 24181 ctggagaggt ggcaggcacc tgtagtccca gctactctgg aggctgaggc aggagaatgg 24241 catgaacccc agggagcgga gcctgcagtg agccgagatt gggccactgc actccagcct 24301 gggtgacagc gagactctgt ctcaaaaaaa aaaaaatgtt gttccctttc tcctcatttt 24361 gttcttatct ttcaagtcct agttcaatcc ccaagcccct ccaaagtgtc ttctcctcct 24421 agtccagggc ccatttactt ctctgctctg ttattggata ctggaggcta ttatcataaa 24481 tttgacaatt tgccattaaa tcattgagtt ttattctcta tattttcttt gtatctaaaa 24541 tgtcttcccc cctccattaa caatatcctc tcattttatt cctttttaaa atatcccagt 24601 ggtgccttgc aagggactgt atctaatgca agcatttggt aaatgtttaa ggagtgatgt 24661 gcagttgatg gcttgcatac atatattaag ctatttaatg tgaaccttta aacaaatgcc 24721 attcgtgcat atgcatgtgt gtgtgtgtgt gtgcacatgt gggcatgcat gtctgtctgc 24781 agtgaaaata tattcagggt ttttgaaaat ttttaaataa taaggtatta tatttataga 24841 aagatttgaa atattttctc tgaagaagtt aaagaacaga cgtcattgat tcatattaaa 24901 caatacccta taaatcttat ttctaggtct catgtattta ttattcaatt ccacccctta 24961 agtgggcttt ctatatagga gaggaagaag acagaaatag tttccatatt atttccatat 25021 tccatattat ttgtggcttt aggccagcag tgtagctgta ttatatgtgc ccagacaggg 25081 gactcagccc tgaataaaag tggtcctctg gcacacctgg gatggggaag gtactccttg 25141 gtaagctccc aacctggcac ttcttgatct ccctggcaat tttcttgccc attactccat

25201 ggagatcaga atatcactct gttgtgtccc ctcaacacgg aaggagtgtc tcaataagaa 25261 tggggctaaa agttgagtcc aaacactgta ggaattgaga ggttccccac cttgcactac 25321 ccttggaagc caagagaaga tgttaaaaat aaaatggtaa tgcttcctga aggtgtcttc 25381 ccatctttac actggatggg ttcaattggg aggaattact ggactctgga agttgaagac 25441 tgtccatata attaaaatgt acaataacta cccaggttta ccttgcaagt ttcaacatac 25501 acaaaattaa ctttatatga ctcttcaaaa acagtttgcc atcataccta ataatctggt 25561 ttaaatttta aaaactcatc cattttactt aaaatttaaa tcaaaaaaga acacaggttt 25621 ccatgaattt gtctcaggcc tggcacagaa tagtactcca taaatatttt gttaaatgat 25681 agatgatgaa tgctctcact gtccaatctt cacacatctt atagactaag tataaagaat 25741 ccaagattta tagtgctgaa agtagttttt atatgtttac aaagcattat tgtcattact 25801 gcattttttt tgcccattac tccatagaga tcagaatatc actctgttgt gtcccctcaa 25861 cactgaagga gtgtctcact cactttgatg ctatactttc tacttttgtt tatttaatgc 25921 ttctcaatat gcttgtttaa ctgttgcaga tccccctgaa attaagctta ggaggacttc 25981 ttcaaccaga aaaacccgtt gttctaaagg ttgagtcaag ggatggcacc gtaagtggag 26041 cctgaatttt cctaaggact tctgctttgc tcttcaagaa atctgtgcct gagaacacca 26101 gagacctcaa attactttgt gaatagaact ctgaaatgaa gatgggcttc atccaatgga 26161 ctgcataaat aaccggggat tctgtacatg cattgagctc tctcattgtc tgtgtagagt 26221 gttatacttg ggaatataaa ggaggtgacc aaatcagtgt gaggaggtag atttggctcc 26281 tttgcttctc acgggactat ttccaccacc cccagttagc accattaact cctcctgagc 26341 tctgataaga gaatcaacat ttctcaataa tttcctccac aaattattaa tgaaaataag 26401 aattattttg atggctctaa caatgacatt tatatcacat gttttctctg gagtattcta 26461 taagttttat gttaaatcaa taaagaccac tttacaaaag ta //

Primers 2fw e 2rv Primers 3fw e 3rv

Anexo II Trabalho apresentado no âmbito do estudo desenvolvido.

Participação em Congressos

- Julho, 2000

13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations, Stresa, Italy.

- Setembro, 2000

XII Congresso Nacional de Bioquímica, Póvoa do Varzim, Portugal.

- Junho - Julho, 2001

27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies in collaboration with the PAN-

American Association for Biochemical Molecular Biology, Lisboa, Portugal.

- Setembro, 2001

12th International Conference on Cytochrome P450, La Grande Motte, France.

Comunicações

Cavaco I, Gil P, Ribeiro V. (2000) Analysis of CYP3A Gene Polymorphisms in a Portuguese

Caucasian Population. 13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations, abst. p.

112, 10, Stresa, Italy.

Cavaco I, Gil P, Ribeiro V. (2000) CYP3A Genetic Polymorphism in a Portuguese Caucasian

Population. XII Congresso Nacional de Bioquímica, abst. p. 53, P2.4, Póvoa do Varzim, Portugal.

Cavaco I, Gil P, Ribeiro V. (2001) Incidence of cytochrome P450 strutural variants, CYP3A4*1B

and CYP3A4*2, in the Portuguese population. 27th Meeting of the Federation of European

Biochemical Societies in collaboration with the PAN-American Association for Biochemical

Molecular Biology, abst. p. 65, PS6-027, Lisboa, Portugal.

Cavaco I, Gil P, Ribeiro V. (2001) PCR-RFLP analysis of cytochrome P450 3A4 polymorphism in

Portuguese. 12th International Conference on Cytochrome P450, abst. p.110, P 326, La Grande Motte,

France.

Cavaco I, Gil P, Ribeiro V. (2001) Cytochrome P450 3A4 and MDR1 genotyping in the

Portuguese population. 6th International Meeting of the International Society for the Study of

Xenobiotics (ISSX), abst. p. 219, 436 Munich, Germany.

Comunicações Orais

- Setembro, 2001

PCR-RFLP analysis of cytochrome P450 3A4 polymorphism in Portuguese. 12th International

Conference on Cytochrome P450, La Grande Motte, France.

Publicações

Cavaco I, Gil JP, Ribeiro V. PCR-RFLP identification of Cytochrome P450 3A4 polymorphism in the

Portuguese population. Submitted.

Anexo III Marcadores de peso molecular usados no trabalho para a identificação dos produtos resultantes

da digestão com os enzimas de restrição.

Marcador IX – 11 fragmentos: 72, 118, 194, 234, 271, 281, 310, 603, 872, 1078, 1353 bp

(Roche Biochemicals).

V

587 540 504 458 434

267 234 213192 184

124/123 104 89/80

64/57/51/ 21/18/11/8

4% Agarose

Gel

IX

1353

1078

872

603

310 281/271

72

1% Agarose

Gel

118

194234

Marcador V – 22 fragmentos: 8, 11, 18, 21, 51, 57, 64, 80, 89, 104, 123, 124, 184, 192, 213, 234, 267, 434, 458, 504, 540, 587 bp

(Roche Biochemicals).

Universidade do Algarve - fctec.ualg.pt · 1.1 – Metabolismo de xenobióticos A maior parte dos...

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