UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA TAIRONE...

UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA

TAIRONE MACHADO

AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA

POLIMERASE (PCR) NO ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS

TECIDUAIS DE BOVINOS

Tubarão

2012

TAIRONE MACHADO




Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Profa. Rosemeri Maurici da Silva, Dra.

Coorientadora: Profa. Maria Luiza Bazzo, Dra.

Tubarão

2012

TAIRONE MACHADO




Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina.

Professora e Orientadora: Rosemeri Maurici da Silva, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina.

Professora: Anna Paula Piovezan, Dra.

Universidade do Sul de Santa Catarina.

Professor: Leonardo de Lucca Schiavon, Dr.

Universidade Federal de Santa Catarina.

RESUMO

A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso e crônica, sendo que no Brasil

apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi avaliar o

rendimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) no isolamento de micobactérias em

amostras teciduais congeladas de bovinos. As amostras teciduais foram descongeladas e

semeadas em meios de cultura Ogawa-Kudoh contendo piruvato de sódio, e outro contendo

glicerol por 42 dias a 37ºC. Foram submetidas à PCR as amostras de tecido e os isolados das

culturas, com primers específicos para M. tuberculosis e M. bovis. Foram analisadas 69

amostras teciduais de bovinos, das quais 81,2% constituíram-se de linfonodos. Tomando-se o

resultado combinado das culturas como padrão áureo, identificou-se a presença de

micobactérias em 17 amostras teciduais (24,6%), 12 delas (70,6%) pertencentes ao Complexo

Mycobacterium tuberculosis (Complexo MTB), e 5 (29,4%) identificadas como

Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). O melhor rendimento diagnóstico foi alcançado pela

cultura específica Ogawa-Kudoh com Piruvato e com descontaminação. O rendimento da

PCR realizada nas amostras teciduais com o gene alvo hsp65 em comparação com o padrão

áureo, foi de 17,6% de sensibilidade (IC95%:-0,005-0,36), especificidade de 98,1%

(IC95%:0,94-1,02), valor preditivo positivo de 75% (IC95%:0,33-1,17), valor preditivo

negativo de 78,5% (IC95%:0,68-1,19), e acurácia de 78,3%. A razão de verossimilhança

positiva foi de 9,18 e a negativa foi de 0,8. A PCR hsp65 realizada diretamente do tecido

acometido apresentou alta especificidade e valor preditivo positivo, porém baixa

sensibilidade, sendo desejável a otimização desta técnica para que possa ser utilizada na rotina

laboratorial.

Palavras-chave: Tuberculose. PCR. M. bovis.

ABSTRACT

Brazilian cattle herds have high morbidity rates due to bovine tuberculosis, which is a chronic

granulomatous disease. The aim of this study was to evaluate the performance of the

polymerase chain reaction (PCR) in the recovery of mycobacteria from frozen tissue samples

of cattle. The tissue samples were frozen-thawed and seeded into Ogawa-Kudoh culture

media, one containing sodium pyruvate and another containing glycerol for 42 days at 37° C.

Tissue samples and culture isolates with primers specific for M. tuberculosis and M. bovis

were subjected to PCR. In total, 69 tissue samples of cattle were analyzed, 81.2% of which

consisted of lymph nodes. Taking the combined results of cultures as the gold standard, the

presence of mycobacteria was identified in 17 (24.6%) tissue samples, of which 12 (70.6%)

belonged to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTB complex), and 5 (29.4%) were

identified as nontuberculous mycobacteria (NTM). The best diagnostic yield was achieved by

Ogawa-Kudoh specific culture with Pyruvate and decontamination. The yield of PCR

performed on tissue samples with the hsp65 gene as the target compared with the gold

standard showed a sensitivity of 17.6% (95% CI: -0.005-0.36), specificity of 98.1% (95% CI:

0.94-1.02), positive predictive value of 75% (95% CI: 0.33-1.17), negative predictive value of

78.5% (95% CI: 0.68-1.19), and accuracy of 78.3%. The positive likelihood ratio was 9.18,

and the negative likelihood ratio was 0.8. The hsp65 PCR performed directly on the affected

tissue showed high specificity and positive predictive value, but low sensitivity. Optimization

of this technique is highly desirable, so it can be used for laboratory routine monitoring.

Keywords: Tuberculosis. PCR. M. bovis.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fluxograma da metodologia utilizada...................................................................... 30

Figura 2 - Lesões macroscópicas em amostras teciduais hepáticas.......................................... 32

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição das amostras teciduais analisadas de acordo com o sítio anatômico. . 32

Tabela 2 - Distribuição das micobactérias isoladas. ................................................................. 33

Tabela 3 - Distribuição dos resultados das culturas específicas em comparação com o padrão

áureo. ........................................................................................................................................ 33

Tabela 4 - Rendimento diagnóstico das culturas específicas em comparação com o padrão

áureo. ........................................................................................................................................ 34

Tabela 5 - Distribuição dos resultados da cultura de acordo com a amostra tecidual analisada.

.................................................................................................................................................. 34

Tabela 6 - Distribuição do resultado da PCR hsp65 em amostras teciduais, de acordo com o

padrão áureo. ............................................................................................................................ 35

LISTA DE SIGLAS

CMTB - Complexo M. tuberculosis

CTAB - cetyltrimethylammonium bromide

MAIS - Mycobacterium avium, M. intracelulareae, M. scrofulaceum

MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MNT - Micobactérias não-tuberculosas

MTBC - M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. canettii, e M. microti

PNCEBT - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal

PNCTBB - Plano Nacional de Controle da Tuberculose e Brucelose Bovina

PPD – Derivado protéico purificado de Mycobacterium

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 10

2 O PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DA BRUCELOSE E

TUBERCULOSE ANIMAL..................................................................................................... 17

3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS ............................................................................................. 19

3.1 BACTERIOSCOPIA ........................................................................................................ 19

3.2 CULTURA E IDENTIFICAÇÃO ................................................................................... 19

3.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) .................................................... 21

3.4 RENDIMENTO DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS .................................................. 23

4 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 26

5 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 27

5.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 27

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 27

6 MÉTODOS ............................................................................................................................ 28

6.1 METODOLOGIA LABORATORIAL ........................................................................... 28

7 ANÁLISE DOS DADOS ...................................................................................................... 31

8 RESULTADOS ..................................................................................................................... 32

9 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 36

10 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 422

REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 43

ANEXOS .................................................................................................................................. 49

ANEXO A – Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal

................................................................................................................................................ 500

ANEXO B – Instrução Normativa SDA n° 10, de 15 de janeiro de 2004 ............................. 533

10

1 INTRODUÇÃO

As micobactérias são organismos que provavelmente, já existiam há milhões de

anos antes do surgimento dos primatas. Mycobacterium bovis, ou uma variante,

provavelmente infectou animais no período paleolítico. O homem não era o hospedeiro

natural e as primeiras infecções humanas ocorreram como eventos isolados, provavelmente

resultantes da ingestão de carne ou de leite infectados. Havia, no entanto, pequena

possibilidade da disseminação da doença nas comunidades humanas primitivas, devido à

dispersão da população e ao mínimo envolvimento pulmonar (VERONESI; FOCACCIA,

2010).

A agricultura, que iniciou há aproximadamente 7.000 anos (a.C.), propiciou o

surgimento de vilas e a domesticação de animais, sendo prática comum mantê-los no

pavimento inferior das moradias para seu aquecimento interno. Essas condições favoreceram

a disseminação de infecções entre os seres humanos, apesar de que a tuberculose não tenha

sido um problema significativo nas populações pré-históricas (DANIEL, 2006).

A doença podia ser encontrada na época paleolítica em virtude das características

da conformação dos grupos de caça e de coleta – os quais se constituíam como povos

nômades e dispersos, dificultando a disseminação do agente etiológico. Entretanto, a maior

concentração dos seres humanos no período Neolítico, começou a propiciar a difusão da

tuberculose (DANIEL, 2006).

A espondilite tuberculosa foi documentada em múmias egípcias datadas de 3.700

(a.C.), muito provavelmente causada por Mycobacterium bovis. Contudo, como a espécie

humana não é a hospedeira natural de Mycobacterium bovis, a doença provavelmente

apresentava menor virulência quando comparada àquela causada por Mycobacterium

tuberculosis (DANIEL, 2006; VERONESI, FOCACCIA, 2010).

Relatos da disseminação da tuberculose podem ser encontrados em textos gregos

e hindus, sendo que os primeiros a denominavam tisis (que significa debilitamento, desgaste),

cabendo a esses povos a descrição mais apurada da doença. Os textos atribuídos a Hipócrates

são assinalados como constituintes do melhor repertório de informações sobre o tema. O

filósofo deslocou a interpretação da enfermidade do domínio exclusivo dos princípios

religiosos, estabelecendo os fundamentos do raciocínio clínico sobre a doença basicamente

pelos seguintes sinais: tosse, expectoração, hemoptise e debilitamento (DANIEL, 1997).

Hipócrates estudou o aniquilamento progressivo que a doença causa no

organismo, descrevendo o desenvolvimento da doença e o tratamento utilizado na época, que

11

consistia basicamente da ingestão de mostarda, lentilhas, leite de vaca e de cabra adicionando

água, mel ou orégano. Como alimentos sólidos, recomendava carne de carneiro cozida e

pescados, sendo que os alimentos gordurosos e salgados eram tidos como os preferidos –

acrescia ainda o uso de vinho tinto. Galeno, partindo das observações de Hipócrates, foi um

dos pioneiros na recomendação do regime climático para os doentes (DANIEL, 1997).

Anteriormente à era bacteriana são numerosas as referências citando o perigo que

representa para o homem o consumo de carne de animais sofrendo de caquexia – e é muito

provável que nesta designação estivesse incluída a tuberculose bovina. Nos ensinamentos da

doutrina mosaica, encontra-se no Talmude, codificado em fins do século II, a proibição ao

povo hebreu de utilizar-se de carne de bovinos em cujos pulmões fossem encontradas lesões

ulcerativas. Em Munique, por volta de 1307 (d.C.), foi promulgada uma lei semelhante a do

Talmude, e em Leipzg, 1788, a morte de 12 estudantes foi atribuída à ingestão de carne de

animal tuberculoso (DANIEL, 2006; DANIEL, 1997; ABRAHÃO, 1998).

Em 1889, Theobald Swit isolou Mycobaterium bovis, e em 1902, Revenel obteve

a primeira prova definitiva da transmissão da tuberculose bovina ao homem decorrente da

ingestão de alimentos. O isolado foi realizado em uma cultura pura dos bacilos presentes em

gânglios mesentéricos de uma criança falecida de meningite tuberculosa, no Hospital Infantil

da Filadélfia, tais bacilos foram inoculados em três bovinos, que em menos de 30 dias foram a

óbito. Os resultados da necropsia destes animais não deixaram dúvidas de que a causa da

morte foi tuberculose (DANIEL, 1997).

Em 1908, Mantoux institui o teste cutâneo para diagnóstico e, em 1931, Kuhnaus

verificou que a carne poderia transmitir a doença somente quando o animal era afetado por

uma tuberculose generalizada e neste caso, seria condenado durante a inspeção realizada nos

matadouros. Todavia, fabricantes gananciosos utilizavam as partes tuberculosas para o

preparo de salsichas que, quando consumidas sem tratamento térmico prévio, ofereciam

grande risco às pessoas (ABRAHÃO, 1998; AMANFU, 2006).

O homem, na tentativa de se relacionar com o ambiente, adquiriu hábitos

impróprios, os quais foram corrigindo-se ao longo das gerações. Conviver com animais ou em

ambientes insalubres sem a mínima condição de saúde possibilitou aos microrganismos

habitar outros organismos e provocar doenças. A tuberculose é uma doença dos seres

humanos que acomete os pulmões e outros órgãos que pode apresentar perfil de resistência

aos medicamentos – acredita-se ter sido introduzida através da cadeia alimentar e nas grandes

invasões à natureza (O’REILLY; DABORN, 1995).

12

O gênero Mycobacterium contém, na atual classificação, 154 espécies e 13

subespécies (EUZÉBY, 2011). É constituído pelo M. leprae, pelas espécies do Complexo M.

tuberculosis (CMTB) e pelas micobactérias denominadas Micobactérias Não-Tuberculosas

(MNT) (BROSCH et al., 2002; McGRATH et al., 2010). Mycobacterium tuberculosis foi

batizado como bacilo de Koch em homenagem a este cientista ganhador do prêmio Nobel de

Medicina em 1905. As micobactérias se distribuíram amplamente pelo ambiente, no solo, na

água ou parasitando alguns animais intracelularmente, provocando doenças nos seres

humanos. Em países que apresentam carência alimentar, falta de saneamento básico e

ausência de orientação sanitária, a incidência da tuberculose é mais exacerbada, vitimando

inúmeras pessoas independentemente de classe econômica ou social (CAMPOS, 2006).

O indivíduo pode adquirir o bacilo e desenvolver a doença ao consumir água não

tratada, carne de animais não vacinados e sem avaliação dos órgãos de saúde responsáveis

pelos alimentos. Os bacilos também são encontrados no escarro das pessoas e animais

doentes, e sua transmissão ocorre pelas microgotículas que são expelidas ao falar ou tossir, e

instalam-se em lugares úmidos ao abrigo do sol. Desta forma, o confinamento dos animais é

um fator propício à instalação da doença (BRASIL, 2008).

No entanto, algumas precauções podem ser tomadas para evitar a doença, ferver o

leite e cozinhar os derivados da carne antes do consumo, é uma das formas de evitar a

transmissão da tuberculose, conhecida também como tísica consumptiva e peste branca.

(BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).

A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso crônico, sendo que

no Brasil apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos leiteiros. Essa enfermidade, por se

tratar de uma zoonose, é um problema de grandes proporções, pois acarreta prejuízos desde a

produção de leite até transtornos econômicos causados diretamente aos pecuaristas. A

população humana em geral é atingida através do consumo de leite cru, de subprodutos

lácteos produzidos in natura, e do contato com animais portadores de tuberculose (KANTOR;

RITACCO, 1994; CORREA, 1992).

No Brasil, o risco para a saúde pública de se contrair o agente pela ingestão de

produtos cárneos contaminados torna-se menor, devido à baixa incidência do agente em

tecidos musculares, e do hábito de não se comer carne crua no país. Porém, tal risco não deve

ser ignorado quando se leva em consideração o grande número de abates clandestinos, ou

mesmo o abate de animais descartados de rebanhos positivos em matadouros municipais que

não atendem as normas de inspeção exigidas pelo rigor da lei (BRASIL, 2008; ABRAHÃO,

1998).

13

Em humanos, quando a contaminação se dá por ingestão, pode ocorrer uma

infecção inicial das amígdalas, prosseguindo então para as cadeias de linfonodos cervicais. A

lesão inicial não passa de uma amigdalite, entretanto, lesões supurativas podem ocorrer nas

cadeias cervicais, afetando linfonodos pré-auriculares, tonsilares e supraclaviculares, com

posterior envolvimento da pele sobrejacente. Tais lesões são comumente conhecidas como

scrofulodermia ou lupus vulgaris. O acometimento da tuberculose na região óssea e articular

também é comum, provocando lesões ósseas localizadas e artrite. Em crianças, é comum se

encontrar acometimento intestinal (CAMPOS, 2006; VERONESI; FOCACCIA, 2010).

Quanto ao acometimento pulmonar, resultados obtidos de estudos experimentais

demonstram que de um a cinco bacilos são capazes de produzir lesões pulmonares quando

atingem as vias aéreas inferiores, principalmente os alvéolos, por inalação de aerossóis.

Entretanto, estudos recentes demonstraram que a infecção intra-nasal em bezerros somente

ocorre se houver inoculação de cerca de 104 a 106 unidades formadoras de colônias. A maior

ocorrência da forma pulmonar da tuberculose bovina em indivíduos da área rural pode ser

explicada por tais resultados, sendo considerada uma doença ocupacional (BRASIL, 2008;

CAMPOS, 2006).

Médicos veterinários e trabalhadores de frigoríficos, que mantêm um contato

direto com o animal, também estão sujeitos à infecção pelo bacilo bovino devido à inalação

de aerossóis. Outra forma de infecção da tuberculose bovina em humanos é através do

acometimento cutâneo. A contaminação se dá pelo contato direto com carcaças contaminadas.

Dessa forma, as pessoas mais acometidas pela tuberculose são os magarefes, auxiliares de

inspeção e médicos veterinários. As lesões dessa infecção, na maioria das vezes são pouco

extensas e regressivas, manifestando-se na forma de pequenas pápulas, semelhantes a

verrugas, sendo conhecidas como butcher wart ou verruga do magarefe. (WHO, 1993;

COSIVI et. al., 1998).

A benignidade da tuberculose cutânea, provavelmente está relacionada à

resistência que os adultos possuem ao bacilo, e não à menor virulência do mesmo. Essas

lesões de mesma benignidade são encontradas nas mãos dos patologistas que praticam

autópsias sem a proteção de luvas, sendo neste caso, causadas pelo bacilo humano

(JULIANO, 2007).

Há evidências que tanto a resistência genética do hospedeiro a uma infecção por

M. bovis, quanto a influência de fatores fisiológicos e imunológicos, em animais e em

pessoas, interferem no curso da tuberculose. Entretanto, não há comprovação experimental

conclusiva que tais fatores possam interferir na infecção, pois esta pode ocorrer na infância e

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permanecer silenciosa, e em algum momento da fase adulta pode ocorrer manifestação dos

sintomas (CAMPOS, 2006; VERONESI; FOCACCIA, 2010).

Os testes de tuberculinização têm sido utilizados para diagnóstico de tuberculose

em bovinos há mais de um século. Estes testes avaliam respostas de hipersensibilidade

retardada, 72 horas após uma injeção intradérmica de tuberculina (PPD – derivado protéico

purificado de Mycobacterium). Atualmente, duas modalidades de testes são utilizadas: o teste

intradérmico simples, que utiliza apenas tuberculina bovina, e o teste intradérmico

comparado, que utiliza tuberculina bovina e aviária (BRASIL, 2008; JULIANO, 2007).

A tuberculinização comparada permite minimizar diagnósticos falso-positivos por

reações decorrentes de bactérias do complexo MAIS (Mycobacterium avium, M.

intracelulareae, M. scrofulaceum), que não são patogênicos para bovinos, porém são capazes

de desencadear reações positivas. Resultados falso-negativos podem ser observados em

diversas situações como: em infecções recentes (30 a 50 dias da infecção), nos casos de

anergia decorrente do acometimento generalizado (tuberculose miliar); no período de 42 a 60

dias entre testes; durante o período de 4 a 6 semanas pós-parto (no qual se observa uma

imunossupressão transitória) (RUGGIERO, 2007).

Apesar da grande variação da sensibilidade do teste de tuberculinização (68% a

95%, podendo ser menor em condições de campo), o mesmo vem sendo utilizado como

principal método de diagnóstico em programas de controle e erradicação da tuberculose

bovina em muitos países, inclusive no Brasil (BRASIL, 2008; RUGGIERO, 2007).

A tuberculose como zoonose, é preocupante principalmente nos países em

desenvolvimento, pois o conhecimento da doença é escasso e as medidas de controle

ineficientes. Por este motivo, é necessária maior preocupação por parte dos profissionais que

atuam no campo da Saúde Pública, em relação à infecção por M. bovis, especialmente com as

populações de risco, neste caso, os trabalhadores rurais que são os mais afetados, já que são

expostos ocupacionalmente (ABRAHÃO, 1998).

No entanto, existe outro agravante, a falta de diagnóstico efetivo que diferencie

cepas de M. bovis e M. tuberculosis. A provável explicação para essa falha seria a perda de

interesse epidemiológico, já que, após a obrigatoriedade da pasteurização do leite, o abate do

gado tuberculínico, e a confiança na eficácia da quimioterapia atual contra todos os tipos de

tuberculose, houve uma queda na incidência da doença. Entretanto, desde que a tuberculose

causada por M. bovis reapareceu em países nos quais ela estava praticamente erradicada, e

desde que a pirazinamida passou ser regularmente usada como um fármaco antituberculose de

15

primeira linha – e M. bovis é naturalmente resistente a ela – existem razões para fazer a

distinção de ambas (ABRAHÃO, 1998; CHIMARA; FERRAZOLI; LEÃO, 2004).

A principal razão seria o fato de que casos de tuberculose humana relacionados

com M. bovis podem estar sendo tratados como tuberculose causada por M. tuberculosis em

todo o país. Como M. bovis é naturalmente resistente à pirazinamida, cepas multidroga-

resistentes poderão ser geradas nestes tratamentos falhos, impedindo a cura do paciente,

tornando-o um potencial transmissor destas cepas resistentes a outras pessoas e animais e,

eventualmente, levando-os à morte (ABRAHÃO, 1998; CAMPOS, 2006; PARREIRAS,

2004).

O Brasil tem atualmente uma população bovina maior do que 190 milhões de

cabeças de gado. Dados recentes mostram nível de infecção entre 0,9% a 2,9%, dos quais

6,2% a 26,3% dos rebanhos possuem animais infectados, sem que essas taxas mostrem

diminuição da incidência. A taxa de animais abatidos encontrados com lesões em matadouros

é de aproximadamente 0,14%. (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E

ABASTECIMENTO, 2011).

Em países desenvolvidos, estima-se que as perdas econômicas decorrentes da

tuberculose afetem 10% da produtividade do gado leiteiro. No Brasil, as perdas na produção

leiteira chegam a 18%, com retardo da primeira lactação e diminuição do número e da

duração das lactações (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E

ABASTECIMENTO, 2011; SABEDOT, 2009; COSIVI, 1998).

O bovino é definido como o hospedeiro verdadeiro da tuberculose bovina, mas

muitas espécies domésticas e silvestres também são susceptíveis à doença, entre elas o búfalo

e o bisão (O’REILLY; DABORN, 1995).

Mycobacterium tuberculosis apresenta-se com menor patogenicidade em bovinos,

sendo que a doença nessa espécie toma caráter autolimitante. Os animais infectados são a

principal fonte de contaminação, sendo a via orofaríngea a porta de entrada mais comum,

pastos e alimentos contaminados têm menor importância na transmissão da doença. O bovino

uma vez infectado, já é capaz de transmitir a doença a outros. O agente pode ser eliminado

pela respiração, pelo corrimento nasal, leite, fezes, urina, secreções vaginais e uterinas, e pelo

sêmen. No entanto, a ingestão de leite contaminado é a principal via de transmissão para

animais jovens, e também para o homem. Já a transmissão transplacentária é considerada

muito rara ou inexistente nos bovinos. As vias de transmissão menos comuns são a

intrauterina e o coito, através de sêmen contaminado (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).

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Quando a infecção se dá pelo trato respiratório (aerossóis), o pulmão é o órgão

primeiramente atingido, assim como os linfonodos regionais. Quando a infecção é pela via

digestiva, a lesão se dá no sítio de entrada, principalmente nos linfonodos faríngeos e

mesentéricos. No entanto, pode atingir praticamente todos os órgãos quando da generalização

do processo. Na primo-infecção pulmonar os bacilos vão se alojar no tecido promovendo uma

reação inflamatória, caracterizada como uma pneumonia. Desta forma, a doença se instala

basicamente nos pulmões, formando nódulos caseosos de tamanhos variados, em muitos

casos tomando todo o parênquima pulmonar e formando lesões cavitárias com expectoração

de material bacilífero. Através de uma reinfecção exógena ou endógena, pela recrudescência

da lesão, esta se torna necrosada, podendo atingir os tecidos vizinhos e se disseminar para

vários órgãos do indivíduo. Quando a resistência orgânica é baixa, acontece a disseminação

do agente pelo parênquima pulmonar, pela via aérea, ou pela via hematogênica, atingindo

linfonodos regionais e formando metástases em outros órgãos (VERONESI; FOCACCIA,

2010).

Neste sentido, ocorre no foco inicial uma infiltração celular, necrose de

caseificação e circunscrição da lesão, que pode evoluir para resolução e calcificação. Assim, a

presença de um nódulo calcificado, predominantemente no terço distal do lobo caudal, e/ou

aumento de volume do linfonodo regional denomina-se “complexo primário”. Os bacilos

podem permanecer nos linfonodos ou nos nódulos tuberculosos por longos períodos, se

multiplicando ou sob a forma latente (VERONESI; FOCACCIA, 2010; CAMPOS, 2006).

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2 O PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DA

BRUCELOSE E TUBERCULOSE ANIMAL

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), instituiu em

2001 o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal

(PNCEBT), o qual tem o objetivo de diminuir a incidência das duas zoonoses, bem como

reduzir o impacto econômico que causam (BRASIL, 2006).

Portanto, a tuberculose causada por Mycobacterium bovis, está disseminada por

todo o país e afeta tanto os bovinos como os bubalinos. No entanto, sua prevalência e

distribuição regional não estão bem caracterizadas. (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA

PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011; KANTOR; RITACCO, 1994).

Os objetivos específicos do programa consistem em baixar a prevalência e a

incidência de novos focos de tuberculose, criar um número significativo de propriedades

certificadas livres de tuberculose ou monitoradas, e que ofereçam ao consumidor produtos de

baixo risco sanitário (BRASIL, 2006).

São consideradas estratégias do programa:

• A capacitação de médicos veterinários tanto da rede oficial quanto da iniciativa

privada. Esses profissionais contribuirão para a solução de importantes problemas de

saúde pública e animal, através da integração do serviço veterinário oficial e privado, e

da constante melhoria do padrão dos serviços oferecidos aos pecuaristas e à população

em geral (BRASIL, 2006).

• Diagnóstico e o apoio laboratorial constante a laboratórios privados e oficiais. O

resultado será a normatização de exames no campo e em laboratórios, padronizando os

exames de diagnóstico e procurando sempre a atualização no caso do surgimento de

testes mais eficientes em relação aos recomendados (BRASIL, 2008).

• A certificação de propriedades livres e monitoradas – de responsabilidade do serviço

oficial – será realizada mediante diagnóstico por amostragem a qualquer momento em

propriedades certificadas e nos testes finais que conferem o certificado de

propriedades livres. Todas estas estratégias visam a promoção da educação sanitária,

na qual o MAPA considera essencial a necessidade de entendimento pelos pecuaristas

e consumidores da adesão ao Programa, considerando-o como um projeto da

sociedade brasileira, permitindo que as ações sanitárias sejam efetivamente aceitas e

cumpridas (BRASIL, 2006; BRASIL, 2008).

18

A distribuição da tuberculose é mundial, apresentando alta prevalência nos países

em desenvolvimento devido à ausência de controle e erradicação eficientes, fazendo com que

os focos da doença se perpetuem. Nos países que implantaram programas de controle da

tuberculose animal ao longo do século passado, baseados em tuberculinização e sacrifício de

animais reagentes, o número de animais infectados foi reduzido drasticamente (ESSEY,

KOLLER, 1994; GORDEJO; VERMEERSCH, 2006). No Brasil, dados oficiais indicam a

prevalência média nacional de 1,3% de animais reagentes à tuberculina no período entre 1989

e 1998 (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).

A tuberculose bovina é responsável por graves perdas econômicas em outros

animais domésticos e de reconhecido perigo para a saúde humana, causando as mesmas

formas clínicas e lesões patológicas que M. tuberculosis. A prevalência da tuberculose

humana de origem animal tem diminuído nos países onde a pasteurização é obrigatória, ou

onde existem campanhas de combate à enfermidade bovina. Naqueles países onde ocorre o

costume de consumo de leite, seus derivados e carne, que passam por um processo de fervura

ou cozimento, a incidência da infecção por M. bovis tem sido mais baixa (GORDEJO;

VERMEERSCH, 2006).

As infecções causadas por M. bovis em bovinos, bubalinos, outras espécies

animais e também no ser humano se dá em 90% dos casos por via respiratória, a partir da

inalação de aerossóis contendo o microrganismo. O exame clínico e a baciloscopia do escarro

não permitem a diferenciação entre a infecção por M. bovis ou por M. tuberculosis no homem.

Essa diferenciação só é possível pelo isolamento e identificação do agente (RODRIGUES,

2008; BRASIL, 2008).

Portanto, a busca ativa realizada para a tuberculose humana é de suma

importância, pois, se estas pessoas residirem no meio rural e tiverem contato com animais,

certamente teremos animais infectados. Nessa hipótese, os animais deverão ser descartados ou

caso contrário, o foco persistirá e o tratamento humano não terá resposta positiva. O controle

da tuberculose bovina deve ser realizado por intermédio dos exames em bovinos e bubalinos,

controle da saúde dos trabalhadores, espécies animais que se encontram em cada propriedade,

e a utilização de instalações com boa ventilação e com exposição direta à luz solar. A

higienização deve ser realizada com desinfetantes apropriados, como hipoclorito de sódio,

fenol, formol cresol, dentre outros. O consumidor deve somente adquirir carne de

estabelecimentos que comercializem produtos com inspeção federal, estadual ou municipal

(BRASIL, 2006).

19

3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

3.1 BACTERIOSCOPIA

Nos indivíduos com suspeita de tuberculose pode-se colher escarro, lavado

gástrico, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano, urina, líquido articular, material de biópsia

ou outro material suspeito, que deverá ser submetido à coloração de Ziehl-Neelsen para a

procura de bacilos álcool-ácido-resistentes (BRASIL, 2008; FRÁGUAS, 2008).

Os bacilos da tuberculose são visualizados como bastonetes retos e finos com

aproximadamente 0,4 x 3 µm, que se coram em vermelho. A observação de BAAR nesses

materiais clínicos é uma evidência presuntiva de tuberculose, mas não definitiva, uma vez que

existem outros bacilos álcool-ácidos-resistentes (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).

3.2 CULTURA E IDENTIFICAÇÃO

Os materiais clínicos obtidos de sítios estéreis (como o líquor) podem ser

cultivados diretamente. O escarro é tratado, inicialmente, com hidróxido de sódio a 2% ou

com outros agentes bactericidas que eliminem a viabilidade dos microrganismos de

crescimento rápido, como bactérias e fungos de vias aéreas superiores. A seguir, o escarro

liquefeito é neutralizado e centrifugado, e o sedimento semeado (BRASIL, 2008). Podem ser

utilizados os seguintes meios de cultura (BRASIL, 2008):

a) Meios sintéticos simples – As micobactérias crescem em meios sintéticos simples, após

algumas semanas, a partir de inóculos grandes. A partir de inóculos pequenos, não há

crescimento nestes meios, devido à presença de quantidades mínimas de ácidos graxos.

b) Meios com ácido oleico e albumina – Podem sustentar a proliferação de pequenos

inóculos, principalmente se Tweens (ésteres hidrossolúveis de ácido graxos) estiverem

presentes (por exemplo, no meio de Dubos). Em geral, as micobactérias crescem em grumos

ou massas por causa da característica hidrofóbica da superfície celular. Os Tweens umedecem

a superfície, permitindo o crescimento difuso nos meios líquidos. O crescimento é quase

sempre mais rápido que em meios complexos.

c) Meios orgânicos complexos – Os inóculos pequenos, como no caso de material obtido de

pacientes, são cultivados em meios contendo substâncias orgânicas complexas, como gema de

ovo, soro animal e extratos de tecidos. Frequentemente, estes meios contêm penicilina ou

verde malaquita para inibir outras bactérias (por exemplo, meio de Löwenstein-Jensen).

20

Embora a diversidade de meios de cultura, no Brasil é adotada os meios a base de

ovo Löwenstein-Jensen ou Ogawa-Kudoh, com glicerol para cultivo de micobactérias em

geral e com piruvato para cultivo de M. bovis, além dos meios líquidos que compõem

sistemas automatizados como MGIT 960 (BRASIL, 2011).

As micobactérias são bacilos aeróbios estritos e obtêm energia a partir da

oxidação de muitos compostos simples de carbono. Desta forma, o aumento da concentração

de CO2 produzido durante seu metabolismo estimula o crescimento. As atividades

bioquímicas não são características, e a velocidade de crescimento é muito menor do que a

maioria das bactérias. O tempo de multiplicação do bacilo da tuberculose é de 12 horas a 25

horas, o que impõe a incubação dos meios inoculados a 37◦C, por até oito semanas. As formas

saprófitas de Mycobacterium tendem a crescer mais rapidamente, proliferam bem a 22◦C,

produzem mais pigmento e são menos álcool-ácido-resistentes que as formas patogênicas

(BRASIL, 2008; MARCHI, et. al., 2008). A identificação de micobactérias pode ser feita de

duas maneiras, com testes fenotípicos ou moleculares. A identificação fenotípica é muito

trabalhosa e implica na utilização de uma série de reações. Essa identificação para algumas

espécies é realizada da seguinte forma (BRASIL, 2008):

a) Observar o crescimento a cada cinco dias. Fazer coloração de Ziehl-Neelsen das

colônias para confirmação da propriedade do álcool-ácido-resistência.

b) Se o crescimento de colônias de BAAR for obtido em menos de cinco dias

(microrganismos de crescimento rápido), deve-se realizar a reação de arilsulfatase.

● Resultado fortemente positivo indica M. fortuitum;

● Resultado negativo ou fracamente positivo indica outras micobactérias desse grupo,

a serem identificadas pelas fermentações de açúcares (M. smegmatis, M. phlei).

c) Se o crescimento de colônias de BAAR for obtido acima de 15 dias

(microrganismos de crescimento lento), deve-se realizar a reação da niacina.

● Colônias rugosas com reação positiva, indicam M. tuberculosis.

● Colônias pequenas e planas com reação negativa, indicam M. bovis, cepa BCG, ou

micobactérias patogênicos para coelhos e cobaias.

● Colônias semiesféricas e lisas com reação negativa, devem ser subcultivadas a 37◦C

em dois tubos com meio de Löwenstein-Jensen, sendo um mantido na luz e o outro, enrolado

em papel de alumínio, mantido no escuro.

Se formar pigmento amarelo a laranja no tubo mantido na luz, e nenhum pigmento

no tubo mantido no escuro, identifica-se como M. kansaii.

21

Se formar pigmento amarelo a laranja no tubo mantido na luz e no tubo mantido

no escuro, identifica-se como micobactérias não patogênicas.

Se não formar nenhum pigmento na luz ou no escuro, identifica-se como

complexo M. avium-intracellulare.

3.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Com a amplificação pela PCR é possível obter-se cópias de segmento(s) do

material genético em quantidade suficiente para detectar ou analisar a sequência de DNA que

é alvo do estudo (RICHELDI, 2006).

A PCR pode amplificar qualquer sequência específica de DNA, a partir de

amostras de diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos corporais,

cabelo e cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina) (PARREIRAS, et. al.,

2004; DE WIT, et. al., 1990).

Para a execução da técnica de amplificação pela PCR é necessário conhecer a

sequência do ácido nucléico que se deseja amplificar (sequência alvo ou sequência molde). A

amplificação será possível com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores ou primers,

constituídos de cerca de 18 a 25 nucleotídeos, que deverão hibridizar mas regiões

flanqueadoras da sequência que será amplificada. Para amplificação de um alvo DNA utiliza-

se um par de primers (sense e reverse) que possibilita a amplificação de duas fitas. Ao

reconhecer o primer , a enzima DNA polimerase sintetiza uma cópia complementar,

obedecendo a informação contida na sequência de DNA que será replicada (sintetizada). Para

a síntese a enzima utiliza-se dos deoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

adicionados à reação e que são os quatro componentes químicos da molécula de DNA

(SAMBROOK; RUSSEL, 2001).

Para o diagnóstico da tuberculose a PCR pode ser realizada no material biológico

coletado recentemente ou a partir de isolados do crescimento em meios de cultura. Desse

material deve-se extrair o DNA utilizando-se um dos diversos protocolos de extração

disponíveis. O importante é que se obtenha o DNA mais puro possível, livre da presença de

proteínas e inibidores (hemoglobina, EDTA, dentre outros). As técnicas de extração seguem

um critério metodológico básico que varia dependendo da amostra utilizada. Basicamente

utilizam-se substâncias desproteinizantes como, por exemplo, o fenol–clorofórmio, capazes

de desnaturar e retirar as proteínas que estão acopladas ao DNA. A adição posterior de etanol

fará com que o material genético precipite no tubo e que posteriormente seja solubilizado para

22

o uso na reação (SAMBROOK; RUSSEL, 2001). A complexa parede celular, composta de

moléculas lipofílicas e polissacarídeos, torna as micobactérias resistentes à maioria dos

protocolos tradicionais de lise celular. A ruptura da parede bacteriana pode ser realizada por

processos mecânicos, enzimáticos ou químicos (AMITA et al., 2002; KÄSER et al., 2009). A

combinação de mais de um desses processos melhora a capacidade de detecção do DNA alvo,

conforme demonstrado por Nogueira e colaboradores (2012). Diversos são os protocolos de

DNA aceitos em Medicina Veterinária para a detecção de M. bovis e M. tuberculosis, dentre

eles destacam-se extrações enzimáticas isoladas ou combinadas, associação de enzima e

detergentes ou ultrassom, uso de colunas (QIAGEN) e a extração com CTAB

(cetyltrimethylammonium bromide) (AMARO et al., 2008; HOSEK et al., 2006).

O terceiro passo da PCR consiste em preparar a mistura de reação, a qual contém

as substâncias necessárias para fazer novas cópias de DNA. Esta reação in vitro deve

mimetizar as condições de amplificação do DNA observadas in vivo, portanto, em um tubo

são colocados os seguintes itens: solução tampão para manter a mistura de reação no pH e

condições iônicas ideais para a reação, os deoxinucleotídeos, os primers, a enzima Taq–DNA

polimerase, e o DNA molde, extraído da amostra. (SAMBROOK; RUSSEL, 2001).

O quarto passo consiste na reação de amplificação em si, feita em um

termociclador que aquece e resfria a reação em vários ciclos consecutivos para amplificar o

DNA. Primeiramente, o tubo é aquecido a 94oC para que o DNA seja desnaturado (abertura

das fitas). Em seguida, a temperatura diminui para permitir a hibridização ou pareamento dos

primers às sequências complementares no DNA. A próxima etapa é a síntese das fitas de

DNA pela polimerase. Após diversos ciclos (geralmente em torno de 30 a 35 ciclos) o DNA

estará amplificado em milhões de cópias (SAMBROOK, RUSSEL, 2001).

Problemas técnicos podem surgir, o mais danoso é a contaminação da amostra

com material genético estranho que pode gerar cópias de DNA não relacionadas ao DNA que

está sendo investigado, sendo que seu resultado pode levar a conclusões erradas. Para

monitorar a possibilidade de riscos desse tipo deve-se realizar as reações com a utilização de

controles positivos e negativos; além da vigilância permanente do laboratório, com adoção de

técnicas universais de boas práticas em laboratórios de Biologia Molecular. O laboratório

deve ter áreas separadas para cada etapa do processo: preparo da amostra e extração de DNA,

preparo da mistura de reação (master mix), amplificação e análise do produto amplificado

(SAMBROOK; RUSSEL, 2001).

O passo final é a análise do amplificado (produto de reação) que pode ser

realizada por meio de gel de agarose ou de poliacrilamida, corados por brometo de etídio,

23

SYBR®, e outros corantes. Em qualquer uma delas o material amplificado é visualizado como

uma banda a ser analisada de acordo com o seu tamanho molecular (SAMBROOK; RUSSEL,

2001).

O sucesso do método de PCR na rotina de diagnóstico da tuberculose está na

dependência de uma série de parâmetros, tais como a qualidade do DNA, que deve estar livre

de contaminantes (os quais interferem na amplificação), na escolha correta dos primers para a

amplificação do material, assim como, no emprego de métodos de extração adequados,

especialmente para amostras paucibacilares (ARAÚJO et. al., 2005).

A distinção do gênero Mycobacterium pode ser realizada com primers gênero-

específicos, que detectam as micobactérias do complexo M. tuberculosis, ou ainda primers

espécie-específicos que reconhecem sequência de DNA de M. bovis. (PINSKI; BANAEI,

2008; RODRIGUEZ et. al., 1995).

3.4 RENDIMENTO DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

O diagnóstico “in vivo” da tuberculose em bovinos é realizado principalmente

com o teste de tuberculina. Entretanto, este teste apresenta sensibilidade duvidosa,

apresentando resultados negativos em muitos casos posteriormente confirmados como

positivos, e vice-versa (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E

ABASTECIMENTO, 2011; BRASIL, 2008; BRASIL, 2006).

Os testes diagnósticos de tuberculose rotineiramente utilizados em humanos como

a coloração pelo álcool ácido-resistência das amostras de secreções traqueais ou brônquicas, e

a cultura para micobactérias, apresentam limitações quando utilizadas para diagnóstico

animal. No primeiro caso, apesar de ser um teste rápido (menos de uma hora) apresenta baixa

sensibilidade e não permite a determinação da espécie bacteriana. No segundo caso, o teste

possibilita a determinação da espécie, mas devido ao lento crescimento das micobactérias

requer de 6 a 10 semanas (BRASIL, 2008).

Nas áreas de endemia, nas quais tuberculoses bovinas e humanas coexistem, é

muito importante distinguir as características entre M. bovis e M. tuberculosis para que se

possa fazer o monitoramento da dispersão de M. bovis entre animais, e destes para o homem

(ABRAHÃO, 1998; MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E

ABASTECIMENTO, 2011; BRASIL, 2006).

No entanto, a distinção entre espécies de micobactérias, especialmente àquelas do

complexo Mycobacterium tuberculosis - MTBC (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M.

24

caprae, M. canettii, e M. microti), é particularmente difícil devido a grande semelhança

morfológica, bioquímica, imunológica, e especialmente, genética entre estes microrganismos.

(NIEMANN et. al., 2000). Porém, algumas características podem ser observadas, M. bovis

apresenta um amplo espectro de hospedeiros, mas é primariamente um patógeno bovino. Por

outro lado, M. caprae ocorre naturalmente em caprinos, M. microti é usualmente isolado de

pequenos roedores, e M. tuberculosis é predominante em humanos (ABRAHÃO, 1998).

Neste sentido, uma série de testes clássicos baseados no crescimento, nas

características fenotípicas, e em testes bioquímicos tem sido utilizados tradicionalmente para

classificar os membros do complexo MTBC. Entretanto, estes testes em conjunto são lentos,

trabalhosos, imprecisos e não reproduzíveis. Tais técnicas, além de não serem accessíveis a

qualquer laboratório de análise, apresentam resultados ambíguos e de difícil interpretação

(BRASIL, 2008).

Apesar da eficiência da análise de alguns genes espécie-específicos para a

diferenciação de espécies de micobactérias não pertencentes ao complexo MTBC,

dificuldades têm sido encontradas para caracterizar inequivocamente espécies e subespécies

que compõem o complexo MTBC. Estes métodos apresentam algum potencial para

classificação de micobactérias, mas são limitados na sua capacidade de tipificação de isolados

(REHREN et. al., 2007).

Na tuberculose, o método de PCR, assim como outros métodos moleculares vêm

sendo empregados para a identificação e detecção do agente tanto em isolados de cultivos,

como em amostras clínicas. Dessa forma, o interesse pelos métodos moleculares tem se

intensificado devido às dificuldades encontradas no diagnóstico da doença em animais,

principalmente pelas limitações quanto à sensibilidade e especificidade do teste de reação

cutânea, e o longo período para confirmação da presença do agente pelos métodos

bacteriológicos de rotina (FRÁGUAS et. al., 2008).

Já o exame post mortem pode ser afetado pelo critério na inspeção da carcaça e os

sítios observados. O exame cuidadoso de pelo menos seis pares de linfonodos entre os de

cabeça (mandibulares, parotídeos e retrofaríngeos), toráxicos (mediastinais e bronquiais),

mesentéricos e da carcaça (pré-escapulares, ilíacos, isquiáticos, sacral e inguinal superficial),

bem como pulmão, fígado, baço, rim, úbere, e órgãos genitais, pode identificar até 95% dos

animais com lesões macroscópicas (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E

ABASTECIMENTO, 2011; TAYLOR, et. al., 2007; BRASIL, 2006).

Para identificar o agente de reações tuberculínicas positivas em animais sem

lesões visíveis ao abate é necessário o exame bacteriológico de amostras congeladas enviadas

25

ao laboratório, principalmente linfonodos colhidos assepticamente. O cultivo para primo-

isolamento de M. bovis pode ser processado pelo método tradicional de Petroff ou pela

descontaminação com cloreto de hexadecilpiridino e semeadura em meios a base de ovo,

como Stonebrink, ou a base de ágar, como Middlebrook 7H11 e B83. Assim, o meio de

cultura mais recomendado para o primo-isolamento de M. bovis é o Stonebrink contendo

piruvato de sódio e não glicerina. O crescimento deste se dá após três a cinco semanas de

incubação. Dessa forma, o isolamento de M. bovis pode demorar até/ou mais de 12 semanas e,

a identificação da cepa isolada por métodos bioquímicos também é um processo lento.

(BRASIL, 2008).

No entanto, alguns animais, ainda que infectados, não respondem aos testes

tuberculínicos, isso porque, fatores como infecção recente, final de gestação e desnutrição

podem ocasionar falso-negativos aos testes. Animais em estado avançado de infecção também

podem manifestar o fenômeno de anergia, ou seja, ausência de reatividade cutânea à

tuberculina. Animais recém-infectados ocasionalmente não respondem ao teste tuberculínico,

sendo que nos bovinos a resposta aparece comumente após 30 a 50 dias da infecção. A

aplicação indevida da tuberculina interfere no resultado do teste. (MINISTÉRIO DA

AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011; BRASIL, 2006).

26

4 JUSTIFICATIVA

Os dados de notificação oficial de tuberculose bovina no Brasil, no período de

1999 a 2009, indicam um percentual de prevalência de animais infectados de 1,3%.

(MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).

Em 2006, a ocorrência de tuberculose bovina no Brasil, com uma população

estimada em 198 milhões de bovinos, estava entre 0,9 a 2,9%, com 6,2% a 26,3% dos

rebanhos acometidos, sendo que neste mesmo período a taxa de identificação com inspeção

federal de animais abatidos em frigoríficos com lesões de tuberculose ficou em torno de

0,14% (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).

As perdas econômicas causadas pela tuberculose nos animais estão relacionadas

principalmente à baixa produtividade e à condenação de carcaças nos frigoríficos. Um animal

tuberculoso pode apresentar de 10 a 25% de queda na capacidade produtiva, além de ser uma

fonte de infecção para outros animais e para o homem (BRASIL, 2006).

Como a transmissão é predominantemente respiratória, o confinamento tem

particular importância na difusão da doença no rebanho, o que explica a maior prevalência no

gado leiteiro estabulado. Na medida em que a idade do rebanho aumenta, há menor

prevalência no gado de corte, pois são criados em sistema extensivo e abatidos precocemente,

sendo menor o tempo de exposição aos membros infectados do rebanho. Desta forma, o

tamanho do rebanho também é importante na transmissão da infecção. A tuberculose em um

rebanho é introduzida, principalmente, pela aquisição de animais infectados podendo se

propagar nos bovinos independentemente da idade, sexo e raça. (BRASIL, 2006).

Na tuberculose, o método de PCR, assim como outros métodos moleculares, vem

sendo empregado para a identificação e detecção do agente, tanto em isolados de cultivos

como em amostras clínicas. O interesse pelos métodos moleculares tem se intensificado

devido às dificuldades encontradas no diagnóstico da doença em animais – principalmente

pelas limitações quanto à sensibilidade e especificidade do teste de reação cutânea e o longo

período para confirmação da presença do agente pelos métodos bacteriológicos de rotina.

Neste sentido, para ter maior subsídio no combate da tuberculose bovina, é necessário que

técnicas diagnósticas mais rápidas e precisas sejam utilizadas, o que contribuiria sobremaneira

para um controle mais eficaz desta zoonose.

27

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

• Avaliar o rendimento da PCR no isolamento de micobactérias em amostras teciduais

congeladas de bovinos.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o rendimento (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor

preditivo negativo e acurácia) da PCR em tecido, comparando com cultura e

diagnóstico macroscópico;

• Descrever o percentual de lesões causadas por M. tuberculosis, M. bovis e outras

micobactérias;

• Comparar o rendimento da PCR em diferentes tecidos.

28

6 MÉTODOS

As amostras de tecido dos animais do presente trabalho foram provenientes de

propriedades rurais do estado de Santa Catarina e do Rio Grande do Sul.

As amostras foram oriundas de estabelecimentos cuja atividade principal é a

pecuária de corte, onde os animais são criados extensivamente, e não confinados, como ocorre

em estabelecimentos leiteiros.

Os animais, ao chegarem ao frigorífico (SIF- Serviço de Inspeção Federal), foram

submetidos às normas do RIISPOA (Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de

Produtos de Origem Animal), descritos nos Anexos A e B. (BRASIL, 2004).

Nos lotes de animais tuberculínicos, as amostras foram obtidas após o abate

normal. Esses animais são acompanhados por uma identificação que faz parte do PNCTBB

(Plano Nacional de Controle da Tuberculose e Brucelose Bovina). (MINISTÉRIO DA

AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011).

Ao serem diagnosticadas macroscopicamente, as lesões de tuberculose na carcaça,

e/ou nas vísceras, foram submetidas aos critérios de julgamento preconizados no artigo 196

do RIISPOA (BRASIL, 2004).

As lesões identificadas macroscopicamente como tuberculose foram embaladas e

identificadas de acordo com o tecido acometido. As amostras ficaram congeladas a uma

temperatura de -18oC até a realização dos testes laboratoriais.

As amostras teciduais foram descongeladas e semeadas em meios de cultura

Ogawa-Kudoh contendo piruvato de sódio e outro contendo glicerol por 42 dias a 37ºC.

Foram submetidas à PCR as amostras de tecido e os isolados das culturas, com primers

específicos para M. tuberculosis e M. bovis.(BRASIL, 2008).

6.1 METODOLOGIA LABORATORIAL

• Isolamento do microrganismo: os fragmentos de órgãos foram macerados em gral com

pistilo ou em tubos contendo pérolas de vidro com água destilada estéril até a formação de

uma suspensão homogênea. A suspensão foi utilizada para realização da cultura de

micobactérias (BRASIL, 2008).

• Cultura: as amostras foram descontaminadas com NaOH 4% durante 2 minutos e semeadas

em meio comercial com piruvato Ogawa-Kudoh (Laborclin) e em meio com glicerol Ogawa-

29

Kudoh (Laborclin) e incubadas à 37ºC durante 42 dias. Adicionalmente, amostras sem

descontaminação foram semeadas nos meios de cultura (BRASIL, 2008).

• Extração de DNA: o DNA das cepas isoladas foi extraído de acordo com Van Soolingen e

colaboradores (1991), utilizando-se o detergente CTAB. A extração do DNA diretamente do

tecido foi feita com o kit comercial Qiagen e seguiu as recomendações do fabricante.

• PCR: o DNA extraído foi amplificado em uma reação com 50µl de volume final contendo

1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 10 ρmoles de cada iniciador;

Tampão de Taq polimerase 1X (200mM Tris-HCl pH 8.4; 500mM KCl), Taq DNA

polimerase recombinante 5U (Invitrogen) utilizando-se os iniciadores JB21(5’-

TCGTCCGCTGATGCAAGTGC-3’) e JB22 (5’- CGTCCGCTGACCTCAAGAGAC-3’), e

10-100ng de DNA. (RODRIGUEZ et. al., 1995).

• Os outros alvos amplificados utilizaram os primers INS1 (5’CGT GAG GGC ATC GAG

GTG GC 3’) e INS2 (5’GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3’) (VAN EMBDEN et al.,

1993) para a sequência de inserção 6110 (IS6110), e os primers Tb11 (5’ –

ACCAACGATGGTGTGTCCAT- 3’) e Tb12 (5’ –CTTGTCGAACCGCATACCCT- 3’)

(TELENTI et al., 1993), para amplificação do gene hsp65.

• As condições da amplificação em termociclador Mastercycle Personal® (Eppendorf) foram:

5 minutos a 94°C e 40 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 68°C, 1 minuto a 72°C e um

ciclo final de 10 minutos a 72°C.

Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose

1,5% corado com bromito de etídio (1µg/ml) e visualizados e fotografados sob iluminação

ultravioleta de 320ηm (HOEFER-MacroVue UV-20), utilizando-se um sistema de foto-

documentação de géis (DOC-PRINT® Biosystems). O tamanho do fragmento foi estimado

por comparação com marcador de peso molecular de 100 pb ladder.

Os primers JB21 e JB22, específicos para M. bovis, amplificam um produto de

495 pares de base (pb), os primers INS1 e INS2, específicos para o CTBM, amplificam um

produto de 244 pb, e os primers Tb11 e Tb12 amplificam um produto de 441 pb do gene

hsp65 presente no gênero Mycobacterium (RODRIGUEZ et al., 1995; VAN EMBDEN et

al.,1993; TELENTI et al., 1993).

A sequência metodológica utilizada encontra-se demonstrada na Figura 1.

30

Figura 1 - Fluxograma da metodologia utilizada.

Fonte: Elaboração do autor, 2012.

Coleta da amostra

Laboratório

Processamento das Amostras

- Maceração do tecido (formação de

suspensão)

Semeadura da Suspensão

Meio de cultura Ogawa-Kudoh sem Piruvato

Meio Ogawa-Kudoh com Piruvato (com e

sem descontaminação)

Incubação a 37°C – 28 dias

Extração de DNA

(direto do tecido)

Kit comercial Qiagen

Extração de DNA

(colônias)

A partir da cultura positiva

Método enzimático CTAB

PCR (genes alvo para identificação)

-hsp65 (gênero Mycobacterium) – PRA-hsp65

- IS6110 (Complexo M. tuberculosis)

- JB (específico M. bovis)

Identificação da Espécie

Resultado das análises

31

7 ANÁLISE DOS DADOS

Foram descritos os números absolutos e percentuais de lesões causados por M.

bovis, M. tuberculosis e outras micobactérias na amostra total e por tecido analisado.

Foi avaliado o rendimento (sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo,

valor preditivo positivo e acurácia) da técnica de PCR para a detecção de M. bovis e M.

tuberculosis, tomando-se como padrão-áureo a cultura. O rendimento foi avaliado para a

amostra total e por tecido analisado.

As amostras negativas em cultura foram consideradas como controles para fins

estatísticos.

Tomando-se como estimativa uma prevalência de 80% de M. bovis e/ou M.

tuberculosis, a menor sensibilidade do teste aceitável de 90%, com intervalo de confiança de

5%, estimou-se a amostra necessária em 69.

32

8 RESULTADOS

Foram analisadas 69 amostras teciduais de bovinos (Figura 1), das quais 81,2%

constituíram-se de linfonodos (Tabela 1).

Tabela 1 - Distribuição das amostras teciduais analisadas de acordo com o sítio anatômico.

Sítio Anatômico N %

Linfonodo 56 81,2

Fígado 07 10,1

Pericárdio 02 2,9

Pulmão 02 2,9

Peritôneo 01 1,4

Pleura 01 1,4

Total 69 100


Figura 2 - Lesões macroscópicas em amostras teciduais hepáticas.


33

Tomando-se o resultado combinado das culturas como padrão áureo, identificou-

se a presença de micobactérias em 17 amostras teciduais (24,6%), 12 delas (70,6%)

pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (Complexo MTB), e 5 (29,4%)

identificadas como Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). A distribuição das micobactérias

isoladas encontra-se demonstrada na Tabela 2.

Tabela 2 - Distribuição das micobactérias isoladas.

Micobactérias Isoladas n %

Complexo MTB

- Mycobacterium bovis

- Mycobacterium tuberculosis

03

09

17,6

52,9

Micobactérias Não Tuberculosas 05 29,4

Total 17 100


Os resultados obtidos nas culturas realizadas com e sem descontaminação, e

aquelas realizadas sem piruvato, tomando-se como padrão áureo o resultado final das culturas,

encontram-se demonstrados na Tabela 3.

Tabela 3 - Distribuição dos resultados das culturas específicas em comparação com o padrão

áureo.

Culturas Específicas

Padrão Áureo Negativo

n(%) Positivo

n(%) Ogawa-Kudoh Piruvato sem Descontaminação

Negativo

Positivo

52(100)

-

16(94,1)

1(5,9)

Ogawa-Kudoh Piruvato com Descontaminação

Negativo

Positivo

52(100)

-

1(5,9)

16(94,1)

Ogawa-Kudoh sem Piruvato (com glicerol)

Negativo

Positivo

52(100)

-

9(52,9)

8(47,1)


34

O melhor rendimento diagnóstico foi alcançado pela cultura específica Ogawa-

Kudoh com Piruvato e com descontaminação (Tabela 4).

Tabela 4 - Rendimento diagnóstico das culturas específicas em comparação com o padrão

áureo.

Culturas

Específicas

Sensibilidade

(IC 95%)

Especificidade

(IC 95%)

Valor

Preditivo

Positivo

(IC 95%)

Valor

Preditivo

Negativo

(IC 95%)

Acurácia

(IC 95%)

Ogawa-Kudoh

Piruvato sem

Descontaminação

0,06

(-0,05-0,17)

1,0

(1,0-1,0)

1,0

(1,0-1,0)

0,77

(0,66-1,60)

0,77

(0,67-0,87)

Ogawa-Kudoh

Piruvato com

Descontaminação

0,94

(0,83-1,1)

1,0

(1,0-1,0)

1,0

(1,0-1,0)

0,98

(0,94-1,0)

0,99

(0,96-1,0)

Ogawa-Kudoh sem

Piruvato

0,47

(0,23-0,71)

1,0

(1,0-1,0)

1,0

(1,0-1,0)

0,85

(0,76-1,1)

0,87

(0,79-0,95)


O tecido linfonodal apresentou o melhor percentual de amostras positivas, seguido

do tecido hepático (Tabela 5).

Tabela 5 - Distribuição dos resultados da cultura de acordo com a amostra tecidual analisada.

Amostra Tecidual

Cultura

Negativa n(%)

Positiva n(%)

Fígado 6(11,5) 1(5,9)

Linfonodo 40(76,9) 16(94,1)

Pericárdio 2(3,8) -

Peritôneo 1 (1,9) -

Pleura 1 (1,9) -

Pulmão 2(3,8) -

Total 52 17


35

O resultado da PCR realizada nas amostras teciduais com o gene alvo hsp65 de

acordo com o padrão áureo, encontra-se demonstrado nas Tabelas 6.

O rendimento alcançado foi de 17,6% de sensibilidade (IC95%:-0,005-0,36),

especificidade de 98,1% (IC95%:0,94-1,02), valor preditivo positivo de 75% (IC95%:0,33-

1,17), valor preditivo negativo de 78,5% (IC95%:0,68-1,19), e acurácia de 78,3%. A razão de

verossimilhança positiva foi de 9,18 e a negativa foi de 0,8. A prevalência de doença na

amostra analisada foi de 24,6%.

Tabela 6 - Distribuição do resultado da PCR hsp65 em amostras teciduais, de acordo com o

padrão áureo.

PCR hsp65 (tecido)

Padrão Áureo

Negativo n(%)

Positivo n(%)

Negativa 51(98,1) 14(82,4)

Positiva 1(1,9) 3(17,6)

Total 52 17


Quando a PCR hsp65 foi realizada diretamente nas culturas positivas, houve 14

resultados concordantes com o resultado da cultura (82,4%), e três resultados falso negativos

(17,6%).

A PCR IS6110 foi realizada diretamente nas culturas positivas e houve 12

resultados concordantes com o resultado da cultura (92,3%), e apenas um resultado falso

positivo (7,7%). Os mesmos resultados foram observados quando a PCR IS6110 foi realizada

diretamente nas amostras teciduais.

36

9 DISCUSSÃO

A necessidade de uma técnica laboratorial sensível e específica para o diagnóstico

etiológico das lesões teciduais macroscópicas observadas em abatedouros, motivou a

realização do presente estudo.

A maioria das amostras analisadas constituiu-se de linfonodos, seguidas de tecido

hepático. Os linfonodos devem ser avaliados com cuidado, visto que constituem-se em

barreiras regionais que atuam na defesa do organismo. É recomendado que pelo menos seis

pares de linfonodos entre os da cabeça (mandibulares, parotídeos e retrofaríngeos), torácicos

(mediastínicos e bronquiais), mesentéricos e da carcaça (pré-escapulares, ilíacos, isquiáticos,

sacral e inguinal superficial), sejam detalhadamente avaliados, assim como o tecido dos

pulmões, fígado, baço, rins, úbere e órgãos genitais, o que pode identificar até 95% dos

animais com lesões macroscópicas (CORNER, 1994; RADOSTITS; BLOOD; GAY, 1995).

Nas lesões macroscópicas causadas por micobactérias, invariavelmente a superfície de corte

da lesão apresenta-se com área central necrótica, rangendo ao contato com o instrumento

cortante utilizado, o que indica a presença de calcificação. Estes dados suportam o diagnóstico

presuntivo de doença causada por micobactérias no animal abatido (OLIVEIRA et al., 1986).

No presente estudo foram isoladas micobactérias em somente 24,6% das amostras

analisadas. Na inspeção realizada em abatedouros, diversas doenças como a actinobacilose,

piogranuloma estafilocócico, mucormicose, coccidioidomicose, pentastomíase, hidatidose

policística e alguns tumores, podem apresentar lesões que macroscopicamente assemelham-se

à tuberculose. Para realizar o diagnóstico diferencial entre a etiologia dessas lesões é

necessário que se realize o exame microbiológico e anatomopatológico (RIET - CORREA;

GARCIA, 2001). Desta forma, as amostras teciduais negativas para a presença de

micobactérias, porém com lesões macroscópicas, poderiam ter sido causadas por qualquer

agente dentre os acima citados. Uma classificação equivocada destas lesões como sendo

causadas por micobactérias tem implicações importantes em termos de saneamento e saúde

pública. Os microrganismos podem ser eliminados pelo ar exalado, através das fezes, do leite,

da urina, de secreções vaginais, e de secreções eliminadas por linfonodos periféricos

fistulizados. As micobactérias podem também ser eliminadas em sua forma viável no muco

nasal e naquele proveniente do aparelho respiratório, antes do aparecimento de qualquer lesão

visível. A inalação é o principal meio de transmissão, mas a transmissão através da ingestão

não pode ser negligenciada. A ingestão de microrganismos ocorre quando o material ingerido

encontra-se contaminado com fezes, porém, neste caso, uma grande quantidade de agentes

37

infectantes é necessária para que o contágio ocorra. Quando um animal com tuberculose entra

em contato com a água, a doença poderá ser transmitida até 18 dias após este contato, o

mesmo não ocorrendo quando a fonte de água é corrente (BLOOD; RADOSTITS, 1989). O

Mycobacterium bovis pode resistir por dois anos nas instalações, fezes, solos e pastagens, por

um ano na água e dez meses na carcaça. Portanto, programas sistematizados de desinfecção

dos locais onde ficam os animais, assume importância fundamental como ferramenta

complementar ao combate à doença. O agente pode ser destruído por desinfetantes como o

hipoclorito de sódio a 5%, fenol a 5%, formol a 7,5%, hipoclorito de cálcio a 5% com

exposição de três horas e, também, pode ser destruído por autoclavação, pasteurização lenta,

pasteurização rápida e fervura (BRASIL, 2001). Desta forma, a diferenciação das lesões

macroscópicas entre lesões causadas por micobactérias e por outros agentes etiológicos, é de

suma importância para que medidas corretas de controle sejam instituídas.

Dentre as micobactérias isoladas, 52,9% eram M. tuberculosis, seguida pelas

micobactérias não tuberculosas (29,4%). M. bovis foi o agente isolado com a menor

frequência. Por ser uma doença crônica e ter vários sinais clínicos causados pela localização

variada da infecção, a tuberculose é difícil de ser diagnosticada por meio de exame clínico.

Deve ser diferenciada das micobacterioses, de pneumonia por aspiração, reticulite traumática,

pleuropneumonia contagiosa crônica dos bovinos, doença do trato respiratório superior,

actinobacilose, leucose bovina e linfadenopatia (BLOOD; RADOSTITS, 1989). Os principais

reservatórios de infecção são humanos e bovinos, no entanto, marsupiais e suínos domésticos

infectados por M. bovis já foram encontrados. A prevalência da doença em tais reservatórios

influencia sua incidência em outras espécies (FRASER, 1991). Todas as espécies são

susceptíveis a tuberculose, incluindo a humana. Os bovinos infectados constituem a principal

fonte de infecção para outros bovinos, mas podem ser responsáveis por transmissão para

humanos, que ocorre por contato direto ou através de alimentos contaminados. A condição de

hospedeiros permanentes, e portanto reservatórios do agente, torna animais silvestres um fator

limitante para a erradicação da tuberculose bovina em alguns países (BLOOD; RADOSTITS,

1989).

No período de 1986 a 1996, segundo o MAPA, a prevalência de infecção por M.

bovis na população bovina do Brasil, variou de 0,9 a 1,7%, em 14 estados brasileiros

(ABRAHÃO, 1999). No período de 1989 a 1998, a prevalência média nacional de animais

infectados era de 1,3%. No sudeste do Brasil a prevalência estimada é de 6,8 a 32,0%

(LILENBAUM, 2000; BRASIL, 2001). No Pará, entre os anos de 1996 e 1997, foi descrita

uma prevalência de 7,7% em búfalos abatidos. Das alterações descritas, 72,1% era localizadas

38

e 27,9% generalizadas. As lesões presentes nas vias aéreas totalizaram 55,1%, seguidas do

conjunto cabeça-língua com 20,1%, carcaça 9,6%, cavidade abdominal 6,3%, e mama com

3,8% das alterações. Com relação aos agentes etiológicos das lesões 67,3% eram por

Mycobacterium bovis (FREITAS; GUERRA; PANETTA, 2001). Em Minas Gerais, de 1993 a

1997, a prevalência de tuberculose em bovinos abatidos foi de 0,7% (BAPTISTA et al.,

2004). Em 1999, um estudo realizado no Triângulo Mineiro e nas regiões do centro e sul de

Minas Gerais, detectou uma prevalência de animais infectados de 0,8%. Nas propriedades de

gado de corte, a prevalência de teste tuberculínico positivo foi de 5,0%, ao passo que nas

propriedades produtoras de leite esta prevalência aumentou para 15%, reforçando o fato de

que áreas leiteiras apresentam maior prevalência da doença por causa do confinamento do

rebanho (BRASIL, 2001).

Na Bahia cidade de Ilhéus, no ano de 2000, 21,7% dos estabelecimentos pecuários

existentes no município apresentavam testes de tuberculinização positivos, acreditando-se que

na maioria destas propriedades foram introduzidos animais adquiridos em outras propriedades

na própria região e em outros Estados (RIBEIRO et al, 2003). No município de Mossoró (Rio

Grande do Norte), no ano de 2002, foram diagnosticados 3,33% de animais reagentes à

tuberculina (OLIVEIRA et al., 2007). Em Passo Fundo no Rio Grande do Sul, em 2002, os

testes intradérmicos para diagnóstico da tuberculose indicaram que 1,5% dos animais testados

apresentaram reações positivas (POLETTO, 2004). Os dados acima descritos demonstram

uma distribuição do percentual de lesões causadas por micobactérias bastante heterogênea

quando são avaliados estados brasileiros em regiões distintas. Tais resultados podem ser

devido à características próprias das propriedades avaliadas, ou seja, predominantemente

leiteiras ou predominantemente de corte, ou na forma de avaliar as lesões e suas respectivas

técnicas.

Os dados obtidos neste trabalho também divergem daqueles obtidos em estudos

no Mato Grosso do Sul, onde setenta e duas amostras de carcaça com lesões sugestivas de

tuberculose foram selecionadas durante os procedimentos de inspeção de abate nos

matadouros. Destas, 23,6% apresentaram colônias sugestivas de micobactérias, que foram

confirmadas como apresentando bacilos álcool-ácido-resistentes pela coloração de Ziehl-

Neelsen. Através da reação em cadeia da polimerase, utilizando-se primers específicos para

M. bovis, foram identificadas 76,5% das amostras contendo M. bovis (ARAÚJO, 2005). A

forma de seleção dos animais com lesões macroscópicas sofre influência direta do

profissional que as classifica, o que pode gerar discrepâncias entre os dados das diversas

regiões. Novamente torna-se clara a necessidade da correta identificação dos agentes

39

causadores das lesões. A tuberculose é uma zoonose de distribuição mundial, com alta

prevalência nos países em desenvolvimento e baixa nos desenvolvidos, devido a programas de

controle e erradicação, inspeção de carnes e pasteurização do leite. Desse modo, é essencial

investigar os pontos a serem melhorados na cadeia de controle da tuberculose bovina para que

a saúde pública seja assegurada.

De acordo com Blood e Radostits (1989), o primeiro passo para a erradicação da

tuberculose é a educação dos pecuaristas. Os criadores devem ser informados sobre o

significado econômico da doença, sua importância à saúde pública, manifestações e

necessidade das várias etapas num programa de erradicação, a qual deve ser compulsória, uma

vez que os esquemas voluntários sempre deixam focos de infecção.

O controle da tuberculose deve ser fundamentado na quebra da cadeia de

transmissão da doença. O controle e a posterior erradicação da tuberculose baseiam-se,

principalmente, na realização periódica da prova tuberculínica e no abate dos animais que

reagem positivamente (RIETCORREA et al, 2001; FRASER, 1991). Muito cuidado deve ser

tomado quando da aquisição de novos animais, evitando a introdução ou reintrodução da

infecção na propriedade (BRASIL, 2001). Da mesma forma, é importante que a saúde dos

trabalhadores da propriedade seja rotineiramente monitorada.

Acredita-se que os números apresentados pelo MAPA estejam muito abaixo da

realidade, dando uma noção limitada do problema. Esta afirmação está amparada no fato de

que há uma grande subnotificação dos animais tuberculina-positivos, e produção insuficiente

de tuberculina para todo rebanho nacional. Além disso, há poucos estudos com dados

atualizados sobre a saúde animal brasileira, principalmente em relação à tuberculose

(ABRAHÃO, 1999).

A tuberculose pode ser causada no homem pelo Mycobacterium tuberculosis,

MNT e Mycobacterium bovis, transmitidos direta ou indiretamente para outros homens e

animais (BAUER et al., 1992; BRASIL, 2004). Mesmo quando causada por este agente,

apresenta-se com as mesmas formas clínicas e lesões patológicas do Mycobacterium

tuberculosis. (PARDI et al., 2001).

Nos casos de lesões macroscópicas típicas de tuberculose em bovinos, o agente

mais frequentemente isolado era Mycobacterium bovis (CASTRO; NEMOTO, 1972;

CORREA; CORREA, 1982). Várias micobactérias não tuberculosas vêm sendo isoladas de

linfonodos de bovinos, dentre elas: Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum,

Mycobacterium gordonae, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium intracellulare, e

40

Mycobacterium terrae (LANGENEGGER et al., 1981). Esta tendência também foi observada

nos dados aqui apresentados.

Tabosa e colaboradores (1996) avaliando carcaças com lesões semelhantes à

tuberculose, observaram que apenas 5 das 32 amostras apresentaram lesões

microscopicamente características de tuberculose. Na inspeção realizada em frigoríficos,

diversas doenças (actinobacilose, actinomicose, entre outras) apresentaram lesões semelhantes

à tuberculose, e sua diferenciação necessita de exames complementares (RIET-CORREA;

GARCIA, 2001; MÉNDEZ, 2001).

O teste considerado padrão áureo para a confirmação da tuberculose bovina é a

cultura. Porém, o isolamento de micobactérias em cultura, a partir de amostras teciduais, é um

processo muito lento, sendo necessários aproximadamente 10 a 100 organismos viáveis,

número geralmente encontrado em um estado avançado da doença. Isto torna a cultura uma

técnica com excelente rendimento, porém pouco factível na prática diária, porque os

resultados precisam ser obtidos de forma mais rápida para que as ações sanitárias sejam

efetivas (ROMERO et al., 1999).

No presente trabalho, a cultura no meio Ogawa-Kudoh, com piruvato e com

descontaminação apresentou o melhor rendimento, com sensibilidade de 94%, especificidade

de 100% valor preditivo positivo de 100%, valor preditivo negativo de 98% e acurácia de

99%. Tais resultados demonstram a cultura como uma técnica de excelente rendimento e

adequada para comparação quando trata-se de estudos que avaliam a utilização de novas

técnicas, tais como as que envolvem a biologia molecular. Além disso, estes resultados

apontam que pode ser importante a inclusão de meios de cultivo com piruvato de sódio, além

daqueles com glicerol, para o diagnóstico da tuberculose humana, especialmente para

amostras oriundas de pacientes que residem em áreas agrícolas ou que têm contato

profissional com bovinos.

Entre 2005 e 2006, 8.121 espécimes clínicos enviados ao Laboratório de

Micobactérias do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho/Instituto de Doenças do

Tórax, no Rio de Janeiro, foram inoculados em meio Löwenstein-Jensen contendo glicerol e

piruvato. Desses espécimes, 79 isolados de micobactérias tiveram crescimento somente em

meio com piruvato, sendo selecionados para a identificação presuntiva de Mycobacterium

bovis. Embora a tuberculose bovina tenha sido identificada no Brasil, não existem dados

disponíveis sobre tuberculose humana causada por M. bovis no país. A falta de notificação

talvez se deva ao fato de que poucos laboratórios de micobactérias utilizam meios de cultura

contendo piruvato rotineiramente (SOBRAL et al., 2011).

41

Quando a PCR hsp65 foi realizada diretamente nas culturas positivas, houve 14

resultados concordantes com o resultado da cultura (82,4%), e três resultados falso-negativos

(17,6%). Porém, a realização da PCR diretamente do tecido com o alvo hsp65, resultou em

alta especificidade e valor preditivo positivo, mas baixa sensibilidade. Estes resultados podem

ser o reflexo da prevalência de micobactérias na amostra analisada (24,6%), haja vista que a

sensibilidade é uma propriedade dos testes diagnósticos diretamente relacionada à prevalência

do evento. Estes resultados não configuram o teste em questão como um teste útil para a

triagem, mas sim para a confirmação do agente etiológico de forma mais rápida do que na

cultura. Há ainda que se considerar a possibilidade de otimização na preparação das amostras

teciduais a serem submetidas à técnica de PCR, uma vez que as culturas evidenciaram

crescimento do microrganismo.

A PCR IS6110 foi realizada diretamente nas culturas positivas e houve 12

resultados concordantes com o resultado da cultura (92,3%), e apenas um resultado falso-

positivo (7,7%). Os mesmos resultados foram observados quando a PCR IS6110 foi realizada

diretamente nas amostras teciduais.

A alta especificidade da técnica de PCR é demonstrada por outros autores, que

concluíram ser um exame útil e rápido para o diagnóstico da tuberculose bovina

(GARBACCIO, CATALDI, 2010; POROCA et al., 2009). Da mesma forma, constitui-se em

técnica rápida e que permite diferenciar os diferentes agentes do CMTB (PARSONS et al.,

2002).

Os resultados aqui apresentados apontam para a necessidade de otimizar a

sensibilidade da técnica, para que ela possa ser utilizada na rotina laboratorial, corroborando

com a afirmação de Ruggiero et al. (2007), de que ainda não dispomos de um ensaio sensível

para o diagnóstico da tuberculose em bovinos, que possa ser implementado na rotina

laboratorial.

42

10 CONSIDERAÇÕES FINAIS

No presente estudo foram isoladas micobactérias em 24,6% das amostras

analisadas, as quais apresentavam lesões macroscopicamente identificadas, o que evidencia a

necessidade de comprovação anatomopatológica e/ou microbiológica para o diagnóstico

etiológico destas lesões.

O M. bovis foi a micobactéria isolada com a menor frequência, demonstrando a

importância do M. tuberculosis e das MNT em termos de saúde pública.

A PCR hsp65 realizada diretamente do tecido acometido apresentou alta

especificidade e valor preditivo positivo, porém baixa sensibilidade, sendo desejável a

otimização desta técnica para que possa ser utilizada na rotina laboratorial.

43

REFERÊNCIAS

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ANEXOS

50

ANEXO A – Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal

Destino de Carcaças com Tuberculose no Departamento de Inspeção Final.

Artigo 196: Tuberculose – A condenação total deve ser feita nos seguintes casos:

1 – Quando no exame “ante – mortem” o animal estava febril;

2 – Quando a tuberculose é acompanhada de anemia ou caquexia;

3 – Quando se constatarem alterações tuberculosas nos músculo, nos tecidos intramusculares,

nos ossos (vértebras) ou nas articulações e, ainda, nos gânglios linfáticos que drenagem a linfa

dessas partes;

4 – Quando ocorrerem lesões caseosas concomitantemente em órgãos torácicos e abdominais

com alteração de suas serosas;

5 – Quando houver lesões miliares de parênquima ou serosas;

6 – Quando as lesões forem múltiplas, agudas e ativamente progressivas, considerando-se

processo nestas condições quando há inflamação aguda nas proximidades das lesões, necrose

de liquefação ou presença de tubérculos jovens;

7 – Quando existir tuberculose generalizada;

Parágrafo 1o – A tuberculose é considerada generalizada quando além das lesões dos

aparelhos respiratórios, digestivos e seus gânglios linfáticos, são encontradas lesões em um

dos seguintes órgãos: baço, rins, útero, ovário, testículos, cápsulas suprarrenais, cérebro e

medula espinhal ou suas membranas. Tubérculos numerosos uniformemente distribuídos em

ambos os pulmões, também evidenciam generalização.

Parágrafo 2o – A rejeição parcial é feita nos seguintes casos:

1 – Quando partes da carcaça ou órgão apresentem lesões de tuberculose;

2 – Quando se trate de tuberculose localizada em tecidos imediatamente sob a musculatura

como a tuberculose da pleura e peritônio parietais; neste caso a condenação incidirá não

apenas sobre a membrana ou parte atingida, mas também sobre a parede torácica ou

abdominal correspondente;

3 – Quando parte da carcaça ou órgãos se contaminarem com material tuberculoso, por

contato acidental de qualquer natureza;

4 – As cabeças com lesões tuberculosas devem ser condenadas, exceto quando correspondem

a carcaças julgadas em condições de consumo e desde que na cabeça as lesões sejam

discretas, calcificadas ou encapsuladas, limitadas no máximo a dois gânglios, caso em que

51

serão consideradas em condições de esterilização pelo calor, após remoção e condenação dos

tecidos lesados;

5 – Devem ser condenados os órgãos cujos gânglios linfáticos correspondentes apresentem

lesões tuberculosas;

6 – Intestino e mesentério com lesões de tuberculose são também condenados, a menos que as

lesões sejam discretas, confinadas a gânglios linfáticos e a respectiva carcaça não tenha

sofrido qualquer restrição; nestes casos os intestinos podem ser aproveitados como envoltório

e a gordura para fusão, depois de remoção e condenação dos gânglios atingidos.

Parágrafo 3o – Após esterilização pelo calor podem ser aproveitadas as carcaças com

alterações de origem tuberculosa, desde que as lesões sejam discretas, localizadas,

calcificadas ou encapsuladas e estejam limitadas a gânglios ou gânglios e órgãos, não

havendo evidência de uma invasão recente do bacilo tuberculoso, através do sistema

circulatório e feita sempre remoção e condenação das partes atingidas. Enquadram-se neste

parágrafo os seguintes casos:

1 – Quando houver lesão de um órgão linfático cervical e de dois grupos ganglionares

viscerais de uma só cavidade orgânica, tais como: gânglios cervicais, brônquicos e

mediastinais ou então gânglios cervicais e hepáticos e mesentéricos;

2 – Nos gânglios cervicais, um único grupo de gânglios viscerais e num órgão de uma só

cavidade orgânica, tais como: gânglios cervicais e brônquicos e no pulmão ou então nos

gânglios cervicais e hepáticos e no fígado;

3 – Em dois grupos de gânglios viscerais e num órgão de uma única cavidade orgânica, tais

como: nos gânglios brônquicos e mediastinais e nos pulmões ou nos hepáticos e mesentéricos

e no fígado;

4 – Em dois grupos de gânglios viscerais da cavidade torácica e num único grupo da cavidade

abdominal ou então num só grupo de gânglios linfáticos viscerais da cavidade torácica e em

dois grupos da cavidade abdominal, tais como: gânglios brônquicos, mediastinais e hepáticos,

ou então nos brônquicos, hepáticos e mesentéricos;

5 – Nos gânglios linfáticos cervicais, num grupo de gânglios viscerais em cada cavidade

orgânica, tais como: cervicais, brônquicos e hepáticos;

6 – Nos gânglios cervicais e num grupo de gânglios viscerais em cada cavidade orgânica, com

focos discretos e perfeitamente limitados no fígado, especialmente quando se trata de suínos,

pois as lesões tuberculosas do fígado são nesta espécie consideradas primárias e de origem

alimentar.

52

Parágrafo 4o – Carcarças que apresentem lesões de caráter mais grave e em maior

número do que as assinaladas no parágrafo anterior, não se enquadrando, porém, nos casos

enumerados para condenação total, a juízo da Inspeção Federal poderão ser utilizadas para

preparo de gorduras comestíveis, desde que seja possível remover as partes lesadas.

Parágrafo 5o – O aproveitamento condicional, por esterilização pelo calor, pode ser

permitido, depois de removidas e condenadas as partes ou órgãos alterados, em todos os

demais casos. Quando não houver no estabelecimento industrial instalações apropriadas para

a esterilização pelo calor, tais casos são considerados de rejeição total.

Parágrafo 6o – Em nenhuma hipótese e seja qual for a natureza da lesão tuberculosa,

as carcaças correspondentes poderão servir para comércio internacional.

53

ANEXO B – Instrução Normativa SDA n°°°° 10, de 15 de janeiro de 2004

O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, DO MINISTÉRIO DA

AGRICULTURA , PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe confere

o art. 15, inciso do Decreto 4.629, de 21 de março de 2003, tendo em vista o disposto no art.

2°, da Instrução Normativa n° 2, de 10 de janeiro de 2001.

Considerando o estabelecido no Capítulo X, do Regulamento Técnico do Programa

Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal, aprovado pela

Instrução Normativa SDA n° 06, de 8 de janeiro de 2004, e o que consta do Processo n°

21000.010257/2003-09, resolve:

Art. 1° Estabelecer as normas de habilitação de médicos veterinários do setor privado

para atuação junto ao Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e

Tuberculose Animal – PNCEBT para fins de execução de atividade previstas no Regulamento

do Programa, referentes de testes diagnósticos de brucelose e tuberculose e participação no

processo de certificação de estabelecimento de criação livres ou monitorados para brucelose e

tuberculose bovina e bubalina.

Art. 2° A solicitação de habilitação deverá ser feita pelo médico veterinário

interessado, na Unidade Local do serviço de defesa sanitária animal do(s) Estado(s) onde irá

atuar. O serviço estadual a documentação exigida e encaminhará o processo ao Chefe do

Serviço de Sanidade Animal da Delegacia Federal de Agricultura da Unidade Federativa. O

ato de habilitação será efetuado pela Delegacia Federal de Agricultura da Unidade Federativa

correspondente.

Art. 3° A habilitação terá validade dentro da(s) Unidade(s) Federativa(s) de atuação

do médico veterinário para a(s) qual (is) foi habilitado.

Art. 4° A habilitação será gratuita.

Art. 5° Para obter a habilitação o médico veterinário deverá:

I – Estar em situação regular com o Conselho Regional de Medicina Veterinária

da(s) Unidade(s) Federativa(s) de atuação;

II – Apresentar à Unidade Local do serviço de defesa sanitária animal da(s)

Unidade(s) Federativa(s) de atuação certificado registrado de participação e aprovação em

Curso de Treinamento em Métodos de Diagnóstico e Controle da Brucelose e Tuberculose

Animal e de Noções em Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis, reconhecido pelo

Departamento de Defesa Animal;

54

III – Possuir infra-estrutura e material adequados à execução dos testes de

diagnósticos para tuberculose, conforme discriminação a seguir:

Para o diagnóstico de tuberculose: pelo menos duas seringas multidose próprias para

tuberculinização de bovídeos, calibradas para 0,1ml e equipadas com agulhas apropriadas

para inoculação intradérmica, cutímetro específico para teste de tuberculinização, tuberculinas

PPD aviária e bovina, aparelho para tricotomia , ferro para marcação de animais reagentes

positivos, formulários para emissão de testados.

Art. 7° O médico veterinário habilitado deverá:

I – Cumprir o Regulamento Técnico do PNCEBT e outras normas complementares

estabelecidas pelo Departamento de Defesa Animal;

II – Fornecer informações relacionadas com esse Programa e apresentar uma via dos

atestados de realização de testes de tuberculose à Unidade Local do serviço oficial de defesa

do Município onde se encontra a propriedade atendida, com periodicidade mensal;

III – Apresentar relatório de utilização de antígenos e tuberculinas, com

periodicidade mensal, ao serviço oficial de defesa sanitária animal onde os mesmos foram

adquiridos;

IV – Registrar as informações dos testes de tuberculose em formulário próprio, que

poderá ser solicitado a qualquer momento pelo serviço oficial de defesa sanitária animal.

Art. 8° A habilitação poderá ser suspensa;

I – A pedido do serviço de defesa sanitária animal do Estado ou pela Delegacia

Federal de Agricultura da Unidade Federativa, em caso de descumprimento do Regulamento

Técnico do PNCEBT, ou de outras normas estabelecidas em legislação sanitária do Ministério

da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e, nesse caso, o médico veterinário somente poderá

requerer nova habilitação depois de decorrido um ano da suspensão que, a critério do serviço

oficial, poderá ou não ser reconhecido, considerando principalmente a irregularidade

cometida;

II – Por interesse próprio, e, nesse caso, o médico veterinário poderá requerer nova

habilitação a qualquer momento, cumprindo as formalidades preventivas nesta Instrução

Normativa.

UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA TAIRONE...

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