UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - …siaibib01.univali.br/pdf/Adriana Campos-2015.pdf ·...
112
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ ADRIANA CAMPOS ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta Itajaí 2015
Transcript of UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - …siaibib01.univali.br/pdf/Adriana Campos-2015.pdf ·...
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ADRIANA CAMPOS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA
CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum
mosenii e Maytenus robusta
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ADRIANA CAMPOS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA
CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum
mosenii e Maytenus robusta
Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Itajaí, Julho de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
C157a
Campos, Adriana, 1988-
Análise fitoquímica e avaliação da atividade antiproliferativa de espécies
adaptadas da flora catarinense: Synadenium grantii, Cipura paludosa,
Epidendrum mosenil e Maytenus robusta / Adriana Campos, 2015.
112f.; il.; fig.; tab.
Cópia de computador (Printout(s)).
Tese (Doutorado) Universidade do Vale do Itajaí, Programa de
Doutorado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho ”
Bibliografia: p.93-107
1. Plantas medicinais. 2. Éster de forbol. 3. Naftoquinonas.
4. Antineoplásicos. 5. Extratos vegetais – isolamento & purificação.
6. Maytenus. I. Título.
CDU: 615.32
CDU: 612.78
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA
CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum
mosenii e Maytenus robusta
Adriana Campos
‘Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. ’
____________________________________ Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Orientador
__________________________________________________________
Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI)
Presidente
______________________________________ Profa. Dra. Angela Malheiros (UNIVALI)
Membro
______________________________________ Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI)
Membro
____________________________________ Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho (UNICAMP)
Membro externo
____________________________________ Prof. Dr. Edesio Luiz Simionatto (FURB)
Membro externo
Itajaí (SC), 17 de Julho de 2015
Aos meus pais Aluízio e Rejane, dedico mais uma conquista,
pois antes desta vitória ser minha com certeza ela é de vocês,
que são a estrutura de toda minha trajetória. A vocês minha eterna
admiração, orgulho e meus sinceros agradecimentos!
AGRADECIMENTOS
A Deus!
Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por todos os ensinamentos, apoio e
paciência que sempre me dedicou nestes anos. Admiro sua inteligência,
competência e seu dom profissional. Obrigada por ter me recebido de forma tão
agradável e por toda confiança.
Aos meus pais Aluízio e Rejane, por todo carinho e incentivo. O apoio e o
amor de vocês foi essencial durante esta trajetória e esta conquista.
Aos membros da banca de qualificação, Professora Dra. Angela Malheiros e
Professor Dr. Sérgio Faloni de Andrade, pelas críticas e contribuições para
conclusão deste trabalho.
Ao Professor Dr. João Ernesto de Carvalho e toda equipe do CPQBA
(UNICAMP), pela gentileza e disposição em me ensinar e ajudar com os
experimentos in vitro.
Ao Professor Dr. Atanasio Pandiella e toda equipe do CIC - Salamanca, pela
atenção e disposição em me ensinar técnicas novas. Obrigada por terem me
recebido com tanto carinho e serem minha família durante 3 meses.
À amiga e Professora Luciane Angela Nottar Nesello, pelas colaborações e
ensinamentos. Sua sabedoria e amor pela pesquisa e docência me motivaram a
continuar nesta área tão bonita e me fizeram crescer tanto profissional quanto
pessoalmente.
Aos meus colegas do laboratório de Fitoquímica e minhas amigas do
NUTRIFAR, que se tornaram mais que colegas de trabalho, e sim amigos de
verdade! Obrigado a todos a vocês pelo apoio e amizade, dentro e fora do
laboratório!
Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Prof. Dra. Tania Mari
Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria;
Ao Prof. Theo e Pedro peja ajuda nas técnicas de CLAE e RMN;
Ao Joel e Deivisson, pela paciência e dedicação, sempre nos ajudando como
técnicos do laboratório.
Às agências de fomento: CAPES, pela concessão da minha bolsa e CNPQ e
FAPESC pelo auxílio financeiro ao laboratório.
“A mente que se abre para uma nova ideia
jamais voltará ao seu tamanho original”.
(Albert Einstein)
ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA
CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum
mosenii e Maytenus robusta
Adriana Campos
Julho/ 2015
Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 110
As plantas têm uma longa história de uso no tratamento de várias doenças, incluindo
o câncer. A descoberta de compostos de origem vegetal que atuam no combate ao
câncer tem incentivado várias pesquisas nessa área. Com isso, o objetivo do
presente estudo foi de obter extratos, frações e compostos puros a partir de plantas
com potencial anticâncer e avaliar este potencial através de ensaios in vitro e in vivo,
bem como estabelecer os possíveis mecanismos de ação. A seleção das plantas
para o estudo foi com base em dois fatores: uso atual na medicina popular como
agente anticâncer (Synadenium grantii) e por apresentarem atividade antimicrobiana
e anti-inflamatória já comprovadas (Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e
Maytenus robusta). Os resultados obtidos demonstraram que o caule da S. grantii e
o os bulbos da C. paludosa possuem atividade antiproliferativa relevante. Como
princípios ativos considerados responsáveis por essa atividade, foi isolado o
composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol na fração CHCl3 do caule da
S. grantii, com presença mais significativa na primavera, e os compostos eleuterina,
isoeleuterina e eleuterol dos bulbos da C. paludosa, com presença mais significativa
no verão. Estes compostos apresentaram ação citocida e/ou citotóxica contra várias
das linhagens celulares tumorais avaliadas, especialmente contra glioma, mama e
rim, com valores de TGI entre 2,8 e 25,2 µg/mL. Os resultados obtidos até o
presente são promissores sob o ponto de vista químico e medicinal, e estimulam a
continuidade destes estudos para a constante busca de plantas e compostos com
potencial atividade antiproliferativa, visando a descoberta de um novo e eficaz
agente terapêutico anticâncer.
Palavras-chave: Plantas medicinais. Potencial anticâncer. Éster de forbol.
Naftoquinonas.
PHYTOCHEMICAL ANALYSIS AND EVALUATION OF
ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY OF SPECIES ADAPTED FROM THE
FLORA OF SANTA CATARINA: Synadenium grantii, Cipura paludosa,
Epidendrum mosenii e Maytenus robusta
Adriana Campos
July/ 2015
Advisor: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances
Number of Pages: 110
Plants have a long history of use in the treatment of various diseases, including
cancer. The discovery of several compounds of plants that act against cancer has
prompted research in this area. Thus, the aim of this study was to obtain extracts,
fractions and pure compounds from plants with potential antiproliferative activity, to
evaluate this potential through in vitro and in vivo assays, and to establish the
possible mechanisms of action. The selection of plants for the study was based on
two factors: current use in folk medicine as anticancer agent (Synadenium grantii),
and the presence of proven antimicrobial and anti-inflammatory activity (Cipura
paludosa, Epidendrum mosenii and Maytenus robusta). The results showed that the
stems of S. grantii and the bulbs of C. paludosa have significant antiproliferative
activity. As active principles considered responsible for this activity, the following
compounds were isolated: the compound 3,4,12,13-tetraacetylphorbol-20-
phenylacetate in the CHCl3 fraction from S. grantii stems, which is present in higher
quantity in the spring, and the compounds eleutherine, isoeleutherine and eleutherol
from C. paludosa bulbs, which are present in higher quantities in the summer. These
compounds showed cytocidal and/or cytotoxic activity against various tumor cell
lines, especially against glioma and breast cancer cell lines, with TGI values of
between 2.8 and 25.2 µg/mL. The results are promising from a chemical and medical
point of view, and encourage the continuation of these studies in the constant search
for plants and compounds with potential antiproliferative activity, in order to discover
a new and effective therapeutic anticancer agent.
Keywords: Medicinal plants. Anticancer potential. Phorbol ester. Naphthoquinones.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura química dos alcaloides da Vinca, vinblastina e
vincristina............................................................................................
30
Figura 2 Estrutura química do taxano paclitaxel (Taxol®) ............................... 31
Figura 3 Estrutura química da camptotecina.................................................... 32
Figura 4 Fotografia da planta identificada como Synadenium grantii............... 34
Figura 5 Bulbos frescos da Cipura paludosa.................................................... 36
Figura 6 Estrutura química dos compostos isolados dos bulbos da C.
paludosa, hongkonina (A) e 11-hidroxieleuterina (B)..........................
36
Figura 7 Fotografia da planta identificada como Epidendrum Mosenii............. 37
Figura 8 Fotografia da planta identificada como Maytenus robusta................. 39
Figura 9 Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 2a
coleta..................................................................................................
47
Figura 10 Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 3a
coleta..................................................................................................
48
Figura 11 Placa de 96 poços utilizada nos ensaios para avaliação da
atividade antiproliverativa in vitro .......................................................
52
Figura 12 Fluxograma de operações realizadas para purificação de
substâncias da fração CHCl3 do caule da S. grantii...........................
57
Figura 13 Cromatografia em camada delgada (CCD) das subfrações 11-15 e
16-19 da fração CHCl3 do caule da S. grantii.....................................
58
Figura 14 Fluxograma de operações realizadas para obtenção de compostos
puros da fração CHCl3 do caule da S. grantii.....................................
59
Figura 15 Espectro de infravermelho (IV) do composto 1................................... 60
Figura 16 Estrutura molecular do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-
tetraacetilforbol (composto 1).............................................................
61
Figura 17 Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) ampliado de 9.5 a 1.0 ppm
do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol................
62
Figura 18 Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 10 a 170 ppm
do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol................
63
Figura 19 Espectro de DEPT-135 do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-
tetraacetilforbol (CDCl3 75MHz)..........................................................
64
Figura 20 Análise por CLAE da subfração 11-15 da fração CHCl3 do caule da
S. grantii e do composto 1..................................................................
66
Figura 21 Fluxograma de operações realizadas para purificação do EMB dos
bulbos da C. paludosa........................................................................
67
Figura 22 Estrutura molecular do composto isoeleuterina.................................. 68
Figura 23 Estrutura molecular do composto eleuterina...................................... 68
Figura 24 Estrutura molecular do composto eleuterol........................................ 69
Figura 25 Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) do composto eleuterol.......... 69
Figura 26 Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 20 a 160 ppm
do composto eleuterol.........................................................................
70
Figura 27 Cromatograma (CLAE) dos extratos do caule da S. grantii obtidos
nas 4 estações, bem como do composto 1........................................
72
Figura 28 Cromatograma (CLAE) dos extratos dos bulbos da C. paludosa
obtidos nas 4 estações, e dos compostos eleuterina, isoeleuterina e
eleuterol, isolados da mesma.............................................................
73
Figura 29 Atividade antiproliferativa da subfração 11-15 da S. grantii................ 77
Figura 30 Atividade antiproliferativa da subfração 16-19 da S. grantii................ 77
Figura 31 Atividade antiproliferativa do composto 1 da S. grantii....................... 78
Figura 32 Atividade antiproliferativa do composto 2 da S. grantii....................... 78
Figura 33 Atividade antiproliferativa do quimioterápico doxorrubicina (controle
posivito)...............................................................................................
79
Figura 34 Atividade antiproliferativa do composto isoeleuterina......................... 82
Figura 35 Atividade antiproliferativa do composto eleuterina............................. 83
Figura 36 Atividade antiproliferativa do composto eleuterol............................... 83
Figura 37 Metabolização de MTT (% controle) contra a linhagem celular MDA-
MB231 do composto 1 e da eleuterina...............................................
86
Figura 38 Metabolização de MTT (% controle) do composto 1 contra as
linhagens celulares MDA-MB231 e HBL100.......................................
87
Figura 39 Ação do composto 1 no ciclo celular da linhagem celular tumoral
MDA- MB231......................................................................................
88
Figura 40 Avaliação da apoptose induzida pelo composto 1 na linhagem
celular tumoral MDA-MB231...............................................................
89
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais linhagens celulares tumorais humanas utilizadas em
ensaios de atividade antiproliferativa in vitro (ATCC; NCI)..................
41
Tabela 2 Plantas e suas partes coletadas para a realização do trabalho........... 45
Tabela 3 Sistema de solventes utilizados para técnica de CLAE........................ 50
Tabela 4 Dados de RMN-1H, RMN-13C e DEPT do composto 1 (20-fenilacetato
de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) em comparação com dados da
literatura................................................................................................
65
Tabela 5 Dados de RMN-1H e RMN-13C do composto eleuterol em
comparação com dados da literatura....................................................
71
Tabela 6 Valores da área do pico do composto 1 (20-fenilacetato de
3,4,12,13-tetraacetilforbol) nos extratos do caule da S. grantii nas 4
estações através da análise por CLAE.................................................
73
Tabela 7 Valores da área do pico dos compostos eleuterina, isoeleuterina e
eleuterol nos extratos dos bulbos da C. paludosa nas 4 estações
através da análise por CLAE................................................................
74
Tabela 8 Valores de GI50 (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos
extratos metanólicos e das frações das plantas S. grantii, C.
paludosa, E. mosenii e M. robusta........................................................
75
Tabela 9
Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e
subfrações da S. grantii........................................................................
79
Tabela
10
Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos
compostos isolados da S. grantii..........................................................
81
Tabela
11
Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos
compostos isoeleuterina e eleuterina isolados da C. paludosa............
84
Tabela
12
Valores de GI50 (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e do
composto eleuterol isolado da C. paludosa..........................................
85
LISTA DE ABREVIATURAS
AE – Acetato de etila
ATCC – American Type Culture Collection
CC – Coluna cromatográfica
CCD – Cromatografia em camada delgada
CDCl3 – Clorofórmio deuterado
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
CPQBA – Centro de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
DEPT – Espectro de RMN-13C utilizando transferência de polarização
DMEM – Meio de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucleico
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
EMB – Extrato metanólico bruto
GI50 – Growth Inhibition 50 (concentração necessária para inibir em 50% o
crescimento celular)
HER2 – Receptor do fator de crescimento epidérmico
HIV – Vírus da imunodeficiência humana
INCA – Instituto Nacional do Câncer
IP – Iodeto de Propídio
IV – Infravermelho
MTT – Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
NCI – National Cancer Institute
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS – Tampão fosfato-salino
PKC – Proteína Quinase C
PPGCF – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
RIBECANCER – Rede Iberoamericana de Investigação em Câncer
RMN-1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN-13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
RPMI – Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute
SFB – Soro fetal bovino
SRB – Sulforrodamina B
UV – Ultravioleta
TCA – Ácido tricloroacético
TGI – Total Growth Inhibition (concentração necessária para inibir totalmente o
crescimento celular)
TMS –Tetrametilsilano
TNBC – Triple negative breast cancer
WHO – World Health Organization
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 23
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 25
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 25
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 25
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 27
3.1 Carcinogênese ................................................................................................... 27
3.2 Produtos naturais e agentes anticâncer ......................................................... 29
3.2.1 Plantas com possível atividade anticâncer..................................................33
3.2.1.1 Synadenium grantii Hook f. (Euphorbiaceae) ........................................... 33
3.2.1.2 Cipura paludosa (Iridaceae) ....................................................................... 35
3.2.1.3 Epidendrum mosenii (Orchidaceae) .......................................................... 37
3.2.1.4 Maytenus robusta (Celastraceae) .............................................................. 38
3.2.2 Ésteres de forbol ............................................................................................ 39
3.3 Modelos farmacológicos para avaliação da atividade anticâncer ................ 40
3.3.1 Ensaios para avaliar atividade antiproliferativa in vitro.............................. 42
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 45
4.1 Material vegetal ................................................................................................. 45
4.2 Análise fitoquímica............................................................................................ 46
4.2.1 S. grantii .......................................................................................................... 46
4.2.2 C. paludosa ..................................................................................................... 49
4.2.3 Análise da variação sazonal ......................................................................... 49
4.3 Identificação dos compostos ........................................................................... 50
4.4 Atividade antiproliferativa in vitro ................................................................... 51
4.4.1 SRB .................................................................................................................. 51
4.4.2 MTT .................................................................................................................. 53
4.5 Análise do ciclo celular e apotose ................................................................... 55
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 57
5.1 Análise fitoquímica............................................................................................ 57
5.1.1 Caule da S. grantii .......................................................................................... 57
5.1.2 Bulbos da C. paludosa ................................................................................... 67
5.1.3 Análise sazonal .............................................................................................. 72
5.2 Atividade antiproliferativa.................................................................................75
5.2.1 Atividade antiproliferativa da S. grantii ........................................................ 76
5.2.2 Atividade antiproliferativa da C. paludosa ................................................... 82
5.2.3 Atividade antiproliferativa do composto 1 (S. grantii) e eleuterina (C.
paludosa) no modelo de MTT ................................................................................. 86
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 91
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 93
ANEXOS - Artigos submetidos para publicação ................................................ 108
23
1 INTRODUÇÃO
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de
doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células anormais que
invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo.
Além disso, sua origem se dá por condições multifatoriais. Esses fatores causais
podem agir em conjunto ou em sequência para iniciar ou promover o câncer (INCA,
2014).
Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, convertendo-se
em um evidente problema de saúde pública mundial. Em 2012, o impacto mundial do
câncer aumentou para cerca de 14 milhões de novos casos por ano, um número que
deverá subir para 22 milhões por ano nas próximas duas décadas (WHO, 2014).
Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), estima-se para o ano de
2030, cerca de 21,4 milhões de casos novos de câncer e 13 milhões de mortes por
esta doença, em consequência do crescimento e do envelhecimento da população,
bem como da redução na mortalidade infantil e nas mortes por doenças infecciosas
em países em desenvolvimento (INCA, 2014).
No Brasil, a estimativa para o ano de 2015, aponta para a ocorrência de
aproximadamente 576 mil casos novos de câncer, sendo o câncer de pele do tipo
não melanoma (182 mil casos novos) o mais incidente na população brasileira,
seguido pelos tumores de próstata (69 mil), mama feminina (57 mil), cólon e reto (33
mil), pulmão (27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil) (INCA, 2014).
Considerando-se o grande número de novos casos de câncer no país, o
desenvolvimento de técnicas eficientes para prevenção e cura e a descoberta de
novos agentes medicinais nesta área pode apresentar grande impacto tanto na
ciência médica como na economia mundial.
De acordo com um relatório da Organização Mundial de Saúde (OMS), mais
de 80% da população do mundo depende da medicina tradicional para suas
necessidades de cuidados de saúde primários (BHANOT; SHARMA; NOOLVI,
2011).
As plantas têm uma longa história de uso no tratamento de câncer.
Baseando-se nesta tendência, o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos
(National Cancer Institute - NCI), promoveu, em 1960, um programa de triagem em
24
larga escala, na busca de quimioterápicos. Entre 1960 e 1982, foram testadas
35.000 plantas, dando origem a vários fármacos, como vinblastina, vincristina,
paclitaxel (Taxol®) e camptotecina. Como consequência, mais de 60% dos agentes
anticâncer utilizados hoje são provenientes de produtos naturais, incluindo plantas,
microorganismos e organismos marinhos (CRAGG; NEWMAN, 2005; CRAGG;
NEWMAN, 2013).
A busca por agentes anticâncer tem aumentado com o objetivo de se
encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos, ou que visem à descoberta de novas
estratégias que impeçam o avanço da doença (BRANDÃO et al., 2010). Para isto, a
interdisciplinaridade é essencial, sendo a utilização da fitoquímica e da química
orgânica na busca e produção de novos compostos, e os ensaios farmacológicos
demonstrando a atividade dos mesmos e seus respectivos mecanismos de ação.
Os produtos naturais continuam sendo uma das principais fontes de
substâncias ativas utilizadas clinicamente como quimioterápicos (CRAGG;
NEWMAN, 2014). É necessária a constante busca de novos e potenciais compostos,
para a possível chance de descoberta de um novo fármaco com atividade
anticâncer. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo o isolamento e
identificação de substâncias com este potencial.
25
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Obter extratos, frações e compostos puros a partir de plantas com potencial
antiproliferativo (Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e
Maytenus robusta) e avaliar este potencial através de ensaios in vitro, bem como
estabelecer os possíveis mecanismos de ação.
2.2 Objetivos Específicos:
Obter extratos e frações a partir de plantas com potencial antiproliferativo
(Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus
robusta), usando metodologias convencionais de maceração e partição
líquido-líquido;
Avaliar a propriedade antiproliferativa dos extratos e frações obtidas, por meio
de ensaios in vitro, utilizando cultura de células tumorais;
Obter compostos puros a partir dos extratos/frações com promissora atividade
antiproliferativa, usando metodologias convencionais de cromatografia,
identificar por técnicas de espectrometria, e avaliar sua possível atividade
antiproliferativa in vitro;
Realizar os estudos necessários para estabelecer os mecanismos de ação
das substâncias com atividade antiproliferativa significativa;
Avaliar o perfil químico, por meio da técnica de CLAE, das plantas
Synadenium grantii e Cipura paludosa, considerando a variação sazonal.
26
27
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Carcinogênese
O desenvolvimento de neoplasias, ou seja, o processo de carcinogênese, é
resultante de alterações que se acumulam progressivamente no material genético
(DNA) de uma célula normal. Este processo está relacionado à exposição com
agentes carcinogênicos químicos, físicos e/ou biológicos presentes no meio
ambiente, ao estilo de vida de um determinado indivíduo ou de uma população e a
fatores genéticos e epigenéticos (PARMIGIANI; CAMARGO, 2010; VINEIS;
SCHATZKIN; POTTER, 2010).
A carcinogênese é um processo dinâmico, longo e envolve múltiplas etapas,
como iniciação, promoção e progressão, na transformação das células normais em
malignas (ULLAH et al., 2014).
Na etapa de iniciação da carcinogênese ocorre alteração irreversível no DNA,
podendo acarretar mutação. Esta alteração é gerada por uma substância
genotóxica, que provoca danos genéticos passíveis de serem transmitidos para as
células-filhas, mas compatíveis com a sobrevida da célula. Já a etapa de promoção
é caracterizada pela proliferação celular, que contribui com a expansão clonal das
células iniciadas pela ação de um agente promotor. Ou seja, na promoção ocorre a
conversão da célula iniciada em célula pré-maligna. Este estágio é reversível,
apresenta grande período de latência e representa o principal alvo da ação de
agentes quimiopreventivos (IRIGARAY; BELPOMME, 2010; PITOT, 2007).
A progressão da célula pré-maligna em maligna ocorre por divisão e
proliferação celular incontrolada, perda da estabilidade genética, caráter invasivo,
metástase e mudanças nas características bioquímicas, metabólicas e morfológicas
das células. Além disso, é irreversível (OLIVEIRA et al., 2007).
A perda do controle de proliferação e a aquisição de características
associadas com a progressão tumoral são consequências de alterações que
ocorrem no DNA das células normais. A célula alterada sofre uma expansão clonal
transmitindo geneticamente a alteração para todas as células que se originam a
partir dela (PARMIGIANI; CAMARGO, 2010). Estas células podem proliferar
indefinidamente e adquirir defeitos na diferenciação e nos mecanismos de controle
28
que param a divisão celular ou induzem a morte celular (apoptose) em resposta ao
stress celular ou aos danos no DNA (ALBERTS et al., 2008; ALBERTS et al., 2011).
A apoptose é desencadeada por excesso ou falta de estímulos de
crescimento, proliferação e/ou dano celular. Portanto, a apoptose pode representar
um mecanismo protetor contra o desenvolvimento de neoplasias por meio da
eliminação das células com danos genéticos ou das que iniciaram a proliferação
(BRAS; QUEENAN; SUSIN, 2005; KONG et al., 2001).
Cada modificação genética adquirida durante a carcinogênese confere às
células cancerígenas várias vantagens, constituindo os Hallmarks of Cancer
(características do câncer). Estas características favorecem a manutenção das
células, e incluem fatores como a proliferação auto sustentada, evasão de sinais
supressores de crescimento, resistência à apoptose, replicação ilimitada, indução de
angiogênese e ativação de invasão e metástase (HANAHAN; WEINBERG, 2000;
HANAHAN; WEINBERG, 2011)
Por apresentarem propriedades invasivas, as células cancerígenas podem
desprender-se do tumor primário, entrar na circulação sanguínea ou nos vasos
linfáticos e formar tumores secundários em outros locais do organismo (ALBERTS et
al., 2011).
A desregulamentação do ciclo celular também é uma característica comum do
processo de carcinogênese. O ciclo celular é dividido em quatro fases: G1, S, G2 e
M. Na fase G1 (gap 1 = interfase), a célula aumenta de tamanho e prepara-se para
copiar seu DNA. A replicação ocorre na fase seguinte, chamada de S (síntese) e
permite que a célula duplique precisamente seus cromossomos. Depois, inicia-se a
fase G2 (gap 2), durante a qual a célula prepara-se para a fase M (mitose) – na qual
a célula-mãe, aumentada, finalmente divide-se ao meio, para produzir duas células-
filhas, com igual número de cromossomos (MALUMBRES; BARBACID, 2009;
RIVOIRE et al., 2001).
No câncer, as células se reproduzem em um ritmo muito além dos limites
normalmente regulados do ciclo celular, podendo formar tumores malignos.
Felizmente, a prevenção do câncer geralmente ocorre através da regulação do ciclo
celular por grupos de proteínas que interagem entre si em uma sequência específica
de eventos que determinam se o ciclo celular irá continuar ou permanecer parado
entre as fases (CHOW, 2010).
29
Sendo o câncer uma doença complexa que resulta de alterações simultâneas
em genes geralmente relacionados à proliferação e à morte celular, considera-se
estes eventos críticos no desenvolvimento da carcinogênese (FEO et al., 2006;
KANUNFRE et al., 2004; PARMIGIANI; CAMARGO, 2010).
Existe uma ligação inegável entre inflamação e câncer. Já foi confirmada a
presença de células inflamatórias no interior de tumores e que estes podem surgir
em locais de inflamação crônica. Esta observação foi feita há 150 anos e levou à
conclusão de que a inflamação contribui significativamente para o desenvolvimento
de câncer. Atualmente, evidências epidemiológicas indicam que mais de 25% dos
tipos de câncer estão relacionados a infecções crônicas e outros tipos de inflamação
(HUSSAIN; HARRIS, 2007; SCHETTER; HEEGAARD; HARRIS, 2010).
Ambas as vias de inflamação, extrínseca e intrínseca podem levar ao
processo de carcinogênese. Na via extrínseca as condições inflamatórias facilitam o
desenvolvimento do câncer, e na intrínseca as próprias células tumorais estimulam o
início do processo inflamatório, estabelecendo assim um microambiente favorável ao
desenvolvimento tumoral. É por essa razão que, independente da origem do tumor,
geralmente existem células inflamatórias ao seu redor (SCHETTER; HEEGAARD;
HARRIS, 2010; VENDRAMINI-COSTA, 2012).
3.2 Produtos naturais e agentes anticâncer
As plantas têm uma longa história de uso no tratamento de câncer, servindo
como fonte de agentes terapêuticos desde muitos séculos, sendo elas próprias
utilizadas ou servindo como base para o desenvolvimento de drogas sintéticas.
(CRAGG; NEWMAN, 2014; MARCHETTI et al., 2012).
Atualmente, mais de 50% de todos os medicamentos disponíveis no mercado
são originados a partir de fontes naturais, dos quais mais de 70% de agentes
anticâncer tem a sua origem em fontes naturais, devido à sua acessibilidade e
abundância (CHINEMBIRI et al., 2014).
Um dos principais motivos que faz dos produtos naturais fontes ricas de
compostos com potencial terapêutico é que grande parte deles são metabólitos
secundários produzidos pelos organismos com a função de defesa, podendo ser
tóxicos e, portanto, com potenciais antiproliferativos ou irritativos. Estes metabólitos
são, em geral, evolutivamente selecionados para se ligarem a macromoléculas,
30
representando estruturas privilegiadas - excelentes moldes para a síntese de novas
moléculas. (CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2009).
De 1960 a 1982, o NCI realizou um programa de coleta de plantas, com o
objetivo de descobrir agentes anticâncer derivados destas (CHINEMBIRI et al.,
2014).
Hartwell (1982), na sua revisão de plantas usadas contra o câncer, listou mais
de 3000 espécies de plantas que têm sido utilizadas no tratamento desta doença. Os
primeiros agentes derivados de plantas a serem utilizados na prática clínica foram os
chamados alcaloides da Vinca, vinblastina e vincristina (Figura 1), isolados da
Catharanthus roseus G. Don., uma pequena planta endêmica de Madagascar
utilizada popularmente no tratamento de diabetes (CRAGG; NEWMAN, 2005;
CRAGG; NEWMAN, 2013).
Figura 1. Estrutura química dos alcaloides da Vinca, vinblastina e vincristina.
Vinblastina: R=CH3 / Vincristina: R=CHO
Durante os testes de atividade hipoglicemiante, os extratos da C. roseus
reduziram a contagem de leucócitos do sangue e causaram supressão da medula
óssea em ratos, sugerindo avaliação em modelos de leucemias e linfomas. Análogos
semissintéticos mais recentes destes agentes, a vinorelbina e a vindesina, são
utilizados principalmente em combinação com outros quimioterápicos para o
tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo leucemias, linfomas, câncer
testicular, câncer de mama, pulmão, e sarcoma de Kaposi (CRAGG; NEWMAN,
2005).
Os medicamentos de fontes naturais que fazem parte da guerra contra o
câncer incluem os já mencionados alcalóides da Vinca (vimblastina, vincristina,
NH
N
O
ON
N
R
O O
O
O O
H
H
H
H
OH
OH
31
vindesina, vinorelbina), os taxanos (paclitaxel, docetaxel), a podofilotoxina, a
camptotecina e seus derivados (topotecan, irinotecan), as antraciclinas e outros
(BHANOT; SHARMA; NOOLVI, 2011; CRAGG; NEWMAN, 2013).
Uma descoberta importante na área de câncer foi o taxano paclitaxel (Taxol®)
(Figura 2), isolado a partir da casca da Taxus brevifolia em 1962. Este mostrou
excelente atividade anticancerígena in vitro, e em 1977 começaram os testes pré-
clínicos pelo NCI. Finalmente foi aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration)
para uso clínico contra o câncer de ovário em 1992 e contra o câncer de mama em
1994 (BRANDÃO et al., 2010). O sucesso do paclitaxel gerou estudos extensos
sobre a síntese de análogos, e o primeiro a ser desenvolvido foi o docetaxel
(Taxotere®) (CRAGG; NEWMAN, 2013).
Uma vez que o paclitaxel teria que ser extraído de espécies que levam
décadas para crescer e é produzido em quantidades muito baixas (0,01-0,03%), a
introdução desse na terapêutica teve que esperar pelo desenvolvimento da síntese
química e pela descoberta de precursores obtidos de fontes renováveis. O problema
foi contornado quando pesquisadores identificaram a presença, em grande
quantidade, da 10-desacetilbaccatina III (10-DAB), nas folhas da Taxus baccata. Tal
molécula pode ser convertida em paclitaxel e em docetaxel (BRANDÃO et al., 2010).
Figura 2. Estrutura química do taxano paclitaxel (Taxol®).
Outra adição importante no arsenal de fármacos para o anticâncer é a classe
de agentes clinicamente ativos derivados de camptotecina (Figura 3), isolada a partir
da árvore ornamental chinesa, Camptotheca acuminata Decne (Nyssaceae)
(RAHIER; THOMAS; HECHT, 2005).
NHO
OOH
O
O
O
O
OHO
O
O
OO
OH
H
32
Figura 3. Estrutura química da camptotecina.
N
N
O
O
OOH
CH3
O uso da camptotecina foi avançado para ensaios clínicos pelo NCI na
década de 1970, mas foi abandonada devido à toxicidade grave na bexiga. Uma
extensa pesquisa levou ao desenvolvimento de derivados mais eficazes, como o
topotecano e o irinotecano. O topotecano é usado para o tratamento de câncer de
pulmão (tipo pequenas células) e de ovário, enquanto o irinotecano é utilizado para o
tratamento de câncer colorretal (CRAGG; NEWMAN, 2005).
Considerando que o Brasil possui a maior biodiversidade do planeta, com
uma riquíssima flora distribuída em diferentes biomas, inúmeras plantas brasileiras
nativas e exóticas vêm sendo estudadas para avaliar seu potencial anticancerígeno
(CAMPOS et al., 2014). Como exemplo, pode-se citar as espécies Allamanda schottii
e Allamanda blanchettii. Extratos etanólicos das raízes destas plantas demonstraram
uma elevada atividade citotóxica na linhagem leucêmica K-562 e em cultura de
células endoteliais. Os extratos apresentaram efeito citostático nas células K-562 em
uma concentração de 80 g/L, sendo citotóxico a 400 g/L. Efeitos citostáticos e
citotóxicos foram também verificados nas células endoteliais, entretanto, em
concentrações 5 a 10 vezes inferiores às necessárias para células da linhagem
leucêmica. Estes resultados são promissores, tornando as raízes das duas espécies
bons alvos como possíveis agentes anticâncer (CAMPOS et al., 2014; SCHMIDT et
al., 2006).
Entre os compostos isolados do gênero Allamanda que demonstraram
atividade citotóxica vale salientar a elevada atividade dos iridóides plumericina e
isoplumericina em células tumorais de câncer de mama, cólon, pulmão e melanoma
(ABDEL-KADER et al., 1997; ABE; YAMAUCHI, 1988; ANDERSON; CHANG;
MCLAUGHLIN, 1988; CAMPOS et al., 2014; KUPCHAN et al., 1974).
33
As descobertas de novas substâncias de origem vegetal que atuam no
combate ao câncer têm incentivado várias pesquisas nessa área. Número
significativo de substâncias naturais provenientes de plantas estão em estudo clínico
para serem utilizados no tratamento do câncer. (CRAGG; NEWMAN, 2014).
Com o avanço da tecnologia, alguns dos agentes que falharam em estudos
clínicos anteriores, estão sendo estudados novamente. Com a rápida identificação
de novas proteínas que possuem efeitos reguladores importantes sobre a
progressão tumoral, moléculas isoladas a partir de produtos naturais estão provando
ser uma importante fonte de novos inibidores da ação destas proteínas, e têm o
potencial para o desenvolvimento de agentes anticâncer seletivos (CRAGG;
NEWMAN, 2005).
A descoberta e desenvolvimento de fármacos anticâncer exige uma estreita
colaboração multidisciplinar, junto com a otimização através da aplicação da química
combinatória e medicinal, síntese, bioquímica, tudo combinado com a biologia
(CRAGG; NEWMAN, 2014).
3.2.1 Plantas com possível atividade anticâncer selecionadas para este estudo
As plantas foram selecionadas para o estudo devido a dois fatores: uso atual
na medicina popular como agente anticâncer (Synadenium grantii) e por
apresentarem atividade antimicrobiana e anti-inflamatória já comprovadas (Cipura
paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta).
Evidências demostram que agentes antimicrobianos possuem efeitos
antiproliferativos e/ou citotóxicos tanto in vitro como in vivo (ALIBEK et al., 2012).
Além disso, vários estudos epidemiológicos, clínicos e experimentais estabeleceram
os medicamentos anti-inflamatórios como promissores agentes anticâncer
(FAJARDO; PIAZZA, 2015; RAO; REDDY, 2004).
3.2.1.1 Synadenium grantii Hook f. (Euphorbiaceae)
A família Euphorbiaceae é complexa e heterogênea e contém cerca de 300
gêneros e 7.000 espécies que foram identificadas em todo o mundo (BITTNER et al.,
2001). Análises fitoquímicas identificaram a presença de flavonoides, saponinas,
34
terpenos, alcaloides, taninos e lecitinas (DE OLIVEIRA et al., 2013; PREMARATNA;
SHADAKSHARASWAMY; NANJAPPA, 1981).
O gênero Synadenium, que pertence à família Euphorbiaceae, tem sido
associado a algumas propriedades farmacológicas relevantes, tais como anticâncer
(PREMARATNA; SHADAKSHARASWAMY; NANJAPPA, 1981), anti-inflamatória
(SOUZA; AMANCIO-PEREIRA; CARDOSO, 2005), ação fibrinolítica (RAJESH et al.,
2006) e imunorregulação (ROGERIO et al., 2007).
A espécie Synadenium grantii Hook (Figura 4) é um arbusto de origem
africana que pode atingir de 2,5 a 3 metros de altura e possui característica de
elevada toxicidade. É conhecida popularmente no Brasil como "Leiteiro" e “Janaúba”
(ANDERSEN et al., 2010).
Figura 4. Fotografia da planta identificada como Synadenium grantii.
Fonte: Autor.
O látex desta planta é utilizado empiricamente no tratamento de várias
doenças, tais como alergias, distúrbios gástricos e, especialmente, o câncer. Em
alguns estados brasileiros, as pessoas utilizam esse látex como uma preparação
chamada garrafada (ORTÊNCIO, 1997). Tal como outras espécies da Família
Euphorbiaceae, sabe-se que o látex é rico em compostos apolares (COSTA et al.,
2012; DE OLIVERA et al., 2013).
Estudos prévios demonstraram que o latex da S. grantii pode apresentar
efeito antiulcerogênico (COSTA et al., 2012) e antitumoral (DE OLIVERA et al.,
35
2013). Além disso, o extrato de clorofórmio das folhas desta planta apresentou
atividade citotóxica em células MRC-5 (fibroblastos pulmonares humanos), e
antiparasitária contra Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e Plasmodium
falciparum (HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012).
Ensaios in vitro e in vivo demostraram atividade antioxidante e anti-
inflamatória significativa das cascas do caule da S. grantii. Estas atividades podem
estar associadas com a presença de compostos fenólicos e terpenos (MUNHOZ et
al., 2014). Outras investigações fitoquímicas indicaram a presença de terpenos e
compostos fenólicos no extrato das cascas da S. grantii (COSTA et al., 2012).
Alguns outros compostos foram encontrados nesta planta, tais como ésteres de
forbol, triterpenos, antocianinas e substâncias não saponificáveis (ANDERSEN et al.,
2010; BAGAVATHI; SORG; HECKER, 1988; COSTA et al., 2012; HASSAN;
MOHAMMED; MOHAMED, 2012; MUNHOZ et al., 2014).
São poucos os trabalhos científicos com a S. grantii que comprovam sua
atividade anticâncer, apesar de ser largamente utilizada no Brasil. Neste contexto, é
importante a realização de trabalhos com a finalidade de gerar informações
relevantes sobre a espécie S. grantii através da determinação do perfil fitoquímico e
avaliação desta possível atividade anticâncer.
3.2.1.2 Cipura paludosa (Iridaceae)
A família Iridaceae é composta por aproximadamente 90 gêneros, incluindo o
gênero Cipura (RAVENNA, 1988). Extratos e princípios ativos obtidos de plantas
desta família apresentam inúmeras atividades biológicas, como antibacteriana,
anticancerígena, antioxidante, citotóxica, antinociceptiva, anti-inflamatória e
imunomoduladora (ABDULLAEV; ESPINOSA-AGUIRRE, 2004; HOSSEINZADEH;
NORAEI, 2009; RAHMAN et al., 2003).
Cipura paludosa (Figura 5) é uma monocotiledônea nativa brasileira
encontrada na floresta amazônica, e popularmente conhecida como “batata-roxa”,
“alho-do-mato” e "cebolinha-do -campo". É utilizada na medicina popular contra
várias doenças, incluindo inflamações, infecções e afecções do trato renal, diarréia e
processos dolorosos (CORREA,1994).
36
Figura 5. Bulbos frescos da Cipura paludosa.
Fonte: Autor.
Estudos indicaram uma série de atividades biológicas desta planta, incluindo
efeitos antinociceptivo, anti-inflamatório e neuroprotetor, além de sua capacidade
antioxidante e antiglutamatérgica (LUCENA et al, 2007; LUCENA et al, 2010; SILVA-
NETO et al, 2014; TESSELE et al., 2011).
Esta planta vem sendo estudada por pesquisadores do Núcleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) e pelo Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPGCF) da UNIVALI. A partir dos bulbos da
mesma, quatro derivados de naftaleno foram isolados e identificados: três
compostos conhecidos: eleuterina, isoeleuterina e hongkonina (Figura 6 - A), e um
novo componente recentemente isolado, 11-hidroxieleuterina (Figura 6 - B). Os dois
principais compostos (eleuterina e isoeleuterina) exibiram atividade pronunciada em
diferentes modelos in vivo de inflamação e hipernocicepção (TESSELE et al, 2011).
Figura 6. Estrutura química dos compostos isolados dos bulbos da C. paludosa,
hongkonina (A) e 11-hidroxieleuterina (B).
O
O OHCH3
OH
CH3
CH3
(A)
O
O
O
CH3
CH3
OCH3
OH (B)
37
3.2.1.3 Epidendrum mosenii (Orchidaceae)
A família Orchidaceae consiste uma das maiores famílias de plantas florais
conhecias, abrangendo aproximadamente 750 gêneros e mais de 30.000 espécies
(KRAMER, 1989).
A planta Epidendrum mosenii (Figura 7), membro desta família, é uma planta
popularmente conhecida no Brasil como "orquídea da praia", crescendo geralmente
perto da costa brasileira, inclusive no Vale do Itajaí, e usada em casas como uma
planta ornamental (FERREIRA et al., 2000).
Figura 7. Fotografia da planta identificada como Epidendrum mosenii.
Fonte: ROSA, 2006.
Estudo fitoquímico realizado por pesquisadores do NIQFAR da UNIVALI
demonstrou a presença de esteroides e triterpenos nesta planta (FLORIANI et al.,
1998). Também foi verificado ação analgésica, cujo efeito parece estar relacionado
com os triterpenos folidotina e 24-metileno-ciclo-artanol em vários modelos
experimentais in vivo (FERREIRA et al., 2000).
Esta planta também é tradicionalmente utilizada no tratamento de processos
infecciosos e dolorosos. Rosa e colaboradores (2007) demonstraram que 24-
metileno-ciclo-artanol é uma das principais substâncias ativas presentes na planta.
Os resultados farmacológicos indicaram que a fração diclorometano foi ativa quando
avaliada em teste de contorção abdominal em camundongos, sendo mais potente do
que alguns medicamentos de referência utilizados como comparação. Os resultados
38
sugeriram que o efeito antinociceptivo da E. mosenii está relacionado, pelo menos
em parte, à presença do 24-metileno-ciclo-artanol.
Novaes e colaboradores (2001) verificaram que o extrato metanólico desta
planta pode também ser utilizado como agente adjuvante no tratamento de diabetes
mellitus, pois apresentou atividade hipoglicemiante significativa no teste de diabetes
induzido com aloxano em ratos.
3.2.1.4 Maytenus robusta (Celastraceae)
As plantas pertencentes à família Celastraceae são comuns em regiões
tropicais e subtropicais (SPIVEY; WESTON; WOODHEAD, 2002).
O gênero Maytenus é o maior desta família, compreendendo cerca de 225
espécies com importante valor terapêutico, como é o caso da Maytenus ilicifolia,
conhecida popularmente como "espinheira-santa" (BRASIL, 2013; SANTOS-
OLIVEIRA; COULAUD-CUNHA; COLAÇO, 2009). Esta planta já é muito conhecida
por apresentar atividade gastroprotetora, citotóxica, antioxidante, dentre outras
(ARAÚJO-JÚNIOR et al., 2013; SANTOS-OLIVEIRA; COULAUD-CUNHA; COLAÇO,
2009; VELLOSA et al., 2006).
Estudos fitoquímicos realizados com plantas pertencentes ao gênero
Maytenus demonstraram a presença de muitas classes de constituintes, incluindo
flavonoides, alcaloides e terpenos (DE SOUSA et al., 2008; NIERO et al., 2006;
SOUSA et al., 2012; TIBERTI et al., 2007; YARIWAKE et al., 2005).
A planta Maytenus robusta (Figura 8) é usada na medicina popular para tratar
úlceras de estômago (BALBACH, 1980). Estudo recente demonstrou que o extrato
hidroalcoólico desta planta exibe atividade gastroprotetora, inibindo
significativamente a formação de úlceras induzidas usando diferentes modelos, bem
como a sua capacidade para diminuir a secreção gástrica. Esses resultados foram
semelhantes aos resultados observados em estudos realizados com a M. ilicifolia,
que está atualmente em fase de extinção no Brasil. Como a M. robusta é muito bem
adaptada para o Sul do Brasil, os resultados indicam que essa espécie poderia ser
usada em preparações fitoterápicas como um substituto para M. ilicifolia. Além disso,
este trabalho corrobora a indicação tradicional de M. robusta, contribuindo para sua
validação farmacológica (ANDRADE et al., 2007).
39
Figura 8. Fotografia da planta identificada como Maytenus robusta.
Fonte: BRASIL, 2013.
Um novo triterpeno 3,15-dioxo-21α-hidroxi friedelano foi isolado a partir do
extrato metanólico da Maytenus robusta e exibiu potentes efeitos dose-dependentes
no teste de contorção abdominal em camundongos, sendo cerca de 10 vezes mais
ativo do que a aspirina e paracetamol, usado como medicamentos de referência
(NIERO et al., 2006).
3.2.2 Ésteres de Forbol
Ésteres de forbol são membros da família tigliane dos diterpenos. São
compostos policíclicos em que dois grupos hidroxilas, em átomos de carbono
vizinhos, são esterificados em ácidos graxos (OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD,
2012a). Estes compostos são instáveis e sensíveis à oxidação, hidrólise,
transesterificação, e epimerização durante procedimentos de isolamento (HAAS;
STERK; MITTELBACH, 2002).
Diversas plantas são conhecidas por apresentarem estes compostos, dentre
elas, Sapium indicum, Sapium japonicum, Euphorbia frankiana, Euphorbia
cocrulescence, Euphorbia ticulli, Croton spareiflorus, Croton tigilium, Croton
ciliatoglandulifer, Jatropha curcas e Homalanthus nutans, todas da família
Euphorbiaceae (BEUTLER et al., 1989).
Estes compostos são conhecidos por apresentarem vários efeitos biológicos,
como inflamação, promoção de tumor, proliferação e diferenciação celular. A maior
parte das suas ações biológicas parecem ser mediadas através da ativação da
proteína quinase C (PKC), que está envolvida na transdução de sinais e processos
de desenvolvimento da maioria das células (DIMITRIJEVIĆ et al., 1996; GOEL et al.,
2007).
Contraditório com esta capacidade de promoção tumoral, há relatos de
40
atividade apoptótica em células tumorais relacionada à presença dos ésteres de
forbol. Observou-se que muitos tipos de células malignas sofrem inibição de seu
crescimento ou apoptose em resposta à ativação da PKC por estes compostos
(GOEL et al., 2007; GONZALEZ-GUERRICO; KAZANIETZ, 2005).
Estudo recente demonstrou que ésteres de forbol isolados da espécie
Jatropha meal diminuíram a expressão de genes promotores de tumor, e foram
citotóxicos contra as linhagens celulares de câncer de mama (MCF7) e câncer
cervical (HeLa) de maneira concentração-dependente (OSKOUEIAN; ABDULLAH;
AHMAD, 2012b).
Além da atividade antitumoral, alguns ésteres de forbol inibem a replicação do
vírus da imunodeficiência humana (HIV) e produzem mudanças estruturais no
parasita Leishmania amazonensis (GOEL et al., 2007).
3.3 Modelos farmacológicos para avaliação da atividade anticâncer
Atualmente, a combinação entre os modelos in vitro e in vivo tem sido uma
boa estratégia para a descoberta de novos agentes anticâncer. Nos modelos in vitro,
a linha de estudo segue para os ensaios de toxicidade, direcionando a pesquisa
para compostos com potencial de matar células tumorais em cultura, numa
correlação entre a concentração do fármaco utilizado e a resposta seletiva para
alguma célula tumoral. Estes estudos in vitro abordam informações básicas sobre a
célula tumoral e a busca por novos alvos moleculares (CARVALHO et al., 2014;
CHABNER; ROBERTS JR, 2005).
A utilização de modelos biológicos in vitro e in vivo na descoberta da atividade
farmacológica de novos agentes é de extrema importância, principalmente no Brasil,
pela sua imensa biodiversidade de plantas com potencial terapêutico (COSTA, 2011;
NASCIMENTO et al., 2000; VILLAS BÔAS; GADELHA, 2007).
Ensaios baseados em células são muitas vezes usados para triagem de
conjuntos de compostos para determinar se as moléculas de teste têm efeitos sobre
a proliferação celular ou mostram efeitos citotóxicos diretos que eventualmente
conduzem à morte celular (RISS et al., 2013).
A consolidação da metodologia in vitro para avaliação de espécies vegetais
tem permitido a avaliação de centenas de extratos, frações, compostos ativos e
substâncias obtidas por síntese. Com este aprimoramento da metodologia de cultura
41
de células foi possível o cultivo de diversas linhagens celulares oriundas de
neoplasias humanas, possibilitando o desenvolvimento da metodologia para triagem
in vitro. Com esse objetivo, o NCI desenvolveu um painel de células que atualmente
conta com 60 linhagens provenientes de nove tipos de tumores humanos: leucemia,
cólon, mama, rim, cérebro, melanoma, ovário, pulmão e próstata. Dessa forma pode-
se avaliar um número elevado de drogas em diferentes tipos de células neoplásicas,
possibilitando a descoberta de compostos com maior especificidade (BAGULEY,
2002; CARVALHO, 2006; SHOEMAKER, 2006).
A disponibilidade de linhagens celulares bem caracterizadas permite ensaios
de triagem em que o efeito de um candidato a fármaco sobre a proliferação de várias
linhas de células tumorais pode ser determinado (HOGENESCH; NIKITIN, 2012).
Estas linhagens celulares (Tabela 1) usadas para cultura em modelos in vitro
são adquiridas de linhas estabelecidas e fornecidas por bancos celulares, como a
American Type Culture Collection (ATCC) (FRESHNEY, 1994).
Tabela 1. Principais linhagens celulares tumorais humanas utilizadas em ensaios de
atividade antiproliferativa in vitro (ATCC; NCI).
Nome Sigla Densidade de inoculação
Adenocarcinoma colorretal HT-29 5000
Adenocarcinoma de mama MCF7 10000
Adenocarcinoma de ovário OVCAR-3 10000
Adenocarcinoma de ovário
resistente a multidroga
NCI/ADR-RES 15000
Adenocarcinoma de pulmão,
tipo não pequenas células
NCI-H460 7500
Adenocarcinoma de rim 786-0 10000
Adenocarcinoma de próstata PC-3 7500
Glioblastoma U251 7500
Leucemia mielóide crônica K-562 5000
Leucemia promielocítica aguda HL-60 40000
Melanoma UACC-62 10000
Triple negativa breast cancer MDA-MB-231 20000
42
Atualmente as substâncias selecionadas pelos testes em cultura de células (in
vitro) estão sendo avaliadas em modelos experimentais de câncer utilizando animais
de laboratório (in vivo) (CARVALHO, 2006).
A realização de estudos com modelos in vivo tem a finalidade de confirmar a
atividade anticâncer observada nos ensaios in vitro, superando as limitações deste.
Aliada à eficácia dos modelos in vivo, está a avaliação acerca da toxicidade e os
mecanismos de ação dos novos compostos, permitindo a obtenção de informações
acerca da farmacocinética e farmacodinâmica destes compostos (CARVALHO et al.,
2014; HOGENESCH; NIKITIN, 2012;).
3.3.1 Ensaios para avaliar a atividade antiproliferativa in vitro
A avaliação da proliferação celular tem como principal objetivo testar a
atividade biológica de vários compostos, avaliando a capacidade de inibir o
crescimento de células tumorais. Geralmente é o primeiro passo para avaliação dos
produtos naturais candidatos a novos fármacos anticâncer (ALBERTS et al., 2008).
Para a avaliação da atividade antiproliferativa, os testes mais utilizados são os
de citotoxicidade in vitro com células tumorais, sendo o teste do MTT
(MOSMANN,1983) e o teste da Sulforrodamina B (SKEHAN et al., 1990) os mais
aplicados na rotina de triagem de compostos com potencial anticâncer pelo NCI
(HOLBECK, 2004). Estes ensaios permitem avaliar grande número de compostos
em pouco tempo, possibilitando a descoberta de novos fármacos anticâncer. Desta
forma, a maior parte dos quimioterápicos usados hoje na terapêutica foram
selecionados pela capacidade de controlar a proliferação celular (BOGO, 2012; DE
ALMEIDA et al., 2005; SUGGITT; BIBBY, 2005).
Independentemente do tipo de ensaio in vitro a ser utilizado, é importante
saber quantas células remanescentes são viáveis no fim do experimento (RISS et
al., 2013).
A sulforrodamina B (SRB) foi primeiramente introduzida na triagem de drogas
anticâncer, e atualmente tem sido amplamente empregada para a avaliação da
citotoxidade e proliferação celular em ensaios em microplacas (LIN; HOULT;
RAMAN, 1999; SKEHAN et al., 1990).
A SRB é um corante proteico que, em condições moderadamente ácidas, se
liga a aminoácidos básicos da proteína celular, e se dissocia em condições básicas.
43
A ligação da SRB é estequiométrica, e a quantidade de corante extraído de células
pigmentadas é diretamente proporcional a massa total de proteína e, portanto,
correlacionada com o número de células (PAPAZISIS et al., 1997, VICHAI;
KIRTIKARA 2006). Este corante se liga aos resíduos de aminoácidos básicos das
proteínas de células viáveis. Portanto, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao
compartimento, menor a atividade antiproliferativa da amostra testada, pois há mais
células viáveis (MONKS et al., 1991; SKEHAN et al., 1990).
O princípio do ensaio da SRB baseia-se na habilidade que tem este composto
de se ligar a componentes proteicos das células, fixados pelo ácido tricloroacético;
ou seja, o método independe da atividade metabólica das células, ao contrário do
MTT que depende de uma enzima mitocondrial (HOUGHTON et al., 2007).
Um dos agentes mais utilizados para a avaliação de viabilidade e proliferação
celular é o metil-tiazolil-tetrazólio, conhecido como MTT (brometo de 3-[4,5-
dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio), que foi descrito por Mosmann em 1983.
O sal MTT, de coloração amarela, é reduzido na mitocôndria das células
vivas, através da clivagem da enzima mitocondrial succinato desidrogenase, em
cristais de formazan, de coloração púrpura. Para a grande maioria das linhagens
celulares, há uma relação linear entre a quantidade de formazan formado e o
número de células vivas, dentro de uma faixa de densidade celular (BHATIA;
YETTER, 2008; CARVALHO et al., 2014).
Quando as células morrem, elas perdem a capacidade de reduzir o MTT a
cristais púrpuros de formazan, assim a cor púrpura serve como um marcador de
células vivas. Dessa maneira a quantidade de formazan, medida por
espectrofotometria (com absorbância perto de 570nm), é diretamente proporcional
ao número de células viáveis. (MARSHALL; GOODWIN; HOLT, 1995).
Um aspecto muito discutido atualmente sobre o MTT diz respeito à exata
localização celular da reação de redução que gera o formazan. Desde o início da
utilização deste método, assumiu-se que a redução do MTT para formazan
acontecia por ação de desidrogenases mitocondriais. A consequência desta
explicação foi assumir que o MTT é reduzido dentro da mitocôndria (CARVALHO et
al., 2014).
44
45
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
A seleção das plantas estudadas no presente trabalho se deu de duas
formas: reavaliação de plantas, já estudadas pelo grupo do NIQFAR, com potencial
biológico em experimentos que possam indicar algum indício de ação anticâncer
(antimicrobiano, anti-inflamatório, etc.), como a C. paludosa, E. mosenii, e M.
robusta; prospecção de plantas usadas contra o câncer, conforme indicações da
medicina popular, como a S. grantii.
Na Tabela 2 estão apresentadas todas as plantas, as partes utilizadas, assim
como a data e o local de coleta.
Tabela 2. Plantas e suas partes coletadas para realização do trabalho.
Planta Partes
utilizadas
Data / local 1ª
coleta
Data / local 2ª
coleta
Data / local 3ª
coleta
Synadenium
grantii
Caule e folhas Março 2013 –
Itajaí (SC)
Agosto 2013 –
Itajaí (SC)
Março 2014 –
Itajaí (SC)
Cipura
paludosa
Bulbo e raíz Março 2013 –
Itajaí (SC)
Agosto 2013 –
Itajaí (SC)
Sem coleta
Epidendrum
mosenii
Caule, folhas e
raíz
Fevereiro 2013
Jaguaruna
(SC)
Sem coleta Sem coleta
Maytenus
robusta
Raíz Março 2013 –
Ilhota (SC)
Sem coleta Sem coleta
As plantas foram coletadas no mesmo local nas diferentes épocas indicadas
na Tabela 2.
Todas as plantas foram identificadas pelo Dr. Oscar B. Iza (Departamento de
Botânica da Universidade de Vale do Itajaí). Um comprovante de amostra foi
depositado no Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí, Santa Catarina, sob número
de excicata VC Filho 118, 108, 003 e 012 para Synadenium grantii, Cipura paludosa,
Epidendrum mosenii e Maytenus robusta, respectivamente.
46
4.2 Análise fitoquímica
O material vegetal selecionado, conforme a Tabela 2, foi moído e submetido a
um processo de maceração com metanol à temperatura ambiente, por um período
de uma semana. Após, o solvente foi removido por destilação em rotaevaporador
sob pressão reduzida, para obtenção do respectivo extrato metanólico bruto (EMB).
O EMB da S. grantii foi solubilizado com os solventes de polaridade crescente:
acetona e metanol.
Após triagem da atividade antiproliferativa dos extratos e frações, as duas
plantas que apresentaram resultados promissores (caule da S. grantii e bulbos da C.
paludosa), foram submetidas à nova coleta e a procedimentos cromatográficos
usuais, como cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em coluna
(CC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (CECHINEL FILHO; YUNES,
1998; MALHEIROS et al., 2010), visando o isolamento e a purificação dos possíveis
princípios ativos presentes nessas espécies.
4.2.1 S. grantii
Caules frescos (1 Kg) da S. grantii foram cortados em pedaços pequenos e
submetidos a extração por maceração com metanol à temperatura ambiente durante
sete dias. Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão
reduzida em rotaevaporador com controle de temperatura em aproximadamente 50
oC. O EMB obtido (31 g) teve um rendimento de 3,1%. Este foi então resuspendido
em uma mistura de metanol:H2O (50:50) e submetido a partição líquido-líquido,
utilizando os solventes de polaridade crescente, clorofórmio (CHCl3) e acetato de
etila (AE), para a obtenção das respectivas frações, conforme metodologia
anteriormente descrita (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; MALHEIROS et al.,
2010).
Todas as frações foram concentradas em rotaevaporador, tendo como
rendimento 2,55% a fração CHCl3 (790 mg) e 5,81% a fração AE (1,8 g). Na Figura 9
está apresentado o fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii na 2ª
coleta.
47
Figura 9. Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 2ª coleta.
Por apresentar melhor resultado na triagem da atividade antiproliferativa
realizada com a 1ª coleta, 700 mg da fração CHCl3 (mais apolar) passou por um
processo de CC aberta (Ø 3,5 x 50 cm), tendo como fase estacionária sílica gel 60
(Merck) (40 g) de granulometria 70-230 mesh (0,063 - 0,20 mm), eluída com
gradiente de hexano e hexano:AE em polaridade crescente (hexano, 100 mL; 90:10,
100 mL; 80:20, 100 mL; 70:30, 100 mL; 50:50, 100 mL; AE, 100 mL). Foram
coletadas 50 subfrações de aproximadamente 20 mL cada.
As frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de CCD
(cromatoplacas de sílica gel 60 F254 - Merck), utilizando hexano:acetona (80:20)
como fase móvel. As placas foram reveladas em câmara de UV (254nm) e com
anisaldeído sulfúrico com aquecimento a 100°C. As frações que exibiram o mesmo
perfil cromatográfico foram reunidas e, quando impuras, nova CC foi realizada.
Visando o isolamento e a purificação dos possíveis princípios ativos presentes
na espécie em estudo, nova coleta do caule (2,5 kg) foi realizada (3ª coleta). O
mesmo foi cortado em pedaços pequenos e submetido ao processo de maceração
com metanol, por um período de uma semana.
48
Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão reduzida
em rotaevaporador (temperatura em aproximadamente 50 oC), para obtenção do
respectivo EMB, com rendimento de 2,2% (55 g). Este foi então particionado com os
seguintes solventes de polaridade crescente: CHCl3 (2,4 g / rendimento de 4,36%) e
AE (1,1 g / rendimento de 2%). A Figura 10 apresenta o fluxograma da obtenção das
frações do caule da S. grantii na 3ª coleta.
Figura 10. Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 3ª coleta.
A fração CHCl3 (2 g) foi utilizada para realização de CC (Ø 3,5 x 50 cm), tendo
como fase estacionária sílica gel 60 (40 g), eluída com gradiente de hexano e
hexano:AE em polaridade crescente (hexano, 100 mL; hexano:AE (95:05), 100 mL;
90:10, 100 mL; 85:15, 200 mL; 80:20, 200 mL; 70:30, 300 mL; 60:40, 200 mL; AE,
200 mL). Foram coletadas 73 frações de aproximadamente 20 mL cada.
As frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de CCD,
utilizando hexano:acetona (80:20) como fase móvel. As placas foram reveladas por
UV (254nm) e com anisaldeído sulfúrico com aquecimento a 100°C. As frações que
49
exibiram o mesmo perfil cromatográfico foram reunidas e quando impuras foram
purificadas por cromatografia flash (CC: Ø 1,5 x 30 cm), tendo sílica gel 60 (15 g) de
granulometria 230-400 mesh (0,04 – 0,063 mm) como fase estacionária.
4.2.2 C. paludosa
Os bulbos frescos (1 kg) da C. paludosa foram cortados em pedaços
pequenos e extraídos por maceração com metanol à temperatura ambiente durante
sete dias.
Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão reduzida
em rota evaporador com controle de temperatura em aproximadamente 50 oC. O
EMB (28 g) obtido teve um rendimento de 2,8%.
Parte do EMB (13 g) passou pelo processo de CC (Ø 5,0 x 50 cm), tendo
como fase estacionária sílica gel 60 (50 g), eluída com gradiente de hexano e
hexano:AE em polaridade crescente (hexano, 200 mL; 90:10, 200 mL; 80:20, 200
mL; 70:30, 300 mL; 50:50, 200 mL; AE 200 mL).
Frações de 10 mL foram coletadas e avaliadas por CCD utilizando hexano:AE
(80:20) como fase móvel. As placas foram reveladas em câmara de UV (254 nm) e
anisaldeído sulfúrico com aquecimento de 100°C. As frações que exibiram o mesmo
perfil cromatográfico foram reunidas, quando impuras foram purificadas por CC ou
cromatografia flash.
4.2.3 Análise da variação sazonal
A análise da variação sazonal foi realizada pela metodologia de CLAE. Foi
utilizado um sistema LC Shimadzu LC-20AT (Shimadzu, Tóquio, Japão), composto
por um foto detector por arranjo de diodos SPD-M20A, um amostrador automático
SIL-20AHT e software LC-Solution (Shimadzu, Tóquio, Japão). As amostras foram
diluídas em metanol a 1 mg/ml. As injeções da amostra (20 µL) foram realizadas em
coluna Coluna Phenomenex® Sinergy 4µm Hydro-RP 80A (150 x 4,60 mm)
condicionada a 40°C. A fase móvel consistiu em água ultrapura, acetonitrila e
metanol, e foi eluída em um sistema de gradiente de 37 minutos, conforme a Tabela
3. As análises foram monitorizadas entre 210 e 240 nm. Todos os solventes
utilizados foram de grau CLAE.
50
Tabela 3. Sistema de solventes utilizados para técnica de CLAE.
Tempo (min) Água ultrapura (%) Acetonitrila (%) Metanol (%)
0 90 8 2
10 58 40 2
20 8 90 2
37 90 8 2
4.3 Identificação dos compostos
Para elucidar e caracterizar quimicamente os compostos purificados, foram
utilizados dados espectroscópicos usuais como Infravermelho (IV), Ressonância
Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-1H) e carbono 13 (RMN-13C) e CLAE
(MALHEIROS et al., 2010).
Para elucidação estrutural dos compostos isolados, foram utilizados os dados
de RMN-1H e RMN-13C. Ambas as técnicas foram realizadas no espectrômetro
BRUKER AC-300F 300 MHz, tendo como referência interna o tetrametilsilano (TMS)
ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram registrados em valores
adimencionais (ppm).
A avaliação dos espectros obtidos dos compostos puros foi acompanhada
com o auxílio de tabelas que indicam deslocamentos químicos para hidrogênios e
carbonos em comparação com trabalhos encontrados na literatura. Todas as
análises foram supervisionadas pelo Professor Dr. Franco Delle Monache da
Universidade de La Sapienza, Roma (Itália).
As análises espectrométricas por IV foram realizadas em espectrômetro
interfotométrico Fourier Transform Infrared IRPrestige 21 (SHIMADZU), pelo método
de reflectância difusa – DRIFTS. Os espectros foram obtidos registrando
transmitância versus número de onda (cm-1) e foram corrigidos pelo algoritmo
Kubelka Munk.
Para análise através da CLAE, foi utilizado o mesmo equipamento da análise
da variação sazonal (item 4.2.3). As amostras foram diluídas em metanol a 1 mg/ml,
e as injeções das mesmas (20 µL) foram realizadas em coluna C18 Luna
Phenomenex® (Wedelia) (250 x 4,6 mm, com espessura de película de 0,5 μm e
100 A), condicionada a 35°C. A fase móvel consistiu em acetonitrila (A) e água (pH
51
2,5 - ácido fosfórico) (B) e foi eluída em um sistema de gradiente, começando com
2% de A e após 98 minutos 100% de A. Isto foi seguido por um período de equilíbrio
de 10 minutos antes da injeção da amostra seguinte. As análises foram
monitorizadas a 210 nm. Todos os solventes utilizados foram de grau CLAE.
4.4 Atividade antiproliferativa in vitro
4.4.1 SRB
Para a avaliação da atividade antiproliferativa in vitro, pelo método da SRB, foi
realizado estágio no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas (CPQBA) na Universidade de Campinas (UNICAMP) através da Rede
Iberoamericana de Investigação em Câncer (RIBECANCER/CYTED/CNPq), sob a
supervisão do Professor Dr. João Ernesto de Carvalho.
A triagem para atividade antiproliferativa in vitro foi realizada em 4 linhagens
de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460
(pulmão, tipo não pequenas células). Valores GI50 (concentração necessária para
inibir em 50% o crescimento celular) foram calculados para avaliação desta
atividade.
As frações e/ou compostos que apresentaram melhor atividade
antiproliferativa foram novamente testados nas seguintes linhagens de células
tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com
fenótipo de resistência a múltiplos fármacos), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo
não pequenas células), PC-3 (próstata), OVCAR-03 (ovário), HT-29 (cólon), K-562
(leucemia); e em uma linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). Para
avaliação foram utilizados os valores de GI50: Growth Inhibition 50 – concentração
necessária para inibir 50% do crescimento celular e TGI: Total Growth Inhibition –
concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular.
A metodologia foi realizada conforme descrito por Vendramini-Costa (2012).
No primeiro dia de experimento, a suspensão celular foi preparada com meio RPMI
(meio de cultura Roswell Park Memorial Institute) com 5% de soro fetal bovino (SFB)
e penicilina-estreptomicina (2 mg/L), e ajustada em sua respectiva densidade de
inoculação. Foram aplicados 100 µl de suspensão celular em placas de 96 poços
(Figura 11), que foram incubadas por 24 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2
52
e ambiente úmido. Foi também preparada uma placa controle (placa T0), com todas
as linhagens celulares utilizadas no experimento.
As amostras (extratos, frações e compostos puros) foram diluídas em solução
de dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck®) na concentração de 0,1 g/mL. Para a adição à
cultura de células, estas soluções foram diluídas em pelo menos 400 vezes em
RPMI com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina (2 mg/L), evitando a toxicidade do
DMSO. As amostras foram adicionadas nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250
µg/mL, (100 µL/poço) em triplicata, e incubadas por 48 horas a 37°C em atmosfera
de 5% de CO2 e ambiente úmido. Como controle positivo foi utilizado o
quimioterápico doxorrubicina, nas concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 µg/mL
(100 µL/compartimento) em triplicata.
Figura 11. Placa de 96 poços utilizada nos testes de atividade antiproliferativa in
vitro.
Fonte: VENDRAMINI-COSTA, 2012.
No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle
T0 foram fixadas com a adição de 50 µL/poço de ácido tricloroacético (TCA) a 50%
(Sigma®) para determinação da quantidade de células presentes no momento em
que as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal 0. O TCA atua como um
53
fixador, precipitando proteínas. Células viáveis se mantém fixas na placa, enquanto
células não viáveis se desprendem, sendo lavadas.
Após 48 horas de tratamento as células tratadas também foram fixadas com
TCA a 50% e incubadas por 1 hora a 4°C. Em seguida, as placas foram submetidas
a quatro lavagens consecutivas com água corrente e foram mantidas à temperatura
ambiente até a secagem completa. Após a secagem, foram adicionados 50 µL/poço
do corante proteico SRB (Sigma®) a 0,4% dissolvido em ácido acético a 1% e a
seguir as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. Estas
foram então lavadas por 4 vezes consecutivas com solução de ácido acético 1% e,
após secagem completa à temperatura ambiente, o corante ligado às proteínas
celulares foi solubilizado com 150 µL/poço de Trizma Base (10µM, pH 10,5)
(Sigma®). A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em leitor de
microplacas a 540nm (Molecular Devices®, modelo VersaMax).
A porcentagem de inibição do crescimento de cada amostra testada foi
calculada segundo Carvalho e colaboradores (2014), sendo que T equivale a média
da absorbância da célula tratada, C o controle de célula e T0 o controle das células
no dia da adição das amostras.
Se T > C, a amostra estimulou o crescimento = proliferação celular
Se T ≥ T0 e < C, a amostra apresentou efeito citostático (inibição do
crescimento) e a fórmula utilizada foi 100 X [(T-T0) / (C-T0)];
Se T < T0, a amostra apresentou efeito citocida (morte celular) e a fórmula
utilizada foi 100 X [(T-T0) / (T0)].
O resultado obtido foi subtraído de 100%, obtendo-se então a porcentagem
de crescimento. Os dados de absorbância foram analisados e compilados na
elaboração de gráficos relacionando a porcentagem de crescimento celular com a
concentração da amostra. As amostras foram consideradas ativas quando
apresentaram inibição de crescimento maior que 50%. Utilizando-se o software
Origin®, realizou-se a regressão linear dos dados obtidos com as médias da
porcentagem de crescimento e foram calculados os valores de TGI (T=T0) e GI50.
4.4.2 MTT
Os compostos naturais isolados (na sua forma mais pura) que apresentaram
melhores resultados na primeira avaliação da atividade antiproliferativa foram
54
selecionados para novos testes, tanto para confirmar tal atividade, como para
descrever seu possível mecanismo de ação. Para isto, foi realizado novo estágio no
Centro de Investigacion del Cancer na Universidad de Salamanca (Salamanca -
Espanha) através da RIBECANCER, sob a supervisão do Professor Dr. Atanásio
Pandiella.
Foram utilizadas as seguintes linhagens celulares de câncer de mama triplo-
negativo: MDA-MB231 e HBL100. As células foram cultivadas em meio de cultura
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), suplementado com 10% de SFB e
antibióticos, e mantidas a 37°C em atmosfera húmida, na presença de 5% CO2 e
95% de ar. As linhagens celulares foram obtidas da American Type Culture
Collection (ATCC - Manassas, VA). O meio de cultura celular e SFB foram
adquiridos da Invitrogen (Gaithersburg, MD, USA).
A avaliação da proliferação celular foi realizada utilizando o ensaio de MTT,
em que o mesmo é reduzido a cristais púrpuros de formazan pela mitocôndria de
células vivas. Aumento no número de células é detectado pelo aumento da
metabolização do MTT, e diminuição no número de células é refletida pela
diminuição metabolização do mesmo (SEOANE et al., 2010).
As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a 8000 células/poço
(MDA-MB231) e 150000 células/poço (HBL100) e cultivadas durante a noite em
DMEM + 10% de SFB. No dia seguinte, um ensaio MTT foi realizado em uma placa
e considerado o ponto de partida (dia 0). Nas outras placas, o meio foi substituído
por de 1 mL de DMEM e 1 µL dos compostos nas concentrações 10 nM, 100 nM, 1
µM, 10 µM e 100 µM ou com 1 µL do controle DMSO, em quadruplicata.
Após 72h de tratamento, foi realizado o ensaio de MTT. Cada poço das
placas foi substituído por 110 µL de meio contendo MTT (5 mg/mL em tampão
fosfato-salino [PBS]) e incubados por 1 hora. O meio foi então removido e 500 µL de
DMSO foi adicionado a cada poço. As placas foram agitadas no escuro por 10
minutos para dissolver os cristais de MTT-formazan. A absorbância das amostras foi
registada a 570 nm em leitor de placas com múltiplas cavidades (Tecan ULTRA
Evolution, Männedorf, Switzerland). Os resultados são apresentados como média ±
desvio padrão em quadruplicada (SEOSANE et al., 2010; YUSTE et al., 2005).
Com base nesses resultados, o composto mais ativo foi escolhido para
continuar os estudos avaliando mecanismo de ação (ciclo celular e apoptose) in
vitro.
55
4.5 Análise do ciclo celular e apoptose
Para a análise de ciclo celular, as células MDA-MB231 foram cultivadas em
placas de cultura celular de 100 mm (300000 células por placa), e após 24 horas de
crescimento, uma placa foi tratada com o composto na concentração de 100 µM e
outra apenas trocado o meio de cultura celular.
Após as 48 horas de tratamento em estufa, o meio de cultura das placas foi
coletado e as células foram lavadas com PBS e incubadas com tripsina-EDTA. As
mesmas foram coletadas em um tubo de citômetro e centrifugadas a 300 g por 5
minutos a 4°C. O sobrenadante foi aspirado, ficando as células no fundo do tubo. Foi
adicionado 200 µL de PBS e 1 mL de etanol 70%. As células foram então guardadas
em -20°C.
No dia seguinte, as células foram centrifugadas a 300g por 10 minutos a 4°C.
Foi aspirado novamente o sobrenadante e adicionado 500 µL de PBS e RNAse A
(Sigma-Aldrich). As células foram então incubadas por 1 hora a 37°C. Após esse
período, foi adicionado 2,5 µL Iodeto de Propídio (IP) – 1 mg/mL (SEOSANE et al.,
2010). A análise do ciclo celular foi realizada no citômetro de fluxo Accuri C6 pelo
software BD AccuriTM C6.
Para avaliação da apoptose, as células foram plaqueadas e tratadas da
mesma forma que para o protocolo de ciclo celular. Após a primeira centrifugação a
300 g por 5 minutos a 4°C, o sobrenadante foi aspirado e foi adicionado 100 µL de
binding buffer e após Anexina V/FITC (BD Biosciences) e IP – 50 µg/mL. As células
foram incubadas por 30 minutos no escuro e adicionado mais 400 µL de binding
buffer (MONTERO et al., 2014; SEOSANE et al., 2010). A análise foi realizada no
citômetro de fluxo Accuri C6 pelo software BD AccuriTM C6.
56
57
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise Fitoquímica
5.1.1 Caule da S. grantii
Com base nos resultados em relação à atividade antiproliferativa deste
trabalho, a fração mais apolar (CHCl3), com rendimento de 2,55%, do caule da S.
grantii foi escolhida para realização de procedimentos cromatográficos (Figura 12).
As subfrações obtidas foram analisadas por CCD e reunidas quando exibiram o
mesmo perfil cromatográfico. A subfração 5-13 (118 mg), obtida com hexano:AE
(90:10) foi recromatografada utilizando-se um sistema de solvente hexano:AE. As
duas subfrações que apresentaram melhor perfil fitoquímico avaliado por CCD
(Figura 13), 11-15 (37 mg) e 16-19 (26 mg), ambas com a possível característica de
terpenos, pois apresentaram colocação azul e preto quando reveladas com
anisaldeído sulfúrico, foram avaliadas na atividade antiproliferativa in vitro.
Figura 12. Fluxograma de operações realizadas para purificação de substâncias da
fração CHCl3 do caule da S. grantii.
CC = Coluna cromatográfica; FM = Fase móvel; FE = Fase estacionária.
58
Figura 13. Cromatografia em camada delgada (CCD) das subfrações 11-15 e 16-19
da fração CHCl3 do caule da S. grantii.
Fase móvel: hexano:acetona (80:20). Revelador: anisaldeído sulfúrico com aquecimento em placa
aquecedora (100°C).
Com o objetivo de isolar maior quantidade e identificar os compostos
presentes, após nova coleta, foi realizada CC com 2 g da fração CHCl3 do caule da
S. grantii. A partir de procedimentos cromatográficos em coluna aberta e flash,
demonstrados na Figura 14, dois compostos puros foram obtidos, composto 1 e
composto 2. Para elucidação e caracterização química destes compostos, foram
utilizados dados de IV, RMN-1H, RMN-13C e CLAE.
59
Figura 14. Fluxograma de operações realizadas para obtenção de compostos puros
da fração CHCl3 do caule da S. grantii.
CC = Coluna cromatográfica; FM = Fase móvel; FE = Fase estacionária.
O espectro de absorção no IV referente ao composto 1 (Figura 14) apresenta
bandas de absorção com intensidade máxima em 2970,30 cm-1, referente à
estiramento de Csp3H. Em 1724 e 1751cm-1 são observados estiramentos de C=O,
em 1600 cm-1 estiramentos de C=C e entre 1000 e 1300cm-1 estiramentos de C-O. A
partir destas informações pode-se inferir que o composto 1 apresenta o grupo
funcional éster, além de insaturações que podem ser atribuídas a grupos alcenos e
aromáticos.
60
Figura 15. Espectro de infravermelho (IV) do composto 1.
Através da análise dos dados de RMN-1H e RMN-13C, o composto 1 foi
identificado como o éster de forbol 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol,
demonstrado na Figura 16. Este composto é raro e seu isolamento foi relatado na
literatura recentemente, a partir das folhas da S. grantii (HASSAN; MOHAMMED;
MOHAMED, 2012).
Os espectros de RMN-1H (Figura 17), RMN-13C (Figura 18) e DEPT (Figura
19) mostram a presença de quatro grupos metila δH 0.88 (3H, d, J = 4.5), 0.98 (3H,
s), 1.04 (3H, s), 1.53 (3H, m) e em δC 15.60, 17.26, 28.63 e 15.08 referentes as
metilas 18, 17, 16 e 19, respectivamente. Quatro grupos acetil foram verificados em
δH 1.96 (3H, s), 2.02 (3H, s), 2.10 (3H, s) e 2.14 (3H, s); em δC 20.61, 20.74, 20.98
e 21.10 e em δC 169.78, 170.16, 170.78 e 170.91, relativos a carboxilas. Estes
grupos estão ligados aos carbonos 3, 4, 12 e 13, respectivamente. Também se
observa um grupo fenilacetil em δH 3.74 (2H, s), δC 41.62 e 169.96 C=O, além dos
sinais relativos aos hidrogênios e carbonos aromáticos. Hidrogênios referentes a
dois grupos olefinas tri-substituídos foram encontrados em δH 4.65 (1H, d, J = 10.8)
e 5.16 (1H, dl, J = 13.2), cujos carbonos se encontram em δC 124.59, 129.19,
129.46 e 136.50.
61
Os dados de RMN encontram-se na Tabela 4, os quais foram comprovados
com dados encontrados na literatura (HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012) e
estão de acordo com a estrutura da Figura 16.
Figura 16. Estrutura molecular do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-
tetraacetilforbol (composto 1).
62
Figura 17. Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) ampliado de 9.5 a 1.0 ppm do
composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol.
63
Figura 18. Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 10 a 170 ppm do
composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol.
64
Figura 19. Espectro de DEPT-135 do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-
tetraacetilforbol (CDCl3 75MHz).
65
Tabela 4. Dados de RMN-1H, RMN-13C e DEPT do composto 1 (20-fenilacetato de
3,4,12,13-tetraacetilforbol) em comparação com dados da literatura*.
Composto 1 Composto 1*
δH δC δH δC
1 4.65 (1H, d, J=10.8Hz) 129.19 CH 4.66 (1H, dd, J=1.2 e 11.2Hz) 129.21b
2 136.5 C 136.53a
3 5.37 (1H, s) 70.76 CH 5.36 (1H, s) 70.82b
4 67.14 C 66.59a
5 2.12–2.18 (2H, m) 38.88 CH2 2.12–2.19 (2H, brd, J=12.8Hz) 38.90c
6 124.59 C 124.69a
7 5.16 (1H, dl, J=13.2Hz) 129.46 CH 5.16 (1H, brd, J=11.6Hz) 129.22b
8 1.39 (m) 26.37 CH 1.39 (1H, brd, J=9.2Hz) 26.44b
9 77.43 C 77.73a
10 1.10–1.17 (1H, m) 29.68 CH 1.11–1.16 (1H, m) 29.70b
11 2.32 (1H, m) 29.27 CH 2.29 (1H, dd, J=7.2 e 8.4Hz) 29.32b
12 5.10 77.00 CH 5.11 (1H, d, J=8.4Hz) 77.49b
13 67.14 C 66.55a
14 1.10–1.17 (1H, m) 29.68 CH 1.11–1.16 (1H, m) 29.69b
15 22.88 C 22.88a
16 1.04 (3H, s) 28.63 CH3 1.08 (3H, s) 28.65d
17 0.98 (3H, s) 17.26 CH3 0.97 (3H, s) 17.25d
18 0.88 (3H, d, J=4.5Hz) 15.60 CH3 0.86 (3H, d, J=7.2Hz) 15.60d
19 1.53 (m) 15.08 CH 1.53 (3H, d, J=1.2Hz, CH3-19) 15.10b
20 4.38 (2H, s) 60.58 CH2 4.38 / 4.64 (2H, brd, J=12.4Hz) 60.61c
C=O 169.96 C 169.94a
CH2 3.74 (2H, s) 41.62 CH2 3.72 (2H, s) 41.64c
1’ 134.08 C 134.14a
2’,6’ 129.60 CH 129.48b
3’,5’ 128.59 CH 128.59b
4’ 127.21 C 127.22a
3-OCOCH3 1.96 (3H, s) 169.78 C
20.61 CH3
2.00 (3H, s) 169.74a
20.59d
4-OCOCH3 2.02 (3H, s) 170.16 C
20.74 CH3
2.01 (3H, s) 170.14a
20.72d
12-OCOCH3 2.10 (3H, s) 170.78 C
20.98 CH3
2.10 (3H, s) 170.74a
20.97d
13-OCOCH3 2.14 (3H, s) 170.91 C
21.10 CH3
2.14 (3H, s) 170.88a
21.09d
*HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012. a: quaternário (C), b: terciário (CH), c: secundário (CH2),
d: primário (CH3).
66
Por semelhança observada através de CCD, foi realizada a técnica de CLAE
para verificar a presença do composto 1 (tempo de retenção em ± 77 minutos) na
subfração 11-15 da 1ª análise, confirmando a presença do mesmo (Figura 20).
Figura 20. Análise por CLAE da subfração 11-15 da fração CHCl3 do caule da S.
grantii e do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol).
O composto 2 ainda não foi identificado, mas está em fase de elucidação
estrutural.
A estrutura dos ésteres de forbol é dependente do esqueleto de carbono
diterpeno tetracíclico conhecido como tigliane, que representa a porção de álcool
fundamental destes compostos. Tigliane contém quatro anéis designados como A, B,
C e D. Estes compostos têm sido isolados de plantas pertencentes à família
Euphorbiaceae (DIMITRIJEVIĆ et al., 1996; EVANS, 1986; GOEL et al., 2007;
OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD, 2012a).
Alguns padrões anteriormente isolados da S. grantii, entre os quais friedelina,
3β-friedelanol, eufol e citrostadienol (DE OLIVEIRA et al., 2013; MUNHOZ et al.,
2014) foram avaliados por CCD junto com a fração CHCl3, e não foi verificada a
presença dos mesmos nesta fração.
67
5.1.2 Bulbos da C. paludosa
Parte do EMB dos bulbos da C. paludosa passou pelo processo de
fracionamento por CC, conforme demonstrado na Figura 21. As subfrações foram
analisadas por CCD e reunidas quando exibiram o mesmo perfil cromatográfico.
Figura 21. Fluxograma de operações realizadas para purificação do EMB da C.
paludosa.
CC = Coluna cromatográfica; FM = Fase móvel; FE = Fase estacionária.
A subfração 16-27 (635 mg), eluída com hexano:AE (90:10) foi escolhida para
realização de nova CC. A partir desta, foi obtido 25 mg do composto isoeleuterina
(Figura 22) e 23 mg de eleuterina (Figura 23), ambos já isolados a partir dos bulbos
da C. paludosa, por pesquisados do NIQFAR (TESSELE et al., 2011). Ambas foram
comparadas diretamente com as amostras autênticas previamente isoladas da
mesma fonte.
68
Figura 22. Estrutura molecular do composto isoeleuterina.
O
O O
O
CH3CH3
CH3
Figura 23. Estrutura molecular do composto eleuterina
O
O O
O
CH3CH3
CH3
A subfração 11-20 (83 mg), da 2ª coluna, foi submetida à CC flash e obteve-
se 14 mg do composto eleuterol (Figura 24), identificado por técnicas de RMN-1H e
RMN-13C.
O espectro de RMN-1H (Figura 25) mostra a presença de 4 sinais de
hidrogênios aromáticos em δ 6.95, 7.38, 7.57 e 7.89. O espectro mostra também um
simpleto em δ 4.11 referente aos hidrogênios do grupo metóxi, ligado ao anel
aromático A. Em δ 1.73 estão os hidrogênios do grupo metila ligado ao C-3. O
quarteto em δ 5.72 refere-se ao hidrogênio do metileno do carbono em que a metila
está ligada. Em δ 9.65 é possível verificar a presença do hidrogênio do grupo OH.
Quando se analisa o espectro de RMN-13C (Figura 26), é possível observar dois
sinais em δ 19.2 e 56.4, referentes aos carbonos dos radicas metila ligados aos
carbonos 3 e 5. Um sinal em δ 78.5, característico do carbono C-3. O sinal em δ
156.6 refere-se ao carbono C-5 ligado ao grupo metóxi. Estes dados foram
comparados com os da literatura na tabela 5 (HARA et al., 1997; IEYAMA;
69
GUNAWAN-PUTERI; KAWABATA, 2011; SHIBUYA et al., 1997), e estão de acordo
com a estrutura proposta na Figura 24.
Figura 24. Estrutura molecular do composto eleuterol.
Figura 25. Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) do composto eleuterol.
70
Figura 26. Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 20 a 160 ppm do
composto eleuterol.
71
Tabela 5. Dados de RMN-1H e RMN-13C do composto eleuterol em comparação com
dados da literatura*.
Eleuterol Eleuterol*
δH δC δH δC
C1 172.2
C3 5.72 (1H, q, J=6.3 Hz) 78.5 5.70 (1H, q, J=6.5 Hz) 78.5
C4 149.7 149.7
C5 156.6 157.1
C6 7.57 (1H, t, J=8.1 Hz) 106.3 7.54 (1H, t, J=7.7 Hz) 107.1
C7 7.38 (1H, t, J=8.1 Hz) 126.6 7.39 (1H, t, J=7.7 Hz) 127.4
C8 6.95 (1H, d, J=7.5 Hz) 123 6.93 (1H, d, J=7.7 Hz) 123.8
C9 7.89 (1H, s) 116.5 7.84 (1H, s) 116.8
C10 125.9 125.7
C11 128 128.1
C12 118.0 118.0
C13 137.8
3-CH3 1.73 (3H, d, J=6.6 Hz) 19.2 1.73 (3H, d, J=6.5 Hz) 19.2
5-OCH3 4.11 (3H, s) 56.4 4.11 (3H, s) 56.7
OH 9.65 (1H, s) 9.63 (1H, s)
*HARA et al., 1997; IEYAMA; GUNAWAN-PUTERI; KAWABATA, 2011; SHIBUYA et al., 1997.
Os 3 compostos isolados são derivados de naftalenos, e já foram isolados nos
bulbos de várias espécies do gênero Eleutherine, como da Eleutherine americana
(HAN et al., 2008; HARA et al., 1997; PARAMAPOJN et al., 2008), Eleutherine
bulbosa (ALVES; KLOOS; ZANI, 2003; GALLO et al., 2010), Eleutherine palmifolia
(SHIBUYA et al., 1997), dentre outras.
Os compostos isoeleuterina e eleuterina, piranonaftoquinonas, já foram
isolados dos bulbos da C. paludosa (TESSELE et al., 2011) e o eleuterol foi pela
primeira vez isolado nesta planta.
72
5.1.3 Análise Sazonal
A análise sazonal, através da técnica de CLAE, do caule da planta S. grantii,
dos bulbos da C. paludosa e dos constituintes de ambas as plantas está sendo
demonstrada pela primeira vez. O objetivo desta análise consiste em identificar a
época de coleta das plantas com maior concentração dos compostos isolados das
mesmas que apresentaram atividade antiproliferativa significante.
Na Figura 27 está apresentado o cromatograma dos extratos metanólicos do
caule da S. grantii obtidos nas 4 estações, bem como do composto 1 (20-fenilacetato
de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) isolado da mesma.
Figura 27. Cromatograma (CLAE) dos extratos do caule da S. grantii obtidos nas 4
estações, bem como do composto 1.
As análises foram monitorizadas a 210 nm.
O composto 1 (tempo de retenção em 22,8 minutos) foi detectado em todos
os extratos avaliados. No entanto, pode-se observar maior intensidade (área) do pico
na estação primavera e menor no outono/inverno (Tabela 6), demonstrando que,
para futuros estudos, maior rendimento do composto pode ser obtido quando
utilizado o caule da planta coletada na primavera.
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
uV(x100,000)
Composto 1
Primavera
Verão
Outono
Inverno
73
Tabela 6. Valores da área do pico do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-
tetraacetilforbol) nos extratos do caule da S. grantii nas 4 estações através da
análise por CLAE.
Estações Área do pico (mAU) do composto 1
Primavera 2419779
Verão 763607
Outono 359498
Inverno 488439
A Figura 28 demonstra o cromatograma dos extratos das 4 estações dos
bulbos da C. paludosa, e dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol,
isolados da mesma.
Figura 28. Cromatograma (CLAE, 240 nm) dos extratos dos bulbos da C. paludosa
obtidos nas 4 estações, e dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol,
isolados da mesma.
1 – Eleuterina; 2 – Isoeleuterina; 3 – Eleuterol; 4 – Verão; 5 – Outono; 6 – Primavera; 7- Inverno.
As análises foram monitorizadas a 240 nm.
O tempo de retenção da eleuterina está em aproximadamente 18 minutos, da
isoeleuterina em 19 minutos e do eleuterol em 19,5 minutos. A presença dos três
compostos foi verificada em todos os extratos avaliados. Os picos da eleuterina e
isoeleuterina foram mais intensos no outrono e no verão, e do eleuterol na primavera
e no verão (Tabela 7). Os três compostos apresenteram picos menos intensos no
74
inverno, demonstrando que, em épocas mais frias, a produção dos mesmos não é
tão significante.
Tabela 7. Valores da área do pico dos compostos eleuterina, isoeleuterina e
eleuterol nos extratos dos bulbos da C. paludosa nas 4 estações através da análise
por CLAE.
Estações Área do pico
(mAU) - eleuterina
Área do pico (mAU)
- isoeleuterina
Área do pico
(mAU) - eleuterol
Verão 3644565 6816086 9881232
Outono 4270103 7484452 9355803
Primavera 3494872 6029888 11564460
Inverno 2075493 3860123 8394023
A época em que uma espécie é coletada é um dos fatores de maior
importância, visto que a quantidade e, até mesmo a natureza dos constituintes ativos
de uma planta não é constante durante o ano. São relatadas variações sazonais no
conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários (GOBBO-
NETO; LOPES, 2007).
Além da sazonalidade, o metabolismo secundário de plantas pode variar
consideravelmente dependendo de outros fatores, como temperatura, altitude, índice
pluviométrico, radiação UV, composição atmosférica, idade, água, micro e
macronutrientes, herbivoria e ataque de patógenos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
O conhecimento da época de maior produção da substância ativa é de
extrema importância para fins de obtenção de um possível medicamento de origem
natural.
75
5.2 Atividade antiproliferativa
Foi realizada uma análise in vitro premilinar para avaliar atividade
antiproliferativa dos EMB das plantas S. grantii, C. paludosa, E. mosenii e M.
robusta, bem como das frações da S. grantii. Para isto, foram utilizadas 4 linhagens
de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460
(pulmão, tipo não pequenas células). Valores de GI50 foram calculados para
avaliação desta atividade e estão demonstrados na Tabela 8.
Tabela 8. Valores de GI50 (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos
extratos metanólicos e das frações das plantas S. grantii, C. paludosa, E. mosenii, e
M. robusta.
Controle e plantas U251 MCF7 786-0 NCI-H460
Doxorrubicina 0,025 <0,025 <0,025 <0,025
S. grantii caule EMB 30,3 28,5 26,7 8,1
S. grantii caule Fr. ac 2,9 2,9 1,4 0,37
S. grantii caule Fr. me >250 250 >250 >250
S. grantii folha EMB 128,7 35,6 69,8 >250
C. paludosa bulbo EMB 30,8 27,1 25,7 1,6
C. paludosa raíz EMB 28,7 25,9 37,5 40,9
E. mosenii caule EMB >250 >250 >250 >250
E. mosenii folha EMB >250 >250 >250 >250
E. mosenii raiz EMB 228,5 223,1 250 >250
M. robusta raiz EMB 34,7 37,6 193,5 201,4
Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo
não pequenas células). aGI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibir 50% do
crescimento celular. EMB=extrato metanólico bruto. Fr. ac = fração acetona. Fr. me = fração metanol.
Estre as plantas analisadas, o EMB do caule e das folhas da S. grantii
apresentaram valores significativos de GI50. No entanto, a fração acetona do caule
da mesma foi a que melhor apresentou atividade antiproliferativa, com valores de 2,9
µg/mL, 2,9 µg/mL, 1,4 µg/mL, 0,37 µg/mL para GI50 contra as linhagens U251
(glioma), MCF7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células),
respectivamente. Com base nestes resultados, fica claro que as substâncias menos
76
polares (fração acetona) presentes no caule da S. grantii são os responsáveis pela
atividade verificada.
O EMB do bulbo e da raiz da C. paludosa também apresentaram atividade
antiproliferativa sendo os valores de GI50 do bulbo mais significativo, com valores de
GI50 de 30,8 µg/mL, 27,1 µg/mL, 25,7 µg/mL, 1,6 µg/mL contra as linhagens U251
(glioma), MCF7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão), respectivamente.
Os resultados obtidos demonstraram que das plantas avaliadas, o caule da S.
grantii e os bulbos da C. paludosa apresentam resultados mais promissores e
princípios ativos com potencial atividade antiproliferativa. Por esta razão, ambas as
plantas foram submetidas a procedimentos cromatográficos para isolamento dos
compostos presentes e nova avaliação da atividade antiproliferativa.
5.2.1 Atividade antiproliferativa da S. grantii
As subfrações 11-15 e 16-19 da fração CHCl3 (mais apolar) do caule da S.
grantii foram selecionadas para realização de novo ensaio de atividade
antiproliferativa in vitro. Estas foram avaliadas em 7 linhagens de células tumorais
humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de
resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas
células); HT-29 (colon); K-562 (leucemia) e uma linhagem não-tumoral humana:
HaCat (queratinócito). Para avaliação desta atividade foram utilizados os valores de
TGI.
Já os compostos 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) e 2 isolados
do caule da S. grantii foram avaliados em 9 linhagens de células tumorais humanas:
U251 (glioma), MCF7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a
múltiplos fármacos), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células), PC-
3 (próstata), OVCAR-03 (ovário), HT-29 (colon), K-562 (leucemia) e uma linhagem
não-tumoral humana: HaCat (queratinócito).
Os gráficos gerados relacionam a porcentagem de crescimento das células e
a concentração das amostras testadas e do controle positivo doxorrubucina (Figuras
29-33). Os valores entre 100% e 0 representam inibição de crescimento, sendo a
linha 0 o marco para a inibição total de crescimento, ou seja, quando a quantidade
de células ao final do experimento é a mesma do momento de adição das amostras
(placa T0). Já os valores negativos representam morte celular, pois a quantidade de
77
células é menor do que aquela do momento de adição das amostras (quantidade de
células analisadas na placa T0) (VENDRAMINI-COSTA, 2013).
Figura 29. Atividade antiproliferativa da subfração 11-15 da S. grantii.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
HT29
K-562
HaCaT
131111 Janaúba 11_15
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa da subfração 11-15 da S. grantii em painel de 7 linhagens tumorais
humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem
de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
Figura 30. Atividade antiproliferativa da subfração 16-19 da S. grantii.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
HT29
K-562
HaCaT
131111 Janaúba 16_19
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa da subfração 16-19 da S. grantii em painel de 7 linhagens tumorais
humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem
de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
78
Figura 31. Atividade antiproliferativa do composto 1 da S. grantii.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
OVCAR-3
HT29
K-562
HaCaT
140728 Janaúba Bl-4
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa do composto 1 da S. grantii em painel de 9 linhagens tumorais humanas e
uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de
crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
Figura 32. Atividade antiproliferativa do composto 2 da S. grantii.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
OVCAR-3
HT29
K-562
HaCaT
140728 Janaúba B8-12
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa do composto 2 da S. grantii em painel de 9 linhagens tumorais humanas e
uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de
crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
79
Figura 33. Atividade antiproliferativa do quimioterápico doxorrubicina (controle
posivito).
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100C
resc
imen
to C
elula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
UACC-62
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
OVCAR-3
HT29
K-562
HaCaT
140728 Doxorrubicina
0,25 2,5 250,025
Atividade antiproliferativa do quimioterápico doxorrubicina (controle positivo) em painel de 10
linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação
entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,025;
0,25; 2,5; e 25 μg/mL).
As subfrações 11-15 e 16-19 da S. grantii inibiram o crescimento das células
avaliadas em função das concentrações empregadas, havendo também indução de
apoptose (ação citocida). A Tabela 9 indica os valores da concentração de amostra
necessária para inibir o crescimento celular (TGI) em 48 horas de tratamento.
Tabela 9. Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e subfrações
da S. grantii.
U251 MCF7 NCI-
ADR
786-0 NCI-
H460
HT-29 K-562 HaCat
Doxorrubicina 0,51 3,7 1,7 0,36 0,57 10,4 >25 0,26
S. grantii 11-15 6,4 9,2 11,7 10,5 9,9 10,5 >250 9,6
S. grantii 16-19 5,6 6,0 8,9 5,3 9,7 8,0 >250 8,7
Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de
resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT-29
(colon); K-562 (leucemia). Linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). aTGI: Total Growth
Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular
80
Ambas subfrações apresentaram atividade antiproliferativa significativa contra
a maioria das linhagens celulares avaliadas, exceto leucemia, com valores de TGI
entre 5,3 e 11,7 µg/mL, sendo a subfração 16-19 ligeiramente mais ativa do que
subfração 11-15, especialmente contra as linhagens de glioma (U251), mama
(MCF7) e rim (786-0), com valores de TGI < 6,25 µg/mL, demonstrando uma
atividade antiproliferativa potente (FOUCHE et al., 2008). Quando comparadas com
o controle doxorrubicina, ambas subfrações foram menos agressivas contra a
linhagem não-tumoral humana, queratinócito.
Os gliomas malignos representam cerca de 40 a 60% dos tumores cerebrais
primários e são responsáveis por um nível desproporcional de morbidade e
mortalidade em pacientes com câncer. Apesar de tratamentos como cirurgia,
radioterapia, quimioterapia e imunoterapia, o tempo médio de sobrevivência é
inferior a 15 meses. Portanto, os desafios no tratamento de gliomas malignos
permanecem consideráveis (HUSE; HOLLAND, 2010; YIN et al., 2007).
O câncer de mama é a neoplasia mais comum e a maior causa de morte por
câncer nas mulheres em todo o mundo. Para o Brasil, em 2014, são esperados
57.120 casos novos de câncer de mama, com um risco estimado de 56,09 casos a
cada 100 mil mulheres (INCA, 2014). Apesar de avanços importantes no tratamento,
o câncer de mama metastático não tem cura, reforçando a necessidade de novos
tratamentos para melhorar o resultado dos mesmos (SEOANE et al., 2010)
Existem diferentes tipos de câncer de rim, cada um com sua própria histologia
e curso clínico, que respondem de forma diferente ao tratamento. Esse tipo de
câncer é responsável por mais de 115.000 mortes por ano em todo o mundo
(FERLAY et al., 2010; LINEHAN; SRINIVASAN; SCHMIDT, 2010).
A toxicidade do gênero Synadenium já foi demonstrada por Valadares e
colaboradores (2007) e Mota e colaboradores (2012), que constataram que a planta
S. umbellatum possui potencial citotóxico e efeitos mutagênicos.
Estudos in vitro e in vivo, mostraram que o látex da S. grantii possui efeito
citotóxico e atividade antitumoral contra células de melanoma B16F10. O composto
citrostadienol, que foi isolado a partir desta planta, apresentou baixa atividade
citotóxica quando testado in vitro contra a mesma linhagem celular, causando
redução de 8% na viabilidade celular a uma concentração de 250 µg/mL (DE
OLIVEIRA et al., 2013). Terpenos que estão presentes no látex, bem como em as
outras partes da S. grantii são descritos como apresentando atividade citotóxica
81
(BAGAVATHI et al., 1988; COSTA et al., 2012; HASSAN; MOHAMMED;
MOHAMED, 2012).
O composto 1 apresentou atividade antiproliferativa moderada contra as
linhagens de glioma (U251, TGI = 25,2 µg/mL), rim (786-0, TGI = 24,5 µg/mL),
pulmão (NCI-H460, TGI = 31,1 µg/mL) e próstata (PC-3, TGI = 22,0 µg/mL),
sugerindo que este pode contribuir, em parte, com a atividade antiproliferativa
observada pela subfração 11-15. Além disso, o composto 1 não demonstrou
atividade na linhagem não-tumoral humana (queratinócito) (Tabela 10). O composto
2 não apresentou atividade relevante.
Tabela 10. Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos
compostos isolados da S. grantii.
2 m a 7 4 p o h k Q
Doxorrubicina 0,042 >25 >25 0,93 21,5 1,9 3,7 >25 1,7 12,9
Composto 1 25,2 >250 >250 24,5 31,1 22,0 74,9 >250 65,3 >250
Composto 2 76,1 >250 >250 114,2 104,5 79,7 >250 >250 50,1 >250
Linhagens tumorais humanas: 2 = U251 (glioma); m = MCF-7 (mama); a = NCI-ADR/RES (ovário com
fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 7 = 786-0 (rim); 4 = NCI-H460 (pulmão, tipo não
pequenas células); p = PC-3 (próstata); o = OVCAR-03 (ovário); h = HT29 (colon); k = K-562
(leucemia). Linhagem não-tumoral humana: Q = HaCat (queratinócito). aTGI: Total Growth Inhibition –
concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular.
A ação antiproliferativa do composto 1, um éster de forbol, não foi tão
pronunciada como a apresentada pela subfração 11-15 em que estava presente,
sugerindo um possível sinergismo entre os compostos, ou a presença de outros
princípios ativos que contribuem para a atividade
Forbóis e os seus diferentes derivados são referidos como sendo promotores
de tumor. Estes compostos não induzem tumores, mas promovem seu crescimento
após a exposição a uma substância cancerígena. Alguns ésteres de forbol isolados
da espécie Jatropha curcas apresentaram propriedades carcinogênicas e
mutagênicas. No entanto, alguns forbóis naturais são inibidores de tumor e possuem
atividade antileucêmica e antimicobacteriana (CHUMKAEW et al., 2003; GOEL et al.,
2007; OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD 2012a).
82
5.2.2 Atividade antiproliferativa da C. paludosa
Os compostos isoeleuterina, eleuterina e eleuterol isolados da C. paludosa,
foram selecionadas para realização de novo ensaio in vitro de atividade
antiproliferativa, avaliada em 7 linhagens de células tumorais humanas: U251
(glioma), MCF7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a
múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT-
29 (colon); K-562 (leucemia) e uma linhagem não-tumoral humana: HaCat
(queratinócito). Para avaliação desta atividade foram utilizados valores de TGI e
GI50.
Os gráficos gerados relacionam a porcentagem de crescimento das células e
a concentração das amostras testadas (Figuras 34-36), avaliados da mesma
maneira que as subfrações da S. grantii (Figuras 29-30).
Figura 34. Atividade antiproliferativa do composto isoleuterina.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
HT29
K-562
HaCaT
131111 Isoleuterine
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa da isoleuterina em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem
não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a
amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
83
Figura 35. Atividade antiproliferativa do composto eleuterina.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
HT29
K-562
HaCaT
131111 Eleuterine
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa da eleuterina em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem
não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a
amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
Figura 36. Atividade antiproliferativa do eleuterol.
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
OVCAR-3
HT29
K-562
HaCaT
140728 Eleutherol
0,25 2,5 25 250
Atividade antiproliferativa do eleuterol em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem
não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a
amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL).
84
Os compostos isoeleuterina e eleuterina apresentaram atividade
antiproliferativa significativa, com efeito citocida, especialmente contra as linhagens
de glioma (U251) e da mama (MCF7), com valores de TGI entre 2,8 e 13,4 μg/mL
(Tabela 11). De acordo com Fouche e colaboradores (2008), valores de TGI entre
6,25 e 15 μg/mL representam atividade moderada, e valores de TGI < 6,25 µg/mL
atividade potente, demonstrando a atividade pronunciada destes dois compostos.
Tabela 11. Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos
compostos isoeleuterina e eleuterina isolados da C. paludosa.
U251 MCF-7 NCI-
ADR
786-0 NCI-
H460
HT29 K-562 HaCat
Doxorrubicina 0,51 3,7 1,7 0,36 0,57 10,4 >25 0,26
Isoleuterina 13,4 6,6 46,0 67,2 79,4 78,8 >250 45,1
Eleuterina 2,8 4,8 20,4 129,9 93,4 29,0 >250 20,0
Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de
resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT29
(colon); K-562 (leucemia). Linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). aTGI: Total Growth
Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular
Em geral, eleuterina foi mais ativa que isoeleuterina, especialmente contra
glioma (U251), sendo 4 vezes mais potente. Estes compostos são isômeros
epiméricos que diferem em termos da relação cis ou trans, respectivamente, dos
dois grupos metil secundário, sendo o grupo metil β-metil para o 1º e α-metil para o
2º. Estes resultados indicam que a melhor atividade do 1º está relacionada com a
quiralidade e seu anel de pirano com o grupo β-metil.
O composto eleuterol demonstrou efeito citostático contra todas as linhagens
tumorais avaliadas, especialmente contra glioma (U251), mama (MCF7) e leucemia
(K-562), inibindo 50% do crescimento celular (GI50) (Tabela 12).
85
Tabela 12. Valores de GI50 (μg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e do
composto eleuterol, isolado da C. paludosa.
U251 MCF-
7
NCI-
ADR
786-0 NCI-
H460
HT29 K562 HaCat
Doxorrubicina <0,025 0,069 0,10 0,038 <0,025 4,2 0,045 0,059
Eleuterol 3,1 3,0 23,3 26,8 25,5 65,5 6,3 18,7
Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma); MCF-7 (breast); NCI-ADR/RES (ovary); 786-0 (kidney);
NCI-H460 (lung); HT29 (colon); K562 (leukemia). Linhagem não-tumoral humana: HaCat
(queratinócito). aGI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibir 50% do crescimento
celular.
Diversos estudos com derivados de naftoquinonas demonstraram seus efeitos
em várias atividades biológicas, como a antitumoral, antiviral, antibacteriana, e
antifúngica (ALVES; KLOOS; ZANI, 2003; FERREIRA et al., 2014; HOOK; MILLS;
SHERIDAN, 2014; RAHMOUN et al., 2012; SASAKI; ABE; YOSHIZAKI, 2002).
As piranonaftoquinonas isoeleuterina e eleuterina isoladas dos bulbos da C.
paludosa já apresentaram ação anti-inflamatória e antinociceptiva contra modelos
químicos e mecânicos de dor em ratos (TESSELE et al., 2011). Foi demonstrado
também que estes compostos melhoraram a memória de curto e de longo prazo em
ratos (LUCENA et al., 2013), possuem atividade antifúngica e imunomodulatória
(ALVES; KLOOS; ZANI, 2003; HONG et al., 2008). Foi verificado também que
ambos compostos possuem atividade antiproliferativa contra a linhagem celular K-
562 (XU et al., 2006), o que não foi observado no presente estudo.
Eleuterina, o principal composto isolado, também mostrou atividade inibidora
contra a topoisomerase humana II, e compostos com esta ação podem ser
considerados como parte de quimioterapia de primeira linha para uma ampla
variedade de tumores sólidos e hematológicos (HARA et al., 1997; KUSUMA et al.,
2010). Isoeleuterina já demonstrou atividade inibitória na replicação do HIV em
linfócitos H9 (HARA et al., 1997).
O composto eleuterol já foi isolado nos bulbos da E. bulbosa, e está espécie é
utilizada por algumas populações para o tratamento de distúrbios intestinais (LIN;
PUCKREE; MVELASE, 2002).
86
Este é o primeiro relatório indicando a planta C. paludosa com efeito
antiproliferativo, demostrando que esta espécie pode ser considerada uma potencial
fonte de compostos com atividade antiproliferativa.
5.2.3 Atividade antiproliferativa do composto 1 (S. grantii) e eleuterina (C.
paludosa) no modelo de MTT
Com base nesses resultados apresentados, o composto 1 isolado da S.
grantii e o composto eleuterina da C. paludosa, foram selecionados para realização
de nova análise da atividade antiproliferativa in vitro, agora pelo método do MTT.
Os resultados da Figura 37 demonstra que os dois compostos (composto 1 e
eleuterina) apresentaram atividade antiproliferativa (diminuição da metabolização do
MTT = diminuição do número de células) na maior concentração utilizada (100
microM) contra a linhagem MDA-MB231 (linhagem resistente). No entanto é possível
observar que o composto 1 já começou a ter efeito entre as concentrações 1 e 10
microM, então este foi escolhido para nova análise utilizando estas concentrações
na mesma linhagem celular (MDA-MB231) e em uma linhagem considerada mais
sensível (HBL100) (Figura 38).
Figura 37. Metabolização de MTT (% controle) contra a linhagem celular MDA-
MB231 do composto 1 e da eleuterina.
0
20
40
60
80
100
120
Control 10 nM 100 nM 1 microM 10 microM 100 microM
Met
ab
oli
zaçã
o M
TT
(%
co
ntr
ole
)
Concentração
MDA-MB231
Composto 1
Eleutherine
87
Figura 38. Metabolização de MTT (% controle) do composto 1 contra as linhagem
celulares MDA-MB231 e HBL100.
Avaliando a Figura 37 pode-se observar que o composto 1 foi mais ativo
contra a 2ª linhagem (HBL100), considerada mais sensível, apresentando boa
atividade já a partir de 1 microM.
O câncer de mama triplo-negativo (Triple negative breast cancer - TNBC) é
responsável por 15% de todos os cânceres de mama. É definido pela ausência da
expressão de receptores de estrogênio, progesterona e de HER2 (receptor do fator
de crescimento epidérmico) (CLEATOR; HELLER; COOMBES, 2007; MONTERO et
al., 2014).
O fenótipo triplo-negativo possui características patológicas e clínicas
bastante diferentes dos demais subtipos de câncer de mama. Estes tumores afetam
mais frequentemente mulheres com menos de 50 anos, apresentando
comportamento mais agressivo (CORRÊA et al., 2010).
Devido à ausência de tratamentos específicos para esse subgrupo, os
cânceres de mama triplo-negativos são gerenciados com o tratamento padrão, no
entanto, esse tratamento é associado com uma elevada taxa de recidiva local e
sistêmica (CLEATOR; HELLER; COOMBES, 2007).
No momento, não há um agente comprovadamente eficaz para o tratamento
do câncer de mama triplo-negativo. Dados recentes mostram que o câncer de mama
triplo-negativo tem características moleculares específicas que podem ser possíveis
alvos para novos fármacos (TOMAO et al., 2015).
0
20
40
60
80
100
120
Control 1microM 5microM 10microM 25microM 50microM 100microM
Met
ab
oli
zaçã
o M
TT
(%
co
ntr
ole
)
Concentração
Composto 1
MDA-MB231
HBL100
88
Em consideração ao mecanismo de ação em que o composto 1 possa estar
atuando, foram avaliados os mecanismos de ciclo celular e apoptose contra a
linhagem celular MDA-MB231.
Quando avaliada a ação do composto 1 (100 microM) no ciclo celular (Figura
39), pode-se observar um aumento de 4% das células na fase G0/G1 e uma
dimuinção de 3% das células na fase M quando comparado com o controle. No
entanto, como os valores não são significativos, não é possível afirmar que o mesmo
age na regulação do ciclo celular.
Figura 39. Ação do composto 1 no ciclo celular na linhagem celular tumoral MDA-
MB231.
Ação do composto 1 no ciclo celular na linhagem MDA-MB231, marcados com IP por citometria de
fluxo. As células foram tratadas com DMSO e com o composto 1 (100 microM) por 48 horas.
A fase G0 compreende o momento em que as células permanecem em um
estado de repouso, latência ou quiescência e a fase G1 representa o período no
qual a célula está se preparando para a síntese de DNA. Em ambas as fases ainda
não ocorreu a divisão celular. Na fase M (mitose) as células dividem-se ao meio para
produzir duas novas células, iniciando o processo de proliferação celular (NECKEL,
2011).
Na avaliação da apoptose (Figura 40), pode-se verificar que, tanto as células
sem tratamento (controle), quanto as células tratadas com o composto 1 (100
microM), ficaram concentradas no quadrante inferior esquerdo, consideradas células
viáveis, pois não estão marcadas por anexina V-FITC ou IP. Com base nesses
resultados pode-se afirmar que o composto não age pelo mecanismo de apoptose.
O marcador IP é permeável somente em células onde a integridade da
membrana foi perdida, evidenciando fenômenos típicos da morte por necrose. As
89
células marcadas apenas com Anexina V-FITC indicam morte apoptótica. Já as
células marcadas com ambos os fluoróforos representam a porcentagem de células
nos estágios finais de apoptose e coincidentes com a morte por necrose. As células
viáveis, por sua vez, não são marcadas nem por anexina V-FITC, nem por IP
(NECKEL, 2011; ZWAAL; SCHROIT, 1997).
Figura 39. Avaliação da apoptose induzida pelo composto 1 na linhagem celular
tumoral MDA-MB231.
Avaliação da apoptose induzida pelo composto 1 na linhagem MDA-MB231, através de ensaio da
Anexina V-FITC e IP por citometria de fluxo. As células foram tratadas com DMSO e com o composto
1 (100 microM) por 48 horas.
Ressalta-se a importância de verificar por qual mecanismo de ação o mesmo
age, por isso novos estudos in vitro de ciclo celular e apoptose serão realizados para
a confirmação deste.
90
91
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos no presente estudo, verificou-se que a fração
CHCl3 do caule da Synadenium grantii e o EMB dos bulbos Cipura paludosa
possuem princípios ativos com potencial antiproliferativo relevante. Já as duas
outras plantas avaliadas, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta não demostraram
resultado antiproliferativo considerado promissor.
A análise fitoquímica permitiu evidenciar a presença de um raro éster de
forbol conhecido como 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol na fração CHCl3
do caule da S. grantii, com presença mais significativa na primavera. Este
apresentou atividade antiproliferativa moderada contra as linhagens de glioma, rim,
pulmão e próstata, além de não demonstrar atividade contra a linhagem não-tumoral
humana (queratinócito). O mesmo apresentou também atividade antiproliferativa nas
concentrações entre 1 e 100 microM, nas linhagens celulares MDA-MB231 e
HBL100 (câncer de mama triplo-negativo). No entanto ainda não foi possível verificar
por qual mecanismo de ação o composto age, uma vez que não demonstrou
resultados significativos na análise de ciclo celular e apoptose. Estudos estão em
andamento para confirmar estes efeitos em outros modelos farmacológicos (in vivo),
verificar seu mecanismo de ação, e para isolar outros possíveis princípios ativos
dessa promissora planta como um agente anticâncer.
Nos bulbos da C. paludosa foi possível verificar a presença dos derivados
de naftaleno eleuterine, isoeleuterine e eleuterol, com presença mais significativa no
verão. Os dois primeiros, considerados os compostos majoritários desta espécie,
demonstraram efeito citocida contra as linhagens de glioma, mama e pulmão, sendo
os principais princípios ativos responsáveis pela atividade antiproliferativa verificada
nesta espécie. Já o composto eleuterol demonstrou efeito menos significativo,
apresentando um efeito mais citostático do que citocida.
Os resultados obtidos até o presente são promissores sob o ponto de vista
químico e medicinal, e estimulam a continuidade destes estudos para a constante
busca de plantas e compostos com potencial atividade antiproliferativa, visando a
descoberta de um novo e eficaz agente terapêutico anticâncer.
92
93
REFERÊNCIAS
ABDEL-KADER, M. S; WISSE, J.; EVANS, R.; WERFF, H. V. D.; KINGSTON, D. G.
I. Bioactive iridoids and a new lignan from Allamanda cathartica and Himatanthus
fallax from the Suriname rainforest. Journal of Natural Products, v.60, p.1294-
1297, 1997.
ABDULLAEV, F. I.; ESPINOSA-ARGUIRRE, J. J. Biomedical properties of saffron
and its potential use in cancer therapy and chemoprevention trials. Cancer
Detection and Prevention, v. 28, p. 426-432, 2004.
ABE, F.; YAMAUCHI, T. 9-hidroxypinoresinol, 9-hidroxymedioresinol and related
lignans from Allamanda Neriifolia. Phytochemistry, v.27, n.2, p.575-577, 1988.
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.
Molecular Biology of the Cell. 5. th. New York: Garland science, Taylor & Francis
Group, 2008. 1725p.
ALBERTS, B.; BRAY, D.; HOPKIN, K.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.;
ROBERTS, K.; WALTER, P. Fundamentos da Biologia Celular. 3. ed. Porto
Alegre: Artmed, 2011. 844p.
ALIBEK, K.; BEKMURZAYEVA, A.; MUSSABEKOVA, A.; SULTANKULOV, B. Using
antimicrobial adjuvant therapy in cancer treatment: a review. Infectious Agents and
Cancer, v.7, n.33, 2012.
ALVES, T. M.; KLOOS, H.; ZANI, C. L. Eleutherinone, a novel fungitoxic
naphthoquinone from Eleutherine bulbosa (Iridaceae). Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, v.98, n.5, p.709-712, 2003.
ANDERSEN, O. M.; JORDHEIM, M.; BYAMUKAMA, R., MBABAZI, A.; OGWENG,
G.; SKAAR, I.; KIREMIRE, B. Anthocyanins with unusual furanose sugar (apiose)
from leaves of Synadenium grantii (Euphorbiaceae). Phytochemistry, v.71, n.13,
p.1558–63, 2010.
ANDERSON, J. E.; CHANG, C. J.; MCLAUGHLIN, J. L. Bioactive components of
Allamanda schotii. Journal of Natural Products, v.51, n.2, p.307-308, 1988.
ANDRADE, S. F., LEMOS, M.; COMUNELLO, E.; NOLDIN, V. F.; CECHINEL-
FILHO, V.;NIERO, R. Evaluation of the antiulcerogenic activity of Maytenus robusta
(Celastraceae) in different experimental ulcer models. Journal of
Ethnopharmacology, v.113, p.252–257, 2007.
94
ARAÚJO JÚNIOR, R. F.; OLIVEIRA, A. L.; PESSOA, J. B.; GARCIA, V. B.;
GUERRA, G. C.; SOARES, L. A.; SOUZA, T. P.; PETROVICK, P. R.; ARAÚJO, A. A.
Maytenus ilicifolia dry extract protects normal cells, induces apoptosis and regulates
Bcl-2 in human cancer cells. Experimental Biology and Medicine, v.238, n.11,
p.1251-1258, 2013.
ATCC – The Global Bioresource Center. Cell Lines. Disponível em:
<http://www.atcc.org/Products/Cells_and_Microorganisms/Cell_Lines.aspx>. Acesso
em: 13 mar. 2015.
BAGAVATHI, R.; SORG, B.; HECKER, E. Tigliane-type diterpene esters from
Synadenium grantii. Planta Medica, v.54, n.6, p.506-10, 1988.
BAGULEY, B. C. A brief history of cancer chemotherapy. In: BAGULEY, B. C.;
KERR, D. Anticancer Drug Development. Academic press, 2002.
BALBACH, A. A flora nacional na medicina doméstica. 2. ed. São Paulo: Vida
Plena, 1980. 34p.
BEUTLER J. A.; ALVARADO, A. B.; MCCLOUD, T. G.; CRAGG, G. M. Distribution of
phorbol ester bioactivity in the Euphorbiaceae. Phytotherapy Research, v.3, n.5,
p.188-192, 1989.
BHANOT, A.; SHARMA, R.; NOOLVI, M. N. Natural sources as potential anti-cancer
agents: A review. International Journal of Phytomedicine, v.3, p.09-26, 2011.
BHATIA, S. K.; YETTER, A. B. Correlation of visual cytotoxicity ratings of
biomaterials with quantitative in vitro cell viability measurements. Cell Biology and
Toxicology, v.24, n.4, p/315-319, 2008.
BITTNER, M.; ALARCÓN, J.; AQUEVEQUE, P.; BECERRA, J.; HERNÁNDEZ, V.;
HOENEISEN, M.; SILVA, M. Estudio quimico de especies de la familia
Euphorbiaceae em Chile. Boletin De La Sociedad Chilena De Quimica, v.46, n.4,
p.1–15, 2001.
BOGO, D. Avaliação da atividade antitumoral in vitro e in vivo de compostos de
liquens. 2012. 110f. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde
e Desenvolvimento na Região Centro-oeste da Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul, Mato Grosso do Sul, 2012.
BRANDÃO, H. N.; DAVID, J. P.; COUTO, R. D.; NASCIMENTO, J. A. P.; DAVID, J.
M. Química e farmacologia de quimioterápicos antineoplásicos derivados de
plantas. Química Nova, v.33, n.6, p.1359-1369, 2010.
95
BRAS, M.; QUEENAN, B.; SUSIN, S. A. Programmed cell death via mitochondria:
different modes of dying. Biochemistry (Moscow), v.70, n.2, p.231-239, 2005.
BRASIL, D. F. B. Estudo fitoquímico e análise gastroprotetora dos principais
constituintes das cascas e das raízes de Maytenus robusta REISS
(Celastraceae). 2013. 121f. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí,
2013.
CAMPOS, A.; MALHEIROS, A.; NIERO, R.; CECHINEL FILHO, V. Biodiversidade
brasileira (terrestre e marinha): uma vasta fonte de agentes anticâncer. In: SAN
FELICIANO, A.; CECHINEL FILHO, V. Descoberta, desenho e desenvolvimento
de novos agentes anticâncer no âmbito do programa Iberoamericano CYTED.
Itajaí: UNIVALI, 2014. p. 193-218.
CARVALHO, J. E. Atividade Antiulcerogênica e Anticâncer de Produtos Naturais e
de Síntese. MultiCiência: Construindo a História dos Produtos Naturais, n.7,
p.1-18, 2006.
CARVALHO, J. E.; RUIZ, A. L. T. G.; COSTA, D. V. C.; MONTEIRO, K. M. Modelos
experimentais para estudo de substâncias com atividade anticâncer. In: SAN
FELICIANO, A.; CECHINEL FILHO, V. Descoberta, desenho e desenvolvimento
de novos agentes anticâncer no âmbito do programa Iberoamericano CYTED.
Itajaí: UNIVALI, 2014. p. 313-345.
CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para a Obtenção de Compostos
Farmacologicamente Ativos a partir de Plantas Medicinais. Conceitos sobre
Modificação Estrutural para Otimização da Atividade. Química Nova, v.21, n.1,
p.99-105, 1998.
CHABNER, B. A.; ROBERTS JR, T. G. Chemotherapy and the war on cancer.
Nature Reviews Cancer, n.5, p.65-72, 2005.
CHINEMBIRI, T. N.; DU PLESSIS, L. H.; GERBER, M.; HAMMAN, J. H.; DU
PLESSIS, J. Review of natural compounds for potential skin cancer treatment.
Molecules, v.19, n.8, p.11679-11721, 2014.
CHOW, A. Y. Cell cycle control by oncogenes and tumor suppressors: driving the
transformation of normal cells into cancerous cells. Nature Education, v.3, n.9, p.7,
2010.
CHUMKAEW, P.; KARALAI, C.; PONGLIMANONT, C.; CHANTRAPROMMA, K.
Antimycobacterial activity of phorbol esters from the fruits of Sapium indicum.
Journal of Natural Products, v.66, n.4, p.540-543, 2003.
96
CLEATOR, S.; HELLER, W.; COOMBES, R. C. Triple-negative breast cancer:
therapeutic options. Lancet Oncology, v.8, n.3, p.235-244, 2007.
CORREA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas.
Ministério da Agricultura. Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, Rio
de Janeiro, v. 1, p. 78, 1994.
CORRÊA, P. B.; TORALLES, M. B. P.; ABE-SANDES, K.; T. MACHADO, T. M. B.;
BONFIM, T. F.; MEYER, L.; ABE-SANDES, C.; NASCIMENTO, I. Câncer de mama
triplo negativo e sua associação com ancestralidade africana. Revista de Ciências
Médicas e Biológicas, v.9, p.3-7, 2010.
COSTA, L. L. G. Screening fitoquímico e estudo biológico de Synadenium
grantii Hook.f. (Euphorbiaceae). 2011. 69f. Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de
Ponta Grossa, Ponta Grossa, 2011.
COSTA, L. L. G.; DAVID, V. C.; PINTO, R. M. C.; MINOZZO, B. R.; KOZLOWSKI
JUNIOR, V. A.; CAMPOS, L. A.; SILVA, R. Z.; BELTRAME, F. L. Anti-ulcer activity
of Synadenium grantii latex. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.22, n.5,
p.1070-1078, 2012.
CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal
of Ethnopharmacology, v.100, n.1-2, p.72-79, 2005.
CRAGG, G. M.; GROTHAUS, P. G.; NEWMAN, D. J. Impact of natural products on
developing new anti-cancer agents. Chemical Reviews, v.109, n.7, p.3012-3043,
2009.
CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug
leads. Biochimica et Biophysica Acta, v.1830, p.3670–3695, 2013.
CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Natural products as sources of new anticancer
agents. In: SAN FELICIANO, A.; CECHINEL FILHO, V. Descoberta, desenho e
desenvolvimento de novos agentes anticâncer no âmbito do programa
Iberoamericano CYTED. Itajaí: UNIVALI, 2014. p. 67-114.
DE ALMEIDA, V. L.; LEITÃO, A.; REINA B. C. L.; MONTANARI, C. A.; DONNICI, C.
L.; LOPES, M. T. P. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-específicos e ciclo-
celular não-específicos que interagem com DNA: uma introdução. Química Nova,
v.28, n.1, p.118-129, 2005.
DE OLIVEIRA, T. L.; MUNHOZ, A. C. M.; LEMES, B. M.; MINOZZO, B. R.; NEPEL,
A.; BARISON, A.; FÁVERO, G. M.; CAMPAGNOLI, E. B.; BELTRAME, F. L.
97
Antitumoural effect of Synadenium grantii Hook f. (Euphorbiaceae) latex. Journal of
Ethnopharmacology, v.150, n.1, p.263-269, 2013.
DE SOUSA, D. P.; SILVA, M. S.; MEDEIROS, V. M.; FOLLY, M. A. B.; TAVARES, J.
F.; BARBOSA-FILHO, J. M. Alkaloid, flavonoids, and pentacyclic triterpenoids of
Maytenus obtusifolia Mart. Biochemical Systematics and Ecology, v.36, p.500–
503, 2008.
DIMITRIJEVIĆ, S. M.; HUMER, U.; SHEHADEH, M.; RYVES, W. J.; HASSAN, N.
M.; EVANS, F. J. Analysis and purification of phorbol esters using normal phase
HPLC and photodiode-array detection. Journal of Pharmeutical and Biomedical
Analysis, v.15, n.3, p.393-401, 1996.
EVANS, F. J. Naturally occurring phorbol esters. Boca Raton: CRC Press, 1986.
FAJARDO, A. M.; PIAZZA, G. A. Anti-inflammatory approaches for colorectal cancer
chemoprevention. American Journal of Physiology Gastrointestinal Liver
Physiology, 2015.
FEO, F.; DE MIGLIO, M. R.; SIMILE, M. M.; MURONI, M. R.; CALVISI, D. F.; FRAU,
M.; PASCALE, R. M. Hepatocellular carcinoma as a complex polygenic disease.
Interpretive analysis of recent developments on genetic predisposition. Biochimica
et Biophysica Acta, v.1765, n.2, p.126-147, 2006.
FERLAY, J.; SHIN, H. R.; BRAY, F.; FORMAN, D.; MATHERS, C.; PARKIN, D.
M. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008.
International Journal of Cancer, v.127, n.12, p.2893-2917, 2010.
FERREIRA, J.; FLORIANI, A. E.; CECHINEL-FILHO, V.; DELLE-MONACHE, F.;
YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B.; SANTOS, A. R. Antinociceptive properties of the
methanolic extract and two triterpenes isolated from Epidendrum Mosenii stems
(Orchidaceae). Life Sciences, v.66, n.9, p.791-802, 2000.
FERREIRA, M. P. S. B. C.; CARDOSO, M. F. C.; DA SILVA, F. C.; FERREIRA, V.
F.; LIMA, E. S.; SOUZA, J. V. B. Antifungal activity of synthetic naphthoquinones
against dermatophytes and opportunistic fungi: preliminary mechanism-of-action
tests. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v.6, p.13-26, 2014.
FLORIANI, A. E.; FERREIRA, J.; SANTOS, A. R.; DELLE-MONACHE, F.; YUNES,
R. A.; CECHINEL-FILHO, V. Analgesic compounds from Epidendrum mosenii stems.
Pharmazie, v.53, n.6, p.426-427, 1998.
98
FOUCHE, G.; CRAGG, G. M.; PILLAY, P.; KOLESNIKOVA, N.; MAHARAJ, V. J.;
SENABE, J. In vitro anticancer screening of South African plants. Journal of
Ethnopharmacology, v.119, p.455-461, 2008
FRESHNEY, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3. ed.
New York: Wiley-Liss, 1994.
GALLO, F. R.; PALAZZINO, G.; FEDERICI, E.; IURILLI, R.; GALEFFI, C.;
CHIFUNDERA, K.; NICOLETTI, M. Polyketides from Eleutherine bulbosa. Natural
Product Research, v.24, n.16, p.1578-1586, 2010.
GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no
conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v.30, n.2, p.374-381, 2007.
GOEL, G.; MAKKAR, H. P. S.; FRANCIS, G.; BECKER, K. Phorbol esters: structure,
biological activity, and toxicity in animals. International Journal of Toxicology,
v.26, n.4, p.279-288. 2007.
GONZALEZ-GUERRICO, A. M.; KAZANIETZ, M. G. Phorbol ester-induced apoptosis
in prostate cancer cells via autocrine activation of the extrinsic apoptotic cascade: a
key role for protein kinase C delta. The Journal of Biological Chemistry, v.280,
n.47, p.38982-38991, 2005.
HAAS, W.; STERK, H.; MITTELBACH, M. Novel 12-deoxy-16-hydroxyphorbol
diesters isolated from the seed oil of Jatropha curcas. Journal of Natural Products,
v.65, n.10, p.1434-1440, 2002.
HAN, A. R.; MIM, H. Y.; NAM, J. W.; NA-YOUN, L.; WYRYAWAN, A.; SUPRAPTO,
W.; LEE, S. K.; LEE, K. R.; SEO, E. K. Identification of a new naphthalene derivative
from the bulb of Eleutherine americana with inhibitory activity on lipopolysacharide-
induced nitric oxide production. Chemical Pharmaceutical Bulletin, v.56, n.9,
p.1314-1316, 2008.
HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. The hallmarks of cancer. Cell, v.100, p.57-70,
2000.
HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell,
v.144, p.646-674, 2011.
HARA, H.; MARUYAMA, N.; YAMASHITA, S.; HAYASHI, Y.; LEE, K. H.; BASTOW,
K. F.; CHAIRUL, R. M.; IMAKURA, Y. Elecanacin, a novel new naphthoquinone from
the bulb of Eleutherine americana. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v.45,
n.10, p.1714-1716, 1997.
99
HARTWELL, J. L. Plants Used Against Cancer: A Survey. Quarterman: Lawrence,
MA, 1982.
HASSAN, E. M.; MOHAMMED, M. M. D.; MOHAMED, S. M. Two new phorbol-type
diterpene esters from Synadenium grantii Hook f. leaves. Records of Natural
Products, v.6, n.3, p.255–262, 2012.
HOGENESCH, H.; NIKITIN, A. Y. Challenges in pre-clinical testing of anti-cancer
drugs in cell culture and in animal models. Journal of Controlled Release, v.164,
p.183-186, 2012.
HOLBECK, S. L. Update on NCI in vitro drug screen utilities. European Journal of
Cancer, v.40, n.6, p.785-793, 2004.
HONG, J. H.; YU, E. S.; HAN, A. R.; NAM, J. W.; SEO, E. K.; HWANG, E. S.
Isoeleutherin and eleutherinol, naturally occurring selective modulators of Th cell-
mediated immune responses. Biochemical and Biophysical Research
Communications, v.371, n.2, p.278-282, 2008.
HOOK, I.; MILLS, C.; SHERIDAN, H. Bioactive naphtoquinones from higher plants.
In: RAHMAN, A. U. Studies in Natural Products Chemistry. Oxford: Elsevier,
2014. p. 119-160.
HOSSEINZADEH, H.; NORAEI, N. B. Anxiolytic and hypnotic effect of Crocus
sativus aqueous extract and its constituents, crocin and safranal, in mice.
Phytotherapy Research, v. 23, p. 768-774, 2009.
HOUGHTON, P.; FANG, R.; TECHATANAWAT, I.; STEVENTON, G.; HYLANDS, P.
J.; LEE, C. C. The sulphorhodamine (SRB) assay and other approaches to testing
plant extracts and derived compounds for activities related to reputed anticancer
activity. Methods, v.42, n.4, p.377-387, 2007.
HUSE, J. T.; HOLLAND, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular
pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer, v.10,
p.319-331, 2010.
HUSSAIN, S. P.; HARRIS, C. C. Inflammation and cancer: an ancient link with novel
potentials. International Journal of Cancer, v.121, n.11, p.2372-2380, 2007.
IEYAMA, T.; GUNAWAN-PUTERI, M. D.; KAWABATA, J. Alpha-Glucosidase
inhibitors from the bulb of Eleutherine americana. Food Chemistry, v.128, p.308-
311, 2011.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=HogenEsch%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22446384
100
INCA – Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva/ Ministério da
Saúde. Estimativa 2014 – Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 2014.
IRIGARAY, P.; BELPOMME, D. Basic properties and molecular mechanisms of
exogenous chemical carcinogens. Carcinogenesis, v. 31, p. 135-148, 2010.
KANUNFRE, C. C.; DA SILVA FREITAS, J. J.; POMPÉIA, C.; DE ALMEIDA, D. C.
G.; CURY-BOAVENTURA, M. F.; VERLENGIA, R.; CURI R. Ciglitizone and 15d
PGJ2 induce apoptosis in Jurkat and Raji cells. International
Immunopharmacology, v.4, n.9, p.1171-1185, 2004.
KONG, A. T.; Yu, R.; HEBBAR, V.; CHEN, C.; OWUOR, E.; HU, R.; EE, R.;
MANDLEKAR, S. Signal transduction events elicited by cancer prevention
compounds. Mutation Research, v.480-481, p.231-241, 2001.
KRAMER, J. Orquídeas. Rio de Janeiro: Salamandra, 1989.
KUPCHAN, S. M.; DESSERTINE, A. L.; BLAYLOCK, B. T.; BRUAN, R. F. Isolation
and structural elucidation of allamandin, an antileukemiciridoid lactone from
Allamanda cathartica. Journal of Organic Chemistry, v.39, p.2477-2484, 1974.
KUSUMA, I. W.; ARUNG, E. T.; ROSAMAH, E.; PURWATININGSIH, S.;
KUSPRADINI, H.; ASTUTI, J.; KIM, Y. U.; SHIMIZU K. Antidermatophyte and
antimelanogenesis compound from Eleutherine americana grown in Indonesia.
Journal of Natural Medicines, v.64, n.2, p.223-226, 2010.
LIN, J.; PUCKREE, T.; MVELASE, T. P. Anti-diarrhoeal evaluation of some medicinal
plants used by zulu traditional healers. Journal of Ethnopharmacology, v.79, p.53-
56, 2002.
LIN, Z. X.; HOULT, J. R.; RAMAN, A. Sulphorhodamine B assay for measuring
proliferation of a pigmented melanocyte cell line and its application to the evaluation
of crude drugs used in the treatment of vitiligo. Journal of Ethnopharmacology,
v.66, p.141-50, 1999.
LINEHAN, W. M.; SRINIVASAN, R.; SCHMIDT, L. S. The genetic basis of kidney
cancer: a metabolic disease. Nature Reviews Urology, v.7, n.5, p.277-285, 2010.
LUCENA, G. M.; GADOTTI, V. M.; MAFFI, L. C.; SILVA, G. S.; AZEVEDO, M. S.;
SANTOS, A. R. Antinociceptive and anti-inflammatory properties from the bulbs of
Cipura paludosa Aubl. Journal of Ethnopharmacology, v.112, p.19–25, 2007.
LUCENA, G. M.; PORTO, F. A.; CAMPOS, E. G.; AZEVEDO, M. S.; CECHINEL-
FILHO, V.; PREDIGER, R. D.; FERREIRA, V. M. Cipura paludosa attenuates long-
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Verlengia%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15251113
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mandlekar%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11506817
101
term behavioral deficits in rats exposed to methylmercury during early development.
Ecotoxicology and Environmental Safety, v.73, n.6, p.1150–1158, 2010.
LUCENA, G. M.; MATHEUS, F. C.; FERREIRA, V. M.; TESSELE, P. B.; AZEVEDO,
M. S.; CECHINEL-FILHO, V.; PREDIGER, R. D. Effects of ethanolic extract and
naphthoquinones obtained from the bulbs of Cipura paludosa on short-term and
long-term memory: involvement of adenosine A1 and A2A receptors. Basic and
Clinical Pharmacology and Toxicology, v.112, n.4, p.229-235, 2013.
MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; NIERO, R.; CECHINEL FILHO, V.
Considerações gerais sobre aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais.
In: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e medicamentos: uma
abordagem multidisciplinar. São Paulo: Santos, 2010. p. 17–44.
MALUMBRES, M.; BARBACID, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing
paradigm. Nature Reviews Cancer, v.9, n.3, p.153-166, 2009.
MARCHETTI, G. M.; SILVA, K. A.; SANTOS, A. N.; SOUSA, I. M. O.; TINTI, S.
V.; FIGUEIRA, G. M.; FOGLIO, M. A.; CARVALHO, J. E. The anticancer activity of
dichloromethane crude extract obtained from Calea pinnatifida. Journal of
Experimental Pharmacology, v.4, p.157-162, 2012.
MARSHALL, N. J.; GOODWIN, C. J.; HOLT, S. J. A critical assessment of the use of
microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth
Regulation, v.5, n.2, p.69–84, 1995.
MONKS, A.; SCUDIERO, D.; SKEHAN, P.; SHOEMAKER, R.; PAULL, K.; VISTICA,
D.; HOSE, C.; LANGLEY, J.; CRONISE, P.; VAIGRO-WOLFF, A.; GRAY-
GOODRICH, M.; CAMPBELL, H.; MAYO, J.; BOYD, M. Feasibility of a High-Flux
Anticancer Drug Screen Using a Diverse Panel of Cultured Human Tumor Cell Lines.
Journal of the National Cancer Institute, v.83, n.11, p.757-766, 1991.
MONTERO, J. C.; ESPARÍS-OGANDO, A.; RE-LOUHAU, M. F.; SEOANE, S.;
ABAD, M.; CALERO, R.; OCAÑA, A.; PANDIELLA, A. Active kinase profiling, genetic
and pharmacological data define mTOR as an important common target in triple-
negative breast cancer. Oncogene, v.33, n.2, p.148-156, 2014.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v. 65,
n.1-2, p.55-63, 1983.
MOTA, M. F.; BENFICA, P. L.; BATISTA, A. C.; MARTINS, F. S.; PAULA, J. R.;
VALADARES, M. C. Investigation of Ehrlich ascites tumor cell death mechanisms
102
induced by Synadenium umbellatum Pax. Journal of Ethnopharmacology, v.139,
n.2, p.319-329, 2012.
MUNHOZ, A. C. M.; MINOZZO, B. R.; CRUZ, L. S.; OLIVEIRA, T. L.; MACHADO, W.
M.; PEREIRA, A. V.; FERNANDES, D.; MANENTE, F. A.; VELLOSA, J. C. R.;
NEPEL, A.; BARISON, A.; BELTRAME, F. L. Chemical and pharmacological
investigation of the stem bark of Synadenium grantii. Planta Medica, v.80, n.6,
p.458-464, 2014.
NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L. Antibacterial
activity of plants extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria.
Brazilian Journal of Microbiology, v.31, p.247-256, 2000.
NCI – National Cancer Institute. Discovery Services: Screening Services - Cell
lines in the in vitro screen. Disponível em:
<http://dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html>. Acesso em: 13 mar.
2015.
NECKEL, G. L. Atividade antineoplásica in vitro e in vivo da chalcona N9 e seu
possível mecanismo de ação. 2011. 145p. Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2011.
NIERO, R.; MAFRA, A. P.; LENZI, A. C.; CECHINEL-FILHO, V.; TISCHER, C. A.;
MALHEIROS, A.; DE SOUZA, M. M.; YUNES, R. A.; DELLE-MONACHE, F. A new
triterpene with antinociceptive activity from Maytenus robusta. Natural Product
Research, v.20, n.14, p.1315-1320, 2006.
NOVAES, A. P.; ROSSI, C.; POFFO, C.; PRETTI JÚNIOR, E.; OLIVEIRA, A. E.;
SCHLEMPER, V.; NIERO, R.; CECHINEL-FILHO, V.; BÜRGER C. Preliminary
evaluation of the hypoglycemic effect of some Brazilian medicinal plants. Therapie,
v.56, n.4, p.427-430, 2001.
OLIVEIRA, P. A.; COLAÇO, A.; CHAVES, R.; GUEDES-PINTO, H.; DE-LA-CRUZ, P.
L. F.; LOPES, C. Chemical carcinogenesis. Anais da Academia Brasileira de
Ciências, v.79, n.4, p.593-616, 2007.
ORTÊNCIO, W. B. Medicina popular do Centro-Oeste. 2 ed. Brasília: Thesaurus,
1997. p.322.
OSKOUEIAN, E.; ABDULLAH, N.; AHMAD, S. Phorbol esters isolated from Jatropha
meal induced apoptosis-mediated inhibition in proliferation of chang and Vero cell
lines. International Journal of Molecular Sciences, v.13, n.11, p.13816-13829,
2012a.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Malheiros%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17393657
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oliveira%20AE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11677867
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schlemper%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11677867
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oliveira%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18066431
103
OSKOUEIAN, E.; ABDULLAH, N.; AHMAD, S. Phorbol esters from Jatropha meal
triggered apoptosis, activated PKC-δ, caspase-3 proteins and down-regulated the
proto-oncogenes in Mcf-7 and Hela cancer cell lines. Molecules, v.17, p.10816-
10830, 2012b.
PAPAZISIS, K. T.; GEROMICHALOS, G. D.; DIMITRIADIS, K. A.; KORTSARIS, A.
H. Optimization of the sulforhodamine B colorimetric assay. Journal of
Immunological Methods, v.208, n.2, p.151-158, 1997.
PARAMAPOJN, S.; GANZERA, M.; GRITSANAPAN, W.; STUPPNER, H. Analysis of
naphthoquinone derivatives in the Asian medicinal plant Eleutherine americana by
RP-HPLC and LC–MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
v.47, n.4-5, p.990-993, 2008.
PARMIGIANI, R. B.; CAMARGO, A. A. O genoma humano e o câncer. In:
FERREIRA, C. G.; ROCHA, J. C. Oncologia Molecular. 2 ed. São Paulo: Atheneu,
2010. p. 3-13.
PITOT, H. C. Adventures in hepatocarcinogenesis. Annual Review of Pathology,
v.2, p.1-29, 2007.
PREMARATNA, A.; SHADAKSHARASWAMY, M.; NANJAPPA, S. Isolation,
purification and properties of a lectin from the latex of Synadenium grantii Hook f.
Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, n.18, p.32–35, 1981.
RAHIER, N. J.; THOMAS, C. J.; HECHT, S. M. Camptothecin and its analogs. In:
CRAGG, G. M.; KINGSTON, D. G. I.; NEWMAN, D. J. Anticancer Agents from
Natural Products. Boca Raton: CRC Press/Taylor & Francis, 2005. p. 5–22.
RAHMAN, A. U.; NGOUNOU, F. N.; CHOUDHARY, M. I.; MALIK, S.; MAKHMOOR,
T.; NUR-E-ALAM, M.; ZAREEN, S.; LONTSI, D.; AYAFOR, J. F.; SONDENGAM, B.
L. New antioxidant and antimicrobial Ellagic Acid derivatives from Pteleopsis
hylodendron. Planta Medica, v. 67, p. 335-339, 2003.
RAHMOUN, N. M.; BOUCHERIT-OTMANI, Z.; BOUCHERIT, K.; BENABDALLAH,
M.; VILLEMIN, D.; CHOUKCHOU-BRAHAM, N. Antibacterial and antifungal activity
of lawsone and novel naphthoquinone derivatives. Médecine et Maladies
Infectieuses, v.42, p.270-275, 2012.
RAJESH, R.; NATARAJUA, A.; GOWDA, C. D. R.; FREYB, B. M.; FREYB, F. J.;
VISHWANATH, B. S. Purification and characterization of 34-kDa, heat stable
glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on human fibrinogen and fibrin
clot. Biochimie, v.88, n.10, p.1313–1322, 2006.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oskoueian%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23203036
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kortsaris%20AH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9433470
104
RAO, C. V.; REDDY, B. S. NSAIDs and chemoprevention. Current Cancer Drug
Targets, v.4, n.1, p.29-42, 2004
RAVENNA, P. Revisional studies in the genus Cipura (Iridaceae). Onira, v.1, p.35-
43, 1988.
RISS, T. L.; MORAVEC, R. A.; NILES, A. L.; BENINK, H. A.; WORZELLA, T. J.;
MINOR, L. Cell Viability Assays - Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda
(MD), 2013.
RIVOIRE, W. A.; CAPP, E.; CORLETA, H. V. E.; DA SILVA, I. S. B. Bases
biomoleculares da oncogênese cervical. Revista Brasileira de Cancerologia, v.47,
n.2, p.179-184, 2001.
ROGERIO, A. P.; CARDOSO, C. R.; FONTANARI, C.; SOUZA, M. A.; AFONSO-
CARDOSO, S. R.; SILVA, E. V.; KOYAMA, N. S.; BASEI, F. L.; SOARES, E. G.;
CALIXTO, J. B.; STOWELL, S. R.; DIAS-BARUFFI, M., FACCIOLI, L. H. Anti-
asthmatic potential of a D-galactose-binding lectin from Synadenium carinatum latex.
Glycobiology, v.17, n.8, p.795-804, 2007.
ROSA, P. W. Perfil fitoquímico, variação sazonal e atividade biológica da
Epidendrum mosenii. 2006. 106f. Dissertação apresentada à Universidade do Vale
do Itajaí, Itajaí, 2006.
ROSA, P. W.; MACHADO, M. S.; CAMPOS-BUZZI, F.; NIERO, R.; DELLE-
MONACHE, F.; CECHINEL-FILHO, V. Seasonal and biological variations of
Epidendrum mosenii: quantification of 24-methylenecycloartanol using gas
chromatography. Natural Product Research, v.21, n.11 p.975-981, 2007.
SANTOS-OLIVEIRA, R.; COULAUD-CUNHA, S.; COLACO, W. Revisão da
Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, Celastraceae. Contribuição ao estudo das
propriedades farmacológicas. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.19, n.2b,
p.650-659, 2009.
SASAKI, K.; ABE, H.; YOSHIZAKI, F. In vitro antifungal activity of naphthoquinone
derivatives. Biologial and Pharmaceutical Bulletin, v.25, n.5, p.669-670, 2002.
SCHETTER, A. J.; HEEGAARD, N. H.; HARRIS, C. C. Inflammation and cancer:
interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways. Carcinogenesis,
v.31, n.1, p.37-49, 2010.
SCHMIDT, D. F. N.; YUNES, A. R.; SCHAAB, E. H.; MALHEIROS, A.; CECHINEL
FILHO, V.; FRANCHI, G. C.; NOWILL, A. E.; CARDOSO, A. A.; YUNES, J. A.
Evaluation of the anti-profiferative effect the extracts of Allamanda blanchetti and A.
105
Schottii on the growth of leukemic and endothelial cells. Journal of Pharmacy &
Pharmeutical Sciences, v.9, n.2, p.200-208, 2006.
SEOANE, S.; MONTERO, J. C.; OCAÑA, A.; PANDIELLA, A. Effect of multikinase
inhibitors on caspase-independent cell death and DNA damage in HER2-
overexpressing breast cancer cells. Journal of the National Cancer Institute,
v.102, n.18, p.1432-1446, 2010.
SHOEMAKER, R. H. The NCI60 human tumor cell line anticancer drug screen.
Nature Reviews Cancer, v.6, p.813-823, 2006
SHIBUYA, H.; FUKUSHIMA, T.; OHASHI, K.; NAKAMURA, A.; RISWAN, S.;
KITAKA, I. Indonesian Medicinal Plants. XX. Chemical structures of Eleutherosides
A, B and C, three new aromatic glucosides from the bulbs of Eleutherine palmifolia
(Iridaceae). Chemical Pharmaceutical Bulletin, v.45, p.1130-1134, 1997.
SKEHAN, P.; STORENG, R.; SCUDIERO, D.; MONKS, A.; MCMAHON, J.; VISTICA,
D.; WARREN, J. T.; BOKESCH, H.; KENNEY, S.; BOYD, M. R. New colorimetric
cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. Journal of the National Cancer
Institute, v.82, n.13, p.1107-1112, 1990.
SILVA-NETO, J. A. P.; MENEZES, L. D.; GOMES, G. O.; CUNHA, E. M. F.;
AZEVEDO, M. S.; FERREIRA, V. M.; DA SILVA, M. V. Evaluation of antinociceptive
and anti-inflammatory activities of the topical preparation of Cipura paludosa
(Iridaceae). Acta Amazonica, v.44, n.2, p. 263-270, 2014.
SOUSA, G. F.; DUARTE, L. P.; ALCÂNTARA, A. F.; SILVA, G. D.; VIEIRA-FILHO, S.
A.; SILVA, R. R.; OLIVEIRA, D. M.; TAKAHASHI, J. A. New triterpenes from
Maytenus robusta: structural elucidation based on NMR experimental data and
theoretical calculations. Molecules, v.17, p.13439-13456, 2012.
SOUZA, M. A.; AMANCIO-PEREIRA, F.; CARDOSO, C. R. B. Isolation and partial
characterization of a D-galactose binding lectin from the latex of Synadenium
carinatum. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.48, p.705–716, 2005.
SPIVEY, A. C.; WESTON, M.; WOODHEAD, S. Celastraceae sesquiterpenoids:
biological activity and synthesis. Chemical Society Reviews, v.31, p.43–59, 2002.
SUGGIT, M.; BIBBY, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening:
Empirical to target-driven approaches. Clinical Cancer Research, v.11, p.971-981,
2005.
TESSELE, P. B.; DELLE MONACHE, F.; QUINTÃO, N. L. M.; DA SILVA, G. F.;
ROCHA, L. W.; LUCENA, G. M.; FERREIRA, V. M.; PREDIGER, R. D.; CECHINEL-
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pandiella%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20811002
106
FILHO, V. A New Naphthoquinone Isolated from the Bulbs of Cipura paludosa and
Pharmacological Activity of Two Main Constituents. Planta Médica, v.77, n.10,
p.1035-1043, 2011.
TIBERTI, L. A.; YARIWAKE, J. H.; NDJOKO, K.; HOSTETTMANN, K. Identification
of flavonols in leaves of Maytenis ilicifolia and M. aquifolium (Celastraceae) by
LC/UV/MS analysis. Journal of Chromatography B, v.846, p.378–384, 2007.
TOMAO, F.; PAPA, A.; ZACCARELLI, E.; ROSSI, L.; CARUSO, D.; MINOZZI,
M.; VICI, P.; FRATI, L.; TOMAO, S.Triple-negative breast cancer: new perspectives
for targeted therapies. Onco Targets and Therapy, v.8, p.177-193, 2015.
ULLAH, M. F.; BHAT, S. H.; HUSAIN, E.; ABU-DUHIER, F.; HADI, S. M.; SARKAR,
F. H.; AHMAD, A. Cancer chemopreventive pharmacology of phytochemicals derived
from plants of dietary and non-dietary origin: implication for alternative and
complementary approaches. Phytochemistry Review, v.13, p.811-833, 2014.
VALADARES, M. C.; CASTRO, N. C. C.; CUNHA, L. C. Synadenium umbellatum:
citotoxicidade e danos ao DNA de células da medula óssea de camundongos.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v.43, n.4, p.631-638, 2007.
VELLOSA, J. C.; KHALIL, N. M.; FORMENTON, V. A.; XIMENES, V. F.; FONSECA,
L. M.; FURLAN, M.; BRUNETTI, I. L.; OLIVEIRA, O. M. Antioxidant activity of
Maytenus ilicifolia root bark. Fitoterapia, v.77, n.3, p.243-244, 2006.
VENDRAMINI-COSTA, D. B. Goniotalamina: atividade antitumoral e anti-
inflamatória. 2012. 182f. Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade
Estadual de Campinas, Campinas, 2012.
VICHAI, V.; KIRTIKARA, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity
screening. Nature Protocols, v.1, p.1112-1116, 2006.
VINEIS, P.; SCHATZKIN, A.; POTTER, J. D. Models of carcinogenesis: an overview.
Carcinogenesis, v.31, n.10, p.1703-1709, 2010.
VILLAS BÔAS, G. K.; GADELHA, C. A. G. Oportunidades na indústria de
medicamentos e a lógica do desenvolvimento local baseado nos biomas brasileiros:
bases para a discussão de uma política nacional. Cadernos de Saúde Pública,
v.23, 2007.
WHO - World Health Organization. International Agency for Research on Cancer.
World Cancer Report, 2014.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yariwake%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17011840
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brunetti%20IL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16567059
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Oliveira%20OM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16567059
107
XU, J.; QUI, F.; DUAN, W.; QU, G.; WANG, N.; YAO, X. New bioactive constituents
from Eleutherine americana. Frontiers of Chemistry in China, v.3, p.320–323,
2006.
YARIWAKE, J. H.; LANÇAS, F. M.; CAPPELARO, E. A.; VASCONCELOS, E. C.;
TIBERTI, L. A.; PEREIRA, A. M. S.; FRANÇA, S. C. Seasonal variability of chemical
compounds (triterpenes, flavonoids, and polyphenols) from Maytenus aquifolium
Mart. (Celastraceae) leaves. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, n.2,
p.162–168, 2005.
YIN, L. T.; FU, Y. J.; XU, Q. L.; YANG, J.; LIU, Z. L.; LIANG, A. H.; FAN, X. J.; XU, C.
G. Potential biochemical therapy of glioma cancer. Biochemical and Biophysical
Research Communications, v.362, n.2, p.225-229, 2007.
YUSTE, L.; MONTERO, J. C.; ESPARÍS-OGANDO, A.; PANDIELLA, A. Activation of
ErbB2 by overexpression or by transmembrane neuregulin results in differential
signaling and sensitivity to Herceptin. Cancer Research, v.65, n.15, p.6801-6810,
2005.
ZWAAL, R. F. A.; SCHROIT, A. J. Pathophysiologic implications of membrane
phospholipid asymmetry in blood cells. Blood, v.89, n.4, p.1121-1132, 1997.
108
109
ANEXOS – Artigos submetidos para publicação
Relação direta com a tese:
1. Adriana Campos, Débora Barbosa Vendramini-Costa, Giovanna Barbarini
Longato, Tailyn Zermiani, Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, João Ernesto de Carvalho,
Atanasio Pandiella, Valdir Cechinel Filho. Antiproliferative effect of Synadenium
grantii Hook f. stems (Euphorbiaceae) and a rare phorbol diterpene ester. Medicinal
Chemistry Research (FI 1.402), Julho 2015.
2. Adriana Campos, Débora Barbosa Vendramini-Costa, Giovanna Francisco Fiorito,
Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, João Ernesto de Carvalho, Greice Maria Rodrigues de
Souza, Franco Delle Monache, Valdir Cechinel Filho. Antiproliferative effect of
extracts and pyranonaphthoquinones obtained from Cipura paludosa bulbs.
Pharmaceutical Biology (FI 1.241), Junho 2015.
Relação indireta com a tese:
1. Adriana Campos, Greice Maria Rodrigues Souza, Franco Delle Monache, Estefanía
Butassi, Susana Zacchino, Valdir Cechinel Filho. Antifungal Activity of
Pyranonaphtoquinones obtained from Cipura paludosa bulbs. Natural Product
Communications (FI 0.924), Fevereiro 2015. (Aceito para publicação).
2. Luciane Angela Nottar Nesello, Adriana Campos, Theodoro Wagner, Arturo San
Feliciano, Fátima de Campos Buzzi, Valdir Cechinel Filho. Chemical composition and
antinociceptive potential of Campomanesia reitziana fruits. Journal of Medicinal
Food (FI 1.626), Março 2015.
3. Luciane Angela Nottar Nesello, Adriana Campos, Karla Capistrano, Fátima de
Campos Buzzi, Valdir Cechinel Filho. Chemical composition and antinociceptive
activity of Myrcianthes pungens. International Journal of Food Sciences and
Nutrition (FI 1.206), Junho 2015.
110
4. Luciane Angela Nottar Nesello, Roseane Leandra da Rosa, Adriana Campos, Sérgio
Faloni de Andrade, Valdir Cechinel Filho. Screening of wild fruits with
gastroprotective activity in different experimental models. Revista Brasileira de
Fruticultura (FI 0.49), Maio 2015.
Capítulo de livro publicado – relação direta com a Tese
CAMPOS, A.; MALHEIROS, A.; NIERO, R.; CECHINEL FILHO, V. Biodiversidade
brasileira (terrestre e marinha): uma vasta fonte de agentes anticâncer. In: SAN
FELICIANO, A.; CECHINEL FILHO, V. Descoberta, desenho e desenvolvimento
de novos agentes anticâncer no âmbito do programa Iberoamericano CYTED.
Itajaí: UNIVALI, 2014. p. 193-218.
