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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI

MARIVANE LEMOS

ESTUDO DO PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO, FRAÇÕES

E SUBFRAÇÕES DAS FOLHAS DE COUVE (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)

Itajaí - 2010

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS

MARIVANE LEMOS



Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade Co-orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero

Itajaí, julho de 2010.

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L544e

Lemos, Marivane, 1984- Estudo do perfil fitoquímico e avaliação da atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações das folhas de couve [manuscrito] : Brassica oleracea L. var. acephala DC. / Marivane Lemos. – 2010. 114 f. : il. ; 30 cm

Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2010. “Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade”. Bibliografia: f. 100-113.

1. Produtos naturais. 2. Alimentos funcionais. 3. Fitoquímica. 4. Plantas medicinais. 5. Farmacologia. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.

CDU: 615 Cristina M. V. Porciúncula – CRB 14/966

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos, que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente: Ao Prof. Dr. Sérgio, pela orientação sempre amiga, pelos ensinamentos sábios e éticos, pelo profissional de respeito, pela dedicação ao estudo, que por todos esses anos, vem acompanhando e incentivando meu crescimento profissional, ajudando-me a superar inúmeras dificuldades. Seus ensinamentos são inestimáveis por toda a minha vida... Ao Prof. Dr. Rivaldo Niero, que sempre com um sorriso me recebeu, e assim como recebe a todos, com uma alegria imensa ao ensinar, que apesar das dificuldades, sempre me orientou a seguir confiante: “No final tudo dá certo. Se não deu certo é porque não chegamos no final ainda”... Aos professores: Dra. Angela Malheiros, Dra. Marcia Maria de Souza, Dra. Nara L. M. Quintão, Dra. Cristiani Bürguer, Dra. Christiane M. da S. Bittencourt, Dra. Fátima de Campos Buzzi, Dr. Rilton Alves de Freitas, Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Dr. Valdir Cechinel Filho, Dr. Rogério Correa, Dr. Telmo José Mezadri... pelos ensinamentos nos corredores dos blocos 17 e 27, que sempre se propuseram a ajudar e esclarecer, que me acompanharam, sempre aconselhando os melhores caminhos a serem seguidos... Pelos risos e conversas, pela amizade proporcionada durante esse tempo... Ao Prof. Dr. David Rivero Tames, pela orientação durante a confecção dos cortes histológicos, pela aula em histologia, dada de maneira fascinante... À técnica do laboratório de farmacologia, Maria Angélica, a Maggie, pelo cuidado com os animais, meu imenso carinho... À técnica do laboratório de histologia do curso de Odontologia, Maria, pelo cuidado com os animais, pela amizade, pelo carinho e dedicação... Ao Joel, técnico do laboratório de fitoquímica, pela paciência em ajudar, pelas risadas e pela companhia durante os estudos fitoquímicos. Aos técnicos do laboratório de histologia do curso de Odontologia, pela disponibilização das instalações para a confecção dos cortes histológicos, Beatriz e Vanessa, minha gratidão e minha admiração pela dedicação com que vocês realizam esse trabalho... Aos técnicos e professores do laboratório de algas do curso de Oceanografia, pela disponibilização e orientação no uso do microscópio para a realização das fotomicrografias dos cortes histológicos, em especial à Renata, ao Prof. Dr. Matias e ao Prof. Dr. Luis Antonio.

Ao aluno de Doutorado da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – FCFRP-USP, Me. João Paulo Barreto de Sousa e ao Prof. Dr. Jairo Kenupp Bastos, pela disponibilização de seu tempo para as análises cromatográficas realizadas... Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UNIVALI, Prof. Dr. Tania Mari Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenize Heyse Moreira. Aos meus colegas de mestrado... como é bom conviver com vocês... se hoje me pedirem se valeu a pena... sim... conheci pessoas especiais... que fazem a minha vida mais feliz... adoro vocês: Isabel, Rosana, Gislaine, Ana Paula, Juliana, José Roberto, Luiz Carlos, Philipe, Alessandro, Nicole, Silvia, Lilian, Thaisa, Vanessa, Fernanda, Jaqueline, Thaís... só podia ser Deus para colocar a amizade e o carinho de vocês no meu caminho... Aos colegas da farmácia... alunos de Pibic e Probic, Francielle, Crislaine e Renan... que me acompanharam e foram acompanhados nos experimentos... pela ajuda e amizade dentro e fora da universidade... Aos alunos de Aracajú, da Universidade Tiradentes – UNIT, Ana Roseli e Gabriel, pela colaboração nos experimentos durante seu estágio... e pela amizade... pela hospitalidade com que me receberam... À minha família, ao meu pai Alterino e minha mãe Lurdes, aos meus irmãos André e William, e ao meu filho, Luiz Miguel, por compreender a minha ausência... ao meu tio Camilo e a minha tia Janete, pelo carinho com que me apoiaram esse tempo que estive aqui... Ao Isaac... por fazer parte da minha vida com seu sorriso, seu jeito alegre... por compartilhar comigo as horas intermináveis dos experimentos, e pelos momentos de “happy hour”, merecidos após o trabalho... por hoje estar comigo em mais uma etapa... À Universidade do Vale do Itajaí, por disponibilizar instalações e materiais para a realização deste trabalho. E por fim, agradeço à Programa de Suporte a Pesquisa de Instituições Particulares – PROSUP/CAPES, que fomentou meus esforços para a realização desta dissertação de Mestrado.

Muito obrigada...

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Marivane Lemos (Dissertação) Junho/2010

Orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor. Co-orientador: Rivaldo Niero, Doutor. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas. Número de Páginas: 113. Relatos populares indicam que a couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC., quando tomada em jejum, sob a forma de suco, produz alívio dos sintomas das desordens gástricas. Estudos demostraram que alguns compostos presentes nas plantas deste gênero apresentam atividade antioxidante, cicatrizante, antimicrobiana, anti-inflamatória e anticancerígena. Sendo assim, este trabalho estudou a atividade gastroprotetora da Brassica oleracea L. var. acephala DC. através dos métodos de úlceras agudas (induzidas por etanol associado a ácido clorídrico, AINE associado a parassimpaticomimético), e úlceras crônicas (induzida por ácido acético), alterações dos parâmetros do suco gástrico (avaliação da secreção gástrica ácida e determinação de muco) e avaliação dos possíveis mecanismos de ação envolvidos (determinação dos papéis do óxido nítrico e compostos sulfidrilas in vivo), além de procurar estabelecer o perfil fitoquímico preliminar. Foram observadas gastroproteção nos tratamentos com o extrato hidroalcoólico, fração clorofórmica e subfrações, e fração aquosa e subfrações. A gastroproteção com o tratamento do extrato hidroalcoólico foi mais pronunciada do que a observada nos tratamentos com fração clorofórmica e fração aquosa, omeprazol e cimetidina, em todos os experimentos realizados. Outro dado importante é que, quando realizado o fracionamento do extrato, suas frações e subfrações não perderam a gastroproteção, porém mostraram-se menos eficientes. Além disso, os mecanismos de ação podem estar relacionados com fatores antioxidantes (participação do NO e GSH), fatores anti-inflamatórios (participação da PGE2) ou a inibidores da secreção ácida (bloqueio da (H+-K+)-ATPase). O estudo crônico permitiu avaliar o efeito curativo do extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC, sendo que foram observadas a diminuição do tamanho da úlcera, bem como alterações histopatológicas. A fração clorofórmica pode apresentar compostos fenólicos responsáveis pela atividade gastroprotetora ligada a fatores anti-inflamatórios e/ou antioxidantes. Já a fração aquosa pode apresentar flavonóides glicosilados que podem interferir aumentando a resistência ao dano produzido pelos agentes indutores de úlcera, e glicosinolatos, que após hidrólise, se convertem em isotiocianatos, que interferem na secreção ácida (bloqueio da (H+-K+)-ATPase). No modelo de ligadura de piloro, podemos observar que tanto o extrato quanto as frações tem a capacidade de interferir na secreção ácida, aumentando o pH, diminuindo o volume estomacal e diminuindo a concentração dos íons hidrogênio, e aumentando a secreção de muco. Já no estudo de úlceras crônicas induzidas por ácido acético, o extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC. tem a capacidade de regenerar o dano produzido pelo ácido acético, re-

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organizando todas as estruturas celulares e restabelecendo a integridade da mucosa e do tecido muscular do estômago. De acordo com os resultados obtidos nos modelos experimentais utilizados, o extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC. apresenta atividade gastroprotetora, confirmando seu uso na medicina popular e reforçando seu papel como alimento funcional. Palavras-chave: Úlcera. Alimentos funcionais. Gastroproteção. Antioxidante. Fitoquímica. Brassica oleracea.

PRELIMINARY PHYTOCHEMICAL PROFILE AND EVALUATION OF GASTROPROCTIVE ACTIVE OF HIDROALCOHOLIC EXTRACT,

FRACTIONS AND SUBFRACTIONS OF KALE LEAVES (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)

Marivane Lemos (Dissertation) June/2010

Advisor: Sérgio Faloni de Andrade, Doctor. Co-advisor: Rivaldo Niero, Doctor. Area of concentration: Natural products and bioactive substances. Number of pages: 113. Popular reports indicate that kale, Brassica oleracea L. var. acephala DC., when taken while fasting, in the form of a juice, relieves the symptoms of gastric disorders. Studies show that some compounds present in plants of this genus exhibit antioxidant, wound healing, antimicrobial, anti-inflammatory and anticancer activity. Thus, this study investigates the gastroprotective activity of Brassica oleracea L. var. acephala DC. through the methods of acute ulcers (induced by ethanol combined with hydrochloric acid, NSAID associated with parasympathomimetic), and chronic ulcers (acetic acid induced), changes in parameters of gastric juice (evaluation of gastric acid secretion and determination of mucus) and evaluation of the possible mechanisms involved (determination of the roles of nitric oxide and sulfhydryl compounds in vivo). It also seeks to establish the preliminary phytochemical profile. Different forms of gastroprotection were observed in treatments with hydroalcoholic extract, chloroform fraction and subfractions, and aqueous fractions and subfractions. Gastroprotection with the treatment of hydroalcoholic extract was more pronounced than that observed in treatments with chloroform fraction and aqueous fraction, omeprazole and cimetidine in all the experiments. Another important finding is that, when fractionation of the extract was performed, its fractions and subfractions did not lose the gastroprotection, but were less efficient. Furthermore, the mechanisms of action may be related to antioxidant factors (involvement of NO and GSH), anti-inflammatory factors (participation of PGE2) or acid secretion inhibitors (blockade of (H+-K+)-ATPase). The chronic study evaluated the curative effect of extract of B. oleracea L. var. acephala DC, and revealed a decrease in size of the ulcer, as well as histopathological changes. The chloroform fraction may exhibit phenolic compounds which are responsible for the gastroprotective activity linked to anti-inflammatory factors and/or antioxidants. Meanwhile, the aqueous fraction may present in flavonoid glycosides that can interfere by increasing resistance to the damage produced by agents that induce ulcer, and glucosinolates, which after hydrolysis, are converted into isothiocyanates that interfere in acid secretion (blocking (H+-K+)-ATPase). In the pylorus ligature model, we observed that both the extract and the fractions have the ability to interfere with acid secretion, raising pH, decreasing the volume of the stomach, decreasing the concentration of hydrogen ions, and increasing mucus secretion. In the study of chronic ulcers induced by acetic acid extract of B. oleracea L. var. acephala DC. has the ability to regenerate the damage caused by acetic acid, re-organizing all the cell structures and restoring the integrity of the mucosa and muscle tissue of the stomach. According to the results obtained in experimental models used, the extract of B. oleracea L. var. acephala

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DC. displays gastroprotective activity, confirming its use in folk medicine and enhancing its role as a functional food. Keywords: ulcer. Functional foods. Gastroprotective. Antioxidant. Phytochemistry. Brassica oleracea.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Detalhe das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. .............. 35

Figura 2. Diagrama geral mostrando os principais produtos da degradação

enzimática dos glicosinolatos. Em detalhe, o "rearranjo de Lossen" do

qual resulta os isotiocianatos. ................................................................ 37

Figura 3. Modo de uso popular: suco das folhas de Brassica oleracea L.var.

acephala DC. .......................................................................................... 39

Figura 4. Secção longitudinal, face ventral do estômago. ..................................... 41

Figura 5. Imagem esquemática das camadas musculares e mucosas do

estômago. ............................................................................................... 42

Figura 6. Representação esquemática dos tipos celulares presentes na mucosa

gástrica . ................................................................................................. 43

Figura 7. Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo

estômago. ............................................................................................... 46

Figura 8. Fluxograma do processo de partição líquido-líquido para a obtenção das

frações.................................................................................................... 49

Figura 9. Perfil cromatográfico: A) 1: α-β-amirina; 2: lupeol; 3: FC; 4: espinasterol;

5: estigmasterol. Revelador: cloreto férrico. B) 1: α-β-amirina; 2: lupeol;

3: FC; 4: espinasterol; 5: estigmasterol. Revelador: anisaldeído sulfúrico.

C) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador:

cloreto férrico. D) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5:

sacarose. Revelador: anisaldeído sulfúrico. E) 1: quercetina; 2: rutina; 3:

FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: ácido p-aminobenzoico. ...... 63

Figura 10. Perfil cromatográfico: A) CCD da SFC (6) (111-150), eluída com Hex: Ac

(7:3) revelado com anisaldeído. B) CCD da SFAQ (6) (41-46) eluída com

CHCl3:MeOH (7:3) revelado com anisaldeído. C) CCD da SFAQ (6) (41-

46) eluída com CHCl3:MeOH (7:3) revelado com ácido p-aminobenzoico.

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............................................................................................................... 64

Figura 11. Perfil cromatográfico por CGAR-DIC obtido das frações hexânica,

clorofórmica e acetato de etila obtidas do extrato hidroalcoólico de B.

oleracea L. var. acephala DC. A) Fração hexânica. B) Fração

clorofórmica. C) Fração acetato de etila. 1: Sinal em 9,00 min. 2: Sinal

em 11,60 min. ......................................................................................... 65

Figura 12. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30

mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B.

oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em

úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. . 67


mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de

B. oleracea L. var. acephala DC.(hexânica, clorofórmica, acetato de etila

e aquosa, na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas

por etanol/HCl em camundongos. .......................................................... 68


mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das

folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e

100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em

camundongos. ........................................................................................ 70


mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de

Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100

mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em

camundongos. ........................................................................................ 70


mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da

fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de

Brassica oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em

úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. . 72

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mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da

fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica

oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em úlceras

gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. .............. 73

Figura 18. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100

mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B.

oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em

úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em

camundongos. ........................................................................................ 74


mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das

folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e

100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por

indometacina/betanecol em camundongos. ........................................... 76


mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de


mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por

indometacina/betanecol em camundongos. ........................................... 76


mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var.

acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em

úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em

camundongos. ........................................................................................ 78

Figura 22. Detalhes de cortes histológicos do efeito da administração oral de

cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica

oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa

(100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético

(30%) em camundongos. ....................................................................... 80

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Figura 23. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de



(100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em

camundongos, associado a administração de L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e

salina (0,1 mL/10 g de peso de animal).................................................. 85

Figura 24. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de



(100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em

camundongos, associado a administração de NEM (10 mg/kg, i.p.) e

salina (0,1 mL/10 g de peso de animal).................................................. 87

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da

fração clorofórmica. ................................................................................ 61

Tabela 2. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da

fração aquosa. ........................................................................................ 62

Tabela 3. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes

doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala

DC. (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por

etanol/HCl em camundongos. ................................................................ 66

Tabela 4. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes

frações do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea L. var.

acephala DC. (hexânica, clorofórmica, acetato de etila e aquosa, na

dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em

camundongos. ........................................................................................ 68

Tabela 5. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das frações

clorofórmica e aquosa obtidas do extrato hidroalcoólico das folhas de


mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos. ............ 69


subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta da fração

clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica

oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas

por etanol/HCl em camundongos. .......................................................... 71


subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta das

frações clorofórmica e aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de

Brassica oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras

gástricas por etanol/HCl em camundongos. ........................................... 72

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Tabela 8. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes

doses do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var.

acephala (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas

por indometacina/betanecol em camundongos. ..................................... 74


frações do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var.

acephala (clorofórmica e aquosa, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em

úlceras gástricas por indometacina/betanecol em camundongos. ......... 75

Tabela 10. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato

hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg)

e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas

agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos................ 77

Tabela 11. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato


e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) na espessura da mucosa

gástrica de úlceras induzidas por ácido acético (30%) em camundongos.

............................................................................................................... 79

Tabela 12. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das

diferentes doses do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea

var. acephala DC. (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da

secreção gástrica ácida de camundongos submetidos à ligadura de

piloro....................................................................................................... 81

Tabela 13. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das

diferentes doses das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg)

obtidas a partir do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea

var. acephala nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica ácida de

camundongos submetidos à ligadura de piloro. ..................................... 82

Tabela 14. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e

indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidralcoólico

das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) nos

18

parâmetros bioquímicos da secreção de muco de camundongos

submetidos à ligadura de piloro. ............................................................. 83

Tabela 15. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e

indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses das diferentes doses

das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg) obtidas do

extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25,

50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção de muco de

camundongos submetidos à ligadura de piloro. ..................................... 83

Tabela 16. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato


e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por

etanol/HCl associado a inibição da NO-sintase em camundongos. ....... 84

Tabela 17. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato


e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por

etanol/HCl associado a alquilação de grupamentos sulfidrilas em

camundongos. ........................................................................................ 86

LISTA DE ABREVIATURAS

ABS – Absorbância

AINE – Anti-inflamatório não-esteroidal

ATP – Adenosina Tri-Fosfato

CCA – Cromatografia em coluna aberta

CCD – Cromatografia de camada delgada

CCK - Colecistocinina

CGAR-DIC – Cromatografia gasosa de alta resolução associada a detector de

ionização de chama

COX – Ciclo-oxigenase

DC. – Augustin Pyrame de Candolle

DI50 – Dose inibitória

EGF - Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidérmico)

EHA – Extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala DC.

EPM – Erro padrão da média

FAE – Fração acetato de etila

FAQ – Fração aquosa

FC – Fração clorofórmica

FDM – Franco Delle Monache

FGF - Fibroblast growth factor (Fator de crescimento de fibroblasto)

FH – Fração hexânica

GMPc – Guanosina monofosfato cíclico

GPS – Global Positioning System (Sistema de Posicionamento Global)

(H+-K+)-ATPase – bomba hidrogênio-potássio ATPase (bomba de prótons)

H2 – Receptor de histamina tipo 2

IC – Índice de cura

IL-1αααα – Interleucina tipo 1 alfa

IL-1ββββ – Interleucina tipo 1 beta

i.p. – Via intraperitonial

L. – Carl von Linné

L-NAME – N-nitro-L-arginina metil éster

LPS – Lipopolissacarídeo

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MeOH - Metanol

mEq – Miliequivalente-grama

N – North

NO – óxido nítrico

NEM – N-etilmaleimida

PDGF - Platelet-derived growth factor (Fator de crescimento derivado de plaquetas)

PGE – Prostaglandina do tipo E

PPPM – Programa de Pesquisa em Plantas Medicinais

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

SFAQ – Subfração aquosa

SFC – Subfração clorofórmica

SUS – Sistema Único de Saúde

TGF – Transforming growth factor (Fator de crescimento tumoral)

TNF – Tumor necrosis factor (Fator de necrose tumoral)

ULI – Ulcer lesion index (Índice de lesão ulcerativa)

UV – Ultravioleta

v.o. – Via oral

var. – Variante

VEGF – Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento vascular

endotelial)

W – West

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 24

2 OBJETIVOS ........................................................................................... 27

2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 27

2.2 Objetivos específicos ............................................................................. 27

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................. 29

3.1 O uso de plantas como alimentos funcionais e fitoterápicos .................. 29

3.2 Brassica oleracea L. var. acephala ........................................................ 32

3.3 Fisiopatologia da úlcera e terapia antiúlcera .......................................... 40

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 48

4.1 Análise fitoquímica de Brassica oleracea L. var. acephala DC. ............. 48

4.1.1 Coleta e preparo do material vegetal ..................................................... 48

4.1.2 Preparação do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L. var.

acephala DC. .......................................................................................... 48

4.1.3 Fracionamento do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L.

var. acephala DC. ................................................................................... 48

4.1.4 Análise cromatográfica ........................................................................... 49

4.2 Animais e ensaios farmacológicos ......................................................... 51

4.2.1 Animais .................................................................................................. 51

4.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa ................. 52

22

4.4 Avaliação da atividade gastroprotetora .................................................. 53

4.4.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl ................................... 53

4.4.2 Modelo de úlcera aguda induzida por antiinflamatório não-esteroidal

associada à estimulação parassimpaticomimética ................................. 54

4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio curativo) .. 55

4.4.4 Análise histopatológica ........................................................................... 56

4.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica .................................. 57

4.5.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro) .............. 57

4.5.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica .......... 58

4.6 Mecanismos de ação antiúlcera ............................................................. 59

4.6.1 Avaliação do papel do Óxido Nítrico (NO) in vivo ................................... 59

4.6.2 Avaliação do papel dos grupos sulfidrílicos (SH) in vivo ........................ 60

5 RESULTADOS ....................................................................................... 61

5.1 Análise fitoquímica preliminar do extrato hidroalcoólico das folhas,

frações e subfrações de Brassica oleracea L. var. acephala DC. .......... 61

5.2 Análise fitoquímica ................................................................................. 62

5.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa ................. 65

5.4 Avaliação da atividade gastroprotetora .................................................. 66

5.4.1 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala

DC., frações e subfrações em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl ...

............................................................................................................... 66

23


DC. e frações em úlceras agudas induzidas por

AINE/parassimpaticomimético ................................................................ 73


DC. e frações no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético

(ensaio curativo) ..................................................................................... 77

5.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica .................................. 81


DC. e frações sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro) ................. 81


DC. e frações sobre a secreção de muco em mucosa gástrica ............. 82

5.6 Mecanismos de ação antiúlcera in vivo .................................................. 84

5.6.1 Papel do óxido nítrico e do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L.

var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl

............................................................................................................... 84

5.6.2 Papel dos compostos sulfidrilas e do extrato hidroalcoólico de Brassica

oleracea L. var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas

por etanol/HCl ........................................................................................ 85

6 DISCUSSÃO .......................................................................................... 88

7 CONCLUSÕES ...................................................................................... 98

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 100

ANEXO A ............................................................................................................. 113

24

1 INTRODUÇÃO

Na última década, em todo o mundo, estudos focam sua atenção na saúde e

na manutenção da vida. Evidências crescentes apontam um aumento no consumo

de frutas e hortaliças levam a uma diminuição risco de câncer e outras doenças

crônicas. Os efeitos saudáveis de frutas, verduras, legumes e hortaliças na

prevenção de doenças têm sido investigados, focando os componentes funcionais

em alimento derivados de plantas (KIM, 2003).

A dieta é um dos fatores mais importantes na manutenção da saúde. Quando

inadequada, predispõe ao surgimento de doenças, por exemplo, diabetes mellitus

tipo 2, arteriosclerose, câncer, doenças cardiovasculares, desordens

gastrointestinais, entre outras (SCHIEBER, STINTZING, CARLE, 2001; HASLER,

2002; HAMAUZU et al., 2008).

Atualmente, muitas plantas usadas como alimentos têm seus efeitos que vão

muito além de seus benefícios nutricionais, sendo chamadas de alimentos

funcionais. Essas plantas, também são alvos de desenvolvimento de fitoterápicos,

pois apresentam fitoconstituintes responsáveis pela redução do risco de doenças,

melhorando a saúde e o bem-estar (HASLER, 1998; ASHWELL, 2001; LAJOLO,

2001; JONES 2002; O’CONNOR, WHITE, 2010).

O padrão alimentar e o estilo de vida da sociedade moderna são um dos

responsáveis pelo acometimento de patologias, que resultam em morbidade e

mortalidade. Essas patologias são resultado de uma dieta com alta ingestão de

gorduras totais e gorduras saturadas, colesterol, açúcar e sódio refinado, associado

a baixa ingestão de gordura insaturada, grãos integrais, legumes, frutas e verduras.

A má alimentação, fumo, estresse, ingestão de álcool, uso abusivo de fármacos

também acarreta em distúrbios na integridade da saúde, além de diminuir a

qualidade de vida (HASLER, 2002).

Com o avanço das indústrias, alimentícia e farmacêutica, houve um aumento

nos estudos de plantas com propriedades sobre a manutenção e recuperação da

saúde. A chamada “onda verde” marca o ressurgimento de pesquisas de plantas na

procura de substâncias com propriedades farmacológicas. Este é um dos grandes

acontecimentos responsáveis por essa mudança de foco industrial, ou seja, na

procura de plantas com propriedades farmacológicas que visem à prevenção e o

25

tratamento de patologias com menos efeitos colaterais (SILVA, 2002).

Os legumes pertencentes ao gênero Brassica apresentam grande importância

econômica, pois são produzidos e consumidos o ano todo, e em todo o mundo.

Estão presentes como ingredientes de saladas, refogados e caldos. Atualmente,

esse gênero pode ser considerado um alimento funcional, pois apresenta diversas

substâncias capazes de interferir em processos patológicos, sendo capazes de

promover a manutenção da saúde. Dentre as propriedades farmacológicas já

descritas estão as atividades antioxidante, cicatrizante, antimicrobiana, anti-

inflamatória e ancancerígena (LIN, LI, HWANG, 2008; SOUSA et al., 2008; ROY et

al., 2009; TOMOHIKO et al., 2009).

A couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.), também conhecida como

couve-manteiga, couve-branca, couve-galega e couve-mineira, sob a forma de suco

das suas folhas, é usada na medicina popular para desordens gástricas. Segundo

estudo etnofarmacológico conduzido por Silva et al. (2006), a couve é uma das

plantas mais utilizadas para o tratamento de úlceras e gastrites.

Como o padrão alimentar e o estilo de vida adotado pela população mundial

favorece ao aparecimento de doenças do trato digestório, as úlceras pépticas

tornaram-se presentes na sociedade moderna. Nos últimos 20 anos, houve um

aumento significativo no quadro de distúrbios gástricos. Em média, pelo menos 10%

da população mundial poderá sofrer um evento relacionado com o aparecimento de

úlceras gástricas no decorrer da vida. O aumento da secreção de ácido é um dos

fatores mais importantes envolvidos na fisiopatologia da úlcera, porém, outros

fatores envolvidos com a citoproteção e manutenção da integridade da mucosa

estão sendo estudados (BRZOZOWSKI, 2003).

Além disso, atualmente no Brasil existem políticas que favorecem o

desenvolvimento de novos medicamentos baseados em plantas. O Programa de

Pesquisas de Plantas Medicinais (PPPM) do SUS (Sistema Único de Saúde) elenca

74 espécies vegetais para novos estudos farmacológicos e toxicológicos. Dentre

essas espécies, a Brassica oleracea foi uma das espécies selecionadas, pois carece

de estudos científicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

Com base nos dados dos fitoconstituintes presentes no gênero, dados

farmacológicos, estudos epidemiológicos e incentivo de políticas nacionais para o

desenvolvimento de novos medicamentos, além das evidências etnofarmacológicas,

tornou-se importante estudar a couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)

26

quanto a sua atividade gastroprotetora e seus constituintes químicos, procurando

observar seu envolvimento nos mecanismos presentes na fisiopatologia das

desordens gástricas (SCHMEDA-HIRSCHAMANN, YESILADA, 2005).

27

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico, frações e

subfrações obtidas das folhas de couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.),

bem como determinar seu provável mecanismo de ação.

2.2 Objetivos específicos

1. Obter extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var.

acephala DC. Através da maceração em etanol 50% a frio.

2. Obter as frações hexano, clorofórmio, acetato de etila e aquosa através

do processo de partição líquido-líquido.

3. Das frações mais ativas, obter subfrações através de cromatografia em

coluna aberta.

4. Determinar o perfil fitoquímico, e comparar com os padrões da

literatura, através de testes cromatográficos preliminares.

5. Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico, frações e

subfrações através modelo de indução de úlcera aguda induzida por etanol

associado a ácido clorídrico em camundongos.

6. Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico e frações

através modelo de indução de úlcera aguda induzida por AINE associado a

parassimpaticomimético em camundongos.

28

7. Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico e frações

através do modelo de indução de úlcera crônica (ensaio curativo): ácido acético,

avaliando sua histopatologia.

8. Verificar o efeito do extrato e frações sobre a secreção gástrica ácida e

produção de muco, no modelo de ligadura de piloro em camundongos

9. Investigar os possíveis mecanismos de ação pelos quais o extrato e

frações de Brassica oleracea L. var. acephala DC. através do modelo de indução de

úlcera aguda induzida por HCl/etanol associado a L-NAME e NEM.

10. Comparar a atividade antiúlcera do extrato hidroalcoólico, frações e

subfrações de Brassica oleracea L. var. acephala DC. com fármacos utilizados na

terapia antiúlcera (omeprazol e cimetidina).

29

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 O uso de plantas como alimentos funcionais e fitoterápicos

Nas últimas décadas é notável o aumento de trabalhos na literatura citando o

papel dos metabólitos secundários presentes nos alimentos e seus potenciais efeitos

benéficos na saúde humana. Isso se deve a conscientização das pessoas de que a

manutenção de sua saúde é, em grande parte, determinada por uma dieta

balanceada (SCHIEBER, STINTZING, CARLE, 2001).

O aprimoramento da indústria de alimentos e da indústria de fitoterápicos

proporcionou o avanço nos estudos com plantas medicinais e alimentícias. O

desenvolvimento da indústria farmacêutica nos proporcionou a praticidade de formas

farmacêuticas prontas, porém, muitos medicamentos ainda apresentam efeitos

colaterais, e nem sempre cumprem o seu papel terapêutico. Por volta de 1960,

houve um aumento de estudos em plantas na busca de novos medicamentos e seus

possíveis efeitos terapêuticos e preventivos. A chamada “onda verde” impulsionou

os estudos de vegetais em busca de novos medicamentos que apresentassem

menos efeitos colaterais (SILVA, 2002).

Nesta mesma década, percebeu-se a relação entre algumas enfermidades

com o tipo da dieta, como por exemplo, doenças cardiovasculares associadas à

ingestão exagerada de gorduras totais e saturadas. As pesquisas desta época

enfatizavam os aspectos negativos da alimentação e como ela poderia provocar

doenças (HASLER, 2002).

Atualmente, existe a preocupação de se buscar nas plantas ingredientes que

possam ser bioativos capazes de beneficiar as funções fisiológicas do corpo, tanto

sob a forma de fitoterápicos, como na forma de alimentos.

Os alimentos funcionais ou alimentos nutracêuticos são alimentos ou

componentes cujos benefícios vão além das necessidades nutricionais básicas,

proporcionando aos consumidores as propriedades de reduzir o risco de doenças,

melhorando a saúde e o bem-estar, tendo aplicações medicinais, terapêuticas e

cosméticas (HASLER, 1998; ARRABI, 2001; ASHWELL, 2001; LAJOLO, 2001;

JONES 2002; O’CONNOR, WHITE, 2010).

Já os fitoterápicos, de acordo com a RDC n. 14, de 31 de março de 2010, em

30

seu capítulo I, artigo 1°, parágrafos 1°, 2° e 3° são descritos como:

“§ 1º São considerados medicamentos fitoterápicos os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências. clínicas. § 2º Os medicamentos fitoterápicos são caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. § 3º Não se considera medicamento fitoterápico aquele que inclui na sua composição substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as associações dessas com extratos vegetais” (BRASIL, 2010).

Os fitoterápicos são provenientes de plantas, e têm funções terapêuticas que

visam a manutenção e promoção da saúde humana. Além disso, os fitoterápicos

constituem um ramo do mercado farmacêutico que, no ano de 2000, apresentou um

rendimento em torno de 22 bilhões de dólares (YUNES, REDROSA, CECHINEL

FILHO, 2001; MALHEIROS et al., 2010).

Em todo o mundo, a população percebeu que evitar o consumo de alimentos

prejudiciais poderia contribuir para uma maior expectativa e melhor qualidade de

vida. Porém, não apenas os consumidores estavam interessados na qualidade e nos

benefícios dos alimentos e plantas. A indústria e a comunidade científica começaram

incentivar pesquisas, levantando informações sobre as substâncias presentes nas

plantas alimentícias, que podem melhorar e promover a saúde (KROUS, WALKER,

2004).

Pesquisas e estudos epidemiológicos demonstram que os micronutrientes

presentes em frutas, legumes e verduras reduzem o risco de doenças. Compostos

fenólicos, por exemplo, tem propriedades anti-inflamatórias, anticarcinogênica,

antialérgica, antioxidante, gastroprotetora, entre outras. A fibra dietética, também

chamada de polissacarídeos de pectina é um componente funcional importante das

frutas. Além de ser hipocolesterolêmica e hipoglicêmica, diminui o risco de várias

doenças do trato digestório, como a melhora do trânsito gastrointestinal (SCHIEBER,

STINTZING, CARLE, 2001; HAMAUZU et al., 2008).

Na grande maioria, os componentes presentes em plantas e alimentos

interferem nos processos oxidativos, que são responsáveis pelo envelhecimento,

câncer, arteriosclerose, artrite, neurodegeneração, desordens inflamatórias, diabetes

31

mellitus, entre outras. O estudo do papel desses componentes antioxidantes

presentes nos alimentos e plantas é de grande interesse, pois atualmente a maioria

dos antioxidantes conhecidos são componentes naturais presentes nos alimentos.

Esses podem ser classificados em dois grupos: os essenciais para a alimentação

(vitaminas e carotenóides) e os não essenciais (polifenóis e flavonóides) (TORRES

et al, 2008).

Essa tendência, de se melhorar a saúde com a ingestão de ingredientes

alimentícios é confirmada no 10º relatório anual da Food Marketing Institute and

Prevention Magazine, onde revela que 76% dos consumidores concordam que

comer de forma saudável é melhor do que usar medicamentos para combater

doenças (SLOAN, 1994; SLOAN, 2000; HASLER, 2002).

Além disso, apesar da grande evolução da indústria farmacêutica, existem

carências quanto ao acesso aos medicamentos por uma parcela da população. Este

é um motivo pelo qual a população recorre às plantas (GARCIA, 1995; VERLI,

BARREIRO, 2005).

A OMS estima que 80% da população nos países em desenvolvimento, de

algum modo usam plantas medicinais na busca de alívio de alguma sintomatologia

dolorosa ou desagradável, isso em números significa que cerca de 4 bilhões de

pessoas confiam nas plantas como fonte de medicamentos (GARCIA, 1995; VERLI,

BARREIRO, 2005).

O uso de medicamento nem sempre resolve todos os problemas, e muitas

vezes, não previne, apenas atenua as doenças já instaladas. Por isso, novas

terapias têm sido buscadas pela população e pela comunidade científica, a fim de

melhorar a qualidade de vida das pessoas. Essas terapias são chamadas de

terapias complementares, e podemos dar destaque ao uso de fitoterápicos e de

nutracêuticos (alimentos funcionais). Nestes dois, o uso de plantas é um fator muito

importante (MACIEL, PINTO, VEIGA, 2002; SILVA, 2002).

Em 2009, nos EUA, a American Dietetic Association reconheceu que

alimentos funcionais são mais bem aceitos pela população do que suplementos

nutricionais em forma de medicamentos, e que prevenir doenças através da

alimentação é melhor do que recorrer aos tratamentos convencionais (O’CONNOR,

WHITE, 2010).

No Brasil, nota-se um crescente interesse das indústrias em desenvolver e

divulgar alimentos e plantas com propriedades funcionais. Há interesse de centros

32

de pesquisa e instituições de ensino em estudarem as características destes

(TORRES, 2001).

Sob a forma de alimentos, as pessoas ingerem uma grande diversidade de

compostos farmacologicamente ativos, sendo que plantas ditas como alimentos

funcionais constituem uma prioridade de pesquisa em todo o mundo, sendo uma

tendência futurista a nível mundial. A vitamina C. vitamina E, carotenóides e

flavonóides, por exemplo, podem estar desempenhando importantes papéis na dieta

humana, sendo compostos necessários na constituição de uma dieta ideal,

constituintes importantes tanto de alimentos funcionais quanto de fitoterápicos

Estudos com a finalidade de elucidar as propriedades e os efeitos que destas

substâncias sobre a saúde são necessários para a identificação e isolamento destes

compostos quimiopreventivos presentes em alimentos funcionais a base de plantas

(OLIVEIRA et al., 2002; MORENO et al., 2006; VRCHOVSKÁ et al., 2006).

3.2 Brassica oleracea L. var. acephala

A família Brassicaceae (também conhecida como Cruciferae), possui

aproximadamente 350 gêneros, organizado em 13 tribos e apresentando 3200

espécies, destacando-se o gênero Brassica, que é o mais importante

economicamente. A origem do gênero Brassica provavelmente é a região da Costa

Norte Mediterrânica, Ásia Menor e Costa Ocidental Européia, atualmente sendo

difundido em todo o mundo. A palavra deriva do celta antigo (bressic), que significa

repolho. Há registros de amplo consumo de repolhos e couves pelos egípcios,

romanos e outros povos antigos, em períodos anteriores a 2500 a. C., considerada

uma fina iguaria. Sua introdução na Europa é atribuída aos celtas por volta do século

IX, de onde foi trazido para o continente americano no século XV (KOWALSKY et

al., 1994; JOLY, 1998; SINGH, JAUHAR, 2007).

Os antigos a consideravam como um remédio universal. Hipócrates a

prescrevia cozida com mel contra cólicas. Durante a gravidez, as mulheres

atenienses comiam abundantes pratos de couves. A urina das pessoas que se

alimentavam de couves era atribuída a cura do herpes, fistulas e até câncer. As

dores lombares e reumáticas desapareciam com a aplicação das folhas cozidas, em

33

cataplasma, e as sementes eram utilizadas como vermífugo (PARACELSO, 1976).

As couves e repolhos, brássicas ou crucíferas, como são conhecidas,

descendem de uma única planta, a Brassica oleracea L. var. sylvestris. Nas

brássicas existem inúmeras complicações quanto a uma classificação botânica mais

precisa. A classificação com base na morfologia, além de volumosa, é difícil, não

refletindo exatamente as suas relações evolutivas. Porém, a tribo Brassiceae está

com seus limites morfológicos mais claramente reconhecidos. Essas alterações

morfológicas são influenciadas pelo seu polimorfismo genético, sendo o seu

mapeamento um desafio para a Botânica moderna. A Brassica oleracea L. var.

oleracea é uma planta cuja a descrição é difícil, pois possui diversas variantes em

termos morfológicos. Mas em geral são plantas herbáceas, com algumas variedades

sublenhosas em torno da base do caule (KOWALSKY et al., 1994; JOLY, 1998;

SINGH, JAUHAR, 2007).

As principais espécies são B. oleracea L. var. acephala (couve), B. oleracea

L. var. capitata (repolho), B. oleracea L. var. botrytis (couve-flor), B. oleracea L. var.

italica (brócolis), B. oleracea L. var. gemmifera (couve-de-Bruxelas), B. oleracea L.

var. gongylodes (couve-rábano) e B. campestris L. var. pekinensis (couve-chinesa)

(JOLY, 1998).

A couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC. é a espécie que mais se

assemelha com a couve silvestre. É uma planta de ciclo bianual, mas pode se tornar

perene. Seu caule é ereto, as folhas da base podem diferir das folhas terminais,

apresentando-se basilares, que podem ser lirado-penatipartidas, enquanto que as

folhas superiores podem ser oblongas, obovadas, onduladas e denteadas. As folhas

geralmente variam de verde escuro a verde amarelado, são grossas, mas não

chegam a ser carnudas, sendo emitidas continuamente. São distribuídas em forma

de roseta, ao redor do caule, havendo também emissão de numerosos rebentos

laterais utilizados na propagação. As flores são dispostas em racimos terminais

eretos, podem ser brancas ou amarelas, com sépalas eretas e corola composta por

quatro pétalas obovadas, ungüiculadas, sendo que a polinização é cruzada, feita

principalmente por abelhas. Os frutos são silíquas cilíndricas ou subcompridas

rostradas (JOLY, 1998; FILGUEIRA, 2003).

A cultura da couve é típica do outono-inverno, sendo que são plantas bem

adaptadas ao frio e resistem à geada, geralmente cultivada no sul do Brasil. É uma

planta bienal, e apresenta certa tolerância ao calor, permanecendo produtiva durante

34

meses. O seu plantio pode se estender ao longo de todo o ano, e as plantas

pertencentes a este gênero são de grande importância econômica e nutricional,

também amplamente utilizadas para a extração óleos, sendo a quarta fonte de

extração de óleos, estando atrás apenas para a soja, a semente de palma e o

algodão. A família Brassicaceae é uma das 10 famílias de plantas ecomomicamente

mais importantes no mundo (TROYER, STEPHESON, FAHEY, 2001; FILGUEIRA,

2003; PEDROCHE et al., 2004).

Os legumes pertencentes ao gênero Brassica são consumidos em todo o

mundo, como ingrediente de saladas, refogados e caldos. A atenção crescente ao

papel dos alimentos funcionais, tanto no fornecimento de nutrientes, quanto no de

substâncias bioativas, está incentivando estudo mais detalhados dos legumes,

sendo eles agora observados do ponto de vista fitoquímico. Atualmente, o gênero

Brassica é considerado um alimento funcional muito promissor, pois diversas

substâncias (vitaminas antioxidantes, compostos fenólicos, carotenóides, polifenóis

e ácidos orgânicos) encontradas nestas plantas apresentam atividades

antioxidantes, cicatrizantes, anti-inflamatórias e antimicrobianas (SINGH et al., 2007;

LIN, LI, HWANG, 2008; SOUSA et al., 2008; ROY et al., 2009; TOMOHIKO et al.,

2009).

As folhas da couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC. (Figura 1), são as

partes utilizadas na alimentação, porém são altamente perecíveis perdendo a

coloração verde, quando mal conservadas, de modo que sua aparência visual reflete

seu teor em constituintes, sendo estes claramente passíveis de processo de

degradação por oxidação (TOMOHIKO et al., 2009).

35

Figura 1. Detalhe das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC.

(Fonte: http://www.google.com.br/imagens)

Compostos fitoquímicos presentes em frutas e legumes neutralizam os danos

causados por agentes oxidativos. Acredita-se que esse efeito benéfico seja

alcançado por vários mecanismos, dentre eles, a estimulação do sistema

imunológico, modulando a expressão do gene e do metabolismo dos hormônios,

resultando na quelação de metais e fornecendo substâncias antibacterianas e

antivirais. O brócolis (Brassica oleracea L. var. italica), por exemplo, apresenta

considerados níveis de glicosinolatos, flavonóides, carotenóides, antocianinas,

cumarinas, ácidos fenólicos, monoterpenos, vitaminas (A, B1, B2 e B6) e minerais

(ROY et al., 2009).

Nesta família, os fitoconstituintes que mais chamam a atenção são os

glicosinolatos, que são compostos do metabolismo secundário, encontrados em

mais 16 famílias de plantas. São compostos quimicamente definidos, todos

compartilhando de uma estrutura básica similar, constituído por um grupo β-D-

tioglicose, um grupo oxima sulfonado e uma cadeia derivada de metionina,

fenilalanina, triptofano ou de uma cadeia ramificada de aminoácidos. O grupo

sulfato de uma molécula de glicosinolato é fortemente ácido e as plantas o

36

acumulam sequestando-os como sais de potássio em vacúolos vegetais (TROYER,

STEPHESON, FAHEY, 2001; MORENO et al., 2006).

Mais de 120 glicosinolatos já foram identificados, e embora sua função na

planta não seja clara, provavelmente são responsáveis pela defesa da planta contra

o ataque de insetos, herbívoros e micro-organismos. Essas substâncias são

liberadas na forma de isotiocianatos, apresentam sabor e odor pungente, sendo

estes característicos das mostardas (Brassica alba, B. juncea e B. nigra). E mesmo

que o tecido vegetal não seja lesionado, esses compostos se volatilizam, sendo

reconhecidos pelos insetos a longas distâncias (AGERBIRKA, ØRGAARDB,

NIELSENA, 2003; MORENO, et al., 2006).

O consumo médio de glicosinolatos por humanos é estimado em 16 mg/dia no

Canadá, 30 mg/dia no Reino Unido e 112 mg/dia no Japão, sendo que no restante

do mundo, esse consumo varia, geralmente inferior a esses índices. Existem

pesquisas para a produção de alimentos ricos em glicosinolatos, que apesar de

apresentar efeitos ora benéficos, ora tóxicos, a sua ingestão é de grande

importância, devido ao seu alto poder quimiopreventivo (TROYER, STEPHESON,

FAHEY, 2001).

Esses compostos atuam sobre enzimas hepáticas que estão associadas ao

metabolismo de xenobióticos e atuam protegendo o DNA contra dano. A alta

ingestão de brássicas está associada à diminuição do risco de câncer,

principalmente no pulmão e trato gastrointestinal. Atualmente, a epidemiologia

também aponta para a redução de risco em câncer de próstata. Um uso incomum é

o suco das folhas de brócolis para doenças de pele e verrugas (MORENO, et al.,

2006).

Quando consumidos, os glicosinolatos não são bioativos, porém são

enzimaticamente hidrolizados pela enzima mirosinase, uma enzima presente na

própria célula vegetal, que é liberada mediante a ruptura mecânica. Esta enzima

converte os glicosinolatos em isotiocianatos, que são substâncias formadas através

de um rearranjo, chamado de “rearranjo de Lossen”, além de outros produtos (Figura

2). Existem grandes dificuldades de isolamento, purificação de glicosinolatos, em

parte devido ao processo de hidrólise, e em parte devido a polaridade destes

compostos (TROYER, STEPHESON, FAHEY, 2001; BONES, ROSSITER, 2006;

MORENO, et al., 2006).

37

Figura 2. Diagrama geral mostrando os principais produtos da degradação enzimática dos

glicosinolatos. Em detalhe, o "rearranjo de Lossen" do qual resulta os isotiocianatos. Fonte: adaptado de BONES, ROSSITER, 2006.

In vivo e in vitro, os isotiocianatos afetam diversas etapas no desenvolvimento

do câncer, incluindo a modulação antioxidante direta ou indireta. Também podem

atuar na redução das infecções por Helicobacter pylori. No entanto, os efeitos das

combinações fitoquímicas e quimiopreventivas presentes nas brássicas ainda não

estão completamente elucidados. Muitos grupos de pesquisa estão estudando os

mecanismos de ação destes compostos de forma individual, porém existem poucos

estudos que correlacionam as atividades destes componentes em conjunto

(MORENO, et al., 2006).

Além dos isotiocianatos, outros compostos presentes nas brássicas estão

envolvidos com as mais diversas atividades. Lin, Li e Hwang (2008) recentemente

provaram que os pigmentos responsáveis pela coloração roxa do repolho (Brassica

oleracea L. var. capitata) apresentam atividade anti-inflamatória. Tais pigmentos

mostraram-se ativos contra a inflamação produzida por lipopolissacarídeo (LPS).

Heo e Lee (2006) relataram que o repolho roxo (Brassica oleracea L. var.

capitata DC) também é uma boa fonte de compostos fenólicos, principalmente

38

antocianinas (responsáveis pela coloração). Estes compostos promovem um

aumento da viabilidade de células de feocromocitoma de ratos PC12. Estas células

passam por uma diferenciação celular quando tratadas com fator de crescimento

neuronal, sendo útil em estudos de diferenciação de células nervosas. As ações

estão associadas às propriedades antioxidantes, protegendo contra a citotoxicidade

induzida pela proteína β-amiloide e aumentando a viabilidade celular neuronal,

podendo atuar em efeitos quimiopreventivos de doenças neurodegenerativas, como

o Alzheimer.

Já as inflorescências da Brassica oleracea L. var. acephala DC. apresentam

grandes quantidades de ácidos orgânicos, principalmente ácido aconítico, cítrico,

pirúvico, málico, fumárico e chiquímico, além de apresentar compostos fenólicos

derivados do campferol e fenólicos glicosilados. O extrato liofilizado das

inflorescências da B. oleracea L. var. acephala DC. apresentou atividade

antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (Bacillus cereus, Bacillus subtilis e

Staphylococcus aureus) e grande atividade antioxidante (SOUSA et al., 2008).

Já nas folhas da B. oleracea L. var. acephala DC., estudos apontam para a

presença dos ácidos fenólicos: gálico, protocatecuico, p-hidroxibenzóico, vanílico,

salicílico, p-cumárico, cafeico, ferúlico e chiquímico, que são ativos contra bactérias

Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, e Bacillus subtilis),

bactérias Gram-negativas (Moraxella catarrhalis) e contra fungos (fungos Candida

tropicali e Candida albicans) (AYAZ et al., 2008).

Também é possível observar a presença de vários aminoácidos: glutamato,

prolina, aspartato, leucina, lisina, valina, arginina, alanina, tirosina, fenilalanina,

treonina, histidina, serina, glicina e metionina, confirmando a presença de proteínas

na planta. Outro aminoácido, S-metilmetionina, conhecida também como vitamina U,

ocorre normalmente nas brássicas, sendo fisiologicamente ativa atuando com um

fator anti-ulceroso, atuando como agente protetor em úlceras gástricas (KIM, 2003;

PEDROCHE et al., 2004; LISIEWSKA, KMIECIK, KORUS, 2008).

Quanto à presença de flavonóides, podem-se encontrar na couve

principalmente quercetina e campferol, principalmente na forma glicosilada. Tais

flavonóides estão descritos para as mais diversas atividades, principalmente como

antimutagênico e anticarcinogênico. Além disso, Zhang et al. (2003) também aponta

para a presença de um novo flavonóide, um composto desconhecido que parece ser

uma forma metilada da quercetina.

39

O SUS (Sistema Único de Saúde) em seu Programa de Pesquisas de Plantas

Medicinais (PPPM) definiu 74 espécies vegetais destinadas a estudos

farmacológicos pré-clínicos e toxicológicos. O PPPM tem por objetivos, constituir

uma parte essencial das políticas públicas de saúde, meio ambiente,

desenvolvimento econômico e social como um dos elementos fundamentais de

transversalidade na implementação de ações capazes de promover melhorias na

qualidade de vida da população brasileira. Dentre as plantas selecionadas, a

Brassica oleracea é uma das espécies alvo para os estudos do PPPM (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2006).

Figura 3. Modo de uso popular: suco das folhas de Brassica oleracea L.var. acephala DC.

(Fonte: http://www.google.com.br/imagens)

A couve (Brassica oleracea L. var. acephala), também conhecida como

couve-manteiga, couve-branca, couve-galega e couve-mineira, é usada

popularmente contra distúrbios gástricos na forma do suco de suas folhas, se

tomado em jejum (Figura 3). Segundo estudo etnofarmacológico realizado por Silva

et al. (2006), a couve é uma das plantas mais utilizadas para o tratamento de úlceras

e gastrites. Além disso, podemos verificar a crescente utilização da couve através de

uma busca rápida na internet com a palavra chave “suco de couve”. Através desta

busca, podemos observar que aproximadamente 11000 sites relacionam-se com

esse tema.

40

Sendo assim, com base nos dados fitoquímicos e famacológicos

apresentados no gênero, com o incentivo de políticas nacionais para o

desenvolvimento de novos medicamentos e baseado em evidências

etnofarmacológicas, torna-se importante o estudo da atividade gastroprotetora da

Brassica oleracea L. var. acephala DC.

3.3 Fisiopatologia da úlcera e terapia antiúlcera

A humanidade convive com úlceras pépticas desde tempos mais remotos. A

primeira descrição de úlceras pépticas data do século IV a. C., inscrita nos pilares do

templo de Esculápido, em Epidaurus (Grécia), descrevendo de forma mitológica a

origem da doença. Outro fato histórico foi a morte de Marco Aurélio, ilustre

imperador romano, cujo médico, Galeano, concluiu ser por perfuração de úlcera

péptica. A terapia mais antiga contra a úlcera gástrica data do século IX, cuja uma

mistura de solos ricos em sais e leite era responsável pela neutralização do ácido

(BRUNTON, LAZO, PARKER, 2005).

Atualmente, úlceras gástricas e duodenais afetam pessoas em todo o mundo.

Aproximadamente 10% da população mundial são afetadas por esta patologia. O

estilo de vida moderno (estresse, fumo, uso de drogas, má alimentação), colabora

para o aumento da incidência de úlceras pépticas. Somente nos EUA

aproximadamente 4 milhões de pessoas tem úlceras pépticas (duodenal e gástrica)

e, a cada ano, 350 mil novos casos são diagnosticados. Cerca de 100 mil pacientes

são hospitalizados e 3000 morrem anualmente devido à úlcera péptica. Nos EUA,

esta patologia acarreta gastos anuais para o tratamento em torno de 3 bilhões e

meio de dólares. A úlcera péptica gera altos custos aos sistemas de saúde, e muitas

vezes impossibilitam o paciente de manter suas atividades normais (MCINTOSH et

al., 1991; BERSTAD, BERSTAD, BERSTAD, 2002; PETERSEN et al., 1995;

CONTRAN, KUMAR, ROBBINS, 2000; BELAICHE et al., 2002; BRUNTON, LAZO,

PARKER, 2005).

A função do sistema digestório é de obter nutrientes para manter o

funcionamento das células do corpo. O estômago é um reservatório em forma de “J”,

no qual o alimento é embebido pelo suco gástrico, que contém enzimas e ácido

41

clorídrico. Este suco gástrico desdobra os alimentos em substâncias químicas mais

simples, que podem ser absorvidas pela mucosa intestinal (GUYTON, 1988;

KUTCHAI, 1996; FLOCH et al., 2007).

O estômago (Figura 4) é um reservatório composto por uma túnica mucosa,

de cor cizento-avermelhado, composta de uma única camada superficial de células

epiteliais que começa na região da cárdia e se estende até a região do piloro. A

capacidade do estômago é de aproximadamente 1200 mililitros (Enciclopédia

Multimídia do Corpo Humano, 2000; FLOCH et al., 2007).

Figura 4. Secção longitudinal, face ventral do estômago. (Fonte: Enciclopédia Multimídia do Corpo Humano, 2000)

Segundo Crawford (2000), o estômago está dividido em quatro regiões

anatômicas:

a) cárdia: representa a região próxima à junção esofagogástrica;

b) fundo: é a região bulbosa subdiafragmática do estômago, localizado à

esquerda do esôfago, em direção cefálica à entrada do esôfago para o estômago;

c) corpo: é a maior região anatômica interposta entre o fundo e o antro

mais caudal. O início do antro é demarcado por uma linha vertical traçada através da

incisura angular da pequena curvatura do estômago;

d) antro ou porção pilórica: se estende desde o corpo do estômago até o

42

esfíncter pilórico.

Na mucosa (Figura 5), estão associadas diversas células responsáveis pela

produção do suco gástrico, que é formado por secreções parietais ou oxínticas

(ácido clorídrico e fator intrínseco) e não parietais (pépticas ou principais) (muco,

bicarbonato, Na+, K+ e pepsinogênio) (Figura 6) (GUYTON, 1991; JOHNSON,

JOHNSON, 1997; RANG, DALE, RITTER, 2001).

Figura 5. Imagem esquemática das camadas musculares e mucosas do estômago.

(Fonte: Enciclopédia Multimídia do Corpo Humano, 2000)

Por dia, o estômago secreta cerca de dois litros e meio de suco gástrico. As

secreções estomacais dependem de um importante gasto energético e são

reguladas pela via nervosa, via humoral e via hormonal (GUYTON, 1991;

Enciclopédia Multimídia do Corpo Humano, 2000).

A secreção gástrica é responsável por iniciar o processo de digestão de

proteínas. Porém, o estômago é constituído da maior parte de músculo liso, que é

formado por proteínas, fazendo com que toda a superfície do estômago seja

recoberto por uma mucosa, com a função de proteger o estômago da própria ação

digestiva (GUYTON, 1988).

43

Figura 6. Representação esquemática dos tipos celulares presentes na mucosa gástrica .

(Fonte: SCHAUF, MOFFETT, MOFFETT, 1998)

O surgimento de úlceras pépticas e desordens gástricas é um processo que

não é totalmente compreendido. Acredita-se que quando este sistema de proteção

se torna deficiente, a mucosa e o epitélio ficam expostos aos fatores agressivos

(secreção do suco gástrico), que geram lesões, inflamação e necrose. Ocorre um

desequíbrio entre os fatores agressivos e os mecanismos protetores da mucosa

(BRZOZOWSKI, 2003; TULASSAY, HERSZE’NYI, 2010).

Segundo o National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases

(2004), a úlcera péptica é definida como uma ferida no revestimento do estômago ou

do duodeno. Esta lesão, pode se estender da camada mucosa até a camada

muscular, porém, geralmente são lesões crônicas e solitárias. As desordens

gástricas também envolvem dispepsias e gastrites, que podem ser tanto agudas

quanto crônicas. A dispepsia é um grupo de sintomas do trato digestório, geralmente

associado a causas orgânicas, mas em geral é caracterizada pelo aumento da

secreção ácida. Já a gastrite é caracterizada como a inflamação do revestimento do

estômago, podendo ser aguda ou crônica, podendo também evoluir para um quadro

ulcerativo (LIPOF, SHAPIRO, KOZOL, 2006; MAHADEVA; GOH 2006).

As desordens gástricas, gastrites e úlceras podem estar associada a fatores

endógenos, tais como predisposição genética, ácido, pepsina, secreção biliar, e

44

fatores endógenos, relacionados com as condições de vida, tais como estresse,

fumo, álcool, uso de drogas e medicamentos, uso de alimentos nocivos ou infecção

por Helicobacter pylori (HIRSCHOWITZ et al., 1995; WOLFE, SANCHS, 2000;

WALLACE, MILLER, 2000; BRUNTON, LAZO, PARKER, 2005).

A infecção crônica da mucosa gástrica pela bactéria Helicobacter pylori é a

infecção mais comum no mundo inteiro, apresentando uma taxa de 40% em países

desenvolvidos e 80% nos países em desenvolvimento. Atualmente, grandes

esforços científicos estão sendo realizados para o controle da Helicobacter pylori,

visto que a sua infecção é de difícil tratamento, por muitas vezes recorrente,

utilizando-se antibióticos específicos e inibidores de bomba, como por exemplo

amoxicilina e claritromicina, associada a esomeprazol (LEE et al., 1995; SIQUEIRA

et al., 2007; SOUZA et al., 2009).

A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes potencialmente

irritantes, tais como ácidos, pepsina, ingredientes alimentares, bactérias e drogas.

Estes implicam na patogênese da úlcera, incluindo aumento da secreção gástrica,

diminuição do fluxo sangüíneo gástrico, supressão de produção de prostaglandinas

endógenas, inibição da proliferação de células da mucosa e alteração da motilidade

gástrica (KONTUREK et al.,1998; PESKAR, MARICIC, 1998; KWIECIEN,

BRZOZOWSKI, KONTUREK, 2002; TULASSAY, HERSZE’NYI, 2010).

O fluxo sanguíneo protege a mucosa gástrica por fornecer oxigênio,

bicarbonato e nutrientes, além de remover o dióxido de carbono, íons hidrogênio e

difundir toxinas do lúmen gástrico. A diminuição do fluxo sanguíneo leva a hipóxia e

hipersecreção ácida, devido ao acúmulo de íons hidrogênio, sendo este um fator

importante da patogênese da úlcera gástrica. Além disso, EROs e o NO podem estar

envolvidos nas condições fisiopatológicas das desordens gástricas. Produtos do

metabolismo do ácido araquidônico, elementos celulares e eventos relacionados

com as reações de oxidação (formação de peróxidos) são responsáveis pelo

aumento da inflamação, nitração de resíduos de proteínas (principalmente no

aminoácido tirosina), depleção de reservas energéticas mitocondriais e dano sobre a

estrutura do DNA (SORBYE, SVANES, 1994; BECKMAN, KOPPENOL, 1996;

REPETTO, LLESUY, 2002).

O muco é secretado por células secretoras encontradas entre as células

superficiais, por toda a mucosa gástrica (Figura 5). No muco estão presentes íons

bicarbonato, que geram um gradiente de pH 6-7 na mucosa gástrica, protegendo-a

45

do pH 1-2 presente na luz estomacal, formando uma camada inerte, como se fosse

um gel, protegendo a mucosa do suco gástrico. Acredita-se que os distúrbios nas

funções secretórias descritas acima estejam envolvidos na patologia da úlcera. As

células parietais são estimuladas pela histamina que provém de mastócitos (ou

células semelhantes), e esta, atua em receptores H2, ocorrendo um aumento da

ação da gastrina e da acetilcolina (TULASSAY, HERSZE’NYI, 2010).

Além do muco e do fluxo sanguíneo, o ácido gástrico também constitui uma

defesa da mucosa, pois reduz a possibilidade de colonização por bactérias. O

epitélio, que se encontra logo após a camada de muco é uma barreira protetora

capaz de se reparar rapidamente, possuindo células de rápida proliferação. Existem

ainda a linha de defesa do sistema imune, como mástócitos, macrófagos e

imunoglobulinas que reconhecem a entrada de invasores na mucosa e produzem

uma resposta inflamatória (WALLACE, GRANGER, 1996; WALLACE 2001).

Uma das mais importantes funções do estomago é a produção de ácido,

responsável pela digestão de proteínas, absorção de ferro, cálcio e vitamina B12. A

secreção de ácido (Figura 7) é mediada por gastrina, um hormônio peptídico

produzido pelas células G encontradas no antro gástrico e no duodeno atua sobre os

receptores CCK-2, estimulado a secreção de HCl pelas células parietais, e

aumentando indiretamente a secreção de pepsinogênio, estimulando o fluxo

sanguíneo e a motilidade gástrica. A gastrina regula também o crescimento de

células gástrica responsáveis na manutenção da integridade do tecido estomacal. A

acetilcolina estimula receptores muscarínicos específicos, já a histamina estimula

receptores histaminérgicos do tipo H2 presentes na superfície das células parietais,

também estimulando a secreção de ácido (POMMIER et al., 2003; SCHUBERT,

2004).

46

Figura 7. Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo estômago.

(Fonte: OLBE, CARLSSON, LINDBERG, 1998)

O tratamento das desordens gástricas, gastrites e úlceras, por muitos anos,

foi baseada na supressão da secreção ácida. Porém, pesquisas recentes revelam

que os fatores envolvidos na defesa participam do controle da acidez, sendo que

atualmente há um grande interesse pelos mecanismos reguladores e cicatrizantes

envolvidos na resolução do quadro ulcerativo (DAJANI, KLAMUT, 2000; WALLACE,

2005).

Assim, fármacos utilizados no tratamento da úlcera gástrica agem por um dos

seguintes mecanismos:

1) Fármacos que inibem ou neutralizam a secreção de ácido gástrico (terapia

anti-secretória). Nesta classe estão agrupados:

a) antagonistas de receptores H2 da histamina (cimetidina, ranitidina);

b) inibidores da bomba de prótons, (H+-K+)-ATPase, que constitui a fase final

da secreção ácida (omeprazol, pantoprazol);

c) antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio,

trissilicato de magnésio, bicarbonato de sódio).

2) Fármacos que protegem a mucosa (quelato de bismuto, sucralgato)

(RANG, DALE, RITTER, 2001; BRUNTON, LAZO, PARKER, 2005).

47

Na terapia, recomenda-se a associação de uma droga que atue inibindo a

secreção de ácido e/ou protegendo a mucosa e associações de antibióticos, tais

como amoxicilina e clindamicina, para o tratamento desta patologia (RANG, DALE,

RITTER, 2001).

Porém, a importância clínica das úlceras pépticas e a inexistência de um

medicamento eficaz, ausente de efeitos colaterais, levam a procura e

desenvolvimento de novas terapias capazes de aliviar os sintomas e até mesmo

curar as desordens gástricas (LA VECCHIA, TAVANI, 2002; RAGHUNATH et al.,

2005).

Assim, tornam-se necessários estudos para uma melhor compreensão da

fisiopatologia envolvida nos distúrbios do sistema digestório, onde observou-se que

uma grande variedade de substâncias químicas derivadas de produtos vegetais

ativas em diversos modelos de indução de úlceras, são provenientes alimentos,

podendo ser uma fonte promissora na descoberta de seus princípios ativos,

possibilitando a descoberta de novas fontes terapêuticas para as úlceras pépticas,

onde a terapia possa estar baseadas em mecanismos reguladores da homeostase

do tecido estomacal (SCHMEDA-HIRSCHAMANN, YESILADA, 2005).

48

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Análise fitoquímica de Brassica oleracea L. var. acephala DC.

4.1.1 Coleta e preparo do material vegetal

As folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. foram coletadas em

setembro de 2008, no município de Rio das Antas, SC, em horta na propriedade do

Sr. Alterino Lemos ( 26 ° 57'31 .96 "N, 51 ° 0'23 .76" W, a 968 metros acima do nível

do mar). Um exemplar foi submetido à análise botânica no Herbário Barbosa

Rodrigues, depositada e registrada sob o número 52747, sendo sua taxonomia

validada pelo botânico Dr. Amaury Antônio Silva Junior, da Empresa de Pesquisa

Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina – EPAGRI – Itajaí, SC.

As folhas foram secas em estufa de ar quente e circulante a 40°C, e após

secagem foram moídas em triturador para fornecer um pó fino, para posterior

determinação do peso seco.

4.1.2 Preparação do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L.

var. acephala DC.

O pó das folhas (700 g) foi submetido à maceração em solução hidroalcoólica

a 50%, durante 10 dias. Após filtração, a solução foi submetida à evaporação do

solvente em rota-evaporador à pressão reduzida (50 ºC), submetido à secura sob

sílica ativada e determinado o seu rendimento.

4.1.3 Fracionamento do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L.

var. acephala DC.

O fracionamento do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var.

acephala DC. (EHA) foi realizado através da partição líquido-líquido com solventes

orgânicos de polaridade crescente, obtendo-se as seguintes frações: hexânica (FH),

clorofórmica (FC), acetato de etila (FAE) e aquosa (FAQ) (NIERO et al., 2003;

49

SIMÕES et al., 2003; MALHEIROS et al., 2010). O processo de partição líquido-

líquido foi realizado conforme demonstrado na Figura 8.

Figura 8. Fluxograma do processo de partição líquido-líquido para a obtenção das frações.

(Fonte: adaptado de MALHEIROS et al., 2010)

4.1.4 Análise cromatográfica

a. Cromatografia em camada delgada

Para avaliação fitoquímica preliminar dos principais constituintes químicos

presentes no EHA, amostras do extrato e das frações foram analisadas através

cromatografia de camada delgada (CCD), utilizando-se sílica gel 60 F254 (Merck)

como fase estacionária, e uma mistura de solventes (hexano:acetato de etila e

clorofórmio:metanol, em diferentes proporções, metanol 100% e FDM (acetato de

etila, 25%: acetona 8%: metanol 3%: água 1%)), como fase móvel.

Cerca de 10 µL das amostras foram aplicadas nas cromatoplacas com auxílio

de um capilar, sendo reveladas em câmara de UV (254/365 nm) e/ou com reagentes

50

cromóforos específicos, como anisaldeído sulfúrico, cloreto férrico e ácido p-

aminobenzoico. Para efeito comparativo, alguns padrões de terpenos, flavonóides,

esteróides e açúcares foram utilizados.

b. Cromatografia em coluna aberta

Na tentativa de isolar as substâncias bioativas, as frações mais ativas

farmacologicamente (FC e FAQ) foram submetidas a purificação através de

cromatografia em coluna aberta (CCA).

Neste aspecto, a FC (740 mg) foi preparada em forma de “pastilha” e

empacotada em sílica gel (0,063-0,200 mm, Merck) como fase estacionária e eluida

inicialmente com hexano 100% (200 mL), com 5% de aumento da polaridade

adicionando-se acetato de etila, a cada 100 mL, até eluir com acetato de etila 100%

(200 mL). Neste ponto, a polaridade foi aumentada adicionando-se 10% de metanol

até a eluição completa com metanol 100%. As subfrações foram recolhidas em

frascos de 10 mL e reunidas de acordo com o perfil semelhante em CCD. As

subfrações três a sete foram testadas farmacologicamente.

De maneira similar, da FAQ (6 g) foi empacotada conforme descrito acima e

eluida inicialmente com clorofórmio 100% (200 mL), aumentando-se a polaridade

adicionando-se metanol (20%) a cada 100 mL até a proporção CHCl3:MeOH 1:1.

Neste ponto, a fase móvel foi alterada para uma mistura de solventes chamado de

FDM (acetato de etila, 25%: acetona 8%: metanol 3%: água 1%). Foram eluidos 300

mL desta mistura. As subfrações foram recolhidas em frascos de 10 mL e reunidas

através do perfil semelhante em CCD, determinada sua massa e testadas

farmacologicamente.

c. Análise em cromatografia gasosa acoplado a detector de ionização de chama

(CGAR-DIC)

Para a análise cromatográfica em cromatógrafo gasoso de alta resolução

associado a detector por ionização de chama (CGAR-DIC) das FH, FC e FAE, as

amostras foram preparadas na concentração de 1mg/mL, filtrada através de filtro

analítico millipore de 0,45 micrometros e 10 µL destas soluções foram injetados

diretamente no sistema cromatográfico no modo split 1:3. O equipamento utilizado

51

foi um cromatógrafo Hewlett Packard, modelo CG 6890N, provido de um detector de

ionização de chama (DIC) e equipado com uma coluna capilar HP-5, com um

diâmetro interno de 0,32 mm, comprimento de 30 m, espessura do filme de

dimetilpolioxano de 0,25 mm.

A programação que possibilitou melhor resolução cromatográfica dos picos de

interesse foi a seguinte condição de análise: fluxo de hidrogênio de 2mL/min, de 120

°C até 150 °C, aumentando a temperatura em 1,5 °C/min; de 150 °C até 180 °C,

aumentando a temperatura em 20 °C/min; e mantendo-se a temperatura em 180 °C

por 5 min. A temperatura do injetor e do detector foram de 210 e 250 °C,

respectivamente.

4.2 Animais e ensaios farmacológicos

As concentrações estabelecidas nos experimentos para a avaliação da

atividade gastroprotetora foram baseadas em estudos preliminares realizados em

nosso Laboratório. No estudo farmacológico de plantas utilizam-se normalmente

concentrações crescentes correlacionadas para possível observação da relação

dose-resposta. Neste estudo foi avaliado o efeito do EHA utilizando-se as

concentrações de 25, 50 e 100 mg/kg, sendo que, após a observação das respostas

do extrato e frações, foram ajustadas as concentrações de 25, 50 e 100 mg/kg para

o FC e FAQ, e de 50 mg/kg para as subfrações.

4.2.1 Animais

Os animais foram mantidos segundo as normas e cuidados com animais de

laboratório, bem estar e biossegurança na experimentação, conforme descritas na

Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as diretrizes da Sociedade

Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Os experimentos foram autorizadas

e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade do Vale do

Itajaí, sob o número de parecer CEP 0369/09a (Anexo A) (BRASIL, 2008;

SBCAL/COBEA, 1991).

Nos ensaios biológicos foram utilizados ratos fêmeos Wistar, pesando 180-

52

280 g e camundongos machos e fêmeos Swiss, pesando entre 25-50 g provenientes

do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram

mantidos em caixas de polipropileno, em sala com temperatura (25 ºC) e ciclo

controlados (claro/escuro 12 horas cada), tendo ração e água ad libitum. Vinte horas

anteriores aos experimentos, os animais foram mantidos em jejum e livre acesso à

água, sendo adicionada a caixa uma grade para inibir a coprofagia.

4.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa

A toxicidade aguda do EHA for realizada conforme descrito no Guideline for

Testing of Chemicals – Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure (OECD 420,

2001) e desenvolvido seguindo normas de cuidados com animais de laboratório,

bem estar e biossegurança na experimentação animal descritas na Lei n. 11.794, de

8 de outubro de 2008, e segundo as diretrizes pela Sociedade Brasileira de Ciência

em Animais de Laboratório (BRASIL, 2008; SBCAL/COBEA, 1991).

Os animais (ratos Wistar fêmeas, 180-300 g) foram divididos em 02 grupos de

03 animais cada e mantidos em jejum de 12 horas. O EHA foi administrado por via

oral na dose de 2 g/kg. O grupo controle recebeu salina (3 mL/kg).

Após a administração do EHA os animais foram observados individualmente,

nos períodos de 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h e 24 h, e, a partir de então,

periodicamente, até o décimo quarto dia, sendo pesados nos tempos 0, 7 e 14 dias

após administração do EHA.

As observações das alterações comportamentais sistemáticas foram

realizadas de acordo com o “screening” hipocrático: atividade geral, frêmito vocal,

irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto cauda, contorção, posição do trem

posterior, reflexo de endireitamento, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia,

reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia,

lacrimação, ptose, micção, defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose,

hiperemia e morte (MALONE, ROBICHAUD, 1962; MALONE, 1977).

A intensidade dos eventos foi semi-quantificada de zero a 4, correspondendo,

respectivamente a: ausente, raro, pouco, moderado e intenso de acordo com o

modelo proposto por Malone e Robichaud 1962 e Malone 1977.

No 14º dia, os animais foram anestesiados e mortos por deslocamento

53

cervical. Em seguida, foi realizada a necropsia com avaliação das características

macroscópicas dos principais órgãos, tais como pulmões, rins, intestinos, fígado,

útero, baço e coração, e quando observadas alterações macroscópicas, os órgãos

foram encaminhados para exames histopatológicos.

4.4 Avaliação da atividade gastroprotetora

Na avaliação da atividade gastroprotetora, foram utilizados experimentos que

procurassem mimetizar os distúrbios gástricos em humanos, baseados em fatores

etiológicos da doença no homem, como por exemplo, o aumento do suco gástrico,

uso de drogas anti-inflamatórias não esteroidais e uso abusivo de bebidas

alcoólicas. Cada experimento apresenta seus respectivos controles positivos

(omeprazol, cimetidina ou carbenoxolona) e negativo (veículo ou indometacina),

dependendo da necessidade de cada modelo.

4.4.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl

A metodologia utilizada neste experimento foi a descrita por Mizui e Doteuchi

(1983), com algumas modificações. Os camundongos foram submetidos inicialmente

a jejum de vinte horas e, após esse período, divididos em diferentes grupos (n=6),

pré-tratados por via oral com omeprazol (controle positivo – 30 mg/kg), veículo

(controle negativo – água destilada), ou EHA nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg. Para

avaliação da fração mais ativa, inicialmente testou-se a FH, a FC, a FAE e a FAQ na

dose de 50 mg/kg. Após a comprovação que as frações mais ativas foram a FC e a

FAQ, estas foram testadas na dose de 25, 50 e 100 mg/kg. As subfrações SFC(3),

SFC(4), SFC(5), SFC(6), SFC(7), SFAQ(3), SFAQ(4), SFAQ(5), SFAQ(6) e

SFAQ(7), que apresentaram melhor perfil fitoquímico também foram testadas na

dose de 50 mg/kg.

Após uma hora e meia dos tratamentos, foram administrados por via oral aos

animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) uma solução de EtOH/HCl (60%/0,3 M) (agente

lesivo). Uma hora e meia após a administração do agente lesivo, os animais foram

mortos por deslocamento cervical, em seguida, os estômagos foram retirados e

abertos ao longo da curvatura maior, sendo esticados em placas de parafina. As

54

imagens foram digitalizadas e analisadas por software de análise de imagens

específico, a fim de determinar-se o número de lesões e o seu tamanho.

Posteriormente, foi realizada a determinação da área total de lesão (mm2), área

relativa lesada (%) e índice de lesão ulcerativa (ULI) calculado através da

severidade das lesões da mucosa gástrica, classificadas como:

a) tipo 1 (T1): área da úlcera < 1 mm2;

b) tipo 2 (T2): área da úlcera de 1-3 mm2; e

c) tipo 3 (T3): área da úlcera > 3 mm2.

O índice lesão ulcerativa (ULI) foi determinado como:

�� 1 � � ��2 � �� 3 ��

O índice de cura (IC) foi determinado como:

�� 100 �� 100�̅�� !

Os resultados foram expressos em quantidade total de área lesada (mm2),

quantidade relativa de área lesada (%), índice de lesão ulcerativa (ULI) e índice de

cura (IC – %).

4.4.2 Modelo de úlcera aguda induzida por antiinflamatório não-esteroidal

associada à estimulação parassimpaticomimética

A metodologia utilizada foi descrita por Rainsford (1980), com algumas

modificações. Após vinte horas de jejum, os camundongos foram divididos em

diferentes grupos (n=6), e pré-tratados por via oral com cimetidina (controle positivo

– 100 mg/kg), veículo (controle negativo – água destilada), EHA nas doses de 25, 50

ou 100 mg/kg; e FC ou FAQ nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg.

Após uma hora e meia da administração dos tratamentos, os animais

receberam 100 mg/kg de indometacina (v.o.), associada com a administração

intraperitonial (i.p.) de um estimulante parassimpaticomimético, o betanecol, na dose

55

de 5 mg/kg, preparada em solução fisiológica antes do uso.

Passadas doze horas após a administração de indometacina os animais

foram mortos por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao

longo da grande curvatura e esticados. As imagens foram digitalizadas e analisadas

por software de análise de imagens específico, a fim de determinar-se o número de

lesões e o tamanho destas.

Posteriormente, foi realizada a determinação da quantidade total de área

lesada (mm2), quantidade relativa de área lesada (%), índice de lesão ulcerativa

(ULI) e índice de cura (IC - %), conforme descrito no item 4.4.1.

4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio curativo)

A metodologia utilizada foi descrita por Takagi, Okabe e Saziki, (1969), com

algumas modificações. Antes da indução da úlcera, os camundongos sofreram um

período de adaptação contra o estresse que a administração das doses e a

manipulação causa. Os animais foram submetidos a restrição alimentar por 1 hora

diária (16:00 às 17:00), sendo mantido o livre acesso à água. Após esse período de

restrição alimentar, foi administrado aos animais 0,1 mL/10 g (peso de animal) de

água durante três dias.

Após o período de adaptação, os animais foram mantidos em jejum de vinte

horas com livre acesso à água. Posteriormente, os animais foram anestesiados com

uma mistura anestésica de xilazina (5 mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10g de

peso de animal) e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise

xifóide. Após a exposição do estômago, foi injetado na camada subserosa da parede

externa do estômago 20 µL de solução de ácido acético 30%. Um grupo normal foi

operado, e injetado 20 µL de salina (falso operado).

O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do

líquido injetado e lavado delicadamente com salina, sendo que a parede abdominal

foi posteriormente suturada. Após dois dias de recuperação dos animais, iniciou-se o

tratamento. Os animais operados com a administração o ácido ácético foram

divididos em diferentes grupos (n=6), classificados de acordo com o seu tratamento:

veículo (controle negativo – água destilada), cimetidina (controle positivo – 100

mg/kg), EHA (100 mg/kg), FC (100 mg/kg) ou FAQ (100 mg/kg). Aos animais falso

56

operados (controle normal, n=6) também foi administrado o veículo.

Diariamente, os animais foram pesados para a determinação da dose

administrada por via oral. No oitavo dia, ao final do período de tratamento, os

animais foram mortos, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande

curvatura e esticados. Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas

por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se se houve

regressão da lesão nos tratamentos quando comparados com o controle, sendo

realizada a determinação da quantidade total de área lesada (mm2), quantidade

relativa de área lesada (%), e índice de cura (IC – %), calculado de acordo com a

equação a seguir:

�� 100 ��"�� 100�̅"�� !

Onde:

ATLTratado: Área total de lesão no grupo tratado

ATLControle: Área total de lesão no grupo controle

4.4.4 Análise histopatológica

Além de analisar a regressão das lesões de forma macroscópica no

tratamento das úlceras crônicas induzidas por ácido acético, é importante analisar

de forma microscópica os aspectos histológicos e o processo de cicatrização

envolvido. Para isto, depois da digitalização das imagens dos estômagos, a área

onde a lesão se encontrava foi separada das demais partes do estômago, e

submetida à fixação em formalina (10%) durante o período mínimo de vinte e quatro

horas. As amostras foram submetidas à técnica histológica clássica, onde os blocos

foram cortados em 4 µm de espessura em micrótomo (Bright 5040) de maneira

semi-seriada, onde foi coletado todo o corte múltiplo de 10. As lâminas cortadas por

esse método semi-seriado foram submetidas à coloração de hematoxilina e eosina,

de acordo com o método descrito por Junqueira e Carneiro (1995) e Junqueira e

57

Junqueira (1985). Foram obtidas 5 lâminas de cada peça.

A análise morfométrica foi determinada através do método descrito por

Ishihara e Ito (2002), com algumas modificações. A média em 10 campos diferentes

da distância entre a camada submuscular da mucosa até o lúmen do estômago foi

determinada em microscópico óptico de sistema invertido Olympus IX51, acoplado a

câmera digital Olympus DP-25, controlado por software Olympus DP2-BSW, versão

2.2, para cada lâmina. Durante a determinação da distância, cada corte recebia uma

classificação, baseada nos critérios de análise histológica, realizada de acordo com

o método descrito por Dokmeci et al. (2005), onde:

0: mucosa normal;

1: dano em célula epitelial;

2: rompimento glandular, vasoconstrição ou edema em mucosa superior;

3: rompimento de mucosa, vasoconstrição ou edema em mucosa mediana;

4: dano na mucosa extenso, vasoconstrição ou edema em toda a mucosa.

A moda (o valor de maior repetição) para cada grupo foi considerado como o

índice de úlcera histológico.

4.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica

4.5.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro)

Este experimento foi realizado de acordo com o método descrito por Shay et

al. (1945), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum por

vinte horas com livre acesso a água, e divididos em diferentes grupos (n=6). Em

seguida foram anestesiados com uma mistura anestésica a base de xilazina (5

mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10g de peso de animal) e submetidos a uma

incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a

administração por via intraduodenal dos diferentes tratamentos: cimetidina (controle

positivo – 100 mg/kg), veículo (controle negativo – salina), EHA (25, 50 ou 100

mg/kg); FC ou FAQ (25, 50 e 100 mg/kg).

Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que quatro horas

58

após a cirurgia, os animais foram mortos por deslocamento cervical. As incisões

foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do

conteúdo gástrico), o estômago foi retirado para determinação do conteúdo

estomacal, pH e concentração de íons hidrogênio.

Após a determinação do volume, foram adicionados 5 mL de água destilada à

amostra, sendo posteriormente centrifugada por 10 min a 3000 rpm. No

sobrenadante foi determinado o pH e titulado com solução de hidróxido de sódio a

0,01 N, utilizando-se fenolftaleína como indicador.

Os resultados foram expressos em mL (volume), pH e mEq/L/4h

(concentração de íons hidrogênio).

4.5.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica

O modelo utilizado neste experimento foi descrito por Sun, Matsumoto e

Yamada (1991), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum

por vinte horas com livre acesso a água, e divididos em diferentes grupos (n=6). Em

seguida foram anestesiados com uma mistura anestésica a base de xilazina (5

mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10g de peso de animal) e submetidos a uma

incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e

administração intraduodenal dos diferentes tratamentos: carbenoxolona (controle

positivo – 200 mg/kg), indometacina (controle negativo – 100 mg/kg), EHA (25, 50 e

100 mg/kg); ou FC ou FAQ (25, 50 e 100 mg/kg).

Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que quatro horas

após a cirurgia os animais foram mortos por deslocamento cervical. As incisões

foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do

conteúdo gástrico) o estômago foi retirado, cuidadosamente lavado em salina, foi

pesado em balança analítica, sendo posteriormente acondicionado em 10 mL de

solução de Alcian Blue (Alcian Blue 0,02%, sacarose 0,16 M, acetato de sódio 0,05

M; pH 5,8 a 20 ºC) por 24 horas.

Após este período, o tecido estomacal foi retirado, e o líquido foi submetido a

centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos. A leitura do sobrenadante foi realizada

através de leitor de microplaca Asys Expert Plus UV (no comprimento de onda a 620

nm), em triplicata. As leituras foram interpoladas em equação da curva padrão de

59

solução de Alcian Blue (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128 µg/mL), sendo os resultados

calculados sobre a média das leituras. Os resultados foram expressos em

quantidade de corante aderido ao muco (mg) por grama de tecido (g).

4.6 Mecanismos de ação antiúlcera

4.6.1 Avaliação do papel do Óxido Nítrico (NO) in vivo

O método utilizado foi descrito primeiramente por Arrieta et al. (2003), com

algumas modificações. O L-NAME (N-nitro-L-arginina metil éster), é uma substância

que tem a capacidade de bloquear a enzima óxido nítrico sintase (NOS),

responsável pela produção de óxido nítrico (NO), que pode estar relacionado com os

processos gastroprotetores.

Após vinte horas de jejum, foram separados nos seguintes grupos: veículo

(água destilada) + L-NAME, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200

mg/kg) + L-NAME, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, EHA (100 mg/kg) + L-

NAME, EHA (100 mg/kg) + salina, FC (100 mg/kg) + L-NAME, FC (100 mg/kg) +

salina, FAQ (100 mg/kg) + L-NAME e FAQ (100 mg/kg) + salina.

Os animais foram tratados com L-NAME na dose de 70 mg/kg, via i. p., sendo

que os outros animais receberam salina por via também por via i. p.. Após trinta

minutos dos tratamentos, administraram-se aos diferentes grupos os seus

respectivos tratamentos por v. o.. Passadas uma hora e meia após a administração

dos tratamentos foi dado aos animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) uma solução de

EtOH/HCl (60%/0,3 M) (agente lesivo).

Após uma hora e meia da administração do agente lesivo, os animais foram

mortos, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura; esticados.

Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de

análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho

destas, conforme descrito anteriormente no item 4.4.1, porém também comparando-

se os tratamentos entre o L-NAME e salina através de teste t.

60

4.6.2 Avaliação do papel dos grupos sulfidrílicos (SH) in vivo

Para a avaliação dos grupamentos sulfidrilas na gastroproteção foi adotado o

modelo de Matsuda, Yoshikawa (1999). O NEM (N-metil-maleimida), é uma

substância que tem a capacidade de quelar os compostos sulfidrilas, que participam

dos mecanismos antioxidantes relacionados com a gastroproteção.

Após vinte horas de jejum, foram separados nos seguintes grupos: veículo

(água destilada) + NEM, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200

mg/kg) + NEM, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, EHA (100 mg/kg) + NEM, EHA

(100 mg/kg) + salina, FC (100 mg/kg) + NEM, FC (100 mg/kg) + salina, FAQ (100

mg/kg) + NEM e FAQ (100 mg/kg) + salina.

Os animais foram tratados com NEM na dose de 10 mg/kg, via i. p., sendo

que os outros animais receberam salina por via i. p.. Após trinta minutos,

administraram-se aos diferentes grupos os seus respectivos tratamentos por v. o..

Passadas uma hora e meia após a administração dos tratamentos foi dado aos

animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) uma solução de EtOH/HCl (60%/0,3 M) (agente

lesivo).

Após uma hora e meia da administração do agente lesivo, os animais foram

mortos, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura; esticados.

Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de

análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho

destas, conforme descrito anteriormente no item 4.4.1, porém também comparando-

se os tratamentos entre o NEM e salina através de teste t.

61

5 RESULTADOS

5.1 Análise fitoquímica preliminar do extrato hidroalcoólico das folhas,

frações e subfrações de Brassica oleracea L. var. acephala DC.

O pó fino das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (700 g)

apresentou um rendimento de 43,78% (306,47 g) de extrato úmido. Este extrato

úmido apresentou um percentual de massa seca de 55,45% (165,94 g). 150 g de

extrato úmido foram submetidos ao processo de partição líquido-líquido para a

obtenção das frações hexânica (FH), clorofórmica (FC), acetato de etila (FAE) e

aquosa (FAQ). Após esse procedimento, os rendimentos obtidos foram de 2,65 g

(1,76%), 2,32 g (1,55%), 2,16 g (1,44%) e 136,75 g (91,16%), respectivamente. A

fração aquosa apresentou um percentual de massa sólida de 77,99% (106,65 g). As

frações que se apresentaram mais ativas nos ensaios farmacológicos (FC e FAQ)

foram submetidas à cromatografia em coluna aberta.

Da coluna da FC (740 mg) foram coletadas 205 frações, que após

comparação de seu perfil fitoquímico através de CCD, foram reunidas por sua

similaridade, resultando em sete novas subfrações. Os rendimentos podem ser

observados na Tabela 1.

Tabela 1. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da fração clorofórmica.

Subfrações Reunião Massa (mg) Rendimento (%) Subfração SFC (1) 1-20 4,90 0,66 Subfração SFC (2) 21-30 12,00 1,62 Subfração SFC (3) 31-65 10,18 1,37 Subfração SFC (4) 66-85 8,80 1,19 Subfração SFC (5) 86-110 16,80 2,27 Subfração SFC (6) 111-150 16,30 2,20 Subfração SFC (7) 151-205 282,50 38,17

Da mesma forma, a cromatografia de coluna aberta da FAQ (6 g) rendeu 69

frações, que após comparação através de CCD de seu perfil fitoquímico, foram

reunidas por sua similaridade, resultando em sete novas subfrações. Os

rendimentos podem ser observados na Tabela 2.

62

Tabela 2. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da fração aquosa.

Subfrações Reunião Massa (mg) Rendimento (%) Subfração SFAQ (1) 1-20 41,73 0,69 Subfração SFAQ (2) 21-24 76,53 1,27 Subfração SFAQ (3) 25-30 515,80 8,60 Subfração SFAQ (4) 31-27 374,90 6,24 Subfração SFAQ (5) 28-40 590,90 9,85 Subfração SFAQ (6) 41-46 185,40 3,05 Subfração SFAQ (7) 47-69 1975,70 32,92

5.2 Análise fitoquímica

Buscando-se verificar a presença de classes de compostos nas FC e FAQ de

B. oleracea L. var. acephala DC., diferentes sistemas de eluentes e reveladores

específicos juntamente com alguns padrões como α-β-amirina, lupeol, estigmasterol,

espinasterol, quercetina, rutina, luteolina e sacarose foram utilizados. Como

reveladores específicos o cloreto férrico (compostos fenólicos), anisaldeído sulfúrico

(esteróides e terpenóides) e ácido p-aminobenzoico (açúcares). Como fase móvel

foram utilizados os sistemas de solventes hexano: acetona (7:3), ou

clorofórmio:metanol (9:1) e (6:4).

Como pode ser observado na Figura 9 A, não foi evidenciada a presença de

nenhum dos padrões de flavonóides na fração clorofórmica e aquosa. No entanto, é

possível observar a presença de outros compostos fenólicos, tendo em vista a

coloração específica observada quando utilizado o cloreto férrico como revelador

(Figura 9 A e C). Da mesma forma, não foi possível observar a presença de nenhum

dos padrões de terpenóides e esteróides. Por outro lado, é observada a presença de

outros compostos desta classe quando revelados com anisaldeído sulfúrico (Figura

9 B e D). Além disso, foi possível verificar a presença de açúcares na FAQ quando

utilizado o revelador ácido p-aminobenzoico (Figura 9 E) (UGAZ, 1994).

63

Figura 9. Perfil cromatográfico: A) 1: α-β-amirina; 2: lupeol; 3: FC; 4: espinasterol; 5: estigmasterol. Revelador: cloreto férrico. B) 1: α-β-amirina; 2: lupeol; 3: FC; 4: espinasterol; 5: estigmasterol. Revelador: anisaldeído sulfúrico. C) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: cloreto férrico. D) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: anisaldeído sulfúrico. E) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: ácido p-aminobenzoico.

Considerando que as FC e FAQ apresentaram promissora atividade

gastroprotetora, foram submetidas à cromatografia em coluna aberta, na tentativa de

buscar as possíveis substâncias responsáveis pela gastroproteção. Neste aspecto,

as subfrações SFC(3), SFC(4), SFC(5), SFC(6) e SFC(7), obtidas da fração

clorofórmica, e as SFAQ(3), SFAQ(4), SFAQ(5), SFAQ (6), e SFAQ(7) obtidas da

fração aquosa, apresentaram melhor perfil fitoquímico e foram posteriormente

submetidas aos testes farmacológicos. A Figura 10 A-C mostra o perfil fitoquímico

das SFC (6) e SFAQ (6), onde pode ser observado um bom grau de pureza,

sugerindo que estas substâncias podem ser responsáveis pelo efeito gastroprotetor

encontrado. Neste sentido, estas frações encontram-se em fase de elucidação

estrutural.

A B C D E

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

64

Figura 10. Perfil cromatográfico: A) CCD da SFC (6) (111-150), eluída com Hex: Ac (7:3) revelado com anisaldeído. B) CCD da SFAQ (6) (41-46) eluída com CHCl3:MeOH (7:3) revelado com anisaldeído. C) CCD da SFAQ (6) (41-46) eluída com CHCl3:MeOH (7:3) revelado com ácido p-aminobenzoico.

Levando-se em consideração que todas as frações obtidas do EHA

apresentaram pequena atividade gastroprotetora, uma análise por cromatografia

gasosa foi efetuada na tentativa de observar diferenças no perfil fitoquímico das

frações mais apolares. Conforme pode ser observado na Figura 11, a fração

clorofórmica apresenta diferenças significativas, com sinais em tempo de retenção,

em 9 e 11,6 min, sugerindo que tais substâncias podem ser responsáveis, em parte,

pela atividade encontrada.

A B C

1 2 1 2 1 2

65

Figura 11. Perfil cromatográfico por CGAR-DIC obtido das frações hexânica, clorofórmica e acetato de etila obtidas do extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC. A) Fração hexânica. B) Fração clorofórmica. C) Fração acetato de etila. 1: Sinal em 9,00 min. 2: Sinal em 11,60 min.

5.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa

Verificou-se neste estudo que a administração oral na dose de 2 g/kg de EHA

não foi capaz de induzir toxicidade aguda nos animais, uma vez que não foram

observadas alterações comportamentais sistemáticas no screening hipocrático. Não

ocorreram óbitos, os animais não apresentaram perda de peso, sendo classificados

com o índice “zero” (ausente), de maneira semi-quantitativa, de acordo com o

método proposto por Malone e Robichaud (1962), e Malone (1977). Na análise

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

pA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

FID1 A, (OECL\FRHCOUV1.D)

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

pA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

FID1 A, (OECL\FRCLCOU1.D)

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

pA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

FID1 A, (OECL\FRACOUV.D)

1 2

A

B

C

66

macroscópica dos órgãos realizada a partir da necropsia não foram constatadas

alterações nos principais órgãos, não sendo necessária a remoção dos mesmos

para exame histopatológico, como preconizado segundo a OECD 420 (2001).

Porém, estudos toxicológicos crônicos são necessários para se complementar os

dados de segurança no uso de produtos derivados da B. oleracea L. var. acephala

DC.

5.4 Avaliação da atividade gastroprotetora


DC., frações e subfrações em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl

O EHA apresentou significativa atividade gastroprotetora, reduzindo a área

total lesada, a área relativa de lesão e o ULI para os tratamentos com as doses de

25, 50 e 100 mg/kg de EHA e omeprazol (30 mg/kg), quando comparados com o

controle negativo (Tabela 3).

Tabela 3. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala DC. (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos.

Tratamentos Dose (mg/kg) Área total de

lesão (mm2)

Área relativa de

lesão (%)

Índice de Lesão Ulcerativa

(ULI)

Controle Veículo 62,41±22,53 13,20±4,25 33,16±4,57

EHA

25 13,03±2,65* 2,62±0,51** 17,00±0,70**

50 12,56±2,22* 2,23±0,40** 14,80±2,39**

100 4,88±1,33** 1,13±0,28** 5,00±1,34**

Omeprazol 30 14,83±4,90** 2,42±0,63** 9,00±1,21**

Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

O EHA apresentou um IC de 48,73±2,13% para a dose de 25 mg/kg;

55,37±7,22% para a dose de 50 mg/kg e 84,92±4,04% para a dose de 100 mg/kg,

sendo esta última, mais efetiva que o fármaco de escolha omeprazol, que

67

apresentou um IC de 72,86±3,65% (Figura 12). A DI50 calculada foi de 30,68 (23,21

– 40,54) mg/kg.

EHA 25 mg/kg EHA 50 mg/kg EHA 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

**

**

**

**

Tratamentos

Índ

ice

de

cura

(IC

- %

)

Figura 12. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

Buscando-se os possíveis metábolitos secundários responsáveis pela

atividade gastroprotetora, realizou-se o fracionamento do extrato através do

processo de partição líquido-líquido. As FH, FC, FAE e FAQ obtidas foram avaliadas

no modelo de úlceras agudas induzidas por etanol/HCl na dose de 50 mg/kg, afim de

se determinar qual ou quais as frações mais ativas.

Neste modelo, a FH, a FC, a FAE e a FAQ apresentaram atividade

gastroprotetora. Todas as frações reduziram a área total lesada e a área relativa

lesada quando comparados com o grupo controle negativo. O ULI apresentou-se

menor com o tratamento das frações FC (19,60) e FAQ (23,00), porém, os

tratamentos com as frações FH (30,60) e FAE (25,16) não foram capazes de reduzir

o ULI quando comparadas com o controle negativo (Tabela 4).

68

Tabela 4. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea L. var. acephala DC. (hexânica, clorofórmica, acetato de etila e aquosa, na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.

Tratamentos Dose

(mg/kg)

Área total de lesão (mm2)

Área relativa de lesão

(%)

Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)


FH 50 33,30±3,85* 7,67±0,77* 30,60±2,72

FC 50 18,04±1,53** 4,21±0,33** 19,60±1,32**

FAE 50 34,26±12,04* 7,24±2,59* 25,16±2,52

FAQ 50 24,61±3,68** 5,72±0,82** 23,00±1,14*

Omeprazol 30 12,93±2,54** 2,59±0,51** 9,40±0,92**


Assim, o índice de cura calculado foi de 24,44±16,51% para a FH;

51,60±10,19% para a FC; 25,43±7,47% para a FAE; 43,20±11,68% para a FAQ e

72,14±8,83% para o omeprazol (30 mg/kg) (Figura 13). De acordo com todos os

parâmetros avaliados, a fração clorofórmica na dose de 50 mg/kg apresentou-se

mais ativa contra o dano gástrico produzido pelo etanol/HCl, seguida pela fração

aquosa que também foi capaz de prevenir este dano.

FH 50 mg/kg FC 50 mg/kg FAC 50 mg/kg FAQ 50 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

**

*

**

Tratamentos

Índ

ice

de

cura

(IC

- %

)

Figura 13. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea L. var. acephala DC.(hexânica, clorofórmica, acetato de etila e aquosa, na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

69

Após concluir que as FC e FAQ são as mais ativas, realizou-se o mesmo

experimento a fim de determinar-se o perfil dose-resposta.

Ambas as frações foram testadas nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg. Neste

experimento, foi possível observar que tanto a fração FC quanto a FAQ apresentam

perfil dose-resposta, sendo capazes de inibir a área total lesada, a área relativa

lesada e o ULI, sendo que as doses de 50 e 100 mg/kg foram mais ativas quando

comparados com o grupo controle negativo (Tabela 5).

Tabela 5. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das frações clorofórmica e aquosa obtidas do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.

Tratamentos Dose (mg/kg)



(%)

Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)


FC

25 41,80±4,47** 11,35±1,49** 39,20±3,00

50 19,50±1,92** 5,27±1,75** 19,60±1,32**

100 15,77±2,30** 3,74±0,51** 16,80±1,28**

FAQ

25 69,46±3,45 16,82±1,97 32,80±3,89

50 22,80±2,44** 6,24±1,38** 24,33±1,25**

100 17,42±3,17** 4,68±0,70** 13,60±1,05**

Omeprazol 30 8,36±1,61** 1,19±1,15** 8,87±1,14**


A partir da determinação do ULI foi possível calcular o índice de cura, onde os

tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FC apresentaram 9,42±5,39%, 54,71±1,72%

e 61,18±2,95% de cura, respectivamente. O omeprazol (30 mg/kg) apresentou um IC

de 79,50±2,63% (Figura 14). A DI50 calculada foi de 71,03 (67,59 – 74,65) mg/kg.

70

FC 25 mg/kg FC 50 mg/kg FC 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

**

**

**

Tratamentos

Índic

e de

cura

(IC

- %

)

Figura 14. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

Os tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FAQ apresentaram um IC de

24,21±5,94%, 43,78±2,90% e 68,57±1,17%, respectivamente, e o tratamento com

omeprazol (30 mg/kg) apresentou um IC de 79,50±2,63% (Figura 15). A DI50

calculada foi de 57,68 (47,49 – 70,07) mg/kg.

FAQ 25 mg/kg FAQ 50 mg/kg FAQ 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

**

**

**

Tratamento

Índic

e de

cura

(IC

- %

)

Figura 15. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

71

Ainda neste mesmo modelo farmacológico, foi testada a atividade

gastroprotetora das subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta

das FC e FAQ.

Das sete subfrações obtidas da FC, cinco subfrações (da três a sete) foram

testadas na dose de 50 mg/kg. Neste experimento foi possível constatar que todas

as subfrações obtidas a partir da fração clorofórmica apresentam atividade

gastroprotetora (Tabela 6).

Tabela 6. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.

Tratamentos Dose

(mg/kg)



(%)

Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)


SFC (3) 50 17,17±2,22** 4,83±0,90** 25,65±0,76

SFC (4) 50 25,14±4,96** 8,85±2,03 32,20±3,68

SFC (5) 50 16,05±1,21** 5,39±1,67* 21,00±2,22*

SFC (6) 50 11,88±0,44** 3,74±0,46** 16,00±2,55**

SFC (7) 50 13,10±0,59** 5,16±0,90* 20,00±2,08*

Omeprazol 30 5,31±1,28** 3,22±1,56** 6,80±0,86**


A partir do cálculo de ULI, foi possível calcular o IC, onde os tratamentos com

as subfrações 3, 4, 5, 6 e 7 obtidas da FC apresentaram um IC de 35,37±1,91%,

18,87±1,80%, 47,09±3,59%, 59,68±2,44 e 49,60±2,24%, respectivamente, e o

tratamento com omeprazol na dose de 30 mg/kg apresentou um IC de 82,86±1,84%.

Assim, a SFC (6) é a subfração mais ativa (Figura 16).

72

SFC (3) 50 mg/kg SFC (4) 50 mg/kg SFC (5) 50 mg/kg SFC (6) 50 mg/kg SFC (7) 50 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

**

*

**

*

*

Tratamentos

Índ

ice

de

cura

(IC

- %

)

Figura 16. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

Da mesma maneira, das sete subfrações obtidas por cromatografia em coluna

aberta da FAQ, cinco subfrações (da três a sete) foram testadas na dose de 50

mg/kg. Todas as subfrações obtidas da fração aquosa testadas apresentam

atividade gastroprotetora (Tabela 7).

Tabela 7. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta das frações clorofórmica e aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.

Tratamentos Dose

(mg/kg)



(%)

Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)


SFAQ (3) 50 19,60±4,80** 5,67±1,20* 20,05±1,05*

SFAQ (4) 50 16,55±3,32** 5,58±1,21* 24,00±2,89*

SFAQ (5) 50 18,24±2,57** 6,45±0,79* 24,33±1,25*

SFAQ (6) 50 6,22±0,68** 2,59±0,74** 9,10±0,73**

SFAQ (7) 50 22,14±3,95** 5,49±1,82* 24,55±2,14

Omeprazol 30 5,31±1,28** 3,22±1,56** 6,80±0,86**


73

O IC calculado para os tratamentos com as subfrações 3, 4, 5, 6 e 7 obtidas

da FAQ apresentaram um IC de 49,48±1,23%, 39,53±1,30%, 38,69±2,93%,

77,07±1,84% e 38,15±2,39% respectivamente, e o tratamento com omeprazol na

dose de 30 mg/kg apresentou um IC de 82,86±1,84%. A SFAQ que se apresentou

mais ativa é a SFAQ (6) (Figura 17).

SFAQ (3) 50 mg/kg SFAQ (4) 50 mg/kg SFAQ (5) 50 mg/kg SFAQ (6) 50 mg/kg SFAQ (7) 50 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80 ****

*

* * *

Tratamentos

Índ

ice

de

cura

(IC

- %

)

Figura 17. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.


DC. e frações em úlceras agudas induzidas por

AINE/parassimpaticomimético

No experimento baseado no modelo de úlceras agudas induzidas por

AINE/parassimpaticomimético (indometacina/betanecol), foi possível observar que o

EHA apresentou atividade gastroprotetora, reduzindo a área total lesada, a área

relativa de lesão e o ULI para os tratamentos com as doses de 50 e 100 mg/kg de

EHA e cimetidina (100 mg/kg), quando comparados com o controle negativo. A dose

de 25 mg/kg de EHA não apresentou atividade gastroprotetora (Tabela 8).

74

Tabela 8. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos.

Tratamentos Dose

(mg/kg)



(%)

Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)


EHA

25 6,79±2,62 2,53±0,46 22,04±1,96

50 4,22±0,85* 1,16±0,23** 9,20±1,98**

100 4,15±1,25** 1,18±0,40** 8,66±2,45**

Cimetidina 30 1,91±0,74** 0,41±0,11** 4,83±1,51**


O EHA apresentou um IC de 14,57±12,39% para a dose de 25 mg/kg;

64,34±9,92% para a dose de 50 mg/kg e 66,43±12,29% para a dose de 100 mg/kg,

e 81,27±7,57% para o tratamento com cimetidina na dose de 100 mg/kg (Figura 18).

A DI50 calculada foi de 62,26 (54,09 – 71,66) mg/kg.

EHA 25 mg/kg EHA 50 mg/kg EHA 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

****

**

Tratamentos

Índ

ice

de

cura

(IC

- %

)

Figura 18. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

75

Da mesma forma, a FC e a FAQ foram testadas nesse modelo, sendo que

apresentaram perfil dose-resposta, sendo capazes de inibir a área total lesada, a

área relativa lesada e o ULI, sendo que os efeitos observados nas doses de 50 e

100 mg/kg foram mais ativos quando comparados com o grupo controle negativo. A

dose de 25 mg/kg não apresentou atividade gastroprotetora (Tabela 9).

Tabela 9. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala (clorofórmica e aquosa, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas por indometacina/betanecol em camundongos.

Tratamentos Dose

(mg/kg)



(%)

Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)


FC

25 5,37±1,43 1,36±0,36 24,33±2,71

50 4,87±1,58** 1,25±0,48** 20,05±1,57*

100 3,95±0,81** 1,18±0,22** 13,00±2,03**

FAQ

25 6,91±1,92 1,85±0,59 27,00±1,14

50 5,87±0,54** 1,58±0,34** 23,05±1,56*

100 2,99±0,54** 1,12±0,24** 13,60±1,58**

Cimetidina 100 3,30±1,00** 0,85±0,27** 10,2±0,58**


O IC calculado os tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FC foi de

31,27±2,75%, 41,88±4,87% e 63,27±5,65%, respectivamente, sendo que o

tratamento com cimetidina (100 mg/kg) apresentou IC de 71,18±1,98% (Figura 19).


76

FC 25 mg/kg FC 50 mg/kg FC 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70 ****

*

Tratamentos

Índic

e de

cura

(IC

- %

)

Figura 19. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

Os tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FAQ apresentaram um IC de

23,72±4,97%, 34,88±2,04% e 61,58±5,33%, respectivamente, sendo que o

tratamento com cimetidina (100 mg/kg) apresentou IC de 71,18±1,98% (Figura 20).


FAQ 25 mg/kg FAQ 50 mg/kg FAQ 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70 ****

*

Tratamentos

Índ

ice

de

cura

(IC

%)

Figura 20. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

77


DC. e frações no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético

(ensaio curativo)

A atividade gastroprotetora curativa do EHA (100 mg/kg), da FC (100 mg/kg),

e da FAQ (100 mg/kg) foi avaliada após 9 dias da indução da lesão com ácido

acético. O EHA, a FC e a FAQ foram capazes de diminuir o tamanho da úlcera em

comparação ao grupo de animais tratados com salina, sendo que o EHA mostrou-se

mais efetivo que a cimetidina (100 mg/kg) na cicatrização das lesões gástricas

(Tabela 10), e podemos observar que o EHA é mais ativo do que suas frações.

Tabela 10. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos.

Tratamentos Dose

(mg/kg)


Área relativa de lesão (%)

Controle Veículo 24,45±2,07 6,15±0,62

EHA 100 3,67±0,53** 0,98±0,14**

FC 100 5,42±1,12** 1,97±0,37**

FAQ 100 6,65±0,55** 1,64±0,21**

Cimetidina 100 4,17±0,71** 1,12±0,19**

Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

A partir da determinação da área total lesada foi possível calcular o IC, onde o

tratamento com EHA (100 mg/kg) apresentou 84,96±2,07% de cura, sendo mais

efetivo que o tratamento com cimetidina (100 mg/kg), que apresentou um IC de

82,94±2,92%. A FC e a FAQ apresentaram 77,80±2,17% e 73,17±2,28% de cura,

respectivamente (Figura 21).

78

EHA 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

90 ****

**

**

Tratamento

Índ

ice

de

cura

(IC

- %

)

Figura 21. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

A partir da análise das lâminas histológicas é possível observar que o

tratamento com EHA, FC e a FAQ promoveu uma diminuição da espessura da

mucosa gástrica quando comprado com o grupo controle negativo, mantendo sua

espessura com valores próximos à espessura de uma mucosa normal (Tabela 11).

Quanto a classificação dos cortes por pontuação, o grupo normal recebeu a

pontuação “zero”, onde a mucosa apresenta-se normal. A mesma pontuação foi

observada para o grupo tratado com EHA. O grupo controle negativo recebeu a

pontuação “quatro”, onde observou-se um dano extenso na mucosa. O grupo FC,

FAQ e cimetidina recebeu a pontuação “um”, onde observaram-se pequenos danos

à mucosa gástrica (Tabela 11).

79

Tabela 11. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) na espessura da mucosa gástrica de úlceras induzidas por ácido acético (30%) em camundongos.

Tratamentos Dose (mg/kg) Espessura da mucosa

gástrica (µµµµm)

Classificação por pontuação

(0 – 4)

Normal Veículo 247,04±7,66 0

Controle Veículo 479,89±65,85 4

EHA 100 190,74±10,76** 0

FC 100 195,53±14,25** 1

FAQ 100 212,55±16,4** 1

Cimetidina 100 193,98±7,51** 1

Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.

Na Figura 22, observamos os cortes histológicos dos grupos normal, controle

negativo, tratados com EHA, FC, FAQ e cimetidina (100 mg/kg). Quando comparado

a um corte histológico normal (Figura 22 A), a úlcera do grupo controle negativo,

apresentou a camada mucosa dilatada, sem organização celular definida e com

ausência de células principais no fundo da glândula gástrica, presentes em mucosa

totalmente regenerada. A camada submuscular da mucosa e a camada muscular

apresentam-se totalmente desorganizadas, com grande infiltrado inflamatório,

presença de linfócitos e fibroblastos (Figura 22 B). Já no tratamento com EHA foi

possível observar que todas as camadas do estômago estão completamente

regeneradas (Figura 22 C). De maneira similar, podemos observar um melhor

arranjo das estruturas celulares com os tratamentos de FC, FAQ e cimetidina (100

mg/kg) (Figura 22 D, E e F, respectivamente). Porém, o processo curativo ainda não

está totalmente estabelecido, sendo que ainda há presença de infiltrado inflamatório,

com linfócitos e fibroblastos.

80

Corte transversal em aumento de 1000 Corte transversal em aumento de 4000 Corte transversal em aumento de 4000 N

orm

al

Con

trol

e

EH

A

100

mg/

kg

FC

100

mg/

kg

FA

Q

100

mg/

kg

Cim

etid

ina

100

mg/

kg

Figura 22. Detalhes de cortes histológicos do efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos. mc: mucosa. sm: submuscular. ms: muscular. ss: subserosa. A) Grupo Normal. B) Grupo Controle Negativo. C) EHA (100 mg/kg). D) FC (100 mg/kg). E) FAQ (100 mg/kg). F) Cimetidina (100 mg/kg). 1: Detalhe do tecido no aumento de 1000 vezes. 2: Detalhe da mucosa no aumento de 4000 vezes. 3: Detalhe da camada muscular no aumento de 4000 vezes.

A1 A2 A3

B1 B2 B3

C1 C2 C3

D1 D2 D3

E1 E2 E3

F1 F2 F3

mc

ms

sm ss

mc

ms sm ss

mc

ms

sm

ss

ms

ss

sm

mc

ss

sm

ms

mc

mc

ms

sm

ss

81

5.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica


DC. e frações sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro)

Os resultados apresentados na Tabela 12 demonstram que o EHA promoveu

a diminuição do volume na secreção gástrica, aumentando o pH nas doses de 50 e

100 mg/kg e no tratamento com cimetidina (100 mg/kg). A dose de 25 mg/kg não

causou alterações significativas no volume de secreção e pH, porém, promoveu

alterações na concentração de íons hidrogênio na secreção gástrica. As doses de 50

e 100 mg/kg de EHA e cimetidina (100 mg/kg) também promoveram uma diminuição

na concentração dos íons hidrogênio na secreção estomacal. A DI50 calculada foi de

46,04 (36,83 – 57,57) mg/kg.

Tabela 12. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala DC. (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica ácida de camundongos submetidos à ligadura de piloro.

Tratamentos Dose (mg/kg) pH Volume de secreção

(mL)

[H+] (mEq.g-1/L)


EHA

25 4,21±0,51 0,49±0,04 51,36±5,21**

50 4,16±0,16* 0,40±0,05 46,62±0,58**

100 4,27±0,32* 0,37±0,06* 44,16±3,60**

Cimetidina 100 4,97±0,51** 0,35±0,02* 34,00±4,30**


Para complementar os resultados, as frações mais ativas (FC e FAQ) foram

submetidas ao teste de ligadura de piloro, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg.

Tanto a FC e quanto a FAQ foram capazes de alterar todos os parâmetros

analisados, porém a FAQ mostrou-se mais ativa. Quanto ao pH, a administração de

FC e FAQ promoveu alterações somente nas doses de 50 e 100 mg/kg. O volume

de secreção foi alterado somente com a administração da dose de 100 mg/kg de FC

e das doses de 50 e 100 mg/kg de FAQ. A concentração de íons hidrogênio

encontrou-se diminuída com a administração da dose de 100 mg/kg de FC e com as

82

doses de 25, 50 e 100 mg/kg de FAQ. A cimetidina (100 mg/kg) mostrou-se eficiente

como controle positivo, pois apresentou atividade em todos os parâmetros

observados (Tabela 13). A DI50 calculada para o tratamento com FC foi de 83,31

(68,38 – 101,49) mg/kg, e para o tratamento com FAQ foi de 51,99 (43,31 – 62,42)

mg/kg.

Tabela 13. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg) obtidas a partir do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica ácida de camundongos submetidos à ligadura de piloro.

Tratamentos Dose (mg/kg) pH Volume de secreção

(mL)

[H+] (mEq.g-1/L)


FC

25 3,45±0,28 0,35±0,04 74,53±4,73

50 4,25±0,32* 0,34±0,04 67,20±4,75

100 4,93±0,31** 0,31±0,02** 50,13±0,88*

FAQ

25 3,49±0,19 0,32±0,05 59,31±3,15*

50 4,00±0,11* 0,29±0,03** 56,40±2,40*

100 5,05±0,17** 0,25±0,05** 39,11±5,64**

Cimetidina 100 5,33±0,23** 0,24±0,03** 35,19±5,09**



DC. e frações sobre a secreção de muco em mucosa gástrica

Os resultados apresentados na Tabela 14 demonstram que a administração

de EHA das doses de 25, 50 e 100 mg/kg foi capaz de aumentar a quantidade de

muco presente na mucosa gástrica. A carbenoxolona (200 mg/kg) mostrou-se efetiva

como controle positivo, pois promoveu o aumento de muco. A indometacina (100

mg/kg) também mostrou-se efetiva como controle negativo, pois diminuiu a

quantidade de muco presente na mucosa gástrica. A DI50 calculada foi de 56,32

(37,72 – 84,09) mg/kg.

83

Tabela 14. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção de muco de camundongos submetidos à ligadura de piloro.

Tratamentos Dose

(mg/kg) pH

Volume de secreção

(ML)

Quantidade de Alcian Blue ligado

(mg/g tecido)

Salina Veículo 3,15±0,21 0,54±0,09 3,19±0,62

Indometacina 100 2,53±0,15 0,43±0,04 1,44±0,18

EHA

50 4,21±0,51 0,49±0,04 3,93±0,12*

250 4,16±0,16* 0,40±0,05 4,59±0,31**

500 4,27±0,32* 0,37±0,06* 4,17±0,25**

Carbenoxolona 200 4,43±0,49* 0,30±0,03** 4,30±0,32**

Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. (ABS = 0,0035 + 0,0081 * Conc; R2: 0,998)

Complementando os resultados obtidos com EHA, as FC e FAQ também

foram submetidas ao modelo de ligadura de piloro. A Tabela 15 demonstra que as

doses de 25, 50 e 100 mg/kg de FC e de 50 e 100 mg/kg de FAQ foram capazes de

aumentar a quantidade de muco presente na mucosa gástrica. A dose de 25 mg/kg

de FAQ não apresentou alterações significativas. A carbenoxolona (200 mg/kg) e a

indometacina (100 mg/kg) foram usados como controles. A DI50 calculada para o

tratamento com FC foi de 13,58 (6,61 – 27,89) mg/kg, e para o tratamento com FAQ

foi de 9,87 (4,20 – 23,18) mg/kg.

Tabela 15. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses das diferentes doses das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg) obtidas do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção de muco de camundongos submetidos à ligadura de piloro.

Tratamentos Dose

(mg/kg) pH

Volume de secreção

(g)

Quantidade de Alcian Blue ligado

(mg/g tecido)

Salina Veículo 2,99±0,14 0,57±0,03 3,95±0,39

Indometacina 100 3,45±0,28 0,65±0,12 2,98±0,53

FC

25 4,25±0,32* 0,35±0,04 6,02±0,33*

50 4,93±0,31** 0,34±0,04 6,68±0,90*

100 4,93±0,31** 0,31±0,02** 10,61±0,94**

FAQ

25 3,49±0,19 0,32±0,05 5,64±0,21

50 4,00±0,11* 0,29±0,03** 6,76±0,11*

100 5,05±0,17** 0,25±0,05** 8,50±1,56**

Carbenoxolona 200 5,16±0,30* 0,24±0,04** 7,04±0,53**

Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. (ABS = 0,0035 + 0,0081 * Conc; R2: 0,998)

84

5.6 Mecanismos de ação antiúlcera in vivo

5.6.1 Papel do óxido nítrico e do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea

L. var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas por

etanol/HCl

O L-NAME é uma substância capaz de inibir a enzima NOS. Em modelos de

avaliação da atividade gastroprotetora ligada a fatores antioxidantes verifica-se a

participação do NO através da pré-administração de L-NAME. Neste modelo,

quando administrado o L-NAME aos animais antes dos tratamentos com EHA, FC e

FAQ (100 mg/kg), verificou-se que estes perderam sua atividade gastroprotetora,

quando comparado com animais tratados somente tratados com EHA, FC e FAQ

(100 mg/kg) (Tabela 16).

Tabela 16. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl associado a inibição da NO-sintase em camundongos.

Tratamentos

L-NAME (70mg/

kg)

Dose (mg/kg)


Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)

Índice de Cura (%)

L-NAME

Controle + Veículo 48,83±4,68 40,57±4,45 -

- Veículo 35,51±2,06 38,30±4,06 5,59±4,06

EHA + 100 36,70±4,80 37,60±6,40 7,32±3,09

- 100 8,33±3,07*## 9,60±2,24**## 76,33±5,54##

FC + 100 32,22±6,18 35,00±5,14 13,72±1,45

- 100 17,41±2,42*## 15,80±2,95**## 61,05±3,78##

FAQ + 100 35,65±6,30 35,60±3,54 12,25±4,19

- 100 19,88±1,65*## 16,80±1,42**# 58,59±3,52#

Carbenoxolona + 200 39,91±5,94 34,70±3,45 14,46±4,72

- 200 6,31±1,93**## 11,20±2,17**## 72,39±5,77##

Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle L-NAME (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos L-NAME e salina (+p<0,05).

Quanto a área relativa lesada, observou-se que o tratamento com EHA (100

mg/kg) promove gastroproteção (1,34%) contra o dano produzido pelo etanol/HCL,

sendo que esta foi perdida quando pré-administrado L-NAME aos animais (12,82%).

Observa-se que o tratamento com as FC (2,59%) e FAQ (3,08%) também

85

apresentou gastroproteção, que foi perdida com o pré-tratamento de L-NAME (FC:

12,51% e FAQ: 13,37%). A carbenoxolona (200 mg/kg) apresentou-se efetiva como

controle positivo pois promoveu uma diminuição no dano gástrico produzido pelo

etanol/HCl (1,58%), que também foi perdida com a pré-administração do L-NAME

(11,68%). No grupo controle negativo, não observamos alterações significativas

entre o grupo tratado com salina (13,08%) e o grupo tratado com L-NAME (15,97%).

Também foi possível observar que o EHA promove maior gastroproteção do que as

suas frações (FC e FAQ). Estes resultados podem ser observados na Figura 23.

Cont. Neg. EHA 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg Cont. Neg. EHA 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg0

10

20

30

*##

*##*##

*##

+

+

+

+

L-NAME SalinaTratamentos

Áre

a R

elat

iva

Les

ada

(%)

Figura 23. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos, associado a administração de L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g de peso de animal). Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle L-NAME (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos L-NAME e salina (+p<0,05).

5.6.2 Papel dos compostos sulfidrilas e do extrato hidroalcoólico de Brassica

oleracea L. var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas por

etanol/HCl

O NEM é uma substância capaz de quelar os grupamentos sulfidrilas

presente na mucosa gástrica, que também participam dos processos antioxidantes

ligados a gastroproteção. Em modelos de avaliação da atividade gastroprotetora,

86

verifica-se a participação desses grupamentos através do pré-tratamento dos

animais com NEM. Antes do tratamento com EHA, FC e FAQ (100 mg/kg), o pré-

tratamento com NEM promoveu a perda da atividade gastroprotetora, quando

comparados com animais tratados somente com EHA, FC e FAQ (100 mg/kg)

(Tabela 17).

Tabela 17. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl associado a alquilação de grupamentos sulfidrilas em camundongos.

Tratamentos NEM

(10mg/kg)

Dose (mg/kg)


Índice de Lesão

Ulcerativa (ULI)

Índice de Cura (%)

NEM

Controle + Veículo 153,89±6,77 41,00±2,42 -

- Veículo 43,70±4,85## 25,80±1,30## 37,07±1,30

EHA + 100 106,01±15,94## 19,80±2,31*## 51,80±7,45

- 100 4,95±1,62**## 11,60±1,20**## 71,70±3,89##

FC + 100 100,23±8,24## 15,83±2,07*## 61,39±6,47

- 100 10,57 ±3,78*## 16,20±2,87*## 60,48±3,26##

FAQ + 100 100,84±10,79## 17,83±1,70*## 56,51±2,26

- 100 13,45±2,63*## 16,83±1,16*# 58,95±3,76#

Carbenoxolona + 200 105,11±9,14## 18,60±2,80*## 54,63±7,04

- 200 6,90±3,10**## 13,20±1,88**## 67,80±8,12##

Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle NEM (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos NEM e salina (+p<0,05).

Quanto a área relativa lesada, observou-se que o tratamento com EHA (100

mg/kg) promove gastroproteção (1,59%) contra o dano produzido pelo etanol/HCL,

sendo que esta foi perdida quando pré-administrado NEM (41,92%). Também se

observou que o tratamento com as FC (2,03%) e FAQ (2,95%) apresentou

gastroproteção, que foi perdida com o pré-tratamento com NEM (FC: 42,19% e FAQ:

39,04%). A carbenoxolona (200 mg/kg), usada como controle positivo, promoveu

uma diminuição no dano gástrico produzido pelo etanol/HCl (1,77%), que também foi

perdida com a pré-administração do NEM (40,36%). No grupo controle negativo, foi

possível observar alterações entre o grupo tratado com salina (22,83%) e o grupo

tratado com NEM (52,08%), sugerindo que o dano produzido por etanol/HCl foi mais

severo quando associado com a pré-administração de NEM. Neste experimento,

também foi possível observar que o EHA promove maior gastroproteção do que as

suas frações (FC e FAQ). Estes resultados podem ser observados na Figura 24.

87

Cont. Neg. EHC 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg Cont. Neg. EHC 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

+++

+++

+++

+++

**##**##

**## **##

##

+++

NEM SalinaTratamentos

Áre

a re

lati

va l

esad

a (%

)

Figura 24. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos, associado a administração de NEM (10 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g de peso de animal). Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle L-NAME (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos NEM e salina (+p<0,05).

88

6 DISCUSSÃO

Para o sucesso de pesquisas farmacológicas com plantas são necessários

alguns critérios de investigação. A escolha baseada em conhecimentos

etnofarmacológicos é, sem dúvidas, a alternativa que apresenta maior possibilidade

de descoberta de novos compostos, com a comprovação da atividade farmacológica

desejada. O progresso, o sucesso nas pesquisas e os conhecimentos de plantas

medicinais e alimentos funcionais é determinado, em grande parte, pelo

conhecimento popular (HASLAM, 1996; HOLETZ et al., 2002; HASLAM, 2007).

Dentro dos métodos modernos de análise fitoquímica, a cromatografia se

destaca devido a sua facilidade com que se efetua a separação, identificação e

quantificação de substâncias químicas (COLLINS, 2006).

O processo de fracionamento de extratos vegetais visa à separação dos

prováveis metabólitos secundários presentes na planta. É utilizado geralmente

quando não se conhece a natureza dos compostos presentes (NIERO et al., 2003;

SIMÕES et al., 2003; MALHEIROS et al., 2010).

As brássicas são um grupo de vegetais amplamente distribuídos e

consumidos em todo o mundo. O seu consumo está relacionado com a redução dos

riscos de doenças crônicas, como problemas cardiovasculares, câncer, diabetes

mellitus tipo 2, entre outras. Estes atividades estão relacionadas com os metabólitos

secundários, mais especificamente, glicosinolatos, compostos fenólicos e

flavonóides. Além disso, estes metabólitos possuem alta capacidade antioxidante,

controlando os mecanismos apoptóticos e necróticos presentes nas células

(FRANCISCO et al., 2009).

Os glicosinolatos são compostos que apresentam várias características,

contém em sua molécula, nitrogênio e enxofre, e são responsáveis pelo odor forte e

pungente das brássicas, especialmente a mostarda (Brassica nigra), nabos

(Brassica rapa), repolhos (Brassica oleracea var. capitata), etc. Estudos in vitro

demonstram principalmente atividades antitumorais e atuação sobre enzimas

hepáticas envolvidas em processos de desintoxicação (BRUNETON, 1991;

FRANCISCO et al., 2009).

Os compostos fenólicos e flavonóides são o grupo de metábolitos secundários

mais abundantes e mais amplamente estudado do reino vegetal. Em plantas do

89

gênero Brassica, esses metabólitos secundários são complexos, podendo

apresentar até cinco resíduos de açúcar ou serem associados com resíduos do

ácido hidroxicinâmico. Estes compostos apresentam alta capacidade antioxidante,

seja por inibir diretamente o radical, ou por induzir a expressão de enzimas

metabolizadoras, reduzindo o risco de diferentes doenças (ZHANG et al., 2003;

FRANCISCO et al., 2009). Além disso, os benefício na saúde humana e os efeitos

sinérgicos podem aparecer entre essas classes de metabólitos (FRANCISCO et al.,

2009).

Além disso, estudos em plantas do gênero Maytenus, conhecidas

popularmente no Brasil como “espinheira-santa”, apontam que terpenos e

flavonóides presentes na planta são as substâncias responsáveis pela atividade

gastroprotetora (YARIWAKE, et al., 2005). Em outro estudo, os flavonóides, ácidos

fenólicos e orgânicos presentes na própolis apresentam atividade antiúlcera

(SOUSA et al., 2007).

De acordo com o perfil fitoquímico observado nas cromatoplacas, dados

presentes na literatura, e na comparação com diferentes padrões de terpenos e

esteróides é possível sugerir que Brassica oleracea L. var. acephala DC. apresentou

diferentes compostos destas classes, tendo em vista a coloração específica quando

revelado com o anisaldeído sulfúrico. Isto também pode ser confirmado quando se

analisa o perfil cromatográfico obtido através de CGAR-DIC, onde foram observadas

nítidas diferenças entre as frações mais apolares analisadas. Considerando que as

diferenças mais significativas encontram-se na fração clorofórmica e que esta fração

foi a que apresentou melhor atividade gastroprotetora, sugere-se que estas

substâncias podem ser responsáveis, em parte, pela atividade encontrada.

O estudo fitoquímico preliminar desta fração (FC), através de cromatografia

em coluna aberta, foi possível obter algumas subfrações com um bom grau de

pureza e que no momento encontram-se em processo de elucidação estrutural.

Da mesma forma, a análise da fração aquosa através de cromatografia em

camada delgada utilizando como padrões flavonóides e açúcares mostraram

coloração característica quando utilizados os reveladores cloreto férrico e ácido p-

aminobenzoico, sugerindo a presença de glicosinolatos ou flavonóides glicosilados.

B. oleracea L. var. acephala DC. é uma espécie que apresenta perfil

fitoquímico bastante polar, de grande complexidade e quantidade de metabólitos,

necessitando de técnicas fitoquímicas mais específicas.

90

Estudos pré-clínicos são importantes para se determinar a eficácia, potência e

a toxicidade de um extrato em estudo (SANTOS, 2008). Levando em consideração

que a couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.) é um alimento muito

consumido pela população, é de extrema importância complementar estudos sobre

toxicologia desta planta, garantindo a segurança na utilização terapêutica da couve.

De acordo com o Guideline for Testing of Chemicals – Acute Oral Toxicity –

Fixed Dose Procedure (OECD 420, 2001), no modelo de toxicidade aguda, é

possível observar a capacidade de um extrato ou substância em causar danos nas

estruturas celulares e no conteúdo genético pouco tempo depois de uma única

exposição, mesmo sendo de curta duração.

Neste estudo, a administração do EHA, os animais não apresentaram

nenhum sinal de toxicidade significativo durante o período de observação. A

ausência de efeitos tóxicos agudos permitiu prosseguir com os ensaios

farmacológicos.

A atividade gastroprotetora do EHA, frações e subfrações foi inicialmente

avaliada nos modelos de indução de úlceras agudas induzidas por etanol, que é um

agente necrosante, e por AINE, que inibe a proteção normal do estômago

(diminuição de síntese de prostaglandinas constitutivas). Apesar de não representar

integralmente a patologia humana, esses dois modelos são clássicos no screening

para o estudo de fármacos com atividades gastroprotetoras. Estes modelos

fornecem importantes indicativos de possíveis mecanismos de ação dos extratos,

que podem estar associados a fatores antioxidantes e/ou fatores anti-inflamatórios,

ou ainda a diminuição da secreção ácida. O uso de substâncias como álcool e

AINES estão entre as principais causas envolvidas na etiologia de úlceras gástricas

no homem (RAIHA et al, 1998; SCHMASSMANN, 1998; LEVENSTEIN, 1998).

No modelo de úlceras agudas induzidas por etanol, as lesões ulcerativas são

decorrentes da ação necrosante do etanol sobre a mucosa gástrica, com menor

participação da secreção ácida, sendo de etiologia bastante ampla e complexa,

envolvendo a depleção dos fatores protetores (muco e bicarbonato, por exemplo) e

aumentando os fatores agressores (ácido clorídrico, por exemplo) (SIKIRIC et al.,

1999; REPETTO, LLESUY, 2002; VAZQUEZ-RAMIREZ et al., 2006).

Os efeitos do etanol sobre a mucosa gástrica podem estar associados com a

formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), que causam um desequilíbrio

entre o processo antioxidante e oxidante celular. A administração de etanol resulta

91

em lesões no plexo vascular, ocasionando ruptura dos vasos, favorecendo a

hemorragia e necrose, retrodifusão de íons hidrogênio, causando esfoliação nas

células epiteliais, rompendo a barreira protetora da mucosa e alterando a

permeabilidade da membrana (LEWIS, HANSON, 1991; SIKIRIC et al., 1999).

Mecanismos antioxidantes de defesa são eventos fisiológicos normais, porém,

em condições patológicas, os EROs causam peroxidação lipídica e dano oxidativo. A

primeira enzima antioxidante da mucosa gástrica é a superóxido dismutase (SOD),

que catalisa a dismutação do O2• em peróxido de hidrogênio (H2O2), que apesar de

ser menos nocivo, ainda causa danos celulares. O H2O2 é reduzido pela enzima

glutationa peroxidase (GPx) em água. Esta reação é acompanhada pela conversão

da glutationa reduzida (GSH) em glutationa oxidada (GSSG), sendo convertida

novamente em GSH pela glutationa redutase (GR) (EL-HABIT et al., 2000;

KWIECIÉN, BRZOZOWISK, KONTUREK, 2002).

Como as membranas apresentam grande quantidades de complexos

enzimáticos redutores de O2•, são alvos constantes das EROs, que atacam as

insaturações dos ácidos graxos poli-insaturados, ocasionando a formação de radical

lipídicos peroxil e alcoxil (ROO• e RO•), captação de O2 e rearranjo de ligações

duplas, resultando na alteração da integridade e fluidez das membranas. Esse

processo é chamado de lipoperoxidação lipídica, que é mantido pela formação de

hidroperóxidos e aldeídos (BUEGE; AUST, 1978; JOURD’HEUIL; GUTTERIDGE,

1995; MCCORD, 2000; ANDREOLI, 2000; CHATTOPADHYAY et al., 2006).

Além de causar mudanças na seletividade, alterações no volume e

metabolismo celular, os hidroperóxidos e aldeídos são citotóxicos, promovendo a

quimiotaxia e regulando a produção de citocinas. A lipoperoxidação lipídica pode ser

interrompida por antioxidantes, como por exemplo o α-tocoferol (vitamina E) e o

óxido nítrico (NO) (CHEN et al., 1996; AW, 1998; JAYATILLEKE, SHAW, 1998;

HOGG, KALYANARAMAN, 1999).

Segundo Vrchoská et al. (2006), legumes pertencentes a família Brassicaceae

apresentam glicosinolatos e seus derivados, flavonóides e outros compostos

fenólicos que tem alta capacidade antioxidante in vitro comprovada (VRCHOVSKÁ

et al., 2006).

Considerando a possível presença destas classes de compostos quando

analisados fitoquimicamente e, os resultados obtidos no modelo de úlcera induzida

por etanol/HCl, sugerem que o EHA, as frações e as subfrações apresentam efeito

92

gastroprotetor por aumentar a citoproteção favorecendo os processos antioxidantes.

Porém, estudos complementares sobre os processos de estresse oxidativo in vivo e

in vitro, serão necessários para comprovar seu envolvimento nos processos

antioxidantes.

A obtenção das frações e subfrações foi uma tentativa de buscar os possíveis

metabólitos responsáveis pela atividade gastroprotetora. À medida que o extrato foi

sendo fracionado, o mesmo apresentou uma diminuição na capacidade de inibir as

úlceras, porém, a capacidade gastroprotetora foi mantida. Esses resultados sugerem

um efeito sinérgico entre as substâncias presentes no extrato, ou seja, estes efeitos

podem ser associados a compostos fenólicos, flavonóides glicosilados e

glicosinolatos. Dados da literatura indicam que as brássicas apresentam seus efeitos

gastroprotetores por mecanismos de maneira sinérgica entre seus constituintes

(FRANCISCO et al., 2009).

A gastroproteção pode estar relacionada com a manutenção da integridade

da mucosa gástrica, que depende da integridade da microcirculação, secreção de

muco e atividade de enzimas antioxidantes (KWIECIÉN et al., 2004).

A atividade antiulcerogênica do EHA, frações FC e FAQ foi avaliada no

modelo de úlcera induzida por AINE/parassimpaticomimético

(indometacina/betanecol). Os anti-inflamatórios não esteroidais apresentam como

efeito adverso. A ulceração da mucosa gástrica, resultado principalmente da

diminuição da síntese de prostaglandinas, devido a inibição da enzima ciclo-

oxigenase. As prostaglandinas são responsáveis pela secreção de muco e

bicarbonato na mucosa gástrica. Sua diminuição acarreta em perda da citoproteção

e redução do fluxo sanguíneo local (CRYER, 2000).

O contato direto de AINEs com a mucosa gástrica ataca os fosfolipídios

presentes tanto no muco quanto no epitélio gástrico, o que reduz a hidrofobicidade

do muco e causando retrodifusão de íons hidrogênio. A redução do nível de

prostaglandinas na mucosa gástrica, ao mesmo tempo que diminui a inflamação,

acarreta a diminuição da defesa natural do estômago (BJORKMAN, 1996;

BERSTAD, BERSTAD , BERSTAD, 2002).

As prostaglandinas exercem seus efeitos via receptores específicos de

membrana, que são acoplados a proteínas-G, denominados de receptores EP. A

PGE2, especificamente quando interage com receptores EP1, resultando na

liberação de IP3 e DAG, quando interage com receptores EP2 e EP4, ativam a via

93

adenilato-ciclase-AMPc, sendo que quando interage com os receptores EP3, inibem

a via adenilato-ciclase-AMPc. Assim, as prostaglandinas exercem seus efeitos

aumentando a secreção de muco e bicarbonato, a resistência epitelial, a

citoproteção e mantêm o fluxo sanguíneo na mucosa (HAWKEY, RAMPTON, 1985;

SUGIMOTO, NARUMIYA, ICHIKAWA, 2000; PAWLIK et al., 2002; DEY et al., 2006).

Neste modelo, as maiores doses de EHA apresentaram atividade

gastroprotetora, sendo que a FC apresentou atividade gastroprotetora mais

pronunciada do que a FAQ. Isto indica que provavelmente o EHA apresenta

componentes com efeitos sinérgicos, sendo que os componentes presentes na FC

são capazes de promover um efeito protetor sobre a mucosa, podendo estar

relacionado com o aumento de síntese de prostaglandinas.

Os resultados nesses dois experimentos sugerem que as substâncias

presentes no EHA promovem a participação coordenada de mediadores na resposta

gastroprotetora. Podem estar havendo influência da PGE2 e NO, os quais podem

modular a defesa da mucosa, estimulando a secreção de muco e bicarbonato,

elevando o fluxo sanguíneo, promovendo o tamponamento da acidez ou inibindo a

secreção ácida, e citoproteção, favorecendo os mecanismos de reparo tecidual

(WALLACE; MILLER, 2000).

O modelo de indução de úlceras crônicas por ácido acético desenvolvido por

Takagi, Okabe e Saziki, (1969) é o que apresenta maior similaridade com a

patologia em humanos. Os autores observaram que o ácido acético é capaz de

produzir uma lesão bem definida envolvendo a camada muscular, de cicatrização

demorada, semelhante à úlcera péptica humana. Por esse motivo, neste estudo foi

selecionado este modelo para a avaliação da atividade curativa da Brassica oleracea

L. var. acephala DC. sobre úlceras crônicas produzidas por ácido acético.

Neste modelo, há três fases distintas de cicatrização, onde ocorre o

desenvolvimento da úlcera com necrose do tecido, infiltração inflamatória e

formação de margem da úlcera; início do processo de cicatrização, com uma fase

rápida, envolvendo migração rápida de células epiteliais e contração da base da

úlcera, e fase lenta de cicatrização, com angiogênese, remodelação dos tecidos de

granulação e completa re-epitelização da cratera da úlcera (SCHMASSMANN, 1998;

TARNAWSKI, 2000).

A úlcera gástrica é resultante de um processo necrótico e isquêmico. Como

ocorre dano microvascular, o tecido em necrose não recebe mais nutrientes,

94

liberando mediadores que causam quimiotaxia de leucócitos e macrófagos. Estes,

fagocitam os restos celulares liberando citocinas pró-inflamatórias como por exemplo

o TNFα, a IL-1α e a IL-1β, envolvendo a enzima COX-2 na defesa da mucosa

gástrica e no processo de cicatrização do tecido. A expressão de COX-2 parece

controlar os mecanismos de re-epitelização, angiogênese, citoproteção e

proliferação celular epitelial (mediada por EGF) (TISUJI et al., 2002; TARNAWSKI,

2005; WALLACE, 2005; POONAM, VINAY, GAUTAN, 2005; SCHMASSMAN et al.,

2005).

As prostaglandinas possuem um papel fundamental na renovação do epitélio

gástrico, mantendo os fatores defensivos da mucosa gástrica. Além de proteger as

células o estômago contra úlceras provocadas nos modelos agudos, o EHA é capaz

de promover a cicatrização de úlceras no modelo crônico. Isso sugere que os

compostos presentes no EHA favorecem os mecanismos anti-inflamatórios e

antioxidantes, provavelmente induzindo a síntese de PGE2 e liberação de NO,

favorecendo os mecanismos de reparo e cicatrização da lesão ulcerativa.

Nos cortes histológicos dos animais tratados com EHA, FC ou FAQ é possível

observar a regeneração do tecido e células funcionais do estômago, o que sugere

que os compostos presentes atuam promovendo os mecanismos de reparo e

cicatrização, reforçando os dados obtidos macroscopicamente. Novamente, é

possível observar que as substâncias atuam em sinergismo, pois os animais

tratados com EHA apresentam organização celular mais evidente do que os tratados

com FC, FAQ e cimetidina.

Histologicamente é possível observar cicatrização da mucosa gástrica, quanto

a migração e proliferação celular, re-epitelização, angiogênese, presença de

fibroblastos e formação de tecido conjuntivo de sustentação, que são processos

controlados por fatores de crescimento (TGFβ, PDGF, EGF, FGF e VEGF) e

citocinas (TNFα, IL-1α, IL-1β) (CONTRAN, KUMAR, ROBBINS, 2000; TARNAWSKI,

2000; TARNAWSKI et al., 2001).

No modelo de ligadura de piloro foi avaliada a atividade do EHA, FC e FAQ

sobre a secreção de ácido, uma das mais importantes funções do estômago.

Quando os mecanismos homeostáticos estão prejudicados, o volume e a acidez

gástrica podem aumentar desproporcionalmente, superando assim as defesas da

mucosa gástrica, levando a formação de úlceras gástricas (LAPA et al., 2008).

95

A via de administração no modelo de ligadura de piloro é a via intraduodenal,

que permite investigar as ações do extrato por via sistêmica, excluindo as interações

do contato direto com a mucosa gástrica. O EHA, FC e FAQ causa alterações no pH,

no volume gástrico e na concentração de íons hidrogênio, sugerindo que os

compostos presentes no extrato e frações possam estar atuando sobre a secreção

ácida gástrica. De acordo com Takeguchi et al (1983), os isotiacianatos, produtos de

degradação dos glicosinolatos, tem atividade antisecretória, inibindo a (H+-K+)-

ATPase in vitro. Estes produtos de degradação podem estar atuando in vivo, pois os

mesmos podem estar presentes FAQ, e esta apresentou uma atividade

antisecretória ácida mais pronunciada do que a FC.

Após a verificação da redução na secreção ácida, um agente agressor da

mucosa, a produção de muco foi investigada. O muco é um dos fatores protetores

da mucosa gástrica, criando uma barreira física contra bactérias, ácidos, toxinas,

além de agir como um lubrificante, reduzindo o atrito e os efeitos abrasivos sobre a

mucosa. O muco tem a capacidade de sequestrar radicais livres, devido a sua

composição glicoprotéica (MOJZIS, HEGEDUSOVA, MIROSSAY, 2000; WALLACE

et al., 2000; NAM et al., 2005; WALLACE, 2007).

A proteção criada pelo muco ligado ao tecido pode ser observada devido a

formação de mucopolissacarídeos solúveis. Estes mucopolissacarídeos são

quantificados de acordo com sua ligação ao Alcian Blue, um corante específico para

mucinas ácidas (LAPA et al., 2008).

Os resultados obtidos neste modelo demonstram que além de diminuir a

secreção ácida gástrica, os componentes presentes no EHA, FC e FAQ estimulam a

produção de muco gástrico, ou seja, favorecem o aparecimento dos fatores

defensivos da mucosa, que pode estar relacionado com o aumento do potencial

antioxidante do muco (HAMAISHI, KOJIMA, ITO, 2006).

Visto que o EHA, FC e FAQ apresentam ação gastroprotetora, provavelmente

por atuar aumentando os mecanismos antioxidantes, deste modo, testes na tentativa

de elucidação do mecanismo de ação (L-NAME e NEM) foram realizados.

O óxido nítrico (NO) tem um importante papel na modulação da defesa da

mucosa gástrica, como: regulador na secreção de muco, vasodilatador produzindo

aumento de fluxo sanguíneo local, inibidor da agregação de neutrófilo e auxiliando

no processo de cicatrização da úlcera gástrica (LAPA et al., 2008).

O bloqueio da síntese de NO aumenta o estresse oxidativo, levando a

96

ativação de mastócitos, que se encontraram em grande quantidade no trato

digestório. O NO exerce seus efeitos atuando sobre a guanilato ciclase, na via da

guanosina-3’,5’-monofosfato cíclico (GMPc) ou atuando diretamente sobre canais de

potássio dependentes de cálcio, gerando hiperpolarização nas células endoteliais

dos vasos, resultando em vasodilatação. Essas células são responsáveis pela

liberação de mediadores que causam o aumento da permeabilidade epitelial. Esses

eventos são rapidamente revertidos pela liberação de NO (ODABASOGLU et al.,

2006; LAPA et al., 2008).

Na mucosa gástrica, o NO é produzido pela enzima óxido nítrico sintase

constitutiva e endotelial (NOSc e NOSe), que mantém a integridade da mucosa. O L-

NAME bloqueia a produção de NO através da inibição da enzima NOS. Como a

gastroproteção do EHA, FC e FAQ é revertida com o pré-tratamento com L-NAME,

estes resultados sugerem que a atividade seja dependente de NO (LAPA et al.,

2008).

Os grupamentos sulfidrílicos são compostos que contribuem para a

integridade da mucosa, com a finalidade básica de reduzir a formação de radicais

livres derivados de oxigênio relacionando-se com proteção celular. São elementos

gastroprotetores capazes de manter o fluxo sanguíneo possibilitando a redução da

lesão tecidual (CHATTOPADHYAY et al., 2006; LAPA et al., 2008).

A redução dos níveis normais de grupos sulfidrílicos torna a mucosa gástrica

susceptível ao ataque de substâncias ulcerogênicas, afetando o mecanismo

defensivo da mucosa. A N-etilmaleimida (NEM), é uma substância capaz de quelar

as pontes de dissulfeto que são responsáveis pela conformação da barreira mucosa,

promovido pelos compostos sulfidrílicos (LAPA et al., 2008).

O NEM, ao diminuir a concentração de SH na mucosa, potencializa os danos

gástricos induzidos pelo etanol, danos estes associados à diminuição significativa

nos níveis de grupos sulfidrílicos, especialmente glutationa reduzida (GSH), em

animais de experimentação e no homem. Essa redução pode ser devida à oxidação

da glutationa, após a geração de metabólitos tóxicos, ou devido à ligação da

glutationa ao acetaldeído gerado através da oxidação de agentes necrotizantes pela

atividade gástrica da enzima álcool desidrogenase (DEVI et al., 2007; LAPA et al.,

2008).

O pré-tramento com NEM mostrou que o EHA, FC e FAQ pode possuir

atividade gastroprotetora dependente de GSH.

97

Em parte, os metabólitos presentes no EHA exercem atividade semelhante

aos fármacos utilizados na clínica (cimetidina e omeprazol), interferindo na secreção

de ácido. Em parte, atua interferindo nos mecanismos citoprotetores, aumentando a

secreção de muco (mecanismo de ação da carbenoxolona). Tanto nos modelos

agudos quanto nos modelos crônicos, os mecanismos gastroprotetores podem

apresentar mecanismos de ação semelhantes. A atividade antioxidante foi

responsável pelos efeitos gastroprotetores in vivo, mostrando-se importante apontar

os compostos presentes no extrato e responsáveis pela atividade farmacológica.

Esses dados colaboram para a comprovação dos dados etnofarmacológicos, sendo

necessários estudos in vitro, na determinação das enzimas e vias envolvidas nos

processos gastroprotetores.

98

7 CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos nos modelos experimentais utilizados e

baseando-se nos relatos da literatura, pode-se concluir que:

1. O EHA apresenta atividade gastroprotetora, confirmando seu uso na

medicina popular e reforçando seu papel como alimento funcional.

2. O perfil fitoquímico apresentado pela planta demonstra que o EHA

pode conter compostos fenólicos, flavonóides glicosilados e glicosinolatos. As SFC

(6) e a SFAQ (6) apresentam bom grau de pureza e serão submetidos a elucidação

estrutural.

3. A CGAR-DIC demonstra que a FC apresenta substâncias que podem,

em parte, estarem ligadas a atividade gastroprotetora.

4. No modelo de úlceras induzidas por etanol/HCl, todas as frações

apresentam pequena atividade gastroprotetora, porém as FC e FAQ são mais

efetivas.

5. A gastroproteção observada no tratamento EHA é mais pronunciada do

que a observada nos tratamentos com FC, FAQ, omeprazol e cimetidina, nos

modelos de úlceras agudas induzidas por etanol/HCl e indometacina/betanecol.

6. Das subfrações obtidas através de cromatografia de coluna aberta das

FC e FAQ, a SFC (6) e a SFAQ (6) apresentam atividade protetora gástrica no

modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

7. O EHA atua sobre a secreção ácida e sobre a secreção de muco, bem

como suas frações (FC e FAQ), sendo porém, a FAQ mais efetiva que a FC.

8. O estudo crônico permitiu avaliar o efeito curativo do EHA. O extrato

99

tem a capacidade de regenerar o dano produzido pelo ácido acético, apresentando

organização de todas as estruturas celulares responsáveis pela integridade da

mucosa e do tecido muscular do estômago.

9. Avaliando-se o papel do NO e dos compostos sulfidrilas, pode-se

sugerir que a atividade gastroprotetora esteja ligada a fatores antioxidantes.

10. De acordo com os resultados observados, os compostos podem

exercer seu efeito farmacológico por sinergismo. Além disso, os mecanismos de

ação podem estar relacionados com fatores antioxidantes (participação do NO e

GSH), fatores anti-inflamatórios (participação da PGE2) ou a inibição da secreção

ácida (bloqueio da (H+-K+)-ATPase).

11. Estudos posteriores in vitro e in vivo devem ser realizados para a

determinação das enzimas envolvidas nos processos antioxidantes e anti-

inflamatórios relacionados com a gastroproteção.

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ANEXO A

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