UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ O PAPEL DAS CININAS E A ...

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

ANA JULIA VON BORELL DU VERNAY FRANÇA

O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE

TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS

L929

Itajaí

2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

ANA JULIA VON BORELL DU VERNAY FRANÇA



L929

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão Co-orientador: Prof. Dr. José Roberto Santin

Itajaí, Maio de 2015

Dedico ao meu ao pai Helcio von Borel du Vernay o qual me ensinou logo cedo que a vida dependia de mim e de tudo que eu pudesse carregar comigo mesma. Ajudou-me a entender a importância de se criar raízes fortes para fortalecer os frutos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço profundamente às minhas filhas; Laura e Clara as quais mudaram de

escola, mudaram suas rotinas, me acompanharam e me apoiaram em todos os

momentos deste trabalho. Doaram espontaneamente o tempo e os momentos

que seriam delas para que eu pudesse chegar até o fim.

Agradeço ao meu marido, Orlando, pelo incansável apoio emocional me

mantendo no centro para que o objetivo fosse concluído. Foi pai, mãe,

conselheiro e revisor de todos os cálculos de diluição deste trabalho.

À minha mãe, irmãos e a querida Laís pelas constantes palavras de apoio.

À minha colega Gislaine “Gi” pelo companheirismo de as horas, por treinar-me

e passar todo o seu conhecimento para que eu pudesse trabalhar com o

cultivo celular.

Á técnica Viviane pela amizade, força e por cuidar para que tudo estivesse

sempre impecável no laboratório de cultivo.

Aos colegas de laboratório pelo apoio, amizade conquistada e pela constante

troca de conhecimento.

Às professoras Caroline Valente e Kathryn pelo conhecimento e ajuda

prestada.

À minha orientadora Nara por transmitir mesmo de longe a confiança e o

conhecimento necessário para que eu chegasse até aqui.

Ao meu co-orientador José Roberto, por aceitar o desafio no meio do caminho,

por ter estado sempre disponível, transmitindo o seu conhecimento e me

apoiando nos momentos mais difíceis.



L929

Ana Júlia von Borell du Vernay França

Maio/2015 Orientadora: Nara Lins Meira Quintão, Doutora.

Co-orientador: José Roberto Santin, Doutor.

Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas

Número de Páginas: 83

A barreira da pele desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do ser humano e

o processo de reparo do tecido cutâneo é considerado um fator crítico. Embora o papel de cininas como

um importante mediador da inflamação seja bem descrito, o seu envolvimento no reparo tecidual ainda

não foi totalmente explorado. A proliferação de fibroblastos é um evento chave na cicatrização do

tecido, uma vez que participa diretamente na formação de tecido de granulação. Modelos in vitro para

a avaliação da cicatrização por proliferação de fibroblastos são amplamente utilizados, no entanto eles

não foram avaliados na presença de fatores inflamatórios importantes, tais como as citocinas e as

cininas. Na tentativa de aproximar o modelo in vitro das condições reais de lesão cutânea com a

evidência de um processo inflamatório, este estudo avalia a co-participação do TNF e das cininas sobre

a proliferação de fibroblastos através do modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de

fibroblastos L929 com o objetivo de propor uma nova metodologia para estudo in vitro de cicatrização

cutânea. Para este estudo realizou-se um rasgo em cultura de monocamada de fibroblastos murino

(L929), na presença ou ausência de TNF (droga utilizada para gerar o estresse celular semelhante ao

processo inflamatório inicial) e / ou agonistas do receptor de cinina B1 e B2. Os resultados obtidos

inicialmente com TNF demonstram que esta citocina foi capaz de aumentar a proliferação celular, a

qual foi bloqueada com o co-tratamento com o respectivo anticorpo, sugerindo a importância dos

estímulos inflamatórios para o processo de regeneração tecidual. As cininas parecem potencializar este

efeito proliferativo exercido pelo TNF, principalmente através da ativação do receptor B2. No entanto,

para confirmar esta hipótese novos experimentos são necessários para analisar a expressão dos

respectivos receptores em células tratadas ou não com TNF, BK e DABK. Os resultados obtidos no

presente trabalho em conjunto com dados da literatura, mostraram que esta estratégia é uma

ferramenta disponível para a investigação do processo de cicatrização in vitro.

Palavras-chave: Cininas. Fibroblastos. Receptor B1 e B2 para cininas. Reparo

tecidual.

THE ROLE OF A KININS AND THE INFLUENCE OF TUMOR

NECROSIS FACTOR ALFA (TNF-α) ON IN VITRO PROLIFERATION

OF L929 FIBROBLASTS

Ana Júlia von Borell du Vernay França

May /2015

Supervisor: Nara Lins Meira Quintão, PhD. Co-Supervisor: José Roberto Santin, PhD.

Area of Concentration: Natural products and bioactive synthetic substances

Number of pages: 83

The skin barrier plays an important role in maintaining homeostasis of the human being, and the cutaneous tissue repair process is considered a critical factor. Although the role of kinins as important mediators of inflammation is well described, their involvement in tissue repair has not been fully explored. Fibroblast proliferation is a key event in healing, as it participates directly in the formation of granulation tissue. In vitro models for the evaluation of healing by fibroblast proliferation are widely used, however, they have not been evaluated in the presence of important inflammatory factors, such as cytokines and kinins. Seeking to bring the in vitro model closer to the real conditions of skin injury with the evidence of inflammatory process, this study evaluates the effect of kinins on the proliferation of murine fibroblasts, stimulated or not by tumor necrosis factor (TNF), with the aim of proposing a new methodology for in vitro wound healing study. The Scratch Assay was used, in a monolayer culture of murine fibroblasts (L929), in the presence or absence of TNF (drug used to generate cellular stress similar to the initial inflammatory process) and/or the kinin receptor agonists B1 and B2. Based on the results obtained with the cytokine TNF, which was capable of increasing the cell proliferation that was successfully blocked by co-treatment with the respective antibody, the importance of inflammatory stimuli for tissue regeneration is suggested. Kinins appear to potentiate this proliferative effect exerted by TNF, mainly through the activation of the B2 kinin receptor. However, to confirm this hypothesis, new experiments are necessary, to analyze the respective receptor expression in cells treated or not with TNF, BK and DABK. These results, together with the literature data, show this strategy as an available tool for the in vitro healing investigation. Keywords: kinins, fibroblasts, B1 and B2 receptors, wound healing

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Camadas da pele

19

Figura 2 Anatomia da pele humana e efetores celulares

21

Figura 3 Linha do tempo de migração de populações de células imunitárias correlacionadas com as fases de cicatrização de feridas

23

Figura 4 Cascata de formação das Cininas

31

Figura 5 Modelo de placa com 24 poços para cultivo celular

38

Figura 6 Modelo de Scratch wound “in vitro”

39

Figura 7 Esquema do procedimento In vitro de “Scratch model”

39

Figura 8 Esquema de tratamento das células com TNF em diferentes

tempos de contato

40

Figura 9 Esquema de tratamento das células com agonista receptor B2 (BK) em diferentes concentrações

41

Figura 10 Esquema de tratamento das células com agonista receptor B1 (DABK) em diferentes concentrações.

41

Figura 11 Esquema de tratamento com o agonista do receptor B2, BK, em células pré tratadas com TNF

42

Figura 12 Esquema do tratamento com o agonista do receptor B1, DABK, em células pré tratadas com TNF.

43

Figura 13 Esquema do tratamento com os antagonistas do receptor B1 e B2, anticorpo anti TNF e PDTC, administrados após o pré tratamento com TNF

44

Figura 14 Esquema do tratamento com os agonistas do receptor B1 e B2 pré tratadas ou não com o TNF e coadministradas ou não com o anticorpo anti TNF

45

Figura 15 Imagens da monocamada de fibroblastos L929 antes e após o ensaio de Scratch

47

Figura 16 Efeito do tratamento com TNF sobre a proliferação de fibroblastos quando incubados por diferentes tempos com TNF

48

Figura 17 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, sem o estímulo do pré-tratamento com o TNF

50

Figura 18 Efeitos do tratamento com DABK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, sem o estímulo do pré tratamento com o TNF

51

Figura 19 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, com o estímulo do pré-tratamento com o TNF

52

Figura 20 Efeitos do tratamento com DABK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, com pré estímulo do TNF

53

Figura 21 Imagem da proliferação celular com tratamento de TNF e dos agonistas dos receptores cininérgicos , BK e DABK, sem e com o pré estímulo do TNF

54

Figura 22 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF

56

Figura 23 Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF na proliferação de fibroblastos L929

58

Figura 24 Imagem do efeito do tratamento as células com o anticorpo anti TNF em coadministração com TNF e desafiadas com os agonistas BK e DABK com sem a presença dos antagonistas cininérgicos HOE-140 e DALBK

59

LISTA DE ABREVIATURAS

α-SMA - α-actina de músculo liso

AMPc - Monofosfato cíclico de adenosina

ANOVA - Análise de variância

APP - Aminopeptidase P

BK - Bradicinina

COM - carboxipeptidases M cinenase I de membrana

CPN - carboxipeptidases N cinenase I do plasma

DABK - des-Arg9-Bradicinina

DALBK - Leu8-des-Arg9-Bradicinina

DC - Células dendrítica

DMEM - Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DMSO - Dimetilsulfóxido

EGF - Fator de crescimento epidérmico

ECA - Cininase II, enzima conversora de angiotensina I

FGF - Fator de crescimento fibroblástico

ERK 1/2 - Kinase regulada por sinais intracelulares

GMPC - Monofosfato cíclico de guanosina

HMWK - Cininogênio de alto peso molecular

IL-1α, IL-1β, IL- 10 Interleucinas

LMWK - Cininogênio de baixo peso molecular

LPS - Lipopolissacarídeo de membrana

Lys-BK - Calidina

MAPK - Proteínas quinases ativadas por mitógenos

MMP-1-13; MT1 Metalaproteinases

NF- kB - Fator de transcrição nuclear Kappa B

NEP - Endopeptidase neural

NO - Óxido nítrico

RNAm - RNA mensageiro

PAF - Fator de agregação plaquetária

PDTC - Pirrolidina ditiocarbamato

PBS - Solução de tampão fosfato

PDGF - Fator de crescimento derivado das plaquetas

PGE2 Prostaglandina E2 PKC - Proteína quinase C

SFB – Soro fetal bovino

TGF-β - Fator de crescimento transformador β

TGF-α - Fator de crescimento transformador α

TNF - Fator de necrose tumoral

TNFRI - Receptor I de fator de necrose tumoral

TNFRII - Receptor II de fator de necrose tumoral

VEGF - Fator de crescimento de células endoteliais

SUMÁRIO

DADOS DE IDENTIFICAÇÃO

1 INTRODUÇÂO.............................................................................. 14

2 OBJETIVOS................................................................................... 17

2.1 Objetivo Geral................................................................................ 17

2.2 Objetivos Específicos..................................................................... 17

3 REVISÃO DA LITERATURA......................................................... 18

3.1 Anatomia e fisiologia da pele......................................................... 18

3.2 Fisiologia e farmacologia do reparo tecidual ................................ 22

3.3 Cininas .......................................................................................... 29

4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................. 37

4.1 Materiais........................................................................................ 37

4.1.1 Linhagem celular ...................................................................... 37

4.1.2 Condições de cultivo...................................................................... 37

4.2 Métodos.......................................................................................... 37

4.2.1 Avaliação da proliferação celular .................................................. 37

4.2.1.1 Preparo da placa de cultivo........................................................... 37

4.2.2 Ensaio de Scratch in vitro.............................................................. 38

4.2.3 Avaliação da proliferação celular em fibroblastos tratados com

TNF.............................................................................................

40

4.2.4 Avaliação do papel das cininas na proliferação celular em

fibroblastos ....................................................................................

41

4.2.5 Avaliação do papel das cininas na proliferação celular em

fibroblastos pré tratados com TNF.............................................

42

4.2.6 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de

fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré

estímulo do TNF....................................................................

43

4.2.7 Avaliação do efeito das cininas na proliferação celular em

fibroblastos pré tratados ou não com TNF em coadministração

ou não do anticorpo anti TNF.......................

45

4.3 Análise de dados e apresentação dos resultados......................... 46

4.4 Análise estatística.......................................................................... 47

5.0 RESULTADOS.............................................................................. 48

5.1 Efeito do TNF na proliferação de fibroblastos ............................ 48

5.2 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, com e sem estímulo do TNF .........

49

5.2.1. Influência da administração de agonistas do receptor de cininas na proliferação de fibroblastos L929 quando administrados sozinhos......................................................................................

49

5.2.2 Influência da administração de agonistas do receptor de cininas na proliferação de fibroblastos L929 quando administrados após células pré tratadas com TNF................................................

51

5.2.3 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF

55

5.2.4 Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF na proliferação de fibroblastos L929...........................................

57

6 DISCUSSÃO................................................................................ 60

7 CONCLUSÕES 72

REFERÊNCIAS............................................................................ 74

14

1 INTRODUÇÃO

A pele é um órgão que apresenta múltiplas funções, atuando principalmente

como barreira contra agentes patogênicos, prevenindo a desidratação e mantendo-se

como fronteira entre o meio interno e externo do organismo. A barreira cutânea

desempenha importante papel na manutenção da homeostase do organismo, desta

forma o processo de reparo tecidual cutâneo é um fator crítico relacionado à sua

sobrevivência (LAU, 2009).

Danos ao tecido epitelial desencadeiam uma série de eventos que envolvem a

quimiotaxia de células inflamatórias, divisão celular, neovascularização e síntese de

matriz extracelular. A ação coordenada destes eventos culmina com a formação e

remodelação do tecido lesado (ENOCH; LEAPER, 2008).

Muitos tipos celulares, incluindo macrófagos, neutrófilos, plaquetas, células

endoteliais, queratinócitos e fibroblastos contribuem para a cicatrização de feridas.

Tendo início imediatamente após a lesão, a resposta inflamatória leva à secreção de

uma variedade de fatores de crescimento e citocinas, que comandam os movimentos

celulares e teciduais necessários para o reparo (MONACO; LAWRENCE, 2003).

O processo de reparo tecidual é classicamente organizado em uma progressão

de etapas sobrepostas e ao avalia-lo desta forma, como uma sequência de eventos

distintos, pode-se propor que a inflamação se caracterize como uma fase circunscrita,

o que sugere o fim de seus efeitos com o início da próxima etapa. Compreensões mais

atuais, no entanto, sugerem que a inflamação persista por todas as fases da

cicatrização, estimulando e coordenando as funções essenciais do processo, através

da produção e controle de seus mediadores. Embora a inflamação seja reconhecida

como um dos primeiros eventos, a compreensão de sua importância e seu papel

regulador neste processo ainda é gradual (HENRY; GARNER, 2003, YUSSOF et al.,

2012)

Estudos experimentais relacionam a inflamação como um processo essencial

para o restabelecimento da homeostase cutânea após uma lesão. Ao longo dos

últimos anos vários trabalhos têm demonstrado a ação de diferentes células e

mediadores químicos no mecanismo de reparo tecidual. No entanto, vários estudos

também vêm discutindo o papel da inflamação no aumento do tempo de cicatrização

e na formação de cicatrizes. Desta forma, a compreensão mais detalhada dos

15

mecanismos que controlam a resposta inflamatória e o processo de resolução da

inflamação pode ser útil para avanços na terapia de reparação de tecidos (EMING;

KRIEG; DAVIDSON, 2007, KYRITSIS et al.,2012, SATISH; KATHJU, 2010)

O início da cascata inflamatória se dá geralmente logo após a lesão tecidual

pela liberação do fator de necrose tumoral (TNF), uma citocina pró-inflamatória

produzida por macrófagos e neutrófilos ativados em resposta a patógenos e a outros

estímulos nocivos. Esta citocina exerce funções pleiotrópicas em condições

fisiológicas e patológicas ao ligar-se aos seus receptores tipo I (TNFRI) ou tipo II

(TNFRII) (PARK; BARBUL, 2004).

O TNF tem demonstrado participar diretamente da angiogênese e induzir a

síntese do fator de crescimento transformador beta (TGF-β), podendo interferir na

proliferação de fibroblastos, um componente essencial no processo de cicatrização

normal (FAHEY et al., 1990). Além disso, induz a biossíntese de vários outros

mediadores inflamatórios, incluindo a interleucina 1 (IL-1) e as cininas, que em sinergia

podem aumentar os seus efeitos (FAHEY et al., 1990; SOUZA et al., 2013).

Schremmer-Danninger e colaboradores (2004) descreveram a ação das cininas

nos processos pró-inflamatórios e de resolução. As cininas são peptídeos que

exercem atividade mitogênica, ou seja, proliferativa em diferentes sistemas tissulares

(REGOLI; BARABÉ, 1980). Em condições normais, formas imunoreativas de

cininogênio já foram localizadas no espaço intersticial entre os queratinócitos, sendo

provável o conceito de que as cininas são produzidas por estas células (YAMAMOTO

et al., 1987). A expressão de ambos os receptores cininérgicos B1 e B2 já foi

evidenciada no tecido cutâneo em condições normais, bem como em biopsia de pele

humana (SCHREMMER- DANNINGER et al., 1999).

Apesar do papel das cininas como importantes mediadores da inflamação ser

amplamente descrito, seu papel no reparo tecidual cutâneo ainda não foi

completamente explorado. Tendo em vista que a migração e proliferação de

fibroblastos e remodelação tecidual são evento centrais no processo de cicatrização

e que o TNF e mediadores inflamatórios como as cininas já demonstraram atuar direta

ou indiretamentente nesta proliferação celular, este estudo teve como objetivo avaliar

a co-participação do TNF e das cininas sobre a proliferação de fibroblastos através do

modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de fibroblastos L929, afim de

aproximar o modelo “in vitro “das condições reais de lesão cutânea com presença de

um processo inflamatório.

http://www.sciencemag.org/search?author1=Nikos+Kyritsis&sortspec=date&submit=Submit

17

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar a co-participação do TNF e das cininas sobre a proliferação de

fibroblastos através do modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de

fibroblastos L929, afim de obter um modelo “in vitro” com características próximas das

alterações inflamatórias reais de lesões cutâneas.

2.2 Objetivos Específicos: 1. Padronizar o modelo de reparo tecidual in vitro descrito como “scratch assay” em

monocamada de fibroblastos murino L929 estimulados com TNF.

2. Avaliar o envolvimento dos receptores cininérgicos na proliferação de fibroblastos

L929 induzida pelo TNF através do emprego de anatagonistas seletivos para estes

receptores.

3. Avaliar o papel dos receptores B1 e B2 das cininas na proliferação de fibroblastos

pré-tratados ou não com TNF por meio da utilização de agonistas e antagonistas

seletivos.

4. Avaliar a co-participação do TNF nos efeitos promovidos pelas cninas sobre a

proliferação de fibroblastos L929 através do emprego do anticorpo anti TNF.

18

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Anatomia e fisiologia da pele

A pele corresponde a 15% do peso corporal, sendo assim considerada o maior

órgão do ser humano. Por recobrir toda a área corporal, envolvendo-o por inteiro e

delimitando o organismo, a mesma confere proteção e interação com o meio externo.

Este órgão forma uma barreira física contra agressões do meio externo para com os

demais órgãos e constituintes do corpo humano assumindo assim a função maior e

vital, a conservação da homeostasia. Para desempenhar tal papel, apresenta

características dinâmicas, sofrendo alterações constantes, sendo dotada de

capacidade renovadora e de reparação (HARRIS, 2009).

A pele é composta por duas camadas principais; a epiderme e a derme. A

epiderme é o compartimento exterior, sendo composta por quatro diferentes camadas:

estrato basal, estrato espinhoso, estrato granuloso e estrato córneo (Figura 1). O

estrato basal é o mais profundo, responsável pela constante renovação das células

da epiderme. Contém uma linha de células indiferenciadas conhecidas como

queratinócitos basais, os quais se dividem com frequência. Estes se diferenciam e

passam para o estrato seguinte, o espinhoso, para iniciar um processo de maturação,

mas também se dividem para repor a camada basal. As células que se movem no

estrato espinhoso modificam sua morfologia e passam de colunar para a forma

poligonal e começam a sintetizar queratina. Na sequência, em direção a superfície, é

formada a camada granulosa composta de queratinócitos do estrato granuloso,

caracterizados por manchas escuras do material citoplasmático e pela intensa

produção de queratina e lipídios. O estrato córneo, como o último produto dos

queratinócitos, é o mais externo da epiderme, e reconhecidamente, o principal

responsável pela função de barreira protetora da pele. As células que compõe esta

camada são conhecidas como corneócitos, células derivadas de queratinócitos mortos

desprovidos de organelas. Os corneócitos são os responsáveis por barrar diversos

agentes tóxicos, como por exemplo substâncias químicas e microrganismos, atuando

desta forma como a primeira barreira do sistema imune inato. Ainda, os mesmos

atuam impedindo a desidratação da pele (NESTLE; MEGLIO; QIN; NICKOLOFF,

2009, PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008, GNIADECKI, 1998).

19

Figura 1 – Camadas da pele

A pele humana apresenta uma epiderme espessa com várias camadas de células que se diferenciam formando seus estrato. Abaixo da epiderme está localizada a derme uma camada de tecido conjuntivo caracterizada pelas projeções das cristas epidérmicas, observa-se a presença de glândula sebácea, vasos linfáticos e sanguíneos assim como células do sistema imune como os macrófagos. Fonte: Adaptado de Pasparakis; Haase; Nestle, (2014).

Adicionalmente, a epiderme possui células especializadas, como melanócitos,

responsáveis pela produção de melanina, e células de Langerhans, responsáveis pela

imunovigilância do tecido cutâneo, sendo assim as principais células residentes do

sistema imunológico da pele (Figura 2) (PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008;

NESTLE; MEGLIO; QIN; NICKOLOFF, 2009).

A pele saudável, além de se renovar normalmente como a maior parte dos

tecidos corporais, tem extraordinária capacidade de auto regeneração quando sofre

lesões. A constante renovação da epiderme ocorre por meio de um processo de ciclo

celular controlado, no qual se formam continuamente novos queratinócitos. A

proliferação dos queratinócitos é regulada por diferentes substâncias como fatores de

crescimento, vitaminas lipossolúveis e seus derivados, ceramidas, neuropeptídeos,

esteróides, hormônios peptídicos e mediadores inflamatórios (GNIADECKI, 1998).

Epiderme

Estrato córneo

Estrato granuloso

Estrato espinhoso

Estrato Basal

Derme Glândula sebácea

Vaso linfático

Vaso sanguíneo

Macrófago

Tecido adiposo

20

Quando ocorre uma lesão na camada epidérmica, as células superficiais

sinalizam às células mais profundas a sua perda de contato com células vizinhas

destruídas. A sinalização gerada estimula as células da camada basal a proliferarem

e se diferenciarem, culminando com o reparo da área lesionada (HERSON, 2004).

Outra importante estrutura da pele é a derme, a qual está localizada abaixo da

epiderme, repousando sobre o tecido subcutâneo. A derme, é formada por uma

camada de tecido conjuntivo associada a um sistema integrado de estruturas fibrosas,

filamentosas e amorfas onde estão acomodados os vasos sanguíneos, linfáticos,

terminações nervosas e anexos cutâneos (glândulas sebáceas, sudoríparas, folículos

pilosos) originados do aprofundamento da epiderme na derme (FREINKEL;

WOODLEY, 2001). Ainda, a derme é importante para a nutrição da epiderme e para

remoção de resíduos, uma vez que a epiderme é uma camada avascular (HILINSK;

MEYERS, 2013).

Uma extensa rede de comunicação entre células epiteliais da epiderme, tecido

conjuntivo da derme e células do sistema imune regula as respostas imunológicas da

pele, a qual é responsável por garantir a defesa do hospedeiro, mantendo ou

restaurando a homeostase do tecido (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014)

21

Figura 2 – Anatomia da pele humana e efetores celulares

A estrutura da pele reflete a complexidade das suas funções como uma barreira protetora para manter a temperatura do corpo, na coleta de informações sensoriais do ambiente e no papel ativo no sistema imunológico. A epiderme é composta de 4 estratos sendo a camada mais externa, o estrato córneo, responsável pela função de barreira da pele. As células especializadas na epiderme incluem os melanócitos, que produzem o pigmento (melanina) e células de Langerhans. Raras células T podem ser encontrada no estrato basal e camada espinhosa. A derme é composta de colágeno, tecido elástico e fibras reticulares. A derme contém muitas células especializadas, como células dendríticas (DC) subconjuntos, incluindo DCs dérmicos. Além disso, macrófagos, mastócitos e fibroblastos estão presentes. Vasos sanguíneos e linfáticos e os nervos (não mostrados na figura) também estão presentes em toda a derme. Fonte: Adaptado de Nestle; Meglio; Qin; Nickoloff (2009).

A derme é rica em matriz extracelular e contém células do estroma, como

fibroblastos, fibrócitos e células estruturais dos vasos sanguíneos e linfáticos. As

células imunes residem e trafegam na derme, são dinâmicas e sofrem alterações

acentuadas durante a resposta imune, como pode ser visualizado na Figura 1

(PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014).

Devido seu posicionamento estratégico na interface entre o meio externo e

interno, os queratinócitos recebem sinais a partir do ambiente e são capazes de

transmiti-los para células do sistema imunológico presentes na pele. Esta

comunicação é realizada a partir da expressão de receptores gerados por meio da

produção de citocinas e quimiocinas, como por exemplo, as interleucinas IL-1, IL-10,

IL-20 e o TNF (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014).

22

Os apêndices epidérmicos, incluindo glândulas sebáceas, glândulas

sudoríparas, glândulas apócrinas e folículos pilosos, desenvolvem-se a partir da

epiderme e se aprofundam na derme. Eles estão alinhados com células epiteliais que

possuem potencial para a divisão e diferenciação, desta forma são uma importante

fonte de células para a reepitelização quando a epiderme é destruída. A destruição

epidermémica pode ocorrer por queimaduras de espessura parcial e traumática, em

peeling químico, dermo abrasão ou por outros processos esfoliativos (HILINSK;

MEYERS, 2013).

3.2 Fisiologia e farmacologia do reparo tecidual

Uma lesão ou ferimento é gerado através da ruptura na integridade do tecido

epitelial da pele e pode estar acompanhado de uma perturbação na estrutura e função

do tecido normal. Esta perturbação pode ser gerada por um trauma, queimadura ou

ainda por uma contusão, laceração ou abrasão. Esta alteração deve ser restaurada

rapidamente uma vez que a integridade da pele é crucial para a manutenção da

homeostasia do organismo (PEREIRA; CURI, 2005; ENOCH; LEAPER, 2008;

BALBINO; MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).

O reparo tecidual é um processo dinâmico que ocorre em uma sequência

preestabelecida de fases que não se excluem, pelo contrário, se somam. Este

processo é resultante da interação complexa entre células da epiderme e da derme,

proteínas da matriz e do plasma e angiogênese controlada (LAU et al.,2009).

Logo após uma lesão, várias vias intra e intercelulares devem ser ativadas e

coordenadas para que a integridade do tecido e a homeostase seja restaurada. Os

componentes celulares do sistema imune, a cascata de coagulação do sangue e as

vias inflamatórias são ativadas, este processo é um dos mais complexos que ocorrem

durante a vida humana (MARTIN, 1997; SINGER e CLARK, 1999, GURTNER et

al.,2008).

Com o objetivo de facilitar a compreensão deste evento dinâmico e complexo

diferentes etapas classificatórias do processo de reparo são utilizadas. Estas fases

são interdependentes em um determinado período de tempo as fases coincidem e

acontecem simultaneamente, permitindo assim o sucesso da cicatrização

(MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003).

23

Estas atividades ocorrem em cascata e estão correlacionadas com o

aparecimento de diferentes tipos celulares e a liberação de mediadores químicos

definindo os estágios ou fases do processo de reparo. Disparados pela lesão no tecido

cutâneo, o reparo tecidual envolve quatro fases; hemostasia, inflamação, proliferação

e remodelagem como pode-se acompanhar através da figura 3 (ENOCH; LEAPER,

2008).

Figura 3 - Linha do tempo de migração de populações de células imunitárias correlacionadas com as fases de cicatrização de feridas.

Fonte: Adaptado de PARK; BARBUL, (2004)

O processo inflamatório, etapa essencial para a manutenção da homeostasia,

tem papel primordial no reparo tecidual. Ocorre imediatamente após o surgimento do

trauma, caracterizado pela ruptura de vasos sanguíneos e extravasamento de seus

constituintes onde inicia a cascata de coagulação (MANDELBAUM; DI SANTIS;

MANDELBAUM, 2003). As plaquetas induzidas pela trombina sofrem degranulação

plaquetária liberando diversos fatores de crescimento, como o fator de crescimento

derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador-β e α (TGF-β;

24

TGF-α), fator de crescimento epidérmico (EGF), e o fator de crescimento de células

endoteliais (VEGF), além de glicoproteínas adesivas como a fibronectina e

trombospondina, que são importantes constituintes da matriz extracelular provisória.

O cruzamento de fibronectina fornece uma matriz preliminar, que alicerçará a

migração das seguintes células, fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos

responsáveis pelo desencadeamento do processo de reparo.

Além disto, a ativação da cascata de coagulação e do complemento,

juntamente com a liberação dos fatores de crescimento e ativação de células

parenquimatosas por células lesionadas, produzem numerosos mediadores

vasoativos e fatores quimiotáticos que auxiliam o recrutamento das células

inflamatórias para o sitio de lesão. Após a saída das plaquetas dos vasos, neutrófilos

e monócitos em resposta a fatores quimiotáticos migram para a região do trauma

(MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).

A primeira contribuição de mediadores circulantes para a formação do

gradiente quimiotáxico vem de proteínas plasmáticas como o Fator de Hageman e o

cininogênio de alto peso molecular. Da interação entre estas duas moléculas é gerada

a bradicinina que, além de propriedades vasoativas e nociceptivas é também indutora

da metabolização do ácido araquidônico para formação de eicosanóides. As

moléculas desta família possuem importância comprovada em vários fenômenos

inflamatórios e dentre eles a atividade quimiotáxica (HUYBRECHTS-GODIN et al.,

1979 apud BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).

Nesta etapa, leucócitos se infiltram na área da lesão e serão os principais

componentes celulares da resposta inflamatória. Estas células são efetoras no

combate de patógenos invasores e também estão envolvidas na degradação do tecido

lesionado. A compreensão do papel essencial da resposta inflamatória no reparo de

feridas irá fornecer estratégias para modular a remodelação do tecido (EMING;

KRIEG; DAVIDSON, 2008).

A força de arraste da corrente sanguínea sobre as células circulatórias está

diminuída devido à vasodilatação local e ainda estão expressas na superfície das

células endoteliais dos vasos não lesionados, moléculas de adesão que ancoram os

leucócitos circulantes e permitem a sua transmigração para o foco inflamatório

(BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).

Na fase final do processo inflamatório, os macrófagos se apresentam como

peças chave no processo regulatório do reparo, pois apresentam ação fagocitária,

25

degradando e removendo componentes de tecido conjuntivo danificado debridando a

ferida (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007,

COUTINHO-NETTO, 2009; ENOCH; LEAPER, 2008; MANDELBAUM; DI SANTIS;

MANDELBAUM, 2003)

O papel dos macrófagos é complexo, esta célula polivalente está envolvida em

muitos aspectos do reparo tecidual através das citocinas e fatores imunomoduladores

que produz. As citocinas produzidas por macrófagos estão envolvidas na

angiogênese, migração e proliferação de fibroblastos, na produção de colágeno e

possivelmente, na contração da ferida (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA;

TENNENBAUM, 2007, COUTINHO-NETTO, 2009; ENOCH; LEAPER, 2008;

MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003; MENDONÇA; MONACO,

LAWRENCE, 2003)

O processo de reparo tecidual é, em grande parte, regulado pela produção de

citocinas, que ordenam e controlam a ativação de genes responsáveis pelo controle

da migração, proliferação e atividade celular. As plaquetas e macrófagos são as

principais fontes celulares de citocinas, embora muitas outras células também as

produzam. O controle da liberação de citocinas é, em parte, regulado por outras

citocinas e pelas características do meio tecidual (MONACO; LAWRENCE, 2003)

Logo após a formação da lesão, as citocinas, interleucina 1 beta (IL-1β) e o

fator de necrose tumoral (TNF), são liberados a partir de células endoteliais rompidas,

queratinócitos e fibroblastos. A liberação destas citocinas, inicia a fase inflamatória,

promovendo o recrutamento de leucócitos para o local da ferida. O pico de

concentração destas, se da no primeiro dia do ferimento e serão sobrereguladas

durante a resposta inflamatória, o que é essencial no estímulo inflamatório e na

modulação do processo de regeneração tecidual e (FAHEY et al., 1990; MEDZHITOV,

2008; KANNO et al., 2013).

Estudos tem demostrado que o TNF participa diretamente da angiogênese e

induz a síntese do fator de crescimento transformador (TGF), assim como a

proliferação de fibroblastos, componentes essenciais no processo de cicatrização.

Ademais, induzem a biossíntese de vários outros mediadores inflamatórios, incluindo

IL-1β e as cininas, que em sinergia podem amplificar a resposta inflamatória (FAHEY

et al.,1990; HENRY; GARNER, 2003)

26

O TNF exerce uma variedade de efeitos biológicos incluindo a produção de

citocinas inflamatórias, regulação positiva de moléculas de adesão, proliferação,

diferenciação e morte celular (KAMATA et al., 2005)

Enquanto tais efeitos são mediados pelos dois receptores do TNF (TNF-RI e

TNF-RII), a morte celular induzida por esta citocina é mediada principalmente por TNF-

RI, ao ligar-se a este receptor o TNF é capaz de estimular a sinalização apoptótica,

resultando no recrutamento e ativação da caspase-8. A caspase-8 ativada por sua

vez, ativa caspases efetoras tais como a caspase-3 e-7, resultando em apoptose

(ALIKHANI et al., 2004, WALLACH et al., 2002)

Assim como, o TNF pode também induzir a apoptose celular, atuando como um

agente citotóxico (pró-apoptótico) em determinadas situações pode estimular a

proliferação de fibroblastos (SUGARMAN et al., 1985). .

Esta dicotomia se deve em parte à capacidade do TNF de atuar como ativador

do fator de transcrição nuclear -kB (NF-kB), responsável pela sobrevivência celular

através da ativação de genes pró sobrevivência e supressão de genes pró-

apoptóticos. Um elemento crítico na sinalização da apoptose induzida por TNF, é a

ativação robusta e prolongada de JNK, o que ocorre quando o NF-kB é inibido. No

entanto, os sinais específicos que podem desencadear esta citotoxicidade não são

completamente ilucidados (CHEN et al., 2007, KAMATA et al., 2005; SAKON et al,

2003).

Durante o processo de cicatrização a IL-1β é liberada por queratinócitos, tendo

um efeito parácrino, assim como age de forma autócrina interferindo na migração e

proliferação destas células epiteliais, e ainda, participam da proliferação de

fibroblastos (BARRIENTOS et al, 2008; RAJA, 2007).

Tal como a IL-1β, o TNF pode induzir a produção de fator de crescimento

fibroblástico (FGF), sugerindo ação indireta na promoção da reepitelização.

(BARRIENTOS et al, 2008).

O TNF, de forma isolada, demonstrou inibir a reepitelização de feridas, tendo

seus efeitos dependentes da concentração e duração da exposição, enfatizando a

importância do equilíbrio entre os sinais pró e anti-inflamatórios no controle da

cicatrização. Em baixas concentrações, o TNF pode promover a cicatrização de

feridas por agir indiretamente estimulando a inflamação e induzindo o aumento no

recrutamento de macrófagos, liberação de fatores de crescimento e proliferação de

fibroblastos. No entanto, em concentrações elevadas de TNF, especialmente durante

27

longos períodos, pode-se observar um efeito prejudicial sobre o processo de reparo,

já que tem a habilidade de suprimir a síntese de proteínas de matriz extracelular e

seus inibidores teciduais, enquanto aumenta a síntese de enzimas proteolíticas como

as metalaproteinases (MMPs), dentre as quais se pode destacar a MMP-1, MMP-2,

MMP-3, MMP-9, MMP-13, e de MT1-MMP. Ainda, elevados níveis de IL-1β

apresentam resposta similar à do TNF, em um processo de retroalimentação,

amplificando este sinal (AGREN et al.,1992; BARRIENTOS et al, 2008).

Quando o processo inflamatório se encerra, já existe uma matriz provisória com

a presença de moléculas com propriedades quimiotáxicas gerando condições

propícias e orientando o sentido da migração celular na região da lesão, servindo

então como alicerce para novas células se proliferarem (BALBINO; PEREIRA; CURI,

2005). A partir desta etapa, se inicia o processo de proliferação, fase responsável pelo

fechamento da lesão. Nesta etapa ocorre a formação do tecido de granulação, um

tecido conjuntivo ainda imaturo, que substituirá o tecido lesionado. Esta etapa

apresenta três importantes eventos: (1) reepitelização, (2) fibroplasia e (3)

angiogênese. (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007)

(1) A reepitelização inicia horas após a lesão, com a movimentação das

células epiteliais que provêm tanto da margem da ferida como dos

apêndices epidérmicos localizados no centro da lesão (MENDONÇA;

COUTINHO-NETTO, 2009; BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK;

SPIRA; TENNENBAUM, 2007).

(2) A fibroplasia se dá pela substituição da matriz extracelular provisória

por um tecido conjuntivo mais forte e elástico. Os fibroblastos são as

células responsáveis por este processo, produzindo proteínas da matriz

como a fibronectina, ácido hialurônico, proteoglicanas e posteriormente

o depósito de colágeno no tecido de granulação. Nesta fase sua

migração e ativação são intensificadas para produção de uma nova

matriz extracelular necessária ao crescimento celular. Após a influência

dos fatores de crescimento e demais mediadores inflamatórios,

derivados principalmente dos macrófagos, os fibroblastos são ativados

e migram das margens da ferida para o seu centro (BRAIMAN-

WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007;

MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). Fatores de

crescimento como PDGF, fator de crescimento fibroblástico básico,

28

TGF-α, IL-1 e TNF induzem a síntese de colágeno durante a fase

proliferativa e também na fase subsequente, a remodelagem. Para que

a fibroplasia ocorra de forma eficiente é necessário a formação de novos

vasos sanguíneos, que irão carrear oxigênio e nutrientes essenciais ao

metabolismo celular local (SINGER; CLARK, 1999; ENOCH; LEAPER,

2008).

(3) Na angiogênese, as células endoteliais migram para a área de lesão

e a produção de novos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes

é acompanhada, na maioria das vezes, por aumento da permeabilidade

vascular. As células endoteliais dos vasos neoformados se diferenciam

em células de revestimento e vasos neoformados assumem

características funcionais de capilares, a seguir ocorre proliferação das

células endoteliais, acesso para as células responsáveis pelas próximas

fases (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003).

Após a formação de um tecido de granulação prossegue-se para a última fase

do processo de reparo, a fase de remodelagem ou remodelamento, marcada pela

maturação dos elementos e alterações na matriz extracelular, o tecido de granulação

é enriquecido com fibras de colágeno e começa a adquirir a aparência de massa

fibrótica característica da cicatriz. Nesta fase ocorrem melhorias e reformulações nos

componentes das fibras de colágeno e na matriz extracelular, aumentando assim a

força de tensão e a diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. Cabe ressaltar

que este processo pode perdurar durante meses (CLARK, 1985).

O remodelamento da cicatriz envolve etapas sucessivas de produção, digestão

e orientação das fibrilas de colágeno. Repetições sucessivas da lise, nova síntese,

redirecionamento e religação formam fibras maiores de colágeno, resultando em uma

configuração mais regular da cicatriz. Isso aumenta a sua resistência devido à

organização das fibras acompanharem as forças mecânicas a que o tecido está sujeito

durante a atividade normal. A neovasculatura diminui, e tardiamente a cicatriz é

considerada avascular (CLARK, 1985).

A partir deste momento a cicatriz adquire sua máxima resistência à tração,

característica marcante desta fase do reparo é a grande e acelerada deposição de

colágeno na região da ferida. Assim, os sinalizadores de importância, de alguma

forma, devem exercer influência sobre os fibroblastos. Esta fase está sob influência

29

de grande número de citocinas incluindo; TNF, IL-1, TGF-β, PDGF e fator de

crescimento fibroblástico básico (ENOCH; LEAPER, 2008).

O TGF-β, um sinalizador com participação crucial nessa fase, é um mitógeno

importante de fibroblastos. Embora exercendo efeitos inibitórios sobre a proliferação

dos queratinócitos, é um potente estimulador da expressão de proteínas da matriz

extracelular e de integrinas (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).

Com a evolução do processo de cicatrização acentua-se a deposição de

colágeno e a maioria das células desaparecem (observa-se a apoptose de fibroblastos

e células endoteliais) formando finalmente a cicatriz avascular com baixo número de

células. Se o teor celular permanecer alto, poderá ocorrer a formação de cicatrizes

hipertróficas ou queloides (MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).

3.3 Cininas

As cininas fazem parte de uma importante família de peptídeos biologicamente

ativos, envolvidos em uma série de processos biológicos e fisiopatológicos. As ações

das cininas já foram confirmadas em diversas reações inflamatórias, além de

processos dolorosos e inflamação (KAPLAN; KUSUMAM; SILVERBERG, 2002).

Pesquisas têm demonstrado que estes peptídeos estão envolvidos em uma

variedade de fenômenos biológicos, como a regulação da pressão arterial sistêmica,

através das suas propriedades vasodilatadoras, contração da musculatura lisa

regulando o tônus vascular, além de modular o metabolismo da glicose (BHOOLA et

al., 1992; MARCEAU; REGOLI, 2004).

Os componentes do sistema cinina-calicreína vêm sendo estudados desde

1909, quando um componente hipotensivo foi encontrado no sistema urinário, sendo

posteriormente identificado como a calicreína tecidual. Em 1949, Rocha-e-Silva e

colaboradores isolaram o peptídeo bradicinina (BK) das globulinas plasmáticas

tratadas com tripsina ou protease provenientes do veneno da cobra Bothrops jararaca

(BHOOLA et al., 1992; MARCEAU e REGOLI, 2004).

As cininas pertencem a um grupo de peptídeos com 9 a 11 aminoácidos,

incluindo a BK, calidina (Lys- BK), T-cinina e seus metabólitos ativos e as des-Arg-

cininas. A cascata de formação das cininas compreende a ação de enzimas

proteolíticas denominadas calicreínas sobre um precursor, o cininogênio, encontrado

no plasma e nos tecidos. A calicreína plasmática cliva o cininogênio de alto peso

30

molecular (HMWK) liberando a BK, este processo encontra-se exacerbado em

respostas inflamatórias. Já a calicreína tecidual utiliza como substrato o cininogênio

de baixo peso molecular (LMWK), sintetizando a Calidina (Lys-BK) (MCLEAN et al,

2000).

Após o processo de síntese, as cininas são rapidamente metabolizadas por

diferentes grupos de peptidases. Há evidências de 4 metalopeptidases que são

responsáveis pelo metabolismo da BK: 1) enzima conversora de angiotensina I (ECA,

cininase II), 2) aminopeptidase P (APP), 3) endopeptidase neutral 24.11 (NEP,

neprilisina) e as 4) carboxipeptidases M (membrana) e N (plasma) (CPM, CPN;

cininases I). Em humanos, os níveis circulantes são regulados pela CPN. Entretanto,

nas superfícies endoteliais, principalmente no leito vascular pulmonar, a regulação é

realizada pela ECA, sendo este o principal mecanismo através do qual a BK e Lys-BK

são inativadas (BHOOLA et al., 1992; MARCEAU; REGOLI, 2004; REGOLI; BARABÉ,

1980).

As principais enzimas que degradam a bradicinina são as cininases I e II. A

cininase II, exerce sua ação através da remoção do dipeptídeo da porção C-terminal

da bradicinina ou calidina ocasionando sua total inativação. Já a atividade da cininase

I apresenta uma importância particular, uma vez que é a responsável pela geração de

metabólitos ativos das cininas, a des-Arg9 bradicinina (DABK) eu des-arg10 calidina,

através da remoção do aminoácido arginina da porção C- terminal da BK e Lys-BK,

respectivamente. (Figura 4) (BHOOLA et al., 1992; KAPLAN; KUSUMAM, 2002;

SHEIKH; KAPLAN, 1989)

31

Figura 4 – Cascata de formação das Cininas

IIustra a via do sistema calicreína-cininas e sua cascata de formação.A partir da ação da Calicreína, tecidual ou plasmática sobre o cininogênio de alto peso molecula (HK) ou ciniogênio de baixo peso molecular, será formada a Bradicinina, que por ação da cininase I pode ser convertida em seu metabólito ativo a DABK ou em um metabólito inativo também por ação de uma cininase (ECA). A bradicinina então agirá preferencialmente nos recptores B2, enquanto seu metabólito ativo, DABK agirá através da ligação nos receptores B1. Fonte: RAMALHO (2000)

Após serem liberadas, BK, Lys-BK e seus derivados ativos exercem uma série

de efeitos biológicos, como vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo e da

permeabilidade vascular, redução da pressão do sague, contração ou relaxamento da

musculatura lisa e sensibilização de fibras aferentes sensoriais. As cininas ainda estão

relacionadas com a liberação de diferentes mediadores pelo endotélio, indução da

proliferação celular, regulação do transporte de glicose e estimular a reabsorção

óssea (BHOOLA et al., 1992; REGOLI; BARABÉ, 1980).

A utilização da biologia molecular como ferramenta no estudo dos receptores

cininérgicos permitiu a definição molecular dos receptores das cininas e foi iniciada

pela clonagem do receptor B2 em ratos (MCEACHERN et al., 1991), seguida pela do

receptor B1 em humanos (MENKE et al., 1994). Os dois receptores parecem estar

envolvidos com alterações observadas durante desordens inflamatórias agudas e

crônicas. Grande parte dessas conclusões está baseada nos estudos dos efeitos dos

antagonistas dos receptores utilizados em diversos modelos de inflamação

(MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998).

32

Diversas investigações demonstram o envolvimento dos receptores B1 e B2 na

resposta edematogênica mediada pelas cininas no modelo de edema de pata em

ratos. Neste modelo os receptores B2 parecem ser constitutivos, enquanto os

receptores B1 apresentam caráter induzido (CAMPOS; CALIXTO,1995; CAMPOS et

al.,1995). Estudos demonstraram que a expressão dos receptores B1 é controlada

principalmente pela produção de citocinas específicas após trauma tecidual,

principalmente pela IL-1β (MARCEAU et al.,1998). Diversos estímulos inflamatórios

são capazes de estimular a produção de IL-1β como citocinas pró-inflamatórias e

produtos bacterianos como lipopolissacarídeo de membrana (LPS) (DINARELLO,

1998).

Assim, os efeitos biológicos das cininas ocorrem pela ativação específica de

receptores denominados de B1 e B2, receptores estes pertencentes à superfamília de

receptores acoplados à proteína G. No entanto, os receptores B1 e B2 se diferenciam

em suas estruturas primárias, regulação, expressão e distribuição no tecido

(MARCEAU et al., 1998).

Receptores B1 são preferencialmente e seletivamente estimulados pelos

metabólitos ativos des-Arg9-BK e Lys-des-Arg9-BK (figura 4). Enquanto que os

receptores B2 apresentam alta afinidade pela BK e Lys-BK (figura 4) (KAPLAN et

al.,2002, MARCEAU et al., 1998). Evidências apontam que receptores B2 encontram-

se expressos de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares

(SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995) e são os principais responsáveis pelas

ações fisiológicas das cininas. Com relação ao receptor B1, não são expressos em

níveis significativos nos tecidos em condições normais, mas são sintetizados e

modulados rapidamente em diversos tipos celulares após traumas teciduais ou

durante condições patológicas, indicando um mecanismo adicional na lesão tecidual

e na recuperação. Além disso, a indução do receptor B1 é resultante de uma cascata

de eventos que envolvem a interação entre fatores de transcrição, proteínas quinases,

células inflamatórias e citocinas, como por exemplo IL-1 e TNF (CALIXTO et al., 2000;

CALIXTO et al., 2004; KAPLAN; KUSUMAM, 2002). Desta forma, grande parte dos

efeitos fisiológicos das cininas são mediados pela ativação dos receptores B2

enquanto os receptores B1 parecem estar envolvidos na amplificação da sinalização

iniciada pelos receptores B2 (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004).

33

O receptor B1 é geralmente expresso no mesmo tipo celular que está presente

o receptor B2, recrutando a mesma via de sinalização, entretanto, o receptor B1 não

sofre dessensibilização após estimulação pelo agonista (MARCEAU; REGOLI, 2004).

Os dois receptores parecem estar envolvidos com as alterações observadas

durante desordens inflamatórias agudas e crônicas. Grande parte dessas conclusões

está baseada nos estudos dos efeitos dos antagonistas dos receptores utilizados em

diversos modelos de inflamação (MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998).

Grandes avanços do envolvimento das cininas em processos fisiológicos assim

como fisiopatológicos se deram com o desenvolvimento de antagonistas seletivos

para os receptores cininérgicos. Os antagonistas seletivos para o receptor B1 se deu

uma década antes do desenvolvimento de antagonistas para receptores B2. O

desenvolvimento do protótipo [Leu8]-des-Arg9-Bk (DALBK) como antagonista seletivo

foi decisivo para definir a existência dos receptores B1 (REGOLI; BARABÉ, 1980).

Mesmo com as limitações da primeira geração de antagonistas de B2, a partir

de seu desenvolvimento, o papel das cininas em condições normais e patológicas

agudas começou a ser delineado (BHOOLA et al., 1992). A segunda geração de

antagonistas da BK começou com os antagonistas exemplificados por Hoechst HOE-

140 (Icatibante), obtido através da introdução de dois aminoácidos sintéticos (Tic e

Oic) nas posições 7 e 8 do antagonista anterior (HOCK et al.,1991; WIRTH et al.,

1991).

Esta alteração estrutural gerou uma molécula com a capacidade de bloquear

sua degradação, aumentando dramaticamente o tempo de meia vida in vivo deste

antagonista em comparação aos antagonistas da primeira geração. A busca por

antagonistas não peptídicos que fossem ativos por via oral, levou ainda ao

desenvolvimento de uma terceira geração de antagonistas (STEWART et al., 1999;

STEWART, 2004).

Apesar de existirem diferenças entre os dois receptors cininérgicos B1 e B2, as

vias de sinalização celular ativadas por eles parecem ser semelhantes. Ambos são

recepetores acoplados a proteína G e sua ativação pode estar envolvida direta ou

indiretamente, com diferentes vias de transdução de sinal (YANAGA et al., 1991; XIE

et al., 2000).

Complementando os efeitos pró-inflamatórios do receptor B2, que se encontram

acoplados a múltiplos mecanismos transducionais. A BK ativa os receptores B2 e

estimula a liberação do ácido araquidônico com formação subseqüente de

34

prostaglandina E2 ou I2, resultando na formação do monofosfato cíclico de adenosina

(AMPc). Outro componente envolvido no processo inflamatório é o óxido nítrico (NO),

também formado pela ativação dos receptores B2, através do aumento de monofosfato

cíclico de guanosina (GMPc) (MARCEAU, HESS, BACHVAROV, 1998).

Outro ponto a se destacar é a ativação de vias alternativas, envolvendo a

fosforilação de algumas classes de quinases, como tirosina quinase, quinases

ativadas por mitógeno, proteína ribosomal S6 quinase e fosfatidilinositol-3-quinase

(MARCEAU; BACHVAROV, 1998; PYNE et al., 1997; PAN et al, 1999).

Os mecanismos descritos acima, podem levar à liberação ou mesmo

potencialização da ação de outros importantes mediadores inflamatórios como as

citocinas, assim como a ativação do fator de transcrição NF-B (PAN et al., 1998).

A ativação de receptores B2 acoplados aos mecanismos de transdução pode

ser responsável pelo aumento da população de receptores B1, sugerindo a existência

de um processo de balanço entre as duas populações de receptores cininérgicos,

durante desordens inflamatórias (CALIXTO et al., 2000).

Outro fato importante a se acrescentar em relação à participação dos

receptores B1 é que durante o desenvolvimento da inflamação, uma grande

quantidade de BK sofre a ação de carboxipeptidases, produzindo grandes

quantidades do metabólito ativo des-Arg9-bradicinina. Esta alta concentração

endógena dos agonistas seletivos para o receptor B1 demonstra que estes possuem

papel fundamental também na regulação de expressão dos receptores B1

(SCHANSTRA et al., 1998).

Processos inflamatórios cutâneos induzidos através de diferentes estímulos,

incluindo substâncias alergênicas ou através da radiação ultravioleta, disparam

respostas inflamatórias no tecido cutâneo induzindo diretamente queratinócitos e

estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias e BK. Nos queratinócitos, a

bradicinina induz o crescimento celular e este efeito pode ser induzido via receptores

específicos de cininas (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995).

Schremmer-Danninger e colaboradores (1995), utilizando técnicas

radiográficas, identificaram receptores específicos para bradicinina na camada basal

de epiderme humana sugerindo que as cininas podem estar envolvidas em

mecanismos de proliferação celular epidérmica.

O RNA mensageiro (RNAm) para o receptor B1, B2 e para a calicreína tecidual

na pele de indivíduos sadios foi identificado e desta forma, a existência do sistema

35

das cininas na pele humana é um fato comprovado (SCHREMMER-DANNINGER et

al., 1999). Poblete e colaboradores (1991) encontraram calicreína tecidual no fundo

secretório de glândulas sudoríparas. Além disso, foi demonstrada a presença de

cininogênio de alto peso molecular no espaço intersticial tecidual na epiderme de

cobaias e também na pele humana (YAMAMOTO et al.,1987; VIDAL et al., 2005).

Dados indicam que as calicreínas e as cininas contêm substratos que normalmente

estão presentes na pele humana contribuindo para o conceito de que as cininas são

formadas localmente (VIDAL et al, 2005).

É importante destacar que outras ações das cininas também sugerem o

envolvimento desse sistema em outras etapas dos processos inflamatórios cutâneos,

como na proliferação celular. Cheng e colaboradores (2004) demonstraram que a BK,

via ativação dos receptores B2, apresenta efeito mitogênico através da ativação de

proteína G, causando fosforilação da via da PKC e consequente estimulação da via

da MEK/ proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da expressão de c-fos e c-

jun em cultura de queratinócitos obtidos da córnea de coelhos. Também através de

receptores B2, a BK promove ativação da cascata da p42/p44 MAPK em vários tipos

de células humanas, incluindo as células da musculatura lisa vascular, endoteliais,

PC-12 e linhagem de células tumorais (CHENG et al., 2004).

Em 2008, Matus e colaboradores utilizando cultura de queratinócitos

comprovaram que o estímulo de receptores B1 pode contribuir para a diferenciação e

migração de queratinócitos através da sinalização da tirosina quinase C ou através da

interação com receptores da família ErbB. Indícios de que o sistema cinina-calicreína

pode estar envolvido com a migração e diferenciação de queratinócitos foram

confirmados em lesões realizadas em cultura celular e tratadas com calicreína. Neste

trabalho, Gao e colaboradores, (2010) constataram que há influência na migração e

diferenciação destas células através da ativação de receptores PAR, sugerindo assim

um importante papel no processo de reparo tecidual.

Como já mencionado anteriormente, os fibroblastos são células importantes na

reparação de tecidos, estando envolvidos na migração, proliferação, contração da

ferida e na produção de colágeno (ENOCH; LEAPER, 2008). Em uma busca na

literatura não foram encontrados estudos relacionando o papel das cininas e seus

receptores envolvendo fibroblastos cutâneos, porém já existem estudos in vitro

usando fibroblastos de outros tecidos indicando que a bradicinina também é capaz de

36

induzir a ativação destas células (CHENG; TSENG; MAO,2012; SABATINI et al.,2013;

VANCHERI et al., 2005).

Estudos in vitro demonstram que a BK através da ativação dos receptores B2 é

capaz de ativar a via do NF-kB e a liberação de citocinas em cultura de fibroblastos

de pulmão humano influenciando na sua contratilidade (VANCHERI et al., 2005). A

BK causa um significativo aumento na α-actina de músculo liso (α-SMA), proteína

expressa por fibroblastos em fase de transformação em miofibroblastos pulmonares.

O receptor B2 foi considerado o responsável por este efeito, pois o tratamento com o

antagonista bloqueou a expressão. A BK também é capaz de induzir a proliferação de

fibroblastos e a produção de colágeno através da ativação da via da MAPK por

fosforilação regulada por sinal extracelular (ERK 1/2) (VANCHERI et al., 2005).

Considerando o importante papel dos fibroblastos na fase proliferativa com o

fechamento da lesão através da formação do tecido de granulação e influenciando o

depósito de colágeno e a contração da ferida. Avaliando o cenário onde, os

mediadores inflamatórios assumem um importante papel na progressão da resposta

de reparo tecidual somando-se às evidências de que o sistema cinina-calicreína pode

regular a proliferação celular, assim como sua possível relevância na a angiogênese.

Considera-se relevante explorar o papel das cininas na proliferação de fibroblastos in

vitro e a influência do TNF neste processo, procurando através do “Scratch model”

mimetizar as condições envolvidas no processo de reparo tecidual.

37

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Materiais 4.1.1 Linhagem celular

As células utilizadas foram adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro.

Fibroblastos Murino linhagem NCTC clone 929 [L CELL, L-929], de origem de tecido

conectivo adiposo.

4.1.2 Condições de cultivo

No cultivo celular in vitro, células de fibroblasto murino L929 desenvolveram-se

como culturas aderentes cultivadas em garrafas plásticas (poliestireno) estéreis da

Techno Plastic Products (TPP). O meio de cultura DMEM (Vitrocell®) suplementado

com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Gibco®) foram adicionados às garrafas. As

células foram mantidas em estufa sob atmosfera contendo 5% de CO2 à temperatura

de 37°C. A subcultura foi realizada de acordo com a confluência das células na

garrafa, utilizando-se a solução de tripsina-EDTA para desprender as células

aderidas. Para o armazenamento das linhagens, as células, foram suspensas em

meio de cultura suplementado com 10% SFB e 10% de DMSO e armazenadas em

nitrogênio líquido.

4.2.Métodos 4.2.1 Avaliação da proliferação celular

4.2.1.1 Preparo da placa de cultivo

Após crescimento celular em alta confluência em monocamada mantida na

garrafa de cultivo, células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 24 poços e

mantidas em estufa até atingirem máxima confluência, como pode ser visualizado no

modelo demonstrado na figura 5.

38

Figura 5 – Modelo de placa com 24 poços para cultivo celular

4.2.2 Ensaio de Scratch in vitro

Após confluência na placa de 24 poços, o meio de cultivo foi retirado dos poços

e com o auxílio de uma ponteira (tip 200) foi realizado um risco contínuo na superfície

medial de cada poço, de acordo com a figura 6. Este procedimento ocasiona uma

ruptura do contato entre as células e a retirada destas de uma determinada região da

placa, resultando na formação de uma lesão mecânica na monocamada

Os poços foram lavados com Salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco®),

composto por cloreto de sódio e fosfato de sódio, para remoção das células

debridadas, o esquema de cultivo e experimento in vitro está demostrado na figura 7.

Antes do plaqueamento das células, foi realizada uma marcação central

utilizando um marcador permanente objetivando uma melhor padronização na

confecção do rasgo e das medidas. Esta marcação estabelece um campo visual no

poço, o qual será analisado posteriormente após o estabelecimento do rasgo na

monocamada, em tempo zero, 24 e 48 horas. Posteriormente, foi feito o

acompanhamento da proliferação das células adjacentes em direção ao espaço livre

na placa conforme a figura 6.

39

Figura 6 – Esquema do procedimento In vitro de “ Scratch model”

Após confluência na placa de 24 poços cada poço (A) foi submetido ao stress mecânico através da ruptura da monocamada com um “rasgo” contínuo utilizando uma ponteira de micropipeta (B), após a retirada das células desaderidas as céulas adjacentes tendem a se proliferar em direção ao espaço livre na placa (C). Fonte: Adaptado de VEDULA et al., (2013). Figura 7 – Modelo de Scratch wound “in vitro”

Após confluência em monocamada, as células de

fibroblastos L929 foram tripsinizadas

semeadas em placas de plástico (TPP) de 24 poços

1x 105 cels/poço

e mantidas em estufa até atingirem a máxima

confluência

A placa foi marcada no seu verso, de modo que cada

poço obtivesse uma marcação central.

Esta marcação estabelece qual campo do poço será analisado em tempo zero,

24 e 48horas

Retirou-se o meio de cultura e com o auxílio de uma

ponteira (tip 200) foi feito um risco contínuo na superfície

medial de cada poço,

. Os poços foram então lavados com Salina

tamponada com fosfato (PBS) para remoção das

células desaderidas

40

4.2.3 Avaliações da proliferação celular em fibroblastos tratados com TNF

Com o objetivo de ativar os receptores cininérgicos e avaliar um possível efeito

das cininas na proliferação de fibroblastos, após o trauma mecânico (Scratch) as

células foram tratadas com TNF.

As células, após Scratch, foram incubadas com solução rm TNF em meio de

cultivo suplementado com 5% de SFB na concentração de 2 ng/mL (GOLDBERG et

al., 2007).

Inicialmente, foi realizado experimento com o intuito de verificar o melhor tempo

de exposição de contato com TNF para indução da proliferação celular, após o stress

mecânico as células foram mantidas incubadas por 30, 60, 90, 180 ou 240 minutos.

Após o tempo de contato com o TNF, o meio foi retirado, as células foram lavadas

com PBS e então foi adicionado meio DMEM suplementado com 5% de SFB (figura

8). Foi mantido um grupo controle onde as células receberam apenas meio de cultivo

suplementado e PBS. A análise fotográfica foi feita no tempo zero (imediatamente

após o rasgo), após 24 e 48 horas após o rasgo.

Figura 8 – Esquema de tratamento das células com TNF em diferentes tempos de contato.

Tempo zero

Tempo de contato

com TNF

30,60,90,180 e 240

min.

Tempo

Após rasgo

24 horas

Tempo

Após rasgo

48 horas

Após confluência na placa de 24 poços “Scratch “ rasgo”

Incubação com TNF

Registro fotográfico imediatamente após o

rasgo e incubação

Lava com PBS e adiciona meio

suplementado com 5% SFB

Registro fotográfico Retira o meio

Lava com PBS

Adiciona meio de cultivo com 5% de SFB

Avaliação da proliferação

Registro fotográfico Avaliação da proliferação

41

4.2.4 Avaliações do papel das cininas na proliferação celular em fibroblastos

Com o objetivo de avaliar a interferência das cininas no processo de

proliferação de fibroblastos L929, as células foram incubadas com agonistas dos

receptores cininérgicos B1 [des-Arg9]BK (DABK, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,

U.S.A.) e B2, Bradicinina (BK, Bachem California, Torrance, CA) ®

Para avaliar qual concentração do agonista do receptor B2 (BK) pode interferir

na proliferação celular, o ensaio seguiu o esquema descrito na figura 9. O mesmo

procedimento foi executado para avaliar a interferência do agonista do receptor B1

empregando para tal o seu agonista DABK, figura 10.

Figura 9 - Esquema de tratamento das células com agonista receptor B2 (BK) em diferentes concentrações.

Tempo zero

1

Tempo de contato

60 minutos

diferentes [ ] de BK

(0,1, 1,0 e 100µM)

2

Tempo

24 horas

3

Tempo

48 horas

4

Após confluência na placa de 24 poços

Scratch “rasgo” Incubação com diferentes [ ] de BK + meio sem SFB

Registro fotográfico

Após 60 minutos Retira o meio

Lava com PBS Adiciona meio 5% SFB

Registro fotográfico Retira o meio lava com PBS

Adiciona meio com 5% SFB

Avaliação da proliferação


Figura 10 - Esquema de tratamento das células com agonista receptor B1 (DABK) em diferentes concentrações.

Tempo zero

1

Tempo de contato

60 minutos

2

Tempo

24 horas

3

Tempo

48 horas

4

Após confluência na placa de 24 poços

Scratch “rasgo” Incubação com diferentes

[ ] deDABK (0,1, 1,0, 10 e 100nM)

Meio sem SFB Registro fotográfico




Lava com PBS Adiciona meio com 5%

SFB Avaliação da proliferação


42

4.2.5 Avaliações do papel das cininas na proliferação celular em fibroblastos

pré tratados com TNF

Com o objetivo de avaliar a co-participação do TNF na proliferação celular de

fibroblastos L929 induzida pelos agonistas cininérgicos, as células foram pré-tratadas

com TNF imediatamente após o stress mecânico e mantidas em contato por 240

minutos. Após este estímulo o meio é retirado, as células lavadas com PBS e então

tratadas com agonistas cininérgicos por 60 minutos. Após este período o meio foi

retirado, as células foram lavadas com PBS, incubadas com meio de cultivo

suplementado com 5% de SFB e mantidas por 48 horas. Foi realizada avaliação da

proliferação celular por meio de registro fotográfico em 24 e 48 horas após o rasgo

(Figura 11 e 12).

Figura 11 – Esquema de tratamento com o agonista do receptor B2, BK, em células pré tratadas com TNF.

Tempo zero

Incubação com

TNF

1

Tempo 240

minutos

2

Tempo 60

minutos

3

Tempo

24 horas

4

Tempo

48 horas

5

Após confluência na placa de 24 poços “Scratch“ rasgo”

Incubação com TNF 2ng/ml + meio 5%

de SFB

Registro fotográfico imediatamente após o rasgo e incubação

Após 240min

Retira o meio Lava com PBS

Adiciona meio sem

suplementação

acrescido das

diferentes [ ] de BK

(0,1, 1,0 ,10 e

100µM)

Após 60 minutos

Retira o meio

Lava com PBS

adiciona meio com

5% SFB


Lava com PBS Adiciona meio com

5% SFB Avaliação da proliferação

Registro fotográfico

Avaliação da

proliferação

43

Figura 12- Esquema do tratamento com o agonista do receptor B1, DABK, em células pré tratadas com TNF.

Tempo zero

1

Tempo 240

minutos

2

Tempo 60

Minutos

3

Tempo

24 horas

4

Tempo

48 horas

5


Incubação com TNF 2ng/ml+meio 5% de

SFB


Após 240min Retira o meio

Lava com PBS Adiciona meio sem

suplementação acrescido das

diferentes [ ] de DA BK (0,1, 1,0, 10

e 100nM)


Lava com PBS adiciona meio com

5% SFB


Lava com PBS Adiciona meio com

5% SFB Avaliação da proliferação


4.2.6 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos

L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF.

Para padronizar a resposta obtida e otimizar o modelo testado foram efetuadas

algumas modificações no modelo anteriormente descrito.

Como no ensaio de padronização com diferentes tempos de contato do TNF

com as células os tempos de 90 até 240 minutos apresentaram aumento significativo

na proliferação celular em comparação às células tratadas somente com PBS, sendo

que o tempo de 240 minutos aumenta considerável este nível de proliferação,

padronizou-se o tempo 180 miunutos para os demais ensaios.

Foi utilizada 300µL de meios em cada poço da placa de 24 poços e a

proliferação celular foi avaliada mediante registro fotográfico no tempo zero

(imediatamente após o rasgo), 30 e 48 horas após o rasgo.

A fim de confirmar o possível envolvimento dos receptores cininérgicos B1 e B2

e a co participação do TNF no processo de proliferação dos fibroblastos, foi realizado

um experimento adicionando os antagonistas cininérgicos; antagonista seletivo do

receptor B1) Lys-(Des-Arg9, Leu8)-BK DALBK; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,

U.S.A. e com o antagonista seletivo do receptor B2, HOE -140 (D-Arg0-Hyp3-Thi5-DTic7-

Oic8-BK, Hoechst AG, Frankfurt, Germany), após o pré estimulação do TNF por 180

minutos, e mantidos em contato com as células, conforme o esquema da figura 13.

44

Para confirmar a participação do TNF o mesmo foi incubado na presença do

anticorpo anti TNF em coadministração e mantidos por 180 minutos, após foi retirado

o meio e as células foram lavadas com PBS.

E ainda para avaliar o envolvimento do fator de transcrição NF-ƙB na

proliferação dos fibroblastos foi efetuado um tratamento utilizando um inibidor da

ativação deste fator de transcrição o PDTC (pirrolidinaditiocarbamato), administrado

após o estímulo do TNF por 180 minutos, e os tratamentos foram mantidos até 48

horas após o rasgo, conforme figura 13.

Figura 13- Esquema do tratamento com os antagonistas do receptor B1 e B2, anticorpo anti TNF e PDTC, administrados após o pré tratamento com TNF.

Tempo zero

1

Tempo 180

minutos

2

Tempo

30 horas

4

Tempo

48 horas

5



de SFB

AB anti TNF

Nas cels que não receberam estímulo

com TNF receberam apenas

PBS + meio 5% SFB



Lava com PBS Adiciona meio 5% SFB acrescido de:

HOE-140 1µM DALBK 10µM

Ou PDTC



45

4.2.7 Avaliação do efeito das cininas na proliferação celular em fibroblastos

pré tratados ou não com TNF em coadministração ou não do anticorpo anti

TNF.

Para avaliar o efeito da coparticipação do TNF na proliferação celular de

fibroblastos estimulada pelos agonistas cininérgicos as células foram cultivados em

placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida incubados

com TNF coadministradas ou não com o anticorpo recombinante para esta citocina.

Após este tempo de contato as células foram estimuladas com agonistas das cininas

(BK ou DABK) conforme exemplificado figura 14.

Com o objetivo de comparar a proliferação sem o pré estímulo do TNF, também

foram realizados tratamentos onde as células foram tratadas apenas com os agonistas

BK ou DABK esquema da figura 14.

Para confirmar a hipótese de estresse mecânico gerado pela ruptura da adesão

celular causada pelo rasgo na monocamada também induz a liberação de cininas

pelas células, as mesmas foram tratadas com os antagonistas, HOE-140 e DALBK

logo após o rasgo.

Figura 14 - Esquema do tratamento com os agonistas do receptor B1 e B2 pré tratadas ou não com o TNF e coadministradas ou não com o anticorpo anti TNF.

Tempo zero

1

Tempo 180 minutos

2

Tempo

30 horas

4

Tempo

48 horas

5



de SFB

AB anti TNF

Nas cels que não receberam estímulo

com TNF receberam apenas PBS + meio %%

SFB




acrescido de:

BK 10 µM DABK 1nM

HOE-140 1µM DALBK 10µM

BK 10 µM+HOE1µM DABK 1nM+DALBK 10µM

Registro fotográfico Avaliação

da proliferação


46

4.3 Análises dos dados e apresentação dos resultados

O cultivo com os tratamentos foi mantido e controlado após scratch, pelo

período de 24 e 48 horas. A condição controle foi realizada com veículo de diluição

dos componentes (PBS).

Nos tempos zero (logo após o trauma mecânico), 24 e 48 horas o ensaio foi

analisado utilizando microscópio de contraste de fase (Olympus CKX 41) e as imagens

capturadas com uma câmera digital acoplada ao microscópio, com aumento final de

100x. As análises foram realizadas medindo a área sem proliferação, obtida na região

do “risco” em mm2 utilizando o software ImageJ1.46r como apresentado na figura 15.

A análise dos resultados foi realizada a partir do cálculo da % área de cobertura

de proliferação usando a fórmula abaixo:

% da área de cobertura 24 h = Área em 24 h x 100 - 100

Área em T0


Área em T24

Os tratamentos dos itens 4.2.6 e 4,2,7, foram avaliados de forma diferente para

melhor padronização da técnica, onde as células foram mantidas por 48horas após o

estresse mecânico e as análises fotográficas foram feitas em 30 horas após o rasgo.

As células foram mantidas por mantidas por 48 horas e os registros fotográficos foram

feitos, porém pelaquantidade de meio por poço foi diminuída e mantida por 48 horas

percebe-se uma diminuição da proliferação celular em 48 horas e uma mudança na

morfologia celular, portanto foi mantida apenas a análise em 30 horas decultivo após

o estresse mecânico (rasgo).

Os resultados obtidos foram avaliados conforme a formulação abaixo:


Área em T0

47

Figura 15- Imagens da monocamada de fibroblastos L929 antes e após o ensaio de Scratch

Ilustração das imagens do cultivo celular utilizando o software ImageJ1.46r para avaliação A). Representa o cultivo de fibroblastos L929 em monocamada após confluência de 48horas. B) Imagem da monocamada no tempo zero após execução do scratch e como análise da área formada na monocamada. C) Imagem do campo da placa de cultivo de um ensaio após 48 horas do scratch com a marcação da análise da área demarcada indicando a diminuição da área e um subsequente aumento na área de cobertura do rasgo através da proliferação celular.

4.4 Analise estatística

Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos em média ± erro

padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por Teste “t” de student ou

pela análise de variância com comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário,

foram utilizados como pós-teste o Teste de Tukey-Kramer ou Newman-Keuls. Os

dados foram analisados no programa GraphPad Prism, admitindo como

significativamente estatístico o p<0,05.

A B C

48

5.0 RESULTADOS

5.1 Efeitos do TNF sobre a proliferação de fibroblastos

Os dados apresentados na figura 16 mostram o efeito do tratamento com TNF

(2 ng/mL) na proliferação de fibroblastos utilizando o modelo de scratch. É possível

verificar que a proliferação é dependente do tempo de exposição ao TNF, sendo o

tempo de 240 minutos o que promove maior proliferação celular após 48 horas,

portanto, foi adotado como o período de incubação nos ensaios posteriores onde

houve o estímulo celular com o TNF. Porém no decorrer do trabalho observa-se que

o período de 240 minutos de contato com as células em 24 horas já demonstra 90%

de proliferação o que não oferece uma janela adequada para os estímulos

subsequentes desta forma, para melhor padronização do método utilizou-se o tempo

de 180 minutos decontato do TNF com as células.

Figura 16 - O tratamento com TNF aumenta a proliferação de fibroblastos quando incubados por 240 minutos.

PBS 30 60 90 2400

20

40

60

80

100

Tempo de exposição (min)

TNF (2 ng/mL)

*

**

% á

rea d

e c

ob

ert

ura

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL por diferentes tempos de contato e mantidas incubadas por 48 hs. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls.* p<0,05 e ** p<0,01 diferem significativamente do grupo tratado com veículo PBS .

49

5.2 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na

proliferação de fibroblastos, com e sem estímulo com TNF.

5.2.1 Influência da administração de agonistas dos receptores de cininas na

proliferação de fibroblastos L929 quando administrados sem o pré estímulo do

TNF.

Os dados apresentados na figura 17 e 21 demontram que o tratamento com

BK, um agonista de receptores B2, não induz proliferação celular em nenhuma das

concentrações avaliadas. Ressalta-se que este experimento foi realizado em

fibroblatos sem o pré estímulo com TNF. Adicionalmente, a concetração de 100 µM

de BK apresentou efeito antiproliferativo quando comparado com as demais doses de

BK.

Quando as células foram tratadas com agonista de receptores B1 (DABK),

utilizando concentrações nanomolares, foi observado aumento significativo na

proliferação em todas as doses avaliadas quando comparado com células tratadas

apenas com veículo (Figuras 17 e 21).

50

Figura 17- Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, sem o estímulo do pré-tratamento com o TNF

0

20

40

60

80

100

0,1 10

BK [M]

PBS 1

###

100

% á

rea c

ob

ert

a

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de BK em diferentes concentrações e mantidas por 48 horas. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 24 e 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls.### p < 0,001 diferem significativamente do grupo tratado com veículo PBS .

51

Figura 18- Efeitos do tratamento com DABK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, sem o estímulo do pré tratamento com o TNF-α

0

20

40

60

80

100

###

0,1 10

DABK [nM]

PBS 1 100

% á

rea c

ob

ert

a

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de DABK em diferentes concentrações e mantidas por 48 horas. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 24 e 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. ### p < 0,001 diferem significativamente do grupo tratado com veículo PBS.

5.2.2 Influência da administração de agonistas do receptor de cininas na

proliferação de fibroblastos L929 quando administrados após células pré

tratadas com TNF.

O efeito do tratamento com os agonistas cininérgicos BK e DABK foi avaliado

240 minutos após pré-tratamento com TNF. Diferentes doses dos agonistas foram

empregadas, e as células foram incubadas durante 60 minutos.

Os dados obtidos (figura 19 e 21) mostram que diferentes concentrações de BK

apresentam efeitos distintos, quando as células foram tratadas com 0,1 ou 1 µM não

foi verificada diferença no efeito proliferativo em comparação ao grupo tratado

somente com TNF (2ng/mL). No entanto, na concentração elevada (100 µM), foi

observado diminuição na capacidade proliferatiava. Entretanto a dose de 10 µM após

48 horas de proliferação apresentou efeito adicional aos efeitos induzidos pelo TNF

(figura 20 e 21). A partir dos dados obtidos pode-se sugerir a participação dos

52

receptores B2 no efeito mitogênico/proliferativo de fibroblastos, demonstrando uma

dependência do processo inflamatório induzido pelo TNF.

Figura 19- Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos, com o estímulo do pré-tratamento com o TNF

0

20

40

60

80

100

0,1 1 100

Bk [M]

Br 10

### #####

###

##

TNF (2ng/mL; 240 min)

*

% á

rea c

ob

ert

a

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL por 240 min.e após incubadas com solução de BK em diferentes concentrações e mantidas por 48 horas. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 24 e 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicate. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. * p < 0,05 difere significativamente do grupo tratado com TNF. ## p < 0.01 e ### p < 0,001 diferem significativamente do grupo tratado com veículo PBS.

Os dados da figura 20 permitem observar que o tratamento das células com

DABK em concentrações nanomolares após pré tratamento com TNF, não parece

potencializar o efeito proliferativo do TNF em nenhuma das concentrações utilizadas.

Mostrando assim uma não correlação dose-efeito da DABK, porém a janela obtida

com pré estímulo com o TNF não permite analisar a resposta da DABK com precisão

já que em 24 horas o TNF já apresenta um resultado na área de cobertura superior a

80%.

53

Figura 20 - Efeitos do tratamento com DABK em diferentes concentrações (nanomolar) na proliferação de fibroblastos, com pré estímulo do TNF.

0

20

40

60

80

100

TNF (2ng/mL; 240 min)

DABK [nM]

0,1 1 10 100PBS

*** ***** **

% á

rea c

ob

ert

a

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL por 240 min.e após incubadas com solução de DABK em diferentes concentrações e mantidas por 48 horas. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata. A análise estatística foi realizada com ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. **p<0,01 para os tratamentos com TNF e com TNF+ DABK 100nM em relação às células tratadas apenas com PBS (veículo). ***p<0,001 para as demais concentrações em relação às células tratadas apenas com o veículo (PBS).

Pode se observar uma maior porcentagem da área de cobertura quando as

células são tratadas com TNF (Figura 21). Observa-se que o pré estímulo com TNF

aumenta a procentagem da área de combertura quando comparada com as células

sem este estímulo. Porém esta área não apresenta este incremento na porcentagem

de área cobertura quando tratadas apenas com os agonistas sem o estímulo do TNF.

54

Figura 21 - Imagem da proliferação celular com tratamento de TNF e dos agonistas dos receptores cininérgicos , BK e DABK, sem e com o pré estímulo do TNF

Ilustra a proliferação de fibrobloblasto L929 após stress mecânico com a ruptura da monocamada com uma ponteira (tip200) e na sequência foram incubados com TNF-α por 240 minutos, também demonstra a proliferação celular com tratamentos dos agonistas (BK e DABK) por 60 minutos, com e sem o pré estímulo do TNF.

55

5.2.3 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos

L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF

Para padronizar a resposta obtida nos resultados anteriores e otimizar o modelo

testado, foram efetuadas algumas modificações no modelo inicialmente descrito.

Como no ensaio de padronização com diferentes tempos de contato do TNF

com as células os tempos de 90 até 240 minutos apresentaram aumento significativo

na proliferação celular em comparação às células tratadas somente com PBS, sendo

que o tempo de 240 minutos aumenta considerável este nível de proliferação,

padronizou-se o tempo 180 miunutos para os demais ensaios.

Foram utilizados 300µL de meio em cada poço da placa de 24 poços e a

proliferação celular foi avaliada mediante registro fotográfico no tempo zero

(imediatamente após o rasgo) e 30 48 horas após o rasgo.

Para avaliar a participação do TNF na proliferação celular fibroblastos

cultivados em placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida

incubados com TNF coadministrados ou não com o anticorpo recombinante para esta

citocina.

A partir dos dados mostrados na figura 22 e 24 pode se observar que o TNF

potencializa a proliferação de fibroblastos, a qual foi bloqueada pelo seu anticorpo,

para níveis abaixo do tratamento apenas com PBS. O efeito do a administração do

anticorpo anti TNF logo após o estresse mecânico sem o estímulo com TNF não

apresentou resultado significativo quando comparado com as células tratadas apenas

com o veículo demonstrando a importância do estímulo com esta citocina para início

da resposta inflamatória e proliferativa.

Quando as células foram pré estimuladas com TNF por 180 minutos e depois

incubadas por 48 horas com os antagonistas cininérgicos tanto do receptor B1

(DALBK) como do receptor B2 (HOE-140), observa-se uma redução significativa da

proliferação quando comparada à proliferação obtida sem estes antagonistas, o que

demonstra uma participação destes receptores no estímulo proliferativo destas células

(figura 22).

Para avaliar o envolvimento do fator de transcrição NF-ƙB na proliferação dos

fibroblastos foi efetuado um tratamento utilizando um inibidor da ativação deste fator

de transcrição o PDTC, administrado após o estímulo com TNF por 180 minutos, e os

56

tratamentos foram mantidos até 48 horas após o rasgo. Analisando os dados da figura

22, pode-se concluir que o estímulo proliferativo ocorre via fatores de transcrição

nuclear já que a incubação com PDTC inibe de forma significativa a proliferação obtida

pelo estímulo com TNF.

Figura 22 - Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF

PB

S

TN

F

TN

F +

Ab

PB

S +

Ab

TN

F +

DA

LB

K

TN

F +

HO

E

TN

F +

DL

AB

K +

HO

E

TN

F +

PD

TC

0

10

20

30

40

50

60

*

##

**

*

ns

**

proliferação em 30 horas

% á

rea c

ob

ert

a

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL com e sem coadministração do anticorpo recombinante para esta citocina, com os antagonistas cininérgicos seletivos HOE-140 e DALBK ou ainda na presença de ambos e também com o inibidor do fator de transcrição nuclear NF-ƙB (PDTC). Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 30horas após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. ##p<0,01 difere significativamente do grupo ttratado com PBS e *p<0,05 e **p<0,01 diferem significativamente do grupo tratado com TNF.

57

5.2.4 Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF na

proliferação de fibroblastos L929.

Para avaliar o efeito dos receptores cininérgicos na proliferação, fibroblastos


incubados com TNF coadministrados ou não com o anticorpo recombinante para esta

citocina. Após 180 minutos de contato, as células foram lavadas e tratadas com o

agonista do receptor B1 (DABK) e o agonista do receptor B2 (BK), assim como

tratamentos onde estes agonistas foram coadministrados com seus antagonistas

seletivos DALBK e HOE -140 respectivamente.

Foram realizados tratamentos onde as células foram tratadas apenas com o os

agonistas, BK ou DABK sem pré estímulo com TNF assim como tratamentos apenas

com os antagonistas seletivos destes recepetores (DALBK e HOE-140).

A partir dos dados demonstrados na figura 23 e 24 pode se observar que o TNF

potencializa a proliferação de fibroblastos, a qual foi bloqueada pelo seu anticorpo,

para níveis abaixo do tratamento apenas com PBS.

Também pode-se observar, que o TNF potencializa a ação da BK, uma vez que

o tratamento com TNF e o agonista do receptor B2 (BK) apresenta um efeito adicional

à proliferação obtida com tratamento apenas com o TNF e quando comparada com a

proliferação obtida apenas com o agonista sem o pré estímulo do TNF.

A adição dos antagonistas dos receptores cininérgicos HOE-140 e DALBK foi

capaz de diminuir a proliferação celular para níveis inferiores aos obtidos com o

estímulo do TNF e com o efeito adicional da BK demonstrando um envolvimento dos

receptores cininérgicos na proliferação celular induzida pelo TNF.

Neste tratamento, o anticorpo anti-TNF e a coadministração do antagonista do

receptor B2 com a BK após o estímulo o pré estímulo com TNF interfere de forma

significativa na redução da proliferação induzida pela BK com o pré estímulo do TNF

demontrando a importância do estímulo inflamatório para a proliferação induzida pela

BK.

Já a DABK não parece potencializar o efeito obtido na proliferação induzida

pelo TNF, nem a proliferação obtida sem pré estímulo do TNF parece interferir de

forma significativa quando comparada com o grupo tratado apenas com PBS. Já

administração do antagonista do receptor B1, DALBK foi capaz de diminuir a

proliferação a níveis menores do que os obtidos com o estímulo do TNF.

58

Figura 23 - Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF na proliferação de fibroblastos L929

Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL com e sem coadministração do anticorpo recombinante para esta citocina, com os agonistas BK e DABK em coadministração ou não com seus antagonistas HOE -140 ou DALBK respectivamente, com e sem o pré estímulo do TNF Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 30 hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. # p < 0,05 difere do grupo tratado com PBS , *p<0,05 difere do grupo tratado com TNF e + p < 0,05 difere do grupo tratado com TNF + BK.

Proliferação em 30 horas

59

Na figura 24 é possível observar uma significativa diminuição da porcentagem da área

de cobertura quando as células são tratadas com o anti TNF em co administração com

TNF ou com os antagonistas dos receptores cininérgicos.

Observa-se que o pré estímulo com TNF mantém a procentagem da área de

combertura, ao incubar as células com o agonista do receptor B2, a BK em células

estimuladas com TNF, esta células demonstraram um efeito adicional no aumento da

porcentagem da área de cobertura, fato não observado quando este agonista foi

incubado sozinho sem o pré estímulo da citocina. È possível notar que a adição do

PDTC após o pré estímulo com TNF bloqueia a proliferação celular em fibroblastos

L929, sugerindo que este estímulo ocorra via ativação do NF-ƙB.

Figura 24 – Imagem do efeito do tratamento as células com o anticorpo anti TNF em coadministração com TNF e desafiadas com os agonistas BK e DABK com sem a presença dos antagonistas cininérgicos HOE-140 e DALBK.

Ilustra a proliferação de fibrobloblasto L929 após stress mecânico com a ruptura da monocamada e na sequência a incubação com TNF por 180 minutos em coadministração ou não com o anti corpo anti TNF, tamb com a adição dos agonistas co administrados ou não com seus antagonistas e a imagem de células incubadas com PDTC após o pré estímulo com TNF.

60

6.0 DISCUSSÃO

Após a ocorrência de uma lesão tecidual, várias vias de sinalização inter e

intracelular são ativadas com o objetivo de restaurar rapidamente a homeostase do

tecido. Os componentes celulares do sistema imunológico, a cascata de coagulação

sanguínea e as vias inflamatórias são ativadas. Várias células, incluindo células do

sistema imune, como neutrófilos, monócitos, linfócitos e células dendríticas, células

endoteliais, queratinócitos e fibroblastos, sofrem alterações na expressão gênica,

ocasionando a migração, proliferação e diferenciação celular (GURTNER et al., 2008).

A fibroplasia é uma etapa fundamental na formação de um novo tecido, sendo

caracterizada pela migração e proliferação de células, como os fibroblastos, que irão

formar o tecido de granulação (SINGER; CLARK, 1999; ENOCH; LEAPER, 2008). A

proliferação celular é um processo central em condições fisiológicas e possui papel

essencial no processo de reparação tecidual onde a mitose é regulada por um gama

de sinais autócrinos, parácrinos e fatores humorais (WALSH; FAN, 1997).

Diversos modelos experimentais in vitro têm sido desenvolvidos para estudar o

processo de reparo tecidual e reepitelização. Dentre eles pode-se destacar o modelo

organotípico de cultura 3D de queratinócito e fibroblasto ex vivo, o modelo ex vivo

onde se usa pele de camundongo ou de humano extraídas de cirurgia plástica ou

ainda o co-cultivo in vitro em duas câmaras envolvendo cultura de fibroblasto e

queratinócitos (LOO; HALLIWELL, 2012).

Um modelo amplamente empregado e de baixa complexidade é o “scratch

assay” (ensaio do rasgo). Neste modelo uma monocamada de células confluentes é

submetida a uma lesão mecânica promovendo a descontinuidade da adesão celular

fazendo com que as células presentes na borda do rasgo se proliferem para o

posterior preenchimento do espaço até que novos contatos célula-célula sejam

estabelecidos. Esta técnica pode ser empregada para medir a proliferação de células

in vitro (LOO; HALLIWELL, 2012). As imagens são capturadas no início do ensaio

(logo após o “rasgo”) em intervalos regulares durante a migração celular até o

fechamento do espaço criado pela ruptura na monocamada. Comparando as imagens

durante o período pode se quantificar a taxa de proliferação celular (LIANG; PARK;

GUAN, 2007).

61

A partir da padronização do método descrito acima, o presente estudo teve

como objetivo inicial avaliar a proliferação celular de fibroblastos da linhagem murino

L929 estimulados com TNF na tentativa de mimetizar o processo inflamatório

encontrado na derme após a lesão tecidual. O TNF é uma citocina sintetizada por

monócitos, macrófagos, célula endotelial, neutrófilos, linfócitos na presença de um

estímulo inflamatório, após ativação do fator de transcrição NF-B. Após ser produzido

e clivado pela ação da enzima TACE, este mediador é liberado e a sua ação nas

células-alvo ocorre pela ligação a receptores específicos denominados receptores de

TNF I e II (TNF-RI e TNF-RII). O TNF-RI é expresso constitutivamente nas células,

enquanto o TNF-RII é induzido pela ação de metaloproteinases em resposta a sinais

inflamatórios. Quando liberado no local da resposta inflamatória, o TNF promove

ativação celular bem como a liberação de outras citocinas e mediadores químicos

(DINARELLO; MOLDAWER, 2000; ABBAS; SEELY, 2003; ISHII et al., 2010).

Os dados obtidos no presente trabalho demostram que fibroblastos L929

tratados com (2 ng/mL) por 240 minutos apresentam aumento na proliferação celular

em 24 e 48 horas, evidenciando assim um efeito positivo do TNF sobre a proliferação

de fibroblastos L929. Dados obtidos por Kanno e colaboradores (2013), mostram que

as células estruturais da pele, como queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais

vasculares, produzem TNF quando estimuladas por uma bactéria, o que leva a

infiltração de neutrófilos e acelera o processo de reparo tecidual. Em estudos

anteriores os mesmos autores concluíram que a inoculação com P. aeruginosa

(PAO1) favorece a cicatrização de feridas através da indução de infiltração de

neutrófilos, que desempenha um papel importante como fonte de TNF (KANNO et al.,

2011).

Por outro lado, dados da literatura também demostram que o TNF pode inibir a

reepitelização de feridas, mostrando assim que os efeitos dessa citocina são

dependentes da concentração e da duração da exposição. Em baixas concentrações

o TNF pode promover o reparo tecidual por agir indiretamente estimulando a

inflamação e induzindo a migração de neutrófilos e a liberação de fatores de

crescimento. No entanto, concentrações elevadas de TNF, especialmente durante

longos períodos, podem ter um efeito prejudicial sobre o processo de reparo, uma vez

que esta citocina tem a capacidade de suprimir a síntese de proteínas de matriz

extracelular e seus inibidores teciduais, enquanto aumenta a síntese das MMPs

(MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, e de MT1-MMP) (BARRIENTOS et al.,

62

2008). Ainda, em altas concentrações, através da sua atuação sobre receptores TNF-

R1, estimula a via de sinalização apoptótica, resultando no recrutamento e ativação

da caspase-8. A caspase-8 ativada por sua vez, ativa caspases efetoras tais como a

caspase-3 e-7, resultando em apoptose celular (ALIKHANI et al., 2004; WALLACH et

al., 2002).

Logo após a formação da lesão, o TNF será liberado a partir de diferentes

células, entre elas os fibroblastos e desta forma, iniciando o estímulo inflamatório

(FAHEY et al., 1990; MEDZHITOV, 2008; KANNO et al., 2013). Além disso, outros

mediadores e vias de sinalização são produtos da ação de citocinas, como é o caso

dos receptores B1 para cininas. Os mesmos são sintetizados e modulados

rapidamente em diversos tipos celulares após trauma tecidual e que sua indução é

resultante de uma cascata de eventos que envolvem também liberação de citocinas,

como por exemplo, IL-1 e TNF (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004; KAPLAN;

KUSUMAM, 2002).

Considerando a importância deste estímulo assim como a modulação da

cascata inflamatória para o processo de regeneração tecidual, a influência desta

citocina foi então primeiramente avaliada.neste trabalho.

Para confirmar o envolvimento do TNF na proliferação celular os fibroblastos


incubados com TNF co-administrados ou não com o anticorpo recombinante para a

mesma citocina durante 180 minutos.

Os resultados obtidos demonstram que a incubação das células com o TNF

potencializa o efeito proliferativo, o que foi comprovado através do bloqueio da

proliferação pelo anticorpo anti-TNF, levando os níveis proliferativos para níveis

inferiores aos obtidos apenas com incubação com o veículo. Estes dados direcionam

o raciocínio para a hipótese de que a proliferação celular do grupo tratado apenas com

veículo também é dependente de TNF liberado pelos próprios fibroblastos, sugerindo

que o estresse mecânico causado pela ruptura do contato célula-célula induz a síntese

de TNF. Diferentes estudos realizados com outros ensaios mencionam o efeito

proliferativo do TNF (HEO et al, 2011; VOLOSHENYUK et al, 2011).

Ao iniciar o estímulo proliferativo através da liberação de TNF acredita-se ainda

que este estresse mecânico também interfira na regulação de outros mediadores,

incluindo as cininas, nos fibroblastos levando-os à liberação destes.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Voloshenyuk%20TG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21893029

63

Cabe ressaltar que durante a fase de padronização do método foram testadas

várias concentrações de SFB para suplementação do meio de cultivo. Dados da

literatura sugerem a utilização de baixas concentrações de SFB para não interferir nos

resultados de proliferação bem como na possível degradação dos mediadores

utilizados (LOO; HALLIWELL, 2012). Por outro lado, ao cultivar as células sem

suplementação, ou seja, na ausência de fatores de crescimento ocorre uma privação

de nutrientes levando à morte celular, fato observado quando as células foram

cultivadas sem SFB. Foi então padronizada a concentração de 5% de SFB para a

suplementação e mantida no decorrer do trabalho.

Na vigência de um processo inflamatório induzido, por exemplo, pelo TNF,

outras vias intracelulares podem ser ativadas. A ligação do TNF aos seus dois

receptores, o TNFR1 e TNFR2, resulta em recrutamento de transdutores de sinais que

ativam, pelo menos, três diferentes vias. Através de uma complexa cascata de

sinalização, estes efetores levam à ativação de caspases e dois fatores de transcrição,

ativação da proteína-1 e NF-kappaB (BAUD, KARIN, 2001). Para confirmar a ativação

do fator de transcrição nuclear citado acima as células foram subtidas ao pré estímulo

com TNF, foram mantidas por 180 minutos e posteriormente subtidas ao contato de

um inibidor do fator de transcrição nuclear o PDTC. A incubação com PDTC inibe a

proliferação obtida pelo o estímulo do TNF, confirmando os dados citados por Baud e

colaboradores, 2001 onde descrevem que após a ligação do TNF aos seus receptores

ocorra a ativação de fatores de transcrição nuclear iniciando a cascata inflamatória e

a síntese de outros mediadores do processo.

Diversas evidências apontam que receptores B2 para cininas encontram-se

expressos de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares,

inclusive queratinócitos (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995) e são responsáveis

pela maioria das ações fisiológicas das cininas. Já os receptores B1 não são expressos

em níveis significativos nos tecidos em condições normais, mas são sintetizados e

rapidamente modulados em diversos tipos celulares após trauma tecidual ou durante

condições patológicas, indicando um mecanismo adicional na lesão e na recuperação

tecidual. Além disso, a indução do receptor B1 é resultante de uma cascata de eventos

que envolvem a interação entre fatores de transcrição, proteínas quinases, citocinas

e células inflamatórias (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004). Os receptores

B1 são preferencialmente e seletivamente estimulados pelos metabólitos ativos des-

64

Arg9-BK e Lys-des-Arg9-BK, enquanto que os receptores B2 apresentam alta afinidade

pela BK e Lys-BK (MARCEAU; REGOLI, 2004).

Evidências a partir de ensaios in vitro indicam que os agonistas do receptor de

cinina podem estimular a proliferação celular, em particular na presença de outros

fatores de crescimento e mediadores químicos. Esta afirmação feita por Walsh e Fan,

(1997) foi confirmada no presente trabalho quando fibroblastos L929 foram incubados

com concentrações crescentes de BK, após o pré-tratamento com TNF. Foi observado

que a proliferação se apresenta de forma distinta, sendo dose-dependente da

concentração de BK. Nas concentrações de 0,1 e 1 µM de BK não foi verificada

diferença no efeito proliferativo quando comparado ao grupo tratado somente com

TNFα (2ng/mL). De modo semelhante ao observado com o tratamento com TNF, a

BK, em concentrações elevadas (100 µM), reduziu a capacidade proliferativa dos

fibroblastos. De acordo com a literatura, esta diminuição na proliferação se deve em

partes a ação da BK sobre a liberação de ácido araquidônico, o qual é precursor para

a sintese das Ciclooxigeneses e consequente produção de PGE2, a qual apresenta

efeito anti-proliferativo (STRAUS; PANG, 1984). De fato, quando celulas são tratadas

com BK e um anti-inflamatório não esteroidal, como a indometacina, o efeito é

revertido (GOLDSTEIN; WALL, 1984, M MCALLISTER; LEEB-LUNDBERG; OLSON,

1993). Por outro lado, a dose de 10 µM de BK, 48 horas após o tratamento, apresentou

efeito adicional aos efeitos induzidos pelo TNF na proliferação, evidenciando assim

um efeito proliferativo da BK em fibroblastos L929.

Com o intuito de verificar o papel proliferativo da BK foi realizado o mesmo

procedimento sem o pré tratamento com TNF. Neste ensaio foi possível observar que

em nenhuma das concentração a BK promoveu aumento da proliferação de

fribroblastos L929, quando comparado ao grupo tratado apenas com PBS e também

quando comparado com as células pré estimuladas com TNF. Este resultado

demonstra uma dependência de um processo inflamatório pré-instalado, como o

promovido pelo pré-tratamento das células com TNF para induzir a cascata de

proliferação celular através da ação das cininas.

O efeito anti-proliferativo da BK foi anteriormente escrito por Patel e Schrey,

(1992) onde cita que o efeito proliferativo da BK pode apresentar uma curva de

concentração/resposta na forma de “sino” com a inibição em maiores concentrações

deste agonista. Este efeito é decorrente da mesma situação citada anteriormente,

65

onde doses elevadas de BK podem promover aumento da síntese de moléculas anti-

proliferativas como a PGE2.

Vários estudos sugerem que os receptores B2 das cininas são os responsáveis

pelas ações proliferativas da BK em fibroblastos. Linhagens de fibroblastos sensíveis

aos efeitos de crescimento estimulados pela BK expressam constitutivamente o

receptor B2 (ROBERTS, GULLICK, 1989; BATHON ET AL, 1992; MENKE et al, 1994;

KIEHNE, ROZENGURT, 1995).

Cheng e colaboradores (2004) demonstraram que a BK, através da ativação

dos receptores B2, apresenta efeito mitogênico por ativar a proteína Gq causando

fosforilação da via da PKC e consequente estimulação da via da MEK/ proteína

quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da expressão de c-fos e c-jun em cultura de

queratinócitos obtidos da córnea de coelhos. Também através de receptores B2, a BK

promove ativação da cascata da p42/p44 MAPK em vários tipos de células humanas,

incluindo as células da musculatura lisa vascular, endoteliais, PC-12 e linhagem de

células tumorais.

Após avaliação dos dados obtidos pode-se sugerir a participação dos

receptores B2 no efeito proliferativo de fibroblastos como observou Kiehne e

Rozengurt, (1994) em fibroblasto 3T3, onde o estímulo proliferativo da BK foi

bloqueado por antagonistas do receptor B2.

O uso de antagonistas para os receptores da cininas tem sido ferramenta

poderosa para determiar os papéis das cininas tanto em condições fisiológicas como

patológicas (STEWART et al, 1999). Foi então realizado um experimento adicionando

o agonista BK e a DABK, com e sem o pré-estímulo do TNF, co-administrados com

antagonista B1 e/ou B2, após este pré estímulo e mantidos em contato com as células

por 30 horas após o estresse mecânico. A BK foi capaz de causar aumento adicional

à prolferação celular obtida com a incubação somente com TNF. Porém sem o pré

estímulo com estacitocina não foi observado o mesmo resultado, onde a proliferação

celular foi menor do que às células tratadas apenas com o veículo. Quando as células

foram tratadas com TNF por 180 minutos e após incubadas com o antagonista do

receptor B2 HOE-140, houve uma diminuição da proliferação quando comparada às

células tratadas apenas com esta citocina.

Este resultado demonstra que existe participação das cininas na proliferação

induzida pelo TNF e esta proliferação pode ocorrer via indução de receptores B2, uma

vez que o antagonista seletivo deste receptor, HOE -140, foi capaz de inibir

66

significativamente a proliferação induzida pela BK em células estimuladas com TNF,

a níveis abaixo dos observados quando as células foram tratadas apenas com o

veículo e nas que foram induzidas apenas com o TNF.

Através deste resultado, acredita-se que a via de proliferação dependa

inicialmente do estímulo inflamatório gerado pelo estresse mecânico e pela adição do

TNF e em seguida da ação da BK sobre receptores B2, levando a proliferação a níveis

menores que o tratamento com veículo, para que após este estímulo a proliferação

seja desencadeada pelos receptores B1 através de mais liberação de TNF ao meio.

Esta hipótese foi construída baseada no fato de que o antagonista do receptor

B1 a DALBK também foi capaz interferir na proliferação celular induzida pelo seu

agonista DABK em células pré estimuladas com TNF assim com em células que

sofreram apenas o estrsse mecânico. Este fato pode ser discutido baseando-se em

relatos da literatura onde evidenciam que os receptores B2 encontram-se expressos

de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares (SCHREMMER-

DANNINGER et al., 1995) e são os principais responsáveis pelas ações fisiológicas

das cininas.

Com relação ao receptor B1, são sintetizados e modulados rapidamente em

diversos tipos celulares após trauma teciduais. Além disso, a indução do receptor B1

é resultante de uma cascata de eventos que envolvem a interação entre fatores de

transcrição, proteínas quinases, células inflamatórias e citocinas, como por exemplo,

IL-1 e TNF-α (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004; KAPLAN; KUSUMAM,

2002). Fato demonstrado por Brechter e colaboradores (2008) onde estudam os

efeitos de citocinas em células osteoblástica MG-6 e em fibroblastos gengivais

humanos, comprovando que ambos os receptores são sobre-regulados por IL-1β e

TNF nestas linhagens celulares.

Desta forma estes resultados sugerem duas hipóteses possíveis; onde a

DALBK bloqueie os receptores B1 que foram expressos rapidamente em minutos após

o estress mecânico ou que já existam receptores na membrana para que o antagonista

se ligue.

No mesmo estudo citado anteriormente os autores demonstram que ambos os

receptores B2 e B1 são constitutivamente expressos nas linhagens celulares de

osteoblastos MG-63 e em fibroblastos gengivais humano (BRECHTER et al, 2008). A

presença de forma constitutiva de receptores B1 já havia sido relata por Schremmer-

67

danninger e colaboradores (1999) onde demontraram que estes estão

constitutivamente expressos na pele normal

A Expressão constitutiva de Receptores B1 e B2 em linhagem IMR-90 de

fibroblasto pulmonar humano também foi detectada através da ligação específica de

[3H] desArg10KD e [3H] BK, respectivamente. Após incubação das células em meio

DMEM durante 6 h a 37 ° C, as células IMR-90 expressam receptores B1 e B2 em uma

proporção de cerca de 1:85 (PHAGOO, POOLE, LEEB-LUNDBERG, 1999)

Os dados obtidos até o momento demostram que a BK aumenta a atividade

proliferativa dos fibroblastos L929 atuando em receptores B2 após o estímulo celular

com TNF o que possivelmente favoreça o aumento da expressão deste receptor, no

entanto, a atuação dos receptores B1 não pode ser descartada. O efeito global das

cininas na proliferação celular depende, em parte, no nível relativo de B2 e da

expressão do receptor B1 (ROBERTS, GULLICK, 1989; TAYLOR et al., 1992). Uma

série de tipos celulares, incluindo fibroblastos, podem co-expressar tanto receptors B1

como B2, correspondentemente, a regulação da proliferação pelas cininas pode ser o

produto de diferentes ações simultâneas e através de ambos os receptores

(BASCANDS et al, 2003; MARCEAU; REGOLI, 2004).

Com base na afirmação anterior onde sugerem que o efeito das cininas na

proliferação celular depende, em partes, da expressão dos receptores B1 e B2 foi

também estudado o efeito do receptor B1 na proliferação celular de fibroblastos L929.

(ROBERTS; GULLICK, 1989; TAYLOR; 1992.). A expressão destes dois subtipos de

receptores pode ser regulada em diferentes situações. O receptor B2 como citado

anteriormente é expresso constitutivamente, embora ambos possam ser regulados

por mediadores inflamatórios, tais como a interleucina-1 (IL-1) e o TNF (BATHON et

aL, 1992; GALIZZI et aL, 1994).

Os dados obtidos no presente trabalho empregando um agonista seletivo de

receptores B1, a DABK, demonstraram que em nenhuma das concentrações

empregadas (0,1, 1, e 100 µM) após o pré-tratamento com TNF apresentaram

aumento do efeito proliferativo quando comparado ao grupo somente tratado apenas

com TNF em 24 ou 48 horas. No entanto, cabe ressaltar que o tratamento com DABK

na concentração de 0,1 e 1 µM apresentou efeito anti prolifertivo (dados não

demonstrados), ou seja, inibiu a proliferação celular induzida pelo pré-tratamento com

TNF. Walsh e Fan, (1997) assim como Bascands e colaboradores (2003), também

relatam em sua revisão a existência tanto de efeitos mitogênico e antimitogênico

68

relacionados às cininas, observados em diferentes linhagens celulares e em diferentes

condições, indicando a interação com várias vias importantes na regulação da

proliferação celular. Essa multiplicidade de ação pode resultar da ativação de segundo

mensageiros e de múltiplos subtipos de receptores. Um fator importante relacionado

aos efeitos antiproliferativos da DABK são as doses empregadas, pois os estudos

citados acima sugerem que doses muitos elevadas podem diminuir a proliferação

enquanto doses menos elevadas podem estimular a mesma, ativando vias distintas

dependendo da dose empregada.

Ao incubar os fibroblastos com doses 1000 vezes menores e sem pré estímulo

de TNF foi observado um efeito proliferativo quando comparado às células incubadas

somente com veículo. Porém ao efetuar o pré estímulo com TNF foi observado um

efeito proliferativo em todas as concentrações utilizadas do agonista seletivo do

receptor B1 a DABK. Importante citar que na metodologia inicialmente empregada o

agonista foi incubado e mantido em contato por 60 minutos e lavadas com PBS, como

a ação da DABK pode depender a expressão do receptor B1 talvez este tempo de

contato seja pouco para que ocorra uma significativa expressão dos mesmos,

interferindo no resultado. A adição de DABK 12 horas após o estresse mecânico e/ou

estímulo com TNF também pode interferir no resultado, em uma possível ação tardia

mediada pelos receptores B1, já que os mesmos são expressos após trauma tecidual

(BATHON et aL, 1992; GALIZZI et aL, 1994).

Foi então realizado um experimento em condições diferentes das inciais para

melhor padronização do método. As células foram pré estimuladas com TNF e após

180 minutos foram lavadas e tratadas com o agonista do receptor B1, DABK co-

administrados com seu antagonista seletivo e, assim como outro grupo foi tratado

apenas com o antagonista DALBK e outro apenas com o agonista, sem pre estímulo

do TNF e os tratamento foram mantidos por 30 horas em contato com as células.

A adição do antagonista seletivo para o receptor B1 (DALBK) foi capaz de

alterar a ação proliferativa do seu agonista DABK em células pré estimuladas com

TNF, diminuindo a proliferação até os níveis das células tratadas apenas com veículo,

porém ao administrar a DABK sem pré estímulo do TNF não houve aumento da

proliferação em relação às células tratadas apenas com TNF, demonstrando a

importância do estímulo inflamatório para início da cascata de proliferação. Um dado

importante obtido foi a diminuição de forma significativa da proliferação quando as

células foram tratadas apenas com o antagonista do receptor B1 DALBK, com e sem

69

pré estímulo do TNF, fato que demonstra o envolvimento também deste receptor na

cascata proliferativa dos fibroblastos L929 induzida pelo estresse mecânico e do

estímulo do TNF. Estes dados sustentam a hipótese de que esta cascata proliferativa

seja iniciada pelo TNF seguido da ativação do receptor B2 e consequente indução do

receptor B1 e mantida por mais TNF liberado.

A ativação de receptores B2 acoplados aos mecanismos de transdução pode

ser responsável pelo aumento da população de receptores B1, sugerindo a existência

de um processo de balanço entre as duas populações de receptores cininérgicos,

durante desordens inflamatórias (CALIXTO et al., 2000).

Outro fato importante a se acrescentar em relação à participação dos

receptores B1 é que, durante o desenvolvimento da inflamação, uma grande

quantidade de BK sofre a ação de carboxipeptidases, produzindo grandes

quantidades dos metabólitos ativos des-Arg9-bradicinina. Esta alta concentração

endógena dos agonistas seletivos para o receptor B1 demonstra que estes possuem

papel fundamental também na regulação de expressão dos receptores B1

(SCHANSTRA et al., 1998).

Processos inflamatórios cutâneos induzidos através de diferentes estímulos,

incluindo substâncias alergênicas ou através da radiação ultravioleta, disparam

respostas inflamatórias no tecido cutâneo induzindo diretamente queratinócitos e

estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias e BK. Nos queratinócitos, a

bradicinina induz o crescimento celular e este efeito pode ser induzido via receptores

específicos de cininas (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995).

Schremmer-Danninger e colaboradores (1995), utilizando técnicas

radiográficas, identificaram receptores específicos para bradicinina na camada basal

de epiderme humana sugerindo que as cininas podem estar envolvidas em

mecanismos de proliferação celular epidérmica.

Na tentativa de confirmar os efeitos do TNF e dos receptores para cininas na

proliferação de fibroblastos, foi utilizado o anticorpo anti-TNF em coadministração com

os agonistas de cininas em células pré estimuladas com TNF.

Assim como confirmado que o estímulo mecânico é importante para o início do

estímulo proliferativo, o pré estímulo dos fibroblastos com o TNF é capaz de

potencializar a ação poliferativa da BK. Os dados obtidos confirmam esta hipótese,

uma vez que ao incubar as células com TNF após 180 minutos tratá-las com BK, foi

observado um aumento da proliferação em relação às células tratadas com veículo,

70

assim como aquelas tratadas apenas com TNF. O pré-tratamento do anticorpo anti-

TNF coadministrado com o TNF por 180 minutos e posterior adição da BK e DABK ao

meio parece interferir na proliferação, diminuindo os níveis proliferativos quando

comparados às células tratadas apenas com a citocina e aquelas tratadas somente

com veículo. Acredita-se que o anticorpo bloqueie o TNF livre no meio de cultivo,

porém, e adição posterior dos agonistas cininérgicos não a BK foi capaz de manter o

estímulo proliferativo, comprovando novamente a dependência do estímulo

inflamatório induzido pelo TNF para início da cascata de ploriferação.

Os mecanismos descritos acima, podem levar à liberação ou mesmo

potencialização da ação de outros importantes mediadores inflamatórios como as

citocinas, assim como a ativação do fator de transcrição NF-B (PAN et al., 1998).

Estes resultados confirmam as evidências da literatura que sugerem que a BK

uma vez ligada ao receptor B2 seja capaz de manter o estímulo proliferativo através

da regulação de rceptores B1 e liberação de TNF (BRECHTER et al, 2008, PHAGOO

et al, 1999; SOUZA et al, 2013)

Com os dados até aqui obtidos neste estudo sugere-se que a BK via receptor

B2 e o TNF ativariam a via de transcrição para aumentar a expressão do receptor B1,

que se encontra expresso de modo constitutivo e por fim causar proliferação.

Pela ação observada após a co aministração do antagonista seletivo para

receptores B2, HOE-140, acredita-se que a via de proliferação dependa da ação da

BK sobre receptores B2, para que no final a proliferação seja desencadeada pelos

receptores B1 através de mais TNF, uma vez que a DALBK também foi capaz de inibir

a proliferação induzida pelo TNF.

O estresse mecânico causado pelo (rasgo) na monocamada é capaz de induzir

a liberação de TNF no meio. Entretanto, em menores concentrações, a adição de BK,

DABK e TNF, potencializa este efeito proliferativo dependente da dose e do tempo de

contato.

Cabe ressaltar que novos experimentos são necessários, para a melhor

visualização dos efeitos proliferativos das cininas. Desta forma, para confirmação

destes dados sugere-se a a incubação dos antagonistas e do anticorpo anti TNF 12

horas após a administração da BK, DABK ou TNF. Esta sugestão tem o objetivo de

bloquear o estímulo gerado durante as primeiras horas após a agressão mecânica,

bloqueando os mediadores gerados neste período, proporcionando desta forma a

71

obtenção de mais dados sobre o início da cascata de eventos envolvidos na

proliferação observada.

Ressalta–se ainda a importância da quantificação da expressão proteica e

gênica dos receptores B1 e B2, através de técnicas de biologia molecular como

Western Blot ou Real Time PCR. Adicionalmente, sugere-se a avaliação em condições

inicias (basais), assim como, nas condições testadas; na presença de TNF, na

presença dos agonistas (BK e DABK) com e sem estímulo do TNF, utilizando os

tempos zero, 12, 30 e 48 horas após estresse mecânco.

72

7 CONCLUSÕES

A partir da padronização do método “ Scratch “ em monocamada de fibroblastos

murinho L929, foi possível padronizar um método de reparo tecidual in vitro na

tentativa de se aproximar às condições reais de um processo inflamatório encontrado

na derme após a lesão tecidual, possível através da incubação celular com a citocina

TNF.

Os restultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:

Fibroblastos L929 tratados com TNF (2 ng/mL) por 240 minutos apresentam

aumento na proliferação celular em 24 e 48 horas.

O efeito proliferativo induzido pelo TNF é dependente da dose e do tempo de

incubação, o que foi comprovado através do bloqueio da proliferação pelo

anticorpo anti-TNF.

Sugere-se que o estresse mecânico causado pela ruptura do contato célula-

célula também induza a síntese de TNF

Acredita-se que a cascata de estímulo proliferativo inicada pela ligação do TNF

aos seus receptores esteja ocorrendo via a ativação de fatores de transcrição

nuclear iniciando a cascata inflamatória e a síntese de outros mediadores do

processo.

Ao iniciar o estímulo proliferativo através da liberação de TNF este estresse também

interfere na regulação de outros mediadores, incluindo as cininas.

A BK interfere na proliferação celular de fibroblastos submetidos ao estresse

mecânico.

Este estímulo é dependente do processo inflamatório ali instalado pelo TNF já

que sem o pré estímulo com esta citocina e incubadas com o agonista, as

células não apresentam o mesmo efeito proliferativo.

Existe participação das cininas na proliferação induzida pelo TNF e esta

proliferação pode ocorrer via indução de receptores B2, uma vez que o

antagonista seletivo deste receptor, HOE -140, foi capaz de inibir

significativamente a proliferação induzida pela BK em células estimuladas com

TNF.

O antagonista do receptor B1 a DALBK também foi capaz interferir na

proliferação celular induzida pelo seu agonista DABK em células pré

73

estimuladas com TNF assim com em células que sofreram apenas o estresse

mecânico, demonstrando o envolvimento também deste receptor na cascata

proliferativa dos fibroblastos L929 induzida pelo estresse mecânico e do

estímulo do TNF.

Acredita-se que a via de proliferação dependa inicialmente do estímulo

inflamatório gerado pelo estresse mecânico e pela adição do TNF e em seguida

da ação da BK sobre receptores B2, para que após este estímulo a proliferação

seja desencadeada pelos receptores B1 através de mais liberação de TNF ao

meio.

Juntos, os dados obtidos mostram a importância do processo inflamatório, aqui

representado pelo estímulo prévio do TNF, para a proliferação celular de fibroblastos

murino L929 e que o efeito das cininas na proliferação é dependente deste estimulo

inflamatório, já que as mesmas sozinhas não apresentam efeito proliferativo evidente.

Ainda, o efeito das cininas na proliferação parece ser dependente da ativação de

receptores B2 mas os dados indicam participação também dos receptores B1 já que o

antagonista seletivo deste também interfere na diminuição da proliferação induzida

pelo TNF.

Os resultados obtidos no presente trabalho em conjunto com dados da

literatura, mostraram que esta estratégia é uma ferramenta disponível para a

investigação do processo de cicatrização in vitro

74

REFERÊNCIAS

ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. IMUNOLOGIA BÁSICA: Funções e Distúrbios do Sistema Imune. 2ed, Rio de Janeiro: Revinter, 2003 ADETUTU, A., MORGAN, W.A., CORCORAN, O., Ethnopharmacological survey and in vitro evaluation of wound-healing plants used in South-western Nigeria. J. Ethnopharmacol., v. 137, p. 50– 56, 2011 AGREN, M.S., TAPLIN, C.J., WOESSNER, J.F. JR., EAGLSTEIN, W.H., MERTZ, P.M. Collagenase in wound healing: effect of wound age and type, J Invest Dermatol, v. 99, p 709-14, 1992. ALIKHANI, M.; ALIKHANI, Z.; RAPTIS, M.; GRAVES, D. T. TNF-α In Vivo Stimulates Apoptosis in Fibroblasts Through Caspase-8 activation and Modulates the expression of Pro-Apoptotic Genes .Journal Of Cellular Physiology, v.201, p.341–348, 2004 BALBINO, C. A.; PEREIRA, L. M.; CURI, R. Mecanismos envolvidos na cicatrização: uma revisão. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 41, n. 1, jan./mar. 2005. BARRIENTOS, S.; STOJADINOVIC, O.; GOLINKO, M. S.; BREM, H.; MARJANA TOMIC-CANIC, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Rep Reg, v.16, p. 585–601, 2008. BASCANDS, L., SCHANSTRA, J. P., COUTURE, R., GIROLAMI J.P. Les récepteurs de la bradykinine: de nouveaux rôles physiopathologiques. Medecine/Sciences, v. 19, p. 1093-100, 2003 BATHON, J.M., MANNING, D.C., GOLDMAN, D.W., TOWNS, M.C. AND PROUD, D. Characterization of kinin receptors on human synovial cells and upregulation of receptor number by interleukin-1. J. Pharmacol. Exp. Ther. V. 260, p.384-392, 1992 BAUD, V.,KARIN, M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives.Trends Cell Biol, v.11 , p. 372-7, 2001 BHOOLA, K. D.; FIGUEROA, C. D. E.; WORTHY, K. Bioregulation of kinins: kallikreins,kininogens, and kininases. Pharmacol. Ver., v. 44,n. 1, p .1-80, 1992. BRAIMAN-WIKSMAN, L.; SOLOMONIK, I.; SPIRA, R.; TENNENBAUM, T. Novel Insights into Wound Healing Sequence of Events. Toxicologic Pathology, v. 35, p.767–779, 2007 CAMPOS, M. M; CALIXTO, J. B.; Involvement of B1 and B2 receptors in badykinin-induced rat paw oedema. Br.J. Pharmacol., v. 114, p.1005-1013, 1995. CAMPOS, M. M; MATA, L. V.; CALIXTO, J. B.; Expression of B1 kinin receptors mediating paw edema and formalin-induced nociception modulation by glucocorticoids. Can. J. Physiol. Pharmacol., v. 73, p. 812-819, 1995.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Agren%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1469286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Taplin%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1469286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Woessner%20JF%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1469286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eaglstein%20WH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1469286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mertz%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1469286

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mertz%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1469286

75

CAMPOS, M. M.; SOUZA, G. E. P.; RICCI, N. D.; PESQUERO, J. L.; TEIXEIRA, M. M; CALIXTO, J. B. The role of migrating leukocytes in IL-1b-induced up-regulation of kinin B1receptors in rats.Br. J. Pharmacol., v.135, p.1107-1114, 2002. CALIXTO, J. B.; CABRINI, D. A.; FERREIRA, J. E.; CAMPOS, M. M. Kinins in pain and inflammation. Pain, v. 87, n.1, p.1-5, 2000. CALIXTO, J. B; MEDEIROS, R.; FERNANDES, E. S.; FERREIRA, J.; CABRINI, D. A.; CAMPOS, M. M. Kinin B1 receptors: key G-protein-coupled receptors and their role in inflammatory and painful processes. Br. J. Pharmacol., v. 143, n. 7, p. 803-818, 2004. CHEN, C.C., YOUNG, J. L., MONZON, R. I., CHEN, N., TODOROVIC, V., LAU, L.F. Cytotoxicity of TNF-α is regulated by integrinmediated matrix signaling. EMBO J., v. 26, p. 1257–1267, 2007 CHENG, C. Y.; HUANG, S. C.; HSIAO, L. D.; SUN, C. C.; JOU, M. J.; YANG, C. M. Bradykinin-stimulated p42/p44 MAPK activation associated with cell proliferation in corneal keratocytes. Cell Signal, v.16, n. 5, p. 535-549, 2004. CHENG, C.; TSENG, H.C.; MAO, Y.C. Bradykinin-Mediated Cell Proliferation Depends on Transactivation of EGF Receptor in Corneal Fibroblasts. J. Cell. Physiol, v. 227, p. 1367–1381, 2012 CHIARI, B. G.; MAGNANI. C.; SALGADO, H. R. N.; CORRÊA, M. A.; ISAAC, V. L. B.; Estudo da segurança de cosméticos: presente e futuro. Rev Ciênc Farm Básica Apl, v.33, n. 3, p. 323-330, 2012. CLARK, R. A. F. Cutaneous tissue repair: basic biologic considerations. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 13, p. 701-725, 1985. CLARK, E.; SCERRI, L. Superficial and medium-depth chemical peels. Clinics in Dermatology, v. 26, p. 209–218, 2008 COUGHLIN, S.; LEE, W.M.; WILLIAMS, P.W.; GIELS, G.M.; WILLIAMS, L.T. c-myc gene expression is stimulated by agents that activate protein kinase C and does not account for the mitogenic effect of PDGF. Cell, v.43, p.243-251, 1985. DINARELLO, C. A. Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor antagonista. Int. Rev. Immunol., v. 16, p. 457-499, 1998 DINARELLO, C.A., MOLDAWER, L.L. Proinflammatory and Anti-inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis. A primer for clinicians, 2ed, Amgen, 2000 EMING, S.; KRIEG, T.; DAVIDSON, J.M.Inflammation in Wound Repair: Molecular and Cellular Mechanisms. Journal of Investigative Dermatology, v. 127, p.514-525, 2007. ENOCH, S.; LEAPER, D. J. Basic science of wound healing. Surgery, v. 36, n. 2, p. 31-37, fev. 2008.

http://www.sciencedirect.com.ez119.periodicos.capes.gov.br/science/journal/02639319

76

FAHEY, T. J.; SHERRY, B.; TRACEY, K. J.; DEVENTER V. S.; JONES, W. G.; MINEI, J. P.; MORGELLO, S.; SHIRES, G. T.; CERAMI, A. Cytokine production in a model of wound healing: The appearance of MIP-1, MIP-2, cachectin/TNF-α and IL-I, Cytokine, v. 2, p. 92-99, 1990

FERNANDES, E. S.; PASSOS, G. F.; CAMPOS, M. M.; ARAUJO, J. G. V. C.; PESQUERO, J. L.; AVELLLAR, M. C.; TEIXEIRA, M. M.; CALIXTO, J. B. Mechanisms underlying the modulatory action of platelet activating factor (PAF) on the upregulation of kinin B1 receptors in the rat paw. Br.J.Pharmacol., v.139, n. 5, p. 973-981, 2003. FERREIRA, J.; TRICHES, K. M.; MEDEIROS, R. et al..Mechanismis involved in the nociception produced by peripheral protein kinase C activation in mice.Pain.v.117, p.171-181, 2005. FISCHER, T.C; PEROSINO, E.; POLI, F.; VIERA, M.S.; DRENO, B. Chemical peels in aesthetic dermatology: an update 2009. Journal European Academy of Dermatology and Venereology, v.24, p. 281–292, 2010. FREINKEL, R. K.; WOODLEY, D. T. The Biology of the Skin. Lancaster: Parthenon, 2001. GAD, C.S. Recent developments in replacing, reducing, and refining animal use in toxicologic research and testing. Fundam. Appl. Toxicol.,v. 5, n. 1, p. 8-16, 1990 GALIZZI, J.P.; BODINIER, M.C.; CHAPELAIN, B.;LY, S.M.; COUSSY, L.; GIROUD, S., NELIAT, G.; JEAN, T. Up-regulation of [SH]-des-Arg10 binding to the bradykinin B 1 receptor by intedeukin-l[3 in isolated smooth muscle cells: correlation with B1 agonist-induced PGI 2 production. Br. J. Pharmacol. V. 113,p.389-394,1994. GAO, L.; CHAO, L.; CHAO, J. A novel signaling pathway of tissue kallikrein in promoting keratinocyte migration: Activation of proteinase-activated receptor 1 and epidermal growth factor receptor. Experimental Cell Research, v. 316, p. 376-389, 2010. GNIADECKI, R. Regulation of keratinocyte proliferation. Gen. Pharmacol., v. 30, n. 5, p. 619-622, 1998. GODIN, C.; SMITH, A.D.; RILEY, P.A. Bradykinin stimulates DNA synthesis in competent Balb/c 3T3 cells and enhances inositol phosphate formation induced by platelet- derived growth factor. Biochem. Pharmacol., v 42, p.117-122, 1991. GOLDBERG, M.T.; HAN, Y.P.; YAN, C.; SHAW, M. C.; GARNER, W. L. TNF-α Suppresses a-Smooth Muscle Actin Expression in Human Dermal Fibroblasts: An Implication for Abnormal Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology, v. 127, p. 2645–2655, 2007.

77

GOLDSTEIN, R. H.; WALL, M. Activation of Protein Formation and Cell Division by Bradykinin and Des-Argg-bradykinin. The Journal of Biological Chemistry, V.259, p. 9263-9268, 1984 GOUGAT, J.; FERRARI, B.; SARRAN, L. et al..SSR240612 [(2R)-2-[((3R)-3-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-3-{[(6-methoxy-2-naphthyl)sulfonyl]amino}propanoyl)amino]-3-(4-{[2R,6S)-2,6-dimethylpiperidinyl]methyl}phenyl)-N-isopropyl-Nmethylpropanamide Hydrochloride], a New Nonpeptide Antagonist of the Bradykinin B1Receptor: Biochemical and Pharmacological.J. Pharmacol. Exp. Ther, v.309, p. 661-669, 2004. GURTNER, G. C.; WERNER, S.; BARRANDON, Y.; LONGAKER, M. Wound repair and regeneration. Nature, v.453, p.314-321, 2008 HARRIS, M. I. N. C. Pele: estrutura, propriedades propriedades e envelhecimento. 3. ed. rev. e ampl . São Paulo, SP: SENAC, 2009. HENRY, G.; GARNER, W. L., Inflammatory mediators in wound healing, Surg. Clin. N. Am.,v. 83, p. 483-507, 2003 HEO, S. C., JEON, E. S., LEE, H.I., KIM, H. S., KIM, M. B., KIM, J. H. Tumor Necrosis Factor-a-Activated Human Adipose Tissue–Derived Mesenchymal Stem Cells Accelerate Cutaneous Wound Healing through Paracrine Mechanisms. Journal of Investigative Dermatology, v. 131, p. 1559–1567, 2011, HERSON, M. Processo de cura de feridas. In: MAIO, Mauricio de. Tratado de medicina estética. São Paulo: Roca, 2004. cap. 35, p.723-729.

ISHII, D.; SCHENK, A.D.; BABA, S.; FAIRCHILD, R.L. Role of TNFα in Early Chemokine Production and Leukocyte Infiltration into Heart Allografts. Am J Transplant, v.10, n.1, p. 59-68, 2010.

KAMATA, H., HONDA, S., MAEDA, S., CHANG, L., HIRATA, H., KARIN, M. Reactive oxygen species promote TNFalpha-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases. Cell, v. 120, p.: 649–661, 2005. KANNO, E.; KAWAKAMI, K.; RITSU, M.; ISHII, K.; TANNO, H.; TORIYABE, S. ; IMAI, Y. ; MARUYAMA, R. ; MASAHIRO, T. Wound healing in skin promoted by inoculation with Pseudomonas aeruginosa PAO1: The critical role of tumor necrosis factor-a secreted from infiltrating neutrophils. Wound. Rep. Reg.,v. 19, p. 608–62 , 2011. KANNO, E.; KAWAKAMI, K.; MIYAIRI, S.; TANNO, H.; OTOMARU, H.; HATANAKA, A.; SATO, S.; ISHII, K.; HAYASHI, D.; SHIBUYA, N.; IMAI, Y.; GOTOH, N.; MARUYAMA, R.; TACHI, M. Neutrophil-derived tumor necrosis factor-a contributes to acute wound healing promoted by N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone from Pseudomonas aeruginosa. J. Dermatol. Sci., v.70, p. 130–138, 2013.

http://siaibib01.univali.br/biblioteca/php/pbasbi2.php?codAcervo=191404&codBib=,&codMat=,&flag=A&desc=gane&titulo=Pesquisa%20B%C3%A1sica&contador=0&tipo=&letra=&cod=&texto=&posicao_atual=1&posicao_maxima=2

http://siaibib01.univali.br/biblioteca/php/pbasbi2.php?codAcervo=191404&codBib=,&codMat=,&flag=A&desc=gane&titulo=Pesquisa%20B%C3%A1sica&contador=0&tipo=&letra=&cod=&texto=&posicao_atual=1&posicao_maxima=2

78

KAPLAN, A.P.; KUSUMAM, J.; SILVERBERG,M.Pathways for bradykinin formation and inflammatory disease. J.Allergy Clin.Immunol., v.109 (2), p. 195–209 , 2002 KIEHNE, K; ROZENGURT, E. Synergistic stimulation of DNA synthesis by bradykinin and vasopressin in Swiss 3T3 cells. J. Cell. Physiol., v.160, p. 502-51, 1994. KIMURA, A.; KANAZAWA, N.; LI, H.J.; YONEI, N.; YAMAMOTO,Y.; FURUKAWA, F. Influence of chemical peeling on the skin stress response system. Experimental Dermatology, v. 21,p. 8–10, 2012 KYRITSIS. N, KIZIL. C, ZOCHER. S, KROEHNE. V, KASLIN.J, FREUDENREICH. D, ILTZSCHE. A, BRAND. M, Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science, v.7, p. 1353-6, 2012 LAU, K.; PAUS, R.; TIEDE, S.; DAY, P.; BAYAT, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Experimental Dermatology, v.18, p. 921-933, 2009. LIANG, C. C.; PARK, A. Y.; GUAN, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc., v. 2, n. 2, p. 329-333, 2007.

LOO, A.E.K.; HALLIWELL, B. Effects of hydrogen peroxide in a keratinocyte-fibroblast co-culture model of wound healing, Biochemical and iophysical

Research Communications, v. 423, p.253-258, 2012. MANDELBAUM, S. H.; DI SANTIS, E. P.; MANDELBAUM, M. H. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares - Parte I - An Bras. Dermatol., v. 78, n. 4, p. 393-410, jul./ago. 2003. MARCEAU, F.; HESS, J. F. E.; BACHVAROV, D. R. The B1 receptors for kinins. Pharmacol .Rev., v. 50, n. 3, p. 357-386, 1998. MARCEAU, F.; REGOLI, D. Bradykinin receptor ligands: therapeutic perspectives. Nat. Ver. Drug. Discov., v. 3, n. 10, p. 845-852, 2004. MATUS, C. E.; EHRENFELD, P.; PAVICIC, F.; SARMIENTO, J. M.; ASTROZA, A.; SANCHEZ, T.; SALEM, C.; CONCHA, M.; VIDAL, M. A.; GONZALEZ, C. B.; FIGUEROA,C. D. Activation of kinin B receptor triggers differentiation of cultured human keratinocytes. Br. J. Dermatol., v. 159, n. 4, p. 792-803, 2008. MCEACHERN, A. E.; SHELTON, E. R.; BHAKTA, S.; OBERNOLTE, R.; BACH, C.; ZUPPAN, P.; FUJISAKI, J.; ALDRICH, R. W.; JARNAGIN, K. Expression cloning of a rat B2 bradykinin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., v. 88, n. 17, p. 7724-8, 1991.

MCALLISTER, B.S; LEEB-LUNDBERG, F.; OLSON, M. S., Bradykinin inhibition of

EGF- and PDGF-induced DNA synthesis in human fibroblastos. American Journal of

Physiology - Cell Physiology, v.265, p. 477-484,1993

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kyritsis%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kizil%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zocher%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kroehne%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kaslin%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Freudenreich%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Freudenreich%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Iltzsche%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brand%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23138980

79

MCLEAN, P.; PERRETTI, M.; AHLUWALIA, A. Kinin B receptors and the cardiovascular system: regulation of expression 1 and function. Cardiovascular Res. v. 48, p. 194–210, 2000. MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation. NATURE, v. 454,

2008.

MENDONÇA, R.J.; COUTINHO-NETTO, J. Aspectos celulares da cicatrização. An Bras. Dermatol., v. 84, n. 3, p 257-62, 2009. MENKE, J. G.; BORKOWSKI, J. A.; BIERILO, K. K.; MACNEIL, T.; DERRICK, A. W.; SCHNECK, K. A.; RANSOM, R. W.; STRADER. C. D.; LINEMEYER, D. L.; HESS, J. F.Expression cloning of a human B1 bradykinin receptor. J. Biol. Chem., v. 9, n. 34, p. 21583-6, 1994. MICHALIK, L.; DESVERGNE, B.; TAN, N. S.; MODAK, S. B; ESCHER, P.; RIEUSSET, J.; PETERS, J. M.; KAYA, G.; GONZALEZ,F.J.; ZAKANY, J.; METZGER, D.; CHAMBON, P.; DUBOULE, D.; WAHLI, W. Impaired skin wound healing in peroxisome proliferator–activated receptor (PPAR)α and PPARβ mutant mice. The Journal of Cell Biology, v.154, n.4, p. 799–814, 2001. MONACO,J.L.; LAWRENCE, W.T. Acute wound healing An overview, Clin Plastic Surg, v. 30 , p. 1-12, 2003. NESTLE, F.O.; MEGLIO, P.D.; QIN, J.; NICKOLOFF, B.J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews Immunology, v. 9, p. 679-691, 2009. PARK, J.E.; BARBUL, A.; nderstanding the role of immune regulation in wound healing, The American Journal of Surgery,v. 187, p.11-16, 2004 PASPARAKIS, M.; HAASE, I.; NESTLE, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology, 2014. PATEL, K.V.; SCHREY, M.E Inhibition of DNA synthesis and growth in human breast stromal cells by bradykinin: evidence for independent roles of B1 and B2 receptors in the respective control of cell growth and phospholipid hydrolysis. Cancer Res.,v. 52, p. 334-340, 1992. PEREDA-MIRANDA, R.; BAH, M. Biodynamic constituents in the Mexican morning glories: purgative remedies transcending boundaries. Curr. Top. Med. Chem., v. 3,p.111–131, 2003. PEREDA-MIRANDA, R.; ROSAS-RAMÍREZ, D.; CASTAÑEDA-GÓMEZ, J.. RESIN glycosides from the morning glory family. In: Kinghorn, A.D., Falk, H., Kobayashi, J. (Eds.),Progress in the Chemistry of Natural Products, v. 92. Springer, New York, p.77–153, 2010. PHAGOO, S. B., POOLE, S., LEEB-LUNDBERG, L. M. F. Autoregulation of Bradykinin Receptors: Agonists in the Presence of Interleukin-1b Shift the Repertoire

80

of Receptor Subtypes from B2 to B1 in Human Lung Fibroblasts, molecular pharmacology, v. 56, p. 325–333 ,1999

PHIPPS, J. A.; FEENER, E. P., The kallikrein–kinin system in diabetic retinopathy: Lessons for the kidney. Kidney International, v.73, p.1114-1119, 2008.

PIETROVSKI, E. F.; PALUDO, K. S.; MENDES, D. A. G. B.; GUIMARÃES, F. S. F.; VEIGA, S. S.; BUCHI, D. F.; FONSECA , R. G.; ZAMPRONIO, A. R.; BADER, M.; PESQUERO, J. B.; FERREIRA, J.; OTUKI, M. F.; CABRINI, D. A. B1 and B2 kinin receptor participation in hyperproliferative and inflammatory skin processes in mice. Journal of Dermatological Science, v. 64, p. 23-30, 2011. POBLETE, M. T.; REYNOLDS, N. J.; FIGUEROA, C. D.; BURTON, J. L.; MÜLLERESTERL, W.; BHOOLA, K. D. Tissue kallikrein and kininogen in human sweat glands andpsoriatic skin. Br. J. Dermatol., v. 124, n 3, p. 236-341, 1991. PROKSCH, E.; BRANDNER, J. M.; JENSEN, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp. Dermatol., v. 17, n.12, p.1063-1072, 2008. . RAJA, SIVAMANI, K , GARCIA, M. S.,ISSEROFF, R. R., Wound reepithelialization: modulating keratinocyte migration in wound healing. Front Biosci., v. 12, p. 2849–68 ,2007

RAMALHO, F.S.; A regeneração hepática e os inibidores da enzima conversora da angiotensina, Acta Cir. Bras., v.15, 2000

REGOLI, D. E.; BARABÉ, J. Pharmacology of bradykinin and related kinins. Pharmacol. Rev., v. 32, n. 1, p. 1-46, 1980

ROBERTS, I.L.A.; GULLICK, W.J. Bradykinin receptor number and sensitivity to ligand stimulation of mitogenesis is increased by expression of a mutant ras oncogene. J. Cell Sci. v.94, p. 527-535, 1989 ROGERS, K.L; GRICE, I.D., GRIFFITHS, L.R. Inhibition of platelet aggregation and 5-HT release by extracts of Australian plants used traditionally as headache treatments. Eur J Pharm Sci., v.9, p. 355-363, 2000. RUSENHACK, C. Microdermoabrasão. In: BORGES, (Org.). Dermato-Funcional: modalidades terapêuticas nas disfunções estéticas. São Paulo: Phorte, 2006. Cap. 4, p. 101-115. RUSSEL, W.M.S.; BURCH, R.C. The principles of human experimental technique. London: Methuen; 1959.

81

SABATINI, F.; LUPP, F., PETECCHIA, L.; STEFANO, A.D.; LONGO, A. M.; EVA, A.; VANNI, C.; PIETER, S.H.; STERK PETER,J.; SORBELLO, V.; FABBRI, L. M.; ROSSI, G. A.; RICCIARDOLO, F.M. Bradykinin-induce de asthmatic fibroblast/myofibroblast activities via bradykininB2 receptor and diferente MAPKpathways. European Journal of Pharmacology, v. 710, p.100-109, 2013. SAKON, S., XUE, X., TAKEKAWA, M., SASAZUKI, T., OKAZAKI, T., KOJIMA, Y., PIAO, J.H., YAGITA, H., OKUMURA, K., DOI, T., NAKANO, H. NF-kappaB inhibits TNF-induced accumulation of ROS that mediate prolonged MAPK activation and necrotic cell death. EMBO J. , v.22,p. 3898–3909, 2003 SATISH. L, KATHJU. S. Cellular and Molecular Characteristics of Scarless versus Fibrotic Wound Healing. Dermatology Research and Practice, v. 2010, p. 1-11, 2010 SCHREMMER-DANNINGER, E.; HEINZ-ERIAN, P.; TOPFER-PETERSEN, E.; ROSCHER, A. A. Autoradiographic localization and characterization of bradykinin receptors in human skin. Eur. J. Pharmacol., v. 283,n. 1-3, p. 207-216, 1995. SCHREMMER-DANNINGER, E.; HERMANN, A.; FINK, E.; FRITZ, H.; ROSCHER, A. A.Identification and occurrence of mRNAs for components of the kallikrein-kinin system inhuman skin and in skin diseases. Immunopharmacology , v. 43, n. 2-3, p. 287-291, 1999. SCHREMMER-DANNINGER, E.; NAIDOO, S.; NEUHOF, C.; VALESKE, K.; SNYMAN, C.; SANDER, C.; BHOOLA, K. D.; NEUHOF, H. Visualisation of tissue kallikrein, kininogen and kinin receptors in human skin following trauma and in dermal diseases. Biol. Chem., v. 385, n. 11, p. 1069-1076, 2004. SEELY, A.J.E.; PASCUAL, J.L.; CHRISTOU, N.V. Science review: Cell membrane expression (connectivity) regulates neutrophil delivery, function and clearance. Critical Care, Ottawa, v. 7, p. 291-307, 2003

SHEIKH, I.A.; KAPLAN, A.P. Mechanism of digestion of bradykinin and lysylbradykinin (kallidin) in human serum. Role of carboxypeptidase, angiotensin-converting enzyme and determination of final degradation products. Biochemical Pharmacology. v. 38, n. 6, p. 993-1110, 1989

SINGER. A. J.; CLARK, M. D. Cutaneous wound healing. N. Engl.J .Med., v. 341, p. 738-746, 1999. SONG, H. Y.; JU, S. M.; GOH, A. R.; KWON, D.; CHOI, S. Y.; PARK, J. Suppression of TNF-alpha-induced MMP-9 expression by a cell-permeable superoxide dismutase in keratinocytes. JBMB, v. 44, n. 7, p. 462-467, 2011. SOUZA, P.P.C.; BRECHTER, A.B.; REIS, R.I.; COSTA, C.A.S.; LUNDBERG, P.; LERNER, U.H. IL-4 and IL-13 inhibit IL-1b and TNF-α induced kinin B1 and B2 receptors through a STAT6-dependent mechanism. British Journal of Pharmacology, v. 169, p. 400-412, 2013.

82

STRAUS, D.S; PANG, K.J. Effects of bradykinin on DNA synthesis in resting NIL8 hamster cells and human fibroblasts. Exp. Cell Res. V. 151, p.129-135, 1984. STEWART, J. M., GERA, L., YORK, E. J., CHAN, D. C., BUNN, P. Bradykinin antagonists: present progress and future prospects, Immunopharmacology , v. 43, p. 155–161, 1999 SUGARMAN, B.J., AGGARWAL, B.B., HASS, P.E.,FIGARI, I.S., PALLADINO, M.A. JR.,SHEPARD, H.M. Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro. Science, v. 230, n. 4728, p.943-945, 1985 TAYLOR, L.; RICUPERO, D.; JEAN, J.C.; JACKSON, B.A.; NAVARRO, J.; POLGAR, P. Functional expression of the bradykinin-B 2 receptor cDNA in Chinese hamster lung CCL39 fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., v.188, p.786-793, 1992. YAMAMOTO, T.; TSURUTA, J.; KAMBARA, T. Interstitial-tissue localization of highmolecular-weight kininogen in guinea-pig skin. Biochem Biophys Acta, v. 16, n. 3, p. 332-342, 1987. VANCHERI, C; GILI, E; FAILLA, M.; MASTRUZZO, C.; SALINARO, E.T.; LOFURNO, D.; PISTORIO, M. P.; ROSA, C.; CARUSO, M.; CRIMI, N. Bradykinin differentiates human lung fibroblasts to a myofibroblast phenotype via the B2 receptor. J. Allergy. Clin. Immunol., v.116, p. 1242-8, 2005. VIDAL, M. A.; ASTROZA, A.; MATUS, C. E.; EHRENFELD, P.; PAVICIC, F.; SANCHEZ, T.; SALEM, C.; FIGUEROA, J.; CONCHA, M.; GONZALEZ, C. B.; FIGUEROA, C. D. Kinin B2 Receptor-Coupled Signal Transduction in Human Cultured Keratinocytes. J. Invest. Dermatol., v. 124, n. 1, p. 178-186, 2005.

VOLOSHENYUK, T.G,HART, A.D.,KHOUTOROVA, E.,GARDNER, J.D. TNF-α increases cardiac fibroblast lysyl oxidase expression through TGF-β and PI3Kinase signaling pathways. Biochem Biophys Res Commun, v. 413, p.370-375, 2011

WALLACH, D., ARUMUGAM, T. U., BOLDIN, M. P., CANTARELLA, G., GANESH,K. A., GOLTSEV, Y., GONCHAROV, T. M, KOVALENKO, A. V., RAJPUT ,A., VARFOLOMEEV, E., ZHANG, S. Q. How are the regulators regulated ? The search for mechanisms that impose specicity on induction of cell death and NF-kB activation by members of the TNF/NGF receptor family. Arthritis Res., v. 4, p. 189-196, 2002 WALSH, D.A., FAN, T.D. Bradykinin as a Growth Factor. In: Farme, S. G.The Kinin System. Elsevier Ltd.,1997.p 301-314. WIERNAS,K., DAVIS,L.T., GRIFFIN,B.W., SHARIF, N.A. Effects of bradykinin on signal transduction, cell proliferation, and cytokine, prostaglandin E2 and collagenase-1 release from human corneal epithelial cells. British Journal of Pharmacology, v. 123, p. 1127-1137, 1998,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sugarman%20BJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Aggarwal%20BB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hass%20PE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Figari%20IS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Palladino%20MA%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Palladino%20MA%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shepard%20HM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3933111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Voloshenyuk%20TG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21893029

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hart%20AD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21893029

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khoutorova%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21893029

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gardner%20JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21893029

http://www.sciencedirect.com/science/book/9780122493409

http://www.sciencedirect.com/science/book/9780122493409

83

YADAV, K. S.; YADAV, N. P.; RAWAT, B.; RAI, V. K.; SHANKER, K.; RAO, C. V. An Assessment of Wound Healing Potential of Argyreia speciosa Leaves. Hindawi Publishing Corporation. The Scientific World Journal, 2014. YUSSOF, S. M., OMAR, E., PAI, D., SOOD, S. Cellular events and biomarkers of wound healing. Indian Journal of Plastic Surgery. V.45 .p.220, 2012

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ O PAPEL DAS CININAS E A ...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ O PAPEL DAS CININAS E A ...