Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e...

Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Tatiana de Moura Pereira

CARACTERIZAÇÃO DE GENES DE Paracoccidioides brasiliensis ASSOCIADOS À FUNÇÃO DA ATP SINTASE

MITOCONDRIAL

.

São José dos Campos, SP 2006

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Tatiana de Moura Pereira

CARACTERIZAÇÃO DE GENES DE Paracoccidioides brasiliensis ASSOCIADOS À FUNÇÃO DA ATP SINTASE

MITOCONDRIAL

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Gorgônio da Nóbrega

São José dos Campos, SP 2006

Dedico aos meus pais, João Bosco e Cecilia por terem me apoiado e sempre acreditado em mim...

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco G. Nóbrega, por quem tenho grande

admiração. Obrigada por ter me acolhido no laboratório de Genética e principalmente pela

paciência e confiança em mim depositada.

A Prof. Dra. Marina P. Nóbrega pelos ensinamentos, pelas ricas discussões e

entusiasmo com a pesquisa científica.

A Prof. Dra. Maria Sueli Soares Felipe por ter gentilmente cedido alguns clones de

cDNA de Paracoccidioides brasiliensis.

A todos os colegas do Laboratório de Genética Molecular e Genomas (LGMG) por

esses anos de convívio, pelas inúmeras experiências trocadas e as divertidas conversas nas

horas de descontração. Em especial a Flavia e ao Luciano.

As minhas queridas amigas Amanda, Carol, Kátia, Milena e Raquel pelos conselhos

dados nas horas de dúvida, pelo ombro amigo oferecido nas horas de desespero e não

poderia esquecer das nossas reuniões divertidíssimas. Valeu Amigas!!!

Ao meu querido namorado Francisco (Chico) pela experiência compartilhada, pela

paciência dedicada, pela grande ajuda com as filogenias e principalmente pelo

companheirismo e carinho demonstrado ao longo desses anos todos ao meu lado. Amo

você!!!

A todas as pessoas da minha família principalmente a minha mãe, meu pai e meus

irmãos Alexandre e Juliano que sempre acreditaram no meu potencial, me apoiaram e

torceram por mim e tenho certeza que continuarão torcendo. Amo todos vocês!!!

A Família Moral pelo carinho sempre...

A FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pela bolsa de

mestrado concedida (03/04553-2) e pelo financiamento desse projeto e ao CNPq.

"Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir

um castelo".

Fernando Pessoa

RESUMO

O fungo patogênico termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (PB), agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), apresenta-se sob a forma de micélio, quando cresce à temperatura ambiente (23 a 28o C) ou em seu habitat (solo) e sob a forma de levedura quando à temperatura de 37o C ou no hospedeiro. Essa transição afeta marcadamente a fisiologia mitocondrial, com redução temporária de vários indicadores da função organelar durante a transição de micélio para levedura. O complexo da ATP sintase é o responsável pela transdução da energia do gradiente eletroquímico gerado pelo bombeamento de prótons gerando ATP, uma função central da organela. Esta enzima é formada por dois componentes, cada um constituído por várias cadeias polipeptídicas: uma porção esférica chamada fator de acoplamento 1, contendo os sítios de síntese de ATP e a segunda porção, Fo, que confere sensibilidade a oligomicina, constituída por subunidades que formam um canal através do qual os prótons retornam a matriz mitocondrial. Neste trabalho, usando os genes de Saccharomyces cerevisiae relacionados à ATP sintase mitocondrial para identificar, entre os genes de PB existentes nas bases de dados, oito genes nucleares relacionados ao complexo da ATP sintase: PbATP2, PbATP3, PbATP4, PbATP5, PbATP7, PbATP14, PbATP16 e PbINH1. Foi feita a identificação e o seqüenciamento completo destes genes, uma análise de suas seqüências de endereçamento, a comparação com genes ortólogos de outros fungos e foi construída uma árvore filogenética com os polipeptídeos concatenados de Paracoccidioides brasiliensis, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Magnaporthe grisea, Gibberella zeae, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe. Verificamos a consistência do clado que está agrupando Paracoccidioides brasiliensis com Aspergillus nidulans, ambos pertencentes à classe Eurotiomycetes frente às espécies, Gibberella zeae, Magnaporthe grisea e Neurospora crassa que, pertencendo à classe Sordariomycetes ficaram em ramo independente. A complementação funcional heteróloga em Saccharomyces cerevisiae foi tentada para 3 genes (PbATP7, PbATP14 e PbINH1) de PB e resultou positiva para PbATP7 e PbATP14.

Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, ATP sintase, complementação heteróloga, análise filogenética.

ABSTRACT

The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis (PB), the causative agent of a deep systemic mycosis, is a mycelium at room temperature (23 to 28oC) in the laboratory or in soil but becames a yeast when grown at 37o C or in the vertebrate host. This transition markedly affects mitochondrial physiology, creating a temporary reduction in mitochondrial functions. The ATP synthase complex is a energy transducer that converts the electrochemical membrane gradient in the chemical energy of the ATP molecule. This enzyme has two multisubunit components: the spherical F1 portion and the membrane portion that confers sensitivity to oligomycin and provides the channel for the return of protons to the mitochondrial matrix. In this work, we used the known ATP synthase-related genes of Saccharomyces cerevisiae to search the PB existing database and we found eight nuclear genes for study: PbATP2, PbATP3, PbATP4, PbATP5, PbATP7, PbATP14, PbATP16 e PbINH1. The identified genes were completely sequenced, their targeting presequences were analysed, the polypeptides compared with orthologs from other fungi and a phylogenetic tree was constructed with the concatenated polypeptides from Paracoccidioides brasiliensis, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Magnaporthe grisea, Gibberella zeae, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe. A consistent clade has Paracoccidioides brasiliensis and Aspergillus nidulans both belonging to the Eurotiomycetes class while the species Gibberella zeae, Magnaporthe grisea e Neurospora crassa group together as representatives of the Sordariomycetes class. Heterologous functional complementation in Saccharomyces cerevisiae was attempted for 3 genes (PbATP7, PbATP14 and PbINH1) and resulted positive for PbATP7 and PbATP14.

Key-words: Paracoccidioides brasiliensis, ATP synthase, functional complementation, phylogenetic analysis

SUMÁRIO

1. Introdução

1.1 A paracoccidioidomicose e seu agente etiológico 01 1.2 Mitocôndria e a cadeia respiratória 04 1.3 A ATP sintase mitocondrial 06 1.4 A levedura Saccharomyces cerevisiae 10

2. Objetivos

2.1 Objetivo Geral 13 2.2 Objetivos Específicos 13

3. Material e Métodos

3.1 Meios de cultura para bactéria 14 3.2 Meios de cultura para levedura 14 3.3 Linhagens de Saccharomyces cerevisiae 15 3.4 Plasmídeos utilizados 16 3.5 Iniciadores utilizados 18 3.6 Análise dos clones nos bancos de ESTs e RSTs 19 3.7 "Boiling Prep" 20 3.8 Sequenciamento de DNA 21

3.8.1 Purificação e precipitação das reações de sequenciamento 22 3.8.2 Sequenciamento automático 22

3.9 Análise das sequências completas 23 3.10 Desenho dos primers específicos 23

3.10.1 Amplificação por PCR 25 3.11 Eletroeluição 26 3.12 Preparo de células competentes 27 3.13 Transformação bacteriana 27 3.14 Coleta dos clones em meio seletivo 28 3.15 Mini preparação de DNA plasmidial 28 3.16 Extração de pDNA de bactéria - Triton Prep (média escala) 29 3.17 Digestão enzimática 30 3.18 Transformação de levedura pelo método de lítio 30 3.19 Extração de pDNA de levedura (pequena escala) 31 3.20 Eletroforese em gel de agaraose - 1% 32 3.20.1 Preparo do gel 33

3.21 Esporulação 34 3.22 Dissecção de tétrades 34 3.23 Endereçamento protéico 34

3.24 Análise filogenética 35 3.24.1 Análise filogenética conjunta 36

4.Resultados

4.1 Análise das sequências no banco de ESTs 39 4.2 Análise das sequências no banco de RSTs 40 4.3 Sequenciamento completo dos cDNAs 41 4.4 Alinhamento múltiplos de todos organismos 43

4.5 Endereçamento protéico 53 4.6 Clonagem molecular 54

4.7 Esporulação e Dissecção de tétrades 57 4.8 Complementação heteróloga em levedura 57 4.9 Análise filogenética conjunta 61

5.Discussão

5.1 Sequenciamento completo 62 5.2 Alinhamento múltiplo 63 5.3 Endereçamento protéico 65 5.4 Complementação heteróloga 66 5.5 Análise filogenética 67

6. Conclusão 69 Referências Bibliográficas 70 Anexos 76

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema do complexo Respiratório 5 Figura 2: Esquema simplificado da ATP sintase e seus 2 componentes 7 Figura 3: Esquema representativo da ATP sintase da levedura 8 Figura 4: Vetor de clonagem da Stratagene – pBluescript SK- 16

Figura 5: Vetor de clonagem da Invitrogen – pSPORT6 17 Figura 6: Vetor de expressão – pMGL4 18 Figura 7: Alinhamento múltiplo do ATP2 45 Figura 8: Alinhamento múltiplo do ATP3 46 Figura 9: Alinhamento múltiplo do ATP4 47

Figura 10: Alinhamento múltiplo do ATP5 48 Figura 11: Alinhamento múltiplo do ATP7 49 Figura 12: Alinhamento múltiplo do ATP14 50 Figura 13: Alinhamento múltiplo do ATP16 51

Figura 14: Alinhamento múltiplo do INH1 52 Figura 15: Eletroforese em gel de agarose 1% - Mini-prep e digestão dos

clones de ATP14 e INH1 54 Figura 16: Eletroforese em gel de agarose 1% - Mini-prep e digestão dos clones de ATP7 e ATP14 55 Figura 17: Eletroforese em gel de agarose 1% - Amplificação 55 Figura 18: Eletroforese em gel de agarose 1% - Eletroeluição e digestão 56 Figura 19: Teste de complementação funcional do ATP7 58 Figura 20: Teste de complementação funcional do ATP14 58 Figura 21: Teste de complementação funcional do INH1 59

Figura 22: "Back transformation" do ATP7 60 Figura 23: "Back transformation" do ATP14 60 Figura 24: Filogenia concatenada 61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas nos procedimentos 15

Tabela 2: Iniciadores utilizados nos procedimentos. 18 Tabela 3: Organismos similares a ATPase de P. brasiliensis e seus números de acesso 35 Tabela 4: Genes codificadores de proteínas relacionadas à ATPase mitocondrial 38 Tabela 5: Resultados obtidos pelo BLAST no banco de ESTs 39 Tabela 6: Resultados obtidos pelo BLAST no banco de RSTs 41

Tabela 7: Bases acrescentadas às seqüências já existentes no banco de dados 42 Tabela 8: Tabela comparativa dos produtos gênicos relacionados à ATP sintase

de Saccharomyces cerevisiae e Paracoccidioides brasiliensis. 43 Tabela 9: Endereçamento protéico por diferentes programas computacionais 53

LISTA DE ABREVIATURAS

Δ deleção total ou parcial de um gene específico

μL microlitro

μg micrograma

ADP adenosina difosfato

ATP adenosina trifosfato

CaCl2 cloreto de cálcio

cDNA DNA complementar

DNA ácido desoxirribonucléico

EDTA ácido etilenodiamino tetracético

EtOH etanol

LA meio de cultura de Luria e Bertani com Ampicilina

LB meio de cultura de Luria e Bertani

M molar

mg miligrama

mL mililitro

mm milímetro

mtDNA DNA mitocondrial

mRNA RNA - mensageiro

NaCl cloreto de sódio

NADH nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido

NH4OAc acetato de amônia

ng nanograma

PB Paracoccidioides brasiliensis

pBLUESCRIPT SK- vetor de clonagem

pCMVSPORT6 vetor de clonagem

PCM Paracoccidioidomicose

PCR "polymerase chain reaction" ou reação em cadeia da polimerase

pDNA DNA plasmidial

pH potencial hidrogeniônico

pMGL4 vetor de expressão

qsp quantidade suficiente para

RNA ácido ribonucléico

rpm rotação por minuto

SDS dodecil sulfato de sódio

TBE Tris borato e EDTA

TE Tris-Cl e EDTA

Tris hidroximetil aminometano

UV ultravioleta

V volts

vol volume

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 A paracoccidioidomicose e seu agente etiológico

O Paracoccidioides brasiliensis (PB), agente etiológico da paracoccidioidomicose

(PCM), é um organismo pleomórfico dependente da temperatura para manifestar sua

morfologia (SAN-BLAS; SAN-BLAS, 1994), apresenta duas formas de crescimento, a forma

leveduriforme que se manifesta em temperatura de 37o C ou no hospedeiro, e a forma de

micélio, ou bolor, que cresce em temperatura ambiente (23 a 28o C) ou em seu habitat (solo),

sendo por isso denominado termodimórfico (MEDOFF; PAINTER; KOBAIASHI, 1987). A

fase leveduriforme caracteriza-se por células esféricas ou ovais, com paredes bem definidas.

refringente, aparentemente duplas, que podem apresentar brotamento multipolar

característico. A fase micelial apresenta hifas delgadas, longas, dependendo das condições de

cultivo. Entretanto nenhuma das estruturas reprodutivas da fase micelial revelou-se útil como

critério de identificação do microrganismo (LACAZ, 1994).

O P. brasiliensis foi primeiramente descrito por Adolfo Lutz em 1908. Posteriormente

recebeu várias denominações e atualmente é taxonomicamente classificado como um

microrganismo Eukaryota do reino Fungi, filo Ascomycota, subfilo Pezizomicotina, classe

Eurotyomicetes, ordem Onygenales, família Onygenaceae, gênero Paracoccidioides e

espécie brasiliensis, segundo NCBI (National Center for Biotechnology Information -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Os países que apresentam maior incidência da doença são o Brasil, Argentina,

Venezuela e Colômbia (RESTREPO; MCEWEN; CASTANEDA, 2001). No Brasil as áreas

endêmicas são as regiões subtropicais, principalmente onde as atividades agrícolas são

predominantes como o Sudeste, Sul e o Centro-Oeste. Não há referência da doença na Guiana,

Guiana Francesa, Suriname, Chile e Nicaraguá. As condições predominantes nos locais com

2

alta endemicidade são temperaturas discretas em torno de 18 a 24oC, chuvas abundantes,

predomínio de floresta e de árvores nativas e ainda invernos curtos e verões ensolarados

(BAGAGLI et. al., 1998). Casos ocorridos fora dessas regiões envolvem indivíduos que

visitaram essas áreas durante algum tempo (AJELLO; POLONELLI, 1985), além de

consumirem álcool e tabaco em excesso apresentam também outras infecções oportunistas,

que se instalam rapidamente. Nesses casos, as condições sócio-econômicas são precárias e os

pacientes apresentam um quadro de desnutrição que compromete a resposta imune

favorecendo a instalação da doença. Embora trabalhadores rurais sejam os mais afetados,

casos de doenças em áreas urbanas e arredores, afetando crianças e trabalhadores do comércio

e indústrias, sugerem também a ocorrência do fungo em áreas urbanas (GREER; RESTREPO,

1977). Estima-se que a incidência anual da doença ativa seja de 1 a 3 indivíduos por 100.000

habitantes em áreas endêmicas (SAN BLAS; PADRÓN; MURGICH, 2002).

Quanto a forma de contágio há evidências de que o fungo penetre no hospedeiro

através das vias aéreas superiores sob a forma de propágulos da sua fase micelial que são

encontrados na natureza, provocando um complexo primário pulmonar, de onde poderia,

então, ocorrer a disseminação hematogênica ou linfática para outros órgãos (FRANCO,

1987). Dentre os principais fatores que contribuem para o estabelecimento da PCM-doença,

destacam-se a idade, o estado nutricional, o patrimônio genético e a integridade da resposta

imunológica. A virulência e a antigenicidade fúngica também constitui fatores importantes

para o estabelecimento da infecção.

A doença geralmente se apresenta sob duas formas: aguda (tipo juvenil) e crônica (tipo

adulto). A forma aguda é responsável por 3 a 4% dos casos com disseminação hematogênica

ou linfática, comprometimento sistêmico e hipertrofia do baço (BRUMMER; CASTAÑEDA;

RESTREPO, 1993). Caracteriza-se também por um curso mais rápido (semanas ou meses) e

por marcante envolvimento do fígado, gânglios e medula óssea. A maioria dos pacientes é

3

constituída por criança ou adultos jovens com função imune gravemente deprimida

(BÁRTHOLO et al., 2000).

A forma crônica da PCM representa a maioria dos casos e é encontrada

predominantemente em indivíduos do sexo masculino, na faixa etária de 30 a 50 anos. Esta

forma apresenta evolução lenta e manifestações pulmonares evidentes em 90% dos adultos,

sendo que em 25% dos casos os doentes apresentam lesões restritas aos pulmões (forma

unifocal). Em outros casos, o envolvimento pode ser silencioso, e quando o paciente procura

assistência médica, a doença já se apresenta disseminada (ANGULO-ORTEGA, 1972). Para

combater e controlar a PCM, são utilizados, além de drogas antifúngicas, o emprego de

medidas que melhorem as condições gerais do paciente e acompanhamento pós-terapêutico. A

duração do tratamento está relacionada a progressão e estabilidade do paciente diante da

mesma (LACAZ, 1991).

O tratamento da PCM é longo, começando com uma fase de ataque, que dura cerca de

6 meses. As drogas mais utilizadas são as sulfonaminas, a anfotericina B e derivados do

imidazol. O tratamento é seguido por uma fase de manutenção por mais 1 ano após a

negativação sorológica (MENDES-GIANNINI et. al., 1994).

A incidência dessa doença é maior em homens do que em mulheres (13:1). Isso parece

estar relacionado com fatores hormonais que poderiam, por sua vez, afetar a patogênese do

fungo. Aristizabal e colaboradores (1998) mostraram in vivo que a transição não afetava

fêmeas. Os experimentos foram realizados em ratos onde observaram que em ratos machos a

transição dos conídios para a forma infectante ocorria em 24 a 96 horas. Já nas fêmeas, a

transição não acontecia consequentemente não havia infecção. Este evento in vivo é

consistente com as observações epidemiologicas in vitro, sugerindo que os hormônios

femininos eram responsáveis por bloquear a transição do fungo ocasionando a resistência nas

fêmeas.

4

A transição da fase micelial para a leveduriforme, induzida pelo aumento da

temperatura de 25 para 37o C é dividida em três estágios característicos. Nas primeiras 24

horas ocorre o desacoplamento total ou parcial da fosforilação oxidativa com diminuição nos

níveis celulares de ATP e da taxa de respiração. Em seguida, as células entram num processo

de dormência de 4 a 6 dias que é caracterizado por ausência ou baixos níveis de respiração,

diminuição na concentração dos componentes do transporte de elétrons e inibição da síntese

de proteína. Finalmente, ocorre a recuperação da respiração e a completa transformação para a

forma de levedura acontece (MEDOFF; PAINTER; KOBAIASHI, 1987). Desta forma é

possível verificar alterações na função mitocondrial que acompanham as alterações

morfológicas que caracterizam a forma infectante.

Os fatos descritos sugerem que a atividade mitocondrial é fortemente modulada

durante a transição dimórfica. Paralelamente a atividade da organela é essencial para o

funcionamento dos organismos eucariotos devido ao seu papel na geração de energia pela

completa oxidação dos substratos (fosforilação oxidativa) e em outras funções essenciais

aparentemente independentes da respiração como a importação de proteínas sintetizadas no

citoplasma (BAKER; SCHATZ, 1991 and SCHATZ, 1995) e a síntese, montagem e

exportação de centros Fe/S pela organela (LILL; KISPAL, 2000).

1.2 Mitocôndria e a Cadeia Respiratória

A mitocôndria possui duas membranas, cada qual com suas próprias proteínas e

fosfolípides. O espaço intermembrana e a matriz mitocondrial também possuem suas próprias

enzimas. Na matriz encontramos o DNA da organela e os ribossomos. Essa organela é

responsável por gerar energia nas células eucarióticas. Isso ocorre através da fosforilação

oxidativa, processo no qual os elétrons são transportados ao longo de vários complexos

5

enzimáticos supramoleculares localizados na membrana interna e que constituem a cadeia de

transporte de elétrons.

Esses elétrons são fornecidos em boa parte por meio da nicotinamida adenina

dinucleotídeo reduzida (NADH) produzida pela oxidação de moléculas como glicose, ácidos

graxos e outros substratos. No fim da cadeia o complexo enzimático da citocromo oxidase

transfere os elétrons para o oxigênio.

A cadeia de transporte de elétrons é composta por 4 complexos enzimáticos situados

na membrana interna da mitocôndria (Figura 1). A passagem de elétrons pelos complexos

libera energia, que é armazenada na forma de um gradiente de prótons através da membrana e

é, em seguida, dissipada pela ATP sintase para gerar ATP de ADP e fosfato.

Fonte: Marzzoco; Torres, 1999

Figura 1: Esquema mostrando os complexos I, II, III, IV presentes na matriz mitocondrial, mais a ATP sintase. O bombeamento de prótons para o espaço membranas proporcionará a síntese de ATP.

O complexo I é composto pelas subunidades da NADH: ubiquinona oxiredutase

(NADs); o complexo II pela succinato: ubiquinona oxiredutase (SDHs); o complexo III pelo

ubiquinol: citocromo c oxiredutase; o complexo IV pela citocromo c oxidase (COX) onde

estão presentes os citocromos “a” e “a3” e o complexo V pela adenosina trifosfato sintase

6

(ATP sintase) (SARASTE, 1999). Os complexos I, III e IV lançam prótons da matriz

mitocondrial para o espaço intermembranar durante o transporte eletrônico gerando o

gradiente eletroquímico mencionado.

Nos últimos anos o interesse por se estudar a mitocôndria aumentou muito devido à

sua participação em etapas da apoptose (GREEN; REED, 1998), no processo de

envelhecimento e em certas doenças (WALLACE, 1999).

1.3 A ATP sintase mitocondrial

Ultimamente, muitas pesquisas foram dirigidas para elucidar os eventos envolvidos na

síntese de ATP pela fosforilação oxidativa, bem como, os eventos envolvidos na biogênese

dessa maquinaria (EBADI, 2001).

Fazendo parte da fosforilação oxidativa, o complexo da ATP sintase é o responsável

pela transdução da energia do gradiente eletroquímico gerado pelo bombeamento de prótons

para fora da membrana interna com energia derivada do transporte eletrônico (SARASTE,

1999), sendo esta energia transformada em energia química da ligação ADP + fosfato

inorgânico gerando ATP.

A ATP sintase é formada por dois componentes (Figura 2a), cada um constituído por

várias cadeias polipeptídicas. Um porção esférica, hidrofílica (que interage bem com a água)

chamada de fator de acoplamento 1, contém os sítios de síntese de ATP. A segunda porção Fo,

que confere sensibilidade a oligomicina, fica embebida na membrana interna e é constituída

por subunidades hidrofóbicas formando um canal através do qual os prótons retornam à

matriz mitocondrial. Para esta enzima estar funcional, esses dois componentes (F1 e Fo)

devem estar adequadamente associados e intactos (ARSELIN et al., 1996).

7

A estrutura tridimensional de uma ATPase bacteriana foi elucidada e verificou-se por

meio de técnicas sofisticadas, que o complexo de subunidades funciona como um motor que

gira ao executar sua tarefa de transdução de energia (WANG; OSTER, 1998) (Figura 2b).

(a) b)

Fonte: www.escolavesper.com.br/atp.htm Figura 2: (a) Esquema simplificado da ATP sintase mostrando seus dois componentes

(F1 e Fo). (b) Analogia demonstrando que a energia dos prótons gira a porção F1 como se fosse uma turbina, catalizando a reação do ADP + fosfato inorgânico resultando em ATP.

A porção F1 é composta por 3 cópias das subunidades α e β e também as subunidades

γ, δ e ε. Sendo que essas 3 últimas subunidades fazem parte da haste central da ATP sintase

unindo-se aos peptídeos da Atp9p (TZAGOLOFF et al., 2004) (Figura 3).

A porção Fo de eucariotos é mais complexa do que em procariotos. Eucariotos além

das 3 subunidades 6, 4 (ou b) e 9 equivalentes em Escherichia coli às subunidades a, b e c

respectivamente, apresentam também outras subunidades como a d, OCSP (“oligomycin

sensitivity-conferring protein”, ou subunidade 5) e 8. Adicionalmente temos também as

subunidades e, f e g (ARSELIN et al., 1996).

http://www.escolavesper.com.br/atp.htm

8

Nove subunidades são consideradas componentes essenciais da porção Fo

mitocondrial, já que a deleção do gene codificador para essas estruturas ou qualquer mutação

nessas subunidades pode causar um defeito respiratório. Essas subunidades essenciais são: 4,

OSCP, 6, d (ou subunidade 7), 8, 9, f, h, i/j (ACKERMAN; TZAGOLOFF, 2005).

Segundo DEVENISH et al. (2000) a porção Fo de uma ATPase mitocondrial é

constituída da seguinte maneira (Figura 3):

Fonte: Devenish et.al. em 2000

Figura 3: Esquema representativo da ATP sintase mitocondrial da levedura. O esquema mostra a complexidade dessa estrutura juntamente com suas subunidades.

A. Canal de prótons: Constituído pelas subunidades 6 e 9 que são proteínas integrais

de membrana.

B. 1) Subunidade 8, semelhante a 6 e 9. Estudos sugerem que essa subunidade tenha

uma função estrutural essencial para a atividade do complexo mitocondrial.

2) Subunidades b (ou 4), OSCP (ou 5) e d (ou 7). Essas subunidades pertencem a haste

central do complexo da ATP sintase, fazendo parte do "caule" da ATPase.

3) Subunidades f e h. Estudos com mutantes demonstraram que essas subunidades são

essenciais para a montagem e função do complexo enzimático. Quanto à subunidade i/j ainda

não se tem informações sobre sua provável função no complexo (DEVENISH et al., 2000).

9

C) Interações inter-complexos: Esse grupo representa uma nova classe de subunidades

incluindo as subunidades e, g e k. Estudos sugerem que estas 3 subunidades estão envolvidas

na formação e na estabilidade de dímeros da ATPase mitocondrial. Outros estudos envolvem

a subunidade g numa interação entre a ATPase e o complexo da citocromo c oxidase e a

subunidade e pode estar envolvida com a translocação de proteína pela membrana da

mitocôndria (DEVENISH et al., 2000).

D) Complexo inibidor: Esse grupo inclui 3 proteínas, são elas: INH1, STF1 e STF2,

consideradas como subunidades regulatórias da atividade da ATPase mitocondrial

(DEVENISH et al., 2000).

Segundo Ackerman e Tzagoloff (2005), a atividade hidrolítica da ATP sintase é

regulada naturalmente pela ocorrência da proteína inibidora, INH1. Segundo Dienhart e

colaboradores (2002), em levedura o efeito inibidor da proteína INH1 é aumentada devido a

interação de 2 proteínas estabilizadoras, STF1 e STF2 (STF= stabilizing factors). STF1

apresenta uma seqüência similar a INH1 com 51% de identidade e ainda mostram-se muito

semelhantes quanto as estruturas. Já STF2 difere quanto a sua seqüência e também a estrutura.

Destacamos também o fato do gene INH1 atuar externamente ao complexo da ATP

sintase mitocondrial o que permitiria que sua seqüência e conformação possa sofrer uma

menor pressão seletiva sem perda de função e, portanto, ter uma maior diferença entre os

organismos coerente assim com a função de proteína assessória do complexo com função

inibitória da síntese de ATP (DIENHART et al., 2002).

A ATP sintase em levedura é codificada por um total de 18 genes (ATP1, ATP2,

ATP3, ATP4, ATP5, ATP6, ATP7, ATP8, ATP9, ATP14, ATP15, ATP16, ATP17, ATP18,

ATP19, ATP20, INH1 e TIM11) três dos quais (ATP6, ATP8, ATP9) codificados no DNA

mitocondrial na levedura (ARNOLD et al., 1998).

10

Adicionalmente há genes codificando produtos que embora essenciais para a

montagem de uma ATP sintase funcional, não fazem parte da enzima ativa. Estes genes atuam

como "assembly facilitators" ou chaperoninas específicas. As proteínas Atp11p e Atp12p

foram às primeiras descritas como enzimas necessárias para a montagem do componente F1

da ATP sintase mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae, atuando como auxiliares na

biogênese do complexo (WANG; WHITE; ACKERMAN, 2001) sendo que Atp11p interage

especificamente com a subunidade beta da ATP sintase (SHELUHO; ACKERMAN, 2001).

Atp12p se associa como subunidade alfa da enzima durante a montagem do complexo

(WANG et al., 2000). Atp13p é necessária para a expressão da subunidade 9 da enzima

(ACKERMAN et al., 1991). Atp10p tem uma provável função de chaperonina com interação

direta com Atp6p e necessária para uma montagem estável (TZAGOLOFF et al., 2004).

Como aeróbicos obrigatórios, os mamíferos são completamente dependentes da ATP

sintase para a sua sobrevivência. Portanto a deficiência genética resultante da perda da

atividade da enzima é letal para o organismo, e a perda parcial de função pode ser tolerável

em algumas situações (WANG; WHITE; ACKERMAN, 2001).

1.4 A levedura Saccharomyces cerevisiae

A Saccharomyces cerevisiae é um eucarioto unicelular e foi o primeiro a ter seu

genoma inteiramente sequenciado (GOFFEAU, 1996). Classificada como ascomiceto é

considerada um dos melhores modelos para estudo da célula eucariótica devido a facilidade

de cultivo e de análise genética nuclear e citoplasmática, o que resultou em grande avanço no

estudo de sua biologia celular e molecular contribuindo muito para compreendermos melhor

os diversos aspectos da estrutura e função na célula eucariótica (COUGHLAN; BRODSKY,

2005; GALGOCZY et al., 2004).

11

Segundo Adams e colaboradores (1997) as células de S. cerevisiae crescem por

brotamentos. A célula que dá origem a um broto é chamada de célula-mãe e o broto é

denominado célula-filha. O broto é originado na célula mãe durante a fase S e continua seu

crescimento durante o ciclo celular até que seja separada da célula-mãe ao final do ciclo, no

final da mitose. A célula-mãe possui capacidade definida de gerar novos brotos, atingindo este

limite a célula não mais se reproduz e morre.

Seu ciclo de vida dura aproximadamente 90 minutos e possui uma fase de

desenvolvimento haplóide e uma fase diplóide. As células haplóides e diplóides são

morfologicamente similares mas, diferem em vários aspectos importantes. O volume

citoplasmático aumenta com a ploidia e o diamêtro da célula diplóide é normalmente 1,3

vezes maior que a haplóide (ADAMS et al., 1997).

Nas células de levedura existem três diferentes tipos celulares, os de acasalamento:

MATa e MATα; os quais são capazes de gerar células diplóides MATa/α. O processo de

conjugação entre duas células começa com a troca de feromônios que tem como conseqüência

o alongamento das células em direção uma a outra (formação de "shmoos") até que se

aderem, iniciando, em seguida a fusão de seus citoplasmas e então seu núcleo fusiona para

formar o núcleo diplóide (MATa/α).

A esporulação geralmente ocorre em células diplóides privadas de glicose ou

nitrogênio, na presença de uma fonte de carbono não-fermentável (MILLER, 1988). Durante a

esporulação, a célula diplóide sofre meiose, gerando quatro células haplóides, as quais se

tornam encapsuladas como esporos ou ascósporos, em uma estrutura denominada asco.

Saccharomyces cerevisiae por ser um organismo facultativo quanto à respiração,

podendo sobreviver na presença de fonte de carbono fermentável quando apresenta ausência

de respiração mitocondrial ou fosforilação oxidativa (ACKERMAN; TZAGOLOFF, 2005)

embora exija oxigênio para finalidades específicas como a síntese do ergosterol. Também

12

apresenta ativa recombinação homóloga tornando-se interessante para os estudos de biologia

molecular.

O estudo dos genes de P. brasiliensis tem se concentrado particularmente na

investigação do transcriptoma do fungo durante a transição dimórfica. Goldman e

colaboradores (2003) registraram e anotaram 4.692 genes expressos que foram divididos nas

seguintes categorias: metabolismo celular (8%), estrutura celular (5%), metabolismo protéico

(4%), síntese de RNA (2%), divisão celular (1%), resposta ao stress (1%) e o restante está

dividido em proteínas hipotéticas ou não classificadas. Felipe e colaboradores (2003)

estudaram 1.040 genes sendo que desse total 894 foram classificadas em 18 categorias,

destacamos: metabolismo celular (44%), armazenamento e processamento de informação

(25%), processos celular como divisão celular e outros (19%) e os genes com função ainda

desconhecida (12%).

Recentemente estudos mais completos buscaram acompanhar as variações de

expressão destes genes mapeando alterações metabólicas durante a transição morfológica com

macroarranjos onde foi analisado 6.022 ESTs da fase micelial e da fase leveduriforme

compreendendo aproximadamente 80% do genoma estimado do fungo termodimórfico

(FELIPE et al., 2005). Essa análise total do transcriptoma fornece informação sobre o ciclo

celular, à resposta ao stress, a resistencia de droga e as vias de transducão do sinal do

patógeno.

Outro trabalho recente, a hibridização de micro arranjos contendo segmentos dos ESTs

obtidos apresentou homologia a genes envolvidos no catabolismo do aminoácido, transdução

do sinal, síntese da proteína, metabolismo da parede celular, estrutura do genoma, resposta ao

stress oxidativo, controle do crescimento e o desenvolvimento do fungo (NUNES et al.,

2005).

13

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar os genes de Paracoccidioides brasiliensis (PB) com similaridade aos genes

nucleares de levedura reconhecidamente ligados à função da ATP sintase mitocondrial.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1- Utilizar as seqüências dos genes de S. cerevisiae relacionados à função da ATP sintase

mitocondrial para identificar os prováveis ortólogos de P. brasiliensis varrendo o banco de

dados do mesmo.

2- Completar o seqüenciamento dos cDNAs escolhidos, identificar a ORF para fazer análise

comparativa dos polipeptídeos potencialmente codificados por alinhamento com as proteínas

similares já descritas em outros organismos.

3- Obter informações filogenéticas válidas para esses genes/organismos

4- Testar a complementação funcional em levedura de cDNAs completos identificados.

14

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MEIOS DE CULTURA PARA BACTÉRIA

"LB" (meio completo)

1% Triptona; 0,5% Extrato de Levedura; 5% NaCl; 0,1% Glicose pH 7,0

"LA" (meio completo com adição do antibiótico Ampicilina)

1% Triptona; 0,5% Extrato de Levedura; 5% NaCl; 0,1% Glicose pH 7,0

Ampicilina (50mg/litro)

3.2 MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURA

"WO" (meio mínimo)

0,17g% YNB (Yeast Nitrogen Base) sem aminoácidos e sulfato de amônio

0,50g% Sulfato de Amônio; 2% Dextrose

"EG" (meio completo com fonte de carbono: Etanol + Glicerol)

1% Extrato de Levedura; 2% Peptona; 2% Glicerol; 2% Etanol

"YPD" (meio completo com dextrose ou glicose)

1% Extrato de Levedura; 2% Peptona; 2% Dextrose

"GNA" (meio de pré-esporulação) (BRACHMANN et al., 1998)

5% Glucose; 3% Nutrient broth; 1% Extrato de Levedura

Meio de esporulação média (BRACHMANN et al., 1998)

1% Acetato de potássio; 0,005% Acetato de zinco

15

3.3 LINHAGENS DE Saccharomyces cerevisiae

As linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho estão descritas na

tabela 1.

Tabela 1: Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas nos procedimentos.

Linhagens Genótipo Referências

W303 MAT a/α, ade2-1, trp1-1, his3-115, leu2-3, ura3-1, 112ρ+, canR ROTHSTEIN, (1983)Columbia University

W303 – 1A MAT a, ade2-1, trp1-1, his3-115, leu2-3, ura3-1, 112ρ+, canR ROTHSTEIN, (1983)

Columbia University

W303 – 1B MAT α, ade2-1, trp1-1, his3-115, leu2-3, ura3-1, 112ρ+, canR ROTHSTEIN, (1983)

Columbia University

CB11 MAT a, ade1 ρ0 TZAGOLOFF et al., 1975

KL14 MAT α, his1, trp2 ρ0 TZAGOLOFF et al., 1975

BY4741 MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0 BRACHMANN, et al.,

1998

BY4743 MATa/α, his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; met15Δ0/MET15;

LYS2/lys2Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0

BRACHMANN, et al.,

1998

YJR121w

(ΔATP2)

BY4743; MATa/α; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; lys2Δ0/LYS2;

MET15/met15Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0; YJR121w::kanMX4/YJR121w

BRACHMANN, et al.,

1998

YBR039w

(ΔATP3)


MET15/met15Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0;

YBR039w::kanMX4/YBR039w

BRACHMANN, et al.,

1998

YPL078c

(ΔATP4)

BY4741; MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0 BRACHMANN, et al.,

1998

YDR298c

(ΔATP5)



YDR298c::kanMX4/YDR298c

BRACHMANN, et al.,

1998

YKL016c

(ΔATP7)



YKL016c::kanMX4/YKL016c

BRACHMANN, et al.,

1998

YLR295c

(ΔATP14)



YLR295c::kanMX4/YLR295c

BRACHMANN, et al.,

1998

16

YDL004w

(ΔATP16)



YDL004w::kanMX4/YDL004w

BRACHMANN, et al.,

1998

YDL181w

(ΔINH1)



YDL181w::kanMX4/YDL181w

BRACHMANN, et al.,

1998

3.4 PLASMÍDEOS UTILIZADOS

3.4.1 Vetor de clonagem pBluescript SK-

Legenda: Ori - origem de replicação, MCS - "multiple cloning site" sitio múltiplo de clonagem, gene de

resistência a ampicilina.

Figura 4: Vetor de clonagem da Stratagene – pBluescript SK- mostrando seus sítios de clonagem múltipla.

17

3.4.2 Vetor de clonagem pSPORT6

Legenda: Ori - origem de replicação, MCS - "multiple cloning site" sitio múltiplo de clonagem, gene de

resistência a ampicilina

Figura 5: Vetor de clonagem da Invitrogen – pSPORT6 mostrando seus sítios de clonagem múltipla.

18

3.4.3 Vetor de expressão pMGL4

Legenda: Promotor e terminador do gene ADH1, MCS - "multiple cloning site" sitio múltiplo de clonagem, ,

genes de resistência a ampicilina e o gene URA3 de levedura.

Figura 6: Vetor de expressão – pMGL4 mostrando seus sítios de clonagem múltipla

3.5 INICIADORES UTILIZADOS

Os iniciadores utilizados neste trabalho estão descritas na tabela 2.

Tabela 2: Iniciadores utilizados nos procedimentos.

Número Primer Sequência

99F pBluescript SK- 5` TAATACGACTCACTATAGGG 3`

128T3 pBluescript SK- 5` ATTAACCCTCACTAAAGGGA3`

100R pSPORT6 5` ATTTAGGTGACACTATAG 3`

140 pSPORT6 5` TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3`

19

386 pMGL4 5` CAATATTTCAAGCTATAC 3`

436 ATP2 - Fw

(primer interno)

5` ATCATGATCCCTGTTGGC 3`

437 ATP2 - R

(primer interno)

5` TAGATGCCCAGCTCGGAG 3`

553 ATP2 - Fw 5` GCGCCCGGGAAAAATGTTCAAGAGCGGTGTT 3`

554 ATP2 - R 5` CGTCTAGATTACGACTTCTCCAACTCAG 3`

555 ATP3 - Fw 5` GCGCCCGGGAAAAATGCTCTCTCGAACCGCT 3`

556 ATP3 - R 5` CGTCTAGATTACATGTCCTCACTGGCAGT 3`

557 ATP4 - Fw 5` GCGCCCGGGAAAAATGGCTTCGAGATTGGC 3`

558 ATP4 - R 5` CGTCTAGACTACTGGGGCTTAGC 3`

559 ATP5 - Fw 5` GCGAGCTCAAAAATGTTATCCTCCAGAGCAGC 3`

560 ATP5 - R 5` CGTCTAGATTACAAGGTGTCAGTTAGAACTTT 3`

561 ATP16 - Fw 5` GCGCCCGGGAAAAATGAACTCTCTTAGAATCGCTC 3`

562 ATP16 - R 5` CGTCTAGATTATTTCAAAGCAGCCTG 3`

3.6 ANÁLISE DOS CLONES NOS BANCOS DE ESTs E RSTs

A análise dos clones ESTs ("Expressed Sequence Tags") gerados de mRNA preparado

da fase leveduriforme de PB que estão clonados de maneira orientada no vetor

pCMVSPORT6 da Invitrogen, foram feitas buscando similaridade correspondente ao

conjunto dos genes de levedura reconhecidamente envolvidos com a função da ATP sintase

da membrana interna da mitocôndria. As proteínas correspondentes são designadas Atp1p,

Atp2p, Atp3p, Atp4p, Atp5p, Atp6p, Atp7p, Atp8p, Atp9p, Atp14p, Atp15p, Atp16p, Atp17p,

Atp18p, Atp19p, Atp20p, Inh1p e Tim11p, (The Saccharomyces Genome Database (SGDTM)

CHERRY et al., 1997; http://www.yeastgenome.org). Adicionalmente temos os genes

ATP10, ATP11, ATP12 e ATP13 que codificam proteínas (Atp10p, Atp11p, Atp12p e Atp13p)

essenciais para a montagem do complexo sem que participem da enzima ativa.

As seqüências de proteínas correspondentes, no formato FASTA, foram processadas

com a ferramenta BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool” ALTSCHUL et al., 1997),

http://www.proteome.com/databases/index.html

20

usando o programa TBLASTN (“protein sequence against 6-frame nucleotide translated

database sequences”) disponível no portal do projeto na Internet, de acesso restrito, (Pipeline

do projeto genoma de Paracoccidioides brasiliensis (http://200.136.178.18/rstpb/frame2.htm)

contra a base de dados existente e também no banco de dados do grupo de Brasília.

A busca por representantes de genes nucleares relacionados à atividade da ATP sintase

mitocondrial, nos clones genômicos contendo fragmentos aleatórios (RSTs - "Randon

Sequence Tags") do genoma de Paracoccidioides brasiliensis foi realizada através do mesmo

portal do projeto. Foram feitos "BLASTs" com todas as seqüências de proteína dos genes de

ATPase (ATP1, ATP2, ATP3, ATP4, ATP5, ATP6, ATP7, ATP8, ATP9, ATP10, ATP11,

ATP12, ATP13, ATP14, ATP15, ATP16, ATP17, ATP18, ATP19, ATP20, INH1 e TIM11)

usando o programa disponível no site do projeto contra a base de dados de RST existente no

momento. Foram examinados todos os "hits" com E-value ≤10-5.

3.7 "BOILING PREP"

As minipreparações de DNA para o sequenciamento foram feitas utilizando a “boiling

prep” descrita por MARRA et al. (1999), assim como uma adaptação do procedimento de lise

alcalina de BIRNBOIM (1983). Detalhando:

Faz-se um inóculo antes da extração em microplaca para 96 amostras “Deep Well”

(esterilizada por 2 minutos aproximadamente no UV), com o meio CircleGrow e ampilicina

(50 μg/ml) e incuba-se a 37°C, 220rpm, por 24 horas.

Centrifuga-se 3000rpm, 20°C, 10 minutos. Despreza-se o sobrenadante, deixa-se

drenar bem sobre papel absorvente e ressuspende-se em 25μl de água destilada sob agitação

no “vortex” (aproximadamente 10 minutos).

http://200.136.178.18/rstpb/frame2.htm)

21

Adiciona-se a placa 70μl de solução contendo Tween20 (para 7mL: 4,2mg de

lisozima, 7mL de Stet Tween 20 Solution (0,1M NaCl; 5%v/v Tween20; 1mM EDTA pH 8,0;

0,1M Tris HCl pH 8,0) e 133µL de RNAase 10mg/mL), agita-se por 1 minutos no vortex e

deixa-se incubando 5 minutos em temperatura ambiente.

Leva-se a placa ao microondas em alta potência até que se observe fervura (~30

segundos). Inverte-se a posição da placa em 180 graus dentro do microondas. Repete-se o

procedimento por mais 2 vezes. Imediatamente remove-se a placa do microondas e adiciona-

se 300μl de água destilada, agita-se no vortex por 15 segundos e deixa-se no gelo por 10

minutos. Centrifuga-se por 10 minutos a 4000rpm, a 4°C

Prepara-se as placas receptoras (capacidade 300ul) com 110μl de isopropanol e 10μl

de 5M Acetato de Amônio. Coleta-se 180ul do sobrenadante homogenizado. Deixa-se 30

minutos a -80°C. Centrifuga-se por 40 minutos a 4000rpm, a 4°C.

Despreza-se o sobrenadante e lava-se o precipitado de pDNA com 200μl de EtOH

80%, tampa-se a placa com borracha e vidro, agita-se com cuidado por inversão 2 vezes.

Centrifuga-se por 20 minutos, 4000rpm, a 4°C.

Despreza-se o EtOH. Deixa-se secar no vácuo por 5 minutos e dissolve-se em 25μl de

TE (5mM Tris pH 7,5 e 1mM EDTA), cobre-se com o filme selante, “vortexa-se” até a

completa dissolução e centrifuga-se (pulso de 1000rpm) para recolher todo o líquido no fundo

dos poços da microplaca.

3.8 SEQÜENCIAMENTO DE DNA

As reações de sequenciamento foram preparadas em microtubos estéreis de 0,2mL

("RNAase free") utilizando-se 1,8µL de mix Amersham (Applied Biosystems), 2,2µL de água

destilada e deionizada (milliQ), 1,6pmol/µL de iniciador e cerca de 200ng de DNA. As

22

condições de amplificação linear seguem as recomendações do fabricante em presença de

terminadores fluorescentes, variando somente a temperatura de anelamento conforme o Tm

do iniciador a ser utilizado.

3.8.1 PURIFICAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DAS REAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO

Às amostras foram adicionadas 7µL de solução 5M NH4OAc (contendo 1mg/mL de

glicogênio), seguido de um pulso de centrifugação a 1000rpm em centrífuga Jouan CR3i e

agitação em um vortex de tubos 251 (Fanem - SP). 50µL de etanol 95% foram adicionados e

as amostras foram homogeneizadas por inversão 3x seguido de um pulso de 1000rpm. As

amostras foram levadas ao freezer -80oC e deixadas lá por 20 minutos.

Realizou-se uma centrifugação de 4000rpm por 30 minutos à 20oC. O sobrenadante foi

desprezado e um pulso de 300rpm com os tubos invertidos sobre papel absorvente foi

realizado. 110µL de etanol 80% foram adicionados a cada amostra e centrifugou-se estas por

15 minutos à 20oC a 14000rpm. Novamente desprezou-se o sobrenadante e um pulso de

300rpm com os tubos invertidos sobre papel absorvente foi realizado. 110µL de etanol 80%

foram adicionados, centrifugando-se por 5 minutos. O sobrenadante foi então desprezado e

um pulso de 1000rpm foi realizado com os tubos invertidos. Finalmente, as amostras foram

submetidas à secagem à vácuo por aproximadamente 7 minutos.

3.8.2 SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO

As amostras foram diluídas em 10µL de formamida e em seguida submetidas à

desnaturação por 5 minutos a 95oC antes de aplicar as amostras no sequenciador automático

ABI 3100 (Applied Biosystems). As configurações do aparelho foram realizadas segundo

recomendações do fabricante.

23

3.9 ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS COMPLETAS

As seqüências completas obtidas de 8 genes estudados (ATP2, ATP3, ATP4, ATP5,

ATP7, ATP14, ATP16 e INH1), foram analisadas com o programa Sequencher 3.1 (Gene

Codes) para serem editadas. Em seguida usando-se o programa “ORFfinder”, disponível no

site do NCBI (National Center for Biotechnology Information), foram identificadas as fases

de leitura de cada gene. Os segmentos de DNA foram analisados cuidadosamente quanto aos

seus sítios de restrição preocupando-se com as etapas de clonagem posterior.

Para cada gene foram escolhidos sítios para enzimas de restrição ausentes no segmento

de interesse e também atentando para a orientação correta para serem clonados no vetor de

expressão pMGL4.

Para os genes ATP7, ATP14 e o INH1 foram escolhidos os sítios KpnI e XbaI na

direção de 5` para 3`.

Para os 5 outros genes restantes estávamos tendo dificuldade na escolha do vetor de

expressão por falta de sítios compatíveis com o vetor disponível. Com isso foi escolhido o

método de amplificação do gene inteiro utilizando “primers” específicos com os sítios para as

enzimas de restrição desejadas adicionados as pontas da seqüência.

3.10 DESENHO DOS “PRIMERS” ESPECÍFICOS

Devido a dificuldades na clonagem pela falta de sítios compatíveis com o vetor

disponível, o pMGL4, foram desenhados “primers” com sítios específicos para a amplificação

do gene inteiro.

Os “primers” foram desenhados seguindo o esquema abaixo:

"Forward": 5` GC -->sítio de restrição escolhido --> AAAAATG 3`

"Reverse": 3` TAA sítio de restrição escolhido GC 5`

24

Sendo assim os “primers” abaixo foram desenhados no programa Net Primer usando

sítios específicos de restrição como SmaI, XbaI e SacI. Os primers "reverse" já estão

exemplificados em sua posição correta, complementar reverso.

ATP2: Fw (SmaI)

5` GCGCCCGGGAAAAATGTTCAAGAGCGGTGTT 3`

ATP2: R (XbaI)

5` CGTCTAGATTACGACTTCTCCAACTCAG 3`

ATP3: Fw (SmaI)

5` GCGCCCGGGAAAAATGCTCTCTCGAACCGCT 3`

ATP3: R (XbaI)

5` CGTCTAGATTACATGTCCTCACTGGCAGT 3`

ATP4: Fw (SmaI)

5` GCGCCCGGGAAAAATGGCTTCGAGATTGGC 3`

ATP4: R (XbaI)

5` CGTCTAGACTACTGGGGCTTAGC 3`

ATP5: Fw (SacI)

5` GCGAGCTCAAAAATGTTATCCTCCAGAGCAGC 3`

ATP5: R (XbaI)

5` CGTCTAGATTACAAGGTGTCAGTTAGAACTTT 3`

25

ATP16: Fw (SmaI)

5` GCGCCCGGGAAAAATGAACTCTCTTAGAATCGCTC 3`

ATP16: R (XbaI)

5` CGTCTAGATTATTTCAAAGCAGCCTG 3`

3.10.1 AMPLIFICAÇÃO POR PCR

Tivemos problemas com a demora dos "primers" que levaram certa de 4 meses para

chegar devido a problemas do fornecedor com a alfândega. Quando finalmente os oligos

chegaram foi feito uma análise para definir um Tm (temperatura média de fusão) comum para

todos os pares de "primer", sendo assim foi utilizado o programa NetPrimer (programa para

desenhar os “primers”), o Tm salt da Promega (www.promega.com/biomath) e o Tm do

fabricante (Wmed). Como tivemos uma grande diferença entre cada Tm resolvemos fazer um

PCR de amplificação por gradiente com uma variação de 49ºC a 55ºC.

A reação de PCR foi feita com um Kit GoTaq da Promega. Utilizou-se 5µL de 5x

green GoTaq buffer, 0,5µL de dNTPs 10mM (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 2µL de "primer"

forward, 2µL de "primer" reverse, 0,3µL de DNA, 0,2µL de GoTaq DNA polimerase e

completa para 25µL com H2O milliQ.

Essa reação foi realizada na máquina PCR Express Thermal Cycler da Hybaid

Limited, seguindo a ciclagem abaixo:

95ºC por 2 minutos - Desnaturação inicial

95ºC por 45 segundos - Desnaturação da cadeia

Tm variado por 45 segundos - Anelamento do "Primer" 35 ciclos

72ºC por 2 minutos - Elongação da cadeia

72ºC por 5 minutos - Elongação final

4ºC - Resfriamento

http://www.promega.com/biomath

26

Depois dessa reação inicial para definir o melhor Tm, foram feitas as primeiras

reações usando os 5 pares de "primer" para amplificar as seqüências dos genes ATP2, ATP3,

ATP4, ATP5 e ATP16 usando um Tm de 52ºC com a mesma ciclagem. Essas reações foram

repetidas por mais 2 vezes variando o Tm de 52ºC para 58ºC e a última reação para 62ºC.

3.11 ELETROELUIÇÃO

Tratam-se os sacos de diálise com água destilada. Adicionam-se 1\10 TBE dentro dos

saquinhos de diálise juntamente com os pedacinhos dos géis contendo as bandas desejadas do

inserto e do vetor aberto. Fecha-se a extremidade dos saquinhos com um clip plástico

especial, coloca-se na cuba de eletroluição e aplica-se um potencial de 500V por 5 minutos.

Faz-se a inversão do campo elétrico por 5 segundos a 500V.

Removem-se os géis dos saquinhos e recolhe-se o líquido com o DNA eletroeluído.

Tampona-se com 50mM Tris-Cl pH 8,5.

Faz-se extração com 1vol. de fenol, centrifuga-se 5 minutos a 14000rpm e extrai-se 2

vezes com 1vol de éter. Remove-se o éter com uma seringa a vácuo na capela.

Precipita-se com 1\20 de vol. NaCl 5M, 1µL de glicogênio (10mg/ml), mistura-se

bem, acrescenta-se 3vol de etanol 100% e deixa-se 20 minutos a –80ºC. Centrifuga-se 15

minutos a 14000rpm na ultracentrifuga para garantir boa recuperação. Lava-se 2 vezes o

precipitado com etanol 70% e centrifuga-se 5 minutos a 14000rpm.

Dissolve-se o precipitado em 7µL de água milliQ. Corre-se 1µL no gel juntamente

com STOP-A diluído em TBE 1X na proporção de 1:1, para analisar a concentração de DNA

para uma posterior ligação.

A ligação do fragmento de DNA de interesse no vetor apropriado é realizada

utilizando-se o Kit de ligação Fast - Link DNA Ligation Kit (Epicentre Technologies).

27

3.12 PREPARO DE CÉLULAS COMPETENTES

Inocula-se a linhagem de E. coli em placa de LB fresca por 24 horas. No dia seguinte

coleta-se uma pequena pelota de células e inocula-se em 40mL de LB líquido num erlenmayer

especial com tubo lateral para leitura no colorímetro Klett. Incuba-se no agitador giratório a

37ºC.

Após 2 horas acompanha-se o crescimento até que a leitura alcance 90 unidades Klett

Feito isso mergulha-se o frasco em mistura gelo-água rapidamente. Agita-se um pouco para

resfriar.

Transfere-se para um tubo corning estéril gelado de 50mL e centrifuga-se a 5000rpm,

4ºC por 10 minutos. Despreza-se o sobrenadante e ressuspende-se o precipitado em 15mL de

10mM CaCl2, 10mM Tris-Cl pH 8,0 gelado. Repete-se a centrifugação e descarta-se o

sobrenadante.

Ressuspende-se as células em 15mL de 50mM CaCl2, 10mM Tric-Cl pH 8,0 gelado e

deixa-se no gelo por 30 minutos. Centrifuga-se a 5000rpm, 4ºC por 10 minutos e despreza-se

o sobrenadante. Suspende-se o precipitado em 3mL do 50mM CaCl2, 10mM Tric-Cl pH 8,0.

3.13 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA

Acrescenta-se 2µL da ligação a 200µL de suspensão de células competentes, mistura-

se bem e coloca-se no gelo por 20 minutos. Dá-se um choque térmico a 42ºC de 2 minutos.

Volta-se ao gelo por 30 segundos e transferem-se as células para um tudo corning de 15mL

contendo 1mL de LB. Incuba-se no shaker por 1 hora a 37ºC. Plaqueia-se em meio LA (LB

mais 50ug\mL de ampicilina) diluído e concentrado depois de centrifugar por 3 minutos a

4000rpm a suspensão de células transformadas. Incuba-se as placas de LA a 37ºC por 24

horas.

28

3.14 COLETA DOS CLONES EM MEIO SELETIVO

Os clones obtidos são coletados com auxílio de palitos esterilizados e transferidos para

outra placa de meio LA de maneira ordenada e são colocados para crescer em estufa a 37oC

por 24 horas. Dos clones crescidos extraímos os pDNAs utilizando o protocolo de mini-prep.,

segundo adaptações de Sambrook and Russell, 2001.

3.15 MINI-PREPARAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL

(segundo adaptação de Sambrook and Russell (2001)

Coleta-se uma pequena pelota de célula fresca e suspende-se em 200µL de Get com

RNAase (dextrose; 1M Tris-Cl pH 8,0; EDTA 0,2M e RNAase). Adiciona-se 400µL de

solução de lise (20% SDS e NaOH 10N) a cada tubo. Mistura-se suavemente rodando o tubo

entre as mãos por 2 vezes.

Após 3 minutos adiciona-se 400µL de solução de neutralização (Acetato de potássio,

ajustado o pH para 4,8 com ácido acético glacial) a cada tubo. Fecha-se e mistura-se por

inversão cerca de 8 vezes. Leva-se ao gelo por 20 minutos. Centrifuga-se por 15 minutos a

14000rpm. Enquanto isso adiciona-se 600µL de isopropanol em uma série de tubos paralelos

correspondentes aos tubos sendo centrifugados.

Com cuidado para não perturbar o precipitado coleta-se 800µL do sobrenadante pára

os tubos correspondentes com isopropanol. Tampa-se e mistura-se 4 vezes por inversão.

Centrifuga-se por 10 minutos a 14000rpm.

Drenam-se bem os tubos sobre papel absorvente. Adiciona-se 500ul de etanol 70% a

cada tubo. Tampa-se e mistura-se por inversão 2 vezes. Centrifuga-se por 5 minutos e drena-

se por inversão sobre papel absorvente.

Colocam-se os tubos para secar por 7 minutos na Speed Vac. Dissolve-se em 20µL de

água milliQ e examina-se por eletroforese em gel de agarose 1%.

29

3.16 EXTRAÇÃO DE pDNA DE BACTÉRIA - "TRITON PREP" (média

escala)

Inocula-se 100µL de célula em 10mL de LB com 10µL de Ampicilina e deixa-se "over

night". No dia seguinte, os erlenmeyer inoculados foram transpostos para um corning de

15mL e centrifugou-se por 5 minutos à 5000rpm a 20°C. Desprezou-se o sobrenadante e ao

corning adicionou-se 1mL de 5% sacarose, 50mm Tris pH 7,5 colocando para agitar no

vortex. Adicionou-se 1,2mL de solução de lise (p/ 3mL: 2mL de 25mM Tris pH 8,0; 0,5mL

de 0,25M EDTA; 10mg lisozima; 200µL de RNAse 10mg/mL), homogeinizou-se e incubou-

se no gelo por 30 minutos.

Adicionou-se 1mL da solução de Triton (0,3 Triton X-100; 0,19M EDTA; 0,15M Tris

pH 8,0) e mexeu-se levemente por inversão transferindo para o tubo do rotor MLA-80 da

ultracentrifuga (Optima™ MAX Ultracentrifuge 130.000rpm - BECKMAN COLUTER™) e

centrifugou-se por 15minutos à 50.000rpm, a 4°C. Coletou-se o sobrenadante e transferiu-se

para um tubo de vidro “corex" e fez-se e extração v/v de fenol e 3 extrações v/v de éter.

Precipitou-se o pDNA com 1/20V de 5M NaCl e 2,5V de etanol 100% e incubou-se no

gelo por 5minutos. Centrifugou-se por 10minutos à 8000rpm a 4°C. O sobrenadante foi

desprezado (com pipeta) e ressuspendido em 2mL de 2M NH4OAc; 0,2mM EDTA e 6mL de

etanol 100%, incubou-se no gelo por 5minutos. Centrifugou-se por 10minutos à 9500rpm a

4°C e desprezou-se o sobrenadante.

Ressuspendeu-se o precipitado em 800µL de 2M NH4OAc; 0,2mM EDTA separando

em dois tubos com aproximadamente 400µL onde foi acrescentado 1mL de etanol 100%.

Incubou-se no gelo por 5minutos e centrifugou-se por 5minutos a 13000rpm. O precipitado

foi então lavado duas vezes com etanol 80% com EDTA. Uma vez purificado, o precipitado

foi submetido a uma secagem à vácuo e ressuspendido em 400ul com TE.

30

3.17 DIGESTÃO ENZIMÁTICA

Para confirmar as bandas desejadas, realiza-se digestão dupla com as enzimas XbaI e

KpnI (ATP7, ATP14 e INH1), para liberação dos fragmentos. Adiciona-se em um tubo

Eppendorf: 0,25µL de enzima XbaI, 0,25µL de enzima KpnI, 1,0µL de BSA10X, 1,0µL de

buffer 2, 1,0µL do pDNA e H2O milliQ qsp 10µL.

Ambas amostras (vetor e inserto) foram deixadas 1 hora em banho-maria a 37°C. Para

confirmar a construção, saber se o inserto é mesmo a região desejada (o gene escolhido), após

essa digestão, faz-se uma reação de seqüenciamento novamente e um “blast” no NCBI

3.18 TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURA PELO MÉTODO DE LIOAC

(ACETATO DE LÍTIO) (Segundo GIETZ et al., 1995)

Foram feitas 3 transformações de levedura utilizando as linhagens diplóides dos

mutantes de ATPase (YKL016c (ΔATP7), YLR295 (ΔATP14) e YDL181w (ΔINH1)), com as

respectivas construções prontas no vetor de expressão pMGL4.

O procedimento de transformação de levedura pelo método de acetato de lítio consiste

da seguinte maneira:

Um inóculo de levedura Saccharomyces cerevisiae diplóide mutante

foi suspensa em 10mL de meio YPD líquido em erlenmeyer de 50mL e crescido por 24 horas,

sob agitação de 220rpm a 30°C, em "C24 Classic Benchtop Incubator Shaker" (New

Brunswick Scientific). Dessa suspensão, transfere-se 200µL para um novo erlenmeyer de

50mL, contendo 10mL de YPD e deixa-se crescer sob agitação controlada, 220rpm à 30°C

por 4 horas.

Transferem-se as células em suspensão para um tubo Corning de 15mL e centrifuga-se

por 5 minutos a 7000 rpm na centrifuga de mesa "Sorvall RC-5B" (Du Pont Instrument).

31

Despreza-se o sobrenadante e ressuspende-se as células em 1mL de solução TEL (10mM Tris

pH 7.5, 0,1M LiOAc, 1mM EDTA), homogenizando-se sempre gentilmente. Transferem-se

as células para um tubo Eppendorf de 1.5 mL. Centrifuga-se por 2 minutos em

microcentrífuga Spectrofuge 16M (National Labnet Co.) e despreza-se o sobrenadante,

ressuspende-se as células em 100µL de solução TEL (10mM Tris pH 7,5; 0,1M LiOAc e

1mM EDTA), homogenizando-se gentilmente com a pipeta, e deixa-se em repouso por 5

minutos a temperatura ambiente.

Adicionam-se 5µL de "carrier" DNA de salmão (Sigma – 8mg/mL) e 3µL do DNA

desejado. Deixa-se por 10 minutos à temperatura ambiente. Após o descanso, adiciona-se 0,8

mL de solução PEG 40% (PEG-3640 em TEL), homogeneizada por inversão. Incuba-se por

15 minutos à temperatura ambiente, sem agitação. Transferem-se as células a um choque

térmico de 42°C por 12 minutos. Centrifuga-se por 5 minutos na microcentrífuga, remove-se

o sobrenadante. Ressuspende-se as células restantes em 0,5 mL de solução TE (10mM Tris

pH 7.5, 1mM EDTA), e centrifuga-se por 2 minutos. Remove-se o sobrenadante com a pipeta,

ressuspende-se as células em 150µL de TE e plaqueia-se em meio WO contendo os

suplementos necessários para seu crescimento, ou seja, histidina (10mg/mL), leucina

(10mg/mL) e o antibiótico geneticina (40mg/mL) para uma melhor seleção. A base

nitrogenada uracil não foi necessário porque o vetor pMGL4 possui resistência a ele e a

geneticina está presente nos mutantes de ATPase sendo assim os transformantes serão mais

confiáveis.

3.19 EXTRAÇÃO DE pDNA DE LEVEDURA (pequena escala)

Após crescimento em placa durante a noite, coletou-se uma quantidade moderada de

célula a qual é dispersa em 500µL de água milliQ. Centrifugou-se por 2 minutos à 14000rpm

32

e o sobrenadante é então desprezado. Realizou-se então uma lavagem com 500µL de Sorbitol

1,2M e nova centrifugação de 5 minutos, desprezou-se o sobrenadante.

As células foram dispersas em 0,3mL de Zimoliase (1,2M Sorbitol; 0,1M Citrato de

sódio pH 7,0; 60mM EDTA pH 7,5; 0,4M β-Mercaptoetanol; 1mg/mL de Zimoliase) e

incubadas por 25 minutos à 37ºC.

Centrifugou-se 5 minutos à 14000rpm e o sobrenadante foi desprezado. Os

protoplastos foram lavados com 0,3mL de 1,2M Sorbitol e repetiu-se a centrifugação por 4

minutos desprezando o sobrenadante em seguida (repetindo-se a lavagem).

O protoplasto foi disperso em 0,1mL de solução de 50mM glicose, 25mM Tris pH 8,0,

10mM EDTA e 3µL de RNAse e mantido por 10 minutos à temperatura ambiente.

Adicionou-se 0,2mL de NaOH 1% SDS e homogeinizou-se por inversão mantendo por 5

minutos à temperatura ambiente. 150µL de 3M NaOAc pH 4,8 foram adicionados e mantido

10 minutos no gelo. Centrifugou-se por 5 minutos 14000rpm e o sobrenadante foi coletado em

novo microtubo, acrescido de 1mL 100% etanol e mantido por 20 minutos à -80ºC após

homogeinização.

Centrifugou-se por 5 minutos à 14000rpm, descartou-se o sobrenadante e o precipitado

foi então dissolvido com 0,3mL de 2M NH4OAC com EDTA e 1 mL de etanol 100%. Após

15 minutos à -80ºC centrifugou-se novamente e desprezou-se o sobrenadante. Realizou-se 2

lavagens com 700µL de etanol 80% com EDTA. O tubo foi então levado para secagem à

vácuo e o precipitado dissolvido em 50µL de TE (10mM Tris pH 7,5; 1mM EDTA).

3.20 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE – 1%

(SAMBROOK; FRITSCH; MINIATIS, 1989)

A eletroforese em gel de agarose é o método utilizado para separar, identificar e

purificar fragmentos de DNA. O DNA pode ser visualizado diretamente no gel após a adição

33

do corante intercalante fluorescente brometo de etídio e observação sob luz ultravioleta no

transluminador.

O tampão de eletroforese é o 1X TBE (80mM Tris; 113mM ácido bórico e 2,5mM

EDTA, pH entre 8,0 a 8,3).

Para eletroforese utiliza-se gel de agarose a 1%.

3.20.1 PREPARO DO GEL

Pesa-se 0,40g de agarose ultra-pure "Gibco BRL" e dilui-se em 40mL de TBE 1X.

Aquece-se no microondas até a completa diluição. Deixa-se esfriar. Acrescenta-se 1µL de

brometo de etídio (10mg/mL dissolvido em 100mM Tris pH 8,0). Derrama-se no "tray gel"

Bio Rad, adaptado com um pente de 15 dentes. Após a polimerização do gel, retira-se o pente

e coloca-se o gel na cuba de eletroforese (Mini-Sub-cell GT System by Bio Rad) com TBE

1X.

Carrega-se o gel com as amostras preparadas com adição de STOP A (5,25g de Ficoll

400, 75mg de SDS em 10mL de 5mM Tris-Cl pH 7,5. Acrescenta-se 3mL de 0,25M EDTA

pH 7,5, 15mg bromofenol blue e 15mg xilene cianol e completa-se com 5mM Tris-Cl pH 7,5

para um volume final de 15mL), utilizando um pipeta automática. Utilizamos em um dos

poços 2µL do padrão apropriado de tamanho molecular. Liga-se a cuba de eletroforese a uma

fonte Power Pac 300, a 120V. Após o término da corrida expõe-se o gel ao transluminador

Fotodyne FOTO/UV-26, usando máscara de proteção Fotodyne. Fotografa-se com a máquina

Kodak DC290 Digital e a análise é feita através do software Kodak 1D 3.5.3 (Scientific Image

Systems – Kodak).

34

3.21 ESPORULAÇÃO

As células crescidas em meio YPD sólido são inoculas em meio GNA sólido (meio de

pré-esporulação) e incubadas por 1 dia a 30ºC. Após esse tempo transfere-se um pouco de

célula para o meio líquido de esporulação média indicada pelo fabricante e incuba-se por 7

dias a 30ºC em tudos "L" em uma incubadora de gradiente de temperatura.

3.22 DISSECÇÃO DE TÉTRADES

Tratamento com Glucuronidase

Centrifuga-se as células em um tubo corning de 15 mL por 5 minutos a 500rpm e

ressuspende-se as células em 500µL de e H2O milliQ estéril. Adiciona-se 10µL de glusulase

ou β-glucuronidase (SIGMA) e digere-se a temperatura por 15 minutos. Adiciona-se 5mL

H2O milliQ estéril e centrifuga-se 5 minutos a 5000rpm.

Repete-se essa lavagem por mais duas vezes e ressuspende-se as células em 5mL de

H2O milliQ estéril.

Tratamento com Zimoliase (ADAMS et al., 1997)

Em um eppendorf , acrescenta-se 150µL de célula esporulada do meio de esporulação

média, adiciona-se 50µL de Zimoliase (0,5mg/mL em 1M Sorbitol) e incuba-se por 10

minutos a 30ºC. Logo após a incubação o tudo é imediatamente transferido para o gelo e

acrescenta-se 800µL de H2O milliQ estéril sendo derramado pela parede do tubo

vagarosamente.

3.23 ENDEREÇAMENTO PROTÉICO

A análise das 8 seqüências de sinalização organelar (endereçamento intracelular) foi

feita por meio dos programas TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)

http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

35

desenvolvido por Emanuelsson et al., (2000), Predotar V.1.03 (http://genoplante-

info.infobiogen.fr/predotar/predotar.html) desenvolvido por Small (2004), MitoPred

(http://bioinformatics.albany.edu/~mitopred/) desenvolvido Guda et al., (2004) e o programa

MitoProt (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) desenvolvido por Claros e Vincens (1996).

3.24 ANÁLISE FILOGENÉTICA

As seqüências completas dos 8 genes estudados de P. brasiliensis foram analisadas

utilizando a ferramenta BLASTX disponível no NCBI. Com isso foi possível identificar as

proteínas similares de outros organismos, sendo que para alguns desses organismos exibindo

"E-value" significativos, as seqüências foram adquiridas para os estudos comparativos através

dos seus números de acesso (Tabela 3).

Tabela 3: Organismos que demostraram similaridade aos polipeptídeos da ATPase de P. brasiliensis e seus números de acesso no banco de dados do NCBI.

Organismos * ATP2 ATP3 ATP4 ATP5 ATP7 ATP14 ATP16 INH1

A. nidulans EAA64426 EAA66125 EAA64241 EAA58671 EAA58160 EAA61005 EAA66150 EAA60843

N. crassa XP_325285 XP_331511 XP_324682 XP_328045 XP_324816 XP_330635 XP_322471 XP_329995

M. grisea XP_360642 AAX07697 XP_362307 AAW69347 XP_366585 XP_363324 XP_360368 XP_363663

G. zeae EAA73638 EAA76715 EAA69633 EAA68690 - EAA68484 EAA77584 EAA76368

S. cerevisiae NP_012655 NP_009595 NP_015247 NP_010584 NP_012909 NP_013398 NP_010280 NP_010100

K lactis XP_453538 XP_451839 AAC64860 XP_452662 XP_454767 XP_452431 AAC15908 XP_455330

C. albicans EAK94264 EAK98899 EAK95962 EAK98840 XP_711749 - EAL00552 -

S. pombe NP_593151 NP_595430 CAA22340 NP_588505 NP_596058 NP_595838 NP_596259 -

* Nome completo dos organismos: Aspergillus nidulans, Neurospora crassa,

Magnaporthe grisea, Gibberella zeae, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis,

Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe.

http://bioinformatics.albany.edu/%7Emitopred/

http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html

36

Para cada proteína, individualmente, as seqüências foram alinhadas juntamente com as

seqüências de outros fungos similares ao Paracoccidioides brasiliensis disponíveis no

GenBank (Tabela 3), através do programa Clustal X (THOMPSON et. al., 1997) com

parâmetros alterados do padrão, baseados nas sugestões de Hall, 2001. O formato inicial

FASTA foi convertido para um arquivo *.ALN e posteriormente para um arquivo no formato

NEXUS. Alterações manuais para busca de possíveis erros, tanto para inserções como para

deleções, foram feitos no programa BIOEDIT v.5.0.9 (HALL, 1999). O arquivo final gerado

(*.bio) foi convertido para o formato fasta e visualizado no programa GeneDoc versão

2.6.002 (NICHOLAS; NICHOLAS; DEERFIELD, 1997).

O programa MODELTEST (POSADA; CRANDALL, 1998) foi usado para selecionar

o modelo de substituição nucleotídica que mais se adequava aos dados usados neste trabalho.

A reconstrução filogenética foi desenvolvida usando o método de distância Neighbor –

Joining (NJ) do programa PAUP versão 4.0b10 (SWOFFORD, 2003) e cada árvore

filogenética teve sua robustez obtida para nódulos e braços através do uso de 1000 pseudo-

réplicas para o cálculo de "bootstrap".

3.24.1 ANÁLISE FILOGENÉTICA CONJUNTA

A análise filogenética conjunta foi feita utilizando a associação dos genes completos

de Atp2p, Atp3p, Atp4p, Atp5p, Atp7p, Atp14p, Atp16p e Inh1p de PB, com as proteínas

correspondentes de outros oito fungos descritos no banco de dados do NCBI (National Center

for Biotechnology Information), através da construção de uma topologia, usando como grupo

externo a seqüência de proteína do organismo Schizosaccharomyces pombe.

O alinhamento das seqüências foi obtido através do programa CLUSTAL X

(THOMPSON et. al., 1997) com valores de penalidades sugeridos por Hall em 2001.

37

Alterações manuais para busca de possíveis erros, tanto para inserções como para deleções,

foram feitos no programa BIOEDIT v.5.0.9. (HALL, 1999).

Os dados para a análise filogenética foram provenientes da associação de 8 genes da

ATP sintase da membrana interna da mitocôndria totalizando 16211 aminoácidos de 9

diferentes espécies (Paracoccidioides brasiliensis, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa,

Magnaporthe grisea, Gibberella zeae, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis,

Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe).

A filogenia foi gerada pelo método de Máxima Verossimilhança com modelo

evolutivo obtido pelo programa MODELTEST (POSADA; CRANDALL, 1998) utilizando

valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações dentro do programa computacional

PAUP versão 4.0b10 (SWOFFORD, 2003).

38

4. RESULTADOS

Genes nucleares de PB relacionados à atividade respiratória codificam proteínas que

são sintetizadas no citoplasma porém exercem suas funções estruturais ou catalíticas na

mitocôndria. Sabemos que mais de 90% das proteínas existentes na organela são codificadas

no DNA nuclear e o restante é codificado, transcrito e traduzido no interior da organela

(TZAGOLOFF, 1977).

A ATPase é codificada em levedura por 18 genes (Tabela 4), 3 dos quais codificados

no DNA mitocondrial. O produto de 1 dos genes (Atp19) está presente apenas na forma

dimérica do complexo (ARNOLD et al., 1998).

Tabela 4: Genes codificadores de proteínas de levedura relacionadas à ATPase mitocondrial

GENE PRODUTO GÊNICO

ATP1 Subunidade alfa da F1-ATP sintase

ATP2 Subunidade beta da F1-ATP sintase

ATP3 Subunidade gama da F1-ATP sintase

ATP4 Subunidade 4 da F0-ATP sintase

ATP5 Subunidade 5 da F0-ATP sintase, confere sensibilidade à oligomicina

ATP6 Subunidade 6 da F0-ATP sintase (mtDNA)

ATP7 Subunidade 7 da F0-ATP sintase



ATP14 Subunidade h da ATP sintase

ATP15 Subunidade epsilon da F1-ATP sintase

ATP16 Subunidade delta da F1-ATP sintase

ATP17 Subunidade f da ATP sintase

ATP18 Subunidade j (ou i) da ATP sintase

ATP19 Subunidade k da F1-F0 ATP sintase (dímero apenas)

ATP20 Subunidade g da F1-F0 ATP sintase, domínio membranar do F0

39

TIM11 Subunidade e da F1-F0 ATP sintase, translocação de proteínas

INH1 Subunidade regulatória (inibitória) da ATP sintase

4.1 Análise das seqüências no banco de ESTs

Usando como "sonda" as seqüências de 18 genes de ATPase de levedura (ATP1,

ATP2, ATP3, ATP4, ATP5, ATP6, ATP7, ATP8, ATP9, ATP14, ATP15, ATP16, ATP17,

ATP18, ATP19, ATP20, TIM11 e INH1) foi feita uma busca global no nosso banco de dados

do P. brasiliensis e também no banco do grupo de Brasília.

Abaixo demostramos os resultados obtidos somente dos genes com “hits”

significativos, ou seja, E-value ≤10-5.

Tabela 5: Resultados obtidos pelo BLAST no banco de ESTs

GENE SEQÜÊNCIA

DE PB

REGIÃO DO

ALINHAMENTO (Q/S)a

PRODUTO GÊNICO E -

VALUE

ATP1

545aa

VP1-Pb30001-

202H08

467

39-131/184-462

Subunidade alfa da F1-ATP sintase 5e-37

ATP2

511aa*

VP1-Pb50001-

177A09

527

351-497/526-86

Subunidade beta da F1-ATP sintase 6e-64

ATP3

311aa*

EST003508 1011

18-235/148-783

Subunidade gama da F1-ATP sintase 2e-40

ATP4

244aa*

EST000954 868

34-241/133-750

Subunidade 4 da F0-ATP sintase 1e-52

ATP5

212aa*

EST000279 867

25-168/187-621

Subunidade 5 da F0-ATP sintase,

confere sensibilidade à oligomicina

2e-31

ATP7

174aa*

RC2-Pb30001-

125C01

368

1-115/23-367


ATP9

76aa

EST001725 429

36-74/63-179

Subunidade 9 da F0-ATP sintase

(mtDNA)

6e-10

ATP14

124aa*

VP1-Pb30001-

196C05

506

6-124/64-405

Subunidade h da ATP sintase 7e-09

ATP15

62aa

EST001663 902

3-51/122-265

Subunidade epsilon da F1-ATP sintase 1e-05

40

ATP16

160aa*

EST000733 869

32-160/116-508

Subunidade delta da F1-ATP sintase 8e-30

INH1

85aa*

VP1-Pb30001-

197H04

491

17-85/154-369

Subunidade regulatória (inibitória) da

ATP sintase

5e-12

a: o primeiro número indica o tamanho da seqüência. Abaixo indicamos a posição dos aminoácidos da proteína de levedura utilizada como "query" que alinham com os nucleotídeos indicados do clone de PB

* - Genes escolhidos para estudo detalhado neste projeto

4.2 Análise das seqüências no banco de RSTs

O banco de dados de RST é constituído por fragmentos de clones genômicos onde

foram depositados 11931 reads, que formam 2536 contigs e 4829 singlets provenientes de um

estudo liderado por nosso laboratório e com a participação da USP de Ribeirão Preto e da

UMC (Universidade de Mogi das Cruzes).

A mesma metodologia foi usada para a busca global no nosso banco de RSTs do P.

brasiliensis. Abaixo demostramos os resultados obtidos somente dos genes com “hits”

significativos, ou seja, E-value ≤10-5.

Com os "blasts" realizados nesse banco foi possível identificar apenas uma seqüência

correspondente ao do gene ATP17 com um provável íntron que através do alinhamento dessa

proteína com a seqüência genômica revela um íntron de 195 nucleotídeo.

41

Tabela 6: Resultados obtidos pelo BLAST no banco de RSTs

GENE SEQÜÊNCIA

DE PB

REGIÃO DO

ALINHAMENTO (Q/S)

PRODUTO GÊNICO E - VALUE

ATP1

545aa

VP1-Pb30003-

023A28

523

419-520/522-217

Subunidade alfa da F1-ATP sintase 5e-38

ATP2

511aa

VP1-Pb30003-

010D11

521

294-407/12-437

Subunidade beta da F1-ATP sintase 6e-05

ATP3

311aa

RC2-Pb30004-

001D10

5231

33-180/100-522

Subunidade gama da F1-ATP sintase 1e-33

ATP4

244aa

VP1-Pb30003-

028B05

494

191-241/493-341


ATP6

212aa

VP1-Pb30003-

024C02

506

1-73/307-504


(mtDNA)

5e-10

ATP7

212aa

VP1-Pb30003-

044F12

495

135-168/109-210


ATP8

212aa

VP1-Pb30003-

024C02

382

1-48/75-218


(mtDNA)

8e-09

ATP17

212aa

RC2-Pb30004-

005C06

527

15-46/428-523

2-15/192-233

Subunidade f da ATP sintase 1e-05

2.0

4.3 Sequenciamento completo dos cDNAs

Com o resultado da busca global, foi selecionado para o projeto 8 genes, sendo 4 do

nosso banco (ATP2, ATP7, ATP14 e INH1), e mais 4 genes do banco de Brasília (ATP3,

ATP4, ATP5 e ATP16). Os clones de Brasília foram cedidos gentilmente pela Dra. Maria

Sueli Soares Felipe.

Dos 8 clones de cDNAs incompletos trabalhados, todos foram completamente

seqüenciados usando-se "primers" "forward" e "reverse", sendo o tamanho dessas regiões N-

terminais e C-terminais acrescidas mostradas na tabela a seguir (Tabela 7).

42

Tabela 7: Bases acrescentadas às seqüências já existentes no banco de dados.

Gene N-terminal C-terminal

ATP2 1053 bases 42 bases




ATP7 _ 177 bases

ATP14 18 bases _

ATP16 96 bases _

INH1 51 bases _

As seqüências geradas foram submetidas ao "Blast" no NCBI para a confirmação do

gene de interesse. Com o auxílio do programa Sequencher 3.1 (Gene Codes), as seqüências

foram editadas e utilizando o ORFfinder disponível no site do NCBI foi possível analisar as

fases de leitura de cada gene. Para todos os clones portanto temos uma ORF completa

representando toda a seqüência codificadora do cDNA.

Abaixo (Tabela 8) demonstramos uma tabela comparativa entre Paracoccidioides

brasiliensis e Saccharomyces cerevisiae, destacando o tamanho dos polipeptídeos codificados

pelos genes relacionados ao complexo da ATP sintase, que foram completamente

sequenciados.

43

Tabela 8: Tabela comparativa dos produtos gênicos relacionados à ATP sintase de Saccharomyces cerevisiae e Paracoccidioides brasiliensis.

Saccharomyces cerevisiae

Paracoccidioides brasiliensis

No seqüências geradas

INH1 85aa 101aa 5 seq Fw (100) 6 seq R (140)

ATP16 160aa 165aa 4 seq Fw (T3) 5 seq R (99F)

ATP14 124aa 122aa 6 seq Fw (100) 6 seq R (140)

ATP7 174aa 174aa 2 seq Fw (100) 2 seq R (140)




ATP2 511aa 513aa

4 seq Fw (100) 3 seq R (140)

3 seq Fw (436) 2 seq R (437)

4.4 Alinhamento múltiplo de todos organismos

Através do "blast" feito no NCBI das seqüências de proteínas de P. brasiliensis, foi

possível identificar os organismos similares à ele, sendo que algumas destas seqüências, com

melhores E-value, foram adquiridas para os estudos comparativos.

Todas as seqüências adquiridas juntamente com a de P. brasiliensis foram agrupadas,

alinhadas e comparadas utilizando o programa Clustal X (THOMPSON et al., 1997) com

valores sugeridos por Hall (2001) para o alinhamento múltiplo. Alterações manuais foram

feitos no programa BIOEDIT v.5.0.9. (Hall, 1999) e visualizados no programa GeneDoc

versão 2.6.002 (NICHOLAS; NICHOLAS; DEERFIELD, 1997). Esses alinhamentos serão

mostrados a seguir.

45

Figura 7: Comparação entre as seqüências de proteínas codificadas pelo gene ATP2 de P. brasiliensis com as proteínas homólogas correspondentes de outros fungos. As regiões em preto indicam aminoácidos conservados, as regiões em cinza indicam substituições conservadas e as regiões de fundo branco indicam variações. Os traços indicam "gaps" introduzidos para otimizar o alinhamento e revelam diferença de tamanho entre as proteínas comparadas ou resíduos de aminoácidos que faltam entre as mesmas.

46

Figura 8: Comparação entre as seqüências de proteínas codificadas pelo gene ATP3

de P. brasiliensis com as proteínas homólogas correspondentes de outros fungos. As regiões em preto indicam aminoácidos conservados, as regiões em cinza indicam substituições conservadas e as regiões de fundo branco indicam variações. Os traços indicam "gaps" introduzidos para otimizar o alinhamento e revelam diferença de tamanho entre as proteínas comparadas ou resíduos de aminoácidos que faltam entre as mesmas.

47


48


49


50


51


52

Figura 14: Comparação entre as seqüências de proteínas codificadas pelo gene INH1 de P. brasiliensis com as proteínas homólogas correspondentes de outros fungos. As regiões em preto indicam aminoácidos conservados, as regiões em cinza indicam substituições conservadas e as regiões de fundo branco indicam variações. Os traços indicam "gaps" introduzidos para otimizar o alinhamento e revelam diferença de tamanho entre as proteínas comparadas ou resíduos de aminoácidos que faltam entre as mesmas.

53

4.5 Endereçamento Protéico

A análise de endereçamento protéico, de todas as seqüências, foi realizada com o

auxílio de 4 diferentes programas computacionais, são eles: TargetP, Predotar, MitoPred,

MitoProt. O resultado dessa análise está descrito na tabela abaixo (Tabela 9)

Tabela 9: Endereçamento protéico analisado por diferentes programas computacionais.

TargetP Predotar MitoPred MitoProt A

ATP2 MTP – 0,973 SP – 0,008 TPlen: 35 Outros – 0,068 Localização: Mitoc

Mitocondrial – 0,95 ER – 0,01 Outros – 0,05 Localização: Mitoc

Localização: Mitoc Confiável: 99,0%

Ponto de clivagem: 390,9988














Mitocondrial – 0,09 ER – 0,03 Outros – 0,89 Localização: none






Ponto de clivagem: não previsível 0,9906





INH1 MTP – 0,926 SP – 0,029 TPlen: 16 Outros – 0,106 Localização: Mitoc




54

Legenda: TargetP - mTP: (mitochondrial targeting peptide) peptídio com alvo mitocondrial; SP: (secretory pathway) peptídio com alvo para via secretora; TPlen: ponto de clivagem. Predotar - ER: retículo endoplasmático. MitoProt - a porcentagem indica a probabilidade de exportação para a mitocôndria.

4.6 Clonagem Molecular

Após realizar-se a transformação bacteriana da construção foram feitas as digestões

para confirmação das possíveis estratégias de clonagem. Para as amostras onde a digestão foi

positiva fez-se uma reação de seqüenciamento utilizando-se o iniciador 386 (que anela

próximo ao sítio de clonagem múltipla do vetor pMGL4). Obtivemos resultados satisfatórios

para 3 genes (ATP7, ATP14 e INH1).

Abaixo exemplificamos resultados relativos a alguns desses experimentos.

2 3 8 P 11 14 18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 P1112131415

16171819 P

(a) (b)

Figura 15: (a) Eletroforese em gel de agarose a 1% de DNA plasmidial obtido de

construções feitas para os genes ATP14 e INH1, nos poços de 1 à 9 e de 11 à 19 respectivamente, sendo os poços 10 e 20 o padrão (só vetor – pMGL4). (b) Digestão com KpnI e XbaI dos clones 2, 3, 8 (clones do ATP14), 11, 14 e 18 (clones do INH1) confirmando a construção somente dos três últimos clones que correspondem ao INH1.

Repetimos a construção para o clone ATP14.

55

2 5 6 9 11 12 13 17

1 2 3 4 5 6 7 8 9P1112131415

16171819P

(a) (b) (c)

Figura 16: (a) Eletroforese em gel de agarose a 1% de DNA plasmidial obtido de construções feitas para os genes ATP7 e ATP14, nos poços de 1 à 9 e de 11 à 19 respectivamente, sendo o poço 10 e 20 o padrão (só vetor – pMGL4). (b) Digestão com KpnI e XbaI dos clones 2, 5, 6 e 9 confirmando a construção. (c) Digestão com KpnI e XbaI dos clones 11, 12, 13 e 17 confirmando a construção no primeiro, segundo e quarto poço.

Utilizando os "primers" específicos, que foram construídos, foi feito um PCR de

amplificação por gradiente com uma variação de 49ºC a 55ºC na temperatura de anelamento

para escolher as condições ideais de reação, usando amostras de DNA de 2 genes somente, o

ATP2 e ATP16 e em todas as temperaturas houve amplificação como podemos perceber na

figura abaixo (Figura 17).

Amostras de 1 a 6 são provenientes do ATP2 e as

amostras do 7 ao 12 são provenientes do ATP16.

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12

Figura 17: Eletroforese em gel de agarose a 1% de amostras amplificadas por PCR. Os poços 1 e 7, 2 e 8, 3 e 9, 4 e 10, 5 e 11, 6 e 12 foram amplificados usando temperatura de anelamento de 49,2ºC; 50,5ºC; 51,9ºC; 53,4ºC; 54,3ºC; 55,1ºC respectivamente.

Para nossa surpresa a amplificação está robusta e funcionou em todas as condições

testadas. Foram feitas então as primeiras reações usando os 5 pares de "primers" para

56

amplificar as seqüências dos genes ATP2, ATP3, ATP4, ATP5 e ATP16 usando um Tm de

52ºC. Como apareceram algumas bandas inespecíficas novamente experimentamos

temperaturas entre 52ºC e 58ºC e uma terceira reação a 62ºC.

As bandas provenientes da amplificação foram eletroeluídas (Figura 18a) e feitas as

digestões desejadas dos 5 genes e do vetor também (Figura 18b)

1 2 P 3 4 5

1 2 P 3 4 5 6 7 8 9 10 P 11 12

(a) (b)

Figura 18: (a) Eletroforese em gel de agarose a 1% de DNA. Amostras de DNA eletroeluída dos clones correspondentes aos genes ATP2, ATP3, ATP4, ATP5 e ATP16 nos poços 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente. (b) Digestão dupla dos clones correspondentes aos genes ATP2, ATP3, ATP4, ATP5 e ATP16 nos poços 1, 2, 4, 6 e 7 respectivamente e nos poços 9 e 12 estão as digestões duplas do vetor pMGL4 com SacI, e XbaI e SmaI e XbaI respectivamente. Nos poços 3, 5, 8, 10 e 11 não foram aplicadas amostras com objetivo de manter espaçamento entre os poços para o corte das bandas para uma segunda eletroeluição. Os poços com P foram usados com o padrão.

Foram feitas as reações de ligação e em seguida transformação bacteriana porém não

obtivemos clones em meio LA. Talvez pelo sítio XbaI ser coesivo e pelo sítio SmaI ser cego

haja uma dificuldade na clonagem. Então foram feitas novas digestões substituindo a SmaI

pelo XmaI tendo esta a mesma seqüência do sítio de clivagem que a SmaI porém gerando

extremidades coesivas mas também não tivemos sucesso.

57

4.7 Esporulação e Dissecção de Tétrades

Foi utilizado um tratamento com a enzima Zimoliase, onde a dissecção foi eficiente,

tendo uma fácil separação das tétrades.

Juntamente com esse procedimento de dissecção das tétrades, foi feito a transformação

dos diplóides em levedura daqueles mutantes compatíveis com as construções já feitas no

vetor pMGL4 (vetor de expressão com promotor e terminador do gene ADH1, multicópia e

genes resistentes à ampicilina e o gene URA3 de levedura), que são dos genes ATP7, ATP14 e

o INH1.

A transformação foi eficaz no meio WO suplementado com histidina, leucina e

geneticina. Esses transformantes foram inoculados ao meio líquido de esporulação média

suplementados. E após 7 dias foram submetidos ao tratamento com zimoliase e dissecados.

As tétrades foram então plaqueadas em meio YPD, YPD com geneticina (devido a

deleção do gene ter sido elaborada pela introdução do cassete KanMX conferindo assim

resistência à geneticina) e EG (para avaliar a recuperação da capacidade respiratória).

4.8 Complementação Heteróloga

Nas placas de YPD com geneticina, por possuir somente um alelo defeituoso, 2

tétrades crescem tanto nas amostras transformadas quanto nas não transformadas e na placa de

EG (para avaliar a recuperação da capacidade respiratória) crescem 2 tétrades nas amostras

não transformadas e nas transformadas se crescerem as 4 podemos dizer que houve a

complementação heteróloga. Com base nesses dados podemos dizer que a complementação

foi positiva para o gene de ATP7 (Figura 19) e ATP14 (Figura 20). Nas figuras abaixo a placa

à esquerda é YPD com geneticina e à direita é EG sendo as amostras de cima as não

transformadas e as debaixo as transformadas.

58

E para o gene INH1 (Figura 21) o resultado não foi esclarecedor, já que todos os

esporos não transformados cresceram em EG portanto não obtivemos um fenótipo a ser

testado após a transformação heteróloga.

YPD com geneticina EG

abcd

5 4 3 2 1

ΔATP7 diplóide

heterozigoto

ΔATP7 diplóide

heterozigoto transformado

com o inserto de PbATP7

Figura 19: Tétrades dissecadas. Os esporos resistentes a geneticina (3a e 3d) e (5c e 5d) foram EG+ e os esporos não resistentes a geneticina (3b e 3c; 5a e 5b - não mutados) iam ser EG+ sempre então em meio EG os 4 esporos cresceram. Portanto a complementação foi positiva nesses dois exemplo


ΔATP14 diplóide

heterozigoto

ΔATP14 diplóide


com o inserto de PbATP14

abcd

4 3 2 1

Figura 20: Tétrades dissecadas. Os esporos resistentes a geneticina (3a e 3d) foram EG+ e os esporos não resistentes a geneticina (3b e 3c - não mutados) iam ser EG+ sempre então em meio EG os 4 esporos cresceram. Portanto a complementação foi positiva nesse exemplo.

59


ΔATP14 diplóide

heterozigoto

ΔATP14 diplóide


com o inserto de

PbATP14

Figura 21: Tétrades dissecadas. Na placa de EG (à direita), todos os esporos cresceram tanto os transformados quanto os não transformados Portanto não se pode obter nenhum resultado satisfatório.

Logo após esses resultados positivos foi realizado o processo de "back transformation"

para a confirmação dos resultados. Foram utilizados os esporos haplóides YPD+ e EG+ de

ambas amostras (para ATP7 - esporos 3a; 3d e 5c; 5d e para ATP14 - esporos 3a; 3d).

Escolhido os esporos foi realizado a extração de pDNA, transformação bacteriana,

mini-prep plasmidial, transformação em levedura e análise dos transformantes. Ressaltamos

que a transformação final foi feita de várias maneiras. Foi transformado o ΔATP7 haplóide

com o inserto de PbATP7, o ΔATP7 haplóide e somente o vetor (pMGL4), o ΔATP14

haplóide com o inserto de PbATP14, ΔATP14 haplóide e somente o vetor (pMGL4) e também

utilizando os mutantes diplóides com suas respectivas construção, ou seja, foram feitas 6

diferentes transformações com intuito de analisar a complementação heteróloga pretendida.

Somente a transformação com os mutantes diplóides foi positiva. Sendo assim os

transformantes foram submetidos a esporulação e dissecção de suas tétrades. E através dos

meios YPD com geneticina e EG foi possível confirmar a complementação funcional para os

genes ATP7 (Figura 22) e ATP14 (Figura 23) como mostram as figuras abaixo.

60


5 4 3 2 1

abcd

ΔATP7 diplóide

heterozigoto

transformado

com o inserto de

PbATP7

Figura 22: “Back Transformation” do ATP7. Os esporos resistentes a geneticina foram EG+ e os esporos não resistentes a geneticina iam ser EG+ sempre então em meio EG os 4 esporos cresceram. Portanto a complementação foi positiva nos 4 casos destacados.


ΔATP14 diplóide

heterozigoto

transformado

com o inserto de

PbATP14 4 3 2 1

d

abc

Figura 23: “Back Transformation” do ATP14. Os esporos resistentes a geneticina

foram EG+ e os esporos não resistentes a geneticina iam ser EG+ sempre então em meio EG os 4 esporos cresceram. Portanto a complementação foi positiva nos 2 casos destacados.

61

4.9 Análise Filogenética Conjunta

A filogenia apresentada abaixo (Figura 24) corrobora a hipótese de manter o ramo da

espécie de estudo Paracoccidioides brasiliensis (Pb) junto ao seu representante na classe

Eurotiomycetes (NCBI), o exemplar Aspergillus nidulans de forma consistente e também

separando destes o clado politômico entre Neurospora crassa, Magnaporthe grisea e

Gibberella zeae, todos pertencentes a classe Sordariomycetes (NCBI).

S . pom be

S . cerev is iae

C . a lb icans

K . lac tis

P . b ras iliens is

A . n idu lans

N . c rassa

M . g risea

G . zeae

93

93

93

100

53

100

Figura 24: Árvore filogenética obtida pelo método de Máxima Verossimilhança (ML) com valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações. A hipótese filogenética foi baseada em um concatenado formado pelo alinhamento de nucleotídeos de 8 genes de expressão mitocondrial (ATP2, ATP3, ATP4, ATP5, ATP7, ATP14, ATP16 e INH1) de P. brasiliensis com o de outras 8 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie S. pombe.

62

5. DISCUSSÃO

O presente trabalho apresenta o seqüenciamento completo de oito genes do fungo

patogênico Paracoccidioides brasiliensis, que codificam proteínas associadas à ATP sintase

mitocondrial. Sendo que desse total de oito genes, para dois foi possível obter a

complementação heteróloga funcional recuperando então a capacidade respiratória.

Ressaltamos a importância desse trabalho por ser o primeiro a estudar os genes

envolvidos com a função da ATP sintase de um fungo tão importante para a área da saúde.

Os resultados obtidos servirão como base para outros trabalhos.

5.1 Sequenciamento completo

A primeira parte desse trabalho compreendeu sequenciar por completo todos os 8

genes identificados nos clones gerados por estudos anteriores. Foram feitas varias reações de

PCR "forward" e "reverse" para cada gene até completar o seqüenciamento. O clone do ATP2,

por ser um gene grande com mais de 1500 bases não foi possível fazer o sequenciamento

completo direto usando-se os "primers" do vetor, assim sendo construimos "primers" internos.

Com o auxílio do programa "OLIGO Primer Analysis Software" (Molecular Biology Insights,

Inc), foram então sintetizados dois "primers", “forward” (436) e “reverse” (437).

Comparando a extensão dos genes de ATPase de Paracoccidioides brasiliensis com

Saccharomyces cerevisiae percebemos que são bem semelhantes porém destacamos o ATP5 e

o INH1 de P. brasiliensis maiores que em levedura com uma diferença de 18 e 16

aminoácidos respectivamente. Por outro lado percebemos o ATP3 como sendo menor que em

Saccharomyces cerevisiae com uma diferença de 14 aminoácidos.

Como podemos perceber com os resultados apresentados anteriormente o acréscimo

na região C-terminal foi menor e dependeu de melhor qualidade de seqüência pois os clones

63

eram de cDNA e o seqüenciamento inicial foi “single pass” e realizado a partir da

extremidade 3’do clone.

5.2 Alinhamento múltiplo

No alinhamento do produto do gene ATP2, destacamos uma região de 8 aminoácidos a

partir da posição 67 presente somente em Magnaporhe grisea. Percebemos também grandes

regiões conservadas entre os 9 organismos.

No alinhamento do produto do gene ATP3, destacamos em Saccharomyces cerevisiae

uma região de 3 aminoácidos iniciais exclusivo para esse organismo. A seqüência de proteína

de Candida albicans é menor que os outros organismos, iniciando depois de 41 aminoácidos.

Em Aspergillus nidulans também existe uma seqüência de 8 aminoácidos exclusivo para este

organismo presente próximo a porção C-terminal desse gene.

Vale a pena ressaltar que os 5 primeiros organismos do alinhamento do produto do

gene ATP3 (Paracoccidioides brasiliensis, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa,

Magnaporthe grisea, Gibberella zeae) possuem as mesmas seqüências de 10 aminoácidos

iniciais porém esses organismos pertencem a 2 grupos de classes diferentes, são eles

P.brasiliensis e A.nidulans pertencem a Eurotiomycetes enquanto N.crassa, M.grisea e

G.zeae pertencem a Sordariomycetes (NCBI)

No alinhamento do produto do gene ATP4, destacamos uma região N-terminal com 11

aminoácidos presente somente em Magnaporthe grisea, alguns "gaps" em várias seqüências

principalmente no seu início entretanto é significativa a presença de várias e extensas regiões

conservadas. Também ressaltamos para esse gene a mesma semelhança entre os 5 primeiros

organismos percebido na comparação feita para o produto de ATP3.

No alinhamento do produto do gene ATP5, destacamos um início tardio das

seqüências para os organismos Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis e Candida

64

albicans, mais uma vez aqui demonstrado que o grupo em destaque nos demais alinhamentos

permanece diferenciado dos demais organismos. Percebemos também algumas regiões

conservadas principalmente no final das seqüências.

No alinhamento do produto do gene ATP7, destacamos um alinhamento mais

uniforme porém com algumas pequenas variações de tamanho na extremidade N-terminal das

proteínas entre os organismos com diferença de 1 a 2 aminoácidos. Percebemos também as

extensas regiões conservadas ao longo de todo o alinhamento. Destacamos ainda a

inexistência da ortólogo de Gibberella zeae para essa proteína.

No alinhamento do produto do gene ATP14, destacamos vários "gaps" ao longo de

todo alinhamento para os 9 organismos. Nota-se também em Schizosaccharomyces pombe e

Kluyveromyces lactis a presença de polipeptídeos menores devido a seqüências de

endereçamento mais curtas.

No alinhamento do produto do gene ATP16, destacamos alguns fatos interessantes. A

seqüência de proteína de Gibberella zeae possui quase 130 aminoácidos na região N-terminal

exclusivo deste organismo. Por outro lado a seqüência de proteína de Aspergillus nidulans

possui mais de 400 aminoácidos na região C-terminal exclusivo para este organismo, ou seja,

esses 2 organismos são nitidamente maiores que os outros. As seqüências de Neurospora

crassa e Magnaporthe grisea tem um inicio tardio próximo a posição 160.

No alinhamento do produto do gene INH1, destacamos a seqüência de Neurospora

crassa como sendo maior que as demais possuindo 67 aminoácidos a mais que os outros

organismos em sua porção N-terminal. Percebemos também que Aspergillus nidulans possui

uma região de 19 aminoácidos exclusiva para este organismo. Presença de poucas regiões

conservadas ao meio das seqüências.

65

5.3 Endereçamento Protéico

Através da análise de endereçamento protéico de todas as seqüências em 4 diferentes

programas é possível ter uma previsão mais confiável do endereçamento organelar dos

produtos dos genes estudados.

O programa TargetP (EMANUELSSON et al., 2000), detecta apenas seqüências N-

terminais com uma fidelidade de cerca de 85%, informando se a proteína será direcionada

para a mitocôndria, cloroplasto (no caso de plantas) e/ou via secretora, assim como o ponto de

clivagem para a proteína madura, informação importante para os testes de endereçamento

protéico.

Com o Predotar (SMALL, 2004) é possível verificar o provável endereçamento

protéico para a mitocôndria, plastídeo ou retículo endoplasmático. Já o programa TargetP,

detecta apenas endereçamento N-terminal para a mitocôndria. Segundo os autores, os

resultados contém poucos falsos positivos.

O MitoPred (GUDA et al., 2004) prediz o endereçamento protéico apenas

mitocondrial, para todos os organismos, incluindo plantas. A performance desta ferramenta é

superior a 0,73, enquanto do TargetP é 0,51, segundo Guda e colaboradores em 2004.

Por fim, o programa MitoProt (CLAROS et al., 1996), assim como os demais, analisa

as seqüências amino-terminais, com direcionamento apenas mitocondrial, assim como o sítio

de clivagem.

Segundo os 4 diferentes programas computacionais para endereçamento protéico

podemos confirmar que esse tipo de análise confirma que os 8 genes do complexo da ATP

sintase estudados possuem endereçamento mitocondrial. Porém há, em alguns genes, uma

variação de tamanho da região de endereçamento, como pode ser percebido nos genes ATP3,

ATP4 e ATP7, por exemplo.

66

5.4 Complementação Heteróloga - Esporulação e Dissecção de Tétrades

As linhagens mutantes utilizadas (da Euroscarf), segundo o fornecedor, possuem uma

esporulação difícil e com rendimento de apenas 30%, sendo assim exigiu mais trabalho:

foram utilizados alguns meios especiais como o GNA, meio de pré-esporulação, e o meio de

esporulação composto por acetato de potássio e o acetato de zinco (BRACHMANN et al.,

1998).

Primeiramente para a dissecção dos tétrades foi utilizado a enzima β-glucuronidase da

SIGMA para a digestão dos ascos. Porém com esse procedimento não obtivemos resultados

positivos tendo muita dificuldade para separar as tétrades talvez pela enzima não estar com

boa atividade. Então fizemos um novo tratamento utilizando a enzima Zimoliase (ADAMS et

al., 1997), com isso a dissecção foi eficiente, tendo uma fácil separação das tétrades.

Segundo as informações do fabricante os mutantes respiratórios possuem somente 1

alelo defeituoso e sua manipulação genética foi elaborada pela introdução do cassete KanMX

conferindo resistência à geneticina (BRACHMANN, et al., 1998). Sendo assim utilizamos o

meio YPD com geneticina para a análise dos esporos onde foi possível uma fácil observação

quanto a deleção dos genes de ATPase uma vez que em presença de geneticina 2 esporos

cresceram e 2 esporos não cresceram. E o meio EG com fonte de carbono não fermentável foi

a ferramenta utilizada para avaliar a recuperação da capacidade respiratória dos mutantes

estudados.

As linhagens então transformadas foram examinadas fenotípicamente para avaliar a

recuperação da capacidade respiratória ou a normalização de outra característica fenotípica

que diferencia o mutante da célula parental selvagem. (NÓBREGA; NÓBREGA;

TZAGOLOFF, 1992, NÓBREGA, 1998, SOUZA et al., 2000; UEDA et al., 1997).

A complementação heteróloga foi eficiente para os mutantes nulos dos genes ATP7 e

ATP14 onde a deficiência respiratória foi evidente. Já para o INH1 não foi possível confirmar

67

uma complementação devido à inexistência de um fenótipo de deficiência respiratória nos

esporos derivados da esporulação do diplóide heterozigoto para a inativação do gene INH1.

Devemos ressaltar que o produto do gene INH1 é uma proteína acessória do complexo da

ATP sintase com função inibitória da síntese de ATP (Dienhart, 2002) o que poderia dificultar

mais a complementação heteróloga.

5.5 Análise Filogenética

Observando as topologias geradas no método Máxima Verossimilhança (MV) para as

análises filogenéticas dos genes de ATPase (Anexos), encontramos 2 clados (grupos) bem

consistentes, podendo variar de acordo com a presença ou não de determinados organismos

no estudo.

Destacamos o primeiro clado onde se encontra o fungo P. brasiliensis junto a mais 4

táxons: A. nidulans, G. zeae, M. grisea e N. crassa; sendo este número reduzido nas análises

dos cladogramas de ATP7 e ATP16, devido a falta dos táxons G. zeae e A. nidulans,

respectivamente. Dentro deste clado, destacamos a afinidade já esperada entre os fungos P.

brasiliensis e A. nidulans, por pertencerem à mesma classe taxonômica: Eurotiomycetes

(segundo NCBI). Já os outros exemplares do clado (G. zeae, M. grisea e N. crassa) se

encontram em outra classe taxonômica, denominada Sordariomycetes (NCBI). Porém na

análise do ATP16 encontramos a falta do táxon representado por A. nidulans, portanto a

topologia apresentou uma maior afinidade entre P. brasiliensis e G. zeae, o que demonstra

para esta hipotética análise que este organismo se encontra mais próximo evolutivamente a

classe do P. brasiliensis.

Ainda para este clado, com exceção das análises dos INH1 e ATP7, os representantes

da classe Sordariomycetes permanecem constantes em sua ramificação.

68

O segundo clado representado pelos táxons: K. lactis, S. cerevisiae e C. albicans

pertencentes a classe taxonômica Saccharomycetes (NCBI) aparecem agrupados em todas as

hipóteses obtidas, sendo que para os genes ATP3, ATP4, ATP5 e ATP7 C.albicans e S.

cerevisiae se encontram no mesmo ramo, já para os genes ATP2 e ATP16 ocorre uma

diferente posição dos ramos da árvore, agrupando mais fortemente K. lactis com S. cerevisiae.

Para todas as topologias, com exceção do gene INH1 (por não conter seqüência

descrita no banco de dados NCBI), destacamos o fungo S. pombe como grupo externo

pertencente à classe Schizosaccharomycetes (NCBI).

Ressaltamos que o alinhamento do gene INH1 mostrou-se bem divergente em relação

aos outros genes, onde podemos observar uma maior diferença entre o agrupamento das

seqüências de todos os organismos. Tal fato, possivelmente, pode ser explicado por este gene

ser uma proteína acessória do complexo da ATP sintase com função inibitória da síntese de

ATP (Dienhart, 2002), atuando externamente ao complexo o que permitiria que sua seqüência

e conformação possa sofrer uma menor pressão seletiva sem perda de função e, portanto, ter

uma maior diferença entre os organismos.

Destacamos que todas as análises descritas são hipóteses baseadas em topologias de

genes individuais, portanto diferenças encontradas entre essas topologias são discutíveis, já

que cada hipótese apenas descreve a possível história evolutiva de cada gene.

A árvore concatenada apresentou-se de forma esperada mantendo o ramo robusto de

P.brasiliensis junto ao A. nidulans ambos representante da mesma classe Eurotiomycetes

(NCBI), separando destes os outros organismos pertencentes a outras classes taxonômicas.

Salientamos também que a realização da análise filogenética conjunta foi feita com a

finalidade de permitir uma discussão integrada da filogenia, tentando assim descrever a

história evolutiva dos organismos baseada nos genes/proteínas da ATP sintase mitocondrial

que foram os 8 ATPs trabalhados e estudados nesse projeto.

69

6. CONCLUSÃO

De acordo com os objetivos iniciais propostos para este trabalho podemos concluir

ressaltando:

• Com as buscas feitas no banco de EST foi possível detectar oito genes incompletos

que foram selecionados para este estudo. No banco de RST detectamos somente o

gene ATP17 com um possível intron através do alinhamento analisado.

• Oito genes da ATP sintase mitocondrial (ATP2, ATP3, ATP4, ATP5, ATP7, ATP14,

ATP16 e INH1) foram sequenciados por completo. Os novos dados acrescentaram um

total de 1.645 bases às seqüências já disponíveis. Essas seqüências serão depositadas

no GenBank.

• Através da análise filogenética percebemos o agrupamento da espécie

Paracoccidioides brasiliensis com o Aspergillus nidulans, ambos representantes da

classe Eurotiomycetes ficando separado deste o clado de Neurospora crassa,

Magnaporthe grisea e Gibberella zeae, todos pertencentes a classe Sordariomycetes.

• Os testes de complementação heteróloga em levedura foram positivos para os

mutantes dos genes ATP7 e ATP14 onde a deficiência respiratória foi corrigida nos

transformantes. Já para o mutante de gene INH1 não obtivemos sucesso pois os

esporos haplóides não exibiram fenótipo de deficiência respiratória.

70

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76

ANEXOS

Figura 1: Topologia obtida pelo método de distância (NJ) com valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações (em negrito ao lado dos clados, sendo que os valores menores que 50% não foram descritos). A hipótese filogenética foi baseada no alinhamento de nucleotídeos do produto do gene ATP2 de P. brasiliensis com o de outras 8 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie S. pombe.

S.pombe

C.albicans

K.lactis

S.cerevisiae

97

100

P.brasiliensis

A.nidulans

G.zeae

M.grisea

N.crassa69

98

95

100

77

S.pombe

K.lactis

C.albicans

S.cerevisiae

63

73

P.brasiliensis

A.nidulans

G.zeae

N.crassa

M.grisea

85

56

100

Figura 2: Topologia obtida pelo método de distância (NJ) com valores de "bootstrap"

para 1000 pseudo-replicações (em negrito ao lado dos clados, sendo que os valores menores que 50% não foram descritos). A hipótese filogenética foi baseada no alinhamento de nucleotídeos do produto do gene ATP3 de P. brasiliensis com o de outras 8 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie S. pombe.

78

S.pombe

K.lactis

C.albicans

S.cerevisiae

90

91

G.zeae

N.crassa

M.grisea

89

81

A.nidulans

P.brasiliensis

84

100

100


79

S.pombe

P.brasiliensis

A.nidulans

94

G.zeae

M.grisea

N.crassa

92

80

100

K.lactis

S.cerevisiae

C.albicans

80

100

100


80

Figura 5: Topologia obtida pelo método de distância (NJ) com valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações (em negrito ao lado dos clados, sendo que os valores menores que 50% não foram descritos). A hipótese filogenética foi baseada no alinhamento de nucleotídeos do produto do gene ATP7 de P. brasiliensis com o de outras 7 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie S. pombe, não sendo representada a espécie G. zeae.

S.pombe

K.lactis

C.albicans

S.cerevisiae

65

77

P.brasiliensis

A.nidulans

N.crassa

M.grisea

98

67

100

100

81

S.pombe

S.cerevisiae

K.lactis

P.brasiliensis

A.nidulans

G.zeae

N.crassa

M.grisea

50

96

53

98

93

100

Figura 6: Topologia obtida pelo método de distância (NJ) com valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações (em negrito ao lado dos clados, sendo que os valores menores que 50% não foram descritos). A hipótese filogenética foi baseada no alinhamento de nucleotídeos do produto do gene ATP14 de P. brasiliensis com o de outras 7 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie S. pombe, não sendo representada a espécie C. albicans .

82

Figura 7: Topologia obtida pelo método de distância (NJ) com valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações (em negrito ao lado dos clados, sendo que os valores menores que 50% não foram descritos). A hipótese filogenética foi baseada no alinhamento de nucleotídeos do produto do gene ATP16 de P. brasiliensis com o de outras 7 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie S. pombe, não sendo representado a espécie A. nidulans.

S.pombe

M.grisea

N.crassa

G.zeae

P.brasiliensis

76

62

98

C.albicans

K.lactis

S.cerevisiae

97

99

100

83

K.lactis

S.cerevisiae

M.grisea

G.zeae

N.crassa

87

96

P.brasiliensis

A.nidulans

100

93

100

Figura 8: Topologia obtida pelo método de distância (NJ) com valores de "bootstrap" para 1000 pseudo-replicações (em negrito ao lado dos clados, sendo que os valores menores que 50% não foram descritos). A hipótese filogenética foi baseada no alinhamento de nucleotídeos do produto do gene INH1 de P. brasiliensis com o de outras 6 espécies de fungos, tendo esta, como grupo externo a espécie K. lactis e não sendo representadas as espécies C. albicans e S. pombe.

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