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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica ISABELA BUENO ROSSETI EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA ANTIMICROBIANA E DE COMPOSTOS ORGANOCALCOGÊNEOS SOBRE Candida albicans São José dos Campos, SP 2015
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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica
ISABELA BUENO ROSSETI
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA ANTIMICROBIANA E DE COMPOSTOS
ORGANOCALCOGÊNEOS SOBRE Candida albicans
São José dos Campos, SP 2015
ISABELA BUENO ROSSETI
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA ANTIMICROBIANA E DE COMPOSTOS
ORGANOCALCOGÊNEOS SOBRE Candida albicans
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Doutor em Engenharia Biomédica. Orientadora: Profª Dra. Maricilia Silva Costa
São José dos Campos, SP 2015
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo Dom da Vida, e a Maria por passar sempre à frente de todas as
situações da minha vida, boas e ruins.
À Profa. Dra. Maricilia Silva Costa, minha orientadora. Obrigada pelo cuidado de mãe
durante a Iniciação Científica e o Doutorado. Sou grata pela amizade, ensinamentos e
oportunidades. Sou eternamente grata por tudo que fizestes por mim.
Ao Prof. Dr. João Batista Teixeira da Rocha, por dispor de seu valioso tempo e intelecto
para auxiliar no desenvolvimento deste trabalho. Sua ajuda foi de fundamental importância.
Aos amigos de Laboratório, agradeço a paciência, o apoio e o companheirismo.
Principalmente à Ana Paula, Bruna, Marília, Moisés e Nikele que me acompanharam na fase
final do Doutorado.
Aos meus pais, Pedro e Rosemeire, e ao meu irmão Maurício, meus exemplos de vida,
dedicação, amor, paciência e carinho. E por sempre acreditarem em mim.
Ao meu namorado Vitor, por me acalmar e estar sempre ao meu lado, apoiando as minhas
decisões e acreditando em mim.
Aos amigos de longa data: Luciene, Toni, Ana Maria, Daniel, Juliana, João, Maiara,
agradeço pela agradável convivência, ensinamentos e amizade.
À comissão examinadora desta tese, pela disponibilidade e contribuições.
À todos os professores e funcionários do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da
UNIVAP, que contribuíram de alguma forma para minha formação.
Ao CNPq, FAPESP e à Universidade do Vale do Paraíba, pelo financiamento e
possibilidade de realizar este curso.
Resumo O fungo oportunista C. albicans é capaz de produzir infecções superficiais e sistêmicas em pacientes imunocomprometidos. A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFA) é um processo que combina luz e um agente fotossensível, que na presença de oxigênio, produz espécies reativas de oxigênio (EROs) que podem levar as células tratadas à morte. Os compostos organocalcogêneos podem reduzir o crescimento da C. albicans. Neste trabalho, estudamos os efeitos da TFA e dos compostos organocalcogêneos, (PhSe)2 e (pCl-PhSe)2 sobre a C. albicans. Foram avaliados o crescimento, a produção de EROs, a permeabilidade celular, a habilidade de formar biofilme e a viabilidade de biofilmes, após os diferentes tratamentos. Após a TFA, foi observado um aumento na produção de EROs e na permeabilidade celular. Ainda, foi observada a inibição de 62% da formação do biofilme, na presença de 0,1mg/ml de AT (Azul de Toluidina). A TFA reduziu a viabilidade do biofilme de 24 horas em 50% (0,1mg/ml de AT). O efeito do composto (PhSe)2 foi dependente da densidade de células no meio e da concentração do (PhSe)2. Foi observado aumento da produção de EROs (67%) e da permeabilidade celular (2,94 vezes) na presença (PhSe)2 10µM. O composto (PhSe)2 promoveu a redução da atividade de proteinases (6,8 vezes) em relação ao grupo não tratado. Também foi observada a redução, tanto do crescimento, como da formação do biofilme, após o tratamento com (PhSe)2. O composto (pClPhSe)2 também foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans, de uma maneira dependente da densidade de células no meio. A inibição do crescimento de C. albicans na presença de 10µM (pCl-PhSe)2 foi de aproximadamente 60%, 57%, 47% e 24%, nas densidades de 103, 104, 105 e 106 células/ml, respectivamente. O composto (pCl-PhSe)2 foi capaz de inibir a formação do biofilme de C. albicans. Foi observado o aumento na produção de EROs (96%) e na permeabilidade celular (1,10 vezes) na presença de 10µM (pCl-PhSe)2. Estes resultados demonstram que, tanto a TFA, como os compostos organocalcogêneos (PhSe)2 e (pCl-PhSe)2 apresentam potencial fungicida sobre C. albicans. Palavras-chave: Candida albicans, biofilme, Azul de Toluidina, Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana, (PhSe)2, (pCl-PhSe)2.
Effect of photodynamic Antimicrobial Chemotherapy and organochalcogenide compumds on Candida albicans
Abstract The opportunistic fungal C. albicans is able to produce both superficial and systemic infections in immunocompromised patients. Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) is a process that combines light and a photosensitizer, in the presence of oxygen, producing reactive oxygen species (ROS) that can kill the treated cells. The organochalcogenide compounds can reduce C. albicans growth. In this work, we investigate the effects of both, PACT and organochalcogenide compounds (PhSe)2 and (pCl-PhSe)2 on C. albicans. It was determinate: growth, ROS production, cell permeability, the ability to form biofilm and the viability of biofilms, after the various therapies. It was observed an increase in both the ROS production and cell permeability after PACT. Moreover, it was observed an inhibition of 62% at biofilm formation, in the presence of 0.1 mg/ml TB (Toluidine blue). PACT decreases the viability of 24 hour biofilm in 50% (0.1 mg/ml TB). The effect of compound (PhSe)2 was depended on both cell density, in the medium and (PhSe)2 concentration. It was observed an increase in the ROS production (67%) and cell membrane permeability (2,94-fold), in the presence of (PhSe)2 10µM. The compound (PhSe)2 promoted a marked decrease in the proteinase activity (6.8-fold) in relation to non-treated group. A decrease in the both cell growth and biofilm development were observed, after treatment with (PhSe)2. Also, the compound (pClPhSe)2 was able to inhibit the growth of C. albicans, in a cell density dependent manner. The inhibition of Candida albicans growth in the presence of 10µM (pCl-PhSe)2 was ~60, 57, 47 and 24%, in cell densities of 103, 104, 105 and 106 cells/ml, respectively. The compound (pCl-PhSe)2 was able to inhibit biofilm formation in C. albicans. It was observed an increase in both ROS production (96%) and cell membrane permeability (1.107-fold) by 10µM (pCl-PhSe)2. These results demonstrate that both PACT and organochalcogenide compounds, (PhSe)2 e (pCl-PhSe)2 present a great potential to inhibit Candida albicans. Keywords: Candida albicans, biofilm, Toluidine Blue, Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy, (PhSe)2, (pCl-PhSe)2.
Lista de Figuras
Figura 1 - Formação do biofilme de C. albicans. .................................................................................. 17
Figura 2 - Estrutura química do (PhSe)2. .............................................................................................. 23
Figura 3 - Estrutura química do composto (pCl-PhSe)2. ....................................................................... 24
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Classes dos antifúngicos convencionais. .............................................................................. 16
Tabela 2 - Fases da formação do biofilme de C. albicans. ................................................................... 18
Lista de Abreviações
(pCl-PhSe)2: Para-Cloro-Disseleneto de Difenila.
(PhSe)2: Disseneleto de Difenila.
AIDS: Acquired immunofeficiency Syndrome.
AM: Azul de Metileno.
AT: Azul de Toluidina.
C. albicans: Candida albicans.
DNA: Deoxyribonucleic acid.
EROs: Espécies reativas de Oxigênio.
FS: Fotossensibilizador.
GaAlAs: Arseneto de Gálio Alumínio.
InGaAlP: Índio, Gálio, Alumínio, Fósforo.
K: Potássio.
Laser: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation.
LED: Light Emission Diode.
MeHg: Metilmercúrio.
Na: Sódio.
PACT: Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy.
RNA: Ribonucleic acid.
ROS: Reactive Oxygen Species.
TB: Toluidine Blue.
TFA: Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana.
UFA: Unidade Formadora de Colônia.
Sumário
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 12
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................................. 14
2.1 Infecções fúngicas ........................................................................................................................ 14
2.2 Antifúngicos .................................................................................................................................. 15
2.3 Biofilme de Candida albicans ....................................................................................................... 16
2.4 Terapia fotodinâmica antimicrobiana .......................................................................................... 19
2.4.1 TFA e Candida albicans ................................................................................................................ 21
2.5 Compostos organocalcogêneos .................................................................................................... 22
3 OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 25
3.1 OBJETIVOS GERAIS ........................................................................................................................ 25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................... 25
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................ 26
5 CONCLUSÃO .................................................................................................................................. 27
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................... 28
ANEXO A – Artigo 1 ........................................................................................................................ 38
ANEXO B – Artigo 2 ........................................................................................................................ 38
ANEXO C – Artigo 3 ........................................................................................................................ 38
ANEXO D – Artigo 4 ........................................................................................................................ 38
12
1 INTRODUÇÃO
Fungos e bactérias são capazes de formar biofilmes, uma comunidade celular que adere e
se desenvolve em superfícies bióticas ou abióticas. Esta adesão tem representado um sério
obstáculo para o tratamento de infecções (AKBARI; KJELLERUP, 2015; CHABRIER-
RESELLÓ et al., 2005; CUÉLLAR-CRUZ et al., 2012; FERREIRA et al., 2013; MAYER,
WILSON, HUBE, 2013; NETT, ANDES, 2015; WHITE, BACHEWICH, 2007).
Em comparação com células planctônicas, os biofilmes são mais resistentes às terapias
antimicrobianas convencionais e à defesa do hospedeiro. A formação de biofilme tem sido
descrita em Candida albicans, o fungo mais comum em ambiente hospitalar e causador de
infecção da corrente sanguínea (AUTMIZGUINE et al., 2014; CALDERONE et al.,
2014;SRINIVASAN, LOPEZ-RIBOT, RAMASUBRAMANIAN, 2014; SHAPIRO,
ROBBINS, COWEM, 2011; AZEVEDO et al., 2015).
A semelhança entre as células fúngicas e as células de mamíferos, compreendem a
estrutura celular e as vias de biossíntese presentes nestes eucariotos. Esta semelhança dificulta
a busca de antifúngicos seguros, baratos e eficazes. Atualmente, os antifúngicos disponíveis
no mercado podem ser divididos em cinco classes: Polienos, Análogos da pirimidina, Azóis,
Alilaminas, Equinocandidas. Apesar de serem eficazes, estes compostos apresentam efeitos
colaterais intensos e existem relatos de resistência microbiana (BASSETTI et al., 2015;
BUSTAMANTE, 2005; CANNON et al., 2014; MOTA et al., 2015; PERLIN, 2014;
PIERCE, LOPEZ-RIBOT, 2013; WALRAVEN, LEE, 2013).
Infecções na corrente sanguínea e infecções sistêmicas causadas por espécies do Gênero
Candida apresentam uma alta taxa de mortalidade (46-75%) e alta morbidade em pacientes
que sobrevivem à infecção. Ainda, o tratamento resulta em um alto custo financeiro pessoal e
governamental (ARENDRUP, 2013; BROWN et al., 2012; BARBEDO, SGARBI, 2010;
SARDI et al., 2013; HAVLICKOVA, CZAIKA, FRIEDRICH, 2005).
Portanto, o desenvolvimento de novas terapias antifúngicas se faz de grande valia para
reduzir a mortalidade e a morbidade de pacientes, além de reduzir o custo financeiro para o
paciente e a instituição hospitalar.
O estudo da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFA) e de compostos
organocalcogêneos como alternativa para o tratamento de infecções fúngicas tem sido
relatado.
13
A TFA tem recebido destaque como terapia antifúngica. Esta técnica combina luz a um
corante não tóxico, na presença de oxigênio, promovendo a formação de radicais livres e de
oxigênio singleto (altamente reativo). Esta combinação resulta em dano celular permanente e,
consequentemente a morte celular (CALZAVARA-PINTON et al., 2012; CASAS et al, 2011;
DEMIDOVA, HAMBLIN, 2004; DONELLY, MCCARRON, TUNNEY, 2008;
WAINWRIGHT, 1998).
Os compostos organocalcogêneos podem ser formados pelos elementos químicos
oxigênio, enxofre, selênio, telúrio e polônio. Recentemente, estes compostos têm apresentado
efeitos farmacológicos importantes como: antioxidante, antifúngico, antimutagênico, entre
outros. (ROSA et al., 2005; ROSA et al., 2007; ROSA et al., 2004; ROSSATO et al., 2002;
ROSSETI et al., 2010; ROSSETI et al., 2014a; ROSSETI et al., 2014b; ROSSETI, DA
ROCA, COSTA, 2015; SANTOS et al., 2009; SAVEGNAGO, JESSE, NOGUEIRA, 2009).
O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da TFA e dos compostos
organocalcogêneos ((PhSe)2 e (pCl-PhSe)2) sobre a formação e a viabilidade do biofilme
produzido por C. albicans.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Infecções fúngicas
As infecções causadas por fungos são responsáveis por inúmeras mortes no mundo todo.
Estas infecções podem ser superficiais ou sistêmicas. O organismo dos mamíferos é capaz de
combater as infecções fúngicas, porém, em casos de imunossupressão do hospedeiro a
infecção pode ser instalada (AGUILAR et al., 2015; BARBEDO, SGARBI et al., 2010;
FALAGAS, APOSTOLOU, PAPPAS, 2006; LIM, et al., 2012).
As infecções superficiais ocorrem sobre as mucosas e pele (vaginite, mucosite,
onicomicose) e são infecções de tratamento simples, porém, demorado. Raramente evolui
para infecção sistêmica, o tipo de infecção em que o microrganismo invade a corrente
sanguínea e pode causar a morte do hospedeiro (HAVLICKOVA, CZAIKA, FRIEDRICH,
2008; MAYER, WIOLSON, HUBE, 2013).
A incidência das infecções causadas por fungos é modificada de acordo com a região
geográfica, classe socioeconômica, idade do hospedeiro e tipo de microrganismo, porém,
estes dados não estão bem consolidados, pois são poucas as agências de saúde ao redor do
mundo que realizam uma busca efetiva dos dados referentes às infecções micóticas
(AGUILAR et al., 2015; ARENDRUP, 2013; BASSETTI et al., 2015; BROWN et al., 2012;
EDMOND et al., 1999).
Dentre os fungos patogênicos, as espécies de Candida tem sido as maiores causadoras de
infecções nosocomiais nos últimos 20 anos. Existem mais de 100 espécies de Candida,
porém, as mais frequentemente isoladas em infecções hospitalares são: C. albicans, C. krusei,
C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis (ENOCH, LUDLAM, BROWN, 2006;
FERREIRA et al., 2013; SRINIVASAN, LOPEZ-RIBOT, RAMASUBRAMANIAN, 2014).
Nos últimos anos tem sido relatado um aumento na incidência de infecções causadas por
espécies não-albicans, porém, a C. albicans continua sendo a maior causadora de infecções
dentro da espécie (FERREIRA et al., 2013).
A C. albicans tem sido a maior causadora de morbidade e mortalidade de hospedeiros
com infecções na corrente sanguínea. A incidência destas infecções tem aumentado
significativamente nos últimos anos, devido ao aumento do número de pacientes
imunocomprometidos e neutropênicos após transplante de órgãos, terapia contra o câncer ou
AIDS. Nestas populações, a C. albicans está associada a uma alta taxa de mortalidade e,
grandes consequências econômicas. Apenas nos Estados Unidos, os custos anuais com
15
infecções sistêmicas por fungos são de aproximadamente U$2,6 bilhões, sendo que, apenas as
infecções por Candida custam em torno de U$1,8 bilhões (BARBEDO, SGABI, 2010;
BASSETI et al., 2015; EDMOND et al., 1999; ENOCH, LUDLAM, BROWN, 2006).
Estudos recentes têm demonstrado que a incidência de candidose após transplante de
fígado é de 68-78,7%, enquanto que a incidência de infecções por outros fungos é
consideravelmente menor. A taxa de mortalidade após um episódio de infecção por fungo é de
50-92%. Além disso, o tratamento resultar em alto custo financeiro, pessoal e governamental
(AUTMIZGUINE et al., 2014 ).
Portanto, o desenvolvimento de novas terapias antifúngicas se faz de grande valia para
reduzir a mortalidade e a morbidade de pacientes, além de reduzir o custo financeiro para o
paciente e a instituição hospitalar.
2.2 Antifúngicos
Durante os últimos 30 anos, a incidência das infecções fúngicas tem aumentado
drasticamente. As opções terapêuticas disponíveis são reduzidas e os microrganismos
patogênicos apresentam capacidade mutagênica e adquirem resistência aos tratamentos
disponíveis. Isto ocorre pelo uso descontrolado e repetitivo de antifúngicos, além da
administração concomitante com outros fármacos (CALDERONE et al., 2014;
M\HMOUDABADI, ZARRIN, KIASAT, 2014).
A busca por antifúngicos seguros, baratos e eficazes é dificultada pelas grandes
semelhanças entre a estrutura celular e as vias de biossíntese dos fungos e seus homólogos
mamíferos (SHAPIRO, ROBBINS, COWEN, 2011; WALRAVEN, LEE, 2013).
Os fármacos convencionais para o tratamento de infecções fúngicas podem ser divididas
em cinco classes, descritas na Tabela (1).
16
Tabela 1 - Classes dos antifúngicos convencionais.
Classes Mecanismo de ação Fármaco
Polienos
Ligam-se aos esteróis presentes na membrana celular
fúngica promovendo, a saída de eletrólitos (formação
de canais transmembranares)
Anfotericina B
Análogos da
pirimidina Inibem a síntese de DNA e RNA Flucitosina
Azóis Inibem a síntese de ergosterol (bloqueio da enzima 14-
α lanostero-demetilase) Fluconazol
Alilaminas Inibem a síntese de ergosterol (bloqueio da enzima
esqualeno-oxidase) Terbinafina
Equinocandinas Bloqueiam a enzima β- sintase 1,3-glucano (alteração
da permeabilidade da parede celular) Caspofungina
Fonte: Walraven (2013); Srinivasan, Lopez-Ribot, Ramasubramanian, (2014) e Perin, (2014).
O fluconazol e a Anfotericina B têm sido a droga de escolha para o tratamento das
infecções causadas por Candida. Porém, tem sido relatados casos de resistência a estes
antifúngicos e, consequente, morte do paciente (SHAPIRO, ROBBINS, COWEN, 2011;
PIERCE, LOPEZ-RIBOT, 2013; COSTE et al., 2007).
2.3 Biofilme de Candida albicans
O biofilme é considerado um importante fator de virulência. Virulência é a capacidade de
um microrganismo causar doença e é determinado por diversos fatores. A virulência descreve
o grau de patogenicidade de uma espécie (CUÉLLAR-CRUZ, LOPES-ROMERO,
VILLAGÓMEZ-CASTRO, 2012; DE ROSSI et al., 2011; FERNANDES, DIAS, 2013;
GRASL et al., 2015).
A C. albicans apresenta diversos fatores de virulência, o que facilita a ocorrência da
infecção por este patógeno oportunista. Os fatores de virulência deste fungo incluem: adesão a
células hospedeiras, secreção de enzimas de degradação, formação de biofilme e alterações
morfológicas (Figura 1) (MAYER, WILSON, HUBE, 2013; MATHÉ, DIJCK, 2013; NETT,
ANDES, 2014).
17
A C. albicans pode crescer como levedura (blastóporos) e é capaz de produzir filamentos
(pseudohifa, micélio), portanto é considerada um fungo polimórfico (PIERCE, LOPES-
RIBOT, 2013; RAMAGE et al., 2005).
Figura 1 - Formação do biofilme de C. albicans.
Fonte: Adaptado de: Mayer, Wilson e Hube (2013).
As células de levedura entram em contato com a superfície da célula do hospedeiro e
expressam adesinas. Este contato promove a transição de levedura para hifas. A ligação das
células de levedura em superfícies abióticas (cateteres) ou biótica (células hospedeiras de
superfícies) levando à formação de biofilmes com células de levedura na parte inferior e hifas
na parte superior do biofilme. A forma de levedura é útil para disseminar o fungo na corrente
sanguínea, porém a forma filamentosa tem a capacidade de penetrar as barreiras hospedeiras
(MAYER, WILSON, HUBE, 2013; MATHÉ, DIJCK, 2013).
A C. albicans possui um conjunto especializado de proteínas (adesinas) que participam da
adesão a outras células de C. albicans, a outros microrganismos, a superfícies abióticas e a
células do hospedeiro (NETT, ANDES, 2015; SARDI et al., 2013; TARASZKIEWICZ et al.,
2013; ).
As adesinas podem ser definidas como biomoléculas que promovem a aderência de células
de C. albicans a superfícies (MAYER, WILSON, HUBE, 2013; NETT, ANDES, 2015).
Os biofilmes são produzidos em um processo sequencial que inclui adesão celular
(leveduras) ao substrato, proliferação das células aderidas, formação de hifas na porção
superior do biofilme, acúmulo de matriz extracelular e, então, ocorre à dispersão das células
pela corrente sanguínea (SILVA-DIAS et al., 2015; MAYER, WILSON, HUBE, 2013).
Os biofilmes dificultam o tratamento de pacientes com infecções sistêmicas por ter uma
maior resistência às drogas antifúngicas e a resposta imune do hospedeiro, além de poder
causar falhas em dispositivos médicos. Estes dispositivos, tais como cateteres e válvulas
18
cardíacas, proporcionam superfícies adequadas para a adesão e a ancoragem do biofilme
(WHITEWAY, BACHEWICH, 2007).
Em geral, a formação de biofilmes de C. albicans é dividida em quatro fases, descrito na
tabela 2.
Tabela 2 - Fases da formação do biofilme de C. albicans.
Fase Evento
1 Adesão da parede celular, mediada por proteína de adesão das células de
levedura, a uma superfície
2 Crescimento das células de levedura em anexo a uma camada fina de células
3 Maturação do biofilme por meio do desenvolvimento de hifas e pseudo-hifas e
excreção de material de matriz extracelular
4 Dispersão das células do biofilme, possivelmente levando a colonização de
lugares distantes.
Fonte: Mayer, Wilson e Hube (2013).
Os biofilmes são comunidades heterogêneas de células embebidas dentro de uma matriz
extracelular e sua formação inclui 3 fases distintas de desenvolvimento WHITEWAY, M.;
BACHEWICH, C., 2007; SHAPIRO et al., 2011):
1) Fase inicial (0-11h) – envolve a adesão das células ao substrato.
2) Fase intermediária (12-30h) – os blastóporos proliferam, formando comunidades e
produzindo uma matriz extracelular rica em carboidratos.
3) Fase de maturação (31-72h) – as células estão completamente envolvidas por uma
matriz extracelular espessa.
Os biofilmes de C. albicans parecem ser resistentes as diversas drogas antifúngicas
convencionais (RAMAGE et al., 2005; SHAPIRO et al., 2011; IÑIGO et al., 2012) e uma
correlação entre a resistência às drogas antifúngicas e a habilidade da C. albicans em formar
hifas tem sido descrita (HA, WHITE, 1999; RAMAGE et al., 2005). Tem sido demonstrado
que biofilmes de C. albicans podem ser mais de 1.000 vezes mais resistentes às terapias
antifúngicas tradicionais do que as células planctônicas (RAMAGE et al. 2005; CHANDRA
et al. 2012).
Tem sido demonstrado que, quando comparados aos biofilmes na fase inicial do
desenvolvimento, biofilmes maduros apresentam um progressivo aumento na resistência às
19
drogas antifúngicas tradicionais, tais como a Anfotericina B (CHANDRA et al. 2001;
PERUMAL et al. 2007; SHINDE et al. 2012; ZHU et al. 2013). CHANDRA et al. (2001),
demonstraram que biofilmes na fase inicial do seu desenvolvimento apresentaram baixos
MICs para Anfotericina B e um aumento dos valores de MIC foram observados em biofilmes
desenvolvidos de C. albicans.
Embora as estruturas do biofilme possam diferir dependendo das condições de
crescimento, biofilmes maduros de C. albicans, presentes na maior parte, após 24-48 horas da
formação de biofilme, consistem numa camada fina de levedura responsável pela ligação da
camada mais espessa, que compreende as células de levedura e hifas, para a superfície
(AKBARI; KJELLERUP, 2015; CHABRIER-RESELLÓ et al., 2005; CUÉLLAR-CRUZ,
LOPES-ROMERO, VILLAGÓMEZ-CASTRO, 2012).
Biofilmes maduros são muito mais resistentes a agentes antimicrobianos em comparação
com células planctônicas. Os fatores responsáveis pela resistência aumentada incluem a
arquitetura complexa dos biofilmes, a matriz do biofilme e o aumento da expressão de
bombas de efluxo de drogas. Estudos recentes indicam que biofilmes de C. albicans são
resistentes à morte por neutrófilos (FERNANDES, DIAS, 2013; FERREIRA, et al., 2013;
MAYER, WILSON, HUBE, 2013; MATHÉ, DJICK, 2013; DIEZMANN, LEACH, COWEN,
2015).
Para o tratamento de biofilmes, a eficácia das equinocandinas e das formulações lipídicas
do polieno Anfotericina B tem sido demonstrada, tanto in vitro, como in vivo. Os azóis
antifúngicos, os análogos de pirimidina, alilaminas e formulações clássicas de polienos não
são eficazes para reduzir o crescimento do biofilme (PIERCE, LOPES-RIBOT, 2013; SARDI
et al., 2013; SILVCA-DIAS et al., 2015).
A TFA tem sido defendida como uma alternativa aos agentes antimicrobianos para matar
microrganismos (GARCEZ et al., 2013; KISHEN et al., 2010), pois, o extensivo e
inadequado uso de agentes antimicrobianos tem levado à ineficiência da terapêutica
convencional (HÁ, WHITE, 1999);
2.4 Terapia fotodinâmica antimicrobiana
A TFA tem sido defendida como uma alternativa aos agentes antimicrobianos para tratar
infecções (CAFFAREL-SALVADOS et al, 2015), pois o extensivo e inadequado uso de
agentes antimicrobianos tem levado a ineficiência da terapêutica convencional
(WAINWRIGHT, 1998; DEMIDOVA, HAMBLIN, 2005).
20
Esta técnica utiliza um corante não-tóxico, um composto fotossensível (FS), que, excitado
por luz e na presença de oxigênio pode causar danos permanentes às células do
microrganismo (WAINWRIGHT, 1998; CASA et al., 2011).
O composto fotossensível absorve a luz em comprimento de onda específico, o oxigênio
presente no meio é convertido para seu estado excitado tripleto, que, por sua vez, reage com
um substrato local (reação tipo I), para formar radicais citotóxicos ou com o oxigênio
molecular (reação tipo II), para a produção do oxigênio citotóxico singleto. Este reage
rapidamente com o seu ambiente (parede celular, ácidos nucléicos, peptídeos, lipídeos,
proteínas, etc.). Estas reações tipo II têm sido consideradas como o principal mecanismo de
dano foto-oxidativo em microrganismos (DONNELLY, MCCARRON, TUNNEY, 2008).
Mais de 400 compostos com propriedades FS são conhecidos, incluindo corantes,
medicamentos, produtos químicos e compostos naturais. O azul de toluidina (AT) é um
corante fenotiazínico que apresenta pico absorção em 630nm e tem demonstrado eficácia na
inibição do crescimento de C. albicans (HUANG et al., 2010). Para o sucesso da TFA,
utilizando o AT como agente FS, deve-se utilizar uma fonte de energia capaz de produzir luz
em 630nm, comprimento de onda correspondente ao pico de absorção de luz do AT (HUANG
et al., 2010; HARRIS, CHATFIELD, PHOENIX, 2005).
Diversas fontes de luz podem ser utilizadas na aplicação da TFA, as duas principais fontes
de estudo são os lasers (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) e LED
(Light Emission Diode).
O laser produz um feixe de luz com energia colimada, coerente e monocromática. Já o
LED é um diodo semicondutor capaz de transformar energia elétrica em energia luminosa, a
luz produzida não é monocromática, colimada e nem coerente (WAINWRIGHT, 1998;
MAISCH, 2007).
Os efeitos produzidos pela TFA utilizando como fonte de luz lasers e LEDs são
semelhantes, apesar das diferenças nas propriedades da luz (PLAETZER et al., 2013;
PRATES et al., 2009). A possibilidade de irradiar áreas maiores e o menor custo dos LEDs o
torna uma alternativa.
Diante deste panorama, a TFA tem sido uma alternativa no tratamento de infecções
fúngicas e bacterianas, porém, muitos estudos ainda precisam ser realizados para elucidar os
mecanismos de ação desta terapia (METCALF et al., 2006; DA COSTA et al.,2010; GAD et
al., 2004).
21
2.4.1 TFA e Candida albicans
Buscando uma nova linha terapêutica para o tratamento de infecções causadas por C.
albicans, diversos autores tem relatado que esta terapia apresenta grande potencial antifúngico
(ANDRADE et al., 2013; DE SOUZA 2006 ). A TFA tem sido amplamente utilizada na
odontologia para a desinfecção da superfície dental em procedimento endodônticos
(GARCEZ et al., 2007; FONTANA et al., 2009).
Segundo SUZUKI et al., (2010), a TFA utilizando como corante AT e como fonte de luz
um LED (630+/- 20nm) sobre biofilme de C. albicans é capaz de reduzir as do biofilme,
sugerindo uma destruição da arquitetura do biofilme, provavelmente causadas por Espécies
Reativas de Oxigênio (EROs).
A TFA, utilizando uma lâmpada (400nm – 700nm) e, como fotossenssibilizador, o
Photofrin@, sobre a formação do tubo germinativo e biofilme de C. abicans, foi capaz de
inibir o crescimento do biofilme maduro, além de reduzir a atividade metabólica de tubos
germinativos (CHABRIER-ROSELLÓ et al., 2005). MUNIN et al., (2007), verificaram que a
TFA foi capaz de impedir a formação de tubos germinativos, o que poderia reduzir a
virulência de C. albicans.
Tem sido estudado o efeito fungicida de TFA, comparando seu efeito fungicida utilizando
um laser de GaAlAs (630nm) e três diferentes corantes (Azul de metileno (AM), AT e verde
de malaquita). Os três corantes testados foram capazes de inibir, em pelo menos 50% a
formação de UFC (Unidade Formadora de Colônia) de C. albicans, utilizando a densidade de
energia de 40J/cm2 (SOUZA et al., 2010).
Segundo PRATES et al., (2009), demonstraram que alterações nos parâmetros de
irradiação influenciam os efeitos da TFA sobre leveduras de C. albicans. Foi utilizado um
Laser GaAlAs (660nm), e, como agente fotossensível, o AM. A TFA foi eficaz em inibir o
crescimento de C. albicans. Os resultados foram mais significativos utilizando a fluência de
energia de 300mW/cm2. Estes autores também demonstraram que a fluência da luz utilizada
para a realização da TFA está diretamente ligada à produção das EROs e consequentemente,
aos danos fotodinâmicos produzidos às células.
Tem sido demonstrado que a TFA utilizando diferentes fontes de luz, e diferentes agentes
fotossensível é capaz de inibir 50% das UFC produzidas por células de biofilme de C.
albicans.. Além de reduzir a capacidade de adesão do biofilme formado por este fungo
(PEREIRA et al., 2010; COSTA et al., 2012; BLISS et al., 2004; KATO et al., 2013).
22
Giroldo et al., (2009), avaliaram o efeito da TFA utilizando AM e Laser e demonstraram
que esta terapia é capaz de aumentar a permeabilidade de membrana de C. albicans e,
consequentemente, a morte do microrganismo, sugerindo o mecanismo de ação desta terapia.
Tem sido estudada a associação de nanopartículas de ouro ao AM para otimizar a absorção
de luz deste composto sobre o biofilme de C. albicans. Esta associação foi capaz de inibir o
crescimento do biofilme produzido por C. abicans (KHAN et al., 2012).
Células planctônicas e em forma de biofilme reagem diferentemente aos tratamentos
antifúngicos. A C. albicans necessita de uma maior concentração de antifúngico para inibir o
crescimento de biofilme, comparado às células leveduriformes (CALDERONE et al., 2014).
Segundo Gonzales et al., (2013), o Photofrin@ é um FS, utilizando na TFA é capaz de
inibir o crescimento de células de C. albicans na forma de levedura e na forma de biofilme
(filamentosa).
Diante da revisão da literatura, é possível sugerir que a TFA pode ser uma nova opção
terapêutica para as infecções causadas por este fungo. Utilizando diferentes fontes de luz e
corantes, pois, os parâmetros para a aplicação da TFA ainda são variados (PRATES, et al.,
2010; SORIA-LOZANO, 2015).
2.5 Compostos organocalcogêneos
Os compostos organocalcogêneos podem ser formados pelo elemento químico Selênio
(Se), que pode apresentar-se sob quatro estados de oxidação: selenato (Se+6), selenito (Se+),
selênio elementar (Se0) e Seleneto (Se-2) (ROTRUCK et al., 1973).
O papel bioquímico do Se ficou bem estabelecido após descobrimento de que esse
composto faz parte da enzima antioxidante Glutationa Peroxidase. Desde a descoberta das
funções do Se para o sistema biológico enzimático, tornou-se necessário esclarecer a
importância desse elemento para as selenoenzimas (ROTRUCK et al., 1973).
Tem sido demonstrado que o (PhSe)2 pode ser um mutagênico fraco, promovendo quebras
no DNA, devido a ação pró-oxidante sobre bactérias e leveduras. Ainda, o efeito pró-oxidante
do (PhSe)2 tem sido demonstrado em leveduras Saccharomyces cerevisiae expostas a
condições geradoras de espécies reativas de oxigênio (ERO’s) (ROSA et al., 2005; ROSA et
al., 2007).
As propriedades antioxidante e neuroprotetora do disseleneto de difenila (PhSe)2, um
composto orgânico estruturalmente simples, foram demonstradas em modelos experimentais
de isquemia e toxicidade induzida por MeHg (ROSA et al., 2014).
23
Figura 2 - Estrutura química do (PhSe)2.
Denardi et al., (2013), observaram que o (PhSe)2 quando associado aos antifúngicos
convencionais, fluconazol ou Anfotericina B, podem inibir em 50% o crescimento de C.
glabrata.
Rosseti et al., (2010), relataram que o (PhSe)2 foi capaz de inibir o crescimento e a
formação de tubo germinativo de C. albicans, em baixas concentrações do composto.
Devido a crescente necessidade do desenvolvimento de compostos que apresentem
atividades biológicas e aplicações farmacológicas, os organocalcogêneos com propriedades
antioxidantes, que em geral, são inibidores da peroxidação lipídica têm chamado bastante
atenção (LORETO et al., 2011).
Os compostos utilizados são estruturalmente relacionados ao (PhSe)2 e as alterações na
molécula poderiam causar alterações na sua estrutura química e, consequentemente, em suas
atividades biológicas. Assim, sua potencial atividade contra Candida albicans também
poderia ser modificada.
Alterações estruturais no anel aromático do (PhSe)2 com a introdução de grupos
funcionais foram propostas e avaliações farmacológicas e toxicológicas desenvolvidas. O
(pCl-PhSe)2 (Figura 4) é um dos compostos organocalcogêneos sintetizados a partir da
molécula do (PhSe)2.
De acordo com Rosseti et al., (2010), o (pCl-PhSe)2 apresenta menos eficiência em inibir
o crescimento de C. albicans, comparado ao efeito do (PhSe)2. Porém, é capaz de inibir 80%
da formação do tubo germinativo desta levedura. Isto demonstra que este diferenças na
estrutura química do composto pode alterar seu efeito biológico .
A dose letal (DL50) do (pCl-PhSe)2 para camundongo é superior à 381mg/kg. A partir de
modelos experimentais, in vivo e in vitro foi constatado que, dependendo da dose e das
condições testadas, o composto inibe a atividade da omega-ALA-D, catalase, Na+/k+-ATPase
e a captação de serotonina (DE FREITAS et al., 2012).
24
Figura 3 - Estrutura química do composto (pCl-PhSe)2.
Estes compostos podem induzir a produção de EROs. As espécies reativas de oxigênio
(EROs) são produzidas normalmente durante o metabolismo celular aeróbico. As EROs
incluem o peróxido de hidrogênio (H2O2), bem como radicais livres, tais como ânion
superóxido (02.-), radical hidroxila (.OH) entre outros (CÁP, VÁCHOVÁ, PALKOVÁ, 2012).
Estas moléculas são normalmente neutralizadas pelos sistemas antioxidantes presentes nos
organismos. As defesas antioxidantes podem ser, tanto enzimáticas (catalase, superóxido
dismutase, glutationa peroxidase, etc), quanto não-enzimáticas (tocoferóis, ácido ascórbico)
(FINKEL, HOLBRIIK, 2000).
Assim, o estresse oxidativo pode resultar tanto de um aumento na produção de EROs,
quanto na redução da capacidade antioxidante celular total, ou seja, a ocorrência de um dano
oxidativo depende de um desequilíbrio entre a produção de EROs e a atividade e os níveis de
defesa antioxidantes (FINKEL, HOLBRIIK, 2000).
O estresse oxidativo é uma condição celular ou fisiológica caracterizada por elevadas
concentrações de EROs, as quais podem causar danos às estruturas moleculares de
componentes celulares, tais como, lipídeos, proteínas, carboidratos e DNA com consequente
alteração funcional e prejuízo das funções vitais em diversos tecidos ou órgãos (DELATTIN
et al., 2014).
Portanto, estudar o mecanismo de ação destes compostos sobre C. albicans se faz de
extrema importância clínica.
25
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo deste estudo foi avaliar o mecanismo de ação da TFA, utilizando o AT,
como agente fotossensível e dos compostos organocalcogêneos (PhSe)2 e (pCl-PhSe)2 sobre
Candida albicans.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a produção EROs, alterações na permeabilidade de membrana, a formação de
biofilme e o crescimento da levedura após a TFA em C. albicans (ANEXO A);
• Avaliar os efeitos das TFA sobre o biofilme de C. albicans: produção EROs,
alterações na permeabilidade de membrana, a viabilidade celular do biofilme e o
crescimento das células que se destacaram (ANEXO B);
• Avaliar o efeito do composto (PhSe)2 em diferentes concentrações, sobre o
crescimento e a viabilidade do biofilme de C. albicans(ANEXO C);
• Avaliar a produção de EROs, a permeabilidade celular, a atividade proteolítica e a
morfologia de C. albicans após tratamento com (PhSe)2(ANEXO C);
• Avaliar o efeito do composto (pCl-PhSe)2 em diferentes concentrações, sobre o
crescimento e formação do biofilme de C. albicans (ANEXO D);
• Avaliar a produção de EROs e a permeabilidade celular de C. albicans após
tratamento com (pCl-PhSe)2 (ANEXO D).
26
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Os itens Materiais e Métodos, Resultados e Discussão, encontram-se nos artigos
científicos, nos anexos (I, II, III e IV).
ANEXO A – Artigo 1
ROSSETI, I. B.; CHAGAS, L. R; COSTA M. S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy
(PACT) inhibits biofilm formation by Candida albicans, increasing both ROS production and
membrane permeability. Lasers in Medical Science; v.29, n.3, p. 1059-1064, 2014c.
ANEXO B – Artigo 2
ROSSETI, I. B.; COSTA, M. S. The viability of biofilm produced by Candida albicans is
decreased by photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) with toluidine blue. Trends
in Photochemistry & Photobiology, v.6, p. 19-24, 2014a.
ANEXO C – Artigo 3
ROSSETI, I. B.; JUNIOR, P. T.; DE CAMPOS, C. B. L.; DA ROCHA, J. B. T; COSTA M.
S. Biofilm Formation by Candida albicans is Inhibited by 4,4-Dichloro Diphenyl Diselenide
(pCl-PhSe)2. Current drug discovery technologies, v. 11, p. 1-4, 2014b.
ANEXO D – Artigo 4
ROSSETI, I. B.; DA ROCHA, J. B. T; COSTA M. S. Diphenyl Diselenide (PhSe)2 inhibits
biofilm formation by Candida albicans, increasing both ROS production and membrane
permeability. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, v. 29, p. 289-295, 2015.
27
5 CONCLUSÃO
Observamos que a TFA utilizando o AT, como agente fotossensível, pode inibir o
crescimento e a formação do biofilme. Este efeito pode ser explicado por um mecanismo que
envolve a produção de EROs, que promove danos a membrana celular, expondo conteúdo
nucleico. Sugerimos que a habilidade de C. albicans para formar biofilme pode ser reduzida
pela TFA, além de reduzir a viabilidade do biofilme produzido por este fungo, demonstrando
o potencial da TFA, utilizando o AT, como terapia fungicida efetiva.
Foi observado que o composto, (PhSe)2, pode reduzir o crescimento e a formação do
biofilme produzido por C. albicans por um mecanismo que envolve um aumento na produção
de EROs, promovendo dano permanente na membrana celular, levando, consequentemente, a
morte da célula. Também, o (PhSe)2, foi capaz de reduzir a transição do fungo, da forma de
levedura para a forma filamentosa, um estágio essencial para a colonização e virulência,
demonstrando que o (PhSe)2, pode ser um potencial fármaco com atividade antifúngica.
Demonstramos que ao incubar as células de C. albicans na presença do composto
(pCl-PhSe)2, ocorreu aumento na permeabilidade celular, sugerindo que a redução do
crescimento e da formação do biofilme, pode estar relacionada com o aumento na produção
de EROs. Estas alterações promovem danos permanentes à membrana celular e
consequentemente, acarreta a morte da célula. Portanto, a habilidade de C. albicans para
formar biofilme pode ser reduzida pelo composto (pCl-PhSe)2 , demonstrado o potencial
deste composto como um eficiente fungicida .
28
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ANEXO A – Artigo 1
ROSSETI, I. B.; CHAGAS, L. R; COSTA M. S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy
(PACT) inhibits biofilm formation by Candida albicans, increasing both ROS production and
membrane permeability. Lasers in Medical Science; v.29, n.3, p. 1059-1064, 2014c.
ANEXO B – Artigo 2
ROSSETI, I. B.; COSTA, M. S. The viability of biofilm produced by Candida albicans is
decreased by photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) with toluidine blue. Trends
in Photochemistry & Photobiology, v.6, p. 19-24, 2014a.
ANEXO C – Artigo 3
ROSSETI, I. B.; JUNIOR, P. T.; DE CAMPOS, C. B. L.; DA ROCHA, J. B. T; COSTA M.
S. Biofilm Formation by Candida albicans is Inhibited by 4,4-Dichloro Diphenyl Diselenide
(pCl-PhSe)2. Current drug discovery technologies, v. 11, p. 1-4, 2014b.
ANEXO D – Artigo 4
ROSSETI, I. B.; DA ROCHA, J. B. T; COSTA M. S. Diphenyl Diselenide (PhSe)2 inhibits
biofilm formation by Candida albicans, increasing both ROS production and membrane
permeability. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, v. 29, p. 289-295, 2015.
