Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

BÁRBARA ROSA PENHA

UMA NOVA ESPÉCIE DE PLANÁRIA LÍMNICA IDENTIFICADA POR DNA

BARCODING: Girardia joseensis (TRICLADIDA: DUGESIIDAE)

São José dos Campos, SP 2016

Bárbara Rosa Penha

UMA NOVA ESPÉCIE DE PLANÁRIA LÍMNICA IDENTIFICADA POR DNA

BARCODING: Girardia joseensis (TRICLADIDA: DUGESIIDAE)

Orientadoras: Profa. Dra. Nádia M. R. Campos Velho Profa. Dra. Flavia Villaça Morais

São José dos Campos, SP 2016

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências – Área Ciências Biológicas.

FICHA CATALOGRAFICA

Bárbara Rosa Penha

UMA NOVA ESPÉCIE DE PLANÁRIA LÍMNICA IDENTIFICADA POR DNA

BARCODING: Girardia joseensis (TRICLADIDA: DUGESIIDAE)

Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Ciências – Área Ciências Biológicas, do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do

Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:

Presidente: Profª. Dra. Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho (UNIVAP)

Orientador (as): Profª. Dra. Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho (UNIVAP)

Profª. Dra. Flavia Villaça Morais (UNIVAP)

Membro interno: Prof. Dra. Renata de Azevedo Canevari (UNIVAP)

Membro externo: Prof. Dra. Agnes Barbério (UNITAU)

São José dos Campos, 22 de março de 2016.

Este trabalho é dedicado a todos os integrantes do Laboratório de

Planárias (LAPLA), aos que já passaram e os que ainda

permanecem realizando seus trabalhos.

Agradecimentos

Agradeço a Deus por toda força e perseverança dados a mim neste caminho.

À Universidade do Vale do Paraíba - UNIVAP pela oportunidade de realizar

este trabalho, e ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e ao

Programa de Suporte à Pós-Graduação de Instituições de Ensino Particular

(CAPES- PROSUP) pela concessão da bolsa integral de mestrado.

Aos meus pais Carlos e Vilma, a minha irmã Tâmara, aos meus sobrinhos Andrew e

Davi, e ao meu namorado João Luiz, pelo carinho, incentivo e por sempre me

apoiarem nas minhas escolhas e na busca por meus objetivos. Obrigada pela força,

vocês foram fundamentais para realização deste trabalho.

As minhas orientadoras Profa. Dra. Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho

e Profa. Dra. Flavia Villaça Morais, por todo carinho, apoio, incentivo e confiança em

mim depositados desde os tempos da Iniciação Científica, fundamentais para meu

crescimento científico, profissional e pessoal.

À Profa. Me. Karla Andressa Ruiz Lopes pelo apoio, incentivo e amizade.

Aos colegas do Laboratório de Planárias (LAPLA) – Centro de Estudos da Natureza,

UNIVAP, os que já passaram e os que ainda permanecem realizando seus

trabalhos. Obrigada pela amizade, companheirismo, e pelo ambiente agradável de

trabalho.

Aos colegas (Andrea, Caroline, Gisele, Juliene, Lucas e Mariana) do Laboratório de

Biologia Celular e Molecular de Fungos (IP&D-UNIVAP) pela atenção, ajuda,

incentivo e convivência que foram fundamentais para o desenvolvimento deste

trabalho.

Aos Professores Dra. Cristina Pacheco Soares e Dr. Newton Soares por

disponibilizarem os equipamentos dos seus laboratórios, e aos alunos do

Laboratório de Biologia Celular e Tecidual (IP&D-UNIVAP).

Ao meu colega Ítalo Rigotti Pereira Tini, pela amizade.

À Prof. Dra. Renata de Azevedo Canevari do Laboratório de Biologia Molecular do

Câncer - (IP&D-UNIVAP) e a todos os alunos deste laboratório pelo auxílio com o

espectrofotômetro e transluminador utilizados neste trabalho.

Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Biológicas (PPGCB) da

UNIVAP, pelas disciplinas oferecidas à Pós-Graduação.

À Maria e a Priscila Leite da Central de Laboratórios Multiusuários (CLM), sempre

muito atenciosas e prestativas.

A toda minha família que sempre torceu pelo meu sucesso tanto pessoal quanto

profissional e fazem partem desta minha conquista.

Aos meus amigos, que torceram por mim.

A todos que direta ou indiretamente contribuiram de alguma forma para realização

deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos.

UMA NOVA ESPÉCIE DE PLANÁRIA LÍMNICA IDENTIFICADA POR DNA BARCODING: Girardia joseensis (TRICLADIDA: DUGESIIDAE)

RESUMO A identificação das planárias normalmente é realizada por histologia do sistema reprodutor, entretanto, planárias assexuadas não desenvolvem o aparelho copulador, uma fonte tradicional de caracteres taxonômicos, específicos de cada espécie. A falta deste aparelho dificulta a determinação da espécie de populações assexuadas. Devido às limitações, inerentes à identificação baseada em morfologia, em 2003, foi proposto um sistema de identificação molecular de espécies animais, baseado na análise da sequência de pequenos segmentos do gene que codifica a citocromo c oxidase I (COI). Para utilização na identificação de espécies, esse segmento gênico, denominado de código de barras ou DNA Barcoding, tem sido fundamental, principalmente nos casos onde a análise morfológica é insuficiente, representando um avanço no diagnóstico da diversidade biológica. O presente estudo teve por objetivo inferir a relação filogenética existente entre Girardia tigrina (sexual) e uma espécie não identificada de planária (assexuada), por meio da análise do DNA Barcoding. Na região Sudeste destacando-se o Vale do Paraíba, entre os municípios de São José dos Campos e Jacareí-SP foram coletados espécimes de planárias límnicas e extraído o DNA genômico. Foram utilizados dois grupos de Girardia tigrina – 1: coletado em 2012 e adaptado ao laboratório (C12) por três anos (2012-2015) e 2: coletado (C15) em 2015, e um grupo de uma espécie não identificada de planária, coletado em 2012 e adaptado ao laboratório por três anos (2012-2015). A amplificação do segmento parcial do gene COI foi realizada com o DNA dos três grupos de planárias, sob temperatura de anelamento de 55 oC, com os oligonucleotídeos iniciadores senso: 5’–AGCTGCAGTTTTGGTTTTTTGGACATC CTGAGGT–3’ e anti-senso: 5’–ATGAGCAACAACATAATAAGTATCATG–3’. Após purificação, os amplicons obtidos foram sequenciados e com os dados foram realizados os alinhamentos das sequências através do programa Clustal W (BioEdit). Utilizando as sequências parciais do gene COI das espécies deste estudo foram realizadas análises utilizando a ferramenta BLASTn do banco de dados NCBI para busca de sequências similares entre diferentes gêneros da infraordem paludicola. Entre os dois grupos de Girardia tigrina (C12 e C15) foi observado que não houve diferença na sequência de nucleotídeos (100% de identidade). O alinhamento da sequência da espécie não identificada com Girardia tigrina (C12 ou C15) apresentou 87% de identidade, seguido de Girardia dorotocephala (86%) e Girardia sp. (85%). A partir deste alinhamento foi proposta uma árvore filogenética com base na metodologia de Maximum Likelihood com parâmetro de Kimura 2-p e bootstrap com 1000 repetições. Utilizando o DNA Barcoding, a espécie não identificada foi alocada dentro do gênero Girardia, próxima dos espécimes brasileiros de Girardia tigrina (C12 e C15). A partir dos resultados apresentados neste estudo nós podemos concluir que a espécie não identificada de planária é uma nova espécie pertencente ao gênero Girardia, diferindo da Girardia tigrina existente na região, assim como das demais espécies desse gênero, sendo, portanto, uma nova espécie Turbellaria de água doce, denominada Girardia joseensis Penha, Morais & Campos-Velho, sp. nov. Palavras-chave: Platyhelminthes. mtDNA. Citocromo c oxidase I. Identificação. Filogenia.

A NEW SPECIES OF LIMNIC PLANARIAN IDENTIFIED BY DNA BARCODING: Girardia joseensis (TRICLADIDA: DUGESIIDAE)

ABSTRACT The identification of planarians is usually performed by histology of their reproductive system, however, asexual planarians do not develop the copulatory apparatus, which is a traditional source of specific taxonomic characteristics of each species. The lack of this apparatus makes it difficult to determine the species asexual populations. Due to the limitations inherent identification based on morphology, in 2003, a molecular identification of animal species system has been proposed, based on sequence analysis of small segments of the gene encoding cytochrome c oxidase I (COI). For use in the identification of species, the gene segment, called the barcode or DNA Barcoding, has been essential, especially in cases where the morphological analysis is insufficient, representing an advance in the diagnosis of biological diversity. This study aimed to infer the existing phylogenetic relationship between Girardia tigrina (sexual) and an unidentified species of planarian (asexual), through DNA Barcoding analysis. In the Southeast highlighting the Vale do Paraiba, between the towns of São José dos Campos and Jacareí, São Paulo State, Brazil, were collected specimens of limnic planarians and extracted genomic DNA. Two groups of Girardia tigrina were used - 1: collected in 2012 and adapted to the laboratory (C12) for three years (2012-2015) and 2: collected (C15) in 2015, and a group of an unidentified species planarian collected in 2012 and adapted to the laboratory for three years (2012-2015). The amplification of partial gene segment COI was performed with DNA from the three groups of planarians under annealing temperature of 55 °C, with sense primers 5’–AGCTGCAGTTTTGGTTTTTTGGACATCCTGAGGT–3’ and antisense: 5’–ATGAGCAACAACATAATAAGTATCATG–3’. After purification, the obtained amplicons were sequenced and with the data were performed the alignments of the sequences using the Clustal W program (BioEdit). Using the partial sequences of the COI of the species this work, were performed analysis using the BLASTn tool of NCBI database to search for similar sequences between different genus of the paludicola infraorder. Between the two groups Girardia tigrina (C12 and C15) was observed that there was no difference in the sequence of nucleotides of the two groups (100% identity). The sequence alignment of the unidentified species with Girardia tigrina (C12 or C15) showed 87% identity, followed by Girardia dorotocephala (86%) and Girardia sp. (85%). From this alignment, a phylogenetic tree was proposed based on the Maximum Likelihood methodology with parameters of Kimura 2-p and bootstrap with 1000 replicates. Using DNA Barcoding, the unidentified species was allocated inside the genus Girardia, nearest the Brazilian specimens of Girardia tigrina (C12 and C15). From the results presented in this study we can conclude that the unidentified species of planarian is a new species belonging to the genus Girardia, differing from Girardia tigrina existing in the region, as well as other species of this genus, and is therefore a new species Turbellaria freshwater, called Girardia joseensis Penha, Morais & Campos-Velho, sp. nov.

Keywords: Platyhelminthes. mtDNA. Cytochrome c oxidase I. Identification. Phylogeny.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Características morfológicas de Girardia tigrina – Presença de um par de aurículas (au) e ocelos (oc) na região anterior, faringe (fa) na região central e cauda (ca) na região posterior. Barra de escala: 1 mm. ............................................................. 19

Figura 2 - Diferença no padrão de pigmentação entre Girardia tigrina e espécie não identificada – (a) Exemplar de Girardia tigrina característico por apresentar epiderme pigmentar clara e manchas escuras e (b) espécie não identificada, característico por apresen .................................................................................................................................... 19

Figura 3 - Faringe – Estrutura protrátil utilizada tanto para ingestão quanto para egestão de alimentos. ........................................................................................................... 20

Figura 4 - Sistema reprodutor sexual - Representação do sistema reprodutor sexual de Schmidtea mediterranea com suas principais estruturas. ......................................... 21

Figura 5 - Reprodução sexuada das planárias – As planárias dulcícolas são monoicas, porém, necessitam de um parceiro para que ocorra a troca de gametas. Detalhe para os ovos aderidos. Barra de escala: 1 cm. .................................................. 22

Figura 6 - Reprodução assexuada das planárias – Após a fissão inicia-se o processo de regeneração das partes perdidas dando origem a duas planárias iguais à original. .................................................................................................................................................. 22

Figura 7 - Histologia do sistema reprodutor de Girardia tigrina – am: átrio masculino; bc: bolsa copulatória penial; c: câmara bulbar; cb: canal da bolsa; ov: oviduto; pp: papila penial; vd: vaso deferente. ....................................................................................... 23

Figura 8 - Regeneração em organismos multicelulares – (A) Os táxons que contém animais que possuem capacidade regenerativa estão sombreados. Nos táxons restantes, a regeneração é ausente ou a sua presença é desconhecida. (B) Exemplos de organismos em que as capacidades regenerativas estão sob investigação molecular: (Ba) cnidário Hydra vulgaris; (Bb) planária dulcícola Schmidtea mediterranea, (Bc) peixe-zebra Danio rerio e (Bd) salamandra Notophthalmus iridescens. Barra de escala: 2 mm. ......................................................... 24

Figura 9 - Local de coleta dos espécimes de Girardia tigrina – Detalhe das macrófitas (Pistia stratiotes) do Rio Paraíba do Sul, Jacareí – SP (23°18'18.0"S 45°58'40.3"W). ....................................................................................................................... 30

Figura 10 - Local de coleta dos espécimes da espécie não identificada - Detalhe dos tanques de criação de rã (23°05'48.6"S 45°56'36.6"W). ................................................. 31

Figura 11 - Morfologia da espécie não identificada - a: vista dorsal e b: vista ventral. 1: ocelos; 2: aurícula e 3: boca. Barra de escala: a e b = 1 mm. ................................... 35

Figura 12 - Migração do DNAg em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo - Migração do DNAg de: 1, 2 e 3 espécie não identificada; 4, 5 e 6 Girardia tigrina (C12); 7, 8 e 9 Girardia tigrina (C15). Em PPM, padrão de peso molecular de 1kb (Thermo Scientific ™) .................................................................................................... 37

Figura 13 - Amplificação parcial do gene COI - Migração, em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo, dos amplicons de: 2 e 3 espécie não identificada; 4 e 5 Girardia tigrina (C12); 7 e 9 Girardia tigrina (C15). Em PPM, padrão de peso molecular de 100 pb (Thermo Scientific™). 38

Figura 14 - Purificação dos amplicons do gene COI - Migração, em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo, dos amplicons, para o segmento parcial do gene COI da espécie não identificada, e Girardia tigrina pela técnica de PCR. 2: espécie não identificada; 5: C12 e 9: C15. Em PPM, padrão de peso molecular de 100 pb (Thermo Scientific™). ........................................................................................................... 38

Figura 15 - Alinhamento das sequências parciais do gene COI dos dois grupos de Girardia tigrina (C12 e C15) - Em asterístico (*) regiões consenso. ............................. 39

Figura 16 - Alinhamento das sequências parciais do gene COI da espécie não identificada com a espécie Girardia tigrina (C15) – Em asterístico (*) regiões consenso. ................................................................................................................................ 40

Figura 17 - Alinhamento das sequências parciais do gene COI da espécie não identificada, dos dois grupos de Girardia tigrina (C12 e C15) e de outras espécies de planárias límnicas disponíveis no banco de dados NCBI - Em asterístico (*) regiões consenso. ................................................................................................................................ 42

Figura 18 - Árvore filogenética gerada com base na análise Maximum Likelihood com parâmetro de Kimura 2-p e bootstrap com 1000 repetições da sequência parcial do gene COI. Procedores littoralis foi escolhido como grupo externo. ......................... 44

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resultado da quantificação do DNAg por espectrofotometria de ultra-

violeta – 1, 2 e 3: espécie não identificada; 4, 5 e 6: Girardia tigrina (C12) e 7, 8 e 9

Girardia tigrina (C15). ................................................................................................ 36

Tabela 2 - Espécies selecionadas para análise filogenética. .................................... 41

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

COI: citocromo c oxidase I

C12: coleta em 2012

C15: coleta em 2015

DNA: ácido desoxirribonucleico

DNAg: DNA genômico

dNTP: desoxirribonucleotídeo fosfatado

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

IP&D: Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

LAPLA: Laboratório de Planárias

mtDNA: DNA mitocondrial

NaAc: Acetato de Sódio

pb: pares de bases

PCR: reação em cadeia da polimerase

PPM: padrão de peso molecular

RNA: ácido ribonucleico

RNAse: ribonuclease

S (South): sul

SDS: dodecil sulfato de sódio

SNC: Sistema Nervoso Central

SP: São Paulo

sp.: espécie

Taq: DNA polimerase termoestável derivada da bactéria Thermus aquaticus

TBE: solução tampão Tris/Borato/EDTA

U: unidade

UNIVAP: Universidade do Vale do Paraíba

W (West): oeste

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 17

2.1 Planária .............................................................................................................. 17

2.1.1 Distribuição, habitat e alimentação .............................................................. 17

2.1.2 Características morfológicas externas......................................................... 18

2.1.3 Características anatômicas internas e fisiológicas .................................... 20

2.2 Estudos Moleculares......................................................................................... 23

2.2.1 Filogenia molecular ........................................................................................ 25

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 29

3.1 Objetivo Principal .............................................................................................. 29

3.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 29

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 30

4.1 Modelo Experimental ........................................................................................ 30

4.2 Análise do Gene Coi.......................................................................................... 31

4.2.1 Extração do dna genômico ............................................................................ 31

4.2.2 Amplificação do gene coi por pcr (reação em cadeia da polimerase) ....... 32

4.2.3 Purificação dos fragmentos amplificados ................................................... 33

4.2.4 Sequenciamento parcial do gene coi ........................................................... 33

4.3 Análises Filogenéticas ...................................................................................... 33

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 35

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 47

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 48

APÊNDICE I .............................................................................................................. 53

15

1 INTRODUÇÃO

Planárias são metazoários com simetria bilateral pertencente ao filo

Platyhelminthes (REDDIEN; ALVARADO, 2004), à classe Turbellaria e ordem

Seriata. São atribuídas à subordem Tricladida devido aos três ramos principais do

seu sistema digestório. Os tricladidos podem ser subdivididos em relação ao habitat

ecológico: água doce (Infraordem: Paludicola), marinho (Infraordem: Maricola),

terrestre (Infraordem: Terricola) e caverna (Infraordem: Cavernicola) (NEWMARK;

ALVARADO, 2001; CARBAYO; FROEHLICH, 2008). As planárias paludicolas são

geralmente as mais estudadas, podendo ser encontradas em riachos, lagoas e rios,

alimentando-se predominantemente de insetos, larvas de insetos e outros

invertebrados (REDDIEN; ALVARADO, 2004).

As planárias são hermafroditas e podem apresentar dois modos de

reprodução: sexuada, forma em que ocorre a troca de gametas entre dois indivíduos

e assexuada, que se reproduzem por fissão. A reprodução assexuada por fissão é

frequente em planárias de água doce. Porém, populações assexuadas representam

um problema taxonômico: dificuldade na classificação adequada destas espécies.

Normalmente para identificação das planárias realiza-se a histologia do sistema

reprodutor, entretanto, planárias assexuadas não desenvolvem o aparelho

copulador, uma fonte tradicional de caracteres taxonômicos específicos de cada

espécie. A falta deste aparelho dificulta a classificação de populações assexuadas a

uma determinada espécie (LÁZARO et al., 2009). Devido às limitações através da

identificação com base na morfologia, um sistema de identificação com base na

análise da sequência de pequenos segmentos de DNA vem sendo utilizado (TAUTZ

et al., 2002). O uso de dados moleculares para inferir filogenia tem sido crucial para

a compreensão da origem e evolução de muitas características do Filo

Platyhelminthes (RIUTORT et al., 2012).

Em 2003 o gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI) foi padronizado para

utilização na identificação molecular de espécies animais. Esse marcador foi

denominado de código de barras ou DNA Barcoding, e tem como proposta utilizar

uma sequência gênica pequena como posição padrão no genoma. Um dos grandes

objetivos do DNA Barcoding é ser um método automático, rápido e preciso (HEBERT

et al., 2003).

16

O crescente estudo deste marcador molecular tem possibilitado identificar e

inferir relações filogenéticas de diversos organismos, entre eles: planárias

(BESSHO; OHAMA; OSAWA, 1992; BAGUÑÀ et al., 1999; LÁZARO et al., 2009;

CHEN et al., 2015), insetos (PAGÉS et al., 2009; LAURITO et al., 2013; ENGDAHL

et al., 2014), moluscos (MELO et al., 2010), aves (KERR et al., 2009), peixes

(STEINKE et al., 2009; BINEESH et al., 2015), entre outros.

Estudos realizados por Baguñà et al (1999) e Lázaro et al (2009) utilizando

dados moleculares para identificação de espécies de planárias de populações

assexuadas, demonstraram que o gene mitocondrial COI, é um excelente marcador

molecular, permitindo a classificação das populações de espécies assexuadas.

O uso de dados moleculares associados à morfologia vem promovendo uma

melhor descrição e interpretação da diversidade biológica. Segundo Abad-Franch e

Monteiro (2005), a correta identificação dos organismos e suas possíveis relações

filogenéticas e evolutivas possibilitam diversos estudos, tais como, ecologia,

epidemiologia, comportamento, fisiologia, controle, monitoramento, entre outros.

O presente estudo objetivou inferir a relação filogenética existente entre

Girardia tigrina e uma espécie não identificada de planária, por meio da análise do

DNA Barcoding.

17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Planária

O nome planária é derivado do Latim planus (plana) cujo corpo é achatado ao

longo do eixo dorso-ventral (SALÓ; AGATA, 2012). Refere-se aos vermes

pertencentes ao filo Platyhelminthes, classe Turbellaria, ordem Seriata e subordem

Tricladida.

O filo Platyhelminthes inclui mais de 20.000 espécies e é o quarto maior filo

animal depois dos artrópodes, moluscos e cordados (RUPPERT; FOX; BARNES,

2005). Este filo inclui tanto representantes de vida-livre, em que se incluem as

planárias, ectoparasitas e parasitas.

As planárias de água doce (infraordem: Paludicola) são os Platyhelminthes

mais utilizados em pesquisa de regeneração por serem facilmente criadas em

laboratório, apresentando plasticidade e desenvolvimento extraordinário

(NEWMARK; ALVARADO, 2002; SALÓ, 2006). Além dos estudos de regeneração,

as planárias são utilizadas em áreas como genética, biologia celular, biologia

molecular, ecologia, fisiologia, comportamento, dentre outros.

2.1.1 Distribuição, habitat e alimentação

A família Dugesiidae possui distribuição mundial. O gênero Dugesia é

distribuído em toda a Europa, Ásia e África, enquanto Schmidtea tem uma

distribuição quase exclusivamente europeia (algumas populações já foram descritas

no Norte da África). Girardia originalmente tinha uma distribuição americana,

entretanto uma espécie, Girardia tigrina foi introduzida na Europa no início do século

20. Da mesma forma, Schmidtea polychroa foi introduzida na América (RIUTORT et

al., 2012).

As planárias paludicolas mais comumente encontradas na América do Sul são

pertencentes ao gênero Girardia. No Brasil a espécie Girardia tigrina, uma das

utilizadas no presente estudo, pode ser encontrada em São Paulo, Santa Catarina,

Rio Grande do Sul e Bahia (KNAKIEVICZ et al., 2007).

As planárias são organismos livre-nadantes e habitantes de ecossistemas

paludicolas lênticos (lagos e lagoas) (KNAKIEVICZ et al., 2007) e lóticos (rios).

18

Esses organismos podem ser encontrados sob as raízes da vegetação submersa,

permanecendo nas regiões mais sombreadas do ambiente, visto que são

fotonegativos.

A temperatura da água é um fator extremamente importante que pode

determinar a abundância das planárias no ambiente. Temperaturas extremas da

água, abaixo 4 oC ou acima de 25 oC, dependendo da espécie, pode resultar no

desaparecimento destes organismos (GAMO; NOREÑA-JANSSEN, 1998).

No ambiente natural, as planárias são carnívoras alimentando-se de

pequenos invertebrados, como protozoários, rotíferos, larvas de insetos, pequenos

crustáceos, moluscos e pequenos anelídeos (RUPPERT; FOX; BARNES, 2005). Em

laboratório sua dieta aliementar é composta de fígado bovino ou de galinha cru, ou

gema de ovo.

2.1.2 Características morfológicas externas

As planárias paludicolas são achatadas dorso-ventralmente, bilateralmente

simétricas, possuem eixos anteroposterior (AP) e dorsoventral (DV) bem definidos

(ADELL; CEBRIÁ; SALÓ, 2010).

Na Figura 1 pode-se observar na região anterior projeções laterais da cabeça

chamadas aurículas (quimiorreceptores), e um par de ocelos (fotorreceptores). Na

região central está presente à faringe, e posteriormente a cauda. Possuem

coloração que variam entre os tons de cinza, preto e marrom.

19

Figura 1 - Características morfológicas de Girardia tigrina – Presença de um par de aurículas (au) e ocelos (oc) na região anterior, faringe (fa) na região central e cauda (ca) na região posterior. Barra de escala: 1 mm.

Fonte: Autora.

Uma das características que difere a espécie Girardia tigrina da espécie não

identificada, utilizadas no presente estudo, é o padrão de coloração. Girardia tigrina

apresenta a epiderme pigmentar clara, enquanto a espécie não identificada possui a

epiderme escura (Figura 2).

Figura 2 - Diferença no padrão de pigmentação entre Girardia tigrina e espécie não identificada – (a) Exemplar de Girardia tigrina característico por apresentar epiderme pigmentar clara e manchas escuras e (b) espécie não identificada, característico por apresen

Fonte: Acervo da autora (2013).

A cavidade digestória das planárias é composta por um saco cego. A boca é

equipada com uma faringe protrátil, utilizada para ingestão e egestão (RUPPERT;

FOX; BARNES, 2005) (Figura 3). Enzimas proteolíticas são liberadas e auxiliam na

au

oc

fa

ca

20

perfuração do corpo da presa, onde por meio da peristalse faríngea o conteúdo

digerido e liquefeito é bombeado para o interior do trato digestório (KNAKIEVICZ,

2007).

Figura 3 - Faringe – Estrutura protrátil utilizada tanto para ingestão quanto para egestão de alimentos.

Fonte: Rossant (2014).

As planárias são capazes de suportar períodos prolongados de fome. Em

casos extremos, elas acabam reabsorvendo e utilizando parte do intestino, todos os

tecidos parenquimais e do sistema reprodutivo, reduzindo o volume corporal a

aproximadamente 1/300 do original (RUPPERT; FOX; BARNES, 2005).

2.1.3 Características anatômicas internas e fisiológicas

As planárias são acelomadas, ou seja, desprovidas de uma cavidade interna

contendo órgão. Esses organismos são triploblásticas (ectoderma, mesoderme e

endoderme), onde todo o espaço entre os vários sistemas de órgãos é preenchido

por um mesênquima (REDDIEN; ALVARADO, 2004). As planárias não apresentam

sistema circulatório e respiratório, utilizam-se do processo de difusão para obter

oxigênio (NEWMARK; ALVARADO, 2001).

A superfície ventral das planárias é composta por uma camada epidérmica

ciliada que a impulsiona por meio de um movimento de deslizamento, auxiliando na

Faringe

21

locomoção. Abaixo desta camada epidérmica existe um complexo muscular

composto de fibras musculares circulares, diagonais e longitudinais (NEWMARK;

ALVARADO, 2001).

O sistema reprodutor das planárias consiste em ovários pares situados atrás

dos gânglios cefálicos, com numerosos testículos localizados dorso-lateralmente. Na

região ventral, posterior à abertura da faringe está o gonóporo, levando ao aparelho

copulador (REDDIEN; ALVARADO, 2004) (Figura 4).

Figura 4 - Sistema reprodutor sexual - Representação do sistema reprodutor sexual de Schmidtea mediterranea com suas principais estruturas.

Fonte: Chong et al (2011).

As planárias são hermafroditas podendo apresentar dois modos de

reprodução: reprodução assexuada por fissão e reprodução sexuada por

acasalamento envolvendo pares. Das espécies utilizadas neste estudo uma faz

reprodução sexuada (Girardia tigrina) e outra reprodução assexuada (espécie não

identificada).

Na reprodução sexuada ocorre fecundação cruzada, com troca de gametas

masculinos entre dois indivíduos (NEWMARK; ALVARADO, 2001); após a cópula,

em algumas semanas, as planárias depositam as cápsulas de ovos que se aderem

ao ambiente através de um pedúnculo que termina em um disco adesivo. O

desenvolvimento dos ovos fecundados é direto, e os filhotes eclodem prontos para

alimentar e crescer (SALÓ et al., 2009) (Figura 5).

22

Figura 5 - Reprodução sexuada das planárias – As planárias dulcícolas são monoicas, porém, necessitam de um parceiro para que ocorra a troca de gametas. Detalhe para os ovos aderidos. Barra de escala: 1 cm.

Fonte: Autora.

Na reprodução assexuada ocorre fissão transversal do corpo geralmente na

região pós-faringeal, onde os dois fragmentos resultantes regeneram as partes

perdidas (NEWMARK; ALVARADO, 2001) (Figura 6).

Figura 6 - Reprodução assexuada das planárias – Após a fissão inicia-se o processo de regeneração das partes perdidas dando origem a duas planárias iguais à original.

Fonte: Cebriá (2014).

Para identificação das planárias sexuadas realiza-se a histologia do sistema

reprodutor (Figura 7). No caso das planárias assexuadas onde não ocorre a

formação do aparelho copulador, a identificação vem sendo realizada através de

análises moleculares.

23

Figura 7 - Histologia do sistema reprodutor de Girardia tigrina – am: átrio masculino; bc: bolsa copulatória penial; c: câmara bulbar; cb: canal da bolsa; ov: oviduto; pp: papila penial; vd: vaso deferente.

Fonte: Muñoz e Vélez (2007).

2.2 Estudos Moleculares

O desenvolvimento de técnicas genômicas tornou as planárias um importante

modelo no campo das células-tronco e regeneração. Essas técnicas têm sido

essenciais para analisar o processo de regeneração a partir de um ponto de vista

molecular (ADELL et al., 2014).

Segundo Handberg-Thorsager, Fernandez e Saló (2008) compreender as

células-tronco tem sido fundamental devido ao seu potencial nas aplicações

médicas. Enquanto a regeneração vem sendo estudada em uma variedade de

modelos, a utilização da planária como sistema modelo é notável. Um fragmento tão

pequeno como 1/279 do tamanho do animal pode regenerar completamente em

poucas semanas. Um dos aspectos mais interessantes das planárias como sistema

modelo é a presença de células estaminais indiferenciadas (neoblastos) que podem

diferenciar em todos os tipos de células encontradas no organismo, incluindo a da

linha germinal.

A regeneração de invertebrados tem sido estudada há mais de 200 anos.

Além das planárias outros invertebrados, também, são utilizados como modelos de

estudo de regeneração: hidra, Macrostomum (Platyhelminthes, Rhabditophora),

convoluta (Acoelomorpha, Acoela). Além disso, muitos outros invertebrados são

24

conhecidos por exibir capacidades regenerativas, como por exemplo, artrópodes,

anelídeos, nemertea, e alguns invertebrados deuterostômios como equinodermos e

ascídias. Embora haja menos exemplares de regeneração em vertebrados, existem

importantes modelos, onde os mais utilizados são os anfíbios (tritões, axolotes e

salamandras) e o peixe-zebra (HANDBERG-THORSAGER; FERNANDEZ; SALÓ,

2008) (Figura 8).

Figura 8 - Regeneração em organismos multicelulares – (A) Os táxons que contém animais que possuem capacidade regenerativa estão sombreados. Nos táxons restantes, a regeneração é ausente ou a sua presença é desconhecida. (B) Exemplos de organismos em que as capacidades regenerativas estão sob investigação molecular: (Ba) cnidário Hydra vulgaris; (Bb) planária dulcícola Schmidtea mediterranea, (Bc) peixe-zebra Danio rerio e (Bd) salamandra Notophthalmus iridescens. Barra de escala: 2 mm.

Fonte: Alvarado e Tsonis (2006).

Além de servirem como organismo-modelo no campo das células-tronco e

regeneração, as planárias têm sido consideradas importantes bioindicadores

ambientais, permitindo a avaliação do efeito dos poluentes por meio de análises de

diferentes bioensaios, os quais detectam efeito em distintos níveis de organização

biológica, tais como molecular, celular, morfológico, fisiológico ou comportamental

(GUECHEVA; HENRIQUE; ERDTMANN, 2001). A poluição por metais pesados no

25

meio ambiente apresenta um grave problema devido à alta toxicidade e capacidade

de bioacumulação nos organismos. Ao atuar em nível molecular, os xenobióticos

podem modificar a estrutura, bem como a atividade de biomoléculas, incluindo o

material genético (PRÁ et al., 2005). Espécies e populações de regiões distintas de

planárias mostram grandes divergências quanto à sensibilidade para os metais

(INDEHERBERG; VAN STRAALEN; SCHOCKAERT, 1999). Essas diferenças

podem ser explicadas através da seleção natural que reflete mudanças evolutivas na

resposta ao estresse em populações residentes em áreas contaminadas a longo

prazo (SCHILL; KÖHLER, 2004).

O conhecimento da espécie e sua correta identificação são fundamentais,

pois diferentes espécies e populações de regiões distintas podem apresentar

divergências a determinadas condições (INDEHERBERG; VAN STRAALEN;

SCHOCKAERT, 1999). No caso das populações assexuadas de planárias onde a

análise morfológica é insuficiente, o uso de dados moleculares para identificar e

inferir filogenia tem sido crucial.

2.2.1 Filogenia molecular

A filogenia molecular cresceu no início da década de 90, devido ao

desenvolvimento de métodos mais rigorosos para construção de árvores

filogenéticas (BROWN, 2002). A filogenia tem como objetivo identificar e

compreender as relações evolutivas entre os diferentes organismos. Anos atrás, os

primeiros critérios para reconstrução filogenética baseavam-se em dados

morfológicos. Com o acesso à estrutura de macromoléculas (DNA, RNA e proteínas)

as análises filogenéticas se tornaram cada vez mais utilizadas (FERNANDES-

MATIOLI, 2001). Com base nessas relações, árvores filogenéticas podem ser

desenvolvidas mostrando as relações evolutivas ou agrupamentos de organismos

(BUSO, 2005).

A utilização de marcadores moleculares tem sido muito importante na

identificação de espécies de diversos grupos. Muitos desses marcadores são genes

do DNA mitocondtial (mtDNA). O mtDNA da maioria dos animais apresenta-se como

uma molécula circular dupla fechada, contendo 37 genes. Este genoma é

relativamente simples, de herança materna (sem recombinação), apresentando taxa

de evolução dez vezes mais rápida que as substituições do DNA nuclear, o que o

26

torna importante em estudos de genética populacional, evolução molecular e

relações filogenéticas. Estas características permitem que ele seja utilizado, por

exemplo, na definição e diferenciação de espécies; no estudo das relações de

espécies do mesmo gênero e na definição das relações entre diferentes gêneros de

uma família (AVISE et al., 1987).

Um marcador molecular mitocondrial muito utilizado na filogenética molecular

para identificação animal, e utilizado em nosso estudo, é o gene mitocondrial

citocromo c oxidase I (COI). Em 2003, Hebert et al propuseram padronizar o

marcador utilizado na identificação molecular de espécies animais. Com isto, foi

criado um sistema de diagnóstico universal, baseado em um fragmento de 648 pb.

Esse marcador foi denominado de código de barras ou DNA Barcoding, e se refere a

uma região do gene mitocondrial COI. Alguns dos motivos que fizeram com que um

gene mitocondrial fosse escolhido como DNA Barcoding foram: estar amplamente

distribuído entre os animais; ter um grande número de cópias por célula; não sofrer

recombinação e apresentar altas taxas de substituição, que fazem com que as

sequências mitocondriais modifiquem-se de forma mais rápida do que sequências

nucleares, tendo assim altas taxas de evolução.

As diferentes regiões do mtDNA e nuclearDNA evoluem em taxas distintas.

As regiões que evoluem rapidamente, como é o caso do mtDNA, são indicadas para

o estudo de organismos muito próximos e aquelas que são conservadas

(nuclearDNA) são mais apropriadas para comparações entre níveis taxonômicos

superiores, acima do nível de espécie (ABAD-FRANCH; MONTEIRO, 2005). O

genoma mitocondrial animal é também considerado um ótimo marcador molecular

devido à ausência de íntrons, diferentemente do genoma nuclear (SACCONE et al.,

1999).

Em outros grupos de organismos, no entanto, o gene mitoconfrial COI não

funciona eficientemente como um código de barras. Em plantas e fungos, por

exemplo, o DNA mitocondrial possui baixos níveis de variabilidade, ou podem conter

grandes quantidades de íntrons (um problema ocorrente nos fungos) (CHASE et al.,

2007; SCHOCH et al., 2012).

O DNA Barcoding tem sido utilizado para diversas aplicações biológicas, tais

como: identificação de espécies crípticas, identificação do organismo em todas as

fases do seu ciclo de vida (ovos, larvas, indivíduos maduros), identificação de

27

espécies a partir de fragmentos biológicos, descoberta de novas espécies, revisões

taxonômicas, entre outras (HEBERT et al., 2003).

O avanço da biologia molecular resultou na geração de um grande número

de sequências de DNA depositadas em bancos de dados genéticos que visam reunir

e disponibilizar, gratuitamente, informações genéticas de táxons do mundo todo, o

que tem contribuído para a realização de pesquisas em diversas áreas, dentre elas:

taxonomia, sistemática, biologia da conservação, genética populacional e ecologia

(BUENO-SILVA, 2012).

O Consortium for the Barcode of Life (CBOL) foi criado com o objetivo de

fortalecer o desenvolvimento e o emprego do DNA Barcoding como um padrão

global de identificação de espécies biológicas. Instituições do mundo todo

contribuem para a identificação de organismos por meio do DNA Barcoding. Um

banco de dados público chamado Barcode of Life Data System (BOLD)

(http://www.barcodinglife.org) também foi criado e têm como objetivo aprimorar o

conhecimento acerca da biodiversidade e permitir identificação específica. Ele foi

estabelecido para abrigar e disponibilizar os códigos de barra de DNA e todas as

informações ligadas a este, tais como os dados morfológicos dos espécimes,

imagem e localização do ponto de coleta, instituição no qual o material foi

depositado, dados taxonômicos e informações moleculares, como eletroferogramas

das sequências e iniciadores utilizados. Nesta base de dados a identificação é

realizada através da comparação da sequência de interesse com sequências já

depositadas (RATNASINGHAM; HEBERT, 2007).

No Brasil, o consórcio Brazilian Barcode of Life (BrBOL), tem como objetivo a

identificação molecular da biodiversidade brasileira. Diferentes organismos são

caracterizados pelo do código de barras, incluindo: organismos marinhos,

invertebrados terrestres, plantas, fungos, parasitas/vetores de doenças tropicais,

peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos (BrBOL, 2012).

As limitações inerentes à identificação baseada em morfologia e, por vezes, a

falta de um sistema de identificação, faz com que sistemas de identificação

microgenômica, que permitem a análise de um pequeno segmento do genoma,

representem uma abordagem extremamente promissora para o diagnóstico da

diversidade biológica (HEBERT et al., 2003). O DNA Barcoding tem permitido

desvendar vários aspectos da evolução dos animais e tem sido fundamental na

discriminação de espécies. Neste estudo como utilizamos uma espécie ainda não

28

identificada de planária límnica (assexuada), optamos pelo gene mitocondrial COI

também chamado de DNA Barcoding, pois tem sido recomendado por

pesquisadores, como região de escolha para identificação molecular de espécies

animais, além de permitir que espécies proximamente relacionadas sejam

discriminadas.

29

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Principal

Analisar filogeneticamente a relação entre Girardia tigrina e uma espécie não

identificada de planária, por meio da análise do DNA Barcoding.

3.2 Objetivos Específicos

Amplificar e sequenciar o gene parcial COI de Girardia tigrina e da espécie

não identificada;

Inferir a relação filogenética, por DNA Barcoding, entre diferentes gêneros da

Infraordem Paludicola;

Comparar as sequências parciais do gene COI dos espécimes de Girardia

tigrina.

30

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Modelo Experimental

Os espécimes de Girardia tigrina (sexuados) utilizados neste estudo foram

provenientes de coleta realizada em um trecho urbano do Rio Paraíba do Sul, no

município de Jacareí-SP (23°18'18.0"S 45°58'40.3"W) (Figura 9). Dois grupos de

Girardia tigrina foram utilizados – 1: coleta em 2012 e adaptado ao laboratório (C12)

por três anos (2012-2015) e 2: coleta em 2015 (C15).

Figura 9 - Local de coleta dos espécimes de Girardia tigrina – Detalhe das macrófitas (Pistia stratiotes) do Rio Paraíba do Sul, Jacareí – SP (23°18'18.0"S 45°58'40.3"W).

Fonte: Google Earth-Mapas (2015), Autora.

O terceiro grupo utilizado neste estudo consistiu de uma espécie de planária

não identificada (assexuada) que foi coletada em 2012 em tanques de criação de rã

em São José dos Campos – SP (23°05'48.6"S 45°56'36.6"W) e adaptado ao

laboratório por três anos (2012-2015) (Figura 10).

31

Figura 10 - Local de coleta dos espécimes da espécie não identificada - Detalhe dos tanques de criação de rã (23°05'48.6"S 45°56'36.6"W).

Fonte: Google Earth-Mapas (2015); Tocalobo (2013); Autora.

Os espécimes foram acondicionados em recipientes plásticos e cultivados no

Laboratório de Planárias da Universidade do Vale do Paraíba (LAPLA-UNIVAP), no

município de São José dos Campos – SP. As condições de temperatura variaram

entre 20ºC ±1ºC. A alimentação ocorreu semanalmente com fígado bovino, e a

limpeza e a troca de água (livre de cloro) dos recipientes após cada alimentação.

4.2 Análise do Gene Coi

Todos os ensaios moleculares, exceto o sequenciamento dos amplicons,

foram realizados no Laboratório de Biologia Celular e Molecular de Fungos,

localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D-UNIVAP).

4.2.1 Extração do dna genômico

A extração do DNA genômico (DNAg) de Girardia tigrina (C12 e C15) e da

espécie não identificada foi realizada com base no protocolo descrito por Balavoine

e Telford (1995), com algumas modificações.

O DNAg foi extraído a partir de três exemplares adultos de cada grupo (C12,

C15 e espécie não identificada). Os espécimes foram macerados e homogeneizados

32

com 1mL de solução de lise contendo 100 mM de Tris (pH 7,4), 100 mM de EDTA,

0,1% de SDS, 100 g/mL de proteinase K. A suspensão foi incubada a 50 ºC por 1 h

e, posteriormente, foi centrifugada (9.000rpm, 5 min, 4 ºC) para deposição dos

debris celulares. Com o sobrenadante recuperado foram realizadas duas extrações

fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (50 : 49 : 1) e a ele, ao final, foi adicionado o

mesmo volume de clorofórmio. Após centrifugação (12.000rpm, 5min, 4 ºC), foi

adicionado o mesmo volume de isopropanol. A mistura foi mantida durante a noite a

-20 ºC, para facilitar a precipitação do DNA e, após centrifugação (12.000rpm, 5min,

4 ºC) e descarte do sobrenadante, o precipitado de DNA, parcialmente, seco foi

ressuspendido em 0,5 mL de TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) e incubado a 65 ºC por

10 min. O RNA contaminante foi eliminado pelo tratamento com RNAse (100 g/mL

por 1 h a 37 ºC. Nova extração fenol : clorofórmio : álcool isoamílico (50 : 49 : 1),

seguida de uma de cloroformio foi realizada e o DNA foi precipitado com a adição de

0,1 volumes de acetato de sódio (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado.

O DNA precipitado foi dissolvido em 60 L de solução TE e armazenado a -20ºC.

O produto final foi analisado por espectrofotometria em aparelho NanoDrop®

(Laboratório de Biologia Molecular do Câncer – (IP&D-UNIVAP) e analisado em gel

de agarose 0,8%. A velocidade de corrida ocorreu a 80 V, por 35 min, em tampão

TBE 1X e posterior visualização em luz ultravioleta.

4.2.2 Amplificação do gene coi por pcr (reação em cadeia da polimerase)

A amplificação parcial do gene COI foi obtida pela reação em cadeia da

polimerase (PCR) em um volume final de 100 L consistindo de 250 ng de DNAg

(molde), 1x Buffer Taq (Sigma-Aldrich®), 1,5 mM de cloreto de magnésio (Sigma-

Aldrich®), 200 M de dNTP (LGC Biotecnologia®), 1,2 U de enzima Taq polimerase

(Sigma-Aldrich®) e 1 M de cada iniciador (pr-a2 5’-AGCTGCAGTTTTGGTTTTTTG

GACATCCTGAGGT-3’ e pr-b2 5’-ATGAGCAACAACATAATAAGTATCATG-3’)

(BESSHO; OHAMA; OSAWA, 1992) em um Termociclador MultiGeneTM OptiMax

Thermal Cycler. Um fragmento do gene mitocondrial COI de 435 pares de bases (pb)

(AF178316.1) foi amplificado por um ciclo inicial a 95 °C (10 min), seguidos por 35

ciclos compreendendo desnaturação (95°C, 1 min), anelamento (55°C, 1 min 30

seg), e extensão (72°C, 3 min), finalizando com um ciclo a 72°C por 10 minutos.

33

A análise do produto amplificado foi confirmada por meio de eletroforese em

gel de agarose 2% após corrida eletroforética (80 V), por 40 min, em tampão TBE 1X

e posterior visualização em luz ultravioleta.

4.2.3 Purificação dos fragmentos amplificados

Os amplicons obtidos foram purificados utilizando o Pure LinkTM Quick Gel

Extraction Kit (InvitrogenTM). Após eletroforese do produto de PCR em gel de

agarose 1,5% (80 V, 20 min), os amplicons foram excisados com auxílio de bisturi, e

adicionadas em tubos de microcentrífuga, previamente pesados, para aferição do

peso de cada fatia de gel removida. Assim, o DNA amplificado foi eluído do gel,

seguindo indicações do fabricante e foram armazenados a -20 oC.

A qualidade e a quantidade obtida dos amplicons foram avaliadas após

eletroforese em gel de agarose 2% (80 V, por 40 min) em tampão TBE 1X, e

comparadas com um padrão de peso e massa molecular (GeneRuler 100 bp DNA

Ladder, ready-to-use, Thermo Scientific™) (BARBAS III et al., 2007).

4.2.4 Sequenciamento parcial do gene coi

Para o sequenciamento parcial do gene COI foi utilizado o produto da PCR

purificado. Em tubo de microcentrífuga de 0,5 mL foram adicionados de 30 a 60 ng

de DNA-molde (produto de PCR), 4,5 pmol de um dos iniciadores, e água ultrapura

(Milli-Q) estéril para um volume final de 6 L. Após a homogeneização, o material foi

seco em estufa a 60 oC, por aproximadamente 1h.

As amostras foram sequenciadas em ambos os sentidos utilizando os

iniciadores pr-a2 e pr-b2. As reações correram em um sequenciador automático ABI-

Prism 3500 (Applied Biosystems), no Laboratório ACTGene Análises Moleculares –

Ludwig Biotec, Alvorada-RS.

4.3 Análises Filogenéticas

Os eletroferogramas (Apêndice I) obtidos a partir do sequenciamento parcial

do gene COI da espécie não identificada e dos dois grupos de Girardia tigrina (C12 e

C15) foram visualizados utilizando o programa Bioedit, versão 7.2.5 (HALL, 1999).

34

As sequências de DNA foram alinhadas, utilizando Clustal W (Bioedit versão

7.2.5; HALL, 1999), e o percentual de similaridade da sequência do gene COI, entre

as espécies, foi obtido por meio da análise das sequências na opção BLASTn, do

banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information).

A análise filogenética foi baseada na metodologia Maximum Likelihood (ML)

com distribuição gama (G) e número de sítios invariáveis (I), com parâmetro Kimura

2-p (KIMURA, 1980) e 1000 repetições de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985),

utilizando o programa MEGA, versão 6 (TAMURA et al., 2013).

A planária Procerodes littoralis pertencente à infraordem maricola foi

escolhida como grupo externo.

35

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As planárias incluem animais com aparência externa muito semelhante. O

objetivo de identificar as espécies utilizando DNA Barcoding tem fornecido apoio

para as descrições morfológicas e permitido a identificação de novas amostras

(AVAREZ-PRESAS; RIUTORT, 2014). A morfologia externa do gênero Girardia é

normalmente caracterizada por manchas pretas e brancas espalhadas por todo o

corpo, uma cabeça em forma de triângulo com um par de aurículas e faringe

pigmentada (CHEN et al., 2015). A espécie não identificada possui as características

morfológicas do gênero Girardia (Figura 11) e foi confirmada pelo DNA Barcoding.

Além do modo reprodutivo da espécie não identificada (assexuada) e da espécie

Girardia tigrina (sexuada) do presente estudo (C12 e C15), elas também diferem

quanto ao padrão de coloração, onde os espécimes de Girardia tigrina apresentam

coloração mais clara.

Figura 11 - Morfologia da espécie não identificada - a: vista dorsal e b: vista ventral. 1: ocelos; 2: aurícula e 3: boca. Barra de escala: a e b = 1 mm.

Fonte: Autora.

36

A extração e a purificação de ácidos nucléicos a partir de diversas amostras

experimentais é uma etapa fundamental na obtenção de alta eficiência de

amplificação nos protocolos que usam a reação em cadeia da polimerase (PCR)

(OLIVEIRA et al., 2007).

A pureza dos ácidos nucléicos é medida pela razão 260/280, que em caso de

aferição de DNA deve estar entre 1,6 e 1,8 (VALENTIN; JOHN; MEDLIN, 2005). O

DNAg, de duas espécies de planárias, Girardia tigrina (C12 e C15) e espécie não

identificada, foi extraído com base no protocolo descrito por Balavoine e Telford

(1995), com algumas modificações. O produto final foi analisado por

espectrofotometria (Tabela 1).

Tabela 1 - Resultado da quantificação do DNAg por espectrofotometria de ultra-violeta – 1, 2 e 3: espécie não identificada; 4, 5 e 6: Girardia tigrina (C12) e 7, 8 e 9 Girardia tigrina (C15).

Amostra ng/μl A260/280 nm

1 415,60 1,6

2 384,51 1,7

3 231,33 1,7

4 94,55 1,9

5 64,50 1,8

6 228,00 1,5

7 73,28 1,6

8 175,74 1,4

9 53,33 1,8

Fonte: Autora.

As amostras de DNAg, extraídos neste estudo (espécie não identificada: 1, 2

e 3; C12: 4 e 5 e C15: 7 e 9), podem ser consideradas puras, se considerados os

valores determinados pelos autores Valentin, John e Medlin (2005). A integridade e

qualidade dessas amostras de DNAg, também, foram confirmadas por meio de

eletroforese em gel de agarose. Foram utilizados duzentos e cinquenta nanogramas

(250 ng) de DNAg de cada amostra, sendo possível visualizar e avaliar sua

integridade e qualidade (Figura 12). Não foi observada a formação de arraste, que

indica degradação do DNAg.

37

Figura 12 - Migração do DNAg em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo - Migração do DNAg de: 1, 2 e 3 espécie não identificada; 4, 5 e 6 Girardia tigrina (C12); 7, 8 e 9 Girardia tigrina (C15). Em PPM, padrão de peso molecular de 1kb (Thermo Scientific ™)

Fonte: Autora

O uso de marcadores moleculares tem sido muito importante na identificação

de diversos grupos de animais. Genes do DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido

amplamente utilizados devido à capacidade de discriminar espécies intimamente

relacionadas (HEBERT et al., 2003). O uso de dados moleculares associado à

morfologia tem promovido uma melhor descrição e interpretação da diversidade

biológica (AVAREZ-PRESAS; RIUTORT, 2014).

Os principais caracteres utilizados para identificar espécies de planárias

incluem órgãos copuladores e gônadas. Estes caracteres dificulta a identificação de

indivíduos que não possuem esses órgãos, tais como os jovens e populações

compostas exclusivamente por indivíduos assexuados (LÁZARO et al., 2009;.

ALVAREZ-PRESAS; RIUTORT, 2014). Neste estudo realizou-se o sequenciamento

parcial do gene mitocondrial COI de uma espécie não identificada de planária

(assexuada) e Girardia tigrina (C12 e C15). O gene COI foi utilizado porque tem sido

recomendado por muitos pesquisadores como uma região de escolha para a

identificação molecular de espécies animais.

Foram selecionadas duas amostras de DNAg de cada grupo para

amplificação parcial do gene COI. A amplificação parcial do gene COI gerou

fragmentos de tamanhos similares (435 pb) para Girardia tigrina (C12 e C15) e para

espécie não identificada (Figura 13).

38

Figura 13 - Amplificação parcial do gene COI - Migração, em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo, dos amplicons de: 2 e 3 espécie não identificada; 4 e 5 Girardia tigrina (C12); 7 e 9 Girardia tigrina (C15). Em PPM, padrão de peso molecular de 100 pb (Thermo Scientific™).

Fonte: Autora.

Para duas amostras não houve amplificação do gene COI: amostra 4 do

grupo Girardia tigrina (C12) e amostra 7 do grupo Girardia tigrina (C15).

Após a amplificação dos fragmentos realizou-se a purificação dos produtos

amplificados de uma amostra de cada grupo (espécie não identificada: 2; C12: 5 e

C15: 9) através do kit Pure LinkTM Quick Gel Extraction Kit (InvitrogenTM). A

purificação foi confirmada por meio de eletroforese em gel de agarose 2% (Figura

14).

Figura 14 - Purificação dos amplicons do gene COI - Migração, em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo, dos amplicons, para o segmento parcial do gene COI da espécie não identificada, e Girardia tigrina pela técnica de PCR. 2: espécie não identificada; 5: C12 e 9: C15. Em PPM, padrão de peso molecular de 100 pb (Thermo Scientific™).

Fonte: Autora.

39

Os fragmentos COI sequenciados 2 (espécie não identificada), 5 (Girardia

tigrina C12) e 9 (Girardia tigrina C15), apresentaram 407 pb de comprimento e foram

alinhados usando o programa Clustal W (Bioedit version 7.2.5; HALL, 1999). Para o

alinhamento utilizou-se a sequência sense de cada fragmento sequenciado

(Apêndice I).

O uso de marcadores moleculares abriu a possibilidade de estudar a

diversidade dentro da espécie (ALVAREZ-PRESAS; RIUTORT, 2014). O

alinhamento das sequências do gene COI dos dois grupos de Girardia tigrina

(coletado em 2012 e coletado em 2015) exibiu 100% de homologia, sugerindo que

as condições do laboratório não alteraram o seu material genético (Figura 15).

Figura 15 - Alinhamento das sequências parciais do gene COI dos dois grupos de Girardia tigrina (C12 e C15) - Em asterístico (*) regiões consenso.

Fonte: Autora.

40

A sequência obtida para a espécie não identificada foi alinhada com a sequência

do grupo C15 de Girardia tigrina obtendo-se 87% de identidade (Figura 16).

Figura 16 - Alinhamento das sequências parciais do gene COI da espécie não identificada com a espécie Girardia tigrina (C15) – Em asterístico (*) regiões consenso.

Fonte: Autora.

Obs: O grupo C12 de Girardia tigrina não foi utilizado para este alinhamento pois ele apresenta 100% de identidade com a sequência do grupo C15.

41

Usando as sequências do grupo C15 e da espécie não identificada como

consulta foram realizadas análises usando a ferramenta BLASTn do NCBI para

buscar sequências similares em diferentes gêneros da infraordem paludicola (Tabela

2).

Tabela 2 - Espécies selecionadas para análise filogenética.

Espécie Código GenBank

(COI)

Identidade (%)

Girardia tigrina

(C15)

Espécie não

identificada

Espécie não identificada presente estudo 87 100

Girardia tigrina (C12) presente estudo 100 87

Girardia tigrina (C15) presente estudo 100 87

Girardia sp.1 KP091895.1 89 85

Girardia tigrina2 DQ666042.1 88 84

Girardia tigrina3 AF178316.1 88 84

Girardia dorotocephala KM200929.1 88 86

Girardia anderlani DQ666038.1 82 81

Polycelis sp. GU066814.1 74 74

Polycelis felina DQ666049.1 77 76

Polycelis tenuis AF178321.1 75 76

Schmidtea mediterranea AF178322.1 75 74

Schmidtea polychroa AF287133.1 74 73

Schmidtea lugubris AF290022.1 74 73

Schmidtea nova AF290023.1 74 75

Dugesia sicula KR140068.1 75 78

Dugesia sagitta KF308818.1 77 75

Dugesia arcádia KF308795.1 75 75

Dugesia ariadnae KF308713.1 74 74

Dugesia japonica HQ637483.1 74 73

Procerodes litorralis DQ666050.1 72 72

Fonte: Autora.

C12: Girardia tigrina coletada em 2012; C15: Girardia tigrina coletada em 2015; 1 Girardia

sinensis (CHEN et al., 2015), 2 e 3 são diferentes espécimes de Girardia tigrina encontradas

na Europa.

42

A análise BLASTn utilizando a espécie não identificada como consulta

mostrou alinhamento com identidades variando entre 87% a 73%. O valor de

identidade mais alto (87%) foi obtido com Girardia tigrina (C12 e C15), seguido por

Girardia dorotocephala (86%) e Girardia sp. (85%). A sequência parcial do gene COI

de 17 espécies da infraordem paludicola e os três exemplares do presente estudo

(C12, C15 e espécie não identificada) foram alinhados (Figura 17).

Figura 17 - Alinhamento das sequências parciais do gene COI da espécie não identificada, dos dois grupos de Girardia tigrina (C12 e C15) e de outras espécies de planárias límnicas disponíveis no banco de dados NCBI - Em asterístico (*) regiões consenso.

43

Fonte: Autora.

44

A partir desse alinhamento foi proposta uma árvore filogenética envolvendo as

duas espécies utilizadas neste estudo: Girardia tigrina (C12 e C15) e espécie não

identificada, juntamente com as espécies disponíveis no banco de dados NCBI.

As relações filogenéticas construídas foram baseadas na metodologia de

Maximum Likelihood com parâmetro Kimura 2-p. De acordo com Nei e Kumar

(2000), o modelo de evolução molecular Kimura 2-p é o melhor modelo a ser

adotado quando as distâncias genéticas são baixas.

A análise ML resultou em 67% de probabilidade de bootstrap separando a

família Dugesiidae (superfamília Geoplanoidea) da família Planariidae (superfamília

Planaroidea) (Figura 18).

Figura 18 - Árvore filogenética gerada com base na análise Maximum Likelihood com parâmetro de Kimura 2-p e bootstrap com 1000 repetições da sequência parcial do gene COI. Procedores littoralis foi escolhido como grupo externo.

Fonte: Autora.

Obs: 1: Girardia sinensis (CHEN et al., 2015),

2: AF178316.1 e

3: DQ666042.1.

45

A sequência parcial do gene COI dos dois grupos de Girardia tigrina (C12 e

C15), formou um clado com 100% de probabilidade de bootstrap. Dentro do clado

Girardia, molecularmente definido pelo gene COI, nossos resultados mostraram

sequências de nucleotídeos diferentes entre as espécies Girardia tigrina (C12 e C15,

AF178316.1 e DQ666042.1). Essas diferenças provavelmente ocorrem devido à

história evolutiva e condições ambientais, tais como geográfica e climática, do

ambiente onde esses espécimes vivem (LÁZARO et al., 2009). De acordo com Cox

e Hebert (2001), Wares e Cunningham (2001) o gene mitocondrial COI possui uma

evolução rápida que permite não só a distinção entre espécies, como também de

grupos filogenéticos dentro da mesma espécie. Os espécimes C12 e C15, utilizados

neste estudo foram coletados no sudeste do Brasil, especificamente na região do

Vale do Paraíba, enquanto AF178316.1 (BAGUÑÁ et al., 2001) e DQ666042.1

(AVAREZ-PRESAS; BAGUÑÁ; RIUTORT, 2008) foram encontrados na Europa

(Figura 18).

Por meio da metodologia ML a espécie não identificada foi alocada dentro do

gênero Girardia, próxima das amostras brasileiras de Girardia tigrina (C12 e C15)

(Figura 18).

O valor de 100% ML probabilidade de bootstrap separou o grupo monofilético

do gênero Girardia dos outros gêneros Schmidtea, Polycelis e Dugesia. Estes

gêneros também formaram clados monofiléticos com altos valores de bootstrap,

Schmidtea (98%), Dugesia (99%) e Polycelis (68%), apoiando a hipótese de que a

espécie não identificada pertence ao gênero Girardia (Figura 18).

Estudo realizado por Chen et al (2015) revelou através de análise morfológica

e molecular uma nova espécie de planária límnica pertencente ao gênero Girardia,

chamada Girardia sinensis (sexual). Esta espécie mostrou 89% de identidade da

sequência COI com a espécie Girardia tigrina (AF178316.1). No presente estudo, a

espécie não identificada do sudeste do Brasil mostrou 84% de identidade com

Girardia tigrina (AF178316.1) e 85% com Girardia sinensis (KP091895.1) (Tabela 2).

A utilização do DNA Barcoding com o objetivo de padronizar métodos

moleculares utilizados na identificação de espécies animais tem sido extremamente

importante (HEBERT et al., 2003) e útil na identificação de espécies de planárias,

pois permite a classificação adequada de espécies assexuadas. Os resultados do

presente estudo elucidaram a relação filogenética entre Girardia tigrina e a espécie

não identificada de planária. Considerando às diferenças reprodutivas, morfológicas

46

e moleculares entre a espécie não identificada e Girardia tigrina, e outras espécies

deste gênero, propôs-se uma nova espécie de planária límnica Girardia joseensis

Penha, Morais e Campos-Velho, sp. nov.

47

6 CONCLUSÃO

A amplificação e o sequenciamento parcial do gene mitocondrial COI, por

meio da técnica de PCR, foram bem sucedidos;

Não houve alteração genética para Girardia tigrina C12, durante os três anos

de cultivo em condições de laboratório;

Não houve alteração genética para Girardia tigrina C15, durante três anos em

seu habitat natural;

A relação filogenética entre os exemplares estudados foi identificada pela

metodologia de Maximum Likelihood com parâmetro Kimura 2-p, indicando que a

espécie não identificada:

o pertence ao gênero Girardia;

o difere da Girardia tigrina existente na região, assim como das demais

espécies desse gênero, já descritas;

o é uma nova espécie, denominada Girardia joseensis Penha, Morais e

Campos-Velho, sp. nov.

48

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53

APÊNDICE I

1 - Sequência parcial do gene mitocondrial COI de Girardia tigrina (C12) 407 pb.

Sense: TTTTTGATTTTGCCTGGGTTTGGGATGATTTCCCACATAGTTATTTATTATAGTGGCAAGTGTGGATCATTTGGTCATTTGGGGATGGTATTTGCTATGATTGCAATTGGTTTTTTAGGTTTCATTGTGTGGGCTCATCATATGTATACAGTGGGGATGGATTTTGATTCTCGAGCTTATTTTACAGGTGTGACAATGATTATTGGGGTGCCTACAGGTATAAAGGTATTTAGGTGATTGGCAACTTTATATGGTGGGTGGTTTGATTTGTTTATGAATTCGGTTTCTGTGTTGTGGGCTTTGGGGTTTATTTATTTATTTACTGTTGGAGGTTTGACTGGGATAGTTCTTTCTAATGCGTCTTTAGATGTTTGTTTGCATGATACTTATTATGTTGTTGCTCAAAA

Eletroferograma:

54

2 - Sequência parcial do gene mitocondrial COI de Girardia tigrina (C15) 407 pb.

Sense: TTTTTGATTTTGCCTGGGTTTGGGATGATTTCCCACATAGTTATTTATTATAGTGGCAAGTGTGGATCATTTGGTCATTTGGGGATGGTATTTGCTATGATTGCAATTGGTTTTTTAGGTTTCATTGTGTGGGCTCATCATATGTATACAGTGGGGATGGATTTTGATTCTCGAGCTTATTTTACAGGTGTGACAATGATTATTGGGGTGCCTACAGGTATAAAGGTATTTAGGTGATTGGCAACTTTATATGGTGGGTGGTTTGATTTGTTTATGAATTCGGTTTCTGTGTTGTGGGCTTTGGGGTTTATTTATTTATTTACTGTTGGAGGTTTGACTGGGATAGTTCTTTCTAATGCGTCTTTAGATGTTTGTTTGCATGATACTTATTATGTTGTTGCTCAAAA

Eletroferograma:

55

3 - Sequência parcial do gene mitocondrial COI da espécie não identificada 407 pb.

Sense: TTTTGAATTTTGCCTGGATTTGGGATGATTTCTCATGTTGTAATATATTATAGAGGGAAGTGTTTTTCGTTTGGTCATTTAGGTATGGTTTTTGCAATGATCAGGATTGGTTTTTTAGGGTTTATAGTTTGAGCGCACCATATGTATACAGTAGGCATGGATTTTGATTCTCGAGCCTATTTTACGGGTGTTACAATGATTATAGGAGTGCCGACAGGAATAAAGGTATTTAGATGATTAGCTACTTTGTATGGTGGTTGGTTTGATTTGCTTATGAATTCGGTTTCTGTGTTGTGAGCTTTGGGTTTTATTTATTTATTTACTGTTGGAGGTTTGACTGGAATTGTTCTGTCAAATGCTTCTTTGGATGTGTGTTTGCATGATACTTATTATGTTGTTGCTCAAAA

Eletroferograma