UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

EBE CHRISTIE DE OLIVEIRA

AVALIAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO LINFOCITÁRIO EM

CARCINOMAS HEPATOCELULARES DE FÍGADOS CIRRÓTICOS E NÃO

CIRRÓTICOS, ATRAVÉS DE ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

CAMPINAS 2017


AVALIAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO LINFOCITÁRIO EM

CARCINOMAS HEPATOCELULARES DE FÍGADOS CIRRÓTICOS E NÃO

CIRRÓTICOS, ATRAVÉS DE ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos para obtenção do título

de Doutora em Ciências Médicas, Área de Concentração Anatomia

Patológica

ORIENTADORA: Profa. Dra. CECILIA AMÉLIA FAZZIO ESCANHOELA

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA EBE CHRISTIE DE OLIVEIRA E ORIENTADA PELA PROF. DRA. CECILIA AMÉLIA FAZZIO ESCANHOELA

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO


Orientadora: PROFA. DRA. CECILIA AMÉLIA FAZZIO ESCANHOELA

MEMBROS:

1. PROFA. DRA. CECILIA AMÉLIA FAZZIO ESCANHOELA

2. PROFA. DRA. MARIA LETICIA CINTRA

2. PROF. DR. LEANDRO LUIZ LOPES DE FREITAS

3. PROFA. DRA. ESTELA REGINA RAMOS FIGUEIRA

4. PROF. DR. RENATO FERREIRA DA SILVA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data da defesa: 31 de agosto de 2017

DEDICATÓRIA

Aos meus filhos, Matteo e Sophie, e ao meu esposo, Vanderlei, que enchem minha vida de significado e motivação.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Profa. Dra. Cecilia A. Fazzio Escanhoela, professora e amiga, que compreendeu como ninguém os percalços que enfrentei ao longo destes anos e que me motivou a prosseguir, a despeito de qualquer dificuldade. Ao meu esposo, Vanderlei Segatelli, pela contribuição neste trabalho, mas, sobretudo, pela presença forte e constante em minha vida, desde o instante em que decidimos trilhar o caminho juntos. À minha mãe, Lurdes, sempre uma fonte de inspiração pela força na luta diária e pela resiliência incomparável. Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Merçon de Vargas, por me apresentar, ainda nos anos da graduação, o universo único e instigante da Anatomia Patológica. À funcionária Ana Claudia S. Piaza, pelo trabalho de execução das reações imuno-histoquímicas deste trabalho. À secretária Maria do Carmo, pela gentileza constante e pelo auxílio. A todos os funcionários do Departamento de Anatomia Patológica da UNICAMP, pela contribuição nas diversas etapas de execução deste projeto.

RESUMO

O carcinoma hepatocelular (CHC) destaca-se como uma das formas mais comuns

de câncer no mundo, correspondendo a aproximadamente 80% das neoplasias

malignas primárias do fígado, sendo a cirrose seu principal fator de risco. Assim

como em neoplasias do trato gastrointestinal, pele, trato genital feminino e mama, a

presença de pronunciado infiltrado linfocitário associado ao CHC tem se relacionado

a melhor prognóstico, sendo interpretado como uma manifestação do sistema imune

do hospedeiro contra o tumor. Relatos recentes têm documentado o padrão

imunofenotípico do infiltrado linfocitário associado ao CHC, todavia sem destaque

para os CHCs originados em fígados não cirróticos. Nosso objetivo principal foi

realizar uma avaliação comparativa da intensidade e do imunofenótipo do infiltrado

linfocitário tumoral, através de estudo imuno-histoquímico, em CHCs originados em

fígados cirróticos e não cirróticos. Comparamos também as características desse

infiltrado com alguns aspectos macro e microscópicos da lesão: tamanho, graduação

histológica e presença de êmbolos neoplásicos. Selecionamos 40 blocos de parafina

referentes a 20 casos de CHC com cirrose e 20 casos de CHC sem cirrose,

diagnosticados em produtos de ressecção cirúrgica ou transplantes hepáticos,

independentemente do fator etiológico, sexo, cor, idade ou grupo étnico. Em todos

os casos, realizamos o seguinte painel imuno-histoquímico: CD3, CD20, CD4 e CD8.

A partir de imagens digitalizadas, realizamos a contagem das subpopulações de

linfócitos em três áreas de maior número de células (hot spots). O infiltrado tumoral

mostrou-se composto predominantemente por linfócitos T nas duas populações, com

maior contagem dessas células nos CHCs de fígados não cirróticos (81,7 ± 68,2).

Observou-se maior número médio de linfócitos T CD4+ intratumorais, principalmente

nos CHCs originados em fígados não cirróticos, contudo sem diferença

estatisticamente significativa entre os grupos. No grupo de fígados não cirróticos,

observou-se maior número de linfócitos B e T entre os CHCs de grau histológico 2,

quando comparados aos de grau 1. Não se evidenciou correlação entre a

quantidade de células das subpopulações de linfócitos com a presença de êmbolos

neoplásicos ou com o tamanho do tumor.

Palavras-chave: fígado; carcinoma hepatocelular; cirrose; infiltrado linfocitário tumoral.

ABSTRACT

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common forms of cancer

worldwide, accounting for approximately 80% of primary liver malignancies. Cirrhosis

is the main risk factor in this tumor. As occurs in malignancies of the gastrointestinal

tract, skin, female genital tract and breast, the presence of marked lymphocytic

infiltration associated with HCC has been related to a better prognosis, and is

interpreted as a manifestation of the host immune system against the tumor. Recent

reports have documented the immunophenotypic pattern of lymphocytic infiltrate

associated with HCC, although there is no emphasis on HCCs originated from non-

cirrhotic livers. Our main goal was to make a comparative evaluation of the intensity

and immunophenotype of tumor-infiltrating lymphocytes, by means of

immunohistochemical study in HCCs originated from cirrhotic and non-cirrhotic livers.

We also compared characteristics of this infiltrate with some macroscopic and

microscopic features of the lesion: size, histologic grade and the presence of

neoplastic emboli. We selected 40 paraffin blocks of 20 HCC cases with cirrhosis and

20 HCC cases without cirrhosis, diagnosed in products of surgical resection or liver

transplantation, irrespective of etiologic factor, gender, color, age or ethnic group. In

all cases, we conducted the following immunochemical panel: CD3, CD20, CD4 and

CD8. From digitized images, we counted lymphocyte subpopulations in three hot

spots (areas containing a higher number of cells). Tumor-infiltrating lymphocytes

were predominantly composed of T lymphocytes in both populations, with a higher

count of TILs in HCCs of non-cirrhotic livers (81.7 ± 68.2). A higher mean number of

these cells was observed in intratumoral CD4+ T lymphocytes, mainly in HCCs

originated from non-cirrhotic livers, although there was no statistically significant

difference between groups. In the group of non-cirrhotic livers, a higher number of B

and T lymphocytes was observed among histologic grade 2 HCCs, in comparison to

grade 1 HCC tumors. There was no evidence of a correlation between the amount of

cells in lymphocyte subpopulations and the presence of neoplastic emboli or tumor

size.

Keywords: liver; hepatocellular carcinoma; cirrhosis; tumor-infiltrating lymphocytes.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1. Representação esquemática do microambiente tumoral e seus constituintes celulares 20 Figura 2. O conceito da imunoedição tumoral 22 Figura 3. Interações entre o microambiente imune e células tumorais 24 Figura 4. Contagem do número de linfócitos T CD8+ intratumorais por campo de grande aumento (400x) com o programa de processamento de imagens ImageJ®. 34 Figura 5. Linfócitos T intratumorais em CHC originado em fígado Cirrótico (marcador CD3; X400) 40 Figura 6. Linfócitos B intratumorais em CHC originado em fígado Cirrótico (marcador CD20; X400) 40 Figura 7. Linfócitos T intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD3; X400) 41 Figura 8. Linfócitos B intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico cirrótico (marcador CD20; X400) 41 Figura 9. Linfócitos T CD8+ intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (marcador CD8; X400) 42 Figura 10. Linfócitos T CD4+ intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (marcador CD4; X400) 43 Figura 11. Linfócitos T CD8+ intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD8; X400) 44 Figura 12. Linfócitos T CD4+ intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD4; X400) 44

LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS

Página

Gráfico 1: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados cirróticos 36 Gráfico 2: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados não cirróticos 37 Gráfico 3: Avaliação do infiltrado linfocitário intratumoral em CHCs originados em fígados cirróticos 42 Gráfico 4: Avaliação do infiltrado linfocitário intratumoral em CHCs originados em fígados não cirróticos 43 Gráfico 5: Comparativo da contagem dos subtipos de linfócitos do ILT em CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos 45 Gráfico 6: Taxa de incidência/detecção de hepatites virais segundo agente etiológico e ano de notificação 49 Gráfico 7: Taxa de detecção de hepatite C segundo sexo, razão de sexos e ano de notificação. Brasil, 2002 a 2015 50 Tabela 1: Sumário dos aspectos clínicos da amostra 38 Tabela 2: Fatores de risco para CHC e achados do parênquima peritumoral no grupo 2 (14 entre 20 casos de CHC

originados em fígados não cirróticos) 39 Tabela 3: Relação entre subtipos de linfócitos do ILT e tamanho do tumor (correlação de Spearman) 46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CHC: Carcinoma Hepatocelular

DHGNA: Doença Hepática Gordurosa Não-Alcoólica

DAB: Diaminobenzidina

DM: Diabetes Mellitus

DNA: Ácido Desoxirribonucleico

DP: Desvio-Padrão

EHNA: Esteato-Hepatite Não Alcoólica

FCM: Faculdade de Ciências Médicas

FD: Focos Displásicos

FDA: Food and Drug Administration

FRSM: Fator de Risco para Síndrome Metabólica

HAS: Hipertensão Arterial Sistêmica

HDL: High Density Lipoprotein

HE: Hematoxilina-Eosina

ILT: Infiltrado Linfocitário Tumoral

IL-2: Interleucina 2




LDL: Low Density Lipoprotein

µm: Micrômetro

ND: Nódulos Displásicos

NIH: National Institute of Health

PBS: Phosphate Buffer Saline

PKB: Protein Kinase B

SM: Síndrome Metabólica

Treg: Célula T reguladora

TMA: Tissue Microarrays

TNF-α: Fator de Necrose Tumoral-α

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

VHB: Vírus da Hepatite B

VHC: Vírus da Hepatite C

SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO 14

1.1. Aspectos epidemiológicos 14

1.2. Hepatocarcinogênese 15

1.3. Microambiente e imunoedição tumoral 19

1.4. Infiltrado linfocitário associado ao CHC 25

2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO 29

3. OBJETIVOS 30

4. MATERIAIS E MÉTODOS 31

4.1. Desenho do estudo e casuística 31

4.2. Tissue microarrays 31

4.3. Critérios de exclusão 32

4.4. Reações imuno-histoquímicas 32

4.5. Análise das reações imuno-histoquímicas 33

4.5.1. Análise qualitativa 33

4.5.2. Captura de imagens e análise quantitativa 33

4.5.3. Metodologia estatística 34

4.6. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 35

5. RESULTADOS 36

5.1. Aspectos clínicos 36

5.2. Achados anatomopatológicos 38

5.2.1. Aspectos macro e microscópicos 38

5.2.2. Achados imuno-histoquímicos 40

5.2.3. Correlação entre achados imuno-histoquímicos e 45

aspectos morfológicos

6. DISCUSSÃO 47

7. CONCLUSÕES 51

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52

9. ANEXOS 60

9.1. Anexo 1: Protocolo de realização da técnica imuno-histoquímica 60

do Laboratório de Imuno-histoquímica da Pós-graduação

do Departamento de Anatomia Patológica da Unicamp

9.2. Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da 62

Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP

14

INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos epidemiológicos

O câncer primário do fígado é a sexta neoplasia maligna mais frequente e

a segunda maior causa de morte por câncer no mundo. O carcinoma hepatocelular

(CHC) é o tipo histológico mais frequente e corresponde a 80% dos tumores

malignos primários do fígado. A incidência do CHC é bastante variável, sendo que

as mais altas taxas de incidência estão na Ásia e na África. Cerca de 75% dos

cânceres hepáticos ocorrem na Ásia, sendo a China o país com mais de 50% dos

casos do mundo (1). Em estudos epidemiológicos internacionais, o Brasil é

considerado um país de prevalência baixa a intermediária de CHC, e, segundo

dados nacionais, esse tumor não figura entre as dez neoplasias mais frequentes em

nosso país (2). Os estados brasileiros que registram as maiores incidências de CHC

são Bahia e Espírito Santo (3).

O desenvolvimento do CHC depende, dentre outros, de fatores

ambientais e socioeconômicos, sendo que as variações de incidência nas diferentes

regiões geográficas no mundo estão relacionadas à exposição a diversos fatores de

risco que causam agressão hepática crônica e a diferentes vias moleculares

associadas à carcinogênese hepática.

Nos países da África subsaariana e sudeste da Ásia, observam-se altos

índices de infecção pelo vírus da hepatite B (VHB), colocando essa forma de

hepatite na posição de causa mais comum de CHC, responsável por estimados 54%

dos casos desse tipo tumor em todo mundo (4).

No mundo ocidental e no Japão, prevalece a infecção pelo vírus da

hepatite C (VHC), que é o segundo maior fator de risco para o desenvolvimento do

CHC, responsável por cerca de 10-25% de todos os casos de CHC no mundo (4).

Taxas de incidência específicas por idade diferem significativamente entre

regiões no mundo, e há maior prevalência masculina no desenvolvimento de

CHC(1).

No Brasil, assim como na maioria do mundo ocidental, VHC é o principal

agente causador de hepatite crônica, cirrose e CHC. Dados publicados por Carrilho

15

et al. (5) relataram que, nas regiões Sul e Sudeste, a infecção pelo VHC

correlaciona-se com mais de 55% dos casos de CHC. Nas regiões Norte e Nordeste,

embora o VHC fosse a principal causa do CHC, ele correspondeu a menos da

metade dos casos, e a segunda causa mais frequente, o VHB, tinha prevalência

proporcionalmente mais alta do que nas regiões Sul e Sudeste (22-25%). No Centro-

Oeste brasileiro, a infecção pelo VHB foi identificada como a etiologia mais comum,

correspondendo a 40% dos casos, seguido do VHC (30%).

Embora seja incomum, o CHC pode se originar em fígado não cirrótico. A

proporção desses casos varia entre 7% e 54% em diferentes regiões geográficas, e

essa variação certamente está associada a diferentes fatores de risco para a

hepatocarcinogênese (6,7). No Ocidente, entre 15 e 20% dos CHCs são

diagnosticados em fígados não cirróticos. Nesses casos, o CHC tem uma

distribuição por faixa etária bimodal, com picos na 2ª e na 7ª década de vida (8). No

primeiro pico, há um equilíbrio na incidência da doença entre homens e mulheres,

sendo que esse grupo inclui grande parte dos carcinomas hepatocelulares

fibrolamelares, uma variante rara de CHC que ocorre quase que exclusivamente em

fígados não cirróticos de pacientes com idade inferior a 40 anos (6). No segundo

pico, encontram-se, principalmente, os portadores de hepatites virais, dada a

elevada prevalência de infecção por VHB e VHC em regiões específicas do mundo.

Contudo, o crescimento mundial alarmante das taxas de obesidade, diabetes

mellitus (DM) do tipo 2 e síndrome metabólica (SM) tem incluído cada vez mais

nesse grupo pacientes portadores de doença hepática gordurosa não alcoólica

(DHGNA) decorrente desses distúrbios, mesmo na ausência de cirrose (9). O típico

paciente portador de esteato-hepatite não alcoólica (EHNA) sem cirrose associada

que se apresenta com CHC é um indivíduo do sexo masculino, de faixa etária mais

elevada e que preenche critérios para um ou mais achados da SM (10).

1.2. Hepatocarcinogênese

A extensa heterogeneidade de alterações genéticas e epigenéticas

presentes nos CHCs, associada à incidência relativamente baixa de cada uma delas,

sugere que lesões hepáticas pré-malignas e CHC sejam consequências de

alterações que comprometam mais de uma via regulatória.

16

Já foram demonstradas alterações em mais de onze vias moleculares

diferentes em CHCs, sugerindo que existem múltiplas rotas de iniciação e

progressão para esta neoplasia (11). As vias mais comumente mutadas no CHC são

as vias Wnt/β catenina, Hedgehog, p53 e a JAK/STAT-dependentes (12).

O maior fator de risco para o desenvolvimento de CHC é a cirrose

hepática que se desenvolve por agressão hepática crônica, como ocorre nas

hepatites virais B e C, obesidade, doença alcoólica, DHGNA, hemocromatose e ação

de compostos tóxicos como as aflatoxinas (4).

O microambiente do fígado cirrótico pode ativar vias oncogênicas através

de múltiplos mecanismos. Em primeiro lugar, o comprometimento do fluxo sanguíneo

associado à cirrose prejudica a resposta imune e induz a um fenótipo mais

tolerogênico das células imunes residentes e do infiltrado inflamatório. Isso não

apenas inibe o clearance dos vírus das hepatites crônicas, prolongando, assim, a

inflamação hepática, como também permite que hepatócitos pré-neoplásicos

escapem da imunovigilância. A redução da distribuição de oxigênio e nutrientes para

os hepatócitos desencadeia, ainda, agressões metabólicas e oxidativas que causam

inflamação cíclica, necrose, regeneração compensatória e um turnover aumentado

de hepatócitos que, no decorrer de muitos anos, leva ao acúmulo de erros genéticos

e mutações, como mutações de ponto, deleções nos genes TP53, AXIN1 e

CTNNB1, assim como leva à ativação de proto-oncogens como RAS-MAPK e β-

catenina, resultando na formação de populações monoclonais de hepatócitos

displásicos (4). Vale lembrar ainda que células estromais modificadas produzem

sinais pró-oncogênicos para os hepatócitos, como a liberação de TGF-β (12).

O CHC associado aos seus principais fatores causais (VHB e VHC)

usualmente apresenta mutações e transcrições alteradas em várias vias

moleculares, que causam, por exemplo, desregulação no ciclo celular, ativação da

via da PKB (protein kinase B) ou AKT e inativação da via AXIN1 (12).

A base estrutural genômica do VHB é uma molécula de DNA circular. Nas

infecções crônicas, a integração do DNA do VHB ao genoma do hospedeiro induz

nesse uma ampla variedade de alterações genéticas, incluindo deleções

cromossômicas, translocações, fusão de transcritos, amplificação do DNA celular e

instabilidade cromossômica generalizada (13), que levam ao descontrole da

proliferação celular. A integração do DNA viral ao genoma do hepatócito pode

também codificar produtos, como a proteína HBx, que leva ao desenvolvimento de

17

CHC por meio de uma grande variedade de mecanismos, como ativação ou

inativação de vias de sinalização, redução ou inibição de vias de reparo do DNA,

indução de vias de stress oxidativo, inibição de vias apoptóticas, mutações genéticas

e eventos epigenéticos, como metilações e acetilações (14).

O VHC é um vírus RNA monofilamentar que tende a causar infecção

crônica em 70-80% dos indivíduos, enquanto o VHB induz cronicidade em apenas

10% dos indivíduos infectados (4). Cerca de 20% dos indivíduos persistentemente

infectados pelo VHC desenvolverão cirrose hepática no prazo de 20 a 30 anos, e,

uma vez estabelecida a cirrose, o risco de desenvolvimento de CHC é de 1-6% ao

ano (12). A carcinogênese do VHC é mediada por fatores induzidos pelo próprio

vírus e pela resposta imunológica do hospedeiro. Sua ação não envolve integração

com o genoma da célula hospedeira (4). A infecção crônica por VHC induz uma

reação imune persistentemente ativada e direcionada para os hepatócitos infectados

pelo próprio vírus. Em adição a essa inflamação crônica, o VHC causa alterações

maciças nos hepatócitos infectados, incluindo reprogramação metabólica, resposta

prolongada ao estresse, produção de radicais livres e alterações em importantes

vias de sinalização (12). Estudos atuais demonstram que proteínas virais

específicas, como as proteínas core, NS3, NS4B e NS5A, atuam como agentes

importantes na hepatocarcinogênese viral. A proteína core, por exemplo, altera a via

de sinalização MAPK, afetando a proliferação celular (4), bem como altera a

homeostase de lipídios no parênquima hepático, o que resulta na esteatose típica da

hepatite induzida por esse vírus, e que está associada a um risco aumentado de

desenvolvimento de CHC (12). A proteína NS5A inibe a via do P53 que afeta o ciclo

celular, a proliferação celular e mecanismos antitumor (4).

A infecção crônica por VHC ou VHB também é o principal fator de risco

para o desenvolvimento de CHC em fígados não cirróticos (6). Ambos os vírus são

capazes de ativar a carcinogênese hepática, independentemente do

desenvolvimento de cirrose (6,15). Na infecção por VHB, a integração do genoma do

vírus pode levar a microdeleções no DNA do hospedeiro e a proteína genotóxica

HBx pode alterar a atividade transcricional por modificar a expressão de vários

genes controladores do crescimento (6). Além disso, há evidências de que o

acúmulo de mutações no core basal promotor do vírus e a elevada carga viral (104-5

cópias/ml) são fatores preditores de desenvolvimento de CHC, mesmo na ausência

de cirrose (16).

18

Na infecção por VHC, acredita-se que o surgimento do CHC deva-se mais

ao processo necroinflamatório mantido nos pacientes cronicamente infectados do

que ao potencial oncogênico direto do vírus (6). Um grupo de pacientes com hepatite

crônica por VHC sem cirrose hepática que sabidamente apresenta risco aumentado

para o desenvolvimento de CHC é aquele de indivíduos que alcançaram resposta

viral sustentada após o uso de terapia antiviral. Sabe-se que as principais terapias

(interferon/ribavirina) para hepatite C crônica reduzem consideravelmente, mas não

anulam o risco de CHC nesses pacientes. Estudo recente de El-Serag HB et al.

relata um risco relativamente alto (0,33% ao ano) de surgimento de CHC em

pacientes curados de hepatite do pelo VHC (17). Alguns CHCs se desenvolvem

mesmo em pacientes com discreta fibrose hepática, vários anos após a resposta

viral sustentada. Há evidências de que nesses pacientes o diabetes mellitus (DM) e

a elevado índice FIB4 são importantes fatores de risco que sobrepostos, concorrem

para o desenvolvimento de CHC (18).

Quanto ao CHC associado à DHGNA, a maioria dos casos ocorre em

fígado cirrótico que provê um forte ambiente tumorigênico. Contudo, o CHC pode

complicar a DHGNA com fibrose mínima ou ausente (19). A patogênese do CHC em

fígados não cirróticos associado à DHGNA é distinta do CHC em fígado cirrótico,

pois a SM, a obesidade e a resistência à insulina dão suporte a uma série de

mecanismos únicos que promovem a tumorigênese. A resistência à insulina

associada à SM, DHGNA e DM leva à liberação de várias citocinas pró-inflamatórias,

incluindo fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 6 (IL-6), leptina e resistina,

além de reduzir os níveis de adiponectina. Esse conjunto de fatores favorece o

desenvolvimento de esteatose e inflamação hepática que precedem o

desenvolvimento de CHC (10).

O desenvolvimento de CHC na ausência de cirrose também pode estar

associado à exposição a agentes genotóxicos (toxinas, carcinógenos químicos

industriais, elementos radioativos, sobrecarga de ferro), doenças hereditárias

metabólicas (hemocromatose hereditária, deficiência de alfa-1-antitripsina,

glicogenose do tipo I), doenças congênitas como síndrome de Alagille e fibrose

hepática congênita, uso de hormônios sexuais (esteroides anabolizantes) e

transformação maligna de adenoma hepático (6,8).

19

1.3. Microambiente e imunoedição tumoral

Como exposto, as alterações genéticas, fundamentais para o

desenvolvimento de neoplasias, podem resultar da ação de fatores extrínsecos

como agentes infecciosos, agentes químicos, radiação e de fatores intrínsecos como

mutações genéticas herdadas ou erros aleatórios de replicação de DNA. A

tumorigênese é um processo de múltiplas etapas e essas etapas refletem alterações

genéticas que determinam a transformação progressiva das células envolvidas em

derivados neoplásicos malignos. Usualmente, ocorre uma série de mutações

genéticas que influenciarão na proliferação, diferenciação e morte celular. Hanahan

e Weinberg (20,21) propuseram uma série de alterações celulares elementares para

o surgimento de uma neoplasia, quais sejam: autossuficiência em sinais de

proliferação, insensibilidade a sinais antiproliferativos, capacidade de evasão da

apoptose, potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada e capacidade de

invasão tecidual e metástase. Cada capacidade adquirida através de diferentes vias

moleculares representa uma estratégia de evasão dos diversos mecanismos

existentes contra o desenvolvimento tumoral, que envolvem não apenas as células

neoplásicas propriamente ditas, mas também outras células do ambiente em que

essas estão inseridas e células recrutadas para agir localmente. Desse modo, um

tumor maligno não se constitui apenas de uma massa de células neoplásicas

proliferadas, mas de um tecido complexo formado por diferentes tipos de células que

interagem entre si (20,22). O conjunto formado por células neoplásicas, vasos

sanguíneos e linfáticos, fibroblastos, pericitos, adipócitos e células do sistema imune

formam o microambiente tumoral (Figura 1). Um número crescente de estudos (23-

27) tem demonstrado que essas células não neoplásicas têm importante

participação em diversos processos de progressão tumoral, induzidas pelas células

neoplásicas que passam a determinar, nesse caso, uma nova dinâmica tecidual.

Dentre as células não tumorais desse microambiente, destaca-se o papel das

células do sistema imune e seus produtos, no desenvolvimento e progressão das

neoplasias malignas.

A iniciação causada por carcinógenos químicos ou virais envolve

alterações no DNA que são irreversíveis e podem permanecer indefinidamente no

tecido normal até a ocorrência de um segundo evento estimulador (promoção),

resultante da ação de agentes como: irritantes químicos, fatores liberados no local

20

da agressão, hormônios e inflamação. Muitos promotores induzem direta ou

indiretamente a proliferação celular, o recrutamento de células inflamatórias e o

aumento de formas reativas de oxigênio que levam ao dano oxidativo e reduzem o

reparo do DNA (28). A conhecida relação causal entre inflamação e neoplasia foi

descrita por Virchow em 1863 (29) quando ele aventou que o câncer surgisse em

sítios de inflamação crônica, em parte baseado na hipótese de que algumas classes

de irritantes, juntamente com a agressão tecidual e inflamação que eles

desencadeiam, estimulariam a proliferação celular.

Figura 1: Representação esquemática do microambiente tumoral e seus constituintes celulares. Fonte: Balkwill FR et al.J Cell Sci. 2012;125(22).

Além do papel promotor que a inflamação tem na gênese de muitas

neoplasias, outra ação exercida pelo sistema imune, essa em frente oposta, é a de

reconhecer e eliminar tumores em desenvolvimento, mesmo na ausência de

21

tratamentos. Esse processo, chamado de imunovigilância tumoral, é um tópico

vigente desde 1909, quando Erlich propôs que células nascentes transformadas se

originam continuamente em nosso organismo e que o sistema imune as detecta e as

erradica, antes que elas se manifestem clinicamente (30). Na década de 1950, a

hipótese da imunovigilância foi formalmente postulada ao se atribuir à imunidade

celular adaptativa um papel na eliminação de células transformadas (31,32). Hoje,

sabe-se que antígenos tumorais distinguem as células neoplásicas das células

normais saudáveis e que esses antígenos geram estímulos imunológicos capazes

de destruir (33,34) ou selecionar células neoplásicas (30). Essas atividades,

aparentemente opostas do sistema imune, estão integradas na chamada

imunoedição tumoral, que em sua manifestação mais completa é composta de três

fases sequenciais de eliminação, equilíbrio e escape tumoral (“os três Es”)

(30,35,36) (Figura 2).

A eliminação é uma interpretação mais moderna do antigo conceito de

imunovigilância em que as respostas imunes, inata e adaptativa, trabalham em

conjunto para detectar e destruir células transformadas, antes mesmo que elas se

tornem aparentes (37). Nessa fase, há completa obliteração das células tumorais por

linfócitos T (30). A fase de equilíbrio corresponde à fase subsequente, em que

variantes de células tumorais não são eliminadas, em virtude de sua reduzida

antigenicidade. Essas células estão mais capacitadas a sobreviver em um

hospedeiro imunocompetente, o que explica o aparente paradoxo do

desenvolvimento de um tumor em indivíduos com o sistema imune preservado (30).

Essa fase é a mais longa e pode ocorrer no decorrer de muitos anos. Na fase final, a

fase de escape, as células tumorais desenvolvem estratégias de evasão dos

sistemas de detecção e destruição do sistema imune, que podem corresponder à

perda de antígenos tumorais, secreção de citocinas inibidoras ou downregulation de

moléculas do complexo de histocompatibilidade maior (38). É nessa fase que a

neoplasia torna-se clinicamente aparente (37).

22

Figura 2: O conceito da imunoedição tumoral. Fonte: Schreiber et al. Science. 2011;331(6024):1565-70 (36). Legenda:CTLA-4: antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico, DC: célula dendrítica, IDO: idoleamina 2,3 dioxigenase, IFN-γ: interferon gama, IFN-α/ß: interferon alfa/beta, IL-6: interleucina 6, IL-10: interleucina 10, IL-12: interleucina 12, MDSC: células supressoras de linhagem mieloide, MHC: complexo principal de histocompatibilidade, Mø: macrófago, NK: célula natural killer, NKG2D: ligante da célula natural killer do grupo 2D, NKR: receptor de célula natural killer, NKT: célula T natural killer, PD-1: proteína de morte celular programada 1, PDL-1: ligante de proteína de morte celular programada do tipo 1, TGF-ß: fator de transformação de crescimento beta, TNF: fator de necrose tumoral, Treg: célula T reguladora, TRAIL: ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral.

A tradução histológica da ação do sistema imune sobre células

neoplásicas está na presença de infiltrado linfocitário tumoral (ILT), e a mais forte

evidência da imunoedição tumoral vem de relatos que correlacionam quantidade,

qualidade e distribuição desse infiltrado com a sobrevida dos pacientes (39-45). No

23

ILT, linfócitos T CD8+ citotóxicos exercem papel central na defesa imune contra o

câncer. Eles agem diretamente sobre células tumorais, causando a lise da

membrana e morte celular, assim como a morte das células do estroma que

possuem antígenos cruzados e, por meio da ação de citocinas, impedem a formação

do estroma e levam à rejeição tumoral. Ao lado de outras células do sistema imune,

como as células natural killer, os linfócitos T CD8+ são células efetoras no controle

do crescimento tumoral e requerem a ação de linfócitos T auxiliares CD4+do tipo

TH1 para exercerem sua função em plenitude (46). A figura 3 detalha a interação de

integrantes do sistema imune e as células neoplásicas.

Do ponto de vista prático, a caracterização do ILT (composição,

distribuição e quantidade) tem sido vista como um fator promissor no sentido de

fornecer informações adicionais aos já consolidados parâmetros macro e

microscópicos usados no estadiamento das neoplasias malignas. Peculiaridades do

microambiente tumoral, como os aspectos do ILT, poderiam eventualmente explicar

a evolução clínica diferente de pacientes portadores de tumor com mesmo tipo

histológico e mesmo estadiamento anatomopatológico, assim como o desfecho ruim

de pacientes com tumores precoces.

24

Figura 3: Interações entre o microambiente imune e células tumorais. Adaptado de: Dushyanthen et al. BMC

Med. 2015;13:202 (44). A resposta imune antitumor é dependente da produção de IFN-γ pelos linfócitos CD4+

(Th1) que por sua vez medeiam a expansão, diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+

tumor-específicos. Células T citotóxicas CD8

+ induzem a lise celular via reconhecimento de antígenos tumorais-associados como

MHC, FAS e TRAILR na superfície das células neoplásicas/APCs. Similarmente, células T CD4+ tem a

capacidade de reconhecer MHC II nas APCs. Como resultado da formação deste complexo (TCR-MHC/peptídeo), níveis elevados de granzimas, IFN𝛾 e perforina são liberados pelos linfócitos T CD8

+ citotóxicos,

resultando na exocitose de grânulos e morte células via apoptose. Células NK e NKT com ajuda de linfócitos T CD4 Th1 tem a capacidade de reconhecer e eliminar células tumorais. No ambiente pró-tumor, CTLA-4, TIM-3 e PD-1 liberam sinais inibitórios como resultado da anergia/exaustão de células T causada por sua ativação prolongada. O CTLA-4 regula negativamente as células T na fase de ativação. O PD-1 expresso pelas células T na fase efetora de resposta destas células se combina ao seu ligante PDL-1, expresso dentro do microambiente tumoral. Isso resulta na inibição da atividade de células T (apoptose). Linfócitos Treg FOXP3+ exercem um papel crítico durante a seleção de células T CD8

+ reduzindo sua funcionalidade. Linfócitos Treg também tem ação

inibidora sobre APCs, células T CD8+, NKs e células T CD4

+ Th1. Tanto células Tregs e células tumorais

produzem adenosina que tem efeitos inibidores sobre células T. Células tumorais podem secretar citocinas e quimiocinas (pex, TGFβ, CCL2) que recrutam e estimulam células supressivas como Tregs, MDSCs e macrófagos M2. Macrófagos M2 e MDSCs inibem respostas de células T através do sequestro de nutrientes via geração de arginase, ROS e NOS, bem como pela interferência com o trânsito dentro do sítio tumoral. O upregulation de enzimas supressivas como IDO e arginase, cataboliza nutrientes essenciais requeridos para a ativação de células efetoras. Além disso, as células tumorais regulam negativamente a expressão de moléculas MHC, perdem a expressão de moléculas antigênicas e aumentam a expressão de moléculas inibidoras como PD-L1, levando à inibição do reconhecimento imune, permitindo o escape a progressão do câncer. Legenda: AMP: monofosfato de adenosina, ADP: difosfato de adenosina, APC: célula apresentadora de antígeno, ATP: trifosfato de adenosina, CCL-2: ligante 2 de quimiocina, CTLA-4: antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico, GAL-9: galectina 9, IDO: idoleamina 2,3 dioxigenase, IFN-γ: interferon gama, IL: interleucina, MDSC: células supressoras de linhagem mieloide, MHC: MHC: complexo principal de histocompatibilidade; NK: célula natural killer, NKT: célula T natural killer, NOS: óxido nítrico sintetase, PD-1: proteína de morte celular programada, PDL-1: ligante de proteína de morte celular programada do tipo 1, TCR: receptor de célula T, TRAIL: ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral, Treg: célula T reguladora, ROS: espécies reativas de oxigênio.

25

1.4. Infiltrado linfocitário associado ao CHC

Dados da literatura mostram que, em paralelo a uma série de trabalhos

que investigavam a relação entre o prognóstico de pacientes portadores de câncer e

seu estado imunológico via imunocompetência de seus linfócitos periféricos, muitos

estudos passaram a pesquisar a associação entre prognóstico e infiltração de

células mononucleares no tecido tumoral. Evidências crescentes constataram que os

linfócitos com a atividade antitumor mais potente se encontram dentro do próprio

sítio de crescimento neoplásico (47).

Como regra geral, os tumores sólidos são comumente infiltrados por

células do sistema imune, quais sejam linfócitos B e T, células NK, células NK-T,

células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos. Linfócitos T

CD8+ são células essenciais na ação do sistema imune contra o câncer. No CHC, a

presença de linfócitos T CD8+ capazes de reconhecer epítopos tumorais já foi

observada (48). Essas células agem através de contato direto com as células

neoplásicas, causando a morte delas pela liberação de grânulos que causam a lise

da membrana citoplasmática, como perforina e granzima, assim como causam a

morte de células do estroma que apresentam antígenos cruzados com as células

tumorais (49). Além disso, citocinas liberadas pelos linfócitos T CD8+, incluindo

TNFα, IL-4 e IL10, contribuem para a rejeição tumoral por inibir a formação do

estroma tumoral (49).

Assim como já demonstrado em cânceres de ovário, pulmão, mama,

cólon-reto e melanoma (50-55), a presença de ILT proeminente associado ao CHC

está relacionada a um melhor prognóstico dos pacientes (56-64).

Em 1992, Kawata et al. cultivaram linfócitos isolados de infiltrado

associado a 17 CHCs de humanos e, posteriormente, demonstraram citotoxicidade

aumentada dessas células sobre células alogênicas da linhagem do CHC (65).

Nesse estudo experimental, a quantidade inicial de ILT por unidade de peso de

tumor foi maior no grupo de pacientes com melhor prognóstico, demonstrando que

ILT mais intenso parecia ser um marcador de evolução clínica melhor.

Na esteira dos estudos experimentais in vitro, seguiu-se uma série de

outros estudos em produtos de biópsia e ressecção tumoral, com o intuito de avaliar

a possível associação do prognóstico do CHC com a presença de ILT. Numa época

em que a maioria dos estudos acerca de fatores prognósticos do CHC enfatizava

26

parâmetros clínicos e poucos examinavam parâmetros anatomopatológicos em

detalhe, Ng IO et al. publicaram, em 1995, uma análise multivariada com ênfase em

aspectos patológicos de 278 pacientes submetidos hepatectomia para tratamento de

CHC primário (66). Nesse estudo, 20 parâmetros anatomopatológicos, incluindo a

análise quantitativa de infiltrado linfocitário tumoral, foram correlacionados com

dados da sobrevida dos pacientes e, dentre eles, encapsulamento e intenso ILT

estavam significativamente associados à taxa mais baixa de recorrência, enquanto

margens de ressecção negativa e intenso ILT foram fatores significativamente

associados a maior tempo de sobrevida dos pacientes.

Muitos estudos experimentais in vitro e trabalhos que usaram exame

imuno-histoquímico e/ou citometria de fluxo em espécimes cirúrgicos de variadas

neoplasias para análise qualitativa dos infiltrados atestam que o efeito antitumor do

ILT se dá, principalmente, via imunidade celular pela ação de linfócitos T e,

parcialmente, pela imunidade humoral, conferida pelos linfócitos B dos folículos

linfoides formados, assim como pela ação de citocinas produzidas pelas próprias

células tumorais (61). O mesmo se dá no caso do CHC. Sendo assim, a

caracterização do infiltrado de células T, determinando intensidade, distribuição nos

tumores (se agride as células tumorais, se é estromal ou se localiza na periferia da

neoplasia), distribuição no parênquima não neoplásico e seu imunofenótipo, é um

tema muito relevante na literatura atual sobre CHC.

Wada et al. (61) examinaram o produto de ressecção de 11 CHCs (6 em

fígados cirróticos e 5 em fígados não cirróticos) com menos de 3 cm de diâmetro e

marcado ILT em pacientes com sorologia positiva para VHC. Nesse estudo

quantitativo, o número de linfócitos foi contado em 10 áreas de 0,25 mm2 em

aumento de 400X e expresso em números absolutos. O conjunto da análise

quantitativa e qualitativa demonstrou que a maioria dos linfócitos do infiltrado era T e

que linfócitos B estavam localizados em folículos. Notou-se uma tendência de maior

contagem de linfócitos T CD8+ em relação aos linfócitos T CD4+, mas sem diferença

significativa (linfócitos T CD8+: 43,5±15,1; linfócitos T CD4+: 33,4±9,3; p= 0,735). A

análise clinicopatológica comparativa entre esses casos, e mais de uma centena de

casos do grupo-controle de CHCs sem ILT proeminente e sorologia positiva para

VHC, revelou que a taxa de recorrência foi significativamente maior no grupo

controle (47,5% contra 9,1%) e a taxa de sobrevida em 5 anos foi de 100% entre os

pacientes com marcado ILT e de 68,1% no grupo-controle.

27

Gal et al. (59) avaliaram, através de exame imuno-histoquímico, o ILT em

CHCs de 302 pacientes dispostos em tissue microarrays (TMAs). A contagem das

células linfoides foi feita em cinco campos microscópicos de 400X contendo infiltrado

linfocitário mais denso e o resultado expresso como a média do número de células

(± desvio-padrão) por campo de grande aumento (400X). Eles demonstraram que,

dentro da população de linfócitos CD3+, a quantidade de linfócitos T CD4+ era

significativamente mais alta nos TILs do que no infiltrado linfocitário presente no

tecido não neoplásico peritumoral. Por outro lado, a porcentagem de linfócitos T

CD8+ estava reduzida no ILT. Guo et al. (64) e Pang et al. (67) relataram resultados

semelhantes. Nesses estudos também foi avaliada a presença dos linfócitos T

reguladores (células Treg), subgrupo de linfócitos T CD4+ com função supressora,

caracterizada pela expressão da cadeia α do receptor de IL2 (CD25) e do fator de

transcrição regular FoxP3. As células Treg inibem a proliferação e a função de

muitos tipos diferentes de células do sistema imune, como linfócitos T CD8+, além de

linfócitos T CD4+, células NK, células NKT, células B, células dendríticas e

monócitos/macrófagos (62). Gal et al. e Guo et al. evidenciaram que o número

aumentado de Treg no ILT associado ao CHC está relacionado com a redução do

número de linfócitos T CD8+, o que resulta em supressão da imunidade antitumor

efetiva e progressão da neoplasia (68).

Unitt et al. (46) avaliaram 69 explantes de pacientes submetidos a

transplante hepático por CHC associado a diferentes hepatopatias e demonstraram

que a presença de ILT e a elevada proporção entre linfócitos T CD4+:CD8+ em

particular estavam associadas com risco reduzido de recorrência tumoral após o

transplante. Uma explicação possível para esse achado é a de que linfócitos T CD8+

dependem de linfócitos T helper CD4+ para obterem seu efeito máximo. Outra

possibilidade é a existência de linfócitos T CD8+ funcionalmente deficientes, que, por

exemplo, têm capacidade reduzida de expressar as proteínas indutoras de apoptose

perforina e granzima B, necessitando de uma forte resposta de linfócitos T helper

CD4+ para superar esses defeitos.

No estudo desenvolvido por An et al. (49), fez-se uma avaliação da

intensidade e distribuição dos linfócitos T CD4+ e CD8+ no parênquima e no estroma

de 86 casos de CHC em fígados cirróticos e não cirróticos. Para esse estudo, foram

selecionadas, de cada caso, áreas representativas do ILT associado ao CHC e

tecido peritumoral que, retiradas com punch de 3 mm, foram usadas para a

28

confecção de TMAs. A contagem dos linfócitos foi feita em 5 hot spots e os

resultados expressos em número médio de linfócitos T (CD4+ e CD8+). O número

médio de linfócitos T (CD4+ e CD8+) no estroma tumoral estava significativamente

aumentado em relação ao número dessas células no parênquima tumoral; além

disso, detectou-se um número médio de linfócitos T CD8+ no estroma e no

parênquima tumoral, significativamente mais alto do que linfócitos T CD4+. Vale

ressaltar que o número médio de linfócitos T CD8+ no estroma e no parênquima era

significativamente mais alto em tumores com diâmetro ≤ 5,0 cm de diâmetro do que

em tumores com diâmetro > 5,0 cm, sugerindo que as células T CD8+ que infiltram

estroma e parênquima tumoral possam estar envolvidas no controle do tamanho da

neoplasia.

A avaliação de 65 pacientes portadores de CHC submetidos à ressecção

primária, realizada por Gabrielson et al (45), demonstrou que apenas 15% dos

pacientes que apresentavam elevada densidade de linfócitos T CD8+ no interior e

nas bordas infiltrativas do tumor apresentaram recorrência do tumor, contra 45%

daqueles com baixa densidade de células T CD8+.

Em suma, os achados dos estudos do ILT em CHC são semelhantes aos

que já foram observados em outras neoplasias malignas, como cânceres de mama,

trato gastrointestinal, ovário, pulmão e melanoma: a presença de ILT é um fator

prognóstico positivo (56-64), destacando-se o papel importante exercido pelas

células T CD8+, por seu efeito citotóxico direto sobre as células neoplásicas.

Ressalta-se dessa revisão da literatura que grande parte dos estudos já

publicados sobre esse tema incluem, em sua casuística, casos de CHCs originados

em fígados cirróticos e CHCs originados em fígados não cirróticos (45,59,61,64).

Contudo, não existem trabalhos que comparam as características do ILT nessas

duas subpopulações.

29

2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO

Não existem relatos da comparação do ILT presente em CHCs originados

em fígados cirróticos e não cirróticos. A maioria dos estudos tem se dedicado a fazer

análises qualitativas e quantitativas do ILT em CHCs originados em fígados

cirróticos. Os CHCs originados em fígados não cirróticos são bem menos frequentes

e ora se constituem em uma população menor nos grupos de estudo.

O papel do ILT no controle e erradicação das neoplasias malignas é um

tema muito atual em oncologia, e os avanços dos estudos sobre esse tema em

relação aos CHCs, em geral, ainda estão em progressão. O conhecimento crescente

sobre a interação entre sistema imune e células neoplásicas do CHC é muito

relevante, pois fornece substrato para a instituição de novas modalidades

terapêuticas para esse tumor que tem opções de tratamento limitadas, sobretudo

para os pacientes com doença avançada.

CHCs originados em fígados não cirróticos são incomuns, e as hepatites

virais são importantes fatores de risco para essa neoplasia. Contudo, a epidemia de

obesidade e síndrome metabólica, que atualmente atinge todo o mundo, tem

elevado não só a prevalência e a incidência da doença hepática gordurosa não

alcoólica do fígado, mas também tem aumentado a incidência desta neoplasia. Há

que se confirmar se esses também são os principais fatores de risco para essa

doença em nosso meio.

30

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral: Avaliar, através de exame imuno-histoquímico, o infiltrado

linfocitário tumoral presente em CHCs originados em fígados cirróticos e não

cirróticos.

3.2. Objetivos específicos:

Avaliar as características imunofenotípicas do infiltrado linfocitário tumoral em

CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos;

Determinar a intensidade das subpopulações de linfócitos presentes no

infiltrado linfocitário tumoral nos dois grupos de CHCs: originados em fígados

cirróticos e não cirróticos;

Comparar as características (intensidade e imunofenótipo) do infiltrado

linfocitário tumoral em CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos;

Correlacionar as características do infiltrado linfocitário tumoral (intensidade e

imunofenótipo) com aspectos morfológicos relacionados ao prognóstico

(graduação histológica, tamanho do tumor e presença de êmbolos

neoplásicos), em CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos;

Definir possíveis fatores etiológicos associados aos CHCs originados em

fígados não cirróticos e as eventuais alterações histológicas presentes no

parênquima não neoplásico deste subgrupo de tumores.

31

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Desenho do estudo e casuística

Foi realizado um estudo retrospectivo utilizando-se os arquivos de

biópsias do Departamento de Anatomia Patológica da Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP) no período de 2010 a 2014.

A partir de 2014, foram selecionados retrospectivamente 20 casos

consecutivos de CHC clássico oriundos de fígados sem cirrose e o mesmo número

de casos de CHC clássico em fígados cirróticos, provenientes de produtos de

ressecção cirúrgica: nodulectomia, hepatectomia total (explante) ou parcial,

independentemente de fator etiológico, sexo, cor, idade ou grupo étnico. De cada

caso, foi selecionado um bloco de parafina.

Tais casos foram divididos em dois grupos:

- Grupo 1: vinte (20) casos de pacientes com carcinoma hepatocelular e

cirrose;

- Grupo 2: vinte (20) casos de pacientes com carcinoma hepatocelular

sem cirrose.

As informações clínicas e características macroscópicas dos casos foram

adquiridas nos prontuários dos pacientes e nos laudos anatomopatológicos. A

graduação histológica dos tumores foi feita de acordo com o sistema de graduação

de Edmondson e Steiner (AJCC Cancer Staging Manual, 8ª edição)(69).

4.2. Tissue microarrays

De cada caso, realizou-se a punção do bloco de parafina correspondente

com um punch de 3 mm, e os cilindros obtidos foram transferidos para blocos de

parafina receptores que aprupavam: tissue microarray 1 (TMA 1), CHCs em fígados

cirróticos e tissue microarray 2 (TMA 2), CHCs em fígados não cirróticos. Os blocos

receptores de TMA foram colocados na estufa para derretimento e fusão das

parafinas. Posteriormente, realizaram-se cortes histológicos de 4 µm de espessura

que, submetidos à coloração de hematoxilina-eosina (HE), foram analisados para

garantir a representatividade do ILT distante de áreas de necrose e/ou hemorragia.

32

4.3. Critérios de exclusão

Foram excluídos casos cujos materiais biológicos nos blocos de parafina

não apresentavam condições para o estudo, como amostras insuficientes, fixação

inadequada ou predomínio de necrose tumoral secundárias ou não à alcoolização ou

à quimioembolização prévia. Também foram excluídos casos de carcinoma

hepatocelular fibrolamelar, um subtipo de carcinoma hepatocelular que ocorre em

pacientes jovens sem cirrose, com características peculiares clínicas e morfológicas.

Este estudo também não incluiu nenhum caso de CHC linfoepitelioma-like, uma rara

forma de carcinoma indiferenciado do fígado com abundante infiltrado linfoide

associado (70) e que aparentemente tem melhor prognóstico (71).

4.4. Reações imuno-histoquímicas

Os materiais previamente fixados em formalina 10% e emblocados em

parafina foram submetidos a cortes histológicos de 4µm de espessura, colocados

em lâminas silanizadas e submetidos a exame imuno-histoquímico usando o sistema

de detecção Advance (DAKO), conforme protocolo do Laboratório de Imuno-

histoquímica da Pós-graduação do Departamento de Anatomia Patológica da

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (vide anexo 1).

Foram utilizados os anticorpos primários CD20 (clone L26 Dako, diluição

1:300) para marcação dos linfócitos B, CD3 (clone F7.2.38 Dako; diluição 1:50) para

marcação dos linfócitos T, CD4 (clone 4B12 Dako; diluição 1:50) para marcação dos

linfócitos T CD4+ e CD8 (clone C8/144B Dako; diluição 1:50) para marcação dos

linfócitos T CD8+.

Para o controle das reações imuno-histoquímicas, utilizaram-se blocos de

parafina de tonsilas palatinas normais, concomitantemente submetidos a todo

procedimento acima descrito para os casos dos grupos de estudo.

33

4.5. Análise das reações imuno-histoquímicas

4.5.1. Análise qualitativa

Inicialmente, foi realizada uma leitura da reação imuno-histoquímica dos

quatro marcadores utilizados ao microscópico óptico, que foram considerados

positivos quando observada a expressão em membrana citoplasmática de linfócitos

intratumorais.

4.5.2. Captura de imagens e análise quantitativa

As lâminas dos TMAs foram digitalizadas no equipamento

AperioScanscope® AT Turbo(LeycaBiosystems). As áreas de interesse a serem

analisadas foram selecionadas no programa AperioImagescopev12.1.0.5029 (Aperio

Technologies, Inc). Para os 4 marcadores CD20, CD3, CD4, CD8, foram

selecionados, em maior aumento (X400), três (03) campos histológicos contendo

maior densidade de linfócitos positivos (hot spots). Cada hot spot foi fotografado e o

número absoluto de linfócitos tumorais positivos para cada marcador foi contado

com o auxílio do programa de processamento de imagens ImageJ® (ImageJ 1.51j8;

Java 1.8.0_122 64-bit) (Figura 4) desenvolvido pelo NIH (National Institute of Health)

e disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Posteriormente, calculou-se

o número médio de linfócitos tumorais positivos por campo de grande aumento

(X400).

34

Figura 4: Contagem do número de linfócitos T CD8

+ intratumorais por campo de grande aumento (X400) com o

programa de processamento de imagens ImageJ®.

4.5.3. Metodologia estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada com a colaboração de

profissional estatístico da FCM-UNICAMP.

Para descrever o perfil da amostra segundo as variáveis em estudo, foram

feitas tabelas descritivas das variáveis numéricas com valores de média, desvio

padrão, valores mínimo e máximo e mediana.

Para comparação das variáveis categóricas, utilizou-se o teste Qui-

quadrado e, quando necessário, o teste exato de Fisher.

Especificamente, para comparação do tamanho dos tumores, assim como

da contagem de células de cada subpopulação de linfócitos entre os dois grupos, foi

utilizado o teste de Mann-Whitney.

A análise comparativa da presença de êmbolos neoplásicos entre os

grupos 1 e 2 foi feita através do teste Qui-quadrado e a avaliação da relação entre a

35

quantidade de cada subtipo de linfócito, e a presença de êmbolos neoplásicos foi

feita através do teste de Mann-Whitney.

A relação entre a quantidade de cada subtipo de linfócito e o tamanho dos

tumores nos dois grupos foi analisada através da correlação de Spearman.

O estudo da relação entre a quantidade de cada subtipo de linfócito e o

grau histológico dos CHCs nos dois grupos foi feito através do teste de Kruskal-

Wallis/teste de Mann-Whitney.

A análise comparativa da quantidade de linfócitos T CD4+ e linfócitos T

CD4+ no grupo 2 foi feita com o teste de Wilcoxon para amostras pareadas.

O nível de significância adotado para este estudo foi de 5%.

Para a análise, foi utilizado o programa computacional The SAS System

for Windows (StatisticalAnalysis System), versão 9.4. SAS Institute Inc, 2002-2008,

Cary, NC, USA.

4.6. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

de Ciências Médicas da UNICAMP – Plataforma Brasil, parecer número: 1.989.428

(Anexo 2).

Por se tratar de trabalho retrospectivo em material biológico proveniente

de arquivo de blocos de parafina, dispensou-se a utilização do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido.

36

5. RESULTADOS

5.1. Aspectos clínicos

Tanto no grupo de CHCs originados em fígados cirróticos (grupo 1)

quanto no grupo de CHCs originados em fígados não cirróticos (grupo 2), houve

predomínio absoluto de pacientes do sexo masculino (82,5%). Dentre os 20

pacientes portadores de CHCs originados em fígados cirróticos e 20 pacientes

portadores de CHCs originados em fígados não cirróticos, respectivamente 17 (85%)

e 16 (80%) eram homens. A idade dos pacientes variou entre 42 e 70 anos (média

de idade: 56,50 anos ± 7,45 DP) no grupo 1 e entre 31 e 77 anos (média de idade:

52,75 anos ± 13,55 DP) no grupo 2.

O grupo 1 era composto por 05 pacientes negros e 15 pacientes brancos

e o grupo 2, por 2 pacientes negros e 18 pacientes brancos.

No grupo 1, assim como o esperado para países ocidentais, o principal

fator etiológico associado à cirrose hepática foi infecção pelo VHC. Dezesseis

pacientes (80%) eram portadores de VHC e, dentre esses, 11 apresentavam uma ou

mais causas adicionais de hepatopatia crônica como infecção por VHB, etilismo e

fator(es) de risco para síndrome metabólica (SM). Dentre os quatro pacientes com

sorologias negativas, um apresentava hemossiderose hepática, dois eram etilistas e

um era etilista e apresentava ainda um fator de risco para síndrome metabólica

(FRSM) (gráfico 1).

Legenda: VHC= vírus da hepatite C, VHB= vírus da hepatite B, FRSM= fator de risco para síndrome metabólica

25%

5%

5% 25%

20%

5% 10% 5%

Gráfico 1: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados cirróticos

VHC

VHC+VHB

VHC+VHB+Etilismo

VHC+Etilismo

VHC+Etilismo+FRSM

Hemossiderose

Etilismo

Etilismo+FRSM

37

No grupo 2, um número significativo de pacientes, 13 (65%), apresentava

um ou mais fatores de risco para SM e, nesse subgrupo, 3 pacientes apresentavam

ainda outra(s) causa(s) associada(s) ao desenvolvimento de CHC (porfiria em um

caso, etilismo em outro caso, VHC e etilismo no terceiro caso). Quatro pacientes

eram etilistas (20%) e 3 pacientes (15%) eram etilistas e portadores de VHC (gráfico

2).

Legenda: FRSM= fator de risco para síndrome metabólica, HAS= hipertensão arterial sistêmica, VHC= vírus da

hepatite C.

Os dados clínicos referentes aos dois grupos que compõem a amostra

estão sumarizados na tabela 1.

50%

5% 5% 5%

20%

15%

Gráfico 2: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados não cirróticos

FRSM

FRSM+Etilismo

FRSM(HAS)+Etilismo+VHC

FRSM(DM2)+porfiria

Etilismo

Etilismo+VHC

38

Tabela 1. Sumário dos aspectos clínicos da amostra

GRUPO 1 n=20

GRUPO 2 n=20

Sexo Homens: 17 (85%) Homens: 16 (80%)

Mulheres: 3 Mulheres: 04

Idade (anos) 56,50 (±7,45 DP) 52,75 (±13,55 DP)

Raça Brancos: 15 Brancos: 18

Negros: 5 Negros: 2

Fatores etiológicos

VHC: 16 (80%) VHC apenas: 5 VHC+etilismo+FRSM: 5 VHC+etilismo: 3 VHC+VHB: 2 VHC+VHB+etilismo: 1

FRSM: 10 (50%) Obesidade: 3 Obesidade+HAS: 3 HAS+DM2: 3 DM2: 1

Etilismo: 2 (10%) Etilismo: 4 (20%)

Etilismo+1 FRSM (HAS): 1 (5%) Etilismo+VHC: 3 (15%)

Etilismo+1 FRSM (obesidade): 1 (5%)

Hemossiderose: 1 (5%) Etilismo+VHC+1 FRSM (HAS): 1 (5%)

1 FRSM (DM2)+porfiria: 1 (5%)

Legenda: DM= diabetes mellitus tipo 2, DP= desvio padrão, FRSM= fator de risco para síndrome metabólica,

HAS= hipertensão arterial sistêmica, VHC= vírus da hepatite C, VHB= vírus da hepatite B.

5.2. Achados anatomopatológicos

5.2.1. Aspectos macro e microscópicos

A comparação entre o tamanho médio dos tumores nos dois grupos

revelou que no grupo 2 os tumores eram significativamente maiores do que no grupo

1 (p=0,0108). O tamanho médio dos CHCs no grupo 2 foi 5,79 cm ± 4,45 DP (menor

tumor: 1,8 cm e o maior: 20 cm), e no grupo 1 foi 2,89 cm ± 1,15 DP (menor tumor:

0,7 cm e o maior: 6,7 cm).

Nos dois grupos, houve predomínio CHC grau 2 de Edmondson-Steiner

(70%). No grupo 1, 16 pacientes (80%) possuíam CHC grau 2 e quatro pacientes

(20%) possuíam CHC grau 1. Apenas no grupo 2 foram diagnosticados CHCs grau 3

39

(4 pacientes). Os demais casos desse grupo incluíram 12 CHCs grau 2 (60%) e

quatro (20%) CHCs grau 1.

Não houve diferença significativa entre os dois grupos, no que diz respeito

ao número de casos em se detectou a presença de êmbolo(s) neoplásico(s)

(p=0,3272). No grupo 1, observou-se a presença de êmbolo(s) neoplásico(s) em 6

casos. No grupo 2, a presença de êmbolos neoplásicos foi detectada em 9 casos.

Em 14 casos de CHCs originados em fígados não cirróticos, havia

amostra de tecido peritumoral suficiente para a avaliação e, dentre esses, 9 casos

(64,3%) apresentavam algum tipo de lesão hepática (Tabela 2). Oito casos (57,1%)

apresentavam um ou mais fatores de risco para síndrome metabólica e algum grau

de esteato-hepatite (grau 1 ou 2), com ou sem fibrose associada. Em 3 dos 4 casos

sem fatores de risco conhecidos para hepatopatias e/ou CHC, havia algum tipo de

lesão hepática. Em 5 casos, não havia sinais de hepatopatia crônica e, nesse

conjunto, 1 caso apresentava fígado normal e os demais apresentavam alterações

de periferia de lesão expansiva.

Tabela 2. Fatores de risco para CHC e achados do parênquima peritumoral no grupo

2 (14 entre 20 casos de CHC originados em fígados não cirróticos)

Sorologias virais FRSM Parênquima peritumoral

VHC + Ausente FN

Negativas HAS+DM2 FP2

Negativas obesidade+HAS EH 2+Sid3+Hepatopatia crônica Bi+colangite aguda 3

Negativas Ausente FP leve+FR

Negativas DM2 FR

Negativas obesidade EH1 e fibrose perissinusoidal1 na zona 3

VHC + Ausente PLE

negativas Ausente PLE, sem HC, sem EH

negativas HAS+DM2 PLE, sem HC, sem EH

VHC + HAS Hepatopatia crônica Bi sem colangite+PLE

negativas Ausente EH1 sem fibrose

negativas obesidade+HAS EH1 sem fibrose

negativas Ausente EH1 com FP1

negativas obesidade PLE, sem HC, sem EH

Legenda: FRSM: fator de risco para síndrome metabólica, HAS: hipertensão arterial sistêmica, DM2: diabetes

mellitus tipo 2; FN: fígado normal; FP: fibrose portal; EH: esteato-hepatite; Sid: Siderose: Bi: padrão biliar FR: fígado reacional; PLE: periferia de lesão expansiva; 1: leve; 2: moderada; 3: intensa.

40

5.2.2. Achados imuno-histoquímicos

A maioria dos linfócitos intratumorais, nos grupos 1 e 2, eram linfócitos T

(Figuras 5-8).

Figura 5: Linfócitos T intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (marcador CD3; X400).

Figura 6: Linfócitos B intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (marcador CD20; X400).

41

Figura 7: Linfócitos T intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD3; X400).

Figura 8: Linfócitos B intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD20; X400).

No grupo 1, a contagem média de linfócitos T por campo de grande

aumento (X400) foi de 52,61 células, enquanto a contagem média de linfócitos B foi

de 4,88. A contagem média de linfócitos T CD4+ foi de 22,01, muito próxima da

42

contagem de linfócitos CD8+, que foi de 20,11 (Gráfico 3). As figuras 9 e 10 ilustram

esses achados.

Legenda: CHCs= carcinomas hepatocelulares

Figura 9: Linfócitos T CD8+ intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (X400).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Linfócitos T Linfócitos TCD4+

Linfócitos TCD8+

Linfócitos B

52

,61

22

,01

20

,11

4,8

8

35

,50

9,3

3

9,0

0

2,1

7

9,6

6

0,0

0

2

0,0

0

17

4,0

0

10

1,0

0

74

,33

17

,00

Nú

mero

de

lin

fóc

ito

s

Gráfico 3: Avaliação do infiltrado linfocitário intratumoral em CHCs originados em fígados cirróticos

Média

Mediana

Mínimo

Máximo

43

Figura 10: Linfócitos T CD4+

intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (X400).

No grupo 2, a contagem média de linfócitos B e T por campo de grande

aumento (X400) foi superior à do grupo 1, sendo a contagem média de linfócitos B

de 17,83 e o número médio de linfócitos T de 81,70. Linfócitos T CD4+predominaram

em relação aos linfócitos T CD8+ (30,88 e 18,25 linfócitos, respectivamente), embora

não em nível significativo (p=0,1769). Tais achados estão compilados no gráfico 4 e

ilustrados nas figuras 11 e 12.

Legenda: CHCs= carcinomas hepatocelulares

0

50

100

150

200

250

300

Linfócitos T Linfócitos T CD4+ Linfócitos T CD8+ Linfócitos B

81

,70

30

,88

18

,25

17

,83

80

,33

13

,33

16

,33

3,8

3

4,6

6

0,0

0

2,0

0

0,0

0

25

3,3

3

86

,33

46

,00

14

6,3

3

Nú

mero

de l

infó

cit

os

Gráfico 4: Avaliação do infiltrado linfocitário intratumoral em CHCs originados em fígados não cirróticos

Média

Mediana

Mínimo

Máximo

44


intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (X400).


intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (X400).

Apesar de termos observado essa tendência de maior número de

linfócitos B e linfócitos T (incluindo os subgrupos linfócitos T CD4+ e CD8+)

intratumorais no grupo 2, o estudo comparativo de variáveis numéricas pelo teste

Mann-Whitney não revelou diferença estatisticamente significativa entre o número de

nenhum tipo de linfócito quando esse grupo foi comparado ao grupo 1 (p=0,3029

45

para linfócitos B, p=0,1677 para linfócitos T, p=0,2388 para linfócitos T CD4+ e

p=0,6167 para linfócitos T CD8+). O gráfico 5 agrupa esses dados e permite melhor

avaliação comparativa.

Legenda: ILT=infiltrado linfocitário tumoral

5.2.3. Correlação entre achados imuno-histoquímicos e aspectos morfológicos

O estudo da relação entre a intensidade do infiltrado linfocitário e o

tamanho do tumor nos grupos 1 e 2 não demonstrou correlações significativas, como

está demonstrado na Tabela 3.

A análise comparativa entre o ILT e o grau histológico dos tumores no

grupo 2 (CHCs em fígados não cirróticos) revelou um número significativamente

maior de linfócitos T (p=0,0274) e linfócitos B (p=0,0480) nos CHCs grau 2 em

relação aos CHCs grau 1. Dentro do grupo de linfócitos T, notou-se uma tendência

de maior infiltrado de linfócitos T CD4+ (p=0,0541). No grupo 1, não se observou

diferença significativa na contagem das diferentes subpopulações de linfócitos do

ILT nos tumores de diferentes graus histológicos.

46

Tabela 3. Relação entre subtipos de linfócitos do ILT e tamanho do tumor

(correlação de Spearman)

Carcinomas hepatocelulares em fígados cirróticos

Tamanho CD3 CD4 CD8 CD20

ρ -0.0227 0.0046 -0.1305 -0.1580

p 0.9244 0.9848 0.5835 0.5060

Carcinomas hepatocelulares em fígados não cirróticos

Tamanho CD3 CD4 CD8 CD20

ρ -0.1786 -0.2623 0.0475 -0.2402

p 0.4512 0.2638 0.8424 0.3077

Legenda: ρ - coeficiente de correlação

O coeficiente de correlação (ρ) pode variar de -1 (indicando forte correlação negativa entre as duas

variáveis, ou seja, quando uma cresce a outra decresce) a 1 (indicando forte correlação positiva

entre as duas variáveis. Quando o ρ está próximo de 0, conclui-se que não existe correlação linear

entre as duas variáveis.

Quanto à análise de possível relação entre a presença de êmbolos

neoplásicos e a intensidade do infiltrado de diferentes subtipos de linfócitos do ILT

em cada grupo (teste de Mann-Whitney), não foi demonstrada correlação

estatisticamente significativa em nenhum dos dois grupos, com os seguintes valores

de p:

Fígados cirróticos: p=0,9013 para linfócitos B, p=0,9015 para linfócitos T,

p=0,8685 para linfócitos T CD4+ e p=0,9671 para linfócitos T CD8+.

Fígados não cirróticos: p=0,4023 para linfócitos B, p=0,2545 para linfócitos

T, p=0,8196 para linfócitos T CD4+ e p=0,4249 para linfócitos T CD8+).

47

6. DISCUSSÃO

A ressecção cirúrgica é a melhor opção terapêutica para o CHC, contudo

ela é reservada apenas para os tumores precoces (72). Mesmo esses casos

apresentam altas taxas de recorrência tumoral e não existem tratamentos

disponíveis que reduzam o risco de recorrência. Situação mais complexa envolve os

carcinomas avançados, irressecáveis, uma vez que CHCs são refratários à

quimioterapia clássica e a toxicidade da radioterapia no parênquima hepático torna

essa modalidade de tratamento inapropriada em pacientes que, em sua maioria,

apresentam grave comprometimento da função hepática decorrente de hepatopatia

crônica subjacente (73). Para esses pacientes, está indicada a terapia sistêmica com

Sorafenibe, um inibidor de quinases que aumenta a sobrevida mediana em apenas

7,9 a 10,7 meses (73) e pode desencadear reações adversas importantes, como

eventos tromboembólicos, hipertensão arterial, toxicidade cutânea e eventos

hemorrágicos.

Nesse cenário, a necessidade de novas modalidades terapêuticas para

essa neoplasia é premente e, dadas as evidências de que pronunciado infiltrado

linfocitário tumoral correlaciona-se com melhor prognóstico em tipos variados de

tumores, as opções de tratamento mais promissoras atualmente têm sido aquelas

que promovem ativação do sistema imune no microambiente tumoral. De fato,

medicamentos inibidores de checkpoints imunológicos, anticorpos terapêuticos,

imunoterapia celular adotiva, vacinas antitumorais e moduladores do sistema imune,

como citocinas e fatores de crescimento, têm sido usados com sucesso em uma

série de neoplasias (74) e espera-se que também possam ser utilizados com

sucesso nos CHCs (75). Resultados promissores já foram alcançados em estudos

de fase I/II com o imunoterápico nivolumab em pacientes portadores CHC avançado

em fígados com e sem infecção por VHC e VHB (76).

Pelo acima exposto, conhecer as características do ILT nos CHCs

originados não só em fígados cirróticos, mas também em fígados não cirróticos,

constitui-se em um passo importante para eventualmente beneficiar uma população

maior de indivíduos.

O presente estudo demonstra o predomínio de linfócitos T no ILT de

CHCs originados em fígados cirróticos e de CHCs originados em fígados não

48

cirróticos, além de confirmar o papel já estabelecido dos linfócitos T (CD4+e CD8+)

na fase de eliminação da imunoedição tumoral nesses dois cenários.

Por seu papel citotóxico direto sobre células neoplásicas, um maior

número de linfócitos T CD8+ no ILT está relacionado ao melhor prognóstico dos

CHCs (45,49). Não observamos predomínio de linfócitos T CD8+ em nenhum dos

dois grupos de nossa amostra. No grupo 2, composto por tumores maiores (tamanho

médio: 5,79 cm) do que os tumores do grupo 1 (tamanho médio: 2,89 cm), ao

contrário, observou-se um discreto predomínio de linfócitos T CD4+em relação aos

linfócitos T CD8+(p=0,1769). A hipótese de que o tamanho maior dos tumores nesse

grupo estaria relacionado ao número menor de linfócitos T CD8+ não se confirmou,

conforme demonstrou o teste de Spearman (Tabela 3). Muito mais provavelmente o

que ocorreu nesse grupo é que, diferentemente do grupo 1, em que o estado de

portador de cirrose exigiu o seguimento dos pacientes com exames radiológicos e

disso decorreu o diagnóstico de CHCs mais precoces, na maioria dos casos do

grupo 2, o diagnóstico foi feito em lesões maiores, já sintomáticas.

No que diz respeito à relação entre o infiltrado linfocitário tumoral e outra

variável morfológica, o grau de diferenciação histológica dos tumores, notou-se que,

no grupo 2, CHCs grau 2 apresentavam um número significativamente maior de

linfócitos T e B em relação aos CHCs grau 1. O fígado possui imunobiologia ímpar,

que garante um meio imunossupressivo, mesmo no órgão saudável (74). Seu

suprimento sanguíneo se dá através da artéria hepática e da via porta, que traz

consigo toxinas e microrganismos provenientes dos intestinos. Para prevenir

respostas imunes aberrantes à contínua exposição aos patógenos, o fígado possui

um sistema de regulação imune redundante e único, da qual participam hepatócitos,

células endoteliais do sinusoides hepáticos, células de Kupffer e células dendríticas.

Isso cria um ambiente tolerogênico que parece se acumular na hepatocarcinogênese

(74). Mesmo não sendo considerado um tumor imunogênico, as células neoplásicas

que compõem o CHC, assim como a de outras neoplasias, expressam antígenos

tumorais específicos, que os diferem das células normais e que podem,

provavelmente, ser mais ou menos imunogênicas na dependência do grau de

diferenciação do tumor.

Em relação à quantidade de linfócitos B, linfócitos T, linfócitos T CD4+ ou

CD8+, a comparação dos dois grupos não evidenciou diferença significativa. É

49

possível que isso reflita o fato de que, independentemente da via de carcinogênese

do CHC, os mecanismos de imunoedição tumoral sejam os mesmos.

Quanto às variáveis clínicas, o predomínio de infecção pelo VHC (80%)

associado aos CHCs do grupo 1 reflete a prevalência da infecção por esse vírus no

Brasil, bem como o fato de que cerca de 20% dos indivíduos cronicamente

infectados por ele evoluem para cirrose e, dentre esses, cerca de 1% a 5% para

câncer hepático (77). O gráfico 6 mostra a taxa de incidência/detecção de hepatites

virais segundo os agentes etiológicos, no período de 2002 a 2015, sendo possível

notar uma tendência de aumento da taxa de incidência/detecção de HCV nesse

período (78).

Fonte: Boletim Epidemiológico Hepatites Virais. Agosto de 2016. Ministério da Saúde- Secretaria de Vigilância

em Saúde.

A maior proporção de indivíduos do sexo masculino acometidos por CHC

em fígados cirróticos (85%) possivelmente reflete a maior prevalência de HCV

(gráfico 7) e etilismo nessa população.

No grupo 2, o grande número de indivíduos (65%) com um ou mais

fatores de risco para SM dá indícios de que esses pacientes, ainda que não

portadores de cirrose, possam apresentar graus variados de hepatopatia dentro do

espectro da DHGNA. O fato de que nesses casos a amostra seja composta por

hepatectomias ou nodulectomias com pouco tecido não neoplásico para avaliação

limita a confirmação dessa hipótese. Dentre os 14 casos em que havia tecido

peritumoral para avaliação, 9 casos mostraram algum grau de lesão hepática e,

nesse subgrupo, 6 casos apresentavam um ou mais FRSM. Inicialmente

50

considerada uma doença benigna, a DHGNA é uma doença multifatorial que envolve

fatores ambientais e genéticos, que pode evoluir para formas mais graves como

cirrose e CHC (79). Está associada aos componentes da SM, quais sejam DM tipo 2,

resistência à insulina, hipertensão arterial sistêmica (HAS) e, principalmente,

obesidade abdominal (visceral), dislipidemia, hipertrigliceridemia, níveis baixos de

lipoproteína de alta densidade (HDL) e níveis elevados de lipoproteína de baixa

densidade (LDL). Devido ao aumento progressivo da obesidade, a DHGNA tem se

tornado cada vez mais frequente em todas as populações, sobretudo no mundo

ocidental, sendo considerada a causa mais comum de hepatopatia crônica em

países industrializados. Estima-se que sua prevalência ao redor do mundo varia de

20% a 30% (80). No Brasil, não se conhece a prevalência de DHGNA, mas a de

esteatose, avaliada por ultrassonografia, está estimada em 18% (81). Kawuada et al.

(82) conduziram um estudo de 1.168 pacientes que se submeteram à ressecção

hepática por CHC e nesse grupo tiveram 8 casos de CHC que se desenvolveram em

fígados com EHNA, 6 dos quais (75%) em fígados sem cirrose. A média de idade no

momento da apresentação foi de 73 anos e todos os pacientes apresentavam pelo

menos uma doença metabólica incluindo obesidade, DM tipo 2, HAS ou

hiperlipidemia. No presente estudo, o perfil clínico dos pacientes tende a

acompanhar os dados da literatura, uma vez que houve uma maior prevalência de

homens (80%) e 30% dos indivíduos tinham mais de 60 anos.

Fonte: Boletim Epidemiológico Hepatites Virais. Agosto de 2016. Ministério da Saúde- Secretaria de Vigilância

em Saúde.

51

7. CONCLUSÕES

1. O infiltrado linfocitário tumoral presente nos CHCs originados em fígados cirróticos

e não cirróticos é composto predominantemente por linfócitos T;

2. No grupo 1 (CHCs originados em fígados cirróticos), o número médio de linfócitos

T CD4+ e linfócitos T CD8+ por campo de grande aumento que compõem o infiltrado

linfocitário tumoral foi muito semelhante;

3. No grupo 2 (CHCs originados em fígados não cirróticos), houve um leve

predomínio de linfócitos T CD4+ em relação aos linfócitos T CD8+. Contudo, essa

diferença não foi estatisticamente significativa;

4. Não houve diferença significativa entre a quantidade de linfócitos B, linfócitos T,

linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ presentes no infiltrado linfocitário tumoral de

CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos, muito provavelmente

refletindo o fato de que a ação do sistema imune no microambiente tumoral

independe da via da hepatocarcinogênese envolvida no caso;

5. Apesar do ambiente tolerogênico presente no CHC, evidenciou-se maior

imunogenicidade dos CHCs grau 2 em relação ao de grau 1 dentro do grupo dos

fígados não cirróticos, refletida pelo maior número de linfócitos T e B nos CHCs de

grau 2;

6. Não se evidenciou correlação significativa entre a intensidade de qualquer

subpopulação de linfócitos do infiltrado linfocitário tumoral e o tamanho dos tumores

nos dois grupos de estudo;

7. Não se evidenciou correlação significativa entre a intensidade de qualquer

subpopulação de linfócitos do infiltrado linfocitário tumoral e a presença de êmbolos

neoplásicos;

8. A existência de um ou mais fatores de risco para síndrome metabólica evidenciou-

se como o principal fator etiológico associado ao surgimento de CHC em fígados não

cirróticos.

52

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. McGlynn KA, Petrick JL, London WT. Global epidemiology of hepatocellular

carcinoma: an emphasis on demographic and regional variability. Clin Liver Dis.

2015;19(2):223-38.

2. Instituto Nacional de Cancer José Alencar Gomes da Silva. INCA - Instituto

Nacional de Câncer - Estimativa 2016 [Internet]. Rio de Janeiro: Instituto Nacional

de Cancer José Alencar Gomes da Silva; [atualizada em 2016; acesso em 16 de

abril de 2017]. Disponível em: http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/sintese-de-

resultados-comentarios.asp

3. Gomes MA, Priolli DG, Tralhão JG, Botelho MF. Carcinoma hepatocelular:

epidemiologia, biologia, diagnóstico e terapias. Rev Assoc Med Bras.

2013;59(5):514-24.

4. Ghouri YA, Mian I, Rowe JH. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology,

etiology, and carcinogenesis. J Carcinog. 2017;16:1.

5. Carrilho FJ, Kikuchi L, Branco F, Goncalves CS, Mattos AA. Clinical and

epidemiological aspects of hepatocellular carcinoma in Brazil. Clinics.

2010;65(12):1285-90.

6. Trevisani F, Frigerio M, Santi V, Grignaschi A, Bernardi M. Hepatocellular

carcinoma in non-cirrhotic liver: A reappraisal. Dig Liver Dis. 2010;42(5):341-7.

7. Schütte K, Schulz C, Poranzke J, Antweiler K, Bornschein J, Bretschneider T, et

al. Characterization and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma

(HCC) in the non-cirrhotic liver. BMC Gastroenterol. 2014;14:117.

8. Gaddikeri S, McNeeley MF, Wang CL, Bhargava P, Dighe MK, Yeh MMC, et al.

Hepatocellular carcinoma in the noncirrhotic liver. Am J Roentgenol.

2014;203(1):34-47.

9. Cholankeril G, Patel R, Khurana S, Satapathy SK. Hepatocellular carcinoma in

non-alcoholic steatohepatitis: Current knowledge and implications for

management. World J Hepatol. 2017;9(11):533-43.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McGlynn%20KA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25921660

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petrick%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25921660

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=London%20WT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25921660

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Global+epidemiology+of+hepatocellular+carcinoma%3A+an+emphasis+on+demographic+and+regional+variability+Katherine+A.+McGlynna%2C+Jessica+L.+Petricka%2C+and+W.+Thomas+LondonbaDivision

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cholankeril%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28469809

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Patel%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28469809

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khurana%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28469809

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Satapathy%20SK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28469809

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hepatocellular+carcinoma+in+non-alcoholic+steatohepatitis%3A+Current+knowledge+and+implications+for+management

53

10. Perumpail RB, Liu A, Wong RJ, Ahmed A, Harrison SA. Pathogenesis of

hepatocarcinogenesis in non-cirrhotic nonalcoholic fatty liver disease: Potential

mechanistic pathways.World J Hepatol. 2015;7(22):2384-8

11. Schulze K, Imbeaud S, Letouzé E, Alexandrov LB, Calderaro J, Rebouissou S, et

al. Exome sequencing of hepatocellular carcinomas identifies new mutational

signatures and potential therapeutic targets. Nature genetics. 2015;47(5):505-11.

12. Tu T, Bühler S, Bartenschlager R. Chronic viral hepatitis and its association with

liver cancer. Biol Chem. 2017;398(8):817-37.

13. Tsai W-L, Chung R. Viral hepatocarcinogenesis. Oncogene. 2010;29(16):2309-

24.

14. Liu S, Koh SSY, Lee CGL. Hepatitis B virus X protein and hepatocarcinogenesis.

Int J Mol Sci. 2016;17(6):940.

15. Sukowati CH, El-Khobar KE, Ie SI, Anfuso B, Muljono DH, Tiribelli C. Significance

of hepatitis virus infection in the oncogenic initiation of hepatocellular carcinoma.

World J Gastroenterol. 2016;22(4):1497-512.

16. Liu C-J, Chen B-F, Chen P-J, Lai M-Y, Huang W-L, Kao J-H, et al. Role of

hepatitis B virus precore/core promoter mutations and serum viral load on

noncirrhotic hepatocellular carcinoma: A case-control study. J Infect Dis.

2006;194(5):594-9.

17. El-Serag HB, Kanwal F, Richardson P, Kramer J. Risk of hepatocellular

carcinoma after sustained virological response in Veterans with hepatitis C virus

infection. Hepatology. 2016;64:130-7.

18. Toyoda H, Kumada T, Tada T, Kiriyama S, Tanikawa M, Hisanaga Y, et al. Risk

factors of hepatocellular carcinoma development in non-cirrhotic patients with

sustained virologic response for chronic hepatitis C virus infection. J Gastroenterol

Hepatol. 2015;30(7):1183-9.

19. Baffy G. Hepatocellular carcinoma in non-alcoholic fatty liver disease:

epidemiology, pathogenesis, and prevention. J Clin Transl Hepatol.2013;1(2):131-

7.

20. Hanahan D and Weinberg RA. The immune hallmarks of cancer. Cell.

2000;100:57-70.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26464753





https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu+C-J%2C+Chen+B-F%2C+Chen+P-J%2C+Lai+M-Y%2C+Huang+W-L%2C+Kao+J-H%2C+et+al.+Role+of+Hepatitis+B+Virus+Precore%2FCore+Promoter+Mutations+and+Serum+Viral+Load+on+Noncirrhotic+Hepatocellular+Carcinoma%3A+A+Case-Control+Study.



54

21. Hanahan D and Weinberg RA. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell.

2011;144(5):646-74.

22. Balkwill FR, Capasso M, Hagemann T. The tumor microenvironment at a glance.

J Cell Sci. 2012;125(23):5591-6.

23. Mbeunkui F, Johann DJ. Cancer and the tumor microenviroment: a review of an

essential relationship. 2010;63(4):571-82.

24. Joyce JA, Pollard JW. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev

Cancer. 2009;9(4):239-52.

25. Hanahan D and Coussens LM. Accessories to the crime: functions of cells

recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 2012;21(3):309-22.

26. Quail D, Joyce J. Microenvironmental regulation of tumor progression and

metastasis. Nat Med. 2013;19(11):1423-37.

27. Chen F, Zhuang X, Lin L, Yu P, Wang Y, Shi Y, et al. New horizons in tumor

microenvironment biology: challenges and opportunities. BMC Med. 2015;13:45.

28. Coussens LM and Werb Z. Inflammation and cancer. Nature.

2002;420(6917):860-7.

29. Balkwill F, Mantovani A. Inflammation and cancer: Back to Virchow? Lancet.

2001;357(9255):539-45.

30. Kim R, Emi M, Tanabe K. Cancer immunoediting from immune surveillance to

immune escape. Immunology. 2007;121(1):1-14.

31. Burnet M. Cancer - A Biological Approach: III. Viruses Associated with Neoplastic

Conditions. IV. Practical Applications. British Medical Journal. 1957;1(5023):841-

847.

32. Dadi S, Chhangawala S, Whitlock BM, Franklin RA, Luo CT, Oh SA, et al. Cancer

Immunosurveillance by Tissue-Resident Innate Lymphoid Cells and Innate-like T

Cells. Cell. 2016;164(3):365-77.

33. Boon T, Cerottini JC, Van den Eynde B, van der Bruggen P, Van Pel A. Tumor

antigens recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 1994;12:337-65.

34. Boon T, Coulie PG, Van den Eynde B. Tumor antigens recognized by T cells.

Immunol Today. 1997;18(6):267-8.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Joyce%20JA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19279573

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pollard%20JW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19279573

55

35. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annu

Rev Immunol. 2004;22(1):329-60.

36. Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. Cancer immunoediting: integrating immunity's

roles in cancer suppression and promotion. Science. 2011.25;331(6024):1565-70.

37. Vesely MD, Schreiber RD. Cancer immunoediting: Antigens, mechanisms, and

implications to cancer immunotherapy. Ann N Y Acad Sci. 2013;1284(1):1-5.

38. Stewart TJ, Abrams SI. How tumours escape mass destruction. Oncogene.

2008;27(45):5894-903.

39. Brambilla E, Le Teuff G, Marguet S, Lantuejoul S, Dunant A, Graziano S, et al.

Prognostic effect of tumor lymphocytic infiltration in resectable non-small-cell lung

cancer. J Clin Oncol. 2016;34(11):1223-30.

40. Mei Z, Liu Y, Liu C, Cui A, Liang Z, Wang G, et al. Tumour-infiltrating

inflammation and prognosis in colorectal cancer: systematic review and meta-

analysis. Br J Cancer. 2014;110(6):1595-605.

41. Zhang L, Conejo-Garcia JJR, Katsaros D, Gimotty PA, Massobrio M, Regnani G,

et al. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N

Engl J Med. 2003;348(3):203-13.

42. Ladányi A. Prognostic and predictive significance of immune cells infiltrating

cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2015;28(5):490-500.

43. Melichar B, Študentova H, Kalábová H, Vitásková D, Čermáková P, Hornychová

H, et al. Predictive and prognostic significance of tumor-infiltrating lymphocytes in

patients with breast cancer treated with neoadjuvant systemic therapy. Anticancer

Res. 2014;34(3):1115-25.

44. Dushyanthen S, Beavis PA, Savas P, Teo ZL, Zhou C, Mansour M, et al.

Relevance of tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer. BMC Med.

2015;13:202.

45. Gabrielson A, Wu Y, Wang H, Jiang J, Kallakury B, Gatalica Z, et al. Intratumoral

CD3 and CD8 T-cell densities associated with relapse-free survival in HCC.

Cancer Immunol Res. 2016;4(5):419-30.

46. Unitt E, Rushbrook SM. Marshall A, Davies S, Gibbs P et al. Compromised



56

lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma: the role of T-regulatory cells.

Hepatology. 2005;41(4):722-30.

47. Rabonivich H, Cohen R, Bruderman I, Steiner Z, Klajman A. Funcional analysis of

mononuclear cells infiltrating tumors: lysis of autologus human tumor cells by

cultures infiltrating lymphocytes. Cancer Research. 1987;47:173-7.

48. Zerbini A, Pilli M, Soliani P, Ziegler S, Pelosi G, Orlandini A et al. Ex vivo

characterization of tumor-derived melanoma antigen encoding gene-specific

CD8+cells in patients with hepatocellular carcinoma. J Hepatol.2004;40(1):102-9.

49. An JL, Ji QH, An JJ, Masuda S, Tsuneyama K. Clinicopathological analysis of

CD8-positive lymphocytes in the tumor parenchyma and stroma of hepatocellular

carcinoma. Oncol Lett. 2014;8(5):2284-90.

50. Brambilla E, Le Teuff G, Marguet S, Lantuejoul S, Dunant A, Graziano S, et al.

Prognostic effect of tumor lymphocytic infiltration in resectable non-small-cell lung

cancer. J Clin Oncol. 2016;34(11):1223-30.

51. Mei Z, Liu Y, Liu C, Cui A, Liang Z, Wang G, et al. Tumour-infiltrating

inflammation and prognosis in colorectal cancer: systematic review and meta-

analysis. Br J Cancer. 2014;110(6):1595-605.

52. Zhang L, Conejo-Garcia JJR, Katsaros D, Gimotty PA, Massobrio M, Regnani G,

et al. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N

Engl J Med. 2003;348(3):203-13.

53. Ladányi A. Prognostic and predictive significance of immune cells infiltrating

cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2015;28(5):490-500.

54. Melichar B, Študentova H, Kalábová H, Vitásková D, Čermáková P, Hornychová

H, et al. Predictive and prognostic significance of tumor-infiltrating lymphocytes in

patients with breast cancer treated with neoadjuvant systemic therapy. Anticancer

Res. 2014;34(3):1115-25.

55. Dushyanthen S, Beavis PA, Savas P, Teo ZL, Zhou C, Mansour M, et al.

Relevance of tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer. BMC Med.

2015;13:202.

56. Nakagawa S, Umezaki N, Yamao T, Kaida T, Okabe H, Mima K, et al. Survival

impact of lymphocyte infiltration into the tumor of hepatocellular carcinoma in




https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nakagawa%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28696046

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Umezaki%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28696046

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yamao%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28696046

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kaida%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28696046

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Okabe%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28696046

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mima%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28696046

57

hepatitis B virus-positive or non-B non-C patients who underwent curative resection.

Hepatol Res. 2017 Jul 11. doi: 10.1111/hepr.12936. Epub 2017 August 10.

57. Chew V, Tow C, Teo M, Wong HL, Chan J, Gehring A, et al. Inflammatory tumour

microenvironment is associated with superior survival in hepatocellular carcinoma

patients. J Hepatol. 2010;52(3):370-9.

58. Unitt E, Marshall A, Gelson W, Rushbrook SM, Davies S, Vowler SL, et al.

Tumour lymphocytic infiltrate and recurrence of hepatocellular carcinoma following

liver transplantation. J Hepatol. 2006;45(2):246-53.

59. Gao Q, Qiu SJ, Fan J, Zhou J, Wang XY, Xiao YS, et al. Intratumoral balance of

regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular

carcinoma after resection. J Clin Oncol. 2007;25(18):2586-93.

60. Rabonivich H, Cohen R, Bruderman I, Steiner Z w Klajman A. Funcional analysis

of mononuclear cells infiltrating tumors: lysis of autologus human tumor cells by

cultures infiltrating lymphocytes. Cancer Research. 1987;47:173-7.

61. Wada Y, Nakasshima O, Kutami R, Yamamoto O, Kojiro M. Clinicopathological

study on hepatocellular carcinoma with lymphocytic infiltration. Hepatology.

1998;27(2):407-14.

62. Shirabe K, Motomura T, Muto J, Toshima T, Matono R, Mano Y, et al. Tumor-

infiltrating lymphocytes and hepatocellular carcinoma: pathology and clinical

management. Int J Clin Oncol. 2010;15:552-58.

63. Garnelo M, Tan A, Her Z, Yeong J, Lim CJ. Interaction between tumour-infiltrating

B cells and T cells controls the progression of hepatocellular carcinoma. Gut.

2017;66(2):342-51.

64. Guo CL, Yang HC, Yang XH, Cheng W, Dong TX. Associations between

infiltrating lymphocyte subsets and hepatocellular carcinoma. Asian Pacific J

Cancer Prev. 2012;13(11):5909-13.

65. Kawata A, Une Y, Hosokawa M, Uchino J, Kobaiashi H. Tumor-infiltrating

lymphocytes and prognosis of hepatocellular carcinoma. Jpn J Clin Oncol.

1992;1:256-63.

66. Ng IO, Lai EC, Fan ST, Ng MM, So MK. Prognostic significance of pathologic

features of hepatocellular carcinoma. A multivariate analysis of 278 patients.


58

Cancer. 1995;76(12):2443-8.

67. Pang YL, Zhang HG, Peng JR, Pang XW, Yu S, Xing Q, et al. The

immunosuppressive tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma. Cancer

Immunol Immunother. 2009;58(6):877-86.

68. Takeuchi Y, Nishikawa H. Roles of regulatory T cells in cancer immunity. Int

Immunol. 2016;28(8):401-9.

69. Amin MB, Edge S, Greene F, Byrd DR, Brookland RK, Washington MK et al.

AJCC Cancer Staging Manual. 8th edition. New York, NY: Springer; 2017.

70. Cacciato Insilla A, Faviana P, Pollina LE, De Simone P, Coletti L, Filipponi F, et

al. Lymphoepithelioma-like hepatocellular carcinoma: Case report and review of

the literature. World J Gastroenterol.2015;21(36):10468-74.

71. Chan AW, Tong JH, Pan Y, Chan SL, Wong GL, Wong VW, et al.

Lymphoepithelioma-like hepatocellular carcinoma: an uncommon variant of

hepatocellular carcinoma with favorable outcome. Am J Surg Pathol.

2015;39(3):304-12.

72. Omata M, Cheng A-L, Kokudo N, Kudo M, Lee JM, Jia J et al. Asia-Pacific clinical

practice guidelines on the management of hepatocellular carcinoma: a 2017

update. Hepatology Int. 2017;11(4):317-70.

73. Liu D, Staveley-O'Carroll KF, Li G. Immune-based therapy clinical trials in

hepatocellular carcinoma. J Clin Cell Immunol. 2015;6(6):1-12.

74. Immunotherapy: Using the immune system to treat cancer. Bethesda (MD):

National Institute of Health. [atualizado em 14 de setembro de 2015; acesso em

16 de abril de 2017]. Disponível em:

www.cancer.gov/research/areas/treatment/immunotherapy-using-immune-system.

75. Pardee AD, Butterfield LH. Immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Unique

challenges and clinical opportunities. Oncoimmunology. 2012;1(1):48-55.

76. El-Khoueiry AB, Sangro B, Yau T, Crocenzi TS, Kudo M, Hsu C, et al. Nivolumab

in patients with advanced hepatocellular carcinoma (Check Mate 040): an open-

label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial. Lancet.

2017;389(10088):2492-502.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4579894/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chan%20AW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25675010

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tong%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25675010

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pan%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25675010

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chan%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25675010

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wong%20GL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25675010

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wong%20VW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25675010


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kudo%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28620797

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28620797

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jia%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28620797



http://www.cancer.gov/research/areas/treatment/immunotherapy-using-immune-system.%2075

http://www.cancer.gov/research/areas/treatment/immunotherapy-using-immune-system.%2075

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Immunotherapy+of+hepatocellular+carcinoma+Unique+challenges+and+clinical+opportunities




59

77. IST-AIDS Hepatites Virais. Departamento de Vigilância, Prevenção e controle das

IST, do HIV/AIDS e das Hepatites Virais [Internet]. Brasília: Ministério da Saúde;

[Atualizado em 13 de março de 2017; acesso em 16 de maio de 2017]. Disponível

em: http://www.aids.gov.br/pagina/hepatite-c.

78. Boletim Epidemiológico Hepatites Virais [Internet]. Brasília: Ministério da Saúde-

Secretaria de Vigilância em Saúde- Departamento de Vigilância, Prevenção e

Controle das DST, AIDS e Hepatites Virais; [Atualizado em 05 de agosto de 2016;

acesso em 15 de maio de 2017]. Disponível em:

http://www.aids.gov.br/sites/default/files/anexos/publicacao/2016/59121/boletim_h

epatites_05_08_2016_pdf_96185.pdf

79. Farrell GC, Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis.

Hepatology. 2006;43(2 Suppl 1):S99-S112.

80. Williams CD, Stengel J, Asike MI, Torres DM, Shaw J, Contreras M, et al.

Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis

among a largely middle-aged population utilizing ultrasound and liver biopsy: a

prospective study. Gastroenterology. 2011;140(1):124-31.

81. Parise ER, Salgado AL, Secaf R, Cerri L, Cerri G. Prevalence of liver steatosis in

abdominal ultrasound. GED. 2003;22:235-7.

82. Kawada N, Imanaka K, Kawaguchi T, et al. Hepatocellular carcinoma arising from

non-cirrhotic nonalcoholic steatohepatitis. J Gastroenterol. 2009;44(12):1190-4.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Farrell%20GC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16447287

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Larter%20CZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16447287


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Williams%20CD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20858492

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stengel%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20858492

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Asike%20MI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20858492

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Torres%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20858492

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shaw%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20858492

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Contreras%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20858492


60

9. ANEXOS

9.1. Anexo 1: Protocolo de realização da técnica imuno-histoquímica do

Laboratório de Imuno-histoquímica de Pós-graduação do Departamento de

Anatomia Patológica da Unicamp

1ª ETAPA: Desparafinização

1) Mergulhar as lâminas no Xilol I, Xilol II e Xilol III por 10 minutos cada em

temperatura ambiente;

2) Álcool absoluto I, II, III, 80%, 50% em temperatura ambiente. Fazer

várias lavagens de aproximadamente 30 segundos cada;

2) Lavar em água corrente (5 minutos) e passar água destilada;

3) No caso de cortes congelados, fixar antes do bloqueio com 2 lavagens de 20

segundos em acetona;

4) Bloqueio de peroxidase endógena: Incubar com 3 banhos de imersão de 5

minutos cada à temperatura ambiente. H2O2 10 volumes;

5) Lavagem em água corrente e destilada (5 minutos);

6) Colocar em panela a vapor em tampão tris-EDTA pH 8,9 por 30 minutos a 95ºC

ou tampão citrato pH 6,0; Dependendo do marcador usa-se pepsina a 4%;

7) Deixar esfriar por no mínimo 15 minutos;

8) Lavar por 5 minutos em água destilada;

9) Deixar as lâminas mergulhadas em PBS;

10) Secar as lâminas com papel filtro, tomando cuidado para não danificar o

fragmento;

11) Pingar os anticorpos primários específicos, previamente diluídos em BSA

(Albumina Bovina). Incubar em câmara úmida durante 30 minutos a 37ºC.

Verificar se para o marcador não é necessário 1 hora e à temperatura ambiente;

12) Colocar na geladeira overnight.

2ª ETAPA: Coloração

13) Retirar as lâminas da incubação com o anticorpo primário e fazer 3 lavagens em

PBS à temperatura ambiente com duração de 5 minutos cada;

14) Secar com papel de filtro e pingar o sistema de visualização:

61

Envision , Envision Plus 1 hora a 37°C,

NovoLink é utilizado em 2 etapas de 30 minutos cada (primeiro o

vermelho e depois o roxinho), lavando em PBS por 3 a 5 minutos entre um

e outro;

Advance Cada etapa, incubar por 30 minutos à temperatura ambiente

(primeiro amarelo e depois o marrom);

15) Usar DAB líquido na proporção de 1 ml do tampão DAB para 1 gota do

cromógeno. Homogeneizar e pingar sobre os cortes até que comece corar, então

mergulhe a lâmina em água destilada fresca.

16) Lavar em água corrente e passar água destilada;

17) Contracorar com hematoxilina de Mayer;

18) Passar por alguns segundos em água amoniacal;

19) Lavar em água destilada;

20) Desidratar, diafanizar e montar com Entellan®.

62

9.2. Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Ciências Médicas da UNICAMP

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...