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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

THALITA FERNANDA ARAUJO

ESTUDOS FENOTÍPICOS DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Leishmania infantum

CAMPINAS

2019

THALITA FERNANDA ARAUJO

ESTUDOS FENOTÍPICOS DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Leishmania infantum

Dissertação apresentada ao Instituto

de Biologia da Universidade Estadual

de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra

em Biologia Animal na área de Relações

Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELA ALUNA THALITA FERNANDA ARAUJO

E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SELMA GIORGIO

Orientadora: SELMA GIORGIO

CAMPINAS

2019

Campinas, 24 de maio de 2019.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Selma Giorgio (orientadora)

Prof. Dr. Carlos Emilio Levy

Profa. Dra. Adriana Degrossoli

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se

encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a minha mãe (in memoriam), ao meu pai (in memoriam), e minha

família que sempre me apoiaram.

“Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes,

mas não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo.

E que posso evitar que ela vá à falência. Ser feliz é reconhecer que vale a pena

viver, apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de crise. Ser feliz é

deixar de ser vítima dos problemas e se tornar autor da própria história. É atravessar

desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da sua alma.

É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos

próprios sentimentos. É saber falar de si mesmo. É ter coragem para ouvir um “não”.

É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta”.

Augusto Cury

AGRADECIMENTOS

A Deus, que me fortalece todos os dias.

Agradeço a CAPES, sendo que o presente trabalho foi realizado com apoio da

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) -

Código de Financiamento 001.

À Profa. Dra. Selma Giorgio, que me deu a oportunidade de estar desempenhando

esse projeto, ensinando e orientando com dedicação e incentivo.

À minha família e amigos que me apoiaram nessa jornada em busca de uma

realização profissional, e que em tantos momentos de dificuldade ficaram ao meu lado

encorajando-me para não desistir.

Aos meus colegas de laboratório que tanto me ensinaram, ajudaram e tornaram os

dias mais leves e divertidos.

Aos colaborados desse trabalho pelo material fornecido e pela parceria nos

experimentos.

Aos funcionários do departamento de Biologia Animal e do Laboratório de Doenças

Tropicais pela ajuda no que foi possível.

A essa banca examinadora e suplentes.

Aos animais que foram utilizados nesse trabalho, meu respeito e gratidão.

RESUMO

A leishmaniose visceral no Brasil é uma doença causada pelo protozoário Leishmania

infantum, afetando o homem e o cão. Os cães infectados são apontados como o

principal reservatório de L. infantum em áreas urbanas. Devido às pressões seletivas

distintas sofridas pelos isolados de L. infantum podem ocorrer diferentes fenótipos do

parasita. A existência desses diferentes fenótipos terá consequências na resistência

aos fármacos, infectividade e patogenicidade. Nesse trabalho isolamos dois parasitas

provenientes de casos de leishmaniose visceral de paciente humano do Hospital das

Clínicas da UNICAMP e de cão proveniente da Superintendência de Controle de

Endemias – SP, identificamos as espécies, comparamos a morfologia dos

promastigotas, capacidade proliferativa e infectiva, e susceptibilidade a fármacos

desses isolados clínicos para a análise do perfil fenotípico. Através da metodologia da

PCR mostrou-se que os dois isolados clínicos de Leishmania, pertencem a mesma

espécie (L. infantum). Como parasita referência de todos os ensaios, utilizamos a L.

infantum MHOM/BR/1972/LD proveniente de caso clínico humano. Na comparação

morfológica do tamanho dos promastigotas não observamos diferenças significativas

entre os isolados clínicos e o parasita referência. Nos ensaios de infectividade,

macrófagos de origem humana da linhagem THP1 e canina da linhagem DH82 foram

infectados nas proporções macrófago:parasita, 1:10 e 1:20, no período de 24 e 48

horas, e camundongos BALB/c foram inoculados com 2x106 promastigotas. Os

resultados indicaram que os isolados clínicos e o parasita referência infectam

macrófagos humano e canino, observando-se formas amastigotas intracelulares.

Camundongos BALB/c foram igualmente infectados, analisados pela histopatologia e

carga parasitária. Não há diferença significativa entre os isolados clínicos e o parasita

referência no padrão histopatológico e de carga parasitária. Em relação a

susceptibilidade aos fármacos analisada no modelo in vitro concluímos que os

parasitas são igualmente susceptíveis a anfotericina B, miltefosina e ao antimoniato

de meglumina.

Palavras-chave: Leishmania infantum, leishmaniose visceral, leishmaniose visceral

canina.

ABSTRACT

Visceral leishmaniasis in Brazil is a disease caused by the protozoan Leishmania

infantum, infecting man and dog. The infected dogs are designated as the main

reservoir of L. infantum in urban areas. Due to the different selective pressures of L.

infantum isolates, different parasite phenotypes may occur. The existence of these

different phenotypes will have consequences on drug resistance, infectivity and

pathogenicity. In this work, we isolated two parasites from cases of visceral

leishmaniasis one of them was isolated from a human patient of the Clinicals Hospital

of UNICAMP and another clinical isolate was obtained from a dog of Endemics Control

Superintendence - SP, identified the species, compared the morphology of

promastigotes, proliferative and infective capacity, and susceptibility to drugs of these

clinical isolates for the analysis of the phenotypic profile. With the methodology of the

PCR it was shown that the two clinical isolates of Leishmania are L. infantum. As a

reference parasite of all the trials, we used L. infantum MHOM/BR/1972/LD from a

human clinical case. In the morphological comparison of promastigote size, we did not

observe significant differences between clinical isolates and reference parasite. In the

infectivity assays, human macrophages THP1 and canine macrophages DH82 were

infected in the macrophage:parasite, 1:10 and 1:20 ratios in the 24 and 48 hour period,

and BALB/c mice were inoculated with 2x106 promastigotes. The results indicated that

the clinical isolates and the reference parasite infect human and canine macrophages,

observing intracellular amastigote forms. BALB/c mice were also infected, analyzed by

histopathology and parasite load. Was evaluated no significant difference between

clinical isolates and the reference parasite in the histopathological and parasitic load

pattern. Regarding drug susceptibility, we conclude that the parasites are similarly

susceptible to drugs used (amphotericin B, miltefosine and meglumine antimoniate).

Key words: Leishmania infantum, visceral leishmaniasis, canine visceral

leishmaniasis.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11

1.1. Histórico ....................................................................................................... 11

1.2. Ciclo de vida ................................................................................................. 11

1.3. Leishmanioses ............................................................................................. 13

1.4. Leishmaniose Visceral ................................................................................. 14

1.5. Leishmaniose visceral humana .................................................................... 16

1.6. Leishmaniose visceral canina ...................................................................... 17

1.7. Medidas profiláticas e tratamento ................................................................ 18

1.8. Isolados clínicos de L. infantum ................................................................... 20

2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 23

3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 24

3.1. Objetivo Geral .............................................................................................. 24

3.2. Objetivos específicos ................................................................................... 24

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 25

4.1. Camundongos .............................................................................................. 25

4.2. Parasitas ...................................................................................................... 25

4.3. Isolados clínicos ........................................................................................... 25

4.4. Linhagens celulares ..................................................................................... 26

4.5. Análise por PCR dos isolados clínicos ......................................................... 27

4.6. Manutenção in vitro e congelamento de L. infantum .................................... 27

4.7. Ensaio de proliferação dos promastigotas ................................................... 28

4.8. Análise morfométrica dos promastigotas ..................................................... 28

4.9. Ensaio e monitoramento da infecção dos macrófagos com L. infantum ...... 28

4.10. Testes com fármacos ................................................................................... 29

4.11. Infecção de camundongos com L. infantum ................................................. 30

4.12. Análise histopatológica ................................................................................. 30

4.13. Análise da carga parasitária ......................................................................... 30

4.14. Análise estatística ........................................................................................ 31

5. RESULTADOS ................................................................................................... 32

5.1. Isolados clínicos ........................................................................................... 32

5.2. Identificação dos isolados clínicos ............................................................... 33

5.3. Curva de proliferação celular dos promastigotas de L. infantum .................. 34

5.4. Medidas de promastigotas de L. infantum e L. amazonensis ....................... 35

5.5. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em macrófagos. ... 36

5.6. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em camundongo. ... 44

5.7. Susceptibilidade dos isolados clínicos aos fármacos anti-Leishmania ........ 48

DISCUSSÃO ............................................................................................................. 59

CONCLUSÃO ............................................................................................................ 66

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 67

ANEXOS ................................................................................................................... 81

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. Histórico

Os parasitas Leishmania pertencem ao Reino Protista (Haeckel, 1866), Classe

Kinetoplastea (Honigberg, 1963 emend. Vickerman, 1976), Subclasse

Metakinetoplastina (Vickerman, 2004), Ordem Trypanosomatida (Kent, 1880), Família

Trypanosomatidae (Döflein, 1901), Subfamília Leishmaniinae (Maslov e Lukeš 2012)

e Gênero Leishmania (Ross, 1903) (AKHOUNDI et al., 2016).

Na literatura existem relatos da existência de espécies semelhantes a

Leishmania em tempos pré-históricos e documentada em dois fósseis de

invertebrados, que apresentavam as formas promastigotas e amastigotas do parasita

(STEVERDING, 2017). A primeira observação da Leishmania foi feita por Cunnignham

em 1885. O parasito foi identificado no início do século XX, quando William Leishman

encontrou o protozoário no baço de um soldado indiano e Donovan, em 1903, foi o

responsável pela primeira publicação. Em 1903, Ross criou o gênero Leishmania e

denominou Leishmania donovani o agente causador do calazar (do indostão, Kala-

azar, onde kala significa negro, e azar, doença). No Brasil, o primeiro a relatar a

doença e a suspeitar do papel dos flebotomíneos como vetores foi Cerqueira em 1885,

na Bahia (GONTIJO; CARVALHO, 2003). A espécie foi descrita como Leishmania

infantum por Nicole (1908) e Cunha e Chagas (1937) descreveram a espécie

Leishmania chagasi como causadora da leishmaniose visceral na América. De acordo

com Mauricio; Stothard; Miles (2000), pesquisas moleculares comprovam que L.

chagasi e L. infantum são sinonímias.

1.2. Ciclo de vida

O ciclo de vida da Leishmania é classificado como heteróxeno, necessitando

de hospedeiros vertebrado e invertebrado. O protozoário apresenta dois estágios:

promastigotas, com corpo alongado e flagelo, são móveis e encontrados no interior

12

do trato digestivo dos flebotomíneos; e amastigotas, que tem forma arredondada, sem

flagelo e vivem intracelularmente em células do sistema fagocitário mononuclear do

hospedeiro vertebrado, tais como os macrófagos (PACE, 2014).

Os hospedeiros vertebrados são infectados, quando fêmeas dos flebotomíneos

inoculam promastigotas metacíclicos, forma infectante, localizadas na parte anterior

do tubo digestivo, durante o repasto sanguíneo. Ocorre o processo de internalização

dos parasitas pelos macrófagos, ficando localizados dentro de um vacúolo

parasitóforo (HARHAY et al., 2011).

Em um período de 24 a 48 horas, os promastigotas se transformam em

amastigotas e se iniciam sucessivas multiplicações. Quando a célula hospedeira não

é capaz de realizar um controle parasitário, pode sofrer apoptose, e com sua ruptura,

há liberação dos amastigotas que são internalizados por outros macrófagos, causando

sua distribuição pelo organismo (RODRIGUES et al., 2016; PAGLIANO; ESPOSITO,

2017).

A infecção do hospedeiro invertebrado, o flebótomo, ocorre no momento do

repasto sanguíneo, ao ingerir formas amastigotas que acompanham o sangue e/ou

linfa contendo macrófagos oriundos, sobretudo, da pele. No intestino do inseto

ocorrerá a transformação dos amastigotas em promastigotas e com aproximadamente

três a quatro dias ocorre multiplicação intensa. Estes se diferenciam em promastigotas

metacíclicas, que são infectantes e se localizam na parte anterior do tubo digestivo do

vetor dando continuidade ao ciclo (HARHAY et al., 2011; VAN GRIENSVEN; DIRO,

2012) (Figura 1).

13

Figura 1. Ciclo de vida de Leishmania spp. (1) Picadas do vetor flebotomíneos durante o repasto

sanguíneo no reservatório inoculam as formas promastigotas do parasita. (2) Promastigotas se aderem

aos macrófagos. (3) Promastigotas são fagocitados por macrófagos. (4) Promastigotas são

transformados em amastigotas dentro do vacúolo parasitóforo. (5) Proliferação dos amastigotas dentro

do vacúolo parasitóforo. (6) Lise do macrófago e liberação dos amastigotas. (7) Invasão dos

amastigotas em células de vários tecidos. (8) Infecção dos flebótomos do sangue infectado, ingerindo

células infectadas com formas amastigotas. (9) Amastigotas são transformados em formas

promastigotas procíclicos no intestino médio. (10) Divisão e transformação em formas promastigotas

metacíclicos e migração para a probóscide (adaptado de ORTEGA; GIORGIO; PAULA, 2017).

1.3. Leishmanioses

As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas de grande importância

mundial, afetando humanos e animais (PAGLIANO; ESPOSITO, 2017). Há registros

das doenças em 98 países da Europa, África, Ásia e América. Mas, cerca de 90% dos

novos casos ocorrem em apenas 13 países: Afeganistão, Argélia, Bangladesh,

Bolívia, Brasil, Colômbia, Etiópia, Índia, Irã, Peru, Sudão do Sul, Sudão e Síria

(STEVERDING, 2017).

As leishmanioses se manifestam principalmente em três formas: leishmaniose

cutânea, mucocutânea ou visceral (SAVOIA, 2015). No Brasil, as principais espécies

são L. amazonensis, L. braziliensis, e L. guyanensis, que causam a leishmaniose

tegumentar. Outras espécies como L. naiffi, L. shawi, L. lansoni e L. lindenberg

também foram notificadas, mas o maior número de casos da forma cutânea e muco-

14

cutânea atribui-se à L. braziliensis (GURUNG; KANNEGANTIL, 2015; OPAS/OMS,

2018).

A forma mais grave e fatal da doença é a visceral resultando em infecção

sistêmica, acometendo a maioria dos órgãos internos como baço, fígado e medula

óssea (KHADEM; UZONNA, 2014).

Nas regiões da África Oriental, Bangladesh, Índia e Nepal, é causada por L.

donovani, sendo a transmissão antroponótica, forma mais comum, sem a presença

de reservatórios. Na bacia do mediterrâneo, China, Oriente Médio e na América do

Sul, é uma doença zoonótica, causada por L. infantum, e apresenta o cão doméstico

como principal reservatório devido à sua suscetibilidade à infecção e ao alto

parasitismo cutâneo. No ambiente silvestre, no Brasil, o reservatório natural da doença

é a raposa (Vulpes vulpes). Todavia, diversas espécies já foram relatadas com

infecção, como lobo guará (Chrysocyon brachyurus), raposa-do-campo (Lycalopex

vetulus) e cachorro-vinagre (Speothos venaticus), além de outros mamíferos como

marsupiais (Didelphis albiventris e D. marsupialis) e gato doméstico (Felis catus)

(FONSECA et al., 2014; MILLÁN; FERROGLIO; SOLANO-GALLEGO, 2014; SOUZA,

et al., 2010).

Enquanto L. infantum afeta predominantemente crianças e indivíduos

imunocomprometidos, a L. donovani tende a afetar todas as faixas etárias

(PAGLIANO; ESPOSITO, 2017; VAN GRIENSVEN; DIRO, 2012).

1.4. Leishmaniose Visceral

A leishmaniose visceral era uma zoonose eminentemente rural e recentemente

vem se expandindo para áreas urbanas. Os principais fatores, observados

atualmente, relacionados à incidência e endemicidade elevada de leishmaniose

visceral humana (LV) e leishmaniose visceral canina (LVC), são: a diminuição de

populações de animais silvestres reservatórios do vetor L. longipalpis, ocasionada

pelo intenso desmatamento, colocando o homem e cão mais acessíveis ao vetor; a

adaptação do vetor as áreas urbanas (HARHAY et al., 2011) (Figura 2), além de

15

alterações climáticas, intensa urbanização, mobilizações de tropas militares,

refugiados e trabalhadores sazonais (STEVERDING, 2017).

Figura 2. Vetor da L. infantum, o flebotomíneo Lutzomyia sp.

Leishmaniose visceral e a LVC são importantes problemas de saúde pública

em vários países. Aproximadamente 350 milhões de pessoas vivem em áreas

caracterizadas pela transmissão ativa de leishmaniose, com 14 milhões de pessoas

diretamente afetadas pela doença (SAVOIA, 2015). Nos casos em que há

desenvolvimento da doença, cerca de 20.000 a 30.000 morrerão caso não tratados

(NOLI; SARIDOMICHELAKIS, 2014; STEVERDING, 2017). No período de 2001-2016

foram reportados 55.530 casos humanos de LV nas Américas (OPAS/OMS, 2018).

Os primeiros casos de LV no Brasil foram relatados nas regiões Nordeste e

Norte por volta de 1930. Surgiram novos focos expandidos de áreas endêmicas,

porém há registros de transmissão autóctone em mais de 1.200 municípios do país.

Atualmente registra-se mais de 3.000 casos anuais, em humanos, no Brasil, com

distribuição que vai desde o norte da Amazônia até o sul da fronteira com o Paraguai,

e a região Centro-Oeste. No entanto, a doença persiste predominantemente no

Nordeste (MARZOCHI, 2016; WERNECK, 2010).

Desde a década de 1970, os estados de Minas Gerais e do Espírito Santo, no

Sudeste do Brasil, são áreas endêmicas com registros de casos de LV. No estado do

Rio de Janeiro, a doença apareceu no final dos anos 1970 no bairro de Bangu, situado

na Zona Oeste. Desde os anos 80, a LV tornou-se urbanizada em as áreas

16

metropolitanas de Teresina, Belo Horizonte e Montes Claros, e isso foi seguido na

década de 1990 pelos municípios no oeste do Estado de São Paulo. Em particular,

Araçatuba e Bauru foram afetados, e estes têm relações comerciais estreitas com os

municípios endêmicos do Estado do Mato Grosso do Sul, Campo Grande e Três

Lagoas, na região Centro-Oeste (MARZOCHI, 2016).

Entre 1999 e 2013, foram notificados 2.324 casos e 200 óbitos por LV em São

Paulo, concentrados em cinco regiões de saúde e com 80 municípios afetados,

correspondendo, respectivamente, à incidência e mortalidade de 2,8 casos e 0,2

óbitos por 100 mil habitantes-ano e à letalidade de 8,6%. Dos casos notificados, 97,4%

ocorreram na área urbana e 2,4% na rural respectivamente (CARDIM et al., 2016).

1.5. Leishmaniose visceral humana

A LV é uma doença crônica, sistêmica e caracterizada por febre de longa

duração, perda de peso, anemia, entre outras manifestações. O parasita apresenta

tropismo acentuado pelo sistema fagocítico mononuclear do baço, fígado, medula

óssea e tecidos linfoides, mas outros órgãos e tecidos podem ser afetados, como

intestino, sangue, pulmões, rins e pele. Nas fases mais avançadas basicamente

encontra-se o parasita em todos os órgãos (NOLI; SARIDOMICHELAKIS, 2014;

RODRIGUES et al., 2016). Quando não tratada, pode evoluir para óbito em mais de

90% dos casos. A LV tem incidência e letalidade altas principalmente em indivíduos

não tratados, crianças desnutridas e é emergente em indivíduos portadores do vírus

da imunodeficiência adquirida (GONTIJO; MELO, 2004; VAN GRIENSVEN; DIRO,

2012).

A resposta imune protetora, e que controla a infecção na maioria das espécies

de Leishmania, inclusive a L. infantum, é mediada por células Th1. Macrófagos

infectados e outras células apresentadoras de antígenos apresentam antígenos de

Leishmania aos linfócitos T tipo CD4+. Esses linfócitos Th1 produzem IL-12 e IFN-γ

associado na produção de citocinas pró-inflamatórias e a ativação de macrófagos

infectados, para a produção de NO (óxido nítrico) e ROI (Oxigênio

intermediário reativo). Durante a resposta Th2, ainda não muito bem definida, há

17

produção de IL-4 associada estimulação de plasmócitos para produção anticorpos

anti-Leishmania. Na LV os macrófagos são incapazes de destruir os amastigotas. Em

pacientes infectados observa-se aumento dos níveis de IL-10, que em sinergismo com

a IL-4 parece ser fundamental no desenvolvimento da doença, pois essas citocinas

são capazes de inibir a ação dos macrófagos (RODRIGUES et al., 2016; KHADEM;

UZONNA, 2014).

1.6. Leishmaniose visceral canina

A infecção de cães pela L. infantum é caracterizada por diferentes

manifestações clínicas, variando da forma assintomática e subclínica a casos

sintomáticos e severos, que levam ao óbito. Os diferentes quadros da LVC

desencadeiam alterações hematológicas e bioquímicas séricas como aumento na

produção imunoglobulinas e a formação de complexos imunes solúveis, além de

alterações histológicas de órgãos linfoides. Os principais sintomas da LVC são: lesões

cutâneas pelo corpo, conjuntivites crônicas, sangramento de mucosa nasal,

hemorragias e onicogrifose (PALATNIK-DE-SOUSA, 2012; PETERSEN; BARR,

2009).

O mecanismo que direciona a resposta imune dos cães não é bem conhecido,

mas acredita-se que é semelhante ao descrito na LV humana, sendo que os linfócitos

T têm papel fundamental na imunidade à leishmaniose, por influenciar a produção de

citocinas pró-inflamatórias e interagir com os macrófagos infectados. No entanto,

parece que fatores como raça, imunossupressão e estado nutricional podem

influenciar no resultado da infecção. Da mesma forma, a presença de coinfecções

com outros patógenos ou infecções prévias parecem estar associadas com

aumento dos sinais clínico-patológicos agravando a doença (MORENO et al., 2012;

HOSEIN; BLAKE; SOLANO-GALLEGO, 2016).

A prevalência da LVC é menos estudada, mas estima-se que afete milhões de

cães e está presente em aproximadamente 50 países, principalmente na Ásia,

Europa, Norte da África, América do sul e é considerada uma doença emergente na

América do Norte. Inquéritos epidemiológicos indicam 2,5 milhões de cães infectados

com L. infantum no sul da Europa, soroprevalência de 2-25% em áreas endêmicas

18

europeias, e 1,9-35% no Brasil (ROATT et al., 2014; LINS et al., 2018; CAMPINO;

MAIA, 2018). Estudos epidemiológicos em Belo Horizonte - MG, área endêmica de

leishmaniose, realizados com o método do PCR (Reação em cadeia da polimerase)

demonstram que cerca de um quarto dos cães soronegativos estavam infectados com

L. infantum (COURA-VITAL et al., 2011), sugerindo que o número de cães

parasitados é subestimado.

Desde 2007 vêm sendo registrados casos importados de LV canina no

município de Campinas - SP, oriundos de várias regiões. A partir de 2009, casos

autóctones começaram a ser diagnosticados no Distrito de Sousas. No biênio 2016-

2017, foram notificados oito casos importados e 25 autóctones de LV canina.

Levantamentos entomológicos identificaram a presença do vetor L. longipalpis, na

cidade de Campinas, nos distritos de Sousas e Joaquim Egídio, em um ponto do bairro

Fogueteiro, na divisa com Indaiatuba, e em um ponto na divisa com Monte Mor

(DEVISA, 2018).

1.7. Medidas profiláticas e tratamento

As medidas profiláticas e de controle da LV, considerando-se o complexo ciclo

de transmissão, a natureza zoonótica da infecção, as distintas características

epidemiológicas das áreas geográficas endêmicas, a escassez de dados relacionados

à distribuição, a frequência da LVC e o custo das estratégias de controle, são muitas

vezes de difícil implementação. A Organização Mundial da Saúde até recentemente,

recomendava o tratamento de pacientes humanos, o uso de inseticidas em

habitações, a remoção e eutanásia de cães soropositivos (PALATINK-DE-SOUSA,

2012; WHO, 2011; OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013).

O antimoniato de meglumina (Glucantime®) é o fármaco de primeira linha

utilizado no Brasil para tratamento das leishmanioses humanas. Possui um esquema

terapêutico prolongado e apresenta muitas reações adversas. O composto age

inibindo enzimas do parasita relacionadas à oxidação de ácidos graxos e glicólise,

resultando na depleção dos níveis de ATP intracelular. A forma tóxica para os

parasitas é o antimônio trivalente (Sb3+), formado pela redução da forma pentavalente

(Sb5+) no interior do parasita, e capaz de interferir no metabolismo dos tióis

19

(FREITAS-JUNIOR et al., 2012). Os antimoniais são empregados no tratamento das

leishmanioses desde 1945 e casos de resistência vem sendo relatados há vários anos

(MESQUITA; TEMPONE; REIMÃO, 2014).

A miltefosina pertence à classe das alquilfosfocolinas, que são ésteres de

fosfocolina de álcoois alifáticos de cadeia longa, originalmente foi desenvolvida contra

o câncer. Do ponto de vista funcional, é considerada um inibidor da Akt, também

conhecida como proteína quinase B, importante na via de sinalização intracelular. Foi

o primeiro fármaco oral do mercado e está registrada para tratamento de LV na Índia,

devido à resistência causada pelo tratamento da LV com antimoniais no continente, e

na Alemanha. Na Colômbia é usada no tratamento da leishmaniose cutânea (DORLO

et al., 2012; MONDELAERS et al., 2016).

A anfotericina B (AmB), é um antibiótico poliênico produzido naturalmente pelo

actinomiceto Streptomyces nodosus. Inicialmente era usado no tratamento das

infecções fúngicas, mas hoje é prescrito no tratamento da leishmaniose em

associação com outros fármacos, ou como primeira escolha onde há resistência de

antimoniais. Formulações lipídica e lipossomal de AmB estão disponíveis. A

seletividade da anfotericina B contra a Leishmania é devida a maior afinidade do

fármaco com o esterol, predominante nas membranas do parasita, do que com o

colesterol predominante em células de mamíferos. Ocorre a alteração da

permeabilidade da membrana provocando extravasamento dos componentes

intracelulares. Outros compostos anti-Leishmania usados contra a doença são:

alopurinol, puromomicina, sitamaquina, pentamidina dentre outros que ainda estão em

estudo (SEIFERT, 2011).

Em relação aos cães com LVC, os fármacos disponíveis para o tratamento são:

alopurinol, aminosidina, anfotericina B, antimoniais pentavalentes e estibogluconato

de sódio (RIBEIRO et al., 2018). No Brasil, a situação é complexa. Em 2008, a portaria

interministerial proibiu a utilização de produtos de uso humano ou não registrados no

tratamento de cães infectados, mas em 2013 a portaria foi derrubada, permitindo-se

o tratamento dos cães. Apesar de controverso, o tratamento de LVC é defendido por

diversos autores que consideram não apenas necessário para a sobrevida dos

animais e a melhora de suas condições gerais, mas também para reduzir a carga

20

parasitária e a probabilidade de transmissão (OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013;

ROATT et al., 2014).

De acordo com a Nota Técnica Conjunta n° 001/2016 MAPA/MS, assinada pelo

Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento e pelo Ministério da Saúde foi

autorizado o registro do produto Milteforan® indicado para o tratamento da LVC, uma

vez que a miltefosina, princípio ativo do medicamento em questão, não é uma droga

utilizada para o tratamento da doença em humanos no Brasil. É necessário seguir o

protocolo de tratamento descrito na rotulagem do produto, avaliação periódica de um

Médico Veterinário para o controle da carga parasitária, tempo de tratamento e uso

de coleira repelente (SBTM, 2016).

O controle dos cães pela eutanásia é matéria de discussão, pois enquanto

alguns estudos indicam que as campanhas de remoção e eutanásia têm efeitos

positivos na prevenção da LV (NUNES et al., 2010), outras avaliações apontam para

efeitos pouco significativos dessa estratégia na profilaxia (PALATNIK-DE-SOUSA,

2012). No mercado há vacinas comerciais disponíveis para a LVC, mas o Ministério

da Saúde não as reconhece como medida de controle, devido à baixa eficácia

protetora, 68 a 71%. Vacinas e medicamentos anti-Leishmania estão constantemente

sendo testados para melhoria na proteção e combate à doença (OTRANTO, DANTAS-

TORRES, 2013; RIBEIRO et al., 2018).

1.8. Isolados clínicos de L. infantum

A importância de preservar e estudar os isolados clínicos de um parasita reside

no fato de que populações de parasitas encontradas em humanos e animais sofrem

pressões seletivas distintas que devem gerar diferentes fenótipos de resistência aos

fármacos, virulência e patogenicidade (CARNIELLI et al., 2018).

Existe uma necessidade prática de diferenciar e caracterizar as populações de

parasitas para diagnóstico, tratamento e controle da doença, além da importância

desses estudos para a taxonomia. Há inúmeros relatos do isolamento de parasitas em

animais e humanos. A maioria dos estudos relaciona-se a análise do material genético

dos isolados clínicos, para a pesquisa de polimorfismo genético inter e intraespecífico.

Por exemplo, Teixeira (2017) realizou sequências genômicas de 20 isolados de L.

21

infantum coletados no nordeste do Brasil, comparando-as entre si e com as

sequências genômicas disponíveis de 29 isolados de L. infantum e L. donovani do

Nepal e Turquia. Foram coletadas amostras de sangue e medula óssea de humanos

e cães, lesão cutânea de humano e baço de cães. Vinte sequências genômicas

apresentam 99,95% de semelhança entre si. No geral, as análises não sugerem

variantes de sequências individuais responsáveis por diferenças no resultado clínico

ou na adaptação de diferentes hospedeiros. E, Carnielli et al. (2018) identificaram

marcadores moleculares que predizem falha no tratamento da LV com miltefosina,

uma vez que o fármaco tem sido usado com sucesso no tratamento na Índia, mas sem

sucesso para LV em ensaio clínico no Brasil. Uma forte associação foi identificada

(p=0,0005) entre a presença de um lócus de sensibilidade (LSM) a miltefosina

geneticamente estável em L. infantum e uma resposta positiva ao tratamento com

miltefosina. O risco de falha do tratamento aumentou 9,4 vezes quando um isolado

não tinha o LSM. O LSM foi encontrado nos genomas de todos os isolados

sequenciados de L. infantum e L. donovani (n = 671), onde a miltefosina pode ter uma

taxa de cura superior a 93%.

Análises da infectividade, comportamento em cultura e susceptibilidade a

fármacos são menos frequentes (SERIN et al., 2005). Mas alguns trabalhos

apresentam dados interessantes, como por exemplo, Nunes (2018), que realizou

caracterização molecular de HSP70, mpi e ITS1 de amostras de 29 isolados de L.

infantum de medula óssea de cães naturalmente infectados das cidades de

Divinópolis, Pará de Minas e Brumadinho, localizados nas regiões centro-oeste e

central do estado de Minas Gerais, respectivamente. A análise das sequências de

nucleotídeos do parasito demonstrou uma homogeneidade muito alta das amostras.

Nas regiões endêmicas estudadas, os parasitas são genotipicamente indistinguíveis.

Os estudos dos isolados de cães são mais escassos. Análises genéticas de

isolados clínicos de cães e humanos infectados com L. infantum, da região

metropolitana de Belo Horizonte - MG foram publicadas recentemente (SILVA et al.,

2015).

Em relação às análises da infectividade, comportamento em cultura axênica e

susceptibilidade a fármacos também há poucos estudos no Brasil. Por exemplo,

Alcolea et al. (2016) isolaram promastigotas resistentes ao óxido nítrico (NO) através

22

de análise proteômica de isolados de cães infectados com L. infantum syn. L. chagasi

do centro de controle de zoonose da cidade de Aracajú, estado de Sergipe – Brasil.

Concluíram que promastigotas resistentes ao NO são mais infecciosas do que as

sensíveis ao NO. Entre as regiões diferencialmente abundantes, 40 proteínas podem

ser identificadas com sucesso na linhagem sensível e 38 em promastigotas

resistentes.

Na literatura, há pesquisas de isolados clínicos de outras espécies de

Leishmania, por exemplo, Silva Junior et al. (2015), que avaliaram a metaciclogênese

in vitro de isolados de pacientes humanos de L. braziliensis e L. amazonensis

utilizando critérios como tamanho da promastigota (análise morfométrica e citometria

de fluxo), curva de crescimento, modificações de superfície (perda de ligação de

lectina ou de anticorpo monoclonal (mAb), resistência ao complemento) e infectividade

em macrófagos humanos. Os resultados mostraram que, ao utilizar diferentes técnicas

para avaliar diferentes aspectos da metaciclogênese (aspectos morfológicos e

bioquímicos), diferentes porcentagens de promastigotas metacíclicos podem ser

detectadas em cada cultura isolada.

23

2. JUSTIFICATIVA

A principal justificativa para esse estudo fenotípico de parasitas é de que o

conhecimento de características fenotípicas, tais como morfometria, proliferação de

diferentes isolados clínicos diagnosticados na região de Campinas - SP, contribuirá

para o monitoramento da infectividade e da resposta aos fármacos de parasitas

circulando em diferentes ecótopos. Faz-se necessário também o estudo dos isolados,

uma vez que a LV é uma zoonose afetando humanos e animais hospedeiros, os quais

podem exercer diferentes pressões seletivas no parasita.

O Hospital das Clínicas da UNICAMP é um centro de referência em diversas

especialidades médicas, recebendo pacientes de cidades do Estado de São Paulo. A

Divisão de Patologia Clínica é responsável pelos serviços pré e pós-analítico da área

de parasitologia clínica, e realiza exames parasitológicos, entre eles, o diagnóstico

etiológico de leishmanioses. Com a colaboração da Sucen (Superintendência de

Controle de Endemias) tem sido possível o diagnóstico de cães com LVC.

Nos últimos anos, nosso laboratório tem auxiliado na análise de material de

pacientes com suspeita de LV, leishmaniose tegumentar e LVC. Nesse trabalho

avaliamos isolados clínicos de casos de LV e LVC.

24

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Análise do perfil fenotípico de isolados clínicos de L. infantum diagnosticados

na região de Campinas – SP.

3.2. Objetivos específicos

• Identificação da espécie de Leishmania dos isolados clínicos pelo método de

PCR.

• Análise morfométrica dos promastigotas.

• Análise dos promastigotas mantidos em meio de cultivo quanto a capacidade

de proliferação.

• Análise da capacidade dos promastigotas de infectar macrófagos de linhagens

humana e canina.

• Análise dos parasitas quanto a susceptibilidade aos fármacos usados na

clínica.

• Análise da capacidade de promastigotas de infectar camundongos BALB/c.

25

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Camundongos

Os animais utilizados foram camundongos fêmeas da linhagem BALB/c de 4

semanas de idade fornecidas pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP). Os camundongos

foram ambientados durante duas semanas antes dos experimentos no Biotério do

Laboratório de Doenças Tropicais do Instituto de Biologia/UNICAMP. Todos os

ensaios foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais

CEUA/UNICAMP (Protocolo N° 4710-1, 9 de novembro de 2017).

4.2. Parasitas

O parasita L. infantum (MHOM/BR/1972/LD) foi mantido na forma promastigota

em meio Schneider (SIGMA-ALDRICH) contendo 0,1% de gentamicina, 10% de soro

fetal bovino (SFB) e 5% de urina humana a 26°C, e usado como parasita referência

dos experimentos. O parasita L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) e L. braziliensis

(MHOM/BR/00/BA788) foram mantidos em meio RPMI-1640 (SIGMA-ALDRICH)

contendo 0,1% de gentamicina e 10% de SFB. As respectivas espécies são mantidas

in vivo mediante passagens sucessivas em camundongos BALB/c.

4.3. Isolados clínicos

As amostras de biópsia foram coletadas no Hospital das Clínicas da UNICAMP

e encaminhadas a Divisão de Patologia Clínica, para diagnóstico diferencial de outras

patologias. Após esses procedimentos essas amostras foram enviadas ao nosso

laboratório onde foram cultivadas em meios de culturas. Os promastigotas desses

isolados clínicos estão congelados nos tanques de nitrogênio líquido do Departamento

de Biologia Animal do Instituto de Biologia da UNICAMP.

26

Um dos isolados clínicos (isolado humano) foi obtido da amostra de punção de

medula óssea e linfonodo de paciente humano, feminino, 8 anos, atendido no HC da

Unicamp no ano de 2014, apresentando hepatoesplenomegalia e pancitopenia. O

paciente só iniciou o tratamento com Glucantime® e Anfotericina B lipossomal após o

resultado positivo para LV no exame direto, cultura e PCR. Os promastigotas obtidos

da cultura desse isolado foram imediatamente congelados em DMSO

(Dimetilsulfóxido) e SFB em freezer a -80ºC e transferidos para nitrogênio líquido após

24 horas. O segundo isolado clínico foi obtido da punção de medula óssea e linfonodo

de cão diagnosticado com LVC pelo teste sorológico ELISA, recolhido pelo Serviço

Regional de Campinas SR-05 (Sucen – SP) no ano de 2014, após eutanásia. Os

promastigotas obtidos da cultura desse isolado foram imediatamente congelados em

DMSO e SFB em freezer a -80ºC e transferidos para nitrogênio líquido após 24 horas.

E, um terceiro isolado clínico foi obtido da punção de medula óssea e linfonodo de cão

do município de Valinhos - SP, recolhido pela Sucen – SP no ano de 2017,

apresentando os seguintes sintomas: descamação e úlcera de pele, onicogrifose,

emagrecimento e aumento de linfonodo. O teste sorológico ELISA foi positivo para

LVC e o cão foi eutanasiado. Amostras de baço e fígado recebidas em solução salina

foram posteriormente fixadas em formol 10% por 24 horas e mantidas em álcool 70%.

O processamento histológico (inclusão em parafina, micrometria com cortes de 5 µm

e coloração com hematoxilina/eosina) foi realizado no Serviço de Soluções em

Anatomia Patológica, Histocell, São Paulo, SP.

4.4. Linhagens celulares

A linhagem THP1 (Homo sapiens) foi isolada do sangue de uma criança de um

ano de idade, com leucemia monocítica aguda (TSUCHIYA et al., 1980). As células

foram cultivadas em meio RPMI-1640 (SIGMA-ALDRICH) com 2 mM de L-glutamina,

1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 4,5 g/L de glicose, 10mM de HEPES (4-(2-hidroxietil)-

1-piperazino-etossulfónico), 1,0 mM de piruvato de sódio, 0,05 mM de 2-

mercaptoetanol e 10% SFB em estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2 balanceado,

a 37ºC. A diferenciação monocítica de células THP-1 em macrófagos foi induzida com

27

13-acetato de forbol-12-miristato (PMA - SIGMA-ALDRICH) durante 48 horas (SHIO

et al., 2015). A linhagem DH82 foi estabelecida a partir de células progenitoras

neoplásicas de histiocitose maligna canina (Canis familiaris) de um Golden Retriever

masculino de dez anos (WELLMAN et al., 1988), e foi cultivada em Dulbecco's

Modified Eagle's Medium (DMEM - NUTRICELL) suplementado com 1% aminoácidos

não essenciais, 2 mM L-glutamine, 1 mM piruvato de sódio, 1,5 g/L bicabornato de

sódio, 1.0 g/L glucose e 10% de SFB em estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2

balanceado, a 37°C. As subculturas da DH82 são preparadas tratando-se células com

0,25% de tripsina/0,03% de solução de EDTA a 37°C (SIGMA-ALDRICH)

(LORKOWSKI, 2011). As linhagens são provenientes do Banco de Células da

Universidade Federal do Rio de Janeiro (ATCC nacional).

4.5. Análise por PCR dos isolados clínicos

O DNA de promastigotas foi extraído usando-se o kit QIAamp® DNA Mini, de

acordo com as instruções do fabricante. As amostras de DNA foram quantificadas

usando Thermo Scientific NanoDrop 2000c. As amplificações do gene foram

realizadas com o par de iniciadores RV1 (5´-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3´) e

RV2 (5´-CACCTGGCCTATTTTACACCA-3´) específico para a espécie L. infantum

como citado por Costa et al. (2014). Os componentes da PCR consistem em 40,5 µL

de água Milli-Q, 5µL de tampão, 1 µL dNTP’s, 1µL de primer RV1, 1µL de primer RV2,

0,5 µL deTaq polimerase e 1µL de DNA. O mix foi colocado no termociclador Veriti

TM96-Well Thermal Cycler – Applied Biosystems. Os ciclos foram de 94°C – 5

minutos, 29 ciclos de: 94°C - 30 segundos, 60°C – 30 segundos, 72°C – 30 segundos

e extensão final de 72°C - 5 minutos. Para a análise dos produtos da PCR, foi realizada

a eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE (tris base, ácido bórico e

EDTA).

4.6. Manutenção in vitro e congelamento de L. infantum

Os parasitos são cultivados em número de 2x105 promastigotas/mL em 5 mL

de meio Schneider em frasco de cultura de 25 cm2 e incubados em estufa a 26°C. Os

28

parasitos são mantidos em cultura por no máximo 7 dias e depois são congelados em

nitrogênio líquido com 90% SFB e a adição de 10% do crioprotetor DMSO.

4.7. Ensaio de proliferação dos promastigotas

Os promastigotas foram cultivados em 5 mL de meio Schneider em frascos de

25 cm2 e incubados a 26°C durante 10 dias sem renovação do meio. Amostras da

suspensão foram retiradas diariamente e fixadas em solução de formaldeído 0,1% e

Tampão fosfato salino (PBS). Os promastigotas foram contados em câmara de

Neubauer em microscópio óptico (Zeiss® Primo star Axiocam) em aumento de 400x.

Os experimentos foram realizados em triplicata.

4.8. Análise morfométrica dos promastigotas

O volume de 10 µL contendo 5x105 parasitas foi colocado em orifícios de

lâminas de imunofluorescência (GlassTécnica - SP). As lâminas foram secas em

temperatura ambiente e coradas com Giemsa. As fotos foram realizadas no programa

de obtenção de imagens, Axio-vision 4,3 (Zeiss®) em microscópio óptico (Zeiss®

Primo star Axiocam) em aumento de 1000x. As imagens foram analisadas utilizando

o software Image J (Atlanta, GA, USA). O tamanho do corpo celular e o comprimento

do flagelo foram medidos em 100 parasitas de cada isolado (SILVA JUNIOR et al.,

2015).

4.9. Ensaio e monitoramento da infecção dos macrófagos com L. infantum

Os ensaios foram realizados utilizando-se linhagens de macrófagos THP1 e

DH82 e promastigotas de L. infantum. Cerca de 5x104 macrófagos/0,4mL foram

plaqueados em lâminas de 8 poços (Lab-TekChamber Slide w/Cover Permanox Slide

Sterile). Para a detecção de células viáveis foi utilizado o corante azul de tripan

(SIGMA-ALDRICH). As proporções célula:parasita utilizadas foram 1:10 e 1:20.

As células THP1, previamente diferenciadas com PMA (subitem 4.4 de

materiais e métodos) foram plaqueadas com meio RPMI-1640 suplementado com

10% de SFB, infectadas com os promastigotas e incubadas durante 24 e 48 horas em

29

estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2 balanceado a 37ºC. Os macrófagos DH82

foram plaqueados com meio DMEM suplementado de 10% de SFB e incubados em

estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2 balanceado, a 37ºC durante 3 horas. Após

esse período, foram lavados com PBS, infectados com os promastigotas e incubados

por mais 24 e 48 horas.

Para a avaliação da infecção as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS,

fixadas com metanol por 10 minutos e coradas com Giemsa diluído em solução de 1M

de tampão fosfato, pH 7,0, na proporção Giemsa:solução tampão 1:20 v/v por 3

minutos. Após a secagem em temperatura ambiente, as lâminas foram examinadas

em microscópio óptico no aumento de 1000X. Duzentas células, por poço, foram

avaliadas quanto ao número de células infectadas e o número de amastigotas

intracelulares. Os experimentos foram repetidos no mínimo duas vezes (MORAES et

al., 2018; TERREROS et al., 2017).

4.10. Testes com fármacos

Os fármacos utilizados foram: o Glucantime® (antimoniato de meglumina,

Sanofi Aventis, 300 mg/mL), Anfotericina B® (anfotericina B, Sigma-Aldrich, 1g) e

Miltefosine® (miltefosina, Cayman Chemical Company, 500mg). Anfotericina B e

miltefosina foram dissolvidas em DMSO, conforme as instruções dos fabricantes, e

depois diluídas em meio de cultura adequado para cada linhagem celular. O cálculo

do Glucantime® foi baseado do conteúdo do antimônio pentavalente (Sb+5). Um ml

do antimoniato de meglumina usado nos testes contém 81 mg de Sb+5 (Massa

molecular do antimoniato de meglumina: 365,97 g/mol), concentrações usadas nos

ensaios segundo Terrenos (2016). O tratamento das células foi realizado após a

infecção das mesmas (item 4.9 de materiais e métodos). As culturas de macrófagos

após 24 horas de infecção foram lavadas com PBS, e os fármacos foram adicionados.

As culturas celulares foram mantidas por 48 horas. Após a secagem em temperatura

ambiente e coloração com Giemsa, as lâminas foram examinadas em microscópio

óptico no aumento de 1000X. Duzentas células, por poço, foram avaliadas quanto ao

número total de células, células infectadas, número de amastigotas intracelulares e

analisado a viabilidade celular. Para a análise da viabilidade celular foram contadas

30

células de 20 campos por poço. Os experimentos realizados em triplicata foram

repetidos no mínimo duas vezes.

4.11. Infecção de camundongos com L. infantum

Os camundongos foram infectados com 2x106 promastigotas via

intraperitoneal. Após 2 meses do inóculo de infecção os camundongos foram

eutanasiados por deslocamento cervical para remoção de medula óssea, baço e

fígado para realizarmos as análises histopatológicas e carga parasitária (MORAES et

al., 2018).

4.12. Análise histopatológica

Amostras do fígado e baço dos camundongos foram fixadas em formol 10% por

24 horas e transferidas para o álcool 70% e enviados para histopatologia. Os cortes

dos tecidos tinham espessura de 5 µm e foram corados com Hematoxilina e Eosina

(OLIVEIRA et al., 2017; MORAES et al., 2018). (Histocell Soluções em Anatomia

Patológica, São Paulo – SP). As fotos foram realizadas no programa de obtenção de

imagens, Axio-vision 4,3 Zeiss® em microscópio óptico (Zeiss® Primo star Axiocam)

em aumento de 400x e 1000x.

4.13. Análise da carga parasitária

Para análise da carga parasitária, baço e fígado dos camundongos foram

pesados e homogeneizados em meio Schneider. A medula óssea foi retirada do osso

fêmur, com a lavagem (3 vezes) do canal medular com meio Schneider. Os

homogeneizados dos tecidos foram diluídos em séries de 1:4 em duplicata em placas

96-wells e mantidas a 26ºC durante 10 dias. Mediante o uso de microscópio invertido

foram avaliados os poços quanto a presença de promastigotas e estimado o número

de parasitas por mL de tecido (medula óssea) e mg de tecido (baço e fígado) (BUFFET

et al., 1995). Para a detecção de promastigotas na medula óssea e no baço 1 mL dos

homogeneizados foram colocados em placas de 6-wells contendo 5 ml de meio

Schneider e mantidos a 26ºC por até 10 dias.

31

4.14. Análise estatística

O teste estatístico utilizado foi ANOVA do pacote estatístico GraphPad Prism

7.0, com um nível de significância estabelecido como p<0,05.

32

5. RESULTADOS

5.1. Isolados clínicos

Os dois isolados clínicos utilizados nesse estudo foram obtidos de humano e

cão, e estavam congelados até a realização dos experimentos. Um terceiro isolado

clínico foi obtido durante o período de execução desse trabalho. Recebemos da

SUCEN – SP materiais de biópsia (baço e fígado) e punção (medula óssea e

linfonodo) de cão diagnosticado com LVC na região de Valinhos – SP. Esses materiais

biológicos foram cultivados em meio de cultura Schneider a 26ºC. Após 24 horas

foram observados promastigotas nas culturas de linfonodo e medula óssea. Porém, o

frasco com material de linfonodo apresentou contaminação com bactérias e foi

descartada. Após 48 horas, os promastigotas observados em frasco com material de

medula óssea não sobreviveram, o que não possibilitou a expansão e congelamento

do isolado clínico. As análises histopatológicas de baço e fígado do cão são mostradas

na Figura 3. Observa-se desorganização tecidual em ambos os tecidos, sem infiltrado

inflamatório, mas com intensa vacuolização celular e presença de amastigotas

intracelulares.

Figura 3. Histopatologia de fígado (A) e baço (B) de cão diagnosticado com leishmaniose visceral

canina. As setas indicam formas amastigotas.

33

5.2. Identificação dos isolados clínicos

Com o objetivo de identificar a espécie dos isolados clínicos realizamos o

ensaio da PCR. A Figura 4 representa o produto da extração de DNA de promastigotas

dos isolados clínicos, parasita referência e L. braziliensis (MHOM/BR/00/BA788). Os

valores mensurados de DNA extraído das amostras de L. infantum

(MHOM/BR/1972/LD), isolado humano, isolado de cão e L. braziliensis foram 42,1

ng/µL, 75,5 ng/µL, 36,1 ng/µL e 24,3 ng/µL, respectivamente. De acordo com esses

valores a qualidade do DNA estava adequada para a realização da PCR.

Figura 4. Produtos da extração de DNA de promastigotas. Marcador de 1200pb (M). Isolados clínicos

de humano (1) e cão (2). Parasita referência (3). L. braziliensis (MHOM/BR/00/BA788) (4). Controle

negativo água (5).

Os resultados da amplificação do DNA dos isolados clínicos com os iniciadores

RV1/RV2 de L. infantum estão apresentados na Figura 5. Os isolados clínicos

avaliados foram positivos para a espécie L. infantum, assim como o parasita

referência. Como esperado, não ocorreu à amplificação do DNA de promastigotas de

L. braziliensis.

Figura 5. Produtos de amplificação da PCR com os iniciadores RV1/RV2. Marcador de 148pb (M).

Isolados clínicos de humano (1) e cão (2). Parasita referência (3). L. braziliensis (MHOM/BR/00/BA788)

(4). Controle negativo água (5).

34

5.3. Curva de proliferação celular dos promastigotas de L. infantum

As curvas de proliferação dos promastigotas do parasita referência e dos

isolados clínicos foram realizadas para compararmos o comportamento dos parasitas

em cultura. Na Figura 6 observa-se que o número de promastigotas aumenta

exponencialmente até o dia 5 atingindo o pico de proliferação (± 170x106

parasitas/mL) nas culturas dos dois isolados. O número de parasitas é reduzido

gradativamente, até o dia 10 (14x106 parasitas/mL em isolado de cão e 8x106

parasitas/mL em isolado humano). Para o parasita referência o pico de proliferação é

observado no dia 7 (190x106 parasitas/mL) e o número de parasitas é reduzido

gradativamente, até o dia 10 (49x106 parasitas/mL). Não há diferença significativa

entre as curvas de proliferação dos dois isolados clínicos e do parasita referência.

Figura 6. Curvas de proliferação de promastigotas de L. infantum (MHOM/BR/1972/LD) e dos isolados

clínicos. Cerca de 2x105 promastigotas/mL foram cultivados em meio Schneider contendo 10% de soro

fetal bovino, 5% de urina, 0,1% de gentamicina, e mantidos em frasco de cultura de 25cm2 incubados

a 26°C. Os promastigotas foram contados em câmara de Neubauer durante 10 dias consecutivos.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5

6

7

8

9

Dias

Pro

ma

sti

go

tas

(L

og

10 c

élu

las

/mL

)

Isolado de Cão

Isolado Humano

Parasira referência

35

5.4. Medidas de promastigotas de L. infantum e L. amazonensis

Com o objetivo de avaliar se há diferenças morfológicas entre os isolados

clínicos, parasita referência e L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) analisamos o

tamanho dos promastigotas. Na Figura 7, observamos as médias das medidas do

comprimento do corpo celular do parasita referência, isolado de cão, isolado humano

e L. amazonensis, que são, 8,09 μm ± 1,9, 7,76 μm ± 1,5, 8,57 μm ± 1,9 e 9,48 μm ±

2,19 respectivamente; e as médias das medidas do comprimento do flagelo do

parasita referência, isolado de cão e isolado humano, que são 8,5 μm ± 1,9, 7,52 μm

± 1,5, 8,6 μm ± 1,8 e 11,67 μm ± 2,55, respectivamente.

Figura 7. Medidas do comprimento (μm) do corpo celular e flagelo de promastigotas de L. infantum e

L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269).

Na figura 8, observamos a média do comprimento celular total (corpo+flagelo)

de promastigotas do parasita referência, isolado de cão, isolado humano e L.

corpo flagelo corpo flagelo corpo flagelo corpo flagelo

0

5

10

15

20

Ta

ma

nh

o (

m)

Parasita referência

Isolado de cão

Isolado humano

L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269)

36

amazonensis, que são 16,55μm ±3,04, 15,27μm ±2,12, 17,21 μm ±3,03 e 21,15μm

±3,68, respectivamente. Quando consideramos o comprimento total, corpo celular e

flagelo, não detectamos diferença significativa entre os quatro parasitas analisados,

apesar da observação de vários indivíduos menores na população de promastigotas

do cão e vários indivíduos maiores na população de promastigotas da L. amazonensis.

Figura 8. Medidas do comprimento (μm) total de promastigotas de L. infantum e L. amazonensis

(MHOM/BR/73/M2269).

5.5. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em macrófagos.

Os objetivos desses ensaios foram avaliar e comparar a capacidade infectiva

dos isolados clínicos e parasita referência. Para tanto, usamos macrófagos humano

THP1 e canino DH82. Nos ensaios de infecção, realizados no período de 24 e 48

horas, foi usada a forma promastigota do parasita e testadas as razões macrófago:

parasita 1:10 e 1:20.

Quando os macrófagos THP1, previamente diferenciados foram infectados com

promastigotas do parasita referência, isolado de cão e isolado humano, as

porcentagens de células infectadas foram de 29,0%, 26,0% e 24,0%, respectivamente

0

10

20

30

40

Ta

ma

nh

o (

m)


Isolado de cão

Isolado humano

L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269)

37

e os números de amastigotas por macrófago foram de 2,46, 2,47 e 2,44 na proporção

1:10 em 24 horas. Após 48 horas de infecção, as porcentagens de células infectadas

com o parasita referência, isolado de cão e isolado humano foram de 24,0%, 23,0% e

22,0%, respectivamente, e os números de amastigotas por macrófago foram de 2,47,

2,27 e 2,37 (Figura 9).

Parasita referência Isolado de cão Isolado humano

0

10

20

30

40

0

1

2

3

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:1

0)

24

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção

nº de amastigotas/macrófago

A


0

10

20

30

0

1

2

3

4

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:1

0)

48

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção


B

Figura 9. Infectividade in vitro de macrófagos THP1. Porcentagem de infecção e número de

amastigotas por macrófagos infectados com promastigotas de L. infantum na proporção 1:10 durante

24 (A) e 48 (B) horas.

38

Os macrófagos THP1 infectados com o parasita referência, isolado de cão e

isolado humano na proporção 1:20 obtiveram as porcentagens de células infectadas

de 42,0%, 38,0% e 35,0%, respectivamente, e os números de amastigotas por

macrófago foram de 3,77, 3,88 e 3,80 em 24 horas. Após 48 horas, as porcentagens

de células infectadas com o parasita referência, isolado de cão e isolado humano

foram de 39,0%, 36,0% e 35,0%, e os números de amastigotas por macrófago foram

de 3,68, 3,33 e 3,29, respectivamente (Figura 10).


0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

5

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:2

0)

24

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção

nº amastigotas/macrófago

A


0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

5

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:2

0)

48

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção

nº amastigotas/macrófago

B

Figura 10. Infectividade in vitro de macrófagos THP1. Porcentagem de infecção e número de


24 (A) e 48 (B) horas.

39

Com o objetivo de verificar a capacidade infectiva dos isolados clínicos e do

parasita referência em outro tipo de macrófago utilizamos macrófagos de linhagem

canina DH82 que foram infectados utilizando-se protocolo semelhante ao utilizado

com macrófagos THP1.

Quando os macrófagos DH82 foram infectados com promastigotas do parasita

referência, isolado de cão e isolado humano as porcentagens de células infectadas

foram de 29,0%, 24,5% e 24%, respectivamente, e os números de amastigotas por

macrófago foram de 2,39, 2,49 e 2,56 na proporção 1:10 em 24 horas. Após 48 horas

de infecção, as porcentagens de células infectadas com o parasita referência, isolado

de cão e isolado humano foram de 28,0%, 24,0% e 25,0%, respectivamente, e os

números de amastigotas por macrófago foram de 2,67, 2,42 e 2,59, respectivamente

(Figura11).


0

10

20

30

40

0

1

2

3

4

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:1

0)

24

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção


A

40


0

10

20

30

40

0

1

2

3

4%

de

in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:1

0)

48

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção


B

Figura 11. Infectividade in vitro de macrófagos DH82. Porcentagem de infecção e número de


24 (A) e 48 (B) horas.

Os macrófagos DH82 infectados na proporção 1:20 com o parasita referência,

isolado de cão e isolado humano obtiveram as porcentagens de infecção de 43,0%,

36,0%e 36,0%, respectivamente e os números de amastigotas por macrófago foram

de 3,56, 3,62 e 3,68 em 24 horas. Após 48 horas, as porcentagens de células

infectadas com o parasita referência, isolado de cão e isolado humano foram de

41,0%, 36,0% e 35,0%, e os números de amastigotas por macrófago foram de 3,40,

3,23 e 3,45, respectivamente (Figura 12).

41


0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

5

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:2

0)

24

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção


A


0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

% d

e in

fec

çã

o

ma

cró

fag

o:p

rom

as

tig

ota

s (

1:2

0)

48

ho

ras

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

acró

fag

o

% de infecção


B

Figura 12. Infectividade in vitro de macrófagos DH82. Porcentagem de infecção e número de


24 (A) e 48 (B) horas.

Os resultados indicam que os promastigotas dos isolados clínicos e do parasita

referência são infectantes para os macrófagos humano e canino. Não há diferença

significativa entre as porcentagens de infecção dos macrófagos e os números de

amastigotas intracelulares em culturas infectadas com os dois isolados clínicos e

parasita referência nos períodos de 24 e 48 horas de infecção.

42

Avaliamos também a morfologia dos macrófagos infectados com o parasita

referência e os isolados clínicos. Observa-se na Figura 13, fotos representativas de

macrófagos THP1 sem infecção. Eles possuem aspecto normal, isto é, formato oval

e/ou fusiforme com núcleo excêntrico e espraiados na lamínula. Os macrófagos

infectados com L. infantum do isolado humano nas proporções 1:10 e 1:20, as 24 e

48 horas de infecção apresentam-se ovais, núcleo excêntrico, hipertróficos,

vacuolizados e com formas amastigotas intracelulares.

Figura 13. Micrografias de macrófagos THP1 sem infecção (A) e infectados com amastigotas

intracelulares de L. infantum do isolado humano na proporção 1:10 as 24 horas (B) e 48 horas (C), na

proporção 1:20 as 24 horas (D) e 48 horas (E) de infecção. As setas indicam amastigotas intracelulares.

A morfologia dos macrófagos DH82 infectados com o parasita referência e os

isolados clínicos também foi analisada. Observa-se na Figura 14, fotos

43

representativas dos macrófagos sem infecção que têm formato oval a circular e núcleo

localizado excentricamente. E, macrófagos infectados com o isolado clínico humano

nas proporções 1:10 e 1:20, as 24 e 48 horas de infecção. Os macrófagos

apresentam-se ovais, núcleo excêntrico, hipertróficos, vacuolizados e com formas

amastigotas intracelulares.

Figura 14. Micrografias de macrófagos DH82 sem infecção (A) e infectados com amastigotas

intracelulares de L. infantum do isolado humano na proporção 1:10 as 24 horas (B) e 48 horas (C), na

proporção 1:20 as 24 horas (D) e 48 horas (E) de infecção. As setas indicam amastigotas intracelulares.

44

5.6. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em

camundongo.

Com o objetivo de avaliar a capacidade infectiva dos isolados clínicos in vivo,

foram usadas formas promastigotas para infectar camundongos BALB/c. Os animais

após 3 semanas do inóculo foram eutanasiados e a pesagem, a análise

histopatológica e a avaliação da carga parasitária dos órgãos foram realizadas.

Os pesos de baço e fígado de camundongos infectados com o parasita

referência e isolados clínicos foram comparados com os pesos de baço e fígado de

camundongos não infectados (controle). Os dados mostrados na Figura 15 indicam

que não há diferença significativa nos pesos dos baços de animais infectados em

relação ao grupo controle. Porém, os pesos dos fígados dos animais infectados

apresentam diferença significativa em relação ao grupo controle.

Figura 15. Peso de órgãos de animais infectados com L. infantum. Camundongos BALB/c foram

infectados com promastigotas do parasita referência, isolado de cão e isolado humano. Após 3

semanas do inóculo foram eutanasiados e os baços e fígados foram pesados. Grupo controle:

camundongos não infectados. Foram usados grupos de camundongos com n=3. Os asteriscos (*)

indicam os pesos que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o grupo controle (teste

ANOVA, p>0,05).

Controle Parasita referência Isolado cão Isolado humano

0

500

1000

1500

2000

2500

Pe

so

(m

g)

Baço

Fígado

*

* *

45

Para a análise histológica, baços e fígados de camundongos BALB/c infectados

e não infectados foram processados em parafina e coradas com hematoxilina e

eosina. Os baços de camundongos não infectados apresentam vascularização assim

como a estrutura do órgão preservados, sem aspecto hipertrófico e vacuolizado das

células. Nos baços de animais infectados com o parasita referência, isolado de cão e

isolado humano observam-se granulomas, presença de infiltrado de células

inflamatórias, além de tecido conjuntivo fibroso, desorganização das células com

aspecto hipertrófico e vacuolizado. Não foram observadas formas amastigotas

intracelulares (Figura 16).

Figura 16. Histologia de baços de camundongo não infectado (A) infectado com L. infantum do parasita

referência (B), isolado de cão (C) e isolado humano (D). Células hipertróficas e vascularizadas (seta

preta). Granulomas (*).

Os fígados de camundongos não infectados apresentam a vascularização e

estrutura do órgão preservados, sem o aspecto hipertrófico e vacuolizado das células

46

notados em animais infectados. Nos fígados dos animais infectados com o parasita

referência, isolado de cão e isolado humano observam-se a presença de infiltrados de

células inflamatórias, desorganização tecidual com células de aspecto hipertrófico e

vacuolizado. Não foram observadas formas amastigotas intracelulares (Figura 17).

Figura 17. Histologia de fígados de camundongo não infectado (A) infectado com L. infantum do

parasita referência (B), isolado de cão (C) e isolado humano (D). Células hipertróficas e vascularizadas

(seta preta).

A análise da carga parasitária foi realizada após a retirada dos órgãos (baço,

fígado e medula óssea), homogeneização, diluição seriada e cultivo. Durante 10 dias

o material foi observado e detectada baixa carga parasitária. Não houve diferença

significativa entre órgãos de animais infectados com os três parasitas analisados

(Figura 18).

47

Figura 18. Carga parasitária de L. infantum em baço e fígado (A) e medula óssea (B) nos diferentes

grupos do experimento in vivo. Os órgãos foram obtidos e cultivados conforme descrito no item 4.13 de

Material e Métodos.

Baço Fígado

0

11001

21001

31001

41001

51001

5.01002

1.01003

1.51003

2.01003c

arg

a p

ara

sit

ári

a (

mg

/te

cid

o)


Isolado de cão

Isolado humano

A


0

21001

41001

61001

81001

Ca

rga

pa

ras

itá

ria

/mL


Isolado de cão

Isolado humano

B

48

Considerando os dados observados acima, também avaliamos esse material

cultivado sem diluição seriada prévia, mas cultivado em placas de 6-wells com 5 mL

de meio Schneider. O resultado foi positivo para o aparecimento de formas

promastigotas nos poços contendo tecidos de animais infectados com o parasita

referência, isolado de cão e isolado humano, após 10 dias de incubação (Tabela 1).

Observamos que as formas promastigotas dos isolados clínicos aparecem primeiro

em comparação ao parasita referência.

Tabela 1 - Análise da positividade de culturas de órgãos de camundongos BALB/c.

Animais foram infectados com 2x106 promastigotas e após 3 semanas foram eutanasiados. Os órgãos

(medulas óssea e baço) foram homogeneizados e incubados a 26°C por 10 dias. (M) Medula óssea (B)

Baço.

5.7. Susceptibilidade dos isolados clínicos aos fármacos anti-Leishmania

A susceptibilidade dos isolados clínicos aos fármacos foi realizada avaliando-

se a ação de antimoniato de meglumina, miltefosina e anfotericina B em macrófagos

THP1 e DH82 infectados com promastigotas L. infantum na proporção

macrófago:parasita 1:20. Os resultados da infecção dos macrófagos THP1 e DH82

pelo parasita referência, isolado de cão e isolado humano foram semelhantes, como

observado nas Figuras 10 e 12 do item 5.5 dos resultados.

Nesse ensaio a análise foi feita calculando-se as porcentagens de macrófagos

infectados e o número de amastigotas intracelulares, após a incubação das culturas

celulares com os compostos, durante 48 horas. Cada composto foi usado em 2 doses

diferentes; Glucantime® (32 µg/mL e 128 µg/mL), Anfotericina B (0,2 µg/mL e 0,4

µg/mL) e Miltefosine® (2 µg/mL e 4 µg/mL). O DMSO foi usado como diluente para a

miltefosina e a anfotericina B, e assim, também testado nas culturas celulares.

49

Na Figura 19 observamos que quando os macrófagos THP1 foram infectados

por 24 horas com promastigotas do parasita referência observa-se que as

porcentagens de macrófagos infectados e os números de amastigotas por macrófago

tratados com DMSO não tiveram diferenças significativas em relação ao controle

(macrófagos infectados sem tratamento). A anfotericina B nas doses de 0,2 µg/mL e

0,4 µg/mL não reduziu as porcentagens de macrófagos infectados, mas reduziu os

números de amastigotas intracelulares. A miltefosina reduziu as porcentagens de

macrófagos infectados nas duas doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL), embora tenha

ocorrido diminuição dos números de amastigotas intracelulares somente com a dose

de 4 µg/mL. O antimoniato de meglumina não causou redução das porcentagens de

macrófagos infectados em nenhuma das duas doses testadas (32 µg/mL e 128

µg/mL), mas causou diminuição dos números de amastigotas intracelulares com as

doses de 128 µg/mL.

Figura 19. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do parasita referência em

macrófagos THP1 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos (*) indicam as

dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e tratamento com

DMSO (teste ANOVA, p>0,05).

Contr

ole

DM

SO

Am

B 0

,2

g/mL

Am

B 0

,4

g/mL

Milt

e 2 g

/mL

Milt

e 4 g

/mL

Glu

ca 3

2 g

/mL

Glu

ca 1

28

g/mL

0

10

20

30

40

0

1

2

3

4

% d

e i

nfe

cç

ão

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

ac

rófa

go

% de infecção


* ** * * * * * *

50

Quando os macrófagos THP1 foram infectados por 24 horas com promastigotas

dos isolados clínicos observa-se semelhança nos resultados obtidos. Em ambos, as


tratados com DMSO não tiveram diferença significativa em relação ao controle

(macrófagos infectados sem tratamento). Com a Anfotericina B não houve redução

nas porcentagens de macrófagos infectados na dose de 0,2 µg/mL, mas houve

redução nas porcentagens de macrófagos infectados na dose de 0,4 µg/mL. Também,

houve redução nos números de amastigotas intracelulares nas duas doses testadas.

A miltefosina causou redução nas porcentagens de macrófagos infectados e nos

números de amastigotas intracelulares nas duas doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL).

O antimoniato de meglumina não causou redução nas porcentagens de macrófagos

infectados, mas causou diminuição nos números de amastigotas intracelulares nas

duas doses testadas (32 µg/mL e 128 µg/mL) (Figura 20).

Contr

ole

DM

SO

Am

B 0

,2

g/mL

Am

B 0

,4

g/mL

Milt

e 2 g

/mL

Milt

e 4 g

/mL

Glu

ca 3

2 g

/mL

Glu

ca 1

28

g/mL

0

10

20

30

40

0

1

2

3

4

% d

e i

nfe

cç

ão

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

ac

rófa

go

% de infecção


* * * * * * * * *

A

51

Figura 20. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do isolado de cão (A) e isolado

humano (B) em macrófagos THP1 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos

(*) indicam as dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e

tratamento com DMSO (teste ANOVA, p>0,05).

Quando os macrófagos DH82 foram infectados por 24 horas com promastigotas

do parasita referência observa-se que as porcentagens de macrófagos infectados e

os números de amastigotas por macrófago tratados com DMSO não tiveram diferença

significativa em relação ao controle (macrófagos infectados sem tratamento). A

anfotericina B com a dose de 0,2 µg/mL não reduziu as porcentagens de macrófagos

infectados, mas reduziu as porcentagens de macrófagos infectados com a dose de

0,4 µg/mL. Os números de amastigotas intracelulares reduziram com as duas doses

testadas (0,2 µg/mL e 0,4 µg/mL). A miltefosina causou redução nas porcentagens de

macrófagos infectados e nos números de amastigotas por macrófago com as duas

doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL). O antimoniato de meglumina não causou

redução nas porcentagens de macrófagos infectados, mas causou diminuição dos

números de amastigotas intracelulares com as duas doses testadas (32 µg/mL e 128

µg/mL) (Figura 21).

Contr

ole

DM

SO

Am

B 0

,2

g/mL

Am

B 0

,4

g/mL

Milt

e 2 g

/mL

Milt

e 4 g

/mL

Glu

ca 3

2 g

/mL

Glu

ca 1

28

g/mL

0

10

20

30

40

0

1

2

3

4

5%

de

in

fec

çã

o

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

ac

rófa

go

% de infecção


B

* * * * * * * * *

52

Figura 21. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do parasita referência em

macrófagos DH82 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos (*) indicam as



Na infecção com o isolado de cão em macrófagos DH82 observa-se que as


tratados com DMSO não teve diferença em relação ao controle (macrófagos

infectados sem tratamento). A anfotericina B com a dose de 0,2 µg/mL não reduziu as

porcentagens de macrófagos infectados, mas reduziu com a dose de 0,4 µg/mL. Os

números de amastigotas intracelulares reduziram com as duas doses testadas (0,2

µg/mL e 0,4 µg/mL). A miltefosina reduziu as porcentagens de macrófagos infectados,

mas não reduziu os números de amastigotas por macrófago com as duas doses

testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL). O antimoniato de meglumina não reduziu a

porcentagem de macrófagos infectados, mas reduziu os números de amastigotas

intracelulares com as duas doses testadas (32 µg/mL e 128 µg/mL) (Figura 22).

Contr

ole

DM

SO

Am

B 0

,2

g/mL

Am

B 0

,4

g/mL

Milt

e 2 g

/mL

Milt

e 4 g

/mL

Glu

ca 3

2 g

/mL

Glu

ca 1

28

g/mL

0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

% d

e i

nfe

cç

ão

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

ac

rófa

go

% de infecção


* * * * * * * * *

53

Figura 22. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do isolado de cão em

macrófagos DH82 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos (*) indicam as



Na infecção com o isolado humano em macrófagos DH82 observa-se que as


tratados com DMSO não teve diferença em relação ao controle (macrófagos

infectados sem tratamento). A anfotericina B com a dose de 0,2 µg/mL não reduziu as

porcentagens de macrófagos infectados, mas reduziu as porcentagens de macrófagos

infectados com a dose de 0,4 µg/mL. Os números de amastigotas intracelulares

reduziram com as duas doses testadas (0,2 µg/mL e 0,4 µg/mL). A miltefosina reduziu

as porcentagens de macrófagos infectados, mas não reduziu os números de

amastigotas por macrófago com as duas doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL). O

antimoniato de meglumina não reduziu as porcentagens de macrófagos infectados

com a dose de 32 µg/mL, mas reduziu com a dose de 128 µg/mL. Os números de

amastigotas intracelulares reduziram com as duas doses testadas (32 µg/mL e 128

µg/mL) (Figura 23).

Contr

ole

DM

SO

Am

B 0

,2

g/mL

Am

B 0

,4

g/mL

Milt

e 2 g

/mL

Milt

e 4 g

/mL

Glu

ca 3

2 g

/mL

Glu

ca 1

28

g/mL

0

10

20

30

40

0

1

2

3

4

% d

e i

nfe

cç

ão

nº d

e a

ma

stig

ota

s/m

ac

rófa

go

% de infecção


* * * * * * *

54

Figura 23. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do isolado humano em

macrófagos DH82 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. \Os asteriscos (*) indicam as



Outro aspecto avaliado foi a viabilidade dos macrófagos THP1 e DH82

infectados com o parasita referência e os isolados clínicos, não tratados e tratados

com antimoniato de meglumina, miltefosina, anfotericina B, DMSO. Na Figura 24

observamos redução significativa na viabilidade celular comparado ao grupo controle

apenas com o tratamento com miltefosina (2 µg/mL e 4 µg/mL).

Contr

ole

DM

SO

Am

B 0

,2

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55

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56

Figura 24. Efeito dos fármacos em macrófagos THP1 e DH82. Macrófagos THP1 (quadrado preto) e

DH82 (quadrado cinza) infectados com o parasita referência (A), isolado de cão (B) e isolado humano

(C) foram tratados ou não (controle) com DMSO, anfotericina B, miltefosina e antimoniato de meglumina

durante 48 horas. Após esse período foi realizada a contagem de células em lâminas coradas com

Giemsa. Os asteriscos (*) indicam redução da viabilidade celular com diferenças estatísticas

comparando-se com o controle e tratamento com DMSO (teste ANOVA, p>0,05).

Avaliamos também a morfologia dos macrófagos infectados com o parasita

referência e os isolados clínicos. Observa-se na Figura 25 e 26, fotos representativas

de macrófagos THP1 e DH82, respectivamente, infectados com isolado de cão e não

tratados, e macrófagos infectados com isolado de cão e tratados com DMSO,

anfotericina B, miltefosina e antimoniato de meglumina durante 48 horas. Os

macrófagos infectados e não tratados apresentam-se ovais, núcleo excêntrico,

hipertróficos, vacuolizados e com formas amastigotas intracelulares. Os macrófagos

infectados e tratados com os fármacos também se apresentam ovais, núcleo

excêntrico, hipertróficos, vacuolizados e com formas amastigotas intracelulares. Nas

lâminas de macrófagos tradados com miltefosina observamos restos celulares

decorrente da maior toxicidade do fármaco aos macrófagos.

Contr

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THP1

DH82

* * * *

C

57

Figura 25. Micrografias de macrófagos THP1 infectados com L. infantum do isolado de cão e tratados

com diferentes fármacos. Macrófagos infectados e sem tratamento (A). Macrófagos infectados e

tratados com DMSO (B), anfotericina B 0,2 µg/mL (C) e 0,4 µg/mL (D). Miltefosina 2 µg/mL (E) e 4

µg/mL (F). Antimoniato de meglumina 32 µg/Ml (G) e 128 µg/mL (H) em 48 horas. As setas indicam


58

Figura 26. Micrografias de macrófagos DH82 infectados com L. infantum do isolado de cão e tratados

com diferentes fármacos. Macrófagos infectados e sem tratamento (A). Macrófagos infectados e

tratados com DMSO (B), anfotericina B 0,2 µg/mL (C) e 0,4 µg/mL (D). Miltefosina 2 µg/mL (E) e 4

µg/mL (F). Antimoniato de meglumina 32 µg/Ml (G) e 128 µg/mL (H) em 48 horas. As setas indicam


59

DISCUSSÃO

O objetivo principal desse trabalho foi analisar o perfil fenotípico de isolados

clínicos de L. infantum diagnosticados em paciente humano e cão da região de

Campinas-SP. Algumas características fenotípicas foram escolhidas para serem

avaliadas: espécie, morfometria, proliferação, viabilidade, infectividade e

susceptibilidade do parasita a fármacos.

Dois isolados clínicos foram usados, um proveniente de paciente humano

diagnosticado com LV pelo exame direto, cultura e PCR; e outro de cão diagnosticado

com LVC pelo teste sorológico ELISA. No primeiro momento, era necessário a

identificação da espécie da Leishmania desses isolados. Os dois isolados clínicos

foram positivos para os iniciadores RV1/RV2 na reação em cadeia da polimerase, o

que permitiu a identificação de Leishmania infantum como agente etiológico da

doença, concordando com as citações da literatura quanto à utilização desses

iniciadores na caracterização da espécie de Leishmania (LACHAUD et al., 2002;

FERROGLIO et al., 2006; LIMA JUNIOR et al., 2009; COSTA et al., 2014). Outros

dados também apontam para a presença dessa espécie do parasita diagnosticado

pela PCR na região de Campinas, como mostram os resultados de Costa et al. (2014),

que detectaram a espécie L. chagasi em cães e Von Zuben et al. (2014) relatando o

primeiro surto canino de leishmaniose visceral em Campinas, detectando a espécie L.

chagasi syn. L. infantum.

Esperávamos heterogeneidade de perfil fenotípico entre os isolados clínicos,

uma vez que se trata de parasitas provenientes de hospedeiros diferentes, humano e

cão, que são espécies de mamíferos com funções orgânicas distintas (temperatura,

tipos celulares, expectativa de vida) e exercendo pressão seletiva distinta no parasita.

Nesse trabalho foi analisada a cinética de proliferação dos promastigotas em

meio de cultivo Schneider. As culturas demonstraram que os isolados clínicos

proliferam mais rápido, isto é, atingem a fase estacionária antes do parasita referência.

Entretanto, o número de promastigotas, observados durante os 10 dias foi semelhante

entre os três parasitas analisados. Dados similares, isto é, um padrão de curva de

60

proliferação igual, foi obtido por Cunha et al. (2013); Gaona (2016) usando isolados

clínicos de L. infantum e Vanaerschot (2010) usando isolados de L. donovani.

Alterações morfológicas como diferenças no tamanho do corpo celular e do

flagelo de promastigotas podem ocorrer devido a características biológicas de cada

isolado ou a fatores externos como as condições experimentais, meio de cultura,

número de gerações e principalmente na fase de proliferação em que os

promastigotas se encontram (SACKS; PERKING, 1984; SARAIVA et al., 2005,

FARINHA, 2011). Sendo assim, analisamos a morfologia dos isolados e os dados

mostraram não existir diferença significativa entre os comprimentos médios dos quatro

parasitas analisados (L. infantum parasita referência, isolado de cão, isolado humano

e L. amazonensis) em fase estacionária da curva de proliferação. Quando

comparamos os dados com a literatura observamos que Silva Junior et al. (2015)

detectaram formas metacíclicas de L. amazonensis são maiores que formas

metacíclicas de L. braziliensis em 6 e 10 dias de cultura, indicado pela razão do

tamanho do corpo/flagelo, sendo que os isolados da mesma espécie são

semelhantes. O valor das médias das medidas de comprimento do corpo e flagelo de

L. amazonenis são semelhantes ao nosso (9,49 µm e 11,37 µm, respectivamente). Lei

et al. (2010); Farinha (2011) e Santi (2017) observaram que isolados de L. infantum

são semelhantes em tamanho de corpo celular e flagelo entre si, e os valores também

são semelhantes aos obtidos nesse trabalho.

Outro aspecto fenotípico importante é a capacidade infectiva, isto é, a

capacidade do parasita invadir e sobreviver dentro de macrófago, sendo sua taxa de

multiplicação nesse ambiente um fator importante para determinar o potencial de

infectividade do isolado e a manifestação da doença. Esta capacidade do parasita é

avaliada in vitro com macrófagos cultivados e expostos a promastigotas, e então

analisada a porcentagem de células infectadas e o número de amastigotas

intracelulares (KANELLOPOULOS et al., 2014). O uso de macrófagos se justifica por

serem as células-alvo onde os parasitas se multiplicam e sobrevivem (LIU; UZONNA,

2012). Sabendo que a leishmaniose visceral acomete várias espécies de hospedeiros,

optamos por analisar macrófagos humano (THP1) e canino (DH82). Além de serem

61

os hospedeiros em que foram isolados os parasitas que pesquisamos nos permite

demonstrar in vitro se esses isolados têm afinidade por algum desses macrófagos.

Para validar o uso destas linhagens na infecção por L. infantum avaliamos,

após 24 e 48 horas, a internalização do parasito testando diferentes proporções entre

células, parasitas e tempos.

Os dados mostraram que ambas as linhagens são infectadas com amastigotas

presentes por pelo menos 48 horas. Entre 22% e 24% dos macrófagos THP1; 2,27 e

2,47 amastigotas intracelulares por célula são encontrados quando a infecção foi na

proporção 1:10 para todos os isolados e parasita referência. Entre 35% e 39% dos

macrófagos THP1; 3,29 e 3,68 amastigotas intracelulares por célula são encontrados

quando a infecção foi na proporção 1:20 para todos os isolados e parasita referência.

E, cerca de 25% e 28% dos macrófagos DH82; 2,42 e 2,68 amastigotas intracelulares

por célula são encontrados quando a infecção foi na proporção 1:10 para todos os

isolados e parasita referência. Entre 35% e 41% dos macrófagos DH82; 3,23 e 3,45

amastigotas intracelulares por célula são encontrados quando a infecção foi na

proporção 1:20 para todos os isolados e parasita referência. Concluímos que os

isolados clínicos são capazes de infectar os dois tipos de macrófagos, em diferentes

proporções macrófago:parasito e sem predileção por nenhuma das linhagens

celulares, indicando que o isolado de cão não têm preferência e/ou maior facilidade

para infectar macrófagos de cão, o que também ocorreu com o parasita isolado de

humano com macrófago humano.

Dados na literatura apontam para conclusões semelhantes na capacidade

infectiva de isolados ao infectar macrófagos. Maia et al. (2007) testaram a capacidade

infectiva de dois isolados de L. infantum em diferentes macrófagos, incluindo os

macrófagos DH82, e concluíram que os parasitas são capazes de infectar todas as

linhagens de macrófagos. Kanellopoulos et al. (2014) analisaram o potencial de

infecção de isolados clínicos de L. infantum infectando células THP-1 in vitro e os

resultados mostram similaridade dos isolados quanto a infectividade. Em ensaios

realizados por Kerkhof et al. (2018) notou-se que macrófagos derivados de medula

óssea de camundongos BALB/c foram mais permissivos à replicação de amastigotas

intracelulares de isolados de L. infantum. Os resultados de todos os trabalhos

62

apresentam resultados que variam muito em relação à porcentagem células

infectadas e ao número de amastigotas intracelulares devido a diferenças nas células

e parasitas utilizados, entretanto em todos os casos observou-se parasitas

intracelulares e manutenção da infecção de macrófagos.

Após os testes de infecção in vitro que mostraram que os isolados são capazes

de infectar macrófagos, foi avaliada a capacidade de infectividade desses isolados em

camundongos BALB/c. Os camundongos BALB/c são excelentes modelos animais

experimentais para estudos sobre leishmaniose, porque são susceptíveis a infecção,

com doença crônica e respostas imunes incapazes de controlar os parasitas (NIETO

et al., 2011).

Nos nossos experimentos, o comportamento infectivo dos isolados e parasita

referência foi semelhante. Os animais inoculados apresentaram parasitas em baixas

quantidades no baço, fígado e medula óssea. Diferente do que foi observado por

Correa (2011); Agallou et al. (2018) e Silva et al. (2018), que ao inocularem

promastigotas de L. infantum em camundongos BALB/c obtiveram valores das cargas

parasitárias elevados. Entretanto esses autores inocularam promastigotas por via

endovenosa. Rolão, Melo e Campino (2004) obtiveram resultados semelhantes aos

nossos (carga parasitária esplênica) quando inocularam L. infantum via

intraperitoneal. Marques et al. (2005) e Figueiredo et al. (2017) obtiveram resultados

com maior carga parasitária (esplênica e hepática) comparados aos nossos dados

utilizando o mesmo método. Em relação a histopatologia, todos os camundongos

BALB/c inoculados com os isolados clínicos ou parasita referência sobreviveram até

o período de 3 meses e apresentaram granulomas, presença de infiltrado de células

inflamatórias, além de tecido conjuntivo fibroso, desorganização das células com

aspecto hipertrófico e vacuolizado no baço e no fígado concordando com os

resultados de Honoré et al. (1998); Coelho (2011); Cajueiro et al. (2017); Moraes et

al. (2018). Assim, concluímos que os isolados infectam camundongos e são

igualmente patogênicos.

Analisamos os efeitos de fármacos com atividade leishmanicida em macrófagos

de linhagem humana e canina infectados com L. infantum. Nosso objetivo era avaliar

se há variação na susceptibilidade de parasitas de isolados de cão e humano para

63

anfotericina B, miltefosina e antimoniato de meglumina, pois na literatura há relatos

de resistência. Por exemplo, na Índia, o uso da miltefosina foi licenciado após

resistência aos antimoniais, resultando em falha do tratamento em até 60% dos

pacientes (GUERIN et al., 2002; SUNDAR, 2001). Estudos in vitro apontam que

promastigotas de populações de Leishmania resistentes a anfotericina B e a

miltefosina apresentam diminuição do metabolismo de ácido graxo e esterol em

comparação a cepa selvagem (MBONGO et al., 1998; RAKOTOMANGA; SAINT-

PIERRE-CHAZALET; LOISEAU, 2005). Estudos realizados com L. infantum e outras

espécies de Leishmania predominantes no Brasil sugerem que doses mais elevadas

de miltefosina são necessárias para melhorar a eficácia de cura do tratamento de

pacientes infectados (MORAIS-TEIXEIRA et al., 2011). Maia et al. (2013) ao testarem

a susceptibilidade de isolados humanos e de cães de Leishmania relataram insucesso

terapêuticos em isolado de paciente humano imunossuprimido tratado com o

Glucantime®.

Em nossos experimentos observamos que apenas em macrófagos humanos

THP1 infectados com o parasita referência e tratados com doses de 128 µg/mL de

antimoniato de meglumina há redução de ambos, macrófagos infectados e

amastigotas intracelulares. As doses de 32 µg/mL reduziram apenas amastigotas

intracelulares. Em macrófagos humanos THP1 infectados com os isolados há redução

apenas de amastigotas intracelulares nas doses de 32 µg/mL e 128 µg/mL de

antimoniato de meglumina.

Nos macrófagos caninos DH82 infectados com o parasita referência há redução

apenas de amastigotas intracelulares nas doses de 32 µg/mL e 128 µg/mL de

antimoniato de meglumina. Macrófagos caninos DH82 infectados com os isolados há

redução de ambos, macrófagos infectados e amastigotas intracelulares apenas nas

doses de 128 µg/mL de antimoniato de meglumina. Nas doses de 32 µg/mL há

redução apenas de amastigotas intracelulares em macrófagos infectados com o

isolado de cão. Sugerimos que a interação de macrófagos humanos THP1 com os

isolados resultou em uma situação mais difícil de tratamento com antimoniato.

Enquanto, em macrófagos canino DH82, a interação dos macrófagos com os isolados

mostrou-se mais sensíveis ao composto.

64

Vale salientar que há diversos trabalhos na literatura sobre o efeito dos

antimoniais em cultura de macrófagos infectados, usando condições diversas de

tempo, espécie do parasita e doses (variações entre 64 µg/ml até mais de 1322 µg/ml)

(AREVALO et al., 2007; GIORGIO et al., 2000; MOREIRA; PETRILLO-PEIXOTO,

1991; WALKER; SARAVIA, 2004; ZAULI-NASCIMENTO et al., 2010). Alguns estudos

avaliam a susceptibilidade dos parasitas aos fármacos calculando IC50, o que não foi

realizado em nosso trabalho. Porém, podemos comparar nossos dados com os de

Pérez et al. (2016), que usaram o antimoniato em promastigotas de L. infantum de

isolado canino e amastigotas intracelulares em macrófagos humano THP1 e

comprovaram que isolado era resistente ao fármaco após duas intervenções

terapêuticas. Terrenos (2015) apesar dos altos desvios estatísticos, demonstrou que

o Glucantime® às 48 horas apresentou efeito leishmanicida no tratamento dos

macrófagos peritoneais infectados com L. amazonensis.

Os macrófagos THP1 infectados com o parasita referência e isolados foram,

semelhantemente, susceptíveis a doses de 2 µg/mL e 4 µg/mL de miltefosina, pois

ambos, macrófagos infectados e amastigotas intracelulares foram reduzidos. Já em

macrófagos DH82 infectados com o parasita referência há redução de ambos,

macrófagos infectados e amastigotas intracelulares nas doses 2 µg/mL e 4 µg/mL de

miltefosina. Na infecção com os isolados, há menor susceptibilidade em relação as

duas doses, pois somente há redução na porcentagem de macrófagos infectados.

Entretanto, a miltefosina foi tóxica para ambos os macrófagos, THP1 e DH82 pelo fato

de ser um fármaco anticâncer com efeito leishmanicida. Essa toxicidade já era

esperada, uma vez que células THP1 e DH82 são linhagens tumorais (SINGH;

KUMAR, SINGH, 2012). Sugerimos que a interação de macrófagos humanos THP1

com os isolados resultou em uma situação susceptível ao tratamento com miltefosina.

Enquanto, em macrófagos caninos DH82, a interação dos macrófagos com os

isolados mostrou-se uma situação mais difícil ao tratamento.

Nos experimentos de macrófagos THP1 infectados com o parasita referência e

isolados, semelhantemente, há redução de amastigotas intracelulares nas doses 0,2

µg/mL e 0,4 µg/mL de anfotericina B. Os macrófagos infectados somente foram

reduzidos nas doses de 0,4 µg/mL de anfotericina B quando infectados com os

65

isolados. Em relação a macrófagos DH82 infectados com o parasita referência e

isolados há redução de ambos, macrófagos infectados e amastigotas intracelulares

nas doses de 0,4 µg/mL de anfotericina B, diferente nas doses de 0,2 µg/mL onde

houve redução apenas dos amastigotas intracelulares. Sugerimos que a interação de

macrófagos humanos THP1 e DH82 com os isolados resultou em uma situação

susceptível ao tratamento com anfotericina B.

De acordo com a literatura, há variação nas doses do fármaco. Por exemplo,

Corral et al. (2013) demonstrou que doses de 0,1 µg/mL de anfotericina B não

afetaram a taxa de infecção em macrófagos infectados com L. infantum ou L.

donovani, e ainda demonstraram que a associação com outro fármaco (Alicina) pode

ser mais eficaz na inibição da proliferação do parasita. Mukhopadhyay et al. (2010)

mostraram em estudos in vitro com células THP1 que a dose de 2 mg/ml de

anfotericina B poderia mediar depuração do parasita devido à forte indução de radicais

livres e citocinas pró-inflamatórias.

Sugerimos que as doses dos fármacos analisados não dificultam a entrada dos

compostos em nenhuma das duas linhagens celulares. Porém, agem diferente em

relação a porcentagem de macrófagos infectados e/ou amastigotas intracelulares, o

que faz o parasita se tornar mais ou menos susceptível ao composto. De acordo com

os nossos dados, os isolados clínicos foram mais susceptíveis a miltefosina e

anfotericina B quando a interação foi com macrófagos THP1 e mais susceptíveis a

antimoniato de meglumina e anfotericina B quando a interação foi com macrófagos

DH82.

Consideramos que é importante realizar análises do perfil fenotípico de isolados

clínicos provenientes de humanos e cães, como fizemos nesse trabalho, pois

características diferentes podem aparecer, o que serviria de base para estudos mais

avançados. Como perspectiva para mais estudos desses isolados seria importante

compará-los com um maior número de isolados clínicos, diferenciar as fases da

proliferação através da citometria de fluxo, assim como a realização de análises

genômica e proteômica de isolados com perfis fenotípicos diferentes.

66

CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos podemos concluir que:

• A espécie de Leishmania dos isolados clínicos identificada foi

Leishmania infantum.

• Em relação a análise da morfométrica dos promastigotas dos isolados

clínicos e parasita referência mostram que são semelhantes no

tamanho.

• As curvas de proliferação dos isolados clínicos e parasita referência

são semelhantes.

• Os isolados clínicos e o parasita referência são igualmente capazes de

infectar macrófagos caninos (DH82) e macrófagos humanos (THP1).

• Em relação a susceptibilidade aos fármacos os isolados clínicos

isolados clínicos foram mais susceptíveis a miltefosina e anfotericina B

quando a interação foi com macrófagos THP1 e mais susceptíveis a

antimoniato de meglumina e anfotericina B quando a interação foi com

macrófagos DH82.

• Os isolados clínicos e o parasita referência são igualmente capazes de

infectar camundongos BALB/c porque os valores da carga parasitária

pelo método de diluição e a presença de granulomas no histopatológico

foram semelhantes.

67

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76, out. 2010.

81

ANEXOS

Abaixo constam o certificado de aprovação da CEUA, o certificado de alteração

do título do projeto, a declaração de direitos autorais e declaração de bioética e

biossegurança.

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