Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

FR 803 – Controle de Qualidade Biológico de Medicamentos e de Cosméticos

Prof. Dr. Rodrigo Ramos Catharino

PIROGÊNIOSJuliana Filippi Steck RA048795

Leila Regina Giarola RA 062192Luiza Koreeda RA 062596Patricia R Murari RA 063514

Roteiro

• Introdução – Histórico

• Conceito de Pirogênio

• Despirogenização e Métodos

• Teste de Pirogênio por Método In Vivo

• Determinação de Endotoxinas por Métodos In Vitro

• Conclusões

Introdução – Histórico

Gregos Acreditavam que a FEBRE era um mecanismo mais terapêutico que fisiopatológico

Início do Séc. XIX - Billbroth - primeiro a usar o termo “pirogênio” para descrever o princípio promotor da febre- Burdon-Sanderson – FEBRE com origem em um agente exógeno, como a bactéria, ou de origem endógena, da célula do hospedeiro

Final do Séc. XIX - Centanni - primeiro a reconhecer a relação causa-efeito entre

endotoxina e a febre - Gram desenvolveu o processo de coloração de bactérias. A partir

daí, concluíu-se que as endotoxinas estavam associadas às Gram (-).

Introdução – Histórico

Passagem do Séc. XIX para o XX

- Existência de injeções e administração parenteral que acompanhavam febre e outros efeitos colaterais

- Os métodos da época de eliminação de bactérias por esterilização térmica ou filtração não eliminava a pirogenicidade

- Necessidade de planejamento e padronização de testes de pirogenicidade

- Teste em coelhos - classificava a bactéria em pirogênica e não pirogênica e as correlacionava com o esquema Gram de classificação bacteriana.

Introdução – Histórico

1942 - Estudo colaborativo entre a US National Institute of Health e 14 indústrias farmacêuticas - primeiros testes oficiais em coelhos e incorporação na USP XII.

1952 - Westphal e colaboradores - métodos de extração de lipopolissacarídeos (LPS) purificados, livres de proteínas, de diferentes enterobactérias. Demonstrou-se ser o LPS o responsável pelas reações biológicas induzidas pela endotoxina, pois causava febre mesmo em quantidades reduzidas

Conceitos - Pirogênio

Pirogênios ExógenosInduzem elevações térmicas quando injetados em animais e no homem

Fontes: desde bacteriana, fúngica e viral, bem como componentes de bactérias Gram (-) e Gram (+), assim como alguns fármacos, esteróides, frações do plasma etc.

Exemplos: Streptococos grupo A - produz toxinas que causam avermelhidão na pele, comprovadamente potente fonte de pirogênios.Vírus - são provavelmente responsáveis por mais episódios pirogênicos em humanos que qualquer outro agente isolado. Fungos - têm se mostrado altamente pirogênicos quando injetados via intravenosa em animais experimentais, permanecendo não claro o mecanismo indutor.

Conceitos - Pirogênio

Pirogênios endógenos

São produzidos internamente pelo hospedeiro, sintetizados por diferentes células em resposta ao estímulo e exposição aos pirogênios exógenos.

Aparentemente, o pirogênio endógeno e exógeno são considerados mediadores primários da febre, pois induzem uma elevação da temperatura corporal a partir de substância obtida de leucócitos polimorfonucleares e da produção de prostaglandinas.

Endotoxina – Composição Química

As endotoxinas são complexos de alto peso molecular associados à membrana externa de bactérias Gram (-), e se constituem na mais significante fonte de pirogênio para a indústria farmacêutica.

Endotoxinas não purificadas podem conter lípides, carboidratos e proteínas.

Quando purificadas são denominadas

de lipopolissacarídeos (LPS) para enfatizar sua natureza química.

LPS – Composição Química

Lipídeo A - composto de um dissacarídeo de glucosamina, altamente substituído por ácidos graxos de cadeia longa com grupamentos amida e éster.

Possui atividade biológica de pirogenicidade, toxicidade letal, necrose da medula óssea, ativação do complemento, queda de pressão sanguínea, agregação plaquetária, indução de tolerância à endotoxina, atividade de macrófagos etc.

Endotoxina – Indução da Febre

Fagocitose do lipídeo A

Produção de pirogênio endógeno que atravessa a barreira hematoencefálica

Alteração do ponto de equilíbrio dos neurônios reguladores de temperatura do hipotálamo anterior

Recentemente descobriu-se um aumento na concentração de prostaglandina E

2 e adenosina

monofosfato cíclica (cAMP) no fluido cerebroespinal de coelhos

Níveis Pirogênicos

A questão torna-se crucial ao considerar os limites de liberação para os produtos farmacêuticos

Teste in vivo - Importância de determinar a sensibilidade relativa de coelhos e humanos a várias endotoxinas, visando a segurança no uso de medicamento parenteral em humanos.

Deve-se levar em consideração que a pirogenicidade pode depender de qual a endotoxina estudada, assim como do nível da dose.

Níveis Pirogênicos

Os limites atualmente considerados aceitáveis (FDA) para endotoxina bacteriana são:

produtos farmacêuticos e biológicos: 5 UE/kg; radiomarcadores: 2,5 UE/kg; parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL; água para injeção: 0,25 UE/mL; drogas intratecais: 0,2 UE/mL; correlatos: até 0,5 UE/mL; correlatos intratecais: 0,06 UE/mL.

PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO

REMOÇÃO

DESPIROGENIZAÇÃO

INATIVAÇÃO

• TRATAMENTOS QUÍMICOS (QUEBRA OU BLOQUEIO

DE SÍTIOS NECESSÁRIOS À ATIVIDADE PIROGÊNICA)

• ALTAS TEMPERATURAS (DESTRUIÇÃO TOTAL DA

MOLÉCULA)

• DIFERENTES MÉTODOS, CONSIDERANDO

CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DAS ENDOTOXINAS:

• TAMANHO•PESO MOLECULAR

•CARGA ELETROSTÁTICA•AFINIDADE A SUPERFÍCIES

DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO

•Despirogenização através da desativação do lipídeo A (2 possíveis mecanismos).

•Empregado na despirogenização de materiais.

•Utiliza-se HCl 0,05 N por 30 minutos a 100oC ou ácido acético glacial 1,0% por 2 a 3 horas a 100oC.

• HIDRÓLISE ÁCIDA

MEMBRANA EXTERNA

PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS

Rompimento de ligação lábil junto ao

lipídeo A, desativando o LPS.

Alteração da conformação do lipídeo A (sítios funcionais ou cliva ácidos graxos)

DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO

• Despirogenização através da aplicação de peróxido de hidrogênio.

• Empregado na obtenção da Água Estéril para Injeção USP, solução salina normal e salina-dextrose, lavagem de componentes plásticos empregados na fabricação de correlatos.

• Efetividade é dependente do tempo, pH e concentração do agente químico.

• Vantagem: segurança no manuseio, facilidade de eliminação da solução, e a inativação de endotoxinas.

• Desvantagem: pode ser capaz de degradar alguns componentes de produtos.

• OXIDAÇÃO

MEMBRANA EXTERNA

Mecanismo sugerido: oxidação dos ácidos graxos presentes

no lipídeo A

O peróxido de hidrogênio pode ser substituído por oxigênio molecular, ácido hipocloroso, periodato de sódio, permanganato de potássio diluído, permanganato neutro, ácido nítrico, dióxido de selênio, porém, com maiores limitações de compatibilidade.

DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO

• Despirogenização através da aplicação de óxido de etileno.

• Podem também ser aplicados os anidridos acético e succínico, que atuam através de acetilação e succinilação.

• A alquilação ocorre através de substituição nucleofílica na ligação glucosamina do lipídeo A.

• Método é compatível com materiais termolábeis, empregados na fabricação de produtos médico-hospitalares.

• ALQUILAÇÃO

DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO

• Despirogenização através da aplicação de calor seco

• Método de escolha para materiais termoresistentes, como frascos de vidros e instrumentos metálicos

• O método padrão é de exposição a 250oC ou mais, por 30 minutos ou mais

• Mecanismo de inativação é a incineração

• PROCESSO TÉRMICO

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO

• Destaca-se como um dos métodos mais antigos e simples

• Utilizado para remoção de endotoxinas de superícies sólidas.

• Emprega-se para lavagem um solvente apirogênico, usualmente Água Estéril para Injeção USP.

• Efetivo para a remoção de baixos níveis de endotoxinas superficiais, presentes em vidrarias, tampas e dispositivos.

• LAVAGEM

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO

• Destaca-se como um método efetivo para remoção de pirogênios da água

• Nesse processo, a água é submetida a duas alterações de fase, de líquida a vapor e de vapor a líquida

• A rápida fervura leva a água ao estado de vapor, enquanto moléculas de LPS, de elevado peso molecular, permanecem na fase líquida

• A água recém destilada é coletada e mantida em frascos despirogenizados estéreis

• DESTILAÇÃO

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO

• Método com mecanismo fundamentado em limites de exclusão de peso molecular

• Efetividade é dependente das membranas, empregadas como filtros despirogenizantes: endotoxinas que excedem determinado valor limite de peso molecular permanecem retidas

• Subunidades do LPS (monoméricas) possuem cerca de 10.000 a 20.000 daltons de tamanho: podem ser removidas por um ultrafiltro molecular de 10.000

• Subunidades agregadas possuem cerca de 300.000 a 1 milhão de daltons: removidas efetivamente por ultra-filtros que retém moléculas de 100.000 daltons ou maiores

• É empregado em uma ampla faixa de fármacos, soluções de baixo a médio peso molecular, antibióticos e na produção de solução eletrólito.

• ULTRAFILTRAÇÃO

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO

• Utiliza-se uma membrana constituída de materiais de acetato de celulose ou poliamida, com poros pequenos o suficiente para a exclusão de íons (porosidade nominal de cerca de 10 Ao)

• Essa membrana remove endotoxinas por simples exclusão de tamanho, retendo os pirogênios

• Efetivo para remoção de endotoxinas de água, exclusivamente, já que pode ocorrer a passagem de outras moléculas, distintas da água

• OSMOSE REVERSA

Consiste, juntamente com o método de destilação, em um processo reconhecido na USP

para a produção de Água Estéril para Injeção.

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO

• Despirogenização de soluções através de adsorção de endotoxinas ao carvão ativo

• É feita a adição do carvão à solução, esta é agitada, e finalmente o carvão é removido por filtração ou precipitação

• Eficaz para soluções com eletrólitos, porém, o carvão possui afinidade por substâncias não ionizadas de elevado peso molecular, limitando sua aplicação em algumas situações

• Evita-se seu uso em soluções contendo baixas concentrações de agentes ativos, já que podem ser adsorvidos

• Outra possível limitação deste método pode ser a remoção de traços de carvão, que pode ser contornada com o emprego de carvão sintetizado.

• CARVÃO ATIVO

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo• Foi o primeiro teste para comprovação de apirogenicidade em produtos injetáveis a fazer parte da Farmacopéia Americana (1942).

• Este teste tem em seu favor o envolvimento de toda a reação fisiológica do animal.

• É um ensaio limite, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra mediante resposta obtida a partir de um grupo de coelhos, que devem atender a um nível padrão de estado febril.

Teste de Hipertermia em Coelhos

• Um grupo de coelhos recebe injeção intravenosa da amostra e é observado, geralmente por 3 horas, tendo sua temperatura corpórea monitorada, antes e durante o teste.

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoModelo Animal

• Coelho Adulto: escolhido porque quanto à sensibilidade do teste é equivalente quando comparados aos humanos. Ou seja, o sistema regulador de temperatura do coelho tem características parecidas com as humanas.

• Peso: mínimo de 1,5kg (praticidade analítica). Melhores raças são: Holandesa, Himalaia e Polaca.

• Coelhos Specific Pathogen Free: é recomendado por possuir melhor padrão microbiológico. Evita tolerância passageira e imunização natural cruzada.

• Triagem do animal: importante que os animais sejam testados no momento da escolha do grupo para saber se está respondendo ao estado febril.

Nucleianato Sódico (5mg/kg) – 0,8 a 1,2°C

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoModelo Animal

• Condicionamento: animais devem ser treinados (estímulos adversos podem interferir gerando falsos-negativos e falsos-positivos).

• O animais podem ser reutilizados, porém deve-se respeitar períodos de descanso: 2 a 3 dias (animais que receberam material apirogênico) ou 2 a 3 semanas (animais que receberam material positivo para pirogenicidade).

• Condições do Biotério: respeitar a neutralidade térmica de cada espécie, boas instalações, renovação do ar constante, barreiras acústicas e controle de insetos e outros roedores.

Material Auxiliar

• Vidraria: usada para o preparo de amostras devem ser despirogenizadas previamente por tratamento térmico.

• Tomada de Temperatura: Utiliza-se par termoelétrico (preferencialmente) inserido no reto do animal. Termômetros clínicos depois de calibração podem ser utilizados.

• Antes do início do teste os animais escolhidos devem passar controle de temperatura, a fim de determinar a flutuação térmica (~0,3°C). – Valor médio serve como controle.

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In Vivo

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoAmostra

• Sob o ponto de vista do controle de qualidade todos os injetáveis de grande e de pequeno volume devem ser testados.

• Produtos de grande volume e de pequeno volume com administração intravenosa requerem atenção, bem como aqueles de inoculação intratecal – (1000 vezes mais potente).

• Sensibilidade: é uma limitação do teste in vivo. Concentrações menores que 50 pg/mL, na dose de 10 mL/kg não são detectáveis.

• Padronização da dose: geralmente 10 mL/kg para injetáveis de grande volume e líquidos extraídos de materiais plásticos.

Dose pirogênica = homem = coelho – então coelho recebe dose maior que a terapêutica para maior segurança do teste. Recomenda-se no mínimo 1 décimo / kg da dose.

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoAmostra

• Fármacos que atuem sobre o sistema termo-regulador não permitem detectar a presença de contaminantes termogênicos. Para esses usa-se métodos alternativos, ou a amostra deve ser tratada para impedir a interferência do princípio ativo.

• Produtos incompatíveis com teste: hipnóticos, anestésicos, gluconato de cálcio, alguns antibióticos como anfotericina e vincomicina, radiofármacos.

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoInterpretação de Resultados

• Classificação final: apirogênico, pirogênico, duvidoso.

• Amostra deve ser testada em 3 animais e os dados são confrontados com uma tabela de elevação térmica cumulativa padrão.

• Amostra duvidosa é retestada em outros 3 animais e comparada a nova tabela. Pode ser retestada por no máximo 12 animais.

< 1,15°C Amostra apirogênica> 2,65°C Amostra pirogênica

1,15°C < Amostra < 2,65°C Reteste

6 animais testados 2,8 a 4,3°C9 animais testados 4,45 a 5,95°C12 animais testados 6,6°C

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoInterpretação de Resultados

• Farmacopéia Brasileira IV – 1996

Determina um valor de elevação térmica crítica: >0,6°C

Limite para somatória de 3 coelhos: 1,4°C

Caso uma exigência não seja atendida a amostra é retestada em outro 5 coelhos. Destes novos animais, não mais q 3 devem podem acusar elevação térmica crítica. E o valor da somatória dos 8 coelhos não deve exceder 3,7°C.

• Produtos imunoterápicos: permitem elevação térmica maior por produzirem aumento da temperatura corpórea naturalmente.

Determinação de Endotoxinas: MÉTODO In VivoMétodos não Oficiais

• Toxicidade de pirogênio bacteriano em embrião de galinha

• Associação de endotoxinas em Actinomiciana D em camundongos

• Hipoferremia em ratos

• Determinação de leucopenia e leucocitose em camundongos

Estes testes visam a determinação da DL50 ou a quantificação de parâmetros hematológicos relacionados à dose de pirogênio bacteriano. Entretanto nenhum é aplicado para o controle de medicamentos quanto à inocuidade por substâncias termogênicas.

Método in vitroLisado de Amebócito de Limulus (LAL);Limulus polyphemus;

Amebócitos + Ca²+ + endotoxina = coagulação = gel

Método in vitro

Esquema de preparo do LAL• sangria de caranguejos Limulus polyphemus.• anticoagulante, como N-etilmaleimida 0,125% em solução a 3% de cloreto de sódio.• centrifugada por 10 minutos e o sobrenadante é desprezado.• lavagem em cloreto de sódio a 3%.• choque osmótico pela adição de água destilada apirogênica ou outro mecanismo.• estável a 4°C por ao menos 3 anos.

Métodos analíticos:

• Ponto Final de Gelificação;• Ensaio Turbidimétrico;• Método Colorimétrico de Proteína de Lowry;• Método Nefelométrico;• Método Cromogênico;

Método in vitro

Ponto final de gelificaçãoMétodo in vitro

Ensaio turbidimétrico

• qualquer aumento na concentração da endotoxina causa um proporcional aumento na turbidez devido à precipitação de proteína coagulável no lisado.

• quantificação de endotoxina pelo método turbidimétrico exige que o lisado seja diluído a níveis que impeçam a formação do coágulo.

Método in vitro

Método CromogênicoMétodo in vitro

Essa liberação é proporcional a concentrações crescentes de endotoxina.

Vantagens

• simples e fácil de ser aplicado

• 155 avaliações conduzidas, 24 foram positivas apenas no LAL e não no ensaio de coelhos USP.

• Embora duas amostras apresentassem resultados positivos no ensaio animal e negativo no LAL, os dados sugeriam sensibilidade superior no LAL.

Método in vitro

Desvantagens

• vulnerabilidade a estações e lotes.

• o teste de LAL não determina a presença de outras substâncias que promovam reação febril além da endotoxina.

• podem haver outros componentes que inibam ou aumentem a velocidade dessa reação.

• teste de compatibilidade do produto.

Método in vitro

Abrangência do método

• Farmacopéia Brasileira: admite o método de gelificação, turbidimétrico ou colorimétrico do tipo cinético ou leitura final, embora detalhe particularidades apenas para o primeiro.

• Para ser empregado o método de LAL, o fabricante de produto farmacêutico, biológico ou correlato deve obter dados quanto à sensibilidade, inibição/exacerbação e, se adequado, teste de sensibilidade de colônia de coelhos a ser empregada.

Método in vitro

CONCLUSÕES

Todo o processo produtivo deve ser realizado em condições de higiene, envolvendo desde os operadores até o ambiente, empregando-se processos validados, pessoal qualificado e treinado, tendo-se sempre em foco as boas praticas de fabricação, de forma que o produto obtido seja apirogênico, dispensando tratamentos adicionais.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Pinto, T. J. A., Kaneko, T. M. , Ohara, M. T. “Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos”, 2ª Edição, Atheneu, 2003. p 181-215.

Fukumori, N.T.O. Determinação de Endotoxina Bacteriana (Pirogênio) em Radiofármacos pelo Método de Formação de Gel. Validação. Dissertação de Mestrado em Ciências na área de Tecnologia Nuclear. São Paulo. 2008.

Silveira, L.R., Andrada, S.S., Schimidt, C.A., Casali, R.G., Dalmora, S.L. Comparative Evaluation Pyrogenens Tests in Pharmaceutical Products. Brazilian Journal of Microbiology. v.35, p.48-53, 2004.

Barth, T., Dalmora, V.J., D´Avila, F.B., Dalmora, S.L. Avaliação de Pirogênios em Produtos de Uso Veterinário pelos testes de Hipertermia em Coelhos e do Lisado de Amebócito do Limulus. Ciência Rural, v.37, n.1, p.190-4., Jan-Fev 2007.

OBRIGADA PELA ATENÇÃO!