UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

GRAZIELA BARONI DE SOUZA DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO POR Trypanosoma cruzi EM

CÃES (Canis familiaris) DO SUDESTE DA BAHIA

ILHÉUS- BAHIA 2016

GRAZIELA BARONI DE SOUZA

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO POR Trypanosoma cruzi EM

CÃES (Canis familiaris) DO SUDESTE DA BAHIA

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como exigência para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Clínica e Sanidade Animal Orientador: Prof. Dra. Fabiana Lessa Silva

ILHÉUS – BAHIA 2016

S729 Souza, Graziela Baroni de. Diagnóstico molecular da infecção por Trypa- nosoma cruzi em cães (Canis familiaris) do sudeste da Bahia / Graziela Baroni de Souza. – Ilhéus, BA: UESC, 2016. 39f. : Il. Orientadora: Fabiana Lessa Silva. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências.

1. Cão - Doenças. 2. Chagas, Doença de. 3. Diagnóstico molecular. 4. Tripanossomose. I. Título. CDD 636.0896

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho primeiramente a Deus, que é minha fortaleza e fonte de

sabedoria, aos meus pais Ramiro e Leila e ao meu irmão Douglas, que são meu

porto seguro, ao meu namorado Léo, aos meus amigos e ao meu cachorrinho

Fly.

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo dom da vida e por ser presença constante em todos os momentos,

me guiando, me capacitando e não me deixando desistir.

À minha família, em especial aos meus pais Ramiro Antônio Seidel de Souza e

Leila Maria Baroni de Souza e meu irmão Douglas Baroni Seidel de Souza, meu

eterno agradecimento por todo amor, esforço e incentivo que foram essenciais

para que eu conquistasse mais esta vitória.

Ao meu namorado Léo Barcelos Ferreira, agradeço pelo amor, companheirismo

e paciência durante esses anos de ausência. Obrigada por me incentivar, por

acreditar em mim e por me fazer feliz desde o primeiro dia.

Aos meus amigos, obrigada por me aconselharem, pela companhia, por

momentos de risadas e pelas palavras de carinho e incentivo que foram

fundamentais, não só nestes anos, mas em toda minha vida. Agradeço também

aos amigos que cultivei ao longo deste Mestrado. Cada um de uma maneira

especial, ajudou a tornar a caminhada mais leve e prazerosa, em especial à

minha amiga Paula Elisa Brandão Guedes, pelos inúmeros ensinamentos, por

ser tão gentil e por ser minha conselheira em todos os momentos desta

caminhada.

À prezada e querida Drª Fabiana Lessa Silva, pela competente e eficiente

orientação e amizade. Obrigada por ter acreditado em mim desde o princípio e

pelo constante empenho em transformar seus orientados em profissionais

exemplares.

Às colegas do Laboratório de Histopatologia, Érika, Janaína, Jeane, Paula e

Thaís, juntas nós formamos uma equipe que proporcionou não só o crescimento

profissional, mas também pessoal.

Aos colegas dos demais laboratórios da Universidade Estadual de Santa Cruz,

obrigada pela amizade, pelos conhecimentos transmitidos e por sanarem minhas

dúvidas em todos os momentos.

Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal, pelos

ensinamentos transmitidos, em especial ao professor George Rêgo Albuquerque

que inúmeras vezes me aconselhou e tirou minhas dúvidas, contribuindo muito

com o trabalho.

Aos funcionários do Hospital Veterinário da UESC, obrigada por contribuírem

com esta conquista através dos diversos serviços prestados, em especial ao

técnico do Laboratório de Histopatologia, Ivo Arouca, que além de ser

competente está sempre pronto a ajudar.

Aos membros da banca por colaborarem para o enriquecimento do trabalho.

À Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós Graduação em

Ciência Animal por possibilitar a realização e execução do projeto de pesquisa e

que, por aproximadamente dois anos, tornou-se minha segunda casa. Neste

ambiente tive a honra de conhecer pessoas maravilhosas e adquirir uma

bagagem de conhecimentos com ilustres professores.

À todos aqueles que participaram de alguma forma na construção deste

caminho, deste sonho que hoje se torna uma realidade, meus sinceros

agradecimentos!

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO POR Trypanosoma cruzi EM CÃES (Canis familiaris) DO SUDESTE DA BAHIA

RESUMO

A Doença de Chagas é uma antropozoonose de grande importância para a saúde pública e é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Diversas espécies de mamíferos atuam como reservatórios do parasita, incluindo o cão. O objetivo deste trabalho foi verificar a infecção natural por T. cruzi na população de cães do município de Ituberá, Bahia. Foram estudados 392 cães domiciliados dos quais foram coletados 5mL de sangue para posterior realização do diagnóstico molecular e sorológico. A amplificação do DNA de T. cruzi foi realizada através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), na qual foram utilizados os primers P35 e P36, que amplificam um fragmento de 330 pb. Os produtos das PCRs foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% contendo Sybr (Invitrogen®). O controle positivo utilizado foi proveniente de DNA de cultura de T. cruzi e o negativo foi água ultra-pura. No intuito de verificar a presença de reação cruzada entre T. cruzi e Leishmania sp., foi realizada sorologia para detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. através da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Os controles positivos e negativos da reação foram provenientes de soro de cães positivos e negativos, respectivamente, na PCR para Leishmania sp. Adicionalmente foi feita aplicação de questionário epidemiológico junto aos proprietários para identificação dos fatores de risco de infecção. Dos 392 cães avaliados, apenas 2 (0,51%) animais, um macho e uma fêmea, foram positivos no diagnóstico molecular de T. cruzi. Não houve reação cruzada entre T. cruzi e Leishmania sp. Quanto a avaliação dos fatores de risco associados à infecção, os resultados não foram significativos. Conclui-se com esse estudo que há cães naturalmente infectados pelo T. cruzi no município de Ituberá-Bahia. Este achado constitui um alerta aos veterinários, profissionais da saúde e autoridades sanitárias locais para a possibilidade da transmissão desta zoonose a partir destes cães infectados, os quais podem atuar como reservatórios da doença.

Palavras-chave: Doença de Chagas; Diagnóstico molecular; Reação cruzada; Tripanossomíase; Tripomastigota metacíclico.

MOLECULAR DIAGNOSIS OF Trypanosoma cruzi INFECTION IN DOGS

(Canis familiaris) FROM SOUTHEAST BAHIA

ABSTRACT

Chagas disease is a anthropozoonosis of great importance to public health and is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. Several species of mammals act as reservoirs for the parasite, including dogs. The aim of this study was to determine the natural T. cruzi infection in the dog population from the municipality of Ituberá, Bahia. For this, 392 pet dogs were studied, of which 5 mL of blood were collected for later obtaining the bufft coat for subsequently DNA extraction and Polymerase Chain Reaction (PCR). For the amplification of T. cruzi DNA were used the P35 and P36 primers that amplify a 330 bp fragment. The PCR products were subjected to electrophoresis on a 2% agarose gel containing Sybr. Culture of T. cruzi was used as positive control and negative control was ultra-pure water. In order to verify the presence of cross-reactivity between T. cruzi and Leishmania sp., serology was performed for detection of anti-Leishmania antibodies by indirect immunofluorescence (RIFI). Serum from dogs positive and negative in the PCR for Leishmania sp. were used as positive and negative controls, respectively. In addition it was made application of an epidemiological questionnaire with the owners to identify the infection risk factors. Of the 392 dogs evaluated in this study, only 2 (0.51%) animals, one male and one female, were positive in the molecular diagnosis for T. cruzi infection. There was no cross-reactivity between T. cruzi and Leishmania sp. As for the assessment of risk factors associated with infection, the results were not significant. It concludes with this study that there are dogs naturally infected with T. cruzi in the municipality of Ituberá-Bahia. This finding is a warning to veterinarians, health professionals and local health authorities to the possibility of transmission of this zoonoses from these infected dogs, which can act as reservoirs of disease.

Keywords: Chagas disease; Molecular Diagnostics; Cross Reaction; Trypanosomiasis; Metacyclic Trypomastigote.

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Ciclo biológico do T. cruzi. 17

2 Localização de Ituberá no estado da Bahia. 23

3 Fotografia de eletroforese em gel de agarose

à 2,0% corado com Sybr, evidenciando animal

positivo para T. cruzi na canaleta 15 (seta).

26

4 Fotografia de eletroforese em gel de agarose

à 2,0% corado com Sybr, evidenciando animal

positivoo para T. cruzi na canaleta 6 (seta).

27

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

ELISA

EDTA

HAI

PCR

RIFI

SESAB

WHO

“Enzyme Linked Imuno Sorbent Assay”

Ácido etilenodiamino tetra-acético

Reações de Hemaglutinação

Reação em Cadeia da Polimerase

Reação de Imunofluorescência Indireta

Secretaria Estadual de Saúde da Bahia

World Health Organization

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12

2 OBJETIVOS .................................................................................................. 13

2.1 Geral........................................................................................................... 13

2.2 Específicos ................................................................................................. 13

3 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 14

3.1 Agente etiológico ........................................................................................ 14

3.2 Vetores ....................................................................................................... 14

3.3 Transmissão ............................................................................................... 16

3.4 Ciclo biológico ............................................................................................ 16

3.5 Epidemiologia ............................................................................................. 17

3.6 Patogenia e sinais clínicos ......................................................................... 18

3.7 Diagnóstico ................................................................................................. 20

4 MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................22

4.1 Características do município ...................................................................... 22

4.2 Animais e amostragem ............................................................................... 23

4.2.1 Coleta de dados epidemiológicos ............................................................ 24

4.3 Obtenção das amostras biológicas ............................................................ 24

4.4 Extração de DNA ........................................................................................ 24

4.5 Análise molecular ....................................................................................... 24

4.6 Exames sorológicos ................................................................................... 25

4.7 Análise estatística ...................................................................................... 26

5 RESULTADOS .............................................................................................. 26

5.1 Diagnóstico molecular ................................................................................ 26

5.2 Diagnóstico sorológico ............................................................................... 27

5.3 Fatores de risco associados à infecção por T. cruzi ................................... 27

6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 28

7 CONCLUSÃO ................................................................................................ 29

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 30

ANEXOS .......................................................................................................... 39

12

1 INTRODUÇÃO

A Doença de Chagas ou Tripanossomíase Americana é uma infecção

parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (CHAGAS,

1909), descoberta no Brasil no ano de 1909, por Carlos Ribeiro Justiniano das

Chagas (Carlos Chagas). A história natural da doença começou há milhões de

anos, sendo considerada uma infecção enzoótica e selvagem, pois tinha como

reservatórios da doença os animais silvestres (COURA; VIÑAS, 2010; COURA;

BORGES-PEREIRA, 2010). Entretanto, com o crescimento da população,

acompanhado do desmatamento, predação de animais silvestres e construção

de moradias no habitat natural do parasita, a doença foi transmitida

acidentalmente aos seres humanos e a diversas espécies de animais

domésticos, incluindo o cão, transformando-se assim em uma antropozoonose

(COURA; BORGES-PEREIRA, 2010).

Desde seu surgimento, a Doença de Chagas caracteriza-se por ser

endêmica e restrita a países da América Latina nos quais são encontrados os

triatomíneos, que são os insetos responsáveis por transmitir a doença.

Entretanto, nas últimas décadas, problemas políticos e econômicos têm

estimulado a migração de latino-americanos infectados para outros continentes,

disseminando a doença para países não endêmicos como, Estados Unidos,

Canadá, Alemanha, Austrália, Espanha, França, dentre outros (SCHMUNIS,

2007; WHO, 2010; TANOWITZ et al., 2011, WHO, 2016). Devido a este fluxo

migratório, a doença foi introduzida em novos países através do carreamento

dos vetores, contaminação dos bancos de sangue por amostras provenientes de

pessoas infectadas, transmissão vertical, transplante de órgãos e acidentes

laboratoriais relacionados à contaminação durante o manuseio de sangue

infectado (COURA; VIÑAS, 2010).

De acordo com Vinhaes e Dias (2000), no Brasil, a área de risco de

transmissão vetorial da doença representa 36% do território nacional. Aras et al.

(2002) avaliaram a prevalência de infecção por T. cruzi em humanos na região

nordeste e concluíram que o estado da Bahia apresenta os maiores níveis de

infecção, com soroprevalência variando de 5,4 a 25%.

13

Inúmeros estudos comprovam a relevância da Doença de Chagas para a

saúde pública no Brasil (COURA; VIÑAS, 2010; TANOWITZ et al., 2011;

WESTPHALEN et al., 2012). Estudos prévios também já comprovaram a

infecção natural de cães por T. cruzi (MOTT et al., 1978; BARRET et al., 1979;

GÜRTLER et al., 2007; SOUZA et al., 2008; LEÇA-JÚNIOR et al., 2013;

ALMEIDA et al., 2013), entretanto na região de Ituberá-BA não existem estudos

com estes animais, sendo este trabalho pioneiro na região.

Atualmente, estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas no mundo estão

infectadas pelo T. cruzi (WHO, 2016) e segundo o Ministério da Saúde (2014), o

Brasil apresenta 2 a 3 milhões de pessoas portadoras da doença crônica. Tendo

em vista que o município de Ituberá é endêmico para a Doença de Chagas

(SESABa, 2013), os cães dessa região podem atuar como sentinelas e

reservatórios, ressaltando assim sua importância epidemiológica, além de

sugerir aos veterinários um alerta da infecção destes animais na região

estudada.

2 OBJETIVOS

2.1 Geral:

Verificar a infecção natural por Trypanosoma cruzi na população de cães

do município de Ituberá, Bahia.

2.2 Específicos:

- Detectar a presença de DNA de T. cruzi no sangue de cães oriundos do

município de Ituberá, Bahia.

- Identificar os fatores de risco relacionados à infecção por T. cruzi nos

cães do município de Ituberá, Bahia.

14

- Avaliar a ocorrência de reação cruzada entre T. cruzi e Leishmania

chagasi nos cães do município de Ituberá, Bahia.

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Agente etiológico

A Doença de Chagas é causada pelo parasito Trypanosoma cruzi,

pertencente à ordem Kinetoplastea, sub-ordem Trypanosomatina, gênero

Trypanosoma, sub-gênero Schizotrypanum e espécie Trypanosoma

(Schizotrypanum) cruzi. Caracteriza-se por ser um protozoário flagelado,

possuindo um único flagelo, e por apresentar o DNA localizado no cinetoplasto,

uma organela presente no interior da mitocôndria (DIAS; COURA, 1997). O T.

cruzi possui como reservatórios animais silvestres, animais domésticos e o

homem (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010). Durante o seu ciclo de vida,

apresenta três diferentes formas evolutivas: a tripomastigota (estágio infectante),

a epimastigota (estágio de multiplicação no vetor) e a amastigota (estágio de

multiplicação no interior das células do hospedeiro) (DIAS; COURA, 1997;

SOUZA et al., 2010).

Atualmente as cepas de T. cruzi são classificadas em 6 DTUs (Discrete

Typing Units), denominadas TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV e TcVI (ZINGALES et al.,

2009). Cada cepa possui suas particularidades, sendo encontradas em

diferentes ecótopos, transmitidas por vetores distintos, acometendo diferentes

hospedeiros e, por sua vez, apresentado virulência e patogenia distintas

(ZINGALES et al., 2012).

3.2 Vetores

Os triatomíneos são insetos hematófagos pertencentes à ordem

Hemíptera, subordem Heteroptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae

(LENT; WYGODZINSKY, 1979). No Brasil, são conhecidos popularmente como

barbeiros, chupões, fincões, chupanças, bicudos e procotós (DIAS; COURA,

1997).

15

Atualmente, são descritas 148 espécies de triatomíneos distribuídas em

cinco tribos e 18 gêneros (JURBERG, 2014), das quais 64 foram registradas no

Brasil, destacando-se Triatoma infestans, T. brasiliensis, T. jatai, T.

pseudomaculata, T. juazeirensis, Panstrongylus megistus e Rhodnius zeledoni

(GALVÃO et al., 2003; COSTA; FÉLIX, 2007; JURBERG et al., 2009;

GONÇALVES et al., 2013). Esses insetos vivem em média 1 a 2 anos e

apresentam 5 estágios reprodutivos, podendo se infectar pelo T. cruzi em

qualquer estágio (DIAS; COURA, 1997).

Em função das medidas de controle dos vetores realizadas a partir da

década de 1970, o Brasil recebeu em 2006 a Certificação Internacional pela

Interrupção da Transmissão da Doença de Chagas pelo T. infestans, conferida

pela Organização Pan-Americana da Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

Entretanto, esta certificação não significa que o Brasil possui o controle efetivo

da doença, pois existem diversas outras espécies de triatomíneos vetores da

doença, principalmente na região Nordeste (FERREIRA; SILVA, 2006; RIBEIRO

JR et al., 2015).

Os triatomíneos possuem hábitos noturnos e se infectam pelo T cruzi

durante o repasto sanguíneo nos mamíferos infectados (DIAS; COURA, 1997).

A afinidade pelo hospedeiro varia de acordo com a espécie de triatomíneo, sendo

encontradas espécies antropofílicas, que se instalam em ambientes domésticos

como quartos, por exemplo, e espécies que, mesmo sendo consideradas

domésticas, têm maior afinidade por animais domésticos do que pelo homem, a

exemplo do T. rubrofasciata (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010).

A adaptação dos triatomíneos silvestres ao ambiente doméstico ocorreu

devido à busca por novas fontes de alimentos, tendo em vista que a fonte

original, constituída por mamíferos silvestres, encontrava-se escassa. Desta

forma, esses insetos ocuparam progressivamente o ambiente doméstico e

peridoméstico (RIBEIRO JR et al., 2015), vivendo em rachaduras de parede,

telhados de casas e cabanas, colchões, dentre outros (COURA; BORGES-

PEREIRA, 2010; COURA; VIÑAS, 2010; JURBERG, 2014).

16

3.3 Transmissão

As formas infectantes do T. cruzi são as tripomastigotas metacíclicas, as

quais são eliminadas nas fezes do triatomíneo após o repasto sanguíneo, sendo

inoculadas diretamente no orifício da picada, mucosa ocular ou pele lesionada.

A transmissão também se dá de forma indireta, através da infecção oral

(ingestão de alimentos contaminados), infecção laboratorial acidental, transfusão

de sangue, transplacentária (BAHIA et al., 2002; OPAS, 2009; COURA;

BORGES-PEREIRA, 2010; COURA; VIÑAS, 2010), transplante de órgãos,

dentre outras (SOUZA et al., 2010).

A possibilidade de transmissão do protozoário depende de alguns fatores,

como o número de triatomíneos infectados pelo T. cruzi, o tempo decorrido entre

a picada e a defecação, o número e a quantidade de defecações em um

determinado intervalo de tempo, carga parasitária eliminada, intensidade do

prurido durante a picada (COURA; BORGES-PEREIRA, 2010) e virulência da

cepa (ZINGALES et al., 2012)

Cabe ressaltar que, na ausência na transmissão vetorial, a transmissão

congênita ou por transfusão de sangue tornaram-se relevantes nas últimas

décadas, principalmente em regiões não endêmicas. Isso se dá devido à

urbanização progressiva e imigração de latino-americanos infectados para

grandes centros e para outros países onde não existe o controle do banco de

sangue, contribuindo para a disseminação da doença (OPAS, 2009; COURA;

VIÑAS, 2010).

3.4 Ciclo biológico

O T. cruzi é um parasito heteroxeno, ou seja, necessita de hospedeiro

vertebrado e invertebrado para completar seu ciclo de vida. Após serem

ingeridas pelo vetor invertebrado, as formas tripomastigotas de T. cruzi passam

por sucessivas transformações no tubo digestivo do triatomíneo até chegarem

ao estágio de epimastigota, que inicia sua multiplicação no intestino médio. Ao

atingirem a porção final do tubo digestivo, as epimastigotas diferenciam-se em

tripomastigotas metacíclicas. Esta transformação denomina-se

17

metaciclogênese, na qual se originam as formas tripomastigotas metacíclicas

que são altamente infecciosas, sendo eliminadas nas fezes e urina do inseto

(DIAS; COURA, 1997; COURA et al., 2012).

Durante o repasto sanguíneo no hospedeiro vertebrado, o triatomíneo

libera nas fezes as tripomastigotas metacíclicas (formas infectantes) que,

obrigatoriamente, necessitam penetrar em alguma célula do hospedeiro

vertebrado a fim de completarem seu ciclo (COURA et al., 2012).

Figura 1. Ciclo biológico do T. cruzi.

3.5 Epidemiologia

A Doença de Chagas vem sendo amplamente combatida nas últimas

décadas, principalmente no que diz respeito à transmissão vetorial e

transfusional. Entretanto, apesar dessas ações, ela ainda representa uma das

Fonte: CDC

18

mais importantes endemias do Continente Americano (WESTPHALEN et al.,

2012).

Segundo dados da organização Drugs for Neglected Diseases iniciative

(DNDi, 2013), a Doença de Chagas é responsável por levar à óbito cerca de 12

mil pessoas por ano na América Latina, sendo que metade desses óbitos

acontecem no Brasil. Isso representa perdas de produtividade e um custo anual

de 129 milhões de dólares com saúde pública no país.

Os animais domésticos, como os cães e os gatos, apresentam

importância epidemiológica na transmissão da doença pelos triatomíneos.

Entretanto, o homem e os cães são três vezes mais infectados quando

comparados com os gatos. Desta forma, cabe ressaltar a predileção do vetor por

determinados hospedeiros e a importância do cão como reservatório da doença

(GÜRTLER et al., 2007).

Um estudo epidemiológico realizado no Brasil entre 1975 a 1980 por

Camargo et al (1984) demonstrou que os estados com maior prevalência de

infecção no país foram o Rio Grande do Sul (8,84%), Minas Gerais (8,83%),

Goiás (7,40%), Sergipe (5,97%) e Bahia (5,44%). Estudo mais recente indica

que a Bahia ainda se destaca com elevada prevalência de infecção por T. cruzi

em humanos, apresentando soroprevalência variando de 5,4 a 25% (ARAS et

al., 2002). Além disso, estima-se que atualmente existem aproximadamente dois

a três milhões de pessoas portadoras da doença crônica no Brasil (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2014).

3.6 Patogenia e sinais clínicos

Após adentrarem o organismo do hospedeiro vertebrado, as

tripomastigotas metacíclicas invadem as células do hospedeiro e em seguida

transformam-se em amastigotas. As tripomastigotas têm tropismo por células do

sistema monocítico fagocitário, fibras musculares esqueléticas, cardíacas e lisas,

sistema nervoso central e periférico, células epiteliais e fibroblastos (NELSON;

COUTO, 2006; COURA et al., 2012).

Após um período de latência de 20 a 30 horas, as formas amastigotas

iniciam o processo de divisão binária, que acontece a cada 12 horas e,

19

posteriormente, transformam-se em tripomastigotas, as quais são liberadas na

corrente sanguínea após ruptura da célula, levando à infecção de outras células

(DIAS; COURA, 1997; ARGOLO et al., 2008; COURA et al., 2012). Como

consequência, há um aumento exponencial do número de tripomastigotas e de

células parasitadas, caracterizando a fase aguda da doença, a qual pode levar

o hospedeiro à morte ou à infecção crônica, caso o sistema imunológico consiga

controlar a proliferação parasitária (DIAS; COURA, 1997; ARGOLO et al., 2008).

A Doença de Chagas no cão apresenta evolução e sintomatologia clínica

semelhante à doença no homem (ANDRADE; ANDRADE, 1980; SOUZA et al.,

2008; PASCON et al., 2010). Nos caninos foram descritas manifestações agudas

e crônicas. Entretanto, alguns animais podem ser assintomáticos na fase aguda

da doença (WOODS et al., 2000). A fase aguda acomete frequentemente cães

jovens, entre cinco e seis meses de idade. Esses animais podem desenvolver

infecções generalizadas, acometendo principalmente o miocárdio e o sistema

nervoso central, podendo apresentar intolerância ao exercício e fraqueza, devido

à miocardite, bem como linfadenopatia generalizada, mucosas pálidas,

taquicardia, hepatomegalia, distensão abdominal, anorexia, diarreia, sinais

neurológicos e ocorrência de morte súbita decorrente de arritmia cardíaca grave

(CAMACHO, 2003; NELSON; COUTO, 2006).

As lesões microscópicas são caracterizadas pelo intenso parasitismo no

miocárdio, com ruptura das células parasitadas, intenso infiltrado inflamatório

focal de células mononucleares e polimorfonucleares, necrose de miócitos,

diferentes graus de miocardite (LANA et al., 1988; ARAÚJO-JORGE; CASTRO,

2000), congestão hepática, esplênica e pulmonar (ALMEIDA et al., 2013) e

neurite, com possível despopulação neuronal (LANA et al., 1988). Apesar de ser

raro, também existe relato de lesões no trato gastrointestinal caracterizadas por

infiltrado linfocitário multifocal na camada muscular do esôfago, estômago e

intestino (PAVARINI et al., 2009).

Assim como os humanos, os cães que sobrevivem à fase aguda

desenvolvem a forma crônica da doença a qual, no cão, ocorre de oito a 36

meses após a infecção inicial (LAPPIN, 1997; SOUZA et al., 2008). Nesta fase,

os sinais clínicos podem ser inexistentes ou podem estar relacionados a

20

alterações cardíacas, como insuficiência cardíaca congestiva, anormalidades na

condução do impulso, disfunção diastólica, lesão miocárdica, dentre outras

(SOUZA et al., 2008; PASCON et al., 2010; SANTANA et al., 2012). À necropsia

pode-se evidenciar coração aumentado de tamanho e apresentando formato

globoso com dilatação da câmara cardíaca direita (ANDRADE; ANDRADE,

1980; LANA et al., 1988; ALMEIDA et al., 2013).

Diante destes sinais clínicos e anatomopatológicos, cabe ressaltar a

importância de incluir a Doença de Chagas como diagnóstico diferencial de

outras doenças que apresentam sinais clínicos inespecíficos, associados ou não

a doenças cardiovasculares (SANTANA et al., 2012).

3.7 Diagnóstico

O diagnóstico da infecção pelo T. cruzi deve ser realizado através do

exame clínico e epidemiológico, juntamente com o auxílio de técnicas

laboratoriais parasitológicas, sorológicas e moleculares (LUQUETTI; RASSI,

2000).

Na fase aguda da infecção é possível evidenciar o parasito no sangue

periférico com maior facilidade e as manifestações clínicas geralmente estão

presentes (COURA et al., 2012). Na fase crônica, ocorre o período de latência

clínica, no qual o paciente pode apresentar sinais clínicos somente após anos

de infecção. Nesta fase, a carga parasitária no sangue diminui, e isso dificulta a

visualização do parasito no exame parasitológico direto, sendo necessário lançar

mão de técnicas mais sensíveis, como os métodos diagnósticos indiretos (DIAS;

MACEDO, 2005).

O exame parasitológico consiste em uma observação direta, que visa

identificar o parasita circulante no sangue periférico. Apresenta elevada

sensibilidade e especificidade na fase aguda e baixa sensibilidade nos casos

crônicos (COURA et al., 2012). Dentre as técnicas utilizadas, cita-se pesquisa à

fresco dos tripanossomatídeos, a técnica de esfregaço convencional, esfregaço

de gota espessa, método de Strout, capa de leucócitos e/ou xenodiagnóstico

(BRASIL, 2004; OPAS, 2009).

21

Adicionalmente, são utilizadas as técnicas sorológicas no intuito de

complementar o diagnóstico parasitológico, principalmente quando o paciente se

encontra na fase crônica da doença. Os testes sorológicos mais utilizados são a

Hemoaglutinação Indireta (HAI), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e

o Teste Imunoenzimático (ELISA) (BRASIL, 2004; OPAS, 2009). Por serem

testes com sensibilidade elevada e de baixo custo, são amplamente utilizados

nas triagens de doadores de sangue e em inquéritos epidemiológicos (COURA

et al., 2012).

A RIFI é muito utilizada em estudos epidemiológicos por apresentar

elevada sensibilidade, entretanto, apresenta reações cruzadas entre o T. cruzi e

Leishmania sp, pelo fato desses parasitas apresentarem proximidade

filogenética, podendo levar a resultados falso-positivos (De MARCHI; NETO;

ALMEIDA, 2007; LUCIANO et al., 2009). Desta forma, preconiza-se que a

confirmação do diagnóstico de infecção por T. cruzi deva ser feita pelo emprego

de duas técnicas sorológicas diferentes, sendo uma de elevada sensibilidade,

como o ELISA ou RIFI, e outra com elevada especificidade, como a HAI

(LUQUETTI et al., 2003; CONSENSO BRASILEIRO EM DOENÇA DE CHAGAS,

2005).

O diagnóstico molecular realizado através da Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) é amplamente utilizado na confirmação da infecção por T.

cruzi, principalmente em indivíduos com resultados discrepantes nos exames

sorológicos (SALLES et al., 1996). Caracteriza-se por ser uma técnica rápida,

sensível e por necessitar de pequenas quantidades de DNA do parasita para

identificá-lo na amostra (STURM et al., 1989; LUQUETTI; RASSI, 2000;

GALVÃO et al., 2003; COURA et al., 2012).

O diagnóstico molecular através da PCR geralmente é utilizado no

acompanhamento de pacientes que iniciaram o tratamento, bem como na

identificação do DNA de T. cruzi principalmente na fase crônica da infecção. Em

ambas as situações a carga parasitária torna-se reduzida, dificultando o

diagnóstico através dos métodos parasitológicos (STURM et al., 1989; ÁVILA et

al., 1990; GALVÃO et al., 2003). A PCR também tem sido utilizada no diagnóstico

22

ou confirmação da doença crônica em cães a partir da amplificação do DNA do

cinetoplasto (LUCHEIS et al., 2005).

Como foi mencionado, atualmente estão disponíveis e padronizadas

diversas técnicas diagnósticas para a Doença de Chagas. Entretanto, por ser

uma doença multissistêmica e apresentar sinais clínicos muitas vezes

inespecíficos, seu diagnóstico torna-se difícil, principalmente em regiões

endêmicas (SOUZA et al., 2008), o que ressalta a importância de manter a

vigilância epidemiológica.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Características do município

O estudo foi realizado no município de Ituberá, situado na região Sudeste

da Bahia (13º 43’ S 39º 08’ O), distante aproximadamente 150 km da capital

baiana, Salvador. A região tem clima quente, temperatura média de 25,3º C e

amplitude térmica anual de 5,6º C, com pluviosidade anual variando entre 1.800

e 2.400mm, distribuídos ao longo do ano. O bioma do município é representado

pela Mata Atlântica. O município tem uma população aproximada de 29.108

habitantes, área total de 417 km2 e densidade de 63,73 habitantes/km2 (IBGE,

2014).

23

Figura 2. Localização de Ituberá na Bahia.

Fonte: Wikipédia

4.2 Animais e amostragem

Foram estudados 392 cães domiciliados do município de Ituberá, Bahia.

O cálculo do tamanho amostral foi realizado utilizando-se o software Epi Info

3.5.2, com intervalo de confiança de 95%, considerando-se o tamanho da

população canina como sendo 12% da população humana do município

(CIFUENTES, 1988). A coleta das amostras foi realizada no período de julho a

novembro de 2015 e distribuída homogeneamente pelos bairros do município,

abrangendo tanto a zona rural quanto a zona urbana, respeitando a proporção

da população de cada bairro em relação à população total do município. Para

cada residência visitada, um máximo de dois cães foi avaliado. A pesquisa foi

aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade

Estadual de Santa Cruz, sob o protocolo 028/12.

24

4.2.1 Coleta de dados epidemiológicos

Os proprietários dos animais incluídos no estudo foram submetidos a um

questionário epidemiológico (Anexo). Para tanto, eles deveriam ser maiores de

idade, e, no momento da visita, serem responsáveis pelo domicílio. As perguntas

foram elaboradas com a finalidade de identificar os fatores de risco de exposição

dos animais ao agente etiológico e vetores de T. cruzi no município de Ituberá.

Os fatores de risco avaliados foram idade dos animais, presença de gambás no

peridomicílio, ausência de reboco nas casas, galinheiro no peridomicílio,

presença de muitas árvores na vizinhança e localização da moradia (zona rural

ou urbana).

4.3 Obtenção das amostras biológicas

Foram coletados 5mL de sangue a partir de punção da veia cefálica ou

jugular dos cães. As amostras foram separadas em dois tubos, sendo um sem

anticoagulante, para a realização de testes sorológicos, e o outro com

anticoagulante (EDTA), para procedimentos de biologia molecular.

Posteriormente, foram refrigeradas e encaminhadas ao laboratório de Genética

Veterinária da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC).

4.4 Extração de DNA

O sangue armazenado no tubo com EDTA foi centrifugado para obtenção

das capas de leucócitos, das quais o DNA foi extraído utilizando o kit Easy-DNA

(Invitrogen®) e posteriormente estocado à temperatura de -20° C. Antes da

utilização, a concentração de DNA de cada amostra foi quantificada através do

NanoDrop 2000 (ThermoScientific) para posterior realização da PCR.

4.5 Análise molecular

Primeiramente, a integridade do DNA foi verificada utilizando os primers

GAPDH (5’ CCAAAGTTGTCATGGATGA 3’ e 5’ CCTTCATTGACCTCAACTAC

3’).

Para a amplificação do DNA de T. cruzi foram utilizados os primers P35:

5’ AAATAATGTACGGGGGAGATGCATGA 3’ e P36: 5’

25

GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT 3’, que amplificam um fragmento de 330 pb

(ÁVILLA et al., 1990). As condições da reação foram adaptadas da metodologia

descrita por Ávila et al. (1990). De maneira simplificada, a Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) foi realizada utilizando 1,0x de tampão da Taq DNA

polimerase, 1,5mM de MgCl2, 2mM de cada dNTPs, 10 pmoles de cada primer,

1,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®) e 100ng do DNA genômico. As

condições termocíclicas foram: 94ºC por 1 min, 61ºC por 1 min para anelamento

dos primers e extensão final com 1 min a 72ºC num total de 35 ciclos.

O controle positivo foi proveniente da extração do DNA de formas

epimastigotas provenientes da cultura da cepa Tc II (antiga cepa y) de T. cruzi e

o controle negativo foi água ultrapura. A cultura de T. cruzi foi cedida pela

pesquisadora Danielle Oliveira dos Anjos do Centro de Pesquisa Gonçalves

Muniz (UESC).

Os produtos das PCRs foram submetidos à eletroforese em gel de

agarose a 2% contendo Sybr (Invitrogen®). A presença de bandas foi analisada

com o auxílio do transiluminador (Loccus Biotecnologia).

4.6 Avaliação sorológica

Amostras de sangue venoso dispensadas em tubos sem anticoagulantes

foram centrifugadas para obtenção de soro, que foi armazenado a -20° C.

Posteriormente, a detecção de anticorpos anti-Leishmania spp. foi realizada

através de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando lâminas de

silicato sensibilizadas com promastigotas L. chagasi (UNESP Jaboticabal) e um

conjugado anti-dog (ITCF F7884, SigmaTM). Para a leitura das lâminas, foi

utilizado microscópio com sistema de epifluorescência (OLYMPUS, BX 51®).

A reação foi adaptada daquela anteriormente descrita por Camargo e

Rebonato (1969). Consideraram-se como positivas as reações que

apresentaram completa fluorescência na periferia das promastigotas,

considerando como ponto de corte a diluição de1:40. O protocolo de realização

da RIFI encontra-se no Anexo B

26

4.7 Análise estatística

Para analisar os fatores associados à infecção foi realizada uma análise

bivariada utilizando o programa Epi-Info 3.5.1. Cada variável independente foi

cruzada com a dependente (positivo ou negativo), sendo considerado

significativo p<0,05.

5 RESULTADOS

5.1. Diagnóstico molecular

Dos 392 cães avaliados no presente estudo, apenas 2 (0,51%), um macho

e uma fêmea, foram positivos no diagnóstico molecular de T. cruzi (Figuras 3 e

4).

Figura 3. Fotografia de eletroforese em gel de agarose 2,0%, corado com Sybr, evidenciando os amplímeros relativos à PCR para T. cruzi. Canaleta 1 e 12: Marcador de peso molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen R), canaleta 2: controle negativo, caneleta 3 e 13: controle positivo (330pb), canaleta 15: amostra de cão positivo (seta), canaletas 4 a 10, 14 e 16: amostras de cães negativos. Canaleta 11 não contém amostra. Fonte: Arquivo pessoal, 2015.

27

5.2 Diagnóstico sorológico

Dos 392 cães avaliados, 55 foram sorologicamente positivos para L.

chagasi. Entretanto, não houve reação cruzada entre Leishmania e T. cruzi,

tendo em vista que os animais positivos na PCR para T. cruzi foram negativos

na sorologia para L. chagasi e os animais positivos na sorologia para L. chagasi,

foram negativos na PCR de T. cruzi.

5.3 Fatores de risco associados à infecção por T. cruzi.

Quanto à avaliação dos fatores de risco, os resultados não foram

significativos (p > 0,05) quando submetidos à análise estatística.

Figura 4. Fotografia de eletroforese em gel de agarose 2,0%, corado com Sybr, evidenciando os amplímeros relativos à PCR para T. cruzi. Canaleta 1: Marcador de peso molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen R), canaleta 2: controle negativo, canaleta 3: controle positivo (330pb), canaleta 6: amostra de cão positivo (seta). Fonte: Arquivo pessoal, 2015.

28

6 DISCUSSÃO

Ainda são escassos os estudos sobre a infecção natural de cães pelo T.

cruzi, sendo a maior parte das pesquisas nessa espécie realizadas à partir de

infecção experimental e utilizando exames sorológicos como técnica diagnóstica

(BAHIA et al., 2002; PASCON et al., 2010). Isso se dá devido aos elevados

custos inerentes à utilização da técnica de PCR, sendo a mesma utilizada em

caráter experimental ou na confirmação de alguns resultados sorológicos

discrepantes (OPAS, 2009).

Os resultados da PCR encontrados no presente estudo evidenciaram uma

baixa prevalência (0,5%) de infecção natural por T. cruzi em cães, corroborando

com os resultados obtidos por Leça-Júnior et al. (2013), que também

pesquisaram a infecção natural em cães domiciliados utilizando a PCR como

técnica diagnóstica.

As variações nos resultados da PCR podem estar relacionadas ao volume

de sangue coletado, faixa etária dos animais, parasitemia, número de amostras

coletadas por paciente e realização seriada de PCR’s em uma mesma amostra

(ARAÚJO et al., 2002; CASTRO et al., 2002). A baixa positividade deste estudo

pode estar relacionada com alguns dos fatores mencionados acima, como o fato

de ter sido realizada apenas uma coleta de sangue por animal e de ter sido feita

uma única reação de PCR por amostra. Outra possibilidade seria que os animais

infectados desse estudo estivessem na fase crônica da doença ou que eles de

fato não estavam infectados.

Quanto aos dois animais positivos detectados neste estudo, pode-se

afirmar que de fato eles tinham o DNA do parasito no sangue circulante uma vez

que a técnica de PCR possui elevada sensibilidade e os primers utilizados foram

específicos para o diagnóstico do parasito em questão. A positividade desses

cães domiciliados tem grande importância epidemiológica, uma vez que esses

animais atuam como reservatórios do parasito e são importantes fontes de

alimentação do T. infestans e de outros triatomíneos, atraindo estes insetos para

o ambiente doméstico (GÜRTLER et al., 1997; GÜRTLER et al., 2007).

Adicionalmente, um estudo prévio realizado por Gürtler et al. (2005) constatou

que a presença de cães e gatos infectados nos domicílios está significativamente

29

relacionada com a prevalência da infecção em humanos e com a incidência de

T. cruzi.

A região estudada é considerada endêmica tanto para leishmaniose

quando para Doença de Chagas (SESAB, 2013ab). Analisando os resultados

sorológicos do presente estudo, observou-se que não houve reação cruzada nas

amostras testadas, diferentemente do que foi encontrado em estudos prévios

desenvolvidos por Luciano et al. (2009) e Souza et al. (2009). A ausência de

reação cruzada pode estar relacionada ao baixo número de animais positivos

para T. cruzi encontrados neste estudo.

A região de Ituberá está situada em uma região que apresenta risco de

transmissão da Doença de Chagas (SESAB, 2013a) e segundo Secretaria de

Vigilância em Saúde (2015) a transmissão por via oral foi responsável pela

maioria dos casos da doença aguda em humanos no estado da Bahia entre os

anos de 2000 a 2013. Por outro lado, a região estudada abriga focos

remanescentes do principal vetor, denominado T. infestans, mesmo após o

intenso combate de vetores no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

Adicionalmente, existem outras espécies de triatomíneos na região Nordeste,

que até então eram consideradas silvestres, mas que atualmente vem sendo

encontradas em domicílios, apresentando grande importância na transmissão da

doença, como o Panstrongylus megistus, Triatoma brasiliensis e Triatoma

pseudomaculata (DIAS et al, 2000; FERREIRA; SILVA, 2006; ALMEIDA et al.,

2009).

7. CONCLUSÃO

Os resultados deste trabalho permitem concluir que há cães naturalmente

infectados pelo T. cruzi no município de Ituberá-Bahia. Este achado constitui um

alerta aos veterinários, profissionais da saúde e autoridades sanitárias locais

para a possibilidade da transmissão desta zoonose a partir de cães infectados,

os quais podem ser considerados como reservatórios da doença em Ituberá,

Bahia.

30

REFERÊNCIAS

ALMEIDA, A. B. P. F.; PAULA, D. A. J.; OTTON, M. L. P.; JAUNE, F. W.; CRUZ, R. A. S.; MADEIRA, M. F.; NAKAZATO, L.; MENDONÇA, A. J.; PESCADOR, C. A.; SOUSA, V. R. F. Natural infection byTrypanosoma cruzi in one dog in central western Brazil: a case report. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 55, n. 4, p.287-289, 2013.

ALMEIDA, C. E.; FOLLY-RAMOS, E.; PETERSON, A. T.; LIMA-NEIVA, V.; GUMIEL, M.; DUARTE, R.; LIMA, M. M.; LOCKS, M.; BELTRÃO, M.; COSTA, J. Could the bug Triatoma sherlocki be vectoring Chagas disease in small mining communities in Bahia, Brazil? Medical and Veterinary Entomology, v.23, p.410–417, 2009. ANDRADE, Z. A.; ANDRADE, S. G. A patologia da doença de Chagas experimental no cão. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.75, p.77-95, 1980. ARAS, R.; VEIGA, M.; GOMES, I.; MOTA, G.; RODRIGUES, B.; RABELO, R.; GUZMAN-BRACHO, C.; MELO, A. Prevalence of Chagas’ Disease in Mulungu do Morro Northeastern Brazil. Arquivo Brasileiro de Cardiologia, v.78, n.5, p.441-443, 2002. ARAÚJO, F. M. G.; BAHIA, M. T.; MAGALHÃES, N. M.; MARTINS-FILHO, O. A.; VELOSO, V. M.; CARNEIRO, C. M.; TAFURI, W. L.; LANA, M. Follow-up of experimental chronic Chagas’ disease in dogs: use of polymerase chain reaction (PCR) compared with parasitological and serological methods. Acta Tropica, v.81, p.21-31, 2002. ARAÚJO-JORGE, T. C.; CASTRO, S. L. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. In: ANDRADE, S. G. Cão. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2000, p.157-159. ARGOLO, A. M.; FELIX, M.; PACHECO, R.; COSTA, J. Doenças de Chagas e seus principais vetores no Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Rio de janeiro: Editora Imperial Novo Milênio, 2008, 65p. ÁVILA, H.; GONÇALVES, A. M.; NEHME, N. S.; MOREL, C. M.; SIMPSON, L. Schizodeme analysis of Trypanosoma cruzi stocks from South and Central America by analysis of PCR-amplified minicircle variable region sequences. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 42, p.175-188, 1990.

31

BAHIA, M. T.; TAFURI, W. L.; CALIARI, M. V.; VELOSO, V. M.; CARNEIRO, C. M.; COELHO, G. L. L. M.; LANA, M. Comparison of Trypanosoma cruzi infection in dogs inoculated with blood or metacyclic trypomastigotes of Berenice-62 and Berenice-78 strains via intraperitoneal and conjunctival routes. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, n.4, p.339-345, 2002. BARRET, T. V.; HOFF, R.; MOTT, K. E.; GUEDES, F.; SHERLOCK, I. A. An outbreak of acute Chagas’s disease in the São Francisco Valley region of Bahia, Brazil: triatomine vectors and animal reservoirs of Trypanosoma cruzi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, v. 73, n.6, p.703-709, 1979. BRASIL. Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. Doenças Infecciosas e Parasitárias: Guia de Bolso.3ª ed. Brasília: Ministério da Saúde, v.1, 2004. 235p. CDC. American Trypanosomiasis. 2013. Disponível em: < http://www.cdc.gov/dpdx/trypanosomiasisAmerican/>. Acesso em: 16 mar. 2016. CAMACHO, A. A. Cardiomiopatia chagásica em cães. In: BELERENIAN, G. C.; MUCHA, C. J.; CAMACHO, A. A. Afecções Cardiovasculares em Pequenos Animais. São Paulo: Interbook, p.162-165, 2003. CAMARGO, M.E.; REBONATO, C. Cross reactivity in fluorescence tests for Trypanosoma and Leishmania antibodies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 18, n. 4, p. 500-505, 1969.

CAMARGO, M. E.; SILVA, G. R.; CASTILHO, E. A.; SILVEIRA, A. C. Inquérito sorológico da prevalênc|a de infecção chagásica no Brasil, 1975/1980. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v.26, n.4, p.192-204, 1984. CASTRO, A. M.; LUQUETTI, A. O.; RASSI, A.; RASSI, G. G.; CHIARI, E.; GALVÃO, L. M. C. Blood culture and polymerase chain reaction for the diagnosis of the chronic phase of human infection with Trypanosoma cruzi. Parasitology, v.88, p.894-900, 2002. CHAGAS, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.1, p.159-218, 1909.

32

CIFUENTES, E. E. Program for the elimination of urban rabies in Latin America. Reviews of Infectious Diseases, v.10, p. 689-692, 1988. CONSENSO BRASILEIRO EM DOENÇA DE CHAGAS. Secretaria de vigilância em saúde do Ministério da Saúde. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.38, 2005. COSTA, J.; FELIX, M. Triatoma juazeirensis sp. nov. from the state of Bahia, Northeastern Brazil (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.102, n.1, p. 87-90, 2007. COURA, J. R.; BORGES-PEREIRA, J. Chagas disease: 100 years after its discovery. A systemic review. Acta Tropica, v.115, p.5-13, 2010. COURA, J. R.; MOREIRA, C. J. C.; JUNQUEIRA, A. C. V. A doença de chagas na região Amazônica. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2012. 69p. Laboratório de Doenças Parasitárias do Instituto Oswaldo Cruz. COURA, J. R.; VIÑAS, P. A. Chagas disease: a new worldwide challenge. Nature/ Outlooks, 2010. DE MARCHI, C. R.; NETO, V. A.; ALMEIDA, I. C. Comportamento do método quimioluminescente-ELISA em relação a resultados considerados discordantes por meio de três técnicas convencionais para diagnóstico da doença de Chagas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.40, n.1, p.68-70, 2007. DIAS, J.C.P.; COURA, J. R. Trypanosoma cruzi: Morfologia e Ciclo Evolutivo. In: BRENER, Z. Clínica e terapêutica da doença de Chagas: uma abordagem prática para o clínico geral. Rio de Janeiro: Fundação Oswaldo Cruz, p.25-30, 1997. DIAS, J.C.P.; MACEDO, V.O. Doença de Chagas. In: JR Coura, Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 555-593, 2005. DIAS, J. C. P.; MACHADO, E. M. M.; FERNANDES, A. L.; VINHAES, M. C. Esboço geral e perspectivas da doença de Chagas no Nordeste do Brasil. Caderno de Saúde Pública, v.16, p.13-34, 2000.

33

DNDi. DNDi na imprensa. 2013. Disponível em: < http://www.dndial.org/pt/centro-de-documentacao/dndi-na-imprensa/548-07-06-2013-valor.html>. Acesso em: 7 jan. 2016. FERREIRA, I. L. M.; SILVA, T. P. T. Eliminação da transmissão da doença de Chagas pelo Triatoma infestans no Brasil: um fato histórico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.39, n.5, p.507-509, 2006. GALVÃO, C.; CARCAVALLO, R.; ROCHA, D. S.; JURBERG, J. A checklist of the current valid species of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera, Reduviidae) and their geographical distribution, with nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa, v. 202, p.1-36, 2003. GONÇALVES, T. C. M.; TEVES-NEVES, S. C.; SANTOS-MALLET1, J. R.; CARBAJAL-DE-LA-FUENTE, A. L.; LOPES, C. M. Triatoma jatai sp. nov. in the state of Tocantins, Brazil (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 108, n.4, p.429-437, 2013. GÜRTLER, R. E.; CECERE, M. C.; LAURICELLA, M. A.; CARDINAL, M. V.; KITRON, U.; COHEN, J. E. Domestic dogs and cats as sources of Trypanosoma cruzi infection in rural northwestern Argentina. Parasitology, v.134, p.69-82, 2007. GÜRTLER, R. E.; CECERE, M. C.; LAURICELLA, M. A.; PETERSEN, R. M.; CHUIT, R.; SEGURA, E. L.; COHEN, J. E. Incidence of Trypanosoma cruzi infection among children following domestic reinfestation after insecticide spraying in rural northwestern Argentina. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.73, p.95–103, 2005. GÜRTLER, R. E.; COHEN, J. E.; CECERE, M. C.; CHUIT, R. Shifting host choices of the vector of Chagas disease Triatoma infestans in relation to the availability of hosts in houses in north-west Argentina. Journal of Applied Ecology, v.34, p. 699–715, 1997. IBGE. Cidades@. 2014. Disponível em: <http://www.cidades.ibge.gov.br/xtras/perfil.php?lang=&codmun=291730&search=||infogr%E1ficos:-informa%E7%F5es-completas>. Acesso em: 18 jan. 2016. JURBERG, J.; ROCHA, D. S.; GALVÃO, C. Rhodnius zeledoni sp. nov. afim de Rhodnius paraensis Sherlock, Guitton & Miles, 1977 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae). Biota Neotropica, v.9, n.1, p.123-128, 2009.

34

JURBERG, J.; RODRIGUES, J. M. S.; MOREIRA, F. F. F.; DALE, C.; CORDEIRO, I. R. S.; JR, V. D. L.; GALVÃO, C.; ROCHA, D. S. Atlas iconográfico dos triatomíneos do Brasil (vetores da Doença de Chagas). Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 58p., 2014. LANA, M.; TAFURI, W. L.; CALIARI, M. V.; BAMBIRRA, E. A.; CHIARI, C. A.; LEITE, V. H. R.; BARBOSA, A. J. A.; TOLEDO, M. J. O.; CHIARI, E. Fase crônica cardíaca fibrosante da tripanossomíase cruzi experimental no cão. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.21, n.3, p.113-121, 1988. LAPPIN, M. R. Infecções protozoárias e mistas. In: ETTINGER, S. J.; FELDMAN, E. C. Tratado de Medicina Veterinária Interna: doenças do cão e do gato. São Paulo: Manole, 1997, p.431-440. LEÇA-JÚNIOR, N. F.; ALMEIDA, V. A.; CARVALHO, F. S.; ALBUQUERQUE, G. R.; SILVA, F. L. First report of Trypanosoma cruzi infection in naturally infected dogs from southern Bahia, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.22, n.1, p.182-185, 2013. LENT, H.; WYGODZINSKY, P. W. Revision of theTriatominae (Hemiptera, Reduviidae), and their significance as vectors of Chagas’ disease. Bulletin of the AMNH. New York: American Museum of Natural History, v. 163, n.3, 1979. LUCHEIS, S. B.; SILVA, A. V.; ARAÚJO JR, J. P.; LANGONI, H.; MEIRA, D. A.; MARCONDES-MACHADO, J. Trypanosomatids in dogs belonging to individuals with chronic chagas’ disease living in Botucatu town and surrounding region, São Paulo state, Brazil, Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, v.11,n.4, p.492-509, 2005. LUCIANO, R. M.; LUCHEIS, S. B.; TRONCARELLI, M. Z.; LUCIANO, D. M.; LANGONI, H. Avaliação da reatividade cruzada entre antígenos de Leishmania spp e Trypanosoma cruzi na resposta sorológica de cães pela técnica de imunofluorescência indireta (RIFI). Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.46, n.3, p.181-197, 2009. LUQUETTI, A.O.; PONCE, C.; PONCE, E.; ESFANDIARI, J.; SCHIJMAN, A.; REVOLLO, S.; AÑEZ, N.; ZINGALES, B.; RAMGEL-ALDAO, R.; GONZALEZ, A.; LEVIN, M. J.; UMEZAWA, E. S.; SILVEIRA, J. S. Chagas’ disease diagnosis: a multicentric evaluation of Chagas Stat-Pak, a rapid immunochromatographic assay with recombinant proteins of Trypanosoma

35

cruzi. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v.46, p.265-271, 2003. LUQUETTI, A.O.; RASSI, A. Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo Trypanosoma cruzi. In: BRENER, Z.; ANDRADE, Z.; BARRAL-NETO, M. Trypanosoma cruzi e doença de Chagas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000, p.344 – 378. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Descrição da doença. 2014. Disponível em:<http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-ministerio/principal/leia-mais-o-ministerio/646-secretaria-svs/vigilancia-de-a-a-z/doenca-de-chagas/l2-doenca-de-chagas/11113-descricao-da-doenca-de-chagas>. Acesso em: 14 dez. 2015. MOTT, K. E.; MOTA, E. A.; SHERLOCK, I.; HOFF R.; MUNIZ, T.M.; OLIVEIRA, T.S.; DRAPPER, C. C. Trypanosoma cruzi infection in dogs and cats and household seroreactivity to T. cruzi in a rural community in northeast Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.27, n.6, p.1123-1127, 1978. NELSON, R. W.; COUTO, C. G. Tripanossomíase Americana. In: NELSON, R. W.; COUTO, C. G. Medicina Interna de Pequenos Animais. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006. p. 1266 – 1267. OLIVEIRA, D. M.; LONARDONI, M. V. C.; TEODORO, U.; SILVEIRA, T. G. V. Comparison of different primers for PCR-based diagnosis of cutaneous leishmaniasis. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 15, n. 3, p. 204- 210, 2008. OPAS. Guia para vigilância, prevenção, controle e manejo clínico da doença de Chagas aguda transmitida por alimentos. Rio de Janeiro: PANAFTOSA-VP/OPAS/OMS, 2009, 92p PASCON, J. P. E.; NETO, G. B. P.; SOUSA, M. G.; JÚNIOR, D. P.; CAMACHO, A. A. Clinical characterization of chronic chagasic cardiomyopathy in dogs. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.30, n.2, p.115-120, 2010. PAVARINI, S. P.; OLIVEIRA, E. C.; BANDARRA, P. M.; LEAL, J. S.; UMEZAWA, E. S.; ROZZA, D. B.; DRIEMEIER, D. Miocardite chagásica em caninos no Estado do Rio Grande do Sul. Ciência Rural, v. 39, n.4, p.1243-1247, 2009.

36

RIBEIRO JR, G.; GURGEL-GONÇALVES, R.; REIS, R. B.; SANTOS, C. G. S.; AMORIM, A.; ANDRADE, S. G.; REIS, M. G. Frequent House Invasion of Trypanosoma cruzi-Infected Triatomines in a Suburban Area of Brazil. Neglected Tropical Diseases, v.9, n.4, 2015. SALLES, N. A.; SABINO, E. C.; CLIQUET, M. G.; ELUF-NETO, J.; MAYER, A.; ALMEIDA-NETO, C.; MENDONÇA, M. C.; DORLIACH-LLACER, P.; CHAMONE, D.F.; SAÉZ-ALQUÉZAR, A. Risk of exposure to Chagas disease among seroreactive Brazilian blood donors. Transfusion, v. 36, p. 969-973, 1996. SANTANA, V. L.; SOUZA, A. P.; LIMA, D. A. S. D.; ARAÚJO, A. L.; JUSTINIANO, S. V.; DANTAS, R. P; GUEDES, P. M. M.; MELO, M. A. Caracterização clínica e laboratorial de cães naturalmente infectados com Trypanosoma cruzi no semiárido nordestino. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.32, n.6, p.536-541, 2012. SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE. Boletim epidemiológico. Ministério da Saúde, v.46, n.21, p.1-9, 2015. SCHMUNIS, G. A. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries: the role of international migration. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.102, p.75-85, 2007. SESAB. Situação da leishmaniose tegumentar americana (LTA) no estado da Bahia. 2013b. Disponível em: <http://www.suvisa.ba.gov.br/sites/default/files/Bletim%20de%20leishmaniose%20TEGUMENTAR_2013_0.pdf>. Acesso em 22 jan.2016. SESAB. Situação epidemiológica da doença de Chagas- Bahia. 2013a. Disponível em: <http://www.suvisa.ba.gov.br/sites/default/files/2%20boletim_epidemiologico%20Chagas%20%5B1%5D.pdf>. Acesso em 21 jan. 2016. SOUZA, W.; CARVALHO, T. M. U.; BARRIAS, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host cell interation. International Journal of Cell Biology, p.1-18, 2010. SOUZA, A. I.; OLIVEIRA, T. M. F. S.; MACHADO, R. Z.; CAMACHO, A. A. Soroprevalência da infecção por Trypanosoma cruzi em cães de uma área rural do Estado de Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 29, n.2, p. 150-152, 2009.

37

SOUZA, A. I.; PAULINO-JUNIOR, D.; SOUSA, M. G.; CAMACHO, A. A. Aspectos clínico-laboratoriais da infecção natural por Trypanosoma cruzi em cães de Mato Grosso do Sul. Ciência Rural, v.38, n.5, p.1351-1356, 2008. STURM, N. R.; DEGRAVE, W.; MOREL, C.; SIMPSON, L. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 33, p.205-214, 1989. TANOWITZ, H. B.; WEISS, L. M.; MONTGOMERY, S. P. Chagas disease has now gone global. PLoS Neglected Tropical Diseases, v.5, p.1-2, 2011. VINHAES, M. C.; DIAS, J. C. P.; Doença de Chagas no Brasil. Cadernos de Saúde Pública, v.16, p.7-12, 2000. ZINGALES, B.; ANDRADE, S. G.; BRIONES, M. R. S.; CAMPBELL, D. A.; CHIARI, E.; FERNANDES, O.; GUHL, F.; LAGES-SILVA, E.; MACEDO, A. M.; MACHADO, C. R.; MILES, M. A.; ROMANHA, A. J.; STURM, N. R.; TIBAYRENC, M.; SCHIJMAN, A. G. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraespecific nomenclature: second revision meeting recommends Tcl to TcVI. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 104, n. 7, p.1051-1054, 2009. ZINGALES, B.; MILES, M. A.; CAMPBELL, D. A.; TIBAYRENC, M.; MACEDO, A. M.; TEIXEIRA, M. M. G.; SCHIJMAN, A. G.; LLEWELLYN, M. S.; LAGES-SILVA, E.; MACHADO, C. R.; ANDRADE, S. G.; STURM, N. R. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: Rationale, epidemiological relevance and research applications. Infection, Genetics and Evolution, v.12,

p.240-253, 2012. WESTPHALEN, E. V. N.; BISUGO, M. C.; ARAÚJO, M. F. L. Aspectos epidemiológicos e históricos do controle da doença de Chagas no Continente Americano. Boletim Epidemiológico Paulista (BEPA), v.9, n.105, p.17-34, 2012. WHO. Control and prevention of chagas disease in Europe: report of a WHO informal consultation (jointly organized by WHO headquarters and the WHO Regional Office for Europe), Geneva: World Health Organization. 2010. WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). 2016. Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/>. Acesso em: 17 jan. 2016.

38

WIKIPÉDIA. Ituberá.2016. Disponível em: <

https://pt.wikipedia.org/wiki/Ituber%C3%A1>. Acesso em: 16 mar. 2016. WOODS, J. P.; DECKER, L. S.; MEINKOTH, J.; STEURER, F. Lymph node aspirate from a 4-month-old Mastiff with weight loss, lymphadenopathy, and pyrexia. Veterinary Clinical Pathology, v. 29, p. 137–139, 2000.

39

ANEXOS

Anexo A - Questionário epidemiológico

Proprietário Nome:_________________________________________________________ Endereço:______________________________________________________ Zona: ( ) rural ( ) urbana Telefone: _______________________________________________________ E-mail:_________________________________________________________ Data de nascimento: ____/_____/______ Animal Nome:________________________________________________________ Número:_______ Raça:________________________________________________________ Sexo: ( ) M ( ) F Idade:________ O domicílio, mesmo que esporadicamente, é visitado por gambás? Sim ( ) Não ( ) Na vizinhança tem muitas árvores? Sim ( ) Não ( ) No peridomicílio tem galinheiro? Sim ( ) Não ( ) A casa possui reboco? Sim ( ) Não ( )

40

Anexo B - Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania spp, Retirar as lâminas do refrigerador e deixe-as secar em temperatura ambiente por

10 a 15 minutos;

2. Adicionar 10 µL do soro controle negativo na cavidade de número 6 da lâmina

e 10 µL do soro controle positivo na cavidade 7;

3. Adicionar 10 µL dos soros teste diluídos nas cavidades restantes, registrando-

se a posição de cada uma conforme a marcação na lâmina;

4. Incubar as lâminas por 30 minutos em estufa a 37°C, em câmara úmida;

5. Utilizando cuba de vidro, lavar as lâminas três vezes em PBS 1X concentrado,

5 minutos em cada lavada;

6. Adicionar 10 µLdo conjugado diluído em azul de Evans e PBS;

7. Incubar as lâminas por 30 minutos em estufa a 37°C, em câmara úmida;

8. Utilizando cuba de vidro, lavar as lâminas três vezes em PBS 1X concentrado,

5 minutos em cada lavada;

9. Montar as lâminas com lamínula e glicerina tamponada, e fazer a leitura em

microscópio equipado para leitura de imunofluorescência, usando objetiva de 40

X.

Observação: Após a montagem, proteger as lâminas da exposição à luz e fazer

a leitura em seguida.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

1. Reação positiva: os parasitas apresentarão fluorescência esverdeada

distribuída por toda a sua superfície.

2. Reação negativa: não haverá fluorescência e o campo aparecerá escuro.