UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA -UESB … · Ao meu marido, Hércules, meu refúgio em...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA -UESB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS Área de Concentração: Ciência de Alimentos VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE IVERMECTINA EM LEITE DE VACA COM USO DE ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER COM REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FTIR-ATR) Autora: Valdirene Rodrigues Santana ORIENTADOR: Prof. Dr. Sérgio Augusto de Albuquerque Fernandes ITAPETINGA BA-BRASIL Fevereiro/2017
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA -UESB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Área de Concentração: Ciência de Alimentos
VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE
IVERMECTINA EM LEITE DE VACA COM USO DE ESPECTROSCOPIA DE
INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER COM
REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FTIR-ATR)
Autora: Valdirene Rodrigues Santana
ORIENTADOR: Prof. Dr. Sérgio Augusto de Albuquerque Fernandes
ITAPETINGA
BA-BRASIL
Fevereiro/2017
VALDIRENE RODRIGUES SANTANA
VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE
IVERMECTINA EM LEITE DE VACA COM USO DE ESPECTROSCOPIA DE
INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER COM
REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FTIR-ATR)
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Augusto de Albuquerque Fernandes
Co-orientadores: Profª. Drª. Sibelli Passini Barbosa Ferrão
Prof. Dr. Leandro Soares Santos
ITAPETINGA
BAHIA-BRASIL
Fevereiro/2017
Dissertação apresentada como parte das
exigências para obtenção do Título de
Mestre em Engenharia e Ciência de
Alimentos, no Programa de Pós-Graduação
em Engenharia e Ciência de Alimentosda
Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia.
Catalogação na fonte:
Angélica Renata de Castro - CRB/6 - 2746
Bibliotecária Documentalista
Índice sistemático para desdobramento por assunto:
1. Ivermectina - Leite de vaca
2. Leite de vaca - Espectroscopia
3. Leite de vaca - Espectroscopia FTIR-ATR
637
S231v
Santana, Valdirene Rodrigues
Validação de metodologia para detecção e quantificação de
ivermectina em leite de vaca com uso de espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR) /
Valdirene Rodrigues Santana. Itapetinga: UESB, 2016.
75 p.
Dissertação apresentada à Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia, como parte das exigências do Programa de Pós Graduação em
Engenharia e Ciência de Alimentos, área de concentração em Ciência de
Alimentos para obtenção do título de "Mestre". Sob a orientação do Prof. DSc.
Sérgio Augusto de Albuquerque Fernandes e co-orientação da Profª. Sibelli
Passini Barbosa Ferrão e do Prof. DSc. Leandro Soares Santos.
1. Ivermectina - Leite de vaca. 2. Leite de vaca - Espectroscopia. 3.
Leite de vaca - Espectroscopia FTIR-ATR I. Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia. Pós Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos. II.
Fernandes, Sérgio Augusto de Albuquerque. III. Título.
.
CDD(21):637
ii
"Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer. "
Mahatma Gandhi
iii
À minha mãe, maior amor da minha vida
Ao meu pai por estar sempre me esperando
Aos meus irmãos, Wágneton e Vanessa, que são meu incentivo e minha força.
Aos meus Ninos, Rayanne e Raysson, meus grandes amores e inspiração
Ao meu marido, Hércules, meu refúgio em todos os momentos de angústia durante esses 2
anos.
Então, a vocês, minha família, por quem dedicarei todo o meu esforço em todos os dias da
minha vida.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me acompanhar e me iluminar durante todo o tempo durante o curso.
À minha mãe, por sempre acreditar em mim, incentivar, guiar, acolher e ser a maior
razão das minhas lutas e vitórias.
Ao meu pai, Valdivino, por sempre me esperar, ansiosamente, a cada período distante.
Aos meus irmãos, Wágneton e Vanessa, por serem meus pilares, minha força, por toda
confiança de que sempre estarei do lado de vocês e, de fato, estarei.
Aos meus ninos, Rayanne e Raysson, meus grandes amores, fonte da minha força, alívio
das minhas angústias, meus presentinhos de Deus.
Ao meu marido, Hércules, pela compreensão, companheirismo, incentivo e por estar
sempre presente, ainda que fisicamente distante.
Ao meu tio, José Márcio, por sempre fazer papel de pai, inclusive durante o curso.
Às minhas amigas-irmãs, Danuta e Sheyla, pela fiel amizade, companheirismo e
conversas nas madrugadas que foram tão importantes nos momentos mais difíceis nesse tempo.
Ao meu, mais que orientador, um verdadeiro amigo todo esse tempo, Sérgio Fernandes,
por toda paciência e orientação que dedicou a mim.
Aos professores Leandro Soares e Camila Messias pelos ensinamentos e
disponibilidade.
Às minhas amigas, Acsa, Rebeca, Josi e Karine, pelo apoio nos momentos mais difíceis
em Itapetinga e por aliviarem os fardos que, muitas vezes, carreguei.
Aos meus colegas de mestrado, por participarem da minha conquista.
Ao programa de pós-graduação em Engenharia Ciência de Alimentos pela realização do
curso.
Aos amigos e companheiros de trabalho do IFNMG – Campus Salinas, Karina, José
Aparecido, Fábio, Edilene e Dênis, pelo esforço que fizeram para que eu pudesse realizar o
curso e a Osmar e a professora Araci pela oportunidade de fazê-lo em condição de afastamento.
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. vii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................................................... ix
RESUMO ................................................................................................................................... x
ABSTRACT .............................................................................................................................. xi
I REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................................... 1
1.1 Introdução ............................................................................................................................. 1
1.2 A produção de leite ........................................................................................................... 2
1.3 O leite ................................................................................................................................ 3
1.4 Uso de medicamentos veterinários e segurança do leite ................................................... 4
1.5 Avermectinas .................................................................................................................... 6
1.5.1 Ivermectinas ............................................................................................................... 8
1.6 Espectroscopia de Infravermelho .................................................................................... 10
1.6.1 Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)..................... 15
1.6.2 Aplicação da Espectroscopia de Infravermelho na indústria de alimentos .............. 17
1.7 Quimiometria .................................................................................................................. 20
1.7.1 Análise de Componentes Principais ......................................................................... 21
1.7.2 Análise Discriminante .............................................................................................. 22
1.8 Redes Neurais Artificiais (RNA) .................................................................................... 24
1.9 Referências Bibliográficas .............................................................................................. 26
II OBJETIVOS ......................................................................................................................... 38
2.1 Objetivo geral ................................................................................................................. 38
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 38
III CAPÍTULO 1 - USO DA ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO POR
TRANSFORMADA DE FOURIER COM REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FTIR-
ATR) ASSOCIADO A QUIMIOMETRIA COMO TESTE DE TRIAGEM PARA
IVERMECTINA EM LEITE.................................................................................................... 39
RESUMO .............................................................................................................................. 39
vi
ABSTRACT .......................................................................................................................... 40
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 41
2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 42
2.1 Origem das amostras ................................................................................................... 42
2.2 Delineamento experimental......................................................................................... 42
2.3 Preparo das amostras ................................................................................................... 42
2.4 Análise espectrofotométrica vibracional ..................................................................... 43
2.5 Caracterização e comparação dos espectros das amostras .......................................... 43
2.6 Medidas de Dispersão e Padronização da Matriz de Dados........................................ 43
2.6.1 Construção das matrizes de dados utilizadas nas técnicas multivariadas. ........... 43
2.7 Análise Estatística ....................................................................................................... 44
2.7.1 Análise de Componentes Principais .................................................................... 44
2.7.2 Análise discriminante .......................................................................................... 45
2.8 Redes Neurais Artificiais ............................................................................................ 45
2.8.1 Arquitetura e desenvolvimento das RNA’s ......................................................... 45
2.8.2 Treinamento e Validação ..................................................................................... 46
2.8.2.1 Predição ........................................................................................................ 46
2.8.2.2 Classificação ................................................................................................. 47
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 48
3.1 Caracterização e comparação das amostras de Ivermectina (IVM) e Leite ................ 48
3.2 Análise Estatística Multivariada.................................................................................. 51
3.2.1 Análise de Componentes Principais .................................................................... 51
3.2.2 Análise discriminante .......................................................................................... 53
3.3 Redes neurais artificiais .............................................................................................. 55
3.3.1 Predição ............................................................................................................... 55
3.3.2 Classificação ........................................................................................................ 56
4 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 57
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 58
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura Química da Ivermectina...............................................................................9
Figura 2. Mudança no momento dipolo de molécula heteronuclear diatômica. ....................... 12
Figura 3. Modos Vibracionais .................................................................................................... 6
Figura 4. O sistema FTIR ......................................................................................................... 20
Figura 5. Espectro do Leite por FTIR....................................................................................... 24
CAPÍTULO 1
Figura 1. Espectro no Infravermelho da Ivermectina ............................................................... 48
Figura 2. Espectro no Infravermelho do leite puro ................................................................... 49
Figura 3. Médias dos pontos de máxima intensidade de absorção da Ivermectina, Leite e o leite
adulterado (10µg/L e 20µg/L) ................................................................................................. 51
Figura 4. Escores das amostras de IVM, Leite, Leite adulterado (2 a 10 µg/L) - A e Leite
adulterado (12 a 20 µg/L) - B em relação a CP1 e CP2, em que: A* - I vs L; B* - I vs L vs A vs
B; C* - L vs A vs B ................................................................................................................... 53
Figura 5. Coeficiente de determinação dos dados experimentais e preditos (dados normalizados
0-1) das amostras de leite puro e adulterado para a rede utilizando a função Tangente
Hiperbólica .............................................................................................................................. 56
Figura 6. Valores de RMSE e ciclos da rede com três camadas intermediárias contendo 45
neurônios cada utilizando a função Tangente Hiperbólica ....................................................... 57
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Produção anual de leite por Região (1000 litros) ....................................................... 2
Tabela 2. Participação de cada estado na produção de leite na região Nordeste. ....................... 3
Tabela 3. IDA e LMR de avermectinas no leite. ........................................................................ 8
Tabela 4. Graus de liberdade de moléculas poliatômicas lineares e não lineares. ................... 12
Tabela 5. Regiões do espectro eletromagnético e amostras a que se aplicam. ......................... 13
Tabela 6. Correlação entre as vibrações e as faixas espectrais. ................................................ 14
Tabela 7. Regiões espectrais do leite em FTIR. ....................................................................... 19
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Descrição dos grupos usados nas análises de componentes principais (ACP), análise
discriminante (AD) e Redes Neurais (RN). .............................................................................. 44
Tabela 2. Arquiteturas das redes neurais utilizadas .................................................................. 46
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ACP - Análise de Componentes Principais
AD - Análise Discriminante
CLAE-EM/EM - Cromatografia Líquida De Alta Eficiência Acoplada À Espectrometria De
Massas
CLAE-FL - Cromatografia Líquida De Alta Eficiência Com Detector De Fluorescência
CP’s - Componentes Principais
FAO – Food and Agriculture Organization
ATR - Reflectância Total Atenuada
FTIR – Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
FT-NIR- Espectroscopia no Infravermelho Próximo com Transformada de Fourier
GABA - Ácido Gama-Aminobutírico
IDA - Ingestão Diária Aceitável
IN – Instrução Normativa
IVM - Ivermectina
Lactonas Macrocíclicas (LM)
LMR - Limites Máximos de Resíduos
Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)
MLP - Perceptron Multi-Camadas
PAMVet - Programa de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos
PNCRC - Plano Nacional de Controle de Resíduos
RIISPOA - Regulamento Da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal
RMSE – Raiz Quadrada do Erro Médio
RNA - Rede Neural Artificial
UV – Ultravioleta
x
RESUMO
SANTANA, V. R. Validação De Metodologia Para Detecção e Quantificação De
Ivermectina Em Leite de Vaca Com Uso De Espectroscopia De Infravermelho Com
Transformada de Fourier Com Reflectância Total Atenuada (FTIR-ATR). Itapetinga, BA:
UESB, 2016. 76. p. Dissertação. (Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos, Área de
Concentração em Ciência de Alimentos).
As Ivermectinas (IVM), do grupo das Avermectinas e da família das Lactonas Mocrocíclicas
são usadas rotineiramente em animais de produção como endo e ecto-parasitários e como outros
medicamentos, tem seus resíduos no leite controlados oficialmente. Desenvolvemos o estudo
do tema e apresentamos o conhecimento atual da realidade da produção de leite, do uso da IVM
em animais leiteiros e o controle de seus resíduos no leite, além do uso da espectroscopia
associada à quimiometria na análise de alimentos. Para detecção e quantificação de IVM em
leite usa-se oficialmente a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Esta técnica consome
muito tempo, requer o uso de muitos reagentes químicos e o descarte de seus resíduos, além da
insalubridade do ambiente nos laboratórios. Este conjunto de informações criou a demanda para
o desenvolvimento de novas técnicas, que consigam mitigar estes efeitos. Assim, surge a
Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) que apresenta maior
agilidade no processo, menor custo e tem sido utilizada em análise de alimentos. A utilização
dessa técnica para a detecção de IVM em leite não foi testada e preencher esta lacuna foi o
nosso objetivo. Apresentamos no capítulo 1 os resultados de nosso estudo de validação
metodológica com o uso da Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
associada à quimiometria na detecção de Ivermectina no leite. Leite de vacas sadias que não
tratadas com IVM foi utilizado no estudo. O delineamento experimental foi desenvolvido para
a obtenção dos dados representativos dos espectros do leite adulterado com IVM (diluições
sucessivas no leite), leite puro e padrão de IVM (tratamentos). A análise de componentes
principais classificou o leite adulterado e o leite puro, distintamente. No mesmo sentido as
análises discriminantes classificaram as amostras em leite puro e adulterado da mesma forma
que as redes neurais artificiais. Baseados nos resultados indicamos o uso da espectroscopia
FTIR-ATR como teste de triagem de resíduos de IVM em leite.
Palavras chave: análise discriminante, redes neurais artificias, medicamentos veterinários.
________________________________
*Orientador: Sérgio Augusto de Albuquerque Fernandes, Dr. UESB e Co-orientadores: Sibelli
Passini Barbosa Ferrão, Drª. UESB e Leandro Soares Santos, Dr. UESB.
xi
ABSTRACT
SANTANA, V. R. Validation of the methodology for detection and quantification of Ivermectin
in cow's milk using Fourier transform infrared spectroscopy with attenuated total reflectance
(FTIR-ATR). Itapetinga, BA: UESB, 2016. 75. p. Dissertation. (MSc in Food Science and
Engineering, Food Sciences Concentration Area).
Originally the Ivermectin (IVM) are from the Avermectin group and the Mocrocyclic Lacton
family and are routinely used in animal production as anti-parasitic agents (endo and ecto). Like
other medicines, their residues in the milk are officially controlled. This study was developed
for the know a current knowledge of the reality of milk production, the use of IVM in dairy
animals and the control of its residues in milk, besides the use of spectroscopy associated to
chemometric analysis in food evaluation. For the detection and quantification of Ivermectin in
milk it is officially used the High-Performance Liquid Chromatography. This technique is time
consuming, requires the use of many chemical reagents and the disposal of its residues, in
addition, an unhealthy environment in the laboratories are created. Based on this information
the necessity of a new techniques, that can mitigate these effects, was observed. Thus, Fourier
transform infrared with attenuated total reflectance (FTIR-ATR) appears as technical that
presents greater agility in the process, lower cost and has been used in food analysis. However,
the use of FTIR-ATR for the detection of IVM in milk was not tested and filling this gap was
our goal. We present in Chapter 1 the results of our study with the use of FTIR-ATR associated
with chemometric in the detection of Ivermectin in milk. Milk from healthy cows that had not
been treated with IVM was used in the study. The experimental design was developed to obtain
the representative data of the spectra of adulterated milk with IVM (successive dilutions in
milk), pure milk and standard of IVM (treatments). Principal component analysis results
classified adulterated milk and pure milk distinctly. In the same sense, discriminant analyzes
and artificial neural networks classified the samples into pure and adulterated milk. Based on
the results, we indicate the use of FTIR-ATR spectroscopy as a screening test for IVM residues
in milk.
Keywords: artificial neural networks, discriminant analyzes, veterinary medicine
1
I REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Introdução
Produzido em todo o território nacional, o leite representa um dos principais
produtos da agropecuária brasileira, gerando emprego e renda no campo. Associado aos
fatores de ordem econômica e social, tem-se fator nutricional, por ser este fonte de
nutrientes necessários aos seres humanos.
A contaminação do leite representa riscos à saúde dos consumidores e estão
relacionadas tanto a parâmetros microbiológicos quanto químicos. Os contaminantes
microbiológicos originam-se em função das condições higiênico de obtenção do leite
assim como devido às condições sanitárias na ordenha e no cuidado com os animais. Por
sua vez, as contaminações químicas ocorrem devido à presença de resíduos de
medicamentos usados de forma inadequada, como as Avermectinas, utilizadas no
combate a endo e ectoparasitas. As Avermectinas são um dos grupos da família da
Lactonas Mocrocíclicas, que possuem como destaque as Ivermectinas, usadas na sanidade
animal.
Os medicamentos de uso veterinários são regulados pela ANVISA e pelo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e são continuamente monitorados
por estes órgãos. As técnicas utilizadas oficialmente utilizam a cromatografia liquida de
alta eficiência com detector de fluorescência (CLAE-FL) ou acoplada à espectrometria
de massas (CLAE-EM/EM). Estas técnicas demandam maior tempo laboral, limitando
assim o número de amostras a serem analisadas, usam reagentes químicos, gerando
resíduos que causam danos ambientais e são equipamentos caros, contudo, são precisos.
Estudos são desenvolvidos para a criação de técnicas auxiliares à cromatografia
liquida, que sirvam como testes de triagem, que serviriam para avaliar maior número de
amostras, e indicando apenas as amostras positivas otimizando o controle de resíduos de
medicamentos de uso veterinários no leite
Nesse contexto surge a Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de
Fourier, técnica que realiza análises de forma rápida e eficiente de diversos materiais por
meio da análise de espectros criados a partir da composição da amostra. Essa técnica vem
sendo amplamente utilizada na indústria de alimentos e em laboratórios para realização
do monitoramento da composição dos produtos e, consequentemente, viabilizar o
controle de qualidade de alimentos.
2
Este estudo apresenta evidências positivas do uso da Espectroscopia no
Infravermelho com Transformada de Fourier na detecção de Ivermectina em leite
associada à quimiometria, como ferramenta de controle de resíduos desta substancia em
leite.
1.2 A produção de leite
O leite é um dos principais produtos da agropecuária brasileira. Com produção
aproximada de 35 milhões de toneladas de leite por ano, o Brasil ocupa a quarta posição
no ranking mundial, perdendo apenas para Estados Unidos, Índia e China (FAO 2010;
IBGE, 2015), importando ainda cerca de 130 mil toneladas de produtos lácteos,
equivalente à 1,1 bilhão de litros de leite (ZOCCAL, 2016).
A produção de leite no Brasil ocorre de forma distribuída em todo o território
nacional, com maior contribuição das regiões Sul e Sudeste, no entanto, o maior
percentual de crescimento na produção de leite para o período de 2013/2014 ocorreu na
região Nordeste, enquanto a região Sudeste teve um aumento inferior à média nacional
(Tabela 1).
Tabela 1. Produção anual de leite por Região (1000 litros)
Região 2013 2014 Variação em 1 ano
Centro-Oeste 5.016.292 4.969.238 -0,9%
Sudeste 12.019.947 12.169.774 1,2%
Sul 11.774.331 12.200.824 3,6%
Norte 1.846.420 1.946.149 5,4%
Nordeste 3.598.250 3.888.286 8,1%
Total 34.255.240 35.174.271 2,7%
Fonte:IBGE, 2015.
Na região Nordeste, a Bahia é o estado que mais contribui na produção de leite
anual, apesar disso, sua produtividade (L/vaca/ano) está abaixo da média da região e é a
segunda menor entre estes estados, superando apenas a produtividade do Piauí (Tabela
2).
3
Tabela 2. Participação de cada estado na produção de leite na região Nordeste.
Estado Quantidade
(1000 L)
2013
Quantidade
(1000 L)
2014
Variação
2013/2014
Produtiv.
2014
(L/vaca/ano)
Maranhão 385.880 393.030 1,9% 631
Piauí 82.542 79.957 -3,1% 571
Ceará 455.452 494.024 8,5% 851
Rio Grande do Norte 209.150 232.338 11,1% 904
Paraíba 157.258 170.479 8,4% 797
Pernambuco 561.829 656.673 16,9% 1.396
Alagoas 252.135 304.674 20,8% 1.887
Sergipe 331.406 345.020 4,1% 1.466
Bahia 1.162.598 1.212.091 4,3% 586
Total 3.598.250 3.888.286 8,1% 818
Fonte: IBGE, 2015.
Em função da demanda maior que a produção, o Nordeste é uma região
importadora de leite, no entanto, há possibilidades de aumentar a produção de leite
melhorando sua produtividade por meio de melhorias nas técnicas hoje empregadas, uma
vez que, a região produz, atualmente, pouco mais de 10% do leite nacional (EMBRAPA,
2015).
A produção leiteira no país acompanhou o processo de urbanização e ao observar
os municípios brasileiros, é incomum encontrar um deles que não tenha pelo menos uma
vaca leiteira. E essa atividade leiteira é importante tanto para o desempenho econômico
do país em relação a atender a demanda interna do produto, quanto para se tornar
fornecedor no mercado internacional e principalmente por gerar empregos para os
cidadãos (ZOCCAL et al., 2008; TRENNEPOHL, 2010).
1.3 O leite
A produção e a composição do leite são influenciados por diversos fatores, entre
eles, é possível destacar fatores ambientais, genéticos, manejo, fase de lactação e a
alimentação animal (AGANGA et al., 2002; CERDÓTES et al., 2004; RESTLE et al.,
2004; NORO et al., 2006; ZANELA et al., 2006).
4
Segundo o Regulamento Da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem
Animal (RIISPOA), o leite é o produto obtido pela ordenha completa e ininterrupta, sob
condições higiênicas, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas (BRASIL, 1997).
O leite é um alimento complexo composto por água, glicídeos, proteínas, gorduras e
minerais e, em função da sua importância nutricional, sendo, inclusive, a principal fonte
de cálcio para a alimentação humana. O Ministério da Saúde recomenda que o leite ou
seus derivados sejam consumidos diariamente em três porções (BRASIL, 2006).
A qualidade do leite está associada ao fator nutricional, rico em nutrientes
necessários à saúde humana, assim como às características higiênico-sanitária, pois este
pode conter agentes causadores de zoonoses e produtos químicos não naturais
(PEREIRA, 2014).
No mundo, o consumo de leite e derivados tem aumentado entre 2 e 3% ao ano.
Cinquenta por cento deste consumo tem ocorrido devido ao crescimento populacional
mundial, e a outra metade devido ao aumento do consumo per capita, com expectativas,
de crescimento contínuo da demanda mundial (IFCN, 2013)
A indústria de laticínios está entre as 4 primeiras atividades industriais
alimentícias no Brasil, o que revela sua importância econômica, com estimativa de,
aproximadamente, 10% de participação no faturamento total da indústria de alimentos do
país. Na cadeia produtiva de leite, a indústria processadora é o elo mais forte e dinâmico
e o maior responsável pelas transformações e alterações de posturas nos demais
segmentos da cadeia (VIANA & FERRAS, 2007; CARVALHO, 2010).
1.4 Uso de medicamentos veterinários e segurança do leite
Animais que produzem alimentos, a exemplo de bovinos, comumente recebem
tratamentos com medicamentos veterinários, como antiparasitários. Estes medicamentos
podem deixar resíduos no leite e representam risco à saúde humana. No sentido de
diminuir a contaminação do leite por medicamentos e ou agrotóxicos no leite, a FAO,
juntamente com organismos de diversos países, criou o CODEX Alimentarius, que entre
outras coisas, determina os limites máximos permitidos para os diversos agentes
medicamentosos no leite e em outros alimentos.
Agências reguladoras nacionais e regionais estabelecem Limites Máximos de
Resíduos (LMR) para cada medicamento com uso aprovado, seguindo o padrão do
CODEX Alimentarius, os dados de monitoramento desses resíduos em leite são de grande
importância para conhecer e avaliar a exposição humana a esses contaminantes por meio
5
dos alimentos (SILVA et al., 2014). A OMS/FAO designou o JECFA (Joint FAO/WHO
Expert Committee on Food Additives) como o comitê responsável pela avaliação e
controle da IDA (Ingestão Diária Aceitável), que é expressa em µg/kg peso corpóreo, de
aditivos alimentares, contaminantes e drogas veterinárias (JARDIM & CALDAS, 2009).
O número de medicamentos veterinários utilizados em animais de produção é
expressivo, isso ocorre em função da sua importância econômica e essa prática pode
resultar em resíduos desses medicamentos em produtos de origem animal, o que gera
preocupação entre os consumidores, uma vez que, os possíveis riscos à saúde humana
ocasionados pelo uso de medicamentos veterinários nos animais podem estar associados
à presença de resíduos medicamentos veterinários nos alimentos e, esses podem ocorrer
quando o uso dos medicamentos não observa Boas Práticas de Uso de Medicamentos
Veterinários, em especial as especificações de uso (ANVISA, 2003; NETTO et al., 2005;
CASELANI, 2014.)
Os animais destinados à produção de alimentos que recebem tratamento
medicamentoso devem receber cuidados específicos, para inibir a ocorrência de resíduos
dos medicamentos nos alimentos. Dessa forma, é necessário observar o período de
carência que representa o tempo para que o contaminante atinja concentrações seguras no
organismo do animal em tratamento. Este intervalo é o tempo entre a última
administração da dose do medicamento e o momento permitido para o uso do alimento
oriundo desses animais (SPINOSA et al., 2011; BRASIL, 1997).
Os resíduos de medicamentos veterinários nos alimentos podem causar reações
alérgicas, infecções diversas, alterações na microbiota intestinal além de efeitos
carcinogênicos ou teratogênicos em função da exposição prolongada a estas substâncias
(BOTSOGLOU & FLETOURIS, 2001; DOYLE, 2006). Entretanto, nem todos os
medicamentos veterinários acarretam resíduos que provocam danos à saúde humana ou
animal e, quando são nocivos, os problemas só ocorrem caso a quantidade de resíduo seja
superior ao LMR permitido (BRASIL, 1999).
Visando avaliar e atuar na prevenção de riscos relacionados à contaminação do
leite e outros alimentos por resíduos de medicamentos, foram criados no Brasil o
Programa de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos
(PAMvet) e o Programa Nacional de Controle de Resíduos de Contaminantes (PNCRC).
O objetivo do PAMVet é promover o controle de resíduos de medicamentos veterinários
em alimentos de origem animal para o consumo humano por meio de fiscalização e
análises em amostras de todo o país, enquanto o PNCRC que é coordenado pelo
6
Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) trata-se de um programa
de fiscalização baseado na análise de risco que visa monitorar os sistemas de produção e
a qualidade dos produtos de origem vegetal e animal, ou seja, uma ferramenta de
gerenciamento de risco (ANVISA, 2003; BRASIL, 2012).
O leite que apresenta resíduos de substâncias químicas é considerado fraudado e,
por isso, impróprio para o consumo humano, pois não atende aos requisitos de qualidade
necessários para que tenha padrão de qualidade considerado aceitável (FONSECA et al.,
2001; VENTURINI et al., 2007; MENDES et al., 2008).
A preocupação por oferecer produtos de qualidade e que possam ser ingeridos
pelo consumidor é um problema mundial, e assim, faz-se necessário a busca de detecções
em produtos adulterados e com qualidade inferior no mercado (EGITO et al., 2006).
Produtos adulterados geram inúmeros prejuízos para indústria processadora de lácteos,
pois, essa alteração leva a uma redução dos produtos, redução de valor nutricional, bem
como um risco a saúde dos consumidores devido a presença de substancias nocivas, tais
como: neutralizante de acidez, agentes antimicrobianos, reconstituintes de densidade,
entre outras (CORTEZ et al., 2010; BRASIL, 2006).
Diversas técnicas de rotina são utilizadas para detecção de fraudes e novas
metodologias estão sendo desenvolvidas em virtude da necessidade de respostas de
diferentes tipos de adulteração que estão sendo utilizados (CORTEZ et al., 2010;
BRASIL, 2006).
1.5 Avermectinas
As avermectinas, substâncias que pertencem ao grupo das Lactonas Macrocíclicas
(LM), são os anti-helmínticos mais utilizados na medicina veterinária que são, em sua
maioria, produzidas a partir da bactéria Streptomyces avermitillis. Esses compostos agem
sobre a membrana das células musculares dos nematoides causando danos irreversíveis
com consequente paralisia e morte dos parasitos. As avermectinas atuam no controle de
diversas espécies, tais como, Dityocalus viviparus, Haemonchus contortus, Strongyloides
spp. e Ascaris spp, adicionalmente, as avermectinas podem atuar também no controle de
artrópodes como carrapato, piolhos, ácaros que causam sarnas e larvas de insetos (BURG
et al., 1979).
As avermectinas foram descobertas em 1976, no entanto seu uso em animais só
começou em 1981 com a utilização das ivermectinas, desde então, as avermectinas tem
7
sido utilizadas em diversos animais e seres humanos no controle de doenças parasitárias
(VERCRUYSSE & REW, 2002).
Essas substâncias são praticamente insolúveis em água e possuem alta
lipossolubilidade, o que facilita que esses medicamentos se depositem no local onde
foram aplicados por via subcutânea, essa deposição faz com que o medicamento
permaneça no organismo do animal por período prolongado (LANUSSE & PRICHARD,
1993; NETTO et al., 2005).
As avermectinas podem ser classificadas, de acordo com características
estruturais, em “A ou B”, “1 ou 2” e “a ou b”. As estruturas que possuem um grupo
metoxila no carbono 5 são classificadas como avermectinas “A”, já as que possuem uma
hidroxila nessa posição são classificadas como avermectinas “B”; quando possuem uma
ligação dupla entre os carbonos 22 e 23, são classificadas como da série “1”, quando,
nessa posição, ocorre uma ligação simples com um grupo hidroxila no carbono 23, são
classificadas como sendo da série “2”; quando, no carbono 25, ocorre a presença do grupo
sec-butil, a avermectina é classificada na série “a”, mas se, nessa posição ocorrer um
grupo isopropil, é classificada como da série “b” (LUMARET et al., 2012; ÕMURA &
CRUMP, 2004; CANGA, 2009).
O metabolismo das avermectinas ocorre principalmente no fígado e sua
eliminação é feita por meio da bile no material fecal, na urina e nas glândulas mamárias
dos animais em fase de lactação, podendo acarretar resíduos no leite por um período de
até 28 dias após o tratamento (BALDANI et al., 1999).
As técnicas utilizadas para determinação de avermectinas no leite, de acordo com
o MAPA, pelos seus laboratórios oficiais, que são os Laboratórios Nacionais
Agropecuários, Lanagros, são CLAE-FL (Cromatografia líquida de alta eficiência –
detecção de fluorescência) e CLAE EM/EM (cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada à espectrometria de massas sequencial) (BRASIL, 2011).
A utilização de avermectinas no rebanho leiteiro apresenta o inconveniente de que
essas substâncias causam níveis de resíduos prolongados no leite (SCHENCK &
LAGMAN, 1999) e sua utilização no Brasil havia sido proibida em 2014, porém, a
Instrução Normativa 6 de 27 de março de 2015 revoga a anterior, liberando a sua
utilização (BRASIL, 2015).
No Brasil, os LMR de antiparasitários no leite são estabelecidos pela IN nº 11 de
22 de maio de 2012 que trata do Programa de Resíduos e Contaminantes em Carnes
(Bovina, Aves, Suína e Eqüina), Leite, Pescado, Mel, Ovos e Avestruz e, segundo o
8
CODEX Alimentarius, a utilização das avermectinas deve estar dentro de um padrão
aceitável, para isso, limita a ingestão diária admissível (IDA) para uso nos animais como
mostra a (Tabela 3) (CODEX, 2015; BRASIL, 2012).
Tabela 3. IDA e LMR de avermectinas no leite.
Avermectina LMR (µg/kg de leite) IDA (µg/kg peso
corpóreo)
Abamectina 10 0 – 2
Doramectina 15 0 – 0,5
Ivermectina 10 0 – 1
Fonte: CODEX Alimentarius 2015 e BRASIL 2012
Segundo Ferreira e colaboradores (2012), pesquisas que de monitoramento de
resíduos de medicamentos em leite realizadas entre 2000 e 2012 apontaram que, em 70%
das amostras analisadas, foi confirmada a presença de avermectinas e, em vários casos, a
presença desses contaminantes ocorreu em quantidades superiores a LMR.
1.5.1 Ivermectinas
Dentre o grupo das avermectinas, as ivermectinas se destacam, tendo sido o
primeiro membro das LMs a ser comercializado e utilizado como antiparasitário em
animais a partir de 1981. Esse medicamento é um composto que contém, no mínimo 80%
de 22,23-diidroavermectina B1a, C48H74O14, de peso molecular 875,1 g/mol e menos de
20 % de 22, 23-diidroavermectina B1b C47H72O14, de peso molecular 861,1 g/mol, esses
percentuais se referem à amostra de IVM na sua forma cristalina, sem etanol ou
dimetilformamida (YATES et al., 2003; ÕMURA & CRUMP 2004; CANGA et al.,
2009).
A IVM é o principal fármaco utilizado em animais no controle antiparasitário,
essa utilização ocorre em função do amplo espectro de ação desse medicamento no
combate a diversos nematoides, pois apresenta ação contra quase todas as espécies de
nematoides gastrointestinais de importância patogênica e econômica em bovinos,
entretanto, sua eficácia varia de acordo com o parasita alvo (CAMPBELL & BENZ, 1984;
LANUSSE & PRICHARD, 1993), entretanto, a IVM.
O mecanismo de ação da IVM consiste no estímulo à liberação do
neurotransmissor inibidor GABA (ácido gama-aminobutírico), sob o efeito do GABA,
ocorre a inibição da neurotransmissão dos estímulos por meio da abertura dos canais de
cloro permitindo o influxo de íons cloreto, esse processo promove a paralisia da
9
musculatura e morte do parasita, possibilitando a sua eliminação. Esses canais só ocorrem
em invertebrados, por isso, a IVM só pode ser utilizada no controle de parasitas
(CAMPBELL & BENZ, 1984; ARENA et al., 1995).
A Ivermectina apresenta alta lipossolubilidade, o que faz com que ela permaneça
no organismo animal por períodos prolongados e que possibilita sua excreção por meio
do leite (SUTHERLAND & CAMPBELL, 1990). A lipossolubilidade da IVM é a
principal propriedade físico-química que explica a absorção da IVM por via subcutânea,
uma vez que a pele pode ser considerada uma camada lipídica de várias camadas
(BAGGOT & MCKELLAR, 1994).
De acordo com Silva e colaboradores (2012), quando utilizada, o prazo de
carência da Ivermectina nos bovinos é de 122 dias, os mesmos autores ressaltam que não
deve ser feito o uso desse medicamento em animais cujo leite se destina ao consumo
humano. Entretanto, ocorre também o emprego da IVM contra parasitoses em humanos,
essa prática vem se intensificando a partir da década de 1990 no controle a diversas
doenças parasitárias, tais como oncocercose, strongiloides, ancylostomas, sarcoptes,
carrapatos e piolhos (FERNANDES et al., 2001).
A matéria prima de IVM é constituída normalmente de isômeros estruturais que
diferenciam em um grupamento CH3 na ligação como o carbono 25 da estrutura
(SANTOS, 2013). IVM é formada por grupos hidroxilas, metoxilas, lactona macrocíclica,
anéis tetrahidropirano e tetrahidrofurano e ésteres e (Figura 1).
Figura 7. Estrutura Química da Ivermectina
Adaptado de CANGA et al., 2009; SANTOS,2013.
10
Uma das dificuldades relacionadas à utilização dessa substância é a carência de
orientação técnica. Esse problema já foi identificado em diversas propriedades rurais, o
que evidencia o problema da utilização das ivermectinas (SILVA et al., 2012). O mesmo
autor ressalta danos que podem ser causados por essa substância à saúde humana como,
urticária, edema, dores de cabeça, tontura, náusea, vômito, diarreia e dores abdominais.
A metodologia utilizada no Brasil, sob recomendação da ANVISA, para a
determinação de Ivermectina em leite é a Cromatografia líquida de alta eficiência com
detector de fluorescência (ANVISA, 2005). O controle de resíduos de IVM no leite no
Brasil é realizado pelo PNCRC e o PAMVet. O relatório PAMVet, que realizava o
levantamento, entre outras coisas, da ocorrência de resíduo de IVM no leite no Brasil,
apontou em sua última publicação, elaborado entre 2006 e 2007, que das 600 amostras de
leite analisadas em todo o Brasil, 43% delas apresentaram resíduo de IVM, ainda que
abaixo do LMR (ANVISA, 2009).
1.6 Espectroscopia de Infravermelho
A espectroscopia no infravermelho é uma técnica versátil baseada na interação
entre radiação eletromagnética e a matéria. A partir desta, é possível observar os níveis
de energia de átomos ou moléculas observando os espectros obtidos na medida. No caso
das moléculas, existem 3 níveis de energia que podem ser observados em regiões
espectrais diferentes: eletrônicos, vibracionais e rotacionais. As transições eletrônicas são
observadas na região ultravioleta ou visível, as vibracionais são observadas na região do
infravermelho, já as rotacionais são observadas na região de microondas (SALA, 2008).
A região do infravermelho compreende entre a faixa superior da região de
microondas e a faixa inferior da região ultravioleta ou visível, que compreende a faixa de
frequência entre 102 e 0,8 Hz. Nesta região ocorrem as vibrações moleculares, no entanto,
para que um modo vibracional seja ativo e realize absorção da radiação eletromagnética.
Isso ocorre quando há variação no momento dipolo da molécula em estudo, ou seja, pelo
menos 1 dos componentes, momento de transição, deve ser diferente de 0, esta é a regra
de seleção da espectroscopia de infravermelho (STUART, 2004; BRUICE, 2006; SALA,
2008).
A radiação infravermelha foi descoberta em 1800 por Herschel e, por volta de
1900, Coblentz obteve espectros de absorção no infravermelho de grande número de
compostos orgânicos em estado sólido, líquido e vapor, desde então, esta técnica vem
11
sendo utilizada para identificar um determinado composto, ou ainda, determinar a
composição de uma amostra qualitativa e quantitativamente, trabalhando com
componentes que apresentam ligações químicas, não sendo possível a análise de
componentes monoatômicos (SALA, 2008; SALIBA et al., 2009).
A absorção de energia de radiação infravermelha por uma molécula orgânica
acarreta a vibração dessa molécula, e promove a formação de bandas de um espectro que
irá refletir estes movimentos vibracionais. A razão entre a energia transmitida e a energia
recebida pela molécula é chamada de transmitância e o inverso do logaritmo decimal
desta medida é a absorbância (Equação 1) (SILVERSTEIN et al., 1994; STUART, 2004):
𝐴 = −𝐿𝑜𝑔(𝑇) = 𝐿𝑜𝑔 (1/𝑇) Equação 1
Em que:
A é a Absorbância e T é a Transmitância
As posições das bandas de um espectro podem ser expressas em números de onda
(cm-1) ou em comprimentos de onda (µm), por sua vez, as unidades de medida das
intensidades de cada banda do espectro são expressas em percentual de Transmitância
(%) ou Absorbância (A) e essa denominação depende do modo utilizado para a captação
das informações para a geração do espectro (STUART, 2004; SALA, 2008).
As intensidades e energias das absorções na região do infravermelho são
influenciadas por diversos fatores que podem contribuir para a ampliação e alternância
das intensidades das bandas. As bandas do espectro eletromagnético podem ser alargadas
em função da colisão entre as moléculas, no caso dos gases, do efeito Doppler, quando a
radiação é deslocada para outra direção, além de existir uma relação direta entre o tempo
de vibração e a largura da banda correspondente, uma vez que, quanto menor o tempo de
duração de um estado vibracional, menos definida é a energia desse modo e,
consequentemente, resultará no alargamento da banda de absorção deste espectro, o que
é conhecido como Princípio da incerteza de Heisenberg (STUART, 2004; SALA, 2008).
Os modos vibracionais de uma molécula podem ser classificados de duas formas:
deformações axiais (estiramentos) e deformações angulares. A deformação axial ocorre
quando a acontece a deformação no eixo da molécula, os comprimentos das ligações
aumentam e diminuem sistematicamente provocando a vibração molecular. Por sua vez,
a deformação angular consiste no movimento de um grupo de átomos em relação à
molécula. As deformações angulares podem ocorrer de forma simétrica ou assimétrica e,
12
nos dois casos, pode ocorrer dentro ou fora do plano conforme apresentado na (Figura 2)
(STUART, 2004).
Figura 8. Modos Vibracionais
Fonte: Adaptado de STUART, 2004.
A quantidade de modos vibracionais de uma molécula varia de acordo com o
tamanho da sua estrutura. Em uma molécula com um determinado número de átomos (N),
existem 3N graus de liberdade, destes, 3 são dos movimentos de translação e 3 dos
movimentos de rotação, portanto, 3N-6 graus de liberdade vibracional, porém, moléculas
lineares tem apenas 2 graus de liberdade rotacional, assim tem 3N-5 graus de liberdade
vibracional (Tabela 4).
Tabela 4. Graus de liberdade de moléculas poliatômicas lineares e não lineares.
Tipos de Graus de liberdade Moléculas Lineares Moléculas não lineares
Translacional 3 3
Rotacional 2 3
Vibracional 3N-5 3N-6
Total 3N 3N
Adaptado de STUART, 2004; SALA, 2008.
13
As regiões espectrais podem ser expressas por submúltiplos de metro, assim é
comum encontrar em espectroscopia as medidas de Å, nm e µm que equivalem,
respectivamente a 10-10m, 10-9 m e 10-6 m. Apesar disso, as medidas mais comuns na área
da espectroscopia são dadas em números de onda cm-1 que correspondem à quantidade de
comprimentos de onda que estão contidos em 1 cm e tem a vantagem de apresentar
linearidade com a energia, ou seja, é proporcional à energia do fóton. O número de onda
é obtido por meio da relação entre a frequência e o comprimento de onda (Equação 2)
(STUART, 2004; SALA, 2007; SALA, 2008).
ῦ = 1/ 𝜆 = ʋ/𝑐 Equação 2
Em que:
ῦ = número de onda;
λ = comprimento de onda da radiação no vácuo e
ʋ = frequência
c = velocidade da luz
A região do infravermelho eletromagnético pode ser dividida em três partes
principais e a escolha da região a ser utilizada depende do tipo de amostra que se deseja
avaliar, sendo que a região denominada de infravermelho médio é a de maior interesse
para fins analíticos (MENDHAM et al., 2002; HOLLER et al., 2009.) (Tabela 5).
Tabela 5. Regiões do espectro eletromagnético e amostras a que se aplicam.
Região do
espectro
Comprimento
de onda µm
Número
de onda
cm-1
Amostras a que se aplicam
Próximo (região
das harmônicas)
0,8 – 2,5 12550 -
4000
Materiais comerciais sólidos ou
líquidos e misturas gasosas
Médio (Região
de vibração-
rotação)
2,5 – 50 4000 – 200 Sólidos, líquidos ou gases puros,
misturas complexas de líquidos,
sólidos ou gases
Distante (Região
de rotação)
50 – 1000 200 - 10 Amostras sólidas, líquidas e
gasosas
Fonte: MENDHAM et al. (2002); HOLLER et al. (2009).
A identificação dos compostos presentes na amostra pode ser feita por meio da
associação entre os grupos funcionais e a região do espectro em que cada um deles
apresenta absorção da radiação eletromagnética para grupos funcionais (Tabela 6).
14
Tabela 6. Correlação entre as vibrações e as faixas espectrais.
Tipo de vibração Atribuição Frequência cm-1
Estiramento C-H Alcanos 3000-2850
Alcenos 3100-3000
Torção fora do plano C-H Alcenos 1000-650
Estiramento C-H Alcinos 3300-3250
Estiramento C-H Aromáticos 3150-3050
Torção fora do plano C-H Aromáticos 900-690
C-H Aldeídos 2900-2700
C═C Alceno 1680-1600
C═C Aromáticos 1600-1475
C≡C Alcinos 2250-2100
C═O Aldeídos 1740-1720
Cetonas 1730-1700
Ácidos Carboxílicos 1725-1700
Ésteres 1750-1730
Amidas 1700-1640
Anidridos 1810-1760
Cloreto ácido 1800
C-O Alcoóis, éteres, ésteres, ácidos
carboxílicos, anidridos
1300-1000
O-H Ácidos carboxílicos 3400-2400
Alcoóis e fenóis 3650-3600 e 3400-3200
N-H (estiramentos) Aminas e amidas primárias e
secundárias
3500-3100
N-H (torções) Aminas e amidas primárias e
secundárias
1640-1550
C-N Amidas 1350-1000
Fonte: PAVIA et al. (2010).
A espectroscopia de infravermelho tem se tornado cada vez mais importante na
análise qualitativa e quantitativa de materiais, pois é uma técnica que apresenta extensa
15
utilização em laboratórios analíticos industriais e laboratórios de pesquisa diversos
(FIORINI, 2000). O uso da Espectroscopia no Infravermelho está de acordo com os
conceitos políticos da química verde, que visa reduzir o tempo, custo e geração de
resíduos das análises (FERREIRA, 2013).
Tradicionalmente desde meados de 1940 os aparelhos utilizados para a obtenção
de espectros eram aparelhos dispersivos. Na análise por meio destes aparelhos, a radiação
atravessa a amostra e é refletida por um sistema de espelhos, passa por fendas estreitas e
seguem para um detector e, em seguida para um registrador. Este sistema apresenta fraca
potência de radiação infravermelho, dificultando sua medição, necessita de grades de
difração apuradas, a precisão é afetada pelo frequente desalinhamento do sistema óptico,
alto valor em relação sinal ruído e é lento. Para resolver esse problema, iniciou-se o uso
de instrumentos não dispersivos como o (FTIR) (FIORINI, 2000; STUART, 2004).
1.6.1 Espectroscopia Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) produz
gráficos por meio da análise das amostras, identificando os componentes ali presentes e
a informação dos espectros dessas amostras ocorre mais rapidamente quando comparado
com outros instrumentos dispersivos (SALIBA et al., 2009; PAVIA et al., 2010;
THERMO, 2016).
O FTIR tem como princípio o interferômetro de Michelson, sistema que consiste
em um espelho fixo, um espelho móvel e um divisor de feixes (beam-splitter) que
transmite metade da radiação para o espelho móvel e reflete a outra metade para o espelho
fixo. Estes espelhos refletem os dois feixes para um divisor, onde são recombinados e
passam pela amostra, que retém parte da energia, e em seguida pelo detector, dando
origem a um interferograma. Após a geração do interferograma, este é submetido ao
método matemático de transformação de Fourier, que converte os dados do
interferograma em um espectro que relaciona a intensidade com a frequência (Figura 3)
(FIORINI, 2000; STUART, 2004; PAVIA et al., 2010).
16
Figura 9. Esquema do caminho óptico de um feixe de luz IR no espectrômetro do FTIR
Fonte: RODRIGUES, 2012.
O espectro resultante da análise por meio do FTIR representa a absorção e
transporte molecular, criando uma impressão digital molecular da amostra, com a
presença de cada componente. Como não há uma mesma impressão digital para duas
estruturas moleculares, estruturas diferentes não são capazes de produzir o mesmo
espectro, isso faz com que a espectroscopia de infravermelhos seja utilizada para vários
tipos de análise, apresentando vantagens como precisão e velocidade de análise
(THERMO, 2016).
A transformação de Fourier é um método matemático que trouxe significativos
avanços para a espectroscopia de infravermelho. Sua utilização propicia a redução do
tempo de obtenção dos espectros permitindo adequar funções não periódicas como
problemas de comunicações e processamento de sinais (STUART, 2004).
Dentre os métodos de análise por FTIR, o ATR tem provocado avanços nas
análises de amostras sólidas e líquidas, pois não requer laborioso preparo de amostras e
produz espectros reprodutíveis. Esse método, que está associado ao FTIR, utiliza o
17
fenômeno da reflectância total interna por meio de um cristal com alto índice de refração
e baixo índice de absorção na região do infravermelho. O acessório ATR realiza as
medições das mudanças que ocorrem no feixe de radiação infravermelha ao entrar em
contato com a amostra. Quando o feixe de radiação passa do cristal para a amostra, ocorre
a reflexão. A fração do feixe de luz incidente que é refletida aumenta conforme aumenta
o ângulo de incidência, e quando excede um determinado ângulo crítico (a) a reflexão é
completa. Essa técnica pode ser utilizada na análise pastas, adesivos e pós que não podem
ser analisados como pastilhas ou filmes (STUART, 2004; SOUZA, 2009).
Quando comparado aos instrumentos dispersivos, o FTIR apresenta algumas
vantagens, dentre estas, as principais são: vantagem de Fellgett, vantagem de Jacquinot e
a vantagem da velocidade (STUART, 2004).
A vantagem de Fellgett ou vantagem de multiplexação refere-se ao fato de que
este sistema oferece a melhor relação sinal/ruído por unidade de tempo proporcional à
raiz quadrada do número de resolução dos elementos que estão sendo monitorados, isso
possibilita que o detector receba todas as informações dos componentes durante a leitura
do interferograma, isto resulta em melhor resolução dos elementos que estão sendo
monitorados, uma vez que, a relação sinal/ruído é determinada pelo tempo de observação
(VANASSE & SAKAI, 1967; STUART, 2004).
A vantagem de Jacquinot refere-se ao fato de que neste sistema ocorre menor
perda luminosa entre o feixe da fonte e o detector, isto ocorre por que o FTIR não requer
a utilização da fenda ou qualquer outro dispositivo de restrição que reduza a transferência
da potência, assim, toda a energia emitida pela fonte passa pela amostra, o que resulta em
ganho de energia no detector e aumento da razão sinal/ruído. O aumento da razão
sinal/ruído resulta em melhores interpretação dos resultados e utilização dos dados
(VANASSE & SAKAI, 1967; STUART, 2004;).
Além das vantagens de Jacquinot e Fellgett, a utilização do FTIR possibilita maior
precisão da frequência, a luz dispersa não afeta o detector, uso de feixe mais amplo e
obtenção mais fácil dos dados, maior velocidade do leitor, que permite monitoramento
das amostras submetidas a rápidas mudanças, não submete as amostras a efeitos térmicos
e emissões de radiação pela amostra não afetarão o espectro (FIORINI, 2000).
1.6.2 Aplicação da Espectroscopia de Infravermelho na indústria de alimentos
A indústria de alimentos vem utilizando a espectroscopia de infravermelho no
controle de qualidade dos produtos. Na indústria de bebidas alcoólicas, a espectroscopia
18
de infravermelho tem sido utilizada na determinação de parâmetros das bebidas e licores
(ARZBERGER & LACHENMEIER, 2008), na determinação de ácidos orgânicos em
vinhos (REGMI et al., 2012), na caracterização e classificação de vinhos e bebidas
destiladas (PALMA & BARROSO, 2002).
Em laticínios, já foi verificada a eficácia da técnica para análise de leite e
derivados com a finalidade de avaliar a composição dessas amostras, além de detectar a
presença de adulterantes nesses alimentos (IÑÓN et al., 2004, KAROUI &
BAERDEMAKE, 2007), determinação de sólidos não gordurosos (BASSBASI et al.,
2014), determinação de proteínas (KHER et al., 2007), composição físico química
(ADLER et al., 2013), entre outros diversos trabalhos que vem utilizando a
Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier na análise de leite e
derivados lácteos (BUNACIU et al., 2016).
Hewavitharana e Brakel (1997) utilizaram o (FTIR) associado às técnicas
quimiométricas, como a análise de regressão de mínimos quadrados parciais (PLS) e a
regressão de componentes principais (PCR) para a quantificação rápida e direta de caseína
no leite cru e os resultados foram satisfatórios.
Em um trabalho desenvolvido por Luiz e colaboradores (2014), com a finalidade
de avaliar a qualidade do leite de maneira rápida (interessante para indústria), utilizou-se
a Espectroscopia no Infravermelho Próximo com Transformada de Fourier (FT-NIR)
associada à Análise de Componentes Principais (ACP) em amostras de leite pasteurizado
tipo “A” integral homogeneizado comercializado na região de Juiz de Fora, Minas Gerais.
Os resultados obtidos foram satisfatórios, pois as amostras pré-contaminadas foram
facilmente detectadas. Ressaltando que a técnica multivariada (ACP) foi essencial para
obtenção dos resultados.
Em análises de leite por FTIR, as vibrações moleculares decorrentes dos seus
principais constituintes, gordura, proteínas e carboidratos, ocorrem em diferentes faixas
espectrais apresentando bandas distintas em cada faixa conforme apresentado na Tabela
7.
19
Tabela 7. Regiões espectrais do leite em FTIR.
Número de onda (cm-1) Grupo
Funcional
Associação Modo Vibracional
3438 OH Água Estiramento simétrico
2920 CH2 Lipídeos Estiramento
assimétrico
2850 CH2 Lipídeos Estiramento simétrico
2350 CH2 Lipídeos Estiramento Simétrico
1747 C = O Lipídeos Estiramento simétrico
1660 – 1650 Amida Proteína Estiramento
1547 – 1541 Amida Proteína Deformação angular
1241 Amida Proteína Estiramento
1160 C - O Lipídeos Estiramento
1150 – 1030 (C – O) (C – C)
(C – O – O)
Carboidratos Estiramento
1000 – 800 Anel de
vibração
Carboidratos Deformação angular
722 (CH2)n Lipídeos Deformação angular
700 N – H Proteína Deformação angular
Fonte: STUART, 2004; AERNOUTS, 2011.
Por meio da associação entre a faixa espectral onde ocorrem as vibrações
moleculares que resultam em absorção da radiação infravermelho e as funções orgânicas
que as provocam, é possível identificar e quantificar os compostos do leite. Utilizando
esta técnica, Heuer e colaboradores (2001) realizaram estudo da composição do leite
avaliando a presença de cetona na amostra (Figura 4).
20
Figura 10. Espectro do Leite por FTIR.
Fonte: HEUER, 2001
1.7 Quimiometria
O uso de computadores para analisar dados químicos foi crescente nos últimos
anos e a aquisição de dados, principalmente na área analítica passou a produzir grande
quantidade de informações, muitas vezes complexa e variada, atingindo um número
elevado de variáveis que podem ser medidos em uma única amostra, como exemplo, é
possível citar as medidas de absorção em milhares de comprimentos de onda que são
registrados em um espectro. De posse de tal quantidade de dados, surgiu a necessidade
de ferramentas mais precisas para tratá-los, o que deu origem à Quimiometria que destina-
se à análise de dados químicos de natureza multivariada com uso de ferramentas vindas
da matemática, estatística e informática (FERREIRA et al., 1999).
Análise multivariada de dados se refere a um conjunto de técnicas estatísticas que
permitem a análise simultânea de múltiplas variáveis, desse modo, qualquer técnica que
tenha como objetivo analisar duas ou mais variáveis pode ser considerada, a princípio,
como multivariada, no entanto, para que a análise seja considerada realmente como
multivariada, todas as variáveis devem ser aleatórias e inter-relacionadas entre si, dessa
forma, seus efeitos não podem ser interpretados separadamente (HAIR JÚNIOR et al.,
2009).
A escolha dos métodos multivariados se dá a partir dos objetivos a serem
alcançados durante pesquisa. Sabe-se que a análise multivariada gera hipóteses e não
criam confirmações sobre o conjunto de dados, pois é uma análise exploratória de dados.
21
Entretanto, algumas vezes pode ser utilizada para confirmação dos eventos (HAIR
JÚNIOR et al., 2009).
Segundo Ferreira, 1996, os objetivos gerais, para os quais a análise multivariada
conduz são:
Redução de dados ou simplificação estrutural: o fenômeno sob estudo é
representado da maneira mais simples possível, sem sacrificar informações
valiosas e tornando as interpretações mais simples;
Ordenação e agrupamento: agrupamento de objetos (tratamentos) ou variáveis
similares, baseados em dados amostrais ou experimentais;
Investigação da dependência entre variáveis: estudos das relações estruturais entre
variáveis muitas vezes é de interesse do pesquisador;
Predição: relações entre variáveis devem ser determinadas para o propósito de
predição de uma ou mais variável com base na observação de outras variáveis;
Construção e teste de hipóteses.
Segundo Regazzi (2000), as técnicas de análise multivariada foram desenvolvidas
para resolver problemas específicos, principalmente de Biologia e Psicologia, porém,
podem ser também utilizadas para resolver outros tipos de problemas em diversas áreas
do conhecimento.
1.7.1 Análise de Componentes Principais
A ACP é uma técnica ou uma formulação matemática utilizada na redução da
dimensão de dados com menor perda possível da informação (JOLLIFFE,1986). A
análise de componentes principais visa explicar a estrutura de covariância por meio de
poucas combinações lineares das variáveis originais do estudo, sendo que,
essencialmente, o número de componentes principais é igual ao número de variáveis
estudadas. Os componentes principais são gerados em ordem decrescente de variância,
assim, o componente principal 1 possui maior informação estatística que o componente
principal 2 e assim sucessivamente. Esta técnica tem como principais objetivos reduzir o
número de variáveis e facilitar a interpretação das análises realizadas (FERREIRA, 1996;
NETO & MOITA, 1998; HAIR JÚNIOR et al., 2009).
Cada componente principal apresenta propriedades importantes, tais como: são
independentes entre si, representam em ordem decrescente o máximo de informação, em
termos da variação total contida nos dados e são formados por meio uma combinação
22
linear de todas as variáveis originais (NETO & MOITA, 1998; VARELA, 2008). O
sistema de coordenadas que dá origem aos componentes principais baseia-se na
combinação entre autovetores e autovalores conforme a Equação 3 (MINGOTI, 2007).
𝐶𝑃𝑖 = 𝑎𝑖1 𝑍1 + 𝑎𝑖2 𝑍2 + 𝑎𝑖3 𝑍3+. . . + 𝑎𝑖, 𝑛 𝑍𝑛 Equação 3
Em que: CP é a componente principal; a corresponte aos autovetores, que são fatores de
ponderação que define a contribuição de cada variável para uma CP numa combinação
aditiva e linear e Z, os autovalores, que representam a variância de cada CP.
A ACP é uma técnica não supervisionada, portanto, não pode ser usada para prever
o comportamento de uma nova amostra. Ao inserir uma nova amostra no conjunto de
dados, e necessário que um novo modelo seja construído (MASSARD et al.,1998). Este
conjunto de dados é composto por n amostras e p variáveis inerentes a cada elemento
amostral (HOTELLING, 1933).
Em vista disso, a ACP é uma técnica estatística empregada para identificar um
pequeno número de aspetos que podem ser úteis na identificação de uma possível relação
entre um conjunto de muitas variáveis correlacionadas entre si. Também estimando a
maior correlação existente entre as variáveis (MAROCO, 2007).
O objetivo desta técnica é explicar a variância e covariância dos vetores, composto
por variáveis, por meio do cálculo das CP’s (MINGOTI, 2007). Desta forma, a tarefa do
pesquisador que trabalha com estatística multivariada é interpretar a distribuição dos
pontos no gráfico de componentes principais e identificar as variáveis originais com
maior peso na combinação linear das componentes principais mais importantes (NETO
& MOITA, 1998).
1.7.2 Análise Discriminante
A Análise Discriminante (AD) é um método utilizado para identificar as variáveis
que discriminam os grupos e, assim, quando há uma nova observação é capaz de prever
e distinguir qual o grupo mais adequado a que ela deverá pertencer, de acordo com suas
características. Para que o objetivo desta técnica seja alcançado, a AD gera funções
discriminantes ou combinações lineares que aumentam a distinção dos grupos relatados
pelas variáveis dependentes (FÁVERO et al., 2009). Essa técnica é utilizada para separar
amostras em grupos distintos, de acordo com características já conhecidas (REIS, 2001).
23
A AD é uma ferramenta utilizada para indicar as variáveis que discriminam naturalmente
dois ou mais grupos. A análise discriminante dispõe de alguns objetivos como, identificar
as variáveis que melhor se diferenciam entre dois ou mais grupos, utilizar as variáveis
para criar uma função discriminante que represente de forma ponderada as
dissimilaridades entre os grupos e aplicar a função discriminante para classificar novas
amostras nos grupos (MAROCO, 2007; MINGOTI, 2007).
Essa análise se torna eficiente quando ocorre baixa taxa de erro, ou seja, resulta
em alta taxa de classificação das amostras (HAIR JÚNIOR et al., 2009). Segundo Johnson
& Wichern (1999), para que haja menores erros, a regra de classificação deve levar em
consideração as probabilidades e os custos de má classificação, além de observar as
variâncias das populações se são iguais ou não. Pois, quando se assume que as variâncias
das populações são iguais, as funções discriminantes são consideradas lineares e quando
diferentes são consideradas quadráticas.
Os coeficientes das funções discriminantes são indicadores da importância ou da
contribuição que as variáveis originais exercem para cada função discriminante. Ao obter
a função discriminante ela é utilizada para dividir regiões de alocação, separando o
conjunto de dados de acordo com a similaridade das amostras (REGAZZI, 2000).
Na utilização da AD, quando há um grupo de observações cujos componentes já
são distinguidos eles são utilizados para estimar os pesos da função discriminante de
acordo com alguns critérios, com a minimização dos erros de classificação (SUEYOSHI
& GOTO, 2009). A Análise discriminante determina uma equação de regressão linear,
que é utilizada para prognosticar o grupo que a amostra em estudo pertence (MINGOTI,
2007; SOUZA et al., 2009). A equação é apresentada da seguinte forma:
𝐷 = 𝑎 + 𝑣1𝑋1 + 𝑣2𝑋2 + 𝑣3𝑋3+. . . + 𝑣𝑖𝑋𝑖 Equação 4
Em que:
D é a função discriminante;
v é o coeficiente discriminante ou o peso atribuído a cada variável;
X é o escore das variáveis estudadas;
a é uma constante;
i é o número de variáveis preditoras.
24
1.8 Redes Neurais Artificiais (RNA)
A Rede Neural Artificial (RNA) pode ser compreendida como um grupo de
neurônios artificiais interconectados entre si formando vários subgrupos de camadas
(entrada, intermediárias e saída) em sua estrutura que são conectadas uma com as outras.
RNA é capaz de acumular os conhecimentos adquiridos na aprendizagem (experiência) e
disponibilizar esses conhecimentos para posterior utilização (HAYKIN, 1999).
O desenvolvimento da RNA teve como princípio o desejo de obter um sistema
que executasse atividades inteligentes semelhantes às exercidas pelo cérebro humano.
Uma importante vantagem das redes neurais é a sua capacidade de estabelecer as relações
existentes dentro de um conjunto de dados experimentais, tendo eles tanto o
comportamento linear como o não linear (RAI et al., 2005).
Perceptron Multi-Camadas (MLP) é uma das arquiteturas mais utilizadas nas
redes neurais artificiais. A topologia desse tipo de RNA consiste em uma camada de
entrada, uma ou mais camadas ocultas/intermediárias e uma camada de saída. Uma ou
duas camadas intermediárias são bem sugeridas na maioria dos estudos (VILLIERS et al.,
1993). De acordo com Hornik e colaboradores (1989) isso ocorre devido ao fato de que
os resultados podem ser os mesmos ao aumentar o número de neurônios na camada
escondida ou aumentar o número de camadas escondidas.
A Figura 5 mostra um exemplo de uma rede de com duas camadas intermediárias
ou escondidas, tipicamente utilizada na resolução de vários problemas complexos. É
nessas camadas que ocorre a extração de informações dos dados, estabelecendo as
relações existentes entre os dados de entrada e os dados de saída.
Figura 11. Rede com dois neurônios na camada de entrada, quatro neurônios em cada
camada intermediária e um neurônio na saída.
Fonte: GARCIA, 2004.
25
As RNA’s têm sido aplicadas com sucesso em várias áreas de pesquisa química,
matemática, engenharia, medicina e psicologia devido a uma boa adaptação em diversos
campos de pesquisa e aos bons resultados apresentados (RAMADHAS et al. 2006).
O algoritmo Backpropagation, também conhecido como retropropagador do erro,
é um algoritmo de aprendizado supervisionado que utiliza a técnica de gradiente
descendente para atingir o seu objetivo que é minimizar a função de erro entre a saída real
e a desejada. É muito utilizado na topologia de redes neurais feedforward com algoritmo
de aprendizagem, pois é capaz de resolver muitos problemas de reconhecimento de
padrões (BRAGA et al., 2007).
Segundo Haykin (2001) durante a fase de treinamento do algoritmo
Backpropagation duas etapas são estimuladas para cada padrão de entrada apresentado,
sendo que uma consiste no processamento para a frente e a outra no processamento para
trás. Na primeira etapa ocorre um fluxo das unidades de entrada em direção as de saída e
os pesos sinápticos permanecem sem alteração. Posteriormente, a função de ativação é
aplicada e assim os neurônios de saída são produzidos. Após a produção dos neurônios
da camada de saída, o algoritmo Backpropagation inicia a etapa de treinamento para o
padrão indicado. Duas condições são utilizadas como critério de parada da etapa de
treinamento: número máximo de iteração estipulada pelo pesquisador e convergência da
rede. Essa convergência se dá a partir do momento em que o somatório dos erros da
camada de saída atinge um valor de erro aceitável para o problema em questão (DURÃES,
2009).
O treinamento de redes MLP utilizando o algoritmo Backpropagation possui uma
sensibilidade relacionada a critérios de superfície de erro, e assim surgem dificuldades na
convergência em regiões de baixo gradiente e de mínimos. Ao considerar os efeitos de
segunda ordem no gradiente descendente, pode-se minimizar essa dificuldade. Outras
possibilidades para ajudar no aceleramento do algoritmo bem como reduzir os efeitos dos
mínimos locais é utilizar taxas de aprendizado decrescente, usar um termo de momento
durante desempenho da rede e adicionar ruído aos dados. (BRAGA et al., 2007).
O algoritmo Resilient Backpropagation foi criado com a finalidade de evitar e/ou
corrigir os problemas encontrados no Backpropagation, ele possui uma taxa de
aprendizagem dinâmica que é atualizada a cada conexão estabelecida entre os neurônios
e assim diminui o erro de forma individual para cada neurônio (OLIVEIRA et al, 2015)
26
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38
II OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar e validar a utilização do FTIR na detecção e quantificação de
Ivermectina em leite.
2.2 Objetivos específicos
Obter o espectro referência para o leite in natura sem adulteração por meio da
espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR);
Obter o espectro referência para da Ivermectina por meio da espectroscopia de
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR);
Criar e validar metodologia de utilização do FTIR associada a técnicas de análise
multivariada e Redes Neurais Artificiais para a classificação de amostras em
grupos que identifiquem a presença ou ausência de Ivermectina no leite.
39
III CAPÍTULO 1 - USO DA ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO POR
TRANSFORMADA DE FOURIER COM REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA
(FTIR-ATR) ASSOCIADO A QUIMIOMETRIA COMO TESTE DE TRIAGEM
PARA IVERMECTINA EM LEITE.
RESUMO
As Ivermectinas (IVM) são usadas rotineiramente na produção animal para tratamento de
um amplo espectro de doenças parasíticas. O seu uso em vacas leiteiras pode deixar
resíduos no leite, cujos níveis não devem ultrapassar, segundo o Codex Alimentarius, 10
µg/L. A principal técnica empregada na detecção da IVM em leite é a HPLC-FL, no
entanto, esta técnica é laboriosa e exige o uso de reagentes químicos e equipamentos
caros, o que dificulta o monitoramento de maior número de amostras. O objetivo do
presente estudo foi utilizar a espectrofotometria no infravermelho médio com
transformada de Fourier (FTIR-ATR) associada a técnicas multivariadas, a fim de superar
as desvantagens ora apresentadas. Foram coletadas amostras de leite de 10 vacas sadias
não tratadas com IVM durante três períodos. Estas amostras foram fracionadas e
adicionado padrão de IVM, obtendo-se as seguintes concentrações: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14, 16, 18 e 20 µg/L de leite. Na região espectral entre 4000 a 600 cm-1, foram observados
no FTIR-ATR, 16 e 29 picos cujas absorbâncias máximas foram correspondentes às
vibrações das ligações dos respectivos grupos funcionais presentes no leite e no padrão
de IVM, respectivamente. As absorbâncias dos 45 picos foram inicialmente submetidas
a Análise de Componentes Principais (ACP), que indicou redução de dimensionalidade
de 45 para 16 variáveis de importância para o estudo. Observamos clara distinção na
dispersão gráfica do CP1 e CP2A entre as amostras de leite puro, leite adicionado de IVM
e padrão de IVM. Utilizando as 16 variáveis selecionadas na ACP realizou-se a
classificação das amostras em leite adicionado de IVM e leite puro, utilizando-se a
Análise Discriminante e as Redes Neurais Artificiais (RNA). Ambas as técnicas foram
capazes de classificar corretamente 100% das amostras, mesmo quando estão presentes
pequenas concentrações de IVM como 2 µg /L. A RNA quando utilizada para predizer a
concentração de IVM em leite não foi eficiente comprovado pelos valores de RMSE
elevados e correlação não significativa entre os valores preditos pela rede e os
experimentais. Assim, FTIR-ATR associado a técnicas multivariadas pode ser usado
como teste de triagem de IVM em leite.
Palavras-chave: Triagem, Ivermectina, Leite, Espectroscopia
40
ABSTRACT
Ivermectin’s (IVM) are routinely used in animal production and its use in lactating
animals may leave residues in milk. Liquid chromatography is the main technique
employed in the detection of IVM in milk; however, this technique is laborious and
requires chemical reagents, which makes it difficult to monitor a greater number of
samples. The goal of this study was evaluated the Fourier transform infrared with
attenuated total reflectance (FTIR-ATR) associated with multivariate techniques as a
screening test for IVM in milk. Milk samples from 10 healthy cows not treated with IVM
were collected during three periods. These samples were fractionated and IVM standard
added (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 μg/L of milk). In the spectral region between
4000 and 600 cm -1, 16 and 29 peaks were observed, whose maximum absorbance’s
corresponded to the vibrations of the respective functional groups (milk and IVM,
respectively). The absorbance of the 45 peaks was initially subjected to Principal
Component Analysis (PCA), which indicated reduction from 45 to 16 variables of
importance for the study. We observed a clear distinction in the graphic dispersion (PC1
and PC2) between the samples of pure milk, milk added with IVM and standard of IVM.
Using the 16 variables selected in the PCA, was carried out Discriminant Analysis and
Artificial Neural Networks (ANN). Both techniques were able to sample classify (100%).
Thus, FTIR-ATR associated with multivariate techniques can be used as a screening test
for IVM in milk.
Key words: Screening, Ivermectin, Milk, Spectroscopy
41
1 INTRODUÇÃO
As Avermectinas (abamectinas, doramectinas, emamectinas, eprinomectinas,
ivermectinas e selamectinas) são anti-helmínticos e ectoparasitas semi-sintéticos
pertencentes às Lactonas Macrocíclicas usadas em animais e seres humanos,
rotineiramente, e em sua maioria, produzidas a partir da bactéria Streptomyces
avermitillis (WEISHER & BROWN, 2001; VERCRUYSSE & REW, 2002). Neste grupo
as Ivermectinas (IVM) se destacam. A IVM é um composto que contém, no mínimo 80%
de 22,23-diidroavermectina B1a e menos de 20 % de 22, 23-diidroavermectina B1b
(YATES et al., 2003; CANGA, et al., 2009; ESCRIBANO et al., 2012).
Na União Europeia, assim como Canadá, Estados Unidos e Japão resíduos de IVM
em leite de animais para consumo humano não são permitidos. Por sua vez, o Codex
Alimentarius indica como limite máximo de resíduos no leite (LMR) 10 ng·mL-1, similar
ao permitido no Brasil, enquanto a Austrália permite até 50 ng·mL-1 (BRASIL, 1986;
BRASIL, 2003; CERKVENIK-FLAJS et al., 2010; BRASIL, 2012; ESCRIBANO, et al.,
2012).
As técnicas descritas para quantificação de IVM em leite, e em geral, são mais
laboriosas, devido à complexidade da matriz, exigem pessoal treinado e equipamentos
caros e usam muitos reagentes químicos (DANAHER et al., 2006; CERKVENIK-FLAJS,
et al., 2010; ESCRIBANO et al., 2012), o que dificulta o monitoramento. Assim,
buscando-se agilidade neste processo, testes de triagem para LM tem sido buscados em
todo o mundo, contudo, os relatos indicam o uso da cromatografia líquida como teste de
triagem (JEONG et al., 2012; WEI et al., 2015; OZDEMIR & KAHRAMAN, 2016), o
que não resolve o problema da velocidade de avaliação de amostras e do uso de reagentes
químicos.
A espectrometria de infravermelho tem sido usada em leite para caracterizar
parâmetros nutricionais (IÑÓN et al., 2004; BASSBASI et al., 2014), adulteração por
mistura de leite de distintas espécies (RECIO et al., 2004; NICOLAOU et al., 2010) entre
outros usos (CAPUANO et al., 2014), porém, não tem sido usada no monitoramento de
IVM.
As técnicas de determinação/quantificação de IVM, em geral cromatográficas, são
trabalhosas, requerem maior tempo de análise e uso de reagentes químicos. Olhando para
o futuro, testes de triagem auxiliarão o monitoramento desenvolvido por laboratório de
42
controle, atualmente desenvolvido em grande número de amostras, assim, estes se
concentrarão em amostras que necessitam confirmação (TOLDRA & REIG, 2006).
Assim, o uso de espectroscopia associada à quimiometria (técnicas estatísticas e
matemáticas usadas para análise de informações químicas) tem se destacado na avaliação
de alimentos, por sua facilidade, agilidade e baixo custo (NICOLAOU et al., 2010). Nesse
sentido, propomos uma nova técnica que sirva como teste de triagem, possibilitando o
aumento do número de amostras a serem confirmadas, sendo nosso objetivo o
desenvolvimento/validação do uso de espectroscopia no infravermelho médio por
transformada de Fourier na detecção de resíduos de Ivermectina em leite.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Origem das amostras
O leite foi obtido de vacas sadias, com adequado controle sanitário e grau de
sangue zebuíno, em rebanho comercial da Fazenda Santo Antônio em Itapetinga – BA e
que não receberam tratamento com Ivermectina (IVM). Para a análise de IVM, foi
utilizado padrão de IVM Sigma Aldrich.
2.2 Delineamento experimental
Para a realização do experimento, foram coletadas amostras de 500 mL de leite de
10 vacas, no turno matutino, em 3 períodos distintos com intervalos de 1 semana,
totalizando a coleta de 30 parcelas. Após homogeneização de cada amostra, foram
retiradas alíquotas para diluições sucessivas até a obtenção das concentrações pré-
definidas.
As amostras de leite cru sem IVM foram adulteradas com o padrão de IVM nas
concentrações de: 0 (leite puro), 2, 4, 6, 8, 10 (limite máximo permitido), 12, 14, 16, 18
e 20 µg de IVM/L de leite em cada uma das parcelas, resultando em 30 amostras para
cada tratamento, assim, 300 amostras de leite adulterado, 30 amostras de leite puro, além
de 30 amostras de padrão de IVM.
2.3 Preparo das amostras
Após a adição de IVM às amostras, estas foram colocadas em eppendorfs
identificados individualmente, cobertos com papel alumínio em toda a sua abertura e
realizados diversos furos no papel para viabilizar a posterior liofilização e, após
acondicionadas, as amostras foram congeladas à -20 ºC + 2 ºC por 24 horas. O excedente
do material não utilizado nos eppendorfs foi colocado em frascos plásticos, identificado
43
individualmente e armazenado sob as mesmas condições de congelamento mencionadas
anteriormente, essa medida foi adotada como forma de garantir a reserva desse material
em caso de dano ou perda das amostras liofilizadas.
Após o congelamento, as amostras de leite puro e leite adulterado com IVM foram
liofilizadas à -48 ºC + 2 ºC e 0,100 mBar por 24 horas em liofilizador de bancada, modelo
FreeZone 4,5 L, marca Labconco (Kansas City, USA).
2.4 Análise espectrofotométrica vibracional
Os espectros das amostras de leite, IVM e do leite com as distintas concentrações
de IVM foram determinados com o uso da espectroscopia por reflectância total atenuada
acoplada, na região do infravermelho médio 4000-600 cm-1 por transformada de Fourier
(ATR-FTIR), em equipamento modelo Cary 630, marca Agilent (Santa Clara, USA). Os
dados foram obtidos com uso do software Microlab e o Resolution Pro, marca Agilent
(Santa Clara, USA), para posterior caracterização e comparação dessas amostras.
2.5 Caracterização e comparação dos espectros das amostras
Para a caracterização das amostras, os espectros dessas foram analisados de
acordo com as características das bandas que constituíam cada um. A partir das
características das bandas dos espectros, foram descritas as propriedades às quais estas se
relacionavam e, a partir dessas informações, foi realizada a comparação dos espectros e,
consequentemente, das amostras (Stuart, 2004).
2.6 Medidas de Dispersão e Padronização da Matriz de Dados
Para a Análise de Componentes Principais e Análise Discriminante, os dados
originais dos espectros foram padronizados a partir do desvio padrão e do coeficiente de
variação. Essa padronização consistiu na criação de nova variável (Y) de média
equivalente a zero e desvio padrão igual 1, para a eliminação das diferenças entre as
medidas das variáveis a serem estudadas (Equação 1).
Y =x−µ
σ
Equação 5
Em que: Y = Variável padronizada; X = Variável original; µ = Média, e σ = Desvio padrão
2.6.1 Construção das matrizes de dados utilizadas nas técnicas multivariadas.
Os resultados das análises foram organizados em conjuntos de dados e, desses,
foram construídas as matrizes que avaliariam os efeitos das variáveis (números de onda)
44
sobre as amostras. Para a separação das amostras foram construídas, inicialmente, 4
matrizes (A1, A2, A3 e A4) com X número de amostras (Leite, IVM ou leite adulterado
com IVM) e Z número de variáveis, inicialmente igual a 45 (16 variáveis referentes ao
leite e 29 referentes à IVM), que seriam reduzidas à medida em que fosse realizada a
ACP, formando assim, as matrizes X x Z.
A1 consistiu em uma matriz 60x45, (30 amostras de leite e 30 amostras de padrão
de IVM); A2 consistiu em uma matriz 360x45, as 60 amostras anteriores somadas as 300
amostras de leite adulterado com IVM; A3 consistiu em uma matriz 330x45, 30 amostras
de leite puro, leite adulterado com IVM com níveis de 2 a 10 µg/L (150 amostras) e leite
adulterado com IVM com níveis de 12 a 20 µg/L (150 amostras); A4 consistiu em uma
matriz 330x45, 30 amostras de leite puro e 300 amostras leite adulterado. Para todas as
matrizes, os valores de Z correspondiam aos 45 números de onda onde ocorrem vibrações
moleculares no leite ou na IVM. Os grupos de amostras utilizados em cada análise e as
simbologias utilizadas estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Descrição dos grupos usados nas análises de componentes principais (ACP),
análise discriminante (AD) e Redes Neurais (RN).
População Símbolo Número de
amostras
Inclusão de
Ivermectina (µg/L)
Análises
Ivermectina I 30 Padrão de IVM ACP
Leite L 30 0 ACP, AD e RN
Leite A A 150 ≥2 e ≤10 µg/L ACP, AD e RN
Leite B B 150 ≥12 e ≤20 µg/L ACP, AD e RN
Leite adulterado C 300 ≥2 e ≤20 µg/L AD
2.7 Análise Estatística
2.7.1 Análise de Componentes Principais
Após o tratamento dos dados e obtenção das médias padronizadas conforme o
item 2.6, as variáveis Y foram utilizadas para a ordenação de um novo sistema de
coordenadas com eixos ortogonais (Equação 2).
𝐶𝑃𝑖 = 𝑎𝑖,1𝑍1 + 𝑎𝑖,2𝑍2 + 𝑎𝑖,3𝑍3 + ⋯ + 𝑎𝑖,𝑛𝑍𝑛
Equação 6
Em que: i = 1,2,3, ...,n, sendo:
45
CPi: i-ésimo componente principal;
ai,1, ai,2, ai,3, ..., ai,n, elementos do i-ésimo autovetor (a1) normalizado, associado ao i-
ésimo autovalor (Zi) do i-ésimo componente principal (CPi ).
A partir dessa equação, foram obtidos os Componentes Principais (CP’s) em
ordem decrescente de variância, em que, o CPi explica maior variação dos dados quando
comparado a CPi+1 e assim sucessivamente. Essa ordenação possibilitou a redução do
número de variáveis, inicialmente igual a 45. Para a seleção dos CP’s, foram utilizados
os critérios de Kaiser, onde foram selecionados os primeiros CP’s que acumulam
percentual de variância superior a 70% e autovalor maior que 1, conforme descrito em
Jolliffe (1972) e Mardia e colaboradores (1979) que torna passível de descarte variáveis
de forte correlação com CP’s de menor autovalor (variância). Associados a esses critérios,
foi definido que as variáveis seriam excluídas em função da classificação das amostras
pelos CP’s.
2.7.2 Análise discriminante
Funções matemáticas foram desenvolvidas para classificar as amostras da matriz
A3 (Y x Z), com 330 amostras (Leite, Leite A e Leite B) (Y) e 16 variáveis (Z) e A4
também com 330 amostras, (Leite e Leite adulterado com IVM) e as mesmas variáveis
(Z), selecionadas na análise de componentes principais. Os dados foram aleatorizados e
divididos em dois grupos: um de treinamento (80%) e o outro de validação (20%) para
cada grupo de amostras para obtenção da função discriminante linear, sendo que o último
grupo verificaria a capacidade de generalização da função.
2.8 Redes Neurais Artificiais
2.8.1 Arquitetura e desenvolvimento das RNA’s
Após coleta, os dados gerados foram normalizados e inseridos no software Java
Simulator Neural Network (Java NNS) – Java Neural Network Simulator 1.1 (Fischer et
al., 2001), o qual é baseado no SNNS - Stuttgart Neural Network Simulator.
A rede escolhida para realização do presente trabalho foi a do Tipo Perceptron de
Múltiplas Camadas (MLP) e o algoritmo utilizado foi o Resilient Propagation que possui
uma taxa de aprendizado dinâmica facilitando o processo de aprendizagem. As
arquiteturas das redes testadas é apresentada na Tabela 2.
Na primeira e na segunda camada escondida foram testados de 10 a 50 neurônios
para que pudesse ser feita a escolha da melhor configuração. Para o desenvolvimento da
rede foram observados o sistema e a taxa de aprendizagem. Rai e colaboradores (2005)
46
mostram que a taxa de aprendizagem auxilia na variação de pesos de conexão durante a
constituição da rede, a faixa especifica para essa taxa varia entre 0,05 e 0,75. A taxa de
aprendizado utilizada neste trabalho foi de 0,2.
Tabela 2. Arquiteturas das redes neurais utilizadas
Rede Usada Rede Neural De Retropropagação
Classificação Predição
Aprendizagem Supervisionado Supervisionado
Função de Ativação Logística Tangente
Hiperbólica
N° variáveis de entrada 16 16
N° de camadas intermediárias 1 a 3 1 a 2
N° de neurônios nas camadas intermediárias 10 a 100 10 a 50
N° variáveis de saída 1 3
Sistema de Aprendizagem Resilient
Propagation
Resilient
Propagation
Taxa de aprendizagem 0,2 0,2
Ciclos 100 a 300 100 a 300
2.8.2 Treinamento e Validação
2.8.2.1 Predição
O conjunto total de dados (330 amostras) foi dividido em dois conjuntos,
aprendizagem e validação. Essa separação foi realizada empregando o modo aleatório e
critério de mínimo e máximo. O primeiro conjunto com 80% dos dados (264 dados) foi
utilizado para o treinamento da rede e o segundo conjunto com 20% dos dados (66 dados),
foi utilizado para validação. Para a construção da rede, foram utilizados os escores das 16
variáveis selecionadas na ACP e utilizada na AD.
Os dados de entrada e de saída foram normalizados automaticamente pelo
software usado (Equação 3) (NEURALWARE, 2000).
47
𝑋𝑖, 𝑛𝑜𝑟𝑚 =𝑥𝑖−𝑥𝑚í𝑛
𝑥𝑚á𝑥−𝑥𝑚í𝑛
Equação 7
Em que xi,norm representa os dados normalizados; xi, os dados experimentais;
xmín, o valor mínimo dos dados; xmáx, o valor máximo dos dados .
Os desempenhos das diferentes formações da RNA foram comparados de acordo
com o coeficiente de correlação (R) entre dados de saída experimentais e preditos e raiz
do erro quadrado médio (RMSE) (Equação 4). A correlação de aprendizagem e
verificação de iterações dos RNA’s criados foram calculados a partir de dados
normalizados.
2
1
1
n
d p
i
RMSE x xn
Equação 8
Em que n é o número de pontos de dados, e xd e xp são os valores experimentais e
previstos dos níveis de contaminação das amostras testadas na rede: Leite, Leite A e Leite
B, respectivamente.
2.8.2.2 Classificação
A rede neural artificial também foi utilizada para classificar os dados (Leite puro,
Leite A e Leite B) que também foram separados em dois grupos (treinamento e
validação). A entrada da rede foi constituída pelos dados originados no espectrofotômetro
(FTIR), e a saída foi representada por um vetor multidimensional formado por uma matriz
identidade, em que a dimensão corresponde a quantidade de grupos que compõem os
dados utilizados, conforme a classificação a seguir:
(1,0,0) = Leite A
(0,1,0) = Leite B
(0,0,1) = Leite puro
Os conjuntos de dados, treinamento e validação, foram montados neste formato
numérico, de modo que, cada amostra ao ser classificada corretamente teria o número 1
atribuído a ela e ao ser classificada erroneamente o número 0.
48
As redes foram testadas de forma a obter a que melhor se desempenhasse em
relação ao menor RMSE (raiz do erro quadrático médio) obtido por meio da equação 4 e
consequentemente a melhor taxa de classificação.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Caracterização e comparação das amostras de Ivermectina (IVM) e Leite
O espectro da Ivermectina (Figura 1) apresentou grande número de bandas
estreitas, isto se deve ao tamanho da estrutura da Ivermectina (mínimo de 80%
Ivermectina B1a – C48H74O14 e máximo de 20% Ivermectina B1b – C47H72O14) que
apresenta diversas funções orgânicas, destacando-se grupos hidroxilas, metoxilas, anel
tetrahidrofurano, anel tetrahidropirano, éteres, ésteres e álcoois, com ligações químicas
que apresentam vibrações moleculares em diferentes faixas do espectro.
A formação de bandas estreitas e pontiagudas demonstrou que os modos
vibracionais da IVM são bem definidos (STUART, 2004) e a predominância de bandas
de pouca expressão nas faixas de 3150 a 3050, 1600 a 1475 cm-1 e 900 a 690 cm-1
evidencia a ausência de compostos aromáticos na estrutura da IVM (PAVIA,2010).
Figura 12. Espectro no Infravermelho da Ivermectina.
49
A análise das amostras de leite por FTIR, na região do infravermelho médio (4000
– 600 cm-1) originou espectros com bandas características de gordura, proteína e lactose
em diferentes faixas, observadas em 16 números de onda (Figura 2).
Figura 13. Espectro no Infravermelho do leite puro.
As bandas que caracterizam a gordura, ocorreram em função das vibrações das
moléculas de ácidos graxos presentes em suas estruturas e apresentaram picos de absorção
em 2919 e 2851 cm-1 (estiramento C=O), em 1742 cm-1 (estiramento C=O) e em 1458 e
1376 cm-1 (estiramento C-H) (HEUER, 2001; AERNOUTS, 2011; GRELET, 2015).
As vibrações características das estruturas das proteínas resultaram em bandas
com picos de absorção em: 3278 cm-1 (Amida secundária - estiramento N-H), porém,
nessa região espectral também ocorre vibração de estiramento do grupo O-H presente na
água, com isso, é possível afirmar que a banda formada nessa região ocorre em função da
presença de água e proteína; em 1647 cm-1 (Amida I - estiramento C-O), em 1541 cm-1
(Amida II - estiramento C-N e deformação angular N-H); em 1241 cm-1 (Amida III –
estiramento C-N, deformação angular N-H, estiramento C=O e vibrações de deformação
angular em O=C=N), em 768 cm-1 (Amida IV – estiramento O-C-N) e em 700cm-1
(Amida V – deformação angular fora do plano N-H), (KONG &YU, 2007; AERNOUTS
et al., 2011).
50
A lactose originou bandas nas regiões espectrais características das vibrações das
moléculas de grupos carboxílicos presentes nas suas estruturas, com picos de absorção
em 1148 cm-1 (estiramento C-O-C) e em 1023 cm-1 (estiramento C-O-C) (HEUER et al.,
2001; GRELET et al., 2015).
A comparação dos espectros da Ivermectina e do Leite indica diferença entre eles,
pois alguns picos são distintos (números de onda de máxima intensidade de absorção),
assim como sua forma. Enquanto o leite apresenta bandas mais arredondadas, a IVM
apresenta bandas mais estreitas, facilmente observado na faixa de 1150 a 750 cm-1, onde
se encontram bandas referentes à lactose, na faixa de 1737 a 1481 cm-1, onde se encontram
as bandas de gordura, e nas bandas de proteína, entre 2919 a 2851 cm-1. Entretanto, apesar
dessas diferenças, não foi possível encontrar uma banda no espectro da IVM fora das
faixas onde ocorreram bandas no espectro do leite, o que impossibilitou a classificação
de amostras de leite adulterado com IVM apenas pela identificação de uma banda distinta
no espectro da matriz.
A avaliação dos pontos médios de máximas intensidades de absorção do
Infravermelho nos espectros da IVM, leite e o leite adulterado (10µg/L e 20µg/L)
demonstrou alterações em algumas regiões do leite adulterado em relação ao leite puro.
Estas alterações foram observadas mais claramente nos seguintes pontos: 1457 cm-1,
associado à gordura; 3278 e 1647 cm-1, associados à proteína; 1023 cm-1, associado à
lactose (Figura 3). Estas observações confirmaram que a presença da IVM no leite
acarretou a ligação de componentes da IVM com os do leite, promovendo assim as
alterações observadas no espectro e indicam a possibilidade de separação de amostras de
leite puro e adulterado com IVM pelo método FTIR.
51
Figura 14. Médias dos pontos de máxima intensidade de absorção da Ivermectina, Leite
e o leite adulterado (10µg/L e 20µg/L).
A razão de crescimento dessa intensidade de absorção evidencia que, quando
presente no leite, apesar de não alterar o perfil do seu espectro, a IVM confere efeito
aditivo a algumas dessas bandas que, por sua vez, apresentam intensidades de absorção
alteradas.
Devido às pequenas diferenças visuais destacadas anteriormente no leite
adulterado com IVM, as correlações dos espectros foram avaliadas com o uso de análises
multivariadas como componentes principais (ACP), análise discriminante e redes neurais
artificiais.
3.2 Análise Estatística Multivariada
3.2.1 Análise de Componentes Principais
O primeiro teste realizado de ACP avaliou as amostras de IVM e Leite. Como
esperado, a ACP separou claramente essas amostras em 2 grupos (Figura 4a),
confirmando a avaliação do espectro no infravermelho médio por transformada de
Fourier, já destacada anteriormente. Nesta análise, a CP1 explicou a quase totalidade da
variação dos dados (99,3%), enquanto CP2 explicou apenas 0,45%. As amostras de leite
apresentaram correlação positiva com CP1, enquanto as amostras de IVM apresentaram
correlação negativa, demonstrando assim a capacidade do CP1 separar o leite puro do
52
padrão de IVM. Para esta classificação, após a redução das variáveis, verificou-se que
apenas 5 delas foram suficientes: 3278, 1647, 1541, e 1241 cm-1 (proteínas) e 1458 cm-1
(gordura), todas apresentaram correlação superior a 98% com o CP1, sendo indicados
para explicar a separação da IVM do leite. Estas variáveis representam bandas
características do leite, já que a Ivermectina não possui estas biomoléculas, o que indica
a diferença entre elas. A lactose, apesar de não estar presente na IVM, não está entre as
substâncias que diferenciam, dessa forma, o leite da IVM, pois nas faixas onde ocorrem
bandas da lactose, também ocorrem bandas expressivas do espectro da IVM em função
do estiramento C-O-C.
A ACP que avaliou as amostras de IVM, Leite e leite adulterado de 2 a 10 µg/L
(A) leite adulterado de 12 a 20 µg/L (B) indicou a separação entre os tratamentos em 3
grupos: IVM, leite e leite adulterado. A análise não foi capaz de separar as amostras de
leite adulterado por níveis de IVM (Figura 4b).
Esta análise indicou a redução de 45 para 23 variáveis que apresentaram alta
correlação com CP1 que explica 76,1% da variação dos dados e, algumas com CP2, que
explica 9,4% da variação, deixando clara a importância do CP1. Essas variáveis, que
foram suficientes para a separação das amostras de IVM, Leite e leite adulterado, se
referem a bandas características do leite: 3278 e 1458 cm-1 (gordura), 1647, 1541 e 1241
cm-1 (proteína); e variáveis relacionadas ao espectro da IVM: 3450, 2963, 2934, 2887,
1730, 1676, 1457, 1380, 1340, 1313, 1065, 1047, 970, 900, 832, 786, 761 e 726 cm-1.
Na avaliação das amostras de Leite, Leite A e Leite B, a variação explicada pelo
CP1 foi de 81,64% e pelo CP2, 6,95%, totalizando 88,6% (Figura 4c), houve redução até
16 variáveis que apresentaram alta correlação com CP1, todas associadas à faixas
espectrais características de formação de bandas da Ivermectina: 3450, 2963, 2934, 2887,
1676, 1457, 1380, 1340, 1313, 1065, 1047, 900, 832, 786, 761 e 726 cm-1. Estas variáveis
indicam os efeitos da Ivermectina sobre o leite.
53
Figura 15. Escores das amostras de IVM, Leite, Leite adulterado (2 a 10 µg/L) - A e Leite
adulterado (12 a 20 µg/L) - B em relação a CP1 e CP2, em que: A* - I vs L; B* - I vs L
vs A vs B; C* - L vs A vs B.
3.2.2 Análise discriminante
A análise discriminante das amostras permitiu determinar três funções lineares
(Equações 5, 6 e 7) das variáveis que minimizaram a dispersão nos grupos avaliados e
elevaram a razão existente entre eles, possibilitando a definição dos grupos de leite, leite
A e Leite B. Nestas funções, foram atribuídos pesos (coeficientes discriminantes) a cada
variável, assim, estes pesos foram multiplicadores para os resultados intensidade de
absorção obtidos nas análises em cada variável (números de onda).
Os resultados da análise discriminante permitiram a previsão do grupo em que as
amostras se encaixaram, especificamente no grupo adulterado. As funções discriminantes
evidenciaram a relação dessas variáveis à presença de IVM no leite, uma vez que, o
aumento dos valores escores dessas variáveis ocorre à medida que se verifica a presença
de IVM no leite.
54
𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 = −15,30147 − 0,86161 ∗ 𝑌3450 − 11,00694 ∗ 𝑌2963 + 4,87254 ∗ 𝑌2934 +
11,00828 ∗ 𝑌2887 + 0,69160 ∗ 𝑌1676 − 4,03767 ∗ 𝑌1457 + 2178238 ∗
𝑌1380– 33,69269 ∗ 𝑌1340 + 28,16606 ∗ 𝑌1313 + 24,01355 ∗ 𝑌1065 − 20,89078 ∗
𝑌1047 + 9,09333 ∗ 𝑌900– 2,48619 ∗ 𝑌832 + 36,97411 ∗ 𝑌786 − 53,93883 ∗
𝑌761 + 45,82136 ∗ 𝑌736 Equação 9
𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 𝐴 = −15.33151 − 2,06059 ∗ 𝑌3450 − 10,69601 ∗ 𝑌2963 + 3,80826 ∗
𝑌2934 + 12,62285 ∗ 𝑌2887 + 0,74960 ∗ 𝑌1676 − 1,42954 ∗ 𝑌1457 + 25,74307 ∗
𝑌1380– 39,05799 ∗ 𝑌1340 + 25,95683 ∗ 𝑌1313 + 30,99277 ∗ 𝑌1065 − 23,94909 ∗
𝑌1047 + 7,21802 ∗ 𝑌900– 0,16348 ∗ 𝑌832 + 41,35095 ∗ 𝑌786 − 48,43452 ∗
𝑌761 + 31,8434 ∗ 𝑌73 Equação 10
𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 𝐵 = −383.71473 + 4,20025 ∗ 𝑌3450 + 52,54298 ∗ 𝑌2963 − 22,52935 ∗
𝑌2934 − 50,03985 ∗ 𝑌2887 − 1,35053 ∗ 𝑌1676 + 10,40666 ∗ 𝑌1457 −
115,77251 ∗ 𝑌1380 + 168,49672 ∗ 𝑌1340 − 127,55194 ∗ 𝑌1313 − 160,11690 ∗
𝑌1065 + 125,46721 ∗ 𝑌1047 − 40,52560 ∗ 𝑌900 + 6,87775 ∗ 𝑌832 − 196,02447 ∗
𝑌786 + 242,87243 ∗ 𝑌761 − 168,64826 ∗ 𝑌736 Equação 11
A capacidade de treinamento apresentou taxa de classificação de 52,5% para o
Leite A, 64,1% para o Leite B e 100% para o Leite (L). Por sua vez, no procedimento de
validação, utilizado para avaliar a capacidade de generalização do método, a capacidade
de previsão para as amostras foi de 46,67%, 70% e 100%, para o Leite A, Leite B e Leite,
respectivamente.
Os resultados obtidos demonstram que 100% das amostras de leite foram
classificadas corretamente. No entanto, as amostras adulteradas apresentaram resultados
diferentes. As amostras de leite A apresentaram redução no percentual de amostras
classificadas corretamente na validação quando comparada ao treinamento, enquanto as
amostras do leite B tiveram melhor classificação na validação quando comparada ao
treinamento. Destacamos que nenhuma das amostras adulteradas, nos grupos A e B, se
comportou como sendo leite.
A taxa de classificação apresentada demonstrou que a técnica foi capaz de separar
leite e leite adulterado com IVM, no entanto, a técnica foi ineficiente para separar as
55
categorias de leite adulterado, uma vez que amostras de leite contaminado com
concentrações entre 2-10 µg/L foram classificadas como sendo entre 12- 20 µg/L e vice-
versa.
Uma vez que a análise discriminante não apresentou eficiência para separação de
leite adulterado por níveis de IVM, procedeu-se nova análise utilizando-se os mesmos
dados e procedimentos anteriores, porém, nesta nova análise foram considerados apenas
2 grupos: leite e leite adulterado com IVM 2-20µg/L (matriz A4), objetivando otimizar a
capacidade discriminatória das funções. Assim, foram obtidas 2 novas funções
discriminantes (Equações 8 e 9).
𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 = −385,178 + 4,15016 ∗ 𝑌3450 + 52,76146 ∗ 𝑌2963– 22,6744 ∗
𝑌2934– 50,1425 ∗ 𝑌2887 − 1,35251 ∗ 𝑌1676 + 10,59049 ∗ 𝑌1457– 115,997 ∗
𝑌1457 + 168,8462 ∗ 𝑌1340 − 128,163 ∗ 𝑌1313 − 160,345 ∗ 𝑌1065 + 125,7791 ∗
𝑌1047– 40,7844 ∗ 𝑌900 + 7,03231 ∗ 𝑌832 − 196,534 ∗ 𝑌786 + 244,1068 ∗
𝑌761 − 170,066 ∗ 𝑌736 Equação 12
𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 𝐴𝑑𝑢𝑙𝑡𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 (𝐴 + 𝐵) = −15,3545 − 1,45869 ∗ 𝑌3450 − 10,8951 ∗ 𝑌2963 +
4,36414 ∗ 𝑌2934 + 11,85005 ∗ 𝑌2887 + 0,72297 ∗ 𝑌1676 − 2,7615 ∗ 𝑌1457 +
23,82731 ∗ 𝑌1457– 36,4789 ∗ 𝑌1340 + 27,17989 ∗ 𝑌1313 + 27,56192 ∗ 𝑌1065 −
22,4854 ∗ 𝑌1047 + 8,19945 ∗ 𝑌900 − 1,34543 ∗ 𝑌832 + 39,28334 ∗ 𝑌786 −
51,4196 ∗ 𝑌761 + 39,07456 ∗ 𝑌736 Equação 13
Nesta nova etapa, verificou-se que, quando comparada à análise anterior, ocorreu
o aumento da taxa de classificação, sendo de 100% tanto para leite quanto leite adulterado
nas fases de treinamento e validação. Estes resultados indicaram que a análise
discriminante foi precisa ao separar amostras de leite das amostras de leite adulteradas,
confirmando os resultados obtidos na análise de componentes principais, o que robustece
a possibilidade do uso da espectrometria por infravermelho médio com transformada de
Fourier como teste de triagem para a detecção da contaminação do leite por IVM.
3.3 Redes neurais artificiais
3.3.1 Predição
Entre as redes neurais testadas (com uma ou duas camadas intermediárias),
utilizando-se as 16 variáveis selecionadas na ACP, a rede que apresentou menor erro foi
constituída por 16 neurônios na camada de entrada, 1 camada intermediária com 50
neurônios e 1 neurônio na camada de saída. Os dados de entrada foram as variáveis que
56
classificam as amostras de acordo com a quantidade de IVM, os neurônios da camada
intermediária foram utilizados para extrair informações que relacionavam a entrada com
a saída e o neurônio de saída corresponde ao nível de contaminação do leite por IVM.
Concordando com ACP e com a AD, a rede somente foi capaz de identificar a adulteração,
porém, não foi capaz de quantificar a IVM presente nas amostras de leite.
Para a predição das amostras, o comportamento do erro, no decorrer do
treinamento, diminuiu, enquanto permaneceu constante para validação. Não houve uma
concentração dos pontos de dados em torno da linha de tendência linear e o valor de R2 =
0,266 mostrou-se baixo (Figura 5), sendo assim a RNA desenvolvida não teve capacidade
de predição da quantidade de IVM nas amostras.
Figura 16. Coeficiente de determinação dos dados experimentais e preditos (dados
normalizados 0-1) das amostras de leite puro e adulterado para a rede utilizando a função
Tangente Hiperbólica.
3.3.2 Classificação
A classificação é uma das opções que pode ser desenvolvida utilizando-se a RNA
para classificar amostras com características pertinentes a um determinado grupo. Diante
disto, algumas arquiteturas de redes foram testadas com o intuito de encontrar uma rede
com menor RMSE possível.
Para a classificação, foram testadas redes neurais com uma, duas ou três camadas
intermediárias com a mesma finalidade da predição em escolher a rede que obtivesse um
menor RMSE. Os resultados mostraram que a configuração da RNA composta de três
camadas intermediárias com quarenta e cinco neurônios em cada, apresentou a melhor
estrutura para a classificação de amostras tanto puras quanto adulteradas com IVM (Leite,
57
Leite A e Leite B). Apesar de ter encontrado um RMSE com valor baixo (0,4584) a taxa
de classificação não foi satisfatória para os grupos de leite A e B, pois houve somente
46,67% de classificação correta, para cada um desses grupos, ao passo que as amostras
sem adulteração obtiveram 100% de classificação correta.
Com o aumento dos ciclos, a curva de treinamento diminuiu e a de validação
apresentou baixa variação, porém apresentou tendência de aumento, o que pode ter
ocorrido em função da rede neural estar decorando os dados e suas características à
medida que os dados são treinados pela rede (Figura 6).
Figura 17. Valores de RMSE e ciclos da rede com três camadas intermediárias contendo
45 neurônios cada utilizando a função Tangente Hiperbólica.
O RMSE encontrado RMSE foi de 0,4584 e a taxa de classificação não foi
satisfatória para os grupos de Leite A e B, pois houve somente 46,67% de acertos tanto
para leite A quanto para leite B. Apenas as amostras sem adulteração obtiveram 100% de
acertos na classificação.
4 CONCLUSÃO
Por meio da espectroscopia do infravermelho por transformada de Fourier, é
possível obter espectros de referência de leite e IVM que tem modos vibracionais
distintos, apesar disto, a técnica não é capaz de demonstrar a presença de IVM no leite
por meio da avaliação visual dos espectros. No entanto, quanto associada a técnicas
quimiométricas (Análise de Componentes Principais, Análise Discriminante e Redes
Neurais Artificiais) pode ser utilizada como teste de triagem na detecção da presença de
Ivermectina no leite, contudo, a técnica é ineficiente para a quantificação deste resíduo
até o nível testado (20µg/L leite).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 50 100 150 200 250 300 350
RM
SE
Ciclos
Treinamento Validação
58
Acknowlegdment
Agradecemos ao Deputado Federal Waldenor Pereira pela doação do
espectrofotômetro infravermelho médio utilizado neste estudo e ao IF Salinas pela
disponibilização de recursos financeiros, realizados por meio da liberação da primeira
autora desenvolver sua dissertação.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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