UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

CONTRIBUIÇÃO AO MAPEAMENTO DO CROMOSSOMO 9 DO BÚFALO DE

RIO (BUBALUS BUBALIS) UTILIZANDO PAINEL DE CÉLULAS SOMÁTICAS

HÍBRIDAS IRRADIADAS

André Marcos Santana

Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Jorge Amaral

Co-Orientadora: Profa. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL

Fevereiro de 2008

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de

Jaboticabal, como parte das exigências para a

obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária

(Reprodução Animal).

Santana, André MarcosS232c Contribuição ao mapeamento do cromossomo 9 do búfalo de rio

(Bubalus bubalis) utilizando painel de células somáticas híbridas irradiadas / André Marcos Santana. – – Jaboticabal, 2008

xiii, 37 f. : il. ; 28 cm

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008

Orientador: Maria Elisabete Jorge AmaralBanca examinadora: Vera Fernanda Martins H. de Lima,

Humberto Tonhati, Simone Cristina Méo Niciura Bibliografia

1.Búfalo de rio. 2. Mapeamento. 3.Cromossomo 9. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.

CDU 619:575:636:293

Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.

DADOS CURRICULARES DO AUTOR

André Marcos Santana possui graduação em Medicina Veterinária pela

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal da Universidade

Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (2005). Tem experiência na área de

Medicina Veterinária, com ênfase em Patologia Clínica Veterinária e Genética

Animal, atuando principalmente em temas como proteinograma, bioquímico

sérico e mapeamento genético em búfalos. Durante a graduação foi bolsista de

Iniciação Científica da FAPESP de setembro de 2003 a julho de 2005, tendo

desenvolvido os trabalhos de Iniciação Científica “Hemograma e proteinograma

sérico de búfalas (Bubalus bubalis) sorologicamente reagentes e de não

reagentes à Brucelose” e “Constituintes do soro sanguíneo de Veados-

Catingueiro (Mazama Gouazoubira) criados em cativeiro”. Durante os meses de

Agosto a Novembro de 2005, realizou estágio na empresa Minerembryo (Alfenas

- MG), desenvolvendo o trabalho de graduação intitulado “Influência da sincronia

da receptora e do estágio de desenvolvimento de embriões produzidos in vitro

(PIV) sobre a taxa de prenhez, em fêmeas bovinas” . Iniciou mestrado no

Programa de Medicina Veterinária da UNESP - Jaboticabal, no Departamento de

Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, com ênfase em genética

animal, em Março de 2006.

DEDICATÒRIA

Aos meus pais, meus verdadeiros mestres, exemplos de vida pessoal e

profissional. Muito obrigado por todo amor e dedicação em todos os momentos

da minha vida. Muito obrigado por serem a luz no final do túnel, por estenderem a

mão nos momentos mais difíceis, por me guiarem pelos caminhos mais seguros.

Muito obrigado por construírem um ambiente de paz e alegria. Descobri em vocês

o valor da amizade, da humildade e da honestidade. Espero um dia encher seus

corações de orgulho. E se esse dia chegar, digo do fundo do meu coração que

estarei em paz com o mundo e que viver valeu a pena...

A minha querida irmã, que enche minha vida de alegria. Me orgulho de ser seu

irmão e tenho certeza de que seremos amigos para sempre. Como você mesmo

diz, “Quando a gente acha que tem todas as respostas a vida vem e muda todas

as perguntas”. Por isso estarei sempre ao seu lado, para encontrarmos juntos as

respostas que procuramos...

AGRADECIMENTOS

A Prof. Dra. Maria Elisabete Jorge Amaral, pela orientação e apoio dados na

execução deste trabalho, por me dar a oportunidade de crescer profissionalmente

e pessoalmente, por me receber e me acolher de braços abertos.

A Prof. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, pela co-orientação e apoio

dados na execução deste trabalho e pela ajuda em conseguir contato com São José do

Rio Preto.

Ao Prof. Dr. César Roberto Ésper, pelo apoio durante todo o mestrado.

A Prof. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, ao Prof. Dr. Humberto Tonhati e

a Dra. Simone Cristina Méo Niciura por participarem como membros da banca de defesa

e sugerirem alterações valiosas que contribuíram para a melhor qualidade da dissertação

final.

A Prof. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, ao Prof. Dr. César Roberto

Ésper e a Prof. Dra. Lúcia Galvão Albuquerque por participarem da banca de qualificação

e também sugerirem alterações valiosas que contribuíram para a melhor qualidade da

dissertação final.

Ao Prof. Dr. José Jurandir Fagliari, por me abrir as portas e despertar meu interesse pelo

mundo da ciência, pelo apoio durante toda minha formação profissional.

A Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), UNESP, Campus de

Jaboticabal e ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE),

UNESP, Campus de São José do Rio Preto, Laboratório de Genômica

Comparativa onde realizei todo o mestrado.

A todo pessoal do Laboratório de Genômica Comparativa (Melissa, Nedenia,

Vanderlei, Edson, Patrícia, Larissa e Larissa Fornitano), do Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), UNESP, Campus de São José do

Rio Preto. Muito obrigado pela paciência e amizade no decorrer da execução

desse trabalho. Muito obrigado por me ensinarem tudo que foi possível dentro do

laboratório e por me receberem tão bem. Dedico esse trabalho também a vocês,

pois ele não é de uma pessoa só, e sim de todo um grupo. Desejo a vocês todos

muito sucesso na vida profissional e muita alegria e paz na vida pessoal.

A CAPES, pelo apoio financeiro no decorrer do mestrado.

A todos os funcionários da FCAVJ e do IBILCE que de alguma forma ajudaram

na execução desse trabalho e pela convivência.

A todos os docentes da FCAVJ, pela ajuda em nosso conhecimento profissional.

Ao pessoal da VET01. Já fazem dois anos, mais não existe um dia em que não

me lembre de nossos momentos juntos.

Aos meus tios Marly e Fernando, pela amizade e carinho que me deram durante

toda minha vida. Ao meu primo Fernandinho, grande amigo de infância que vou

levar por toda minha vida.

As minhas avós Iracema e Isaura, que sempre me trataram com todo o amor do

mundo!!!

A toda minha família em geral.

Aos meus companheiros, amigos do peito de São Carlos (Boka, Pressão,

Consuelo, Marcão e Mirto). Espero que jamais o tempo nos separe, obrigado por

fazerem dos meus dias mais alegres.

A República Magnata (Koja véio, Jessé, Cauby, Pixera tranquera, Naim, Fui-Eu,

Zé Pequeno, Tinoco e Paia), onde morei quase toda minha graduação. Quantas

festas, quantas brigas, quantos momentos de reflexão e aprendizado....

Considero todos vocês como irmãos e torço por cada um nessa longa jornada da

vida...

Ao meu amigo Chacal e a minha amiga Colombina, obrigado pela amizade

durante todos esses anos de Jaboticabal...

A República Taverna (Papada, Gracinha, Mocinha, Chinês, Rhola, Xibata, Jane,

Urubu, Placebo e Koréia), onde morei pouco tempo, mais fiz grandes amigos. Do

que valeria a vida sem um pouco de risada!!!!! Muito obrigado por fazerem parte

da minha história, por terem me acolhido como um irmão, por me ajudarem a

crescer como ser humano.

A todos que de alguma forma me ajudaram a crescer pessoalmente e

profissionalmente.

viii

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................ix

RESUMO ................................................................................................................xii

SUMMARY ............................................................................................................xiii

I. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA.................................................... 1

II. OBJETIVOS ...................................................................................................... 10

III. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 11

1. Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino...... 11

2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino........................................ 12

3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000 ....................... 13

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 15

1.Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino....... 15

2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino........................................ 15

3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000 ....................... 18

V. CONCLUSÕES .................................................................................................29

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 30

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

ABCB Associação Brasileira dos Criadores de Búfalos

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

ACP5 Símbolo do gene responsável por codificar a Fosfatase Ácida

do tipo 5

AZU1 Símbolo do gene responsável por codificar a proteína catiônica

antimicrobiana 37 (Azouricin 1)

BBU9 Cromossomo 9 do búfalo de rio (Bubalus bubalis)

BBURH5000 Painel contendo 90 linhagens de células somáticas híbridas

irradiadas, geradas a partir da fusão entre fibroblasto de búfalo

e de hamster.

BOVMAP Banco de dados com marcadores bovinos do Institut National

de Recherche Agronomique

BTA7 Cromossomos 7 de gado bovino (Bos taurus)

CCNH Símbolo do gene responsável por codificar a ciclina H

CD14 Símbolo do gene responsável por codificar duas formas

protéicas: a “glycosylphosphatidylinositol-anchored membrane

protein (mCD14)” e a “monocyte or liver-derived soluble serum

protein (sCD14)”

CD74 Símbolo do gene responsável por codificar molécula do

complexo de histocompatibilidade, classe II

COMP Símbolo do gene responsável por codificar a “cartilage

oligomeric matrix protein”

CPATU Centro de Pesquisa Agropecuária do Trópico Úmido

CRTL1 Símbolo do gene responsável por codificar a “cartilage linking

protein 1”

DCVC S-1,2-diclorovinil-l- cisteína

DNM2 Símbolo do gene responsável por codificar a “dynamin 2”

DNTP Desoxinucleotídeo Trifosfato

x

D7S3 Símbolo de segmento de DNA codificante

EDAS Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System™

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

e-PCR PCR eletrônico

ESTs “Expressed Sequence Tags” = Seqüência Marcada Expressa

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

FISH Flourescence In Situ Hybridization = Hibridização In Situ

Fluorescente

FR Freqüência de Retenção

F12 Símbolo do gene responsável por codificar o “coagulation

factor XII”

GABRA1 Símbolo do gene responsável por codificar a “gamma-

aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1”

GNPI Símbolo do gene responsável por codificar a “Glucosamine-6-

phosphate deaminase 1”

GUK1 Símbolo do gene responsável por codificar a “guanylate kinase

1”

ICAM3 Símbolo do gene responsável por codificar a “intercellular

adhesion molecule 3”

IDF “International Dairy Federation” = Federação Internacional de

Laticínios

IEP Intervalo Entre Partos

ILTXRH map Mapa RH 5000rad Terceira Geração de Bovino da University of

Illinois at Urbana-Champaign Texas A&M University

IL3 Símbolo do gene responsável por codificar a Interleucina 3

IL4 Símbolo do gene responsável por codificar a Interleucina 4

IL12B Símbolo do gene responsável por codificar a Interleucina 12B

INSL3 Símbolo do gene responsável por codificar a “insulin-like 3

(Leydig cell)”

IRF1 Símbolo do gene responsável por codificar o fator de regulação

xi

do interferon 1

ISH “in situ” Hybridization = Hibridização “in situ”

KCl, Cloreto de Potássio

MARC Meat Animal Research Center - USA

MBD3 Símbolo do gene responsável por codificar a “methyl- CpG

binding domain protein 3”

Mbp Mega pares de bases

MEF2C Símbolo do gene responsável por codificar a “myocyte

enhancer factor 2C”

MgCl2 Cloreto de Magnésio

NCBI National Center For Biotechnology Information

NIH- USA National Institute of Health – Estados Unidos da América

NSF Fundação Americana “National Science Foundation”

PCR Polymerase chain reaction = Reação em cadeia de polimerase

QTL Quantitative Traci “Loci” = “locus” de características

quantitativas

RASA1 Símbolo do gene responsável por codificar a proteína ativadora

de GTPase

RH Radiation hybrid = híbridas irradiadas

SCH Somatic Cell Hybrid = Células Somáticas Híbridas

SENAI-RS/UNET Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial – Departamento

Regional do Rio Grande do Sul - Unidade de Negócios em

Serviços Tecnológicos

STS Sequence Tagged Sites = Sítios de Seqüência Marcada

TA Temperatura de Anelamento

Taq Polimerase Thermus Aquaticus Polimerase

USDA United States Department of Agriculture

VDAC1 Símbolo do gene responsável por codificar a “voltage

dependent anion channel 1”

xii

CONTRIBUIÇÃO AO MAPEAMENTO DO CROMOSSOMO 9 DO BÚFALO DE

RIO (BUBALUS BUBALIS) UTILIZANDO PAINEL DE CÉLULAS SOMÁTICAS

HÍBRIDAS IRRADIADAS

RESUMO - O búfalo de rio (Bubalus bubalis) é uma espécie de interesse

econômico pertencente à família Bovidae, utilizado para a produção de carne e

leite, além de força de trabalho no campo, constituindo-se em um animal de tripla

aptidão. Recentemente, a construção de um painel de células somáticas híbridas

irradiadas (linhagens celulares) contendo fragmentos do genoma do búfalo de rio,

incorporado ao genoma de hamster (BBURH5000), está permitindo, pela primeira

vez, o mapeamento de todos os cromossomos bubalinos. A utilização desse

painel de células associado a análises estatísticas, está gerando mapas

genômicos de alta resolução contendo diferentes tipos de marcadores

moleculares. O presente trabalho teve por objetivo utilizar este painel de células

para gerar grupos de ligação com os marcadores mapeados no cromossomo 9

bubalino e assim comparar a organização dos grupos de ligação obtidos com

aqueles já descritos para o cromossomo 7 bovino. Para tal, foram testados com

DNA bubalino, seqüências de “primers” para PCR de 26 marcadores moleculares

previamente mapeados no cromossomo 7 bovino, o qual foi descrito na literatura

como o homólogo ao cromossomo 9 de búfalo. Do total de marcadores testados,

18 geraram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel

BBURH5000, sendo que destes 18, foi possível a genotipagem final de 10

marcadores. A partir das análises de ligação com os 10 marcadores genotipados,

foi possível distribuir os mesmos em três grupos de ligação no BBU9. A análise

comparativa entre os grupos de ligação do BBU9 e do BTA7 revelou a presença

dos mesmos grupos de ligação nos cromossomos de ambas espécies,

evidenciando conservação de sintenia.

Palavras-Chave: Bubalus bubalis, búfalo de rio, cromossomo 9, genoma,

mapeamento, painel de células somáticas híbridas irradiadas

xiii

CONTRIBUTION FOR THE MAPPING OF CHROMOSOME 9 OF THE RIVER

BUFFALO (BUBALUS BUBALIS) USING RADIATION HYBRID SOMATIC CELL

PANEL

SUMMARY - The river buffalo (Bubalus bubalis), a member of the Bovidae

family, is an economically important livestock specie useful to produce milk and

meat, as well as source of labor, comprising an animal of triple aptness. The recent

construction of a whole-genome 5000-rad radiation hybrid somatic cell panel for

the river buffalo genome (BBURH5000), is allowing for the first time the mapping of

all chromosomes from the specie. The use of BBURH5000 panel associated with

statistical analyses is generating high-resolution RH maps integrating different

types of molecular markers. The goal of this study was to genarate linkage groups

with the markers mapped on the river buffalo chromosome 9 (BBU9), using the

BBURH5000 panel, and then compare these groups with those already described in

BTA7. Previous studies have identified bovine chromosome 7 as homologous to

BBU9. Cattle derived PCR primers from 26 markers, previously mapped in cattle,

were tested with buffalo DNA. A total of 18 of the 26 markers amplified PCR

products suitable for RH mapping. From these 18 markers, it was possible the

genotyping of 10. The analyses of linkage with the 10 markers genotyped turned

possible to distribute them in three linkage groups on the BBU9. The comparative

analyses between the linkage groups of BBU9 and BTA7 revealed the presence of

the same linkage groups on the chromosome of both species, revealing

conservation of synteny between them.

Keywords: Bubalus bubalis, river buffalo, chromosome 9, genome, mapping,

radiation hybrid somatic cell panel

1

I. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

O búfalo doméstico (Bubalus bubalis) é originário da Índia e chegou ao Brasil

entre 1890 e 1895, na Ilha de Marajó, Estado do Pará (FONSECA, 1986; MIRANDA,

1986; TONHATI et al., 1999), vindo em pequenos lotes da Ásia, Europa (Itália) e Caribe.

Sua grande adaptabilidade aos mais variados ambientes, assim como sua elevada

fertilidade e longevidade produtiva (OLIVEIRA, 2005), despertaram o interesse dos

produtores como alternativa para a produção de carne e derivados do leite, permitindo

que o rebanho bubalino brasileiro experimentasse uma evolução significativa.

Segundo estimativas da “Food and Agriculture Organization of the United

Nations” (FAO, 2007), houve aumento do número de bubalinos no mundo de

aproximadamente 98%, passando de 88 milhões em 1961, para 174 milhões de

cabeças em 2005, sendo que 90% do total da população encontra-se na Ásia,

continente predominantemente agrário onde os búfalos, além da produção de leite e

carne, também são muito utilizados como animais de tração, sendo por isso

considerados animais de tripla aptidão.

No Brasil, o crescimento da população bubalina entre 1961 e 2002 foi de,

aproximadamente, 18 vezes o percentual mundial no mesmo período, passando de 63

mil para 1,2 milhão de cabeças (IBGE, 2007), englobando as raças Jafarabadi,

Mediterrâneo e Murrah, sendo que o Estado do Pará possui o maior rebanho brasileiro.

Segundo OLIVEIRA et al. (2005) a população bubalina brasileira está distribuída cerca

de 50% na região Norte, 15% na região Sudeste, 14% no Nordeste, 12% no Centro

Oeste e 9% na região Sul, destacando-se que na região Sudeste a população bubalina

vem aumentando de maneira considerável, com ênfase para a produção leiteira.

Segundo a Federação Internacional de Laticínios (IDF, 2007), a produção

mundial de leite bubalino, em 2002, foi de 70,7 milhões de toneladas, 12,84% da

produção mundial de leite e embora a produção mundial de leite de vacas seja superior

à produção de leite de búfalas (501,5 milhões de toneladas de leite) as estimativas

apontam para o aumento de 48,52% na produção mundial de leite de búfalas no

2

período de 1992 a 2002, bem superior ao aumento verificado na produção de leite de

vaca, de 8,83%, para o mesmo período.

No Brasil, a produção de leite de búfalas é uma atividade que tem crescido nos

últimos anos, particularmente nos estados da região Sudeste, onde já existem vários

laticínios, sendo o leite destinado, quase que na sua totalidade, para a produção de

queijo tipo “muzzarella” (MADELLA-OLIVEIRA et al., 2005). O elevado teor de sólidos

totais, incluindo gordura e proteína (caseína), torna o leite mais calórico e valioso para a

produção de produtos lácteos, tais como queijos, leites fermentados e iogurtes, entre

outros, favorecendo decisivamente o aumento do rendimento na fabricação desses

derivados quando comparado ao rendimento do leite de vaca (NASCIMENTO &

CARVALHO, 1993). Segundo NADER FILHO et al. (1984) e VALE (1999), o rendimento

industrial do leite de búfalas pode chegar, comparativamente, a suplantar o rendimento

do leite bovino em mais de 40%, sendo que produtos como a “muzzarella” podem

atingir no mercado até quatro vezes o valor do similar em bovinos (DAMÉ, 2007).

Pesquisas realizadas demonstraram que os bubalinos apresentam grande

produtividade e capacidade de adaptação às condições brasileiras (JORGE et al., 1997)

e segundo PEREIRA & TAVARES (2007), o ganho de peso de búfalos sob as mesmas

condições de manejo e alimentação, tem revelado superioridade quando comparados a

bovinos, mesmo de raças especializadas. Desta forma, a bubalinocultura passa a ser

uma atividade atraente para produção de carne, tanto em pastagens (MACEDO et al.,

2001), quanto em confinamento (JORGE & FONTES, 2001).

A utilização de técnicas moleculares, que tem permitido o conhecimento de como

determinados genes atuam na determinação de características de interesse econômico,

possibilitará a complementação dos métodos tradicionais de melhoramento, visando

ganhos genéticos adicionais. Para tal, conhecimentos de genética quantitativa e

melhoramento animal deverão ser utilizados no desenvolvimento de estratégias de

melhoramento e seleção, visando incorporar tecnologias moleculares em programas de

melhoramento para obter o máximo de benefício possível da informação gerada pela

genética molecular (LEDUR & SCHMIT, 2000).

3

O mapeamento genômico em animais e plantas, por meio dos cruzamentos

selecionados por marcadores e da manipulação do genoma, representa o primeiro

passo necessário para fazer uso prático das tecnologias baseadas em DNA. Assim,

torna-se aparente que o sucesso do uso de técnicas moleculares visando manipulação

de genes economicamente importantes reside na obtenção de mapas físicos e

genéticos saturados, com uma resolução cada vez mais apurada, descrevendo de

maneira ordenada a constituição genética de espécies animais e vegetais (LEDUR &

SCHMIT, 2000).

Neste contexto, o uso de genes e microssatélites como marcadores moleculares

assume fundamental importância na construção de mapas saturados e conseqüente

estudo de polimorfismos em populações. Os genes, altamente conservados, podem

auxiliar no entendimento da evolução das espécies através de estudos comparativos de

genomas. Já os microssatélites, seqüências de repetição em tandem de dois a cinco

nucleotídeos comuns em genomas de eucariotos, vem sendo muito utilizados para

construção de mapas genômicos devido ao alto grau de polimorfismo e características

de co-dominância na natureza (KAPPES et al, 1997).

Os mapas estruturais do genoma estão divididos em três categorias: o mapa

genético, os mapas físicos (mapa citogenético, mapa de sintenia e mapa RH) e, mais

recentemente, os mapas moleculares. O mapa genético é de grande utilidade, pois

deduz a ordem de marcadores em um mesmo cromossomo e a distância entre eles,

utilizando como critério a freqüência de recombinação meiótica. Estes marcadores, no

entanto, não podem ser designados a cromossomos específicos ou a regiões

específicas em um cromossomo (CHOWDHARY & RAUDSEPP, 2005). Desta forma,

torna-se de fundamental importância o mapeamento físico, onde, utilizando técnicas

envolvendo células somáticas híbridas (SCH) (mapa de sintenia), células somáticas

híbridas irradiadas (mapas RH), hibridização “in situ” (ISH) e hibridização “in situ”

fluorescente (FISH) (mapa citogenético), os marcadores são capazes de mostrar

regiões específicas de cromossomos já conhecidos.

O mapeamento utilizando painel de células somáticas híbridas irradiadas (mapas

RH) provou ser uma poderosa arma na construção de mapas de alta resolução,

4

chegando a ter até dez vezes maior resolução que os mapas genéticos e maior

resolução que os demais mapas criados. A grande vantagem da construção de mapas

RH está na possibilidade de ordenar fisicamente todos os tipos de marcadores,

polimórficos e não polimórficos (genes codificantes), possibilitando o mapeamento de

genes, os quais geralmente se apresentam extremamente conservados durante o

processo evolutivo. Este tipo de mapeamento leva certa vantagem em relação aos

mapas de sintenia (células somáticas híbridas), onde marcadores podem ser indicados

a um determinado cromossomo, porém não ordenados. Leva certa vantagem também

em relação aos mapas genéticos, onde apenas utilizam-se marcadores de DNA que

apresentam polimorfismo, já que a técnica baseia-se na análise de recombinação

meiótica entre marcadores ao longo do cromossomo, dependendo de diferenças

alélicas dentro da população estudada para serem mapeados (CHOWDHARY e

RAUDSEPP, 2005).

A estratégia de mapeamento utilizando painéis de células somáticas híbridas

irradiadas (mapeamanto RH) foi primeiramente descrita por GOSS & HARRIS (1975) e

redescoberta por COX et al. (1990). Atualmente, a cobertura genômica completa foi

alcançada em humanos e a técnica vem sendo estendida ao mapeamento de outras

espécies como camundongo (MCCARTHY et al., 1997), suínos (HAWKEN et al., 1999),

eqüinos (KIGUWA et al., 2000), caninos (PRIAT et al., 1998), felinos (MURPHY et al.,

1999) e bovinos (WOMACK et al., 1997). A partir do projeto de pesquisa iniciado em

2004 no Laboratório de Genômica Comparativa – IBILCE/UNESP, com financiamento

conjunto da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP –

Processo 02/10150-5) e da Fundação Americana “National Science Foundation”

(Processo OISE-0405-743), foi construído, a partir do genoma total do búfalo de rio, um

painel de células somáticas hibridas irradiadas para o mapeamento do genoma

bubalino (AMARAL et al., 2007).

Neste método, uma dose letal de radiação é aplicada nas células do genoma de

interesse, denominadas doadoras, com a função de quebrar, ao acaso, seus

cromossomos em múltiplos fragmentos (COX et al., 1990). Estes fragmentos são

posteriormente incorporados ao genoma de uma célula receptora mutante, geralmente

5

de roedor, através de um processo de fusão celular. Cada clone RH gerado a partir

desta fusão contém uma combinação diferente de fragmentos cromossômicos da célula

doadora incorporado ao genoma da célula receptora, que atinge a estabilidade após

sucessivos processos de divisão celular. Posteriormente, os clones híbridos são

testados quanto à presença ou à ausência de marcadores de DNA do genoma de

interesse. Utilizando métodos estatísticos para a ordenação linear, a distância relativa

entre os diferentes marcadores pode ser determinada.

Apesar de uma população relativamente grande e em crescimento, e levando-se

em consideração que a espécie bubalina já possui importância econômica em muitos

países, o mapeamento do genoma bubalino encontra-se atrasado quando comparado

aos genomas de outras espécies de interesse econômico, possuindo somente 302

marcadores moleculares mapeados (IANUZZI et al., 2003; DI MEO et al., 2006) sendo

que a espécie bovina já possui 17.254 marcadores moleculares mapeados (SNELLING

et al., 2007). Desta maneira, o conhecimento de seu genoma torna-se de fundamental

importância para identificação e manipulação de genes responsáveis por características

de interesse econômico como resistência a parasitos, ganho de peso, produção de

leite, fertilidade, intervalo entre partos (IEP), entre outros, que permitirão o

melhoramento genético desses animais e maior retorno econômico para o setor.

Mundialmente, os búfalos são divididos em duas espécies: o búfalo asiático

(Bubalus bubalis) e o búfalo africano (Syncerus caffer). O búfalo asiático é dividido em

duas subespécies: o búfalo de rio (2n = 50), representada pelas raças Murrah,

Mediterrâneo e Jafarabadi, e o búfalo de pântano (2n = 48), representada pela raça

Carabao ou Rosilho, sendo que os búfalos de rio, são os mais numerosos (IANNUZZI,

1994).

A espécie bubalina, assim como a bovina, pertence a família Bovidae, que é a

mais diversa das nove famílias de Artiodactyla, com 45 gêneros e 124 espécies

(VAUGHAN, 1986). Apesar do número diplóide (2n) de cromossomos dentro dessa

família variar de 30 a 60 cromossomos (OTHMAN, 2004), o número de braços

cromossômicos é relativamente constante, de 56 a 58. BUKLAND & EVANS (1978), em

seus estudos com citogenética, sugeriram que a pequena variação no número de

6

braços cromossômicos é um indicativo de que a evolução cromossômica da família

Bovidae procede de um cariótipo primitivo de 58 cromossomos autossomos

acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (2n = 60). Desta forma, propuseram

que a variabilidade do número diplóide de cromossomos dentro da família Bovidae foi

primeiramente resultado de translocação e posterior fusão cêntrica envolvendo este

cariótipo primitivo inicial, o que indica que dentro dessa família existe uma grande

conservação de material genético.

O cariótipo do búfalo de rio (Bubalus bubalis) (2n = 50) consiste em 5 pares de

cromossomos autossomos submetacêntricos e 19 pares de cromossomos autossomos

acrocêntricos, além de um par de cromossomos sexuais X e Y, enquanto que o bovino

doméstico (Bos taurus) (2n = 60) possui 29 pares de cromossomos autossomos

acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (IANUZZI et al, 2003). Estudos de

citogenética envolvendo cromossomos do búfalo de rio e bovino revelaram um alto grau

de homologia entre bandas, tendo confirmado a hipótese de que os cinco pares de

cromossomos submetacêntricos do búfalo de rio são resultantes de translocações e

posterior fusões cêntricas entre dez pares de cromossomos acrocêntricos do genoma

bovídeo ancestral (EL NAHAS et al., 1997; EL NAHAS et al., 1999; OTHMAN & EL

NAHAS, 1999; DE HONDT et al., 2000).

Assim, considerando o alto grau de homologia de bandas entre os cromossomos

de bovinos e búfalos e levando-se em consideração vários estudos que demonstraram,

através da conservação de genes de um mesmo grupo sintênico, uma extensa

conservação cromossômica entre as duas espécies (IANNUZZI et al., 1990, 1998,

1999, 2001a, 2001b; EL NAHAS et al., 1996; DI MEO et al., 2000; EL NAHAS et al.,

2001; NAVANI et al., 2002), o uso dos mapas físicos e genéticos bovino pode ser

extremamente útil na construção de um mapa genômico comparativo do búfalo de rio,

principalmente levando-se em consideração que o genoma bovino é o mais estudado

entre as espécies de interesse econômico.

A genômica comparativa é um método de análise do genoma que busca ganhar

conhecimentos em uma espécie usando os conhecimentos do genoma de outra

espécie, sendo uma ferramenta poderosa para identificar e estudar os segmentos

7

genômicos conservados entre as espécies. A base do mapeamento comparativo

fundamenta-se no conceito de que os genes ligados em uma espécie mantêm-se

ligados na outra espécie, sendo que a probabilidade da ordem de ligação estar

conservada ou interrompida depende dos rearranjos que ocorreram desde a

divergência evolutiva das espécies que estão sendo estudadas (NADEAU & SANKOFF,

1998). Entre os mamíferos, espera-se que a genômica comparativa auxilie numa maior

compreensão da diversidade fisiológica, fenotípica e metabólica, tanto em níveis

moleculares quanto sistêmicos (LARKIN et al., 2003). Dessa forma, genomas

seqüenciados de mamíferos representam padrões de referência que permitirão o uso

da genômica comparativa como ferramenta para compreender as bases moleculares da

diversidade fenotípica dentro desta classe de vertebrados (O’BRIEN et al., 2001).

O cromossomo 9 do búfalo de rio (BBU9) é acrocêntrico e possui apenas cinco

genes (IL3, EEF2, RASA1, CAST e LDLR) e dois marcadores do tipo microssatélite

(D7S3 e RM006) mapeados por meio da técnica de hibridização “in situ” fluorescente

(FISH) (IANNUZZI et al., 2003). Estes mesmos marcadores já foram mapeados no

cromossomo 7 bovino (BTA7) (BOVMAP, 2007), evidenciando conservação

cromossômica entre as duas espécies (EL NAHAS et al., 2001).

O cromossomo 7 bovino, por sua vez, apresenta 67 genes e 14 marcadores do

tipo microssatélite mapeados pela técnica de células somáticas híbridas irradiadas

(mapa RH) (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004). Neste cromossomo, equivalente ao

cromossomo 9 bubalino (BBU9), são encontrados diversos genes relacionados com o

funcionamento do sistema imune que ainda não foram mapeados em búfalo como o

IL4, IL12B, CD14, CD74, IRF1 e AZU1 (BOVMAP, 2007). Além disso, também já foram

identificados no BTA7, alguns “loci” de características quantitativas (QTL) relacionados

com taxa de ovulação (KIRKPATRICK et al., 2000), taxa de nascimento de gêmeos

(LIEN et al., 2000), contagem de células somáticas e incidência de distocias (KUHN et

al., 2003).

Dentre os genes de interesse mapeados no BTA7, encontram-se aqueles

codificantes das interleucinas, que são proteínas secretadas pelas células da imunidade

inata e adaptativa, mais especificamente pelos leucócitos, atuando principalmente em

8

outros leucócitos, tendo inúmeras funções dentro do sistema imune (ABBAS &

LICHTMAN, 2005). O gene IL3, indicado por FISH na região 9q15 do cromossomo 9

bubalino (IANNUZZI et al., 2003), codifica a proteína interleucina 3, responsável por

atividades como o estimulo do crescimento e maturação de eosinófilos, neutrófilos e

monócitos, a diferenciação e a ativação mastocítica e basofílica e a ativação de

eosinófilos (TIZARD, 1998). Em suínos, ANDREW e colaboradores (2006) descobriram

que a interleucina 3 pode ser utilizada de maneira eficiente como adjuvante em vacinas

contra a Peste Suína Clássica. Já o gene IL4, que codifica a proteína interleucina 4, é

responsável por estimular a produção de anticorpos IgE (reações alérgicas) e participar

do desenvolvimento de células TH2 a partir de células T auxiliares CD4+ naive. O gene

IL12B, também localizado no cromossomo 7 bovino, codifica a interleucina 12B. Esse

gene encontra-se ativo, principalmente, em macrófagos e células dendríticas, que

produzem e liberam essas proteínas, responsáveis indiretamente pelo combate a

microorganismos intracelulares (ABBAS & LICHTMAN, 2005).

O gene IRFl também tem importante função no sistema imune e codifica o fator

regulatório de interferon, responsável pela ativação do interferon tipo I e outros

interferons produzidos (FUJITA et al., 1989), além de possuir atividades

antioncogênicas (HARADA et al., 1993). Em humanos, este gene está localizado na

região 5q3 1.1, sendo que, recentemente, foi provado que a sua deleção, devido a

anomalias envolvendo a deleção do braço longo do cromossomo 5 humano, pode ser

um dos principais fatores responsáveis pelo desenvolvimento dos quadros de leucemia

mielóide aguda (AML) e das síndromes mielodisplásicas (MDS) (WILLMAN, 1993).

Outros genes importantes também são encontrados no BTA7, como o gene

RASA1, responsável por codificar a proteína ativadora de GTPase, participante do

processo de transdução de sinais iniciada por hormônios (VOET et al., 2002) e o gene

COMP, responsável por codificar uma proteína que atua no desenvolvimento de tecido

músculo-esquelético, incluindo condrócitos, osteoblastos e células formadoras de

tendões e ligamentos (LIU, 2005). Segundo SONG et al. (2003), mutações neste gene

em humanos são responsáveis por dois tipos de displasia do tecido ósseo, a

pseudoacondroplasia (PSACH) e a displasia múltipla de epífise (MED).

9

Assim, levando-se em conta a riqueza de informações encontradas no

cromossomo 7 bovino, o mapeamento comparativo paralelo com o cromossomo 9

bubalino permitirá um maior conhecimento dos genes presentes neste cromossomo,

auxiliando na compreensão da evolução e da fisiologia desta espécie, trazendo

informações importantes para futura manipulação de genes envolvidos em

características economicamente importantes, sendo possível, inclusive, a utilização das

informações geradas em programas de melhoramento genético desta espécie, já que

os marcadores moleculares aumentam a acurácia da estima de ganho genético para

um determinado indivíduo.

10

II. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivos:

1. Avaliar o aproveitamento de pares de “primers” para PCR de marcadores já

mapeados no BTA7 para o mapeamento do BBU9;

2. Gerar grupos de ligação com os marcadores mapeados no cromossomo 9

bubalino;

3. Comparar a organização dos grupos de ligação obtidos para o cromossomo 9

bubalino com aqueles descritos para o cromossomo 7 bovino.

11

III. MATERIAL E MÉTODOS

1. Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino

Para mapeamento de genes codificantes e microssatélites no cromossomo 9 do

búfalo de rio foram utilizados “primers” para PCR descritos na literatura e previamente

utilizados no mapeamento do cromossomo 7 bovino (BTA7). Dentre os genes

selecionados, dois (IL3 e RASA1) foram previamente indicados como pertencentes ao

cromossomo 9 bubalino por meio da técnica de hibridização “in situ” fluorescente (FISH)

(IANNUZZI et al., 2003).

Para a seleção dos marcadores foram utilizadas informações de mapas do

cromossomo 7 bovino, disponíveis nos bancos de dados públicos NCBI e BOVMAP

(NCBI, 2007). Dentre os mapas consultados no banco de dados americano NCBI –

“Map Viewer” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/), constam o mapa de ligação

gerado pelo “United States Department of Agriculture” (USDA) – “Meat Animal Research

Center” - USA (MARC) (USDA – ARS, 2007)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genomeprj&cmd=ShowDetailView&TermT

oSearch=17371), que apresenta a ordem linear e a posição dos marcadores, na sua

maioria microssatélites, e o mapa RH produzido em conjunto pela “University of Illinois”

e pela “Texas A&M University” (ILTX), que contém informações da terceira geração de

mapas RH do genoma bovino publicado por EVERTS-VAN DER WIND e colaboradores

(2005), incluindo 3484 marcadores, entre eles genes, etiquetas de seqüências

expressas (ESTs) e microssatélites. Foi utilizado também o banco de dados europeu

BOVMAP (http://dga.jouy.inra.fr/cgi-bin/lgbc/main.pl?BASE).

12

2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino

Com a intenção de selecionar os marcadores adequados para genotipagem com

as linhagens do painel BBURH5000, foram realizadas reações de PCR com gradiente de

temperatura de anelamento visando à obtenção de um produto de PCR único com DNA

bubalino, podendo este ser búfalo específico ou diferenciado do produto de PCR com

DNA de hamster. Para realização desses experimentos, utilizou-se um termociclador do

tipo gradiente PTC-200™ (M.J.Research), com bloco para 96 amostras distribuídas em

12 colunas e 8 linhas. Em cada coluna, o termociclador programa uma temperatura de

anelamento pré-determinada. As temperaturas utilizadas nas 12 colunas foram,

respectivamente: 50ºC; 50,4ºC; 51,2ºC; 52,5ºC; 54,2ºC; 56,4ºC; 58,9ºC; 61ºC; 62,7ºC;

63,9ºC; 64,7ºC e 65 ºC.

Nos experimentos com gradiente de temperatura de anelamento, cada marcador

foi testado com:

- DNA bovino, em temperaturas variando de 50ºC a 65ºC, para verificar a

qualidade do “primer” a ser utilizado uma vez que estes foram inicialmente desenhados

para o mapeamento do genoma bovino (controle positivo).

- DNA de hamster, provenientes dos fibroblastos utilizados na formação do painel

BBURH5000, em temperaturas variando de 50ºC a 65ºC, para verificar se as

amplificações geradas poderiam interferir nas amplificações geradas pelo DNA

bubalino.

- DNA bubalino, provenientes dos fibroblastos utilizados na formação do painel

BBURH5000, em temperaturas variando de 50ºC a 65ºC, para verificar a presença de

amplificação e assim escolher a temperatura ideal de anelamento, levando em conta as

amplificações geradas em hamster.

- Além disso, utilizou-se o controle negativo, ou seja, reação de PCR sem a

adição de DNA.

13

As reações de PCR foram feitas em um volume total de 10µl, utilizando 2µl de

DNA (25 ng/µl), 0,2 mM de “primer” sense, 0,2 mM de “primer” antisense, 100 mM de

dNTP, 10mM Tris pH 9, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2 e 0,5 unidade de Taq DNA

polimerase (AmpliTaq Gold™, Promega e Easy). Os ciclos para a amplificação da

reação de PCR foram os seguintes: desnaturação inicial de 2 minutos a 94ºC, seguida

de 35 ciclos com desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento variando de 50-

65ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos. A extensão final foi de 72ºC

por seis minutos.

Os produtos de PCR (bovino, hamster e bubalino) foram submetidos a corrida

em gel de agarose a 2% (100 mL de tampão TBE 1X – formado por tris, ácido bórico e

EDTA - para 2 gramas de agarose comum), corado com brometo de etídeo (2µl em

cada 100 mL de gel). A corrida foi realizada em cuba média, durante 30 minutos,

utilizando voltagem de 250 V e amperagem de 100 A. Os géis foram visualizados em

transiluminador e posteriormente fotodocumentados com câmera digital DC290

KODAK™ e analisados com o programa EDAS (próprio da câmera digital DC290

KODAK™).

3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000

O painel utilizado na genotipagem dos marcadores, denominado BBURH5000,

contém 90 linhagens de células somáticas híbridas irradiadas, geradas a partir da fusão

entre fibroblasto de búfalo e de hamster. A fragmentação dos cromossomos do genoma

bubalino foi obtida submetendo-se as células a um total de 5000 “rads” de irradiação X

(AMARAL et al., 2007).

Os pares de “primers” selecionados a partir dos experimentos de PCR com

gradiente de temperatura de anelamento, foram utilizados na genotipagem dos

respectivos marcadores nas 90 linhagens híbridas búfalo/hamster do painel BBURH5000.

Cada marcador foi genotipado duas vezes com todas as linhagens híbridas, incluindo

DNA parental de búfalo e de hamster e um controle negativo, para evitar a ocorrência

14

de resultados falso positivos ou falso negativos. Nos casos em que as linhagens

apresentaram produtos de PCR duvidosos, estas foram testadas uma terceira vez.

O padrão de presença e ausência dos produtos de PCR de cada marcador nas

linhagens híbridas foi registrado em uma tabela do tipo “Excel”, a qual foi analisada

estatisticamente pelo pacote estatístico rh_tsp_map (AGARWALA et al. 2000)

(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/agarwala/rhmapping/rh_tsp_map.tar) e CONCORDE

(APPLEGATE et al. 1998) (http://www.isye.gatech.edu/~wcook/rh/) ligado a Qsopt

(website http:// www.isye.gatech.edu/~wcook/qsopt), seguindo procedimentos já

utilizados na construção dos mapas de outros cromossomos da espécie bubalina, como

demonstrado nos trabalhos de AMARAL et al. (2007), MIZIARA et al. (2007) e

STAFUZZA et al. (2007). O software “rh_tsp_map” e “CONCORDE” foram originalmente

desenvolvidos para a construção de mapas RH do genoma humano, sendo atualmente

também aplicados na construção de mapas dos genomas de equinos, ovinos, felinos,

caninos, etc., além do genoma bubalino ( SCHAFFER et al., 2007).

A análise estatística foi realizada pelos pesquisadores Doutor Alejandro Schaffer

e Doutora Richa Agarwala, do “National Institutes of Health” (NIH) dos Estados Unidos,

os quais são colaboradores do Programa Internacional do Mapeamento do Genoma

Bubalino.

A análise dos dados de RH para a ordenação dos “loci” foi realizada pela função

de máxima verossimilhança (MLE – Maximum likelihood) como descrita por MENOTTI-

RAYMOND et al. (2003), para a construção de um mapa consenso, onde os

marcadores foram escolhidos de forma que sua ordem ótima fosse a mesma para as

três variantes do critério “MLE” que diferem no tratamento dos valores computados

como 2 (incerteza) nos dados de cada marcador, resultando na distribuição dos

marcadores em grupos de ligação.

15

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

1.Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino

Foram selecionados do banco de dados NCBI (mapas do genoma bovino MARC

e ILTX) e do banco de dados BOVMAP, pares de “primers” para PCR de 26 marcadores

derivados do BTA7. Destes, 22 (ACP5, AZU1, CACH1, CCNH, CD14, COMP, CRTL1,

DNM2, F12, GABRA1, GNPI, GUK1, ICAM3, IL3, IL4, IL12B, INSL3, IRF1, MBD3,

MEF2C, RASA1, VDAC1) são genes e 04 (BM1557, BMS1331, BMS2258, RM006) são

microssatélites. Dentre os marcadores selecionados, 02 genes (IL3 e RASA1) e 01

microssatélites (RM006) haviam sido previamente indicados ao BBU9 por meio da

técnica de FISH (IANNUZZI et al., 2003).

2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino

Dos 26 pares de “primers” para PCR testados nos experimentos com gradiente

de temperatura de anelamento, 18 apresentaram produtos de PCR búfalo-específico,

mostrando-se adequados para serem genotipados com o DNA das linhagens híbridas

do painel BBURH5000, sendo 16 genes: ACP5, CCNH, COMP, CRTL1, GNPI, GUK1,

ICAM3, IL3, IL4, IL12B, INSL3, IRF1, MBD3, MEF2C, RASA1, VDAC1 e 02

microssatélites: BM1557 e BMS2258.

Está ilustrado na Figura 1 o resultado da amplificação obtida com o par de

“primers” correspondente ao gene CRTL1, a partir da reação de PCR com gradiente de

temperatura de anelamento. Observa-se que em temperaturas próximas a 64ºC é

possível obter um produto de PCR único e específico com DNA de búfalo e ausência de

produto de PCR com o DNA de hamster. Assim, este e os demais 17 pares de “primers”

16

para PCR que apresentaram produtos únicos de PCR búfalo-específico foram

selecionados para posterior genotipagem do marcador com as linhagens do painel

BBURH5000.

Figura 1. Gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo, mostrando uma reação de PCR com gradiente de temperatura de anelamento com o marcador CRTL1. Parte A: DNA bovino utilizado como controle positivo. Parte B: DNA de hamster. Parte C: DNA bubalino. 1: marcador de peso molecular 100 bp. A.2-A.7 e B.2-B.7: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 52,5ºC; 56,4ºC; 61ºC; 63,9ºC e 65ºC, respectivamente. C.2-C.11: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 51,2ºC, 52,5º C; 54,2ºC; 56,4ºC; 58,9ºC; 61ºC; 62,7ºC, 63,9ºC e 64,7ºC, respectivamente. b: controle negativo da reação de PCR. Nota-se que o primer gera produto de PCR com DNA bubalino entre as temperaturas de 50,4ºC a 64,7ºC. Selecionou-se a temperatura de 64ºC (interior do quadrado), como a temperatura ideal para os experimentos de PCR com este marcador.

A temperatura de anelamento elevada aumenta a especificidade dos primers,

exigindo um alto grau de homologia com o DNA de interesse (AUDY et al., 1996). Desta

forma, ressalta-se a importância da realização das reações de PCR com gradiente de

C

b

1 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

17

temperatura de anelamento, uma vez que os “primers” utilizados em búfalo foram

desenhados a partir de sequências do genoma bovino.

A partir dos experimentos de PCR com gradiente de temperatura foram excluídos

oito marcadores do conjunto, sendo seis genes (AZU1, CACH1, CD14, DNM2, F12 e

GABRA1) e dois microssatélites (BMS1331 e RM006). Destes, três não geraram

produto de amplificação com o DNA bubalino e bovino (AZU1, CACH1 e CD14), um

apresentou amplificação fraca do DNA bubalino e bovino (BMS1331) e quatro

apresentaram amplificações inespecíficas com o DNA bubalino e bovino (DNM2, F12,

GABRA1 e RM006). Desta forma, embora tenham sido excluídos estes oito

marcadores, não pode ser descartada a possibilidade da presença da seqüência

homóloga em búfalo, uma vez que os “primers” utilizados, específicos para a espécie

bovina, não amplificaram produtos de PCR ou amplificaram produtos de PCR

inespecíficos para a própria espécie bovina.

Está ilustrado na Figura 2 o resultado da amplificação obtida com o par de

“primers” correspondente ao marcador RM006. Os produtos obtidos em búfalo e bovino

são inespecíficos. Assim, esse marcador também foi excluído dos experimentos de

genotipagem com as linhagens do painel BBURH5000.

18

Figura 2. Gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo, mostrando a reação de PCR com gradiente de temperatura de anelamento com o marcador RM006. Parte A: DNA bovino utilizado como controle positivo. Parte B: DNA de hamster. Parte C: DNA bubalino. 1: marcador de peso molecular 100 bp. A.2-A.7 e B.2-B.7: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 52,5ºC; 56,4ºC; 61ºC; 63,9ºC e 65ºC, respectivamente. C.2-C.11: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 51,2ºC, 52,5º C; 54,2ºC; 56,4ºC; 58,9ºC; 61ºC; 62,7ºC, 63,9ºC e 64,7ºC, respectivamente. b: controle negativo da reação de PCR.

3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000

Depois de verificado o padrão de amplificação dos 18 pares de “primers” para

PCR que geraram produtos adequados ao mapeamento RH, estes foram submetidos

aos experimentos de PCR com o DNA das linhagens do painel BBURH5000, para

determinar o padrão de presença ou ausência dos produtos de PCR nas diferentes

linhagens.

As Figuras 3, 4, 5 e 6 ilustram géis de agarose de reações de PCR com o par de

“primers” do gene COMP com todas as linhagens do painel BBURH5000. A partir dos

1 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

A B

C

b

19

resultados obtidos, podemos observar a presença de produto de PCR em 29 das 90

linhagens (8, 22, 33, 44, 47, 62, 66, 76, 80, 82, 87, 90, 92, 95, 97, 110, 112, 114, 117,

122, 126, 131, 132, 137, 141, 150, 151,162 e 163), sendo a linhagem 38 considerada

como duvidosa.

Figura 3. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando o padrão de

amplificação do marcador COMP em parte das linhagens híbridas do painel

BBURH5000. M: marcador de peso molecular 100 bp. B: DNA bubalino. R:

DNA de hamster. 02 a 51: DNA das linhagens híbridas búfalo/hamster do

painel BBURH5000. b: controle negativo da reação de PCR. Observa-se a

presença de produtos de PCR nas linhagens 8, 22, 33, 44 e 47, bem como no

DNA bubalino parental.

M B R 2 5 8 9 15 17 21 22 23 24 25 26 27

M 30 31 33 38 39 44 47 48 51 B R b

20

Figuras 4. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando duas

repetições do padrão de amplificação do marcador COMP em parte das

linhagens híbridas do painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular

100 bp. B: DNA bubalino. R: DNA de roedor. 53 a 93: DNA das linhagens

híbridas búfalo/roedor do painel BBURH5000. b: controle negativo da

reação de PCR. Observa-se que houve produtos de amplificação nas

linhagens 62, 66, 76, 80, 82, 87, 90 e 92, bem como no DNA bubalino

parental.

M 53 55 62 63 66 67 70 71 72 75 76 78 79 80 81 82

M 85 86 87 89 90 91 92 93 B B R R b

21

Figuras 5. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando duas

repetições do padrão de amplificação do marcador COMP em parte das

linhagens híbridas do painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular

100 bp. B: DNA bubalino. R: DNA de roedor. 94 a 131: DNA das linhagens

híbridas búfalo/roedor do painel BBURH5000. b: controle negativo da

reação de PCR. Observa-se que houve produtos de amplificação nas

linhagens 95, 97, 110, 112, 114, 117, 122, 126, 131, bem como no DNA

bubalino parental. OBS: As linhagens 127 e 131, que estão em negrito no

segundo gel, fazem parte da primeira genotipagem

M 94 95 97 98 100 102 103 104 105 106 110 111 112 113 114 116

M 117 120 121 122 123 126 127 131 127 131 B B R R b

22

Figuras 6. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando duas repetições do

padrão de amplificação do marcador COMP em parte das linhagens híbridas do

painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular 100 bp. B: DNA bubalino. R: DNA

de roedor. 02 a 51: DNA das linhagens híbridas búfalo/roedor do painel BBURH5000.

b: controle negativo da reação de PCR. Observa-se que houve produtos de

amplificação nas linhagens 132, 137, 141, 150, 151,162 e 163 bem como no

DNA bubalino parental.

Dos 18 pares de “primers” submetidos aos experimentos de PCR com as

linhagens do painel BBURH5000, oito deles (ACP5, BM1557, BMS2258, GNPI, IL3,

INSL3, MBD3, VDAC1), embora tenham apresentado amplificações diferenciadas entre

búfalo e hamster durante os experimentos de gradiente de temperatura de anelamento,

não amplificaram ou tiveram amplificações inespecíficas no painel RH. Por esse motivo,

após várias tentativas, foram também excluídos, restando dez marcadores com

resultados adequados.

M 132 133 134 137 138 139 141 143 144 145 146 147 148 150 151 153

M 158 159 162 163 B B R R b

23

A Tabela 1 apresenta informações dos dez marcadores genotipados no painel

RH, incluindo a seqüência dos “primers” utilizados, temperatura de anelamento e a

freqüência de retenção dos marcadores nas diferentes linhagens do painel.

O valor da freqüência de retenção foi obtido a partir do cálculo da porcentagem

de linhagens do painel classificadas como positivas para o respectivo marcador em

relação ao número total de linhagens, o qual apresentou uma variação de 10%, para o

gene CRTL1, a 32% para o gene COMP.

O padrão de presença e ausência dos produtos de PCR nas linhagens híbridas

dos dez genes selecionados foram registrados em tabela do tipo “Excel”, como

exemplificado na Tabela 2, e foram analisados pelos colaboradores do NIH-USA, como

descrito nos trabalhos de AMARAL et al. (2007), MIZIARA et al. (2007) e STAFUZZA et

al. (2007).

As análises estatísticas distribuíram os dez marcadores em três grupos de

ligação utilizando LOD score 7. Seis marcadores foram agrupados em dois grupos de

ligação contendo 3 marcadores (CCNH/MEF2C/RASA1 e ICAM3/IRF1/IL4). O

marcador COMP mostrou-se ligado com o gene RFXANK, formando um grupo de

ligação com dois marcadores. O gene RFXANK não foi analisado neste trabalho, mas

consta do banco de dados de marcadores mapeados do genoma bubalino.

Três marcadores (CRTL1, GUK1 e IL12B), não apresentaram ligação com os

outros marcadores analisado. Este fato, associado à distribuição dos demais 7

marcadores em grupos de ligação pequenos, indicam que a genotipagem de um maior

número de marcadores será necessária para determinar corretamente a ordem e a

distância dos marcadores dos respectivos grupos de ligação.

No entanto, a partir dos grupos de ligação gerados para o cromossomo 9

bubalino, foi possível realizar comparações importantes com o cromossomo 7 bovino.

Para comparação, foi utilizado o mapa de seqüência do BTA7 (NCBI – Bos taurus Build

3.1, disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9913&chr=28),

que possui tamanho de 101Mb, sendo que os genes estudados encontram-se alinhados

na seguinte ordem: RFXANK, GUK1, COMP, ICAM3, IL4, IRF1, IL12B, CRTL1, RASA1,

CCNH e MEF2C (Figura 4). Foi utilizado também o mapa RH do BTA7 (EVERTS-VAN

24

DER WIND et al., 2004), com o intuito de analisar a quais grupos de ligação cada gene

estudado pertence no BTA7.

Os genes RASA1, CCNH e MEF2C, determinados neste trabalho como

pertencentes ao mesmo grupo de ligação em bubalinos, estão também ligados no BTA7

(grupo de ligação 3) (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004), encontrando-se nas

seguintes posições: RASA1 (78,791 Mb), CCNH (78,794 Mb) e MEF2C (80,03 Mb).

Além disso, o gene CRTL1, que no BBU9 não foi ligado a nenhum outro dos genes

analisados, pertence também ao mesmo grupo de ligação que os genes RASA1, CCNH

e MEF2C no BTA7, e está localizado logo acima do gene RASA1 (78,791 Mb), na

posição 78,21 Mb, sendo que juntos, ocupam um espaço de 1,82 Mb (menos que 2%

da região total do cromossomo) (Figura 4). Segundo NADEAU & SANKOFF (1998),

genes presentes em segmentos genômicos conservados apresentam uma tendência a

se manterem ligados no genoma de espécies relacionadas, porém a ordem desses

genes no segmento podem se apresentar alterada. Desta maneira, é necessário a

genotipagem de um maior número de genes nesta região para indicar a posição deste

gene no BBU9.

Os genes ICAM3, IL4 e IRF1, também determinados neste trabalho como

pertencentes ao mesmo grupo de ligação em bubalinos, estão também ligados no BTA7

(grupo de ligação 1) (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004), nas seguintes posições:

ICAM3 (10,76 Mb), IL4 (19,62 Mb) e IRF1 (19,76 Mb); Assim, estão numa região de 9

Mb (Figira 4). É interessante observar que, no BTA7, esses genes ICAM3, IL4 e IRF1

estão distantes 58,45 Mb dos genes RASA1, CCNH e MEF2C e desta maneira, assim

como em bubalinos , estão em grupos de ligação diferentes no BTA7 (NCBI – Bos

taurus Build 3.1; EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004).

Os genes RFXANK, GUK (3,072 Mb) e COMP (4,39 Mb), no BTA7, estão

próximos,ocupando juntos um espaço de 4,39 Mb (Figura 4), e pertencem ao mesmo

grupo de ligação que os genes ICAM3, IL4 e IRF1 (grupo de ligação 1) (EVERTS-VAN

DER WIND et al., 2004), sendo a distância entre o gene COMP e o gene ICAM3 de 6,4

Mb (Figura 4). Neste trabalho, foi possível observar que o marcador COMP mostrou-se

25

ligado com o gene RFXANK, enquanto o gene GUK1 não apresentou-se ligado a

nenhum outro marcador do conjunto.

Além dos genes CRTL1 e GUK1, o gene IL12B também não apresentou ligação

com nenhum outro marcador analisado neste trabalho. No BTA7, este gene encontra-se

na posição 65,1 Mb, distante 13,11 Mb do gene CRTL1 e 45,34 Mb do gene IRF1

(Figura 4), fazendo parte do grupo de ligação 2 (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004).

Assim, a posição deste gene no cromossomo bovino em relação a posição dos outros

genes analisados, pode explicar, em bubalinos, porque este gene não foi ligado a

nenhum outro gene, sendo necessário a inclusão de um número maior de marcadores

nesta região cromossômica para que se possa definir a sua verdadeira posição.

A partir dos resultados obtidos e da comparação dos grupos de ligação

encontrados no BBU9 com o BTA7, podemos observar que, além dos 7 marcadores já

mapeados por FISH no BBU9 (IL3, EEF2, RASA1, CAST, LDLR, D7S3 e RM006)

(IANNUZZI et al., 2003), pela primeira vez obteve-se produto de PCR com DNA

bubalino para outros 9 genes (CCNH, COMP, CRTL1, GUK1, ICAM3, IL4, IL12B, IRF1

e MEF2C), totalizando 16 genes que podem ser comparados entre o BBU9 e o BTA7.

Esses dados reforçam a teoria já demonstrada por vários autores (IANNUZZI et

al., 1990; EL NAHAS et al., 1996; IANNUZZI, 1998; IANNUZZI et al., 1999; DI MEO et

al., 2000; EL NAHAS et al., 2001; IANNUZZI et al., 2001 a; IANNUZZI el al., 2001 b;

NAVANI et al., 2002) de que, dentro da Família Bovidae, ocorre uma conservação de

braços cromossômicos, onde o número diplóide de cromossomos variam, porém grupos

de genes apresentam-se conservados dentro dos braços cromossômicos (conservação

de sintenia).

Dessa forma, a genotipagem de um maior número de genes em cromossomos

bubalinos, obtendo mapas cada vez mais saturados, juntamente com o uso da

genômica comparativa, serão passos fundamentais na compreensão da evolução do

genoma dessa espécie bem como para o entendimento da dinâmica dos genes dentro

de cada cromossomo, facilitando o estudo das funções e interações dos mesmos e a

manipulação daqueles de interesse econômico para estudos adicionais.

26Tabela 1. Marcadores derivados do BTA7, genotipados no painel BBURH5000, incluindo seqüência e referência

dos primers, temperatura de anelamento (TA) selecionada e freqüência de retenção (FR).

Símbolo do

MarcadorTipo

FR

(%)Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’)

TA

(ºC)Referência

CCNH Gene 24 AAGCTTTCCAGTACCTCTCTC CAGGCTTTGGTCTTCAGTAA 60Everts van-der Wind et al.

(2004)

COMP Gene 32 AGAACATCATCTGGGCCAACCT CCGCCACACAGACACACTTTAT 64Everts van-der Wind et al.

(2004)

CRTL1 Gene 10 GGCTACATCATCCCAGTGAAGT CAACCTCTCAGAGCCTCAGTTT 64Everts van-der Wind et al.

(2004)

GUK1 Gene 17 ATAAAGAAGGCCCAAGGCACTG AAGAGACAAGGTCCTCCAAGCA 60Everts van-der Wind et al.

(2004)

ICAM3 Gene 22 CATGACATTTACCACCTGACG TTGAAGATAGGTACAGCCAAGC 50Everts van-der Wind et al.

(2004)

IL4 Gene 17 GTGCTGGACATCTGCAAGTG ACATTCAGGTCTGTGATCCATG 57 Kappes et al. (1997)

IL12B Gene 14,44 CCAAATGCCAGGACCTCACAGT GGCTGCCACTCTTTCCTCTGTCT 64 NCBI-ePCR

IRF1 Gene 20 GGGTCACACAGGTAGTCATCAT ATGTGCTAGGACCCATACAGAG 65Everts van-der Wind et al.

(2004)

MEF2C Gene 21 AGAGCTGGACACAGTTTGACCT CCTGCTAGAGCAAAGACTCAGA 65Everts van-der Wind et al.

(2004)

RASA1 Gene 16 CAGTGTTCTGCATGGATTCAGC GAGCAGTTCCCAGCAGAATCTT 65Everts van-der Wind et al.

(2004)

27Tabela 2. Padrão de presença e ausência obtido para os 10 genes analisados, em parte das linhagens do painel

BBURH5000 .

0: Ausência do produto de PCR na linhagem do painel BBURH5000

1: Presença do produto de PCR na linhagem do painel BBURH5000

2: Não definido (dúvida)

2 5 8 9 15 17 21 22 23 24 25 26 27 30 31 33 38

CCNH 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1

COMP 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0

CRTL1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

GUK1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

ICAM3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

IL12B 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

IL4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

IRF1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

MEF2C 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2

RASA1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

28

Figura 7. Representação esquemática do mapa de seqüência do BTA7 (NCBI –

Bos taurus Build 3.1), com tamanho de 101 Mb, destacando a posição

dos marcadores no BTA7 que foram genotipados no BBU9.

00 MMbb FFRRXXAANNKK

GGUUKK11

CCOOMMPP

IICCAAMM33IILL44

IIRRFF11

IILL1122BB

MMEEFF22CC

CCRRTTLL11

RRAASSAA11

CCCCNNHH

110011 MMbb

1100

2200

3300

4400

5500

6600

7700

8800

9900

44,,3399 MMbb

99,,0000 MMbb

11,,8822 MMbb

66,,3377 MMbb

4455,,3344 MMbb

1133,,1111 MMbb

5588,,4455 MMbb

29

V. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que:

1. Marcadores derivados do cromossomo 7 bovino, incluindo genes e

microssatelites, podem ser utilizados no mapeamento do cromossomo 9

bubalino, já que pela primeira vez obteve-se produto de PCR com DNA bubalino

para os genes: CCNH, COMP, CRTL1, GUK1, ICAM3, IL4, IL12B, IRF1 e

MEF2C;

2. As analises de ligação com os 10 marcadores genotipados no painel BBURH5000

distribuiu os mesmos em dois grupos de ligação contendo 3 marcadores

(CCNH/MEF2C/RASA1 e ICAM3/IRF1/IL4) e um grupo de ligação com 2

marcadores (RFXANK/COMP);

3. A análise comparativa entre os grupos de ligação do BBU9 e do BTA7 revelou a

presença dos mesmos grupos de ligação nos cromossomos de ambas espécies,

indicando conservação de sintenia entre os mesmos.

30

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