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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA DIÊGO RODRIGO SANTOS RAMOS RIOS DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE DIRETAMENTE DE FLUIDOS CORPÓREOS Salvador – Bahia 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
DIÊGO RODRIGO SANTOS RAMOS RIOS
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE DIRETAMENTE DE
FLUIDOS CORPÓREOS
Salvador – Bahia
2014
DIÊGO RODRIGO SANTOS RAMOS RIOS
Detecção e Caracterização molecular de Streptococcus
pneumoniae diretamente de fluidos corpóreos.
Dissertação apresentada ao Colegiado do Curso de Pós – Graduação em Farmácia, da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como pré – requisito obrigatório para a obtenção do grau de Mestre em Farmácia.
Orientador: Profª Drª Joice Neves Reis Pedreira
Salvador – Bahia
2014
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Rios, Diêgo Rodrigo Santos Ramos.
Detecção e caracterização molecular de Streptococcus pneumoniae diretamente de fluidos corpóreos / Diêgo Rodrigo Santos Ramos Rios. - 2014. 70 f.: il. Inclui anexos. Orientadora: Profª. Drª. Joice Neves Reis Pedreira. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador, 2012.
1. Stroptococcus pneumoniae. 2. Bactéria. 3. Diagnóstico molecular. 4. Vírus. 5. Vacinas. I. Pedreira, Joice Neves Reis. II. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Farmácia. III. Título.
CDD - 616.01 CDU - 616
Aos meus pais, por todo incentivo e
carinho sempre.
E aos meus grandes amigos, por todo o
apoio dado naqueles momentos em que pensei
desacreditar no meu potencial.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, Grande Arquiteto do Universo, que a tudo criou e deu sentido com as suas
mais variadas leis de necessidade e amor, permitindo que tudo resultasse neste trabalho.
Também ao meu anjo da guarda, meus guias e mentores espirituais.
Aos meus pais, Ana Cristina e Evandro Rios, por todo o amor e sacrifício. Todo carinho e
atenção. Todo suporte, direto ou indireto. Pela educação, pelo bom gosto, pelos princípios.
A minha orientadora, Professora Dra. Joice Neves, por ter sido uma das pessoas a me
apresentar o maravilhoso mundo da microbiologia e bacteriologia, bem como pela
oportunidade de ingressar e integrar uma equipe de pesquisa, unida e excelente. Pelo exemplo
em pesquisa e pensamento científico, sempre com clareza e objetividade, corrigindo a minha
insistência em romancear o que deve ser objetivo.
A Dr. Mitermayer Reis e o Laboratório de Patologia e Biologia Molecular (FIOCRUZ),
pela possibilidade de realização de todos os meus experimentos, da concepção à análise, e
todo o suporte em dias úteis, fins de semana e feriados, e também pelos momentos de lazer e
integração entre colegas e suas diferentes equipes.
A equipe do laboratório de bacteriologia do Hospital Couto Maia: Bioquímicos Dra.
Neide Oliveira e Dr. Marcelo Telles, pelos ensinamentos que nenhum livro me daria de forma
tão didática e perfeita, e com quem tive o prazer de conviver e aprender desde o meu estágio
extracurricular, em especial a Dr. Marcelo Telles, pelo aprendizado de todo dia, pela
oportunidade de me sentir bioquímico responsável de tão importante setor de um tão distinto
hospital, e pela sua confiança em meu trabalho. Também ao coordenador do laboratório, Dr.
Ronaldo, grande amigo. Obrigado pela sua confiança em meu trabalho, e também pelo
carinho desde a minha recepção à minha despedida. Ao corpo técnico desde laboratório
maravilhoso, meus agradecimentos por tantas manhãs agradáveis e divertidas aMarijan,
Helenita, Simone, Edileuza, Geórgia, Celidalva. Sempre digo e sempre direi que, se tive um
ambiente de trabalho bom e que me dava gosto de ir trabalhar todas as manhãs, fizesse chuva
ou sol, e do qual tive e tenho orgulho de dizer que fiz parte, este lugar foi o Laboratório de
Bacteriologia do Hospital Couto Maia. Foi um prazer enorme ter todos vocês em minha vida.
O período de quase dois anos e meio foi curto, mas permanecerá fixado em minha memória.
Muito Obrigado!
A minha equipe de trabalho, a equipe meningites, uma equipe unida e com foco na
excelência, onde fiz bons amigos e contatos. Milena Soares, Ana Paula Menezes, Mariela
Correia, Vivian Galvão, Eliane Escobar, Eder Silva, André Silvani, Lorena Galvão, Paulo
Lobo, Soraia Cordeiro, Jailton Azevedo, Leila Campos. Com uns, um pouco mais, com outros
um pouco menos, mas em todos os casos, foram boas interações e que serviram para o meu
crescimento de alguma forma. Obrigado a todos, por toda a ajuda e companheirismo.
A alguns amigos especiais, agradecimentos especiais...
Fernanda Albuquerque, grande amiga, incentivadora e motivadora. Uma verdadeira
cientista, culta e inteligente, mas que acima de tudo sabe viver o seu lado mais humano.
Apoio e ombro amigo sem os quais a jornada poderia ter sido muito mais pesada. Muito
obrigado pelo carinho e amizade hoje e sempre.
Vivian Galvão, pelos desabafos conjuntos, tanto de alegrias quanto de momentos mais
tensos. Pela companhia de todos os dias, não só durante o expediente, mas também na saída
dele. Muito obrigado pela amizade e companheirismo.
Nadja Gonçalves, pela amizade, carinho e companheirismo. Pelo suporte quando ameacei
fraquejar e pelas palavras ternas e leais.
Artur Trancoso, meu caro amigo, pela ajuda de valor inestimável na análise das minhas
sequencias para o MLST. Sua ajuda foi fundamental para o sucesso. Muito obrigado!
Eder Silva, obrigado pela companhia até mesmo nos dias em que praticamente só havíamos
nós em todo o Centro de Pesquisa (feriados, greves, finais de semana...).
Mariela Leite, querida amiga, companheira de tardes e tardes. Sempre simples, sempre doce,
sempre você. Obrigado pelo carinho, sempre.
Milena Soares e Ana Paula Menezes, amigas e professoras. Aprender a analisar as
sequencias do MLST jamais teria sido tão fácil e divertido como foi com a ajuda de vocês.
Soraia Machado, muito obrigado pela ajuda na extração e no Real Time. Foi muito trabalho,
mas nem por isso deixou de ser leve e divertido. Foram tardes e tardes divertidas e leves.
Jailton Azevedo, obrigado por ter me instruído logo em meu ingresso na equipe, pois para
todo começo sempre se faz necessário o primeiro passo, e este foi muito bem dado. Obrigado!
Luis Morais, uma pessoa maravilhosa que tive o prazer de conhecer, pela ajuda em alguns
experimentos.
A alguns outros amigos que não contribuíram diretamente na composição deste trabalho, mas
que ficaram na torcida sincera: Selton Diniz, Mariangela Solano, Rafael Avelar, Vanessa
Meneses, Milena Lima, e outros que porventura posso ter - me esquecido de mencionar aqui,
mas que fazem parte da minha vida e tornam-na mais leve e bela. Muito obrigado!
À Plataforma de Sequenciamento da FIOCRUZ - Silvana Paz, pela paciência e ajuda com
as minhas amostras urgentes e difíceis.
A CAPES, pela bolsa concedida para a realização deste trabalho.
“Onde há muita luz, as sombras são mais profundas”
Goethe
“De que vale o eterno criar, se a criação em nada adiantar?”
Goethe (extraído de “Fausto”)
RIOS, Diêgo Rodrigo Santos Ramos. Detecção e Caracterização molecular de Streptococcus
pneumoniae diretamente de fluidos corpóreos. 70 f. Dissertação (Mestre em Farmácia) Universidade Federal da Bahia (UFBA), 2014.
RESUMO
Streptococcus pneumoniae é um dos principais agentes causadores de doenças invasivas graves como: pneumonia, meningite e septicemia. Estima-se o óbito em cerca de 2,0 milhões de crianças em países em desenvolvimento. O padrão ouro para diagnóstico é a cultura, mas a sua sensibilidade é baixa e por isso o aprimoramento no diagnóstico dos casos continua um desafio. O objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de técnicas moleculares diretamente em líquor visando detectar e caracterizar genotipicamente Streptococcus pneumoniae em casos de meningite. Um estudo prospectivo de corte transversal foi realizado no Hospital Couto Maia, no período entre abril de 2006 a dezembro de 2010. As amostras de líquor foram selecionadas de acordo com critérios de inclusão como celularidade superior a 100 células/mm3 e/ou Glicorraquia inferior a 40 mg/dl e/ou Proteinorraquia superior a 65 mg/dl, e foram submetidas a análises de rotina do hospital, e posteriormente testadas por técnica de PCR em tempo real para detecção de S. pneumoniae, usando como alvo o gene lytA e a reação de PCR-Multiplex para a dedução do sorotipo capsular. A caracterização genotípica foi realizada através da técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). Foram analisadas 1141 amostras de líquor provenientes de pacientes com suspeita clínica de meningite bacteriana. Destas, 92 amostras foram positivas para S. pneumoniae por PCR em tempo real. Das quais, 68 amostras(73,9%) foram cultura positiva e 24 (26,1%) cultura negativa. Os sorotipos de 21 dos 24 casos cultura negativa foram deduzidos. Cerca de 46% dos sorotipos encontrados nos casos cultura negativa, foram não vacinais.Dentre os sorotipos vacinais mais frequentes estavam o 6A/B/C com 6 casos (25%), 14 com 3 casos (12,5%), 23F com 2 (8,3%), 18A/B/C com 1 caso (4,2%) e 4 com 1 caso (4,2%).Do total de 24 casos cultura negativa, três casos (12,5%) não apresentaram positividade para qualquer dos 40 sorotipos testados, embora tenham apresentado positividade para o gene cpsA, permanecendo então como não determinados.Seis amostras (25%) tiveram genótipo caracterizado por MLST, sendo definidos os STs 750, 6403 e 2814. Este estudo conclui que as técnicas moleculares de PCR em tempo real e Multiplex PCR podem ser bastante úteis quando aplicadas diretamente em espécimes clínicos, possibilitando uma melhor detecção e diagnóstico dos casos, mesmo quando todas as outras técnicas diagnósticas convencionais não são capazes de fazê-lo, além de proporcionar um ganho de informações epidemiológicas que não seriam possíveis de serem obtidos por métodos convencionais, devido à ausência de positividade das culturas bacteriológicas.
Palavras chaves: Streptococcus pneumoniae, diagnóstico molecular, sorotipos, MLST, vacinas.
RIOS, Diêgo Rodrigo Santos Ramos. Detection and molecular characterization of Streptococcus pneumoniae directly de fluidos tangible. 70 f. Dissertation (Master of Pharmacy) Federal University of Bahia (UFBa), 2014.
ABSTRACT
Streptococcus pneumoniae is a major cause of severe invasive diseases such as pneumonia, meningitis and bacteremia. It is estimated death in about 2.0 million children in developing countries. The gold standard for diagnosis of this agent is the culture, but its sensitivity is low and therefore the accurate diagnosis of cases of pneumococcal meningitis remains a challenge. The aim of this study was to evaluate the use of molecular techniques to detect directly in CSF samples, and genotype Streptococcus pneumonia in meningitis cases. A prospective cross-sectional study was conducted at Hospital Couto Maia, in the period from April 2006 to December 2010.The CSF samples were selected according to inclusion criteria as cellularity above 100 cells/mm3 and / or CSF glucose less than 40 mg/dl and / or protein levels over than 65 mg / dl, and were submitted to routine hospital and subsequently tested by PCR in real time for the detection of S. pneumoniae, using targeting the lytA gene and PCR-Multiplex for the deduction of capsular serotype. The genotypic characterization was performed by Multilocus Sequence Typing technique (MLST). One amount of 1141 CSF samples were collected from patients with suspected bacterial meningitis and submitted for analysis. Of these, 92 samples were positive for S. pneumoniae by real-time PCR. Of which, 68 samples (73.9%) were culture positive and 24 (26.1%) culture negative. The serotypes of 21 of the 24 culture-negative cases were found. About 46% of the serotypes found in culture-negative cases were non – vaccine types. Among the most common vaccine serotypes were the 6A/B/C with 6 cases (25%), 14 with 3 cases (12.5%), 23F with 2 (8.3%), 18A/B/Cwith one case (4.2%) and 4 with 1 case (4.2%). Of the total of 24 culture-negative cases, three cases (12.5%) showed positivity for any of the 40 serotypes tested, although they presented positive result for the gene CPSA amplification and remain as not determined. Six samples (25%) had the genotype characterized by MLST, the STs being set 750, 6403 and 2814. This study concludes that the molecular techniques of real-time PCR and multiplex PCR can be useful when applied directly on clinical specimens, enabling better detection and diagnosis of cases, even when all other conventional diagnostic techniques are not able to do it, and provide a gain of epidemiological information that would not be possible to obtain by conventional methods, due to the absence of positive bacterial cultures.
Key words: Streptococcus pneumoniae, molecular diagnostics, serotypes, MLST, vaccines.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Principais fatores de virulência de S. pneumoniae:A autolisina LytA, as
proteínas de superfície A e C (PspA e PspC), as proteínas ligadoras de
metal, em especial o antígeno de superfície A (PsaA). ........................................ 23
Figura 2: Distribuição dos sorotipos capsulares pneumocócicos por reação de
dedução capsular por Multiplex PCR. ................................................................. 37
Figura 3: Distribuição dos sorotipos capsulares dos casos de meningite pneumocócica
identificados no Hospital Couto Maia, no período de Abril de 2006 a
Dezembro de 2010. ................................................................................................. 43
Figura 4: Distribuição dos tipos capsulares de pneumococos em casos de meningite
cultura negativa identificados no Hospital Couto Maia, no período de Abril
de 2006 a Dezembro de 2010. ................................................................................ 43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características clínicas e epidemiológicas dos casos de meningite
pneumocócica identificados no Hospital Couto Maia, por Real Time PCR. .... 41
Tabela 2: Resultados dos métodos de diagnósticoutilizados para identificar os
casos de meningite pneumocócica em Salvador, Bahia (N=59). ........................ 42
Tabela 3: Características gerais dos casos de meningite pneumocócica dentre os
quais todos os testes convencionais de diagnóstico laboratorial foram
negativos (N=7/59). ................................................................................................. 44
Tabela 4: Perfil genotípico de Streptococcus pneumoniae caracterizados diretamente
de amostras de LCR cultura negativa, provenientes de casos de meningite
pneumocócica. ........................................................................................................ 45
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
DNA: do inglês “desoxiribonucleicacid” – (Ácido desoxirribonucleico)
MLST: do inglês “multi locus sequencetyping”
HIV: do inglês “human immuno deficiency virus” – (Vírus da imunodeficiência humana)
PCR: do inglês “polimerase chain reaction” - (Reação em cadeia da polimerase)
PCV: do inglês “pneumococcal conjugated vaccine” - (Vacina conjugada pneumocócica)
LCR: líquido cefaloraquidiano
PFGE: do inglês “pulsedfield gel electrophoresis” – (Eletroforese em gel com campo
pulsado)
ST: do inglês “sequencetype”
CC: do inglês “clonal complex”
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 17
2.1 MENINGITE .............................................................................................................................. 17
2.2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MENINGITES BACTERIANAS .......................... 18
2.3 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE .......................................................................................... 21
2.4 EPIDEMIOLOGIA DA MENINGITE PNEUMOCÓCICA ...................................................... 23
2.5 PREVENÇÃO............................................................................................................................. 24
2.6 DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE S. PNEUMONIA E DIRETAMENTE DE FLUÍDOS BIOLÓGICOS ....................................................................... 28
3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................... 31
4 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 32
4.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 32
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 32
5 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 33
5.1. DESENHO DO ESTUDO .......................................................................................................... 33
5.2 LOCAL DO ESTUDO ................................................................................................................ 33
5.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO .................................................................................................... 33
5.4 COLETA DE DADOS ................................................................................................................ 34
5.5 DIAGNÓSTICO MOLECULAR ............................................................................................... 34
5.5.1 Extração de Ácido Desoxirribonucleico (DNA) das amostras de LCR. ............................... 34
5.5.2 Reação em cadeia da polimerase em tempo real .................................................................... 35
5.6 DEDUÇÃO DO SOROTIPO CAPSULAR POR MULTIPLEX PCR ....................................... 36
5.7 MULTI – LOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) ................................................................... 37
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................................................... 39
5.9 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS .................................................................................................... 39
6 RESULTADOS ......................................................................................................................... 40
7 DISCUSSÃO .............................................................................................................................. 46
8 CONCLUSÕES ......................................................................................................................... 51
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 52
APÊNDICES: ............................................................................................................................ 57
15
1 INTRODUÇÃO
Streptococcus pneumoniae é uma bactéria que normalmente coloniza o trato respiratório
superior, sendo um dos principais responsáveis pelos casos de pneumonia adquirida na
comunidade, meningite e sepse (PELTOLA, 2010). As faixas etárias mais acometidas por
doenças pneumocócicas invasivas são as crianças menores de cinco anos e adultos maiores de
65 anos (LYNCH; ZHANEL, 2009).Estima-se o óbito de cerca de 1,6 milhões de crianças
menores de cinco anos por doença pneumocócica todos os anos no mundo, sendo a maior
concentração destes casos nos países em desenvolvimento (WHO, 2007).
Por definição, doença pneumocócica invasiva é a infecção onde a bactéria é encontrada
em fluidos corpóreos normalmente estéreis como: sangue, líquor, líquido pleural, líquido
ascítico e sinovial (PLETZ et al., 2008). Dentre as formas invasivas da doença pneumocócica,
a meningite é considerada uma importante causa de morbi – mortalidade no mundo, em
especial em países em desenvolvimento, onde as vacinas contra Haemophilus influenzae tipo
b e contra a doença meningocócica não foram implantadas no calendário nacional de
imunização (THIGPEN et al., 2011).
O diagnóstico laboratorial de meningite é realizado através da análise bioquímica,
citológica e microbiológica do líquido cefalorraquidiano (LCR). A cultura é considerada o
padrão ouro para a identificação do agente etiológico (FITCH; BEEK, VAN DE D., 2007),
entretanto este método apresenta uma baixa sensibilidade, o que pode contribuir para
subestimar a incidência da meningite pneumocócica (AZZARI et al., 2008). Uma cultura
negativa compromete não apenas a detecção do agente, mas os dados relativos aos sorotipos
capsulares, que por sua vez são importantes para adoção de medidas preventivas baseadas em
vacinas. A utilização de técnicas moleculares para a obtenção dessas informações está sendo
cada vez mais aplicada (SAHA et al., 2008).
A sorotipagem de pneumococos tem como padrão ouro a aglutinação com anti – soros
capsulares específicos, conhecida por reação de Quellung. No entanto, os reagentes para a
reação de Quellung apresentam alto custo e exigem o isolado clínico viável para sua
execução. O que vem a ser uma limitação do método, especialmente quando o paciente faz
uso de antimicrobianos antes da assistência médica, o que pode inviabilizar a positividade da
cultura (RESTI et al., 2009). Técnicas moleculares baseadas na reação de polimerase em
cadeia (PCR) que permitam detectar e deduzir o sorotipo capsular dos pneumococos,
independente da positividade das culturas, contribuem para a aquisição de dados importantes
16
para a compreensão da epidemiologia da doença e para subsidiar estudos de composição
vacinal (SAHA et al., 2008).
Conhecer o perfil genotípico dos pneumococose a sua disseminação, também é
importante do ponto de vista epidemiológico local e global, e para isso, ao longo dos anos,
diversas técnicas com alto poder discriminatório foram utilizadas, mas por serem técnicas
com baixa reprodutibilidade intra e inter – laboratorial, a comparação entre os resultados de
diferentes laboratórios no mundo tornava-se difícil (MAIDEN et al., 1998). Neste contexto
desenvolveu-se a técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST), tendo como principio o
sequenciamento de genes conservados e o depósito destas sequencias (ST’s) na rede mundial
de computadores. A técnica de MLST foi inicialmente validada para Neisseriameningitidis
(MAIDEN et al, 1998), e posteriormente adaptada para Streptococcus pneumoniae
(ENRIGHT & SPRATT, 1998) e outros agentes bacterianos. A metodologia para MLST
também se encontra adaptada para aplicação direta em fluídos corpóreos (ENRIGHTet al.,
2000), abrindo precedentes para a sua aplicação nos casos em que a obtenção dois o lado
bacteriano é inviável (XU et al., 2011).
No Brasil, entre os anos de 2007 e 2010, foram notificados 4.317 casos de meningite
pneumocócica, sendo que apenas 68,6% destes casos foram cultura positiva. Os demais casos
foram diagnosticados por reação de aglutinação em látex (23%) (BRASIL, 2010).Além do
diagnóstico inconclusivo, os dados relativos aos sorotipos, importantes à epidemiologia local
e também num contexto global, são prejudicados, sendo recomendado o uso de uma
abordagem através de técnicas moleculares baseadas na reação da polimerase em cadeia
(PCR) (AZZARI et al., 2008, 2010) e/ou sequenciamento (MLST) (XU et al., 2011).
Neste estudo foram aplicadas três técnicas moleculares diretamente no líquor: PCR em
tempo real, multiplex PCR e MLST, de forma a detectar o agente Streptococcus pneumoniae,
deduzir o sorotipo capsular deste agente e por fim, obter a caracterização do genótipo. Este
conjunto de informações é de considerável importância, haja vista que o Ministério da Saúde
introduziu em 2010 a vacina pneumocócica de cavalente no calendário do Programa Nacional
de Imunizações.
17
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 MENINGITE
A meningite é um processo inflamatório das leptomeninges dentro do espaço
subaracnoide. Em geral é causada por uma infecção, porém pode ocorrer em resposta a um
irritante não bacteriano introduzido no espaço aracnoide. A meningite infecciosa é
classificada em piogênica aguda (meningite bacteriana), asséptica (meningite aguda viral) e
crônica (tuberculosa, sifilítica, criptocócica) (BRASIL, 2010). A suspeita clínica de meningite
geralmente ocorre quando o paciente apresenta alguns sinais clínicos como o de Kernig
(resistência e dor quando o joelho é estendido com o quadril totalmente flexionado),
Brudzinski (o levantamento involuntário das pernas em irritação meninge a quando levantada
a cabeça do paciente) e rigidez de nuca (MAGAZZINI et al., 2012). Estes sinais e sintomas
variam conforme a idade dos indivíduos, e se manifestam nas primeiras 24 a 48 horas, sendo
frequentemente associados a: febre (75 – 95% dos casos), dor de cabeça (80 – 95%), vômito
(90% em crianças, 10% em adultos), rigidez de nuca (50 – 90%) e confusão mental (75 –
85%). Em recém – nascidos, outros sinais e sintomas patognomônicos, como abaulamento da
fontanela, irritabilidade e diminuição do nível de consciência são observados
(SCARBOROUGH; THWAITES, 2008). A presença da tríade de sinais e sintomas (rigidez
de nuca, sinal de Kernig e sinal de Brudzinski) é específica, mas não sensível, significando
que a sua ausência não exclui a possibilidade da presença de um quadro de meningite
(MAGAZZINI et al., 2012).
Dentre as meningites de etiologia bacteriana, o Streptococcus pneumoniae, e a
Neisseriameningitidis são os seus principais agentes. Outras bactérias também podem estar
implicadas como: o Haemophilus influenzae, oS. agalactiae(associado à meningite em
neonatos), a Listeriamonocytogenes (neonatos, idosos e indivíduos imuno comprometidos), a
Salmonella sp. não typhi (pacientes imuno comprometidos por HIV), dentre outras
(SCARBOROUGH; THWAITES, 2008).
18
2.2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MENINGITES BACTERIANAS
Após a confirmação da suspeita de meningite através dos sinais e sintomas clínicos, é
realizada a punção lombar e análises bioquímicas, citológicas e microbiológicas do LCR. Nos
casos em que a punção lombar não pode ser realizada, alternativas podem ser utilizadas para o
diagnóstico como a utilização de marcadores inflamatórios séricos, hemocultura, biópsia de
lesões epiteliais e detecção de antígenos na urina (BROUWER et al., 2010).Dentre as técnicas
mais utilizadas, as microbiológicas, em especial a cultura bacteriológica é considerada padrão
ouro para a identificação do patógeno, possibilitando informações importantes para a
terapêutica do paciente e também para estudos epidemiológicos da doença em sistemas de
vigilância epidemiológica (FITCH; BEEK, VAN DE D., 2007).
O diagnóstico laboratorial convencional da meningite, através do exame do LCR
compreende algumas etapas e segue critérios e técnicas bem estabelecidos, cujos resultados
devem ser avaliados e reunidos para a definição do diagnóstico, que são:
a) Aspecto: O LCR normal é límpido, classicamente chamado de “água de rocha”. Pode
também apresentar-se xantocrômico ou turvo. Este último normalmente associado ao
quadro de meningite bacteriana já estabelecida e decorrente do grande número de
leucócitos.
b) Citologia: O LCR normal costuma apresentar uma celularidade inferior a 5
células/mm3 em adultos e inferior a 20 células/mm3 em recém-nascidos. A presença de
um número de células superior a 100 células/mm3 sugere um quadro de meningite
bacteriana. Uma meningite purulenta é definida com uma celularidade igual ou
superior a 500 células/mm3. O predomínio de leucócitos polimorfo nucleares é típico
de meningite bacteriana (CARBONNELLE, 2009).
c) Bioquímica:
1. Glicorraquia: O valor normal oscila em cerca de 2/3 da glicemia do
indivíduo. Em meningite bacteriana, os valores tendem a baixar, mas este
não é um parâmetro específico (CARBONNELLE, 2009).
2. Proteinorraquia: Num LCR normal de um paciente adulto varia entre 0,15
– 0,45g/L, enquanto num recém-nascido atinge até 1,5g/L.
Independentemente da etiologia, o valor encontra-se elevado em casos de
meningite (CARBONNELLE, 2009).
3. Outros marcadores:Alguns marcadores para o diagnóstico diferencial das
meningites têm sido estudados. Viallon e colaboradores concluíram que os
19
níveis de lactato (sensibilidade 94% e especificidade 92%) e procalcitonina
sérica (sensibilidade 95% e especificidade 100%) são bastante
discriminatórios para o diagnóstico diferencial entre meningites bacterianas
e meningites virais (VIALLON et al., 2011).
d) Microbiologia:
1. Exame microscópico direto:O exame direto do sedimento corado pelo
método de coloração de Gram tem sensibilidade que varia de 50 a 90% e
permanece positiva em cerca de 15% dos casos onde a cultura foi negativa,
sendo extremamente útil para um direcionamento terapêutico inicial
(SCARBOROUGH; THWAITES, 2008).
2. Cultura: É o padrão ouro para o diagnóstico da meningite bacteriana,
possibilita o isolamento, a identificação de microrganismos, bem como
testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. No entanto, possui baixa
sensibilidade, exige infra estrutura para processamento e pessoal
especializado para o manuseio e identificação dos isolados (CORLESS et
al., 2001).
e) Sorológicos:
1. Os testes mais comuns baseiam-se na resposta antígeno – anticorpo
específico. As reações de aglutinação, onde os anticorpos estão fixados em
partículas de látex, apresentam sensibilidades variando entre 50 – 100%
(GRAY; FEDORKO, 1992). Apresentam melhores performances quando
em casos onde a celularidadeliquórica é elevada (CARBONNELLE, 2009),
mas apresenta resultados controversos nos casos onde foi empregada
antibioticoterapia prévia(SCARBOROUGH; THWAITES, 2008).
2. Testes imunocromato gráficos, são principalmente aplicados na detecção de
antígeno urinário e apresentam valores de sensibilidade que variam entre 70
– 80% e especificidade superior a 90% (WERNO; MURDOCH, 2008), mas
que tem como principal desvantagem a não distinção entre um paciente
infectado e um indivíduo colonizado, o que pode ocasionar um falso
diagnóstico (ADEGBOLA et al., 2001; DOWELL et al., 2001).
20
Uma abordagem molecular, nos casos onde a cultura foi negativa, faz-se necessária para
determinar o agente etiológico. As técnicas moleculares, como a reação em cadeia da
polimerase (PCR), utilizando múltiplos primers (Multiplex), e a reação da PCR em tempo real,
possuem maior sensibilidade e especificidade na detecção do patógeno, podendo ser utilizadas
diretamente em espécimes clínicos, possibilitando a detecção dos casos, mesmo na ausência do
patógeno viável em cultura (AZZARI et al., 2010; SAHA et al., 2008).A técnica de PCR em
tempo real tem a vantagem de ser relativamente rápida, uma vez que dispensa a etapa de
eletroforese em gel de agarose, e ao utilizar-se de primers específicos para cada agente
etiológico que se deseja pesquisar, apresenta altas sensibilidade e especificidade. No que diz
respeito à detecção dos principais agentes etiológicos da meningite bacteriana, a técnica de PCR
em tempo real tem sido extensamente utilizada e com bons resultados (SACCHI et al., 2011).
Quando aplicada à detecção de pneumococos, a identificação é normalmente baseada na
detecção do gene específico lytA, que codifica uma autolisina que é específica e naturalmente
expressa em todos os isolados de pneumococos (KADIOGLU et al., 2008).
Resti e colaboradores apresentaram um estudo onde, mesmo com antibiótico terapia
prévia (igual ou superior a quatro dias) à admissão hospitalar, a técnica de PCR em tempo real
apresentou 100% de especificidade e sensibilidade 2,6 vezes maior que a técnica de cultura,
identificando o agente Streptococcus pneumoniaeem diferentes formas de doença tais como:
pneumonia, meningite e artrite (RESTI et al., 2009). Azzari e colaboradores afirmam que a
técnica de PCR em tempo real é mais sensível que a técnica de Multiplex PCR convencional,
tantono diagnóstico quanto para a sorotipagem em casos de doença pneumocócica invasiva
(AZZARI et al., 2010).
Outra variação metodológica, a técnica de Multiplex PCR, tem sido utilizada para a
detecção de patógenos com sucesso. Xu e colaboradores utilizaram a técnica de Multiplex
PCR para a identificação de Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae diretamente
em amostras de fluido de ouvido médio provenientes de pacientes diagnosticados com otite
média aguda. Nesta metodologia, foram utilizados como gene alvo os genes codificantes da
porção 16S dos patógenos investigados, gerando produtos de diferentes tamanhos. A técnica
foi validada contra resultados obtidos através do uso da técnica em culturas puras dos
patógenos. Os casos onde a cultura foi positiva tiveram a identificação 100% concordante
entre cultura e Multiplex PCR (XU et al., 2011).
21
As técnicas moleculares têm sido empregadas não apenas com finalidade diagnóstica,
mas também epidemiológica (sorotipagem) aplicada a pneumococos, especialmente em casos
onde a cultura é negativa, pois estas técnicas permitem a obtenção de informações que não
seriam obtidas nestes casos através das técnicas convencionais. Em seu estudo, Saha e
colaboradores propuseram o uso da técnica de Multiplex PCR convencional diretamente em
espécimes clínicos nos casos onde a cultura foi negativa, como uma alternativa viável,
relativamente simples e barata para estudos de vigilância e definição de composição vacinal
(SAHA et al., 2008). Azzari e colaboradores, por outro lado, testaram as técnicas de PCR em
tempo real e Multiplex PCR convencional, para sorotipagem de casos de doenças
pneumocócicas diversas, de forma a avaliar a aplicabilidade das mesmas e verificaram que a
técnica de PCR em tempo real era mais sensível, pois foi capaz de deduzir o sorotipo capsular
mesmo em amostras onde o Multiplex PCR convencional não foi capaz (AZZARI et al., 2010).
Com a introdução da vacina conjugada pneumocócica de cavalente, se faz necessária a
realização de estudos de vigilância para o constante monitoramento dos casos e os sorotipos
implicados. No entanto com o uso de antibióticos previamente à admissão hospitalar e a baixa
sensibilidade do isolamento em cultura, existe a necessidade de utilização de técnicas mais
sensíveis e específicas que o método tradicional de cultura, e que sofram menos a
interferência da introdução de antibióticos, de forma a se obter não apenas uma maior rapidez
no diagnóstico, mas também avaliar a eficácia da vacina.
2.3 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
OS. pneumoniae é uma bactéria, pertencente à família Streptococcaceae, que se
apresenta em arranjos de diplococos Gram – positivos de aspecto lanceolado.São anaeróbios
facultativos, não produtores de catalase e suas colônias produzem alfa hemólise quando
cultivadas em meio de culturaTSA (trypticsoyagar) suplementado com 5% de sangue de
carneiro.Sua identificação laboratorial é feita através do teste de susceptibilidade à optoquina,
e também através do teste de bile solubilidade, pois os pneumococos são solúveis quando
expostos a uma solução de desoxicolato de sódio a 2% (MURRAY, 2007). Seu principal
reservatório é o homem, colonizando anasofaringe e a partir deste local se dissemina para o
trato respiratório inferior e/ou outros sítios, onde pode vir a causar infecção (LYNCH;
ZHANEL, 2009).
22
As infecções causadas pelo S. pneumoniae podem ser não invasivas ou invasivas.
Dentre as infecções não invasivas mais comuns estão conjuntivite (em especial os
pneumococos não – tipáveis), otite e pneumonias adquiridas em comunidade. Enquanto dentre
as manifestações invasivas, as mais frequentes são: meningite e bacteremia (LYNCH;
ZHANEL, 2009; SÁ-LEÃO et al., 2006). Sua disseminação comunitária ocorre
principalmente por aerossóis provenientes de indivíduos colonizados ou doentes (LYNCH;
ZHANEL, 2009).
Um dos principais fatores de virulência dos pneumococos é a expressão da sua cápsula
polissacarídica, sendo atualmente descritos 93 sorotipos (CALIX; NAHM, 2010).A cápsula
atua impedindo ou dificultando a fagocitose pelo sistema imunológico do hospedeiro. Pela
importância como fator de virulência e pelo papel desempenhado na proteção da bactéria
contra o sistema imunológico, os pneumococos não encapsulados tem sido considerados
como não patogênicos (PLETZ et al., 2008). E embora muitos autores afirmem a não
patogenicidade dos pneumococos não capsulados (sendo, portanto, não tipáveis), existem
relatos na literatura citando-os como contagiosos e relacionando-os a grandes surtos de
conjuntivite e ocasionalmente sendo também relacionados a outras patologias próprias de
pneumococos como otites, infecções respiratórias, e outras doenças invasivas (SÁ-LEÃO et
al., 2006).
Além da cápsula polissacarídica, os pneumococos possuem outros importantes fatores
de virulência (Figura1). Os genes que codificam alguns destes fatores tem sido explorados
como genes alvo para a sua detecção, tal como o lytA, um gene codificante de uma autolisina
que atua na parede celular dos pneumococos e que está relacionada ao fenômeno de autólise
comum ao crescimento em meios de cultura sólidos e também relacionada à liberação de
pneumolisinas. Cepas mutantes lytA negativas, tem virulência reduzida em modelos murinos
de bacteremia e pneumonia (BERRY et al., 1989). Outro exemplo de gene alvo para a
detecção é o gene codificante das pneumolisinas (ply), que também tem importante papel na
virulência, embora não tenham exibido a mesma especificidade que o lytA em ensaios de
detecção, sendo positivo também em isolados de S. pseudopneumoniae (CARVALHOet al.,
2007). Outro fator de virulência importante e utilizado como alvo para ensaios de detecção, é
o psaA, um antígeno de superfície pneumocócica, cuja deleção na bactéria ocasiona a perda
total da sua virulência em modelos murinos de pneumonia, bacteremia e colonização
(JOHNSONet al., 2002; MARRA et al., 2002). O psaA e o lytA, foram os genes alvo mais
23
promissores nos ensaios de detecção por PCR em tempo real, realizado por Carvalho e
colaboradores, mostrando-se os mais específicos para a detecção dos pneumococos.
Alguns fatores de virulência são estudados como potenciais antígenos para composição
de vacinas, por favorecerem o estímulo à formação de anticorpos opsônicos, como é o caso
das proteínas de superfície pneumocócicas PspA e PspC. A PspA interfere na fixação do
componente C3 do complemento à superfície do pneumococo, mas estudos indicam que a sua
virulência depende das propriedades da cápsula polissacarídica expressa pelo isolado. A PspC
impede a formação do componente C3b do complemento, e a sua deleção em modelos
experimentais ocasiona redução da colonização da nasofaringe (CARVALHOet al., 2007;
KADIOGLU et al., 2008).
Figura 1: Principais fatores de virulência de S. pneumoniae:A autolisina LytA, as proteínas de superfície A e C (PspA e PspC), as proteínas ligadoras de metal, em especial o antígeno de superfície A (PsaA).
Fonte: (KADIOGLU et al., 2008).
2.4 EPIDEMIOLOGIA DA MENINGITE PNEUMOCÓCICA
As doenças pneumocócicas são um problema de saúde pública disseminada
mundialmente. Em 2005 a Organização mundial de Saúde estimou que cerca de 1,6 milhões
de indivíduos morrem por doenças pneumocócicas (meningite, sepse, pneumonia, otite média,
24
sinusite e bronquite) todos os anos, principalmente crianças com idade inferior a cinco anos,
oriundas de países em desenvolvimento (WHO, 2007).
Nos Estados Unidos, no período entre 1998 – 1999, a incidência de casos de meningite
pneumocócica foi estimada em 1.09 casos/100.000 habitantes (THIGPEN et al., 2011).No
Canadá, entre 1998 – 2001, a incidência de doenças pneumocócicas invasivas em crianças
com idade inferior ou igual a dois anos era de 81,6 casos/100.000 habitantes (J.D. KELLNER,
D.L. CHURCH, 2005).Segundo Quadros, em um levantamento do número de casos anuais de
meningite pneumocócica em diferentes realidades globais, a América Latina apresenta o
segundo menor número de casos, com cerca de 3.637 casos/ano, e que à despeito do uso de
antibióticos, os índices de letalidade são altos, atingindo o nível de 60%. Na Ásia, o número
de casos pode atingir a marca dos 25.865 ao ano, por conta da população estimada da Ásia
que chega a ser sete vezes maior que a população da América Latina (QUADROS, DE, 2009).
No Brasil, entre os anos de 2007 – 2010 foram notificados 94.879 casos de meningite,
sendo 4.317 casos (4.55%) de meningite pneumocócica. No que se refere à localização dos
casos de meningite pneumocócica, São Paulo e Rio de Janeiro ocupam o primeiro e segundo
lugar respectivamente, enquanto a Bahia está em 6º lugar, com 6,0% dos casos (BRASIL,
2010). Menezes e colaboradores relatam um declínio de 26% na incidência de meningite
pneumocócica no período de 2000 a 2008 na cidade de Salvador sendo que esta redução
ocorreu em todas as faixas etárias. Entretanto a letalidade da meningite pneumocócica
continuou elevada, sendo de 42% no mesmo período (MENEZES et al., 2011). Desta forma, é
fundamental um rápido diagnóstico dos casos e adoção de medidas terapêuticas adequadas
para minimizar a possibilidade de sequelas neurológicas e desfechos graves, como o óbito,
nos casos de meningite pneumocócica.
2.5 PREVENÇÃO
Embora a busca por estratégias preventivas baseadas em vacinas para as doenças
pneumocócicas tenha começado com a vacina polissacarídica, foi necessário o
desenvolvimento de uma vacina mais eficaz devido à baixaimuno genicidade dos
polissacarídeos em crianças com idade inferior a dois anos. Atualmente dois tipos de vacina
são utilizados, com diferentes tecnologias e públicos alvos: A vacina polissacarídica 23 –
25
valente e as vacinas pneumocócicas conjugadas (10-valente e 13-valente)(LYNCH;
ZHANEL, 2009; PLETZ et al., 2008).
A primeira vacina, licenciada em 1983, foi a polissacarídica 23 – valente. Uma vacina
composta dos polissacarídeos: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F,
18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F e33F. Nos países desenvolvidos, a sua composição abrange
entre 85 – 90% dos sorotipos causadores de doenças invasivas e atualmente são
comercializadas duas marcas, a Pneumovax® 23 (Merck & CO., INC., NJ, USA) e a Pneumo®
23 (Sanofi Pasteur AS, Lyon, França) (PITSIOU; KIOUMIS, 2011).
Apesar da ampla cobertura, a vacina polissacarídica 23 – valente não gera memória
imunológica eficiente, pois ativa as células B, mas não as células T independentes.Por isso
não é indicada para uso em crianças com idade inferior a dois anos (PITSIOU; KIOUMIS,
2011; PLETZ et al., 2008). Além disso, a vacinação em adultos requer reforço da dose a cada
5ou 6 anos e indivíduos “não responsivos” à imunização são particularmente frequentes
dentro da população idosa (PLETZ et al., 2008). O seu uso ficou restrito a determinados
grupos de indivíduos, como: indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos,
imunocompetentes portadores de doenças crônicas, crianças com idade igual ou superior a
dois anos, asplênicos (CDC, 1997), indivíduos que vivem em ambientes onde o risco de
aquisição de doença pneumocócica invasiva é maior (populações indígenas ou nativos do
Alaska, por exemplo), ou que são imuno comprometidos (LYNCH; ZHANEL, 2009).
As vacinas pneumocócicas conjugadas a proteínas foram desenvolvidas no sentido de
obter uma melhor imunogenicidade e resposta imunológica, especialmente para indivíduos
com idade inferior a dois anos. Estas vacinas possuem os antígenos capsulares conjugados a
proteínas carreadoras (Ex. Toxóide diftérico CRM197). Esta modificação permite que o
sistema imunológico imaturo desenvolva uma melhor resposta de memória, por parte das
células T dependentes. Atualmente existem duasformulações destas vacinas no mercado:
Synflorix® (PCV10) e Prevnar 13® (PCV13) (FITZWATER et al., 2012).
A vacina heptavalente foi licenciada em 2000, nos EUA, e posteriormente no Canadá
e Austrália. Formulada com antígenos capsulares dos sorotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e
23F) até então os mais frequentes em casos de doença invasiva identificados naqueles países
(superior a 80% dos casos) (ALBRICH et al., 2007; PELTON, 2008). Nos EUA, após a
implementação da PCV7, houve um declínio de 92% na incidência de doença pneumocócica
invasiva por sorotipos vacinais. A incidência reduziu de 0,61 casos/100.000 habitantes em
1998 – 1999 para 0,05 casos/100.000 habitantes em 2000 – 2007, ao passo em que a
26
incidência da doença pneumocócica por soro tipos não vacinais (não – PCV7) aumentou em
61%, passando de 0,48 casos/100.000 habitantes para 0,77 casos/100.000 habitantes no
mesmo período (THIGPEN et al., 2011).
O Reino Unido introduziu a PCV7 em 2006 e experimentou uma redução significativa
no número de casos de doenças pneumocócicas invasivas cuja incidência entre os anos de
2000 a 2006 era de 16,1 casos / 100.000 habitantes e sofreu um decréscimo de 34%, com 10,6
casos / 100.000 habitantes entre 2009 a2010 (MILLER et al, 2011), tanto em crianças com
idade inferior a cinco anos, quanto em idosos com idade superior a 65 anos (no primeiro
grupo, a redução foi maior). No entanto, houve o surgimento de novos casos relacionados a
sorotipos não vacinais (fenômeno de replacement), principalmente no grupo de indivíduos
maiores de 65 anos de idade (CHOI et al., 2011).
Na França, a PCV7 foi introduzida no ano de 2002, reduzindo a incidência em crianças
< 18anos de 1,65 casos/100.000 crianças em 2001, para 0,80 casos/100.000 crianças em 2005.
Em crianças com idade inferior a dois anos, a incidência caiu de 8,9 casos para
1,8casos/100.000 crianças, mostrando um total de 82% de redução na incidência. Entretanto,
um estudo de coorte realizado no período de 2005 a 2008, houve um aumento na incidência de
meningite pneumocócica de 0,8 casos para 1,8 casos/100.000 crianças para o grupo com idade
< 18anos, e de 1,8 casos para 11,9 casos/100.000 crianças, no grupo de indivíduos com idade
inferior a dois anos. Este aumento registrado no período de 2005 a2008 foi devido a ocorrência
da doença por sorotipos não vacinais (ALEXANDRE et al., 2010; DUBOS et al., 2007).
No Brasil, a PCV7 foi introduzida em 2000 apenas na rede de saúde privada. Em
2003, tornou-se disponível gratuitamente apenas para grupos especiais, nos centros de
referência para imunobiológicos especiais (CRIE). A vacina heptavalente tem sido aos poucos
substituída pela PCV13, em virtude da sua menor abrangência em sorotipos capsulares, em
diversos países que inicialmente haviam-na adotado, conforme tem sido relatado em literatura
(FITZWATER et al., 2012).
Uma vacina de polissacaride-proteina conjugada contendo 10 polissacarídeos
específicos por sorotipos de pneumococo (Synflorix, GSK) foi aprovada para uso em crianças
brasileiras pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em junho de 2009e
assim, no primeiro semestre de 2010, o Programa Nacional de Imunizações (PNI) introduziu a
vacina pneumocócicadecavalente no calendário básico de vacinação infantil. Além dos
sorotipos presentes na PCV7, foram adicionados os sorotipos 1, 5 e 7F. Considerando os
27
casos de meningite pneumocócica identificados no sistema de vigilância em Salvador, estima-
se uma redução de 77,4% dos casos de meningite pneumocócica em crianças com idade
inferior a dois anos após a introdução da PCV10 (MENEZES et al., 2011).
Além do favorecimento à resposta imunológica em crianças, as vacinas
pneumocócicas conjugadas (PCV-10 e -13) induzem resposta imune humoral e com isso a
produção de anticorpos da classe IgA, presentes em mucosas. Com a ativação desta resposta,
portadores assintomáticos deixam de ser colonizados por sorotipos inclusos na vacina,
erradicando-os, e por sua vez favorecendo também a imunidade de rebanho, que é a proteção
para os indivíduos não vacinados, mas que em contato direto com indivíduos vacinados
deixam de se comportar como reservatórios da bactéria (FITZWATER et al., 2012; PITSIOU;
KIOUMIS, 2011; PLETZ et al., 2008).
Com a adoção das vacinas conjugadas e a erradicação dos sorotipos vacinais através
também da eliminação dos portadores assintomáticos, um importante fenômeno tem sido
descrito, que é o fenômeno de reposição ou substituição sorotípica (PLETZ et al., 2008). Com
isso, países que inicialmente adotaram a PCV7, estão agora adotando a PCV13, de forma a
cobrir, além dos sorotipos presentes na PCV7 (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) também os
sorotipos 1, 5, 7F, 3, 6A e 19A.
Um sorotipo tem se destacado após a implementação da vacina heptavalente, o
sorotipo 19A. Este sorotipo está relacionado a altos índices de resistência a antibióticos, e tem
sido um dos principais sorotipos emergentes na era pós-vacinal (TECHASAENSIRI et al.,
2010). À despeito de pertencer ao mesmo sorogrupo do sorotipo 19F (presente na PCV7), os
anticorpos induzidos pela vacina não exibem reação cruzada protetora sobre o sorotipo 19A.
Estudos indicam que estes novos casos atribuídos ao sorotipo 19A, estejam relacionados a
novos clones deste sorotipo (PLETZ et al., 2008). Nos EUA, a incidência de casos
relacionados ao sorotipo 19A aumentou de 0,8 – 2,5 casos/100.000 habitantes entre os anos
de 1998 a 2005, enquanto a incidência geral de doença pneumocócica invasiva sofria um
decréscimo. Ao mesmo tempo, a incidência dos casos não susceptíveis à penicilina atribuídos
ao sorotipo 19A, aumentou de 6,7% para 35% (MOORE et al., 2008).
Ainda nos EUA, dos 151 isolados de pneumococos não susceptíveis à penicilina do
sorotipo 19A, 73% pertenciam ao complexo clonal emergente 320 (CC320), que está
relacionado ao clone Taiwan19F – 14, um clone multiresistente aos antimicrobianos. Os
demais isolados pertenciam ao CC199. Até o ano de 1999, apenas o CC199 estava
28
relacionado ao sorotipo 19A, o que sugere uma expansão clonal e variabilidade genéticas que
tornaram o sorotipo 19A bem-sucedido na era pós-vacinal (MOORE et al., 2008).
2.6 DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE S. PNEUMONIA E
DIRETAMENTE DE FLUÍDOS BIOLÓGICOS
O isolamento em cultura é o padrão ouro para o diagnóstico de meningite bacteriana,
entretanto apenas 68,6% dos casos de meningite bacteriana identificados no período entre
2007 e 2010 apresentaram cultura positiva, sendo que um considerável número de casos foi
fechado como sendo de etiologia não especificada(BRASIL, 2010a). Estes dados reforçam a
hipótese de que a incidência da doença pneumocócica invasiva, em especial a meningite, é
subestimada não apenas no nosso país, mas globalmente (AZZARI et al., 2008). Uma vez que
nos casos onde a cultura foi negativa, a etiologia nem sempre pode ser esclarecida por outras
técnicas que tenham adequada sensibilidade e especificidade, caso não haja disponibilidade
para uma abordagem molecular (XU et al., 2011).
Alguns fatores contribuem para o aumento do número de casos de meningite cultura
negativa e consequentemente os casos de etiologia não especificada, tais como:
antibioticoterapia empírica no tratamento; Uso indiscriminado de antibióticos (aquisição sem
prescrição médica, ou prescrições inadequadas) (RESTI et al., 2009); Pouco volume do
espécime clínico para ser semeado em meio de cultura; Inóculo bacteriano insuficiente para
crescimento em meio de cultura (estágio muito precoce da doença ou coleta e/ou
acondicionamento inadequado da amostra). Na ausência dos dados fornecidos pela cultura,
outros critérios devem ser utilizados para a escolha da medida terapêutica mais apropriada
para o paciente, mas sem uma técnica sensível e específica o suficiente, fica difícil a definição
da etiologia, e com isso, dados epidemiológicos importantes são perdidos (AZZARI et al.,
2008; SAHA et al., 2008).
O método de PCR em tempo real tem uma elevada sensibilidade, podendo detectar até um
mínimo de 10 cópias do genoma bacteriano em 200uL de LCR. A detecção pode ser feita
utilizando qualquer gene alvo já conhecido ou que seja específico para a espécie que se deseja
identificar, o que dá uma grande versatilidade à técnica. Carvalho e colaboradores realizaram
ensaios com diferentes genes alvo (ply, lytA e psa), de forma a incrementar a aumentar a
29
sensibilidade e especificidade da técnica, usando novos conjuntos de primers específicos e sondas,
mas preconiza ainda o uso daqueles que já estão bem estabelecidos (CARVALHOet al., 2007).
A técnica de PCR em tempo real é um ensaio que não requer a bactéria viável,
podendo ser utilizada no diagnóstico até mesmo em pacientes que foram admitidos na unidade
de saúde e/ou foram previamente medicados com antimicrobianos, e ainda assim obter um
resultado positivo. Azzari e cols. mostram que a detecção por crescimento em meio de cultura
foi positiva somente em pacientesque receberam tratamento com antibióticos por no máximo
dois dias, enquanto a técnica de PCR em tempo real foi capaz de detectar estes casos mesmo
após 4 dias de antibioticoterapia (AZZARI et al., 2008).
A técnica padrão ouro para a sorotipagem de Streptococcus pneumoniae é a reação de
Quellung, que se caracteriza pelo intumescimento capsular do pneumococo quando exposto a
antissoros capsulares específicos. Mas é uma técnica laboriosa, exige o isolado clínico para a
sua realização, além de pessoal especializado para a execução e análise do teste (AZZARI et
al., 2010).
Uma alternativa ao uso da reação de Quellung foi criada, utilizando-se a técnica de
PCR multiplex em um esquema diferenciado, para a sorotipagem capsular de Streptococcus
pneumoniae, sendo muito mais simples e rápida e também com uma boa relação custo –
benefício. Este esquema foi baseado em dados do CDC sobre a distribuição sorotípica dos
pneumococos nos Estados Unidos, de forma que os conjuntos de primers específicos para
cada sorotipo capsular foram arrumados de acordo com a sua maior prevalência, em reações
distintas e progressivas, num total de sete reações com quatro sorotipos cada uma. Essa
combinação permite que um maior número de amostras seja identificado logo nas primeiras
reações (PAI et al., 2006).
Diferentes métodos de tipagem molecular têm sido utilizados ao longo do tempo com
diferentes propósitos, seja para avaliar a epidemiologia local quanto para a epidemiologia
global de possíveis surtos e suas relações, ou de como determinados patógenos se comportam
em diferentes situações ou locais e se pertencem a uma mesma linhagem (MAIDEN et al.,
1998). A técnica de MLST surgiu como uma alternativa à técnica de multilocus enzima
eletroforese (MLEE), que também possuía um bom poder discriminatório, mas dificilmente
era tinha os seus resultados reproduzidos de forma idêntica entre laboratórios distintos, uma
vez que esta é uma limitação do uso da eletroforese em géis de agarose. Da mesma forma
ocorrendo com técnicas como a eletroforese em campo pulsado (PFGE). São técnicas com
30
alto poder discriminatório, e excelentes para estudos epidemiológicos de surtos, pois são
capazes de detectar mudanças sutis na variedade genética dos patógenos (ENRIGHT, M C;
SPRATT, B G, 1999).
A aplicabilidade direta da técnica de MLST em fluidos corpóreos em casos onde a
cultura foi negativa permite a caracterização molecular dos casos de meningite pneumocócica
de uma forma mais completa, identificando ou esclarecendo o referido caso num contexto
epidemiológico em termos locais e globais, verificando a sua inserção num clone já conhecido
e disseminado, ou não.
31
3 JUSTIFICATIVA
As doenças pneumocócicas invasivas são importantes causas de morbi – mortalidade
no mundo, e por esta razão fazem parte dos objetivos do milênio, propostos pela Organização
Mundial de Saúde, em pelo menos duas das suas categorias: A redução da mortalidade infantil
e o combate a doenças infecto – contagiosas imuno preveníveis (WOLFSON, 2008). Para
isso, faz-se necessário o diagnóstico rápido para uma terapêutica eficaz e de dados
epidemiológicos que auxiliem na adoção das melhores medidas preventivas bem como para
avaliar as de uso corrente.
O presente estudo visa utilizar uma abordagem molecular para diagnóstico e
tipagem dos casos de meningite pneumocócica, sobretudo cultura negativa, realizada
diretamente no espécime clínico. Uma combinação de métodos moleculares como a
detecção do agente bacteriano através de PCR em Tempo Real, a dedução capsular por
Multiplex PCR e a genotipagem por MLST, oferecem a confirmação do agente etiológico
(diagnóstico) e a caracterização do perfil genético é importante para o controle da
disseminação geográfica do patógeno.
Com a implementação da vacina conjugada pneumocócica decavalente no calendário
nacional de imunização, o Brasil avançou rumo aos objetivos do milênio traçados pela
Organização Mundial da Saúde, no entanto este avanço só terá progresso através do constante
monitoramento epidemiológico das doenças pneumocócicas invasivas, seja através de
projetos de pesquisa ou de serviços de vigilância epidemiológica dos pneumococos
circulantes e da sua caracterização molecular, podendo assim identificar eventuais mudanças
no perfil do patógeno e o real impacto alcançado pelas medidas de prevenção implementadas.
32
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Detectar e caracterizar isolados de S. pneumoniae diretamente de amostras de LCR, de
pacientes com diagnóstico de meningite bacteriana cultura negativa.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Identificar através de PCR em tempo real, casos de meningite bacteriana cultura
negativa.
2) Realizar a dedução do sorotipo capsular de S. pneumoniae diretamente de LCR.
3) Caracterizar o perfil genético de S. pneumoniae através da técnica de multilocus
Sequence typing diretamente de LCR.
4) Determinar o percentual de casos de meningite pneumocócica com cultura negativa,
que são de sorotipos representados na vacina decavalente.
33
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 DESENHO DO ESTUDO
Este é um estudo de vigilância conduzido no período de abril de 2006 a dezembro de
2010.
5.2 LOCAL DO ESTUDO
As amostras de LCR deste estudo foram provenientes de pacientes atendidos no
Hospital Couto Maia (HCM). Este é um hospital estadual de referência em doenças
infecciosas, com 101 leitos, localizado em Salvador, Bahia. A Secretaria de Saúde do Estado
da Bahia (SESAB) recomenda que os casos suspeitos de meningite da região metropolitana da
cidade de Salvador sejam referidos ao HCM, e mais de 95% dos casos da região são
reportados (LIMA et al., 2010).
Todas as amostras de líquor foram transportadas em recipiente contendo nitrogênio
liquido até o Laboratório de Patologia e Biologia Molecular do Centro de Pesquisas Gonçalo
Moniz – (LPBM) FIOCRUZ, onde ficaram armazenadas em freezer -70oC até a execução dos
protocolos deste estudo.
5.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Foram incluídos neste estudo, pacientes com suspeita clínica de meningite (história
aguda de febre, cefaléia, rigidez de nuca, vômitos, convulsões) atendida no HCM, submetidos
à punção lombar para a coleta de LCR, conforme protocolo da instituição, e cujo perfil
citoquímico liquórico fosse compatível com meningite bacteriana: pleocitose igual ou
superior a 100 células/mm3 ou glicorraquia menor ou igual de 40 mg/dL ou proteinorraquia
maior ou igual a 65 mg/dL.Todos os pacientes aceitaram participar do estudo e assinaram o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 1).
34
5.4 COLETA DE DADOS
As informações necessárias ao estudo foram obtidas por meio de entrevista com os
pacientes internados no HCM. Um questionário epidemiológico (Apêndice 2), foi preenchido
com informações demográficas, sintomas, tratamento prévio, antecedentes médicos,
internações prévias e resultados dos exames laboratoriais. Posteriormente, foi realizada a
revisão de prontuários para que todas as informações clínicas de interesse ao estudo fossem
coletadas. Vale ressaltar que foram incluídos no estudo aqueles pacientes provenientes de
outros hospitais, mas que foram encaminhados ao HCM para realização da punção liquórica.
5.5 DIAGNÓSTICO MOLECULAR
5.5.1 Extração de Ácido Desoxirribonucleico (DNA) das amostras de LCR.
O DNA do genoma bacteriano foi extraído de 200mL da amostra de LCR usando o kit
QI Amp DNeasy Bloodand Tissue kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com o seguinte
protocolo: Alíquotas de 200uL de LCR foram adicionadas a 100mL de tampão TE (10mM de
Tris – HCl, 1mM de EDTA, pH8.0) contendo 0,04 g/mL de lisozima, 75U/mL de
mutanolisina e homogeneizadas. O homogeneizado foi incubado em banho – maria à 37ºC
por uma hora.Após incubação, foram adicionados 20µL de Proteinase K sob agitação suave, e
200mL de Tampão AL seguido de uma nova incubação a 56ºC por 30 minutos.
Após incubação, as amostras foram submetidas a uma rápida centrifugação, de modo a
eliminar a água de condensação nas paredes do tubo, e a cada tubo foram adicionados260µL
de etanol (96 – 100%) seguido de homogeneização. As amostras foram então transferidas para
as Colunas QIAamp (fornecidas no kit) e centrifugadas a 8000rpm por um minuto
(temperatura ambiente), e posteriormente foi descartado o primeiro tubo coletor.
A coluna foi novamente posicionada num novo tubo coletor de 2mL, onde foram
adicionados 500mL de Tampão AW1 a cada amostra, submetendo-os a centrifugação a
8000rpm por um minuto. Os tubos coletores foram novamente descartados e as colunas
35
recolocadas em novos tubos, sendo adicionados 500mL de Tampão AW2. O sistema foi então
submetido à centrifugação em rotação de 14.000 rpm por três minutos. Os tubos coletores
foram descartados e as colunas colocadas em tubos estéreis de 1,5mL, submetidos então a
eluição com 100mL de tampão AE e incubados por cinco minutos à temperatura ambiente. As
amostras foram centrifugadas por um minuto a 8000rpm (temperatura ambiente) para a
eluição do DNA, e os tubos contendo o DNA extraído foram então armazenados à – 20ºC
para a posterior análise.
5.5.2 Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Os oligonucleotídeos (primers)e sonda, utilizados foram baseados na sequência que
codifica o gene da autolisina do pneumococo, lytA (F373 – acgcaatctagcagatgaagca; R424 –
tcgtgcgttttaattccagct; Pb400 – tgccgaaaacgcttgatacagggag).O fragmento amplificado foi de 75
pares de bases. A reação foi composta de TaqMan Universal Master Mix 2x (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA), primerse sonda a uma concentração de 200nM, e água
livre de DNase e RNase, para compor o volume final de 23µL. O tampão foi distribuído em
placas ópticas de 96 poços, e a cada poço foram adicionados 2µl do DNA a ser analisado.
Foi utilizado em cada bateria de testes um controle positivo para cada reação, e quatro
controles negativos. A amplificação foi processada no aparelho 7500 Real Time PCR System
(AppliedBiosystems, Foster City, CA, EUA), utilizando ciclos com os seguintes
parâmetros:desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos. Em seguida, 50 ciclos com dois
estágios de temperatura de 95°C por 15segundos e 60°C por 60 segundos e uma temperatura
final de 50°C por 2minutos.
Ao término de cada análise, foram gerados gráficos referentes à amplificação, bem
como os valores de Ct (Cyclethreshold) para cada amostra e controles, que são valores
baseados no sinal fluorescente emitido. Se não houver nenhuma mudança no sinal
fluorescente após os 30 ciclos, a amostra é considerada negativa.
36
5.6 DEDUÇÃO DO SOROTIPO CAPSULAR POR MULTIPLEX PCR
Para a dedução do sorotipo capsular, foi empregado um protocolo desenvolvido pelo
CDC (Center for Disease Controland Prevention, Atlanta, EUA), disponível no site
(www.cdc.gov/ncidod/biotech/files/pcr-Latin-Amer-clinical-specimens.pdf).
Este protocolo foi desenvolvido de forma a definir até 40 sorotipos/sorogrupos
capsulares distribuídos em oito reações de PCR multiplex, utilizando para isto um conjunto de
primers específicos (Apêndice 3), onde cada par de primers corresponde a um
sorotipo/sorogrupo e um par de primersadicional corresponde ao gene cpsA, um gene
codificante da cápsula polissacarídica pneumocócica, usado como controle positivo interno da
reação.Para cada reação foram utilizados 20ul de Master Mix 2X PCR Buffer (Qiagen Hot
Start Taq® Multiplex PCR máster mix, Hilden, Alemanha), contendo 12,5ul de 2X PCR
Buffer, 3,5ul de água ultrapura, e quantidades equimolares dos pares de primers (0,1 – 0,5mM
cada), acrescido de 5ul de DNA da amostra em estudo.
As amplificações foram executadas em um termociclador Gene Amp® PCR System
97000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com os seguintes
parâmetros: ativação inicial de 15 minutos a 95ºC seguida de 35 ciclos com 94ºC por 30
segundos, 57ºC por 90 segundos e 72ºC por 60 segundos. Após os 35 ciclos, uma extensão
a 72ºC por 10 minutos. Um total de 10ul do produto amplificado, foi utilizado para
revelação por eletroforese em gel de agarose Nu Sieve® (Seakem LE, EUA) a 2%,
preparada com tampão TAE 1X (40mMTris, 20mM de Ácido acético glacial, 1mMEDTA,
pH 8.0). Para a visualização na etapa de revelação, foi utilizado 0,5ug/ml de brometo de
etídio incorporados ao gel. Os parâmetros para a eletroforese foram: voltagem constante
de 100V, por 1 hora e 30 minutos.
Os tamanhos dos fragmentos de DNA amplificados foram determinados por análise
comparativa, utilizando-se o padrão de peso molecular de 50 pb DNA Ladder (Promega,
Fitchburg, WI, EUA). O gel foi visualizado em transiluminador de luz ultravioleta Gel Doc
XR Chemi Doc – XRS (Bio Rad, Hercules, CA, EUA) e a imagem de cada experimento foi
capturada e salva em arquivo de formato jpg para impressão e registro.
A determinação de cada sorotipo foi feita com base no tamanho do fragmento
amplificado de acordo com cada reação do multiplex, conforme os dados do Quadro 1.
37
Figura 2: Distribuição dos sorotipos capsulares pneumocócicos por reação de dedução capsular por Multiplex PCR.
Sorotipo Tamanho (pb)
Sorotipo Tamanho (pb)
CpsA 160
Rea
ção
1
14 189
Rea
ção
5
7C/B/ 40 260
6A/B/C 250 12F/A/44/46 376
23F 384 11A/D 463
19A 566 10A 628
9V/A 816 23A 722
Rea
ção
2
19F 304
Rea
ção
6
21 192
3F 371 33F/47F 338
15B/C 496 15A/F 434
18A/B/C 573 35F/33A/37 517
17F 693 13 655
Rea
ção
3
1 280 R
eaçã
o 7
39 98
5 362 23B 199
9N/L 516 35A/C/42 280
7F/A 599 38/25F 574
16F 717 35B 677
Rea
ção
4
8 201
Rea
ção
8 24A/B/F 99
2 290 10F 248
4 430 34 408
20 514 31 701
22F/A 643
Rea
ção
9
6C 727
5.7 MULTI – LOCUS SEQUENCE TYPING (MLST)
A técnica de multilocus Sequence typing (MLST) foi realizada de acordo com o
protocolo descrito por ENRIGHT & SPRATT, 1998, para todos os casos que foram
identificados através da técnica de PCR em tempo real. A técnica é baseada no
sequenciamento de sete genes altamente conservados, comumente chamados de house-
keeping genes (aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt e ddl) do DNA cromossômico de S. pneumoniae.
As sequências obtidas foram comparadas com obanco de dados disponível no site
(http://www.mlst.net) para determinar o ST.
38
O procedimento teve inicio com a reação de amplificação, a qual foi realizada com o
volume de 25µl, utilizando-se o Master Mix Promega (Promega, Fitchburg, WI, EUA), a um
volume de 12,5µl por amostra, e ao qual foram acrescidos 8,0µl de água ultrapura, 0,5µl dos
primers específicos forward e reverse, e 3,5µl do DNA da amostra. As sequencias dos
primers utilizados encontram-se descritas no site (www.mlst.net).
A reação de amplificação foi realizada no termociclador Gene Amp® PCR System
97000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), foi realizada segundo protocolo descrito
com os seguintes parâmetros: 94ºC por 1 minuto, seguido de 10 ciclos de 94ºC por 15
segundos, 54ºC por 30 segundos e 72ºC por 45 segundos, e segunda etapaa94ºC por um
minuto seguido de 20 ciclos de 94ºC por 15 segundos, 54ºC por 30 segundos e 72ºC por 45
segundos com auto-extensão de 10 segundos a cada ciclo. Concluindo com uma extensão
final à 72ºC por 10 minutos.
A amplificação dos genes foi confirmada por eletroforese em gel de agarose a 1% em
TAE 1X e tensão de 100 volts por 30 minutos. Os géis foram corados com brometo de Etídio
para a visualização de uma banda, confirmando assim a amplificação. Cada gene gera um
fragmento de tamanho conhecido conforme descrito a seguir: aroE 405pb, gdh 459pb,
gki483pb, recP 448pb, spi 472pb, xpt 486pb e ddl441pb.
Após a confirmação da amplificação, o produto da reação foi submetido a um processo
de purificação utilizando EXOSAP (GE Healthcare), realizada numa proporção de 3µl do
produto de PCR para 4µl de EXOSAP. A purificação foi submetida a dois estágios: o
primeiro a 37ºC por 15 minutos e o segundo a 80ºC por 15 minutos.Os produtos foram
estocados em freezer -20ºC até o momento da reação de sequenciamento. O sequenciamento
foi realizado a partir dos produtos purificados e seguindo protocolos da plataforma de
sequenciamento PDTIS FIOCRUZ.
As sequências consenso finais foram editadas a fim de se igualar o tamanho dos
fragmentos aos alelos moldes disponíveis no www.spneumoniae.mlst.net utilizando-se o
software BioEdit versão 7.0.9. As sequências finais dos genes foram então submetidas ao site
do MLST para definição dos tipos de sequências (sequencetypes - STs), que foram obtidos
automaticamente para os alelos já conhecidos. Os STs obtidos foram comparados com aqueles
depositados no banco de dados para definição de complexos clonais (CC) com auxílio do
programa eBURST versão 3. A visualização da população completa contida do banco de
sequências de pneumcocos também foi gerada pelo programa eBURST versão 3.
39
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados clínicos, demográficos e epidemiológicos foram armazenados em bases de
dados do programa Epi Info versão 3.5.1. Quando apropriado foram utilizados os testes do qui
- quadrado com auxílio do programa Epi Info versão 3.5.1. Foram considerados como
estatisticamente significativos os resultados que revelaram valores de p < 0,05.
5.9 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Pesquisas
Gonçalo Moniz (Apêndice4).
40
6 RESULTADOS
No período de janeiro de 2006 a dezembro de 2010 foram identificados 4.448 casos de
meningite bacteriana no Hospital Couto Maia, de acordo com os critérios de inclusão
empregados neste estudo. Um total de 1.141/4.448(25,7%) amostras de LCR, sendo uma
única amostra de cada paciente, foi analisado por PCR em tempo real, sendo que 8%
(92/1141) das amostras foram positivas para S. pneumoniae. Das 92 amostraspositivas pela
Reação de PCR em tempo Real, 68/92 (74%) apresentaram cultura positiva e 24/92(26%)
cultura negativa.
Os pacientes com teste positivo para S. pneumoniae foram, na maioria (57%)
proveniente de outras cidades do estado da Bahia. Entretanto, quando estratificamos pelo
resultado da cultura foi possível observar que esta diferença foi maior entre os pacientes que
apresentaram cultura negativa (p=0,03). A tabela 1 apresenta as características clínicas e
epidemiológicas dos pacientes com meningite pneumocócica, estratificados pelo resultado da
cultura do LCR. Com exceção da procedência do paciente, e dos valores de Proteinorraquia
não houve diferença estatística entre as populações comparadas. O uso prévio de
antimicrobianos não foi uma variável importante no resultado da cultura do LCR, sendo que
53% dos casos de cultura positiva tiveram o teste microbiológico sugestivo da presença de
antimicrobianos, não tendo diferença no grupo com resultado de cultura negativo (54%).
Os resultados dos testes convencionais de diagnóstico laboratorial encontram-se
descriminados na tabela 2. Considerandoo grupo de casos com cultura positiva, o exame
bacterioscópico pela coloração de Gram foi sugestivo para pneumococos em 67 (98,5%)
casos, enquanto que no grupo de cultura negativa apenas oito (33%) tiveram positividade no
método de Gram. A reação de aglutinação por látex foi realizada em apenas 59 casos, sendo
realizados 41 testes no grupo cultura positiva e 18 testes no grupo de cultura negativa. Sendo
que este foi o teste que apresentou menor eficiência em detectar os casos de meningite
pneumocócica, com 14 casos falsos - negativo. A reação de PCR em tempo real identificou
sete casos que foram negativos em todos os testes convencionais de diagnóstico laboratorial e
na tabela 3 encontram-se as características destes casos, que tiveram meningite bacteriana de
etiologia não determinada ou meningite de etiologia não esclarecida como resultados
diagnósticos finais.
41
Tabela 1: Características clínicas e epidemiológicas dos casos de meningite pneumocócica identificados no Hospital Couto Maia, por Real Time PCR.
Características Cultura Positiva (n=68) Cultura Negativa (n=24) p******
Sexo
Masculino 47 (69%) 15 (62,5%)
Idade em anos
<2 16 (23,5%) 5 (20,8%)
2 - 5 4 (5,9%) 2 (8,3%)
5 - 15 11 (16,2%) 7 (29,2%)
> 15 37 (54,4%) 10 (41,7%)
Procedência
Salvador 34 (50%) 6(25%) 0.0359
Interior 30 (44%) 16 (66,7%)
Dados laboratoriais*
Celularidade (células/mm3) 2.825 (0 – 10.000) 5.350 (132 – 10.000)
Glicose (g/dl) 20 (1 – 69) 25 (10 – 71)
Proteínas (g/dl) 360 (28 – 1100) 300 (30 – 500) 0.0168
Gram** 67 8
Reação de Látex (n=59)*** 36 (87,8%) 9 (50%)
Quadro Clinico na Admissão
Dias com sintomas-mediana 3 (0 – 15) 5,5 (1 – 18)
Alteração neurológica**** 70,6% 50%
Fonte de infecção da Meningite
IVAS 17 (25%) 9 (37,5%)
Pneumonia 4 (5,9%) 1 (4,2%)
Trauma ou fratura 5 (7,4%) 0%
Uso prévio de antibiótico*****
Prontuário 8 (11,8%) 5 (20,8%)
Laboratorial 36 (53%) 13 (54%)
Antecedentes médicos
Doença crônica 13 (19,1%) 5 (20,8%)
Alcoolismo 8 (11,8%) 3 (12,5%)
Meningite anterior 8 (11,8%) 2 (8,3%)
Evolução Clínica
N° de dias internados - mediana 15 (1 – 108) 16,5 (6 – 100)
Nº de dias na UTI - mediana 9 (1 – 100) 15 (4 – 29)
Óbito 16 (23,5%) 1 (4,2%) *Foi utilizado a mediana e a amplitude do interquartil quando pertinente. **Foi considerada a presença de diplococos Gram positivos como sugestivo de pneumococos ***A reação de látex foi aplicada para 59 casos (41foram cultura positiva e 18foram cultura negativa). ****Alteração do quadro neurológico inclui coma e alterações não especificadas. *****Uso prévio de antibióticos refere-se à descrição no prontuário. ******Valor de “p” calculado pelo método exato de Fischer, sendo considerado significativo quando seu valor for < 0.05.
42
Tabela 2: Resultados dos métodos de diagnósticoutilizados para identificar os casos de meningite pneumocócica em Salvador, Bahia (N=59).
Cultura Gram Látex PCR n
- - - + 7
+ + - + 5
- + + + 7
- - + + 2
- + - + 2
+ + + + 36
Todos os 68 casos de meningite que foram cultura positiva tiveram o tipo capsular
determinado diretamente do isolado clinico. Para os 24 casos, cuja cultura foi negativa, o tipo
capsular foi determinado pela reação de multiplex PCR diretamente do DNA extraído do
LCR. Dentre os casos onde a cultura foi negativa, 21/24 casos (87,5%) tiveram o sorotipo
capsular deduzido e três casos (12,5%) não apresentaram positividade para qualquer dos 40
sorotipos testados, embora tenham apresentado positividade para o gene cpsA, permanecendo
então com sorotipo não determinado. Os sorotipos mais frequentes foram: 6A/B/C (25%), 14
(12,5%), 34 (12,5%), 23F(8,3%) e3 (8,3%). Dentre os sorotipos vacinais mais frequentes
estavam o 6A/B/C, 14, 23F, 18A/B/C e 4 (Figuras 2 e 3).
Considerando os sorotipos identificados neste estudo de forma geral, estimamos que
76% dos casos (19 casos) em crianças menores que cinco anos poderiam ser preveníveis
através do uso da vacina conjugada 10-valente (PCV-10)e de 95% para a vacina conjugada
13-valente (PCV-13). Para os 21 casos cuja cultura foi negativa e que foi possível determinar
o tipo capsular, 52,4% (11 casos)é de sorotipos inclusos na vacina decavalente. Para os sete
casos em que o diagnóstico positivo foi possível apenas pelo uso do método de PCR em
Tempo real, nós identificamos que 71% (5/7) dos casos foram por sorotipos não vacinais.
Nós submetemos 16 casos cuja a cultura foi negativa e havia DNA ou LCR suficiente
para tipificação molecular por MLST. Dos 16 casos submetidos, foi possível completar a
análise do perfil alélico de seis casos, sendo três deles Single Locus Variante, e outros três
com perfil alélico completo. Dentre os ST’s com perfil alélico completo, foram encontrados
os STs 750, 6403 e o 2814, enquanto os Single Locus Variante foram os STs 4913, 756 e um
terceiro caso com três ST’s possíveis (66 / 785 / 7038), o qual precisa da sequência do gene
spi para definição (Tabela 4).
43
Figura 3: Distribuição dos sorotipos capsulares dos casos de meningite pneumocócica identificados no Hospital Couto Maia, no período de Abril de 2006 a Dezembro de
2010.
Figura 4: Distribuição dos tipos capsulares de pneumococos em casos de meningite cultura negativa identificados no Hospital Couto Maia, no período de Abril de 2006 a Dezembro de 2010.
0
2
4
6
8
10
124 6* 14 18*
19F
23F
10A
12F
15B
15C
16F
19A 20
28A 3 34
35B 35
…
38 8
9N 13
17F
Nº
de c
asos
Sorotipos
Cultura positiva
0
1
2
3
4
5
6
7
4
6 (A
/B/C
)
14
18 (
A/B
/C)
23F
12F 13
17F 3 34
Nº
de c
asos
Sorotipos vacinais // Sorotipos não vacinais
Sorotipos não vacinais
Sorotipos vacinais
44
Tabela 3: Características gerais dos casos de meningite pneumocócica dentre os quais todos os testes convencionais de diagnóstico laboratorial foram negativos (N=7/59).
No. Caso Idade
em Anos
Procedência Sexo Nível de Proteína
Nível de
Glicose
Celularidae Aspecto liquórico
Evolução final
Uso Prévio de Atb
Diagnóstico final
11.0346 13 Não M 300 20 10000 Turvo Curado sim MBENE
13.0338 9 Sim F 200 55 7200 Turvo Curado não MBENE
13.0580 63 Sim F 400 35 10000 Turvo Curado sim MEND
14.0657 2 Não M 300 25 4500 Turvo Curado não MBENE
15.0375 24 Não F 380 49 2200 Turvo Curado sim MBENE
15.0671 6 Não F 120 30 3200 opalescente Curado não MBENE
15.0746 3 Sim F 32 71 500 opalescente Curado não MBENE MBENE = Meningite Bacteriana de etiologia não especificada MEND= Meningite de etiologia não definida
45
Tabela 4: Perfil genotípico de Streptococcus pneumoniae caracterizados diretamente de amostras de LCR cultura negativa, provenientes de casos de meningite pneumocócica.
Amostras Sorotipo Perfil Alélico MLST
aroE gdh gki recP spi xpt ddl 11,0047 ND - 8 2 4 - 1 1
11,005 4 5 5 4 5 - - 7
11,0071 34 - - - - - - -
11,0163* ND 11 16 4 1 - 1 1 4913
11,0192* 6A/B/C 12 62 1 2 - 102 14 756
11,0264 6A/B/C 13 5 9 50 - - 14
11,0346 13 - - - - 7 - -
11,0347 6A/B/C - - - - - - -
11,0358* 14 2 8 2 4 - 1 1 66 / 785 / 7038
12,0074 3 2 - 9 47 - 17
12,0275 34 - - - - 9 - -
12,0349 23F - - - - - - -
13,0338 3 - - - - - - -
13,058 ND
14,014 34 - - - - - - -
14,0462 6A/B/C - - 1 2 - 1 -
14,0657 14 1 - - 5 5 3 8
14,0713 14 - - - - - - -
15,0359 6A/B/C 7 47 1 37 6 1 14 750
15,0375 6A/B/C - - - - - - -
15,0519 17F 1 16 71 1 6 17 6 6403
15,0532 18 13 10 2 16 1 26 1 2814
15,0671 23F - - - 6 - - -
15,0746 12F - - 14 - - - 29 * A não amplificação de todos os genes que compõem o perfil alélico não permitiu chegar a um ST, de forma que os ST’s reportados foram Single Locus Variante.
46
7 DISCUSSÃO
Neste trabalho foi apresentada a caracterização molecular quanto ao sorotipo e ao
genótipo de Streptococcus pneumoniae diretamente de fluidos corpóreos de pacientes com
suspeita de meningite bacteriana, bem como o diagnóstico molecular frente a outras técnicas
laboratoriais diagnósticas convencionais, em cinco anos de vigilância, entre abril de 2006 a
dezembro de 2010.
A proporção de casos confirmados por cultura neste estudo (68 casos - 74%) é
concordante com os dados encontrados em outras cidades do país, conforme dados do
SINAM NET – Ministério da Saúde. Dentre os grupos diagnosticados com cultura positiva ou
cultura negativa, não houve diferenças significativas na distribuição por gênero, embora tenha
havido predominância do sexo masculino em ambos os grupos com os percentuais de 69% e
62,5% respectivamente, e que estes dados sejam concordantes com dados dos EUA
(THIGPEN et al., 2011), onde o sexo masculino foi acometido em aproximadamente 50% dos
casos de meningite pneumocócica em adultos, e aproximadamente 55% dos pacientes
pediátricos, também com dados da Grécia, onde 57,2% dos casos acometeram o sexo
masculino (KARANIKA et al., 2009).
A distribuição dos casos por faixas etárias entre os grupos diagnosticados com cultura
positiva ou cultura negativa não apresentou diferenças significativas entre si, entretanto
observou-se a formação de dois grupos etários distintos representando a maior incidência da
doença. O primeiro e maior grupo etário era o de indivíduos com idade > 15 anos, cujos
percentuais foram de 54,4% dos casos no grupo cultura positiva e 41,7% no grupo cultura
negativa, de forma que este achado é discordante da maior parte da literatura corrente no
mundo. O fato provavelmente deve-se a uma menor procura por assistência médica diante dos
primeiros sintomas das doenças fonte de infecção por parte deste grupo, o que termina por
permitir a evolução da doença, culminando em uma entidade mais grave como a meningite
pneumocócica. A literatura aponta como o principal grupo etário acometido o de crianças com
idade < 2 anos, sendo então concordante com osnossos achados referentes ao segundo grupo
etário com maior número de casos, responsável por 23,5% dos casos no grupo cultura positiva
e 20,8% dos casos no grupo cultura negativa. Os dados referentes ao segundo maior grupo
etário são concordantes com diversos estudos em diferentes países tais como: EUA
(THIGPEN et al., 2011), França (DUBOS et al, 2007), Grécia (KARANIKA et al., 2009),
47
Ásia (SAHA et al., 2008, 2009) e América Latina (QUADROS, DE, 2009; VALENZUELA
et al., 2009).
Este estudo identificou que no que diz respeito à procedência do paciente que ingressa
no Hospital existe diferença significativa entre os grupos cultura positiva e cultura negativa.
Observou-se que no grupo em que o resultado da cultura foi negativo, um total de 66,7% dos
pacientes vinha do interior do Estado para serem atendidos no Hospital Couto Maia, contra
44% apenas no grupo em que o resultado da cultura foi positivo. Pacientes que vem de
localidades distantes da capital costumam ser medicados, muitas vezes de forma empírica,
para evitar ou retardar o agravo do quadro cínico, o que resultaria numa maior possibilidade
de inviabilização no crescimento das culturas, conforme o demonstrado em estudo na Itália
(RESTI et al., 2009) e no Brasil (SACCHI et al., 2011), este último aponta que o uso de
antibióticos pode aumentar em até 16 vezes a possibilidade de negativação do resultado da
cultura. No entanto, na casuística deste estudo, não houve diferença significativa quanto ao
uso de antibióticos (relatado ou testado) entre os grupos cultura positiva e cultura negativa,
não sendo possível correlacionar com os dados relativos à procedência.
Os antecedentes médicos dos pacientes no que diz respeito a doenças crônicas, tanto do
grupo diagnosticado por cultura positiva (19,1%), quanto do grupo com cultura negativa
(20,8%), embora não tenha sido um dado estatisticamente relevante, corroboram o já descrito
em literatura quanto a doenças como diabetes melitus, asma, doenças cardíacas e pulmonares
crônicas, e o maior risco de doenças pneumocócicas invasivas em quaisquer faixas etárias
(LYNCH; ZHANEL, 2009). Neste estudo, o segundo maior fator de risco foi o alcoolismo,
tendo sido reportado em 11,8% do grupo cultura positiva, e 12,5% do grupo cultura negativa.
Quanto à fonte de infecção da meningite, também não foram encontradas diferenças
significativas entre os grupos, no entanto a infecção das vias aéreas superiores foi a mais
relatada tanto no grupo diagnosticado com cultura positiva (25%), quanto no grupo com
cultura negativa (37,5%).
Não foram observadas diferenças significativas na contagem de leucócitos das amostras
de LCR, bem como na determinação das taxas de Glicorraquia em nenhum dos dois grupos,
entretanto a Proteinorraquia do grupo de casos em que a cultura foi negativa (301,25g/dl) foi
significativamente menor que no grupo de casos onde a cultura foi positiva (398,37g/dl) e
corroboram a literatura quanto ao fato de ser um bom marcador para diferenciar os quadros
entre meningites virais e bacterianas (CARBONNELLE, 2009; BRIVET et al, 2005). O
48
aumento da Proteinorraquia está normalmente relacionado à celularidade, inclusive as
sanguíneas (em casos de punção traumática existem fatores de correção que podem ser
utilizados para uma melhor estimativa) e bacterianas, então uma possível explicação para os
valores elevados no grupo onde a cultura foi positiva pode ser devido a uma maior carga ou
inóculo bacteriano na amostra, que no caso onde a cultura foi negativa eram possivelmente
menores ou foram reduzidos pela possível introdução de antibióticos anteriormente à
internação em unidade médica de referência.
Quanto à detecção dos casos, no grupo onde o resultado da cultura foi positivo,
observou-se que o exame bacterioscópico pela coloração de Gram apresentou um bom
desempenho ao exibir resultado sugestivo de pneumococos em cerca de 98,5% dos casos
(67/68 casos), ao passo em que a aglutinação em látex se mostrou uma importante
ferramenta de suporte diagnóstico na confirmação dos casos onde a cultura foi positiva
corroborando a literatura e seus achados em outros países (CARBONNELLE, 2009;
SCARBOROUGH; THWAITES, 2008), que justificam o bom desempenho destas técnicas
como dependentes da carga do inóculo bacteriano presente na amostra de LCR obtida,
numa relação diretamente proporcional. Entretanto, nos casos onde a cultura apresentou-
se negativa, a técnica de PCR em tempo real foi a única capaz de identificar todos os
casos (24 casos), sendo que em sete destes casos (29,2%), a técnica foi a única capaz de
identificar o patógeno, uma vez que todos os outros testes foram negativos. Uma
observação mais minuciosa destes sete casos levou a constatação de que a técnica de PCR
em tempo real conseguiu exibir positividade para pneumococos nas mais variadas
situações de celularidade (500 – 10.000 células/mm³), valores de Glicorraquia (20 – 71
mg/dl) e Proteinorraquia (32 – 400 mg/dl), e mesmo em pacientes que já haviam utilizado
antibióticos, sendo portanto concordante com o já descrito em literatura mundial corrente
(AZZARI et al., 2008, 2010; RESTI et al., 2009; SACCHI et al., 2011).
Num período pós – vacina se faz necessário acompanhar a composição sorotípica e suas
tendências, no maior número de casos possível. Neste estudo, a utilização da técnica de PCR
em tempo real para a detecção dos casos diretamente das amostras de LCR, foi possível a
identificação de 92 casos (92/ 1141), cerca de 8%. O não uso da técnica de PCR em tempo
real, baseando-se apenas no resultado da cultura, reduziria a identificação para apenas 68
(68/1141) casos (6%). Observa-se então, que a técnica utilizada para a detecção permitiu um
ganho de 2% em termos de diagnóstico dos casos, detectando-os mesmo quando a cultura não
pôde ser útil. E vale a pena ressaltar que este ganho só não pôde ser maior, porque está
49
relacionado ao número de amostras de LCR que foi possível armazenar (1141 amostras / 4448
casos), de forma que, se fossem captadas mais amostras dentro do número total de casos
identificados pela Vigilância no Hospital Couto Maia, provavelmente haveria um maior
número de casos positivos para S. pneumoniae, mas que por não terem sido investigados por
técnicas mais sensíveis, foram concluídos como casos de meningite bacteriana de etiologia
não esclarecida ou indeterminada.
Da mesma forma, a utilização da técnica de dedução capsular por Multiplex PCR, tão
extensamente utilizada em diversos estudos, aplicada diretamente em isolados (DIAS et al.,
2007; MORAIS et al., 2007; SAHA et al., 2009), foi utilizada neste estudo para os 68 casos
onde a cultura foi positiva e conforme visto na figura 2, houve um predomínio dos sorotipos
vacinais na composição sorotípica destes casos. Neste estudo a adaptação e utilização desta
técnica, aplicada diretamente em espécimes clínicos (amostras de LCR), possibilitando
ganhos também na identificação ou dedução dos sorotipos capsulares de mais 21 casos, onde
o resultado da cultura foi negativo (24 casos), equivalendo a cerca de 23% de ganho em
resultados em relação ao número total de casos positivos para S. pneumoniae (92 casos), e
sendo portanto concordante com o já afirmado em literatura, sobre a importância do uso de
ferramentas moleculares para a identificação do perfil sorotípico em casos onde o resultado da
cultura é negativo, partindo-se diretamente dos espécimes clínicos (AZZARI et al., 2008,
2010; SAHA et al., 2008).
Quanto à distribuição sorotípica dos casos onde o resultado da cultura foi negativo,
observou-se através das figuras 2 e 3, que houve uma maior distribuição de sorotipos vacinais,
cerca de 66%. Entretanto, observou-se que dentre estes casos, oito (33%) foram identificados
como não vacinais, e somando-se a estes aqueles três casos onde não foi possível determinar o
sorotipo, mas que são, portanto também não vacinais, o percentual passa para cerca de 46%
(11 casos) de sorotipos não vacinais como o 12F, 13, 17F, 3 e 34. O fato de este estudo ter
trabalhado com casos onde a detecção e dedução dos sorotipos capsulares terem sido feitos
diretamente do espécime clínico, e de que os seus resultados poderiam ser maiores caso mais
amostras tivessem sido armazenadas e investigadas, permite a observação de que é
preocupante o número de casos provocados por sorotipos não vacinais, especialmente
considerando que uma vacina foi recentemente implementada, e que muito embora seja
estimada uma cobertura de cerca de 75,7% para a cidade de Salvador e região metropolitana
(MENEZES et al., 2011) estes dados baseiam-se apenas naqueles que foram identificados por
cultura. É portanto preocupante, a possibilidade de haver desde já um alto percentual de casos
50
sendo provocados por sorotipos não vacinais, e que não foram levados em consideração
quando na escolha da vacina implementada pelo fato de não terem sido investigados.
O uso da técnica de MLST diretamente em amostras de LCR, como foi utilizado neste
estudo, constitui uma prática pouco explorada, não havendo outras citações na literatura
corrente, muito embora um protocolo já tivesse sido descrito (ENRIGHT, M C et al., 2000).
Dentre as 24 amostras submetidas à técnica de MLST, apenas de três foi possível a obtenção
do perfil alélico completo (ST), e outras três tiveram o ST deduzido como Single Locus
Variante (falta de um dos alelos) do alelo spi. O baixo rendimento em termos de resultados
para o uso da técnica de MLST diretamente em espécimes clínicos já havia sido relatado (XU
et al., 2011), e acredita-se que se deva a uma degradação prévia do DNA no espécime clínico,
impossibilitando a amplificação dos sete genes de estudo. Uma outra possível causa para o
baixo rendimento, pode decorrer do fato de que os primeiros protocolos desenvolvidos para a
técnica de MLST em espécimes clínicos utilizavam a técnica de PCR do tipo Nested, para a
amplificação dos genes, o que elevava a sensibilidade da técnica, permitindo a amplificação
mesmo com um número muito reduzido de cópias de DNA (ENRIGHT, M C et al., 2000).
51
8 CONCLUSÕES
Segundo resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:
1. A técnica de PCR em tempo real pode ser uma importante aliada na detecção e
diagnóstico dos casos de meningite pneumocócica nos casos em que a cultura
bacteriológica apresenta-se negativa, tanto em quadros iniciais de infecção e quanto
nos casos em que o paciente fez uso de antimicrobianos previamente à admissão na
unidade de referência.
2. A técnica de Multiplex PCR para sorotipagem de S. pneumoniae adaptada ao uso
direto em espécimes clínicos permitiu um ganho de cerca de 23% em resultados, que
não poderiam ser obtidos sem o uso da referida técnica, sendo portanto importante
em estudos de vigilância e observação da composição sorotípica local e suas
tendências.
3. A técnica de MLST, apesar de importante para a obtenção de dados do perfil
genotípico de S. pneumoniae nos casos onde a cultura apresentou resultado negativo,
apresentou um baixo rendimento quando aplicada diretamente a espécimes clínicos
de acordo com o protocolo utilizado neste estudo.
4. Dos 24 casos onde o resultado da cultura foi negativo, 87,5% tiveram o sorotipo
capsular deduzido, sendo oito (33,3%) não vacinais e três (12,5%) de sorotipo não
definido, mas provavelmente não vacinais, elevando o percentual de sorotipos não
vacinais para cerca de 46%.
5. Uma vez que apenas 25,7% do total de casos de meningite bacteriana identificados
no hospital tiveram amostra de LCR armazenadas e analisadas neste estudo, o
percentual alto de sorotipos não vacinais (46%) entre os casos cultura negativa pode
estar sendo subestimado.
52
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APÊNDICES
APÊNDICE I - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Página 1 de 2
Hospital Couto Maia/Secretaria da Saúde do Estado da Bahia
Título do Projeto: Meningite Bacteriana em Salvador, Brasil. Paciente: ____________________________ No. de estudo:____________ Para ser lido a todos os pacientes adultos e responsáveis legais dos pacientes menores:
As informações que se seguem descrevem o estudo de pesquisa e o seu papel como participante. O entrevistador responderá a quaisquer perguntas que você tiver sobre este questionário ou sobre o estudo de pesquisa. Por favor, ouça com atenção e não hesite em fazer qualquer pergunta sobre a informação que está sendo fornecida.
Objetivo do Estudo de Pesquisa: Você/Sua criança está sendo convidado a participar de um estudo de pesquisas que estamos
realizando no Hospital Couto Maia sobre meningites bacterianas. Nos convidamos você a participar deste estudo porque os seus sintomas e os seus resultados de exames laboratoriais indicam que você tem esta doença. A meningite é uma infecção dos tecidos e do fluido que cercam o cérebro. Para identificar o agente causador da doença, seu médico fará alguns exames de rotina e uma parte de sua amostra de líquor será testada para um novo método de diagnóstico. Você não sofrerá nenhum desconforto e não haverá nenhum risco para sua saúde. Nenhuma amostra será coletada só para o estudo, as amostras serão coletadas somente se o médico solicitar, e o estudo não vai interferir no seu tratamento. O objetivo de nosso estudo é conhecer mais esta doença na nossa população, estudando a forma como elas são transmitidas; quais são os fatores que fazem com que algumas pessoas apresentem um quadro mais grave que outras, quais as melhores formas de tratamento, e os testes de diagnóstico. Obtendo estas informações teremos condições, no futuro de implantar medidas para diminuir o número de pessoas com meningite.
Procedimento: Se você voluntariamente decidir participar deste estudo de pesquisas após ter lido este
formulário de consentimento, o investigador lhe fará perguntas relacionadas ao local onde você mora, sua ocupação (trabalho) e sua história médica. Irá ainda examiná-lo (a) buscando sinais da doença e lerá seu prontuário médico para obter os resultados de seus exames no hospital. O investigador, a partir de então, irá lhe fazer uma breve visita diária no período em que você estiver no hospital, lhe fará perguntas relativas ao seu estado de saúde e fará em pequeno exame. Não há nenhum risco na participação desse estudo de pesquisas.
Sigilo: As respostas feitas durante a entrevista, as informações do seu prontuário médico ou dos seus
exames serão confidenciais e apenas você e o investigador terão acesso a elas. Você não será identificado (a) em qualquer relatório ou publicação resultante deste estudo de pesquisas.
Participação voluntária: Sua participação neste estudo de pesquisas é voluntária. Você pode se recusar a participar ou
pode desistir de participar em qualquer momento do estudo de pesquisas se você quiser. Você não precisa responder a qualquer pergunta durante a entrevista ou avaliação diária. Sua recusa em participar no estudo de pesquisas ou em parte do mesmo, ou sua decisão de interromper sua participação, não afetará seu cuidado futuro de nenhuma forma, nem prejudicará suas relações com o
58
Hospital Couto Maia no presente ou no futuro. Uma cópia deste formulário lhe será dada para você. Você não será responsável por nenhuma despesa associada a este estudo de pesquisas, nem receberá compensação financeira.
Benefícios: Não haverá de imediato benefício para o paciente. Mas, indiretamente os
participantes estarão contribuindo com informações muito importantes no estudo das meningites que poderão melhorar o controle da doença e aumentar o conhecimento científico.
Com quem contatar: Se você tiver qualquer pergunta futura sobre sua participação neste estudo, ou sobre seus
direitos como participante desta pesquisa, por favor, entre em contato com a Dra. Miralba Oliveira Silva pelo telefone: (071) 312-0084 ou diretamente no Hospital Couto Maia cujo endereço é Rua São Francisco, s/n, Monte Serrat, no. 40, CEP 40.425-001, Salvador, Bahia. Caso você tenha alguma pergunta no que se refere a você como indivíduo pesquisado, por favor, entre em contato com a Dra. Marilda Gonçalves, Presidente da Comissão de Ética do Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz, Rua Waldemar Falcão 121, Brotas, Salvador, telefone (71) 3356 4320.
Consentimento: Pelo presente Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, declaro que autorizo a minha
participação neste projeto de pesquisa, pois fui informado, de forma clara e detalhada, livre de qualquer forma de constrangimento e coerção, dos objetivos, da justificativa, dos riscos, desconfortos e benefícios todos acima descritos.
__________________________________ ________________ ______________ Assinatura do paciente (Incluindo Menores) Data Hora Impressão datiloscopia do paciente Eu ouvi e entendi este formulário de consentimento. Minhas dúvidas foram respondidas. Eu
voluntariamente consinto que o paciente do qual eu sou pai ou mãe ou responsável legal participe deste estudo de pesquisas.
__________________________________ ________________ ______________ Assinatura do pai ou mãe ou responsável legal Data hora Impressão datiloscopia do pai ou mãe ou guardião legal _________________________________ ________________ ______________ Assinatura do Investigador Data Hora __________________________________ ________________ ______________ Assinatura da testemunha Data Hora
59
Hospital Couto Maia/Secretaria da Saúde do Estado da Bahia Assentimento para Menores na Investigação Clínica: Pág. 1
Título do Projeto: Meningite Bacteriana em Salvador, Brasil. Paciente: ___________________________________________No de Estudo:_______
Para ser lido a todos os pacientes menores de idade: As informações que seguem serão para um estudo que estamos realizando. Será feita uma entrevista na qual você deverá responder algumas perguntas. Por favor, escute cuidadosamente e pergunte sobre qualquer dúvida que você tenha.
Nós estamos pedindo para você nos ajudar porque você tem uma infecção. Muitos
sinais desta infecção são similares à doença causada por uma infecção nos tecidos que circundam o cérebro que se chama meningite. Nós gostaríamos de conseguir o máximo de informações possíveis para determinar a melhor maneira que podemos tratar e prevenir essa doença. Futuramente, suas informações ajudarão outras pessoas com esse problema.
Se você concordar em ajudar, nós faremos a você e a seus pais algumas perguntas.
Nós só iremos te fazer algumas perguntas se você e seus pais concordarem. Consentimento: Eu ouvi e entendi este termo de consentimento. Minhas perguntas
foram respondidas. Eu , voluntariamente, concordo em participar: __________________________________ ________________ ______________
Assinatura do Paciente Menores de Idade Data Hora Impressão Digital do Paciente __________________________________ ________________ ______________ Assinatura da Testemunha Data Hora _________________________________ ________________ ______________ Assinatura do Investigador Data Hora
60
APÊNDICE II - QUESTIONÁRIOS DA PESQUISA
Questionário M01IND01
Projeto: Meningite Bacteriana
Meningite Bacteriana em Salvador – Brasil
Questionário de Dados Pessoais Etiqueta
1ª Digitação
D
GIND
D
DGIND
2ª Digitação
D
G2IND
DD
G2IND
PARA PROTEGER A CONFIDENCIALIDADE DO PACIENTE, ESTE QUESTIONÁRIO DEVERÁ SER DESTACADO PELO GESTOR DO PROJETO OU INVESTIGADOR PRINCIPAL DEPOIS DA ENTREVISTA E ANTES QUE OS DADOS SEJAM DIGITADOS. TODOS OS QUESTIONARIO DO MESMO PACIENTE DEVEM TER NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO UNICO (MB)
Data da Entrevista: DEIND ____/____/____
Iniciais do Entrevistador: EIND
|__|__|__|__| I. IDENTIFICAÇÃO:
2.1 Nome: |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
2.2 Nº de Registro ou PA:
Obs. 99 999 (não sabe PA) e 88 888 (outro hospital)
IDR |__|__|__|__|__|
2.3 Data de Admissão no HCM: DA ____/____/____
2.4 O paciente foi de outro hospital?
Sim: 1 Não: 0
OUTROH
|__| Se sim, Qual (QOUTROH):
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| Obs. Se sim e não sabe 99 e se não 88
2.5 Data de Nascimento:
NASC ____/____/____
1.1 N° de Identificação MB:
MB |__|__|__|__|__|__|
1.2 Sim: 1 Não: 0 Termo de consentimento: CONS |__|
61
II. ENDEREÇO: 3.1 Rua / N° (END):
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| Obs. Não sabe 99 (PA) e não se aplica 88 (outro hospital)
3.2 Telefone (n° e nome de contato): Obs. Não sabe 9999-9999 (PA) e não se aplica 8888-8888 (outro hospital)
TEL |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
3.3 Ponto de Referencia (REF): |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| Obs. Não sabe 99 (PA) e não se aplica 88 (outro hospital)
3.4 Bairro (BAI): |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| Obs. Não sabe 99 (PA) e não se aplica 88 (outro hospital)
3.5 Cidade (CID): |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| Obs. Não sabe 99 (PA) e não se aplica 88 (outro hospital)
3.6 Mora em Pau da Lima/São Marcos Sim 1 Não 0 Não se aplica 8 Não sabe 9
Obs: Não sabe 9 (PA) e não se aplica 8 (outro hospital)
PLM |__|
III. USO PRÉVIO DE ANTIBIÓTICOS: Obs. Se a pergunta 3.1 for não sabe (9) ou não (0), preencher as outras perguntas com não se aplica (8 ou 88, no caso de resposta escrita). 3.1
O paciente usou antibióticos no último mês: (Resposta do Paciente)
Sim 1 Não 0 Não sabe 9
AM3 |__|
3.2
Se usou, por quantos dias o paciente fez uso?
TEMPDIAS2 |__|__|
3.3 Se usou, qual a data da última dose? DAANT2 ____/____/____
3.4 Qual a via de administração?
Oral 1 Injetável 0 Não se aplica 8 Não sabe 9
ADM2 |__|
3.5 Se fez uso de antibióticos, onde adquiriu?
Hospital 1 Posto de Saúde 2 Consultório médico 3 Farmácia 4 Família 5 Outros 6 NSA 8
LAM2 |__|
3.6 Qual(is) antibióticos que o paciente usou no último mês (QA2): |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
3.7
Paciente tomou bactrim ou similares nos últimos 6 meses: Sim 1 Não 0 Não se aplica 8 Não sabe 9
BCT2 |__|
3.8 Qual a classe do antibiótico?
Penicilinas 1 SULFAS 2 Cefalosporinas 3 Quinolonas 4 Macrolídeos 5 Outro _________ 6 NSA 8
QANT2 |__|
62
Questionário M01EPI01 Projeto: Meningite Bacteriana
Parte: 1 de 2 N° de MB :____________
Meningite Bacteriana em Salvador – Brasil
Questionário Epidemiológico – preenchido para todos os pctes
Etiqueta
1ª Digitação DGIND DDGIND
2ª Digitação DG2IND DDG2IND
Data do Preenchimento: DEEPI ____/____/____
Iniciais do Entrevistador: EEPI |__|__|__|__|
I. IDENTIFICAÇÃO:
Obs. Para Sexo, grupo racial e procedência, preencher com 8 (não se aplica ) para paciente de outro
hospital e 9 (não sabe) para Pronto Atendimento.
II. DADOS DO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL: 2.1 Aspecto do líquor:
Límpido 1 Opalescente 2 Purulento 3
Hemorrágico 4 Levemente hemorrágico 5
Não sabe 9 Xantocrômico 7 Outro 6
LIQASP
|__|
2.2 Dados liquóricos prejudicados: Sim 1 Não 0 PREJ |__|
2.3 Contagem de leucócitos: (88888=não se aplica) LLEU
|__|__|__|__|__|
2.4 Presença de hemácias:
Sim 1 Não 0 Não se aplica 8
LHEM
|__|
2.5 Predominância de PMNs (>50%):
Sim 1 Não 0 Não se aplica 8
LPMN
|__|
2.6 Glicose: (888 =não sabe) GLI |__|__|__|
2.7 Proteínas: (888 =não sabe) PROT |__|__|__|
1.1 Data de admissão no HCM: DA ____/____/____
1.2 N° de registro no HCM: Obs. 99 999 (não sabe PA) e 88 888 (outro hospital)
IDR |__|__|__|__|__|
1.3 Idade em anos (se <1ano, coloque 0): Obs. 99 (não sabe PA) e 88 (outro hospital). Para RN preencher 0 para idade em anos, 0 para idade em meses e 99 para idade em dias.
ANO |__|__|
Se <2 anos, idade do paciente em meses: MÊS |__|__|
Se <1 mês, idade do paciente em dias: DIA |__|__|
1.4 Sexo: Masculino 1 Feminino 0 Não sabe 9
SX |__|
1.5 Grupo Racial: Branco 1 Mulato 0 Negro 3
RACE |__|
1.6 Procedëncia: Salvador 1 Interior 0 Não sabe 9
SAL |__|
63
2,8 Resultado da Coloração pelo Gram:
Não observou bactérias 0 Observou bactérias 1
Não realizado 8 Não sabe 9
DGC
|__|
2.9 Exame Direto pelo Gram:
não foram observadas bactérias 0 cocos Gram positivos em cadeia 1 cocos Gram positivos aglomerados 2 cocos Gram positivos 3 diplococos Gram positivos 4 diplococos Gram negativos 5 bacilos Gram negativos tipo Haemophilus 6 bacilos Gram negativos 7 bacilos Gram positivos 8 outro _______________ 10 não sabe 99
GRAM
|__|__|
2.9.1 Cultura do Líquor:
Negativo após 48h 0 N. meningitidis 1 S. pneumoniae 2 Haemophilus sp. 3 S. agalactiae 4 Streptococcus sp. 5 Staphylococcus sp. 6 E. coli 7 L. monocytogenes 10 Salmonella sp. 11 Shigella sp. 12 Outro ___________ 13 não sabe 99 não se aplica 88
CULT
|__|__|
2.9.2 Resultado da Hemocultura:
Negativa 0 Positiva 1 Não realizado 8 Não sabe 9
HP
|__|
2.9.3 Se Hemocultura foi positiva, bactéria identificada:
Negativo após 48h 0 N. meningitidis 1 S. pneumoniae 2 Haemophilus sp. 3 S. agalactiae 4 Streptococcus sp. 5 Staphylococcus sp. 6 E. coli 7 L. monocytogenes 10 Salmonella sp. 11 Shigella sp. 12 Outro ___________ 13 não sabe 99 não se aplica 88
HEMO
|__|__|
2.9.4 Aglutinação com Látex:
Negativo 0 N. meningitidis 1 S. pneumoniae 2 H. influenzae 3 Streptococcos do grupo B 4 E.coli 5 Não sabe 9 Não realizada 8
LATEX
|__|
IV. INCLUSÃO EM OUTROS ESTUDOS: 4.1 Participa de outro estudo do grupo?
Sim : 1 Não: 0
ESTUDO1 |__|
4.2 Participa do estudo de pneumococos? Sim : 1 Não 0
SPN1 |__|
4.3 Nº no estudo de pneumococos? SP1 |__|__|__|__|
4.4. Participa do estudo de meningococos? Sim : 1 Não: 0
SNM1 |__|
4.5 Nº no estudo de Meningiococos? NM1 |__|__|__|__|
4.6 Participa do estudo de Haemofilos? Sim : 1 Não: 0
SHI1 |__|
4.7 Nº no estudo de Haemofilos? HI1 |__|__|__|__|
4.8 Participa no estudo de Outras Bactérias? Sim : 1 Não: 0
SBAC1 |__|
64
4.9 Nº no estudo de outras bactérias? NOBAC1 |__|__|__|__|
4.9.1 O liquor foi armazenado? Sim : 1 Não: 0
ALCR |__|
V. DETECÇÃO DE ANTIBIÓTICOS NO LCR: 5.1 Detecção de antibiótico no LCR?
Não 0 Sim 1 Não realizado 2 Não se aplica 8 Não sabe 9
LATB
|__|
5.2 Se sim, qual o tam do halo em mm?( 88=Não se aplica, 99= Não sabe) LHALO
|__|
VI. RESULTADO RT-PCR: 6.1 Foi feito RT-PCR
Sim : 1 Não : 0
RTPCR |__|
6.2 Qual foi o resultado?
S.pneumoniae 1 N.meningitidis 2 H.influenzae 3 Outro 4 Não se aplica 8 Não Sabe 9
RRTPCR
|__|
6.3 Qual o CT? (99,99=inconclusivo) |_||_|,|_|_|
QCT |__|__|, |__|__|
6.4
Se for N.meningitidis, qual o sorogrupo? A 1 B 2 C 3 Y 4 W135 5 Outro 6 Não se aplica 8 Não sabe 9
SORTPCR
|__|
65
Questionário M01EPI01
Projeto: Meningite Bacteriana
Parte: 2 de 2
N° de MB :___________
Meningite Bacteriana em Salvador – Brasil Etiqueta
1ª Digitação
DGEPI2 DDGEPI2
2ª Digitação
DG2EPI2 DDG2EPI2
Data de Revisão: DEEPI2 ____/____/____
Iniciais do Entrevistador: EEPI2 |__|__|__|__|
Data de admissão no HCM:
N° de registro no HCM:
III. HISTÓRIA CLÍNICA:
3.1
Fonte de Infecção da Meningite: Pneumonia 1 Otite Média 2 Sinusite 3 Sepse ou Bacteremia 4 Endocardite 5 Abscesso 6 T.C. E. ou fratura craniana 7 I.V.AS 8 Não identificado 0 Não Sabe 9 Outro_____ 10 Não se aplica 88
FIN |__|
Se souber a fonte, qual foi a evidencia? (FINEVID) |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
Obs. Não sabe colocar 99 (PA); não se aplica colocar 88 (outro hospital)
3.2 Antecedentes Médicos: 1=Sim/0=Não/8=NSA/9=Não sabe a) Tem doença crônica (CI): |__| Qual? (QCI) |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| b) Alcoolismo (AL) |__| c) Meningite anterior (MEN) |__| d) Imunodeficiência (IMD) |__| Qual?(QIMD)|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| Obs. Quando preencher as sentenças com 8 (outro hospital), qual deverá ser 88 Quando preencher as sentenças com 9 (pronto atendimento), qual deverá ser 99
3.3 Foi hospitalizado no último mês: Sim 1 Não 0 Não sabe 9
Se sim, onde?(LPHP)
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
PHP
|__|
66
IV. USO PRÉVIO DE ANTIBIÓTICOS: Obs. Se a pergunta 4.1 forem não sabe (9) ou não (0), preencher as outras perguntas com não se aplica
(8 ou 88 no caso de resposta escrita).
4.1 O paciente usou antibióticos no último mês: (Prontuário) Sim 1 Não 0 Não sabe 9
AM |__|
4.2 Se usou, por quantos dias o paciente fez uso? TEMPDIAS |__|__|
4.3 Se usou, qual a data da última dose? DAANT ____/____/____
4.4 Se fez uso de antibióticos, onde adquiriu? Hospital 1 Posto de Saúde 2 Consultório médico 3 Farmácia 4 Família 5 Outros 6 NSA 8
LAM |__|
4.5 Qual(is) antibióticos que o paciente usou no último mês (QA): |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
4.6
Paciente tomou bactrim ou similares nos últimos 6 meses: Sim 1 Não 0 Não se aplica 8 Não sabe 9
BCT |__|
4.7 Qual a classe do antibiótico? Penicilinas 1 SULFAS 2 Cefalosporinas 3 Quinolonas 4 Macrolídeos 5 Outro _________ 6 NSA 8
QANT |__|
V. QUADRO CLÍNICO NA ADMISSÃO: 5.1 No de dias com sintomas:
Obs. Não sabe preencher 99 (PA); não se aplica preencher 88 (outro hospital) QCD |__|__|
5.2 Quadro neurológico na admissão:
normal 1 alterado 2 coma 3 não sabe 9
NSA 8
PCO |__|
Obs. Paciente de outro hospital preencher o quadro neurológico com 8 (não se aplica)
VI. ALTA FINAL: (999=não sabe, 888=não se aplica) 6.1 Tipo de alta:
Curado 1 Transferido 2 Outro diagnóstico 3 Óbito
NSA 8
Obs. Paciente de outro hospital preencher com 8 ( não se aplica)
FTAL |__|
Data da alta: FDAL ____/____/___
6.2 Quantos dias foi internado no HCMaia: Obs. Não sabe preencher 999 (PA); não se aplica preencher 888 (outro hospital)
FDI |__|__|__|
6.3
Quantos dias foi internado na UTI do HCMaia: Obs. Não sabe preencher 999 (PA); não se aplica preencher 888 (outro hospital)
FUTI |__|__|__|
.4 Diagnóstico Final:
Obs. Não sabe preencher 99 (PA); não se aplica preencher 88 (outro hospital) DGF
|__|__|
67
APÊNDICE III - LISTA DE PRIMERS UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS
68
69
70
APÊNDICE IV - AUTORIZAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
![[Livro] Fausto Goethe](https://static.fdocumentos.com/doc/165x107/577cd31d1a28ab9e7896ba14/livro-fausto-goethe.jpg)
