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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DO

ÓLEO ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE EM LINHAGENS

RESISTENTES DE STAPHILOCOCCUS AUREUS.

ISIS CAROLINE DA SILVA CIRINO

ORIENTADOR: JOSÉ PINTO DE SIQUEIRA JÚNIOR

JOÃO PESSOA – 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR

COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

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COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE EM LINHAGENS RESISTENTES DE

STAPHILOCOCCUS AUREUS.

ISIS CAROLINE DA SILVA CIRINO

ORIENTADOR: JOSÉ PINTO DE SIQUEIRA JÚNIOR

Monografia apresentada à Coordenação

do curso de Ciências Biológicas do

Centro de Ciências Exatas e da Natureza

da Universidade Federal da Paraíba

como requisito parcial à obtenção do

grau de BACHAREL EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS.

João Pessoa - 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR

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ISIS CAROLINE DA SILVA CIRINO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE EM LINHAGENS RESISTENTES DE

STAPHILOCOCCUS AUREUS.

MONOGRAFIA APROVADA EM __/__/___.

Banca Examinadora

__________________________________________

Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior

Orientador

__________________________________________

Profa. Dr.a Hilzeth de Luna Freire Pessôa

Examinador

__________________________________________

Profa. M.Sc Cybelle Pereira de Oliveira

Examinador

__________________________________________

Profa. M.Sc Vivyanne dos Santos Falcão Silva

Examinador

__________________________________________

Prof. M.Sc Vicente Carlos de Oliveira Costa

Examinador

4

DEDICATÓRIA

Dedico estas linhas, tão tortuosamente

escritas, a todas as pessoas que amo e que

fazem parte da minha vida, especialmente

aos meus pais sem os quais eu nada seria...

5

AGRADECIMENTOS

A Deus, aos meus pais e às minhas irmãs, por estarem sempre presentes em minha vida.

Ao Professor José Pinto de Siqueira Júnior, pela oportunidade de aprendizado, paciência

e dedicação durante toda a trajetória da construção deste projeto.

Aos amigos do LGM e agregados, em especial, Vivy, Sú, Rapha, Antony e Guga pelo

carinho, amizade e companheirismo dentro e fora do laboratório.

A Seu Bosco e Dona Severina pelo apoio na realização dos experimentos e pela

companhia no café da manhã de todos os dias.

À “Melhor Turma de Todos os Tempos da última Semana” pelos momentos

maravilhosos vividos durante os anos de graduação.

Às minhas queridas amigas Ana, Clara, Cláudia, Deby, Gi, Helô e Lia pela amizade e

por aguentarem toda minha dramaticidade.

Aos meus amigos João Neto e Vlad pelo carinho, cuidado, amizade e paciência para

sobreviver às minhas crises.

Aos companheiros de mestrado Derek, Rachel e Layanne pela ajuda durante a

elaboração deste projeto.

Ao CNPq pelo incentivo financeiro.

E por fim, a todos aqueles que de forma direta ou indireta, contribuíram para a

realização deste trabalho.

6

RESUMO

A resistência bacteriana a drogas pode ser ocasionada por diferentes mecanismos.

Dentre esses, podemos destacar as chamadas Bombas de efluxo as quais são partes

integrantes da membrana plasmática. Na tentativa de encontrar uma solução para esse

problema, os produtos de origem vegetal (extratos, óleos essenciais e fitoconstituintes)

surgem como uma rica fonte de pesquisa na busca de potenciais “moduladores da

resistência à droga”, ou seja, drogas que aumentam a atividade de certos antibióticos ou

mesmo revertem à resistência bacteriana. Entretanto, poucos trabalhos relatam o efeito

potencializador dos óleos essenciais quando combinados com drogas antimicrobianas

clássicas; mais escassos ainda são trabalhos avaliando os mesmos como moduladores de

resistência a drogas por inibição de bombas de efluxo. Neste trabalho, avaliamos como

modificadores da atividade antibiótica em linhagens de Staphylococcus aureus -

portadoras das bombas de efluxo - o óleo essencial de Origanum vulgare (OEOV), seu

constituinte majoritário, o Carvacrol, e o isômero deste último, o Timol. Como

resultado, observou-se que os produtos naturais avaliados apresentaram uma

significativa atividade antibacteriana e podem atuar como modificadores da atividade

antibiótica ao agirem como inibidores de bomba de efluxo na linhagem IS-58, ao

reduzirem a CIM da Tetraciclina em 4 vezes (64μg/mL para 16μg/mL) quando em

combinação com OEOV e em 2 vezes (64μg/mL para 32 μg/mL) quando combinados

com o Carvacrol e Timol. Não foi observada inibição e/ou redução da CIM ao serem

utilizadas a Norfloxacina e Eritromicina. Os resultados indicam que produtos naturais

de origem vegetal são, de fato, potenciais adjuvantes de antibióticos.

Palavras-chave: resistência bacteriana; Staphylococcus aureus; produtos naturais.

7

ABSTRACT

The bacterial resistance to drugs can be developed by different mechanism. Among

these mechanisms, there are efflux bombs which are part of plasmatic membrane. To

find a solution to this problem, products from plants (extracts, essential oils and

phytochemicals) arises as a rich research source for potential modulators of drugs

resistance, that is, drugs that increase antibiotics activity or even change bacterial

resistance. However, few works show the potentiating effect of essential oils when they

are combined with classic antimicrobial drugs. Still scarcer are the drugs modulators by

inhibition of efflux bomb. In this work we evaluated modifiers of antibiotic activity in

Staphylococcus aureus lineage which contains efflux bomb, essential oil from

Origanum vulgare (OEOV), its main constituent Carvacrol e its isomer Tymol. As

result, we observed that natural products evaluated showed significant antibacterial

activity and that they can be modifiers of antibiotic activity, acting as inhibitors of

efflux bomb in IS-58 lineage, reducing Tetraciclin CIM four times (64μg/mL to

16μg/mL) when it is combined with OEOV, and reducing two times (64μg/mL para 32

μg/mL) when Carvacrol and Tymol are together. Inhibition and/or reduction of CIM was

not observed to Norfloxacin and Eritromicin. The results showed that natural products

from plants are, in fact, potential adjuvant of antibiotics.

Key-words: Bacterial resistance, Staphylococcus aureus, natural products.

8

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO.................................................................................................. 9

1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 11

1.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS............................................................. 11

1.2 A UTILIZAÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS E A PROBLEMÁTICA DA

RESISTÊNCIA BACTERIANA..............................................................

11

1.3 BOMBA DE FLUXO................................................................................ 14

1.4 AGENTES MODIFICANTES DE ATIVIDADE ANTIBIÓTICA....... 16

1.5 PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL.................................................. 17

2.5.1 ORIGANUM VULGARE 18

2. OBJETIVO......................................................................................................... 19

2.1 GERAL...................................................................................................... 19

2.2 ESPECÍFICOS.......................................................................................... 19

3. METODOLOGIA.............................................................................................. 20

3.1 LINHAGENS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS................................ 20

3.2 ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO, CARVACROL E TIMOL........ 20

3.3 ANTIBIÓTICOS....................................................................................... 20

3.4

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA

MÍNIMA (CIM) DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORIGANUM

VULGARE, CAVACROL E TIMOL......................................................

21

3.5

DETERMINAÇÃO DAS CIM DOS ANTIBIÓTICOS E NA

PRESENÇA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE,

CAVACROL E TIMOL

21

4. RESULTADOS E DISCUSÔES........................................................................ 22

5. CONCLUSÃO.................................................................................................. 24

REFERÊNCIAS 25

9

INTRODUÇÃO

A introdução dos antibióticos para quimioterapia das infecções bacterianas foi

uma das mais importantes realizações da medicina nos últimos 60 anos. Entretanto, o

aparecimento da resistência bacteriana minou a utilidade terapêutica dos agentes

existentes, criando a necessidade, cada vez maior, da descoberta de novas drogas

antibacterianas (TAVARES, 2000). Para tanto, diversas estratégias emergiram, dentre

elas o aperfeiçoamento de antibióticos existentes por manipulação química e a procura

por novos alvos de drogas.

Uma estratégia alternativa seria um melhor entendimento do modo de ação dos

antibióticos já existentes. Assim, vias bioquímicas ou processos inibidos por antibióticos

já em uso clínico podem, apesar de tudo, conter funções chaves que representam alvos

ainda não explorados para a descoberta de novas drogas.

Uma das soluções para o problema da resistência envolve o desenvolvimento de

análogos aos antibióticos existentes, entretanto, que não sofram ação enzimática, não

reconheçam a bomba de efluxo e nem se liguem ao alvo modificado presente na bactéria

resistente. Essa abordagem clássica em muito contribuiu para contornar o problema da

resistência. No entanto, os resultados muitas vezes tiveram vida curta, já que novas

variantes bacterianas surgiram com mecanismos de resistência que faziam frente aos

novos análogos.

O importante, então, é que as futuras estratégias de pesquisa ultrapassem o

antigo paradigma da “manipulação sintética das classes estruturais já existentes”. A

prioridade deveria ser a identificação de novas estruturas que teriam, ipso facto,

diferentes modos de ação, diminuindo assim a chance de resistência cruzada (CHOPRA

et al., 2002; MCDEVITT, et al., 2002). De qualquer forma, meros antibióticos (stricto

sensu) já não são mais suficientes para conter o fardo das doenças infecciosas

existentes. O conceito de antimicrobiano deve ser expandido (COURVALIN e DAVIES,

2003; PROJAN, 2003).

Dentro dessa perspectiva, estão sendo consideradas abordagens válidas as

pesquisas com as - assim chamadas - “drogas não-antibióticas”, as quais apresentam

alguma influência na fisiologia e na viabilidade de micro-organismos; influência essa

que pode se revelar pela atividade do antibiótico, pela modificação da atividade

antimicrobiana do antibiótico e pela atividade na fisiologia e na patogenicidade do

10

micro-organismo. Incluem-se entre os não-antibióticos: neurolépticos tricíclicos,

antidepressivos, anti-inflamatórios não esteróides, agentes mucolíticos, bloqueadores de

canal de cálcio, inibidores de bomba de próton (MUÑOZ-BELINDO et. al., 2000 e ref.

cit.; AMARAL e KRISTIANSEN, 2000; GUNICS et al., 2000; DASTIDAR et al.,

2000; AMARAL et al., 2000). Pela importância dos biofilmes na resistência bacteriana, a

avaliação de agentes que interfiram com a sua formação/manutenção seria também uma

abordagem expressiva (POOLE, 2002).

Reconhecida a importância e os avanços da Farmacognosia (o estudo dos

produtos naturais biologicamente ativos), a avaliação da atividade antimicrobiana de

produtos naturais de origem vegetal é também uma abordagem de grande interesse

capaz de oferecer relevantes contribuições em vista da biodiversidade.

Bombas de efluxo são partes integrantes da membrana plasmática bacteriana que

têm sido responsabilizadas por diversos casos de resistência bacteriana a antibióticos

(MARQUEZ, 2005; PIDDOCK, 2006). Agentes modificadores de atividade antibiótica

ou moduladores da resistência são compostos que potencializam a atividade de um

antibiótico, sendo que alguns desses agentes agem como inibidores de bombas de efluxo

(IBE). Espécies vegetais constituem uma rica fonte de potentes IBE e diversos

fitoconstituintes já foram identificados como tal (GIBBONS, 2004, STRAVI et al.,

2007).

Frente ao alarmante problema da resistência bacteriana aos antibióticos, tem se

tornado então cada vez mais relevante, a avaliação da atividade antimicrobiana direta,

bem como a atuação de produtos naturais de origem vegetal como “modificadores de

atividade antibiótica/moduladores da resistência a drogas"; enfim, como "adjuvantes de

antibióticos”.

11

1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

1.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Os Staphylococcus aureus são constituintes da família Micrococcaceae e

caracterizam-se por serem cocos Gram-positivos e por apresentarem colônias que

medem entre 1 a 3 mm, além de produzirem as enzimas catalase e coagulase. Devido à

presença de carotenóides podem, também, possuir um pigmento amarelo-dourado. São

bactérias anaeróbicas facultativas que estão dispostas sozinhas, em pares ou formando

grupos irregulares com aspecto de cacho de uva. São constituintes da microbiota normal

da pele e da mucosa humana, tendo a nasofaringe como o principal local de

colonização. Entretanto, uma vez que contaminam a ruptura da pele ou as membranas

da mucosa, poderá infectar qualquer tipo de tecido do corpo, causando lesões no local

(LINDSAY; HOLDEN, 2004).

Por serem citados como os principais patógenos hospitalares e pelo fato de

estarem tornando-se cada vez mais virulentos e resistentes aos antibióticos, S. aureus

destacam-se como os principais disseminadores de doenças infecciosas humanas no

mundo, causando desde lesões superficiais na pele até infecções que ameaçam a vida,

tais como: osteomielite, endocartide, bacteremia e pneumonia (SMITH et al., 2005).

Esses fatores de virulência proporcionam a adesão da bactéria às células e

tecidos do hospedeiro, aquisição de nutrientes e evasão da resposta imune do hospedeiro

(ARVIDSON; TEGMARK, 2001; VELÁZQUEZ-MEZA, 2005).

1.2 A UTILIZAÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS E A PROBLEMÁTICA DA RESISTÊNCIA

BACTERIANA

A inserção dos antibióticos no tratamento das infecções bacterianas

proporcionou uma drástica redução da mortalidade causada por doenças microbianas.

Com o passar dos anos, a facilidade de acesso e o uso exacerbado de tais fármacos,

possibilitou o desenvolvimento, por parte das bactérias, de mecanismos de resistência,

tornando ineficiente a utilização de certas drogas (COHEN; TARTASKY, 1997). Este

12

fenômeno de resistência a diversos antibióticos e agentes quimioterápicos impõe sérias

limitações às opções para o tratamento de infecções bacterianas, representando uma

ameaça para a saúde pública (SILVEIRA, 2006).

Os mecanismos que condicionam a resistência aos antimicrobianos são de

natureza genética e decorrem da existência de genes contidos no microorganismo que

codificam diferentes proteínas, responsáveis por mecanismos bioquímicos que impedem

a ação das drogas. Esta resistência pode ser originada por mutações espontâneas e –

podem ocorrer no microorganismo durante o processo de replicação – resultam em uma

modificação na seqüência de bases no DNA cromossômico. A importação de genes por

meio dos mecanismos de transdução, transformação e conjugação - sendo este último o

mais freqüente - é outra forma de aquisição a resistência sendo esta do tipo transferível.

Os elementos genéticos transferíveis são: plasmídeos, transposons e integrons (SMITH

e JARVIS, 1999) (Figura 1).

Os antibióticos apresentaram, por muitos anos, efeito no tratamento de muitas

infecções causadas por patógenos, como S. aureus (FOURNIER et al., 2000). A

utilização indiscriminada destas drogas, no decorrer dos últimos anos, tem

proporcionado um aumento considerável a resistência bacteriana a diversos fármacos. A

Figura 1. Mecanismos de transferência da resistência

bacteriana (http://textbookofbacteriology.net).

13

habilidade dos S. aureus em adquirir resistência à praticamente todos os antibióticos

utilizados atualmente é motivo de considerável preocupação (GIBBONS, 2004).

Após a difusão do uso clínico da penicilina, na década de 40, foram

encontradas linhagens de estafilococos capazes de produzir uma enzima, a penicilinase,

que tornaria o efeito da penicilina ineficiente. Em um curto período de tempo, ainda no

fim dos anos 50, a espécie Staphylococcus aureus já havia adquirido resistência à

praticamente todos os antibióticos de uso parenteral, dentre eles a eritromicina e a

tetraciclina. Da mesma forma, houve resistência aos antibióticos lançados no mercado

nos anos seguintes, como a meticilina (penicilina semi-sintética resistente as

penicilinases) (CHAMBERS, 1988).

Com o passar dos anos, outras linhas de defesa contra a ameaça do S. aureus

surgiram, como a descoberta do antibiótico vancomicina – um glicopeptídico isolado a

partir do fungo Amycolatopsis orientalis – a qual apresentou um excelente desempenho

frente às linhagens MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Este fato

propiciou, ainda que de forma temporária, certa tranquilidade no combate a esses

microorganismos patogênicos, causando inclusive uma desaceleração nos investimentos

de empresas farmacêuticas em programas de descobrimento e desenvolvimento de

novos agentes antimicrobianos. Porém, a incidência recente de S. aureus resistentes a

vancomicina (VRSA) vem abalando essa tranquilidade (SILVEIRA et al., 2006).

As formas pela quais as bactérias tornam-se resistentes podem ser agrupadas

em quatro grupos distintos: 1) inativação ou modificação da droga, onde enzimas

ocasionam inativação dos antibióticos. Por exemplo, as -lactamases que hidrolisam a

classe dos -lactâmicos; 2) modificação do alvo, decorrente de mutações no gene da

molécula-alvo do antibiótico, impedindo o reconhecimento do mesmo e

consequentemente sua ação. Como observado em fluoroquinolonas, que têm como alvo

duas proteínas da replicação do DNA: topoisomerase e DNA girase; 3)

impermeabilidade da membrana, de maneira que a droga não penetra de forma eficiente

na célula bacteriana. É o caso da resistência a vancomicina; 4) bomba de efluxo, que

promove a eliminação de agentes antimicrobianos para o meio extracelular mais rápido

que a difusão pela membrana plasmática, de maneira que a concentração intracelular do

agente se mantém insuficiente para bloquear as funções celulares (POOLE, 2002;

KÖHLER et al., 1999).

Dentre os grupos citados, os dois primeiros mecanismos são específicos para

um ou mais antibióticos relacionados, já os dois últimos mecanismos estão geralmente

14

associados à resistência múltipla as drogas (MDR – MultiDrug Resistance) (KÖHLER

et al., 1999).

1.3 BOMBA DE EFLUXO

Bombas de efluxo são proteínas transmembrana as quais estão envolvidas no

transporte de substratos tóxicos – incluindo todas as classes de antibióticos clinicamente

relevantes – do interior da célula para o ambiente extracelular, diminuindo a

concentração intracelular do substrato antimicrobiano e tornando a célula menos

susceptível ao agente. Assim, a proteína de efluxo nas bactérias contribui para a

sobrevivência delas no seu habitat (VAN BAMBEKE et al., 2003). Este mecanismo

requer gasto de energia para mover o antibiótico para fora da célula e a expressão deste

tipo de resistência a antibióticos é normalmente regulada pela célula, de modo que só

ocorre quando o antibiótico está presente (GUILFOILE, 2007).

Os genes das proteínas de efluxo e seus produtos estão presentes em todos os

organismos, desde bactérias até fungos e eucariotos superiores (VAN BAMBEKE et al.,

2003). Essas proteínas de efluxo podem ser específicas a um substrato ou transportar

vários compostos estruturalmente não relacionados, como antibióticos de classes

Figura 2. Alguns mecanismos de resistência aos

antibióticos (LEVY, 2004).

15

diferentes. Neste último caso, tais bombas podem estar associadas à MDR (WEBBER;

PIDDOCK, 2003).

De acordo com a energia usada para expulsar o substrato e a similaridade na

seqüência, os mecanismos de efluxo estão agrupados em 5 grandes famílias, são elas:

superfamília MFS (major facilitator), superfamília ABC (ATP binding cassette), família

RND (resistance nodulation division), família MATE (multidrug and toxic compound

extrusion) e família SMR (small multidrug resistance) (KUMAR; SCHWEIZER, 2005;

SÁNCHEZ, 2003). Todos esses sistemas utilizam gradiente de próton (H+/Na

+) como

energia para exportar os substratos, exceto a família ABC, que utiliza hidrólise de ATP

(Figura 3).

Figura 3 . Representação esquemática das principais famílias de MDR transportadores

e em procariotos (McKEEGAN et al., 2004 com alterações)

A maior proteína de efluxo MDR caracterizado em S. aureus é a NorA,

encontrada tanto em linhagens MSSA como MRSA (GIBBONS et al., 2004;

PIDDOCK, 2006a). O gene norA foi o primeiro identificado em S. aureus, em 1990.

Sua proteína (NorA) transporta diversos substratos, tais como: fluorquinolonas

hidrofílicas (norfloxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina e ofloxacina), brometo de

etídio, acriflavina, rodamina, centrimida, cloreto de benzalcônio, brometo de

tetrafenilfosfônio, clorafenicol, além do alcalóide berberina (NEYFAKH et al., 1993;

AESCHIMANN, et al., 1999; KAATZ; SEO, 1995). A desativação da proteína NorA

fornece o aumento da susceptibilidade bacteriana de quatro a oito vezes mais para as

fluorquinolonas (YAMADA et al., 1997; HSIEH et al., 1998). JONES et al. (2000) e

KAATZ et al. (1993) isolaram linhagens clínicas que superexpressam o gene norA.

16

Sabe-se atualmente que as bombas de efluxo têm sido responsabilizadas por

diversos casos de resistência bacteriana a antibióticos (MARQUES, 2005; PIDDOCK,

2006). Desta forma, observa-se uma real necessidade de desenvolvimento de novos

agentes antimicrobianos.

1.4 AGENTES MODIFICANTES DE ATIVIDADE ANTIBIÓTICA

O aparecimento da resistência aos antibióticos tem minado o valor terapêutico

dos agentes existentes, criando a necessidade da descoberta de novos agentes

antibacterianos cada vez mais eficientes. Sejam estes de origem natural, semi-sintética

ou sintética (SILVEIRA et al., 2006; CHOPRA et al., 2002).

Os moduladores da resistência a drogas por inibição de bomba de efluxo,

também chamados modificadores de atividade antibiótica ou adjuvantes de antibióticos,

são considerados como a alternativa mais apropriada das novas terapias antibacterianas

(VAN BAMBEKE et al., 2006; LYNCH, 2006).

Ainda não são perfeitamente compreendidos os mecanismos pelos quais os

inibidores de bomba de efluxo podem atuar, entretanto algumas possibilidades têm sido

propostas. Dentre estas podemos mencionar: a ligação direta a um ou mais sítios de

ligação na proteína de efluxo – de maneira competitiva ou não-competitiva;

interferência no gradiente de próton; apresentação da afinidade pelo substrato

transportado pela bomba – de maneira a formar um complexo que poderá não ser mais

reconhecido pela bomba de efluxo; interação com a membrana plasmática modificando

a conformação da proteína de efluxo ou inibição da expressão do gene de efluxo. Todos

esses mecanismos interferem no efluxo do substrato da bomba. Assim, a aplicação

desses inibidores em associação com antibióticos convencionais poderá aumentar a

concentração intracelular desses antibióticos, restaurando sua eficiência, além de reduzir

o emergente desenvolvimento da resistência bacteriana (LOMOVSKAYA; BOSTIAN,

2006; ZLOH et al., 2004; POOLE; LOMOVSKAYA, 2006; MARKHAM et al.,

1999)(Figura 4).

17

1.5 PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL

As plantas produzem uma grande quantidade de metabólitos secundários e

parte significativa dessa diversidade química serve para protegê-la contra patógenos

microbianos. Espécies vegetais constituem uma rica fonte de potentes inibidores de

bomba de efluxo e diversos constituintes já foram identificados como tal (GIBOONS,

2004; STRAVI et al., 2007).

Certos produtos naturais, como o reserpina (alcalóide), têm sido capazes de

bloquear bombas de efluxo e reduzir o CIM (mínima concentração inibitória) da

norfloxacina e outros antibióticos. Porém, a concentração necessária de reserpina para

inibir a bomba de efluxo é neurotóxica para os humanos (MARKHAN et al., 1999).

A escassez de inibidores de efluxo efetivos na prática clínica leva a constante

procura pela identificação e desenvolvimento de novos inibidores, tanto contra os

sistemas de efluxo em microrganismos como em células tumorais resistentes a múltiplas

a drogas (DICKSON et al., 2006; KAATZ et al., 2003). A procura por novos agentes

tem focado os produtos naturais como moduladores da atividade antibiótica por bomba

de efluxo.

Os produtos naturais, tanto de origem terrestre quanto marinha, constituem

uma excelente fonte de moléculas com atividades biológicas promissoras, não apenas

pelo grande número de espécies encontradas nesses habitats naturais, mas

Figura 4. Atuação de um inibidor de efluxo (LEVY,1998).

18

principalmente pela variedade estrutural dos compostos produzidos e pelas propriedades

medicinais inexploradas (NIELSEN, 2002; NEWMAN; CRAGG; SANDER, 2003).

1.5.1 ORIGANUM VULGARE

O gênero Origanum, pertence à família Lamiaceae, tem características

arbustiformes de ocorrência sazonal e perene sendo nativa do Mediterrâneo, Ásia,

México e de algumas localidades da América do Sul, apresentando um total de 38

espécies conhecidas no mundo (PEREIRA, A., 2006). No Brasil, a espécie Origanum

vulgare L., popularmente conhecida por orégano, é a mais comum e amplamente

cultivada nas regiões Sul e Sudeste do país para uso como condimento alimentar

(SIGNOR et al., 2007).

As folhas secas e o óleo essencial de O. vulgare são usados medicinalmente por

vários séculos em diferentes partes do mundo, de forma que o seu efeito positivo sobre

a saúde humana tem sido atribuído à presença de compostos antioxidantes na erva e

consequentemente em seus produtos derivados (CERVATO et al., 2000; HERNÁNDEZ

et al., 2003).

O óleo essencial de O. vulgare apresenta como seus principais componentes

fenólicos, carvacrol [2-metil-5 - (1-metil-etil) fenol], e timol (2-isopropil-5-metilfenol),

os quais são conhecidos pelo seu largo espectro de atividade antimicrobiana, o que tem

sido o assunto de várias investigações in vitro (DORMAN & DEANS, 2000;

LAMBERT et al, 2001) e in vivo (ADAM et al, 1998).

19

2. OBJETIVO

2.1 GERAL

O objeto geral deste trabalho detém-se à avaliação de produtos naturais no que

se refere à sua atividade antimicrobiana direta, bem como, devido aos poucos trabalhos

relatados na literatura, sua atuação como moduladores da resistência a drogas em

linhagens de Staphylococcus aureus, ou seja, como potenciais adjuvantes de

antibióticos.

2.2 ESPECÍFICOS

O objetivo específico deste trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana do

óleo essencial de Origanum vulgare e de seu constituinte majoritário Carvacrol, bem

como sua atuação como possível inibidor de bomba de efluxo.

20

3. METODOLOGIA

3.1 LINHAGENS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Foram utilizadas linhagens de Staphylococcus aureus fornecidas pelo Dr.

Simon Gibbons (Universitry of London): SA-1199B, que superexpressa o gene norA

que codifica a proteína de efluxo NorA, responsável pelo efluxo de fluorquinolonas e

outras substâncias (KAATZ et al., 1993; KAATZ; SEO, 1995); RN-4220 que possui o

plasmídeo pUL5054, o qual, carrega o gene que codifica a proteína para efluxo de

macrolídeos (MrsA) (ROSS et al., 1989) e IS-58, que possui o gene que codifica a

proteína TetK para efluxo de tetraciclina (GIBBONS; UDO, 2000). Estas linhagens são

mantidas em meio de cultura agar sangue (Blood agar base – Difco) inclinado. Antes de

serem utilizadas, as células crescem em caldo nutritivo de infusão (Brain heart infusion

- BHI, Difco) acrescido de antibiótico, em concentração subinibitória, como forma de

preservar a resistência dos microorganismos aos respectivos antibióticos por 18-24 hs a

37 ºC.

3.2 ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO, CARVACROL E TIMOL

O óleo essencial Orégano e o seu constituinte Carvacrol foram fornecidos pelo

Prof. Dr. Evandro Leite de Souza (Laboratório de Microbiologia de Alimentos/UFPB).

Já o isômero do Carvacrol, Timol foi obtido do fabricante Sigma.

3.3 ANTIBIÓTICOS

As soluções estoque da norfloxacina, da tetraciclina e da eritromicina (Sigma-

Aldrich) foram preparadas conforme recomendação (CLSI/NCCLS document M100-

S15).

21

3.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) DO ÓLEO

ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE, CAVACROL E TIMOL

As CIM dos produtos naturais foram determinadas pelo método da diluição em

meio nutritivo solidificado (BHI) acrescido de twenn 20 (0,5%), usando-se

concentrações crescentes e dobradas do óleo essencial (0,015625 a 1%) e suspensões

bacteriana na concentração de 105

ufc/mL, em caldo nutritivo (BHI) na presença de

antibiótico. A CIM foi definida como a menor concentração que inibiu completamente o

crescimento bacteriano.

3.5 DETERMINAÇÃO DAS CIM DOS ANTIBIÓTICOS E NA PRESENÇA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE ORIGANUM VULGARE, CAVACROL E TIMOL

As CIM foram determinadas pelo método da diluição em meio nutritivo

solidificado (BHI) acrescido de twenn 20 (0,5%), com concentrações variando de

256 a 0,25 µg/mL ou 128g/mL a 0,125g/mL (diluições seriadas ½). Os ensaios

para atividade moduladora, foram realizados pelo método da diluição em meio

nutritivo solidificado, na presença do óleo essencial em uma concentração fixa e

subinibitória (¼ CIM), usando-se diluições seriadas dos referidos antibióticos.

22

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Realizamos primeiramente experimentos para determinar a concentração

inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de Orégano, bem como do seu constituinte

majoritário carvacrol e do seu isômero timol em linhagens de Staphylococcus aureus

que codificam proteínas de efluxo (Tabela 1).

Tabela 1: Concentração Inibitória Mínima do óleo essencial de orégano, carvacrol e

timol frente as linhagens de Staphylococcus aureus.

O óleo essencial de orégano apresentou uma relevante atividade antibacteriana

para as três linhagens utilizadas, variando entre 0,125% e 0,250% a concentração

necessária para inibir o crescimento bacteriano. No que se refere a carvacrol e timol,

ambos apresentaram resultados semelhantes com relação a CIM com variações entre

0,03125% e 0,0625%. Este resultado pode ser explicado pelo fato destes serem

isômeros (figura 5).

CIM (%)

Linhagem Orégano Carvacrol Timol

IS-58 0,125 0,03125 0,03125

RN-4220 0,125 0,0625 0,0625

AS-1199B 0,250 0,0625 0,0625

Figura 5. Estrutura do Timol e Carvacrol

23

Pôde-se observar que mesmo apresentando uma diferença estrutural com relação

a posição do grupo hidroxila, timol e carvacrol apresentam, se não o mesmo mecanismo

de ação, a mesma atividade antibacteriana.

Determinadas as concentrações inibitórias mínimas, foram realizadas as CIM

dos antibióticos (norfloxacina, tetraciclina e eritromicina) usando-se concentrações

crescentes e dobradas (0,25µg/mL até 256µg/mL) na ausência, bem como, na presença

dos produtos naturais (≤ ¼ da CIM) (Tabela 2). É importante mencionar que o uso de

uma concentração tão baixa quanto ¼ da CIM é recomendado para evitar possíveis

resultados falso-positivos (STAVRI et al., 2007).

Tabela 2: Concentração Inibitória Mínima dos antibióticos na presença e na ausência

dos produtos naturais.

*Valor de redução da CIM

Resultados relevantes foram obtidos com Orégano, Carvacrol e Timol na

linhagem S. aureus IS-58, na qual se observou uma modulação com redução da CIM da

tetraciclina em até 4 vezes. Já para as linhagens RN-4220 e AS-1199B, apesar dos

produtos naturais testados terem apresentado uma significativa atividade antibacteriana

quando foram incorporados ao meio de cultura juntamente com o antibiótico e em uma

concentração subinibitória, não houve redução da concentração da eritromicina e da

norfloxacina necessária para inibir o crescimento bacteriano, não apresentando inibição

da bomba de efluxo.

Linhagem / Antibiótico

CIM (µg/mL)

CIM dos

antibióticos + Orégano + Carvacrol + Timol

IS-58 / Tetraciclina 64 16 (4x)* 32(2x)* 32(2x)*

RN-4220 / Eritrommicina 256 256 256 256

AS-1199B / Norfloxacina 64 64 64 64

24

5. CONCLUSÃO

Os poucos trabalhos encontrados na literatura relatando tanto o efeito

potencializador de produtos naturais – quando em combinação com drogas

antimicrobianas clássicas – quanto trabalhos avaliando estes como moduladores de

resistência a drogas por inibição de bomba de efluxo, destacam a relevância deste

trabalho e motivam novos estudos que venham a auxiliar na avaliação biológica destes

produtos no combate aos mecanismos de resistência, mais especificamente sobre a

bomba de efluxo.

Os resultados aqui apresentados destacam o óleo essencial de orégano, seu

constituinte carvacrol e isômero timol, para além de outras propriedades, com um

promissor papel antibacteriano contra linhagens de S. aureus resistentes. O presente

trabalho também mostrou que eles modularam a atividade antibiótica de tetraciclina,

reduzindo a quantidade necessária do antibiótico para inibir o crescimento bacteriano.

As conclusões deste estudo destacam a relevância da avaliação biológica de

tais produtos naturais, os quais poderiam ser utilizados no combate das infecções

bacterianas resistentes a múltiplas drogas, agindo com putativos inibidores de bomba de

efluxo.

25

6. REFERÊNCIAS

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