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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Caracterização morfológica e da capacidade fagocítica de hemócitos da hemolinfa de

ostras de mangue Crassostrea gasar

Natanael Dantas Farias

Orientadora: Profª Dra. Patricia Mirella da Silva Scardua

João Pessoa – 2014







Orientadora: Profª. Dra. Patricia Mirella da Silva Scardua

Trabalho - Monografia apresentada ao

Curso de Ciências Biológicas (Trabalho

Acadêmico de conclusão de Curso), como

requisito parcial à obtenção do grau de

Bacharel em Ciências Biológicas.

João Pessoa – 2014

Catalogação na publicação

Universidade Federal da Paraíba

Biblioteca Setorial do CCEN

F224c Farias, Natanael Dantas.

Caracterização morfológica e da capacidade fagocítica de hemócitos da

hemolinfa de ostras de mangue Crassostrea gasar / Natanael Dantas Farias. -

João Pessoa, PB, 2014.

52 p. : il.

Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Universidade

Federal da Paraíba.

Orientador: Profª Drª Patrícia Mirella da Silva Scardua.

1. Ostras. 2. Biologia da ostra. 3. Ostra de mangue. 4. Crassostrea gasar

I. Título.

UFPB/BS-CCEN CDU 564.1(043.2)







Trabalho – Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas, como requisito parcial à

obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas

Data:_________________________________

Resultado: ____________________________

BANCA EXAMINADORA:

Dra. Patrícia Mirella da Silva Scardua - Orientadora

UFPB/ Centro de Ciências Exatas e da Natureza/ Departamento de Biologia Molecular

Dra. Márcia Rosa de Oliveira- Avaliador


Dr. Luis Fernando Marques dos Santos - Avaliador


AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a minha orientadora Dra. Patrícia Mirella da Silva Scardua pela

confiança, pelo carinho e atenção em mim depositados. Por aceitar a minha entrada no

Laboratório de Imunologia e Patologia de Invertebrados (LABIPI), desde a época da monitoria.

Agradeço imensamente pela orientação de grande valor e também por ter conhecido essa pessoa

maravilhosa que és, desde o início da graduação. Agradeço também pela paciência ímpar que

teve e tem em me orientar.

Ao professor Dr. Luis Fernando Marques dos Santos (DBM), a professora Dra. Márcia

Regina Piuvezam (DFP) e a professora Dra. Márcia Rosa de Oliveira (DBM), por aceitarem o

convite de serem membros da minha banca, bem como por fazerem parte de maneira

construtiva, direta ou indiretamente, da minha graduação.

Aos professores Dr. Isac Almeida e Dr. Robson, por disponibilizarem o citômetro de

fluxo FACSCantoTM II, BD Biosciences.

Aos meus pais José Edmar Leal Farias e Nilza Maria Dantas Farias, bem como às

minhas irmãs Luciana Dantas e Marianne Farias, por todo apoio dedicado à minha formação.

Bem como pela atenção e dedicação neste importante período da minha vida.

Ao meu amigo e integrante do LABIPI, Msc. Fernando Ramos Queiroga, que me ajudou

bastante na construção desse trabalho e na obtenção e análise dos resultados. Agradeço também

pela paciência recíproca que tivemos.

Aos meus amigos Anna Carolina, Cairé Barreto e Raianna Boni, por estarem juntos

comigo desde o início da graduação e, juntos, atravessarmos os altos e baixos que ela nos trouxe.

À Sâmia Sousa Duarte, Lucas Nunes Santana e Carol Costa, também membros do

LABIPI pela companhia e pela amizade.

À Cristina Toledo, Jaíse Paiva, Matheus Ramos e Heytor Queiroz, pela dedicação nos

momentos que me senti para baixo e pela amizade.

Ao pessoal do Laboratório de Biologia do Desenvolvimento (LABID), Leonardo Lima,

Elis Torrezan, Jocelmo Cássio, Thaís Mangeon, Andrezza de Araújo, Thyago Fernandes e

Dalliane Macedo, pelos construtivos e divertidos momentos que passamos juntos.

RESUMO

Os hemócitos são as células de defesa de moluscos bivalves e estão presentes na

hemolinfa, líquido circulante análogo ao sangue de vertebrados. Estas células são capazes de

realizar a fagocitose, principal mecanismo de defesa, e produzir moléculas citotóxicas capazes

de destruir o agente patogênico. O objetivo de realizar este estudo foi caracterizar morfológica

e funcionalmente as células imunológicas da ostra Crassostrea gasar. As ostras (n = 60) foram

coletadas de um cultivo no estuário do Rio Mamanguape, na Paraíba, nos meses de março,

agosto e setembro de 2013 e agosto, setembro e outubro de 2014. A hemolinfa foi extraída do

músculo adutor. Para análise morfológica por microscopia óptica (n = 30) as células foram

deixadas aderir espontaneamente em uma lâmina e foram coradas com vermelho neutro ou

Giemsa. Para análise morfológica por citometria de fluxo, a mesma hemolinfa foi fixada com

formol 4% em água do mar filtrada estéril, na proporção de 1:1. Para análise da fagocitose por

citometria de fluxo (n = 30) as células foram adicionadas em contado com partículas

fluorescentes inertes (látex) ou de natureza biológica (zymosan e E. coli). Quanto a

caracterização morfológica, os resultados obtidos pelas duas técnicas mostram que a hemolinfa

da ostra é bastante diversa e apresenta cinco subpopulações hemocitárias: granulócitos grandes,

granulócitos pequenos, hialinócitos, hemócitos vesiculares e as células tipo-blásticas. As

maiores células observadas foram os granulócitos grandes e hemócitos vesiculares e as menores

foram as células do tipo-blásticas. As células mais abundantes na hemolinfa foram os hemócitos

vesiculares e hialinócitos. Quanto a fagocitose, os hemócitos mostraram capacidade diferencial

de fagocitar os três tipos de partículas com os quais foram desafiados; a maior taxa de fagocitose

foi do zymosan (15,1% 0,94), seguida do látex (9,7% 0,45) e da E. coli (5,0% 0,54). Os

diferentes tipos de hemócitos podem reconhecer e fagocitar diferencialmente as partículas; as

de látex foram as mais fagocitadas pelos granulócitos (40,1% 1,87), enquanto que as de E.

coli pelo hialinócitos e hemócitos vesiculares (7,2% 0,36). Os granulócitos foram as células

com maior capacidade fagocítica de látex, quando comparado aos hialinócitos e hemócitos

vesiculares juntos. Este é o primeiro estudo da caracterização morfológica de hemócitos de

ostras C. gasar, uma espécie de grande importância comercial no Nordeste brasileiro.

ABSTRACT

The hemocytes are the defense cells of bivalve mollusks and are present in the

hemolymph, analogous to the blood of vertebrates. These cells are able to perform

phagocytosis, the main defense mechanism, and produce cytotoxic molecules capable of

destroying the pathogen. The aim of this study was to characterize morphologically and

functionally immune cells of the oyster Crassostrea gasar. Oysters (n = 60) were sampled in a

oyster facility located at the estuary of the Mamanguape River, Paraíba, in March, August and

September 2013 and August, September and October 2014. The hemolymph was extracted from

the adductor muscle. For morphological analysis by light microscopy (LM; n = 30) cells were

allowed to adhere spontaneously on a slide and stained with Giemsa or Neutral Red. To

morphological analysis yet, the same hemolymph was fixed with formol 4% in filtered and

sterilized water of sea, in proportion of 1:1. To analyze the phagocytosis by flow cytometry

(FC; n = 30), the cells were added in contact with inert (latex) or biological (zymosan and E.

coli) fluorescent particles.The results obtained by the two techniques (LM and FC) showed that

oysters hemolymph is composed by five hemocytes subpopulations: large granulocytes, small

granulocytes, hyalinocytes, vesicular hemocytes and blast-like cells. The largest cells were

granulocytes and vesicular hemocytes and smallest cells were blast-like cells. The most

abundant cells in the hemolymph were vesicular hemocytes and hyalinocytes. Concerning

phagocytosis, C. gasar hemocytes showed differential ability to phagocyte the three types of

particles which were challenged; the highest rate of phagocytosis was with zymosan (15,1%

0,94), followed by latex (9,7% 0,45) and then E. coli (5,0% 0,54). The different types of

hemocytes can differentially recognize and phagocyte the particles; latex were preferentially

phagocytosed by granulocytes (40,1% 1,87), whilst E. coli by hyalinocytes and vesicular

hemocytes (0,36% 7,2). Granulocytes were more phagocytic than hyalinocytes and vesicular

hemocytes for latex particles. This is the first study on morphological characterization of

hemocytes of oysters C. gasar, a species with great commercial importance in the Northeast

Brazil.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Sistema circulatório da ostra americana Crassostrea virginica 12

Figura 2. Diferenciação celular de hemócitos 14

Figura 3. Diferenciação celular proposta por análises morfológicas por citometria de

fluxo 16

Figura 4. Mecanismos de defesa hemocitários 18

Figura 5. Mecanismos líticos para degradação de patógenos 20

Figura 6. Modelos de ação de peptídeos antimicrobianos por ruptura de membrana 21

Figura 7. Modelo de funcionamento de um citômetro de fluxo 23

Figura 8. Citograma e histogramas representativos para fagocitose de partículas de

látex fluorescentes 28

Figura 9. Citogramas e histogramas representativos para fagocitose de Escherichia coli

e zymosan fluorescentes 29

Figura 10. Granulócitos grandes da hemolinfa de Crassostrea gasar 33

Figura 11. Granulócitos pequenos da hemolinfa de Crassostrea gasar 34

Figura 12. Hemócitos vesiculares da hemolinfa de Crassostrea gasar 34

Figura 13. Hialinócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar 35

Figura 14. Células tipo-blásticas da hemolinfa de Crassostrea gasar 35

Figura 15. Populações de hemócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar observadas

por citometria de fluxo 37

Figura 16. Fagocitose de diferentes partículas por hemócitos de Crassostrea

gasar 38

Figura 17. Fagocitose (%) de diferentes partículas pelos hemócitos da ostra

Crassostrea gasar 39

Figura 18. Fagocitose (%) diferencial de partículas de látex e Escherichia coli em ostras


Figura 19. Capacidade fagocítica (%) de partículas de látex pelos hemócitos de


LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Média (± EP) do tamanho celular (µm e unidades arbitrárias) e da porcentagem (±

EP) das subpopulações de hemócitos da hemolinfa da ostra Crassostrea gasar.

Diferentes letras indicam diferenças significativas do tamanho entre as diferentes

populações celulares. Análises independentes para cada técnica 31

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BPI - Bactericidal /permeability-increasing protein (Proteína bactericida de aumento de

permeabilidade)

FSC - Forward Scattered (Dispersão Frontal)

LPS - Lipopolissacarídeo

NET - Neutrophil extracellular traps (Armadilhas extracelulares de neutrófilos)

NO - Nitric Oxide (Óxido Nítrico)

NOS - Nitric Oxide Synthase (Óxido Nítrico Sintase)

PAM - Peptídeo Antimicrobiano

PAMP - Pathogen-associated molecular patterns (Padrão Molecular Associado ao Patógeno)

PRP - Pattern Recognition Proteins (Proteínas de Reconhecimento Padrão)

PRR - Pattern Recognition Receptors (Receptores de Reconhecimento Padrão)

RNS - Reactive Nitrogen Species (Espécies Reativas de Nitrogênio)

ROS - Reactive Oxygen Species (Espécies Reativas de Oxigênio)

SOD - Superoxide Dismutase (Superóxido Dismutase)

SSC - Side Scattered (Dispersão Lateral)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 11

1.1. Sistema de defesa de bivalve 11

1.2. Ontogenia e células imunoefetoras de bivalves 13

1.3. Mecanismos de defesa hemocitários 16

1.4. Mecanismos líticos na interação parasito-hospedeiro 19

1.4.1. Produção de espécies reativas de oxigênio 19

1.4.2. Produção de espécies reativas de nitrogênio 19

1.4.3. Produção de peptídeos anti-microbianos (PAMs) 20

1.4.4. Enzimas líticas 22

1.5. Outras funções dos hemócitos 22

1.6. Métodos de estudo dos hemócitos 22

1.7. Estudo de hemócitos em bivalves do Brasil 24

2. OBJETIVOS 25

2.1. Objetivo geral 25

2.2. Objetivos específicos 25

3. MATERIAL E MÉTODOS 26

3.1. Coleta dos animais 26

3.2. Extração de hemolinfa 26

3.3. Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica 26

3.3.1. Monocamadas coradas com vermelho neutro 26

3.3.2. Monocamadas coradas com Giemsa 26

3.4. Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo 27

3.5. Caracterização da fagocitose dos hemócitos por citometria de fluxo 27

3.6. Análises estatísticas 30

4. RESULTADOS 31

4.1. Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica 31

4.2. Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo 36

4.3. Caracterização funcional de hemócitos por citometria de fluxo 37

5. DISCUSSÃO 41

5.1. Caracterização morfológica dos hemócitos de Crassostrea gasar 41

5.2. Caracterização funcional dos hemócitos de Crassostrea gasar por

citometria de fluxo 43

6. CONCLUSÕES 45

7. REFERÊNCIAS 46

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. Sistema de defesa de bivalves

O sistema imunológico de invertebrados, ao contrário dos vertebrados, é exclusivamente

inato ou natural, pois não produz anticorpos específicos da imunidade adaptativa, não possuindo

assim memória imunológica.

As células imunoefetoras de bivalves são denominadas hemócitos e estão presentes no

líquido circulante, a hemolinfa, análoga ao sangue de vertebrados, onde encontram-se também

moléculas solúveis no plasma, que atuam no reconhecimento e degradação de agentes não-

próprios (Vargas-Albores & Barracco, 2001; Song et al., 2010)

A hemolinfa de bivalves percorre um sistema circulatório aberto, que é bombeado por

um coração protegido por uma fina camada de epitélio, o pericárdio, e contém 3 câmaras, sendo

um ventrículo e dois átrios. Após ser bombeada pelo coração, a hemolinfa sai do ventrículo e

penetra na artéria aorta anterior, onde supre o sistema gástrico e a região anterior do corpo e

também penetra na artéria posterior. Essa artéria supre o músculo adutor e também o reto. A

hemolinfa percorre as artérias até desembocar em seios hemolinfáticos que banham os diversos

tecidos e órgãos, direcionando-a para as brânquias, retornando para o coração através de um

conjunto de veias e desembocando no átrio por três veias (Fig. 1) (Cheng, 1981; Eble, 2009).

12

Figura 1 - Sistema circulatório da ostra americana Crassostrea virginica

Sistema arterial (A) e venoso (B) observados lateralmente. A hemolinfa é bombeada pelo coração

(sistema arterial) do átrio (AT) para o ventrículo (V), seguindo para a artéria aorta anterior (AA), onde

supre o sistema gástrico e outros órgãos da região anterior e posterior (PA), suprindo o músculo adutor

(MA) e o reto. Ao atingir os seios hemolinfáticos que suprem esses órgãos, a hemolinfa retorna por um

conjunto de veias e chega ao átrio por três veias (não mostradas). Adaptado de Eble (2009).

Brânquias

13

1.2. Ontogenia e células imunoefetoras de bivalves

Embora existam algumas hipóteses para a origem dos hemócitos, o tecido

hematopoiético em bivalves permanece desconhecido. Cheng (1981) sugere que o tecido

conjuntivo seja o responsável pela origem destas células, que posteriormente migram para a

hemolinfa, onde sofrem maturação e diferenciação. Esta hipótese teve o apoio do trabalho de

Smolowitz; Miosky; Reinisch (1989) que identificaram, através da utilização de anticorpos,

antígenos de superfície de hemócitos semelhantes à antígenos de superfície de células do tecido

conjuntivo.

Com respeito aos tipos hemocitários da hemolinfa de bivalves, existem controvérsias

nas diferentes hipóteses de sua classificação. O primeiro trabalho de revisão sobre hemócitos

de várias espécies de bivalves propôs sua classificação simples baseada em características

morfológicas e citoquímicas e divide as células em duas grandes populações, os granulócitos e

os hialinócitos (Cheng, 1981).

Os granulócitos são geralmente as maiores células encontradas na hemolinfa, com a

maior capacidade fagocítica e de produção de espécies reativas de oxigênio, sendo, portanto as

células mais associadas à defesa (Fisher, 1988; Hine, 1999). Elas apresentam muitos filipódios

e são facilmente distinguidas das outras pela abundância de vesículas ou grânulos

citoplasmáticos que se dispõem geralmente na região endoplasmática, podendo ocupar também

a ectoplasmática. Além disso, essas vesículas podem ser basófilas ou acidófilas, dependendo

da espécie de bivalve analisada e do conteúdo enzimático presente em seu interior. O núcleo é

excêntrico, basófilo e apresenta uma baixa relação núcleo:citoplasma. Os hialinócitos são

células menores, com núcleo maior que o dos granulócitos e podem apresentar pouca ou

nenhuma vesícula. Seu citoplasma é geralmente basófilo e possui uma alta relação

núcleo:citoplasma. São células aptas a fagocitar, embora em menor proporção (Cheng, 1981).

A diferenciação de hemócitos também foi postulada pela primeira vez por Cheng (1981)

e hipotetiza duas linhagens celulares progenitoras: os granuloblastos e hialinoblastos. Essas

células seriam capazes de dar origem aos granulócitos e aos hialinócitos maduros (Fig. 2).

Como proposto por Cheng (1981), os granuloblastos se diferenciariam primariamente em

progranulócitos, células menores que os granulócitos, contendo poucos grânulos

citoplasmáticos, com núcleo e vesículas basófilas e capazes de fagocitar. Posteriormente, os

progranulócitos se diferenciariam em granulócitos do tipo I, com tamanho mediano, numerosas

vesículas citoplasmáticas basófilas ou acidófilas, com altos níveis de atividade de hidrolases e

capazes de fagocitar. Por fim, os granulócitos do tipo I maturariam para o tipo II, sendo as

14

maiores células observadas, com presença do complexo de Golgi e lisossomos maduros, bem

como com a maior atividade de hidrolases e maior atividade fagocítica. No caso de realizar uma

fagocitose, os granulócitos do tipo II se caracterizariam por possuir poucas projeções,

geralmente em polos opostos da célula, pouco ou nenhum grânulo, vacúolos de diversos

formatos e tamanhos e menor atividade de hidrolases. Essa alteração morfológica ocorreria

devido à ativação dos mecanismos de degradação intracelular, levando os granulócitos do tipo

II à um aspecto “gasto”. Entretanto, os granulócitos do tipo II poderiam ainda se fusionar,

formando células multinucleadas (Fig. 2).

Os hialinoblastos por sua vez, se diferenciariam em prohialinócitos, com núcleo

relativamente grande e pouco citoplasma, sem vesículas citoplasmáticas e essencialmente

basófilas. Em seguida ocorreria a maturação de prohialinócitos em hialinócitos, que seriam as

células maiores dessa linhagem, com poucos grânulos citoplasmáticos (Cheng, 1981) (Fig. 2).

Figura 2 - Diferenciação celular de hemócitos

Os hemócitos teriam sua origem em duas linhagens celulares, os granuloblastos e hialinoblastos. Os

granuloblastos se diferenciariam em progranulócitos, granulócitos tipo I e granulócitos tipo II,

aumentando gradativamente a capacidade fagocítica e amadurecimento de organelas. A fagocitose

acarretaria uma mudança dos granulócitos tipo II para granulócitos “gastos” ou, no caso de fusão para

células multinucleadas. Os hialinoblastos se diferenciariam em prohialinócitos e hialinócitos. Cheng

(1981).

Recentemente, trabalhos reunidos na revisão de Hine (1999) propuseram novas

classificações envolvendo as subpopulações de granulócitos e hialinócitos.

Os granulócitos com vesículas basófilas ou eosinófilas, bem como neutras, já foram

observados nos bivalves das famílias Ostreidae (Crassostrea virginica, Crassostrea gigas e

Ostrea edulis), Mytilidae (Mytilus edulis, Mytilus. galloprovincialis e Mytilus californianus),

15

Veneridae (Mercenaria mercenaria, Mercenaria campechiensis, Meretrix lusoria, Sunetta

scripta, Villorita cyprinoides, Ruditapes decussatus e Tapes semidecussata), Myidae (Mya

arenaria), Cardiidae (Cerastoderma edule), Arcidae (Scapharca inaequivalvis, Anadara

ovalis), Tridacnidae (Tridacna crocea, Tridacna maxima) e Pinnidae (Pinna nobilis) (vide

revisão de Hine, 1999).

Os hialinócitos, apesar de conterem pouco ou nenhum grânulo, são células muito

heterogêneas em nível de microscopia eletrônica. Por sua vez, podem ser subdivididos em

grandes e pequenos, sendo este último muitas vezes chamado de células tipo-blásticas. Os

hialinócitos grandes possuem núcleo grande, oval ou reniforme, com diversas organelas em seu

citoplasma, e já foi identificado em espécies da família Ostreidae, Mytilidae e Veneridae. As

células tipo-blásticas possuem núcleo central, relativamente pequeno e um citoplasma bem

escasso em volume e organelas, sendo identificadas em alguns bivalves das famílias Ostreidae,

Mytilidae, Dreissenidae, Veneridae, Cardiidae e Tridacnidae. Estas células também foram

descritas para as espécies de ostras C. virginica, C.gigas, O. edulis e Saccostrea glomerata

(Hine, 1999; Hégaret et al., 2003a; Lambert et al., 2003; Dang et al., 2012).

Estudos recentes sugerem que as células tipo-blásticas, para a maioria dos bivalves, são

precursoras dos hemócitos por apresentarem uma porção do citoplasma altamente basófila, o

que indica a presença de ribossomos livres e sugere a imaturidade celular, além de

características morfológicas semelhantes aos hialinócitos (Russell-Pinto et al., 1994; Wen et

al., 1994; Carballal et al., 1997; Rebelo et al., 2013).

Um novo grupo proposto por Hine (1999), os hemócitos vesiculares, encontrados apenas

em alguns bivalves das famílias Ostreidae, Cardiidae, Dreissenidae e Veneridae, possuem

características que são facilmente confundidas com os granulócitos, como a baixa relação

núcleo:citoplasma e com os hialinócitos, pela ausência ou pouca quantidade de grânulos. Nos

bivalves O. edulis, Dreissena polymorpha, M. mercenaria este grupo foi identificado como

hialinócitos, hialinócitos e hemócitos grandes basófilos e hialinócitos e fibrócitos,

respectivamente. Em M. lusoria, C. edule e S. inaequivalvis estes hemócitos foram classificados

como hialinócitos granulares, hemócitos tipo III e hemócitos do tipo II, respectivamente.

Rebelo et al. (2013) propõem ainda outro modelo de diferenciação celular de hemócitos

da ostra C. rhizophorae baseado em características morfológicas, no tamanho e granulosidade

interna, por análise de citometria-de-fluxo. Eles propuseram que as células tipo-blásticas

iniciam o processo diferenciando-se em hialinócitos maiores, pelo aumento da quantidade de

organelas. Em seguida, os hialinócitos podem desenvolver vesículas, adquirindo uma maior

granulosidade interna e maior tamanho, tornando-se granulócitos. Os granulócitos, por fim,

16

poderiam degranular por estímulos extracelulares, conservando seu tamanho, mas com uma

diminuição da granulosidade interna, sendo associados então aos hemócitos vesiculares (Fig.

3).

Figura 3 - Diferenciação celular proposta por análises morfológicas por citometria de

fluxo

Este modelo de diferenciação corrobora a hipótese das células do tipo-blásticas serem precursoras de

todos os hemócitos. O eixo X (FSC) representa o tamanho celular e o eixo Y (SSC) a granulosidade

celular. O amadurecimento intracelular das células tipo-blásticas (BL) levaria à diferenciação em

hialinócitos (HH) maiores, que posteriormente aumentariam a granulosidade e tamanho celular, se

diferenciando em granulócitos pequenos (GP) e grandes (GG), que por sua vez poderiam degranular e

tornarem-se hemócitos vesiculares (HV). Adaptado de Rebelo et al. (2013).

1.3. Mecanismos de defesa hemocitários

A defesa contra os agentes infecciosos, realizada por hemócitos, acontece

principalmente pelo mecanismo de fagocitose ou encapsulamento (Fig. 4). A fagocitose se

realiza em sucessivas etapas: quimiotaxia, reconhecimento, englobamento e degradação.

Primeiro ocorre a quimiotaxia, que é o movimento celular direcionado através de um gradiente

de concentração químico, com objetivo de chegar a um destino, geralmente acontece da

circulação para os tecidos. A quimiotaxia não acontece estritamente para a defesa do organismo,

ela pode ocorrer também no reparo de tecido ou concha, onde os hemócitos têm que chegar no

17

local afetado (Donaghy et al., 2009b). Posteriormente, ocorre o reconhecimento do

microrganismo por moléculas conservadas evolutivamente, chamadas de Padrões Moleculares

Associados aos Patógenos (PAMPs, do inglês Pathogen-Associated Molecular Patterns), como

por exemplo, os lipopolissacarídeos (LPS) presentes na parede celular de bactérias Gram-

negativas e β1,3-glicanas presentes nas paredes de fungos. O reconhecimento dos PAMPs se

dá por moléculas específicas denominadas Receptores ou Proteínas de Reconhecimento Padrão

(PRR, do inglês Pattern Recognition Receptors ou PRP, Pattern Recognition Proteins) que se

encontram na membrana dos hemócitos ou solúveis na hemolinfa (Song et al., 2010; Schmitt et

al., 2011).

Sete grupos de PRR são descritos em bivalves: receptores do tipo-Toll, scavengers,

proteínas de reconhecimento de peptideoglicanas, proteínas de ligação à bactérias Gram-

negativas, lectinas do tipo-C, galectinas e proteínas contendo thio-éster (Song et al., 2010).

Após o reconhecimento, finalmente ocorre o englobamento do microrganismo em um vacúolo

fagocítico para a sua destruição (Fig. 4). Várias vias de destruição podem ser ativadas, como a

da produção e liberação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, a produção de

peptídeos antimicrobianos (PAM) e produção de enzimas hidrolíticas, dentre elas a lisozima

(Song et al., 2010; Schmitt et al., 2011).

O encapsulamento, por sua vez, está relacionado com parasitas de maior tamanho, que

neste caso, não poderiam ser fagocitados (Fig. 4). Esta resposta envolve a interação hemócito-

parasita, onde os hemócitos se dispõem em várias camadas por volta do parasita, impedindo

sua proliferação (Barracco & da Silva, 2008; Vargas-Albores & Barracco, 2001). Estudos

sugerem que, posteriormente, os hemócitos secretam enzimas lisossomais e espécies reativas

de oxigênio para degradar o parasita encapsulado (Chagot et al., 1987; Montes et al., 1997).

18

Figura 4 - Mecanismos de defesa hemocitários

Os hemócitos, podem desencadear respostas dependentes principalmente do tamanho celular, fagocitose

ou encapsulamento. Em ambos os casos, ocorre a quimiotaxia (passo 1), seguido do reconhecimento e

adesão à superfície do microrganismo (passo 2). Quando o microrganismo é relativamente pequeno, o

hemócito internaliza-o (passo 3) e o digere (passo 4). Se o parasito é maior, os hemócitos envolvem-no

por camadas e secretaram substâncias que impedem sua disseminação pelo organismo (passo 3’) e outras

que irão destruí-lo extracelularmente (passo 4’). Adaptado de Soudant; Chu; Volety (2013).

19

1.4. Mecanismos líticos na interação parasito-hospedeiro

1.4.1. Produção de espécies reativas de oxigênio

A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês Reactive Oxygen Species)

é um dos principais mecanismos de ação degradativa nas células de defesa de invertebrados, e

seu maior efeito direto consiste na oxidação de proteínas, carboidratos ou bases do DNA. Sua

produção pode ocorrer em grandes quantidades após o contato com os antígenos, processo

chamado de “explosão respiratória” devido ao alto consumo de oxigênio (do inglês, respiratory

burst). A catalisação da reação ocorre com o consumo de oxigênio molecular (O2) e é realizada

pela ação da enzima NADPH oxidase presente nas membranas da célula: NADPH + 2O2 →

NADP+ + 2O2- + H+ (Fang 2004, Robinson 2008). O produto desta reação, o ânion superóxido

(O2-), pode ainda ser dismutado por enzimas como a superóxido dismutase (SOD, do inglês,

Superoxide Dismutase) pela reação: SOD + O2- + O2

- + 2H+ → 2H2O2 + O2, produzindo o

peróxido de hidrogênio (H2O2), também um radical livre, tóxico para as membranas celulares.

Outros radicais livres podem ser produzidos a partir da interação do O2- e H2O2 com outras

moléculas intracelulares, como o radical hidroxila (OH∙), o oxigênio singlet (1O2) e o ácido

hipocloroso (HOCl) (Robinson, 2008) (Fig. 5).

Vários estudos têm verificado a produção de ROS pela detecção basal ou do respiratory

burst em diversas ostras como C. virginica (Larson et al., 1989; Hégaret et al., 2003b), C. gigas

(Lambert et al., 2003), Crassostrea ariakensis (Donaghy et al., 2009a) e Crassostrea gasar

(Queiroga et al., 2013), mexilhões M. edulis (Pipe, 1992) e mariscos Ruditapes philipinarum

(Cima et al., 2000) e M. mercenaria (Buggé et al., 2007).

1.4.2. Produção de espécies reativas de nitrogênio

A produção de espécies reativas de nitrogênio (RNS, do inglês Reactive Nitrogen

Species), principalmente o óxido nítrico (NO), parece ter uma importante função na defesa de

bivalves, embora não muito bem elucidada, e ocorre através da reação: Arginina + NADPH +

O2 → Citrulina + NO + NADP+, catalisada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS, do inglês

Nitric Oxide Synthase) (Fang, 2004; Schmitt et al., 2011) (Fig. 5).

Os efeitos atribuídos às RNS envolvem passos bioquímicos muito mais complexos que

o das ROS e dependem da condição redox do meio celular. O NO pode inibir, o crescimento

celular de bactérias, através de mecanismos que sequestram o zinco de metaloproteínas

necessárias à replicação e pode bloquear diretamente o processo respiratório. A produção de

óxido nítrico pode ainda culminar no aumento da citotoxicidade das espécies reativas de

20

oxigênio, onde o NO pode interagir com O2- e produzir peroxinitrito (ONOO-) e outros

intermediários tóxicos (Fang, 2004) (Fig. 5).

Figura 2 - Mecanismos líticos para degradação de patógenos

Fagossomo e diversas enzimas que agem para degradação de um parasito englobado. Complexo da

NADPH oxidase que gera ânion superóxido (O2-) (1) a partir do oxigênio molecular (O2). O O2- pode

ser dismutado (2) pela superóxido dismutase (SOD), produzindo peróxido de hidrogênio (H2O2) ou

reagir com óxido nítrico (3) (NO) produzindo peroxinitrito (ONOO-). A mieloperoxidase (MPO) pode

converter H2O2 em HOCl (4) na presença de Cl-. Adaptado de Soudant et al. (2008).

1.4.3. Produção de peptídeos anti-microbianos (PAMs)

Os peptídeos antimicrobianos são moléculas pequenas (menores que 10 kDa) que

apresentam atividade microbicida e possuem natureza anfipática e catiônica. Atuam

principalmente pela formação de poros na membrana e desequilíbrio iônico do patógeno,

levando à lise celular (Schmitt et al., 2012).

Dois modelos principais para a ruptura da membrana por peptídeos antimicrobianos são

propostos, o modelo barril (do inglês “Barrel-stave” Model) e o modelo tapete (do inglês

“Carpet” Model). No modelo barril, a formação de poros se dá pela agregação dos peptídeos,

seguido da sua inserção na bicamada lipídica, onde os aminoácidos hidrofóbicos interagem com

os lipídeos de membrana e os hidrofílicos entre si, formando um canal (Fig. 6A). O modelo

tapete propõe que, os peptídeos em solução interagem primeiramente com os lipídeos e

grupamentos fosfatos da face externa da membrana e posteriormente entre si, criando poros

21

transitórios que, com o aumento da concentração de peptídeos na membrana, levará a formação

de micelas e a ruptura celular (Fig. 6B).

Figura 3 – Modelos de ação de peptídeos antimicrobianos por ruptura de membrana

(A) O modelo barril propõe a agregação dos peptídeos e sua interação posterior com a bicamada lipídica

formando poros que desestabilizarão ionicamente a célula. (B) O modelo tapete sugere que a interação

dos peptídeos primeiramente com a superfície externa da bicamada lipídica e posteriormente entre si,

formando micelas e destruindo a membrana plasmática. Li; Zhao; Song (2009).

Outros peptídeos antimicrobianos podem atuar sobre moléculas envolvidas em

processos vitais como enzimas ou moléculas menores relacionadas ao metabolismo celular, não

causando ruptura da membrana. Os PAMs atuam como barreira primária do sistema de defesa,

prevenindo o crescimento e a instalação de patógenos nos tecidos, sendo altamente expressos

nos epitélios e liberados no muco (Li et al., 2009; Casas et al., 2011).

A síntese de PAMs ocorre de maneira constitutiva e são armazenados em vesículas

dentro dos hemócitos para liberação após interação com o patógeno. Essa síntese ocorre

principalmente em órgãos que estão em contato frequente com o meio externo, como brânquias

e manto (Mitta et al., 2000; Zhao et al., 2007).

Diversos PAMs foram descritos em bivalves, como nos mexilhões M. galloprovincialis

(Hubert et al., 1996), M. edulis (Charlet et al., 1996) e nas ostras C. gigas (Gonzalez et al.,

2007). Em C. gigas, alguns peptídeos antimicrobianos foram caracterizados e incluídos nas

famílias: defensinas e PAM ricos em prolina. As defensinas foram identificadas primeiramente

a partir do manto (Cg-Defm) e posteriormente nos hemócitos (Cg-Defh1 e Cg-Defh2) e ambos

possuem a capacidade de impedir a síntese de peptídeoglicanos de bactérias Gram-positivas.

22

Um PAM rico em prolina foi identificado também nos hemócitos de C. gigas (Cg-Prp) e,

embora sua função seja pouco conhecida, observa-se uma atuação em sinergia com as

defensinas hemocitárias. Outro PAM foi identificado e caracterizado em C. gigas pela atividade

bactericida contra bactérias Gram-negativas e atua através da permeabilização da membrana

externa e interna (BPI, do inglês Bactericidal /permeability-increasing protein) (Schmitt et al.,

2011, 2012).

1.4.4. Enzimas líticas

Os lisossomos de hemócitos contém uma variedade de enzimas hidrolíticas, como a β-

glucuronidase, arilsulfatase, lisozima e catepsina B, no interior de vesículas que podem ter o

pH ácido ou básico e ocupam o citoplasma (Pipe, 1990).

As lisozimas desempenham duas funções necessárias para a sobrevivência de bivalves,

auxiliam na defesa contra patógenos e na digestão intracelular. Nos hemócitos, as lisozimas

secretadas atuam principalmente quebrando moléculas de peptideoglicanos, fundamentais na

estrutura da parece bacteriana (McHenery et al., 1986, Schmitt et al., 2011). Em relação à

digestão, as lisozimas já foram identificadas em células da glândula digestiva de M. edulis e de

C. gigas (Takahashi et al., 1986; Bachali et al., 2002).

1.5. Outras funções dos hemócitos

Atualmente, outras funções têm sido atribuídas aos hemócitos de ostras de acordo com

Marigómez et al. (2002). Como por exemplo, a remoção de metais tóxicos da circulação por

fagocitose (complexos maiores) ou pinocitose (íons livres) e seu posterior transporte para

órgãos de detoxificação, como brânquias e glândula digestiva. Elementos como Cu (Cobre), Zn

(Zinco) e Cd (Cádmio) podem então ser absorvidos pelo organismo dos bivalves, em seguida

serem associados com proteínas citosólicas ou internalizadas em lisossomos de hemócitos para

posterior transporte (vide revisão MARIGÓMEZ et al., 2002).

1.6. Métodos de estudo dos hemócitos

Diversos métodos são empregados nos estudos de caracterização morfológica e

funcional das células imunoefetoras de bivalves (Hine, 1999). Entre eles estão o uso de corantes

histológicos para ressaltar o caráter básico ou ácido do citosol ou dos seus componentes

intracelulares e a microscopia eletrônica de transmissão que revela características

ultraestruturais (Wootton & Pipe, 2003; Chang et al., 2005). Existe ainda a produção de

23

anticorpos monoclonais específicos para antígenos de superfície de hemócitos ou intracelulares,

utilizados tanto na tentativa de caracterizar ou localizar as células em estádios de

desenvolvimento (Renault et al., 2001; Xue & Renault, 2001), quanto de desvendar sua

ontogenia (Smolowitz et al., 1989).

Mais recentemente uma técnica muito utilizada em estudos de vertebrados, a citometria

de fluxo, vem despontando nos estudos da morfologia e funções de diferentes subpopulações

celulares da hemolinfa de bivalves. Esta técnica consiste na utilização de um equipamento que

contém lasers que irão atingir células em suspensão, unitariamente e por um fluxo contínuo,

difratando a luz ao atravessá-las e, posteriormente, atingindo detectores específicos, gerando

assim diversas medidas simultâneas (Fig. 7). Dentre os detectores, destacam-se o Forward

Scattered (FSC), que detecta o tamanho celular por receber a luz refratada frontalmente e o Side

Scattered (SSC), que detecta a complexidade interna celular, recebendo a luz difratada nas

laterais (Fig. 7). Existem ainda detectores de fluorescência, que serão atingidos por diferentes

comprimentos de onda provenientes da excitação de fluoróforos usados para marcar

componentes celulares (BD Biosciences, 2007) (Fig. 7). A utilização da citometria de fluxo traz

a vantagem de permitir a realização de análises simultâneas em uma mesma amostra (Allam et

al., 2002; Hégaret et al., 2003b; Donaghy et al.; 2009, Wang et al.; 2012).

Figura 4 - Modelo de funcionamento de um citômetro de fluxo

Vários parâmetros celulares são medidos em citometria-de-fluxo. O laser azul (488 nm) atinge as células

em suspensão e em fluxo contínuo. A célula refrata a luz e é captada por um sensor de tamanho

(Forward Scattered, FSC), localizado à frente do laser; por um sensor de complexidade interna (Side

Scattered, SSC), que capta a luz difratada, localizado nas laterais. BD Biosciences (2007).

24

1.7. Estudo de hemócitos em bivalves do Brasil

No Brasil, pouco se sabe ainda sobre os mecanismos de defesa de bivalves e poucos

trabalhos de caracterização morfológica e funcional dos tipos hemocitários foram realizados. O

primeiro estudo foi o da caracterização dos hemócitos do mexilhão Perna perna utilizando

diversos métodos de coloração, como o Giemsa para afinidade de grânulos, método de Gomori

para detecção de fosfatases ácidas e Azul de Sudan para marcação de lipídeos. Neste estudo foi

caracterizada a produção de ânion superóxido e capacidade fagocítica dos hemócitos (Barracco

et al., 1999). Posteriormente, os hemócitos da ostra C. rhizophorae foram caracterizados de

forma similar (Barth et al., 2005). Schleder et al. (2008) caracterizou morfologicamente os

hemócitos do pectinídeo Nodipecten nodosus utilizando a coloração de Giemsa e

funcionalmente, detectando a produção de PAMs, atividade de fenoloxidase e atividade de

aglutinação. E recentemente, dois estudos utilizaram a citometria de fluxo, um deles para

caracterizar a produção de ROS, capacidade fagocítica e de aglutinação de hemócitos da ostra

C. gasar (Queiroga et al., 2013) e outro para caracterizar morfológica e ultraestruturalmente os

hemócitos da ostra C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013)

Até o presente momento não há estudos da caracterização morfológica de hemócitos de

ostras C. gasar, uma espécie de grande importância comercial no Nordeste brasileiro.

25

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Caracterizar morfológica e funcionalmente as células imunológicas da ostra Crassostrea

gasar.

2.2. Objetivos específicos

2.2.1. Quantificar e caracterizar morfologicamente as células da hemolinfa da ostra C.

gasar;

2.2.2. Caracterizar a capacidade fagocítica das células da hemolinfa da ostra C. gasar.

26

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Coleta dos animais

Foram realizadas seis coletas de ostras da espécie Crassostrea gasar adultas (> 60 mm)

nos meses de março (n = 10), agosto (n = 10) e setembro (n = 10) de 2013 e agosto (n = 10),

setembro (n = 10) e outubro (n = 10) de 2014, em um cultivo comercial localizado no estuário

do Rio Mamanguape (Marcação, PB - S06°47’08,2”; WO34°59’46,7”). As três primeiras

coletas foram direcionadas para a caracterização morfológica dos hemócitos enquanto que as

três últimas para a caracterização funcional.

Todos os animais foram identificados a nível de espécie por biologia molecular

(Queiroga et al. no prelo).

3.2. Extração de hemolinfa

A hemolinfa das ostras foi retirada do músculo adutor com uma seringa de 1 ml acoplada

a uma agulha (21 G) e foi imediatamente colocada em microtubos sobre gelo e em seguida

preparada para análises em microscopia óptica e citometria de fluxo, como descrito abaixo.

3.3. Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica

3.3.1 Monocamadas coradas com vermelho neutro

A hemolinfa (225 µl) de cada ostra (n = 10) foi corada com uma solução do corante vital

vermelho neutro (concentração final de 0,005%) que penetra nos compartimentos ácidos das

células vivas. Após 5 min. as células em suspensão foram observadas ao microscópio com

contraste de fase (Olympus BX41) e fotografadas durante 20 min. Nesta preparação foram

observadas a emissão de pseudópodes e a presença ou ausência de vesículas ácidas nos

hemócitos.

3.3.2 Monocamadas coradas com Giemsa

A hemolinfa (100 µl) de cada ostra (n = 27) foi adicionada em uma lâmina posicionada

sobre papel umedecido, para formação de uma monocamada de hemócitos por adesão

espontânea, durante aproximadamente 5 min a 25 °C. Após este tempo, a monocamada foi

27

fixada com metanol (5 min.) e corada com Giemsa puro (Newprov) por 5 min. e após secas

foram montadas com Entellan (MERCK). As amostras foram observadas em campo claro e

fotografadas no microscópio Olympus BX41.

Cada célula (n 100 células / animal) foi caracterizada segundo o padrão de coloração

de seus grânulos (basófilos ou acidófilos), relação núcleo:citoplasma (baixa ou alta), formato

(circular ou estrelado) e tamanho celular (medida do maior eixo, sem considerar a projeção dos

pseudópodes). Os tipos celulares encontrados foram quantificados e a porcentagem

determinada sobre o total de células analisadas.

3.4 Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo

A hemolinfa (200 µl) de cada ostra (n = 10) foi imediatamente fixada em solução de

formaldeído à 4% em água do mar filtrada (0,22 µm) estéril na proporção de 1:1. Cada amostra

foi analisada em citômetro de fluxo pelo período de 30s, onde foi obtido o primeiro gráfico de

tamanho em função da complexidade interna (FSC vs SSC) e o experimento foi repetido três

vezes (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, California, USA).

3.5 Caracterização da fagocitose dos hemócitos por citometria de fluxo

Para a avaliação da capacidade fagocítica dos hemócitos da ostra C. gasar, diferentes

partículas foram utilizadas nos ensaios: partículas inertes fluorescentes de látex (Polysciences,

2 µm), porções da parede de fungo, o zymosan (Life Technologies, 3µm) e bactérias Gram-

negativas Escherichia coli (Life Technologies, 1µm).

A hemolinfa de cada ostra (200 µl) (n = 10) foi subdividida em duas subamostras, em

uma foi adicionada a partícula teste (8 µl) na proporção de 1:10 (hemócito:partículas) e na outra,

foi adicionado o volume correspondente de água do mar filtrada estéril (amostra controle). As

suspensões celulares foram incubadas por 1 hora à 25 °C e analisadas em citômetro de fluxo

(FACSCantoTM II, BD Biosciences, San Jose, California, USA). O experimento foi repetido

três vezes.

Para a análise da fagocitose no gráfico de morfologia (FSC vs SSC), as populações de

hemócitos foram selecionadas para serem representadas em um histograma contendo o número

de hemócitos em função da fluorescência das partículas, verde (partículas de látex) ou vermelha

(zymosan e E. coli). As células-blásticas não apresentaram capacidade fagocítica e foram

retiradas desta análise.

28

Para a fagocitose de látex visualizou-se populações de hemócitos contendo diferentes

quantidades de partículas fagocitadas (1 a 2 partículas e 3 ou + partículas) (Fig. 8A e C).

Na fagocitose de zymosan e E. coli, não houve formação de picos definidos de

fluorescência. Com isto, para determinação da porcentagem de células fagocíticas o processo

foi distinto. Uma região no histograma da amostra sem adição de partículas (controle; Fig. 9B)

foi feita e a mesma região foi analisada na amostra com adição da partícula fluorescente

(tratado; Figs. 9C e 9D). A porcentagem de células com fluorescência da amostra tratada foi

diminuída da amostra controle (Fig. 9B).

Figura 5 - Citogramas e histogramas representativos para fagocitose de partículas de látex

fluorescentes

Citogramas representativos das populações analisadas, correspondendo aos hemócitos totais (A) e as

subpopulações hemocitárias (C). Histogramas (B e D) indicando a quantidade de hemócitos não

fagocíticos (M0) e fagocíticos (M1) que fagocitaram 1 a 2 partículas (M2) e mais que 3 (M3). O eixo X

(FSC) representa o tamanho celular e o Y (SSC) a granulosidade interna. Nos histogramas, o eixo Y

representa a quantidade de células e no eixo X o canal de fluorescência vermelho.

29

Figura 96 - Citogramas e histogramas representativos para fagocitose de Escherichia coli e

zymosan fluorescentes

Citogramas representativos da população total de hemócitos analisada (A). Histogramas de

fluorescência dos hemócitos sem adição de partículas (B; amostra controle) e com adição de E. coli (C)

e de zymosan (D). As regiões de fagocitose foram determinadas pelas linhas. No citograma, o eixo X

(FSC) representa o tamanho celular e o Y (SSC) a granulosidade interna. Nos histogramas, o eixo Y

representa a quantidade de células e no eixo X o canal de fluorescência vermelho.

30

3.6 Análises estatísticas

Os dados de porcentagem foram transformados para arco cosseno [acos(sqrt (X/100))]

para respeitar aos requerimentos da ANOVA. A normalidade de todos os grupos de dados foi

verificada com o teste D’Agostino & Person.

O teste de Kruskal-Wallis com post-hoc teste de separação de médias de Dunns foi

realizado para analisar dados não-paramétricos, como o tamanho celular das populações de

hemócitos obtidos por análise em microscopia óptica das monocamadas de hemócitos e por

citometria de fluxo. Para a comparação das proporções celulares obtidas com as duas técnicas

citadas anteriormente, foi realizado o teste de independência (teste G), utilizando uma tabela de

contingência e o teste χ² (Rohlf & Sokal, 1981).

Uma ANOVA Two-way foi realizada para comparar a fagocitose de diferentes partículas:

E. coli, Zymosan e látex. A réplica do experimento (coletas de agosto, setembro e outubro de

2014) foi considerada um segundo fator. Não havendo diferenças entre as réplicas, foi realizada

uma ANOVA one-way, sendo o tipo de partícula o fator principal, e um post-hoc teste de

separação de médias de Tukey.

O teste T não-pareado foi utilizado para 1) comparar a fagocitose de E. coli e látex

(separadamente); e 2) comparar a capacidade fagocítica de partículas de látex (separadamente)

entre as subpopulações de hemócitos (granulócitos e hemócitos hialinos + hemócitos

vesiculares).

Os dados estão representados como média ± erro padrão (EP). Todas as análises foram

feitas no software GraphPad versão 5.0.

31

4. RESULTADOS

Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica

A hemolinfa das ostras da espécie C. gasar apresentou em sua composição diferentes

populações celulares que se mostraram mais ou menos definidas segundo a técnica utilizada.

Por microscopia óptica cinco populações puderam ser distinguidas por suas

características morfológicas e tintoriais, sendo assim denominadas: granulócitos grandes,

granulócitos pequenos, hemócitos vesiculares, hialinócitos e células tipo-blásticas.

Os granulócitos grandes apresentaram o maior tamanho entre as subpopulações

observadas (31,5 ± 0,31 µm; n = 27; Tab. 1). Este tipo celular apresentou muitos grânulos

basófilos (Figs. 10B e D) distribuídos por todo o citoplasma e se coraram também com o

vermelho neutro (Figs. 10A e C). A porcentagem observada deste tipo celular foi de 14,4% (±

1,58; Tab. 1). Em ambos os tipos de monocamadas, estas células projetaram filipódios (Fig.

10A) e lamelipódios (Fig. 10C). Observou-se o ectoplasma e o endoplasma contendo os

grânulos quando corados com Giemsa (Figs. 10B e D). O núcleo mostrou-se excêntrico na

maioria das células, redondo ou oval e com baixa relação núcleo:citoplasma.

Tabela 1. Média (± E. P.) do tamanho celular (µm e unidades arbitrárias) e da porcentagem (± E. P.)

das subpopulações de hemócitos da hemolinfa da ostra Crassostrea gasar. Diferentes letras indicam

diferenças significativas do tamanho entre as diferentes populações celulares. Análises independentes

para cada técnica.

Hemócitos

Giemsa* Citometria* Giemsa Citometria

Tamanho (µm) Tamanho (u.a.) Porcentagem (%) Porcentagem

(%) Nt Np

Granulócito

Grande 31,5 ± 0,31a 369,5 ± 12,96 a 14,4 ± 1,59 6,3 ± 0,79 694 27#

Granulócito

Pequeno 11,9 ± 0,22 c 160,3 ± 4,32 b 4,8 ± 1,10 1,3 ± 0,15 282 27#

Hemócito

Vesicular 23,1 ± 0,24 b 303,1 ± 2,34 a 31,7 ± 2,66 38,2 ± 2,13 528 27#

Hialinócito 10,7 ± 0,13 c 138,7 ± 2,3 b 33,0 ± 2,12 43,8 ± 1,85 529 27#

Células Blásticas 5,4 ± 0,06 d 43,55 ± 0,35 d 16,0 ± 1,53 10,6 ± 1,24 489 27#

* p < 0,0001 (Kruskal-Wallis com post-hoc teste de Dunns); Nt = Número de células medidas por

microscopia óptica; Np = Número de animais usados para cálculo da porcentagem. # 3 animais foram

descartados.

32

Os granulócitos pequenos apresentaram tamanho médio de 11,9 µm (± 0,21; n = 27;

Tab. 1) e foram as células menos abundantes (4,8% ± 1,09; Tab. 1). Os grânulos mostraram-

se abundantes e quando corados com vermelho neutro recobriam o núcleo (Figs. 11A e B), que

foi visualizado quando a célula foi corada com Giemsa. Seus grânulos eram basófilos (Figs.

11A e B). Estas células apresentaram baixa relação núcleo:citoplasma e raramente emitiam

pseudópodes.

Os hemócitos vesiculares apresentaram tamanho médio de 23,1 µm (± 0,24; n = 27;

Tab. 1) com grânulos refringentes (Fig. 12A) e raramente basófilos, com citoplasma levemente

acidófilo (Fig. 12B) e sua porcentagem na hemolinfa foi de 31,7% (± 2,65; Tab. 1). A célula

mostrou dois tipos de formatos após adesão espontânea, circular ou estrelado. O núcleo era

excêntrico ou central e a célula possuía uma baixa relação núcleo:citoplasma. A célula

apresentou projeções na forma de lamelipódios, sendo possível observar o ectoplasma e o

endoplasma (Fig. 12B).

Os hialinócitos apresentaram tamanho de 10,7 µm (± 0,12; n = 27; Tab. 1), sendo este

similar ao dos granulócitos pequenos. O citoplasma não apresentou grânulos, exceto em raras

exceções onde observou-se grânulos basófilos. Este tipo celular foi o mais abundante na

hemolinfa (33,0% ± 2,12; Tab. 1). As células eram geralmente arredondadas ou alongadas e

raramente emitiam projeções citoplasmáticas (Fig. 13A). O núcleo era grande, excêntrico ou

central e possuía escasso citoplasma basófilo (Fig. 13B). Esta célula apresentou alta relação

núcleo:citoplasma (Fig. 13).

33

Figura 10 - Granulócitos grandes da hemolinfa de Crassostrea gasar

Hemócitos corados com vermelho neutro (A e C, contraste de fase) e Giemsa (B e D). Note as projeções

citoplasmáticas do tipo filipódios e lamelipódios (setas largas), o ectoplasma (setas finas), o endoplasma

contendo numerosos grânulos (setas pontilhadas) e os núcleos (pontas de flecha).

34

Figura 11 - Granulócitos pequenos da hemolinfa de Crassostrea gasar

Hemócitos corados com vermelho neutro (A, contraste de fase) e Giemsa (B). Note as projeções

citoplasmáticas do tipo filipódios (seta larga), o ectoplasma (seta fina), o endoplasma contendo

numerosos grânulos (setas pontilhadas) e o núcleo (ponta de flecha).

Figura 7 - Hemócitos vesiculares da hemolinfa de Crassostrea gasar


citoplasmáticas do tipo filipódios e lamelipódios (setas largas), o ectoplasma (setas finas), o endoplasma

contendo alguns grânulos refringentes ou raramente basófilos (setas pontilhadas) e os núcleos (pontas

de flecha).

35

Figura 8 - Hialinócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar


citoplasmáticas do tipo filipódios (setas largas), o endoplasma (seta pontilhada) e os núcleos (pontas de

flecha).

As células do tipo-blásticas foram as menores observadas, apresentando um tamanho

médio de 5,4 µm (± 0,05; n = 27; Tab. 1) e porcentagem de 16,0% (± 1,53; Tab. 1). Seu núcleo

era excêntrico, com citoplasma fortemente basófilo e possuia uma alta razão núcleo:citoplasma.

Raramente se observou filipódios em células do tipo-blásticas coradas com vermelho neutro

(Fig. 14).

Figura 9 - Células tipo-blásticas da hemolinfa de Crassostrea gasar

Células tipo-bláticas coradas com vermelho neutro (A, contraste de fase) e Giemsa (B). Observe a

pequena área citoplasmática (seta pontilhada) e o núcleo (ponta de flecha).

36

Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo

Os citogramas (tamanho vs compexidade interna, respectivamente, FSC vs SSC)

indicaram a presença de cinco subpopulações de hemócitos (Fig. 15; Tab. 1). Os hemócitos

com menor tamanho e granulosidade foram denominados de células tipo-blásticas (Fig. 13.

BL). Duas outras populações celulares com maior tamanho e granulosidade foram classificadas

como hialinócitos (Fig. 15. HH) e hemócitos vesiculares (Fig. 15. HV). As duas populações

com maior granulosidade, mas similares entre si, foram classificados como granulócitos, e estas

apresentaram diferenças em tamanho, correspondendo aos granulócitos grandes (Fig. 15. GG)

e pequenos (Fig. 15. GP).

As células mais frequentes na hemolinfa das ostras foram os hialinócitos e hemócitos

vesiculares e as menos frequentes foram os granulócitos pequenos (Tab. 1). Este resultado

ocorreu tanto para as monocamadas coradas com Giemsa quanto por citometria de fluxo. No

entanto, as proporções celulares obtidas com elas diferiram (G = 9,27; GL = 4) (Tab. 1).

37

Figura 105 - Populações de hemócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar observadas por

citometria de fluxo

Citograma morfológico representativo onde o eixo X (FSC-Height) representa o tamanho celular e o

eixo Y (SSC-Height) a granulosidade interna. Destacam–se 5 subpopulações de hemócitos,

denominadas de células tipo-blásticas (BL); hialinócitos (HH); hemócitos vesiculares (HV);

granulócitos grandes (GG) e granulócitos pequenos (GP).

Caracterização da capacidade fagocítica de hemócitos por citometria de fluxo

Os hemócitos da ostra C. gasar foram capazes de fagocitar os três tipos diferentes de

partículas com os quais foram desafiados: látex (Fig. 16A e B), E. coli (Fig. 16C e D) e zymosan

(Fig. 16E e F). No entanto, os hemócitos mostraram uma atividade fagocítica diferencial, ou

seja, as partículas de zymosan (15,1% 0,94), seguidas das partículas de látex (9,7% 0,45)

foram as mais fagocitadas pelos hemócitos quando comparadas com as bactérias E. coli (5,0%

0,54) (p < 0.0001) (Fig. 17).

38

Figura 11 - Fagocitose de diferentes partículas por hemócitos de Crassostrea gasar

Fagocitose de partículas de látex (A e B), E. coli (C e D) e zymosan (E e F) observadas em microscopia

de contraste de fase e (coluna da direita) e em campo escuro (coluna da esquerda). As partículas ou

agregados de partículas fagocitados estão indicadas pelas flechas.

39

Figura 17 - Fagocitose (%) de diferentes partículas pelos hemócitos da ostra Crassostrea gasar

Lát

ex

Zym

osan

E. c

oli

0

5

10

15

20

b

a

c

% d

e h

emóci

tos

As diferentes letras indicam diferenças da fagocitose entre os três tipos de partículas testadas. (ANOVA

One-way; p < 0.0001).

No caso das partículas de látex e de E. coli foi possível analisar a fagocitose diferencial

entre duas populações de hemócitos: os granulócitos e os hialinócitos + hemócitos vesiculares

(Fig. 18). Para as partículas de látex, os granulócitos foram significativamente (teste t; p <

0.0001) mais fagocíticos (40,1% 1,87) que os hialinócitos + hemócitos vesiculares (7,2%

0,36) (Fig. 18A). Ao contrário, em relação as bactérias E. coli, os hialinócitos + hemócitos

vesiculares foram mais fagocíticos (teste t; p < 0.0001) (5,0% 0,80) que os granulócitos (0,3%

0,15) (Fig. 18B).

40

Figura 128 - Fagocitose (%) diferencial de partículas de látex e E. coli em ostras Crassostrea

gasar

Fagocitose de partículas de látex (A) e de E. coli (B) por diferentes subpopulações de hemócitos. HH:

Hialinócitos; HV: Hemócitos vesiculares; G: Granulócitos. * Indicam diferenças significativas (Teste

t; p < 0.0001) entre as subpopulações de hemócitos para cada partícula.

A capacidade fagocítica das partículas de látex foi determinada para as duas populações

de hemócitos: granulócitos e hialinócitos + hemócitos vesiculares separadamente e está

representado na Fig. 19. Os hialinócitos + hemócitos vesiculares foram as células que mais

fagocitaram (p < 0.0001) 1 a 2 partículas (63,0 0,82%) enquanto que os granulócitos

fagocitaram significativamente 3 ou + partículas (42,2 1,79%) (Fig. 19).

Figura 19 – Capacidade fagocítica (%) de partículas de látex pelos hemócitos de Crassostrea

gasar

2 par

tícula

s)

HH +

HV (

2 par

tícula

s)

G (

3 p

artíc

ulas)

HH +

HV (

3 p

artíc

ulas)

G (

0

20

40

60

80

100 *

*

Ca

pa

cid

ad

e F

ag

ocí

tica

(%

)

Os hialinócitos + hemócitos vesiculares (HH + HV) possuem uma alta capacidade de fagocitar partículas

de látex (2 partículas ou menos, enquanto que os granulócitos (G) possuem uma maior capacidade de

fagocitar 3 ou mais partículas. (Teste t; p < 0.0001).

41

5. DISCUSSÃO

5.1. Caracterização morfológica dos hemócitos de C. gasar

O presente trabalho representa a primeira caracterização morfológica e funcional dos

hemócitos da ostra C. gasar. Recentemente, nosso grupo de pesquisa fez o primeiro estudo em

células do sistema de defesa (hemócitos) desta espécie (Queiroga et al., 2013) e avaliou algumas

respostas celulares (fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio) frente à infecção

pelo protozoário do gênero Perkinsus.

Na hemolinfa das ostras C. gasar foram identificadas duas populações principais de

hemócitos, os granulócitos e os hialinócitos, já descritas e bem caracterizadas para os bivalves

(Cheng, 1981; Hine, 1999). Queiroga et al. (2013) não tiveram a pretensão de realizar um estudo

minucioso das células de defesa desta ostra, mas igualmente identificaram por citometria de

fluxo as duas principais populações (granulócitos e hialinócitos).

No presente estudo, os hemócitos diferenciaram-se por suas características citoquímicas

e morfológicas, incluindo o tamanho, granulosidade interna e relação núcleo:citoplasma, em

cinco subpopulações: os granulócitos grandes, os granulócitos pequenos, os hialinócitos, os

hemócitos vesiculares e as células do tipo-blásticas.

Subpopulações hemocitárias foram descritas para várias espécies de bivalves (Hine, 1999)

e foram correspondentes as observadas no presente estudo.

Os granulócitos em geral se diferenciam dos demais hemócitos por possuírem inúmeras

vesículas no seu citoplasma, facilmente distinguíveis no citosol por um aspecto granuloso,

quando coradas (associação com corantes) ou não (refringência da luz) e observadas ao

microscópio de luz. Esta característica não é observada em nenhum outro tipo de hemócito

(Hine, 1999). Um estudo com hemócitos do mexilhão M. edulis, mostrou que estas vesículas

comportam diversas enzimas, dentre elas hidrolases ácidas e a lisozima, responsáveis pela

destruição de partículas estranhas ao organismo (Pipe, 1990). Por este motivo, os granulócitos

são considerados o tipo celular mais apto à defesa imune (Pipe, 1990).

Neste estudo não foi feita nenhuma caracterização enzimática, mas foi possível confirmar

a presença das vesículas ácidas coradas no citosol e a maior granulosidade intracelular, que se

associam diretamente com a quantidade de vesículas e organelas celulares. As características

dos granulócitos da ostra C. gasar também foram observadas em outras espécies do gênero,

como em C. virginica (McCormich-Ray & Howarwt, 1991) e C. rhizophorae (Rebelo et al.,

2013) e em berbigões R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012).

42

Os hialinócitos também foram encontrados na hemolinfa de C. gasar. Este tipo celular foi

caracterizado por possuir alta relação núcleo:citoplasma e pouco ou nenhum grânulo

intracelular. Tais características foram descritas para hemócitos de outros ostreídeos, como a

ostra nativa do Brasil C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013), mas também em C. virginica

(Cheng, 2009), C. gigas e O. edulis (Auffret, 1989). Além de outros bivalves, como A. cygnea

(Soares-da-Silva et al., 2002; Salimi et al., 2009) e M. galloprovincialis (Carballal et al., 1997).

Os hemócitos vesiculares encontrados na hemolinfa de C. gasar são semelhantes

morfologicamente aos granulócitos, sendo grandes e apresentando baixa relação

núcleo:citoplasma. Entretanto, diferem destes por não possuírem nenhum ou poucos grânulos

citoplasmáticos, o que foi evidente pelo aspecto refringente mesmo após adição de corantes. Os

hemócitos vesiculares foram descritos também em ostras O. edulis e C. gigas (Auffret, 1989)

e C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013).

As células do tipo-blásticas foram as menores células encontradas neste estudo. Possuem

alta relação núcleo:citoplasma e alta basofilia. Essa grande afinidade pelo corante básico é uma

característica que pode ser explicada pela ocorrência de muitos ribossomos livres (ricos em

RNA ribossomal de caráter ácido) (Auffret, 1989; Russell-Pinto et al., 1994; Wen et al., 1994;

Carballal et al., 1997). Estas características estruturais sugerem que as células tipo-blásticas

estão envolvidas no processo hematopoiético (Hine, 1999; Rebelo et al., 2013). Sugere-se que

estas células sejam capazes de maturar na hemolinfa, ou seja, transformar-se morfologicamente

e fisiologicamente em outros tipos hemocitários como os hialinócitos, granulócitos ou

hemócitos vesiculares (Rebelo et al., 2013).

Através da técnica de citometria de fluxo, foi possível identificar e quantificar com

sucesso as subpopulações hemocitárias da hemolinfa de C. gasar. Diversos estudos têm

empregado esta técnica para compreender e elucidar, principalmente, a função dos hemócitos

de outros bivalves, como nos ostreídeos O. edulis (Renault et al., 2001), C. gigas (Lambert et

al., 2003), C. ariakensis (Donaghy et al., 2009), C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013), os

venerídeos, como R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012) e R. philippinarum (Donaghy et

al., 2009b) e A. cygnea (Soares-da-Silva et al., 2002).

Os hialinócitos e hemócitos vesiculares constituíram as subpopulações hemocitárias mais

abundantes. Esta observação foi coincidente tanto por citometria de fluxo quanto por

microscopia óptica e este perfil foi descrito também para a hemolinfa de ostras C. ariakensis

(Donaghy et al., 2009) e C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013) e de pectinídeos Argopecten

irradians (Zhang et al., 2006). Sabe-se que a alteração na proporção dos tipos hemocitários está

associada principalmente à susceptibilidade dos animais aos parasitos, como descrito na ostra

43

O. edulis infectada pelo protozoário Bonamia ostreae (Comesaña et al., 2012). Inclusive na

ostra C. gasar foi observado que na infecção avançada pelo protozoário Perkinsus sp., os

parasitos podem induzir ou causar uma alteração nas proporções de hialinócitos e células do

tipo-blásticas (Queiroga et al., 2013). Outros fatores ambientais podem levar à esta alteração,

como a presença de químicos no ambiente, como foi observado no gastrópode Bellamya

bengalensis e no bivalve Lamellidens marginalis (Ray et al., 2013).

Portanto, conhecer os tipos celulares da hemolinfa e as proporções das subpopulações de

hemócitos de uma espécie em condições normais é fundamental para análises futuras do

impacto de agentes biológicos, químicos ou de outra natureza.

5.2. Caracterização da capacidade fagocítica dos hemócitos de C. gasar por citometria

de fluxo

Independentemente do tipo de hemócito, o zymosan e o látex foram as partículas mais

fagocitadas quando comparadas às bactérias E. coli. Isto demonstra que estas células são

capazes de reconhecer diversas moléculas não-próprias. Dentre elas, as que contém β1,3-

glicanos (zymosan), presentes nas paredes de fungos, e algumas moléculas presentes na parede

da bactéria E. coli, como o LPS. Contudo, a baixa fagocitose de E. coli em relação a de outras

partículas pode estar relacionada à sua não-patogenicidade para os bivalves (Tubiash, 1971) ou

estas bactérias podem estar sendo mortas extracelularmente, através do uso de redes (NETs, do

inglês, Neutrophil extracellular traps), e não fagocitadas (Ng et al. 2013). Este fato, pode ainda

estar associado aos tipos de receptores expressos e o tempo de análise (Zhang et al. 2014). Nos

berbigões R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012) e M. galloprovincialis (García-García et

al., 2008) foi observado resultado semelhante, sendo a fagocitose de bactérias a menor dentre

as partículas testadas.

As bactérias do gênero Vibrio são Gram-negativas e abundantes na água do mar, assim

como a E. coli, mas ao contrário destas, podem ser bastante patogênicas para bivalves (Tubiash,

1971). A infecção de diversas larvas de bivalves por bactérias deste gênero causa anormalidades

na formação da concha, problemas de crescimento e mortalidade (Figueras & Novoa, 2011).

Curiosamente, neste estudo, subpopulações de hemócitos mostraram uma diferente

capacidade fagocítica segundo o tipo de partícula. Os granulócitos foram as células que mais

fagocitaram as partículas de látex, enquanto que os hialinócitos e hemócitos vesiculares foram

as células que mais fagocitaram a E. coli. De forma semelhante ao observado no venerídeo R.

decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012) e no ostreídeo C. ariakensis (Donaghy et al., 2009a),

44

os granulócitos foram as células que mais fagocitaram látex, demonstrando que essas células

são mais aptas a fagocitar partículas estranhas ao organismo, como o poliestireno presente nas

microesferas de látex.

Em relação a E. coli, apenas, os resultados em M. galloprovincialis (García-García et

al., 2008) e C. gigas (Terahara et al., 2006) contrapuseram o observado aqui, pois foi visto uma

maior fagocitose dessa bactéria pelos granulócitos. No presente estudo, o fato da ausência de

um número elevado de granulócitos que fagocitam E. coli pode ter ocorrido devido a

degranulação desta célula, como observado em C. gigas (Iizuka et al., 2014), visto que o

hemócito vesicular aparece em grande quantidade na hemolinfa, ou ainda pode ter ocorrido a

formação de armadilhas extracelulares (NETs), o que levaria a morte dos hemócitos (Ng et al.

2013).

A fagocitose é a principal resposta de defesa desencadeada por parasitas de pequeno

tamanho e pode ser inibida ou potencializada por um agente infeccioso. Como verificado em

ostras C. gasar infectadas pelo protozoário Perkinsus sp. (Queiroga et al., 2013) e em Anadara

trapezia infectados com trematódeos (Dang et al., 2013), este mecanismo de defesa pode ser

inibido.

45

6. CONCLUSÕES

A hemolinfa da ostra Crassostrea gasar é composta por cinco subpopulações de

hemócitos: os granulócitos grandes, granulócitos pequenos, hialinócitos, hemócitos

vesiculares e células do tipo-blásticas.

A citometria de fluxo mostrou-se uma técnica útil em estudos de aspectos morfológicos e

funcionais de hemócitos de bivalves.

A maior fagocitose de zymosan e partículas de látex mostra que os hemócitos da espécie

Crassostrea gasar são capazes de reconhecer partículas estranhas ao organismo, como o

β1,3-glucano presente na parede de fungos.

Mesmo sendo considerada não-patogênica para bivalves, a E. coli é fagocitada em grande

parte por hialinócitos e hemócitos vesiculares, indicando que há reconhecimento de

bactérias Gram-negativas pelos hemócitos.

A maior fagocitose de látex (≥ 3 partículas) pelos granulócitos indica que esta é célula

mais responsável pela defesa da ostra.

A maior fagocitose de látex (≤ 2 partículas) por hialinócitos e hemócitos vesiculares indica

que estas células também respondem à estímulos externos.

46

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