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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ELVISCLEY DE OLIVEIRA SILVA
PRODUÇÃO DE EXTRATO DE Artemisia annua L. ASTERACEAE E O USO DESTE
NA OBTENÇÃO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS
Goiânia
2015
I
ELVISCLEY DE OLIVEIRA SILVA
PRODUÇÃO DE EXTRATO DE Artemisia annua L. ASTERACEAE E O USO DESTE
NA OBTENÇÃO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal de Goiás, como
requisito necessário à obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa Freitas Bara
Co-orientador: Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição
Goiânia
2015
II
Dedico este trabalho à minha esposa, Cecília, que com
amor e paciência me apoiou durante todo o período de sua
realização. À minha mãe, Lindalva, que sempre foi minha
inspiração de trabalho com dedicação e honestidade.
III
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Teresa Freitas Bara, que demonstrou admirável com-
petência e conhecimento durante todas as etapas deste trabalho, sempre oferecendo atencio-
samente seu auxílio.
Ao Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição, ao qual serei sempre muito grato pela confi-
ança depositada em mim, por me convidar para ingressar no mestrado, uma oportunidade ím-
par de aprendizado.
Ao Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto, pelo seu auxílio no desenvolvimento de partes deste
estudo e pela grata satisfação de ter sido seu aluno no curso.
Aos novos amigos do Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais (LPPN), Leandra, Rúbia,
Mariana, Marcos Túlio, Nathália, Karen, Wanessa, Mythali, Rejane, Leonardo, Maria Juíva,
entre outros, que possibilitaram que eu aprendesse ainda mais por compartilhar suas experiên-
cias.
Aos colegas e amigos do Farmatec, Letícia, André e Raphael, por terem me auxiliado com
atenção e empenho.
Aos meus amigos do Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQM), pelo
apoio e compreensão.
IV
RESUMO
A Artemisia annua é originária da China, onde é utilizada há mais de dois mil anos no
tratamento de diversas patologias, principalmente malária. O composto químico de principal
importância terapêutica é a artemisinina, uma lactona sesquiterpênica que contém um anel
endoperóxido, responsável pela potente atividade antimalárica da planta. Apenas um estudo
sobre a produção de formas farmacêuticas com extrato de A. annua foi encontrado na
literatura e não foram encontrados no mercado fitoterápicos contendo este. Desta forma, o
objetivo principal deste trabalho foi a obtenção de extrato concentrado de partes aéreas de A.
annua e utilização deste para produção de formas farmacêuticas sólidas. A droga vegetal
apresentou teor de artemisinina de 1,15 ± 0,05 %. Todos os ensaios da validação do método
analítico ficaram dentro das especificações, com LD e LQ de 1,3 µg/mL e 4,0 µg/mL de
artemisinina, respectivamente. As validações parciais para análise dos comprimidos, cápsulas
e péletes também ficaram dentro das especificações nos ensaios realizados. A droga vegetal
foi percolada e obteve-se rendimento de 80 % na extração de artemisinina. Quatro quilos de
droga vegetal deram origem a 2,5 litros de extrato concentrado, com 1,47 % (m/v) de
artemisinina e 30,78 % (m/m) de resíduo seco. Este foi utilizado para produzir péletes,
cápsulas e comprimidos, que contiveram 8,1 mg, 9,6 mg e 10,0 mg de artemisinina,
respectivamente. Todas apresentaram determinação de peso e uniformidade de conteúdo
dentro das especificações, demonstrando que sua produção foi eficiente em relação à dosagem
de artemisinina almejada. Os comprimidos apresentaram dissolução imediata somente em pH
6,8. Em pH 1,2 desintegraram em 60 min, com liberação de 85,2 % de artemisinina, contra
99,8 % das cápsulas, em 20 min, e 103,3 % e dos péletes, em 30 min. O perfil de dissolução
das cápsulas e dos péletes revelou uma dissolução imediata muito rápido em pH 1,2 e 6,8.
Logo, a eficiência de dissolução (ED) dos comprimidos foi menor que das cápsulas e dos
péletes, em ambos os pH. O valor de F2 indicou diferença entre os perfis dos comprimidos
nos diferentes valores de pH, sendo a menor dissolução em pH 1,2. As formulações
preparadas neste trabalho demonstraram como o extrato concentrado de A. annua pode ser
utilizado na fabricação de fitoterápicos com teor de artemisinina próximo do esperado e
demais propriedades físico-químicas adequadas.
Palavras-chaves: Extrato vegetal, fitoterápicos, perfil de dissolução, validação analítica.
V
ABSTRACT
Artemisia annua is originally from China, where it is used over two thousand years in the
treatment of various diseases, especially malaria. The chemical compound of main therapeutic
importance is artemisinin, a sesquiterpene lactone with an endoperoxide ring, responsible for
potent antimalarial activity of the plant. Only one study about the production of
pharmaceutical forms to A. annua extract was found in the literature. The main objective of
this work was to obtain a concentrated extract of aerial parts of A. annua and using this for
production of phytomedicines. The vegetal drug showed adequate physicochemical properties
and artemisinin content of 1.15 ± 0.05 %. All assays of the analytical method validation were
in specifications with LOD and LOQ of 1.3 mg/ml and 4.0 mg/ml of artemisinin, respectively.
The partial validations for analyze of tablets, capsules and pellets were within the
specifications in selectivity, linearity and repeatability testing. The vegetable drug was
percolated and obtained 80% yield artemisinin extraction. Four kilograms of vegetable drugs
yielded 2.5 liters of concentrated extract with 1.47% (w/v) of artemisinin and 30.78% (w/w)
of dry residue. This was used to produce pellets, tablets and capsules, which contained 8.1
mg, 9.6 mg and 10.0 mg of artemisinin, respectively. All showed determination weight and
content uniformity within specifications, demonstrating that the manufacture from the
concentrated extract was effective in relation to the desired dosage artemisinin. The tablets
showed immediate dissolution at pH 6.8 only. At pH 1.2 disintegrated in 60 minutes,
releasing 85.2% of artemisinin against 99.8% of the capsules at 20 min, and 103.3% of pellets
at 30 minutes. The dissolution profile of the capsules and pellets showed a very fast
immediate dissolution at pH 1.2 and 6.8. Therefore, the dissolution efficiency (DE) of the
tablets was lower than that of the capsules and pellets, for both pH values. The value F2
indicated a difference between the profiles of the tablets at different pH values, with the
smallest dissolution in pH 1.2. The formulations prepared in this study demonstrated how the
concentrate extract of A. annua can be used to manufacture phytomedicines content artemisinin
near the expected and other appropriate physico-chemical properties.
Keywords: Vegetal extract, phytomedicines, dissolution profile, analytical validation.
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Arbusto de Artemisia annua L 13
Figura 02. Estrutura molecular da artemisinina 16
Figura 03. Aducto formado pela ligação da artemisinina ao heme 17
Figura 04. Ciclos de vida do Plasmodium falciparum no mosquito e no homem,
mostrando os estágios exo-eritrocítico e eritrocítico
19
Figura 05. Distribuição de tamanho das partículas 41
Figura 06. Varredura da artemisinina sem derivatização 41
Figura 07. Reação de derivatização da artemisinina 42
Figura 08. Varredura do Composto Q260 de Artemisia annua L. derivatizada 42
Figura 09. Valores de AUC após adição de NaOH 0,05 M sem aquecimento 43
Figura 10. Cromatograma da artemisinina antes da derivatização 43
Figura 11. Cromatograma da artemisinina após a derivatização (ampliação) 44
Figura 12. Estabilização da solução de leitura após a derivatização 44
Figura 13. Estabilidade do composto Q260 versus composto Q292 45
Figura 14. Cromatograma da artemisinina padrão sem derivatização, com fase móvel
acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6 mm, 210 nm
46
Figura 15. Cromatograma mostrando picos de compostos remanescentes da injeção da
amostra, com FM acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6
mm
46
Figura 16a. Cromatograma da Artemisia annua L. e do padrão de artemisinina sem
derivatizar, em acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min
48
Figura 16b. Cromatograma da Artemisia annua L. derivatizada, em acetonitrila:ácido
fórmico 0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min
48
Figura 17. Espectro de varredura ultravioleta de 200 a 400 nm do composto Q260 de
Artemisia annua L
49
Figura 18. Cromatogramas sobrepostos do composto Q260, em 255 nm, da Artemisia
annua L. (preto) e do padrão (azul), identificando o composto Q260
49
Figura 19. Curva analítica do padrão de artemisinina 50
Figura 20. Gráfico da linearidade e de resíduos da análise de Artemisia annua L 50
Figura 21. Quantidade de artemisinina (g) e de resíduo seco (%) em cada etapa da
extração
56
Figura 22. Eficiência de extração de artemisinina em cada fração 56
VII
Figura 23. Comparação da artemisinina na droga vegetal e extrato percolado e
concentrado
57
Figura 24. Cromatograma dos péletes e do padrão de artemisinina 58
Figura 25. Linearidade e gráfico de resíduos da análise de péletes 59
Figura 26. Cromatograma das cápsulas e do padrão de artemisinina 60
Figura 27. Linearidade e gráfico de resíduos da análise das cápsulas 61
Figura 28. Cromatograma dos comprimidos e do padrão de artemisinina 62
Figura 29. Linearidade e gráfico de resíduos da análise dos comprimidos 63
Figura 30. Formulação de péletes número 7. 66
Figura 31. Cápsulas de péletes de extrato hidroalcoólico de A. annua 66
Figura 32. Comprimidos de extrato hidroalcoólico de A. annua 67
Figura 33. Cápsulas de granulado de extrato hidroalcoólico de A. annua 67
Figura 34. Perfis de dissolução em tampão pH 1,2 71
Figura 35. Perfis de dissolução em tampão pH 6,8 71
Figura 36. Comparação entre dissolução, após 60 min, das formas farmacêuticas em
pH 1,2 e pH 6,8
72
Figura 37. Comparação entre eficiência de dissolução das formas farmacêuticas em pH
1,2 e pH 6,8
72
Figura 38. Perfis de dissolução dos comprimidos de A. annua em pH 1,2 e pH 6,8 73
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Composição dos péletes nas diferentes formulações testadas 35
Tabela 02. Dados da curva de calibração do padrão de artemisinina 50
Tabela 03. Dados da Linearidade da Análise de Artemisia annua L 51
Tabela 04. Resultados da repetibilidade da análise de Artemisia annua L 51
Tabela 05. Resultados da precisão intermediária da análise da droga vegetal 52
Tabela 06. Precisão obtida por outros trabalhos 52
Tabela 07. Resultados da exatidão, em três níveis, da análise de Artemisia annua
L
53
Tabela 08. Exatidão obtida por outros trabalhos 53
Tabela 09. Resultados da análise do LD e LQ 54
Tabela 10. Limites de detecção e quantificação de artemisinina obtida por outros
trabalhos
54
Tabela 11. Resultados da robustez do método analítico na análise de Artemisia
annua L
55
Tabela 12. Adequabilidade do Sistema do Cromatograma de Artemisia annua L 55
Tabela 13. Resultado da caracterização do extrato antes e após a concentração 57
Tabela 14. Adequabilidade do sistema do cromatograma de péletes 58
Tabela 15. Dados da linearidade da análise dos péletes 59
Tabela 16. Dados da linearidade da análise dos péletes 59
Tabela 17. Adequabilidade do sistema do cromatograma de cápsulas 60
Tabela 18. Dados da linearidade da análise das cápsulas 61
Tabela 19. Repetibilidade da análise do granulado das cápsulas 62
Tabela 20. Adequabilidade do sistema do cromatograma de comprimidos 62
Tabela 21. Dados da linearidade da análise dos comprimidos 63
Tabela 22. Repetibilidade na análise dos comprimidos 64
Tabela 23. Propriedades dos péletes obtidos nas diferentes formulações 64
Tabela 24. Determinação de peso das formas farmacêuticas 68
Tabela 25. Teor de artemisinina previsto para cada forma farmacêutica 70
Tabela 26. Uniformidade de conteúdo das formas farmacêuticas 70
IX
QUADROS
Quadro 01. Condições cromatográficas em HPLC-PDA testadas para doseamento
de artemisinina em Artemisia annua L
29
Quadro 02. Quantidade de solvente utilizado na percolação 33
Quadro 03. Composição do granulado dos comprimidos 37
X
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 13
1.1. Artemisia annua L. (ASTERACEAE) 13
1.2. ARTEMISININA 15
1.3. MALÁRIA 18
1.4. DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS 20
2. OBJETIVOS 27
2.1. OBJETIVO GERAL 27
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27
3. MATERIAL E MÉTODOS 28
3.1. MATERIAL VEGETAL 28
3.2. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL 28
3.3. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA
DOSEAMENTO DE ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL
28
3.3.1. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ANALÍTICOS 28
3.3.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 30
3.4. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO
DE Artemisia annua L
32
3.4.1. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE RELATIVA 33
3.4.2. DETERMINAÇÃO DA VISCOSIDADE 34
3.4.3. DETERMINAÇÃO DO RESÍDUO SECO 34
3.4.4. DETERMINAÇÃO DO PH 34
3.4.5. DETERMINAÇÃO DE ÁLCOOL 34
3.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DOS MÉTODOS DE DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NAS FORMAS FARMACÊUTICAS PREPARADAS
35
3.6. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PÉLETES 35
3.6.1. CÁLCULO DA ESFERICIDADE DE PÉLETES 36
3.6.2. DETERMINAÇÃO DE UMIDADE DOS PÉLETES 36
3.6.3. DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DOS
PÉLETES
36
3.7. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPRIMIDOS E CÁPSULAS 36
3.7.1. TESE DE DUREZA DE COMPRIMIDOS 37
3.7.2. TESTE DE FRIABILIDADE DE COMPRIMIDOS 38
XI
3.8. TESTE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS 38
3.9. TESTE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
38
3.10. TESTE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
39
3.11. PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS 39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 40
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL 40
4.2. AVALIAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO DE DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL
41
4.2.1. PREPARO DA SOLUÇÃO DE ANÁLISE POR DERIVATIZAÇÃO 41
4.2.2. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS 45
4.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL
48
4.3.1. SELETIVIDADE PARA DOSEAMENTO DE ARTEMISININA NA
DROGA VEGETAL
48
4.3.2. LINEARIDADE E INTERVALO DA ANÁLISE DE Artemisia annua
L. DROGA VEGETAL
49
4.3.3. PRECISÃO DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA
VEGETAL
51
4.3.3.1. REPETIBILIDADE DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA
VEGETAL
51
4.3.3.2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DA ANÁLISE DE Artemisia annua
L. DROGA VEGETAL
52
4.3.4. EXATIDÃO DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA
VEGETAL
53
4.3.5. LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO DA ANÁLISE
DE Artemisia annua L. DROGA VEGETAL
53
4.3.6. ROBUSTEZ DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA
VEGETAL
54
4.3.7. ADEQUABILIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO DA
ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA VEGETAL
55
4.4. OBTENÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO DE Artemisia annua L 55
4.4.1. CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS DE Artemisia annua L 56
XII
4.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NOS PÉLETES
57
4.5.1. SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS PÉLETES 57
4.5.2. LINEARIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS PÉLETES 58
4.5.3. REPETIBILIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS PÉLETES 59
4.6. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NAS CÁPSULAS
60
4.6.1. SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DAS CÁPSULAS 60
4.6.2. LINEARIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DAS CÁPSULAS 61
4.6.3. REPETIBILIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DAS
CÁPSULAS
61
4.7. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NOS COMPRIMIDOS
62
4.7.1. SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS
COMPRIMIDOS
62
4.7.2. LINEARIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS
COMPRIMIDOS
63
4.7.3. REPETIBILIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS
COMPRIMIDOS
63
4.8. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PÉLETES 64
4.9. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPRIMIDOS E
CÁPSULAS
67
4.10. CARACTERIZAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS 68
4.10.1. ANÁLISE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
68
4.10.2. ANÁLISE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
69
4.10.3. ANÁLISE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
69
4.10.4. ANÁLISE DE PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
70
5. CONCLUSÕES 75
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76
XIII
13
1. INTRODUÇÃO
1.1. Artemisia annua L. (ASTERACEAE)
A artemisia, como é conhecida popularmente, é originária da China, onde é utilizada
há mais de dois mil anos na medicina tradicional chinesa para tratamento de febres e malária
(NAEEM et al., 2014). Contudo, foi reconhecida mundialmente no final dos anos 70, após a
descoberta de que é a única fonte para isolamento e produção da artemisinina, um potente
antimalárico presente nos caules, folhas e inflorescências (FERREIRA, 1996).
É comumente conhecida como wormwood (em inglês), ou qinghao (do chinês, “erva
verde”). Na medicina tradicional chinesa, as partes aéreas secas são a parte mais utilizada para
tratamento da malária, tuberculose, e outros tipos de febre (WHO, 2006).
É uma planta herbácea anual, aromática, que pode chegar a 2 metros de altura,
dependendo da região onde é produzida e de aspectos agronômicos (Figura 01). Possui folhas
aromáticas e bem dissecadas, medindo de 2,5 a 5 cm de comprimento por 1 a 3 cm de largura.
As flores são pequenas e amarelas com tamanho entre 2 e 3 mm. Naturalmente é polinizada
por insetos e pelo vento (WHO, 2006).
Figura 01. Arbusto de Artemisia annua L.
Fonte:
http://webdrm.cpqba.unicamp.br/cpma/banco_de_dados/index.php?centro=select&N_ENTR
ADA=842
14
Apresenta boa adaptabilidade em clima tropical por meio da seleção de sementes e
híbridos, pois cresce em diferentes tipos de solo (FERREIRA et al., 1995; QUITÉRIO, 2006).
Poucos países a cultivam em larga escala, como a China, o Quênia, a República Unida da
Tanzânia e o Vietnã. Cultivares em pequena escala estão presentes na Índia, sul da Europa, e
América do Sul (WHO, 2006).
Sua composição química é constituída de constituintes voláteis e não-voláteis. Os
voláteis são principalmente os óleos essenciais, em torno de 0,2 a 0,25 %, compostos em sua
maior parte por canfeno, beta-canfeno, cânfora, beta-cariofileno e beta-pineno. Os não-
voláteis são, principalmente, sesquiterpenoides, flavonoides, cumarinas, proteínas e
esteroides. O composto químico de principal interesse terapêutico é a artemisinina (WHO,
2006). Contém aproximadamente 8,3 % de carboidratos, 6,1 % de lipídios e 14,2 % de fibras
(IQBAL et al., 2012).
Várias outras atividades farmacológicas da Artemisa annua L. vêm sendo estudadas e
demonstradas, como anti-hipertensiva (extrato aquoso), antimicrobiana (óleo essencial), anti-
inflamatória e antioxidante (extrato aquoso), imunossupressora (extrato etanólico),
parasiticida, antiviral (extrato aquoso), anticâncer e antimalárica (planta inteira), sendo esta
última a principal devido à quantidade presente de artemisinina e flavonoides (SADIQ, 2014).
Na droga vegetal a artemisinina não é o único composto com atividade antimalárica,
mas é o principal, sendo que ainda outros compostos presentes aumentam sinergicamente sua
atividade (KLAYMAN, 1985; ELFORD, 1987). Vários flavonoides, por exemplo, podem
promover o aumento da reação da artemisinina com o grupo heme, aumentando a potência
antimalárica da droga vegetal (BILIA et al., 2006). De forma geral, a biodisponibilidade da
artemisinina no sangue é aumentada em cerca de 40 vezes em ratos quando alimentados com
a planta inteira em comparação à administração do fármaco puro (ELFAWAL et al., 2012).
O teor de flavonoides na A. annua pode variar entre 9 % e 11 % e também já
demonstraram atividade antimalárica e antioxidante (OGWANG et al., 2011). Estes e outros
compostos presentes na droga vegetal, como glicosídeos e saponinas, melhoram a
solubilidade da artemisinina (ATEMNKENG et al., 2009) e auxiliam sinergicamente sua
atividade, o que é uma vantagem do extrato em relação ao fármaco purificado (ELFORD,
1987).
A introdução de genótipos superiores provenientes do Vietnã e o desenvolvimento de
novas técnicas realizadas na Suíça tornou possível o desenvolvimento de híbridos adaptados
às condições brasileiras (MAGALHÃES, 2004). As plantas tinham, antes do processo de
15
melhoramento, cerca de 0,01 % de artemisinina, e passaram a uma concentração maior que 1
%, por peso de matéria seca, após o processo adaptativo (FOGLIO, 2005).
Diversos fatores podem alterar a composição e a quantidade dos metabólitos
secundários em plantas medicinais, como sazonalidade, ritmo circadiano, temperatura,
disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, nutrientes disponíveis no solo, altitude, poluição
atmosférica, condições de coleta, estabilização e estocagem, entre outros. O valor terapêutico
da droga vegetal pode ser alterado se as condições críticas para aquela espécie não forem
devidamente controladas (GOBBO-NETO, 2007).
Tem sido observado que o uso de A. annua na forma de infusão apresenta eficácia
significativa no desaparecimento dos sintomas da malária e na redução da parasitemia
(MUELLER et al., 2000), inclusive em concentrações muito baixas de artemisinina, o que
indica que outras substâncias presentes no infuso podem apresentar atividade antimalárica e
agir sinergicamente (DONNO et al., 2012).
A Farmacopeia da República Popular da China lista oficialmente a droga seca A.
annua L. como um medicamento para febre e malária. A dose diária usual varia entre 4,5 e 9
gramas, preparado por infusão, utilizando água fervente (RATH et al., 2004).
Van der Kooy (2013) destaca que a A. annua é uma planta que aparentemente não
apresenta toxicidade, ao passo que possui pronunciada atividade em estudos in vitro. Em
trabalhos realizados por Weathers et al. (2014), pacientes tratados com comprimidos de folhas
secas de A. annua obtiveram resultados terapêuticos iguais ou superiores aos dos pacientes
tratados com artemisinina pura.
No Brasil, as pesquisas com artemísia foram adaptadas à condição tropical por meio
do estudo da reprodução, seleção de genótipos de florescimento tardio e seleção de híbridos
com boa produção de biomassa e artemisinina (MAGALHÃES, 1996). Estes estudos foram
desenvolvidos no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
(CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas/SP (Unicamp) onde, em uma área de 8.000
m² e um campo experimental de 40 hectares, cultiva diversas espécies e híbridos de artemisia
annua (CPQBA, 2014).
1.2. ARTEMISININA
A artemisinina é uma lactona sesquiterpênica, contendo um anel endoperóxido em sua
estrutura (Figura 02), que lhe confere potente atividade antimalárica, possuindo ação contra os
protozoários parasitas em concentrações nanomolares (MESHNICK, 1996). Apresenta-se
16
como um pó cristalino branco, possui peso molecular de 282,33 g/mol e fórmula molecular
C15H22O5. A faixa de fusão descrita em sua monografia é de 151 a 154 ºC (WHO, 2014).
Apresenta degradação térmica a aproximadamente 207 ºC (DONG et al., 2007).
Sua molécula possui baixa absorção no ultravioleta, por não conter grupamentos
cromóforos em sua estrutura. Desta forma, para análise em equipamento provido de detector
ultravioleta é necessário realizar uma derivatização por meio de reação com hidróxido de
sódio, em que o anel endoperóxido é clivado e um composto com maior absorção no
ultravioleta é formado (Zhao, 1986).
Figura 02. Estrutura molecular da artemisinina.
Fonte: Meshnick (1996).
Vários métodos foram descritos para análise de doseamento de artemisinina em A.
annua utilizando métodos cromatográficos, como cromatografia em camada delgada (CCD),
HPLC-ECD (Detecção eletroquímica), HPLC-ELSD (Detector de espalhamento de luz
evaporativo), HPLC-PDA (Detector ultravioleta de arranjo de diodos), GC-FID (Detector por
ionização em chama), GC-MS (Detector por espectrometria de massa), entre outros. Isso
ocorre principalmente devido à sua baixa absorção no ultravioleta, o que torna os métodos
com uso de detector ultravioleta menos sensíveis (PENG et al., 2006).
Foi isolada primeira vez em 1972 a partir da planta A. annua (Asteraceae) e, desde
então, sua eficácia contra malária tem sido amplamente demonstrada, tanto em relação a sua
forma pura quanto aos seus derivados semissintéticos artesunato, arteméter, arteéter,
diidroartemisinina, entre outros (MUELLER et al., 2000).
17
Seu único meio de obtenção é por meio da extração a partir da A. annua. Em 1983 o
primeiro processo de síntese foi registrado, contudo o método envolvia várias etapas e o
rendimento era baixo (DELABAYS, 2001).
Seu mecanismo de ação antimalárico é por meio da reação com o grupo heme presente
nos parasitas em grande quantidade, derivado da proteólise da hemoglobina realizada por
estes. Como a captação de artemisinina pelos eritrócitos é aumentada em mais de cem vezes
quando estes estão infectados por P. falciparum, sua atividade antiparasitária é aumentada.
Um radical livre altamente reativo é formado, a partir da clivagem da ponte endoperóxido, e
exibe alta toxicidade aos parasitas (MESHNICK et al., 1991).
Um dos modos de clivagem da ponte endoperóxido ocorre por redução pelo complexo
heme-Fe2, o que gera um radical que sofre rearranjo estrutural e se liga covalentemente ao
heme formando um aducto (Figura 03). Este reage com grupos tióis das proteínas de
membrana formando, entre outros compostos, oxigênio ativo em níveis tóxicos aos parasitas
(MESHNICK, 1996).
Figura 03. Aducto formado pela ligação da artemisinina ao heme.
Fonte: Cazelles (2001).
A ação da artemisinina é maior durante o estágio sanguíneo do desenvolvimento do
plasmódio. Logo, os trofozoítos, do ring stage, e os gametócitos do parasita são mais
sensíveis a esta droga do que os esquizontes do estágio que se desenvolvem no fígado. O
estágio hepático do P. vivax e do P. falciparum não é afetado pela artemisinina (MESHNICK,
1996).
Efeitos adversos da artemisinina são raros (BREWER et al., 1994), assim como em
pacientes tratados com os seus derivados e são seguros para uso em mulheres grávidas
(MESHNICK, 2002). Contudo, em experimentos in vitro têm demonstrado neurotoxicidade
18
em altas dosagens (MESHNICK, 2002). Também demonstrou neurotoxicidade contra células
neuronais por um mecanismo similar ao de seu efeito antimalárico, com o heme
potencializando sua toxicidade (FISHWICK, 1998).
Uma das limitações do uso das artemisininas é o seu curto tempo de meia-vida (3 a 5
h), que faz com que seu uso em esquemas monoterapêuticos tenha uma capacidade de cura
muito baixa, requerendo sempre o acompanhamento de um segundo fármaco antimalárico
com tempo de meia-vida maior (WOODROW, 2005). Isso faz com que o tratamento seja
mais eficaz, com menor tempo de duração e, consequentemente, diminui a possibilidade de
surgimento de parasitas resistentes (SILVA, 2006).
Alguns fatores que podem contribuir para o desenvolvimento de resistência do parasita
já foram identificados, como tempo de meia-vida plasmática curto, em relação à droga, e
mutações genéticas que alteram proteínas do vacúolo celular do parasita (MESHNICK, 2002).
Resistência do Plasmodium falciparum à artemisinina, determinada geneticamente, emergiu
entre Birmânia e Tailândia nos últimos oito anos e vem aumentando substancialmente (PHYO
et al., 2012).
1.3. MALÁRIA
Todos os dias, cerca de três mil pessoas morrem no mundo vítimas de doenças
tropicais negligenciadas como malária, leishmaniose visceral, dengue, doença de Chagas e
outras. Por ano são mais de um milhão de óbitos (PONTES, 2009).
Estas doenças ocorrem principalmente em regiões de pobreza e contribuem para a
manutenção da desigualdade socioeconômica, já que representam forte entrave ao
desenvolvimento dos países (BRASIL, 2010). Evidências tem demonstrado que o controle das
doenças negligenciadas pode reduzir significativamente os índices de morbidade, de exclusão
social e de mortalidade (WHO, 2011).
Dentre as doenças negligenciadas, a malária se destaca na região da Amazônia Legal
Brasileira, por ser uma das doenças de maior ocorrência. Em 2009, em uma tentativa de
reduzir significativamente o número de internações e de novos casos, foi criada a Rede
Malária, com o objetivo de agregar diferentes competências científicas, de regiões distintas do
país, para o enfrentamento da malária (BRASIL, 2010).
A quantidade de casos de malária no Brasil, mesmo que em declínio no decorrer dos
últimos anos, ainda é preocupante. Segundo dados do Programa Nacional de Controle da
Malária (PNCM), em 2005 foram registrados 607.827 casos, em 2007, foram 457.659 casos,
19
uma redução de 24,7% (BRASIL, 2008). Em 2009 foram registrados mais de 300.000 casos,
uma redução de aproximadamente 34%, sendo 99,8% transmitidos nos estados da Amazônia
Legal (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2010). Em 2012, o número de casos reduziu para 243
mil, com 61 óbitos e 3.328 internações (OPAS, 2013).
A malária é uma doença transmitida por vetores (Mosquitos do gênero Anopheles)
usualmente causada por quatro espécies do parasita Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P.
ovale e P. malariae). Trata-se de uma doença considerada atualmente como um dos maiores
flagelos da humanidade, que continua a desafiar a ciência e a tecnologia médica, com um
número estimado de 300 milhões de pessoas no mundo que a ela sucumbem todos os anos
(NAEEM et al., 2014).
No Brasil, as infecções causadas pelo Plasmodium vivax predominam sobre as
provocadas pelos outros parasitas comumente encontrados no país (P. falciparum e P.
malariae) (BRASIL, 2008).
No combate a estes parasitas, a resistência aos antimaláricos utilizados atualmente é
uma preocupação mundial constante. O antimalárico cloroquina, por exemplo, considerado
um dos principais medicamentos para o controle da malária, é atualmente ineficaz em muitas
áreas de prevalência do P. falciparum e a resistência a outros medicamentos antimaláricos
vem aumentando rapidamente (RIDDER, 2008).
Figura 04. Ciclos de vida do Plasmodium falciparum no mosquito e no homem, mostrando os
estágios exo-eritrocítico e eritrocítico.
Fonte: Naeem et al. (2014).
20
O uso de A. annua na forma de infusão, como automedicação, preparada com drogas
vegetais de origens diversas, pode resultar em falha do tratamento e ocorrência de
recrudescência elevada da malária. Isso pode ocorrer devido à alta variação do teor de
artemisinina entre diferentes cultivares, de 0,01 % a 1,5 %, dependendo das condições de
altitude, clima, nutrientes, pH do solo, duração do dia, entre outros fatores (ATEMNKENG et
al., 2009). Além disso, o armazenamento em condições inadequadas também pode reduzir o
teor de artemisinina na droga vegetal. Por estas razões, em 2012, a Organização Mundial de
Saúde se posicionou contra o uso de plantas cultivadas em domicílio para tratamento e
prevenção da malária, inclusive na forma de infusão (WHO, 2012).
1.4. DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS
Atualmente, o desenvolvimento de resistência dos parasitas também às artemisininas,
já observado em alguns países, é uma grande preocupação, pois ainda não há outros
antimaláricos disponíveis no mercado com o mesmo nível de eficácia e tolerabilidade (WHO,
2012). A obtenção das artemisininas é também um problema, pois requer um alto gasto
financeiro, o que eleva o preço dos medicamentos disponíveis no mercado e dificulta o acesso
da população mais carente (FLEMING, 2007).
O uso de extratos de A. annua em substituição ao uso de artemisinina pura reduziria os
custos de produção, pois não seria necessária a realização das etapas de purificação que
normalmente são utilizadas no isolamento do fármaco. O processo de purificação envolve o
uso de solventes orgânicos tóxicos para os manipuladores envolvidos e para o meio ambiente,
como éter etílico, éter de petróleo, benzeno, tolueno, diclorometano e acetonitrila (FLEMING,
2007).
Na forma de infusão, comumente utilizada por populações carentes em áreas de risco,
os principais flavonoides da A. annua, crisoplenetina, casticina, eupatina e artemetina
(BARALDI et al., 2008), são extraídos fracamente, o que faz com que o uso da infusão esteja
relacionado com a redução do efeito dos flavonoides (WEATHERS, 2013). A atividade
antimalárica de extratos de A. annua, no entanto, tem se mostrado similar à atividade da
artemisinina pura, mesmo com quantidades consideravelmente inferiores de artemisinina. O
valor de IC50 in vitro para a planta, relatado por Wright et al. (2010), foi 6 a 18 vezes menor
que para a artemisinina pura. Diawara et al. (2012) realizaram testes antiplasmódio in vitro
com diversos extratos de A. annua e revelaram uma atividade do extrato hidroalcoólico 50:50
21
(IC50 = 2,85 μg/mL) muito próxima da atividade do padrão de artemisinina (IC50 = 2,73
μg/mL).
Em um estudo de Meshnick (1996), pacientes tratados com 600 mg/dia de
artemisinina pura atingiram um grau de recrudescência igual ou menor que 10 %, ao passo
que, com uma dose de 11,1 mg de artemisinina em comprimidos de A. annua, mais apenas 7,4
mg de artemisinina pura, pesquisadores do International Centre of Insect Physiology and
Ecology (ICIPE) obtiveram uma taxa de 9,1 % de recrudescência da doença. Logo, o uso de
comprimidos de folhas de A. annua com alto teor de artemisinina foi considerado um
tratamento seguro e eficaz contra a malária “não complicada” provocada pelo P. falciparum
(ICIPE, 2005).
Estes resultados estimulam os estudos sobre formulações contendo extrato de A.
annua, com o objetivo de desenvolver um medicamento fitoterápico com aceitável grau de
eficácia, segurança e de baixo custo. São fitoterápicos os produtos obtidos a partir de matéria-
prima ativa vegetal, sem adição de ativos sintéticos ou isolados, com finalidade profilática,
curativa ou paliativa (BRASIL, 2014). A qualidade e a fonte das matérias-primas vegetais têm
um papel central na padronização de medicamentos fitoterápicos, pois, devem possuir
composição constante e propriedades terapêuticas que possam ser reprodutíveis. A
domesticação e o melhoramento genético são ferramentas que auxiliam na obtenção de
matérias-primas vegetais com estas características (GOBBO-NETO, 2007).
Um dos principais desafios na produção de um medicamento fitoterápico é a
complexidade da composição da planta medicinal, que depende de fatores climáticos,
geográficos, condições de cultivo, secagem e armazenamento (CALIXTO, 2000). Grande
parte destes desafios foi contornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo CPQBA/UNICAMP,
por meio da seleção de híbridos com mais alta produção de artemisinina (MAGALHÃES,
1996).
Atualmente, medicamentos fitoterápicos com extrato de A. annua não estão
disponíveis no mercado brasileiro. Um único estudo sobre a produção de um granulado
utilizado como pó para suspensão oral e cápsulas a partir de extrato de Artemisia annua L. foi
encontrado na literatura (DIAWARA, 2012).
Os granulados são o produto intermediário de comprimidos e cápsulas. Tratam-se de
agregados sólidos de resistência e porosidade variadas, formados a partir de pós, cristalinos
ou amorfos. Possuem vantagens sobre simples misturas de pós, como maior densidade,
melhor escoamento, maior compressibilidade, melhor conservação da homogeneidade dos
componentes e resistência mecânica superior (LE HIR, 1997). As principais razões para
22
utilização de granulados na fabricação de formas sólidas de uso oral são para prevenir a
segregação dos constituintes de uma mistura de pós; melhorar as propriedades de fluxo da
mistura e melhorar as características de compactação da mistura (AULTON, 2005).
As principais técnicas de granulação são a seca, por desagregação, e a úmida, por
desagregação ou agregação (COUTO, 2000). Na granulação por via seca a pressão aumenta a
densidade dos pós misturados. Após a formação da massa aglomerada, esta passa por um
processo de redução no qual se formam grânulos densos e irregulares. Na via úmida, utiliza-se
um líquido de umedecimento volátil, que pode ou não conter substâncias aglutinantes. Após a
molhagem, a massa homogeneizada é submetida à secagem e calibração do tamanho das
partículas por meio de tamisação (COUTO, 2000).
Os granulados formados devem possuir propriedades adequadas de fluxo e
coesividade (CURY et al., 2007). A granulação úmida é o método mais adequado quando o
componente ativo se apresenta parcialmente dissolvido no líquido extrator, como no caso de
extratos vegetais líquidos, além de possuir estabilidade térmica para resistir à exposição ao
calor na durante a secagem (COUTO, 2000).
Os comprimidos são formas farmacêuticas sólidas que contêm um ou mais princípios
ativos, com ou sem excipientes, obtidos pela compressão de volumes uniformes de partículas
granuladas (BRASIL, 2010) até que o sistema se rearranje e se deforme formando uma massa
compacta de contornos definidos (MARSHALL, 2001). As propriedades físico-químicas das
substâncias que o compõem são decisivas no comportamento da formulação após a
compactação (NARAYAN, 2003).
As principais vantagens dos comprimidos são a grande aceitação pela população;
maior estabilidade química e física dos ativos; maior precisão da dosagem dos ativos; fácil
manuseio e versatilidade da obtenção; robustez da produção em larga escala e baixo custo.
Sua principal desvantagem está relacionada à biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis
em água (AULTON, 2005).
Comprimidos de A. annua, sem adição de adjuvantes, foram desenvolvidos por
Weathers et al. (2014), porém, o objetivo não foi a obtenção de uma formulação, mas avaliar
a variação dos constituintes presentes na droga vegetal e na formulação final. Concluíram que
não se pode afirmar que todos os constituintes presentes na droga vegetal são os mesmos das
formulações de cápsulas ou comprimidos, contudo, o teor de artemisinina é um dos
componentes que se mantiveram constantes.
As cápsulas são formas farmacêuticas preparadas pela encapsulação de materiais como
granulados ou péletes (AULTON, 2005). Em relação aos comprimidos, são de mais fácil
23
desenvolvimento, utilizam menos excipiente, passam por menos etapas de fabricação, a
formulação é mais flexível, mascaram sabores ruins com mais facilidade, entre outras
vantagens. Suas desvantagens são a mais lenta produção, o custo um pouco mais elevado, a
necessidade de embalagens maiores, unidades com maior variação de peso, a forma e o
tamanho limitados, entre outras (COLE, 1998).
Pó para reconstituição oral e cápsulas gelatinosas duras, contendo extrato de A. annua,
foram desenvolvidos por Diawara et al. (2012), que obtiveram um granulado utilizando o
extrato hidroalcoólico, alcançando resultados satisfatórios em relação à uniformidade de
conteúdo, estabilidade e propriedades microbiológicas.
O uso de um sistema multiparticulado, na forma de péletes, pode ser uma opção para
alcançar propriedades tecnológicas melhoradas em relação aos grânulos (BERINGHS et al.,
2012). São principalmente utilizados no preparo de produtos destinados à liberação controlada
de fármacos (AULTON, 2005).
A produção de péletes consiste na aglomeração de ativos e excipientes de modo a
formar pequenas unidades esféricas. Estas unidades apresentam características físicas
diferentes dos granulados tradicionais (SANTOS et al., 2004) e com diâmetro entre 0,5 e 2
mm, possuem maior densidade e têm maior superfície de contato do que estes, podendo
melhorar a taxa de dissolução, diminuir possível irritação do trato gastrointestinal e aumentar
a dosagem dos ativos incorporados (BERINGHS et al., 2012).
Os péletes oferecem grande flexibilidade para o desenvolvimento de formas
farmacêuticas sólidas, pois, a facilidade do seu fluxo facilita a etapa de envase, resultando em
cápsulas e comprimidos com peso uniforme e de fácil reprodutibilidade (ALLENKI et al.,
2009).
Várias técnicas podem ser utilizadas para obtenção de péletes, como extrusão-
esferonização, criopeletização, freeze peletização e extrusão hot melt. O processo de
peletização comumente utilizado na indústria farmacêutica é a extrusão-esferonização,
composto basicamente por quatro etapas: mistura dos ingredientes secos, malaxagem,
extrusão, esferonização e secagem. Por meio deste processo é possível obter péletes densos,
com alto teor de ativo utilizando o mínimo de excipientes (ALLENKI et al., 2009).
Os excipientes e ativos secos são previamente homogeneizados e na etapa de
malaxagem são molhados com o líquido de granulação para obtenção de uma massa
umidificada. Esta deve possuir consistência ideal para as etapas de extrusão e esferonização
seguintes. A secagem pode ser feita em temperatura ambiente ou elevada, em leito estático ou
dinâmico (SANTOS et al., 2004).
24
Tanto cápsulas quanto comprimidos devem ser submetidos a um controle de qualidade
e apresentar características apropriadas de peso, desintegração, teor do princípio ativo,
uniformidade de doses unitárias e dissolução. Os comprimidos devem também possuir
características de resistência mecânica bem estabelecidas, como dureza e friabilidade
(BRASIL, 2010). Na formulação de péletes, estes devem possuir características de
esfericidade e tamanho adequadas (AULTON, 2005).
O teor do princípio ativo de fitoterápicos usualmente é realizado sobre um marcador
químico, que pode se tratar de uma substância ou um grupo de substâncias que estejam
presentes em maior quantidade, de preferência responsável pela sua atividade farmacológica
(BRASIL, 2010). No caso da A. annua, a artemisinina é o marcador principal, e é também a
principal substância responsável pela atividade antimalárica.
Os métodos analíticos de determinação de teor de ativo devem ser validados antes de
serem adotados na rotina laboratorial (BRASIL, 2010), pois dados analíticos não confiáveis
podem conduzir a decisões desastrosas e levar a prejuízos financeiros irreparáveis (RIBANI et
al., 2004). A validação do método analítico é um componente essencial das medidas
realizadas em um laboratório, permitindo que este produza resultados confiáveis (IUPAC,
2002). O objetivo da validação é demonstrar que um método analítico é adequado para o seu
propósito (BRITO et al., 2003).
Segundo a RDC nº 17 (BRASIL, 2010), validação é o ato documentado que atesta que
um determinado equipamento, processo ou procedimento, consistentemente, leva aos
resultados esperados. Sendo assim, antes da utilização de um método analítico, este deve ser
submetido aos ensaios de validação para atestar a confiabilidade nos resultados por ele
obtidos. Os ensaios de seletividade, linearidade e intervalo, precisão (níveis repetibilidade e
intermediária), exatidão, limite de quantificação, limite de detecção e robustez fazem parte da
validação analítica (BRASIL, 2003).
Seletividade é a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto
em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e
componentes da matriz (BRASIL, 2003). Em métodos cromatográficos, é a garantia de que
um determinado pico de interesse seja exclusivamente do composto analisado (RIBANI et al.,
2004).
É importante não confundir o termo “seletividade” com “especificidade”, utilizado
como sinônimos por diversos autores. Um teste específico é aquele que ocorre somente com a
substância de interesse, enquanto que um teste seletivo ocorre também na presença de outras
25
substâncias, porém, exibe um grau de preferência pela substância de interesse (IUPAC, 2001).
Portanto, o termo seletividade será utilizado neste trabalho.
Linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro
de um intervalo especificado (BRASIL, 2003). É recomendado que sejam realizadas análises
estatísticas para demonstrar que o modelo linear de correlação é o adequado, descartando
outros modelos, como o quadrático, o exponencial e outros (BRASIL, 2010).
É recomendado que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, cinco
concentrações diferentes da amostra. O intervalo dessas determinações deve contemplar de 80
% a 120 % da concentração central do método quando este tiver o objetivo de quantificar o
analito em matérias-primas ou em formas farmacêuticas, de 70 % a 130 % quando objetivar
realização da análise de uniformidade de conteúdo em produtos acabados e de até 50 % a 150
% quando o mesmo for utilizado em análise de teste de dissolução (BRASIL, 2003).
O teste de uniformidade de conteúdo é utilizado quando a quantidade de fármaco de
cada unidade é menor que 25 mg ou a proporção do fármaco na dose é menor que 25 %. O
objetivo é avaliar duas características independentes de um lote de medicamento: a
proximidade do conteúdo de fármaco de cada unidade com a quantidade declarada e a
uniformidade entre os conteúdos de cada unidade. Para isto, utiliza o ensaio de doseamento
em unidades individuais de um mesmo lote (BRASIL, 2010).
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de
medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra (BRASIL, 2003) e pode ser
calculada em três níveis, Repetibilidade, Precisão Intermediária e Reprodutibilidade. Não se
deve confundir a repetibilidade com a precisão instrumental, que é medida pela análise
repetida da injeção de uma mesma solução e também é expressa em DPR (RIBANI et al.,
2004).
A repetibilidade da injeção foi avaliada e resultou em um DPR de 0,2 %, menor que o
recomendado de até 2 % (BRASIL, 2010). A precisão intermediária (Precisão Inter-corridas)
representa a concordância entre os resultados no mesmo laboratório, mas obtidos em dias
diferentes e com analistas diferentes (BRASIL, 2003). É útil na determinação da variação
sofrida pelo método dentro de um laboratório devido a mudanças no dia ou no analista que
realiza a análise (RIBANI et al. 2004).
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo
método em estudo em relação um valor verdadeiro. Deve ser determinada após o
26
estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da seletividade do mesmo (BRASIL,
2003).
O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma amostra
que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições
experimentais estabelecidas. É estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações
conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável (BRASIL, 2003).
O limite de quantificação (LQ) é a menor quantidade do analito em uma amostra que
pode ser determinada, com precisão e exatidão aceitáveis, sob as condições experimentais
estabelecidas (BRASIL, 2003).
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a
pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante seu
uso cotidiano (BRASIL, 2003).
Os testes de adequabilidade do sistema cromatográfico fazem parte de todos os
métodos de cromatografia líquida e devem ser utilizados para avaliação da eficácia da
separação do pico de interesse. Avaliam a resolução e a reprodutibilidade do sistema
cromatográfico. De acordo com os resultados destes testes, as condições de trabalho podem
ser alteradas para se ajustar às suas especificações (BRASIL, 2010).
O fator de capacidade (K) mede onde o pico de interesse está alocado em relação ao
“volume morto” da coluna. A resolução (R) demonstra quão bem dois picos próximos são
separados. A separação eficiente é fundamental para a quantificação exata da substância. O
fator de cauda (T) mede a largura da cauda de um pico. Quanto maior a cauda, menor a
exatidão dos cálculos quantitativos realizados. O número de pratos teóricos (N) é uma medida
da eficiência da coluna, ou seja, quantos picos podem ser alocados por unidade de tempo do
cromatograma (FDA, 1994).
De acordo com dados da ANVISA (BRASIL, 2014), a causa mais frequente de
indeferimento de registros de medicamentos fitoterápicos são problemas relacionados com a
validação de métodos analíticos. Portanto, esta é uma etapa crítica no desenvolvimento destes
produtos.
Diante do exposto, em face da reconhecida atividade antimalárica de extratos de A.
annua e da indisponibilidade no mercado de produtos fitoterápicos a partir destes, foi
estudada neste trabalho a possibilidade de produção de formas farmacêuticas sólidas contendo
extrato padronizado de A. annua, de forma a obter produtos de baixo custo, priorizando a
população mais carente, de acesso limitado aos medicamentos de custo mais elevado.
27
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Produção de extrato hidroalcoólico concentrado de partes aéreas de Artemisia annua
L. (Asteraceae) padronizado em artemisinina e investigação de seu uso na produção de formas
farmacêuticas sólidas.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar a droga vegetal.
Validar o método analítico em HPLC-UV de doseamento de artemisinina na droga
vegetal.
Caracterizar um extrato hidroalcoólico concentrado de A. annua.
Desenvolver péletes e granulados contendo o extrato hidroalcoólico concentrado de
Artemisia annua.
Formular comprimidos e cápsulas gelatinosas duras a partir dos granulados e de
cápsulas gelatinosas duras a partir de péletes.
Realizar validação parcial do método de doseamento de artemisinina para análise das
formas farmacêuticas obtidas.
Realizar caracterização física e físico-química das formas farmacêuticas obtidas.
28
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. MATERIAL VEGETAL
As amostras de partes aéreas de A. annua (Asteraceae) foram provenientes do campo
experimental de plantas medicinais do CPQBA/UNICAMP. Foram coletadas no ano de 2012
e disponibilizadas já rasuradas e dessecadas. Foram reduzidas a pó em triturador tipo
liquidificador com copo de aço inoxidável monobloco Siemsen, e acondicionadas em saco
plástico ao abrigo da umidade e da luz.
3.2. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL
A avaliação de granulometria foi realizada em granulômetro BecTel, com cinco
tamises diferentes (abertura de malha de 710, 355, 250, 180 e 125 μm). O pó foi então
classificado de acordo com a recomendação da Farmacopeia Brasileira (2010).
A análise de perda por dessecação foi realizada em balança de infravermelho Ohaus
MB35, de acordo com método da Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010). O equipamento
foi programado para que indicasse o final da secagem quando a perda de massa da amostra se
tornasse constante. Aproximadamente 1,0 g da droga vegetal foi transferido, em triplicata,
para o recipiente da balança e espalhado sobre esta formando uma fina camada. Em seguida a
balança foi acionada e aguardou-se que a mesma indicasse (em porcentagem) a quantidade
das substâncias voláteis presentes.
O teste de doseamento de artemisinina foi realizado com o método analítico validado
(DIAWARA et al., 2011).
3.3. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL
3.3.1. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ANALÍTICOS
Dois métodos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com detector de
absorção no ultravioleta foram testados, um sem pré-derivatização da artemisinina (BRIARS,
2013) e outro com pré-derivatização (DIAWARA et al., 2011).
29
O quadro 01 resume as condições cromatográficas que foram testadas para a escolha
do método analítico. Ao todo foram 08 condições e apenas na condição “1” foi feita análise de
artemisinina. Nas condições de “2” a “8” houve derivatização desta para o composto Q260. A
temperatura da coluna foi mantida em 30 ºC e o volume de injeção foi de 20 μL.
Quadro 01. Condições cromatográficas testadas para doseamento de artemisinina em
Artemisia annua L.
n Composição da
Fase Móvel
Proporção da
Fase Móvel
Fluxo da
Fase Móvel
(mL/min)
Coluna C18
1 Acetonitrila:Água 50:50 1,0 250 x 4,6 mm
(5 μm)
2 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v) 50:50 1,0
250 x 4,6 mm
(5 μm)
3 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v) 60:40 1,0
250 x 4,6 mm
(5 μm)
4 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v) 50:50 1,0
150 x 4,6 mm
(5 μm)
5 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v) 40:60 1,0
150 x 4,6 mm
(5 μm)
6 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v) 30:70 1,2
150 x 4,6 mm
(5 μm)
7 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v) 35:65 1,2
150 x 4,6 mm
(5 μm)
8 Acetonitrila:Ácido
Fórmico 0,2 % (v/v)
35:65 (0-8 min)
60:40 (10-15 min)
35:65 (17-20 min)
1,2 150 x 4,6 mm
(5 μm)
A derivatização da artemisinina consistiu na adição, em balão volumétrico de 10 mL,
de 4 mL de hidróxido de sódio 0,05 M (ou 0,2 %) a 1 mL da solução do padrão de
artemisinina ou de A. annua, aquecimento em banho-maria a 50 ºC durante 30 minutos,
resfriamento por 10 minutos e, em seguida, completou-se o volume do balão com ácido
acético 0,2 M (ZHAO, 1986; MARCHESE, 2001; ERDEMOGLU, 2007). Esta reação foi
testada em relação à necessidade de aquecimento a 50 ºC, ao uso de diferentes concentrações
de hidróxido de sódio (0,10 mol/L, 0,05 mol/L e 0,025 mol/L) e à necessidade de adição de
ácido acético 0,2 mol/L.
30
Foi utilizado cromatógrafo líquido Waters com módulo de separação e2695, detector
ultravioleta de arranjo de diodos Waters 2998, software Empower®, coluna Zorbax (Agilent)
Eclipse XDB-C18 de 150 x 4,6 mm (5 µm), pré-coluna C18 SecurityGuard Phenomenex.
Filtro em PVDF de 0,45 µm Millex®, 13 mm de diâmetro, foi utilizado para filtração das
soluções antes da injeção.
As soluções de análise foram preparadas pela pesagem de cerca de 1.250 mg da droga
vegetal seca foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL, aproximadamente 20 mL de
etanol 95 % PA foi adicionado e, em seguida, foi levado ao banho de ultrassom durante 40
minutos. Posteriormente, o volume foi completado com o mesmo solvente, homogeneizado e
filtrado, obtendo-se concentração de 50 mg/mL de A. annua. Esta foi derivatizada, filtrada em
0,45 μm e 20 μL foram injetados no sistema cromatográfico.
3.3.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
O método analítico foi validado segundo os parâmetros da Resolução Especial (RE) da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) nº 899 de 2003 (BRASIL, 2003), que
traz o Guia de Validação de Métodos Analíticos, ainda vigente e recomendado pela Resolução
RDC nº 26 de 2014, que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Os ensaios de
seletividade, linearidade e intervalo, precisão (níveis repetibilidade e intermediária), exatidão,
limite de quantificação, limite de detecção e robustez foram realizados.
A seletividade foi determinada pela análise do tempo de retenção do pico de interesse
em comparação ao tempo de retenção apresentado no cromatograma de análise do padrão.
Também foi feito a varredura no ultravioleta, de 190 a 400 nm, do pico de interesse em cinco
pontos diferentes, para verificação de sua pureza, e comparado com a varredura do pico de
análise do padrão de artemisinina (Sigma Aldrich, 2011).
A análise de linearidade foi realizada em um intervalo de 50 % a 150 % da
concentração central do método (50 mg/mL). Foi feito o preparo de uma solução principal e
posterior diluição desta para obter um mínimo de cinco soluções de análise. A partir da
análise cromatográfica destas soluções foi montada a curva de linearidade de concentração
versus AUC (Área Sob a Curva). Foram calculados o coeficiente de correlação linear (r), o
coeficiente de determinação ajustado (r²), o coeficiente angular (a) e o coeficiente linear (b),
com seus respectivos intervalos de confiança.
Uma solução de artemisinina padrão foi preparada pela pesagem e transferência para
balão volumétrico, onde foi solubilizado em etanol 95 % após 40 minutos de agitação em
31
banho de ultrassom. A partir da diluição desta, cinco soluções de concentrações decrescentes
foram obtidas e analisadas e a curva foi construída com valores de AUC versus concentração
(μg/mL).
Foi feito tratamento estatístico dos dados utilizando-se o software Action® 2.7 em que
foram realizados os testes de significância da regressão, por análise de variância (ANOVA),
teste de falta de ajuste linear (Lack of Fit), de normalidade dos resíduos, pelo método de
Anderson-Darling e teste de homocedasticidade dos resíduos, pelo método de Breush-Pagan.
Todos estes foram calculados com intervalo de confiança de 95 %.
A análise de precisão foi realizada nos níveis de repetibilidade e precisão
intermediária. A repetibilidade foi calculada após análise de, no mínimo, seis soluções da
droga vegetal. Todas as soluções foram preparadas pelo mesmo analista e em um único dia.
Para a análise da precisão intermediária o mesmo número de soluções foram analisadas,
porém, por um outro analista e em um dia diferente. O mesmo equipamento foi utilizado,
visto ser o único no laboratório. Foi calculada a média de cada nível e o desvio padrão
relativo (DPR) entre as determinações. A RE nº 899 recomenda que o valor de DPR seja de,
no máximo, 5 % (BRASIL, 2003) para quantificações de compostos em macro quantidades. A
Instrução normativa nº 04 (BRASIL, 2014) recomenda que o valor de DPR não seja superior
a 15 %.
A exatidão foi calculada pelo método de adição de padrão (BRASIL, 2010), em que
uma solução com quantidade conhecida de padrão de artemisinina foi adicionada a uma
solução contendo a droga vegetal (A. annua + Padrão de artemisinina), em triplicata. Tanto o
padrão quanto a droga vegetal foram analisados, individualmente, e após a adição do padrão a
solução resultante foi também analisada. Foi realizado um total de nove determinações, em
três diferentes concentrações (baixa, média e alta, em triplicata), contemplando o intervalo do
método. O valor da exatidão foi obtido pela relação entre a concentração do padrão
adicionado na amostra e a concentração do padrão antes da adição, em porcentagem.
Exatidão = [ (A. annua + Padrão artemisinina) - A. annua] x 100
Padrão artemisinina
Para o cálculo dos limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) foram construídas
três curvas analíticas com soluções de A. annua em concentrações baixas, próximas dos
supostos limites. A primeira solução continha 10 mg/mL de A. annua e foi diluída para
obtenção de, no mínimo, cinco concentrações diferentes e decrescentes da droga vegetal.
Foram calculados os coeficientes angular e linear de cada curva construída para calcular os
limites, conforme as equações da RE nº 899 de 2003.
32
LD = DPa x 3
IC
LQ = DPa x 10
IC
Em que DPa é o desvio padrão entre os coeficientes lineares das três curvas analíticas
e IC é a média dos coeficientes angulares das três curvas analíticas.
Para a análise da robustez do método, vários parâmetros foram variados com o
objetivo de reproduzir alterações que poderiam ocorrer na rotina analítica e interferir nos
resultados, como estabilidade da solução de leitura, comprimento de onda de leitura,
concentração de ácido fórmico na fase móvel, temperatura da coluna e fluxo da fase móvel.
Foi realizada a análise da condição central do método e uma variação para mais e para menos
de cada alteração, sendo obtidos três resultados em cada parâmetro. O resultado foi expresso
como DPR entre estes três valores.
Por se tratar de um método que utiliza sistema cromatográfico de separação, a
adequabilidade do sistema foi calculada em relação ao pico de interesse (BRASIL, 2010).
Foram calculados os parâmetros Fator de Capacidade (K), Resolução (R), Fator de Cauda (T)
e Pratos Teóricos (N) pelo software Empower® do equipamento cromatográfico. As
especificações foram referenciadas do guia de validação de métodos cromatográficos do Food
and Drug Administration (FDA, 1994).
3.4. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO DE Artemisia
annua L
No processo de extração foi utilizado álcool etílico PA 95 % como líquido extrator por
ser um solvente de baixa toxicidade, o que é importante devido à possibilidade de
administração oral, e por possuir boa capacidade de extração de artemisinina a partir de A.
annua (FLEMING, 2007).
Após o estabelecimento das condições mais favoráveis para extração de artemisinina
com maior eficiência, no procedimento de otimização, foi montado um sistema de percolação
no qual foi utilizado 2,0 kg de A. annua em pó em dois percoladores de capacidade de 10
litros cada. A percolação foi realizada de forma a extrair a quantidade máxima possível de
artemisinina.
O etanol 95 % foi adicionado em partes, sendo que cada uma foi mantida em contato
com a droga por 12, 24, 48 e 72 horas, em maceração estática (Quadro 02). Após cada período
de tempo os percoladores foram abertos em fluxo máximo e a fração foi coletada e juntada em
um recipiente único. Após cada coleta, uma nova fração de etanol 95 % era adicionada aos
33
percoladores, a massa de droga vegetal era ressuspendida manualmente com o auxílio de uma
espátula e deixada em maceração pelo tempo seguinte.
Quadro 02. Quantidade de solvente utilizado na percolação.
Etapas de
Extração
Frações de Etanol 95
% utilizadas (mL)
Tempo de contato com 2,0
kg de droga vegetal
1 4.000 12 horas
2 6.000 12 horas
3 5.000 24 horas
4 5.000 24 horas
TOTAL 20.000 72 horas
O teor de artemisinina e de resíduo seco foi calculado para cada fração e para o extrato
total, no qual ainda foram realizados ensaios de pH e de densidade relativa, conforme
Farmacopeia Brasileira (2010). O final da percolação foi determinado pelos resultados da
análise do teor de artemisinina e de resíduo seco de cada fração coletada.
As frações reunidas foram concentradas, sob pressão reduzida, a uma temperatura de
40º C e rotação de 70 rpm, em evaporador rotativo Buchi R-220 SE, até ser observada a
ocorrência de precipitação no balão do equipamento. O extrato concentrado foi caracterizado
quanto ao teor de artemisinina, densidade relativa, viscosidade, resíduo seco, pH e teor
alcoólico (BRASIL, 2010).
3.4.1. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE RELATIVA
A determinação da densidade relativa foi realizada, em triplicata, pelo método do
picnômetro (BRASIL, 2010). Este foi limpo e seco e sua massa foi determinada. Em seguida,
água a 20 °C foi utilizada para preencher todo o conteúdo do picnômetro e sua massa foi
registrada. O picnômetro foi seco novamente, preenchido com amostra a 20 °C, limpado
externamente, e sua massa foi registrada.
A densidade foi calculada pela fórmula abaixo:
Densidade relativa = 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑐𝑜𝑚 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑔)− 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 (𝑔)
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑐𝑜𝑚 á𝑔𝑢𝑎 (𝑔)−𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 (𝑔)
34
3.4.2. DETERMINAÇÃO DA VISCOSIDADE
A viscosidade foi determinada, em triplicata, em viscosímetro de Brookfield DV-I+,
que mede a viscosidade em função da força necessária para o equipamento girar o spindle no
líquido (BRASIL, 2010).
Uma amostra do extrato foi colocada em um béquer de vidro e a velocidade de rotação
e o tipo dos spindles foram alterados até se obter um torque maior do que 20 %. O spindle foi
mergulhado na amostra e a rotação foi acionada. Após estabilização do valor no display, este
foi registrado, em unidades de cP (centiPoise).
3.4.3. DETERMINAÇÃO DO RESÍDUO SECO
O resíduo seco foi determinado, em triplicata, em balança de infravermelho Ohaus
MB35 em 1 g da droga vegetal a 105 ºC até peso constante. A balança calcula e mostra no
visor o valor de voláteis, em porcentagem. Em seguida, este foi subtraído de “100” para
obtenção do valor do resíduo.
3.4.4. DETERMINAÇÃO DO PH
O pH foi determinado, em triplicata, em potenciômetro (pHmetro) Tecnal Tec-3MP.
Previamente ao uso, foi realizada a calibração do equipamento utilizando soluções padrão de
pH 7,0 e 4,0.
3.4.5. DETERMINAÇÃO DE ÁLCOOL
O teor alcoólico foi determinado, pelo método de destilação, pois é o recomendado
para análise de extratos (BRASIL, 2010).
Uma quantidade de 35 mL do extrato foi adicionada em balão de vidro contendo
pérolas de vidro, para evitar ebulição violenta. Igual volume de água destilada foi adicionado
e o conjunto foi destilado até ser coletado cerca de 33 mL de líquido límpido. A densidade do
líquido foi determinada a 20 °C e o teor de álcool etílico foi determinado por meio de consulta
à tabela alcoométrica, que relaciona o teor alcoólico à sua densidade em solução (BRASIL,
2010).
35
3.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DOS MÉTODOS DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA
NAS FORMAS FARMACÊUTICAS PREPARADAS
Para realizar o doseamento de artemisinina nas formas farmacêuticas preparadas, o
método validado para análise da droga vegetal foi utilizado apenas após ser realizada a
verificação do método por meio da validação parcial do mesmo. Para isso, foram feitos os
ensaios de linearidade, seletividade e repetibilidade (BRASIL, 2003) na análise de cada forma
farmacêutica, péletes, comprimidos e cápsulas. Os parâmetros de adequabilidade do sistema
cromatográfico também foram calculados. Esta verificação do método se tornou necessária
para avaliar a influência dos resultados pelos constituintes adicionados na fabricação das
formas farmacêuticas.
3.6. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PÉLETES
Foi utilizado extrusor de bancada Caleva Extruder 20 e esferonizador de bancada
Caleva MBS 250 (Caleva®, UK). A malaxagem consistiu em misturar os adjuvantes e o
extrato concentrado em batedeira planetária, para a obtenção de uma massa sólida úmida
(Tabela 01). A extrusão foi feita em extrusor de rolos 30 rpm, com placa estática com
orifícios de 0,8 mm. A esferonização foi realizada em aparelho contendo uma placa rotatória
de esferonização com ranhuras perpendiculares, com velocidade de 1.500 rpm durante 1 min.
A secagem foi feita em leito fluidizado Hüttlin Mycrolab, com temperatura do ar a 60 ºC e
fluxo de 30 L/min.
Tabela 01. Composição dos péletes nas diferentes formulações testadas.
n Celulose(g)-Extrato(g)-PVP(g)
1 40 - 45 - 0,00
2 40 - 70 - 0,00
3 40 - 70 - 5,04
4 40 - 70 - 3,15
5 40 - 70 - 1,26
6 40 - 65 - 1,23
7 40 - 58 - 0,00
A caracterização foi realizada para avaliar os parâmetros de esfericidade, umidade e
distribuição de tamanho nas formulações e, após a encapsulação, foram avaliados os
36
parâmetros de desintegração, determinação de peso, uniformidade de conteúdo e doseamento
de artemisinina e perfil de dissolução.
3.6.1. CÁLCULO DA ESFERICIDADE DE PÉLETES
A esfericidade projetada (PS) dos péletes foi calculada por meio do programa de
análise processamento de imagens ImageJ versão 1.47v (8 de julho de 2013).
Fotomicrografias foram obtidas com lupa de aumento Leika MZ 6 e analisadas no software de
imagens LAS EZ versão 1.3.0. Cada determinação foi realizada com um mínimo de 300
péletes.
O programa calculou os parâmetros das imagens, que foram utilizadas no cálculo da
esfericidade projetada, segundo fórmula abaixo (SANTOS et al., 2004).
PS = 4𝐴
𝜋.𝑑2
Em que A = área do péletes; e d = maior distância da partícula (ou diâmetro Feret).
3.6.2. DETERMINAÇÃO DE UMIDADE DOS PÉLETES
Após a secagem dos péletes em leito fluidizado, estes foram avaliados quanto ao seu
conteúdo de umidade, ou teor de voláteis, em balança de determinação de umidade a uma
temperatura de 105 ºC até peso constante. Este ensaio foi realizado em triplicata e seu
resultado foi dado em porcentagem de voláteis ± desvio padrão.
3.6.3. DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DOS PÉLETES
O ensaio de distribuição de tamanho foi realizado em analisador de tamanho de
partículas por difração a laser Beckman Coulter LS I3 320. Uma quantidade de 20 g de
péletes foi submetida à análise. Foram calculados os valores do tamanho médio e dos
diâmetros d10 e d90, que representam os diâmetros abaixo dos quais se situam
respectivamente 10 % e 90 % das partículas. Em seguida foi calculada a amplitude de
tamanho dos péletes (d90/d10), parâmetro que revela a dispersão da distribuição. Quanto
menor o seu valor, menor será a dispersão de tamanho entre as partículas (JEREMIAS, 2012).
3.7. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPRIMIDOS E CÁPSULAS
37
O método utilizado para a obtenção dos granulados foi o de via úmida, em que o
extrato líquido concentrado de A. annua foi adicionado à mistura de excipientes contendo
celulose microcristalina 102 (Mintgai Chemical), lactose monohidratada (DFE Pharma) e
glicolato de amido sódico (Embrafarma). Após homogeneização, a mistura foi granulada em
tamis de 2 mm e submetida à secagem em estufa com circulação e renovação de ar, Solab
NO35/5, a 40 °C, por 24 h. Em seguida foram adicionados os lubrificantes estearato de
magnésio (Magnesita, lote 11677105) e silicato de magnésio hidratado (Mapric) e a mistura
foi novamente homogeneizada (Quadro 03).
Quadro 03. Composição do granulado dos comprimidos
Composição Proporção
Extrato líquido concentrado 42,3 %
Celulose microcristalina 102 39,5 %
Lactose monohidratada 13,2 %
Glicolato de amido sódico 1,0 %
Estearato de magnésio 2,5 %
Silicato de magnésio hidratado 1,5 %
A formulação foi submetida à compressão em prensa hidráulica Carver Laboratory
Press, com força de uma tonelada, durante 10 s, utilizando punção côncavo de 11 mm de
diâmetro.
Para encapsulação, foi adicionado ao granulado dos comprimidos o lubrificante
dióxido de silício coloidal (Cabot). Foram utilizadas cápsulas de tamanho n° 00 em
encapsulador manual de 180 poços.
Os granulados foram submetidos à análise de umidade e de teor de artemisinina. Os
comprimidos foram caracterizados quanto à dureza e friabilidade e, assim como as cápsulas,
foram submetidos aos testes de desintegração, determinação de peso, uniformidade de
conteúdo, doseamento de artemisinina e perfil de dissolução.
3.7.1. TESTE DE DUREZA DE COMPRIMIDOS
O ensaio de dureza foi realizado em durômetro de bancada Nova Ética 298 DGP. O
resultado foi expresso em Newtons (N). Foram utilizadas 10 unidades no teste. O resultado do
teste é informativo (BRASIL, 2010).
38
3.7.2. TESTE DE FRIABILIDADE DE COMPRIMIDOS
O teste de friabilidade foi realizado em equipamento Nova Ética, modelo 300. Foram
utilizados 20 comprimidos no teste. Todos foram pesados antes do teste, colocados no
aparelho e submetidos a 100 rotações. Em seguida, os comprimidos foram retirados, limpos e
pesados novamente. Nenhuma unidade deve estar quebrada, lAUCada, partida ou rachada e a
diferença de peso entre o peso inicial e o peso após o teste não deve ser superior a 1,5 % do
peso inicial (BRASIL, 2010).
3.8. TESTE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
O teste de desintegração foi realizado em desintegrador Nova Ética 301 AC. Foram
utilizados 6 unidades de cada forma farmacêutica no teste, com utilização de disco em cada
tubo da cesta, exceto para cápsulas. Foram utilizados água purificada e tampão pH 1,2 como
líquido de imersão, mantidos a 37 ± 1,0 ºC. Ao final do teste todas as unidades devem estar
completamente desintegradas (BRASIL, 2010).
3.9. TESTE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
Para os comprimidos, vinte unidades foram pesadas individualmente (Pn). O peso
médio (Pm) foi calculado dividindo-se a soma do peso de todas as unidades por 20. A partir
de então foi calculado a variação do peso de cada comprimido (Vn) em relação ao peso
médio, em porcentagem.
Vn (%) = Pn− Pm
Pm x 100
Para as cápsulas, vinte unidades cheias foram pesadas individualmente. O conteúdo de
cada cápsula foi retirado e a cápsula vazia foi pesada. O peso do conteúdo de cada unidade
(Pcn) foi calculado pela diferença entre o peso da cápsula cheia e da cápsula vazia. O peso
médio do conteúdo (Pmc) foi calculado dividindo-se a soma do peso do conteúdo de todas as
unidades por 20. A partir de então foi calculado a variação do peso do conteúdo de cada
unidade (Vcn) em relação ao peso médio do conteúdo, em porcentagem.
Vcn (%) = Pcn− Pmc
Pmc x 100
39
A variação permitida foi de até ± 7,5 %. Até duas unidades podem estar acima desta
especificação, porém, nenhuma pode ser maior que ± 15,0 % (BRASIL, 2010).
3.10. TESTE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
O teste de doseamento foi aplicado em 10 unidades, individualmente. A partir dos 10
resultados obtidos, foi calculada a média do teor (Tm), o desvio padrão (DP) e o Valor de
Aceitação (VA) pela equação abaixo.
VA = |M - Tm| + k.DP
Em que M é o valor de referência, podendo ser de 98,5 a 101,5, dependendo do valor
da média (Tm) das unidades. k é a constante de aceitabilidade, igual a 2,4 para 10 unidades
testadas na primeira etapa, e igual a 2,0 na segunda etapa, em que mais 20 unidades são
testadas e o cálculo é feito sobre 30 unidades. Logo, a equação fica da seguinte forma.
VA = |M - Tm| + 2,4.DP
O valor de aceitação não deve ser superior a 15,0 (BRASIL, 2010).
3.11. PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
O perfil de dissolução foi realizado em dissolutor Vankel, modelo VK 7000, com cuba
de 1000 mL, utilizando pá como aparato. Para degaseificação dos meios de dissolução foi
utilizado banho de ultrassom Unique USC 1400 e bomba de vácuo Tecnal TE-058. O teste foi
feito em dois meios de dissolução diferentes, todos mantidos a 37 ± 0,5 ºC por banho
termostatizado Vankel, modelo VK750D: tampão HCl pH 1,2 e tampão pH fosfato 6,8,
ambos a 100 rpm, preparados de acordo com a Farmacopeia Americana (USP, 2007).
Cada unidade testada foi adicionada à cuba com a rotação da pá desligada. O teste foi
feito em triplicata para cada forma farmacêutica e foram utilizadas seringas individualizadas
de coleta das alíquotas em cada cuba. A coleta foi feita a uma distância de 1 cm da parede da
cuba e na região intermediária entre o topo do meio de dissolução e o topo da pá, sendo que o
meio não foi reposto após cada coleta.
Foram coletadas alíquotas nos tempos de 5, 10, 20, 30, 40 e 60 minutos, que foram
imediatamente filtradas em filtro de 0,45 μm. Em cada alíquota foi feito o doseamento de
artemisinina, pelo método verificado, e foi construída a curva de dissolução (tempos de coleta
versus porcentagem dissolvida), com extrapolamento da curva para t=0. A porcentagem
40
dissolvida foi calculada sobre a quantidade esperada para cada forma farmacêutica,
considerada como a média obtida na análise de uniformidade de conteúdo.
Foi calculada a eficiência de dissolução (ED%), em porcentagem, de cada perfil de
dissolução, pela relação entre a AUC do gráfico e a área total do retângulo ATR, definido pela
ordenada em 100 % de dissolução e a abcissa em 60 min (BRUM et al., 2012).
ED% = AUC
ATR x 100
Foram comparados os valores de ED% e os valores da dissolução em 60 minutos entre
cada forma farmacêutica em um mesmo meio de dissolução, e entre a mesma forma
farmacêutica em diferentes meios de dissolução.
Os cálculos estatísticos foram feitos por meio do teste F de variância e do teste t de
comparação entre médias, ambos com nível de confiança de 95 %, utilizando o software
Action® versão 2.7, instalado no software Excel® 2010.
O fator de semelhança (F2) entre perfis de dissolução foi calculado segundo equação
descrita na RDC da ANVISA nº 31 (BRASIL, 2010):
F2 = 50 x log{[1 +1
𝑛∑ (%𝐿1 − %𝐿2)]𝑛
𝑡=1-0,5
x100}
Em que, n = número de pontos de coleta, %L1 = porcentagem liberada em um tempo t
de uma das formas farmacêuticas, %L2 = porcentagem liberada em um tempo t da forma
farmacêutica a ser comparada.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL
No teste de perda por dessecação, foi obtido um resultado de 8,17 ± 0,16 %, próximo
ao encontrado por Rodrigues et al. (2006), de 9 % em amostras de A. annua provenientes do
CPQBA. Na Farmacopeia Brasileira 5ª edição o teor máximo aceitável nas diferentes
monografias é de 6 a 15 % (BRASIL, 2014).
Na análise granulométrica (Figura 05) quase a totalidade das partículas do pó passou
pelo tamis de 710 µm (98,2 %) e menos de 40 % (18,8 %) passou pelo tamis de 250 µm. No
total, 86,6 ± 0,46 % das partículas tinham entre 180 µm e 710 µm, o que classificou o pó
como moderadamente grosso.
41
Figura 05. Distribuição de tamanho das partículas
Fonte: Próprio autor.
O teor de artemisinina foi de 1,15 ± 0,05 %, próximo ao relatado por outros autores
para a A. annua proveniente da UNICAMP, de 1,21 % (Celeghini, 2009; Rodrigues et al.,
2006), 1,16 % (BILIA et al., 2006) e 1,13 % (SILVA et al., 2012).
4.2. AVALIAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA
NA DROGA VEGETAL
4.2.1. DERIVATIZAÇÃO DA AMOSTRA
A varredura no ultravioleta entre 200 e 400 nm de uma solução de artemisinina
resultou em um espectro com máximos de absorbância em comprimentos de onda próximos a
200 nm (Figura 06). Pilkington (2012) encontrou uma absorção máxima de artemisinina (1
mg/mL) em 192 nm. Contudo, análise cromatográfica de artemisinina neste comprimento de
onda aumenta o ruído da linha de base e o limite de detecção em até 4 vezes em relação, por
exemplo, a 210 nm, valor recomendado por Lapkin (2009).
Figura 06. Varredura da artemisinina sem derivatização
Fonte: Próprio autor.
13,216 Peak 1
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
nm
200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
42
Pela ausência de grupos cromóforos na molécula, o método de CLAE com detector
eletroquímico é recomendado por Acton (1985) e Charles et al. (1990), pois a análise com
detector ultravioleta em comprimento de onda baixo é uma desvantagem do método, visto que
várias outras substâncias podem absorver nesta faixa de radiação, reduzindo a seletividade do
método e aumentando o erro nas análises de quantificação (MARCHESE, 2001).
Um método de análise proposto por Zhao e Zeng (1986) que realiza pré-derivatização
da artemisinina, com hidróxido de sódio, aquecimento e ácido (Figura 07), é uma alternativa
para gerar uma substância com maior absorção no ultravioleta, o composto Q260, e vem
sendo utilizado em várias pesquisas para aumentar a sensibilidade do método tradicional
(HAO, 2002; DIAWARA et al., 2011; SUBERU, 2013). O composto Q260 recebeu este
nome devido ao seu máximo de absorção, em aproximadamente 260 nm.
Figura 07. Reação de derivatização da artemisinina
Fonte: Zhao (1986).
A derivatização levou à formação do composto Q260, com máximo de absorção
claramente definido, em 255 nm, assim como o obtido por Erdemoglu et al. (2007). A figura
08 mostra o gráfico de varredura ultravioleta de 200 a 400 nm, onde fica evidenciada a
formação do composto Q260, diferentemente do espectro ultravioleta da artemisinina,
demonstrado na figura 06.
Figura 08. Varredura do Composto Q260 de Artemisia annua L. derivatizada
Fonte: Próprio autor.
6,101 Extracted
6,151 Extracted
6,200 Extracted
6,242 Extracted
6,297 Extracted
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
nm
200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00
43
Foi verificado que o uso de NaOH a 0,025 M resultou em valores de AUC reduzidos,
o que indicou uma provável derivatização ineficiente. Quanto ao uso de NaOH 0,1 M, os
valores de AUC foram iguais aos obtidos com NaOH 0,05 M. Logo, foi mantido na reação o
uso de NaOH 0,05 M, como preconizado.
Foi também investigado se o aquecimento era necessário para a reação. Foi verificado
que, após a adição de NaOH 0,05 M, ocorreu um aumento progressivo da AUC que atingiu
um platô em torno de 50 min (Figura 09), após o qual começou a reduzir. Foram comparados
os cromatogramas de artemisinina e do composto formado, sem aquecimento, e foi
demonstrado o desaparecimento do pico de artemisinina (Figuras 10 e 11), o que indicou que
esta reagiu totalmente.
Figura 09. Valores de AUC após adição de NaOH 0,05 M sem aquecimento
Fonte: Próprio autor.
Figura 10. Cromatograma da artemisinina antes da derivatização
Fonte: Próprio autor.
AU
-0,004
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Artemisinina
44
Figura 11. Cromatograma da artemisinina após a derivatização (ampliação)
Fonte: Próprio autor.
Após a reação com NaOH, a derivatização seguiu com a adição de ácido acético. Foi
observado que os valores de AUC reduziram a partir da adição do ácido, até se estabilizar
após aproximadamente 35 min (Figura 12). Este comportamento ocorreu com ou sem
aquecimento, e poderia resultar em erro de quantificação do método caso a injeção fosse feita
em momentos distintos deste intervalo.
Portanto, tendo em vista estes resultados, foi determinado que fosse aguardado um
tempo de estabilização de, no mínimo, 40 min após a adição de ácido para injetar no sistema
cromatográfico.
Figura 12. Estabilização da solução de leitura após a derivatização
Fonte: Próprio autor.
Com aquecimento, após a estabilização, os valores de AUC foram 14,6 % menores do
que sem aquecimento. Logo, para aumentar os limites de detecção e quantificação do método
e, como foi visto que a derivatização foi completa sem aquecimento, este não foi utilizado nas
derivatizações. Liu et al. (2008) utilizaram a derivatização pós-coluna para quantificação do
45
composto Q292, formado após a adição de NaOH, sem uso de ácido acético, pois julgaram o
método insatisfatório devido à instabilidade do composto Q260.
Existem referências de que o composto Q292 seja também instável (MARCHESE,
2001; ZHAO, 1986). Neste trabalho foi observado que a sensibilidade do composto Q292 foi
cerca de vinte vezes maior que a do composto Q260, devido a uma maior capacidade de
absorção no ultravioleta. Contudo, sua instabilidade foi consideravelmente alta (Figura 13),
assim como referenciado por Marchese (2001). A redução do valor de AUC, no período de 8
horas, chegou a ser aproximadamente dez vezes maior (-26,99 % versus -2,63 %) para o
composto Q292.
Figura 13. Estabilidade do composto Q260 versus composto Q292
Fonte: Próprio autor.
Durante a validação para análise do composto Q292, a exatidão do método foi quase
10 % menor em relação ao método validado para o Q260 e, no ensaio de robustez, o teste de
estabilidade da solução de leitura demonstrou perda de cerca de 2,2 % a cada 40 min, o que
além de interferir na quantificação de artemisinina, dificulta demasiadamente a rotina
laboratorial, pois seria necessário preparar cada solução de leitura imediatamente antes de
cada injeção. Portanto, optou-se pelo método de análise do composto Q260.
A derivatização da artemisinina foi então realizada com adição de 4 mL de hidróxido
de sódio 0,05 M a 1 mL da amostra, em balão volumétrico de 10 mL, aguardou-se em repouso
por 50 min em temperatura ambiente, e completou-se o volume do balão com ácido acético
0,2 M. Foram aguardados, no mínimo, 40 min para injeção no sistema cromatográfico.
4.2.2. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
46
A condição número 1, sem derivatização, obteve resultado similar ao desenvolvido por
Stringham (2009) para análise de matéria-prima, com cromatograma em 210 nm. O padrão de
artemisinina (1,0 mg/mL) foi dissolvido em acetonitrila e eluiu em aproximadamente 16,5
minutos, com pico de baixa intensidade (Figura 14) na concentração utilizada. Stringham
(2009) injetou a artemisinina 5,0 mg/mL, concentração em que obteve melhor estabilidade da
linha de base do cromatograma.
Visto que a A. annua proveniente do CPQBA/UNICAMP, utilizada neste trabalho,
possui aproximadamente 1,2 % (m/m) de artemisinina (CELEGHINI et al., 2009;
RODRIGUES et al., 2006), uma concentração superior a 400 mg/mL seria necessário para
obter um pico com resolução tão boa quanto a do padrão a 5 mg/mL. Esta concentração se
mostrou impraticável devido ao volume que ocuparia na vidraria volumétrica utilizada.
Figura 14. Cromatograma da artemisinina padrão sem derivatização, com fase móvel
acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6 mm, 210 nm.
Fonte: Próprio autor.
Na injeção de solução de A. annua a 50 mg/mL foi observado nas injeções posteriores
o surgimento de picos de compostos remanescentes na coluna (Figura 15). Isso evidenciou a
necessidade do uso de um gradiente para limpeza da coluna, como feito por Pilkington
(2012), Briars (2013) e Suberu (2013), com aumento da proporção de acetonitrila durante um
curto período de tempo.
Figura 15. Cromatograma mostrando picos de compostos remanescentes da injeção da
amostra, com FM acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6 mm
Fonte: Próprio autor.
AU
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
47
A partir da condição 2 a artemisinina foi derivatizada e a fase móvel foi alterada para
acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) (50:50), com detecção do composto Q260 em 255 nm.
Nesta condição pico do composto Q260 eluiu em 5,2 min, muito próximo das demais
substâncias presentes na droga vegetal, prejudicando a seletividade do método. Isso também
ocorreu na condição 3, com 60 % de acetonitrila. Com a coluna de 150 mm, nas condições 4 e
5, o pico de interesse também eluiu juntamente com outras substâncias, utilizando fase móvel
nas proporções de 50:50 e 40:60, respectivamente.
Erdemoglu (2007) obteve boa separação e boa sensibilidade do método com
acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) (50:50), porém, extraiu a artemisinina da droga vegetal
com n-hexano e, por isto, o cromatograma continha menos picos interferentes. Baraldi et al.
(2007) conseguiram separar tanto a artemisinina (210 nm) quanto os flavonoides (270 nm e
350 nm) presentes em A. annua com esta fase móvel, com o fluxo de 1,3 mL/min, porém, sem
derivatizar.
Para aumentar o tempo de retenção e melhorar a separação do composto Q260, a
acetonitrila foi reduzida para 30 % na condição 6, com fase móvel de 1,2 mL/min. Essa
condição resultou em uma boa separação do pico de interesse e com tempo de retenção de
10,9 min. Na condição 7, com 35 % de acetonitrila o tempo de retenção reduziu para 6,3 min,
sendo obtida uma boa separação, resultado similar ao obtido por Peng et al. (2006) com
CLAE/ELSD, em que utilizaram a mesma fase móvel, com um fluxo menor e obtiveram boa
separação de artemisinina, com tempo de retenção de 7,8 min.
Na última condição testada foi aplicado um gradiente de fluxo da fase móvel,
iniciando em acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) 35:65 até 8 min, aumentando a
acetonitrila para 60 % durante 5 minutos, retornando para 35 % em seguida e finalizando com
20 min de corrida. Este gradiente retirou as substâncias retidas na coluna mais rapidamente,
reduzindo o tempo de análise. Desta forma, o método foi fixado nestas condições, com
detecção em 255 nm.
O sinal analítico do composto Q260 foi aproximadamente sessenta vezes maior do que
o da artemisinina devido ao surgimento de grupos cromóforos após a derivatização (Zhao,
1986). A figura 16a mostra o fraco sinal analítico da artemisinina tanto no padrão quanto na
droga vegetal e fica claro na figura 16b o aumento da absorção do composto Q260, o que
permitiu o uso de menores concentrações de artemisinina nas soluções de análise.
48
Figura 16a. Cromatograma da Artemisia annua L. e do padrão de artemisinina sem
derivatizar, em acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min.
Figura 16b. Cromatograma da Artemisia annua L. derivatizada, em acetonitrila:ácido fórmico
0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min.
Fonte: Próprio autor.
Foi possível observar a importância do gradiente no cromatograma, pois, vários outros
picos surgiram no intervalo do gradiente. Uma corrida de 60 minutos demonstrou que
nenhuma outra substância ficou na coluna após os 20 min de corrida do método. Uma injeção
apenas dos solventes e reagentes utilizados (Etanol 95 %, hidróxido de sódio 0,05 M e ácido
acético 0,2 M) foi realizada e demonstrou que estas substâncias eluíram em torno de 1,6
minutos, não influenciando a resolução do pico de interesse.
4.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE
ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL
4.3.1. SELETIVIDADE
Os espectros de varredura no ultravioleta do pico de A. annua (Figura 17)
demonstraram que o pico é de uma única substância. A Figura 18 mostra a sobreposição dos
cromatogramas da A. annua e do padrão de artemisinina e demonstrou que o tempo de
retenção do composto Q260 de ambos são similares, em torno de 6,3 min, o que também
demonstrou adequada seletividade do método analítico.
49
Figura 17. Espectro de varredura ultravioleta de 200 a 400 nm do composto Q260 de
Artemisia annua L.
Fonte: Próprio autor.
Figura 18. Cromatogramas sobrepostos do composto Q260, em 255 nm, da Artemisia annua
L. (preto) e do padrão (azul), identificando o composto Q260.
Fonte: Próprio autor.
4.3.2. LINEARIDADE E INTERVALO
A curva analítica do padrão de artemisinina (Figura 19) construída antes da análise da
linearidade da droga vegetal, foi o primeiro indício de que o método apresenta linearidade
entre concentração do analito e resposta do detector. Ela foi utilizada para a realização dos
cálculos de quantificação de artemisinina nas demais análises da validação. Este método de
quantificação é denominado “padronização externa” (RIBANI et al., 2004).
Figura 19. Curva analítica do padrão de artemisinina
Fonte: Próprio autor.
50
Tabela 02. Dados da curva analítica do padrão de artemisinina
Coeficiente de
correlação linear
(r)
Coeficiente de
determinação
ajustado (r²)
Faixa de
Concentração
(μg/mL)
Intervalo de
confiança de
“a”
Intervalo de
confiança de
“b”
0,9999 0,9996 247,9 a 743,8 1.214,20 a
1.241,26
-32.440,56 a
-18.264,24
O valor do coeficiente de correlação linear (0,9999) atendeu à especificação proposta
pela RE nº 899 de 2003, de maior que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável
linearidade entre os valores de AUC e as concentrações analisadas. O teste de ANOVA
demonstrou significância da regressão linear (p = 0,00), o teste de falta de ajuste indicou
ausência de falta de ajuste dos pontos da curva analítica (p = 0,11) e o teste de Anderson-
Darling indicou normalidade dos resíduos da curva (p = 0,47).
Na análise da linearidade da artemisinina em amostras de A. annua, o valor do
coeficiente de correlação linear (0,9997) atendeu à especificação proposta pela RE nº 899 de
2003, de maior que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável linearidade entre os valores
de AUC e as concentrações analisadas. O teste de ANOVA demonstrou significância da
regressão linear (p = 0,00), ou seja, o modelo linear de regressão representa
significativamente os valores. O teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste dos
pontos na curva analítica (p = 0,78). O teste de Anderson-Darling indicou a distribuição
normal dos resíduos (p = 0,99) no intervalo avaliado. O teste de Breush-Pagan indicou
presença de homocedasticidade, ou seja, variância similar entre os erros (p = 0,22) nas
diferentes concentrações do intervalo avaliado. Os gráficos de linearidade e de resíduos estão
plotados na figura 20.
Figura 20. Gráfico da linearidade e de resíduos da análise de Artemisia annua L.
Fonte: Próprio autor.
51
Tabela 03. Dados da Linearidade da Análise de Artemisia annua L.
Coeficiente de
correlação
linear (r)
Coeficiente de
determinação
(r²) ajustado
Faixa de
Concentração
(mg/mL)
Intervalo de
confiança de
“a”
Intervalo de
confiança de
“b”
0,9997 0,9925 25,0 a 75,0 12.701,87 a
14.045,43
-74.531,98 a
3.575,72
Diversos dos trabalhos encontrados sobre validação de método analítico para análise
de artemisinina em A. annua descrevem apenas os parâmetros obtidos na análise do padrão de
artemisinina e não da droga vegetal (CELEGHINI, 2009; MARCHESE, 2001;
ERDEMOGLU, 2007; LIU, 2007). Desta forma, a linearidade do método utilizado na análise
da droga vegetal não é determinada. O padrão possui pureza maior que 98 %, enquanto que a
droga vegetal possui apenas de 0,01 a 1,5 % de artemisinina (FOGLIO, 2005), logo, trata-se
de amostras muito diferentes. Todas as demais substâncias presentes na matriz complexa da
droga vegetal podem interferir na linearidade do método no intervalo verificado, sendo assim,
se faz importante a avaliação da linearidade na análise da droga vegetal, para qual o método
se destinará.
4.3.3. PRECISÃO
4.3.3.1. REPETIBILIDADE
O DPR calculado foi de 3,0 % (Tabela 04), o que demonstra que o método é preciso
ao nível de repetibilidade.
Tabela 04. Resultados da repetibilidade da análise de Artemisia annua L
n
Concentração
A. annua
(mg/mL)
AUC
Teor de
artemisinina
(%)
Média
(%)
DPR
(%)
1 49,9923 685.860,0 1,16
1,11 3,0
2 49,9555 659.909,5 1,12
3 49,8086 643.043,0 1,09
4 49,9555 631.820,0 1,07
5 50,0290 672.993,0 1,14
6 50,0290 629.585,5 1,07
7 49,8821 652.763,5 1,11
8 49,9923 646.466,5 1,10
52
4.3.3.2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
O DPR calculado entre as determinações dos dois analistas foi de 4,5 % (Tabela 05), o
que atende ao especificado (BRASIL, 2014), demonstrando que o método é capaz de obter o
mesmo resultado com precisão dentro de um mesmo laboratório, com variâncias
significativamente iguais (p = 0,79, ANOVA, IC = 95 %).
Tabela 05. Resultados da precisão intermediária da análise da droga vegetal.
n
Concentração
A. annua
(mg/mL)
AUC
Teor de
artemisinina
(%)
Média
(%)
DPR
(%)
An
ali
sta 1
– D
ia 1
1 49,99 685.860,0 1,16
1,15 4,5
2 49,95 659.909,5 1,12
3 49,81 643.043,0 1,09
4 49,95 631.820,0 1,07
5 50,03 672.993,0 1,14
6 50,03 629.585,5 1,07
7 49,88 652.763,5 1,11
8 49,99 646.466,5 1,10
An
ali
sta 2
– D
ia 2
9 50,18 703.686,5 1,19
10 50,21 687.218,0 1,16
11 50,10 723.574,5 1,22
12 50,40 715.031,0 1,20
13 50,21 698.185,5 1,18
14 50,36 731.997,0 1,23
15 50,14 685.090,5 1,16
16 50,18 685.591,0 1,16
Os resultados de DPR de 3,0 % para repetibilidade e de 4,5 % para precisão
intermediária foram similares e até inferiores aos obtidos em outros trabalhos, utilizando
diferentes métodos (Tabela 06).
Tabela 06. Precisão obtida por outros trabalhos.
Autores Rehder et
al. (2002)
Liu
(2007)
Celeghini et
al. (2009)
Diawara et
al. (2011)
Suberu et
al. (2013)
Método CLAE/IR CLAE/ELSD CLAE/IR CLAE/UV CLAE/EM
Repetibilidade 9,1 % 1,0 a 4,7 % 0,66 % 2,7 % 7,3 %
Intermediária - 1,8 a 4,5 % 0,66 % 7,0 % 7,9 %
53
IR: Detector de Índice de Refração; ELSD: Detector de Espalhamento de Luz Evaporativo; UV: Detector de
Ultravioleta; EM: Detector de Espectroscopia de Massas.
4.3.4. EXATIDÃO
Os resultados obtidos foram muito próximos do ideal, de 100,0 % (Tabela 07), com
exatidão média de 100,1 ± 4,5 %. Este método foi mais exato do que o obtido por outros
trabalhos, utilizando diferentes métodos (Tabela 08).
Tabela 07. Resultados da exatidão, em três níveis, da análise de Artemisia annua L.
A. annua
(mcg/mL)
Padrão de
Artemisinina
(mcg/mL)
A. annua +
Artemisinina
(mcg/mL)
Exatidão (%) Média
(%)
DPR
(%)
Baixa 250,63 126,31
370,07 94,6
100,1 4,5
372,13 96,2
371,81 95,9
Média 552,98 126,31
688,55 107,3
685,43 104,9
684,88 104,4
Alta 793,83 136,54
928,56 98,7
927,76 98,1
931,80 101,0
Tabela 08. Exatidão obtida por outros trabalhos.
Autores Rehder et al.
(2002)
Liu
(2007)
Celeghini et
al. (2009)
Diawara et al.
(2011)
Suberu et al.
(2013)
Método CLAE/IR CLAE/ELSD CLAE/IR CLAE/UV CLAE/EM
Exatidão 95,24 ± 8,7% 97,9 ± 3,8% 103,17 ± 0,6% 102,3 ± 16,8% 103,59 ± 8,4%
IR: Detector de Índice de Refração; ELSD: Detector de Espalhamento de Luz Evaporativo; UV: Detector de
Ultravioleta; EM: Detector de Espectroscopia de Massas.
4.3.5. LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO
Foram encontrados os limites descritos na tabela 09. A precisão ficou entre 3,5 % e 5,6
% e a exatidão ficou entre 80,5 % e 98,5 %, sendo aceitos valores de precisão de até 15 % e
de exatidão de 80 % a 120 %, em baixas concentrações do analito (RIBANI et al., 2004). A
54
curva analítica nesta concentração não demonstrou falta de ajuste linear (p = 0,90) e os
resíduos obtiveram distribuição normal (p = 0,62), com intervalo de confiança de 95 %.
Tabela 09. Resultados da análise do LD e LQ
Parâmetros Resultados
LD 1,3 μg/mL de artemisinina
LQ 4,0 μg/mL de artemisinina
Concentração 0,5 a 10,0 mg/mL de A. annua
r² ajustado 0,9951
Como podem ser observados na tabela 10, os limites calculados aqui foram menores
que o obtido em vários trabalhos que também utilizaram cromatografia, porém, com outros
detectores acoplados. Diawara et al. (2011) são o único exemplo que, além do detector de
ultravioleta, também realizaram derivatização da artemisinina na análise. Estes resultados
demonstraram a eficiência da derivatização da artemisinina que, ao gerar o composto Q260,
aumentou sua absorção e, consequentemente, aumentou os limites de detecção e quantificação
do método.
Tabela 10. Limites de detecção e quantificação de artemisinina obtida por outros trabalhos.
Autores Rehder et al.
(2002)
Liu
(2007)
Celeghini
et al. (2009)
Diawara et
al. (2011)
Suberu et
al. (2013)
Método CLAE/IR CLAE/ELSD CLAE/IR CLAE/UV CLAE/MS
LD 25 mg/mL A. annua 40 μg/mL 2,2 μg/mL 2,7 μg/mL 0,13 ng/mL
LQ 85 mg/mL A. annua 100 μg/mL 7,5 μg/mL 10,0 μg/mL 0,41 ng/mL
IR: Detector de Índice de Refração; ELSD: Detector de Espalhamento de Luz Evaporativo; UV: Detector de
Ultravioleta; MS: Detector de Espectroscopia de Massas.
4.3.6. ROBUSTEZ
Os resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 11. Todos os valores de DPR
ficaram abaixo de 2,4 %, demonstrando que o método pode ser considerado robusto para os
parâmetros avaliados. Alguns trabalhos afirmam que o método é robusto, utilizando esta
palavra de maneira genérica, sem ter sido avaliada nenhuma alteração no método (REHDER,
2002; SUBERU, 2013), o que vai a desencontro com o significado analítico da palavra
(RIBANI et al., 2004; BRASIL, 2003).
55
Tabela 11. Resultados da robustez do método analítico na análise de Artemisia annua L.
Parâmetro avaliado Condição alterada DPR (%)
Estabilidade da solução Entre 0 e 210 minutos 0,58
Comprimento de onda ± 2 nm 0,90
Concentração de ácido fórmico na fase móvel ± 10 % (v/v) 0,50
Temperatura da coluna ± 2 ºC 0,40
Fluxo da fase móvel ± 0,03 mL/min 2,40
4.3.7. ADEQUAÇÃO DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO
Os valores obtidos, em triplicata, estão listados na tabela Tabela 12 e todos ficaram
dentro das especificações recomendados pelo FDA (1994), certificando a adequada separação
do pico de interesse.
Tabela 12. Adequabilidade do Sistema do Cromatograma de Artemisia annua L.
Parâmetros Especificação Resultado ± DP
Fator de Capacidade (K) > 2,0 5,23 ± 0,04
Resolução (R) > 2,0 6,27 ± 0,06
Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 1,08 ± 0,00
Pratos Teóricos (N) > 2.000 9.246,7 ± 113,80
4.4. OBTENÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO DE Artemisia annua L
O tempo total de maceração foi de 72 horas e a proporção droga/solvente utilizada foi
de 1:10. Bilia et al. (2006) e Baraldi et al. (2008) trabalharam com as mesmas condições para
obtenção de extrato hidroalcoólico a partir de A. annua. A utilização de quatro etapas de
extração é comumente utilizada no processo tradicional de extração (RODRIGUES et al.,
2006).
A quantidade de artemisinina extraída em cada etapa da extração (figura 21)
demonstrou que na quarta fração seu teor foi quase vinte vezes menor do que na primeira. A
sua coloração visivelmente mais clara também auxiliou na determinação do final da
percolação. Vinte litros de etanol 95 % foram utilizados para cada 2 kg de A. annua pó. Como
a percolação foi realizada em dois percoladores, foram obtidos 40 litros de extrato.
56
Figura 21. Quantidade de artemisinina (g) e de resíduo seco (%) em cada etapa da extração
Fonte: Próprio autor.
A artemisinina extraída a partir da droga vegetal seca foi de 0,92 %, o que resultou em
uma eficiência de 80 % (Figura 22), em relação ao conteúdo de artemisinina determinado na
análise de precisão intermediária (1,15 ± 0,05 %). Como a eficiência da extração
normalmente relatada está em torno de 60 % a 80 % (BRIARS, 2013), o resultado obtido aqui
foi considerado satisfatório já na terceira etapa, resultando em uma proporção droga/solvente
de 1:7,5.
Figura 22. Eficiência de extração de artemisinina em cada fração, com indicação do DPR em
cada etapa.
Fonte: Próprio autor.
Rodrigues et al. (2006) propuseram uma extração de dois lotes de droga vegetal em
paralelo, utilizando cada fração obtida na extração do primeiro lote, após filtração, como
líquido extrator do segundo, resultando em uma proporção droga/solvente de 1:7,6. Contudo,
a eficiência de extração foi de 73 %, menor do que a alcançada aqui na terceira fração, com
proporção droga/solvente de 1:7,5.
Cinco litros de extrato foram concentrados por vez, durante cerca de 4 horas, sendo
necessários 32 horas (4 h x 8) para redução do volume inicial a 2,5 litros finais.
57
4.4.1. CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS DE Artemisia annua L
O extrato foi caracterizado antes e depois da concentração e foram obtidos os
seguintes resultados apresentados na tabela 13. O resíduo seco é aparentemente composto
principalmente por material graxo.
Na figura 23 é possível observar que o extrato concentrado possui 27,8 % mais
artemisinina que a droga vegetal e 75,0 % mais que o extrato percolado, o que demonstra a
importância da etapa de extração e concentração, em relação ao aumento da quantidade de
artemisinina.
Tabela 13. Resultado da caracterização do extrato antes e após a concentração.
Parâmetros Extrato
Percolado
Extrato
Concentrado
Volume 40.000 mL 2.500 mL
Teor de Artemisinina 0,84 ± 0,01 % 1,47 ± 0,05 %
Teor de Resíduo Seco 2,09 ± 0,05 % 30,78 ± 0,43 %
Densidade relativa 0,85 ± 0,00 g/mL 0,93 ± 0,00 g/mL
pH 6,75 ± 0,05 6,3 ± 0,00
Viscosidade - 3,13 ± 0,06 cP
Teor de Etanol 95,0 % 23,5 %
Figura 23. Comparação da artemisinina na droga vegetal e extrato percolado e concentrado.
Fonte: Próprio autor.
4.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA
NOS PÉLETES
58
4.5.1. SELETIVIDADE
O tempo de retenção do composto Q260 foi o mesmo do padrão e os espectros de
varredura no ultravioleta também apresentaram máximos de absorção semelhantes, o que
indica que o pico obtido no cromatograma da amostra foi isolado dos interferentes da matriz
(Figura 24).
Figura 24. Cromatograma dos péletes e do padrão de artemisinina
Fonte: Próprio autor.
Os parâmetros de adequabilidade do sistema ficaram dentro dos parâmetros
recomendados (FDA, 1994).
Tabela 14. Adequação do sistema do cromatograma de péletes
Parâmetros Especificação Resultado
Fator de Capacidade (K) > 2,0 5,3 ± 0,0
Resolução (R) > 2,0 2,9 ± 1,0
Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 1,0 ± 0,0
Pratos Teóricos (N) > 2.000 10.109,5 ± 190,0
4.5.2. LINEARIDADE
O ensaio de linearidade foi realizado por meio da análise de cinco soluções de péletes,
em triplicata, conforme recomendação do IUPAC (2002). Aproximadamente 400 mg foram
transferidos para balão volumétrico de 10 mL, adicionado etanol 95 % e agitado em ultrassom
durante 10 minutos. O volume foi completado com o mesmo solvente, homogeneizado e 1
mL do sobrenadante foi retirado para derivatização e análise. O método analítico utilizado foi
AU
-0,005
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
59
o mesmo validado para a análise da droga vegetal, mantendo-se as condições cromatográficas
e de derivatização da amostra.
O valor do coeficiente de correlação linear (0,9995) atendeu à especificação de maior
que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável linearidade entre os valores de AUC e as
concentrações analisadas. O teste de ANOVA demonstrou significância da regressão linear (p
= 0,00) e o teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste na curva analítica (p =
0,41). Em relação aos resíduos, o teste de Anderson-Darling indicou sua normalidade (p =
0,53) e o teste de Breush-Pagan indicou homocedasticidade (p = 0,14). Os gráficos de
linearidade e de resíduos estão plotados na figura 25.
Figura 25. Linearidade e gráfico de resíduos da análise de péletes.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 15. Dados da linearidade da análise dos péletes
Coeficiente de
correlação
linear (r)
Coeficiente de
determinação
(r²) ajustado
Faixa de
Concentração
(mg/mL)
Intervalo de
confiança de
“a”
Intervalo de
confiança de
“b”
0,9995 0,9958 15,6 a 39,2 19.685,46 a
21.223,48
-65.288,30 a
21.277,30
4.5.3. REPETIBILIDADE
Seis soluções de péletes foram analisadas e os resultados estão dispostos na tabela 16.
O resultado demonstrou adequabilidade à recomendação de DPR < 15 % para medicamentos
fitoterápicos (BRASIL, 2014), o que demonstra que o método analítico apresenta confiável
repetibilidade.
Tabela 16. Repetibilidade na análise dos péletes
mg Péletes Concentração
(mg/mL) AUC
Artemisinina
(mg/mL) DPR (%)
60
470 45,8250 952772 17,17
1,9
400 39,0000 798079 16,90
405 39,4875 809563 16,93
Tabela 16. Repetibilidade na análise dos péletes (Continuação)
402 39,1950 783935 16,51
400 39,0000 785536 16,63
401 39,0975 821366 17,35
4.6. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA
NAS CÁPSULAS
4.6.1. SELETIVIDADE
O tempo de retenção do composto Q260 foi o mesmo do padrão e os espectros de
varredura no ultravioleta também apresentaram máximos de absorção semelhantes, o que
indica que o pico obtido no cromatograma da amostra foi isolado dos interferentes da matriz
(Figura 26).
Figura 26. Cromatograma das cápsulas e do padrão de artemisinina
Fonte: Próprio autor.
Os parâmetros de adequabilidade do sistema ficaram dentro dos parâmetros
recomendados (FDA, 1994).
Tabela 17. Adequabilidade do sistema do cromatograma de cápsulas
Parâmetros Especificação Resultado
Fator de Capacidade (K) > 2,0 5,2 ± 0,0
Resolução (R) > 2,0 6,7 ± 0,1
Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 0,9 ± 0,0
Pratos Teóricos (N) > 2.000 9.986,5 ± 16,6
AU
-0,005
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
61
4.6.2. LINEARIDADE
O valor do coeficiente de correlação linear (0,9997) atendeu à especificação de maior
que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável linearidade entre os valores de AUC e as
concentrações analisadas. O teste de ANOVA demonstrou significância da regressão linear (p
= 0,00) e o teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste da curva analítica (p =
0,22). Em relação aos resíduos, o teste de Anderson-Darling indicou sua normalidade (p =
0,53) e o teste de Breush-Pagan indicou homocedasticidade (p = 0,13). Os gráficos de
linearidade e de resíduos estão plotados na figura 27.
Figura 27. Linearidade e gráfico de resíduos da análise das cápsulas.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 18. Dados da linearidade da análise das cápsulas
Coeficiente de
correlação
linear (r)
Coeficiente de
determinação
(r²) ajustado
Faixa de
Concentração
(mg/mL)
Intervalo de
confiança de
“a”
Intervalo de
confiança de
“b”
0,9997 0,9938 7,4 a 22,5 20.362,1 a
22.306,1
-34.733,0 a -
3.701,2
4.6.3. REPETIBILIDADE
Seis soluções de péletes foram analisadas e os resultados estão dispostos na tabela 19.
O resultado demonstrou adequabilidade à recomendação de DPR < 15 % para medicamentos
fitoterápicos (BRASIL, 2014), o que demonstra que o método analítico apresenta confiável
repetibilidade.
62
Tabela 19. Repetibilidade da análise do granulado das cápsulas
Massa
(mg)
Concentração
(mg/mL) AUC
Artemisinina
(mg/mL)
DPR
(%)
1.124,2 15,06 294345 16,5
2,3 1.126,0 15,09 306988 17,2
1.127,0 15,10 307366 17,2
1.125,1 15,08 313608 17,6
1.126,5 15,10 313840 17,6
1.125,6 15,08 306651 17,2
4.7. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA
NOS COMPRIMIDOS
4.7.1. SELETIVIDADE
O tempo de retenção do composto Q260 foi o mesmo do padrão (Figura 28) e os
espectros de varredura no ultravioleta também apresentaram máximos de absorção
semelhantes, o que indica que o pico obtido no cromatograma da amostra foi isolado dos
interferentes da matriz.
Os parâmetros de adequabilidade do sistema ficaram dentro dos parâmetros
recomendados (FDA, 1994).
Figura 28. Cromatograma dos comprimidos e do padrão de artemisinina
Fonte: Próprio autor.
Tabela 20. Adequabilidade do sistema do cromatograma de comprimidos
Parâmetros Especificação Resultado
Fator de Capacidade (K) > 2,0 5,1 ± 0,1
Resolução (R) > 2,0 2,4 ± 0,3
AU
-0,005
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
63
Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 0,9 ± 0,0
Pratos Teóricos (N) > 2.000 10.108,0 ± 72,2
4.7.2. LINEARIDADE
O valor do coeficiente de correlação linear (0,9995) atendeu à especificação de maior
que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável linearidade entre os valores de AUC e as
concentrações analisadas. O teste de ANOVA demonstrou significância da regressão linear (p
= 0,00) e o teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste da curva analítica (p =
0,51). Em relação aos resíduos, o teste de Anderson-Darling indicou sua normalidade (p =
0,48) e o teste de Breush-Pagan indicou homocedasticidade (p = 0,31). Os gráficos de
linearidade e de resíduos estão plotados na figura 29.
Figura 29. Linearidade e gráfico de resíduos da análise dos comprimidos.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 21. Dados da linearidade da análise dos comprimidos
Coeficiente de
correlação
linear (r)
Coeficiente de
determinação
(r²) ajustado
Faixa de
Concentração
(mg/mL)
Intervalo de
confiança de
“a”
Intervalo de
confiança de
“b”
0,9995 0,9948 7,4 a 22,5 20.494,5 a
22.269,7
-34.516,4 a
-6.172,4
4.7.3. REPETIBILIDADE
Seis soluções de péletes foram analisadas e os resultados estão dispostos na tabela 21.
O resultado demonstrou adequabilidade à recomendação de DPR < 15 % para medicamentos
fitoterápicos (BRASIL, 2014), o que demonstra que o método analítico apresenta confiável
repetibilidade.
64
Tabela 22. Repetibilidade na análise dos comprimidos
mg
Cápsulas
Concentração
(mg/mL) AUC
Artemisinina
(mg/mL)
DPR
(%)
1.125,0 15,08 299371 16,82
2,9 1.127,0 15,10 321209 18,01
1.126,0 15,09 304487 17,09
1.124,0 15,06 321366 18,07
1.124,0 15,06 309286 17,39
1.128,0 15,12 309573 17,34
4.8. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PÉLETES
O PVP foi solubilizado no extrato, aos poucos, sob agitação constante em agitador tipo
vórtex a 750 rpm durante 10 min. Após a adição do extrato à celulose microcristalina,
misturou-se até a obtenção de uma massa homogênea, com propriedades de aglutinação
adequadas para a etapa seguinte de extrusão. A capacidade aglutinante foi avaliada por meio
da compressão manual da mistura. Quando observou-se a formação de uma massa resistente,
sem extravasamento de líquido por entre os dedos, a mesma foi submetida à extrusão e
esferonização. As formulações obtidas estão resumidas na tabela 23.
Tabela 23. Propriedades dos péletes obtidos nas diferentes formulações.
n
Celulose(g)-
Extrato(g)-
PVP(g)
Perda por
Dessecação
(%)
Esfericidade Tamanho
médio (μm)
Amplitude
de tamanho
Artemisinina
(%)
1 40 - 45 - 0,00 - - - - -
2 40 - 70 - 0,00 2,16 ± 0,11 0,78 ± 0,09 540 2,3 2,03 ± 0,2
3 40 - 70 - 5,04 - - - - -
4 40 - 70 - 3,15 2,57 ± 0,05 0,79 ± 0,09 1.340 1,9 1,89 ± 0,03
5 40 - 70 - 1,26 2,49 ± 0,11 0,77 ± 0,09 1.465 1,8 1,86 ± 0,09
6 40 - 65 - 1,23 2,26 ± 0,05 0,82 ± 0,08 705 2,3 1,74 ± 0,05
7 40 - 58 - 0,00 2,28 ± 0,13 0,82 ± 0,08 551 2,8 1,49 ± 0,02
65
A malaxagem foi realizada em recipiente de batedeira planetária, onde a celulose
microcristalina foi molhada com o extrato concentrado (adicionado ou não de PVP) que agiu
como líquido de granulação e, portanto, não foi utilizado água. A celulose microcristalina
confere a plasticidade necessária à massa para extrusão e esferonização, podendo chegar a
corresponder de 40 a 60 % da massa dos pós secos das formulações de péletes (SANTOS et
al., 2004).
A formulação 1 apresentou elevada formação de pós durante a esferonização e a
formulação 3 ficou excessivamente aglutinada e, por isso, não foram caracterizadas. A
porcentagem de PVP foi calculada sobre o total aproximado de sólidos finais resultantes da
soma da celulose (g) e do extrato (g), considerando o teor de resíduo seco deste de 30,78 %.
A esfericidade dos péletes é um parâmetro importante para sua propriedade de fluxo,
que terá grande influência em uma posterior etapa de enchimento de cápsulas ou de
compressão. Neste trabalho foi calculada a esfericidade projetada, onde valores mais
próximos de 1,0 indicam melhor esfericidade e valores acima de 0,6 já são considerados
satisfatórios (SANTOS et al., 2006).
Os PVPs disponíveis no mercado possuem diferentes graus de viscosidade, sendo esta
diretamente proporcional ao seu peso molecular. São identificados pela letra “K” seguido pelo
valor da sua viscosidade aproximada em uma solução a 1 %. Por exemplo, K30, K60 e K90.
Quanto maior o valor de número, maior a capacidade de aumentar a viscosidade de uma
solução aquosa (ISP, 2014), o que faz aumentar a aglutinação da massa umidificada durante a
malaxagem.
O PVP K30 foi testado e permitiu a obtenção de extrusados com satisfatórios para
formação de péletes após a esferonização. Logo, o uso de outro polímero de maior
viscosidade foi descartado. Na literatura, o uso de até 10 % como aglutinante para obtenção
de péletes foi relatado (FERRAZ et al., 2014).
Na formulação número 2, com maior quantidade de extrato e sem adição de
aglutinante, foi possível obter péletes com propriedades adequadas, contudo, sua
reprodutibilidade não foi possível devido à grande perda de solvente durante o tempo de
malaxagem.
Com o uso de PVP, as formulações 4 e 5 resultaram em péletes com menor amplitude
de tamanho, porém, com tamanho demasiadamente grande. As demais propriedades foram
similares apesar de possuírem diferentes quantidades de aglutinante.
Na formulação 6 a redução de extrato e o uso de aglutinante possibilitou obtenção de
péletes com propriedades adequadas, esfericidade e tamanho um pouco maiores do que na
66
formulação 2, e com a mesma amplitude de tamanho. O teor de artemisinina 14 % menor foi
uma desvantagem desta formulação.
No entanto, a repetição da formulação 6 resultou em péletes excessivamente grandes,
como nas formulações 4 e 5, provavelmente devido ao menor tempo gasto na etapa de
malaxagem.
A diferença entre os tempos de malaxagem resultou em diferentes umidificações
devido à evaporação de etanol. A perda de umidade durante esta etapa deve ser minimizada
(SANTOS et al., 2004) e é ainda mais crítico devido ao conteúdo de etanol no extrato
concentrado.
Com o tempo de malaxagem reduzido, a formulação 6 resultou em péletes tão grandes
quanto nas formulações 3, 4 e 5, pois a quantidade de etanol do extrato sofreu menor
evaporação, ficando em excesso. Para reduzir o tamanho das unidades o PVP não foi utilizado
na formulação 7 (Figura 30). O volume de extrato não foi reduzido para não diminuir ainda
mais o teor de artemisinina na formulação.
Figura 30. Formulação de péletes número 7.
Sem PVP, a formulação número 7 resultou em péletes com teor de artemisinina menor
que nas formulações anteriores e maior amplitude de tamanho, porém, com melhor
esfericidade e reprodutibilidade. Foi, então, encapsulada em cápsulas de tamanho número 00
(Figura 31).
Figura 31. Cápsulas de péletes de extrato hidroalcoólico de A. annua.
67
4.9. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPRIMIDOS E CÁPSULAS
Após a secagem, o granulado presentou 2,69 ± 0,17 % de umidade e 17,84 ± 0,17
mg/g de artemisinina.
O teste de dureza dos comprimidos (Figura 32) indicou valores muito diferentes entre
as unidades testadas porque elas não quebraram durante o teste, mas deformaram sob a
pressão aplicada. Isto pode ter ocorrido devido à característica graxa do resíduo seco do
extrato. No teste de friabilidade, os comprimidos apresentaram perda de massa de 0,0 % e
todas as unidades permaneceram íntegras. A largura e a altura foram, respectivamente, 11,45
± 0,03 mm e 6,32 ± 0,11 mm.
Figura 32. Comprimidos de extrato hidroalcoólico de A. annua.
Para o preparo do granulado para encapsulação foi adicionado 0,5 % de dióxido de
silício coloidal ao granulado utilizado no preparo de comprimidos. Isso foi necessário para
melhorar a fluidez do granulado no encapsulador. O teor de artemisinina do granulado das
cápsulas foi de 17,96 ± 0,27 mg/g. Em seguida, foi encapsulado em cápsulas número 00
(Figura 33).
Figura 33. Cápsulas de granulado de extrato hidroalcoólico de A. annua.
68
Diawara et al. (2012) prepararam granulados a partir do extrato hidroalcoólico de A.
annua e, em seguida, os utilizaram na forma de pó para suspensão e cápsulas. Obtiveram
nesta última bons resultados para os testes de determinação de peso e uniformidade de
conteúdo, porém, os valores não foram mostrados, incluindo do teor de artemisinina no
granulado.
4.10. CARACTERIZAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
4.10.1. ANÁLISE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
O teste se aplica a formas farmacêuticas sólidas em dose unitária (comprimidos não
revestidos, comprimidos revestidos, pastilhas, cápsulas duras e moles e supositórios, entre
outras) e avalia se a massa de cada unidade posológica testada está próxima da massa média
das unidades amostradas. Como a média de todas as formas testadas ficou acima de 300 mg, a
especificação para todas é de ± 7,5 % de variação permitida de cada unidade em relação à
média. Para médias inferiores a 300 mg, a variação permitida pode ser de até 10 % (BRASIL,
2010).
A tabela 24 traz os valores das médias do peso e os respectivos valores mínimos e
máximos obtidos na análise de cada forma farmacêutica. Como pode ser observado, todos os
valores ficaram dentro das especificações recomendadas, demonstrando que o processo de
fabricação foi eficiente na distribuição de massa de cada unidade.
Tabela 24. Determinação de peso das formas farmacêuticas.
Forma farmacêutica Peso médio
(mg)
Variação
máxima
permitida
Variação
mínima
Variação
máxima
69
Comprimidos 606,2 Até 2 unidades
acima de ± 7,5 %,
porém, menor que
o dobro.
-2,0 % 1,2 %
Cápsulas 553,1 -6,8 % 4,8 %
Péletes 605,6 -4,2 % 6,5 %
As cápsulas apresentaram menor peso médio, provavelmente devido à menor
densidade do granulado. Os comprimidos apresentaram a menor variação de massa, assim
como relatado como vantagem para esta forma farmacêutica por Cole (1998).
Os valores obtidos na análise de determinação de peso podem influenciar diretamente
o resultado da análise de uniformidade de conteúdo, que avalia a variação de fármaco entre as
diferentes unidades.
4.10.2. ANÁLISE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
O teste de desintegração verifica se comprimidos ou cápsulas desintegram dentro do
tempo especificado. Para comprimidos não revestidos o tempo recomendado é de até 30 min e
para cápsulas gelatinosas duras de até 45 min, mas a monografia de cada produto pode alterar
este tempo (BRASIL, 2010).
As cápsulas e péletes se desintegraram em menos que 5 min, tanto em água purificada
quanto em tampão fosfato pH 1,2. Os comprimidos precisaram de quase 30 min para
desintegração completa em água. Em tampão pH 1,2 os comprimidos levaram quase 60 min
para desintegração completa. Esses tempos de desintegração dos comprimidos foi
consideravelmente superior ao apresentado por comprimidos de artemisinina pura. Em um
trabalho de desenvolvimento de comprimidos de artemisinina, a formulação final desintegrou
em aproximadamente 1 min (HOA, 1997).
Isso pode ter ocorrido devido à característica graxa hidrofóbica do extrato
concentrado, que aumentou visivelmente em pH 1,2, formando grânulos insolúveis neste. O
material insolúvel demonstrou pronunciada adesividade, o que o fez aderir às partes do
equipamento, fazendo com que a desintegração fosse ainda mais lenta, principalmente dos
comprimidos, cujo conteúdo é compactado.
4.10.3. TESTE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO E DOSEAMENTO DAS FORMAS
FARMACÊUTICAS
70
A tabela 25 resume os valores calculados do valor de aceitação (VA) para cada forma
farmacêutica. O teor previsto foi calculado relacionando o teor de artemisinina dos granulados
e os pesos médios de cada forma farmacêutica.
Tabela 25. Teor de artemisinina previsto para cada forma farmacêutica
Forma
farmacêutica
Teor de
artemisinina do
granulado (mg/g)
Peso médio
(g)
Teor
previsto
(mg)
Comprimidos 17,84 ± 0,17 0,6062 10,81
Cápsulas 17,96 ± 0,27 0,5531 9,93
Péletes 14,90 ± 0,20 0,5674 8,45
Tabela 26. Uniformidade de conteúdo das formas farmacêuticas.
Forma
farmacêutica
Teor
médio,
Tm (%)
Desvio
padrão,
DP (%)
Valor de
referência,
M (%)
Equação para
cálculo do VA VA
Comprimidos 92,3 2,6 98,5
|M - Tm| + k.DP
12,5
Cápsulas 97,2 4,4 98,5 11,8
Péletes 95,8 4,7 98,5 14,0
Todas ficaram abaixo do valor máximo recomendado, de 15,0, na primeira etapa do
teste, o que indica que o conteúdo de artemisinina nas três formas ficou próximo do teor
previsto e que o conteúdo entre as diferentes unidades está satisfatoriamente uniforme. O DP
dos comprimidos foi o menor, reflexo da menor variação de massa obtida para estes na
análise de determinação de peso.
4.10.4. ANÁLISE DE PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS
A solubilidade da artemisinina em água é muito baixa (WHO, 2014), tendo sido
relatados valores de 49,7 μg/mL (CARBONARA et al., 2012), 44,7 μg/mL (BALDUCCI et
al., 2013), 30,1 μg/mL (SAHOO et al., 2011), entre outros, dependentemente ainda da forma
cristalina em que se encontra, pois a artemisinina apresenta polimorfos (CHAN et al., 1997).
No entanto, no extrato vegetal sua solubilidade é aumentada devido à presença,
principalmente, de compostos fenólicos (CARBONARA et al., 2012).
71
Os estudos de dissolução foram realizados em meios tampão de pH 1,2 e 6,8,
abrangendo o valor mínimo e máximo do pH fisiológico (BRASIL, 2010), com 900 mL de
meio de dissolução a uma velocidade de 100 rpm, assim como realizado por HOA et al.
(1996) e Balducci et al. (2013), para estudos em artemisinina pura. Não foram encontrados
estudos de dissolução feitos em formas farmacêuticas com extrato de A. annua.
Nas condições fixadas, cerca de 10 mg de artemisinina em cada forma farmacêutica
foram dissolvidos em tampão pH 1,2 e pH 6,8, resultando em uma concentração de 11,1
μg/mL. Em água, a 37 ºC, HOA (1996) encontrou uma concentração de saturação de
artemisinina de 113 μg/mL. Para avaliar se haveria saturação nos tampões a 11,1 μg/mL de
artemisinina, testes preliminares com cada forma farmacêutica foram realizados, em
concentrações de 20 e 40 μg/mL de artemisinina e, em ambos os meios, foi observada total
solubilização e adequação à condição sink.
As figuras 34 e 35 mostram os perfis de dissolução de cada forma farmacêutica nos
tampões pH 1,2 e pH 6,8, respectivamente. As cápsulas e péletes apresentaram liberação
imediata com dissolução muito rápida em ambos os meios, por terem dissolvido mais que 85
% em até 15 min. Os comprimidos apresentaram liberação imediata apenas em pH 6,8, onde
dissolveram mais que 75 % de artemisinina em 45 min. (BRASIL, 2010). Em pH 1,2 a
dissolução dos comprimidos foi mais lenta, reflexo da sua desintegração mais lenta nesse pH,
tendo liberado após 60 min apenas 85,2 % de artemisinina, menos do que as cápsulas, que
chegaram a 99,8 % em 20 min, e do que os péletes, que alcançaram 103,3 % em 30 min.
Figura 34. Perfis de dissolução em tampão pH 1,2.
Fonte: Próprio autor.
Figura 35. Perfis de dissolução em tampão pH 6,8.
72
Fonte: Próprio autor.
A figura 36 mostra a quantidade de artemisinina liberada pelas diferentes formas
farmacêuticas, após 60 min, nos dois diferentes meios de dissolução. Em geral, a artemisinina
liberada foi menor no tampão pH 1,2 (p = 0,02), com média de 89,4 %, contra 99,0 % em pH
6,8.
Figura 36. Comparação entre dissolução, após 60 min, das formas farmacêuticas em pH 1,2 e
pH 6,8.
Fonte: Próprio autor. Letras iguais entre as colunas indicam dissolução em 60 min
significativamente iguais, com 95 % de significância.
A figura 37 mostra os valores da eficiência de dissolução (ED) das diferentes formas
farmacêuticas nos dois diferentes meios de dissolução. Este parâmetro é diretamente
proporcional à área sob a curva de cada perfil. E esta, por sua vez, está relacionada à
velocidade de dissolução. Quanto mais rápida for a dissolução, maior será a área sob a curva
e, consequentemente, maior a eficiência de dissolução.
Figura 37. Comparação entre eficiência de dissolução das formas farmacêuticas em pH 1,2 e
pH 6,8.
73
Fonte: Próprio autor. Letras iguais entre as colunas indicam eficiências de dissolução
significativamente iguais, com 95 % de significância.
Os comprimidos apresentaram ED significativamente menor (p < 0,05) do que as
cápsulas e os péletes, e estes não demonstraram diferença significativa entre si (p > 0,05), em
ambos os meios de dissolução. Os comprimidos também apresentaram diferença (p < 0,05)
nos diferentes meios, tendo apresentado a menor eficiência de dissolução em pH 1,2 (41,5 ±
0,9 %).
Outra forma de avaliar a diferença entre perfis de dissolução é a utilização do fator de
semelhança “F2”, descrito na RDC nº 31 como método de comparação para fins de
comprovação de equivalência farmacêutica entre medicamentos. É normalmente utilizado
para comparação entre perfis de dissolução de mesmas formas farmacêuticas e perde seu valor
discriminativo quando os perfis apresentam dissolução muito rápida (BRASIL, 2010),
portanto, foi utilizado neste trabalho apenas para comparação entre os perfis dos
comprimidos.
Para considerar que perfis são equivalentes, o valor de F2 deve estar compreendido
entre 50 e 100 (BRASIL, 2010). Kakran et al. (2013), Balducci et al. (2013) e Sahoo et al.
(2010) também compararam diferentes perfis de dissolução de artemisinina utilizando, além
dos dados da eficiência de dissolução, o fator de semelhança F2.
A figura 38 mostra como os perfis dos comprimidos se comportaram diferentemente
em função do pH do meio. Após 60 min de dissolução, em pH 1,2 foi liberado 85,2 % contra
95,1 % em pH 6,8. O valor de F2 calculado entre os perfis dos comprimidos foi de 30,2 (<
50,0), o que corroborou a diferença também obtida pela comparação da eficiência de
dissolução.
Figura 38. Perfis de dissolução dos comprimidos de A. annua em pH 1,2 e pH 6,8.
74
Fonte: Próprio autor.
O perfil de liberação muito rápido obtido pelas cápsulas e péletes pode fazer com que
estes apresentem eficaz atividade antimalárica devido à presença dos compostos sinérgicos da
droga vegetal presentes no extrato, que aumentam a atividade da artemisinina, porém em um
curto intervalo de tempo.
As formulações preparadas neste trabalho demonstraram como o extrato concentrado
de A. annua pode ser utilizado na fabricação de fitoterápicos com teor de artemisinina
próximo do esperado e demais propriedades físico-químicas adequadas. Uma alteração
qualitativa ou quantitativa dos adjuvantes utilizados no preparo dos comprimidos poderá, por
exemplo, modificar sua velocidade de dissolução.
A atividade antimalárica das formulações deve ainda ser avaliada, contudo a alta
quantidade de artemisinina presente na droga vegetal utilizada pode prever uma eficácia
satisfatória, quando comparado com outros trabalhos. Diawara et al. (2012), por exemplo,
com uma droga vegetal contendo apenas 0,23 % (p/p) de artemisinina, obtiveram uma
atividade antiplasmódio do extrato hidroalcoólico semelhante a da artemisinina padrão, com
IC50 de 2,85 μg/mL e 2,73 μg/mL, respectivamente.
Frente ao apresentado, para conclusão da formulação de fitoterápicos, torna-se
necessária, além da avaliação da eficácia antiplasmódio de cada forma farmacêutica e a
realização do estudo de estabilidade físico-químico e microbiológico. A partir destas
informações será possível realizar alterações que se fizerem necessárias para obtenção de
fitoterápicos eficazes no combate à malária.
75
5. CONCLUSÕES
A droga vegetal foi caracterizada, apresentando teor de artemisinina próximo ao
relatado por outros autores.
Os resultados da validação do método de doseamento de artemisinina na droga vegetal
permaneceram dentro das especificações para todos os parâmetros avaliados.
A extração de artemisinina da droga vegetal com solução hidroalcoólica 95 %
alcançou eficiência de 80 %, dentro do esperado.
O extrato foi concentrado e caracterizado, resultando em teor de artemisinina
aumentado em relação à droga vegetal e propriedades físico-químicas adequadas.
Foram produzidos péletes e granulados com propriedades adequadas para obtenção de
formas farmacêuticas sólidas, como comprimidos e cápsulas.
Os resultados das validações parciais do método analítico ficaram dentro das
especificações, o que demonstra confiabilidade para o uso na análise dos péletes, cápsulas e
comprimidos.
Os comprimidos e cápsulas foram caracterizados em relação aos testes farmacopeicos
recomendados para formas farmacêuticas sólidas e apresentaram-se dentro das especificações
para todos os parâmetros avaliados.
Os resultados deste estudo demostraram que é possível obter formulações sólidas
contendo extrato hidroalcoólico de A. annua, que atendam às especificações exigidas, e
poderão servir de referência para o desenvolvimento de medicamentos de baixo custo para o
combate à malária.
76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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