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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA BENIGNO ALBERTO MORAES DA ROCHA Aspectos clínicos e moleculares da dengue na epidemia de 2012/ 2013 em Goiânia – GO, Brasil. Goiânia 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
BENIGNO ALBERTO MORAES DA ROCHA
Aspectos clínicos e moleculares da dengue na epidemia de 2012/ 2013
em Goiânia – GO, Brasil.
Goiânia 2015
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BENIGNO ALBERTO MORAES DA ROCHA
Aspectos clínicos e moleculares da dengue na epidemia de 2012/ 2013
em Goiânia – GO, Brasil.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Profa Dra Celina Maria Turchi Martelli Co-orientador: Profa Dra Adriana Oliveira Guilarde
Goiânia
2015
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Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluno (a): Benigno Alberto Moraes da Rocha
Orientador (a): Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli
Co-orientador (a): Profa. Dra. Adriana Oliveira Guilarde
Membros:
1. Profa. Dra. Adriana Oliveira Guilarde
2. Prof. Dr. Rivaldo Venâncio da Cunha
3. Profa. Dra. Valéria Christina de Rezende Feres
4. Prof. Dr. João Bosco Siqueira Júnior
5. Profa. Dra. Fabiola Souza Fiaccadori
Data:31/03/2015
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho as duas pessoas que mais amo na vida. A minha filha Anita que
me mostrou o verdadeiro amor tornando minha vida infinitamente mais feliz. A
minha esposa Aline, meu eterno amor, minha alma gêmea, com seu exemplo me
inspira todos os dias a ser um pessoa melhor, a quem eu agradeço por estar sempre
do meu lado. Te amo.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me dado condições e a oportunidade de conhecer todas as
pessoas que me trouxeram até aqui.
À minha tia Rusckaya, minha outra mãe, que me socorreu quando precisei, me deu
condições para estudar e o mais importante, me ama como filho.
À Profa Dr
a Celina Maria Turchi Martelli, minha orientadora, com paciência me ensinou
a ter foco, ser objetivo e ver o lado positivo das coisas, e mais importante, levantou
minha cabeça quando mais precisei. A senhora é uma das pessoas que mais admiro e
respeito.
Minha querida irmã Kelly que mesmo longe conseguiu me motivar com suas palavras
de fé e esperança.
À família da minha esposa que sempre me apoiou e motivou na realização deste
trabalho.
À Profa Dr
a Adriana Oliveira Guilarde, minha co-orientadora, uma clínica fantástica,
assim como orientadora, pois com poucas palavras modificar um texto inteiro.
À Profa Dr
a Valéria Christina de Rezende Feres, minha outra co-orientadora (não
oficial), por ter me orientado, me ouvido, por ser uma amiga.
À Prfa Dr
a Lucimeire Fontenelle por ter me auxiliado na parte laboratorial e por dar
conselhos muito importantes.
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À Profa Marília Dalva Turchi, minha orientadora no mestrado, seus ensinamento
perduraram na realização deste trabalho e pelo o auxílio como coordenadora da pós-
graduação que me foi dado.
Ao Profº Drº João Bosco Siqueira Júnior, as poucas vezes que o procurei, foi muito
receptivo prestativos nas minhas dúvidas.
Ao meu grande amigo Ali Kalil que sempre me aconselhou de forma assertiva para as
minhas tomadas de decisão.
À Faculdade União de Goyazes que sempre me apoiou para a realização deste trabalho.
À Dra Angela Argolo por sua amizade, incentivo e motivação na realização deste
trabalho.
À Doutoranda Mônica Reis pela disponibilidade durante a realização dos exames
laboratoriais.
À Doutoranda Isabela Cequine pela disponibilidade durante o trabalho de campo e a
realização dos exames laboratoriais.
À mestra Priscila pela por sua disponibilidade durante o trabalho de campo e a
realização dos exames laboratoriais.
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SUMÁRIO
1. Introdução..................................................................................................... 17
1.1. Epidemiologia da dengue.......................................................................... 17
1.2. Agente Etiológico...................................................................................... 21
1.2.1. Genótipos................................................................................................ 21
1.3. Patologia e Patogênese............................................................................... 25
1.4. Quadro Clínico........................................................................................... 29
1.5. Diagnóstico Laboratorial........................................................................... 31
1.6. Vacinas para Dengue................................................................................. 34
2. Justificativa................................................................................................... 40
3. Objetivos....................................................................................................... 41
4. Métodos........................................................................................................ 42
5. Artigos.......................................................................................................... 53
5.1. Artigo 1..................................................................................................... 56
5.2. Artigo 2..................................................................................................... 80
6. Discussão .................................................................................................... 111
7. Conclusões................................................................................................... 115
Referências....................................................................................................... 116
Anexos.............................................................................................................. 130
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TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Tabelas
Tabela1. Vacinas de dengue em desenvolvimento em fase de ensaios
clínicos.......................................................................................................................... 36
Tabela 2 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope do DENV-
4.................................................................................................................................... 44
Tabela 3. Valores de referência para comparação do amplicon obtido com peso
molecular de massa para determinação da quantidade ideal de DNA a ser aplicada
na reação de sequenciamento ....................................................................................... 46
Figuras
Figura1.Classificação dos genótpos por sorotipo dos DENV e origem das cepas,
segundo Chen e Vasilakis 2011 ................................................................................... 20
Figura 2. Hipótese integral para febre hemorrágica da dengue.................................... 27
Figura 3. Classificação clínica de dengue segundo a OMS 2009................................. 50
Anexos
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética, TCLE............................................................. 128
Anexo 2 – Questionário da Pesquisa ........................................................................... 129
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SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
A.C. Antes de Cristo
ADE Antibody Dependent Enhancement
ALT Alanina Amino Trasnferase
AST Aspartato Tmino Trasnferase
Cais Centro de Atenção Integral à Saúde
Ciams Centro Integrado de Assistência Municipal em Saúde
Cnes Cadastro Nacional de Estabelecimento de Saúde
DC Dengue Clássica
DENV Vírus Dengue
DPOC Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
FHD Febre Hemorrágica da Dengue
HDS Hospital Dermato Sanitário
HDT/DAA Hospital de Doenças Tropicais/ Dr. Anuar Auad
HLA Antígeno Leucocitário Humano
xii
Ht Hematócrito
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL Interleucina
Lacen-Go Laboratório Central – Goiás
OMS Organização Mundial da Saúde
RNA Ácido Ribonucleico
RT-PCR Transcriptase Reverssa – Reação em Cadeia de Polimerase
SCD Síndrome do Choque da Dengue
Sinan Sistema Nacional de Agravos e Notificação
TNF Fator de Necrose Tumoral
UTI Unidade de Tratamento Intensiso
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RESUMO
Contexto: Dengue é a arbovirose que mais cresce no mundo, infectando quase 390
milhões de pessoas. Ela é causada pelos vírus dengue que possui quatro sorotipos
(DENV1-4). Todos os sorotipos podem causar a doença, que varia de formas
assintomáticas a graves e podem levar a óbito. No Brasil em 2010 houve a reemergência
do sorotipo DENV-4 após 28 anos. No ano de 2013, foi registrada a maior epidemia da
história com mais de 1,4 milhão de casos e circulação do quatro sorotipos. Na Região
Central do Brasil, Estado de Goiás, após a entrada sorotipo DENV-4, em 2011, pela
primeira vez na região, em 2013, aconteceu uma grande epidemia onde foi registrado
mais de 10% dos casos do Brasil, com maior frequência do DENV-4 seguido pelo
DENV-1. Neste cenário foi realizado um estudo com os objetivos de caracterizar o
perfil clínico e molecular dos pacientes com dengue, estabelecer se houve associação
entre marcadores de gravidade clínica e laboratorial com os sorotipos virais infectantes
e caracterizar geneticamente o vírus da dengue mais frequente que circulou na epidemia
de 2012/2013 em Goiânia – GO.
Metodologia: Foi realizado um estudo clínico prospectivo com pacientes suspeitos de
dengue atendidos em oito unidades de saúde (cinco públicas, sendo dois hospitais e três
de nível secundário; três hospitais privados) de referência de janeiro de 2012 a julho de
2013. Os pacientes foram abordados em três momentos diferentes e avaliados por
clínicos que coletaram informações clínicas e sócio-demográficas. Também houve
coleta de sangue para realização de exames complementares (Hg, AST e ALT) e
exames confirmatórios da infecção por dengue (IgM, IgG, NS1 e RT-PCR). Foi
realizado ainda o sequenciamento do gene do envelope do vírus dengue tipo 4. Os
pacientes com confirmação da infecção por dengue foram classificados quanto à forma
clínica da doença de acordo com a Organização Mundial de Saúde,
Principais achados: Foram recrutados 650 pacientes, dos quais 18 foram excluídos e
632 foram seguidos. Quatrocentos e cinquenta e dois pacientes (71,5%) tiveram a
infecção confirmada. Destes, 112 (24,8%) foram hospitalizados. Mais de 90% tinham
idade superior a 15 anos e 235 (52,0%) eram do sexo feminino. Para 328 pacientes foi
possível classificar o tipo de infecção e destes, 248 (75,6%) tiveram infecção
xiv
secundária. Classificou-se como FD 188 indivíduos (41,6%), 238 (52,6%) com DwC e
26 (5,8%) com DG. Sangramento espontâneo, dor abdominal intensa e extravasamento
de plasma foram mais freqüentes em menores de 15 anos de idade, quando comparado
aos maiores de 15 anos (p<0,05). Houve um óbito de um adolescente de 16 anos de
idade. O RNA viral foi identificado em 243 (40,5%) de 600 pacientes investigados por
estes exames, onde foi identificados os quatros sorotipos DENV-1 em 91 pacientes
(37,4%) DENV-2 em 4 (1,6%), DENV-3 em 13 (5,3%) e DENV-4 em 135 (55,5%) nos
dois anos de acompanhamento. Foi observada uma frequência maior de alguns sintomas
de gravidade (plaquetopenia, sangramentos espontâneos e dor abdominal intensa) no
sorotipo DENV-1 comparado ao DENV-4. Oitenta por cento dos pacientes com DENV-
4 tiveram infecção secundária. No estudo de filogenia do gene do envelope do DENV-4
foi identificado o genótipo II.
Conclusão: Foi descrito clínica e molecularmente uma grande epidemia que ocorreu em
um Estado da Região Central do Brasil que revelou a circulação concomitante dos
quatros sorotipos virais, frequência de sinais de gravidade em menores de 15 anos de
idade e em pessoas com infecção pelo DENV-1. Identificou-se ainda o genótipo
circulante do sorotipo mais freqüente na epidemia. Estas constatações devem servir de
sinal de alerta para as autoridades de saúde, pois nos encontramos em situação de
grande dispersão dos sorotipos em todo o mundo.
Palavras-chave: Dengue, Infecção Secundária, Dengue Grave, Sequenciamento,
Dengue Tipo 4.
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ABSTRACT
Background: Dengue is the fastest growing arbovirosis in the world, infecting almost
390 million people. The dengue virus is the etiological agent of the disease, which has
four serotypes (DENV1-4). All serotypes can cause dengue, varying from asymptomatic
to severe forms and may lead to death. In Brazil, in 2010, there was the re-emergence of
serotype DENV-4 after 28 years. In 2013, it was registered the largest epidemic in
history with more than 1.4 million cases and circulation of the four serotypes. In the
state of Goiás, Central Region of Brazil, after serotype DENV-4 entry in 2011, for the
first time in the region, in 2013, there was a major epidemic which registered more than
10% of the cases in Brazil, more often DENV -4 followed by DENV-1. In this scenario,
a study was conducted with the objective to characterize the clinical and molecular
profile of patients with dengue; establish if there were associations between clinical and
laboratory markers of severity with the infectious virus serotypes; and genetic
characterization of the more frequent virus serotype during the 2012/2013 dengue
epidemic in Goiânia, Goiás.
Methods: A prospective clinical study with suspected dengue patients from eight
reference health units (five public, two hospitals and three of secondary level; and three
private hospitals) from January 2012 to July 2013 was conducted. The patients were
evaluated in three different moments by clinicians who collected clinical and
sociodemographic information. Blood sampling for laboratory testing (Hg, AST, and
ALT) and confirmatory tests for dengue infection (IgM, IgG, NS1, and RT-PCR) were
performed. The gene sequencing of dengue virus type 4 envelope was also carried out.
Patients with confirmation of dengue infection were classified according to clinical
signs according to the World Health Organization.
Principal findings: Six hundred and fifty patients were recruited; 18 were excluded,
and 632 were followed. Four hundred fifty-two patients (71.5%) had confirmed
infection and 112 (24.8%) were hospitalized. More than 90% were over 15 years of age,
and 235 were female (52.0%). In 328 patients, it was possible to classify the type of
infection, and 248 (75.6%) of these had a secondary infection. 188 (41.6%) were
classified as FD, 238 (52.6%) as DwC and 26 (5.8%) with DG. Compared to those aged
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over 15 years, spontaneous bleeding, severe abdominal pain and plasma extravasation
were more frequent in children under 15 years of age (p <0.05). There was one death of
a 16-year-old. During two years of follow-up, viral RNA was identified in 243 (40.5%)
of 600 patients evaluated in these tests, where the four serotypes were identified: 91
(37.4%) with DENV-1, 4 (1.6%) with DENV-2, 13 (5.3%) with DENV-3 and 135
(55.5%) with DENV-4. A higher frequency of some symptoms of severity was observed
(thrombocytopenia, spontaneous bleeding and severe abdominal pain) in DENV-1
serotype compared to DENV-4. Eighty percent of patients with DENV-4 had a
secondary infection. In the phylogenetic study of DENV-4 envelope gene, genotype II
was identified.
Conclusion: The present study described clinically and molecularly a large dengue
epidemic that occurred in a state of Brazil's Central Region, which revealed the
concurrent circulation of the four serotypes, the frequency of clinical signs of disease
severity in children aged under 15 years and in people with DENV-1 infection. It also
identified the current genotype of the most common serotype in the epidemic. These
findings should serve as a warning sign for the health authorities because we are
experiencing a significant dispersion of serotypes situation worldwide.
Keywords: Dengue, Secondary Infection, Severe Dengue, Sequencing, Dengue Type 4.
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1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Epidemiologia da Dengue
A dengue é uma doença viral aguda causada por um vírus do gênero Flavivirus da
família Flaviviridae e transmitida por meio da picada do mosquito infectado do gênero Aedes,
sendo o Aedes (Stegomyia) aegypti o vetor principal. Existem quatro sorotipos virais
conhecidos DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, todos capazes de causar doenças, que
variam desde infecções assintomáticas ou oligossintomáticas até formas mais graves, como a
febre hemorrágica da dengue e síndrome do choque da dengue (FHD/SCD), que podem levar
o paciente a óbito (HALSTEAD, 2007; WHO, 2012a).
Os primeiros relatos de casos de dengue ocorreram na Ásia, África e América do
Norte no século XIII, no entanto há registros dos sintomas compatíveis com a dengue em 992
A.C. na China (GUBLER, 2006). Durante século XIII e XIX a febre da dengue foi
considerada uma doença não fatal e ocasional, com epidemias dispersa e intercaladas por
longos períodos silenciosos, de 10 a 40 anos (WILDER-SMITH; GUBLER, 2008). No
entanto, depois da II Guerra Mundial, intensificou-se a dengue na Ásia, expandindo-se para o
Pacífico e para as Américas (GUBLER, 2011).
A partir da metade do século XX, a dengue passou a ser a arbovirose mais frequente
no mundo, principalmente nos países tropicais e sub-tropicais, onde o clima e os hábitos
urbanos criam as condições que favorecem o desenvolvimento e a proliferação do Aedes
aegypti, isso aconteceu, principalmente, pelo rápido crescimento do comércio e urbanização
(GUBLER, 2011).
Atualmente a dengue é endêmica em 128 países e está presente em quase todos os
continentes (BRADY et al., 2012a; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Nessas
áreas vivem cerca de 3,97 bilhões de pessoas que estão sob o risco de serem infectadas pelos
18
vírus da dengue. Estima-se que mais de 390 milhões de pessoas contraem a dengue todos os
anos (BHATT et al., 2013; BRADY et al., 2012b).
Na Ásia, a primeira epidemia de FHD foi registrada nas Filipinas, no entanto, a doença
logo se espalhou para os países vizinhos tornando-se um grave problema de saúde pública,
principalmente no sudeste asiático, onde há a circulação dos quatros sorotipos com alta
endemicidade e letalidade afetando, predominantemente, crianças. (CHAREONSOOK et al.,
1999; WERE, 2012). Cerca de 75% da população exposta ao risco de contrair dengue vivem
nesta região, em 10 países, sendo uma das principais causas de internação e morte em
crianças. A taxa de dengue grave é 18 vezes maior que nas Américas (WHO, 2011).
No continente africano o sistema de vigilância de dengue para a para a OMS é muito
precário, mesmo assim têm 34 países com transmissão endêmica, com surtos causados pelos 4
sorotipos, da África Oriental e estima-se que cerca de 64 milhões de pessoas são infectadas
pelo vírus da dengue (AMARASINGHE et al., 2011; BHATT et al., 2013; WERE, 2012).
As primeiras epidemias de dengue nas Américas ocorreram no século XIX, no Golfo
do México e Caribe. Do inicio do século XX até 1970 aconteceram epidemias no sul dos
Estados Unidos, alguns países do Caribe e da América Central, Panamá, Bermudas, Cuba,
Porto Rico, Venezuela, Jamaica e Porto Rico. Este período foi caracterizado pelos primeiros
casos com manifestações hemorrágicas e o primeiro relato de isolamento do vírus DENV-2,
em Trinidad e Tobago (ANDERSON; DOWNS; HILL, 1956; BRATHWAITE DICK et al.,
2012). A partir da década de 1970 a dengue causou grandes epidemias neste continente,
destacando-se a ocorrida em Cuba em 1981com cerca de 300 000 casos de dengue dos quais
10 000 casos de febre hemorrágica da dengue com 158 casos fatais, sendo 101 em crianças
(KOURI et al., 1989).
As décadas de 1980 e 1990 caracterizam-se pela expansão do A. aegypti, co-circulação
de múltiplos sorotipos e aumento de casos de FHD (GUBLER, 1987; PINHEIROA;
CORBERB, 1997). Nos anos 2000 até 2010 houve um aumento muito grande dos casos de
dengue, principalmente nos países Sul Americanos, com a circulação de todos os sorotipos.
Neste período, foram detectadas duas epidemias pan-americana, uma em 2002 e outra em
2010, quando mais de 8 milhões de casos de dengue foram notificados nas Américas
(BRATHWAITE DICK et al., 2012; GUZMAN, 2003; SAN MARTÍN et al., 2010).
19
No Brasil até 1980 há registros de 6 epidemias de dengue, em 1846, 1848, 1851, 1853,
1916 e 1923. Em decorrência do combate vetorial para erradicação da febre amarela urbana, a
dengue esteve sob controle, praticamente, até o inicio da década de 1980 (PINHEIRO;
CORBER, 1997). O vetor principal da dengue o A. aegypti foi considerado como erradicado
de 1957 até 1967 e, novamente, de 1973 a 1976. Após esse período, houve uma expansão
progressiva do vetor, pelo território nacional. (FIGUEIREDO, 2000; PENNA, 2003).
A primeira epidemia, documentada clínica e laboratorialmente, ocorrida no Brasil foi
causada pelos sorotipos DENV-1 e DENV-4 em Boa Vista-Roraíma, de 1981 a 1982, na qual
12.000 pessoas foram infectadas (OSANAI et al., 1983). Em 1986, ocorreu uma epidemia de
grande magnitude no Rio de Janeiro, causada pelo sorotipo DENV-1, estendendo-se para os
estados do Ceará e Alagoas. Um ano após, a dengue foi detectada nos estados da Bahia,
Minas Gerais, Pernambuco e São Paulo. Nessa ocasião, as ações de combate ao A. aegypti
foram intensificadas, porém a circulação viral não foi interrompida (SCHATZMAYR;
NOGUEIRA; ROSA, 1986).
Em 1990 foi detectado o sorotipo DENV-2, em Niterói, com surto de Febre
Hemorrágica da Dengue, com 1.316 notificações, 462 casos confirmados laboratorialmente e
oito óbitos (NOGUEIRA et al., 1990). Nos dois primeiros anos da década de 1990, a doença
manteve-se, quase que inteiramente, restrita aos estados citados anteriormente, acrescentando-
se poucas notificações oriundas do Mato Grosso e do Mato Grosso do Sul (SIQUEIRA et al.,
2005).
A dengue passou a ser considerada endêmica no Brasil a partir de 1980, mas só atingiu
a condição de grave problema de saúde pública, em 1996, quando o número de infectados
passou de 56.621 para 180.392. Os vírus DENV-1 e DENV-2 foram, rapidamente,
disseminados em muitas outras cidades de grande e médio porte, intensamente infestadas pelo
A. Aegypti e epidemias foram se sucedendo no território brasileiro (TADEU; FIGUEIREDO,
2003). Cabe destacar a gravidade da epidemia de 1994 no Ceará, com 47.221 notificações e
uma taxa de incidência de 711,88 por 100 mil habitantes. Foram registrados 185 casos
suspeitos de dengue hemorrágica com 12 óbitos (VASCONCELOS et al., 1995).
Em 1998, o sorotipo DENV-3 foi identificado no Brasil em um paciente que havia
viajado para Nicarágua, mas a entrada do sorotipo 3, de forma autóctone, foi em 2000
20
(NOGUEIRA et al., 2001; ROCCO; KAVAKAMA; SANTOS, 1998). No total, o número de
notificações acumuladas no período de 1981 a 1998 ultrapassou mais de um milhão e meio de
indivíduos (SIQUEIRA et al., 2005). Entre 1990 e 1999 foram notificados 888 casos de
dengue hemorrágica com 39 óbitos, com letalidade média de 4,5%, no Brasil (BRASIL,
2014a).
De 2000 a 2010 houveram 3 grandes epidemias, em 2002 com mais de 900.000 casos
notificados, com predomínio do DENV-3 e aumento dos casos graves. No ano de 2008 foram
notificados mais de 919.000 casos marcando a reintrodução do DENV-2 e aumento de casos
graves em crianças. Em 2010 foram notificados mais de 1.300.000 casos com predomínio de
DENV-1 e óbitos, sobretudo em pacientes de dengue com comorbidades prévias. (SIQUEIRA
JUNIOR et al., 2011; TEIXEIRA et al., 2013).
Este período marca a difusão da doença para todas as unidades federados do país
cidades pequenas e a reentrada do sorotipo DENV-4 em Roraima (TEMPORAO et al., 2011).
De 2011 a 2014 o Sistema Nacional de Agravos e Notificação (SINAN) notificou mais de
4,38 milhões de casos suspeitos de dengue representando 61,7% dos casos notificados pelos
países do continente americano. Neste mesmo período houve 930 óbitos confirmados. No ano
de 2013 ocorreram mais de 1,4 milhão de casos prováveis de dengue, com circulação
concomitante dos 4 sorotipos virais (BRASIL, 2015; PAHO, 2015).
Os primeiros casos de dengue no estado de Goiás ocorreram em 1994 na capital
Goiânia dando origem a primeira epidemia, com 3.500 casos notificados. Em anos
subsequentes os casos de dengue foram registrados em diversos municípios, mas com maior
incidência da doença na região metropolitana. Inicialmente detectou-se a introdução do
sorotipo DENV-1 com circulação concomitante do DENV-2, a partir de 1998. Em 2002
houve a segunda epidemia em Goiânia com mais de 17.000 casos notificados. Em 2003 o
LACEN – GO identificou o DENV-3 que predominou até 2008. Neste mesmo ano voltou a
circular o DENV-2, mas em níveis menores que o DENV-3, na terceira epidemia de Goiânia.
Neste período houve o aumento de casos graves e óbitos, sendo 17% dos casos graves em
crianças, com uma letalidade de 7,4% nesta faixa etária. (FERES et al., 2006; MACIEL;
SIQUEIRA JÚNIOR; TURCHI MARTELLI, 2008; ROCHA, 2008; SIQUEIRA et al., 2005).
21
Em 2009 houve a recirculação do sorotipo DENV-1, em 2010 teve a 4º epidemia, em
Goiânia. No ano de 2011 ocorreram os primeiros casos de dengue pelo sorotipo DENV-4 e
em 2013 aconteceu a maior epidemia de dengue do estado com 163.808 casos e 65 óbitos
confirmados (GOIÁS, 2013; TEIXEIRA et al., 2013). Nos anos de 2010 a 2014 o estado
registrou 472.186 casos suspeitos de dengue com 367 óbitos (BRASIL, 2015; GOIÁS, 2013).
Já a capital do estado de Goiás, Goiânia, nos anos de 2011 a 2014 notificou mais de
40% dos casos prováveis de dengue, com 88 óbitos. Só no ano de 2013 foram 58.354 casos
notificados com um incidência de 4.187 por 100.000 habitantes e circulação concomitante dos
4 sorotipos (GOIÁS, 2013, 2015).
1.2. Agente Etiológico
Os vírus dengue são arbovírus transmitidos por mosquitos do gênero Aedes e
pertencem a família Flaviviridae, do gênero Flavivirus. Este inclui 80 espécies em 9 grupos
sorologicamente relacionados (7 transmitidos por mosquitos, 2 por carrapatos e três sem
vetores conhecidos) e um grupo de vírus que não se classifica dentro desses grupos por meio
da técnica de neutralização, incluindo o vírus da febre amarela. Existem quatro sorotipos e
dezesseis subtipos distintos: DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 (ICTV, 2013). Sendo
que cada um possui variações genéticas dando origem a sub-tipos.
Eles são vírus esféricos, envelopados com um diâmetro de aproximadamente 40-60
nm e uma fita única de RNA de polaridade positiva com cerca de 11kb, possuindo dez genes
que se apresentam na seguinte ordem: 5’-C-PreM-E-NS1-ns2a-ns2b-NS3-ns4a-ns4b-NS5-3’.
Cada um desses genes codifica proteínas do mesmo nome: três estruturais (E, M e C) e sete
não estruturais (NS1, NS2a e NS2b, NS3, NS4a e NS4b, e NS5) O RNA viral é envolto por
um nucleocapsídio com uma simetria isocaédrica, constituída pela proteína C, rodeada por
uma camada lipídica dupla associada com as proteínas de membrana (M) e do envelope (E)
(CHAMBERS et al., 1990; GUBLER, 1998; MENDEZ et al., 2010; OSMAN; FONG;
SEKARAN, 2009).
1.2.1 Genótipos
22
O vírus dengue por ter RNA como material genético e neste tipo de genoma não existe
enzimas de reparação como no genoma DNA, com isso os vírus RNA sofrem muito mais
mutações. A alta taxa de mutação que ocorre nesses genomas favorece o aparecimento de
populações que apresentam significativas diferenças em seus genomas, e multiplicam-se
aqueles que melhor se adaptam às condições do hospedeiro (TWIDDY; HOLMES;
RAMBAUT, 2003).
Estudo de sequenciamento genético da região E/NS1 dos DENV-1 e DENV-2
realizado por Rico-Hesse tem sido utilizado para medir a diversidade genética e para
identificar alguns genótipos distintos. Arbitrariamente, foi definido como genótipos distintos,
o grupo de vírus que possui uma taxa de aproximadamente 6% de divergência em suas
sequências nucleotídicas (RICO-HESSE, 1990b).
Com o avanço da tecnologia de sequenciamento permitiu a utilização de genes ou
genomas completos na obtenção filogenias mais robustas e precisas ao longo desses anos
(CHEN; VASILAKIS, 2011). A partir disso houve um aumento na realização de
sequenciamento dos genes do vírus dengue, possibilitando novas propostas de classificação
dos genótipos.
Em 2003 Rico-Hesse, baseada no seqüenciamento do gene do envelope, classificou os
genótipos dos quatros sorotipos da seguinte forma: DENV-1 (Tailândia; Ásia; Pacífico Sul;
Américas/África; Malásia); DENV-2 (Malásia/Índia Subcontinental; Sudeste da Ásia;
Américas; Oeste da África); DENV-3 (Sudeste da Ásia/Pacífico Sul; Tailândia; Índia
Subcontinental; Américas) e DENV-4 (Indonésia; Sudeste da Ásia; Malásia) (RICO-HESSE,
2003).
Em 2011 Chen e Vasilakis utilizando sequências do gene da proteína do envelope
disponíveis no GenBank reclassificaram os genótipos dos quatros sorotipos virais de acordo
com a região geográfica de origem (Figura 1) (CHEN; VASILAKIS, 2011).
Quadro 1. Classificação dos genótpos por sorotipo dos DENV e origem das cepas,
segundo Chen e Vasilakis 2011.
Sorotipo Genótipos Origem das Cepas
23
DENV-1
Genótipo I
Sudeste Asiático
China, Japão, Korea e Índia
Oriente Médio (Árabia Saudita)
Genótipo II Tailândia (1963)
Genótipo III (Silvetre?) Malásia (1972 e 2005)
Genótipo IV
Austrália e Ilhas do Pacífico
Sudeste Asiático
Ilhas do Oceano Índico
Polinésia Francesa e Havaí
Chile
Filipinas
Japão e Korea
Caribe
Genótipo V
América do Sul
Caribe e América Central
Oeste da África
Ásia
DENV-2
Sudeste Asiático/ Americano
Caribe e América Central
América do Sul
Sudeste Asiático
Asiático I
Sudeste Asiático
América do Sul
Caribe e América Central
Ilhas do Pacífico
Asiático II
Sudeste Asiático
Austrália
Japão
Cosmopolita
Sudeste Asiático
Austrália e Ilhas do Pacífico
China
Filipinas
Oeste da África
Árabia Saudita
Sul da Ásia
Americano
América Central e Caribe
América do Sul
Ilhas do Pacífico
Indonésia
Silvestre
Cepas de humanos, mosquitos e primatas
não humanos do Oeste da África e Sudeste
Asiático
24
DENV-3
Genótipo I Sudeste Asiático
Ílhas do Pacífico
Genótipo II
Ílhas do Pacífico
Sudeste Asiático
China e Taiwan
Genótipo III
Caribe e América Central
América do Sul
China, Japão, Índia e Srilanka
Oriente Médio (Árabia Saudita)
Genótipo IV Porto Rico
Taiti
Genótipo V
Brasil
China, Japão
Filipinas (1956)
DENV-4
Genótipo I China, Índia e Srilanka
Sudeste Asiático
Genótipo II
América do Sul
América Central e Caribe
Estados Unidos
Ilhas do Pacífico
Sudeste Asiático
Genótipo III Thailândia
Silvestre Malásia(1973-1975)
Estudo realizado por Yamashita (2013), de revisão da database dos genótipos de
dengue, utilizando apenas genes do envelope, definiu que atualmente são cinco a seis
genótipos dentro de cada um dos quatro sorotipos: Cinco (I-V) genótipos em DENV-1, sendo
que Brasil circula o genótipo V (CARNEIRO et al., 2012a; GONCALVEZ et al., 2002b). Seis
genótipos (asiático I, asiático II, asiático-americano, cosmopolita, silvestres e americano)
DENV-2, circulando no Brasil o asiático-americano (AÑEZ; MORALES-BETOULLE;
RIOS, 2011; BONA; TWERDOCHLIB; NAVARRO-SILVA, 2012; TWIDDY et al., 2002a).
Cinco (I-V) genótipos em DENV-3 e no Brasil circula o III (DE ARAÚJO et al., 2012;
LANCIOTTI et al., 1994; WITTKE et al., 2002a). Cinco genótipos (I, IIA, IIB, III e silvestre)
em DENV-4. Em 2010 foi identificado o genótipo II e em 2012 o genótipo III circulando no
Brasil (ABUBAKAR; WONG; CHAN, 2002; NUNES et al., 2012; TEMPORAO et al.,
2011).
25
Como podemos observar não existe um consenso na classificação dos genótipos como
tem nos sorotipos, no entanto a classificação mais utilizada nos dias atuais é proposta por
Chen e Vasilakis 2011 (SILVA, 2013).
Todos os 4 sorotipos sofreram mutações independente da época e localização
geográfica, e todos podem ser diferenciados sorologicamente e bioquimicamente
(GONCALVEZ et al., 2002b; LANCIOTTI; GUBLER; TRENT, 1997).
Já epidemiologicamente, esses vírus dengue podem ser classificados em baixo, médio
ou alto impacto, onde esses genótipos podem apresentar baixa transmissbilidade em seres
humanos ou estar associado a doença grave como FHD/SCD. As análises filogenéticas e
epidemiológicas sugerem que os genótipos mais virulentos estão substituindo aqueles de
menor impacto epidemiológico (LEITMEYER et al., 1999a; RICO-HESSE, 2003).
No estado de Goiás estudo de filogenia do DENV-3 mostrou a presença do genótipo
III e que apresentou uma alta similaridade com cepas do Rio de Janeiro de pacientes com a
SCD, no entanto o estudo em questão não observou associação entre o genótipo e a gravidade
da doença (FERES, 2008).
No entanto, a evolução molecular tem apresentado um grande impacto na virulência
para o homem e na epidemiologia da doença em todo o mundo. O monitoramento do
deslocamento dos vírus é um fator importante para o conhecimento epidemiológico da
doença. O mapeamento das epidemias constitui outro valioso elemento de investigação,
permitindo identificar os caminhos prováveis dos vírus dengue e a sua relação com as
diversas epidemias (RICO-HESSE, 2009).
1.3. Patologia e Patogênese
A dengue pode variar da forma assintomática ou oligossintomática até a forma mais
grave, com a síndrome do choque da dengue. A febre clássica da dengue é auto-limitada e se
caracteriza por: febre, cefaléia, mialgia, artralgia, dor abdominal e dor retrorbital e podendo
ter exantema, diarréia e vômitos. Pacientes que desenvolvem a forma mais grave da doença,
podem manifestar hemoconcentração, derrames cavitários e trombocitopenia, que podem
resultar em choque. Além disso, alguns casos em que não se enquadram na forma mais branda
26
e nem nas mais graves da doença são classificados como uma forma intermediária (DCSA),
que é caracterizada por dor abdominal intensa e contínua, ou dor a palpação do abdomen;
vômitos persistentes; acumulação de líquidos (ascites, derrame pleural, pericárdico);
sangramento de mucosas; letargia ou irritabilidade; hipotensão postural (lipotímia);
hepatomegalia maior do que 2 cm; aumento progressivo do hematócrito (BRADY et al.,
2012a; BRASIL, 2013, 2014b).
Os sintomas gerais da dengue, geralmente, surgem após período de incubação de 3 a
14 dias (média de 5 a 8 dias), coincidindo com a viremia. No entanto, técnicas de biologia
molecular, evidenciaram viremias mais prolongadas, mesmo no período defervescência, em
pacientes com formas mais graves. A febre tende a desaparecer após uma resposta vigorosa
do sistema imune ao vírus (GUILARDE et al., 2008; NARAYANAN et al., 2002; WANG et
al., 2003).
A infecção pelo vírus da dengue gera imunidade longa para a reinfecção sorotipo
específico, no entanto para reinfecção de sorotipo diferente a proteção é temporária e parcial,
com isso pode ter infecções sequenciais (LIBRATY et al., 2002).
Monócitos circulantes e células dendríticas têm sido considerados como as principais
células alvo para a replicação viral do Dengue. Os vírus ativam as células alvo, induzindo a
liberação de monocinas, derivados do ácido aracdônico, óxido nítrico, etc. Citocinas pró-
inflamatórias, TNF-a e IL-1 e IL-6 têm sido encontradas em pacientes com dengue na Ásia, e
também no Brasil , e seus níveis circulantes têm correlação com as manifestações
hemorrágicas e uma maior incidência de dengue hemorrágico (SENEVIRATNE;
MALAVIGE; DE SILVA, 2006).
Por um lado, citocinas produzidas e secretadas por macrófagos ativados desempenham
um papel importante no mecanismo de defesa contra infecções virais, inibindo a replicação
viral direta ou indiretamente, entre elas, IFN, TNF-a, IL-1b. Mas por outro lado, o TNF-a
induz IFN-g e outras citocinas, aumentando inflamação, fagocitose e atividade T citotóxica.
TNF-a, IL-1b e H2O2 e outros mediadores inflamatórios agem sobre as células endoteliais,
aumentando a expressão de várias moléculas de adesão tais como ICAM-1,VCAM-1, E- e P-
selectina, essenciais para iniciar o processo de extravasamento plasmático, que por sua vez é
fundamental para a gravidade da doença (MONGKOLSAPAYA et al., 2003).
27
Alguns estudos epidemiológicos mostram que após a entrada de um segundo sorotipo
viral numa região há o aparecimento de casos mais graves como a FHD (SAN MARTÍN et
al., 2010). No Brasil, os primeiros casos de FHD ocorreram na introdução do DENV-2 em
1990, época em que o DENV-1 já circulava há 4 anos (NOGUEIRA et al., 1991). Apesar de
estudos demonstrarem que há uma maior porcentagem de casos graves em pacientes
infectados pela segunda vez, a dengue pode evoluir para casos graves, como FHD e
encefalites e outras em infecções comprovadamente primárias (GUILARDE et al., 2008;
MARTÍNEZ et al., 1993; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Postula-se assim,
que os mecanismos induzidos pela resposta heteróloga secundária deva ter um papel
importante na gravidade ou exacerbação da doença (HALSTEAD, 1988a).
Diferentes teorias são descritas para explicar formas graves da infecção pelo vírus
dengue.
a) Infecção sequencial por sorotipos diferentes. A segunda forma de resposta imune
ao vírus da dengue é paradoxal, ou seja, prejudica o hospedeiro infectado e é responsável pela
imunopatologia da forma grave da dengue (HALSTEAD, 1988a). Essa resposta imune pode
ser observada em dois grupos de indivíduos: acima de um ano de idade com uma segunda
infecção por dengue (mais de 90% dos casos) e crianças, menores de um ano, infectadas pela
primeira vez, filhos de mães possuidoras de anticorpos para dengue (GUZMAN et al., 1984;
HALSTEAD et al., 2002).
Observa-se que, nos casos de infecção sequencial pelas formas graves de dengue, os
anticorpos preexistentes, obtidos quando da infecção prévia por outro tipo viral, não
neutralizam o segundo vírus infectante de tipo diferente e amplificam a infecção, facilitando
ao novo tipo infectante a penetração em macrófagos. Os vírus utilizam a porção Fc dos
anticorpos ligados ao envelope para a ligação com os receptores de membrana Fcg, presentes
na membrana celular macrofágica. Trata-se do fenômeno de facilitação por anticorpos da
penetração viral em macrófagos (antibody dependent enhancement - ADE) (HALSTEAD,
1988b; LEITMEYER et al., 1999a). O segundo grupo de pacientes de risco para dengue grave
são lactentes que receberam, intra-útero, anticorpos maternos contra dengue. Com o passar de
meses, tais anticorpos, que apresentam queda paulatina, atingem níveis subneutralizantes. No
caso de infecção desses lactentes pelo sorotipo de vírus diferente que causou a infecção
28
materna e, na presença dos anticorpos subneutralizantes, ocorreria ADE, e os pacientes
desenvolveriam as formas mais grave da doença (HAMMOND et al., 2005; MARTÍNEZ et
al., 1993).
b) Fatores próprios do hospedeiro: É muito provável que polimorfismos de genes
relacionados com o sistema imunológico determinem o curso da infecção por dengue e sua
gravidade. Na epidemia cubana de 1981, observou-se o maior número de casos em brancos e
relacionou-se ainda a anemia falciforme, diabetes melitus e asma brônquica como fatores de
risco. Também, fatores genéticos como o haplotipo HLA relacionam-se à gravidade dos casos
(CHEN et al., 2015; SIERRA et al., 2007). Estudos realizados no sudeste asiático e no caribe
mostram relação, estatisticamente significante, entre regiões específicas do HLA, que
codificam alguns receptores celulares ou moléculas que reconhecem antígenos e até mesmo
antígenos sanguíneos, como os do sistema ABO e plaquetário, pode estar associado a dengue
grave (STEPHENS, 2010).
c) A virulência da cepa de dengue infectante: Nos casos de infecção secundária, é
também reconhecida como provável fator determinante para o aparecimento do dengue
hemorrágico e sabe-se que FHD/SCD ocorre em freqüência desproporcionalmente mais alta,
quando a infecção é causada pelo tipo 2 (RICO-HESSE et al., 1998). Também, observa-se
nessas epidemias de dengue, agravamento clínico dos casos com a progressão do surto,
sugerindo um aumento da virulência do microorganismo após passagens sucessivas em seres
humanos. É provável que variações na virulência de distintas cepas virais possam contribuir
para a gravidade das infecções por dengue (NISALAK et al., 2003; ROSEN, 1977a). Uma
evidência disto foi o aparecimento do FHD/SCD nas Américas, apenas após a introdução,
nessa parte do mundo, de variantes específicas do sorotipo 2, originárias do sudeste asiático
(RICO-HESSE et al., 1998). A evolução genética do vírus poderia resultar em variações
virulentas dentro dos sorotipos virais de dengue, que poderiam ser responsáveis pela
variabilidade na expressão clínica da doença, determinando o maior ou menor potencial
epidêmico de FHD/SCD. Entretanto, não foram descritas até o momento mutações específicas
claramente associadas a quadros de FHD/SCD (CHUNGUE et al., 1995; LANCIOTTI et al.,
1994).
29
Entretanto, uma outra teoria proposta por Kouri et al., (1987) reconhece que as duas
primeiras não explicam de forma isolada os eventos epidemiológicos que vêm ocorrendo no
mundo e propõe uma teoria integral de multicasualidade, onde há integração de vários fatores
de risco como: individuais – idade, sexo, raça, estado nutricional, preexistência de
enfermidades crônicas e presença de anticorpos. Esses são fatores predisponentes que fazem
com que a doença seja mais frequente em certos grupos de idade ou raça, no entanto a
presença de anticorpos é o principal fator individual, mas não é o único; epidemiológicos –
imunidade de grupo, competência e densidade vetorial, intensidade da circulação viral e
intervalo de tempo entre as infecções por diferentes sorotipos, e os fatores virais – virulência
da cepa circulante, sorotipos virais envolvidos em cada epidemia. Geralmente os fatores
epidemiológicos e virais são determinantes para uma epidemia (GUZMÁN et al., 2002;
KOURI; GUZMÁN; BRAVO, 1987).
Figura 2. Hipótese integral para febre hemorrágica da dengue
Fonte: Adaptada de: Guzman El al 1995
1.4. Quadro clínico
As infecções pelos vírus da dengue podem ser assintomáticas ou produzir febre não
diferenciada, febre da dengue ou febre hemorrágico da dengue ou síndrome do choque da
dengue (BRADY et al., 2012a). A maioria das pessoas infectadas pelo vírus da dengue são
assintomáticas e uma pequena parcela apresenta uma febre indiferenciada. Um número
menor de doentes pode evoluir para formas mais grave, podendo evoluir para óbito
(SHEPARD et al., 2004; WHO, 2012b).
Muitas epidemias de dengue são acompanhadas por complicações que envolvem
sangramentos, tais como epistaxe, sangramento gengival, sangramento gastrointestinal,
30
hematúria e metrorragia (FAGBAMI et al., 1995). Em alguns poucos casos, um sangramento
singularmente severo pode levar o paciente a óbito. No entanto, a principal causa de choque
nos pacientes com dengue grave não são as hemorragias espontâneas e sim o extravasamento
de plasma (PAN; CHOW, 1984).
Os casos típicos de dengue nas formas mais graves apresentam as seguintes
manifestações clínicas: febre alta, fenômenos hemorrágicos, hepatomegalia, frequentemente,
insuficiência circulatória (BRADY et al., 2012a; TRISTÃO-SÁ et al., 2012). Um achado
laboratorial importante é a trombocitopenia de moderada a acentuada com hemoconcentração
intercorrente (DE PINA et al., 1995; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
Os pacientes geralmente desenvolvem febre alta de inicio súbito. Esta fase febril
aguda normalmente dura 2-7 dias e é muitas vezes acompanhada de mialgia, artralgia, dor de
cabeça e dor retroorbital (BRASIL, 2013; RIGAU-PÉREZ et al., 1998). Esses sintomas
podem vir acompanhados de perda de apetite, náuseas, vômitos e diarréia e em 50% dos casos
pode aparecer exantema máculo-papular (BRASIL, 2013; BRITO; LUCENA-SILVA;
GOMES, 2007; KALAYANAROOJ et al., 1997). As petéquias, epistaxe e o sangramento de
gengiva são menos comuns. Ocasionalmente ocorre hemorragia gastrointestinal moderada
(GOMBER et al., 2001; SEIJO; CERNIGOI; DEODATO, 2001).
Entre o terceiro e o sétimo dia do inicio de doença, quando ocorre a defervescência,
podem surgir sinais e sintomas como vômitos importantes e frequentes, dor abdominal intensa
e continua, hepatomegalia dolorosa, desconforto respiratório, sonolência ou irritabilidade
excessiva, hipotermia, sangramento de mucosas, diminuição da sudorese e derrames
cavitários (BRASIL, 2013; GUILARDE et al., 2008). Neste período ocorre, também, um
aumento na permeabilidade capilar com o aumento dos níveis de hematócrito, leucopenia
progressiva, seguida por uma rápida redução no número de plaquetas, marcando a fase crítica
(KALAYANAROOJ et al., 1997; SRIKIATKHACHORN et al., 2007).
Em casos graves, após poucos dias de febre, o estado do paciente se deteriora
repentinamente e pode apresentar derrames de plasma que pode levar ao choque (choque da
dengue), hemorragia grave, grave disfunção de órgãos. Quando da queda da temperatura
corpórea, ou logo após a mesma, entre o terceiro e sétimo dia de doença, surgem sinais de
insuficiência circulatória: pele fria, manchada e congestionada, cianose periférica e
31
taquisfigmia (NAVARRETE-ESPINOSA et al., 2005). Embora alguns pacientes possam
parecer letárgicos, tornam-se inquietos e rapidamente passam para o estágio crítico do
choque. As dores abdominais agudas são queixas frequentes logo antes do início do choque
(NIMMANNITYA, 1987; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
A convalescença dos pacientes com dengue grave, com ou sem choque, é de curta
duração e sem maiores problemas. Mesmo em caso de choque profundo, uma vez que este é
superado a recuperação do paciente pode ocorrer em 2 a 3 dias (BRADY et al., 2012a).
As formas graves da doença, também ocorrem com sinais de disfunção dos órgãos
como o coração, pulmão, fígado, rins e sistema nervoso central. Esses pacientes podem
apresentar insuficiência cardíaca e miocardite. Síndrome da angustia respiratória (SARA). A
insuficiência renal aguda é menos comum, geralmente cursa com pior prognóstico (BRASIL,
2013; WALI et al., 1998).
Alterações das enzimas hepáticas, de intensidade variada são frequentes em pacientes
com dengue e ocorre em 50% dos pacientes (HO et al., 2013; SOUZA et al., 2004). Em várias
ocasiões, tem-se observado insuficiência hepática, caracterizada por grande aumento dos
níveis séricos das aminotransferases e por necrose extensa dos hepatócitos (LING; WILDER-
SMITH; LEO, 2007; TRISTÃO-SÁ et al., 2012). Em alguns países do sudeste asiático, a
hepatite por vírus dengue em crianças, tem ultrapassado as hepatites causadas por vírus da
hepatite A (POOVORAWAN et al., 2006). Outro sistema que a dengue pode atingir é o
nervoso, podendo provocar convulsões, alteração de consciência, espasticidade muscular e
paresias transitórias, Síndrome Reye, Síndrome de Guillain-Barre. Os sintomas do SNC
podem surgir no decorrer do período febril ou, mais tardiamente, na convalescença (BRASIL,
2013; GUILARDE et al., 2008; LÚCIA; FERREIRA; CAVALCANTI, 2005; MISRA et al.,
2006; SOARES et al., 2008).
1.5. Diagnóstico Laboratorial
Os métodos de diagnóstico laboratorial para confirmar a infecção pelo vírus da dengue
podem envolver a detecção do vírus, ácidos nucleicos virais, antígenos ou anticorpos, ou uma
combinação destas técnicas. Após o início da doença, o vírus pode ser detectado no soro,
plasma, células do sangue e outros tecidos que circula por 4-5 dias. Durante a fase inicial da
32
doença, o isolamento de vírus, a detecção do ácido nucleico ou do antígeno podem ser
utilizadas para diagnosticar a infecção. No final da fase aguda da infecção, sorologia é o
método de escolha para o diagnóstico (GUZMÁN; KOURI, 2004; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009).
a) Isolamento viral: O método de escolha para o isolamento viral do vírus dengue é a
inoculação em células C6/36 de esôfago do mosquito Aedes albopictus, no entanto outras
céluas podem ser usadas como a dos mosquitos Aedes pseudoscutellaris AP61 e linhagens de
células de mamíferos, incluindo as células Vero, células LLC-MK2 e células
BHK21(GUZMÁN; KOURÍ, 1996; YUNKER; CORY, 1975). Para o isolamento utilizamos
sangue ou outros fluidos corpóreos, geralmente, até o quinto dia após o inicio dos sintomas,
isto é fase virêmica. A identificação do sorotipo viral é realizada por técnica de
imunofluorescência indireta, aplicando-se anticorpos monoclonais específico para cada
sorotipo (HENCHAL et al., 1983). Outras técnicas estão descritas para o isolamento vírus:
inoculação em cérebros de ratos recém-nascidos, cultura em células de mamíferos, inoculação
intratorácica em mosquito adultos e inoculação em células de mosquito. (GUZMÁN; KOURÍ,
1996).
b) Detecção de antígenos virais: Uma das técnicas utilizadas para pesquisar antígeno
de dengue é imunohistoquímica, principalmente, para elucidação dos casos pós-morte.
(GUZMÁN; KOURI, 2004). Até recentemente, a detecção de antígenos de dengue no soro de
fase aguda era rara em pacientes com infecções secundárias. Novos testes de ELISA foram
desenvolvidos para o antígeno de envelope/ membrana (E/M) e a proteína não- estrutural 1
(NS1) e demonstraram que as concentrações elevadas destes na forma de complexos imunes
pode ser detectada em doentes com infecção por dengue primária e secundárias até nove dias
após o início da doença (DA COSTA; MARQUES-SILVA; MORELI, 2014;
KUMARASAMY et al., 2007b; SHU et al., 2003). Segundo alguns autores, a NS1 estaria
relacionada a formas mais grave da doença (KUMARASAMY et al., 2007b).
c) Teste de biologia molecular: Desde a década de 1990, vários ensaios de
transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foram
desenvolvidos. Eles oferecem uma melhor sensibilidade, de 80% a 100%, em comparação
33
com o isolamento do vírus com um tempo de resposta muito mais rápida (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009). Esses testes tornaram-se importantes ferramentas para o
diagnóstico de dengue, assim como para estudos de vigilância entomológica e de
epidemiologia molecular. Também mostraram-se úteis na pesquisa de patogenia e estudos de
vacinas além de detectarem infecções concorrentes por sorotipos diferentes (SHU; HUANG,
2004a).
Os ensaios “in-house” de RT-PCR usam diferentes genes como alvos e utilizam
diferentes procedimentos de amplificação. Todos os ensaios de detecção de ácidos nucleicos
envolvem a extração de ácidos nucleicos e de purificação, amplificação do ácido nucleico e
detecção e caracterização do produto amplificado. A extração e purificação de RNA viral a
partir da amostra podem ser feitos pelos métodos do fenol ou clorofórmio, mas existem kits
comerciais à base de sílica que são mais reprodutíveis e rápidos. Muitos laboratórios utilizam
o método de nested RT-PCR, com primers universais de dengue para a região C/prM do
genoma. O segundo passo é a amplificação, que é específica do sorotipo, para isso usa-se uma
combinação dos quatro primers oligonucleotídicos específicos do sorotipo em um único tubo
de reação (one step multiplex RT-PCR). Os produtos destas reações são separados por
eletroforese em gel de agarose, o qual permite que os sorotipos de dengue sejam separados
por tamanho do peso molecular (HARRIS et al., 1999; LANCIOTTI et al., 1992).
Outro teste de biologia molecular que vem sendo utilizado é o PCR em tempo real. É
um método que permite, a partir da titulação do vírus, quantificar em aproximadamente 1,5
horas (CHAO; DAVIS; CHANG, 2007; GUZMAN et al., 2010; MACKAY; ARDEN;
NITSCHE, 2002). Este é um sistema de ensaio de um passo utilizado para quantificar o RNA
viral e utilizando pares de primers e sondas que são específicas para cada sorotipo. O uso de
uma sonda fluorescente permite a detecção dos produtos da reação em tempo real, em uma
máquina de PCR especializada, sem a necessidade de eletroforese. Muitos ensaios de RT-
PCR em tempo real foram desenvolvidos utilizando as tecnologias de TaqMan ou SYBR
green. O TaqMan PCR em tempo real é altamente específico, devido à hibridização de
sequência específica da sonda. O SYBR green de RT-PCR em tempo real tem a vantagem da
simplicidade de desenho de primers e utiliza protocolos de RT-PCR universal, mas é
teoricamente menos específico (HARRIS et al., 1999). Os ensaios de RT-PCR em tempo real
podem ser "singleplex" (detecta um sorotipo por vez) ou "multiplex" (detecta os quatros
sorotipos de uma vez). Os ensaios multiplex tem a vantagem de que uma única reação pode
34
determinar todos os quatro sorotipos, sem a possibilidade de introdução de contaminação
durante a manipulação da amostra. No entanto, são menos sensíveis do que ensaios de nested
RT-PCR (HARRIS et al., 1999).
d) Sorologia: Quando uma infecção de dengue ocorre em indivíduos que tenham
sofrido uma infecção de dengue anterior, uma resposta imunitária secundária ocorre, o que
gera níveis elevados de IgG por meio da estimulação de células B de memória a partir da
infecção anterior, bem como uma resposta de IgM para a infecção atual (GUZMAN et al.,
2010). Por meio das técnicas de sorologias podemos diagnosticar infecção aguda, infecção
prévia, re-infecção e até sorotipagem dos vírus da dengue e também podemos fazer inquéritos
soroepidemiológicos e observar a distribuição dos sorotipos na população (GUZMÁN;
KOURÍ, 1996). Uns dos testes mais utilizado é o de captura de IgM MAC-ELISA, este utiliza
uma mistura de quatro antígenos de dengue (geralmente derivados a partir de sobrenadantes
de cultura de células infectadas com vírus de dengue) e apresenta um ótima sensibilidade e
especificidade, quando comparado à inibição da hemoaglutinação que é uma técnica que
detecta infecção primária a partir do quinto dia de doença e infecção secundária por meio da
comparação dos títulos das amostras colhidas na fase aguda e outra colhida na fase de
convalescença (CARDOSA et al., 1992; SA-NGASANG et al., 2003). O teste de ELISA de
IgG que detecta anticorpos específicos para dengue pode ser usado para confirmar a infecção
por dengue em soros emparelhados, mas também é amplamente utilizado para classificar as
infecções primárias ou secundárias . Alguns protocolos usam diluições de soro ao título IgG
específicos de dengue e outros usam a proporção de IgM para IgG para classificar em dengue
secundária (DE SOUZA et al., 2004; SHU et al., 2003). Outro método sorológico utilizado
para determinar infecção secundária é a soro neutralização, além de ser bastante útil para
determinar os sorotipos virais em inquéritos soroepidemiológicos e para estudos de vacinas
(GUZMÁN; KOURI, 2004).
1.6. Vacinas para dengue
A OMS tem considerado como prioridade o desenvolvimento de uma vacina eficiente
e segura contra o vírus da dengue (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
35
Um mecanismo imunológico primário que confere proteção contra a dengue e de
neutralização do vírus por meio de anticorpos e todos que estão pesquisando a produção de
uma vacina para dengue, atualmente, visam obter altos níveis de anticorpos neutralizantes
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Uma vacina ideal para dengue deveria
cumprir as seguintes exigências: promover imunização prolongada contra os quatro tipos de
vírus da dengue, não causar o fenômeno de facilitação, por anticorpos, da penetração viral em
macrófagos (antibody dependent enhancement - ADE); que não inicia o mecanismo
fisiopatológico responsável pela dengue grave; ter baixo custo; ter baixa toxidade
(principalmente neuro e hepatotoxidade) (WHITEHEAD et al., 2007).
No entanto, ainda há vários obstáculos para o desenvolvimento de vacinas contra
dengue. Uma delas é que a patogênese não é totalmente compreendida. Outro é a falta de
modelos animais apropriados. O DENV pode infectar primatas não-humanos, mas não replica
bem nesses animais. Em geral, os “ratinhos” imunocompetentes são os modelos mais
adequados para testar a imunogenicidade de uma vacina, mas o DENV, também não replica
bem nesses. O recente progresso tem sido feito usando a modelagem de camundongos
transgênicos (WAN et al., 2013).
Embora nenhuma licença para vacina contra a dengue ainda não esta disponível,
vários candidatos a vacinas estão em desenvolvimento. Incluindo vacinas de vírus vivos
atenuados, vírus vivo quiméricos, vírus vivo inativadose de subunidades de DNA
recombinante (MURRELL; WU; BUTLER, 2011). Vacinas de vírus vivos avançaram para
ensaios clínicos, mas têm demonstrado problemas, como a imunogenicidade diferente dos
quatro sorotipos e interferência viral entre eles nas formulações tetravalentes. Vacinas não-
virais, também têm sido propostas e desenvolvidas por razões de segurança. Isto inclui as
vacinas de subunidades virais, principalmente, da proteína E ou os seus derivados. No
entanto, a dificuldade de induzir níveis equilibrados de neutralização para cada um dos quatro
sorotipos tem sido a principal preocupação. A NS1 é outra subunidade candidata a vacina,
pois não esta associada à virion e não tem efeitos ADE (MURPHY; WHITEHEAD, 2011).
I. Vacinas de vírus vivo atenuado
Vacinas de vírus vivos atenuados contem vírus atenuados que ainda podem induzir
respostas imunes adaptativas de ambas as proteínas estruturais e não estruturais. A replicação
36
dos vírus vivos atenuados deve ser suficientemente restrita para evitar efeitos patológicos.
Infelizmente as vacinas desse tipo não mostraram sucesso (THOMAS et al., 2013; WAN et
al., 2013). Estudos realizados na Thailândia com vacina tetravalente não apresentou
soroconversão em todos os voluntários para os quatro sorotipos e alguns mostraram
reatogenicidade inaceitável e consequentemente os testes clínicos foram suspensos
(SABCHAREON et al., 2002, 2004). A formulação da vacina tetravalente de dengue do
grupo (WRAIR) também mostrou problemas de imunogenicidade e reatogenicidade, no
entanto novas formulações foram feitas e parece ser segura e imunogênica em um estudo de
fase II, no entanto, a eficácia ainda precisa a ser avaliada (THOMAS et al., 2013; WAN et al.,
2013).
II. Vacinas de vírus inativados
O desenvolvimento dessas vacinas vem enfrentando dificuldades pelo fato desses vírus
não se replicarem em altos títulos nos camundongos ou culturas de células. Este fato levou ao
quase abandono desse processo de produção vacinal para dengue, devido à necessidade de
concentrar os materiais contendo vírus, dificultando e encarecendo muito a produção em larga
escala (ECKELS et al., 2003). Outro fator é que essas vacinas não apresentam imunidade
contra as proteínas não estruturantes e precisam de adjuvantes para aumentar a
imunogenicidade. No entanto estas apresentam a vantagem de não reverter a virulência em
relação às vacinas de vírus vivo (WAN et al., 2013).
III. Vacinas de engenharia genética
Essa tecnologia compreende a inoculação de um vetor plasmidial de expressão em
células eucarióticas contendo o antígeno de interesse, o qual tem por finalidade induzir
resposta imune nos indivíduos vacinados (TANG; DEVIT; JOHNSTON, 1992).
A maioria das vacinas recombinantes vem utilizando como imunógeno a proteína E e
que, na maioria, são obtidas a partir da manipulação genética de adenovírus e alphavírus que
foram projetados para essa função, outra forma de se obter essa proteína é a partir de células
de levedura e de inseto (JAISWAL; KHANNA; SWAMINATHAN, 2003).
37
Outro imunógeno que é utilizado em vacinas recombinantes é a NS1, com a vantagem
de não contribuir com ADE, pois não é parte estruturante do vírus. Os anticorpos anti – NS1
provocam a lise das células infectadas via complemento, sendo assim protetores. Sendo assim
alguns estudos indicam que a imunização passiva por anticoprpos anti-NS1, ou vacinas
recombinantes com NS1 ou vacinação ativa com a proteína NS1 poderia gerar imunidade em
camundongos (AMORIM et al., 2012; FARIA et al., 2013; WU et al., 2003).
No entanto, in vitro e in vivo, anti-NS1 mostrou efeitos patogênicos devido à
reatividade cruzada com proteínas do hospedeiro. Portanto para usar uma vacina baseada na
NS1 segura terá que eliminar ou modificar os epítopos da reação cruzada (TSAI et al., 2009;
WAN et al., 2013).
IV. Perspectiva de vacinas de dengue em desenvolvimentos
O desenvolvimento de vacinas de dengue tetravalente vem sendo considerado uma
prioridade em saúde pública. As vacinas de dengue deverão proteger contra os quatro
sorotipos, proporcionar imunidade de longa duração e serem custo-efetivas
(AMARASINGHE; MAHONEY, 2011; WHITEHEAD et al., 2007). O registro internacional
de ensaios clínicos (ClinicalTrials.gov) mostra vários ensaios clínicos de vacinas de dengue,
concluídos (NCT01511250) ou em andamento (NCT01374516). Inúmeras publicações
apontam para a relevância e o interesse de disponibilizar vacinas de dengue com rapidez
(CARRASCO et al., 2011; DURHAM et al., 2013; GUMNÚN et al., 1988; GUY et al., 2011;
MURRELL; WU; BUTLER, 2011; SABCHAREON et al., 2012). Em julho de 2014 foi
publicado o primeiro resultado do ensaio clinico (RCT - fase III) da vacina tetravalente de
dengue, testado em países da Ásia-Pacifico. A vacina de dengue CYD-TDV (Sanofi Pasteur)
foi considerada eficaz (56,5%; IC 95%: 43,8 – 66,4) quando administrada em 3 doses -
intervalo de 0, 6 e 12 meses - em criança entre dois e 14 anos, apresentando bom perfil de
segurança, houve 4 óbitos no grupo que foi vacinado, mas sem relação com vacina pois 3
morreram de acidente de trânsito e 1 de lesão na traquéia. Segundo os autores, a vacinação
poderia reduzir a incidência de infecções sintomáticas e admissão hospitalar com potencial
benefício em saúde pública (CAPEDING et al., 2014). Um segundo RCT - fase III da CYD-
TDV foi desenvolvido em países da América Latina e Caribe (Brasil, Colômbia, Honduras,
México e Porto Rico), também com patrocínio da Sanofi Pasteur. Foram recrutadas 20.869
38
crianças e adolescentes (9-16 anos) e a eficácia da vacina foi de 64.7% (95% CI, 58.7 to 69.8)
(VILLAR et al., 2015). A dinâmica da dengue e o custo efetividade no Brasil foram
previamente analisados, porém utilizando resultados de RCT-Fase II da vacina CYD-TDV
(DURHAM et al., 2013).
Além da CYD-TDV existem outras vacinas sendo testadas como a de vírus vivo
atenuado (metagênese específica de vírus DEN e DEN / DEN vírus quimérico intratípico)
Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas / Instituto Butantan esta sendo produzida
pelo o Instituto Butantan no Brasil, com o mesmo protocolo do NIH e testada no Brasil. São
duas etapas, a primeira com pessoas sem exposição prévia a dengue e a segunda só
participantes expostos. O recrutamento da primeira fase encerará no final de 2014, com
análise da imunogenicidade. A fase III esta prevista para começar em 2015, no entanto o
estudo esta previsto para findar em 2018 (NCT01696422). Outro estudo que vem sendo
realizado no Brasil é o da vacina de DENV-1 inativado, pela Fundação Oswaldo Cruz, este
estudo está na fase I e também esta sendo testada nos Estados Unidos (ClinicalTrials.gov)
(SINHA, 2014).
Sendo assim estudos de custo-efetividade vêm sendo considerados uma prioridade em
saúde pública mundial frente a perspectiva de conclusão de ensaios clínicos de vacinas de
dengue (BEATTY et al., 2011).
Ta bela1. Vacinas de dengue em desenvolvimento em fase de ensaios clínicos
Fase do
estudo/ País Produtor Descrição do produto
Idade
vacinal
Forma de
administração Local teste Eficácia
Efeitos
colaterais
Fase III
concluída /
Sanofi Pasteur
ChimericVax Dengue. Vacina tetravalente de
vírus vivo atenuado
(Febre Amarela 17D/
DEN vírus quimérico)
2-14 anos
(Ásia)
9-16 anos
(América
Latina)
3 injeções
subcutâneas (intervalo: 0, 6 e
12 meses)
5 países da Ásia- Pacifico
5 países da
América Latina
60% DENV-1;
35% DENV-2;
80-90% DENV-3 e DENV-4 (Ásia)
Reação no local da
injeção;
Ásia
Pacifico
Reação
sistêmica;
América
Latina
50.3% DENV-1;
42.3% DENV-2;
74.0% DENV-3; 77.7% DENV- 4
(América)
4 óbitos
(Ásia)
Fase II em
andamento/ Brasil
Instituto Nacional
de Alergia e
Doenças Infecciosas /
Instituto Butantan
Vacina de vírus vivo
atenuado (alvo mutagênico dos vírus
DEN e vírus
quimérico intertípico DEN/DEN)
18-59 anos 1 injeção
subcutânea Brasil ND ND
39
Fase II
concluída/ Takeda
Pharmaceuticals / Inviragen
Vacina tetravalente de
vírus vivo atenuado
(DNA) (vírus atenuado DEN2 PDK-
53 e vírus quimérico intertípico DEN/DEN)
1,5-45 anos
2 injeções
subcutâneas (intervalo: 0, 3
meses)
Porto Rico,
Colômbia, Singapore e
Tailândia
ND ND
4 países
Fase I
Merck/ Hawaii
Biotech
Vacina de proteína
recombinante
subunidade DEN1-80E (versão E
truncada)
18-49 anos
3 injeções intramuscular
(intervalo: 0, 1 e
2 meses)
Austrália ND ND
GlaxoSmithKline/
Fundação Oswaldo Cruz/
Walter Reed Army
Institute of Research
DEN1, vacina de vírus
inativado purificado 18-39 anos
2 injeções intramuscular
(intervalo: 0, 28
dias)
Estados- Unidos
ND ND Brasil
US Naval Medical
Research Center/
Vical
Vacina DNA Vaxfectin (Vaxfectin
DNA Vaccine -
TVDV), expressão das proteínas de
membrana prM e E.
Formulada com e sem Vaxfectin adjuvante
18-50 anos
3 injeções
intramuscular (intervalo: 0, 1 e
3 meses)
Estados-Unidos ND ND
Fonte: OMS, Biomedtracker; clinicaltrials.gov
40
2 JUSTIFICATIVA
Atualmente a dengue é considerada um dos principais desafios de saúde pública nos
países de clima tropical e subtropical, pela carga da doença. A dengue é uma doença viral e
transmitida por meio da picada do mosquito infectado do gênero Aedes. Existem quatro
sorotipos virais conhecidos DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, todos capazes de causar
doenças, que variam desde infecções assintomáticas ou oligossintomáticas até formas mais
graves, como a febre hemorrágica da dengue e síndrome do choque da dengue (FHD/SCD),
que podem levar o paciente a óbito (WHO, 2012c).
A dengue atinge todas as regiões do Brasil e sua epidemiologia no país vem se
caracterizando por uma tendência crescente do número de casos e rápida dispersão geográfica
no período de 2000-2010 (TEIXEIRA et al., 2013). Em 2010, mais de um milhão de casos
foram notificados, incidência de 538,4 casos por 100.000 habitantes e 3.808 casos registrados
de Febre Hemorrágica de dengue (SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). No país epidemias de
dengue ocorreram nos anos de 2002 com registro de casos prováveis entre 684.527 e 794.219;
em 2008 com 637.663 – 806.036 casos de dengue e mais de 1 milhão casos foram notificados
na epidemia em 2010. Em 2013 registrou-se a maior epidemia de dengue das últimas duas
décadas, com mais de 2 milhões de casos de dengue notificados entre setembro de 2012 e
agosto de 2013 (período epidêmico). Atualmente, co-circulam quatro sorotipos virais (DENV-
1; DENV-2; DENV-3 e DENV-4) o que pode causar epidemias em populações naive pelo
sorotipo circulante prevalente.
No Brasil, as mudanças epidemiológicas e clínicas da dengue nessas duas últimas
décadas requerem que sorotipos virais e cepas circulantes sejam identificadas e estudadas
regionalmente. Adicionalmente a caracterização clínico-epidemiológico dos casos, com
detalhamento e incorporação de técnicas moleculares faz-se necessário para traçar um cenário
atualizado da epidemiologia das infecções virais por dengue.
Nosso estudo faz parte do Projeto PRONEX – REDE DENGUE que visa identificar os
preditores de gravidade, estudo colaborativo com Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães /
FIOCRUZ – PE.
41
3 OBJETIVOS
Caracterizar o perfil clínico e molecular dos pacientes com dengue na epidemia de 2012/2013
na cidade de Goiânia-GO, Brasil.
Estabelecer se houve associação entre marcadores de gravidade clínica e laboratorial com os
sorotipos virais infectantes.
Caracterizar geneticamente o vírus dengue 4 que circulou na epidemia de 2012/2013 em
Goiânia – GO.
42
4 MÉTODO(S)
Delineamento do estudo
Esse é um estudo observacional, prospectivo de pacientes com suspeita clínica de
dengue recrutados em oito unidades de saúde de referência para atendimento de pacientes
com dengue no período de 1º janeiro de 2012 a 31 de julho de 2013 no município de Goiânia
– GO, Brasil.
O estudo foi conduzido nas seguintes unidades de saúde do setor público considerado
de referência para a vigilância epidemiológica de Goiânia: Centros de Atenção Integral à
Saúde (CAIS) Campinas e Chácara do Governador; Centro Integrado de Assistência
Municipal à Saúde (CIAMS) Novo Horizonte; Hospital de Doenças Tropicais Dr. Anuar
Auad (HDT/DAA) com 154 leitos, sendo 17 UTIs; e Hospital de Dermatologia Sanitária
(HDS) com 20 leitos (CNES 2014).
Adicionalmente foram selecionadas três unidades privadas de saúde para o
recrutamento de pacientes: Hospital São Judas Tadeu, Hospital São Francisco de Assis com
108 leitos, sendo 31 de UTIs e Hospital Cidade Jardim com 135 leitos, sendo 10 UTIs (CNES
2014).
Todas essas unidades de saúde localizam-se em Goiânia, a capital do estado de Goiás
(1.412.364 habitantes) (IBGE, 2013) situada na região Centro - Oeste do Brasil. Nesta região
há circulação do vírus da dengue desde 1994, com introdução do DENV-1, sendo a circulação
concomitante dos sorotipos DENV-1, 2, 3 e 4 a partir de 2011 (FERES et al., 2006; GOIÁS,
2013; SIQUEIRA et al., 2005).
Triagem de casos suspeitos de dengue
Os pacientes da demanda espontânea das unidades de saúde de nível secundária foram
triados pela equipe local com os seguintes critérios: febre por até sete dias, acompanhada de
pelo menos dois sinais e sintomas inespecíficos (cefaléia, prostração, dor retro-orbitaria,
exantema, mialgias e artralgias), e história epidemiológica compatível. Presença ou ausência
de sinais de alarme (dor abdominal intensa e contínua, vômitos persistentes, hipotensão
43
postural e/ou lipotímia, hepatomegalia dolorosa, sangramento de mucosa ou hemorragias
importantes, sonolência e/ou irritabilidade, diminuição da diurese, diminuição repentina da
temperatura corpórea ou hipotermia, aumento repentino do hematócrito, queda abrupta de
plaquetas, desconforto respiratório), sangramento espontâneo ou induzido, presença de
comorbidades, grupo de risco ou condições clínicas especiais (menores de 2 anos de idade,
gestantes, adultos com idade acima de 65 anos, com hipertensão arterial ou outras doenças
cardiovasculares graves, diabetes mellitus, DPOC, doenças hematológicas crônicas
(principalmente anemia falciforme e púrpuras), doença renal crônica, doença acido péptica,
hepatopatiasme doenças auto-imunes).
De acordo com a rotina de atendimento estabelecida na epidemia, aos pacientes com
suspeita de dengue examinados era recomendado o poso com hidratação domiciliar ou
permaneciam em observação clínica, por no mínimo 4 horas, com hidratação venosa. Estes
últimos pacientes foram o alvo da pesquisa nestas unidades.
Nos hospitais, todos os pacientes hospitalizados com suspeita clínica de dengue eram
elegíveis para participar da pesquisa.
Em seguida, os casos elegíveis pela equipe de campo eram informados sobre os
objetivos da pesquisa e procedia-se o preenchimento da ficha de notificação de dengue
SINAN e de um questionário estruturado dividido em quatro partes: a primeira continha
questões sobre aspectos sócio, demográfico, econômico e antecedentes clínicos de dengue e
de doenças crônicas. A segunda tinha questões sobre condições clínicas (sinais e sintomas) do
início da doença até o dia da visita. A terceira tinha questões para avaliação física do paciente
no dia da visita e a quarta, onde colocávamos os dados laboratoriais inespecíficos e
específicos. Os pacientes eram acompanhados por componentes da equipe de pesquisa,
composta por médicos, enfermeiros, biomédicos e farmacêuticos, no entanto, as avaliações
clínicas eram realizadas, exclusivamente, por clínicos.
Critério de inclusão
Foram incluídos no presente estudo os pacientes que tiveram a confirmação da
infecção por meio da presença de anticorpos IgM ou detecção de antígeno NS1 ou RNA viral.
Tamanho da amostra
Para o cálculo do tamanho da amostra utilizamos o programa OpenEpi versão 3.01.
Consideramos uma população superior a 1.000.000 de habitantes e uma frequência esperada
de casos de dengue com sinais de alerta e/ ou dengue grave de 25% (Guillarde et. al. 2008).
44
Consideramos um limite de confiança de 5% e para um IC 95% o tamanho da amostra
mínimo foi de 289 participantes.
Seguimento dos pacientes
Os pacientes foram acompanhados por 30 dias, sendo abordados em três momentos
diferentes: a primeira visita até o 7º dia de início da doença, a segunda, do 8º dia de sintomas
até o 15º e a terceira visita, do 16º ao 30º dia de doença. Durante essas visitas, além da
avaliação clínica, foram coletadas amostras de sangue por punção venosa e encaminhadas
para os testes laboratoriais.
Procedimentos laboratoriais
As amostras de sangue e soro foram encaminhadas a temperatura de 2ºC a 8ºC ao
Laboratório Rômulo Rocha da Faculdade de Farmácia (UFG) para realização do hemograma
e análises bioquímicas, respectivamente. Amostras de soro acondicionadas em tubos
criogênicos foram transportadas em gelo seco até o Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública (UFG) onde foram armazenadas a -20ºC para exames sorológicos e a -80ºC para
testes moleculares. O transporte das amostras foi realizado com empresa especializada e
segundo normas de biossegurança.
Exames laboratoriais inespecíficos
O hemograma e a dosagem da aspartato amino transferase (AST) e alanina amino
transferase (ALT) foram realizados em amostras de pacientes colhidas em todas as visitas.
Exames laboratoriais específicos
Testes Sorológicos
Os testes sorológicos para pesquisa de IgM e IgG antidengue foram realizados em
amostras de soro, colhidos na 1º, 2º e 3º visitas, mas para a pesquisa de antígeno NS1 foi
realizada em amostras de soro da 1º visita. Para todas foi realizada a técnica de ensaio
imunoenzimático, sendo que para a pesquisa de IgM utilizou-se a técnica de captura de
anticorpos da classe IgM. Para a dosagem de IgG foi usada a pesquisa indireta de anticorpos.
A detectção de IgM e IgG utilizou-se o kit comercial da PanBio. Já para a pesquisa de
45
antígeno NS1 foi utilizado meio de captura de antígeno com o kit comercial da Bio-Rad. Em
todas as técnicas foram seguidas as recomendações do fabricante.
Testes Moleculares
Extração do RNA
A detecção de RNA viral foi realizada em amostras de soro colhidas até o sétimo dia
após o inicio dos sintomas. O RNA viral foi extraído em duplicata a partir de 140 µL de soro,
por meio da utilização do kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) . O RNA foi eluído em
60µL de tampão de eluição, de acordo com as instruções do fabricante.
RT-PCR e Tipagem Viral
Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia da Polimerase - RT-PCR
A obtenção do cDNA foi realizada por transcrição reversa à 40oC por 60 min usando
10 uL de RNA viral e 10 uL da mistura reagente contendo primer randômico e 50U/uL da
transcriptase reversa (MultiScribeTM
- High Capacity Appllied Biosystems, US).
A amplificação dos fragmentos requeridos foi procedida em duas etapas:
primeiramente, foram utilizados iniciadores consensuais (D1 e D2) para os quatro sorotipos
dos DENV, complementares as seqüências dos genes que codificam as proteínas C e prM. A
mistura de reação consistiu de 2X PCR Master Mix (Promega, US), cada primer a 0,5 µM
(Invitrogen, US) e água livre de RNAse e DNAse completando um volume final de 45µl,
seguido de 40 ciclos de amplificação de 94oC por 30 seg, 58
oC por 1 min, 72
oC por 2 min e
extensão final a 72oC de 10 min. Para amplificação foi utilizado o termociclador Swift
TM
Maxi Thermal Cycler (Esco Technologies, US). No procedimento semi-nested, foram
utilizados iniciadores específicos TS1, TS2, TS3 e TS4 gerando produtos amplificados
(amplicons) com tamanhos específicos (pb) para detecção dos DENV-1 a 4, respectivamente,
segundo o protocolo descrito por Lanciotti et al. (1992). Os produtos de PCR adicionados ao
Gel Red (Biotium, BRA) e padrão de peso molecular 100 bp (Invitrogen, US) foram
submetidos à eletroforese com gel de agarose 1,2% e visualizados em transluminador (Major
Science, US).
Reação de Seqüenciamento
46
Das amostras positivas por RT-PCR fizemos o sequenciamento da região do envelope
viral de uma amostra de DENV-4. As etapas referentes às reações de sequenciamento foram
realizadas no Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás com o uso do seqüenciador
automático ABI 3130 - Applied Biosystems.
Iniciadores
Para a amplificação do gene do envelope foram utilizados os oligonucleotídeos
descritos nas publicações de Araújo et.al., 2012 e representados na tabela 2.
Tabela 2 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope do DENV-4
Região Primer sense A Primer antisense B Posição do
genoma
Produto Tm
(ºC)
(5’-3’) (5’-3’) (de acordo
com
JN559741.2)
(pb)
A/B
1 TCC AAA TCG
GAA GCT TGC TT
GAC CCA TGC TCC
ACC TGA GA 11 - 978 967 59/60
2
GGA AGC ATG
CTC AGA GAG
TAG AGA
ATC CCA GCA CTG
TCA CAT CCT 767 - 1678 911 58/58
3
GTC ACC ATC
GGT TGA AGT
CAA A
GCA CGT CAT GGC
CAT TGA 1416 - 2352 936 59/59
4 TCA TTG GGA
AAG GCT GTG C
CCA TGG ACC CAC
GGT TTG 2206 - 3187 981 58/59
5
GTG TGT GAC
CAC AGG CTG
ATG
CCT CA AGC CAT
GAC CAA TG 2932 - 3932 1000 59/60
Reação em cadeia pela polimerase para o sequeciamento
Em um tubo tipo eppendorf adicionamos 27,5μL de água livre de nucleases (Promega,
Madison, EUA), 2,5 μL (500 nM) do iniciador sense (Invitrogen, EUA), 2,5 μL (500 nM) do
iniciador antisense (Invitrogen, EUA) e 12,5μL do Acessquick Master Mix (2x) (Promega,
Madison, EUA). Em seguida foram adicionados 5μL de cDNA e o tubo foi submetido à
agitação com auxilio de um vórtex antes levar ao termociclador.
Depois foi submetido a 30 ciclos de desnaturação 94°C por 30 segundos, 54°C / 62°C
por 1 minuto (dependendo do par de iniciadores utilizado) e 72°C por 2 minutos, com uma
extensão final a 72°C por 10 minutos. A amplificação foi realizada utilizando termociclador
modelo SwiftTM Maxi Thermal Cycler (Esco Technologies, US). Após o término da PCR
47
para o sequenciamento, analisamos os produtos amplificados por eletroforese em gel de
agarose (BioAmerica Inc., Miami, USA – cat nº D1500 – LE) a 1% em TBE 0,5X, por 60
minutos a 100V.
Purificação
Quando foram observados amplicons únicos na eletroforese em gel de agarose a
purificação foi feita diretamente do produto da PCR usando o “kit comercial PCR
Purification” (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Em um tubo de 1,5 mL, adicionamos 225 µL de Buffer para 45 µL de reação.
Levamos a solução para o vórtex para homogeneização. A solução foi transferida para a
coluna e centrifugamos por 60 segundos a 14.000 rpm. O líquido que foi filtrado pela coluna
foi desprezado, foi adicionado 750 µL do buffer PE e centrifugado novamente por 60
segundos a 14.000 rpm. Após a centrifugação, desprezamos mais uma vez o líquido filtrado e
centrifugamos a coluna por 1 minuto a 14.000 rpm. A coluna foi transferida para um tubo de
1,5 mL, adicionamos 30 µL de H2O livre de nucleases e incubada por 1 minuto a temperatura
ambiente, seguida por uma última centrifugação de 1 minuto a 14.000 rpm. O DNA
purificado foi armazenado a -20 ºC até o momento do uso.
Quando foi observada a presença de amplicons inespecíficos, realizamos um gel de
purificação. A eletroforese foi feita em gel de agarose a 0,7%, a 110V. Aplicamos todo
volume da reação de PCR, 5 µL de GelRed e 5 µL de sacarose nos poços gerados pelo pente.
O gel foi analisado no transiluminador e os amplicons de interesse foram cortados usando
lâminas de bisturi estéreis. Após o corte, o fragmento de gel contendo o amplicon de interesse
foi transferido para um tubo de 1,5 mL e foi realizada a purificação utilizando o “kit
comercial Gel Extraction” (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Adicionamos 300 µL de Buffer QG para cada 100 g de gel e incubamos a 50 ºC por 10
minutos, homogeneizando a cada 2-3 minutos com auxílio do vórtex. Após o período de
incubação, com o gel totalmente dissolvido, checamos a cor da mistura, que deve está
amarela, semelhante ao buffer QG. Em seguida adicionamos 100 µL de isopropanol à amostra
e adicionamos a mistura à coluna previamente preparada, depois centrifugamos por 1 minuto
a 13.000 rpm, desprezamos o filtrado, adicionamos 500 µL do Buffer QG e centrifugamos
novamente seguindo os mesmo parâmetros. Em seguida, desprezamos o filtrado, adicionamos
750 µL de Buffer PE, centrifugamos novamente por 1 minuto, desprezamos o filtrado e
incubamos a amostra durante 2 a 5 minutos antes das duas próximas centrifugações. Por fim,
48
colocamos a coluna em um tubo de coleta de 1,5 mL, adicionamos 30 µL de H2O livre de
nucleases no centro da coluna e centrifugamos por 1 minuto. O DNA purificado foi estocado
a -20 ºC até o momento do uso.
Quantificação do DNA
A partir do produto da purificação direta da reação de PCR ou de gel-purificação,
realizamos uma eletroforese em gel de agarose a 2% com o objetivo de quantificar o DNA
presente em cada amostra e com isso determinar a quantidade ideal de DNA a ser adicionada
a reação de PCR de sequenciamento. Aplicamos 4 µL de peso molecular de Massa
(Invitrogen, Carlsbad, CA) no primeiro orifício do gel e 4 µL do DNA a ser quantificado nos
demais orifícios, juntamente com 2 µL de GelRed e 2 µL de sacarose. O procedimento teve
duração de 60 minutos a 100v.
A concentração do DNA foi estimada por meio da comparação dos amplicons com o
peso molecular de massa, como se segue abaixo.
Tabela 3. Valores de referência para comparação do
amplicon obtido com peso molecular de massa para
determinação da quantidade ideal de DNA a ser
aplicada na reação de sequenciamento
Tamanho do
fragmento em pb
Low DNA Mass em
ng (4µL)
DNA em
µL
(µL/reação)
2000 200 2
1200 120 2
800 80 4
400 40 5
200 20 6
100 10 8
Reação de sequenciamento
O método de sequenciamento utilizado foi o descrito por Sanger et al, (1977). Para o
sequenciamento dos fragmentos de DNA utilizamos 2µL de Big DyeTerminator Cicle
Sequencing Randy (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2 µL do primer específico, 2-8 µL
49
do produto da PCR, a quantidade de DNA determinada pelo processo de quantificação (tabela
3) e completamos o volume com H2O livre de nucleases até atingir 10 µL.
Submetemos a solução à seguinte condição de termociclagem: 30 ciclos de 94ºC por 1
minuto, 30 ciclos de 2 minutos com a TM específica do primer utilizado e 30 ciclos de 3
minutos a 72 ºC. utilizando termociclador modelo SwiftTM Maxi Thermal Cycler (Esco
Technologies, US).
Purificação para remoção de DyeTerminators
Precipitação com isopropanol: foram adicionados 60 uL de Isopropanol a 65% ao
produto do sequenciamento, homogeinizado e deixado em repouso no escuro por 20 minutos.
Depois centrifugou por 45 minutos à 2000 rcf a 20º C e descartado o sobrenadante por
inversão. Depois adicionou 250 uL de etanol 60% e centrifugou por 10 minutos a 2000 rcf a
20 ºC e descartado o sobrenadante por inversão. Depois lavamos com 100 uL de etanol a 60%
e centrifugou por 10 minutos a 2000 rcf a 20º C e descartado o sobrenadante por inverção.
Depois centrifugamos por 1 minuto a 500 rpm com placa invertida sobre papel absorvente e
vedamos com papel alumínio e sacamos no termociclador a 95º C por 2 minutos.
Desnaturação: foram adicionados 10µL de formamida Hi-Di (Applied Biosystems,
P/N 4311320), aquecido por 2 minutos a 95ºC no termociclador e mantido no banho de gelo
até que os 10µL tenham sido aplicados na placa do sequenciador automático “Applied
Biosystems Prism” 3100 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análise filogenética
Para análise filogenética utilizamos sequências protótipo representativas dos diferentes
genótipos do DENV-4 e cepas representativas de outros estados brasileiros disponíveis no
Genbank. Esta análise nucleotídicas foi feita usando Chromas Lite versão 2.1.1 (Technely
siumPty Ltd) e editadas manualmente por meio de alinhamentos feitas no Clustal W.
As seqüências nucleotídicas, para a construção do banco, foram coletadas do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Foram coletadas sequências representativas do genótipo
DENV-4 que tinham sequências do gene do envelope ou completa do vírus, com o objetivo de
comparar e determinar qual genótipo está circulando em Goiânia-GO. Foi montado 1 banco
de sequência. Apenas sequências com ano de isolamento e local de origem foram coletadas.
Foram excluídas sequências descritas como clones e sequências previamente de isolamento
com mais de 2 passagens.
50
As sequências foram submetidas ao BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool/NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para verificar a similaridade com as
sequências de DENV-4. O alinhamento das sequências obtidas e das sequências selecionadas
para comparação foi feito pelo Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
O percentual de identidade entre as sequências e a construção da árvore filogenética foi
realizado utilizando-se os Molecular Evolutionary Genetics Analysis - MEGA versão 5.2
(http://www.megasoftware.net/), por meio dos métodos Neighbor Joining e Tamura Nei e
bootstrap de 1000 replicações. Para permitir o enraizamento da árvore foi colocada uma
sequência de DENV-3 como grupo externo no banco.
Critério de confirmação de infecção por dengue
O critério de confirmação laboratorial, definido por presença de anticorpo anti dengue
IgM, em qualquer momento, ou presença do antígeno NS1, ou soro conversão de IgG ou
detecção de RNA viral. Sendo os pacientes que não apresentaram nenhum dos critérios acima,
considerados sem infecção por dengue.
Critério de infecção secundária
A infecção secundária de dengue foi definida pela a detecção de anticorpo IgG
específico anti-dengue em amostras colhidas antes do 5º dia de inicio dos sintomas associado
à confirmação da infecção por dengue.
Classificação clínica da dengue
Classificação OMS 2009 – Revisada
Dengue sem sinal de alerta
Sinais e Sintomas Definição dos Sinais e Sintomas
Febre >= 37,5 º C
Mais dois dos seguintes sintomas
Náusea ou Anorexia Perda de apetite
Dores Mialgia, Artralgia, dor retrorbital e cefaléia
Leucopenia <= 5000 cel/ mm3
Prova do laço >= 20 petéquias em 2 cm2
Dengue com sinal de alerta
51
Sinais e Sintomas Definição dos Sinais e Sintomas
Dor abdominal Abdome sensível ou dor abdominal contínua
Vômito persistente >= 3 episódios em 12 horas
Ascites, Extravasamento de plasma ou edema
Acúmulo de líquido avaliado pelo médico ou confirmado por ultrassom ou raios-X
Hemorragia de mucosa Epistaxe, gengivorragia, melena, hematêmese, hematúria, hemorragia subconjuntival ou vaginal
Letargia Escala de Glasgow < 15
Irritabilidade Irritabilidade ou agitação
Hepatomegalia Fígado palpável> 2 cm abaixo da margem costal
Diminuição da contagem de plaqueta com o aumento de Ht
A diminuição do número de plaquetas de 10.000 células / mm ³ em 24 horas simultaneamente com qualquer aumento no hematócrito
Plaquetopenia<= 100.000 cels/ mm3 e aumento do Ht
As plaquetas <100.000 células / mm ³ em qualquer momento e qualquer aumento no hematócrito
Dengue Grave
Sinais e Sintomas Definição dos Sinais e Sintomas
Dengue com pelo menos um dos seguintes quadros
Choque hipotensivo Pequena diferença na pressão ou hipotensão e pulso rápido ou pele fria ou bradicardia ou taquicardia ou taquipnéia ou pouco enchimento capilar
Choque compensado Enchimento capilar ruim e pulso ou taquipnéia ou taquicardia ou pele fria rápida
Acúmulo de líquido com dificuldade respiratória
Acúmulo de líquido (ascite, Hipoproteinemia, hipoalbuminemia, hematócrito elevado, hemoconcentração, extravasamento de plasma ou edema) e desconforto respiratório (taxa anormal respiratória, tiragem intercostal, ou saturação de oxigênio inferior a 95%)
Sangramento importante Todo sangramento que coloque em risco a vida do paciente
Alteração de ASL ou ALT AST ou ALT >= 1000 U/L
Alterações Neurológicas Alterações neurológicas graves
Suspeita de miocardiopatia
Sinais vitais instáveis ou carga cristalóide ou dextrano
52
Figura 3. Classificação clínica de dengue segundo a OMS 2009 (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009)
Processamento e Análise de dados
Foi realizada análise descritiva das principais características clínicas e laboratoriais
dos participantes. Foram utilizadas medidas de tendência central e dispersão para variáveis
contínuas; distribuição percentual para variáveis categóricas. Foram aplicados teste de x2
e
teste de Fisher quando apropriado, para avaliar as diferenças observadas nas distribuições de
frequências e teste t de Student para avaliar diferença entre duas médias, ou ANOVA quando
for mais de duais médias. Valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente
significantes. Foram utilizados os programas Epi Info sete e SPSS 17.0 for Windows para
processamento e análise de dados.
Considerações éticas
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do Centro de
pesquisa Aggeu Magalhães (FIOCRUZ – MS). Essa pesquisa seguiu as resoluções do
Conselho Nacional de Saúde 196/ 1996 e 466/ 2012.
53
5 ARTIGOS
Artigo 1 – DENGUE SPECIFIC SEROTYPE RELATED TO CLINICAL SEVERITY
DURING THE 2012/2013 EPIDEMIC IN CENTRAL BRAZIL.
Benigno A M Rocha, Adriana O Guilarde, Angela F L T Argolo, Marianna Peres Tassara
Lucimeire A da Silveira, Isabela C Junqueira, Marília D Turchi, Valéria C R Féres, Celina M
T Martelli
Revista: Infectious Diseases of Poverty (submetido)
Artigo 2 – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DENGUE DURANTE
EPIDEMIA DE 2012-2013 EM GOIÂNIA – GO.
Autores: Benigno A. M. Rocha, Valéria C. R. Féres, Adriana O. Guilarde, Lucimeire A. da
Silveira, Angela F. L. Argolo, Monica da Guarda, Celina M. T. Martelli.
54
Artigo1
DENGUE SPECIFIC SEROTYPE RELATED TO CLINICAL SEVERITY DURING THE
2012/2013 EPIDEMIC IN CENTRAL BRAZIL.
Benigno A M Rocha1,3
, Adriana O Guilarde1, Angela F L T Argolo¹, Marianna Peres Tassara¹
Lucimeire A da Silveira1, Isabela C Junqueira
1, Marília D Turchi
1, Valéria C R Féres
2, Celina
M T Martelli1
1. Institute of Tropical Pathology and Public Health / Federal University of Goiás, Goiânia,
Brazil. 2. Faculty of Pharmacy of / Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil. 3. School of
Nursing / State University of Goias, Ceres, Brazil.
55
Abstract
Background
Currently, in Brazil, there is a co-circulation of the four dengue serotypes. This study aimed to
assess whether different dengue serotypes and antibody response patterns were associated
with dengue severity during a dengue outbreak occurred in 2012 and 2013 in Midwestern
Brazil.
Methods
We conducted a prospective study with 452 patients with laboratory confirmed dengue in
Midwestern Brazil, from January 2012 to July 2013. The clinical outcome was the severity of
dengue cases: dengue, dengue with warning signs, and severe dengue. The patients were
evaluated in three different moments. Blood sampling for laboratory testing and confirmatory
tests for dengue infection were performed. We performed multinomial analysis considering
the three categories of the dependent variable (Dengue, Dengue with warning signs and
severe dengue). Odds ratio (OR) was calculated. A multinomial logistic regression model was
applied for variables with p-value <0.20. Statistical analysis was performed in STATA
software 12.0.
Results
452 patients (71.5%) were diagnosed with dengue. The DENV serotypes were identified in
243 cases. DENV-4 was detected in 135 patients (55.7%), DENV-1 in 91 (37.4%), DENV-3
in 13 (5.3%) and DENV-2 in 4 (1.6%). Patients with DENV-1 serotype were more prone to
present several clinical and laboratory features compared to DENV-4: spontaneous bleeding
(p=0.03), intense abdominal pain (p=0.004), neurological symptoms (p=0.09) and
thrombocytopenia (p=0.01). Secondary infection was predominant among DENV-4 cases
(80.0%) compared to DENV-1 cases (62.3%) (p=0.03). In the univariate analysis, females
(OR=2.12; 95% CI: 1.44-3.13; p<0.01 had higher risk of having dengue with warning signs.
In the multinomial analysis, severe dengue cases with secondary infection had an adjusted
OR= 2.80 (95% CI: 0.78-10.0; p=0.113) compared to dengue fever with primary infection
when adjusted for age and sex.
Conclusion.
56
The current data showed 5.8% of severe cases among patients recruited for dengue treatment
purpose in health care centers or hospitals. DENV-4 was the predominant serotype followed
by DENV-1 in a large outbreak in Central Brazil.
Keywords: Dengue, Secondary Infection, Severe Dengue, Dengue Type 4
57
Introduction
The etiologic agents of Dengue fever and dengue hemorrhagic fever (DF/DHF) are four
serotypes (DENV-1; DENV-2; DENV-3; DENV-4) part of the dengue complex from the
genus Flavivirus [1]. Dengue is a vector-borne viral disease considered a global public health
issue due to increasing incidence and its potential to cause epidemics and/or continuous viral
circulation in most urban areas in tropical and subtropical regions of the world.
Approximately 390 million dengue infected individuals and 20 thousand death were
estimated worldwide in the year 2010 [2–4]. In Brazil, dengue has been reported yearly since
1986 with a widespread from the Atlantic coastal area to other Brazilian macro-regions. 60%
of the dengue cases reported in South America occurred in Brazil in the years 2000 [5]. The
Brazilian Surveillance System registered at least four dengue epidemics in the years 2002,
2008, 2010 and 2013 with predominance of different serotypes according to the period.
Currently there is a co-circulation of the four dengue serotypes since DENV-4 was
reintroduced in the year 2010 [6–9].
Dengue presents with a range of symptoms ranging from asymptomatic through mild
infection to severe illness with life-threatening outcomes. According to the disease
progression, there are three clinical phases, which includes the initial febrile phase from 1-3
days after the onset of symptoms, followed by the critical phase (4-7 days) and recovery or
death. The majority of symptomatic cases progress to dengue fever, considered the mild form
of the disease. The clinical dengue classification has been a matter of extensive literature
discussion [10–15]. The current classification reflects the severity of the clinical features
namely dengue (DF), dengue with warning signs (DwS) and severe dengue (SD). It has been
adopted by the WHO and the Brazilian Ministry of Health to guide clinical management
[2,16,17]. The potential for increasing vascular permeability is the hallmarks of severe disease
progression [2,18–20]. Other specific organ involvement such as skin, eye, musculoskeletal
system, gastrointestinal tract, liver, kidney and genitourinary tract, heart and respiratory
system are part of the dengue clinical presentation [21–23].
Since the four serotypes are considered antigenically related but distinct the previous immune
status of the infected individuals plays an important role in the disease progression [24]. In
58
fact, several potential individual risk factors were implicated in the dengue severity such as
age, gender, immune status related to previous heterologous DENV infection and co-
morbidities among others [24–28]. Most of the current literature is from the Southeast Asia
where the dengue virus has been circulating for longer period of time (several decades). In
this sense, there is much opportunity for research due to the distinct epidemiologic scenarios
due to virus circulation and the immunity of the population in many endemic regions of Brazil
[29–32].
In a previous study we explored the effects of the viremic levels immune status and in relation
with the severity of the disease in the adult population during a DENV-3 epidemic in the
early 2000 in central Brazil [21]. We herein present a clinical cohort of dengue patients
recruited during a DENV-4 outbreak in the year 2013, the largest reported number of incident
cases (2233 suspected cases per 100.000 inhabitants ) at a State level (Goias, central Brazil)
[33,34]. This was the first time that simultaneous co-circulation of the four dengue serotypes
was detected regionally. This scenario represents an opportunity to explore the immune status
of the population, serotypes and other potential risk factors related with severe disease
progression. The aim of the current study was to assess whether different dengue serotypes
and antibody response patterns were associated with dengue severity during dengue outbreak
in the years 2012/ 2013, central Brazil.
Methods
Study design and setting
We recruited 632 clinically suspected dengue cases. 452 (71.5%) were laboratory confirmed
dengue cases. We conducted a prospective study of 452 laboratory confirmed dengue patients
recruited at three health care units and four hospitals in the city of Goiania (1.4 million
inhabitants; IBGE 2013),central Brazil from January 2012 through July 2013. We recruited
patient´s who attended dengue reference centres established by the Secretariat of Health to
timely deal with patients’ referral during dengue outbreak. All recruitment sites had clinical
expertise and operational capability to provide day health care monitoring and intravenous
fluid replacement for suspected dengue cases (Annex 1 for additional information).
59
The study site is a dengue endemic region where dengue incidence peaks during the rainy
season (December to March). The official Surveillance System registered DENV- 1 in 1994
considering the year of dengue introduction in the study area. During the next two decades,
other dengue serotypes were introduced regionally according to the following temporal
sequence: DENV-2 (Year 1998); DENV-3 (Year 2002) and DENV-4 in 2011. Currently, the
four dengue serotypes co-circulate in central Brazil. [6,34,35]. Incidence of dengue disease
was approximately 4.5 thousand dengue cases per 100,000 inhabitants in the study setting in
2013. This figure was the highest incidence reached since dengue virus detection.
Eligibility criteria and follow-up procedures
Inclusion criteria were laboratory confirmed dengue cases. The virologic and serologic tests
for dengue diagnosis ascertainment were: NS1 antigen positive test and/or detection of
serotypes by multiplex polymerase chain reaction (PCR) and/ or IgM serologic positive result
by antibody capture (MAC) ELISA.
Exclusion criteria were clinically suspected dengue cases with communication impairment,
residents outside the city boundaries and with restrictions to comply with the follow-up
procedures. We also excluded outpatients who did not remain in health facilities for clinical
management or monitoring.
Independently of this study protocol, local clinicians were responsible for all management
decision as part of the routine health attendance, following the official guidelines [16].
Clinical outcome:
The clinical outcome was the severity of dengue cases defined by Dengue (DF); dengue with
warning signs (DwS) and severe dengue (SD) [2]. Two infectious disease doctors classified
the dengue cases at the end of the follow-up period.
Screening procedures at baseline: We screened patients with clinically suspected dengue
independently of the age-group. We examined outpatients who were receiving intravenous
fluid replacement or hospitalized patients. After informed consent, trained researchers
obtained demographic information, clinical history and performed medical examination on
60
standard case report forms (CRFs). In addition, we collected an initial blood sample for
diagnostic laboratory confirmation (t1).
Follow-up visits were scheduled: during early convalescent phase >=7 days after the onset of
symptoms (t2); and late convalescent phase at 30 – 45 days of onset of symptoms (t3). In
addition to the clinical examination, we collected blood sample for dengue monitoring
following the same intervals.
For outpatients, the duration of follow-up was the time lag between the first and last blood
collections (t2 or t3) performed during the convalescent phase of the disease. The duration of
follow-up for hospitalized patients was defined as the period from the first medical visit to
either the discharge date or death.
Data Collection: We collected sociodemographics characteristics (age, sex, socio-economic
condition, education), previous dengue episodes, and key warning signs of illness
(e.g.,hypotension, intense abdominal pain, and significant bleeding) were recorded.
Dengue classification
We applied the current dengue classification recommended by the Dengue Control Program
(Brazilian Ministry of Health, 2009) which is online with the recommended WHO
classification [2] as:
Dengue without warning signs: The disease may manifest as a nonspecific febrile
syndrome including presence of acute febrile illness and two of the following symptoms:
headache, retro-orbital pain, myalgia, arthralgia, rash, and hemorrhagic manifestations.
Dengue with warning signs: The patient may present with persistent and severe
abdominal pain, persistent vomiting, fluid accumulation, mucosal bleeding, altered mental
status, hepatomegaly and progressive increase in hematocrit.
Severe Dengue: Severe dengue is defined by one or more of the following: (i) shock
from plasma leakage, fluid accumulation with respiratory distress, or both, (ii) severe
bleeding as evaluated by clinician, or (iii) severe organ involvement; liver: AST or ALT >
1000; CNS: impaired consciousness; and includes heart and other organs.
61
Definition of variables. The first 7 days after onset of symptoms denote the acute phase of
illness. We defined Illness “day 1” as the day of onset of symptoms. Patients receiving day
care were patients who stayed in the hospital for intravenous fluid replacement for 24 h.
Ambulatory patients were patients who attended ambulatory care units and required clinical
monitoring and/ or intravenous fluid replacement for < 24 hours.
Laboratory Procedures
Blood samples (10 mL) were collected at the initial clinical visit and at follow-up visits.
Samples were prepared and sera were cryopreserved according to biosafety guidelines in
freezers at - 20ºC for serological tests and – 80ºC for molecular tests, at the research centre
(Laboratory of Molecular Biology and Immunology of Infectious Diseases) from Institute of
Tropical Pathology and Public Health - Federal University of Goiás, in central Brazil.
At baseline and follow-up visits unspecific laboratory test were also performed for all eligible
patients including hematocrit, platelet, aspartate aminotransferase (AST), alanine
aminotransferase (ALT), and albumin. The reference values for normality were a serum AST
level of 50 U/L, a serum ALT level of 41 U/L, and an albumin level of 3.5–5.0 g/dL.Tests
were performed at Rômulo Rocha Laboratory Faculty of Pharmacy - Federal University of
Goiás, independently of the laboratory routine procedures of the health care units.
Serological tests
Acute and convalescent paired sera were tested by enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) using Dengue IgM-capture (PanBio, Ltd, Brisbane, Australia) and Dengue IgG
Indirect (PanBio, Ltd, Brisbane, Australia) commercial kits. NS1 antigen test was performed
at baseline. (Biorad Platelia™). All tests were carried out according to the manufactures
instructions.
Molecular tests
The serotypes were identified by protocol that includes viral RNA extraction by QiAmp Viral
Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA). The cDNA was obtained by reverse transcription
62
at 40°C for 60 min 10 ul of viral RNA and mix containing 10 mL random primer and 50 U/ul
reverse transcriptase (Multi Scribe - High Capacity Appllied Biosystems, US).
The viral typing was performed by cDNA amplification using consensus primers (D1 and D2)
for the four serotypes of DENV, the complementary sequences of the genes encoding the C
and prM proteins. To use amplification thermocycler SwiftTM Maxi Thermal Cycler (Esco
Technologies, US). Then, the semi-nested specific primers used TS1, TS2, TS3 and TS4 for
detecting each serotype of DENV-1 to 4 (Lanciotti et al, 1992). The bands were visualized on
1.2% agarose gel using the transilluminator (Major Science, US).
A primary infection was defined by detecting IgM antibodies and/or nucleic acid and/or
antigen NS1 in acute serum samples and seroconversion of IgG in the convalescent phase. A
secondary infection was defined by detecting IgG antibodies in acute serum samples of
patients with laboratory confirmation of dengue.
At baseline and follow-up visits.
Unspecific laboratory test were also performed for all eligible patients including Hematocrit,
platelet, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and albumin. The
reference values for normality were a serum AST level of 50 U/L, a serum ALT level of 41
U/L, and an albumin level of 3.5–5.0 g/dL. Tests were performed at Laboratório Rômulo
Rocha da Faculdade de Farmácia (UFG), independently of the laboratory routine procedures
of the health care units.
Data Analysis
Initially we applied descriptive statistics to assess the distributions of the variables in order to
characterize the study population. Qui-square test and t test were applied in order to verify
statistical differences between categorical or continuous variables. We performed multinomial
analysis considering the three categories of the dependent variable (DF, DwS, SD) to
calculate the association between the outcomes and the independent variables, considering DF
as the reference. The odds ratios (OR), with their respective 95% confidence intervals (95%
63
CI), and the p-value (Chi-square test) were calculated. Variables that presented a p-value
<0.20 in association with the outcome were eligible for the multivariate analysis. We applied
a multinomial logistic regression model to adjust OR for sex and age as a continuous variable
. The software used for the multinomial analysis was STATA (Data Analysis and Statistical
Software) version 12.0.
Ethical Considerations
This study was approved by ethics committee on research Aggeu Magalhães Research Center
(FIOCRUZ - PE) under no. 24/11 and review board of each institution. The inclusion was
after the signature of informed consent by the subject or a parent ⁄ guardians when necessary.
Results
Of 632 symptomatic dengue cases clinically and laboratorial screened at baseline, 452
(71.5%) were diagnosed as dengue confirmed by specific serology and/or viral detection
(Figure 1). Table 1 presents clinical and epidemiological data according to case
ascertainment. In both groups (dengue confirmed or symptomatic cases), the majority of
patients (~80%) were adult and approximately half of the participants were females.
Approximately 75% of the patients were recruited in ambulatory setting and reported previous
medical visit during the acute phase of the disease. Considering the adult population
comorbidity was similar between the groups.
At baseline, RT-PCR (53.8%) and NS1 (40.4%) tests yielded higher positive results compared
to IgM serology (25%) in days 1-3 of the onset of symptoms. In contrast, higher frequencies
of IgM positive results (68%) were detected after day 7 of the onset of symptoms versus RT-
PCR (15.6%) and/or NS1 results (Figure 2).
Table 2 presents the main clinical and laboratory findings of confirmed dengue patients
stratified by age group. At baseline, the most frequent symptoms reported were fever (100%),
headache (~80%) and prostration (~90%) similar between the age-group. Approximately
65% of the participants presented cutaneous rash and approximately half of the patients
reported vomit at baseline. During the course of illness, higher frequencies of signs and
64
symptoms were found among children: spontaneous bleeding (47.6%) versus 26.6% among
adults. Also intensive abdominal pain, effusion and ascites were predominant among children
compared to adults, a statistical significant difference between age-groups. Children had
higher frequency of primary infection (39.4%) versus 22% among the adult population, a
statistically significant difference.
The DENV serotypes were identified in 243 cases (53.8%) out of 452 patients tested by RT-
PCR. DENV-4 was the predominant serotype detected in 135 (55.7%) of the patients,
followed by DENV-1 in 91 (37.4%) of the cases. DENV-3 and DENV-2 were detected in 13
(5.3%), and in 4 (1.6%) patients, respectively (Table 3). All 9 severe dengue cases were
infected by DENV-1; comprising 5 males and 4 females, 7 to 57 years of age (median 43
years). Descriptive analyses by serotype showed similar age and gender distributions of the
patients infected between serotypes DENV-1 or DENV-4; the majority of patients were adults
and approximately half females. Each serotype included a large range of clinical forms and
biological variations (data not shown).
Patients with detectable DENV-1 serotype were more prone to present several clinical and
laboratory features compared to DENV-4: spontaneous bleeding (DENV-1: 33.0% versus
DENV-4: 20.0%; p=0.03), intense abdominal pain (DENV-1: 29.7% versus DENV-4: 14.1%;
p=0.004), neurological symptoms (DENV-1: 6.7% versus DENV-4: 2.2%; p=0.09) and
thrombocytopenia (DENV-1: 33.7% versus DENV-4: 18.2%; p=0.01). Immune status
measured by primary or secondary infections were available among 202 patients (DENV-1 or
DENV-4). Secondary infection was predominant among DENV-4 cases (80.0%) compared to
DENV-1 cases (62.3%) a statistically significant difference between subtypes (p=0.03).
Table 4 presents the results of multinomial analysis of the association between antibody
response pattern, serotype and severity of dengue disease taking into account dengue fever as
reference. In the univariate analysis, females had higher risk of having dengue with warning
signs (OR=2.12; 95% CI: 1.44-3.13; p<0.01) in comparison with the patients diagnosed as
dengue fever. Females classified as severe dengue did not differ from the reference (dengue
fever). Adult patients (≥15 years old) had an Odds Ratio of 0.53 (95% CI: 0.26-1.08;
p=0.082) compared to children with dengue fever. Comorbidity was not associated with
65
severity of the disease. Patients classified as dengue with warning signs and that mounted
secondary infection were not at risk (OR=1.03; 95% CI: 0.66-1.60; p=0.890) compared with
patients with dengue fever and primary infection. As well as, severe dengue cases with
secondary infection had an OR=2.63 (95%CI: 0.74-9.30; p=0.134). Results of DENV-1 and
DENV-4 were presented for dengue with warning signs versus dengue fever since few cases
of DENV-2 and DENV-3 were detected in our study. In the multinomial analysis severe
dengue cases with secondary infection had an adjusted OR= 2.80 (95% CI: 0.78-10.0;
p=0.113) compared to dengue fever with primary infection when adjusted by age and sex
(Table 5).
Discussion
Our results show differences in clinical features among dengue patients infected during a
large DENV4 outbreak in Central Brazil. Children presented higher frequencies of several
dengue warning signs of disease severity such as spontaneous bleeding, intensive abdominal
pain and neurological symptoms compared to adults. Secondary infection was more prone to
occur in the adult population however more than 60% of the children and almost 80% of the
adult patients had previously dengue infection pointing out the high DENV circulation in the
region. Few studies compared clinical features and laboratory abnormalities in the paediatric
age group with adults in Brazil [36,37]. In a study conducted in the same region in 2005
showed that secondary infection was not a predictor of severe clinical manifestation in adults
with infected with the DV3 serotype [21]
In a previous prospective clinical study conducted in the same city (Year 2000), we showed
that, mild cases of dengue were predominant among adults [21]. In our study, we classified
the majority of the paediatric and adults patients as dengue with warning signs, followed by
dengue and a few cases of severe dengue cases. This distribution reflects the clinical
characteristics of dengue patients the dengue treated at reference day clinics and hospitals
selected during 2012/2013 epidemic period. It does not resemble the entire dengue patients
since most of the cases are milder cases classified as dengue fever according to the
surveillance system (SINAN, 2012/2013).
66
It is important to note that all patients classified as severe dengue were infected with DENV-
1 and none with DENV-4. However, we are aware that our sample size regarding the severe
form of the disease is small to draw conclusion. Interestingly, the historical data described by
Hastead in the early decades of dengue epidemics regarding differences of clinical
manifestation in DENV-1 and DENV-4 serotypes in Southeast Asia describe similar feature
being DENV-1 more prone to cause severe cases compared to DENV-4[38]. In our study, we
found a high percentage of undetectable viremia among severe case. Dengue patients may
progress to severe disease during the defervescence period which is the period of the hospital
admission and recruiment that is beyond the viremic period [21]. We are aware that this could
represent a potential selection bias in the recruitment of severe cases.
One of the strength of this study was the recruitment of dengue patient approximately two
years after the introduction of DENV-4 serotype in Central Brazil. In this context, it is likely
that the majority of the population in the study area was naïve to DENV-4 that explains the
current outbreak with the predominance of DENV-4 circulation. In fact, DENV-4 had been
previously isolated in nine patients in the neighbouring State of Mato Grosso do Sul in 2012.
The authors had warned about the potential for outbreaks due to the introduction of DENV-4
serotype in susceptible population to this serotype in Central Brazil [38]. Another strength of
our study is that we recruited patients in several ambulatories and hospitals settings within the
region. However, our study population included only patients living in one city and the results
may not be generalizable to rural areas or other regions of the country. Comparison of
clinical manifestations, antibody response patterns and severity of the disease were restricted
to DENV-4 and DENV-1 serotypes since few patients had detectable DENV-2 or DENV-3
serotypes. These findings are concordant with the official laboratory system in charge for
DENV surveillance regionally. It is interesting that DENV-2 serotype had never been
predominantly registered by the viral surveillance in the last two decades in the study area
[35]. We are aware that according to the period that blood sample for serological tests (IgM
or IgG) were collected it may yield negative or positive results, which could lead to
misclassification for primary and secondary infections.
In summary, our present data shows incidence of severe dengue among paediatric and adults
patients in the first registered DENV-4 outbreak in Central Brazil. To our knowledge, this is
67
the first prospective clinical study to compare DENV-1 and DENV-4 patients regarding
antibody response pattern and severity of the disease. Our findings contributed for the
understanding of the clinical differences, immune status related to serotype DENV-1 and
DENV-4 in Central Brazil.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by ethics committee on research Aggeu Magalhães Research Center
(FIOCRUZ - PE) under no. 24/11 and review board of each institution. The inclusion was
after the signature of informed consent by the subject or a parent ⁄ guardians when necessary.
Consent for publication
Not applicable.
Availability of data and materials
The datasets during and/or analyzed during the current study available from the corresponding
author on reasonable request.
Competing interests
The authors declare no conflict of interests in this study.
Funding
This study was funded by National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq) and Foundation for the State of Goiás Research (FAPEG).
Authors’ contributions
68
BAMR conducted the exams of molecular biology, participated in the data analysis and wrote
the manuscript. AOG held the patients’ clinical classification and contributed to the
manuscript writing. AFLTA participated in data collection and assisted in the laboratory
exams. MT participated in data collection and conducted the patients’ clinical classification.
LAS coordinated fieldwork and assisted in the laboratory exams. ICJ participated in data
collection and performed the laboratory exams. MDT assisted in the patients’ clinical
classification and contributed to the manuscript writing. VCRF coordinated the study in the
regional level, assisted in data collection and the molecular biology exams. CMTM
contributed to the study design and the manuscript writing.
Acknowledgements
We would like to thank the collaboration of the State Health Department, the Municipal
Health Department of Goiania, and the cooperation of the employees from the health units
participating in the study. Investigators received partial support from the NationalAdvisory
Board of Scientifi c and Technological Development (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico [CNPq]; scholarship 306708/2014-0 to CMTM.
We thank the director and staff of the participating hospitals and the Secretariat of Health. We
thank the patients for their collaboration and generosity.
Abbreviations
ALT - Alanine Aminotransferase; AST – Aspartate Aminotransferase; CNS - Central
Nervous System; DENV - Virus Dengue; DF - Fever Dengue; DHF - Hemorrhagic Dengue
Fever; DwS - Dengue with warning signs; IBGE - Intituto Brasileiro de Geografia e
Estatística; SD - Severe Dengue; STATA - Data Analysis and Statistical Software; WHO -
World Health Organization.
Trial registration number
This study is not a Clinical Trial. It is a prospective observational study, so it was not
registered.
69
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73
Tables
Table 1. Clinical and epidemiological characteristics of 632 suspected dengue cases according to laboratory confirmation, recruited in Central Brazil, 2012 and 2013.
Characteristics Laboratory confirmeda
dengue cases (%) Unconfirmed
dengue cases (%) pb
Suspected cases dengue 452 (71.5) 180 (28.5) -
Mean age (dp) 35.7 (17.5) 34.8 (16.6) 0.546
Age group (years)
≤ 1 2 (0.4) 3 (1.7) 0.288
2 – 15 48 (10.6) 15 (8.3) 0.371
16– 39 233 (51.5) 100 (55.6) 0.320
40 – 59 118 (26.1) 44 (24.4) 0.629
≥ 60 51 (11.3) 18 (10.0) 0.619
Gender Female 235 (52.0) 88 (48.9) 0.481
Male 217 (48.0) 92 (51.1) 0.481
Health care settingc
Ambulatory 340 (75.2) 126 (70.0) 0.178
Hospital 112 (24.8) 54 (30.0) 0.178
Previous medical visit 142 (31.4) 64 (31.9) 0.316
Comorbidityd 115 (25.4) 48 (29.4) 0.751
Hypertension 82 (18.1) 30 (16.7) 0.661
Diabetes 25 (5.5) 11 (6.1) 0.776
Asthma 14 (3.1) 8 (4.4) 0.404
Chronic renal failure 8 (1.8) 2 (1.1) 0.549
Othersc 15 (3.3) 11(7.2) 0.669
Deaths 1 (0.2) 1 (0.6) 0.487 a laboratory confirmed dengue cases were positive by at least one of the test (RT-PCR and/or NS1 and/or IgM). b x2 test c considering 540 adult patient (≥ 18 years). d lupus erythematosus; cancer; AIDS; transplantation and hepatitis B or C
74
Table 2. Clinical and laboratory findings of confirmed dengue patients estratified by age-group
Features < 15 years N=42 (%)
≥ 15 years N=410 (%) p
a
Signs and symptoms reported or observed during recruitment
Age, years - median (min-max) 10.1 (0-14) 38.4 (15-83) -
Female sex 25 (59.5) 210 (51.2) 0.305
Days of illness - median (min-max) 4 (2-8) 5 (1-13) 0.535g
Headache 36 (85.7) 335 (81.7) 0.519
Prostration 41 (97.6) 373 (91.0) 0.139
Rash 29 (69.0) 269 (65.6) 0.654
Vomit 23 (54.8) 175 (42.7) 0.133
Signs and symptoms reported or observed during the course of the disease
Spontaneous bleeding 20 (47.6) 109 (26.6) 0.004
Gastrointestinal bleeding 3 (7.1) 22 (5.4) 0.631
Neurological alterations 1 (2.4) 24 (5.9) 0.346
Breathing difficulties 0 51 (12.4) 0.015
Icterus 1 (2.4) 17 (4.1) 0.576
Intense abdominal pain 12 (28.6) 66 (16.1) 0.042
Hepatomegaly 3 (11.1) 24 (5.9) 0.737
Effusions and Ascites 4 (9.5) 8 (2.0) 0.004
Main laboratory results during the course of the disease
Hemoconcentration b
12 (29.3) 77 (19.6) 0.146
Leukopenia (< 4000 cel/mL)c
20 (50.0) 230 (58.4) 0.223
Thrombocytopenia (< 100.000 cel/mL)d
9 (22.0) 123 (31.1) 0.307
AST (> 1000)e
0 0 -
ALT (> 1000)f
0 0 -
Clinical classification
Dengue Fever 12 (28.6) 176 (42.9) 0.075
Dengue with Warning Signs 27 (64.3) 211 (51.5) 0.103
Severe Dengue 3 (7.1) 23 (5.6) 0.307
Antibody response patternh
Primary 13 (39.4) 67 (22.7) 0.034
Secondary 20 (60.6) 228 (77.3) 0.034 a x
2 test
b 432 results available;
c 435 results available;
d 433 results available;
e 416 results available;
f 415 results available
Hemoconcentration (children > 44%, adult > 48%) g
Mann-Whitney Test h328 analyzed
73
Table 3. Clinical and epidemiological characteristics of 452 laboratory confirmed dengue cases, Central Brazil, 2012 and 2013.
Parameters
Dengue Fever
N=188 (%)
Dengue with Warning
Signs N=238
(%)
Severe Dengue
N=26 (%)
Gender Female 78 (41.5) 143 (60.1) 14 (53.8)
Age group (years)
<1 1 (0.5) 1 (0.5) 0
2 a 14 11 (5.8) 26 (10.9) 3 (11.5)
15 a 39 108 (57.5) 123 (51.6) 10 (38.5)
40 a 59 44 (23.4) 63 (26.5) 11 (42.3)
≥ 60 24 (12.8) 25 (10.5) 2 (7.7)
Comorbidity 46 (24.5) 60 (25.2) 9 (34.6)
Antibody response
pattern
Primary 38 (27.3) 40 (23.0) 2 (13.3)
Secondary 101 (72.7) 134 (77.0) 13 (86.7)
Serotypesa
DENV-1 35 (18.6) 47 (19.7) 9 (34.6)
DENV-2 2 (1.1) 2 (0.8) 0
DENV-3 3 (1,6) 10 (4.2) 0
DENV-4 63 (33.5) 72 (30.3) 0
Undetectable 75 (39.9) 98 (41.2) 15 (57.7)
Not done 10 (5.3) 9 (3.8) 2 (7.7)
aSerotypes determined by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
74
Table 4. Multinomial analysis of the association between antibody response pattern, serotype and severity of dengue disease as outcome.
Parameters Dengue Fever Dengue with Warning Signs Severe Dengue
N = 188 (%) N = 238 (%) OR (95% CI) p-value N = 26 (%) OR (95% CI) p-value
Gender
Female 78 (41.5) 143 (60.1) 2.12 (1.44 – 3.13) 0.000 14 (53.8) 1.64 (0.72 – 3.75) 0.236
Age group (years)
< 15 12 (6.4) 27 (11.3) Reference - 3 (11.5) Reference -
> 15 176 (93.6) 211 (88.7) 0.53 (0.26 – 1.08) 0.082 23 (88.5) 0.52 (0.14 – 1.99) 0.342
Comorbidity 46 (24.5) 60 (25.2) 1.04 (0.67 – 1.62) 0.860 9 (34.6) 1.63 (0.68 – 3.92) 0.271
Antibody response patterna
Primary 53 (28.2) 62 (26.1) Reference - 3 (11.5) Reference -
Secondary
121 (64.4) 146 (61.3) 1.03 (0,66 – 1.60) 0.890 18 (69.2) 2.63 (0.74 – 9.30) 0.134
Serotypeb
DENV-1 35 (19.7) 47 (19.7) Reference - 9 (34.6) NA -
DENV-4 63 (35.4) 72 (30.3) 0.85 (0.49 – 1.48) 0.568 0 NA -
NA: Not applicable
Reference for the multinomial analysis: dengue fever. a 49 patients not evaluated
bSerotypes determined by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and 226 patients not evaluated
74
Table 5. Multinomial analysis adjusted by age and sex of the association between antibody
response pattern, serotype and severity of dengue disease as outcome.
Parameters Dengue with Warning Signs Severe Dengue
ORAdj (95% CI) p-value ORAdj (95% CI) p-value
Comorbidity 1.20 (0.72 – 2.00) 0.479 1.74 (0.64 – 4.73) 0.279
Antibody response pattern
Primary Reference - Reference -
Secondary
1.20 (0.76 – 1.89) 0.433 2.80 (0.78 – 10.0) 0.113
Missing
1.93 (0.92 – 4.09) 0.083 6.23 (1.32 – 29.4) 0.021
Serotypea
DENV-1 Reference - NA -
DENV-4 0.80 (0.45 – 1.41) 0.444 NA -
Not evaluated 0.95 (0.56 – 1.62) 0.856 NA -
aSerotypes determined by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
75
Figures
Figure 1. Flowchart of suspected dengue cases recruited in the study.
76
Figure 2. Laboratory diagnosis of symptomatic dengue cases according to days between the
date sample collection and the onset of symptoms, outbreak 2012/2013 city of Goiania
Central Brazil.
1-3 days
Positive/tested (%)
4-7 days
Positive/tested (%)
> 7 days
Positive/tested (%)
NS1 103/255 (40.4) 103/322 (32.0) 12/47 (25.5)
RT-PCR 129/240 (53.8) 107/315 (34.0) 7/45 (15.6)
IgM 64/256 (25.0) 198/323 (61.3) 34/50 (68.0)
Total 176/258 (68.2) 240/324 (74.1) 36/50 (72.0)
77
Annex
Annex 1. Association between clinical or laboratory markers and dengue serotypes, Central Brazil, 2012 and 2013.
Parameters
Serotype
pa
DENV-1 DENV-4
N= 91(%) N=135 (%)
FD 35 (38.5) 63 (46.7) 0.22
DwS 47 (51.6) 72 (53.3) 0.80
SD 9 (9.9) 0 0.007
Mean age (dp) 36.4 (17.2) 35.7 (15.9) 0.78b
Hospitalized 11 (12.1) 19 (14.1) 0.666
Gender
Female 45 (49.5) 69 (51.1) 0.807
Type infectionc
Primary 29 (37.7) 25 (20.0) 0.003
Secondary 48 (62.3) 100 (80.0) 0.003
Neurological symptoms 6 (6.7) 3 (2.2) 0.09d
Intense abdominal pains 27 (29.7) 19 (14.1) 0.004
Hepatomegaly 5 (5.5) 4 (3.0) 0.34
Thrombocytopenia 29 (33.7) 24 (18.2) 0.01
Spontaneous bleeding 30 (33.0) 27 (20.0) 0.03
DENV-1 = Virus dengue 1 e DENV-4 = Virus dengue 4 a x2 Test b t-test c 202 case analized d
Fisher's exact test
FD = Fever Dengue DwS = Dengue with Warning Signs SD = Severe Dengue
78
Artigo 2
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DENGUE DURANTE EPIDEMIA DE
2012-2013 EM GOIÂNIA – GO.
Benigno A. M. Rocha, Valéria C. R. Féres, Adriana O. Guilarde, Lucimeire A. da Silveira,
Angela F. L. Argolo, Monica da Guarda, Celina M. T. Martelli.
RESUMO
Dengue é a arbovirose mais frequente no mundo. A infecção é causada por um Flavivírus,
genoma RNA, que compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1-4) e
diferentes linhagens agrupadas dentro de genótipos intratípicos. No Brasil a doença é
endêmica há quase três décadas com ocorrência de principais picos epidêmicos nos anos de
2002, 2008, 2010 e 2013. Entre os anos de 2010 e 2014 houve registro de 4,2 milhões de
casos de dengue correspondendo a mais de 60% dos casos notificados nas Américas e
circulação simultânea dos quatro sorotipos virais. Nesse sentido, estudos que contribuam para
o conhecimento dos sorotipos e das variantes virais de dengue circulantes tornam-se
essenciais para a compreensão dos padrões epidêmicos visando o monitoramento viral e
controle da doença. O presente estudo objetiva caracterizar molecularmente os sorotipos
virais circulantes na epidemia de 2012/2013 em Goiânia-GO. Pacientes ambulatoriais e
hospitalares avaliados clinicamente com coleta de amostra de sangue antes dos sete dias de
doença foram testados pela RT-PCR e selecionadas amostras para o sequenciamento. Dos 600
casos, 243 (40,5%) tiveram o RNA viral detectado. Foram identificados: DENV-1 (37,4%);
DENV-2 (1,6%), DENV-3 (5,3%) e DENV-4 (55,5%). A sequência completa do gene da
região do envelope do DENV-4 foi obtida (GOENVD42013) e o genótipo II identificado,
correspondendo ao genótipo isolado em outras regiões do Brasil. Neste estudo a co-circulação
dos quatros sorotipos virais foi evidenciada pela primeira vez no estado de Goiás. A
introdução do novo sorotipo DENV-4 na região esteve relacionada temporalmente com a
epidemia de dengue no ano de 2013.
79
INTRODUÇÃO
Dengue é a arbovirose mais frequente no mundo. Estima-se que 2,5 bilhões de pessoas
vivam em áreas endêmicas (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009) e a cada ano sejam
infectados cerca de 390 milhões de pessoas (BHATT et al., 2013). A infecção pode variar
desde uma febre indiferenciada a sintomas clássicos até formas graves com risco de morte
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
Os vírus dengue (DENV 1 a 4) são Flavivírus, família Flaviviridae, possuem genoma
RNA de fita simples positiva (11kb) envolto por um capsídeo icosaédrico e um envelope
lipídico (40-50nm). O genoma codifica uma poliproteína posteriormente clivada em três
proteínas estruturais (envelope (E), capsídeo (C) e membrana (M)) e sete não estruturais
(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Nas extremidades existem duas regiões não
codificantes denominadas: 5’ e 3’ com 96 e 454 aminoácidos respectivamente (CHAMBERS
et al., 1990; LINDENBACH; RICE, 1999).
No Brasil ocorreram quatro principais epidemias, 2002 (DENV-3), 2008 (DENV-2),
2010 (DENV-1) e 2013 (DENV-1 e 4). Neste período mais de 8,4 milhões de casos de dengue
foram registrados com 3.058 óbitos confirmados (TEIXEIRA et al., 2013). Entre os anos de
2010 e 2014 houve registro de 4,2 milhões de casos de dengue no Brasil, correspondendo a
mais de 60% dos casos notificados nas Américas (BRASIL, 2014c; PAHO, 2015). Os quatro
sorotipos co-circulam desde 2010, ano de re-introdução do DENV-4 no estado de Roraima
(TEMPORAO et al., 2011). Em 2013, todas as 27 unidades federadas notificaram casos de
dengue durante a maior epidemia registrada no país. Cerca de 1,4 milhão de casos foram
registrados com 213 óbitos sendo o DENV-4 o sorotipo prevalente, seguido do DENV-1
(BRASIL, 2015).
Em Goiás, nos últimos cinco anos houve notificação de 472.186 casos suspeitos de
dengue e 367 óbitos. Representando, em média, cerca de 10% dos casos registrados do país.
A menor incidência de casos de dengue observada no período foi de 398,3/100.000 hab. no
ano de 2012 e atingiu 2.233,6/100.000 hab. em 2013. Esse período foi marcado pela re-
emergência do DENV-1 precedendo a epidemia de 2010 e entrada do sorotipo DENV-4
(2011), culminando com a epidemia de 2013 (BRASIL, 2015; GOIÁS, 2013, 2015).
80
A variabilidade genética dos vírus dengue tem sido avaliada por estudos filogenéticos
que determinaram variantes virais em cada sorotipo denominados genótipos (CHEN;
VASILAKIS, 2011; GONCALVEZ et al., 2002a; LANCIOTTI et al., 1994; LEITMEYER et
al., 1999b; RICO-HESSE, 1990a; TWIDDY et al., 2002b). A existência de diferentes
linhagens geográficas temporalmente relacionadas tem sido sugerida nesses estudos e
identificam sequências de isolados de vírus agrupados dentro dos genótipos (MENDEZ et al.,
2010).
Esses estudos têm demonstrado a existência de quatro a cinco genótipos dentro de
cada um dos quatro sorotipos. Cinco (I-V) genótipos foram caracterizados no DENV-1, sendo
que no Brasil foi detectado o genótipo V (América e África), mas com múltiplas linhagens
descritas (AZEVEDO, 2011; CARNEIRO et al., 2012b; GONCALVEZ et al., 2002a). O
DENV – 2 tem seis genótipos (asiático I, asiático II, asiático-americano, cosmopolita e
americano, e silvestre) (AÑEZ; MORALES-BETOULLE; RIOS, 2011; TWIDDY;
HOLMES; RAMBAUT, 2003). Com circulação de dois genótipos no Brasil: o genótipo
asiático e o genótipo asiático-americano (MIAGOSTOVICH et al., 1998; ROMANO et al.,
2010; SOUSA, 2014). O sorotipo DENV-3 possui cinco genótipos (I-V) (WEAVER;
VASILAKIS, 2009) com a circulação do genótipo III (Sri Lanka, Índia, África e Samoa) no
Brasil (AQUINO et al., 2006; DE ARAÚJO et al., 2012; LANCIOTTI et al., 1994; RIBEIRO
NOGUEIRA et al., 2005; WITTKE et al., 2002b). O DENV – 4 (genótipos I, II, III e
silvestre) (KLUNGTHONG et al., 2004; LANCIOTTI; GUBLER; TRENT, 1997; WEAVER;
VASILAKIS, 2009) foi identificado no Brasil em um surto em Roraima em 1981 com a
circulação do genótipo I (NUNES et al., 2012; OSANAI et al., 1983). Em 2010 os estudos
identificaram o genótipo II (BRASIL, 2011; NUNES et al., 2012; SOUSA, 2014;
TEMPORAO et al., 2011).
Nesse sentido, estudos que contribuam para o conhecimento da circulação de sorotipos
e das variantes virais de dengue, bem como para o monitoramento da introdução de novos
genótipos tornam-se essenciais para a compreensão dos padrões epidêmicos visando o
controle da doença (KLUNGTHONG et al., 2004; WEAVER; VASILAKIS, 2009).
Poucos são os estudos moleculares que avaliaram as variantes virais circulantes em
Goiás. Diante do cenário epidemiológico atual, esses estudos constituem papel relevante para
vigilância viral da dengue na compreensão do padrão epidemiológico observado
regionalmente.
81
Portanto, estudo tem como objetivo caracterizar molecularmente os sorotipos virais
circulante na epidemia de 2012/ 2013 em Goiânia – GO, Brasil.
MATERIAIS E MÉTODOS
Delineamento e população de estudo
O estudo foi conduzido no município de Goiânia-GO (1.412.364 habitantes) (IBGE, 2015)
situado na região Centro - Oeste do Brasil, no período de 1º janeiro de 2012 a 31 de julho de
2013. Pacientes com suspeita clínica de dengue foram recrutados em oito unidades públicas e
privadas, ambulatoriais e hospitalares de referência para o atendimento de casos de dengue.
Foram incluídos no estudo os pacientes que consentiram em participar da pesquisa, eram
residentes em Goiânia-GO e assinaram (ou seus representantes legais) o termo de
consentimento informado. Estes foram avaliados clinicamente segundo classificação do
Ministério da Saúde (BRASIL, 2014d) e tiveram amostra de sangue coletada na fase aguda da
doença (<= 7 dias do início dos sintomas) para a realização de sorotipagem viral. A partir da
identificação do sorotipo foram selecionadas amostras para caracterização genética.
Aspectos éticos
Este estudo faz parte de um projeto multicêntrico intitulado “Imunopatogenia da infecção do
dengue: determinantes genéticos virais e dos hospedeiros (humano e vetor) associados à
patogenia do dengue” e foi aprovado pelo comitê de éticas em pesquisa Centro de Pesquisa
Aggeu Magalhães (FIOCRUZ – PE) sob o n. 24/11. Essa pesquisa seguiu as resoluções do
Conselho Nacional de Saúde 196/ 1996 e 466/ 2012.
Procedimentos laboratoriais
As amostras de sangue coletadas nas unidades de saúde foram processadas para a separação
do soro e transportadas em gelo seco, sob condições de biossegurança, e crioconservadas à -
80ºC até o momento da realização dos testes. A transcriptase reversa seguida da reação em
cadeia da polimerase (RT-PCR) e reação de seqüenciamento foram realizados no Laboratório
82
de Biologia Molecular e Imunologia das Doenças Infecciosas do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública - UFG.
RT-PCR para sorotipagem viral
Extração do RNA: o RNA viral foi extraído em duplicata a partir de 140 µL de soro, por meio
da utilização do kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA). O RNA
foi eluído em 60µL de tampão de eluição, de acordo com as instruções do fabricante.
Tipagem Viral: a obtenção do cDNA foi realizada por transcrição reversa à 40oC por 60 min
usando 10 uL de RNA viral e 10 uL da mistura reagente contendo primer randômico e
50U/uL da transcriptase reversa (MultiscribeTM
, Appllied Biosystems, US). A amplificação
dos fragmentos requeridos foi procedida em duas etapas: primeiramente, foram utilizados
iniciadores consensuais (D1 e D2) para os quatro sorotipos dos DENV, complementares as
sequências dos genes que codificam as proteínas C e prM. A mistura de reação consistiu de
2X PCR Master Mix (Promega, US), cada primer a 0,5 µM (Invitrogen, US) e água livre de
RNAse e DNAse completando um volume final de 45µl, seguido de 40 ciclos de amplificação
de 94oC por 30 seg, 58
oC por 1 min, 72
oC por 2 min e extensão final a 72
oC de 10 min. Para
amplificação foi utilizando o termociclador SwiftTM
Maxi Thermal Cycler (Esco
Technologies, US). No procedimento semi-nested, foram utilizados iniciadores específicos
TS1, TS2, TS3 e TS4 gerando produtos amplificados (amplicons) com tamanhos específicos
(pb) para detecção dos DENV-1 a 4, respectivamente, segundo o protocolo descrito por
Lanciotti et al. (1992). Os produtos de PCR adicionados ao Gel Red (Biotium, BRA) e padrão
de peso molecular 100 bp (Invitrogen, US), foram submetidos à eletroforese com gel de
agarose 1,2% e visualizados em transluminador UV (Major Science, US).
Genotipagem viral
Iniciadores: para a amplificação do gene do envelope foram utilizados os oligonucleotídeos
descritos nas publicações de Araújo et.al. (2012) e representados na tabela 1.
83
Tabela 1 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope do DENV-4
Região Primer sense A Primer antisense B Posição do
genoma
Produto Tm
(ºC)
(5’-3’) (5’-3’) (de acordo
com
JN559741.2)
(pb)
A/B
1 TCC AAA TCG
GAA GCT TGC TT
GAC CCA TGC TCC
ACC TGA GA 11 - 978 967 59/60
2
GGA AGC ATG
CTC AGA GAG
TAG AGA
ATC CCA GCA CTG
TCA CAT CCT 767 - 1678 911 58/58
3
GTC ACC ATC
GGT TGA AGT
CAA A
GCA CGT CAT GGC
CAT TGA 1416 - 2352 936 59/59
4 TCA TTG GGA
AAG GCT GTG C
CCA TGG ACC CAC
GGT TTG 2206 - 3187 981 58/59
5
GTG TGT GAC
CAC AGG CTG
ATG
CCT CA AGC CAT
GAC CAA TG 2932 - 3932 1000 59/60
Reação em cadeia da polimerase RT-PCR: em um tubo tipo eppendorf adicionamos 27,5μL
de água livre de nucleases (Promega, Madison, EUA), 2,5 μL (500 nM) do iniciador sense
(Invitrogen, EUA), 2,5 μL (500 nM) do iniciador antisense (Invitrogen, EUA) e 12,5μL do
Acessquick Master Mix (2x) (Promega, Madison, EUA). À mistura foram adicionados 5μL de
cDNA. A amplificação foi realizada em 30 ciclos de desnaturação 94°C por 30 segundos,
54°C / 62°C por 1 minuto (dependendo do par de iniciadores utilizado) e 72°C por 2 minutos,
com uma extensão final a 72°C por 10 minutos utilizando termociclador SwiftTM Maxi
Thermal Cycler (Esco Technologies, US). Os produtos amplificados foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose (BioAmerica Inc., Miami, USA – cat nº D1500 – LE) a 1% em
TBE 0,5X, por 60 minutos a 100V.
Purificação: a purificação foi feita diretamente do produto da PCR usando o “kit comercial
PCR Purification” (Qiagen, Inc., Valencia, CA) segundo protocolo do fabricante. O DNA
purificado foi armazenado a -20 ºC até o momento do uso.
Quantificação do DNA: para quantificar o DNA presente em cada amostra determinar a
quantidade ideal de DNA a ser adicionada a reação de PCR de seqüenciamento, em um gel de
agarose a 2% aplicamos 4 µL de peso molecular de massa Low DNA Mass (Invitrogen,
Carlsbad, CA) no primeiro orifício do gel e 4 µL do DNA a ser quantificado nos demais
orifícios, juntamente com 2 µL de GelRed e 2 µL de sacarose. O procedimento teve duração
84
de 60 minutos a 100v. A concentração do DNA foi estimada por meio da comparação dos
amplicons com o peso molecular de massa.
Reação de seqüenciamento: 2-8 µL do DNA (20-200 ng) foi sequenciado diretamente em
ambas as direções usando 2µL de Big DyeTerminator Cicle Sequencing Randy (Applied
Biosystems, Foster City, CA), 2 µL do primer específico, e água para completar um volume
de 10 µl (Sanger et al, 1997). Submetemos a mistura à seguinte condição de termociclagem:
30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 30 ciclos de 2 minutos com a TM específica do primer
utilizado e 30 ciclos de 3 minutos a 72 ºC, utilizando termociclador SwiftTM Maxi Thermal
Cycler (Esco Technologies, US).
Purificação para remoção de DyeTerminators
Precipitação com isopropanol: foi adicionado 60 uL de Isopropanol a 65% ao produto do
sequenciamento, homogeneizado e deixado em repouso ao abrigo da luz por 20 minutos. Em
seguida centrifugamos (Centrífuga Refrigerada Eppendorf de Placas 5804R, Germany) por 45
minutos à 2000 rcf a 20º C e descartado o sobrenadante por inversão. Foi adicionado 250 uL
de etanol 60%, centrifugado por 10 minutos a 2000 rcf a 20 ºC e novamente descartado o
sobrenadante. Depois lavamos com 100 uL de etanol a 60% com centrifugação por 10
minutos a 2000 rcf a 20º C. Última centrifugação por 1 minuto a 500 rpm com placa invertida
sobre papel absorvente, vedada com papel alumínio para secagem no termociclador a 95º C
por 2 minutos.
Desnaturação: foi adicionado 10µL de formamida Hi-Di (Applied Biosystems, P/N 4311320)
à placa com o material seqüenciado e purificado, aquecido por 2 minutos a 95ºC no
termociclador e mantido no banho de gelo até que os 10µL tenham sido aplicados na placa do
sequenciador automático sequenciador automático ABI 3130 - Applied Biosystems.
Análise filogenética
Para análise filogenética utilizamos sequências protótipo representativas dos genótipos GEN
I, GEN II, GEN III e GEN Silvestre do DENV-4 e cepas representativas de outros estados
brasileiros disponíveis no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Um banco de sequências do gene do envelope ou sequência completa do vírus representativas
do genótipo DENV-4 foi constituído segundo ano de isolamento e local de origem (tabela 3),
85
como raiz usamos o DENV-3 (GQ398256). Foram excluídas todas as sequências descritas
como clones e sequências previamente de isolamento com mais de 2 passagens.
As sequências foram submetidas ao BLAST (Basic Local Alignment Search Tool/NCBI
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para verificar a similaridade com as sequências de
DENV-4. O alinhamento das sequências obtidas e das sequências selecionadas para
comparação foi realizado pelo Clustal W, incluído no programa Molecular Evolutionary
Genetics Analysis - MEGA versão 6.06 (http://www.megasoftware.net/), onde, também,
analisamos o percentual de identidade entre as sequências e construímos a árvore filogenética,
por meio dos métodos Neighbor Joining e Tamura Nei e bootstrap de 1000 replicações. Para
permitir o enraizamento da árvore foi colocada uma sequência de DENV-3 como grupo
externo no banco.
RESULTADOS
O presente estudo abrangeu os meses de ocorrência de epidemia de dengue nos anos de 2012
e 2013. Foi realizado o exame de RT-PCR em amostras de 600 pacientes com suspeita de
dengue foram recrutados nas unidades de saúde de Goiânia-GO. A razão de sexo
homem:mulher foi de 1.03:1 e a média de idade de 35,2 anos (0 – 83). A maioria dos casos
foram ambulatoriais 440 (73,3%), sendo 160 (26,7%) hospitalizados. A confirmação de
infecção pelos vírus dengue pela presença de RNA viral ocorreu em 243 (40,5%) dos 600
testados pela RT-PCR. A positividade foi significantemente diferente entre os anos variando
de 22,6% (24/106) em 2012 a 44,3 (219/294) em 2013 (p<0,001).
Os quatro sorotipos foram identificados nos dois anos de estudo (Figura 1). DENV-1
91(37,4%), DENV-2, 2(1,6%), DENV-3, 13(5,3%) e o DENV-4 em 135 (55,5%) dos
pacientes.
86
DENV-1 DENV-4 DENV-3 DENV-1 Pares de bases
100
200
300
400
Figura 1. Eletroforese em gel de agarose de produtos amplificados pela transcrição reversa
seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para a tipagem dos vírus dengue em
amostras de pacientes de Goiânia 2012/2013.
A figura 2 mostra a circulação concomitante dos quatro sorotipos e a ocorrência por mês nos
anos de estudo. Todos os sorotipos foram identificados nos dois anos de estudo, sendo o
DENV-1 e o DENV-4 com maior frequência. O DENV-1, 11 (45,8%) casos em 2012 e 80
(36,5%) em 2013. DENV-4, detectado 10 (41,7%) casos em 2012 e 125 (57,1%) em 2013
(125 casos). Os quatro casos de DENV-2 foram distribuídos entre os dois anos, um em 2012 e
três em 2013, respectivamente e para o DENV-3 dois casos (8,3%) foram detectados em 2012
e 11 (5,0%) em 2013. O maior percentual de detecção ocorreu entre os dias 1 e 3 dias de
doença 129/240 (53,8%) e após o quarto dia de doença foi identificado o RNA viral em
114/360 (31,7%) pacientes.
87
Figura 2. Distribuição, por mês e ano, dos sorotipos de dengue identificados em amostras de
pacientes, durante a epidemia de 2012/ 2013, em Goiânia – GO, Brasil.
Reconstrução Filogenética do DENV-4
Das cinco amostras de DENV-4 submetidas ao sequenciamento, uma teve a sequência do
gene do envelope completa. A análise desta foi realizada no programa Mega 6.06, usando o
método de inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo de substituição de nucleotídeo
Tamura-Nei e bootstrapde 1000 replicações. Para a caracterização do genótipo foram usadas
sequências do gene E do sorotipo 4 obtidas no GenBank (Figura 3). As seqüências
nucleotídicas foram submetidas ao programa Blast e apresentaram 98% de com cepas isoladas
nos anos de 2010 e 2011 nas regiões Norte e Sudeste do Brasil. Após a construção da árvore
filogenética a amostra do nosso estudo (GOENVD42013) alinhou-se com o genótipo II
(Figura 3).
88
Figura 3. Árvore filogenética para caracterização genética do DENV-4 obtido de amostra de
paciente da epidemia 2013 em Goiânia-GO, Brasil pelo método de Neighbor-Joining.
DISCUSSÃO
Estudos epidemiológicos têm mostrado a emergência de novos sorotipos que antecederam
grandes epidemias. Em Goiás, o DENV-1 foi o sorotipo prevalente nas epidemias desde sua
introdução em 1994 até 2002, quando houve substituição pelo DENV-3 repercutindo na
epidemia de 2003 (FERES et al., 2006; MACIEL; SIQUEIRA JÚNIOR; TURCHI
MARTELLI, 2008; SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). No período de 2003 a 2007 observou-
se a intensificação da interiorização da dengue em Goiás com predomínio do DENV-3
(BRASIL, 2008; MACIEL; SIQUEIRA JÚNIOR; TURCHI MARTELLI, 2008). O DENV-2,
detectado em 1998 (SIQUEIRA et al., 2004), diferentemente de outros estados no Brasil,
manteve circulação nos anos seguintes sem apresentar-se como sorotipo predominante dentre
os isolados no laboratório de referência no estado (Lacen-GO/SES). Em 2008, o predomínio
dos isolados durante a epidemia foi o DENV-3 (GOIÂNIA, 2015). A partir de 2009 houve
recirculação importante do DENV-1 e alta transmissão da doença, culminando com a
epidemia de 2010 (BRASIL, 2008; SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). O DENV-4 foi
89
detectado em Goiás no final de 2011 e, em 2013 foi o sorotipo prevalente (~60%), seguido do
DENV-1 (GOIÁS, 2013).
O clima tropical com altas temperaturas e o período chuvoso entre novembro e março
favorecem a proliferação do mosquito Aedes e, consequentemente a maior transmissão do
vírus da dengue nesse período (BARRETO; TEIXEIRA, 2008). O presente estudo foi
realizado nos meses de epidemia, janeiro a junho dos anos de 2012 e 2013 e mostra a co-
circulação dos quatro sorotipos virais em Goiás. O DENV-4 (55,1%) foi o sorotipo detectado
com maior frequência na maior epidemia registrada na região (ano 2013), à semelhança do
ocorrido no Brasil (AMÂNCIO et al., 2014; BRAGA et al., 2014; BRASIL, 2015). O DENV-
1 foi o sorotipo mais frequente na epidemia de 2010 e ainda persiste circulando em alta
frequência em 2012 e 2013 (GOIÁS, 2015; SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). Nesse estudo o
DENV-1 representou (37,4%) em 2012 e (36,5%) 2013 confirmando a eficiência de
transmissão desse sorotipo observada em dados epidemiológicos (BRASIL, 2015). A
introdução do DENV-4 (2011) encontrou condições para sua transmissão em população
suscetível repercutindo na alta incidência de casos na epidemia de 2013 (GOIÁS, 2015).
DENV-3 e DENV-2 permanecem co-circulando na região em menor frequência de casos nos
anos do estudo. Estes resultados estão em consonância com os dados epidemiológicos
registrados em Goiás (GOIÂNIA, 2015).
A positividade de 40,5% para o RNA viral detectada nesse estudo está dentro da média de
detecção observada em outros estudos que utilizaram também esta metodologia de detecção,
onde são observados índices de 20,5% (GUIMARÃES, 2014), 25,3% (FERES, 2008), 31,4%
(MISHRA et al., 2014), de 45,7% (NOGUEIRA, 2005) e de 42,5% (CORDEIRO, 2010). O
maior percentual de detecção ocorreu no período de viremia, entre os dias 1 e 3 dias de
doença 129/240 (53,8%), entretanto a sensibilidade da técnica permitiu identificar 114/360
(31,7%) após o quarto dia de doença. Durante a viremia é esperado uma maior positividade
dos testes de biologia molecular para dengue (PEELING et al., 2010; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009) e estudos vêm demonstrando isso (DA COSTA; FAÇANHA, 2011;
GROBUSCH et al., 2006).
A sensibilidade de detecção de RNA viral pela RT-PCR foi amplamente discutida de
diferentes estudos mostrando que os testes moleculares tornaram-se ferramentas importantes
para o diagnóstico e identificação dos sorotipos virais da dengue de forma mais rápida diante
90
de outros testes virológicos, mas não moleculares, como o isolamento viral
(KUMARASAMY et al., 2007a; POLONI, 2009; SHU; HUANG, 2004b).
A caracterização genética da região do envelope do genoma do DENV-4 evidenciou que a
cepa circulante em Goiânia-GO no período 2013 pertence ao genótipo II. O mesmo genótipo
foi encontrado em espécimes biológicas oriundas das regiões Norte, Nordeste e Sudeste
brasileiro (DE SOUZA et al., 2011; NUNES et al., 2012; SOUSA, 2014; TEMPORAO et al.,
2011). A sequencia alinhou-se com outras sequências depositadas no GenBank oriundas da
Venezuela e dos estados brasileiros de Roraima, Amazonas, Pará e São Paulo, com uma
identidade de 98%. Estudo realizado em Goiânia – GO por (GUIMARÃES, 2014), também
mostrou alta similaridade com a cepa de Roraima, Brasil, 2010.
Originário da Indonésia, o DENV – 4 entrou no continente americano e se espalhou para o
Caribe em 1981(KLUNGTHONG et al., 2004; LANCIOTTI; GUBLER; TRENT, 1997;
WEAVER; VASILAKIS, 2009). À época foram identificados dois genótipos I (Tailândia,
Filipinas, Sri Lanka e Japão) e II (Indonésia, Malásia, Taiti, Caribe e América), sendo o
primeiro constituído por cepas do sudeste asiático e Pacífico e o segundo por cepas do
continente americano (LANCIOTTI; GUBLER; TRENT, 1997). Neste mesmo ano foi
identificado no Brasil em um surto em Roraima, com a circulação do genótipo I (NUNES et
al., 2012; OSANAI et al., 1983). Após 28 anos, o DENV-4 re-emergiu em Roraima e se
dispersou para o resto do país, sendo o principal sorotipo circulante, com o predomínio do
genótipo II (BRASIL, 2011; NUNES et al., 2012; SOUSA, 2014; TEMPORAO et al., 2011).
A co-circulação dos quatro sorotipos do vírus dengue numa mesma região do país é mais
comum em países do Sudeste Asiático e América Central (HALSTEAD, 2006; OOI; GOH;
GUBLER, 2006). À exemplo do Sudeste asiático as epidemias ocorrem de longa data e a re-
infecção por diferente sorotipo é encontrada em maior frequência, assim como um grande
número de casos de dengue grave (HALSTEAD, 2006; OOI; GUBLER, 2009).
No Brasil a circulação simultânia dos quatro sorotipos e a alta incidência da doença relatadas
na última década pode ser a responsável pela ocorrência de formas graves e hospitalizações de
pacientes com dengue (TEIXEIRA et al., 2013).
Neste estudo a co-circulação dos quatros sorotipos virais foi evidenciada pela primeira vez no
estado de Goiás. O genótipo II do DENV-4 foi identificado e mostrou que a introdução deste
91
novo sorotipo na região esteve relacionada temporalmente com a epidemia de dengue no ano
de 2013.
92
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109
6 DISCUSSÃO
Nossos resultados mostram diferenças em características clínicas entre pacientes com dengue
infectados com DENV-4 sorotipos DENV-1 ou durante um grande surto no Brasil Central. As
crianças apresentaram maiores freqüências de vários sinais de alerta de dengue de gravidade
da doença, tais como hemorragia espontânea, dor abdominal intensa e sintomas neurológicos
em comparação com adultos. A infecção secundária era mais propenso a ocorrer na população
adulta, no entanto, mais do que 60% das crianças e quase 80% dos pacientes adultos tinham
anteriormente infecção por dengue que ponta uma circulação de DENV na região. Poucos
estudos compararam as características clínicas e alterações laboratoriais na faixa etária
pediátrica com adultos no Brasil (BRITO, 2007; ESCOSTEGUY et al., 2013).
Em um estudo clínico prospectivo anterior realizado na mesma cidade (2000), mostrou que,
casos leves de dengue foram predominantes entre os adultos (GUILARDE et al., 2008). Em
nosso estudo, classificou a maioria dos pacientes pediátricos e adultos como Dengue com
sinais de alerta, seguido de alguns casos de dengue grave. Esta distribuição reflete as
características clínicas de pacientes com dengue tratados em clínicas dia e hospitais de
referência selecionados durante o período da epidemia 2012/2013. Ele não se parece com os
pacientes de dengue completo já que a maioria dos casos classificados como dengue, de
acordo com o sistema de vigilância, são mais leves (SINAN, 2012/2013).
É importante observar que todos os pacientes classificados como dengue grave foram
infectadas com DENV-1 e nenhum com DENV-4. No entanto, estamos conscientes de que o
tamanho da amostra em relação à forma grave da doença é pequena para tirar conclusões.
Curiosamente, os dados históricos descritos por Hastead nas primeiras décadas de epidemias
de dengue mostra relação de diferenças de manifestação clínica entre os sorotipos DENV-1 e
DENV-4, no Sudeste Asiático, onde o DENV-1 foi mais propenso para causar casos graves
em comparação com DENV-4 (NISHIURA; HALSTEAD, 2007). As diferenças na
severidade por ano de estudo pode sugerir que outros fatores além do sorotipo desempenham
um papel na gravidade da doença.
110
Uma das forças do presente estudo foi o recrutamento de paciente dengue cerca de dois anos
após a introdução deste serotipo no Brasil Central. Neste contexto, é provável que a maioria
da população na área de estudo era susceptível ao DENV-4 o que explica o surto corrente com
a predominância da circulação do DENV-4. Na verdade, DENV-4 foi previamente isolada em
nove pacientes no Estado vizinho de Mato Grosso do Sul em 2012. Os autores havia alertado
sobre a possibilidade de surtos devido à introdução deste sorotipo nas populações suscetíveis
a ele (BERTOLACCI-ROCHA et al., 2014). Outro ponto forte do nosso estudo é que os
pacientes recrutados em diversos ambulatórios e hospitais de referência para atendimento de
casos de dengue da região. No entanto, a nossa população do estudo incluiu apenas os
pacientes que vivem em zona urbana e os resultados não podem ser generalizados para áreas
rurais ou em outras regiões do país. Comparação das manifestações clínicas, os padrões de
resposta de anticorpo e a gravidade da doença foram restritas aos sorotipos DENV-4 e
DENV-1. Alguns pacientes tiveram os sorotipos DENV-2 ou DENV-3 detectados. Estes
resultados são concordantes com o sistema de vigilância laboratorial. É interessante que o
sorotipo DENV-2 nunca foi predominantemente registrado pela vigilância viral nas duas
últimas décadas na área de estudo (FERES et al., 2006).
Estudos epidemiológicos têm mostrado a emergência de novos sorotipos que antecederam
grandes epidemias. Em Goiás, o DENV-1 foi o sorotipo prevalente nas epidemias desde sua
introdução em 1994 até 2002, quando houve substituição pelo DENV-3 repercutindo na
epidemia de 2003 (FERES et al., 2006; MACIEL; SIQUEIRA JÚNIOR; TURCHI
MARTELLI, 2008; SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). No período de 2003 a 2007 observou-
se a intensificação da interiorização da dengue em Goiás com predomínio do DENV-3
(BRASIL, 2008; MACIEL; SIQUEIRA JÚNIOR; TURCHI MARTELLI, 2008). O DENV-2,
detectado em 1998 (SIQUEIRA et al., 2004), diferentemente de outros estados no Brasil,
manteve circulação nos anos seguintes sem apresentar-se como sorotipo predominante dentre
os isolados no laboratório de referência no estado (Lacen-GO/SES). Em 2008, o predomínio
dos isolados durante a epidemia foi o DENV-3 (GOIÂNIA, 2015). A partir de 2009 houve
recirculação importante do DENV-1 e alta transmissão da doença, culminando com a
epidemia de 2010 (BRASIL, 2008; SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). O DENV-4 foi
detectado em Goiás no final de 2011 e, em 2013 foi o sorotipo prevalente (~60%), seguido do
DENV-1 (GOIÁS, 2013).
111
O clima tropical com altas temperaturas e o período chuvoso entre novembro e março
favorecem a proliferação do mosquito Aedes e, consequentemente a maior transmissão do
vírus da dengue nesse período (BARRETO; TEIXEIRA, 2008). O presente estudo foi
realizado nos meses de epidemia, janeiro a junho dos anos de 2012 e 2013 e mostra a co-
circulação dos quatro sorotipos virais em Goiás. O DENV-4 (55,1%) foi o sorotipo detectado
com maior frequência na maior epidemia registrada na região (ano 2013), à semelhança do
ocorrido no Brasil (AMÂNCIO et al., 2014; BRAGA et al., 2014; BRASIL, 2015). O DENV-
1 foi o sorotipo mais frequente na epidemia de 2010 e ainda persiste circulando em alta
frequência em 2012 e 2013 (GOIÁS, 2015; SIQUEIRA JUNIOR et al., 2011). Nesse estudo o
DENV-1 representou (37,4%) em 2012 e (36,5%) 2013 confirmando a eficiência de
transmissão desse sorotipo observada em dados epidemiológicos (BRASIL, 2015). A
introdução do DENV-4 (2011) encontrou condições para sua transmissão em população
suscetível repercutindo na alta incidência de casos na epidemia de 2013 (GOIÁS, 2015).
DENV-3 e DENV-2 permanecem co-circulando na região em menor frequência de casos nos
anos do estudo. Estes resultados estão em consonância com os dados epidemiológicos
registrados em Goiás (GOIÂNIA, 2015).
A positividade de 40,5% para o RNA viral detectada nesse estudo está dentro da média de
detecção observada em outros estudos que utilizaram também esta metodologia de detecção,
onde são observados índices de 20,5% (GUIMARÃES, 2014), 25,3% (FERES, 2008), 31,4%
(MISHRA et al., 2014), de 45,7% (NOGUEIRA, 2005) e de 42,5% (CORDEIRO, 2010). O
maior percentual de detecção ocorreu no período de viremia, entre os dias 1 e 3 dias de
doença 129/240 (53,8%), entretanto a sensibilidade da técnica permitiu identificar 114/360
(31,7%) após o quarto dia de doença. Durante a viremia é esperado uma maior positividade
dos testes de biologia molecular para dengue (PEELING et al., 2010; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009) e estudos vêm demonstrando isso (DA COSTA; FAÇANHA, 2011;
GROBUSCH et al., 2006).
A sensibilidade de detecção de RNA viral pela RT-PCR foi amplamente discutida de
diferentes estudos mostrando que os testes moleculares tornaram-se ferramentas importantes
para o diagnóstico e identificação dos sorotipos virais da dengue de forma mais rápida diante
de outros testes virológicos, mas não moleculares, como o isolamento viral
(KUMARASAMY et al., 2007a; POLONI, 2009; SHU; HUANG, 2004b).
112
A caracterização genética da região do envelope do genoma do DENV-4 evidenciou que a
cepa circulante em Goiânia-GO no período 2013 pertence ao genótipo II. O mesmo genótipo
foi encontrado em espécimes biológicas oriundas das regiões Norte, Nordeste e Sudeste
brasileiro (DE SOUZA et al., 2011; NUNES et al., 2012; SOUSA, 2014; TEMPORAO et al.,
2011). A sequencia alinhou-se com outras sequências depositadas no GenBank oriundas da
Venezuela e dos estados brasileiros de Roraima, Amazonas, Pará e São Paulo, com uma
identidade de 98%. Estudo realizado em Goiânia – GO por (GUIMARÃES, 2014), também
mostrou alta similaridade com a cepa de Roraima, Brasil, 2010.
Originário da Indonésia, o DENV – 4 entrou no continente americano e se espalhou para o
Caribe em 1981(KLUNGTHONG et al., 2004; LANCIOTTI; GUBLER; TRENT, 1997;
WEAVER; VASILAKIS, 2009). À época foram identificados dois genótipos I (Tailândia,
Filipinas, Sri Lanka e Japão) e II (Indonésia, Malásia, Taiti, Caribe e América), sendo o
primeiro constituído por cepas do sudeste asiático e Pacífico e o segundo por cepas do
continente americano (LANCIOTTI; GUBLER; TRENT, 1997). Neste mesmo ano foi
identificado no Brasil em um surto em Roraima, com a circulação do genótipo I (NUNES et
al., 2012; OSANAI et al., 1983). Após 28 anos, o DENV-4 re-emergiu em Roraima e se
dispersou para o resto do país, sendo o principal sorotipo circulante, com o predomínio do
genótipo II (BRASIL, 2011; NUNES et al., 2012; SOUSA, 2014; TEMPORAO et al., 2011).
A co-circulação dos quatro sorotipos do vírus dengue numa mesma região do país é mais
comum em países do Sudeste Asiático e América Central (HALSTEAD, 2006; OOI; GOH;
GUBLER, 2006). À exemplo do Sudeste asiático as epidemias ocorrem de longa data e a re-
infecção por diferente sorotipo é encontrada em maior frequência, assim como um grande
número de casos de dengue grave (HALSTEAD, 2006; OOI; GUBLER, 2009).
No Brasil a circulação simultânia dos quatro sorotipos e a alta incidência da doença relatadas
na última década pode ser a responsável pela ocorrência de formas graves e hospitalizações de
pacientes com dengue (TEIXEIRA et al., 2013).
113
7 CONCLUSÕES
Nosso estudo foi realizado durante uma grande epidemia de dengue que ocorreu no Estado de
Goiás, Brasil, onde acompanhamos pacientes com suspeita clínica de dengue atendida em
unidades de saúdes hospitalares e ambulatoriais e foi possível observar:
Os casos de dengue se concentraram na população adulta, ambulatorial e do sexo
feminino.
Os sinais e sintomas dor abdominal intensa, sangramentos espontâneos e
extravasamento de plasma foi mais freqüentes em menores de 15 anos de idade
quando comparado aos maiores de 15 anos.
Crianças e adultos não diferiram, significantemente, quanto a forma mais grave da
dengue, mas ao nível de significância de 10%, crianças tiveram mais chances de ter a
forma intermediária (DWS), quando comparado à forma mais branda da doença (FD).
Quanto à infecção prévia por dengue os adultos apresentaram maior frequência, no
entanto, cerca de 60% dos menores de 15 anos já tiveram contato com o vírus dengue.
Infecção secundária foi mais freqüente em dengue grave, mas não diferiu,
estatisticamente.
Trombocitopenia menor que 100.000, sangramentos espontâneos e dor abdominal
intensa estiveram mais freqüentes em infectados por DENV-1 (p<0,05), quando
comparados aos com DENV-4.
Foi constatado, pela primeira vez no estado de Goiás, a circulação concomitante dos
quatro sorotipos virais (DENV1- 4).
Na caracterização genética do gene do envelope do DENV-4 circulante na epidemia 2013
foi observado o genótipo II.
114
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128
ANEXOS
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética, TCLE
129
Anexo 2 – Questionários da Pesquisa
130
Nome:No.
Endereço:
Raça
1-SIM 2-NÃO 9-IGN
1 - SIM 2 - NÃO 9 - IGN
Já teve dengue
Se sim, quantas consultas médicas anteriores para esse episódio?
( ) Anti-alérgico
Já teve Febre amarela
Vacina Febre amarela
Transplante
Especificar:
Usa medicação regularmente
Hepatite B ou C
Passou por outra unidade de
saúde antes dessa?
Lúpus
Câncer
AIDS
( ) Antibiótico
Gestante
Tomou Medicação para febre na
última semana
Especificar:Outros
( ) Dipirona
( ) Anti-inflamatório Hormonal
( ) Anti-hemético
( ) Paracetamol
( ) anti-inflamatório não hormonal
( ) AAS
Tem pressão alta
Diabetes
IRC
Asma
Renda Familiar (R$):
AVALIAÇÃO INICIAL PRONEX DENGUE UFG/SES-GO/SMS
IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE
ANTECEDENTES
Prontuário:
(1) Ambulatorial (2) hospitalizado
Data de início de sintomas:
dd_____mm_____aa_______
Data de início da febre:
dd_____mm_____aa_______Tempo de duração da febre (dias). Obs.:
Preencher no final do caso.
Há quantos meses?
Data de Nascimento:
dd___mm___aa____
Cidade: Telefone:
Idade:
_______Anos ________Meses
Naturalidade:
RG:
Data da Internação:
dd_____mm_____aa_______
Data da Alta:
dd_____mm_____aa_______
Dias de doença ao internar:
Sexo:
( 1 )Masc ( 2 ) Fem
Grau de Instrução:
( 1 )Analfabeto ( 2 )Ensino fundamental ( 3 )Nível médio ( 4 )Nível superior ( 9 )Não informado
( 1 )Branca ( 2 ) Preto ( 3 ) Parda ( 4 ) Amarela ( 5 ) Indígena ( 9 ) Não informado
US:
99 - NÃO SE APLICA
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133
