UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

ALINE DE ARAÚJO FREITAS

Resposta imune celular e humoral a proteínas recombinantes do

Mycobacterium leprae em pacientes com hanseníase após a

multidrogaterapia e em pacientes com outras dermatoses

Goiânia

Setembro - 2015

2

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES

E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal

de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de

Teses e Dissertações (BDTD/UFG), regulamentada pela Resolução CEPEC nº

832/2007, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98,

o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura,

impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a

partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [X] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Nome completo do autor: Aline de Araújo Freitas

Título do trabalho: Resposta imune celular e humoral a proteínas recombinantes do

Mycobacterium leprae em pacientes com hanseníase após a multidrogaterapia e em

pacientes com outras dermatoses

3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se

imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF da tese ou

dissertação.

_________________________________ Data: 14 /12 /2016

Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

iii

ALINE DE ARAÚJO FREITAS

Resposta imune celular e humoral a proteínas recombinantes do

Mycobacterium leprae em pacientes com hanseníase após a

multidrogaterapia e em pacientes com outras dermatoses

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Medicina

Tropical e Saúde Pública da Universidade

Federal de Goiás para obtenção do Título

de Doutor em Medicina Tropical e Saúde

Pública, Área de concentração –

Imunologia.

Orientadora: Profª Drª Mariane Martins

de Araújo Stefani

Financiamento: American Leprosy Missions

Goiânia

Setembro – 2015

iv

v

vi

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO

Aluna: Aline de Araújo Freitas

Orientadora: Profª Drª Mariane Martins de Araújo Stefani

Membros titulares

1. Danuza de Almeida Esquenazi, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ - RJ

2. Vânia Nieto Brito de Souza, Instituto Lauro de Souza Lima (ILSL), Bauru -SP

3. João Alves de Araújo Filho, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

(IPTSP – UFG) Goiânia, Goiás

4. Ana Paula Junqueira Kipnis, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

(IPTSP – UFG) Goiânia, Goiás

5. Mariane Martins de Araújo Stefani, Instituto de Patologia Tropical e Saúde

Pública (IPTSP – UFG) Goiânia, Goiás

Data: 25/09/2015

vii

“Ando devagar por que já tive pressa

e levo esse sorriso por que já chorei demais,

cada um de nós compõe a sua história, cada ser em si

carrega o dom de ser capaz, e ser feliz

hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe,

só levo a certeza de que muito pouco eu sei ou

nada sei”.

Tocando em frente (Almir Sater e Renato Teixeira).

viii

A todos os pacientes com hanseníase que participaram de forma

voluntária e muito me ensinaram sobre a esperança em dias

melhores e o sentido da existência humana.

ix

AGRADECIMENTOS

Á Deus, pela vida, saúde e coragem para trilhar este caminho. Obrigada senhor por

cuidar de mim o tempo todo em sua infinita graça e misericórdia.

Ao longo destes 4 anos do meu Doutorado tive a oportunidade de conhecer e conviver

com muitas pessoas as quais além de contribuírem direta ou indiretamente para a

realização deste trabalho, também compartilharam comigo seus conhecimentos e

amizade. A essas pessoas ofereço minha gratidão, pois esta tese é também fruto desta

troca e, portanto é obra de todos nós.

Aos meus queridos pais Dalvina e Dimas. Vocês são meus exemplos de vida e minha

maior motivação. Obrigada pelo amor, dedicação, compreensão e apoio em todos os

momentos. A confiança que depositam em mim me incentiva a buscar sempre o melhor.

As palavras são incapazes e insuficientes para expressar o significado e a importância

que vocês têm em minha vida. Amo vocês!

Á minha irmã Dnise por toda a compreensão e presença diária. Obrigada por entender

as inúmeras vezes que fui impaciente em função do intenso e quase imutável cansaço do

cotidiano. Você é muito especial para mim!

Ao meu amado Paulo, pelo amor, compreensão e palavras reconfortantes nos momentos

difíceis. Meu companheiro constante, que muitas vezes escutou pacientemente todas as

minhas reflexões sobre Imunologia e Hanseníase. Obrigada por caminhar ao meu lado

durante estes 4 anos, e pelos momentos agradáveis que compartilhamos os quais fazem

os meus dias mais felizes, você foi imprescindível para que eu chegasse até aqui!

Á minha orientadora Profª Drª Mariane Stefani, obrigada pela confiança depositada em

mim desde o princípio, da qual, muitas vezes nem eu mesma acreditava ser capaz.

Obrigada pela educação científica e, sobretudo pela disposição em me ensinar. Admiro a

visão crítica com que analisa os resultados e a habilidade com que os transforma em

dados científicos. Você é para mim exemplo de competência, determinação e habilidade

científica. Durante todo este período, cresci muito graças a esta experiência, sou

x

consciente de que tive uma grande mestra e que a ela devo esta conquista e muito do que

sou hoje. Obrigada pela oportunidade!

Á minha querida amiga Emerith. Acredito que Deus faz de algumas pessoas seus

instrumentos para que ele possa agir em nossas vidas ou nos ensinar algo. Tenho

consciência de que você foi e é instrumento de Deus em minha vida. Obrigada por ser

esta amiga tão paciente, alegre, sábia e companheira, por ser a paz e o equilíbrio que eu

precisava nos momentos de desespero. Obrigada por compartilhar tão intensamente estes

4 anos, e me “coorientar” inúmeras vezes. Esta conquista também é sua, sem você teria

sido muito mais difícil, sempre sei grata a você!

Á minhas queridas amigas Regiane e Ludimila, pelo companheirismo, auxílio, amizade,

e pelos momentos de descontração dentro e fora do laboratório. Com certeza todo o bom

humor, auxílio e sensatez que demostravam me motivaram a realizar este trabalho. São

amigas que levarei para sempre em meu coração!

Ao meu amigo Rodrigo, obrigada “colega” por ter compartilhado tantos momentos

agradáveis durante os almoços, por tantas reflexões e questionamentos acerca de nossos

trabalhos científicos e acerca de nossas vidas enquanto doutorandos e enquanto pessoas.

Aos colegas do laboratório Dienny, João Pedro e Aline Golçalves. Obrigada pela

amizade, pelas trocas de experiência, companheirismo, cumplicidade, pela disposição em

ajudar e ensinar, pelas conversas sobre imunologia, hanseníase e sobre a vida.

Á Drª Samira Bührer pelo convívio e amabilidade.

Á Drª Ana Lúcia Maroccolo de Souza pela avaliação clínica dos pacientes, coleta das

biópsias e pela paciência e disposição em me ensinar sobre as manifestações clínicas da

Hanseníase.

Ao Dr Maurício Barcelos Costa pela convivência, aprendizado e exames

histopatológicos criteriosamente realizados.

Aos colegas de outros laboratórios, Adeliane, Bruna Daniella, Monalisa, Danilo,

Lázaro, Bruno e Vânia pelo convívio e troca de experiências.

Aos professores do setor de Patologia do IPTSP-UFG, Liliana, Marina, Juliana, Mara

Rúbia, Liliana e Ruy, pelos ensinamentos, incentivos e compreensão nos momentos em

que estive ausente em função da realização deste trabalho.

Aos professores do departamento de Imunologia do IPTSP, pelos ensinamentos

transmitidos e exemplo de vida acadêmica e científica.

xi

A banca de Qualificação: Profª Drª Ana Paula Junqueira Kipnis, Profª Drª Miriam

Leandro Dorta e Profª Drª Patrícia Nagib Alo Resende pela contribuição científica.

A todos os funcionários do IPTSP/UFG, pelo suporte e competência sempre.

Á direção do Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica de Goiânia e em especial

a técnica de enfermagem Divina, pelo grande auxílio no recrutamento dos pacientes com

Hanseníase.

Meus expressos agradecimentos a toda a equipe do Centro de Dermatologia Dona

Libânia (CDERM- Fortaleza, Ceará) que gentilmente nos acolheu e tornou possível a

realização deste trabalho.

Ao Dr Heitor de Sá Gonçalves e a Drª Araci Pontes por ter nos recebido no Centro de

Dermatologia Dona Libânia e ter nos acompanhado tão atenciosamente durante os 35

dias de nossa estadia. Aprendemos muito durante este período, muito obrigada pela

oportunidade desta experiência.

Aos pesquisadores parceiros deste trabalho, em especial, Dr Malcolm Duthie do IDRI-

USA pela produção dos antígenos utilizados neste estudo e pela inestimável colaboração

em nossos estudos.

Aos financiadores que contribuíram para a realização desta tese: Coordenação de

aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e American Leprosy Missions.

xii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1

1.1 Hanseníase: Aspectos gerais ................................................................................... 1

1.2 Mycobacterium leprae ............................................................................................ 2

1.3 Genoma do M. leprae ............................................................................................. 3

1.4 Epidemiologia e transmissão da hanseníase ........................................................... 5

1.5 Formas clínicas e tratamento da hanseníase ........................................................... 7

1.6 Imunologia da hanseníase ..................................................................................... 14

1.7 Diagnóstico da hanseníase .................................................................................... 23

1.7.1 Diagnóstico clínico ............................................................................................... 23

1.7.2 Diagnóstico laboratorial ........................................................................................ 24

1.7.2.1 Baciloscopia e Exame histopatológico ................................................................. 24

1.8 Diagnóstico diferencial da hanseníase .................................................................. 25

1.9 Avaliação da resposta imune celular e humoral à antígenos do M. leprae ........... 26

1.9.1 Testes sorológicos.................................................................................................26

1.9.2 Testes de imunidade celular..................................................................................30

2 JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 34

3 OBJETIVOS ......................................................................................................... 35

4 MÉTODOS .......................................................................................................... 37

4.1 Grupo de estudo .................................................................................................... 37

4.1.1 Abordagem 1 – Avaliação do efeito da MDT na resposta imune celular e humoral a

proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com hanseníase PB e MB................. 37

4.1.2 Abordagem 2 – Avaliação da utilidade do teste de imunidade celular (Ensaio de

sangue total (EST) para a proteína de fusão LID-1 e da dorologia para LID-1 e PGL-I no

diagnóstico diferencial da hanseníase com outras dermatoses clinicamente semelhantes . 39

4.2 Produção das proteínas recombinantes do M. leprae testadas .............................. 40

4.3 Proteínas recombinantes selecionadas .................................................................. 41

4.4 Determinação da imunoreatividade celular por ensaio de sangue total (EST) com

proteínas recombinantes do M. leprae ........................................................................ 41

4.5 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de IFN ................................... 42

4.6 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de IgG anti rML ...................... 42

4.7 Sorologia para detecção de IgM anti-PGL-I ......................................................... 42

xiii

4.8 Análises estatísticas .............................................................................................. 43

4.9 Aspectos éticos ..................................................................................................... 44

5 ARTIGOS .............................................................................................................. 45

Artigo 1 - Alterations to antigen-specific immune responses before and after

multidrugtherapy of leprosy ............................................................................................... 46

Artigo 2 - Application of Mycobacterium leprae-specific cellular and serological tests

for the differential diagnosis of leprosy from confounding dermatoses ................... 69

6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 89

7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 98

REFERÊNCIAS .................................................................................................. 99

ANEXOS ....................................................................................................... .....118

xiv

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Introdução

Figura 1. Espectro clínico e imunológico da hanseníase ............................................ 13

Figura 2 . Principais receptores associados à resposta imune ao M. leprae ............... 17

Artigo 1

Figura 1. Antibody responses of leprosy patients. Serologic reactivity to LID-1, 46f,

92f, PGL-I and 33f (negative control) was determined in newly diagnosed untreated

paucibacillary (A) and multibacillary leprosy patients (B) .......................................... 65

Figura 2. Kinetics of antibody responses in individual PB and MB leprosy patients at

diagnosis and at two time points after MDT. Serum IgG to LID-1 (A and B), 46f (C and

D), 92f (E and F), 33f (I and J) and IgM to PGL-I (G and H) were determined .......... 66

Figura 3. Interferon-gamma (IFN-γ) production in whole blood assay (WBA) upon

stimulation with LID-1, 46f, ML0276, ML2055 and ML2629 (negative control) in newly

diagnosed untreated paucibacillary leprosy patients (A) and newly diagnosed untreated

multibacillary leprosy patients (B) ............................................................................... 67

Figura 4. Kinetics of IFN in individual PB and MB leprosy patients at diagnosis and

at two time points after MDT. IFN was detected upon stimulation of heparinized whole

blood with LID-1(A and B), 46f (C and D), ML0276 (E and F), ML2055 (G and H),

ML2629 (I and J). .................................................................................................... ….68

Artigo 2

Tabela 1. Main features of study groups……………………………………………..86

Figura 1. Anti PGL-I and anti-LID-1 serologic reactivity of: newly diagnosed untreated

multibacillary (MB) and paucibacillary (PB) leprosy patients, patients with other

dermatoses and healthy endemic controls (EC). IgM antibodies to PGL-I (A) and IgG

antibodies to LID-1 (B) were detected by ELISA. Each point represents the mean optical

density (OD) of duplicates of an individual serum sample and the median OD value of

each group is represented by the horizontal line. The traced black horizontal line is the

cut-off (anti-PGL-I serology: OD > 0.150, anti-LID-1 serology: OD > 0.3). The number

above each data set is the percent positive responses. Receiver Operating Curve (ROC)

xv

(C) anti-PGL-I IgM serology in MB patients versus patients with other dermatoses; (D)

anti-LID-1 IgG serology in MB patients versus other dermatoses------------------------87

Figura 2. IFNγ production in the WBA of paucibacillary (PB) and multibacillary leprosy

patients (MB), in patients with other dermatoses and in endemic controls (EC) upon

stimulation with (A) LID-1, (B) MLCS- M. leprae sonicate antigen, (C) PHA-

phytohemagglutinin and (D) PBS- phosphate buffered saline control. Heparinized whole

blood 24-h cultures were performed, individual IFN-γ results (pg/ml) were plotted and

the horizontal line represents the median IFN-γ value. The traced black horizontal line

represents the cut-off (50 pg/ ml). The number at the top of the graphs represents the

percentage of positive responses in each group for each of the antigenic stimulus.

Receiver Operating Curve (ROC) (E) cellular test (WBA-LID-1) based on IFN detection

evaluated in PB leprosy patients versus other dermatoses (area under the curve 0.75)

specificity: 61.5%; sensitivity: 72.5% -------------------------------------------------------88

Anexos

Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética ......................................................................... 118

Anexo 2. Termos de Consentimento Livre e Esclarecidos (TCLEs) ......................... 121

Anexo 3. Questionários .............................................................................................. 133

xvi

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

BAAR- bacilo álcool-ácido resistente

BB- Hanseníase Borderline

BL- Hanseníase Borderline Lepromatosa

BSA – do inglês: Bovin serum albumin

BT – Hanseníase Borderline Tuberculoide

C3 - Componente C3 do sistema complemento

CAMP – do inglês: Cathelicidin antimicrobial peptide

CD – do inglês: Cluster of differentiation

CEP - Comitê de Ética em Pesquisa

CMI – do inglês: Cell mediated immunity

CRDT - Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica

CTLA-4 – do ingles: cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4

DCs – do inglês: dendritic cells

DEFB4 – do inglês: Defensin, beta 4

DNA – Ácido desoxiribonucleico

DO – Densidade óptica

ELISA – do inglês: Enzyme-Linked immunosorbent Assay

ENH - Eritema Nodoso Hansênico

EST - Ensaio de sangue total

Foxp3 – do inglês: Forkhead/winged helix transcription factor 3

FSC- GM – Fator estimulador de colônia – granulócitos e macrófagos

FSC-G – Fator estimulador de colônia - ganulócitos

GLS- do inglês: Granuloma-like structures

GM-CSF – Fator estimulador de crescimento de granulócitos e monócitos

HE - Hematoxilina-eosina

xvii

HLA – do inglês: Human Leukocyte antigen

IB - Índice baciloscópico

IFN - Interferon

Ig - Imunoglobulina

IGRA – do inglês: Interferon gamma release assays

IL – Interleucina

LAM - Lipoarabinomananas

LF – do inglês: Lateral flow

LID-1 – do inglês: Leprosy IDRI diagnostic 1

LL – Hanseníase lepromatosa (LL)

LM - Lipomanana

M. leprae - Mycobacterium leprae

M. tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis

M. ulcerans - Mycobacterium ulcerans

MB - Multibacilar

MBL- do inglês: Mannose binding lectin

MCP-1 - Monocyte chemoattractant protein-1

MDP - Dipeptídeos muramil

MDT – Multidrogaterapia

MDT-U- do inglês: Uniform Multidrug Therapy

MHC I – Molécula apresentadora de antígeno classe I

MHC II - Molécula apresentadora de antígeno classe II

MIP-1 – do inglês: Macrophage Inflammatory Proteins 1

MO-BSA - Monossacarídeo–octyl–BSA

NDO–BSA - Dissacarídeo natural-octyl–BSA

NDO-HSA- Dissacarídeo natural-octyl–HSA

NF-kB – do inglês: Factor nuclear kappa B

NK – do inglês: natural killer

xviii

NLRs – do inglês: NOD like receptors

NTP-BSA - Trissacarídeo natural-phenil–BSA

NTP-HSA - Trissacarídeo natural-phenil– HSA

OMS - Organização Mundial de Saúde

PADL – do inglês: Protein advances diagnostic of leprosy

PAMPs – do inglês: Pathogen-associated molecular patterns

PARK2 – do inglês: Parkinson protein 2

PB – Paucibacilar

PBMCs – do inglês: Peripheral blood mononuclear cells

PBS – do inglês: Phosphate buffered saline

PBST - do inglês: Phosphate buffered saline + Tween 20

PCR – do inglês: Polymerase chain reaction

PDGF-BB - do inglês: Platelet-derived growth factor BB

PDIMs - Tiocerol dimicoceratos

PGL - Glicolipídeos fenólicos

PQT - Poliquimioterapia

PRRs – do inglês : Pattern recognition receptor

pSLC - do inglês: Progenitor/stem-like cells

rML – recombinant protein of M. leprae

RNI - Reativos intermediários do nitrogênio

ROI - Reativos intermediários do oxigênio

RORC – do inglês: Retinoic acid related orphan nuclear hormone receptor C

RR - Reação reversa

RT1 - Reação tipo 1

RT2 - Reação tipo 2

SNPs – do inglês: Single Nucleotide Polymorfisms

TB - Tuberculose

TCLE - Termo de consentimento livre e esclarecido

TCR – receptor da célula T

xix

TGF - do inglês: Transforming growth factor-

Th – Célula T auxiliar

TLR – do inglês: Toll like receptor

TMB – Tetrametilbenzidina

TN – Cepa Tamil Nadu

TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa

Treg – Células T reguladoras

TT – Hanseníase tuberculoide

U-MDT/CT-BR - do inglês: Uniform Multidrug Therapy Clinical Trial Brazil)

VDR – do inglês: vitamin D receptor

WBA – do inglês: Whole blood assay

WHO – do inglês: World Health Organization

xx

RESUMO

A hanseníase é uma doença dermato-neurológica complexa que apresenta múltiplas

formas clínicas e o diagnóstico diferencial requer expertise clínica. As manifestações

clínicas da hanseníase são definidas de acordo com o tipo de resposta imune do paciente,

a qual pode ser celular/Th1 na doença paucibacilar (PB) ou humoral/Th2 na doença

multibacilar (MB). A multidrogaterapia (MDT) é considerada eficaz, todavia, pouco se

sabe sobre seu impacto na resposta imune de pacientes com hanseníase PB e MB. Não

existe um teste laboratorial único adequado para o diagnóstico de todas as formas clínicas

da hanseníase e que possa contribuir para o diagnóstico diferencial. Este estudo avaliou

o impacto da MDT nas respostas imune celular e humoral de pacientes PB e MB recém-

diagnosticados, não tratados em dois momentos após a conclusão da MDT utilizando um

painel de proteínas recombinantes do M. leprae (rMLs). Ao diagnóstico, pacientes PB

produziram IFN para todas as rMLs, pacientes MB produziram baixos níveis de IFN.

Cerca de 4-8 meses após o término da MDT observou-se aumento nos níveis de IFN em

pacientes PB e MB (p<0,05), contudo, não houve produção de IFN cerca de 2 anos após

o término da MDT. A sororeatividade de pacientes PB ao diagnóstico foi negativa para a

maioria das rMLs e para o PGL-I e este perfil não foi modificado após a MDT. Ao

diagnóstico pacientes MB apresentaram alta soropositividade para rMLs e PGL-I após a

MDT os níveis de IgG declinaram. A redução nos níveis de IFN para LID-1 em pacientes

PB e o declínio de IgG em pacientes MB podem auxiliar no monitoramento da eficácia

da MDT, entretanto não se sabe qual a repercussão desta redução no risco de

recidiva/reinfecção. Este estudo também avaliou a utilidade do teste de imunidade celular

(ensaio de sangue total/EST para LID-1) e da sorologia para PGL-I e LID-1 no

diagnóstico diferencial da hanseníase. Pacientes PB e MB recém-diagnosticados, não

tratados, pacientes com outras dermatoses clinicamente semelhantes à hanseníase e

indivíduos saudáveis de área endêmica (EC) foram recrutados em duas áreas endêmicas

do Brasil (Goiânia e Fortaleza). Maiores níveis de IFN para LID-1 foram detectados em

pacientes PB quando comparados aos outros grupos de estudo: MB (p<0,0001), outras

dermatoses (p=0,0008) e EC (p<0,0001). Em pacientes MB a sororeatividade para LID-

xxi

1 e PGL-I foi estatisticamente diferente quando comparada com pacientes PB (p<0,0001),

pacientes com outras dermatoses (p<0,0001) e EC (p<0,0001). A detecção de IFN e a

sorologia para PGL-I e LID-1 foram capazes de discriminar pacientes PB e MB de

pacientes com outras dermatoses indicando a utilidade destes testes no diagnóstico

diferencial da hanseníase.

xxii

ABSTRACT

Leprosy is a complex dermato-neurological disease that presents multiple clinical forms

and its differential diagnosis requires clinical expertise. The clinical manifestations in

leprosy are defined by the type of imune response developed by the patient: cellular/Th1

or humoral/Th2 in paucibacillary/PB and multibacillary disease respectively.

Multidrugtherapy (MDT) is considered efficacious however its impact on the immune

responses of PB and MB leprosy patients remains unknown. Currently no single

laboratory test is capable to detect all clinical forms of leprosy and laboratory tests are

not available to aid the differential diagnosis. This study evaluated the impact of MDT on

both cell-mediated immunity (CMI) and antibody responses by the follow up of untreated

PB and MB leprosy patients evaluated at 2 time points after MDT using a panel of

recombinants M. leprae proteins (rML). At diagnosis, PB patients produced interferon

gamma (IFNγ), and MB patients exhibited low or absent response. Shortly after MDT,

IFNγ production was observed only to LID-1 in PB and MB leprosy patients (p<0,05).

Almost 2 years after MDT, IFNγ levels declined in PB and MB patients. Most untreated

PB patients were seronegative to PGL-I and rML, remaining so after MDT. Most

untreated MB patients were seropositive to all antigens, and IgG to rMLs declined after

MDT. Reduction in antigen-specific CMI in PB and in antibody response in MB patients

may help monitor MDT effectiveness but may also have a role in the risk of

relapse/reinfection. This study also evaluated the usefulness of cellular test (Whole blood

assay – WBA to LID-1) and serology to PGL-I and LID-1 to differential diagnosis of

leprosy. Newly diagnosed and untreated PB and MB leprosy patients, patients with other

dermatoses clinically suspect of leprosy and healthy endemic individuals were recruited

in two geographic areas of Brazil (Goiânia and Fortaleza). Higher IFN levels to LID-1

were detected in PB leprosy patients when compared to all other study groups: MB

patients (p<0.0001), other dermatoses (p=0.0008) and endemic controls (p<0.0001). In

MB patients the seroreactivity to LID-1 and PGL-I was statistically different from: PB

leprosy (p<0.0001), other dermatoses (p<0.0001) and endemic controls (p<0.0001). The

IFN detection by WBA-LID-1 and the serology to PGL-I and LID-1 were able to

discriminate leprosy patients from patients with other dermatoses indicating their utility

for the differential diagnosis of leprosy.

1

1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Hanseníase: Aspectos gerais

A hanseníase é uma das doenças humanas mais antigas que se tem conhecimento,

cujos registros remontam a 4.000 antes de Cristo em papiros egípcios (TAN; GRAHAM,

2008). Estudos apoiam a hipótese de que a hanseníase tenha surgido na África Oriental e

se disseminado para Ásia, Oriente Médio e Europa por meio de migrações comerciais

como a rota da seda, favorecendo desta forma a disseminação da hanseníase e outras

doenças para estes locais. A imigração europeia parece ter sido responsável pela

introdução da hanseníase nas Américas, entretanto, evidências apontam que a doença foi

importada para o Brasil em navios negreiros oriundos da África durante o período colonial

brasileiro, em que o tráfico de escravos era uma prática comum (MONOT et al., 2009).

A hanseníase, também chamada Mal de Hansen, é famosa pela sua grande

capacidade desfigurante e apesar de ser considerada uma doença da antiguidade ainda

constitui até os dias atuais um sério problema de saúde pública em muitas regiões do

mundo (GELUK, 2013a). É uma doença infecciosa de evolução lenta, que tem como

agente etiológico o Mycobacterium leprae (M. leprae) um bacilo gram positivo

intracelular obrigatório que possui tropismo por macrófagos da pele e células de Schwann

(LOWY; RIDLEY, 1954). Em consequência da infecção e destruição das células de

Schwann dos nervos periféricos podem surgir incapacidades e deformidades físicas

permanentes (RIDLEY; JOPLING, 1966). Os doentes normalmente apresentam sinais e

sintomas dermato-neurológicos representados por lesões de pele que podem surgir em

qualquer parte do corpo, com alterações de sensibilidade e de sudorese no local da lesão

(RIDLEY, 1955).

A hanseníase apresenta período de incubação geralmente longo, podendo variar

em média de 2 a 10 anos. Acredita-se que os bacilos presentes nas vias aéreas superiores

de pacientes com alta carga bacilar não tratados representem as principais formas de

transmissão (PEDLEY, 1973). Estima-se que 95% da população global seja resistente a

infecção pelo M. leprae, embora não existam ferramentas para o diagnóstico de infecção

subclínica (SCOLLARD et al., 2006).

2

1.2 Mycobacterium leprae

Em 1874, o médico norueguês Gehard Henrik Amauer Hansen demonstrou a

etiologia infecciosa da hanseníase, por meio da observação de estruturas semelhantes a

bactérias no citoplasma de células provenientes de nódulos presentes em pacientes

lepromatosos. Amauer Hansen encontrou dificuldades para provar sua hipótese, pois, não

obteve sucesso na reprodução do crescimento do M. leprae em meios artificiais ou mesmo

em cobaias (TAN; GRAHAM, 2008). Os obstáculos para reprodução da hanseníase em

modelos animais durante as primeiras tentativas se deviam ao desconhecimento sobre o

ciclo de crescimento prolongado do M. leprae além de sua preferência por áreas mais

frias do corpo e a baixa qualidade dos inóculos de M. leprae, os quais usualmente

consistiam de homogenatos frescos ou congelados, provenientes de nódulos ou lesões de

pacientes lepromatosos não tratados (SCOLLARD et al., 2006). Durante um longo

período, todas as tentativas de cultivo deste micro-organismo falharam, entretanto, em

1960, Shepard obteve crescimento de M. leprae derivado da mucosa nasal de pacientes

lepromatosos por meio da inoculação 103 a 104 bacilos em coxim plantar de camundongos

que desenvolviam durante 9 a 12 meses uma lesão localizada característica da hanseníase

(SHEPARD, 1960).

A infecção experimental pelo M. leprae também foi reproduzida na espécie de

tatus de nove bandas (Dasypus novemcinctus) os quais são naturalmente suscetíveis.

Além disso, a infecção pelo M. leprae ocorre naturalmente em tatus selvagens chegando

a uma prevalência de até 20% em algumas localidades o que constitui um grande

reservatório deste bacilo. Tatus infectados foram encontrados habitando o México e

algumas regiões do sul dos Estados Unidos como Alabama, Arkansas, Louisiana,

Mississipi e Texas (TRUMAN, 2005; TRUMAN et al., 2011; WALSH et al., 1986). O

sequenciamento do genoma completo das cepas de M. leprae provenientes de tatus

selvagens infectados e pacientes hansênicos do sul dos Estados Unidos demonstrou alta

porcentagem de casos de hanseníase não relacionados entre si, desencadeados pela

mesma cepa que ocorre naturalmente em tatus selvagens desta mesma região geográfica,

o que corrobora com a hipótese de que a hanseníase pode ser uma zoonose no sul dos

Estados Unidos (TRUMAN et al., 2011). Outro estudo realizado no Brasil sugere que o

hábito de caçar ou comer tatus constitui um fator de risco para o desenvolvimento da

hanseníase (DEPS et al., 2008).

3

Até os dias atuais não é possível cultivar o M. leprae em meios de cultura

artificiais axênicos (TRUMAN; KRAHENBUHL, 2001). Este bacilo precisa de 12,5 dias

em média para se duplicar e possui predileção por áreas do corpo com menor temperatura

como pele, mucosa nasal e nervos periféricos, fato este, diretamente relacionado à

temperatura ideal para seu crescimento que é de 27ºC a 30ºC (JACOBSON;

KRAHENBUHL, 1999). Dentre as doenças infecciosas causadas por micobactérias, o M.

leprae é o segundo agente mais patogênico perdendo apenas para o Mycobacterium

tuberculosis (M. tuberculosis) causador da tuberculose (GELUK, 2013b).

O M. leprae é definido como um bacilo ligeiramente curvo, imóvel, microaerófilo,

que se cora em vermelho pela fucsina e não sofre descoloração pela solução de álcool e

ácidos orgânicos, sendo denominado um bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) (LOWY;

RIDLEY, 1954). A parede celular do M. leprae é constituída por peptideoglicanos

entrelaçados e ligados a cadeias polissacarídeas que servem de suporte para os ácidos

micólicos. Os ácidos micólicos, lipídeos característicos do seu envelope celular, são

responsáveis pela característica hidrofóbica da micobactéria e estão ligados a resíduos

terminais de arabinose da arabinogalactana. Sua camada mais externa é composta por

moléculas como o tiocerol dimicoceratos (PDIMs), fosfatidil-inositol, manosídeos,

lipomanana (LM), lipoarabinomananas (LAM) e grandes quantidades de glicolipídeos

fenólicos (PGL) (SCOLLARD et al., 2006). O glicolipídeo fenólico I (PGL-I) representa

mais de 3% do peso total do bacilo, e a sua porção constituída por um açúcar é altamente

antigênica induzindo a produção de altos títulos de anticorpos (IgM), o que confere

especificidade imunológica ao M. leprae (SPENCER; BRENNAN, 2011).

1.3 Genoma do M. leprae

A cepa de M. leprae originalmente purificada de lesões de pele provenientes de

pacientes com hanseníase lepromatosa da Índia (cepa TN – Tamil Nadu), e

subsequentemente purificada a partir do fígado de tatus de nove bandas forneceu o DNA

necessário para o sequenciamento do genoma do M. leprae (COLE et al., 2001).

O sequenciamento do genoma completo do bacilo da hanseníase publicado por

Cole e colaboradores em 2001, revelou que o genoma do M. leprae possui 1605 genes

codificadores de proteínas em um total de 3.268.203 pb e um conteúdo médio de 57,8%

de G+C (Guanina + Citosina) (COLE et al., 2001). Houve uma extensa redução gênica

quando comparada com o genoma do M. tuberculosis que possui 4.411.532 pares de base

4

e 65,6% de G+C (COLE et al., 1998). Somente 49,5% do genoma do M. leprae possui

genes codificadores de proteínas, 27% são pseudogenes e os 23,5% restantes

correspondem a sequências regulatórias ou remanescentes de genes mutados. A

distribuição dos pseudogenes é aleatória e quando estes são excluídos, restam 1.604 genes

potencialmente ativos, sendo que 1.439 são comuns ao M. tuberculosis. Dos 165 genes

sem ortólogos no M. tuberculosis, somente 29 possuem funções definidas, sendo que a

análise proteômica comparativa detectou 391 espécies de proteínas solúveis no M. leprae,

comparadas com aproximadamente 1800 no M. tuberculosis indicando que os

pseudogenes são inertes. Considerando-se que todas as micobactérias se originaram de

um ancestral comum, provavelmente o genoma do M. leprae já foi semelhante ao de

outras micobactérias, diante disto, a perda de cerca de 2.000 genes pode ter ocorrido

durante o processo evolutivo.

Cerca de metade dos genes (52%) do genoma do M. tuberculosis surgiram

mediante eventos de duplicação gênica levando a uma extensa redundância funcional.

Muitos destes genes estão envolvidos no metabolismo lipídico, codificação de proteínas

estruturais ou com função desconhecida. Comparativamente, o genoma do M. leprae não

possui genes redundantes, apenas poucos íntrons ou sequências repetitivas, o que indica

que este bacilo preservou somente os genes imprescindíveis para a sua sobrevivência o

que provavelmente reduziu sua capacidade metabólica de maneira que ele se tornou um

bacilo intracelular obrigatório e altamente especializado (COLE et al., 2001).

Estudos de análise da diversidade genética e filogeografia do M. leprae

demonstraram que todas as cepas existentes de hanseníase surgiram de um único clone

cuja disseminação mundial pôde ser recuperada a partir da distribuição de polimorfismos

de base única (Single Nucleotide Polymorfisms – SNPs) (MONOT et al., 2005). Os SNPs

são alterações da sequência de DNA que ocorrem quando um único nucleotídeo (A, T, C

ou G) na sequência do genoma é modificado. Quando os SNPs estão localizados em

regiões codificadoras eles podem modificar um aminoácido e potencialmente causar

variações na estrutura e/ou função da proteína (BROOKES, 1999). Este estudo analisou

175 diferentes amostras de M. leprae provenientes de 21 países, os quais representam os

5 continentes e demonstrou uma pequena diferença na sequência de nucleotídeos

(variabilidade genética) entre as diferentes cepas do M. leprae, de diversas regiões

indicando uma alta proximidade filogenética entre elas (MONOT et al., 2005).

5

A extensa redução gênica e a consequente perda funcional observada no bacilo da

hanseníase influenciaram a taxa de crescimento do M. leprae que é extremamente lento

fato este que poderia explicar a dificuldade de seu cultivo em meios axênicos e a

baixíssima quantidade de cepas diferentes em todo o mundo (COLE et al., 2001; MONOT

et al., 2009). Outro trabalho filogeográfico comparativo realizado em 2009 pelo mesmo

grupo de pesquisa, comparou os genomas completos da cepa Br4923 do M. leprae,

encontrada no Brasil, com o genoma das cepas Thai53 da Tailândia, TN da Índia e

NHDP63 dos Estados Unidos. A comparação do sequenciamento completo mostrou

99,995% de identidade entre as sequências das quatro cepas (MONOT et al., 2009). A

similaridade entre as cepas de M. leprae foi ratificada recentemente por um estudo de

genômica comparativa entre cepas medievais e modernas. A obtenção de sequências

gênicas do M. leprae a partir de 5 esqueletos provenientes de diferentes regiões

geográficas da Europa, demonstrou que ao longo de 1000 anos houve uma preservação

excepcional das sequências gênicas quando comparou-se as sequências medievais com

11 sequências modernas. Além disso, este estudo também confirmou a origem europeia

da hanseníase nas Américas e a existência de uma cepa de M. leprae na Europa medieval

comumente associada com o Oriente médio (SCHUENEMANN et al., 2013).

1.4 Epidemiologia e transmissão da hanseníase

A hanseníase é um importante problema de saúde pública e durante muitos séculos

a inexistência de terapêutica eficaz contribuiu para este fato (NOGUEIRA et al., 1995).

Apesar da redução no número de casos registrados nas últimas duas décadas, a incidência

da hanseníase tem diminuído lentamente (WHO, 2010). O declínio apresentado na

prevalência da hanseníase, com a implementação da MDT, não foi acompanhado de um

declínio na incidência indicando que a prevalência é um parâmetro inadequado para se

avaliar o controle da infecção (FINE PE, 2006).

O último boletim da OMS (Organização Mundial da Saúde) reportou uma

prevalência global da hanseníase de 180.618 casos e incidência de 215.656 casos. O

Brasil ocupa o 2º lugar no ranking mundial contribuindo com 31.044 casos novos e uma

prevalência de 28.485 casos, perdendo apenas para a Índia a qual conta atualmente com

o número de 126.913 casos novos e uma prevalência de 86.147 casos (WHO 2014). A

situação epidemiológica da hanseníase no Brasil é considerada heterogênea devido à

grande variação do coeficiente de prevalência nas várias regiões do país (SOBRINHO;

6

MATHIAS, 2008). Segundo o último boletim epidemiológico de hanseníase no Brasil,

(2013) a maioria dos casos está concentrada nas regiões nordeste (13.896 casos) norte

(6.906 casos) e centro-oeste (5.775 casos). Em Goiás, no ano de 2012 foram

diagnosticados 2.205 casos novos, o que corresponde a 35,8 casos/100.000 habitantes e a

prevalência foi de 3,0/10.000 habitantes (BRASIL, 2013).

A estratégia atual da OMS é reduzir o número de casos novos diagnosticados com

grau de incapacidade dois para taxas < 35% em todo mundo até o final de 2015. É

importante ressaltar que a diminuição no número de casos de hanseníase deve ser

acompanhada pela redução dos desafios socioeconômicos relacionados à doença. É

imprescindível que os programas nacionais de hanseníase de cada país, concentrem-se

em áreas carentes e de difícil acesso a serviços de saúde, intensificando as ações de

vigilância em hanseníase, voltadas à efetividade no diagnóstico e tratamento da doença

(WHO, 2012).

O mecanismo preciso de transmissão do M. leprae ainda é desconhecido

(SCOLLARD et al., 2006), porém, acredita-se que os bacilos presentes nas vias aéreas

superiores de pacientes com alta carga bacilar, não tratados representem a principal via

de transmissão (SHEPARD, 1960; PEDLEY, 1973). Todavia, o contato direto com lesões

de pele ulceradas também constitui uma possível forma de transmissão (JOB et al., 2008).

Secreções orgânicas como urina, fezes, suor, leite materno, secreções vaginais e esperma

de doentes podem conter bacilos, mas não representam importância na disseminação da

infecção (TALHARI; NEVES, 1997; YAWALKAR, 2002).

Alguns autores sugerem a existência de reservatórios não humanos para o M.

leprae tais como, solo, água, plantas ou em várias outras espécies de animais como

amebas, insetos, peixes, primatas e tatus. A hanseníase tem sido observada em indivíduos

que não relatam história de exposição ao M. leprae e que foram identificados em áreas

específicas, tais como áreas próximas a fontes de água (TRUMAN; FINE, 2010). É

importante fazer a distinção entre reservatório e passagem transitória do M. leprae pelo

ambiente. Os pacientes MB podem disseminar grandes quantidades do bacilo no ambiente

e alguns bacilos podem permanecer viáveis por períodos como horas, dias ou semanas,

mas isto não caracteriza um reservatório (DESIKAN; SREEVATSA, 1995). Para que seja

considerado um reservatório, o M. leprae deve multiplicar-se. Entretanto, dados os

conhecimentos do genoma do M. leprae é improvável que este micro-organismo possa se

replicar em qualquer ambiente extracelular (COLE et al., 2001). Contudo, existe a

7

possibilidade do M. leprae presente na água se associar a protozoários ou invertebrados

aquáticos como tem sido mostrado para Mycobacterium ulcerans (M. ulcerans) (MOSI

et al., 2008).

Como mencionado anteriormente, até hoje a única fonte não humana comprovada

do M. leprae é o tatu de nove bandas (Dasypus novemcinctus) do sul dos Estados Unidos.

Truman e colaboradores compararam o genoma completo do M. leprae proveniente de

tatus selvagens e de pacientes com hanseníase dos Estados Unidos, demonstrou que a

cepa era idêntica. Sendo assim, o tatu pode ser um possível reservatório natural da

hanseníase no sul dos Estados Unidos (TRUMAN; FINE, 2010; TRUMAN et al., 2011).

Admite-se que para a transmissão, é necessário que haja um contato íntimo por

um período prolongado, como o que ocorre com familiares que convivem na mesma

residência (BAKKER et al., 2006). Por este motivo, contactantes intradomiciliares de

casos MB têm maior risco de desenvolver a doença do que a população geral. Estima-se

que contatos intradomiciliares de pacientes com baciloscopia positiva, apresentem 4 a 5

vezes mais risco de adoecer que outros indivíduos de uma população endêmica (FINE et

al., 1997; MOET et al., 2004). Entretanto muitos dos casos recém- diagnosticados não

referem contato com paciente com hanseníase (DOUGLAS et al., 2004).

O compartilhamento do domicílio de paciente com hanseníase MB com várias

pessoas e fatores genéticos do hospedeiro, parece predispor a infecção e desenvolvimento

da hanseníase (MIRA et al., 2004). Em áreas endêmicas para o M. leprae a maioria dos

indivíduos expostos é resistente ao bacilo, não desenvolvendo a doença (GODAL;

NEGASSI, 1973; MOET et al., 2004). Variantes dos genes PACRG e PARK2 (parkinson

protein 2, uma proteína do complexo E3 ubiquitina ligase) são considerados fatores de

risco para o desenvolvimento da hanseníase (MIRA et al., 2004). Porém, vários outros

genes como os codificantes de TNF- (fator de necrose tumoral alfa), IL-10 (interleucina-

10) e receptor da vitamina D, parecem estar implicados na resistência ou suscetibilidade

à hanseníase (MORAES et al., 2001; KRUTZIK et al., 2008). Aparentemente uma

combinação de sutis variações em diversos genes pode alterar o risco de desenvolvimento

da doença ou interferir na gravidade da hanseníase (CARDOSO et al., 2011).

1.5 Formas clínicas e tratamento da hanseníase

A hanseníase apresenta um espectro contrastante de manifestações clínicas e

histopatológicas, as quais são definidas de acordo com a habilidade do indivíduo em

8

desenvolver resposta imune celular ao M. leprae (SCOLLARD et al., 2006). As lesões de

pele geralmente se apresentam como manchas eritematosas ou hipocrômicas com

alteração de sensibilidade, infiltrações, nódulos, tubérculos ou placas (JOPLING, 1971).

As alterações de sensibilidade (tátil, térmica e dolorosa) podem ser causadas pela ação do

bacilo nos nervos ou pela resposta do sistema imune frente ao bacilo (RIDLEY;

JOPLING, 1966; SEHGAL et al., 1977). A neurite pode levar a perda da força muscular,

com posterior paralisia, e originar incapacidades e deformidades físicas permanentes

(BRASIL, 2001).

Usualmente a manifestação inicial da hanseníase é a forma indeterminada com

resposta do hospedeiro e manifestações clínicas indefinidas, não permitindo a

classificação clínica ou prognóstico de evolução da doença (RIDLEY; JOPLING, 1966).

A hanseníase indeterminada geralmente se manifesta como uma lesão hipocrômica, que

pode evoluir para cura espontânea ou para outras formas clínicas da doença

(YAWALKAR, 2002).

Em 1966, Ridley e Jopling propuseram uma classificação baseada em critérios

clínicos, histopatológicos, baciloscópicos e imunológicos a qual é considerada até hoje

o método mais completo e criterioso de categorização das diferentes manifestações de

hanseníase existentes. Esta classificação catalogou a hanseníase em formas polares:

tuberculoide (TT) e lepromatosa (LL) e em formas intermediárias: borderline

tuberculoide (BT), borderline (BB) e borderline lepromatosa (BL) (PINHEIRO et al.,

2011; RIDLEY; JOPLING, 1966).

Os pacientes que desenvolvem a forma TT da hanseníase geralmente apresentam

poucas lesões de pele em forma de placas ou manchas com limites precisos, sensibilidade

diminuída e presença ou não de espessamento neural periférico, além disso, pode ocorrer

perda de pêlos e anidrose. De acordo com critérios histopatológicos a forma tuberculoide

da hanseníase é caracterizada pela presença de granulomas bem formados, constituídos

por infiltrado inflamatório que contém macrófagos, células epitelioides e gigantes, com

predomínio de robusta resposta de células T CD4+. Os pacientes que apresentam a forma

TT desenvolvem vigorosa resposta imune Th1 específica ao M. leprae, produção de IFN,

teste cutâneo positivo (reação de Mitsuda) e baciloscopia negativa (Figura 1) (RIDLEY;

JOPLING, 1966; SCOLLARD et al., 2006).

No outro extremo do espectro, pacientes com a forma LL da hanseníase não

apresentam resistência aparente ao M. leprae e clinicamente são observadas múltiplas

9

lesões de pele com limites imprecisos que consistem em máculas, pápulas, placas ou

nódulos anestésicos. Apresentam espessamento neural periférico e eventualmente podem

desenvolver queratite, uveite, madarose, ulceração do nariz e destruição óssea. O exame

histopatológico evidencia um infiltrado celular composto de histiócitos multivacuolados

com citoplasma contendo grande quantidade de lipídeos, o que confere a essas células

aspecto espumoso, denominadas células de Virchow. A forma LL é caracterizada por

produção de altos níveis de anticorpos e predominância de resposta imune celular Th2.

Observa-se predomínio de células T CD8+ e ausência de granulomas com alta carga

bacilar podendo chegar até 1012 bactérias por grama de tecido. Nos pacientes LL a

baciloscopia é fortemente positiva e o teste cutâneo é negativo (Figura 1) (MISCH et al.,

2010; RIDLEY; JOPLING, 1966; SCOLLARD et al., 2006;).

As formas intermediárias da hanseníase constituem uma variedade de formas

clínicas que podem apresentar similaridades com o pólo tuberculoide e lepromatoso da

hanseníase. A forma borderline tuberculoide apresenta lesões bem delimitadas e em maior

número, bem como maior acometimento de troncos nervosos quando comparada com a

forma TT. No histopatológico observam-se raros bacilos e granulomas formados por

células epitelioides, e células gigantes multinucleadas tipo Langhans contornados por

halo linfocitário. A baciloscopia é negativa ou com raros bacilos. A hanseníase borderline

(BB), é caracterizada pelo surgimento de poucas lesões com limites extensos e

imprecisos, ou por múltiplas lesões bem definidas e porosas conhecidas como queijo

suíço ou lesões em renda. A baciloscopia geralmente é positiva. Ao histopatológico

observa-se a presença de bacilos e células epitelioides distribuídas difusamente. A forma

borderline lepromatosa apresenta muitas lesões mal delimitadas e eritematosas. A

baciloscopia é positiva e o histopatológico revela granuloma com macrófagos e grande

quantidade de bacilos (RIDLEY; JOPLING, 1966). Um sistema de classificação

simplificado para hanseníase baseado no número de lesões de pele foi estabelecido pela

OMS para fins operacionais e terapêuticos. Segundo este sistema os pacientes podem ser

classificados em paucibacilares (PB) e multibacilares (MB). Os pacientes PB apresentam

até 5 lesões de pele, e em geral correspondem as formas TT e BT. Por outro lado os

pacientes MB apresentam mais de 5 lesões de pele, e em geral correspondem as formas

BL e LL de Ridley e Jopling.

O tratamento para a hanseníase baseia–se em uma combinação de antibióticos que

é chamada de multidrogaterapia (MDT) ou poliquimioterapia (PQT). A MDT consiste na

10

combinação de rifampicina, clofazimina e dapsona e tenta evitar a resistência

medicamentosa do bacilo (NOORDEEN, 1990). Desde 1995, a OMS fornece a MDT

gratuitamente para pacientes com hanseníase em todos os países endêmicos. Para

pacientes PB a OMS recomenda um regime baseado em uma dose mensal supervisionada

de rifampicina (600 mg) e dapsona (100 mg) e doses diárias auto administradas de

dapsona (100 mg). Devem ser administradas seis doses em até nove meses. Para pacientes

MB preconiza-se o uso combinado de uma dose mensal supervisionada de rifampicina

(600 mg), clofazimina (300 mg) e dapsona (100 mg) e doses diárias auto administradas

de clofazimina (50 mg) e dapsona (100 mg) (WHO, 1991). Devem ser administradas doze

doses em até dezoito meses.

A alta por cura é concedida ao fim do tratamento, ou seja, após a administração

do número de doses preconizadas pelo esquema terapêutico. Ao final da MDT os

pacientes devem ser submetidos ao exame dermatológico, às avaliações neurológicas

simplificadas e do grau de incapacidade física e receber alta por cura. O paciente que

completa a MDT não deve mais ser considerado como caso de hanseníase, mesmo que

este apresente reações hansênicas pós-alta ou que permaneça com alguma sequela da

doença (WHO, 1994). Quando a MDT é administrada adequadamente, raramente o

paciente volta a manifestar os sinais e sintomas característicos da doença, a menos que

ele tenha se reinfectado. O acompanhamento prolongado dos pacientes é importante na

vigilância à resistência medicamentosa.

Apesar da eficácia da MDT empregada para hanseníase, algumas limitações como

tempo prolongado de tratamento e classificação errônea das formas clínicas têm motivado

pesquisas que estão investigando um esquema terapêutico único utilizando 6 doses para

pacientes PB e MB incluindo rifampicina, dapsona e clofazimina denominado MDT-U

(Uniform Multidrug Therapy) que possa substituir a MDT clássica. No Brasil, desde

2004, vem sendo desenvolvido um ensaio clínico controlado denominado “Estudo

independente para determinar efetividade do esquema uniforme de MDT de seis doses

(MDT-U) em pacientes de hanseníase (U-MDT/CT-BR - Uniform Multidrug Therapy

Clinical Trial Brazil). De 2004 a 2009 foram examinados 8.755 indivíduos e incluídos

859 pacientes com hanseníase, os quais foram avaliados mensalmente e anualmente para

verificar episódios reacionais, lesões neurais funcionais, e recidivas. O seguimento dos

pacientes foi realizado por até seis anos após a conclusão do tratamento (PENNA et al.,

2012). Resultados prévios do U-MDT/CT-BR sugerem a possibilidade do uso do MDT-

11

U, uma vez que foram encontrados dados semelhantes entre o esquema uniforme e regular

quanto à frequência de reações hansênicas, comportamento do índice bacilar (IB) e efeitos

adversos (GONÇALVES et al., 2012; PENNA et al., 2012)

Além das formas clínicas clássicas da hanseníase os pacientes podem desenvolver

episódios agudos imuno-inflamatórios denominados reações hansênicas. As reações

podem ocorrer antes, durante ou após a MDT interrompendo o curso crônico da doença.

As reações são a causa primária de incapacidades físicas e representam emergências

médicas que devem ser rapidamente diagnosticadas e tratadas, para que o dano neural

irreversível seja evitado. Existem dois tipos de reação hansênica: Reação tipo 1 (RT1)

também chamada de reação reversa (RR) e Reação tipo 2 (RT2) ou Eritema Nodoso

Hansênico (ENH). A RT1 ocorre preferencialmente em pacientes BT, BB e BL e a RT2

ocorre nas formas clínicas BL e LL. Acredita-se que alguns fatores de risco como

quimioterapia, gravidez, infecções concomitantes e estresse físico e emocional, podem

predispor ao desenvolvimento dos episódios reacionais (PINHEIRO et al., 2011).

A RT1 é caracterizada pelo inchaço e eritema das lesões pré-existentes ou

aparecimento de novas lesões, neurite, perda motora e sensorial e sintomas sistêmicos são

raros. Comumente a RT1 é diagnosticada simultaneamente com a hanseníase ou durante

os 2 primeiros anos da MDT. A RT1 é desencadeada por exacerbação da resposta imune

celular do tipo Th1 contra o M. leprae, com aumento local e sistêmico de citocinas pró-

inflamatórias como IFN (Interferon gama), TNFα (Fator de necrose tumoral alfa), IL12

(Interleucina 12), IL-1 (Interleucina 1), IL-6 (Interleucina 6) dentre outras (MORAES et

al., 1999; STEFANI, 2008). Cerca de 40% dos pacientes com RT1 desenvolvem lesão

neural permanente, mesmo com tratamento adequado (VAN BRAKEL ; KHAWAS,

1996). A quimiocina CXCL-10 (C-X-C quimiocina 10) e a citocina IL-6 foram

identificadas como potenciais biomarcadores para RT1 uma vez que níveis plasmáticos

aumentados de CXCL-10 e IL-6 foram encontrados em pacientes em RT1 quando

comparados com indivíduos sem reação hansênica (STEFANI et al., 2009).

A RT2 apresenta maior exuberância de sintomas e a maioria dos casos ocorre

durante a MDT e em indivíduos com alta carga bacilar. Observa-se o aparecimento de

nódulos eritematosos dolorosos na pele, além de sintomas sistêmicos como febre, mal

estar, aumento dos gânglios linfáticos, anorexia, perda de peso, artralgia e edema. A

imunopatogênese do ENH compreende uma reação inflamatória sistêmica relacionada à

deposição de imunocomplexos, gerando infiltração de neutrófilos e ativação do sistema

12

complemento (KAHAWITA; LOCKWOOD, 2008; MASTRANGELO et al., 2008;

RIDLEY; RIDLEY, 1983). Alguns estudos tem confirmado a presença de altos níveis de

citocinas pró-inflamatórias como TNF, IL-6 e IL-1 (Interleucina 1 beta) no soro de

pacientes com ENH (Figura 1) (KHANOLKAR-YOUNG et al., 1995; SARNO et al.,

1991; SOUSA et al., 2012). A citocina IL-6, e os fatores de crescimento IL-7 (interleucina

7) e PDGF-BB (fator de crescimento derivado de plaquetas) foram sugeridos como

marcadores laboratoriais para RT2 em um estudo comparativo entre pacientes na vigência

e na ausência da RT2 (STEFANI et al., 2009).

O tratamento para reações hansênicas tem como objetivo controlar a inflamação

aguda, aliviar a dor e reverter o dano neural. Para RT1 o tratamento é baseado em

corticosteroides orais em doses baixas por semanas ou meses. Geralmente são utilizadas

doses diárias de 40 mg de prednisona, após a melhora do quadro reacional a dose deve

ser diminuída em 5 mg a cada duas ou quatro semanas. O tratamento da RT2 é realizado

com corticoesteróides e talidomida, que também controlam o episódio inflamatório e a

dor (WALKER; LOCKWOOD, 2006).

13

Figura 1 - Espectro clínico e imunológico da hanseníase

A hanseníase é classificada ao longo de um espectro clínico em tuberculoide (TT),

borderline tuberculoide (BT), borderline borderline (BB), borderline lepromatosa (BL), e

lepromatosa (LL). Cada polo é associado ao desenvolvimento de um perfil imune celular

ou humoral. O polo TT apresenta resposta imune celular do tipo 1 (Th1) e caracteriza-se

por eliminar ou conter os bacilos mediante a formação de granulomas. Por outro lado, o

polo LL caracteriza-se pelo desenvolvimento de uma ineficiente resposta imune humoral

que permite a proliferação dos bacilos dentro e ao redor de macrófagos espumosos. As

reações tipo 1 (RT1) resultam de uma súbita ativação de resposta Th1 em indivíduos que

apresentam as formas BT, BB, ou BL e podem ser a causa de dano neural irreversível

(neurite). O eritema nodoso hansênico (ENH) ocorre em pacientes com as formas BL ou

LL e reflete um aumento em ambas as imunidades celular e humoral ao M. leprae. ENH

está associado com liberação sistêmica de TNF a IL-4, influxo de leucócitos

polimorfonucleares (PMNs) e deposição de complexos antígeno-anticorpo (Ag/Ac).

Adaptado de MISCH et al., 2010.

14

1.6 Imunologia da hanseníase

O amplo espectro de manifestações clínicas e histopatológicas da hanseníase se

devem a diversidade da resposta imune desenvolvida frente ao M. leprae (SCOLLARD

et al., 2006). Considerando-se a via respiratória como a principal via de transmissão do

M. leprae, as células dendríticas (DCs) da mucosa nasal, são as primeiras células a

reconhecerem o bacilo por meio de uma grande variedade de receptores de

reconhecimento padrão (PRRs) (DEMANGEL; BRITTON, 2000). Além das DCs, os

macrófagos também reconhecem e são as células hospedeiras primárias do M. leprae,

desempenhando importante papel na defesa do organismo contra este bacilo mediante

captura, processamento e apresentação de antígenos, além da secreção de monocinas

(Figura 2), porém, na ausência de uma resposta imune adaptativa eficaz, os bacilos podem

se multiplicar no seu interior chegando a 100 bacilos por célula (HAGGE et al., 2004;

SCOLLARD et al., 2006).

Vários pares PRRs-PAMPs participam da resposta imune inata ao M. leprae.

Dentre os PRRs envolvidos podemos destacar os receptores do complemento 1 e 3

presentes na superfície de monócitos e os receptores CR1, CR3 e CR4 em macrófagos

que são essenciais na fagocitose do M. leprae, receptores que se ligam a manose como

dectina 1, MBL, a superfamília das lectinas tipo C os quais apresentam importante função

na captura do M. leprae e receptores “Scavenger” de macrógagos (CD36) os quais podem

estar relacionados com a formação de células espumosas (ADAMS et al., 1993;

GREAVES; GORDON, 2009; MONTOYA; MODLIN, 2010; MOSSER; EDWARDS,

2008; SCHLESINGER; HORWITZ, 1991; SCOLLARD et al., 2006).

Outros PRRs como Toll-like receptors (TLRs) 1, 2, 4, 6, 8, e 9 e a família de

receptores intracelulares NOD like receptors (NLRs) podem estar envolvidos (MISH et

al., 2010). Dentre os 10 TLRs identificados, o TLR2 reconhece LAM e os heterodímeros

TLR2/1 reconhecem lipoproteínas triaciladas, uma vez que lipoproteínas diaciladas são

reconhecidas pelo heterodímero TLR2/6, o que resulta na produção de citocinas

inflamatórias (MONTOYA; MODLIN, 2010). A ativação do heterodímero TLR2/1 pelas

lipoproteínas do M. leprae promove a produção de TNF como componente da resposta

inflamatória aguda e IL-12, citocina indutora da resposta imune do tipo Th1 além de

induzir a expansão de células dendríticas e diferenciação de macrófagos (KRUTZIK et

al., 2003). O TLR2 também atua cooperativamente com a Dectina 1 e MBL que são

receptores que reconhecem carboidratos e facilitam a internalização do antígeno para

15

processamento e apresentação (Figura 2) (MONTOYA; MODLIN, 2010; SCOLLARD

et al., 2006).

Além da fagocitose, os macrófagos utilizam uma variedade de mecanismos

antimicrobianos para eliminar patógenos, que vão deste a geração de óxido nítrico e

radicais superóxidos a indução de peptídeos antimicrobianos como as catelecidinas por

um mecanismo dependente de vitamina D. Em macrófagos infectados com M.

tuberculosis, a ativação de TLR1/2 promove a expressão do receptor da vitamina D (VDR

– vitamin D receptor) e da forma ativa da vitamina D que por sua vez aumenta a produção

de peptídeos antimicrobianos como catelecidinas (CAMP) e defensinas 2 (DEFB4)

levando a morte intracelular (LIU et al., 2006).

Algumas citocinas, como a IL-15 e a IL-10 são produzidas como consequência da

ativação do sistema imune inato e são conhecidas por regular as funções macrofágicas,

sendo diferentemente expressas em lesões de hanseníase (MONTOYA et al., 2009). A

existência de uma divergência no direcionamento da ativação de macrófagos para perfis

altamente fagocíticos (programas fagocítico) ou para macrófagos microbicidas (programa

antimicrobiano) pode estar relacionada à presença destas citocinas. Especificamente, o

programa fagocítico induzido em macrófagos pela IL-10 é evidente em pacientes com

hanseníase lepromatosa, todavia, o programa antimicrobiano induzido via vitamina D em

macrófagos pela IL-15 é observado em pacientes com forma tuberculoide da hanseníase.

Estes dados estabelecem que a produção seletiva de IL-15 ou IL-10 pelo sistema imune

inato, diferencialmente programa os macrófagos para fagocitose versus respostas

antimicrobianas, o que direciona o curso da infecção para resistência do hospedeiro ao

bacilo ou patogênese da doença infecciosa (MONTOYA et al., 2009).

Os NLRs são outro grupo de PRRs citosólicos importantes na defesa contra o M.

leprae, levando-se em consideração seu caráter intracelular obrigatório. A ativação

específica de NOD2 e TLR2/1 e, por conseguinte a indução de diferentes respostas

imunes inatas foi investigada na hanseníase. A ativação do NOD2 ocorre pelo

reconhecimento de dipeptídeos muramil (MDP) presentes no peptidoglicano de várias

bactérias incluindo o M. leprae e promove a diferenciação de monócitos em células

dendríticas na presença de IL-32 (MODLIN, 2010; PEDRA et al., 2009).

As DCs derivadas de monócitos via IL-32 expressam maior quantidade de MHC

de classe I e CD86, o que aumenta a sua capacidade de apresentar antígenos para células

T CD8+ restritas ao MHC I. Além disso, a análise de lesões de pele e monócitos do sangue

16

periférico de pacientes com hanseníase sugere que a ativação de NOD2 via MDP e

consequente diferenciação de DCs por meio da IL-32 correlaciona-se com o

desenvolvimento da forma tuberculoide versus a forma disseminada da hanseníase.

Portanto, a ativação de TLR2/1 contribui para funções efetoras diretas da resposta imune

inata, mediante a diferenciação de macrófagos, por outro lado a ativação de NOD2

colabora na função instrutiva da resposta adaptativa pelo sistema imune inato via

diferenciação de células dendríticas (SCHENK et al., 2012). A relevância do NOD2 na

patogênese da hanseníase foi demonstrada em um estudo de associação de genoma

completo na China, que identificou SNPs em NOD2 e RIP2 predominantemente

associados a hanseníase lepromatosa versus a forma tuberculoide da doença. Este estudo

sugere que os SNPs em NOD2 e RIP2 estão envolvidos na suscetibilidade a hanseníase

MB (ZHANG et al., 2009).

17

Figura 2 – Principais receptores associados à resposta imune ao M. leprae

Abreviações: C3, fator 3 do complemento; CR1, receptor 1 do complemento; DEFB1,

Beta defensina 1; IFN, interferon gama; IL10, interleucina-10; IL12B, subunidade p40

da interleucina-12; IL12RB2, receptor beta 2 da interleucina-12; LTA4H, leucotrieno A4

hidrolase; LTA, linfotoxina alfa; MHC II, complexo de histocompatibilidade principal

classe II; MBL2, lectina ligadora de manose 2; MRC1, receptor de manose 1; NOD2,

domínio de oligomerização de nucleotídeos 2; RIP2, receptor de interação com cinase 2;

NRAMP1, proteína 1 de macrófago associada a resistência natural; TCR, receptor de

célula T; Th1, célula T auxiliar tipo 1; Th2, célula T auxiliar tipo 1; TLR, receptor Toll-

like; TNF, fator de necrose tumoral. Adaptado de MISCH et al 2010.

18

Posteriormente ao reconhecimento, as DCs fagocitam o M. leprae e exercem sua

capacidade de processamento e apresentação de antígenos. O reconhecimento dos bacilos

e subsequente produção local de citocinas e quimiocinas podem regular a inflamação e

manipular o curso da infecção para uma resposta imune adaptativa do tipo Th1 ou Th2

(SCOLLARD et al., 2006).

No polo tuberculoide da hanseníase as DCs e os macrófagos ativados produzem

citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12 que induz células T naive a se diferenciarem

para o perfil Th1. As células Th1 produzem citocinas pró-inflamatórias como IFN,

TNF, IL-12, IL-23 e IL-2, as quais são responsáveis pela destruição do bacilo e

manutenção da resposta celular. As células Th1 CD4+ produtoras de IFN são

predominantes em lesões de pacientes com hanseníase tuberculoide (BRITTON;

LOCKWOOD, 2004). Sob a ação do IFN, o macrófago aumenta a produção de reativos

intermediários do oxigênio (ROI) e de nitrogênio (RNI) com o objetivo de eliminar ou

diminuir a proliferação do M. leprae (ADAMS et al., 2000). O IFN também induz a

ativação da enzima óxido nítrico sintetase responsável pela indução da produção do óxido

nítrico, que leva à destruição dos bacilos no interior dos macrófagos.

O IFN produzido pelas células dendríticas, macrófagos e células natural killer

(NK) também aumenta a expressão do receptor da IL-12 e ativação das células T por esta

citocina produzida pelas células da imunidade inata, o que contribui para a diferenciação

do perfil Th1, e para a produção adicional de IFN. Além disso, essa citocina exerce

importante papel na inibição de linfócitos Th2 (GOULART et al., 2002).

O TNF é uma citocina pro-inflamatória multifuncional produzida pelos monócitos

e macrófagos e é importante para o controle de micobactérias e outras doenças infecciosas

(MISCH et al., 2010). O TNF está envolvido na regulação da imunidade ao M. leprae

atuando na ativação de macrófagos e células Th1, tornando-se a principal citocina

responsável pela formação e manutenção do granuloma em pacientes com hanseníase

tuberculoide, mas por outro lado, seus efeitos podem resultar em imunopatologia, tais

como dano aos nervos periféricos e necrose tecidual (ROACH et al., 2002; SIELING;

MODLIN, 1994).

A ideia de que o granuloma funciona como uma barreira à proliferação e

disseminação micobacteriana foi difundida por décadas. Contudo, um estudo demonstrou

que o M. tuberculosis utiliza o granuloma para sua proliferação e disseminação. O bacilo

19

da tuberculose acelera a apoptose de macrófagos infectados no granuloma, favorecendo

o rápido recrutamento de outros macrófagos para a fagocitose destas células mortas. Os

macrófagos recém-chegados logo se tornam infectados e também sofrem apoptose,

promovendo o recrutamento de outros macrófagos, este ciclo vicioso favorece a

proliferação do bacilo no interior destas células, além de promover a disseminação da

infecção, pois, durante este processo alguns macrófagos infectados migram do granuloma

para outros tecidos (RAMAKRISHNAN, 2012). Apesar desta descoberta acerca do

granuloma, deve-se levar em consideração que não há proteção na ausência da formação

de granulomas, e que estas estruturas são as únicas compostas por macrófagos repletos

de micobactérias e células T ativadas justapostas, onde é observada reduzida proliferação

do M. tuberculosis, fato este que sugere uma causalidade para sua existência (EHLERS;

SCHAIBLE, 2012).

Outro estudo relatou um fato semelhante ao descrito para a tuberculose

envolvendo o papel da célula de Schwann na disseminação do M. leprae para outros sítios

anatômicos. Masaki e colaboradores identificaram um inesperado mecanismo pelo qual

o bacilo da hanseníase dissemina-se pelo organismo. Curiosamente, acredita-se que a alta

carga bacilar em células de Schwann por períodos extensos promova a desdiferenciação

e reprogramação das células de Schwann infectadas adultas para um estado de células

progenitoras mesenquimais “stem-cell-like” (pSLC). As pSLCs apresentam uma série de

propriedades notáveis como alta capacidade proliferativa e migratória, o que pode ser um

importante fator na disseminação do patógeno. Além disso, estas células são capazes de

se rediferenciar em vários tipos celulares mesodérmicos e de se integrar a músculos

esquelético e liso disseminando assim o M. leprae por estes tecidos. Finalmente, as pSLCs

infectadas secretam uma variedade de moléculas imunomoduladoras que atraem

macrófagos, para os quais as pSLCs transferem o M. leprae tornando-os infectados. Este

ciclo resulta na formação de uma estrutura semelhante a um granuloma (granuloma-like

structures - GLS) que se torna a fonte de macrófagos infectados, que atuam como outro

veículo para a disseminação sistêmica do patógeno (MASAKI et al., 2013; WEGNER,

2013).

A hanseníase lepromatosa é caracterizada por resposta imune Th2, secreção de

IL-10 e IL-4, produção de anticorpos, ausência de granulomas e falha em conter o

crescimento do M. leprae (MISCH et al., 2010). As DCs de pacientes com a forma

lepromatosa produzem IL-4 e IL-10, polarizando a resposta para o pólo Th2 (MAEDA et

20

al., 2003). Quando ocorre uma polarização para a resposta imune do tipo Th2, observa-

se exacerbação da resposta humoral que é ineficaz para a eliminação dos bacilos

intracelulares e causa maior suscetibilidade à hanseníase (MODLIN et al., 1986). O M.

leprae possui mecanismos de escape à sua eliminação, como a produção dos antígenos

PGL-I e LAM, que têm como função a supressão da ativação macrofágica e estimulação

da resposta Th2, o que proporciona condições para que o bacilo fique protegido no

citoplasma da célula, multiplicando-se, formando globias e disseminando-se

(HASHIMOTO et al., 2002).

A resposta imune humoral cursa com a produção de citocinas como TGF, IL-4,

IL-5 e IL-10, as quais inibem a ativação de macrófagos e diminuem a expressão de

moléculas MHC II pelas células apresentadoras de antígenos (SIELING; MODLIN,

1994). A IL-4 atua ainda diminuindo a expressão de TLR-2 nos monócitos

(BRIGHTBILL et al., 1999) e induz a produção de imunoglobulinas por linfócitos B

(MODLIN et al., 1986). O TGF-β (transforming growth factor-) tem atividade

imunossupressora de linfócitos T pela inibição da produção de IL-12 e IFN-

(KHANOLKAR-YOUNG et al., 1995; KISZEWSKI et al., 2003). A IL-5 é produzida

pelas células Th2 e inibe fortemente a produção de TNF e IL-12 além de estimular a

produção de IL-4 pelos macrófagos. A IL-10 é uma citocina produzida por macrófagos e

DCs que inibe a produção de substâncias microbicidas como reativos de oxigênio, óxido

nítrico e catelecidinas em macrófagos infectados pelo M. leprae (SIELING et al., 1993).

As citocinas descritas acima são encontradas em lesões de pacientes com as formas

LL/BL da hanseníase (YAMAMURA et al., 1992).

Sabe-se que interferons tipo I (IFN e IFN) são importantes para a proteção

contra muitas infecções virais, ao passo que IFN é essencial para a defesa do organismo

contra alguns patógenos bacterianos (FABRI et al., 2011; O’CONNELL et al., 2004;).

Entretanto, um estudo revelou uma correlação inversa na hanseníase entre IFN e IFN.

Neste estudo, foi demonstrado que em lesões TT e na reação tipo 1, houve expressão

aumentada de IFN e baixa expressão de IFNβ, enquanto que em lesões de pacientes LL

observou-se baixa expressão de IFN e predomínio de expressão de IFNβ, o qual é

coexpresso com a citocina IL-10 nestas lesões. A relação entre IFN e IL-10 revelou que

o IFN é capaz de induzir a secreção de IL-10 e que a indução de IL-10 pelo M. leprae é

21

parcialmente dependente da sinalização via interferons tipo I, o que sugere uma via IFN

- IL-10 em lesões lepromatosas. (TELES et al., 2013).

Novos perfis imunes têm emergido apresentando importantes implicações nas

infecções micobacterianas. Dentre estes perfis destacamos o perfil de células T

reguladoras (Treg) cuja importante função é bem estudada em diferentes doenças crônicas

granulomatosas, na hanseníase a função destas células ainda não é bem elucidada

(PALERMO et al., 2012).

Inicialmente, na tentativa de esclarecer o papel das células Treg na infecção pelo

M. leprae, foram realizados alguns estudos avaliando a frequência das células Treg CD4+

CD25+ e Foxp3+ na circulação e na pele de pacientes com diferentes formas clínicas da

hanseníase (TT, BT, BB, BL e LL), indivíduos com reação hansênica tipo 1 e indivíduos

sem hanseníase. Maior frequência de células Treg expressando Foxp3+ foi encontrada em

pacientes com hanseníase quando comparados com indivíduos sem hanseníase. Dentre as

formas clínicas, a forma TT apresentou maior frequência de Tregs na circulação, ao passo

que a forma LL apresentou uma frequência diminuída de células Treg. Por outro lado, as

biópsias de pele revelaram que não houve diferença estatística na expressão de Foxp3

entre as formas clínicas da hanseníase (TT, BT, BL, LL), contudo, houve uma tendência

de aumento na detecção de células Foxp3+ em biópsias de pele de indivíduos com reação

tipo 1 quando comparada com pacientes em reação tipo 2 e pacientes não reacionais

(ATTIA et al., 2010; MASSONE et al., 2010).

Desta forma, os autores sugerem que as células Treg desempenhem papel

patogênico na hanseníase, limitando a habilidade do sistema imune responder de forma

efetiva ao M. leprae. Resultados concordantes foram observados em estudo recente do

mesmo grupo com maior número de amostras. A expressão de Foxp3 em lesões de pele

foi maior entre pacientes com reação hansênica do tipo I em comparação com pacientes

não reacionais (I, BT e LL) (PARENTE et al., 2015).

Outro estudo avaliou paralelamente expressão de células Treg na circulação

periférica e em lesões de pele de pacientes com hanseníase, contatos domiciliares e

controles saudáveis. Este estudo demonstrou uma maior proporção de células T

reguladoras e IL-10 na circulação de pacientes lepromatosos, por outro lado, a produção

de IFN foi maior entre os pacientes com hanseníase tuberculoide. (PALERMO et al.,

2012). Resultados semelhantes foram observados por Saini e colaboradores (2014) ao

investigar o papel das células Treg em pacientes com hanseníase por meio da avaliação de

22

lesões de pele e de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, peripheral blood

mononuclear cells). Uma maior expressão de Foxp3+, TGF-β e IL-10 foi observada tanto

na pele, quanto em PBMCs estimulados com M. leprae de pacientes com hanseníase

lepromatosa em comparação com hanseníase tuberculoide e contatos saudáveis. O estudo

sugere que a maior expressão de células Treg nos pacientes lepromatosos favorece a não

responsividade aos antígenos do M. leprae, fato que contribui para a persistência de alta

carga bacilar (SAINI et al., 2014).

Poucos são os estudos acerca do papel das células Th17 na hanseníase, contudo,

alguns trabalhos tem buscado esclarecer a importância deste perfil na infecção pelo M.

leprae. Martiniuk e colaboradores investigaram o envolvimento das células Th17 no

ENH, uma vez que a presença abundante de PMNs é característica marcante do perfil

Th17 e do ENH. Este estudo demonstrou que a IL-17A foi detectada em pacientes

reacionais sugerindo que o perfil Th17 pode estar envolvido na patogênese do ENH

(MARTINIUK et al., 2012).

Outros estudos anteriores demonstraram que alguns pacientes de ambos os

espectros da hanseníase não polarizam sua resposta imune para nenhum dos perfis imunes

Th1 e Th2 classicamente descritos (MISRA et al., 1995). De posse deste conhecimento,

um estudo investigou a função das células Th17 em PBMCs e lesões de pele proveniente

de pacientes de ambos os polos da hanseníase, contatos intradomiciliares e indivíduos

clinicamente saudáveis. Maiores níveis das isoformas de IL-17 foram detectadas entre

contatos intradomiciliares e pacientes com hanseníase tuberculoide, quando comparados

com pacientes lepromatosos. Dentro do espectro da hanseníase, a forma tuberculoide

obteve maiores de níveis IL-21, IL-22, e expressão do fator de transcrição RORC. Além

disso, a fenotipagem celular identificou que a maioria das células IL-17+ foram CCR6+

sugerindo a existência de uma população de células T CD4+ efetoras. Este estudo sugere

que as células Th17 podem configurar um terceiro subtipo de células T auxiliares, atuando

como uma via alternativa para o controle da carga bacilar em pacientes onde a polarização

para Th1 ou Th2 não é observada (SAINI et al., 2013).

Resultados semelhantes foram encontrados em um estudo que documentou uma

maior expressão de células TH17 e IL-17 em pacientes com hanseníase PB e contactantes

de pacientes MB, sugerindo uma relação positiva entre IFN e IL-17 que podem estar

atuando sinergisticamente para controlar a infecção. Além disso, pacientes MB não

tratados demonstraram menor expressão de células CD4+IFN+ e CD4+IL-17+, porém,

23

após o segundo mês da MDT estas populações expandiram significantemente, sugerindo

o envolvimento das células Th17 nos processos imunológicos relacionados com a cura da

infecção (ALMEIDA –NETO et al., 2014).

A associação entre células Th17 e Treg na hanseníase foi investigada por um estudo

recente. Baixa secreção de IL-17 e elevada produção de IL-10 e TGFβ foi observada em

pacientes com hanseníase quando comparado a indivíduos saudáveis. Além disso, as

formas TT, neural pura e RT1 apresentam maior frequência de células CD4+ CD25high

Foxp3+Tregs. Este estudo sugere que altos níveis de IL-10 associados a baixos níveis de

IL-17 pode contribuir para a progressão da hanseníase ou para o polo MB da doença

(ATTIA et al 2014).

1.7 Diagnóstico da hanseníase

1.7.1 Diagnóstico clínico

Embora a hanseníase seja reconhecível nos estágios tardios, podem surgir

dificuldades de diagnóstico nos estágios iniciais, quando as manifestações clínicas estão

em desenvolvimento e são inespecíficas. A anamnese e o exame físico cuidadoso

permitem quase sempre que o diagnóstico seja realizado, porém, é de extrema

importância que a hanseníase seja corretamente diagnosticada no início dos sintomas para

que danos neurais irreversíveis sejam evitados (TALHARI; NEVES, 1997;

YAWALKAR, 2009).

O diagnóstico de caso de hanseníase é essencialmente clínico e epidemiológico, e

é realizado por meio do exame dermato-neurológico que se baseia no achado de um ou

mais sinais cardinais, como, presença de lesões de pele hipopigmentadas ou eritematosas

anestésicas ou hipoestésicas, sinais de lesão neural periférica, paralisia e disfunção com

ou sem espessamento neural. A identificação das lesões neurológicas é realizada pela

inspeção dos olhos, nariz, mãos e pés, palpação dos troncos nervosos periféricos,

avaliação da força muscular e a avaliação de sensibilidade nos olhos, membros superiores

e inferiores (BRASIL, 2002). Além disso, deve-se levar em consideração a história e

condições de vida do paciente como, por exemplo, tratamentos prévios e contato com

pessoas hansênicas da família ou do trabalho (YAWALKAR, 2009).

24

1.7.2 Diagnóstico laboratorial

Os exames laboratoriais que podem ser empregados no auxílio do diagnóstico da

hanseníase são escassos, e a maioria deles nem sempre são realizados na prática clínica.

Dentre os exames disponíveis estão a baciloscopia do raspado intradérmico, exame

histopatológico, teste cutâneo de Mitsuda, sorologia e reação em cadeia da polimerase

(PCR). O teste considerado padrão ouro para o diagnóstico de hanseníase é o exame

histopatológico de biópsia da borda de lesão, onde podem ser reconhecidos padrões

histopatológicos característicos, o envolvimento de nervos e a presença do bacilo. A

baciloscopia é considerada um exame semi-quantitativo da carga bacilar do paciente

(SCOLLARD et al., 2006). A reação de Mitsuda é um teste de aplicação intradérmica e

leitura tardia - 28 dias. Utiliza-se na classificação da doença e na definição do

prognóstico. Não possui valor para o diagnóstico. A identificação do M. leprae pela PCR

tem sido estudada em centros de pesquisa, mas não é realizada rotineiramente (ARAÚJO,

2003).

1.7.2.1 Baciloscopia e Exame histopatológico

O raspado intradérmico das lesões e dos lóbulos auriculares e/ou cotovelo é o

exame complementar que auxilia o diagnóstico da hanseníase é de fácil execução e baixo

custo. Colhe-se o material a ser examinado (raspado de tecido dérmico) nos lóbulos das

orelhas direita e esquerda, cotovelos direito e esquerdo e em lesão suspeita. A coloração

é feita pelo método de Ziehl-Neelsen e apresenta-se o resultado sob a forma de índice

baciloscópico (IB), numa escala que varia de 0 a 6+. Nos pacientes LL, a baciloscopia

tende a ser positiva, porém na forma tuberculoide a baciloscopia é por definição negativa

e apresenta resultado variável nas formas intermediárias (ARAÚJO, 2003; BRASIL,

2002).

O exame histopatológico baseia-se na análise microscópica de biópsias de lesões

de pele, ou de nervos sendo geralmente utilizado para a classificação histopatológica da

hanseníase. No exame histopatológico da hanseníase se pesquisa a presença de

granulomas, agressão neural, BAAR, vasculite na derme e/ou hipoderme, paniculite,

infiltrado celular, estratificação e espessamento de tecidos (RIDLEY, 1955). Os

resultados do exame histopatológico de lesões de pele de pacientes de hanseníase diferem

de acordo com a classificação destes pacientes. O exame histopatológico e a baciloscopia

não fazem parte dos exames de rotina preconizados pela OMS para o diagnóstico da

25

hanseníase, e consequentemente também não são recomendados pelo Programa Nacional

de Controle da Hanseníase, mas são realizados em protocolos de pesquisa para a

classificação da hanseníase (WHO, 2000).

1.8 Diagnóstico diferencial da hanseníase

A hanseníase é uma doença dermato-neurológica que apresenta características

clínicas e neurológicas pleomórficas e pode ser confundida com outra doença, ou alguma

doença cutânea neurológica pode ser confundida com a hanseníase. O diagnóstico da

hanseníase é simples, mas requer muita habilidade para diferenciar lesões cutâneas e

reconhecer comprometimento neural. Quando o diagnóstico se baseia somente em

manchas anestésicas é possível perder aproximadamente 30% dos casos MB

(LOCKWOOD; SUNNETHA, 2005). De acordo com a OMS o diagnóstico da hanseníase

pode ser feito se um ou mais dos seguintes sinais cardinais da doença estiverem presentes.

São eles: (1) presença de lesões de pele hipopigmentadas ou eritematosas com perda de

sensibilidade, (2) espessamento de nervos e (3) presença de bacilos álcool-ácido

resistentes.

Entretanto, a possibilidade de presença de várias doenças frequentes ou raras deve

ser sempre lembrada, uma vez que as lesões da hanseníase mimetizam uma variedade de

doenças não relacionadas (GUINTO et al., 1990; YAWALKAR, 2009). O diagnóstico

diferencial de lesões hipopigmentadas na hanseníase incluem vitiligo, hipomelanose,

pitiríase alba, tinea versicolor, tinea corporis, hipopigmentação pós-inflamatória e etc

(YANG et al., 2013). Lesões infiltradas na hanseníase podem ser confundidas com herpes

zoster, lúpus vulgaris, lúpus eritematoso, granuloma anular, pelagra, tinea circinata,

psoríase dentre outras. Lesões nodulares podem ser confundidas com sífilis, leishmaniose

cutânea, leishmaniose dérmica pós-calazar, linfoma cutâneo de células T e etc

(YAWALKAR, 2009). O diagnóstico diferencial da hanseníase também deve ser feito a

nível histopatológico, pois, a hanseníase tuberculoide deve ser diferenciada de outras

dermatites granulomatosas, tais como tuberculose, sarcoidose e leishmaniose

granulomatosa tegumentar pós calazar, contudo a elucidação do diagnóstico pode ser

realizada mediante a demonstração de bacilos álcool-ácido resistente (SINGH A, 2013).

Existem alguns relatos na literatura de diagnósticos errôneos devido à dificuldade

encontrada pelos clínicos em fazer o diagnóstico diferencial da hanseníase como no relato

de caso de um brasileiro que foi tratado para tinea versicolor, entretanto após exames mais

26

detalhados foi demonstrado após 1 ano que se tratava de um caso de hanseníase. Neste

contexto, o diagnóstico e tratamento precoce da hanseníase são vitais para a prevenção

de incapacidades e desfigurações (YANG et al., 2013).

1.9 Avaliação da resposta imune celular e humoral à antígenos do M. leprae

O desenvolvimento de métodos laboratoriais de detecção da hanseníase,

aplicáveis em situação de campo que possam ser utilizados para fins de diagnóstico de

todas as formas clínicas, ou classificação da doença, é considerado prioridade iminente

em pesquisa. Um dos desafios para o desenvolvimento de novos testes laboratoriais para

o diagnóstico da hanseníase foi a escassa oferta de antígeno, visto que o bacilo não é

cultivável em meios axênicos. Neste sentido, a decodificação do genoma do M. leprae,

aliada a novos avanços na produção de proteínas recombinantes e a disponibilidade de

novas ferramentas de bioinformática, permitiram a produção de diversas proteínas

recombinantes do M. leprae e a avaliação da imunoreatividade em pacientes e controles

de área endêmica por vários grupos de pesquisa. Vários estudos já foram realizados

utilizando o peptídeo sintético do PGL-I em testes sorológicos e as proteínas

recombinantes do M. leprae em testes sorológicos e de imunidade celular. Apesar de estes

testes serem utilizados apenas para fins de pesquisa científica, os estudos demonstram

resultados que apoiam o uso destes testes como exames complementares para auxiliar o

diagnóstico da hanseníase.

1.9.1 Testes sorológicos

A maioria dos testes diagnósticos para doenças infecciosas baseia-se em testes

sorológicos e o PGL-I foi um dos primeiros antígenos específicos do M. leprae a ser

isolado e utilizado em testes sorológicos para hanseníase (BRENNAN; BARROW,

1980). A descoberta e elucidação da estrutura química do glicolipídeo específico do M.

leprae e de seu potencial antigênico foram grandes inovações na pesquisa em hanseníase

(MOURA et al., 2008). O PGL-I é o antígeno específico presente na parede celular do M.

leprae mais utilizado na sorologia da hanseníase que devido a sua natureza glicolipídica

estimula predominantemente a produção de anticorpos da classe IgM (BRENNAN;

BARROW, 1980; BRETT et al., 1983). Os anticorpos IgM anti-PGL-I são altamente

específicos e não apresentam reação cruzada com o M. tuberculosis ou com outras

micobactérias conhecidas (CHO et al., 1992).

27

As principais dificuldades para produção de grandes quantidades de PGL-I se

devem ao fato do M. leprae não ser cultivável in vitro, e ao fato da molécula de PGL-I

ser extremamente apolar o que requer procedimentos de deacilação e incorporação do

PGL-I a lipossomas para permitir a utilização do PGL-I em ensaios imunológicos. Outros

estudos propuseram a produção sintética da porção trissacarídea do PGL-I ou dos

terminais monossacarídeo e dissacarídeo associados a carreadores hidrossolúveis

(BSA/HSA), sendo produzidos os seguintes análogos sintéticos do PGL-I:

monossacarídeo–octyl–BSA (M-O-BSA), dissacarídeo natural-octyl–BSA (NDO–BSA),

dissacarídeo natural-octyl–HSA (NDO-HSA), trissacarídeo natural-phenil–BSA (NTP-

BSA) e o trissacarídeo natural-phenil– HSA (NTP-HSA). O PGL-I nativo e seus análogos

sintéticos têm sido amplamente utilizados em vários formatos para a detecção de

anticorpos anti PGL-I: ELISA, aglutinação de partículas, “dipstick” e teste rápido de

fluxo lateral (CHO et al., 1983; BURGESS, et al., 1988; STEFANI, 2008).

A sorologia para detecção de anticorpos IgM específicos para o PGL-I representa

o teste sorológico melhor avaliado e padronizado para hanseníase. A produção de

anticorpos anti-PGL-I está relacionada com a alta carga bacilar e doença MB (GELBER

et al., 1989; SCHWERER et al., 1984; YOUNG; BUCHANAN, 1983).

Vários estudos já demonstraram a ampla aplicabilidade e potencial uso da

sorologia positiva anti-PGL-I para diversos fins como classificação/diferenciação de

pacientes MB e PB, associação com risco de adoecimento em contactantes de pacientes

MB, monitoramento da MDT, predição de reações e recidiva (BUHRER-SÉKULA et al.,

2003, 2007; CELLONA et al., 1993; CHO et al., 2001; GELBER et al., 1989; ROCHE et

al., 1991).

Apesar de todos os estudos realizados evidenciando a confiabilidade da sorologia

PGL-I, deve-se ressaltar que este método sorológico apresenta limitado valor diagnóstico

para hanseníase PB, pois esta categoria de pacientes tem IB baixo ou ausente e é

caracterizada por desenvolver resposta imune celular, ao invés de resposta imune

humoral. Além disso, em áreas endêmicas, uma proporção significativa de indivíduos

saudáveis pode ter sorologia anti-PGL-I positiva. O consenso é de que testes sorológicos

para detecção de imunoglobulinas IgM contra o PGL-I são úteis para auxiliar no

diagnóstico quando os resultados são considerados juntos com as informações clínicas

para auxiliar a classificação de hanseníase MB e PB, e para orientar decisões terapêuticas,

28

fornecendo melhor especificidade que a simples contagem do número de lesões

(BUHRER-SÉKULA et al., 2003, 2007; OSKAM et al., 2003).

O advento da codificação do genoma do M. leprae viabilizou a produção e o uso

de proteínas recombinantes em testes sorológicos (ELISA) para detecção de anticorpos

da classe IgG e revelou novos antígenos candidatos ao uso no diagnóstico sorológico da

hanseníase, especialmente para pacientes com hanseníase MB (ARÁOZ et al., 2006a;

CORSTJENS et al., 2011; DUTHIE et al., 2007, 2010; GELUK et al., 2009; REECE et

al., 2006; SPENCER et al., 2005).

Diferentes estudos avaliaram a imunoreatividade a várias proteínas recombinantes

do M. leprae em pacientes com hanseníase e controles. Os primeiros estudos realizados

em várias regiões geográficas, como Filipinas, Coréia, Mali e Bangladesh, demonstraram

que pacientes com hanseníase MB apresentavam alta reatividade sorológica para algumas

proteínas recombinantes testadas, por outro lado, pacientes com hanseníase PB, contatos

de pacientes MB, controles saudáveis não endêmicos e pacientes com tuberculose

pulmonar mostraram baixa reatividade sorológica (ARÁOZ et al., 2006a; 2006b).

Dentre os estudos realizados, dois deles evidenciaram que pacientes MB das

Filipinas e do Brasil apresentavam alta sororeatividade para as proteínas ML0405 e

ML2331, e que a associação à sorologia PGL-I amplificou a reatividade sorológica em

pacientes com baixo IB comparada com a reatividade isolada do NDO-HSA (REECE et

al., 2006; DUTHIE et al., 2007).

Considerando a observação anterior de que as proteínas recombinantes ML0405

e ML2331 utilizadas individualmente apresentam potencial para diagnóstico da

hanseníase MB em diferentes regiões geográficas do mundo, foi construída uma proteína

de fusão única, incorporando ambas as proteínas ML0405 e ML2331 denominada LID-1

(Leprosy IDRI diagnostic 1). A proteína LID-1 foi avaliada simultaneamente com as

proteínas que a compõe (ML0405+ML2331) em pacientes com hanseníase PB e MB, e

em controles de área endêmica provenientes do Brasil e Japão. Foi demonstrado que a

proteína LID-1 é capaz de manter a imunoreatividade das proteínas originais, e

contactantes que desenvolveram hanseníase apresentaram maiores níveis de IgG em

comparação com os níveis de IgM para PGL-I indicando que LID-1 poderia fornecer o

diagnóstico precoce da hanseníase (DUTHIE et al., 2007; 2008).

Além da proteína de fusão LID-1, outra proteína de fusão quimérica com

multiepítopos (protein advances diagnostic of leprosy - PADL) foi projetada e produzida

29

a partir da fusão dos epítopos reativos de proteínas recombinantes do M. leprae (ML0405,

ML2311, ML2055, ML0049, ML0050 ML0091 e ML0411). De forma geral alta

soreatividade foi observada para PADL semelhante ao que foi observado para LID-1 em

estudos prévios com pacientes MB (DUTHIE et al., 2010).

Outro estudo realizado por Duthie e colaboradores em 2011 sugere que a sorologia

para rMLs, principalmente LID-1 poderia ser utilizada para monitorar a eficácia do

tratamento, uma vez que observou-se um declínio nos níveis de anticorpos após o

tratamento, exceto para pacientes TT que já apresentavam baixa sororeatividade ao

diagnóstico. Além disso, um dos contatos domiciliares apresentou resposta positiva e foi

diagnosticado com infecção subclínica pelo M. leprae sugerindo que a sorologia com

proteínas recombinantes do M. leprae poderia ser utilizada para monitorar a eficácia do

tratamento (DUTHIE et al., 2011).

Outro estudo realizado pelo nosso grupo de pesquisa avaliou a sororeatividade a

proteínas recombinantes do M. leprae em diferentes regiões endêmicas do Brasil. Este

estudo demonstrou que pacientes MB apresentaram alta positividade para proteínas LID-

1, ML0405 e PGL-I em todas as regiões demográficas analisadas, entretanto alguns

pacientes PGL-I negativos apresentaram resposta positiva para proteínas recombinantes

sugerindo que a combinação do PGL-I e proteína recombinante pode aumentar a

sensibilidade da detecção de hanseníase MB (HUNGRIA et al., 2012). Em concordância

com estes resultados, outro estudo evidenciou que a combinação da proteína LID-1 ao

PGL-I poderia melhorar a sensibilidade de um teste diagnóstico para hanseníase MB e

que a sororeatividade para LID-1 e PGL-I demonstrou ser capaz de predizer o início de

hanseníase MB em estudos experimentais e de vigilância clínica (QIONG-HUA et al.,

2013).

De posse deste conhecimento nosso grupo de pesquisa desenvolveu recentemente

um novo teste rápido para hanseníase MB, utilizando o dissacarídeo NDO do PGL-I e a

proteína LID-1 (NDO-LID-1) que detecta anticorpos IgM e IgG em 87% dos pacientes

MB. Estes antígenos foram imobilizados em uma membrana de nitrocelulose o que

permite detectar anticorpos específicos no soro do paciente usando o princípio do teste

“lateral flow”. O teste é acoplado a uma nova plataforma de leitura de testes baseada em

um celular smartphone (Smart Reader® application) que fornece resultados

quantificáveis e consistentes para definição do diagnóstico da hanseníase MB. A

comparação entre as respostas sorológicas indicou que o teste rápido detectou uma maior

30

proporção de pacientes com hanseníase quando comparado com o ELISA para PGL-I,

pois, cerca de 83,3% de pacientes MB e 15,4% de pacientes PB foram positivos para

sorologia PGL-I enquanto a detecção aumentou para 87% e 21,2% respectivamente

quando a combinação NDO-LID® foi utilizada (CARDOSO et al., 2013).

O novo teste rápido NDO-LID® apresentado neste estudo representa um

importante avanço no controle da hanseníase, capaz de auxiliar na detecção rápida,

quantitativa e consistente da hanseníase MB, contudo, estudos maiores de validação

devem ser desenvolvidos para avaliar o desempenho em condições de campo, incluindo

o uso direto de amostras de sangue de punção digital para demonstrar a sua utilidade como

um verdadeiro teste “point of care” (CARDOSO et al., 2013).

1.9.2 Testes de imunidade celular

Testes que avaliam a imunidade humoral apresentam pouca relevância para o

diagnóstico das formas PB da hanseníase, já que estas apresentam resposta fraca ou

ausente de anticorpos. Estudos que utilizam a detecção de IFN como marcador de

imunidade celular após estímulo de células sanguíneas com proteínas recombinantes ou

peptídeos sintéticos do M. leprae, tem como objetivo desenvolver um método diagnóstico

para hanseníase PB. A secreção de IFN em resposta a proteínas e peptídeos do M. leprae

é observada tipicamente em pacientes TT/BT, contatos domiciliares e controles

endêmicos (ARÁOZ et al., 2006b; DUTHIE et al., 2008; GELUK et al., 2005, 2009, 2010,

2012; SAMPAIO et al., 2011, 2012).

O desenvolvimento de ensaios de estimulação de células T in vitro baseados na

produção de IFNγ do tipo IGRA (interferon gamma release assays) para hanseníase PB

tem sido incentivado pelo uso de IGRAs para o diagnóstico da tuberculose. Os antígenos

homólogos usados nos IGRAs para tuberculose (Quantiferon TB gold in tube, ESAT-6 e

CFP-10 na tuberculose, ML0049 e ML0050 na hanseníase) apresentaram reação cruzada

em pacientes com tuberculose limitando assim sua aplicação para diagnóstico da

hanseníase (GELUK et al., 2009). Vários estudos têm investigado novos antígenos

protéicos do M. leprae visando o desenvolvimento de um teste laboratorial específico

para hanseníase PB.

Em 2005, a imunoreatividade celular a 4 proteínas recombinantes do M. leprae e

58 peptídeos sintéticos foi avaliada em pacientes com hanseníase e grupos controles do

Brasil. Esta avaliação foi baseada na detecção de IFN em sobrenadantes de cultura de

31

PBMCs incubadas por 72h. Dos 58 peptídeos testados, 35 induziram respostas com

produção de IFN somente nos grupos PB e contactantes, porém, nenhuma das proteínas

recombinantes testadas induziu resposta imune específica (SPENCER et al., 2005). No

ano seguinte um painel de 17 proteínas recombinantes do M. leprae foi testado em cultura

de PBMCs de pacientes com hanseníase e grupos controles do Brasil e Nepal. Destas,

cinco (ML0576, ML1989, ML1990, ML2283 e ML2567) induziram níveis significantes

de IFN em pacientes PB e contactantes de pacientes MB. Este estudo mostrou ainda que

diferentes populações respondem de forma diferenciada a uma determinada proteína do

M. leprae, provavelmente devido a diferentes formas alélicas de HLA (GELUK et al.,

2008).

As proteínas recombinantes estimulam maior produção de IFN quando

comparadas com peptídeos. Um estudo de 2010 avaliou estratégias para aumentar a

sensibilidade do ensaio de sangue total (EST – ensaio de sangue total) utilizando dois

peptídeos (p1-15 e 11-25) da proteína ML2531 pela adição de citocinas, adição de

anticorpos anti-CD49, CD28, CD40, IL-10 ou CD40L e pela manosilação de peptídeos.

Somente a citocina IL-12 aumentou a produção de IFN em cultura de sangue total em

amostras de pacientes com hanseníase BT da Holanda. Diferente do esperado, nenhum

dos anticorpos apresentou impacto no aumento da secreção de IFN pelas células T. A

manosilação não aumentou a sensibilidade do ensaio, entretanto, permitiu utilizar uma

quantidade 100 vezes menor dos peptídeos, diminuindo o custo do teste (GELUK et al.,

2010).

Estudo colaborativo com nosso grupo de pesquisa comparou paralelamente a

resposta de anticorpos e de células T (IFN) de pacientes com hanseníase MB e PB,

contatos domiciliares de pacientes MB, controles saudáveis de área endêmicas e pacientes

com TB pulmonar provenientes de Goiânia/Goiás. Um painel de 33 proteínas

recombinantes foi avaliado quanto à imunogenicidade e especificidade da resposta por

meio do ensaio imunoenzimático e WBA. Das 33 proteínas avaliadas 16 foram

imunogênicas e estimularam a produção de IFN em pacientes PB e contatos domiciliares

ou foram reconhecidas por anticorpos IgG de pacientes com hanseníase MB. As outras

17 proteínas avaliadas não foram imunogênicas. O número de proteínas capazes de

estimular a resposta de IFN foi superior ao número de proteínas que foram reconhecidas

por anticorpos IgG sugerindo que a indução da resposta imune humoral a antígenos

32

protéicos requer o reconhecimento inicial por linfócitos T CD4+ para que posteriormente

ocorra ativação de linfócitos B. Além disso, os resultados deste estudo mostraram que as

análises in silico não devem ser o único critério para exclusão de antígenos, visto que

proteínas com alta homologia com proteínas de outras micobactérias não apresentaram

reatividade cruzada. (SAMPAIO et al., 2011).

Sabendo-se que a produção de IFN para as proteínas do M. leprae é praticamente

idêntica entre os casos TT/BT e contatos domiciliares, outros biomarcadores que sejam

capazes de distinguir estes dois grupos foram investigados. Em outro trabalho do nosso

grupo de pesquisa, 14 biomarcadores (eotaxina, IFN-, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-

12p70, IL-15, IL-17A, IL-23, IL-31, CXCL10, e TNF) foram avaliados em pacientes

com hanseníase PB e MB e em contactantes de pacientes MB. Neste estudo nenhum

desses biomarcadores foi capaz de distinguir a resposta de pacientes com hanseníase

TT/BT da resposta de contatos domiciliares de pacientes MB, confirmando resposta com

perfil Th1 em ambos os grupos. Houve produção de IL-4 em ensaio de sangue total de

pacientes BL/LL. Entretanto, um contactante de paciente MB apresentou resposta imune

do tipo Th2 e ausência de IFN que poderia indicar doença MB inicial ou subclínica. O

seguimento deste contato é essencial para determinar o valor prognóstico deste

imunomarcador (SAMPAIO et al., 2012).

Outro estudo semelhante avaliou a resposta a 17 proteínas recombinantes e 19

biomarcadores (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A,

IFN, CXCL10, FSC-G, FSC- GM, MCP-1, CXCL9, MIP-1 e TNF), com o objetivo de

encontrar biomarcadores que distinguissem controles endêmicos de pacientes TT/BT.

Foram avaliados pacientes com hanseníase PB, contatos domiciliares, pacientes com TB

pulmonar e controles endêmicos provenientes do Brasil (Fortaleza), Bangladesh, Coréia

do Sul e Etiópia. Apenas, a proteína ML2478 foi capaz de estimular resposta de células

T específica em grupos geneticamente diversos (Africano, Asiático e da América do Sul).

A citocina IL-1 e as quimiocinas MIP-1 e MCP-1 foram capazes de diferenciar pacientes

TT/BT e controles endêmicos. Entretanto, foi observada resposta entre contatos

domiciliares e em pacientes com tuberculose. Estudos de coorte envolvendo um grande

número de pacientes e controles são necessários para validar o uso destas ferramentas

para predizer uma resposta imune patogênica ao M. leprae (GELUK et al., 2012).

Recentemente, nosso grupo de pesquisa avaliou a potencial aplicação de

combinações antigênicas no diagnóstico da hanseníase PB. As proteínas recombinantes

33

foram avaliadas individualmente ou em combinação, quanto a sua capacidade de induzir

produção de IFN em pacientes com hanseníase PB e MB, pacientes com tuberculose,

controles saudáveis de área endêmica e contactantes de pacientes com hanseníase MB.

Três das cinco combinações testadas em ensaio de sangue total (46f+LID-1,

ML0276+LID-1, ML2055+ML1632+ML2044) induziram altos níveis de IFN, quase o

dobro da quantidade de IFN quando comparada com o estímulo das proteínas utilizadas

individualmente em pacientes PB e contactantes de MB. A combinação 46f + ML0276

promoveu a produção de IFN em pacientes PB e não induziu produção desta citocina em

contactantes de pacientes MB, sugerindo que esta combinação antigênica seja capaz de

diferenciar do ponto de vista de imunidade celular estes dois grupos de indivíduos tão

distintos, onde um deles apresenta a doença ativa e o outro não apresenta sinais ou

sintomas de hanseníase. Nenhuma das combinações antigênicas induziu produção de

IFN entre controles de área endêmica ou pacientes com tuberculose indicando a

especificidade desta resposta em uma área endêmica com alta cobertura vacinal pela BCG

(OLIVEIRA et al., 2014).

34

2 JUSTIFICATIVA

A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa milenar, entretanto vários países

do mundo, dentre eles o Brasil, apresentam alta taxa de incidência. O diagnóstico da

hanseníase é baseado em sinais e sintomas da doença e requer treinamento clínico para

diferenciar os sintomas da hanseníase de outras doenças dermatológicas semelhantes.

Entre os maiores desafios para o controle e eliminação da hanseníase está o diagnóstico

precoce antes do desenvolvimento de sequelas irreversíveis associadas à doença,

permitindo o início do tratamento (MDT) que é crucial para interromper a cadeia de

transmissão do M. leprae em regiões endêmicas. Apesar de a MDT ser considerada eficaz,

pouco se sabe sobre seu impacto na resposta imune dos pacientes. Neste sentido o uso de

testes para o diagnóstico laboratorial que sejam aplicáveis em situações de campo e que

possam auxiliar no diagnóstico diferencial pode contribuir para o controle da doença.

Nosso grupo de pesquisa vem atuando na última década na testagem de novos

antígenos proteicos para diagnóstico para hanseníase. Dentre os antígenos mais

promissores está o LID-1, uma proteína de fusão que é reconhecida por teste sorológico

em pacientes MB e em testes de imunidade celular em pacientes PB. Desta forma, este

estudo representa uma oportunidade de avaliarmos a utilidade dos testes sorológico e

celular utilizando LID-1 para o diagnóstico diferencial da hanseníase e outras dermatoses

como eczema, psoríase, dermatofitoses e etc. Paralelamente nossos resultados prévios

indicaram resposta imune celular e humoral específica em pacientes PB e MB virgens de

tratamento. Entretanto, não sabemos qual é o efeito da MDT na resposta imune destes

pacientes. Na presente tese pretendemos investigar a influência da MDT na resposta

imune celular de pacientes com hanseníase PB e MB e a utilidade de testes sorológico e

celular com LID-1 para o diagnóstico diferencial da hanseníase.

35

3 OBJETIVOS

Objetivo Geral

Avaliar a resposta imune celular e humoral a proteínas recombinantes do M.

leprae em pacientes com hanseníase PB e MB antes e após o tratamento (MDT) e em

pacientes portadores de outras dermatoses.

. Objetivos específicos

Avaliar a influência da MDT na resposta imune celular a proteínas recombinantes

do M. leprae em pacientes PB;

Estudar o impacto da MDT na resposta imune humoral a proteínas recombinantes

do M. leprae em pacientes PB;

Investigar o efeito MDT na resposta imune celular a proteínas recombinantes do

M. leprae em pacientes MB;

Descrever o impacto da MDT na resposta imune humoral a proteínas

recombinantes do M. leprae e ao PGL-I em pacientes MB;

Avaliar a utilidade do teste de imunidade celular, Ensaio de sangue total (EST)

para LID-1 para fins de diagnóstico diferencial da hanseníase PB e outras

dermatoses clinicamente semelhantes à hanseníase;

36

Investigar a potencial aplicação da sorologia para LID-1 e PGL-I no diagnóstico

diferencial da hanseníase e outras dermatoses clinicamente semelhantes à

hanseníase.

37

4 MÉTODOS

4.1 Grupos de estudo

Este estudo foi dividido em duas abordagens distintas:

4.1.1 Abordagem 1: Avaliação do efeito da MDT na resposta imune celular e humoral

a proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com hanseníase PB e MB.

Este estudo longitudinal e prospectivo avaliou 30 pacientes com hanseníase recém

diagnosticados, não tratados, recrutados entre Julho de 2010 e Novembro de 2012. Após

o término da MDT estes mesmos pacientes foram convidados a retornar em dois

momentos após a conclusão do tratamento para uma nova avaliação da imunidade celular

e humoral. A maioria dos pacientes retornou pelo menos duas vezes; cerca de 4 meses

para pacientes MB e 8 meses para pacientes PB, e aproximadamente dois anos após a

conclusão do tratamento (20 meses para PB e 22 meses para MB). Segue abaixo o número

de pacientes recrutados em cada período.

§ N=15 pacientes com hanseníase PB recém diagnosticados, não tratados;

§ N=15 pacientes com hanseníase MB recém diagnosticados, não tratados;

§ N=11 pacientes com hanseníase PB após o tratamento (1ª coleta);

§ N=12 pacientes com hanseníase MB após o tratamento (1ª coleta);

§ N=09 pacientes com hanseníase PB após o tratamento (2ª coleta);

§ N=09 pacientes com hanseníase MB após o tratamento (2ª coleta);

Os pacientes com hanseníase PB e MB foram recrutados no Centro de Referência

em Diagnóstico e Terapêutica (CRDT) em Goiânia-GO, e foram submetidos à avaliação

dermato-neurológica e testes de sensibilidade tátil, térmica e dolorosa. Estas avaliações

foram realizadas por dermatologista com comprovada experiência em diagnóstico clínico

de hanseníase. Além do exame clínico os pacientes com hanseníase recém diagnosticados

38

e não tratados foram submetidos a exames complementares para confirmação do

diagnóstico e classificação da forma clínica. Entre estes exames foram realizados:

Baciloscopia - foi realizada a pesquisa BAAR na linfa de pacientes com suspeita

clínica de hanseníase PB e MB. A linfa foi colhida de quatro diferentes regiões do corpo

(lóbulos da orelha, cotovelo e lesão). O índice baciloscópico foi obtido pela média de

BAAR encontrados na linfa.

Histopatológico - as lesões de pele de pacientes com hanseníase PB e MB e de

indivíduos portadores de outras dermatoses foram biopsiadas com “punch” descartável,

número cinco, marca Kolplast (SãoPaulo, SP, Brasil). Os fragmentos de tecidos coletados

foram fixados em formol tamponado a 10%, processados em 24 horas para corte em

parafina e corados pela hematoxilina-eosina (HE) e Fite-Faraco. As avaliações

histopatológicas foram realizadas por patologista com reconhecida experiência em

dermatopatologia e diagnóstico da hanseníase. Os seguintes parâmetros foram avaliados

histologicamente: presença de granulomas, presença de BAAR, infiltrado celular e

infiltrado inflamatório em torno de nervos.

Durante o seguimento destes pacientes após a conclusão da MDT, as principais

causas de perda de seguimento foram falta de disponibilidade em retornar para uma nova

avaliação devido à necessidade de se ausentar ao trabalho, insatisfação com a necessidade

de retorno bem como nova coleta de sangue e dificuldade em contactar o paciente devido

a mudança de números de telefone ou endereço.

Todos os pacientes que aceitaram participar deste estudo foram orientados sobre

o mesmo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (Anexo 1) e

responderam a um questionário padronizado para obtenção de dados sócio demográficos.

Em seguida foi realizada a coleta de sangue por punção venosa em tubos secos (BD

Vacutainer- Franklin Lakes, NJ, USA) e em tubos com heparina (BD Vacutainer Franklin

Lakes, NJ, USA) para obtenção de soro e sangue total respectivamente.

Os critérios de inclusão foram pacientes récem diagnosticados, não tratados, > de

18 anos de idade de ambos os gêneros. Foram excluídos deste estudo, indivíduos menores

de 18 anos, gestantes, indivíduos que possuíam sorologia positiva para HIV e outras

comorbidades como diabetes e tuberculose.

39

4.1.2 Abordagem 2: Avaliação da utilidade do teste de imunidade celular (Ensaio de

sangue total (EST) para a proteína de fusão LID-1 e da sorologia para LID-1 e PGL-I no

diagnóstico diferencial da hanseníase com outras dermatoses clinicamente semelhantes.

Para esta abordagem foi realizado um estudo transversal no qual foram recrutados

4 grupos de estudos provenientes de duas regiões geográficas diferentes no Brasil

(Goiânia e Fortaleza). O teste de imunidade celular (EST) foi realizado em um total de

156 participantes (92 de Goiânia, 64 de Fortaleza). Para a sorologia foram incluídos 216

participantes (152 de Goiânia, 64 de Fortaleza). O número de participantes recrutados em

cada região geográfica foi dependente da demanda local durante o período de

recrutamento. Os participantes provenientes de ambas as regiões geográficas foram

agrupados e alocados nos 4 grupos detalhados abaixo:

§ N=60 pacientes com hanseníase PB recém diagnosticados, não tratados;

§ N=48 pacientes com hanseníase MB recém diagnosticados, não tratados;

§ N=46 pacientes com outras dermatoses clinicamente semelhantes a hanseníase;

§ N=62 indivíduos saudáveis de área endêmica;

Os pacientes com hanseníase e outras dermatoses provenientes de Goiânia foram

recrutados no Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica, CRDT, Hospital de

Doenças Tropicais Dr. Anuar Auad HDT / HAA e Hospital das Clínicas da UFG -. HC /

UFG. Os controles saudáveis de área endêmica foram recrutados entre indivíduos que

frequentavam um laboratório de análises clínicas pertencente ao serviço público de saúde

na mesma área endêmica. Em Fortaleza, pacientes com hanseníase, outras dermatoses e

controles endêmicos foram recrutados em um centro de referência (Centro de

Dermatologia Dona Libânia - CDERM).

Os indivíduos portadores de outras dermatoses provenientes de ambas as áreas

geográficas incluíram 46 casos clinicamente suspeitos de hanseníase, sendo que para 27

pacientes foi solicitado histopatológico da lesão de pele para o diagnóstico definitivo.

Este grupo de 27 pacientes foram categorizados nos seguintes subgrupos: farmacodermia

(n=1), eczema (n=8), pitiríase alba (n=2) dermatite (n=2), dermatofitose (n=1),

granuloma anular (n=1), lobomicose (n=1), lúpus (n=1), necrobioses lipoídica (n=1),

40

Dermatite granulomatosa (n=3), Erupção liquenoide (n=1), infiltrado inflamatório

inespecífico (n=5). Para 19 pacientes, o diagnóstico final baseou-se em achados clínicos:

eczema (n=2), farmacodermia (n=4), hipomelanose macular progressiva (n=1),

granuloma anular (n=2), rosácea (n=1), escleroderma (n=1), psoríase (n=4), vitiligo

(n=2), dermatite psoriaseforme (n=1), Lúpus eritematoso túmido (n=1).

Como descrito para a abordagem 1, os voluntários que aceitaram participar da

pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (Anexo 1) e

responderam a um questionário padronizado para obtenção de dados sócio demográficos

e subsequentemente foi realizada a coleta de sangue por punção venosa.

Os critérios de inclusão para todos os pacientes com hanseníase e pacientes com

outras dermatoses foram, pacientes recém diagnosticados, não tratados, > de 18 anos de

idade de ambos os gêneros. Indivíduos saudáveis de área endêmica foram definidos como

grupo controle e foram definidos como indivíduos que não apresentavam comorbidades

prévias ou história de tuberculose (TB) ou hanseníase na família, > de 18 anos de idade

de ambos os gêneros. Foram excluídos deste estudo indivíduos menores de 18 anos,

gestantes, indivíduos com sorologia positiva para HIV e outras comorbidades como

diabetes e tuberculose.

4.2 Produção das proteínas recombinantes do M. leprae testadas

As proteínas recombinantes que foram utilizadas para as duas abordagens deste

estudo foram produzidas pelo IDRI (Infectious Disease Research Institute - Seattle, WA,

EUA) de acordo com o protocolo a seguir:

Para expressão das proteínas a serem avaliadas, o DNA que codifica proteínas

selecionadas do M. leprae foram amplificadas por PCR a partir do DNA da cepa Thay-

53, usando a DNA-polimerase Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os primers para PCR

foram produzidos com a inserção de sítios específicos para a incorporação das enzimas

de restrição 5’ 3’ no DNA nos genes de interesse e esses sítios foram excluídos

posteriormente no produto final do gene. Após amplificação por PCR, os produtos

purificados foram digeridos com enzimas de restrição e ligadas ao vetor de expressão

pET28a (Novagen, Madison, WI). Os plasmídeos recombinantes foram inseridos em

Escherichia coli BL21 Rosetta 2 (DE3) (pLysS) (Novagen). Foram isolados os produtos

de proteínas recombinantes (proteínas recombinantes solúveis) ou desnaturadas com

ácido Ni-nitrilotriacético (uréia - 8M), usando cromatografia de afinidade de íon metálico

41

(Qiagen, Valença, CA). As frações de proteínas purificadas por afinidade foram

analisadas em gel de eletroforese dodecil sulfato de poliacrilamida e quantificadas usando

o ensaio de proteína ácida bicinchoninic (Pierce, Rockford, IL). Os níveis de endotoxina

foram mensurados pelo ensaio de lise Limulus amebocyte QCL-1000 (Lonza Inc., Basel,

Suíça) e todos apresentaram <100 unidades de endotoxina/mg de proteína.

4.3 Proteínas recombinantes selecionadas

Para a primeira abordagem foram avaliadas cinco proteínas recombinantes do M.

leprae (LID-1, 46f, ML0276, ML2055 e ML2629) quanto a capacidade de induzir a

produção de IFN em pacientes com hanseníase (PB/MB) as quais previamente já se

mostraram imunogênicas e indutoras de resposta imune celular específica (OLIVEIRA et

al., 2014; SAMPAIO et al., 2011). A proteína ML2629 não imunogênica foi utilizada

como controle negativo. A reatividade sorológica foi avaliada em pacientes com

hanseníase PB e MB antes e após o tratamento frente a três proteínas de fusão (LID-1,

46f e 92f) do M. leprae previamente identificadas como imunoreativas e específicas

(SAMPAIO et al., 2011). Uma proteína recombinante do M. leprae não imunogência

(33f) foi utilizada como controle negativo.

Para a segunda abordagem, a proteína LID-1 foi avaliada tanto para avaliação da

imunidade celular quanto para a imunidade humoral em pacientes com hanseníase PB e

MB, pacientes com outras dermatoses e em indivíduos saudáveis de área endêmica.

4.4 Determinação da imunoreatividade celular por ensaio de sangue total (EST)

com proteínas recombinantes do M. leprae

Para as duas abordagens os ensaios com sangue total foram realizados em todos

os grupos de estudo para avaliar a capacidade das proteínas recombinantes do M. leprae

em estimular as células T efetoras de memória a produzir IFN.

Utilizamos 450L de sangue total com heparina de indivíduos de cada grupo de

estudo que foram estimulados com proteínas recombinantes do M. leprae

individualmente na concentração final de 10g/mL em placas de cultura de células com

24 poços – (Costar - Corning Incorporated – N. York, N.Y., EUA) por 24 horas a 37oC

em estufa com atmosfera úmida e concentração de CO2 a 5% . Após a cultura de 24 horas,

42

o plasma proveniente da cultura foi coletado e armazenado a -20oC para posterior análise

por ELISA.

4.5 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de IFN

O plasma proveniente da cultura de sangue total de 24 horas foi testado pelo

método de ELISA QuantiFeron - Qiagen, conforme as instruções do fabricante para

detecção de IFN. A produção dessa citocina indica o reconhecimento das proteínas

recombinantes do M. leprae por células T efetoras de memória dos indivíduos avaliados.

4.6 Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para detecção de IgG anti rML

A reatividade sorológica às proteínas do M. leprae de todos os grupos

categorizados neste estudo foi avaliada por meio de ELISA conforme descrito abaixo.

Placas de poliestireno para ELISA (Costar, 96 poços) foram sensibilizadas com 100

μL de proteínas recombinantes do M. leprae (1 μg/mL), em tampão bicarbonato, pH 9,6,

seguido de uma incubação ‘overnight’ a 4°C. Após o período de sensibilização, as placas

foram incubadas por 1h a temperatura ambiente (15-25ºC) com 200 μL de solução de

bloqueio (tampão fosfato de sódio contendo 0,04 % de tween 20 [PBST] e 1% de

albumina bovina [BSA]). As placas foram lavadas cinco vezes com PBST e duas vezes

com PBS e em seguida adicionados, a cada poço da placa, 100 μL dos soros em duplicata

diluídos 1: 200 em PBST com 0,1% de BSA. Após 2 h de incubação a temperatura

ambiente, as placas foram lavadas e 100 μL de conjugado diluído 1: 5000 em PBST e

0,1% de BSA (anti IgG – peroxidase) foram adicionados. Seguido de um período de

incubação de 1 hora, as placas foram lavadas. A reação é desenvolvida mediante o uso do

cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) contendo o substrato, peróxido de hidrogênio,

seguida de uma incubação de 15 min a temperatura ambiente. A reação foi finalizada com

a adição de ácido sulfúrico (H2SO4) a 1 N. A densidade óptica (DO) foi detectada em um

leitor de ELISA (Thermo Labsystems) usando filtro de 450 nm e 560 nm.

4.7 Sorologia para detecção de IgM anti-PGL I

Todas as amostras foram submetidas a sorologia para detecção de IgM anti-PGL

I para verificação da imunoreatividade a este antígeno do M. leprae. O procedimento

adotado foi o seguinte:

43

Amostras de sangue sem anticoagulante foram coletadas e em um período inferior

a duas horas foram centrifugadas (Ependorff 5804 R – Hamburgo, Alemanha) a 4000 rpm

por 3 minutos, aliquotadas e estocadas a -20°C. A detecção de anticorpos IgM anti-PGL

I foi realizada pela metodologia de ELISA, no Laboratório de Imunologia da AIDS e

Hanseníase do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG. Para a realização

do ELISA, placas (96/WELL – S-2288 Coaster – Corning Incorporated - Nova York,

N.Y, EUA) foram sensibilizadas com 0,01mg de PGL-I por 16 horas a 4oC. Após a

sensibilização, as placas foram lavadas com 200l/well de PBS/Tween (0,05% em PBS

1x) por quatro vezes. Os sítios livres das placas foram bloqueados com uma solução que

contém 1% de BSA em PBS. As amostras de soro foram diluídas 1:200 com PBS 1x e

incubadas por 2h. Após a incubação as placas foram lavadas 3 vezes em PBS/Tween e

posteriormente foi adicionada IgG anti-IgM humana conjugada a peroxidase (A-6907 –

Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA) na diluição de 1:1000 em PBS contendo

5% de BSA por 2h. Após a incubação, a placa foi lavada 3 vezes com PBS/Tween, e em

seguida foi adicionado o cromógeno TMB e as placas foram incubadas por 30 minutos.

A reação enzimática foi então encerrada com a adição de H2SO4 a 2,5 M e após 15

minutos a absorbância foi mensurada em espectrofotômetro de placa com filtro de 490

nm.

4.8 Análises estatísticas

O teste não-paramétrico de Mann-Whitney ou teste U foi utilizado para determinar

as diferenças nas concentrações de IFN- induzidas pelas diferentes proteínas e as

diferenças nos níveis de IgG e IgM nos grupos de estudo estabelecidos. A significância

geral entre os grupos de estudo foi determinada pela utilização do teste não-paramétrico

de Kruskall-Wallis. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos

quando p<0,05. Os gráficos Scatter dot-plot e Symbols & lines foram utilizados como

análise exploratória para avaliação da resposta de IFN e resposta imune humoral entre

pacientes a diferentes proteínas recombinantes do M. leprae. A acurácia dos testes de

imunidade celular e humoral foi avaliada mediante análise da curva ROC (Receiver

Operating Curve). Além disso, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo

(VPP) e valor preditivo negativo (VPN), também foram determinados considerando 95%

de intervalo de confiança (IC). Todas as análises de dados foram realizadas utilizando-se

o programa Graph Pad Prism versão 5.0.

44

4.9 Aspectos éticos

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital das

Clínicas da Universidade Federal de Goiás (nº do parecer: 456.226). A entrevista e a

coleta de sangue foram realizadas após a assinatura do TCLE. A todos os indivíduos que

concordaram em participar do estudo foi garantida privacidade quanto aos resultados dos

testes, conforme descrito no TCLE. Este estudo recebeu financiamento da American

Leprosy Missions.

45

5 ARTIGOS

Artigo 1 - Alterations to antigen-specific immune responses before and after multidrug

therapy of leprosy

Autores: Aline de Araújo Freitas;1 Regiane Morillas Oliveira;1 Emerith Mayra Hungria;1

Ludimila Paula Vaz Cardoso;1 Ana Lúcia Osório Maroccolo de Sousa;1 Maurício

Barcelos Costa;1 Steven G Reed;2 Malcolm S Duthie;2 Mariane Martins de Araújo

Stefani1

1Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goias, Goiania,

Brazil

2Infectious Disease Research Institute, Seattle, WA, USA.

Revista: Diagnostic Microbiology and Infectious Disease - 2015 Oct;83(2):154-61. doi:

10.1016/j.diagmicrobio.2015.06.021. Epub 2015 Jul 2.

Artigo 2 - Application of Mycobacterium leprae-specific cellular and serological tests

for the differential diagnosis of leprosy from confounding dermatoses

Autores: Aline de Araújo Freitas1; Emerith Mayra Hungria1; Maurício Barcelos Costa1;

Ana Lúcia Osório Maroccolo de Sousa1; Mirian Lane Oliveira Castilho2; Heitor de Sá

Gonçalves3; Maria Araci Andrade Pontes3; Malcolm S. Duthie4; Mariane Martins de

Araújo Stefani1

1Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia,

Brazil.

2Hospital of Tropical Diseases (Hospital de Doenças Tropicais Dr Anuar Auad

HDT/HAA), Goiânia, Goiás, Brazil.

3Centro de Dermatologia Dona Libânia (CDERM), Fortaleza, Ceará, Brazil.

4Infectious Disease Research Institute (IDRI), Seattle, WA, USA.

Revista: Diagnostic Microbiology and Infectious Disease - 2016 Oct;86(2):163-8. doi:

10.1016/j.diagmicrobio.2016.07.024. Epub 2016 Jul 27.

46

ALTERATIONS TO ANTIGEN-SPECIFIC IMMUNE RESPONSES BEFORE

AND AFTER MULTIDRUG THERAPY OF LEPROSY

Running title: Leprosy immune responses after treatment

Word count of abstract: 150 words

Word count of body of the text: 3970 words

Aline de Araújo Freitas;1 Regiane Morillas Oliveira;1 Emerith Mayra Hungria;1 Ludimila

Paula Vaz Cardoso;1 Ana Lúcia Osório Maroccolo de Sousa;1 Maurício Barcelos Costa;1

Steven G Reed;2 Malcolm S Duthie;2 Mariane Martins de Araújo Stefani1

Affiliations:

1Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goias, Goiania,

Brazil

2Infectious Disease Research Institute, Seattle, WA, USA.

Corresponding author: Mariane Martins de Araújo Stefani

*Address for correspondence: Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal

University of Goias, Rua 235 s/n Setor Universitário, 74605-050, Goiânia-Goiás/Brazil.

Phone: 55 62 3209 6111. Fax: 55 62 3209 6363. Email address: mmastefani@gmail.com

Abbreviations used in this paper:

BI, bacterial indices

BL, Borderline lepromatous

BT, Borderline tuberculoid

BSA, bovine serum albumin

CMI, cell mediated immunity

IFN, Interferon gamma

LID-1, Leprosy IDRI Diagnostic-1

LL, Lepromatous lepromatous

MB, multibacillary

MDT, multidrug therapy

NT-P-BSA, natural trisaccharide-phenyl-BSA

47

OD, optical density

PB, paucibacillary

PHA, Phytohemagglutinin

PGL-I, phenolic glycolipid-I

rML, M. leprae recombinant antigens

RT, room temperature

TT, Tuberculoid tuberculoid

WHO, World Health Organization

48

Abstract

This study evaluated the impact of leprosy multidrug therapy/MDT on cell mediated

immunity/CMI and antibody responses at diagnosis in untreated paucibacillary/PB

(n=15) and multibacillary/MB patients (n=15) using a panel of Mycobacterium leprae

recombinant antigens (rML) (CMI: 46f, ML0276, ML2055, LID-1,ML2629-negative

control; serology: LID-1, 46f, 92f, 33f-negative control, PGL-I), and at two time points

after MDT (PB: 8-20 months; MB: 4-22 months). At diagnosis PB patients produced

IFN, MB patients exhibited low/absent response. Shortly after MDT, IFN production

in PB patients declined except for LID-1; MB patients produced IFN to LID-1. Almost

2 years after MDT, IFN levels declined in PB and MB patients. Most untreated PB

patients were seronegative to PGL-I and rML remaining so after MDT. Most untreated

MB patients were seropositive to all antigens, IgG to rMLs declined after MDT.

Reduction in antigen-specific CMI in PB and in antibody response in MB patients may

help monitor MDT effectiveness.

Keywords for submission: leprosy; diagnosis; serology; cellular immunity, multidrug

therapy

49

1. Introduction

Leprosy is a chronic disease caused by Mycobacterium leprae that can cause

irreversible peripheral nerve damage (Lockwood 2002). Despite the effectiveness of

multidrug therapy (MDT), leprosy incidence appears not to have changed significantly

and 215,656 newly diagnosed cases were still reported in 2013. Brazil reported 31,044

new leprosy cases in this time period, ranking second in overall leprosy incidence to only

India (WHO 2014).

Leprosy presents a wide and complex spectrum of bacteriologic, clinical and

histopathologic signs that are dependent on the host immune response. Paucibacillary

(PB) leprosy patients present absent bacterial indices (BI), few localized skin and

neurological lesions, strong specific cell mediated immunity (CMI) and low/absent

antibody production. Multibacillary (MB) disease is characterized by high BI, multiple

disseminated skin lesions, weak/absent M. leprae specific CMI and high titers of specific

antibodies (Scollard et al. 2006). MDT currently consists of six doses with rifampicin and

dapsone for PB leprosy and twelve doses with rifampicin, dapsone and clofazimine for

MB patients. Rifampicin is taken once monthly but the other drugs are scheduled

differently (WHO 2009). Upon MDT completion patients are considered cured, however,

even after MDT some patients develops leprosy reactions (www.who.int/lep 2014). Early

diagnosis and treatment before the onset of clinical manifestations are considered key to

reduce M. leprae transmission and to prevent deformities and disabilities (Scollard 2008;

WHO 2013).

Currently the diagnosis of leprosy relies on the recognition of the clinical

manifestations. Spurred by the decoding of the M. leprae genome, research efforts have

pushed toward the identification of M. leprae proteins suitable for the development of

appropriate laboratory tests. For serology-based tests, the LID-1 fusion protein (Leprosy

IDRI Diagnostic-1, combining ML0405 and ML2331 in a single product) has been well

recognized by IgG antibodies of MB patients from multiple leprosy-endemic areas

(Duthie et al. 2008b). Our recent data demonstrated that LID-1 can also induce IFN

production in whole blood assays of PB leprosy patients and healthy household contacts

regularly exposed to M. leprae (Oliveira et al. 2014).

While diagnostic and prognostic tests are needed to monitor preventive and

therapeutic strategies for leprosy, the impact of MDT on M. leprae-specific cell mediated

50

immune responses is unknown. This study evaluated the impact of MDT on the

serological and cellular immune responses against a panel of M. leprae recombinant

antigens (rML).

2. Patients and Methods

2.1 Study groups

This longitudinal and prospective study evaluated newly diagnosed, untreated

leprosy patients at the time of diagnosis (Pre-MDT group) and at two time points after

completing MDT (Post-MDT groups - 8 and 20 months for PB patients; 4 and 22 months

for MB patients).

Thirty newly diagnosed, untreated PB and MB leprosy patients recruited between

July 2010 and November 2012 at the public health center for leprosy diagnosis and

treatment (Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica/CRDT in Goiânia, Goiás)

in a highly endemic area for leprosy in central western Brazil. This study was approved

by the local review board “Comitê de Ética em Pesquisa Humana - Hospital das Clínicas

da Universidade Federal de Goiás” protocol # 456.226 and all patients signed an informed

consent form. Criteria for inclusion were newly diagnosed untreated, adult (>18 years of

age) leprosy patients from either gender. Exclusion criteria included: pregnancy, co-

morbidities such as HIV/AIDS, tuberculosis, diabetes mellitus or other chronic disease.

The same exclusion criteria were also applied to healthy controls who were interviewed

and asked about pre-existing co-morbidities. Each patient was submitted to complete

dermato-neurological examination by one dermatologist with expertise in leprosy

diagnosis. Skin biopsies were obtained from the edges of active skin lesions and venous

blood was collected from all patients.

Patients were classified according to Ridley & Jopling criteria considering

histopathologic, bacilloscopic and clinical findings (Ridley DS and Jopling WH 1966).

For data analysis tuberculoid (TT) and borderline - tuberculoid (BT) leprosy patients were

merged as paucibacillary (PB) leprosy and borderline - lepromatous (BL) and

lepromatous (LL) patients were considered multibacillary (MB) leprosy. All PB leprosy

patients (5 TT and 10 BT) had negative bacilloscopy, while MB (11 BL and 4 LL) leprosy

patients had a mean BI of 3.0 (range 1.25-3.25). The median age of PB leprosy patients

was 54 years old (range 31-71 years; 13 SD) and 51 years for MB leprosy patients (range

23-73 years; 13 SD). The following male: female ratio was reported for each group: 6

51

males: 9 females in PB leprosy and 11 males: 4 females among MB leprosy patients. Most

study participants (96%) had a scar associated with neonatal BCG vaccination.

2.2 Post – MDT groups:

All enrolled patients were invited to return at pre-defined time points after

completion of MDT. However, for several reasons, patients returned according to their

convenience, reflecting different time points after MDT. Besides pre-MDT

immunological evaluation, most enrolled patients returned at least twice after MDT:

shortly after MDT (4-8 months for MB and PB patients respectively) and around two

years after MDT (20 months for PB and 22 months for MB patients). Among the main

causes of loss to follow up of patients we can list: lack of availability to return due to

difficulty in getting time off from work, dissatisfaction with the need for repeated visit

and blood collection, and inability to contact the patient either because he/she had

changed the telephone number or moved away to an unknown location.

First evaluation post-MDT: 23 out of 30 (77%) of newly diagnosed untreated

leprosy patients originally recruited, returned to the reference center after completing the

MDT between July 2012 and July 2013; 7 patients (23%) were lost to follow-up. These

23 patients consisted of 12 MB and 11 PB leprosy patients recruited between 4-8 months

after the conclusion of MDT.

Second evaluation post-MDT: Approximately 20 months after the conclusion of

MDT (22 months for MB and 20 months for PB patients), 18 out of 23 patients (78%)

returned to the reference center (9 PB, 9 MB leprosy patients) for a new evaluation of

their health status and for blood collection.

2.3 M. leprae recombinant proteins

Cloning and purification of rML were performed as previously described (Reece

et al. 2006; Duthie et al. 2008b). The CMI of leprosy patients was evaluated using the

following rML: ML0276, ML2055, 46f, LID-1 and ML2629 as negative control. M.

leprae proteins used in this study were previously evaluated and considered as

immunogenic and capable of eliciting specific immune response (Duthie et al. 2008a,

2008b; Sampaio et al. 2011; Oliveira et al. 2014). The humoral response was evaluated

by IgG antibodies to rML LID-1, 46f, 92f and 33f (negative control) (Hungria et al. 2012)

and IgM antibodies to PGL-I (Bührer-Sekula et al. 1998).

52

2.4 CMI determination by whole blood assay (WBA)

WBA were performed as previously described (Duthie et al. 2008a). Briefly,

undiluted heparinized whole blood was plated (24-well plates; 450 μl/well; Sigma,

St. Louis, MO, USA) with each individual rML (10 μg/ml; LID-1, 46f, ML0276,

ML2055); PBS alone (background control), ML2629 (10 μg/ml; negative control);

positive controls consisted of M. leprae cell sonicate (10 μg/ml; MLCS; provided by

Dr John Spencer, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA, under NIH

contract N01 AI-25469) and Phytohemagglutinin (1 μg/ml; PHA, Sigma, USA). After

incubation (24 h,37°C,5% CO2), plasma was collected, stored (−20 °C) until tested

for human IFNγ (QuantiFERON®-TB Gold/QFT-G; Qiagen, Hilden, Germany). The

results were converted from IU/ml into pg/ml (1 IU/ ml of IFNγ being equivalent to

40 pg/ml according to the manufacturer’s instructions). The detection limit was

5 pg/ml and an arbitrary cut-off point of 50 pg/ml was adopted to determine positive

responses.

2.5 Detection of antibodies to M. leprae antigens

Serum IgG antibodies against rMLs and IgM antibodies to M. leprae specific

phenolic glycolipid-I (PGL-I) were detected by ELISA. Briefly, for the IgG reactivity

PolySorp 96-well plates (Corning Costar, NY, USA) were coated with each individual

rML (1 μg/mL) and blocked (4ºC, PBS-Tween-20/PBST 1% bovine serum

albumin/BSA). Diluted serum samples (1/200 in 0.1% BSA) were incubated in duplicate,

(2h, room temperature), plates were washed and incubated with horseradish per-

oxidase/HRP-conjugated anti-human IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL). After

washings, reactions were developed (peroxidase colour substrate, KPL, Gaithersburg,

MD, USA) and quenched (1 N H2SO4). The corrected optical density (OD) of each well

at 450 nm was determined using a Multiskan Ex microplate reader (Thermo Scientific,

USA). The threshold for positive responses was previously calculated (2 x standard

deviation of the OD of sera from healthy endemic controls) so that samples with OD >

0.3 were considered positive as described in Duthie et al. (2007). The results are expressed

as the mean OD of duplicates.

For IgM reactivity to PGL-I ELISAs employed coated plates with

0.01 mg/ml of the natural trisaccharide-phenyl synthetic analog of PGL-I conjugated

to bovine serum albumin (BSA; NT-P-BSA; kindly provided by Dr Fujiwara, Nara

53

University, Japan; PolySorp 96-well plates, Nunc, Roskilde, Denmark)). Blocking

was performed with 1% BSA/PBS. Diluted serum samples (1/300 PBS-BSA, 10%

normal goat serum/NGS, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) were tested with either NT-P-

BSA or BSA-coated wells. After incubation and washings, HRP-conjugated anti-

human IgM (Immuno Chemicals, St. Louis, MI, USA) was added, incubated, washed,

3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine liquid substrate (TMB Sigma-Aldrich, St. Louis, USA,)

was added and the reaction was quenched (2.5 N H2SO4, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

To control intra and inter test´s variations a duplicate of positive reference serum was

used on each plate and reactions stopped when its reading reached an OD= 0.6. The OD

was measured at 450 nm (Bio-Rad microplate reader, Life Science, Hercules, CA, USA).

The final OD was calculated by subtracting the OD BSA-coated wells from OD values

of NT-P-BSA wells. The cut-off was defined as OD > 0.25 in accordance with Bührer-

Sekula et al. 1998.

2.6 Statistical analyses

Exploratory data analysis, including dot plot, medians, means and standard

deviations were used to analyze the study groups (GraphPad Prism version 5). For the

sequential analyses at different time points, of the immune responses to different antigens,

paired samples from each patient were evaluated. Statistical significance was assessed

using the Kruskal–Wallis one-way analysis of variance (ANOVA) for comparison of

multiple groups and the Mann–Whitney test for comparison between two groups. Results

were considered statistically significant when a p-value < 0.05 was obtained.

3. Results

3.1 Antigen-specific serum antibodies in MB patients

As expected, antigen-specific antibodies were readily detected in serum from

untreated MB patients with high bacterial burdens. IgM antibodies to PGL-I and IgG

antibodies to LID-1, 46f and 92f were observed, with the frequency of responses in this

cohort ranging from a low of 33% against 92f to a high of 87% against LID-1, with 73%

of these patients possessing antibodies against PGL-I (median OD: 0.799). The largest

proportion of seropositive responses was observed against the LID-1 protein (median

ELISA OD: 0.910) (Figure 1A).

54

Evaluation of MB patients 4 months after completing MDT demonstrated that a

statistically significant decline in the levels of IgG was seen in the majority of patients to

all recombinant proteins tested (LID-1: p=0.002, 46f: p=0.004, 92f: p=0.005). Only 2

out of 12 MB patients were still seropositive to LID-1 and 46f, while only 1 patient

remained positive to 92f (Figures 2 A, C and E). In contrast, responses to PGL-I declined

in 7 out of 12 patients and raised in the other 5 patients, so that the net outcome was: 9

out of 12 MB patients evaluated after completing MDT were seropositive to PGL-I

(median OD: 0.507) (p=0.312) (Figure 2 G). Analyses of sera collected approximately 20

months after MDT indicated a slight increase on seropositivity to LID-1 (4 out of 9

patients p=0.436), 46f (1 out of 9 patients p >0.297) and 92f (1 out of 9 patients p >0.401)

while 7 out of 9 MB patients were anti-PGL-I seropositive (p >0.258) (Figures 2 A, C, E

and G). These evaluations indicate that, compared to the anti-PGL-I response, anti-protein

serologic responses of MB patients demonstrate a more robust and consistent decline in

response to treatment (PGL-I: p=0.312, LID-1: p=0.002, 46f: p=0.004, 92f: p=0.005).

3.2 Antigen-specific CMI in MB leprosy patients

The majority (13 out of 15) newly diagnosed, untreated MB patients did not

exhibit IFN production in response to rML in WBA. For the two MB patients that did

demonstrate responses, they were limited to particular proteins; blood from one patient

produced IFN against LID-1 (92pg/mL) while blood from the other patient produced

IFN against 46f (61pg/mL), ML0276 (73pg/mL) and ML2055 (64pg/mL) (Figure 3 A).

Four months after the completion of MDT low or absent IFN production was

again observed for most proteins (46f: p=0.632, ML0276: p=0.688, ML2055: p=0.700 )

(Figures 4 C, E, G). There was an exception, however, with WBA from 9 out of 12 paired

MB patients having measurable IFN secretion following incubation with the LID-1

protein (median: 105 pg/mL, p= 0.006 versus values obtained before MDT) (Figure 4 A).

The anti-LID-1 IFN response had waned 22 months after completing MDT, such that

WBA of only 1 (60pg/mL) out of 9 MB patients assessed at this time point had detectable

levels (p=0.036; versus 4 months after MDT) (Figure 4 A). IFN response to others

proteins tested did not changed 22 months after completing MDT (46f: p=0.371,

ML0276: p=0.833, ML2055: p=0.920) (Figures 4 C, E, G). Thus, a transient cellular

response to the LID-1 protein emerged among MB patients shortly after the completion

of MDT.

55

3.3 Antigen-specific antibodies in PB leprosy patients

As expected, serum antibody levels of untreated PB patients were below the cut-

off for PGL-I and most rML tested (Figure 1 B). Similar observations were made for the

rML when serum collected 8 and 20 months after conclusion of MDT (p >0.05) (Figure

2 B, D, F, J). There was a slight increase of positivity anti-PGL-I among the PB patients

20 months after conclusion of MDT (p=0.062) (Figure 2 H), the meaning of which is

unclear.

3.4 Antigen-specific CMI in PB leprosy patients

IFNγ was readily detected following WBA of blood from untreated PB leprosy

patients incubated with the selected rML. The highest IFNγ levels were stimulated by the

ML0276 protein (median: 78 pg/ml, range 51–125 pg/ml) followed by 46f (median: 73

pg/ml, range 24–137 pg/ml), LID-1 (median: 72 pg/ml, range 38-151pg/ml) and ML2055

(median: 72 pg/ml, range 53–102pg/ml) (Figure 3 B).

When the IFN responses of these same PB leprosy patients were evaluated in

WBA a few months after the completion of MDT, most antigens stimulated secretion of

a statistically reduced amount of IFN (46f: p=0.0002, ML0276: p<0.0001, ML2055:

p<0.0001) relative to the quantities detected in WBA at the time of diagnosis (Figures 4

D, F, H). An exception to this was LID-1, which actually induced more IFN (median:

114 pg/mL) (p=0.430) (Figure 4 B). The enhancement of the anti-LID-1 response was

not permanent, however, as IFN was not detected in WBA conducted with LID-1 around

20 months after the conclusion of MDT compared with quantities of IFN anti-LID-1

detected at the time of diagnosis (p=0.0006) and 8 months after conclusion of MDT

(p=0.021) (Figure 4 B). IFN response to others proteins tested (46f: p=0.625, ML0276:

p=0.237, ML2055: p=0.372) did not changed 20 months after completing MDT (Figure

4 D, F and H).

Although the evaluation of the impact of leprosy reactions in M. leprae specific

serology and CMI was out of the scope of this study, among the 30 patients enrolled, a

minority (1 PB, 5 MB) has developed leprosy reactions after MDT. However, none of

these patients was tested during a reactional episode or while taking medication for

leprosy reaction. The immune profile (serology and CMI) of reactional patients was not

56

statistically different from unreactional patients (p>0.05) in all time points evaluated (data

not shown).

4. Discussion

Although a complete understanding of immune responses during leprosy could

indicate tools for use in intervention trials and aid patient management, relatively little is

known regarding particular antigen-specific responses during and after treatment. We

assessed cellular and humoral immunity of both MB and PB leprosy patients in parallel

to determine how resolving M. leprae infection by treatment affects antigen-specific

responses. Antigen-specific antibody responses were readily detected in MB patients at

the time of diagnosis but were reduced following MDT. While antibody responses were

not detected, direct comparison of paired samples of PB leprosy patients revealed that

IFN recall responses against most M. leprae proteins were reduced after MDT relative

to the magnitude of response detected at diagnosis. An exception was observed for LID-

1, which induced secretion of IFN after treatment at higher levels than those observed in

the same PB patients at diagnosis. Surprisingly, an IFN response to LID-1 was also

observed for MB patients 4 months after the conclusion of MDT.

The majority of untreated MB leprosy patients can be identified by robust

antibody responses (Oskam et al. 2003; Reece et al. 2006; Duthie et al. 2007; Sampaio et

al. 2011; Hungria et al. 2012). Similar to anti-PGL-I IgM responses, IgG responses

against each protein appears to positively correlate with the bacillary load at the time of

diagnosis (Geluk et al. 2011). Decreases during and after MDT in the antibody responses

to PGL-I and rML, including LID-1, have previously been reported (Duthie et al. 2011).

Significant declines in IgG levels were observed among MB patients in our study after

completion of MDT but declines were less pronounced for anti-PGL-I IgM. These results

are in agreement with other studies that demonstrated a drop in anti-PGL-I levels after

the initiation of treatment, albeit reporting wide variations ranging from a linear decline

and quick conversion to seronegative to retention of positive responses for many years

(Prakash et al. 1993; Roche et al. 1993).

The observation of IFN in WBA of untreated PB patients, but its absence in

WBA of MB patients before the treatment, corroborates previous findings (Duthie et al.

2008a; Sampaio et al. 2011, 2012; Oliveira et al. 2014). Although MB patients are usually

considered anergic because they have low or absent CMI to crude fractions of M. leprae,

57

an IFN recall response to LID-1 was also observed among MB patients shortly after the

conclusion of MDT. Why the cellular response against LID-1 (a fusion of ML0405, a

hypothetical protein with unknown function, and ML2331, which is likely a secreted

protein) emerges in MB leprosy patients after MDT is unclear. In situ studies of skin

lesions in both MB and PB leprosy patients evaluated one week after starting MDT have

documented an increased expression of HLA-DR and inflammatory cytokines such as IL-

1β, TNFα and IFN (Tung et al. 1987; Arnoldi et al. 1990; Cree et al. 1995).

Experimental studies have shown that 99% of bacilli can be killed by a single dose

of rifampicin and that this leads to the release of antigens (Cree et al. 1995). In this regard

in vitro stimulations with live M. leprae have led to evasion or suppression of immune

responses, whereas killed or fragmented bacilli components stimulated the response

(Steinhoff et al. 1991; Lahiri et al. 2010). Dendritic cell cultures infected with live M.

leprae had decreased MHC class I and II expression and T cell antigen presentation

(Hashimoto et al. 2002) while M. leprae cell membrane upregulated MHC class II and

CD86 costimulatory molecule expression and CD4 T cell activation (Maeda et al. 2003).

In addition, M. leprae membrane fractions induced strong IFN production by CD4 and

CD8 T cells (Degang et al. 2014). We hypothesize that the destruction of bacilli by MDT

may result in enhanced antigen presentation due to higher exposure to antigens including

new antigens, such as epitopes contained within LID-1, which could lead to the

stimulation of effector memory T cells and IFN production even in previously anergic

MB patients.

The decreased IFN production seen for PB (and also in MB patients) around two

years after MDT could possibly be explained by the elimination of bacilli and clearance

of antigen from the body. MDT is known to effectively reduce the viability of M. leprae,

however persistent antigen can remain in affected tissues up to years post-MDT so that

M. leprae antigen presentation to the immune system may occur and may individually

vary among patients depending on their initial M. leprae load, persistence in affected

tissues during or after MDT and/or continuing presence in their environment (Shetty et

al. 1994). Although similar time points after MDT were used for MB and PB patients (4-

8 months respectively) and around two years after MDT completion (20 months for PB

and 22 months for MB patients), if we consider the time point from diagnosis, MB who

are treated longer (12 months) were evaluated at a longer time post MDT compared to

58

PB patients who are treated for 6 months, however this difference did not seem to have

impacted the changes in immune response seen post therapy.

The reduction of pathogen specific immune responses after successful treatment

has been reported for other infectious diseases such as tuberculosis (Pathan et al. 2001;

Aiken et al. 2006; Ribeiro et al. 2009; Connell et al. 2010). The majority of studies show

a decrease in IFN production following anti-tuberculosis treatment, although similar to

our data, increases in IFN production during treatment subsequently followed by a

decline at the end of treatment have also been reported (Nicol et al. 2005; Herrmann et

al. 2009). While the initial activation of the immune response by pathogens generates

long-lived memory cells that survive for years (Farber et al. 2014), effective treatment

can eliminate the pathogen/ antigen-source and lead to contraction in which the expanded

antigen-specific cells die and restore homeostasis. It is quite possible that this is

happening during the course of leprosy MDT.

The impact of MDT on M. leprae–antigen specific cellular immunity has not been

described previously. Moreover the long-term impact of reduced M. leprae-specific

cellular responses on patient’s prognosis is not known. However some studies in other

infectious diseases have evaluated treatment changes on immune responses and their

impact on prognosis. A recent study showed that most tegumentary leishmaniasis patients

cured by treatment did not produce IFN in vitro in response to Leishmania braziliensis

antigen even though they had a positive leishmania skin test (Carvalho et al. 2013). None

of these patients became reinfected for up to 15 years after therapy indicating that even

in the absence of measurable CMI in vitro these individuals remained protected. An

experimental study with Leishmania major demonstrated that although effector CD4 T

cells were lost in the absence of infection, central memory CD4 T cells were maintained

and upon secondary infection became tissue-homing effector T cells that mediated

protection (Zaph et al. 2004).

Even in schistosomiasis, which like MB leprosy is characterized by strong Th2

type responses, treatment with praziquantel can alter/ redirect the polarization of antigen-

specific responses toward a proinflammatory phenotype that may promote resistance to

reinfection (Bourke et al. 2013).

We acknowledge that the relatively small sample size and the loss to follow up of

patients represent limitations in this study. However our sequential analysis of specific

immunity brings new data showing that both circulating M. leprae-specific cellular and

59

humoral immune responses wane around two years after completion of MDT.

Importantly, the reductions were not global, because both MB and PB leprosy patients

evaluated shortly after MDT presented stronger IFN production against the LID-1

protein. Thus, the killing of M. leprae with drugs, and likely the release of antigens during

the process, may differentially impact the immune response after therapy.

These results are important when we consider that in highly endemic areas,

recrudescence of leprosy or reinfection with M. leprae although rare, can eventually

occur, and our data imply that the decreased IFN responses after MDT apparently has

no detrimental impact on sustained protective immunity. Expanded, multicenter studies

recruiting patients within different leprosy-endemic areas to evaluate antigen-specific

CMI/IFN before, during and after MDT appear warranted. The implications of reduced

M. leprae-specific CMI after MDT for both reinfection and potential immunotherapeutic

interventions in leprosy-endemic areas are unclear but deserve further investigation.

5. Acknowledgments

The authors thank all the patients for donating their blood and information for these

studies and staff of the “Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica” in

Goiânia/GO for their cooperation and support during recruitment. This study was

supported by American Leprosy Missions, The Heiser Program for Research in Leprosy

and Tuberculosis of The New York Community. Dr Mariane M. A. Stefani is a recipient

of a fellowship from National Counsel of Technological and Scientific Development

(CNPq/ Brazil) (grant # 304869/2008-2) and MSc. Aline A. Freitas was supported by a

scholarship awarded by the Coordination of Improvement of Higher Education Personnel

(CAPES Brazil - grant#1054292). We are grateful to Greg Ireton, Jeff Guderian, Raodoh

Mohamath, Alex Picone and Ayesha Misquith for producing of high quality recombinant

proteins and Dr. Tsuyoshi Fujiwara (Nara University, Japan) for generously providing

the NT-P-BSA antigen.

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65

Figures:

Figure 1: Antibody responses of leprosy patients. Serologic reactivity to LID-1, 46f, 92f, PGL-I and 33f

(negative control) was determined in newly diagnosed untreated paucibacillary (A) and multibacillary

leprosy patients (B). Each point represents the mean optical density (OD) of duplicates of an individual

serum sample and the median OD value of each group is represented by the horizontal line. The dotted

horizontal line is the cut-off (OD > 0.3) to rMLs and the continuous horizontal line represents the cut-off

(OD>0.250) to PGL-I. The number above each data set is the percent positive responses.

66

Figure 2: Kinetics of antibody

responses in individual PB and

MB leprosy patients at diagnosis

and at two time points after

MDT. Serum IgG to LID-1 (A

and B), 46f (C and D), 92f (E

and F), 33f (I and J) and IgM to

PGL-I (G and H) were

determined. The dotted

horizontal line in graphs A, B,

C,D E. F, I and J is the OD cut-

off (> 0.3) to rML and in graphs

G and H the OD cut-off (>

0.250) to PGL-I . The number

above each data set is the

percentage of positive

responses. For patients lacking

results in the second post MDT

time point, data was not

available.

67

Figure 3: Interferon-gamma (IFN-γ) production in whole blood assay (WBA) upon stimulation with LID-1,

46f, ML0276, ML2055 and ML2629 (negative control) in newly diagnosed untreated paucibacillary leprosy

patients (A) and newly diagnosed untreated multibacillary leprosy patients (B). Heparinized whole blood 24-

h cultures were performed, individual IFN-γ results (pg/ml) were plotted and the median IFN-γ value is

represented by the horizontal line. The dotted horizontal line represents the cut-off (50 pg/ ml). The number

at the top of the graphs represents the percentage of positive responses to each recombinant protein.

68

Figure 4: Kinetics of IFN

in individual PB and MB

leprosy patients at diagnosis

and at two time points after

MDT. IFN was detected

upon stimulation of

heparinized whole blood with

LID-1 (A and B), 46f (C and

D), ML0276 (E and F),

ML2055 (G and H), ML2629

(I and J). The traced

horizontal line represents the

IFN cut-off (50 pg/ml). The

number above each data set is

the percentage of positive

responses. For patients

lacking results in the second

post MDT time point, data

was not available.

69

APPLICATION OF Mycobacterium leprae-SPECIFIC CELLULAR AND

SEROLOGICAL TESTS FOR THE DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF LEPROSY

FROM CONFOUNDING DERMATOSES

Running title: Differential diagnosis of leprosy

Word count of abstract: 150 words

Word count of body of the text: 3770 words

Affiliations:

Aline de Araújo Freitas1; Emerith Mayra Hungria1; Maurício Barcelos Costa1; Ana Lúcia

Osório Maroccolo de Sousa1; Mirian Lane Oliveira Castilho2; Heitor de Sá Gonçalves3;

Maria Araci Andrade Pontes3; Malcolm S. Duthie4; Mariane Martins de Araújo Stefani1

1Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia,

Brazil.

2Hospital of Tropical Diseases (Hospital de Doenças Tropicais Dr Anuar Auad

HDT/HAA), Goiânia, Goiás, Brazil.

3Centro de Dermatologia Dona Libânia (CDERM), Fortaleza, Ceará, Brazil.

4Infectious Disease Research Institute (IDRI), Seattle, WA, USA.

Corresponding author: Mariane Martins de Araújo Stefani

*Address for correspondence: Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal

University of Goias, Rua 235 s/n Setor Universitário, 74605-050, Goiânia-Goiás/Brazil.

Phone: 55 62 3209 6111. Fax: 55 62 3209 6363. Email address: mmastefani@gmail.com

Abbreviations used in this paper:

AUC, area under the curve

BI, bacterial indices

BSA, bovine serum albumin

70

CMI, cell mediated immunity

EC, healthy endemic controls

IFN, interferon gamma

IGRA, interferon gamma release assay

LID-1, leprosy IDRI Diagnostic-1

MB, multibacillary

MDT, multidrug therapy

MLCS, M. leprae sonicate antigen

NDO-LID-1, PGL-I synthetic antigen and LID-1 combination

NT-P-BSA, natural trisaccharide-phenyl-BSA

NPV, negative predictive value

OD, optical density

PB, paucibacillary

PHA, phytohemagglutinin

PGL-I, phenolic glycolipid-I

PPV, positive predictive value

ROC, receiver operating curve

WBA, whole blood assay

WHO, world Health Organization

71

Abstract

Mycobacterium leprae-specific serological and cell-mediated-immunity/CMI test were

evaluated for the differential diagnosis of multibacillary/MB, and paucibacillary/PB

leprosy from other dermatoses. Whole blood assay/WBA/IFN stimulated with LID-1

antigen and ELISA tests for IgG to LID-1 and IgM to PGL-I were performed. WBA/LID-

1/IFN production was observed in 72% PB, 11% MB leprosy, 38% dermatoses, 40%

healthy endemic controls/EC. The receiver operating curve/ROC for WBA/LID-1 in PB

versus other dermatoses showed 72.5% sensitivity, 61.5% specificity and an area-under-

the-curve/AUC=0.75; 74% positive predictive value/PPV, 59% negative predictive

value/NPV. Anti PGL-I serology was positive in 67% MB, 8% PB leprosy, 6% of other

dermatoses; its sensitivity for MB=66%, specificity=93%, AUC=0.89; PPV=91%,

NPV=72%. Anti-LID-1 serology was positive in 87% MB, 7% PB leprosy, all other

participants were seronegative; 87.5% sensitivity for MB, 100% specificity, AUC=0.97;

PPV=100%, NPV=88%. In highly endemic areas anti-LID-1/PGL-I serology and

WBA/LID-1-represent useful tools for the differential diagnosis of leprosy from other

confounding dermatoses.

Keywords for submission: Leprosy, differential diagnosis of leprosy, other dermatoses,

serology, cellular immunity.

72

1. Introduction

Leprosy is a complex chronic dermato-neurological disease caused by

Mycobacterium leprae that comprises a spectrum of different clinical manifestations

correlated with the host’s immune response to the bacilli. Leprosy is associated with

social stigma and discrimination (WHO 2009). Patients with effective Th1 type cell

mediated immunity (CMI) to M. leprae present with few skin lesions and harbor a low

bacillary load, and are therefore considered paucibacillary (PB) disease. Patients with

vigorous humoral immunity mediated by Th2 type immune response present with weak

CMI, multiple skin lesions with numerous bacilli being referred as multibacillary (MB)

cases (Scollard et al. 2006; WHO 2009). During the chronic course of the disease immune

inflammatory episodes known as leprosy reactions can cause nerve damage, incapacities

and deformities (Lockwood and Sunnetha 2005). Therefore, early and accurate diagnosis

of leprosy and treatment before nerve damage are crucial to interrupt disease development

and associated disabilities.

Since the introduction of multidrug therapy (MDT) a significant decrease in

global prevalence of leprosy has been reported in the last decades, however incidence

remained stable, indicating active transmission in many countries, including Brazil which

ranks second globally. In 2014, 213,899 new cases of leprosy were reported worldwide,

with 31,064 of them in Brazil (WHO 2015). Leprosy diagnosis remains based on clinical

manifestations, which require relatively high levels of expertise and experience to

ascertain the differential diagnosis from a variety of entirely unrelated diseases that share

similar clinical manifestations (Talhari et al. 2006; Yawalkar 2009). Tests to aid the

diagnosis and prognosis of leprosy are needed.

Several M. leprae proteins have been screened for their potential use in diagnostic

tests. Since the M. leprae genome was deciphered, the LID-1 fusion protein (Leprosy

IDRI Diagnostic-1, combining ML0405 and ML2331) has been recognized as one of the

most promising antigens for the development of tests for leprosy. LID-1 is an important

protein antigen that is recognized by serum IgG antibodies of most MB patients from

different leprosy-endemic settings worldwide (Duthie et al. 2008b; Hungria et al. 2012;

Fabri et al. 2015). Recent data from our group demonstrated that LID-1 is also recognized

by circulating immune cells, as indicated by IFN production in whole blood assays

(WBA) of PB leprosy patients and healthy household contacts exposed to M. leprae but

not of otherwise healthy individuals (Oliveira et al. 2014; Freitas et al. 2015). Given that

73

leprosy patients typically enter the diagnostic process through dermatology clinics, this

study assessed the usefulness of LID-1 based serological and cellular tests to aid the

differential diagnosis of leprosy from other clinically related dermatoses.

2. Methods

2.1 Study groups:

Patients with leprosy and skin diseases clinically suspect of leprosy (other

dermatoses) were recruited in two distinct geographic leprosy endemic regions (Goiânia,

Goiás State, Central western region, at 3 public health reference centers -“Centro de

Referência em Diagnóstico e Terapêutica, Hospital de Doenças Tropicais Dr Anuar Auad,

Hospital das Clínicas da UFG; In Fortaleza, Ceará state, Northeast region, at Centro de

Dermatologia Dona Libânia a public health reference center. In all centers physicians had

vast expertise in recognition of leprosy manifestations. Inclusion criteria for leprosy were:

newly diagnosed, untreated adults (>18 years), both genders; exclusion criteria:

pregnancy and comorbidities (HIV/AIDS, tuberculosis, diabetes mellitus, or other

chronic disease). Healthy endemic participants, defined as individuals without preexisting

comorbidities, or history of tuberculosis or leprosy in the family were included as a

control group and recruited in the same settings.

Different numbers of individuals were enrolled into each group depending on the

actual demand during the study period. The study group for serology included 216

participants (152 from Goiânia, 64 from Fortaleza). The WBA was performed in a total

of 156 participants (92 from Goiânia, 64 from Fortaleza). The final diagnosis was based

on clinical signs and symptoms or histopathological findings, whenever requested by the

clinician. Leprosy patients were diagnosed and stratified according to WHO operational

criteria based on the number of skin lesions as PB (< 5 skin lesions) or MB leprosy ( > 6

skin lesions) (WHO 1998). Skin slit smears and biopsies were collected. All patients

assigned to the PB leprosy group had negative or low bacilloscopic index (BI), whereas

all MB cases were BI positive.

Patients with other dermatoses included 46 clinically suspect cases of leprosy and

for 27 of them the definite diagnosis required the histopathology of skin lesion biopsy as

follows: drug induced skin reaction (n=1), eczema (n=8), pityriasis alba (n=2) dermatitis

(n=2), dermatophytosis (n=1), granuloma anulare (n=1), lobomycosis (n=1), lupus (n=1),

necrobiosis lipoidica diabeticorum (n=1), granulomatous dermatitis (n=3), lichenoid drug

74

eruption (n=1), non-specific inflammatory infiltrate (n=5). For 19 patients, the final

diagnosis based on clinical findings: eczema (n=2), drug induced skin reaction (n=4),

progressive macular hypomelanosis (n=1), granuloma anulare (n=2), rosacea (n=1),

scleroderma (n=1), psoriasis (n=4), vitiligo (n=2), psoriasis-like dermatite (n=1), lupus

erytematosus tumidus (n=1). The main characteristics of study groups evaluated by

serology and cellular immunity are detailed in Table 1.

This study was approved by the local review board (Comitê de Ética em Pesquisa

Humana, Hospital das Clínicas (protocol # 456.226); all participants signed an informed

consent form.

2.2 M. leprae-specific T Cell Response

WBA were performed as previously described (Duthie et al. 2008a). Briefly,

undiluted heparinized whole blood (24-well plates; 450 μl/well; Sigma, St. Louis, MO,

USA) was stimulated (50 μl/well PBS alone or 10 μg/ml LID-1 or 10 μg/ml;

ML2629/negative control. Positive controls consisted of M. leprae cell sonicate

(10 μg/ml; MLCS; provided by Dr John Spencer, Colorado State University, Fort Collins,

CO, USA, under NIH contract N01 AI-25469) and Phytohemagglutinin (1 μg/ml; PHA,

Sigma, USA). After 24 h incubation (37°C, 5% CO2), plasma was collected, stored

(−20 °C) and tested for human IFNγ (QuantiFERON®-TB Gold/QFT-G; Qiagen, Hilden,

Germany). Results were converted from IU/ml into pg/ml (1 IU/ ml IFNγ = 40 pg/ml)

according to the manufacturer’s instructions. The detection limit was 5 pg/ml and an

arbitrary cut-off point of 50 pg/ml was adopted.

2.3 Detection of antibodies to M. leprae antigens

Serum IgG antibodies to LID-1 and IgM antibodies to M. leprae specific

phenolic glycolipid-I (PGL-I) were detected by ELISA. IgG reactivity used LID-1 coated

plates (1 μg/mL, PolySorp 96-well,Corning Costar, NY, USA), blocking (4ºC, PBS-

Tween-20/PBST 1% bovine serum albumin/BSA). Serum samples (1/200, 0.1% BSA)

were incubated in duplicate, (2h, room temperature), plates were washed and incubated

with horseradish peroxidase/HRP-conjugated anti-human IgG (Southern Biotech,

Birmingham, AL). After washings, reactions were developed (peroxidase colour

substrate, KPL, Gaithersburg, MD, USA) and quenched (1 N H2SO4). The corrected

optical density (OD 450 nm) was determined (Multiskan Ex microplate reader, Thermo

75

Scientific, USA), results were expressed as the mean OD of duplicates. The threshold for

positive responses was OD> 0.3 as previously calculated (Duthie et al. 2007).

IgM anti-PGL-I ELISA employed coated plates (0.01 mg/ml natural

trisaccharide-phenyl synthetic analog of PGL-I conjugated to BSA/NT-P-BSA,

kindly provided by Dr Fujiwara, Nara University, Japan; PolySorp 96-well plates,

Nunc, Roskilde, Denmark). After blocking (1% BSA/PBS), serum samples (1/300

PBS-BSA, 10% normal goat serum/NGS, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) were tested

with NT-P-BSA or BSA-coated wells. After incubation and washings, HRP-conjugated

anti-human IgM (Immuno Chemicals, St. Louis, MI, USA) was added, incubated,

washed, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine liquid substrate (TMB Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA,) was added and the reaction was quenched (2.5 N H2SO4, Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA). Intra and inter test´s variations were controlled by using a duplicate of positive

reference serum on each plate, reactions were stopped when its OD at 450 nm reached

0.6 (Bio-Rad microplate reader, Life Science, Hercules, CA, USA). The final OD was

calculated by subtracting the OD BSA-coated wells from OD values of NT-P-BSA wells;

the positivity cut-off value was OD=0.150 as defined (Bührer-Sékula et al. 2008).

2.4 Statistical analysis

Exploratory data analysis (dot plot, medians, means, standard deviations) were

used (GraphPad Prism version 5). Statistical significance of medians was assessed using

the Kruskal-Wallis one-way analysis of variance (ANOVA) for comparison of multiple

groups and the Mann–Whitney test for comparison between two groups. Results were

considered statistically significant when p-values<0.05 were obtained. To further assess

the capacity of cellular and antibody tests for the differential diagnosis of leprosy patients

in dermatology clinic, we constructed Receiver Operating Curve (ROC) for WBA and

serological ELISA (GraphPad Prism version 5). Patients with other dermatoses were

considered as true negatives for both WBA (PB leprosy = true positives) and for serology

(MB leprosy = true positives). An area under the curve (AUC) = 0.5 (null hypothesis)

indicates that the given test does not discriminate true positives (PB or MB leprosy) from

true negatives (other dermatoses). A value above 0.7 is considered a satisfactory

performance (Beck and Shultz 1986). The sensitivity, specificity, the positive predictive

value (PPV) and the negative predictive value (NPV) of WBA and serology were

determined with 95% confidence interval (CI).

76

3. Results

3.1 Serum antibody responses

To evaluate the utility of M. leprae-specific antibody responses in providing a

differential diagnosis of MB leprosy from other dermatoses, LID-1 and PGL-I serology

were compared in leprosy (MB and PB), patients with other dermatoses and EC. Leprosy

patients showed the classic pattern of M. leprae specific humoral response previously

described (Duthie et al. 2007; Sampaio et al. 2011; Hungria et al. 2012; Fabri et al. 2015),

with high positivity rates among MB and lower positivity rates among PB leprosy

patients.

Anti-PGL-I IgM responses were detected in 67% of MB leprosy patients (median

OD: 0.349; range: 0-1.352) and in 8% of PB leprosy patients (median OD: 0.009; range:

0.0 – 0.409). In other dermatoses, 6% had anti PGL-I antibodies (median OD: 0.008;

range: 0.0 - 0.357). No EC was positive for antibody responses to PGL-I (Figure 1A).

Most MB leprosy patients (87%) had detectable IgG antibodies against LID-1

(median OD: 0.695; range: 0.062 - 2.115) and low positivity for anti-LID-1 IgG was

observed among PB leprosy patients (7%, 4/60, median OD: 0.091; range: 0.0-0.460). All

of the patients with other dermatoses and all EC were seronegative to LID-1 (Figure 1 B).

In MB patients, the seroreactivity to LID-1 and PGL-I was statistically different from: PB

leprosy (p<0.0001), other dermatoses (p<0.0001) and endemic controls (p<0.0001).

The sensitivity of anti-PGL-I antibody responses for MB leprosy versus other

dermatoses was 66% (95% CI: 51.59%-79.60%), with a specificity of 93% (95% CI:

82.10%-98.63%) and AUC of 0.89 (SD: 0.03; p<0.0001). The PPV for MB leprosy versus

other dermatoses was 91% and NPV was 72% (Figure 1C). The sensitivity of anti-LID-1

IgG responses for MB leprosy versus other dermatoses was 87.5% (95% CI: 74.7%-

95.2%), with a specificity of 100% (95% CI: 92.2%- 100%) and AUC of 0.97 (SD= 0.01;

p<0.0001). The PPV of anti-LID-1 serology for the differential diagnosis of MB leprosy

versus other dermatoses was 100% and the NPV was 88% (Figure 1D).

3.2 Cellular responses to LID-1

None of the participants demonstrated ex vivo IFNγ production when blood was

incubated with PBS alone, and, all produced high levels of IFNγ upon stimulation with

PHA (Figure 2 C and D). Regarding stimulation of WBA by M. leprae cell sonicate

77

antigen (MLCS), IFN production was detected in all 40 PB patients (median: 149

pg/mL), in 14% of MB leprosy (median: 19 pg/mL), in 58 % of patients with other

dermatoses (median: 80.35 pg/mL) and in 76% of EC (median: 120 pg/mL) (Figure 2 B).

Upon incubation with LID-1 protein, IFN production was detected in 72% PB leprosy

(29/40, median: 119 pg/mL) and in 11% MB patients (3/28, median: 16 pg/ml). Mostly

negative IFN responses, or in a few cases low positive were observed in patients with

other dermatoses and in EC. Production of IFN upon stimulation with LID-1 was seen

in 38% (10/26, median: 34 pg/mL) of other dermatoses and 40% EC (25 out 62, median:

34 pg/mL). IFN levels to LID-1 in WBA of PB leprosy patients were higher compared

to all other groups: MB patients (p<0.0001), other dermatoses (p=0.0008) and EC

(p<0.0001) (Figure 2 A). These data indicate that WBA IFN levels to LID-1 discriminate

PB leprosy patients from other groups.

The sensitivity of LID-1 WBA to discriminate PB leprosy from other dermatoses,

based on an IFN threshold of 50 pg/mL, was 72.5% (95% CI: 56.1% -85.4%), with a

specificity of 61.5% (95% CI: 40.5%-79.7%) and AUC of 0.75 (SD=0.06; p = 0.0007).

The positive predictive value (PPV) of IFN WBA for the differential diagnosis of PB

leprosy versus other dermatoses was 74% and the negative predictive value (NPV) was

59% (Figure 2 E).

4. Discussion

This study investigated the potential use of CMI test and serology using the LID-

1 antigen for the differential diagnosis of leprosy from other often confounding

dermatoses. Our results, obtained in two highly endemic, but geographically distinct,

leprosy areas in Brazil demonstrate that both serologic tests and WBA using LID-1

antigen can discriminate leprosy from other unrelated skin diseases. These data provide

further evidence that, after more than a decade of screening including over one hundred

M. leprae protein antigens, the LID-1 di-fusion protein remains one of the most promising

antigens to support the diagnosis of MB and PB leprosy. Leprosy diagnosis is currently

attained by clinical means and depends on the identification of at least one of its cardinal

signs: (1) definite loss of sensation in hypo pigmented or erythematous skin patch; (2) the

presence of thickened or enlarged peripheral nerve, with loss of sensation and/or

weakness of the muscles supplied by that nerve; and (3) in MB cases, detection of acid-

78

fast bacilli in slit skin smear. A major concern in leprosy control efforts is that the number

of clinicians with sufficient expertise to recognize the early signs, and even late,

disseminated leprosy, or to provide a confident differential diagnosis, is declining.

Moreover, high quality skin smears are hardly available and are not routinely conducted

(ILEP 2001; WHO 2009). The differential diagnosis of leprosy from other skin diseases

with similar presentations can therefore be problematic.

The lack of expertise in the clinical diagnosis of leprosy contributes to

misdiagnosis, under diagnosis and failures in early and appropriate treatment (Siddiqui et

al. 2009; Geluk 2013; Raffe et al. 2013). In this context, adjunct laboratory tests to aid

diagnosis can strengthen leprosy control strategies by providing clinicians important

supplementary information to facilitate/ support their diagnosis. Given both the diverse

clinical presentations and high exposure/infection rate in endemic areas, however, even

the newer generation of M. leprae-specific serological and cellular-based tests have

limitations for diagnosis and none of the strategies can be considered 100% sensitive or

100% specific. Indeed, the dichotomous immune response to M. leprae implies that

immunological-based diagnosis requires the evaluation of both cellular and humoral

immune responses to confirm leprosy diagnosis in PB and MB patients, respectively. In

this study anti-LID-1 serology yielded 100% specificity as indicated by negative results

in all 108 non-leprosy participants from endemic areas (EC and other dermatoses) while

87% sensitivity was observed for MB leprosy. Our data are consistent with previous

reports that 60–80% PB leprosy patients are seronegative to PGL-I and LID-1, and among

the seropositives the antibody levels are low (Oskam et al. 2003; Duthie et al. 2008a;

Hungria et al. 2012; Fabri et al. 2015). Therefore, as with other serological tests for

leprosy, including anti PGL-I, the detection of serum anti-LID-1 responses is not sensitive

for PB leprosy.

CMI-based tests, such as WBA, appear more suitable for the detection of PB

patients since they present Th1 type M. leprae specific CMI instead of Th2 type immunity

seen in MB leprosy patients. Regarding CMI-based tests for PB leprosy, in this study we

confirmed our previous findings indicating that LID-1 induces IFN in untreated PB

patients while most MB leprosy patients are unresponsive (Oliveira et al. 2014; Freitas et

al. 2015). In addition, we found that, when stimulated with LID-1 fusion protein, patients

with other potentially confounding dermatoses produced lower levels of IFN than PB

patients. Our results show that in leprosy endemic areas WBA-LID-1 can effectively

79

discriminate PB leprosy patients from other skin diseases based on its sensitivity (72.5%),

specificity (61.5%), the AUC (0.75), the PPV (74%) and NPV (59%). These results

indicate that in addition to detailed clinical exams by trained physicians, simple and rapid

laboratory tests such as M. leprae-specific WBA- LID-1, that can be performed by general

health workers in the field to evaluate individuals with the slightest suspicion of leprosy,

could contribute to the diagnostic algorithm to aid accurate and early diagnosis and

treatment of PB leprosy patients.

Previous reports of PBMC-based tests with M. leprae peptides showed that EC

from two different leprosy endemic regions (Fortaleza/Brazil and Ethiopia), which have

different leprosy prevalence rates, presented distinct peptide recognition patterns/ IFN

production (Bobosha et al. 2012a, 2012b). In our study, based on IFN production in

WBA, a significant proportion of patients with other skin diseases and healthy endemic

controls responded to M. leprae cell sonicate (58% and 76% respectively). This response

probably reflects immunologic cross-reactivity of antigens contained in the MLCS crude

antigen mix with antigens from other mycobacteria including non-pathogenic

environmental mycobacteria. Thus, MLCS does not represent an adequate antigen to

measure M. leprae exposure or latent infection (Geluk 2013). On the other hand, the

frequency of WBA-IFN responses to LID-1 in patients with other skin diseases and

healthy endemic controls was lower compared to MLCS, but still significant (38% and

40% respectively) and probably indicate the percentage of individuals truly exposed and

infected by M. leprae in endemic areas. Nevertheless, the IFN responses of WBA-LID-

1 in EC and in patients with other skin diseases were still statistically lower compared to

PB leprosy patients.

IFN, the hallmark of Th1 immune response is often used as a biomarker for M.

leprae infection. Despite the M. leprae exposure/infection of a significant number of

healthy individuals and of patients with other skin diseases demonstrated by the high rate

of M. leprae specific CMI test positivity, the WBA-LID-1 was still able to discriminate

PB leprosy from other dermatoses. In endemic areas a laboratory test with reasonable

sensitivity and PPV values can help leprosy diagnosis and may represent an important

tool even with limitations in its specificity and NPV.

Since the decoding of M. leprae genome, more than 200 proteins have been

screened for diagnostic purposes by several research groups worldwide including ours.

80

Several studies have indicated that chimeric LID-1 protein can be recognized both by

antibodies of multibacillary patients and also by CMI of paucibacillary patients, therefore

representing an extremely promising candidate for diagnosis (Duthie et al. 2008a; Geluk

et al. 2008, 2009, 2011, 2012; Sampaio et al. 2011, 2012). Moreover, one study has shown

that in combination with other M. leprae antigens LID-1 can synergize IFN production

in PB patients and household contacts (HHC) without affecting the specificity of the

response observed in healthy endemic controls (EC) and tuberculosis patients (TB)

(Oliveira et al. 2014). Nevertheless, further studies are needed to identify other antigens

for use in CMI tests aiming to discriminate active disease from latent asymptomatic

infection while also minimizing the reported limitations on sensitivity and specificity.

The innate and adaptive immune responses to M. leprae involve complex

interactions between different cell networks that produce a numerous cytokines and

chemokines (Nath et al. 2015). Additional biomarkers of infection versus exposure/ latent

infection to M. leprae as IP-10/CXCL-10 have been suggested (Geluk et al. 2012;

Bobosha et al. 2014). However IFN remains the most used biomarker and a rapid

interferon gamma release assay (IGRA) has been commercially available for the

diagnosis of latent tuberculosis (QuantiFERON-TB-Gold-In-Tube® test) (Menzies et al.

2007; Pai et al. 2008; Chegou et al. 2009). Several groups, including ours, have pursued

the development of a rapid IGRA-like CMI based test for PB leprosy aiming to help both

clinicians in the differential diagnosis of PB leprosy and leprosy control programs

(Sampaio et al. 2011; Bobosha et al. 2014; Oliveira et al. 2014).

The serology to PGL-I has been widely used to help the classification of MB and

PB leprosy patients for treatment purposes, case monitoring, identification of the risk of

relapse and selection of household contacts with a higher risk of developing leprosy (Wu

et al. 2002; Bührer-Sékula et al. 2003; Douglas et al. 2004). More recently, studies have

shown the utility of M. leprae recombinant proteins to detect MB leprosy patients by

serology (Hungria et al. 2012; Cardoso et al. 2013). Considering the importance of a point

of care test for leprosy diagnosis in endemic areas, our group has worked on the

development of a new lateral flow rapid test for MB diagnosis (NDO-LID® test), which

detects simultaneously IgG and IgM to NDO-LID-1 (NDO PGL-I synthetic antigen and

LID-1 combination) (Cardoso et al. 2013). In the current study both M. leprae specific

PGL-I and LID-1 tests were able to discriminate MB leprosy patients from other

81

dermatoses, who were all seronegative for LID-1. These results indicate the high

specificity of the LID-1 serology demonstrated by its negativity in non-MB leprosy

individuals from endemic areas where high incidence of tuberculosis and high coverage

of neonatal BCG vaccination are reported. Positive responses in household contacts to

PGL-I and LID-1 have been demonstrated to predict the onset of MB leprosy in

experimental and clinical surveillance settings (Qiong-Hua et al. 2013). Among endemic

controls from our study, the absence of serological response to LID-1 together with

cellular response to LID-1 in 38% is compatible with exposure/infection and suggests that

if these individuals progress to clinical disease, they have a higher chance of PB leprosy

manifestation rather than MB leprosy.

The results of ROC analysis, PPV and NPV for LID-1 serology support its utility

for the differential diagnosis of MB leprosy from other dermatoses, since 100% of

specificity and 87% of sensitivity were observed. Anti-PGL-I serology in MB leprosy

patients showed good specificity, but lower sensitivity, but nevertheless discriminated

MB leprosy from other dermatoses. Although anti LID-1 and PGL-I serologic tests detect

specific antibodies to M. leprae, important methodological differences including the

isotype of antibody and the antigen used, limit comparisons. Serology offers several

advantages over the other laboratory methodologies currently used to aid leprosy

diagnosis like slit-skin smears or histology on skin biopsies which require invasive and

sometimes painful sample collection, labor intensive and time consuming methodologies

with subjective results which depend on the observer. Considering that leprosy endemic

areas often lack sophisticated laboratories, field and user-friendly diagnostic test such as

lateral flow test and a M. leprae specific cellular point of care WBA-LID-1 test can help

clinicians in the differential diagnosis of leprosy with a minimal amount of training and

laboratory infrastructure. These tests can also help leprosy control programs by

facilitating or promoting early and accurate leprosy diagnosis, appropriate treatment,

which is crucial to interrupt M. leprae transmission and deformities and incapacities seen

in late diagnosis.

5. Acknowledgments

The authors thank all the patients for donating their blood and information for these

studies and staff of the “Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica, CRDT,

Hospital de Doenças Tropicais Dr Anuar Auad HDT/HAA and Hospital das Clínicas da

82

UFG - HC/UFG” in Goiânia/GO and “Centro de Dermatologia Dona Libânia - CDERM”

in Fortaleza/CE for their cooperation and support during recruitment. This study was

supported by American Leprosy Missions, The Heiser Program for Research in Leprosy

and Tuberculosis of The New York Community. Dr Mariane M. A. Stefani is a recipient

of a fellowship from National Counsel of Technological and Scientific Development

(CNPq/ Brazil) (grant # 304869/2008-2) and MSc. Aline A. Freitas was supported by a

scholarship awarded by the Coordination of Improvement of Higher Education Personnel

(CAPES Brazil - grant#1054292). We are grateful to Greg Ireton, Jeff Guderian, Raodoh

Mohamath, Alex Picone and Ayesha Misquith for producing of high quality recombinant

proteins and Dr. Tsuyoshi Fujiwara (Nara University, Japan) for generously providing

the NT-P-BSA antigen.

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86

Figures and Table:

Table 1: Main features of study groups

Study Group (n) Age

(mean years, range)

Sex ratio

(male/female)

BI

(mean, range)

PB1 (60) 48 (19-87) 28/32 0 (0-0.2)

MB2 (48) 50 (21-79) 25/23 2.3 (0.2-5.6)

Other dermatoses (46) 44 (19-74) 14/32 NA3

EC (62) 41 (19-78) 19/43 NA

1PB paucibacillary leprosy patients 2 MB multibacillary leprosy patients 3NA: not

applicable.

87

Figure 1: Anti PGL-I and anti-LID-1 serologic reactivity of: newly diagnosed untreated

multibacillary (MB) and paucibacillary (PB) leprosy patients, patients with other

dermatoses and healthy endemic controls (EC). IgM antibodies to PGL-I (A) and IgG

antibodies to LID-1 (B) were detected by ELISA. Each point represents the mean optical

density (OD) of duplicates of an individual serum sample and the median OD value of

each group is represented by the horizontal line. The traced black horizontal line is the

cut-off (anti-PGL-I serology: OD > 0.150, anti-LID-1 serology: OD > 0.3). The number

above each data set is the percent positive responses. Receiver Operating Curve (ROC)

(C) anti-PGL-I IgM serology in MB patients versus patients with other dermatoses; (D)

anti-LID-1 IgG serology in MB patients versus other dermatoses.

88

Figure 2: IFNγ production in the WBA of paucibacillary (PB) and multibacillary leprosy

patients (MB), in patients with other dermatoses and in endemic controls (EC) upon

stimulation with (A) LID-1, (B) MLCS- M. leprae sonicate antigen, (C) PHA-

phytohemagglutinin and (D) PBS- phosphate buffered saline control. Heparinized whole

blood 24-h cultures were performed, individual IFN-γ results (pg/ml) were plotted and

the horizontal line represents the median IFN-γ value. The traced black horizontal line

represents the cut-off (50 pg/ ml). The number at the top of the graphs represents the

percentage of positive responses in each group for each of the antigenic stimulus.

Receiver Operating Curve (ROC) (E) cellular test (WBA-LID-1) based on IFN detection

evaluated in PB leprosy patients versus other dermatoses (area under the curve 0.75)

specificity: 61.5%; sensitivity: 72.5%.

89

6 DISCUSSÃO

A hanseníase tem afligido a humanidade há séculos e ainda acomete anualmente

mais de 200.000 pessoas em todo o mundo, inclusive no Brasil (WHO, 2014). O

diagnóstico precoce de todas as formas clínicas e subsequente prescrição imediata e

apropriada da MDT são vitais para a prevenção de sequelas e interrupção da cadeia de

transmissão (GELUK, 2013b). Contudo, apesar do M. leprae ter sido o primeiro patógeno

descrito associado à infecção humana (STEFANI 2008) o diagnóstico da hanseníase

ainda depende da “expertise” de médicos em reconhecer as manifestações dermato-

neurológicas clássicas da doença. Além disso, a grande semelhança clínica existente entre

as lesões de pele encontradas na hanseníase e em outras doenças cutâneas e neurológicas,

aliada a inexistência de um teste laboratorial capaz de diagnosticar todas as formas

clínicas da hanseníase, favorece o sub-diagnóstico ou induz a erros no diagnóstico.

Embora a MDT seja considerada eficaz, e o completo entendimento da resposta imune

durante o curso da hanseníase seja crucial para o desenvolvimento de métodos que

possam auxiliar no manejo de pacientes com hanseníase, pouco se sabe sobre a influência

do tratamento nas respostas imunes celular e humoral antígeno específicas de pacientes

com hanseníase PB e MB.

Devido à dicotomia da resposta imune observada em pacientes PB e MB, estudos

sobre o desenvolvimento de testes para fins de diagnóstico, prognóstico ou

monitoramento da MDT para hanseníase devem avaliar tanto a resposta imune humoral

quanto a resposta imune celular a novos antígenos. Neste contexto, este estudo descreve

o efeito da MDT nas respostas imune celular e humoral antígeno específicas avaliadas

paralelamente mediante o seguimento de pacientes PB e MB, bem como a utilidade do

ensaio de sangue total (EST) para LID-1 e da sorologia para LID-1 e PGL-I no

diagnóstico diferencial da hanseníase e outras dermatoses clinicamente semelhantes.

No presente estudo, pacientes MB não tratados apresentaram altos níveis de IgG

anti-rML e IgM anti-PGL-I, os quais declinaram após a conclusão da MDT. Baixa

sororeatividade para rML e para PGL-I foi observada em pacientes PB, antes e após a

MDT, porém, a comparação de amostras pareadas demonstrou que a produção de IFN

para a maioria das rMLs testadas declinou após a conclusão da MDT comparada a

magnitude desta resposta observada no momento do diagnóstico. Todavia, uma exceção

foi observada para LID-1, a qual induziu a secreção de maiores níveis de IFN quando

90

comparados aos níveis produzidos pelos mesmos pacientes PB no momento do

diagnóstico. Surpreendentemente, uma resposta de IFN para LID-1 também foi

observada para pacientes MB, 4 meses após a conclusão da MDT.

Ao diagnóstico, a maioria dos pacientes MB apresentou alta produção de

anticorpos anti-rML e anti-PGL-I (DUTHIE et al., 2007; HUNGRIA et al., 2012;

OSKAM et al., 2003; REECE et al., 2006; SAMPAIO et al., 2011). Assim como a

resposta de IgM anti-PGL-I, as respostas de IgG para cada rML testada correlacionou-se

com a carga bacilar no momento do diagnóstico (GELUK et al., 2011). O declínio nos

níveis de anticorpos anti-PGL-I e rML, incluindo LID-1, foi previamente demonstrado

(DUTHIE et al., 2011). Em nosso estudo, um significante declínio nos níveis de IgG entre

pacientes MB foi observado após a conclusão da MDT, porém, este declínio foi menos

acentuado para IgM anti-PGL-I. Estes resultados estão de acordo com outros estudos que

demonstraram uma diminuição nos níveis de IgM anti-PGL-I após o início do tratamento,

embora, este declínio seja amplamente variado entre os pacientes, podendo ser linear e

negativar rapidamente, ou permanecer positiva por muitos anos (PRAKASH et al., 1993;

ROCHE et al., 1993).

A detecção de IFN após EST em pacientes PB ao diagnóstico e sua ausência em

EST de pacientes MB antes do tratamento corrobora com os resultados de estudos prévios

(DUTHIE et al., 2008a; OLIVEIRA et al., 2014; SAMPAIO et al., 2011, 2012). Embora

pacientes MB sejam comumente considerados anérgicos devido a baixa ou ausente

resposta imune celular frente a frações do M. leprae bruto, uma resposta de IFN para

LID-1 foi também observada entre pacientes MB, 4 meses após a conclusão da MDT. O

motivo pelo qual pacientes MB passaram a apresentar resposta celular para LID-1 após a

MDT (fusão entre ML0405, uma proteína hipotética com função desconhecida, e

ML2331, a qual é provavelmente uma proteína secretada) é ainda incerta. Estudos in situ

de lesões de pele provenientes de ambos pacientes MB e avaliados uma semana após o

início da MDT mostraram um aumento na expressão de HLA-DR e citocinas

inflamatórias tais como IL-1β, TNFα e IFN (ARNOLDI et al., 1990; CREE et al., 1995;

TUNG et al., 1987).

Estudos experimentais demonstraram que uma única dose de rifampicina é capaz

de matar 99% dos bacilos e que isto promove a liberação de antígenos (CREE et al.,

1995). Neste sentido, estímulos in vitro com M. leprae vivo demonstraram tanto evasão

ou supressão da resposta imune quanto ativação da resposta imune por meio de estímulos

91

por componentes do bacilo fragmentado ou morto (LAHIRI et al., 2010; STEINHOFF et

al., 1991). Culturas de células dendríticas infectadas com M. leprae vivo demonstraram

que estas células diminuem a expressão de MHC de classe I e II e a apresentação de

antígenos a célula T (HASHIMOTO et al., 2002), enquanto, bacilos mortos ou

fragmentados aumentam a expressão de MHC de classe II, moléculas coestimulatórias

(CD86), aumentam a ativação de células T CD4 e induzem alta produção de IFN pelas

células T CD4 e CD8 (DEGANG et al., 2014; MAEDA et al., 2003). Portanto, sugere-se

neste estudo que a destruição do bacilo pela MDT possa resultar em um aumento na

apresentação antigênica devido a alta exposição aos antígenos incluindo novos antígenos,

os quais incluem epítopos presentes na proteína LID-1, já que é uma proteína modificada,

e que poderiam levar ao estímulo de células T de memória efetoras e subsequente

produção de IFN mesmo em pacientes MB previamente anérgicos.

A redução na produção de IFN observada em pacientes PB (e também MB) cerca

de 2 anos após a MDT poderia possivelmente ser explicada pela eliminação dos bacilos

e pela depuração de antígenos do organismo. Sabe-se que a MDT reduz efetivamente a

viabilidade do M. leprae, contudo, antígenos persistentes podem permanecer em tecidos

afetados anos após a conclusão da MDT, de modo que a apresentação de antígenos do M.

leprae ao sistema imune pode ocorrer variando individualmente entre os pacientes, a

depender da carga bacilar inicial, persistência em tecidos afetados durante ou após a MDT

e ou contínua presença antigênica no ambiente (SHETTY et al., 1994). Neste estudo os

intervalos de tempo em que foi realizada a análise da resposta imune após a introdução

da MDT foi semelhante para pacientes MB e PB (4-8 meses, respectivamente) e cerca de

dois anos após a conclusão da MDT (20 meses para PB e 22 meses para pacientes MB).

Mesmo sendo o período de tratamento, a partir do diagnóstico, diferente para pacientes

MB e PB, esta diferença aparentemente não influenciou as mudanças no padrão de

resposta imune observada após a MDT.

A redução nas respostas imunes patógeno-específicas após o tratamento bem

sucedido também foi demonstrada para outras doenças infecciosas, como a tuberculose

(AIKEN et al., 2006; CONNELL et al., 2010; PATHAN et al., 2001; RIBEIRO et al.,

2009). A maioria dos estudos demonstra uma diminuição na produção de IFN após o

tratamento para tuberculose, todavia, assim como em nosso estudo, o aumento na

produção de IFN durante o tratamento seguido de declínio no final do tratamento

também foi relatada (HERRMANN et al., 2009; NICOL et al., 2005). Enquanto, a

92

ativação inicial da resposta imune pelo patógeno induz a geração de células de memória

de vida longa que sobrevivem por anos (FARBER et al., 2014), a eliminação do patógeno

devido o tratamento eficaz promove mecanismos de feedback negativo na ativação da

resposta imune, o que resulta na morte de clones de células antígeno-específicas e restaura

a homeostase. É possível que isto ocorra durante a MDT para hanseníase.

O impacto da MDT na resposta imune celular específica para o M. leprae não foi

descrita previamente. Além disso, é desconhecido qual o impacto desta redução na

resposta celular específica ao M. leprae no prognóstico dos pacientes. Contudo, alguns

estudos em outras doenças infecciosas avaliaram as mudanças nas respostas imunes em

decorrência do tratamento e seu impacto no prognóstico. Um estudo recente demonstrou

que a maioria dos pacientes “curados” de leishmaniose tegumentar mediante o

tratamento, mesmo apresentando teste cutâneo positivo para leishmânia não

apresentavam produção de IFN in vitro em resposta ao antígeno de parasitos de

Leishmania braziliensis (CARVALHO et al., 2013). Além disso, a reinfecção não foi

observada em nenhum destes pacientes até 15 anos após o tratamento, indicando que

mesmo na ausência de imunidade celular detectável in vitro, estes indivíduos

permaneceram protegidos. Um estudo experimental com parasitos de Leishmania major

demonstrou que embora na ausência de infecção não se observa presença de células T

CD4 efetoras. As células T CD4 de memória central são mantidas e no caso de uma

segunda infecção, estas células tornam-se circulantes e diferenciam-se em células T

efetoras para mediar a proteção (ZAPH et al., 2004). Na esquistossomose, assim como na

hanseníase MB a doença é caracterizada por vigorosa resposta Th2 e o tratamento com

praziquantel pode alterar ou redirecionar a polarização das respostas imunes antígeno-

específicas para um fenótipo pró-inflamatório, o qual, pode prevenir a ocorrência de

reinfecção (BOURKE et al., 2013).

Reconhecemos que o tamanho da amostra utilizada neste estudo é relativamente

pequeno e que a perda de seguimento dos pacientes representa uma limitação deste.

Contudo, nossas análises sequenciais de imunidade específica trazem novos dados

demonstrando que ambas as respostas imune celular e humoral específicas ao M. leprae

declinam cerca de dois anos após a conclusão da MDT. É importante salientar que as

reduções não foram observadas em todos os intervalos de tempo, uma vez que a alta

produção de IFN para LID-1 foi observada em pacientes MB e PB avaliados 4-8 meses

após a conclusão da MDT. Portanto, a morte do M. leprae mediante a MDT, e a provável

93

liberação de antígenos durante este processo, podem diferencialmente impactar a resposta

imune após o tratamento. Estes resultados são importantes quando consideramos que em

áreas altamente endêmicas para hanseníase, recidivas ou reinfecções, embora sejam

eventos raros, podem eventualmente ocorrer, e nossos dados sugerem que a redução nas

respostas de IFN após a MDT aparentemente não influenciam na manutenção da

imunidade protetora.

Estudos multicêntricos, os quais avaliem a resposta imune celular mediante

detecção de IFN em pacientes provenientes de diferentes áreas endêmicas antes, durante

e após a MDT são necessários. O papel da resposta imune celular específica ao M. leprae

após a MDT em reinfecções ou intervenções imunoterapêuticas em áreas endêmicas para

hanseníase são incertas e deve ser melhor investigado.

O conhecimento da influência do tratamento nos mecanismos imunológicos

envolvidos no processo de cura da hanseníase ou persistência da doença, juntamente com

a execução de um diagnóstico acurado e precoce evitariam muitas sequelas, além de

interromper a cadeia de transmissão do M. leprae. Inicialmente é importante que o

diagnóstico seja feito de forma correta e que uma vez definido um caso de hanseníase, o

tratamento seja eficiente e que haja métodos que mensurem a sua eficácia. O diagnóstico

é imprescindível, porém, após o diagnóstico a cura e prevenção de incapacidades é o

objetivo final.

O diagnóstico da hanseníase é eminentemente clínico e depende da identificação

de pelo menos um dos seguintes sinais cardinais: (1) Perda de sensibilidade em mancha

de pele eritematosa ou hipopigmentada; (2) Presença de espessamento neural periférico

com perda de sensibilidade e ou fraqueza dos músculos inervados pelo segmento neural

espessado; (3) Presença de bacilo álcool-ácido resistente na linfa. Uma das principais

preocupações relativa ao controle da hanseníase é que o número de profissionais de saúde

com “expertise” para reconhecer sinais precoces ou mesmo a forma disseminada da

hanseníase, ou fornecer um diagnóstico diferencial confiável está se tornando escasso em

países endêmicos. Além disso, um exame de baciloscopia de alta qualidade é dificilmente

encontrado (ILEP, 2001; WHO, 2009).

Este cenário preocupante pode contribuir para diagnóstico errôneo ou sub-

diagnóstico além de falhas no tratamento precoce e adequado (GELUK, 2013a; RAFFE

et al., 2013; SIDDIQUI et al., 2009). Portanto, testes laboratoriais específicos e acurados

para auxiliar no diagnóstico podem ajudar nas estratégias de controle da hanseníase. Neste

94

sentido, este estudo também investigou a potencial aplicação do EST e da sorologia para

LID-1 no diagnóstico diferencial da hanseníase. Nossos resultados demonstraram que

ambos os testes podem contribuir para discriminar hanseníase de outras doenças de pele

clinicamente semelhantes quando avaliadas em duas regiões geográficas altamente

endêmicas do Brasil. A triagem de mais 100 proteínas recombinantes do M. leprae

durante mais de uma década, revelou que a proteína de fusão LID-1 é um dos mais

promissores antígenos apropriados para o diagnóstico laboratorial da hanseníase PB e

MB.

Mesmo a mais nova geração de testes sorológicos e de imunidade celular

específicos para M. leprae apresentam potenciais aplicações e limitações uma vez que

nenhuma das estratégias é 100% sensível ou 100% específica. Além disso, testes baseados

em mecanismos imunológicos requerem a avaliação de ambas as respostas imunes celular

e humoral para confirmar o diagnóstico de hanseníase PB e MB respectivamente.

Neste estudo, a sorologia anti-LID-1 demonstrou 100% de especificidade

fornecendo resultados negativos em todos os participantes que não apresentavam

hanseníase (controles endêmicos e outras dermatoses) e 87% de sensibilidade para

pacientes com hanseníase MB. Porém, como outros testes sorológicos para hanseníase,

este teste não é sensível para hanseníase PB, a qual requer testes baseados em imunidade

celular (BÜHRER- SÉKULA et al., 2008; CARDOSO et al., 2013). Cerca de 60-80% dos

pacientes PB não produzem anticorpos para PGL-I a níveis detectáveis e a positividade

anti-LID-1 também é baixa (DUTHIE et al., 2008b, FABRI et al., 2015; HUNGRIA et

al., 2012; OSKAM et al., 2003). Neste estudo confirmamos os resultados prévios de nosso

grupo de estudo demonstrando que LID-1 induz produção de IFN em pacientes PB não

tratados e baixa resposta em pacientes MB (OLIVEIRA et al., 2014, FREITAS et al.,

2015). Além disso, observamos que pacientes com outras dermatoses clinicamente

semelhantes produziram menores níveis de IFN comparados a pacientes PB quando

estimulados com a proteína de fusão LID-1. A sensibilidade e especialmente a

especificidade do EST usando LID-1 para diagnosticar hanseníase PB, foi menor

comparada a sorologia, porém ainda suficiente para discriminar hanseníase PB de outras

dermatoses. Além do exame clínico realizado por profissionais treinados, testes

laboratoriais rápidos e simples poderiam ser realizados no campo, por profissionais de

saúde em geral, para avaliar indivíduos com mínima suspeita de hanseníase contribuindo

para o tratamento precoce e preciso.

95

Estudos prévios de testes baseados em estímulo de PBMCs com peptídeos do M.

leprae demonstraram que controles endêmicos (EC) provenientes de duas diferentes

regiões geográficas do mundo (Fortaleza/Brasil e Etiópia), as quais possuem diferentes

taxas de prevalência, apresentaram diferente produção de IFN e padrões de

reconhecimento aos peptídeos (BOBOSHA et al., 2012a; BOBOSHA et al., 2012b). Em

nosso estudo, baseado na produção de IFN mediante EST, uma significante proporção

de pacientes com outras dermatoses e EC responderam ao antígeno sonicado do M. leprae

(58% e 76% respectivamente). A frequência das respostas para LID-1 foi menor, porém,

ainda expressiva (38% e 40% respectivamente). Contudo, as respostas de EC e outras

dermatoses foram ainda estatisticamente menores quando comparadas a pacientes com

hanseníase PB. O IFN, considerado como a citocina assinatura da resposta Th1, é

frequentemente utilizado como biomarcador para infecção pelo M. leprae. Todavia,

nossos resultados corroboram a utilidade do IFN como um bom marcador de exposição

ao invés de um marcador de infecção para hanseníase reforçando a limitação destes testes

baseados na detecção isolada de IFN para fins de diagnóstico.

No entanto, considerando as respostas de IFN na hanseníase PB versus outras

dermatoses, o valor de 0,75 obtido para a área sob a curva na análise curva ROC, pode

ser considerada aceitável, indicando que mesmo com limitações na sensibilidade e

especificidade, o EST é ainda capaz, em muitos casos, discriminar hanseníase PB de

outras dermatoses. As respostas imunes inatas e adaptativas ao M. leprae envolvem

complexas interações entre diferentes componentes celulares os quais produzem várias

citocinas e quimiocinas (NATH et al., 2015). Biomarcadores adicionais de infecção

versus exposição ao M. leprae são necessários e a quimiocina IP-10 tem sido indicada

como um potencial marcador de infecção (BOBOSHA et al., 2014). Tal marcador é

necessário para discriminar indivíduos expostos ao M. leprae de indivíduos infectados

(GELUK et al., 2012). Um teste rápido baseado na liberação de IFN (IGRA) está

comercialmente disponível para o diagnóstico de tuberculose latente (QuantiFERON-TB-

Gold-In-Tube®). Neste contexto, o desenvolvimento de um teste de imunidade celular

rápido para hanseníase PB semelhante ao IGRA para tuberculose e que incorpore um

marcador para infecção, tem sido almejado por vários grupos de estudo, o qual se bem

sucedido, pode auxiliar os médicos no diagnóstico diferencial da hanseníase PB na prática

clínica (BOBOSHA et al., 2014, OLIVEIRA et al., 2014).

96

A sorologia para o PGL-I tem sido amplamente utilizada para fins de tratamento

auxiliando na classificação dos pacientes em MB ou PB, monitoramento de casos,

identificação de risco de recidiva e seleção de contatos intradomiciliares com alto risco

de desenvolver a doença (BUHRER-SÉKULA et al., 2003; DOUGLAS et al., 2004; WU

et al., 2002). Recentemente muitos estudos demonstraram que a sorologia para proteínas

recombinantes do M. leprae podem detectar pacientes com hanseníase MB (CARDOSO

et al., 2013; HUNGRIA et al., 2012). Uma publicação recente do nosso grupo descreveu

o desenvolvimento de um novo teste rápido de fluxo lateral para diagnóstico MB. O teste

NDO-LID® detecta IgG e IgM simultaneamente para NDO-LID-1 (NDO antígeno

sintético do PGL-I combinado a proteína LID-1) e fornece leituras objetivas e

quantificáveis mediante uma plataforma de leitura de testes baseada em um celular

smartphone (“Smart Reader®”) (CARDOSO et al., 2013).

No presente estudo, ambos os testes foram capazes de discriminar pacientes com

hanseníase MB de pacientes com outras dermatoses, os quais todos foram soronegativos

para LID-1 e 6% apresentaram reatividade para PGL-I. Estes resultados refletem a alta

especificidade da sorologia pra LID-1, a qual não apresenta reação cruzada com

indivíduos proveniente destas áreas endêmicas que também reportam alta incidência de

tuberculose e alta cobertura vacinal para BCG. A soropositividade para PGL-I e LID-1

demonstrou ser hábil em predizer o início da hanseníase MB em estudos experimentais e

de vigilância clínica (QIONG-HUA et al., 2013). A ausência de resposta sorológica em

EC juntamente com a significante resposta imune celular para ambos antígeno do M.

leprae sonicado e LID-1 observada neste grupo de estudo, é compatível com a hipótese

de que se esses indivíduos desenvolverem sintomas existe uma maior chance de

desenvolverem a forma PB da doença ao invés da forma MB.

Os resultados da análise da curva ROC juntamente com o cálculo do VPP e VPN

apoia a utilidade da sorologia pra LID-1 para o diagnóstico diferencial da hanseníase MB

com outras dermatoses, uma vez que 100% de especificidade e 87% de sensibilidade foi

observada. Em relação a sorologia para PGL-I, a determinação de VPP e VPN para

hanseníase MB versus outras dermatoses revelaram boa especificidade e menor

sensibilidade, porém capaz de discriminar pacientes MB de outras dermatoses. Embora a

sorologia anti-LID-1 e PGL-I detectem anticorpos específicos para o M. leprae,

diferenças metodológicas importantes como o isótipo do anticorpo detectado e o antígeno

utilizado não permitem comparações.

97

A sorologia oferece várias vantagens em relação às metodologias laboratoriais

utilizadas atualmente para auxiliar o diagnóstico da hanseníase, como a baciloscopia ou

histopatológico a partir de biópsias de pele, cuja coleta é invasiva e em algumas vezes

dolorosa, requerem trabalho intenso e são metodologias prolongadas que fornecem

resultados subjetivos e dependem do observador. Levando-se em consideração que áreas

endêmicas frequentemente não possuem laboratórios sofisticados, um teste de

diagnóstico aplicável em situações de campo tal como para LID-1 e um teste de

imunidade celular específico para M. leprae do tipo “point of care” poderiam auxiliar os

clínicos no diagnóstico diferencial da hanseníase. Estes testes podem fornecer resultados

confiáveis, rápidos e objetivos com um mínimo necessário de infraestrutura e treinamento

laboratorial quando comparados com a biópsia e baciloscopia ou mesmo com a sorologia

convencional. Estes testes também podem auxiliar os programas de controles da

hanseníase facilitando ou promovendo diagnóstico precoce e acurado e tratamento

apropriado, o que é crucial para interromper a cadeia de transmissão do M. leprae.

98

7 CONCLUSÕES

A MDT reduz a produção de IFN em pacientes PB: Na primeira avaliação após

a MDT (8 meses) a produção foi mantida mas declinou dois anos após a MDT;

A soronegatividade predominante antes do tratamento (anti LID-1 e PGL-I) em

pacientes PB não foi modificada após a conclusão da MDT;

Inicialmente a MDT reverteu a anergia celular característica dos pacientes MB,

apenas para LID-1, mas posteriormente (2 anos após a MDT) não houve

produção de IFN para nenhuma rML;

A MDT causou declínio dos níveis de IgG anti-rML e IgM anti-PGL-I na maioria

dos pacientes MB.

O EST para LID-1 apresentou especificidade e sensibilidade consideradas

aceitáveis podendo contribuir para o diagnóstico diferencial da hanseníase PB e

outras dermatoses.

A sorologia para PGL-I e principalmente a sorologia anti-LID-1 discriminou

pacientes MB de pacientes com outras dermatoses com alta sensibilidade e

especificidade máxima para sorologia anti LID-1.

99

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89, p. 389-400. 2014.

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118

ANEXOS

Anexo 1. Parecer Comitê de Ética em Pesquisa – HC/UFG.

119

120

121

Anexo 2. Termos de consentimento livre e esclarecido - TCLE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – Pacientes com suspeita de Hanseníase

Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, em uma investigação sobre testes

diagnósticos para detectar infecção pela bactéria que causa a hanseníase que se chama Mycobacterium

leprae. Você será esclarecido(a) sobre as etapas da investigação a seguir. Caso você aceite participar da

investigação, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do

pesquisador responsável. Em caso de recusa você não terá nenhum prejuízo de qualquer forma.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

Título do Projeto: Pesquisa de biomarcadores aplicada ao desenvolvimento de testes para o diagnóstico e

prognóstico da hanseníase.

Instituição: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás.

Pesquisador Responsável: Dra Mariane Martins de Araújo Stefani, IPTSP (fone: 3209.6111) que estará

disponível para esclarecer suas dúvidas. Duração do estudo: três anos.

Você também poderá contactar o Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital das Clínicas para

maiores esclarecimentos sobre seus direitos. Telefone Comitê de Ética: (62)-3269-8338 ou 3269-8426.

DESCRIÇÃO DA PESQUISA

Até o momento, não existe nenhum teste laboratorial ideal para o diagnóstico precoce da Hanseníase.

Os testes atualmente disponíveis ou apresentam pouca sensibilidade ou são muito sofisticados e caros para

o uso na rotina. Neste sentido, pesquisas, como esta, estão sendo desenvolvidas visando a descoberta de

novos reagentes/testes que possam ser aplicados para o diagnóstico da infecção recente / hanseníase. Você

está sendo convidado a participar deste estudo porque é muito importante testarmos o novo reagente/teste

em pessoas com suspeita clínica de hanseníase, como é o seu caso.

PROCEDIMENTO DA PESQUISA

Para todos os participantes faremos uma única coleta de sangue (10 ml) usando seringa e agulha estéreis

descartáveis. As amostras de sangue serão identificadas por códigos. Tudo que soubermos sobre você através

do estudo (exame clínico, resultados de exames laboratoriais) será confidencial, e você será informado dos

resultados de seus exames. Se publicarmos os resultados do estudo em revista científica ou livro, você não

será identificado de nenhuma maneira. Se você tem alguma dúvida relacionada ao estudo neste momento ou

no decorrer da investigação, você poderá contactar Dra Mariane M. A. Stefani, IPTSP que estará disponível

para esclarecer suas dúvidas. O material biológico será encaminhado e testado no Laboratório de Imunologia

da AIDS e da Hanseníase, IPTSP-UFG. Caso exista sobra deste material doado, lhe pedimos permissão para

U F G

122

armazenar essa sobra em nosso laboratório sob condições de refrigeração (-80oC) para utilização em estudos

futuros. Caso isso ocorra, você será contactado para esclarecimento sobre este novo estudo e para pedir sua

permissão para utilização do material. Você também pode assinar que dispensa este contato, autorizando

assim a utilização automática do material excedente num estudo futuro. Assinale abaixo sim, se você quer

ser contactado antes de permitir o uso das amostras ou não, caso prefira autorizar a utilização futura: Sim,

quero ser contactado antes da utilização. Não, dispenso o contato. Ressaltamos que em caso de utilização

de sobras de materiais em estudos futuros, o projeto será resubmetido para análise por um Comitê de Ética.

PARTICIPAÇÃO

Sua participação é voluntária, e você pode se recusar no momento da coleta de sangue ou retirar o

seu consentimento a qualquer tempo, sem nenhum tipo de prejuízo na realização de qualquer dos exames

de rotina, no tratamento, nem nas consultas médicas.

Riscos e benefícios: Existe um desconforto e risco mínimo para você que se submeter a coleta de material

para esta pesquisa, sendo que se justifica pelos benefícios que este exame lhe proporcionará. Se você aceitar

participar da pesquisa estará exposto a riscos inerentes a coleta de sangue e ao procedimento para realização

da biópsia. É possível que se forme um hematoma (acúmulo de sangue) no local da coleta do sangue e no

que diz respeito a realização da biópsia, você estará exposto a riscos de infecção, formação de quelóide

caso você seja predisposto e reações alérgicas ao anestésico local. A realização de exames complementares

tais como histopatológico e sorologia anti PGL-I te beneficiará no âmbito da possibilidade de realização de

um diagnóstico mais preciso e conclusivo pelo médico, o qual poderá correlacionar os achados clínicos e

laboratoriais.

Forma de acompanhamento e assistência: Em relação a coleta sanguínea, nossos coletadores são

treinados para realizarem o procedimento com segurança e usarão material descartável. Em caso de ocorrer

algum prejuízo a você decorrente da coleta venosa como, por exemplo, hematomas, você será acompanhado

e, caso necessário, receberá assistência médica adequada. O procedimento de coleta da biópsia será

executado em uma sala destinada apenas para realização deste procedimento e por profissionais médicos

qualificados e aptos para tal. Caso alguma intercorrência ocorra, como infecções, formação de quelóide ou

reações alérgicas ao anestésico local, você receberá toda a assistência médica e terapêutica necessária.

CONFIDENCIALIDADE

Os pesquisadores irão tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo.Todos os resultados

da pesquisa serão confidenciais, somente usados pelos pesquisadores para fins científicos. Nenhum nome ou

resultado individual será divulgado, permanecendo, portanto em sigilo. O paciente terá acesso aos resultados

do exame clínico e dos exames laboratoriais a qualquer tempo. Benefícios: a pesquisa pretende contribuir

para identificar novos reagentes que possam ser usados em novos testes laboratoriais para o diagnóstico da

infecção/doença hanseníase. A análise comparativa entre os dados clínicos e laboratoriais poderão resultar

numa melhoria de qualidade no diagnóstico dos pacientes portadores de hanseníase.

123

CUSTO DA PARTICIPAÇÃO, RESSARCIMENTO E INDENIZAÇÃO POR EVENTUAIS

DANOS

A sua participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponibilizada nenhuma

compensação financeira adicional, e caso existam gastos estes serão pagos pelo orçamento da pesquisa. No

caso de você sofrer algum dano, será guardado o direito de indenização legal por danos comprovadamente

decorrentes da pesquisa.

CONSENTIMENTO

Eu li as informações/ As informações do estudo foram lidas para mim e eu fui informado sobre este

estudo, estou ciente que minha participação no estudo é voluntária e pode ser interrompida a qualquer

momento. Em caso de desistência, isto não implicará em nenhuma penalidade ou prejuízo de atendimento

meu em qualquer centro de saúde ou hospital. Além disto, permito que eu seja fotografado para registro dos

sinais e sintomas clínicos, para posterior arquivo no laboratório de pesquisa. Estou também de acordo com

a possível publicação dos resultados dessa pesquisa em forma de resumos e/ou artigos científicos em revistas.

Informo que aceito participar do estudo.

___________________________________ _________________________________

Assinatura do participante/impressão digital Assinatura do pai, mãe ou responsável legal

__________________________________ Data: -------/--------/--------

Assinatura do entrevistador

124

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – Pacientes tratados para Hanseníase

Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, em uma investigação sobre testes

diagnósticos para detectar infecção pela bactéria que causa a hanseníase que se chama Mycobacterium

leprae. Você será esclarecido(a) sobre as etapas da investigação a seguir. Caso você aceite participar da

investigação, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do

pesquisador responsável. Em caso de recusa você não terá nenhum prejuízo de qualquer forma.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

Título do Projeto: Pesquisa de biomarcadores aplicada ao desenvolvimento de testes para o diagnóstico e

prognóstico da hanseníase.

Instituição: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás.

Pesquisador Responsável: Dra Mariane Martins de Araújo Stefani, IPTSP (fone: 3209.6111) que estará

disponível para esclarecer suas dúvidas. Duração do estudo: três anos.

Você também poderá contactar o Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital das Clínicas para

maiores esclarecimentos sobre seus direitos. Telefone Comitê de Ética: (62)-3269-8338 ou 3269-8426.

DESCRIÇÃO DA PESQUISA

Até o momento, não existe nenhum teste laboratorial ideal para o diagnóstico precoce da Hanseníase.

Os testes atualmente disponíveis ou apresentam pouca sensibilidade ou são muito sofisticados e caros para

o uso na rotina. Neste sentido, pesquisas, como esta, estão sendo desenvolvidas visando a descoberta de

novos reagentes/testes que possam ser aplicados para o diagnóstico da infecção recente / hanseníase. Você

está sendo convidado a participar deste estudo porque é muito importante testarmos o novo reagente/teste

em pessoas que já finalizaram o tratamento para hanseníase, como é o seu caso.

PROCEDIMENTO DA PESQUISA

Para todos os participantes faremos uma única coleta de sangue (10 ml) usando seringa e agulha estéreis

descartáveis. As amostras de sangue serão identificadas por códigos. Tudo que soubermos sobre você através

do estudo (exame clínico, resultados de exames laboratoriais) será confidencial, e você será informado dos

resultados de seus exames. Se publicarmos os resultados do estudo em revista científica ou livro, você não

será identificado de nenhuma maneira. Se você tem alguma dúvida relacionada ao estudo neste momento ou

no decorrer da investigação, você poderá contactar Dra Mariane M. A. Stefani, IPTSP que estará disponível

para esclarecer suas dúvidas. O material biológico será encaminhado e testado no Laboratório de Imunologia

da AIDS e da Hanseníase, IPTSP-UFG. Caso exista sobra deste material doado, lhe pedimos permissão para

armazenar essa sobra em nosso laboratório sob condições de refrigeração (-80oC) para utilização em estudos

futuros. Caso isso ocorra, você será contactado para esclarecimento sobre este novo estudo e para pedir sua

permissão para utilização do material. Você também pode assinar que dispensa este contato, autorizando

assim a utilização automática do material excedente num estudo futuro. Assinale abaixo sim, se você quer

U F G

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ser contactado antes de permitir o uso das amostras ou não, caso prefira autorizar a utilização futura: Sim,

quero ser contactado antes da utilização. Não, dispenso o contato. Ressaltamos que em caso de utilização

de sobras de materiais em estudos futuros, o projeto será resubmetido para análise por um Comitê de Ética.

PARTICIPAÇÃO

Sua participação é voluntária, e você pode se recusar no momento da coleta de sangue ou retirar o

seu consentimento a qualquer tempo, sem nenhum tipo de prejuízo na realização de qualquer dos exames

de rotina, no tratamento, nem nas consultas médicas.

Riscos e benefícios: Existe um desconforto e risco mínimo para você que se submeter a coleta de material

para esta pesquisa, sendo que se justifica pelos benefícios que este exame lhe proporcionará. Se você aceitar

participar da pesquisa estará exposto a riscos inerentes a coleta de sangue e ao procedimento para realização

da biópsia. É possível que se forme um hematoma (acúmulo de sangue) no local da coleta do sangue e no

que diz respeito a realização da biópsia, você estará exposto a riscos de infecção, formação de quelóide

caso você seja predisposto e reações alérgicas ao anestésico local. A realização de exames complementares

tais como histopatológico e sorologia anti PGL-I te beneficiará no âmbito da possibilidade de realização de

um diagnóstico mais preciso e conclusivo pelo médico, o qual poderá correlacionar os achados clínicos e

laboratoriais.

Forma de acompanhamento e assistência: Em relação a coleta sanguínea, nossos coletadores são

treinados para realizarem o procedimento com segurança e usarão material descartável. Em caso de ocorrer

algum prejuízo a você decorrente da coleta venosa como, por exemplo, hematomas, você será acompanhado

e, caso necessário, receberá assistência médica adequada. O procedimento de coleta da biópsia será

executado em uma sala destinada apenas para realização deste procedimento e por profissionais médicos

qualificados e aptos para tal. Caso alguma intercorrência ocorra, como infecções, formação de quelóide ou

reações alérgicas ao anestésico local, você receberá toda a assistência médica e terapêutica necessária.

CONFIDENCIALIDADE

Os pesquisadores irão tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo.Todos os resultados

da pesquisa serão confidenciais, somente usados pelos pesquisadores para fins científicos. Nenhum nome ou

resultado individual será divulgado, permanecendo, portanto em sigilo. O paciente terá acesso aos resultados

do exame clínico e dos exames laboratoriais a qualquer tempo. Benefícios: a pesquisa pretende contribuir

para identificar novos reagentes que possam ser usados em novos testes laboratoriais para o diagnóstico da

infecção/doença hanseníase. A análise comparativa entre os dados clínicos e laboratoriais poderão resultar

numa melhoria de qualidade no diagnóstico dos pacientes portadores de hanseníase.

CUSTO DA PARTICIPAÇÃO, RESSARCIMENTO E INDENIZAÇÃO POR EVENTUAIS

DANOS

A sua participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponibilizada nenhuma

compensação financeira adicional, e caso existam gastos estes serão pagos pelo orçamento da pesquisa. No

126

caso de você sofrer algum dano, será guardado o direito de indenização legal por danos comprovadamente

decorrentes da pesquisa.

CONSENTIMENTO

Eu li as informações/ As informações do estudo foram lidas para mim e eu fui informado sobre este

estudo, estou ciente que minha participação no estudo é voluntária e pode ser interrompida a qualquer

momento. Em caso de desistência, isto não implicará em nenhuma penalidade ou prejuízo de atendimento

meu em qualquer centro de saúde ou hospital. Além disto, permito que eu seja fotografado para registro dos

sinais e sintomas clínicos, para posterior arquivo no laboratório de pesquisa. Estou também de acordo com

a possível publicação dos resultados dessa pesquisa em forma de resumos e/ou artigos científicos em revistas.

Informo que aceito participar do estudo.

___________________________________ _________________________________

Assinatura do participante/impressão digital Assinatura do pai, mãe ou responsável legal

__________________________________ Data:-------/--------/--------

Assinatura do entrevistador

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – Indivíduos saudáveis

Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, em uma investigação sobre testes

diagnósticos para detectar infecção pela bactéria que causa a hanseníase que se chama Mycobacterium

leprae. Você será esclarecido(a) sobre as etapas da investigação a seguir. Caso você aceite participar da

investigação, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do

pesquisador responsável. Em caso de recusa você não terá nenhum prejuízo de qualquer forma.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

Título do Projeto: Pesquisa de biomarcadores aplicada ao desenvolvimento de testes para o diagnóstico e

prognóstico da hanseníase.

Instituição: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás.

Pesquisador Responsável: Dra Mariane Martins de Araújo Stefani, IPTSP (fone: 3209.6111) que estará

disponível para esclarecer suas dúvidas. Duração do estudo: três anos.

Você também poderá contactar o Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital das Clínicas para

maiores esclarecimentos sobre seus direitos. Telefone Comitê de Ética: (62)-3269-8338 ou 3269-8426.

DESCRIÇÃO DA PESQUISA

Até o momento, não existe nenhum teste laboratorial ideal para o diagnóstico precoce da Hanseníase.

Os testes atualmente disponíveis ou apresentam pouca sensibilidade ou são muito sofisticados e caros para

o uso na rotina. Neste sentido, pesquisas, como esta, estão sendo desenvolvidas visando a descoberta de

novos reagentes/testes que possam ser aplicados para o diagnóstico da infecção recente / hanseníase. Você

está sendo convidado a participar deste estudo porque é muito importante testarmos o novo reagente/teste

em pessoas que não apresenta nenhum sinal ou sintoma de hanseníase ou tuberculose e que esteja saudável,

como é o seu caso.

PROCEDIMENTO DA PESQUISA

Para todos os participantes faremos uma única coleta de sangue (10 ml) usando seringa e agulha estéreis

descartáveis. As amostras de sangue serão identificadas por códigos. Tudo que soubermos sobre você através

do estudo (exame clínico, resultados de exames laboratoriais) será confidencial, e você será informado dos

resultados de seus exames. Se publicarmos os resultados do estudo em revista científica ou livro, você não

será identificado de nenhuma maneira. Se você tem alguma dúvida relacionada ao estudo neste momento ou

no decorrer da investigação, você poderá contactar Dra Mariane M. A. Stefani, IPTSP que estará disponível

para esclarecer suas dúvidas. O material biológico será encaminhado e testado no Laboratório de Imunologia

da AIDS e da Hanseníase, IPTSP-UFG. Caso exista sobra deste material doado, lhe pedimos permissão para

armazenar essa sobra em nosso laboratório sob condições de refrigeração (-80oC) para utilização em estudos

futuros. Caso isso ocorra, você será contactado para esclarecimento sobre este novo estudo e para pedir sua

permissão para utilização do material. Você também pode assinar que dispensa este contato, autorizando

assim a utilização automática do material excedente num estudo futuro. Assinale abaixo sim, se você quer

U F G

128

ser contactado antes de permitir o uso das amostras ou não, caso prefira autorizar a utilização futura: Sim,

quero ser contactado antes da utilização. Não, dispenso o contato. Ressaltamos que em caso de utilização

de sobras de materiais em estudos futuros, o projeto será resubmetido para análise por um Comitê de Ética.

PARTICIPAÇÃO

Sua participação é voluntária, e você pode se recusar no momento da coleta de sangue ou retirar o

seu consentimento a qualquer tempo, sem nenhum tipo de prejuízo na realização de qualquer dos exames

de rotina, no tratamento, nem nas consultas médicas.

Riscos e benefícios: Existe um desconforto e risco mínimo para você que se submeter a coleta de material

para esta pesquisa, sendo que se justifica pelos benefícios que este exame lhe proporcionará. Se você aceitar

participar da pesquisa estará exposto a riscos inerentes a coleta de sangue e ao procedimento para realização

da biópsia. É possível que se forme um hematoma (acúmulo de sangue) no local da coleta do sangue e no

que diz respeito a realização da biópsia, você estará exposto a riscos de infecção, formação de quelóide

caso você seja predisposto e reações alérgicas ao anestésico local. A realização de exames complementares

tais como histopatológico e sorologia anti PGL-I te beneficiará no âmbito da possibilidade de realização de

um diagnóstico mais preciso e conclusivo pelo médico, o qual poderá correlacionar os achados clínicos e

laboratoriais.

Forma de acompanhamento e assistência: Em relação a coleta sanguínea, nossos coletadores são

treinados para realizarem o procedimento com segurança e usarão material descartável. Em caso de ocorrer

algum prejuízo a você decorrente da coleta venosa como, por exemplo, hematomas, você será acompanhado

e, caso necessário, receberá assistência médica adequada. O procedimento de coleta da biópsia será

executado em uma sala destinada apenas para realização deste procedimento e por profissionais médicos

qualificados e aptos para tal. Caso alguma intercorrência ocorra, como infecções, formação de quelóide ou

reações alérgicas ao anestésico local, você receberá toda a assistência médica e terapêutica necessária.

CONFIDENCIALIDADE

Os pesquisadores irão tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo.Todos os resultados

da pesquisa serão confidenciais, somente usados pelos pesquisadores para fins científicos. Nenhum nome ou

resultado individual será divulgado, permanecendo, portanto em sigilo. O paciente terá acesso aos resultados

do exame clínico e dos exames laboratoriais a qualquer tempo. Benefícios: a pesquisa pretende contribuir

para identificar novos reagentes que possam ser usados em novos testes laboratoriais para o diagnóstico da

infecção/doença hanseníase. A análise comparativa entre os dados clínicos e laboratoriais poderão resultar

numa melhoria de qualidade no diagnóstico dos pacientes portadores de hanseníase.

CUSTO DA PARTICIPAÇÃO, RESSARCIMENTO E INDENIZAÇÃO POR EVENTUAIS

DANOS

A sua participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponibilizada nenhuma

compensação financeira adicional, e caso existam gastos estes serão pagos pelo orçamento da pesquisa. No

129

caso de você sofrer algum dano, será guardado o direito de indenização legal por danos comprovadamente

decorrentes da pesquisa.

CONSENTIMENTO

Eu li as informações/ As informações do estudo foram lidas para mim e eu fui informado sobre este

estudo, estou ciente que minha participação no estudo é voluntária e pode ser interrompida a qualquer

momento. Em caso de desistência, isto não implicará em nenhuma penalidade ou prejuízo de atendimento

meu em qualquer centro de saúde ou hospital. Além disto, permito que eu seja fotografado para registro dos

sinais e sintomas clínicos, para posterior arquivo no laboratório de pesquisa. Estou também de acordo com

a possível publicação dos resultados dessa pesquisa em forma de resumos e/ou artigos científicos em revistas.

Informo que aceito participar do estudo.

___________________________________ _________________________________

Assinatura do participante/impressão digital Assinatura do pai, mãe ou responsável legal

__________________________________ Data:-------/--------/--------

Assinatura do entrevistador

130

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – Pacientes com outras dermatoses

Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, em uma investigação sobre testes

diagnósticos para detectar infecção pela bactéria que causa a hanseníase que se chama Mycobacterium

leprae. Você será esclarecido(a) sobre as etapas da investigação a seguir. Caso você aceite participar da

investigação, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do

pesquisador responsável. Em caso de recusa você não terá nenhum prejuízo de qualquer forma.

INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA

Título do Projeto: Pesquisa de biomarcadores aplicada ao desenvolvimento de testes para o diagnóstico e

prognóstico da hanseníase.

Instituição: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás.

Pesquisador Responsável: Dra Mariane Martins de Araújo Stefani, IPTSP (fone: 3209.6111) que estará

disponível para esclarecer suas dúvidas. Duração do estudo: três anos.

Você também poderá contactar o Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital das Clínicas para

maiores esclarecimentos sobre seus direitos. Telefone Comitê de Ética: (62)-3269-8338 ou 3269-8426.

DESCRIÇÃO DA PESQUISA

Até o momento, não existe nenhum teste laboratorial ideal para o diagnóstico precoce da Hanseníase.

Os testes atualmente disponíveis ou apresentam pouca sensibilidade ou são muito sofisticados e caros para

o uso na rotina. Neste sentido, pesquisas, como esta, estão sendo desenvolvidas visando a descoberta de

novos reagentes/testes que possam ser aplicados para o diagnóstico da infecção recente / hanseníase. Você

está sendo convidado a participar deste estudo porque é muito importante testarmos o novo reagente/teste

em pessoas que apresentam outras dermatoses que possuem semelhança com a hanseníase, como é o seu

caso.

PROCEDIMENTO DA PESQUISA

Para todos os participantes faremos uma única coleta de sangue (10 ml) usando seringa e agulha estéreis

descartáveis. As amostras de sangue serão identificadas por códigos. Tudo que soubermos sobre você através

do estudo (exame clínico, resultados de exames laboratoriais) será confidencial, e você será informado dos

resultados de seus exames. Se publicarmos os resultados do estudo em revista científica ou livro, você não

será identificado de nenhuma maneira. Se você tem alguma dúvida relacionada ao estudo neste momento ou

no decorrer da investigação, você poderá contactar Dra Mariane M. A. Stefani, IPTSP que estará disponível

para esclarecer suas dúvidas. O material biológico será encaminhado e testado no Laboratório de Imunologia

da AIDS e da Hanseníase, IPTSP-UFG. Caso exista sobra deste material doado, lhe pedimos permissão para

armazenar essa sobra em nosso laboratório sob condições de refrigeração (-80oC) para utilização em estudos

futuros. Caso isso ocorra, você será contactado para esclarecimento sobre este novo estudo e para pedir sua

permissão para utilização do material. Você também pode assinar que dispensa este contato, autorizando

U F G

131

assim a utilização automática do material excedente num estudo futuro. Assinale abaixo sim, se você quer

ser contactado antes de permitir o uso das amostras ou não, caso prefira autorizar a utilização futura: Sim,

quero ser contactado antes da utilização. Não, dispenso o contato. Ressaltamos que em caso de utilização

de sobras de materiais em estudos futuros, o projeto será resubmetido para análise por um Comitê de Ética.

PARTICIPAÇÃO

Sua participação é voluntária, e você pode se recusar no momento da coleta de sangue ou retirar o

seu consentimento a qualquer tempo, sem nenhum tipo de prejuízo na realização de qualquer dos exames

de rotina, no tratamento, nem nas consultas médicas.

Riscos e benefícios: Existe um desconforto e risco mínimo para você que se submeter a coleta de material

para esta pesquisa, sendo que se justifica pelos benefícios que este exame lhe proporcionará. Se você aceitar

participar da pesquisa estará exposto a riscos inerentes a coleta de sangue e ao procedimento para realização

da biópsia. É possível que se forme um hematoma (acúmulo de sangue) no local da coleta do sangue e no

que diz respeito a realização da biópsia, você estará exposto a riscos de infecção, formação de quelóide

caso você seja predisposto e reações alérgicas ao anestésico local. A realização de exames complementares

tais como histopatológico e sorologia anti PGL-I te beneficiará no âmbito da possibilidade de realização de

um diagnóstico mais preciso e conclusivo pelo médico, o qual poderá correlacionar os achados clínicos e

laboratoriais.

Forma de acompanhamento e assistência: Em relação a coleta sanguínea, nossos coletadores são

treinados para realizarem o procedimento com segurança e usarão material descartável. Em caso de ocorrer

algum prejuízo a você decorrente da coleta venosa como, por exemplo, hematomas, você será acompanhado

e, caso necessário, receberá assistência médica adequada. O procedimento de coleta da biópsia será

executado em uma sala destinada apenas para realização deste procedimento e por profissionais médicos

qualificados e aptos para tal. Caso alguma intercorrência ocorra, como infecções, formação de quelóide ou

reações alérgicas ao anestésico local, você receberá toda a assistência médica e terapêutica necessária.

CONFIDENCIALIDADE

Os pesquisadores irão tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo.Todos os resultados

da pesquisa serão confidenciais, somente usados pelos pesquisadores para fins científicos. Nenhum nome ou

resultado individual será divulgado, permanecendo, portanto em sigilo. O paciente terá acesso aos resultados

do exame clínico e dos exames laboratoriais a qualquer tempo. Benefícios: a pesquisa pretende contribuir

para identificar novos reagentes que possam ser usados em novos testes laboratoriais para o diagnóstico da

infecção/doença hanseníase. A análise comparativa entre os dados clínicos e laboratoriais poderão resultar

numa melhoria de qualidade no diagnóstico dos pacientes portadores de hanseníase.

CUSTO DA PARTICIPAÇÃO, RESSARCIMENTO E INDENIZAÇÃO POR EVENTUAIS

DANOS

132

A sua participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponibilizada nenhuma

compensação financeira adicional, e caso existam gastos estes serão pagos pelo orçamento da pesquisa. No

caso de você sofrer algum dano, será guardado o direito de indenização legal por danos comprovadamente

decorrentes da pesquisa.

CONSENTIMENTO

Eu li as informações/ As informações do estudo foram lidas para mim e eu fui informado sobre este

estudo, estou ciente que minha participação no estudo é voluntária e pode ser interrompida a qualquer

momento. Em caso de desistência, isto não implicará em nenhuma penalidade ou prejuízo de atendimento

meu em qualquer centro de saúde ou hospital. Além disto, permito que eu seja fotografado para registro dos

sinais e sintomas clínicos, para posterior arquivo no laboratório de pesquisa. Estou também de acordo com

a possível publicação dos resultados dessa pesquisa em forma de resumos e/ou artigos científicos em revistas.

Informo que aceito participar do estudo.

___________________________________ _________________________________

Assinatura do participante/impressão digital Assinatura do pai, mãe ou responsável legal

__________________________________ Data:-------/--------/--------

Assinatura do entrevistador

133

Anexo 3 . Questionários

QUESTIONÁRIO – HANSENÍASE

No DE PROTOCOLO DO PARTICIPANTE: ___ ___ ___ ____

1. IDENTIFICAÇÃO

Nome: __________________________________________________________

Data de nascimento: _____ / _____ / _____

Sexo: MASC ( ) FEM ( )

Endereço: _______________________________________________________

Bairro:___________________________________________________________

Cidade: ____________________ Estado: ____________________

Telefone residência: _____________________________

Telefone celular: ________________________________

Profissão: ______________________________________

Quantas pessoas moram na sua casa ?_________________________

2. ESCOLARIDADE:

____________________________________________________________

3. INTERROGATÓRIO SINTOMATOLÓGICO:

Alguém da família faz ou fez tratamento para hanseníase?___________________________

Há quanto tempo você tem estas lesões e/ou dormências? ___________________________

Conhece alguém que tenha hanseníase?

( ) Não ( ) Sim

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA

Rua Delenda Rezende de Melo s/n Setor Universitário 74 605-050 Goiânia – Goiás Fone

(0XX 62) 3209 6111 FAX (0XX 62) 3202 3066

134

Qual o grau de parentesco com esta pessoa?

_____________________________________________________________________

Presença de cicatriz de vacina BCG ?

( ) Não ( ) Sim

4. EXAME DERMATONEUROLÓGICO:

Nº de lesão(ões):______ + de 10 lesões( )

Tipo da lesão: (1) Mancha (2) Placa (3) Infiltrado (4)Nódulo

Cor: (1) Hipocrômica (2)Eritematosa (3) Hipercrômica

Borda: (1) Bem definida (2) Mal definida

Limites: (1) Regular (2) Irregular

Sensibilidade térmica e dolorosa: (1)

ausente (2) diminuída (3) normal (4)

duvidosa

Localização:

(1) face

(2) região dorsal

(3) região lombar

(4) braço

(5) coxa

(6) pescoço

(7) região torácica

(8) região abdominal

(9) antebraço e mão

(10) perna/pé

(11) região glútea

5: PALPAÇÃO DE NERVOS PERIFÉRICOS

Foi realizada a palpação dos nervos?_____________

Há espessamento de algum nervo?__________Qual?______________________

Qual o grau de incapacidade que o paciente apresenta?

( ) Grau 0

( ) Grau 1

( ) Grau 2

135

6: DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Diagnóstico Sugestivo de MH? __________

Qual forma clínica?

( ) I

( ) TT

( ) BT

( ) BB

( ) BL

( ) LL

( ) Duvidoso

Paciente encontra-se em reação? ________ Qual tipo?_______________

Data do diagnóstico:______________________________

Paciente fez baciloscopia?_______________Resultado (IB):_________________

Foi pedido o exame de baciloscopia?_________________

Data: __ __ / __ __ / __ __

Responsável:________________________________

136

QUESTIONÁRIO – Pacientes tratados para Hanseníase – Pós MDT

No DE PROTOCOLO DO PARTICIPANTE: ___ ___ ___ ____

1. IDENTIFICAÇÃO

Nome: __________________________________________________________

Data de nascimento: _____ / _____ / _____

Sexo: MASC ( ) FEM ( )

Endereço: _______________________________________________________

Bairro:_____________________ Ponto de referência: _________________________

Cidade: ____________________ Estado: ____________________

Telefone residência: _____________________________

Telefone celular: ________________________________

Profissão: ______________________________________

2. ESCOLARIDADE:

____________________________________________________________

3. INTERROGATÓRIO SINTOMATOLÓGICO:

Há quanto tempo você finalizou o tratamento para hanseníase (MDT)?

____________________________________________________________________

Você realizou o tratamento corretamente? Tomou todas as doses nos dias e horários prescritos?

( ) Não ( ) Sim

Você apresentou episódios reacionais antes, durante, ou após o tratamento?

( ) Não ( ) Sim

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA

Rua Delenda Rezende de Melo s/n Setor Universitário 74 605-050 Goiânia – Goiás

Fone (0XX 62) 3209 6111 FAX (0XX 62) 3202 3066

137

Você realizou tratamento para hanseníase durante quanto tempo?

__________________________

Ainda possui alguma mancha/lesão no corpo?

( ) Não ( ) Sim

Quantas lesões e em que região do

corpo?______________________________________________

Conhece alguém que tenha hanseníase?

( ) Não ( ) Sim

Você convive com esta pessoa?

( ) Não ( ) Sim

Presença de cicatriz de vacina BCG?

( ) Não ( ) Sim

Como você considera seu estado de saúde atual em relação a hanseníase?

( ) Considera-se curado

( ) Apresenta dores nas articulações

( ) Apresenta algum grau de incapacidade devido a hanseníase

( ) As manchas/lesões não desapareceram por completo

Outra:

_________________________________________________________________________

Data: __ __ / __ __ / __ __

Responsável:________________________________

138

QUESTIONÁRIO – Pacientes tratados para Hanseníase – Pós MDT – 2ª Coleta

No DE PROTOCOLO DO PARTICIPANTE: ___ ___ ___ ____

1. IDENTIFICAÇÃO

Nome: __________________________________________________________

Data de nascimento: _____ / _____ / _____

Sexo: MASC ( ) FEM ( )

Endereço: _______________________________________________________

Bairro:_____________________ Ponto de referência: _________________________

Cidade: ____________________ Estado: ____________________

Telefone residência: _____________________________

Telefone celular: ________________________________

Profissão: ______________________________________

2. ESCOLARIDADE:

____________________________________________________________

3. INTERROGATÓRIO SINTOMATOLÓGICO:

Há quanto tempo você finalizou o tratamento para hanseníase (MDT)? Há quanto tempo foi a

última coleta de sangue?

_____________________________________________________________________________

Você realizou o tratamento corretamente? Tomou todas as doses nos dias e horários prescritos?

( ) Não ( ) Sim

Você apresentou episódios reacionais após a última coleta de sangue, ou seja, após o

tratamento?

( ) Não ( ) Sim Quantos? __________________________

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA

Rua Delenda Rezende de Melo s/n Setor Universitário 74 605-050 Goiânia – Goiás

Fone (0XX 62) 3209 6111 FAX (0XX 62) 3202 3066

139

Qual foi o tratamento utilizado para reação?

_____________________________________________

Você esteve em alguma consulta médica recentemente? Por qual motivo?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Você realizou algum exame para hanseníase recentemente? Qua(l) (is)? E o resultado?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Ainda possui alguma mancha/lesão com dormência no corpo?

( ) Não ( ) Sim

Quantas lesões e em que região do

corpo?______________________________________________

Conhece alguém que tenha hanseníase?

( ) Não ( ) Sim

Você convive com esta pessoa?

( ) Não ( ) Sim

Presença de cicatriz de vacina BCG?

( ) Não ( ) Sim

Você ainda tem algum sintoma/sinal da doença mesmo após ter finalizado o tratamento e após a

última coleta de sangue?

( ) Não ( ) Sim

Que sinal/sintoma? ____________________________________________________

Data: __ __ / __ __ / __ __

Responsável:________________________________

140

QUESTIONÁRIO – Pacientes com dermatoses

No DE PROTOCOLO DO PARTICIPANTE: ___ ___ ___ ____

1. IDENTIFICAÇÃO

Nome: __________________________________________________________

Data de nascimento: _____ / _____ / _____

Sexo: MASC ( ) FEM ( )

Endereço: _______________________________________________________

Bairro:_____________________ Ponto de referência: _________________________

Cidade: ____________________ Estado: ____________________

Telefone residência: _____________________________

Telefone celular: ________________________________

Profissão:______________________________________

2. ESCOLARIDADE:

____________________________________________________________

3. INTERROGATÓRIO SINTOMATOLÓGICO:

Possui alguma mancha/lesão no corpo?

( ) Não ( ) Sim

O que você sente na região da mancha/lesão?

( ) Dormência

( ) Coceira/Prurido

( ) Dor

( ) Outro sintoma? Qual? ________________________________________________________

Há quanto tempo você possui estas lesões?__________________________________

Já utilizou algum medicamento para tratamento destas lesões?

( ) Não ( ) Sim

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INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA

Rua Delenda Rezende de Melo s/n Setor Universitário 74 605-050 Goiânia – Goiás

Fone (0XX 62) 3209 6111 FAX (0XX 62) 3202 3066

141

Conhece alguém que tenha hanseníase?

( ) Não ( ) Sim

Qual o grau de proximidade com esta pessoa?________________________________________

Alguém da família faz ou fez tratamento para hanseníase?

( ) Não ( ) Sim ( ) Não sabe

Possui alguma alergia?

( ) Não ( ) Sim A que? _____________________________________________________

4. EXAME DERMATONEUROLÓGICO:

No de lesões:____________

Tipo da lesão:

____________________________________________________________________________

Cor: ( ) Hipocrômica ( ) Eritematosa ( ) Hipercrômica ( ) Não há coloração

específica

Sensibilidade: ( ) Normal ( ) Diminuída ( ) Ausente ( ) Duvidosa

Localização:

( ) Face

( ) Região lombar

( ) Região dorsal

( ) Braço

( ) Coxa

( ) Pescoço

( ) Região torácica

( ) Região abdominal

( ) Antebraço e mão

( ) Perna/pé

( ) Região glútea

Possui algum grau de incapacidade?

( ) Não ( )Sim Qual? ____________________________________________

Diagnóstico sugestivo de: _______________________________________________

Data: __ __ / __ __ / __ __

Responsável: __________________________