UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

TATIANA MARLENE GALVEZ SANCHEZ

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DAS PROTEINAS DE

FUSÃO CMX E ECMX NO TESTE DE MANTOUX PARA O

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE.

Goiânia

2017

i

TATIANA MARLENE GALVEZ SANCHEZ

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DAS PROTEINAS DE

FUSÃO CMX E ECMX NO TESTE DE MANTOUX PARA O

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública.

Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis

Goiânia

2017

ii

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno (a): Tatiana Marlene Galvez Sánchez

Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis

Membros:

1. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis

2. Dra. Menira Borges de Lima Dias e Souza

3. Dra. Samira Bührer-Sékula

Bolsista da Organização dos Estados Americanos (OEA)

Data: 20/03/2017

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, quem o tempo todo me deu o que eu precisava no tempo certo, e quem

neste tempo longe de casa me aprimorou em relação à fé, amor e paciência. Sei que o

pai e o filho Jesus Cristo vivem, e estiveram do meu lado me aperfeiçoando com amor.

À minha família, por ter me dado apoio em todas minhas escolhas e pela

confiança que sempre tiveram em mim. Marlene, minha mãe, como a pessoa que mais

me conhece, conseguiu me acalmar e dar forças, mesmo e não sabendo exatamente

minhas dificuldades. Lembrei muitas vezes do seu sorriso e bom ânimo, lembrei muito

dos conselhos e da sua frase “dê tempo ao tempo”, e que mente e coração para as

pessoas que sonhamos demais têm que manter seu equilíbrio. Wilson, meu pai, que

mesmo na ausência dele, sinto até hoje os grandes ensinamentos de amor, fortaleza e

coragem que demonstrou durante a vida. O orgulho e confiança que ele sentia por mim

não me fez desistir. Gherson, meu irmãozinho de convívio, às vezes, era tão complicado

nos suportarmos, mas é tanto amor envolvido entre a gente (risos) que senti muita

saudade dele estar por perto para fazer as coisas mais simples. O tempo passou por nós

e posso ver como você amadureceu na minha ausência. Gianfranco e Genesis, também

meus irmãozinhos, saibam que são um presente para mim, pensar em vocês me faz ser

um melhor exemplo de irmã maior (mais velha).

A toda minha família, tios, primos e sobrinhos, são muito importantes para mim,

e agradeço a todos pelos bons desejos, sei que de longe eles torciam por mim.

Especialmente as minhas vovozinhas, Lola e Olga, elas sempre me faziam saber que

oravam por mim, tanta saudade de escutar suas histórias e ver o quão sábias vocês são,

aprendi muito mais a valorizá-las. Também aos meus amigos, que são quase parte da

minha família, adoro saber que tenho um espaço para que eu possa expressar a minha

simplicidade. Obrigada ao Brato, Círculo e Tikis; se já cresci eu sei, mas ainda cada

letra do nome desses grupos significa alguém muito importante para mim.

À minha orientadora Ana Paula, uma pessoa que respeito e admiro como ser

humano e profissional, saiba que você é um exemplo para mim e que sou muito grata

por tê-la como orientadora. A oportunidade de trabalhar no grupo me ensinou princípios

e valores que com certeza são necessários para tudo na vida. Aquele estresse gostoso e

viradas de noites tentando fazer o melhor possível para surpreendê-la sem sucesso

foram ótimos (risos). Levo-me a sensação de sempre querer ir por mais.

iv

Ao Professor André Kipnis, uma pessoa que também admiro demais, sempre

pronto para ajudar. Obrigada pelo apoio desde que cheguei ao laboratório, pela

paciência e pelas dicas microbiológicas que me sentia à vontade de consultar. As coisas

complexas conseguiam ser muito simples.

Aos meus colegas do laboratório, cada um foi essencial na minha sobrevivência

em equilíbrio aqui. Adeliane, muito obrigada por me acolher e me ensinar muitas coisas

tanto na vida pessoal como profissional. Cresci muito no convívio ao seu lado, o mesmo

temperamento, ou explode ou se junta, quase explodi (risos), mas terminamos juntando

a fórmula, gosto da senhorita e saiba que sua amizade é muito valiosa para mim. Bruno,

algumas vezes falei que você é como meu irmãozinho brasileiro, e é assim mesmo.

Você me acolheu com muito carinho desde o início até sem falar a mesma língua,

puxou-me nos momentos de desânimo e era aquela cumplicidade nos momentos de

vamos sorrir, porque se o mundo vai acabar, pois que acabe mesmo (risos). Danilo, eu

conheci você um pouco depois e sempre consegue tirar um sorriso de mim, você é meu

exemplo de paciência e calma antes de eu conhecer que existia a caixinha do rancor

(risos). Eni, pessoa que gosto demais, até deu aula de Português para mim, sua

simplicidade e humildade para ver as coisas são qualidades que levo sempre presentes,

obrigada por tudo e sucesso sempre, mulher. Fábio, obrigada por me ensinar mais do

perfeccionismo e do saber escutar, sei que adora meu Espanhol e gostaria de falar a

minha língua (risos). Lázaro, foi muito bom sentir-me à vontade de perguntar qualquer

coisa até da “inmortalidad de um cangrejo” se essa era minha dúvida. Obrigada pelas

intermináveis dicas de tudo, de política, filmes, ciência e comidas, é claro, sobretudo

gordicies (aquelas épocas em que eu ia atrás de tudo que poderia ser comido, risos).

Moninha, você é uma alma muito nobre, até quando fica brava, está pronta para ajudar e

compartilhar suas experiências de laboratório e de vida, obrigada pelos abraços e as

caretas de luz que me deram conforto nos momentos difíceis. Rayanni, minha pequena

representante do imenso ânimo, obrigada por tudo, você é muito prestativa e carinhosa,

você consegue me transmitir muita coisa boa, menina. Rogério, você ganhou meu

carinho aos poucos, obrigada por me escutar tanto e não pensar ou fingir que já

enlouqueci. Obrigada por matar minhas curiosidades microbiológicas e pelo ânimo em

cada escolha. Obrigada aos pequenos do laboratório (de carinho); Aline, Estefani,

Frederick, Ítalo, Micaela, Stella, Thaís, Vanessa e Vitor; vocês são o grande motivo para

os mais velhos continuarem, desculpem por não dar o tempo que vocês precisam.

Também houve pessoas que nos visitaram, Anisa, Sofia, Matias e Kenyi, foi muito bom

v

ter vocês um tempo conosco, cada um com uma cultura diferente nos obrigando a falar

inglês ou espanhol (sim). Todos foram muito importantes para meu aprendizado de

conhecimentos e convivência, tudo ajudou muito a me conhecer e melhorar meu caráter,

levarei cada um de vocês no meu coração.

Professora Samira, foi um prazer ter trabalhado como parte de sua equipe. Sou

muito grata pela oportunidade e confiança, a qual me ajudou muito a confiar mais em

mim. Algo que levo presente é o ato de sonhar e trabalhar por aquilo, mesmo que

tenhamos que começar novamente. Obrigada Prof. Marcelo Mendonça, as discussões e

as dicas ótimas de como solucionar problemas nos experimentos me motivaram muito.

João Pedro, Dienny e Ernandez, obrigada por me acolher e me fazer sentir em casa

durante esse tempo de trabalho, vocês são ótimos.

Tenho gratidão pelos colegas, que desde o Perú me apoiaram. Segundo, meu

professor e amigo, que sempre está ao meu lado me motivando a crescer e amar a

pesquisa, aquele jeito de ser feliz e relaxado com milhões de coisas para fazer me dá um

tanto de esperança (risos). Junto ao Antonio, que não me deixaram desistir e voltar ao

Peru antes de acabar o mestrado. Obrigada Claudia, Silver, Lourdes, por ser meu porto

seguro de empolgados pela pesquisa; ter vocês por perto me dá ânimos para continuar.

Aos meus colegas bolsistas com os quais compartilhei as primeiras experiências

de experimentar o primeiro RU, as palavras constrangedoras em Espanhol mal faladas

em Português e as risadas do que acontecia frequentemente, como passear demais ao

pegar o ônibus errado (risos). Muitos deles eram parte da minha aula de Português para

estrangeiros, foi uma troca cultural excelente. Muito obrigada Andrés, Francisco, Juan

Carlos, Leda, Oscar e Stefan.

A todas as pessoas que fora do laboratório me apoiaram aqui no Brasil. Lucio,

meu amigo cultural, obrigada por me receber em Goiânia e por todo o apoio até me

acostumar a caminhar por mim mesma. Graças a ele conheci os mexicanos: Fernanda e

Marujos. Fernanda, você foi minha pessoa aqui, só Deus para colocar você no meu

caminho, não pude ter melhor companhia, sua alegria, ânimos e consolo me mantiveram

enquanto ia me acostumando com a minha nova vida. Quando meus amigos mexicanos

voltaram para casa, tive a sorte de encontrar a Karen. Karen, nossas diferenças na forma

de viver nos acrescentaram muito como pessoas. Você é um ser-humaninho lindo que

quer ajudar ao mundo todo, obrigada por me ensinar a perceber mais o que acontece ao

nosso redor, a amar, a não ter pré-conceitos, a ter uma vez mais paciência e a sorrir

igual retardada (risos), adoro você e sua família. Novamente, separação e começo. Adel

vi

e Grazi, obrigada por me acolher na casa de vocês. Grazi, obrigada pelas correções do

meu portunhol. Seu bom espírito e jeito alegre de ver a vida foi contagiante, obrigada

pelas conversas nada a ver (risos), horas de seriados e karaokê, comidinhas e árduas

sessões de corrida. Só tenho uma coisa a te dizer: “Igual” (Com carinho, o gato de botas

(risos)).

E é claro, também conheci mais pessoas importantes nesse caminho. Muito

obrigada Gustavo, você ajudou muito no meu crescimento fazendo de mim uma melhor

pessoa. À família do Gustavo, que me fizeram sentir em casa o tempo todo, obrigada

pelo carinho, especialmente a tia Idoninha e Deniza. À família Bringel, que me acolheu

muitas vezes como parte da sua família. Outros amigos que Deus me deu a graça de

conhecer, obrigada Bruna, Dayanne, Edvaldo, Guido, Ingrid, Kênia, León, Myke, Sara,

Renata, Simone e Wilton.

À família Palhacia, que me deu um lugarzinho no grupo para fazer algo que sempre

sonhei em fazer, palhaçadas (risos). Tenho muito a agradecer a cada um de vocês, com

quem consegui conhecer esse mundo lindo de ser uma palhaça, onde nossa essência se

mistura com a inocência das crianças em algo que só dá para sentir e não explicar.

Aos professores do IPTSP, cada um de vocês é um exemplo para mim, admiro o

fato de vocês ensinarem e fazer pesquisa, espero ter resgatado o melhor de cada um de

vocês.

A cada componente da minha banca de qualificação. Obrigada Prof. Samira,

Simone e Mara, por dar-se o tempo de revisar meu trabalho. Cada aporte de vocês foi

muito valioso para melhorá-lo. E à minha banca de defesa, Prof. Samira, Menira,

Juliana e Mara; obrigada por ter aceitado o convite de participação, com certeza vão

acrescentar além do mais nesse trabalho.

Ao corpo técnico e administrativo do IPTSP, eles me apoiaram como parte das

suas responsabilidades e com um sorriso gigante que melhorou muito de meus dias.

Muitíssimo obrigada pelos seus atos de gentileza o tempo todo.

À Universidad Nacional Mayor de San Marcos, que me deu a formação base de

“Tecnólogo Médico” no meu país. Além disso, agradeço também à Universidade

Federal de Goiás, que deu continuidade à minha formação. À Organização dos Estados

Americanos (OEA), que mediante o Grupo Coimbra de Universidades Brasileiras

(GCUB), deram-me a oportunidade, assim como a milhares de estudantes dos países

membros de fazer um programa de pós-graduação de relevância social.

vii

SUMÁRIO

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ............................................................................... ix

SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................. xii

RESUMO ....................................................................................................................... xv

ABSTRACT ................................................................................................................. xvi

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ....................................................... 1

1.1 Epidemiologia .......................................................................................................... 1

1.2 Tuberculose humana ................................................................................................ 2

1.2.1 Resposta imune ................................................................................................. 3

1.3 Diagnóstico de TB ................................................................................................... 8

1.3.1 Microscopia ..................................................................................................... 10

1.3.2 Cultura ............................................................................................................. 11

1.3.3 Ensaio XPERT MTB/RIF® (CEPHEID, USA) ............................................. 12

1.3.4 Ensaio de fluxo lateral para lipoarabinomanana (LF-LAM)........................... 12

1.3.5 Ensaio de liberação de interferon-gamma (IGRA) ......................................... 13

1.3.6 Prova tuberculínica ......................................................................................... 14

1.4 Tuberculose murina ............................................................................................... 18

1.4.1 Avaliação da reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em modelo

murino ...................................................................................................................... 20

1.5 Desenvolvimento de testes cutâneos para o diagnóstico de TB ........................... 21

1.6 Proteínas de fusão rCMX e rECMX ..................................................................... 23

2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 27

3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 29

3.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 29

3.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 29

4 METODOLOGIA ......................................................................................................... 30

viii

4.1 Delineamento do estudo ........................................................................................ 30

4.2 Produção de proteínas rCMX e rECMX ............................................................... 31

4.3 Animais utilizados ................................................................................................ 34

4.4 Infecção experimental ........................................................................................... 34

4.5 Avaliação da resposta imune celular específica anti-rCMX e anti-rECMX em

células de baço, pulmões e linfonodos drenantes de camundongos infectados com

Mtb ............................................................................................................................. 34

4.6 Citometria de fluxo ............................................................................................... 35

4.7 Prova da infecção com Mycobacterium Tuberculosis H37RV ............................. 36

4.8 Teste cutâneo pela Técnica de Mantoux ............................................................... 36

4.9 Análise estatística .................................................................................................. 37

5 RESULTADOS ........................................................................................................... 38

5.1 Resposta imune celular anti-rCMX e anti-rECMX em células do baço, pulmões e

linfonodos drenantes de camundongos infectados com Mtb ...................................... 38

5.2 Reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos infectados

com Mtb ...................................................................................................................... 47

6 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 51

7 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 55

REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 56

ANEXOS ........................................................................................................................ 68

ix

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 - Sensibilidade e especificidade de diferentes testes de diagnóstico para

Tuberculose, a partir de revisões sistemáticas usando casos de TB pulmonar

confirmados por cultura como teste de referência ............................................................. 9

Quadro 2 - Causas dos resultados falsos negativos da prova tuberculínica .................. 17

Tabela 1 - Valores da média para cada resposta imune celular específica no baço,

pulmões e linfonodos drenantes (LNDs) de camundongos infectados com Mtb ........... 39

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação do desenvolvimento do granuloma na Tuberculose humana.. 3

Figura 2 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB ativa .............................. 8

Figura 3 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB latente em indivíduos de

grupos de risco .................................................................................................................. 9

Figura 4 - Resposta de hipersensibilidade do tipo tardia em humanos ......................... 16

Figura 5 - Delineamento do estudo ............................................................................... 30

Figura 6 - Esquema de purificação de proteínas mediante cromatografia de afinidade 33

Figura 7 - Gel SDS-PAGE das proteínas rCMX e rECMX .......................................... 33

Figura 8A - Estratégia de separação de populações celulares do baço de camundongos

infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv ..................................................... 40

Figura 8B - Estratégia de separação de populações celulares dos pulmões de

camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv ............................. 41

Figura 8C - Estratégia de separação de populações celulares dos linfonodos drenantes

de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis H37R ........................... 42

Figura 9 - Resposta imune celular induzida no baço após 45 dias da infecção com Mtb

em camundongos BALB/c .............................................................................................. 44

Figura 10 - Resposta imune celular induzida nos pulmões, após 45 dias da infecção

com Mtb em camundongos BALB/c .............................................................................. 45

Figura 11 - Resposta imune celular induzida nos linfonodos drenantes após 45 dias da

infecção com Mtb em camundongos BALB/c ............................................................... 46

Figura 12 - Leitura da espessura do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados

com Mtb H37Rv após o teste cutâneo ............................................................................ 47

Figura 13 - Leitura do inchaço do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados

com Mtb H37Rv após o teste cutâneo ............................................................................ 48

Figura 14 - Leituras de Δ Espessura (14A) e Δ Inchaço (14B) ao longo do tempo ...... 49

Figura 15 - Observação macroscópica do baço e carga bacilar nos pulmões de

camundongos infectados com Mtb ................................................................................. 50

xi

LISTA DE ANEXOS

Anexo I – Parecer do Comitê de Ética

Anexo II – Comprovante de submissão do artigo

xii

SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

Ag Antígeno

APC Célula apresentadora de antígeno

BAAR Bacilo ácido-álcool resistente

BCG Bacillus Calmette-Guérin

CLR Receptor de lectina tipo C (do inglês: “C type lectin receptor”)

ConA Concavalina A

DCs Células dendríticas

DTH Hipersensibilidade do tipo tardia

Fcγ Receptor Fcγ

FSC Tamanho (do inglês: “Forward scatter”)

γδ Células gamma-delta

HIV Vírus de imunodeficiência humana

IFN-γ Interferon-gamma

IGRA Ensaio de liberação de Interferon-gamma (do inglês: “Interferon gamma

release assay”)

IL-1α Interleucina-1α

IL-1β Interleucina-1β

IL-6 Interleucina-6

IL-12 Interleucina-12

IL-17 Interleucina-17

IL-23 Interleucina-23

IPTG Isopropiltiogalactosídeo (do inglês: “Isopropyl-beta-D-

thiogaloctopyranoside”)

IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

xiii

KO Nocaute (Do inglês: “Knock out”)

kDa Quilodalton

LF-LAM Do inglês: “Lateral flow urine lipoarabinomannan assay”

MAIT Células T invariantes associadas à mucosa

MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos 1 (do inglês: “Monocyte

Chemoattractant Protein-1”)

MHC Molécula de histocompatibilidade

MMR Receptor de manose do macrófago (do inglês: “Macrophage mannose

receptor”)

MNT Micobactérias não causadoras de Tuberculose

Mɸs Macrófagos

Mtb Mycobacterium tuberculosis

NK Célula exterminadora natural (do inglês: “natural killer”)

NO Óxido nítrico

NOS-2 Óxido nítrico sintase

LAM Lipoarabinomanana

LB Luria-Bertani

LNDs Linfonodos drenantes

LNMDs Linfonodos drenantes mediastinais

LPS Lipopolissacarídeo

LT Linfócito

OMS Organização Mundial da Saúde

OADC Ácido oleico albumina dextrose catalase

PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos (do inglês: “Pathogen-

associated molecular patterns”)

PBMC Células mononucleares do sangue periférico (do inglês: “Peripheral

blood mononuclear cells”)

xiv

PBS Tampão fosfato salina

PCR Reação em cadeia da polimerase

PDIM Ftiocerol dimicoserato (do inglês: “Pthiocerol dimycocerosate”)

PGL Glicolipídeo fenólico

PPD Derivado proteico purificado (do inglês: “Purified protein derivative”)

PRRs Receptores de reconhecimento padrão (do inglês: “Pattern recognition

receptors”)

PT Prova tuberculínica

RNI Radicais intermediários do nitrogênio

SBCAL Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

SSC Granulosidade (do inglês: “side scatter”)

TB Tuberculose

TGF-β Fator de crescimento transformador beta

Th Célula T auxiliar ou helper

Th1 Célula T auxiliar subtipo 1

Th17 Célula T auxiliar subtipo 17

TLRs Receptores semelhantes à Toll (do inglês: “Toll like receptors”)

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

Treg T reguladora

UFC Unidades formadoras de colônias

UFG Universidade Federal de Goiás

VCAM-1 Molécula de adesão intercelular-1 (do inglês: “Vascular cell adhesion

molecule 1”)

WT Camundongos com genótipo original (do inglês: “Wild type”)

xv

RESUMO

A prova tuberculínica (PT) é um teste cutâneo que identifica a exposição prévia ao M.

tuberculosis (Mtb), mediante a inoculação via intradérmica do derivado protéico

purificado (PPD) de Mtb, o que resulta em uma reação de hipersensibilidade do tipo

tardia (DTH). O ensaio de liberação de IFN-γ (IGRA) foi indicado para substituir a PT.

O IGRA usa os antígenos ausentes na BCG e algumas micobactérias não causadoras de

TB (MNT), ESAT-6 e CFP-10. Porém, apresenta falta de reprodutibilidade e alto custo

quando usado em populações endêmicas para TB. Diante disso, o desenvolvimento de

novos testes de diagnóstico é necessário. Nosso grupo desenvolveu proteínas de fusão

que são reconhecidas por linfócitos gerados pela infecção com Mtb. Assim, o trabalho

propõe avaliar a utilização das proteínas rCMX e rECMX no desenvolvimento de um

teste cutâneo de diagnóstico para tuberculose. Camundongos BALB/c foram infectados

com Mtb H37Rv. Após 45 dias, a infecção induziu linfócitos T CD4+ e CD8+ produtores

de IFN-γ específicos para rCMX e rECMX no baço, pulmões e linfonodos drenantes.

Enquanto ao teste cutâneo realizado 45 dias após a infecção, a leitura de

espessura/inchaço ≥ PPD 2UT (controle positivo) indicou uma reação de DTH positiva.

Avaliando a espessura 24h após o inóculo, rCMX 25µg (0.37±0.02) e rECMX 15-25µg

(0.38±0.03/0,62±0,12) induziram reação de DTH positiva. As 48h, rCMX 25µg

(0.28±0.03) e rECMX 25µg (0.5±0.04) também apresentaram reação positiva. Enquanto

o inchaço as 24h, só a rECMX apresentou DTH positiva. Em conclusão, este trabalho

mostra que as proteínas rCMX e rECMX são reconhecidas pela resposta celular de

camundongos infectados com Mtb, e quando usadas no teste cutâneo induziram reação

de DTH positiva comparável e até superior ao PPD convencional. Dessa forma, é

recomendada a avaliação das proteínas de fusão em outros modelos animais e

posteriormente em humanos.

Palavras-chave: Tuberculose (TB), Prova tuberculínica (PT), Hipersensibilidade do

tipo tardia (DTH).

xvi

ABSTRACT

Tuberculin skin test (TST) identifies a previous exposed to M. tuberculosis (Mtb) using

an intradermal inoculation of purified protein derivates (PPD) that result in a delayed

hypersensitivity reaction (DTH). Interferon-gamma release assay (IGRA) was suggested

to replace TST. The IGRA uses antigens, ESAT-6 and CFP-10, absent in all BCG

strains and some non tuberculous mycobacteria (NTM). However, reproducibility and

high cost were limitations for endemic countries. For this reason, the development of

new diagnose test for latent TB is necessary. Fusion proteins developed by our group

has been recognized by the immune response generated by the infection with

Mycobacterium tuberculosis. Thus the aim of this work was to evaluate the capacity of

CMX or ECMX to be used in a Skin test for tuberculosis. BALB/c mice infected with

Mtb were euthanized forty-five days after infection. Spleens, lungs and draining lymph

nodes of infected mice were processed and evaluated by flow cytometry Both CD4 and

CD8 IFN+ cells were able to recognize rCMX and rECMX. The skin test followed an

evaluation of thickness/swelling ≥ PPD 2UT (positive control) to consider positive

DTH. Based on thickness, at 24 h, rCMX 25µg (0.37±0.02) and rECMX 15-25µg

(0.38±0.03/0,62±0,12) induced a positive DTH response. At 48h, rCMX 25µg

(0.28±0.03) and rECMX 25µg (0.5±0.04) induced also a positive DTH reaction. In

conclusion, fusion proteins rCMX and rECMX are recognized by infected mice with

Mtb and skin test using rECMX 25µg induced better DTH response that of conventional

PPD.

Keywords: Tuberculosis (TB), tuberculin skin test (TST), delayed hypersensitivity

reaction (DTH).

1

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Aspectos gerais da tuberculose

Diferentes doenças têm surgido como resultado da evolução do homem, sendo

erradicadas, controladas ou ainda se mantendo como um problema de saúde global.

Este é o caso da Tuberculose (TB), que em 2015, registrou 10,4 milhões de casos

novos no mundo, sendo destes 56% homens, 34% mulheres e 10% crianças;

provocando 1,4 milhões de mortes (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016).

Estima-se que 11% do total de casos novos são HIV positivos, um indicador

epidemiológico importante, porque a infecção por esse vírus aumenta em 80 a 100

vezes a probabilidade de reativar uma infecção latente de TB (PARSONS et al., 2011;

WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016).

A nova estratégia da Organização Mundial da Saúde “END TB”, estabelecida

para o período 2016-2035, tem como meta reduzir as mortes por TB em até 95% e a

incidência em até 90%. Assim, o processo de controle da infecção pode incluir desde a

prevenção, diagnóstico, e o tratamento da doença. Na Região das Américas em 2015,

foram notificados 230 519 casos, sendo 85% de TB pulmonar, dos quais apenas 77%

de casos foram confirmados bacteriologicamente. Além do mais, na Região das

Américas, quando os pacientes são tratados, o 77% exibe sucesso no tratamento em

HIV negativos, uma porcentagem menor em comparação ao sucesso do tratamento na

Região do Mediterrâneo Oriental (82%) e Pacífico Ocidental (93%) (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2016).

O Brasil pertence ao grupo BRICS, denominação da OMS que inclui os países:

Brazil, Federação Russa, India, China e Africa do Sul; os quais em conjunto são

responsáveis por cerca do 50% de casos de TB no mundo. Assim também, está dentro

dos 30 países com mais alta incidência de TB e dos 9 países com mais alta carga de

casos de co-infecção com HIV. Estima-se que ocorreram em 2015, 84 000 novos casos

de TB e 7 700 mortes ocasionadas pela doença. Além disso, do total de casos

notificados, 52% acometeu homens, 24% mulheres e 8,1% crianças (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2016). Em Goiás, foram identificados 986 novos casos

para todas as formas de TB, contando assim com uma incidência de 14,3/100 000

habitantes em 2015 (GOIÁS, 2016).

2

1.2 Tuberculose humana

Tuberculose (TB) humana, conhecida como a peste branca, foi uma das

principais causas de morte no final do século XIX e início do século XX e continua

sendo, porque apesar de ser uma doença curável e evitável, foi uma das dez principais

causas de mortes por doenças infecciosas no mundo em 2015 (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2016). A infecção é causada principalmente pelo Mycobacterium

tuberculosis (Mtb), e em menor frequência pelo M. africanus. Quando se apresenta

como zoonose, tanto M. bovis como M. caprae também causam doença em humanos.

O gênero bacteriano se caracteriza por ser um bacilo álcool-ácido resistente de

crescimento lento, aeróbio e intracelular facultativo (PAI, 2016; SMITH, 2003).

A transmissão do bacilo ocorre a partir de adultos infectados com TB ativa ao

liberar micobactérias contidas em gotículas de saliva ao tossir ou espirrar, ocasionando

principalmente TB pulmonar (CADENA; FLYNN; FORTUNE, 2016). No entanto,

15% dos pacientes podem apresentar TB extrapulmonar, a qual frequentemente afeta

pleura, linfonodos, fígado, baço, ossos e articulações, coração, cérebro, sistema

geniturinário, meninges, peritônio ou pele (WORLD HEALTH ORGANIZATION,

2013). As manifestações clínicas da TB pulmonar podem incluir tosse, expectoração,

hemoptise, febre, sudorese noturna, anorexia e perda de peso quando não há controle

da infecção. Quando o paciente não apresenta sintomas, mas há confirmação pelo

diagnóstico laboratorial, são descritas como TB subclínica (DAMÁSIO, 2011; PAI et

al., 2016).

Logo após o contato primário com Mtb, cerca de 90% das pessoas conseguem

controlar a infecção mantendo-a como TB latente. Acredita-se que um terço da

população mundial apresenta TB latente (PAI et al., 2016). A cepa dormente da TB

latente se caracteriza pela incapacidade parcial ou total de replicar-se em cultura e pela

baixa atividade metabólica (LIPWORTH et al., 2016). Na população com TB latente,

o risco de progressão para TB ativa está entre o 5-15% em adultos, sendo o risco

maior em crianças; 30-40% em menores de um ano de idade, 24% entre 1-5 anos e

15% em adolescentes (PICCINI et al., 2014).

3

1.2.1 Resposta imune

A resposta imune do hospedeiro vai determinar o desenvolvimento da doença

(Figura 1). As primeiras células do sistema imune ao entrar em contato com os bacilos

são os Mφs alveolares, quando eles são transmitidos pela via aérea. Diferentes

mecanismos acontecem como parte da imunidade inata até a chegada de células

apresentadoras de antígenos (APCs) como monócitos e células dendríticas (DCs) até

os linfonodos drenantes (LNDs). Nos LNDs ocorre a ativação de linfócitos, os quais

são parte do sistema imune adaptativo (PAI et al., 2016).

Figura 1 - Representação do desenvolvimento do granuloma na Tuberculose humana. Na infecção

latente (a) depois da transmissão do Mycobacterium tuberculosis por via aerossol, os bacilos têm o

contato primário com os macrófagos alveolares, os quais funcionam como APCs associados a

monócitos e células dendríticas que ao migrar para os linfonodos drenantes (LNDs) ativam linfócitos.

Os linfócitos e as células ativadas retornam ao pulmão formando o granuloma que é composto por

linfócitos (L), APCs infectadas. Na infecção ativa (b), o sistema imune é incapaz de manter o

granuloma e os bacilos podem ser espalhados via linfática e por via aérea. Adaptado de Pai et al. (2016).

No início como parte da imunidade inata, após a interação dos bacilos com os

Mφs alveolares é promovida uma resposta pró-inflamatória (ERNST, 2012). Os

fagócitos profissionais podem endocitar bacilos opsonizados (complemento C3) ou

não opsonizados. Esses fagócitos contêm na membrana diferentes receptores de

reconhecimento padrão (PRRs), os quais têm como ligantes padrões moleculares

associados a patógenos (PAMPs), que são componentes da própria micobactéria

4

(ERNST, 2012; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002). Os

receptores semelhantes a Toll (TLR) são os receptores mais importantes. O TLR2 liga

lipoproteínas, o TLR4 liga glicoproteínas ou endotoxinas e o TLR9 pode ligar o DNA

bacteriano. Outros receptores como o TLR1 e o TLR6 associados ao TLR2 também

participam no reconhecimento dos bacilos. Dessa forma, os TLRs que conseguem

reconhecer seus ligantes mediante a via MyD88 promovem a liberação de citocinas

pró-inflamatórias como IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-α (ERNST, 2012; SAARAV;

SINGH; SHARMA, 2014; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002).

Uma vez que os Mφs são infectados, eles podem eliminar os bacilos pela indução de

necrose ou apoptose (O’GARRA et al., 2013). A forma dos Mφs agirem frente aos

bacilos depende da sua plasticidade em ser ativados em Mφs de tipo M1 ou de tipo

M2. Na defesa do hospedeiro e após a indução da resposta inflamatória, prevalecem os

Mφs de tipo M1 (MILLS, 2012). Eles também denominados de via clássica,

aumentam a produção de óxido nítrico sintase (NOS-2), que produz óxido nítrico

(NO) e radicais intermediários do nitrogênio (RNI) com função bactericida

(DAMÁSIO, 2011; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002). Em

contrapartida, segundo o microambiente de citocinas, os Mφs de tipo M2 cumprem

uma função anti-inflamatória ao inibir o NO mantido pela liberação de TGF-β

(MILLS, 2012). Outras células envolvidas na resposta imune inata são os neutrófilos,

os quais cumprem uma função protetora. Mediante à apoptose de neutrófilos

infectados, os bacilos podem ser capturados pelas DCs que promoveram a ativação de

LT CD4. Em pacientes com TB ativa se observa neutrofilia possivelmente pelo

excesso de sinalização de IFN tipo I (O’GARRA et al., 2013). Por sua parte, as células

NK têm uma função citolítica. Elas reconhecem os ácidos micólicos da membrana do

bacilo e liberam IFN-γ e TNF-α (CADENA; FLYNN; FORTUNE, 2016). Os

receptores envolvidos nessa função poderiam ser os NKp46 e NKG2D, os quais

dependente do TLR-2 conseguem a lise de Mφs e monócitos infectados com Mtb

(VANKAYALAPATI et al., 2005).

As células T invariantes associadas à mucosa (MAIT) se assemelham aos LT e

até são considerados uma subpopulação de LT CD8. As MAITs estão em aumento no

líquido broncoalveolar de indivíduos com TB ativa, quando comparados com

indivíduos saudáveis. Em vez de um MHC convencional, as MAITs possuem uma

molécula associada ao MHC I (MR1), o qual se liga aos metabolitos derivados de

riboflavina que podem ser produtos de bactérias ou fungos. Independente ou não do

5

MR1, as MAITs podem induzir lise de células epiteliais infectadas com Mtb (função

citotóxica) semelhante aos LT CD8, ou produzem IFN-γ promovendo a liberação de

IL-12 pelas DCs e consequentemente a diferenciação de LT Th1 (GOLD; NAPIER;

LEWINSOHN, 2015; NAPIER et al., 2015).

Os Mφs e demais células fagocíticas geram citocinas pró-inflamatórias como

IL-12, IL-18, IL-23 e IL-27 induzindo a produção de IFN-γ. Enquanto o TNF-α

promove a ativação clássica de Mφs e formação do granuloma (GUILLIAMS;

LAMBRECHT; HAMMAD, 2013; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER

MEER, 2002). Entre as citocinas anti-inflamatórias os Mφs liberam IL-10 como

inibidor do IFN-γ, TNF-α e IL-12. Os monócitos e DCs liberam o TGF-β com função

sinérgica a IL-10; e IL-4 como supressor de produção de IFN-γ (DAMÁSIO, 2011;

VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002).

Uma vez que o sistema imune inato monta uma resposta, e a estimulação

antigénica passa a ser crônica, é formado o granuloma de Gohn, uma estrutura

organizada de células imunes. Os bacilos induzem os Mφs infectados a produzirem

quimiocinas, que atraem um fluxo de DCs, neutrófilos, NKs, linfócitos gamma delta e

mais Mφs aos pulmões levando a formação do granuloma primário ou sólido

(CADENA; FLYNN; FORTUNE, 2016; EHLERS; SCHAIBLE, 2012). Logo, a

imunidade adaptativa é alertada e o granuloma na fase ativa da doença apresenta uma

região necrótica acelular envolvida por células inflamatórias e por linfócitos T (LT) e

B (LB), e eventualmente com tecido fibroso na periferia (granuloma caseoso)

(FLYNN; CHAN; LIN, 2011). A partir dessa fase, o granuloma é denominado de

cavitário, o qual apresenta dano tecidual irreversível, necrótico e com cavitações. Caso

o granuloma não evolua para a fase caseosa e cavitária o Mtb se mantém em fase

latente (poucos bacilos) e a doença se denomina TB latente (KIRAN et al., 2016).

Durante o desenvolvimento da doença, o granuloma é a patologia clássica. Os três

tipos descritos como granuloma primário ou clássico, caseoso e cavitário podem ser

observados na TB ativa e latente. Na sua forma primária e caseosa, o granuloma

parece apresentar uma função protetora pois matem os bacilos em Mφs, evitando sua

disseminação, porém sem capacidade de eliminá-los. No entanto, quando o granuloma

encontrasse na fase cavitária facilita a disseminação dos bacilos que são eliminados

(FLYNN; CHAN; LIN, 2011).

A formação do granuloma depende da resposta adaptativa e principalmente de

uma resposta do tipo Th1. As APCs capturam os antígenos que poderiam ser

6

transportados do interior dos Mφs infectados até o citosol mediante vesículas de

membrana (JURKOSHEK et al., 2016). Logo, as APCs são atraídas pelo fluxo de

quimiocinas aos LNDs drenantes, onde acontece a apresentação de antígenos para

linfócitos virgens. A via de apresentação de antígenos para patógenos intracelulares

como o Mtb, acontece principalmente a través do MHC de classe II para ativar LT

CD4. Mas pode acontecer através do MHC de classe I (apresentação cruzada) para

ativar LT CD8, quando os antígenos contidos em vesículas apoptóticas são

reconhecidos. Os LT CD8 auxiliam aos LT CD4 ao liberar IFN-γ que ativa Mφs pela

via clássica (DAMÁSIO, 2011; O’GARRA et al., 2013). A diferenciação dos subtipos

de LT vai depender do microambiente de quimiocinas.

Entre os LT CD4, a subpopulação Th1 é a mais importante, dessa forma os

defeitos na produção de suas citocinas aumenta o risco de progressão da doença (DA

SILVA et al., 2015; DOMINGO-GONZALEZ et al., 2016). Os LT Th1 são capazes de

liberar IFN-γ, TNF-α e/ou IL-2. O IFN-γ promove a função bactericida dos Mφs.

Outras células como os LT CD8, NKs, γδ também são fonte de IFN-γ (DA SILVA et

al., 2015). O TNF-α age sinergicamente com o IFN-γ otimizando a função bactericida

dos Mφs, além de auxiliar na manutenção do granuloma (DA SILVA et al., 2015;

DOMINGO-GONZALEZ et al., 2016).

A subpopulação Th17 também é importante na função protetora na TB.

Quando os Mφs ativados promovem a liberação de IL-6 e TGF-β, ativam o fator de

transcrição STAT-3 (DA SILVA et al., 2015), e estimulam a liberação de IL-23 pelos

LT CD4, acabam induzindo a diferenciação da subpopulação Th17 produtoras de IL-

22 e IL-17. A IL-22 induz peptídeos antimicrobianos e inibe o crescimento intracelular

de bacilos de Mtb nos Mφs (DOMINGO-GONZALEZ et al., 2016). A IL-17 induz

citocinas pró-inflamatórias como G-SCF, IL-6 e IL-8, que promove a granulopoiese e

assim o recrutamento de neutrófilos e inflamação (CRUZ et al., 2006; LUO et al.,

2016) no local de infecção e intervêm positivamente na formação do granuloma

(JASENOSKY et al., 2015). Além disso, a IL-17 acelera o recrutamento de células

produtoras de IFN-γ até os pulmões após o gradiente de CXCL-9,10 e 11 (O’GARRA

et al., 2013). Já foi demonstrado no sangue periférico de pacientes com TB níveis

maiores de Th17 e aumento de IL-17 no plasma, em comparação controles saudáveis

(CHEN et al., 2010; JURADO et al., LUO et al., 2016).

Os LT CD8 também produzem TNF-α e IL-2, além do IFN-γ. A principal

função dos LT CD8 é de caráter citotóxico, mediante a ação de grânulos pela indução

7

de apoptose. Os grânulos contem perforinas, granulisinas e granzimas. As perforinas e

as granulisinas podem lisar diretamente células infectadas com o bacilo e tem sido

encontradas em células do granuloma. Enquanto as granzimas ativam as caspases e

ativam os mecanismos de apoptose da célula infectada pelo Mtb. A indução de

apoptose também acontece pela ativação da via do Fas-Fas ligante (LIN; FLYNN,

2015). Em pacientes com TB ativa a atividade citotóxica esta diminuída

(JASENOSKY et al., 2015; SILVA et al., 2014), em pacientes com co-infecção de

HIV-TB os LT CD8 são importantes fontes de IFN-γ (WANG, F. et al., 2016).

As subpopulações de LT que liberam mais de duas citocinas de perfis diversos

são chamadas de polifuncionais (IFN-γ/TNF-α ou IFN-γ/IL-2), a qual apresenta maior

eficácia que as subpopulações que liberam só uma citocina e poderiam estar

associadas à proteção (WILKINSON; WILKINSON, 2010). Depois de uma resposta

pró-inflamatória exacerbada, LT reguladores (Treg) começam a atuar. As Treg estão

em altos níveis no sangue periférico de pacientes com TB ativa e está associada com a

carga bacilar aumentada e a multidroga-resistência (SINGH et al., 2012). Enquanto

nos casos de TB latente, as Treg estão diminuídas (DA SILVA et al., 2015).

Os LB nas infecções na maioria das vezes cumprem a função de proteção,

mediante a produção de anticorpos, produção de citocinas ou pelo fato de agir como

APCs para ativar LT virgens. Porém, na TB a função não está bem elucidada (DU

PLESSIS; WALZL; LOXTON, 2016). Em pacientes com TB, observam-se agregados

de LB semelhante a folículos nos pulmões (O’GARRA et al., 2013) e também se tem

descrito a diferença entre o padrão de anticorpos de pacientes com TB ativa e latente.

Os anticorpos isolados de pacientes com TB latente conseguiram melhorar a resposta

de Mφs infectados com Mtb. Essa característica foi devido ao diferente padrão de

glicosilação, quando comparados com os anticorpos isolados de pacientes com TB

ativa (LU et al., 2016).

8

1.3 Diagnóstico de TB

O diagnóstico de TB está centrado na identificação de TB ativa na sua forma

pulmonar. A triagem para TB ativa é antecedida ao uso de testes de diagnóstico de

laboratório. Na triagem, são considerados a identificação de tosse por duas semanas,

algum sintoma compatível com TB ativa (perda de peso, hemoptise, febre

intermitente) ou raios X de tórax (Figura 2). Os algoritmos de diagnóstico que

acompanham os resultados positivos da triagem são a microscopia de escarro ou os

testes rápidos moleculares recomendados pela OMS (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2015a).

Figura 2 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB ativa. Adaptado e traduzido de World

Health Organization (2015a).

O diagnóstico da TB latente está centrado nas populações de risco, as quais são

os prisioneiros, idosos, imigrantes de países com alta incidência de TB, contatos de

pacientes com TB e usuários de drogas ilícitas. As populações de risco devem seguir

um algoritmo diferente ao da procura de TB ativa (Figura 3). Primeiro se utiliza a

mesma triagem utilizada para TB ativa, se o indivíduo não apresenta algum resultado

positivo, os testes diagnósticos recomendados são a PT (Prova tuberculínica) ou o

IGRA (Ensaio de liberação de IFN-γ) (WORLD HEALTH ORGANIZATION,

2015a). Ambos estão baseados na resposta imune frente ao patógeno, porém têm baixa

9

sensibilidade para indivíduos HIV positivos e não diferenciam entre uma infecção

recente ou antiga, ou se a pessoa é re-infectada ou re-exposta (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2016).

Figura 3 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB latente em indivíduos de grupos de

risco. Adaptado e traduzido de World Health Organization (2015a).

Para identificar TB ativa os testes de diagnóstico são desenvolvidos

considerando a cultura de escarro para crescimento de micobactérias como teste de

referência. A eleição de um teste de diagnóstico muitas vezes considera os dados de

sensibilidade e especificidade (Quadro 1) (WORLD HEALTH ORGANIZATION,

2015b). Porém, ao ser aplicado na realidade, outros fatores epidemiológicos e sociais

influenciam nessa escolha.

Quadro 1 - Sensibilidade e especificidade de diferentes testes de diagnóstico para Tuberculose, a

partir de revisões sistemáticas usando casos de TB pulmonar confirmados por cultura como teste

de referência.

a Valores de Sensibilidade e Especificidade obtidos de diversas revisões sistemáticas em % (95% de

intervalo de confiança). b Refere-se à microscopia de luz convencional usada para examinar escarro com coloração de Ziehl-

Neelsen. Microscopia de fluorescência, incluindo microscopia com diodos emitindo luz geralmente tem

uma sensibilidade maior que a microscopia de luz convencional.

Fonte: Adaptado e traduzido de World Health Organization (2015b).

10

1.3.1 Microscopia.

A microscopia identifica a presença de micobactérias álcool-ácido resistentes.

Como a TB ativa se desenvolve principalmente nos pulmões, coleta-se amostras de

escarro (SINGHAL; MYNEEDU, 2015). Utiliza-se a coloração de Ziehl-Neelsen, uma

coloração que aproveita as características de álcool-ácido resistência das micobactérias

(ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD, 2008a). Um resultado

positivo é definido pela identificação de ao menos um bacilo álcool-ácido resistente

(BAAR) em pelo menos 100 campos de leitura no microscópio de luz convencional

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Em uma amostra de escarro podem

ser identificados 104 ou 105 bacilos por mL, e isso se dá quando as condições de coleta

são ótimas (SINGHAL; MYNEEDU, 2015). Atualmente, a OMS recomenda a coleta

de duas amostras de escarro como parte do algoritmo diagnóstico de TB ativa

(CUDAHY; SHENOI, 2016), que seria suficiente para identificar 95-98% dos casos

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015c). Dessa forma, a sensibilidade da

microscopia de luz convencional é de 61% e a especificidade de 98% (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2015b). No entanto, a sensibilidade do teste varia (20-

80%) segundo as condições de coleta de amostras, o processamento e a leitura delas

(PARSONS et al., 2011).

A microscopia possui como vantagens ser uma ferramenta de diagnóstico

rápido em casos com suspeita de TB, ser de fácil execução e de baixo custo

(SINGHAL; MYNEEDU, 2015; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015c).

Contudo, também apresenta desvantagens. Quando os pacientes são pauci-bacilíferos a

sensibilidade diminui, o que acontece em pacientes HIV positivos (PAI et al., 2016;

WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015b) e pacientes pediátricos. Nessa última

população com menos de 12 anos, sendo recomendado uma amostra de aspirado

gástrico (SINGHAL; MYNEEDU, 2015; WORLD HEALTH ORGANIZATION,

2015c). Além disso, a informação da microscopia não permite diferençar o complexo

Mycobacterium tuberculosis de outras micobactérias como as não causadoras de

tuberculose (MNT) e não fornece informações do perfil de resistência bacteriana

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015c).

11

1.3.2 Cultura

A cultura é o teste de referência para identificar casos de TB (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2015b) mediante o processo de crescimento das

micobactérias, a partir de amostras de escarro ou outras em meios sólidos ou líquidos.

Quando as amostras são de locais não estéreis do corpo, como a amostra de escarro, é

necessária a digestão, homogeneização, descontaminação e concentração das amostras,

com o objetivo de evitar o crescimento de flora contaminante (ORGANIZACIÓN

PANAMERICANA DE LA SALUD, 2008b; PARSONS et al., 2011). Depois desses

procedimentos, o concentrado da amostra é inoculado no meio sólido e submetido à

incubação de 37°C por até oito semanas. Os meios sólidos mais utilizados são os

meios a base de ovo, Löwenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh. A leitura no início até o

terceiro dia é realizado para identificar possíveis contaminações e garantir a absorção

da amostra pelo meio de cultura. Na primeira semana e nas semanas consecutivas é

realizada a leitura visual das colônias isoladas. Por último, o registro de resultados

inclui o resultado: contaminado, negativo ou positivo com a quantificação de colônias

(+ 20 a 100 colônias, ++ mais de 100 colônias e +++ quando as colônias são

incontáveis). Além da quantificação, é preciso descrever a morfologia das colônias e a

pigmentação que possuem (ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD,

2008b). Outra forma de cultura utiliza meios líquidos que acrescentam indicadores de

crescimento radioativos ou fluorométricos (CUDAHY; SHENOI, 2016). A

sensibilidade com esses meios de cultura aumenta em 10% e a leitura deixa de ser

visual para ser realizada mediante equipamentos automatizados (BACTEC e MB Bact)

(CUDAHY; SHENOI, 2016; ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD,

2008b). Por ser o método de referência, a cultura tem a vantagem de fornecer um

resultado definitivo. E ela consegue identificar 102 bacilos/mL de amostra (CUDAHY;

SHENOI, 2016) e sua sensibilidade pode aumentar em 30 a 50% quando se associa ao

teste de álcool ácido resistência e avaliação em microscópio. Nas culturas positivas, as

colônias isoladas podem ser utilizadas para conhecer o perfil de resistência das cepas

do Mtb (CUDAHY; SHENOI, 2016). Porém, a limitação principal da cultura é o

tempo de até 12 semanas para obter o resultado (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2016). Além desta desvantagem, a cultura precisa de um

laboratório equipado, pessoal treinado e um sistema de transporte de amostras que

assegure a viabilidade das bactérias (PARSONS et al., 2011; WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2015b, 2015c).

12

1.3.3 Ensaio Xpert MTB/RIF® (Cepheid, USA)

O ensaio Xpert MTB/RIF® é o único teste molecular de diagnostico rápido

recomendado pela OMS desde 2011, para identificar TB e resistência à rifampicina

(CUDAHY; SHENOI, 2016; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Esse

ensaio se baseia na amplificação de ácidos nucléicos por reação em cadeia da

polimerase (PCR) em tempo real. A amostra de escarro é processada de maneira

automatizada, o DNA da amostra é amplificado e a resistência à rifampicina detectada

em cerca de 2 horas. O teste identifica o complexo Mycobacterium tuberculosis e

também o gene rpoB associado à resistência a rifampicina (BRASIL,2011; CUDAHY;

SHENOI, 2016). Quando foi avaliada a sensibilidade e especificidade em diferentes

revisões sistemáticas, encontrou-se uma sensibilidade de 92% (70-100) e

especificidade de 99% (91-100) quando comparadas com o teste de referência, a

cultura (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015b). Esse ensaio quando testado

em população pediátrica pode ser usado em amostras de lavado gástrico e apresentou

melhores resultados que a microscopia de escarro das crianças (DETJEN et al., 2015).

Esse teste também auxiliou no diagnóstico de indivíduos paucibacilares (CUDAHY;

SHENOI, 2016), mas essas vantagens dependem da população estudada (GELETA et

al., 2015). As reações cruzadas são mínimas tendo sido reportadas em 0,6% dos casos

(CUDAHY; SHENOI, 2016). Entre as limitações está o alto custo e o fato de

identificar apenas resistência a rifampicina, sendo necessário mais avaliações e

culturas para avaliação de susceptibilidade a outras drogas (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2016). Apesar de ter sido recomendado pela OMS, após alguns

testes clínicos, o Xpert TB/RIF não demonstrou nenhuma vantagem aos ensaios

originais ou demonstrou alteração nos parâmetros finais de identificação, tratamento e

controle da tuberculose (BOYLES, 2017).

1.3.4 Ensaio de fluxo lateral para lipoarabinomanana (LF-LAM)

O ensaio de LF-LAM é um teste rápido de fluxo lateral que reconhece o

antígeno lipoarabinomanana (LAM), um lipopolissacarídeo da membrana do Mtb. O

LAM é liberado por bactérias ativas metabolicamente e os rins podem filtrá-lo,

podendo aparecer na urina do paciente com TB ativa. Em 2015, a OMS recomendou o

uso do LF-LAM em pacientes HIV positivos com sinais ou sintomas de TB e com a

contagem de LT CD4 ≤ 100 células/μL. Assim como também em pacientes HIV

positivos com doença grave independentemente da contagem dos LT CD4 (PETER et

13

al., 2016; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015d). As vantagens do teste são:

o uso de uma amostra não invasiva como a urina, menor risco de contaminação

quando comparado com a amostra de escarro, e não precisar de pessoal treinado para

fazê-lo. Essas características facilitam o uso do teste na triagem, como em casos de

pessoas HIV positivo (PETER et al., 2016). Entretanto, o uso do teste é limitado às

populações HIV positivas, e ainda não se tem informação suficiente para seu uso em

outras populações.

1.3.5 Ensaio de liberação de interferon-gamma (IGRA)

Para identificar TB latente, a OMS disponibiliza dois testes, o ensaio de

liberação de interferon-gamma (IGRA) e a prova tuberculínica (PT). Ambos

identificam a exposição prévia ao Mtb mediante uma resposta celular específica

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Recentemente, quando avaliado em

contatos de pacientes com TB ativa, o IGRA e a PT, apresentaram resultados similares

na identificação de TB latente (SHARMA et al., 2017). Para realizar o IGRA, uma

amostra de sangue periférico é coletada, e o componente celular é separado e

estimulado com antígenos micobacterianos para avaliar a liberação de IFN-γ por essas

células (GONZÁLEZ-MARTÍN et al., 2010; WHITWORTH et al., 2013). Diferentes

versões do IGRA têm sido desenvolvidas, podendo ser usados antígenos

micobacterianos da região genética RD1 (ESAT-6 e CFP-10) associados ou não com

antígenos da região genética RD11 (TB7.7/RV2654) (GANGULY; SIDDIQUI;

SHARMA, 2008). O primeiro a ser utilizado incluía os antígenos ESAT-6 e CFP-10

usando a técnica de ELISA, e foi denominado QuantiFERON-TB (Cellestis Inc.

Victoria, Australia), aprovado pela FDA em 2001. Com o mesmo princípio, mas

usando a técnica de ELISPOT, foi implementado o TSPOT.TB (Oxford Immunotec,

Oxford, UK), aprovado na Europa em 2004. O QuantiFERON Gold incrementou um

terceiro antígeno, o TB7.7 (Rv 2654), o qual foi melhorado para seu uso em tubo de

coleta, estando disponível desde 2007 como QuantiFERON Gold In-Tube (QFT-GIT)

(WHITWORTH et al., 2013). Entre as vantagens do teste, está o aumento de

especificidade para o reconhecimento de TB latente. Os antígenos micobacterianos

utilizados no IGRA estão presentes no complexo Mtb, mas ausentes na vacina BCG e

algumas MNTs (GANGULY; SIDDIQUI; SHARMA, 2008). O IGRA quando

comparado a PT, requer só uma visita do paciente e os resultados estão liberados entre

24 e 48 horas. Entre as desvantagens descritas para o IGRA, a coleta de amostras de

14

sangue por exemplo pode influenciar diretamente o resultado. O QFT-GIT possui

tubos controles, dos quais no caso de usar primeiro o controle positivo na coleta pode

ocorrer contaminação do controle negativo ou da amostra do paciente. Além disso, o

QFT-GIT apresentou maior resposta quando a coleta de amostra foi durante a tarde em

comparação a coleta pela manhã (BANAEI; GAUR; PAI, 2016). Outra desvantagem

seria a falta de reprodutibilidade por exemplo a reversão de positivo para negativo, e

no caso de indivíduos negativos, a conversão após o contato com paciente com TB

ativa ser mais demorada do que os resultados obtidos com a PT (4-22 semanas)

(JONES-LÓPEZ et al., 2015; RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2014). Resultados falsos

positivos podem ocorrer quando o IGRA é realizado 24 horas após de realizar a PT

(efeito booster) ou por produtos microbianos do próprio indivíduo que podem modular

a resposta ex vivo (BANAEI; GAUR; PAI, 2016). Além disso, esse teste requer

laboratório com infraestrutura complexa e com pessoal treinado, isso junto ao seu alto

custo faz que não seja recomendado para substituir a PT em populações de renda baixa

ou média (GONZÁLEZ-MARTÍN et al., 2010; WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2015b, 2015c). Também é descrito sua limitação em populações

com alta incidência de TB e HIV. O IGRA pode gerar até 8,6% de resultados

indeterminados em população com alta incidência de TB, o que aumenta quando o

indivíduo é HIV positivo com baixa contagem de LT CD4 (ONI et al., 2012).

1.3.6 Prova tuberculínica

O teste utiliza principalmente a técnica de Mantoux para identificar exposição

prévia ao Mtb, gerando uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) ou tipo

IV (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2006). A técnica consiste em injetar PPD

(derivado proteico purificado, do inglês: "purified protein derivate") via intradérmica

no antebraço do indivíduo com suspeita de TB latente. Depois de 48-72 horas se

realiza a avaliação da reação de DTH, representada pela induração e eritema formado

no local de inoculação do PPD. A leitura do diâmetro transversal da induração define o

caso de TB latente. Na população de baixo risco um diâmetro >5 mm é suficiente,

enquanto em população de alto risco precisa de um diâmetro >10 mm para ser

considerado positivo (BRASIL,2015).

O PPD vem sendo usado há muito tempo. Em 1890, Robert Koch utilizou o

filtrado da cultura de Mtb como tratamento da infecção, o qual foi descontinuado

devido aos vários efeitos colaterais (HUEBNER; SCHEIN, 1993). Já em 1926, Seibert

15

isolou as proteínas cristalizadas desse filtrado da cultura, identificando a sua

composição em proteínas e polissacarídeos, o que hoje corresponde ao PPD

(DANIEL, 2009). Em 1930, o PPD começou a ser usado na triagem diagnóstica de

indivíduos com Mtb (HUEBNER; SCHEIN, 1993). O método original para a obtenção

do PPD consistia na cultura de Mtb em meio glicerinado com carne e inativação por

calor a 100°C, e foi denominado OT (Old Tuberculin). Logo com agentes

desnaturantes e de precipitação como o sulfato de amônia, se chegou ao PPD-S

(DANIEL, 2009), o qual em 1952 foi adotado como o PPD de referência internacional

pela OMS (HUEBNER; SCHEIN, 1993). O conteúdo do PPD não era específico

quando começou a ser utilizado no diagnóstico, e desde então foram utilizadas

diversas técnicas de identificação, desde eletroforese de proteínas até espectrometria

de massas. As diferentes preparações do PPD utilizadas em humanos são o PPD-S2,

PPD-RT-23, PPD IC-65 e PPD-CT68. Em 2012, foi mostrado que o PPD-S2 contém

principalmente proteínas de choque térmico (Rv0350/DnaK, Rv0440/GroEL e

Rv3418/GroES e Rv0652) (CHO et al., 2012). Pouco tempo depois, identificaram-se

265 proteínas no PPD-CT68, das quais 142 proteínas foram comuns com o PPD-S2,

incluindo as proteínas de choque térmico mencionadas (PRASAD et al., 2013).

O PPD consegue induzir uma reação de DTH, a qual é uma resposta de tipo

celular (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2006). Após a inoculação do antígeno na

epiderme, as células de Langerhans que são as DCs do local, são ativadas e respondem

frente à lesão liberando citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α). Tanto as células

de Langerhans ativadas como outras DCs fazem fagocitose dos antígenos mediante um

gradiente de quimiocinas (CCL21:CCR7) e migram pelos vasos linfáticos até os

órgãos linfóides secundários. Nestes órgãos, as APCs conseguem apresentar os

antígenos aos LT de memória (SCHEIBLHOFER; THALHAMER; WEISS, 2013), os

quais são ativados e migram ao local de dano, a derme. Ao mesmo tempo, outras

citocinas pró-inflamatórias são liberadas pelos mastócitos, fibroblastos e DCs (Figura

4) (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2008).

As células recrutadas no local de inoculação começam a aparecer após poucas

horas (6 h). No início os neutrófilos são recrutados, logo os Mφs ativados e os

linfócitos (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2006). A induração é causada

principalmente pelo infiltrado linfocitário e não pelo edema inflamatório na pele. Entre

os linfócitos se reconhece a predominância dos LT CD4+ com fenótipo de memória

(CD45RO+), mas também inclui os LT CD8+ (proporção LT CD4:CD8 = 2:1) e de

16

forma infrequente os LB (AKBAR et al., 2013; GIBBS et al., 1984; SARRAZIN et al.,

2009). Dentre os LT CD4+, as Treg têm sido estudadas na DTH por ser um fator de

variabilidade na resposta da PT. Existem trabalhos mostrando que LT CD4+ de

memória e Treg apresentam cinética similar para o local de inoculação

(VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2008). Em pacientes HIV positivo e idosos os níveis

de Treg aumentam e este fato pode influenciar diretamente a reação de DTH

independente da contagem de LT CD4 totais (SARRAZIN et al., 2009). Foi mostrado

que um dos motivos da diminuição da PT em pacientes idosos é a expressão diminuída

de moléculas de adesão (E-seletina e VCAM-1) nas células do endotélio (AGIUS et

al., 2009) e de marcadores de proliferação (Ki67) e ativação (CD69) nos LT CD4+ em

geral (AKBAR et al., 2013).

Figura 4 - Resposta de hipersensibilidade do tipo tardia em humanos. Adaptado de

VUKMANOVIC-STEJIC et al. (2016).

Atualmente, a produção das formulações do PPD tem sido restrita e substituída

pelo IGRA para identificar casos de TB latente. Entre as vantagens da PT temos que é

um teste de alta sensibilidade, de fácil execução e utiliza o reagente PPD de baixo

17

custo. As desvantagens são a necessidade de duas visitas uma para a aplicação e outra

para a leitura do teste, além de apresentar baixa especificidade. Os resultados falsos

negativos estão associados a uma baixa resposta celular do indivíduo por diferentes

causas (Quadro 2). Enquanto, os falsos positivos podem ser consequências da

vacinação com BCG (se utilizado em crianças até os cinco anos de idade) (SEDDON

et al., 2016), exposição repetida ao PPD ou exposição a MNTs (GONZÁLEZ-

MARTÍN et al., HUEBNER; SCHEIN, 1993). Essa falta de especificidade se deve

possivelmente às proteínas de choque térmico que estão mais abundantemente no

conteúdo do PPD (CHO et al., 2012; PRASAD et al., 2013; WIKER; HARBOE,

1992). Contudo, ainda se sugere o uso da PT na triagem de TB latente em populações

com alta prevalência e com história de vacinação pelo BCG (FERREIRA et al., 2015),

e em populações com renda baixa e média (WORLD HEALTH ORGANIZATION,

2015b).

Quadro 2 - Causas dos resultados falsos negativos da prova tuberculínica.

Fonte: Adaptado e traduzido de Gonzáles-Martin et al. (2010).

18

1.4 Tuberculose murina

Um modelo animal bem aceito para o estudo da resposta imune é o modelo

murino, pois a pesar da resposta ao estímulo frente ao Mtb diferir dos humanos, é

possível controlar muitas variáveis, facilitando assim a interpretação dos resultados

(COOPER, 2015). Em 1947 Pierce e colaboradores avaliaram a sobrevivência a

infecção por Mtb em 22 linhagens diferentes de camundongos e classificou as

linhagens que não sobrevivia mais que 150 dias após a infecção como susceptíveis

(CBA/J e DBA/2) e que sobreviviam mais que 300 dias, como resistentes (BALB/c e

C57BL/6) (BEAMER; TURNER, 2005; SÉRGIO et al., 2015). Os camundongos

desenvolvem uma fase aguda e crônica da infecção diferente dos humanos que

apresentam a forma ativa e a latente da doença. Na fase aguda, a infecção se estabelece

nos pulmões com altas taxas de replicação (duas semanas após a infecção) (MOGUES

et al., 2001; TSAI et al., 2006). As primeiras células do sistema imune que entram em

contato com o bacilo são os Mφs alveolares, que agem como fagócitos e APCs

(BEAMER; TURNER, 2005). Primeiro, os Mφs podem facilitar o crescimento das

micobactérias até ele ser ativado por outros mecanismos do ambiente. Segundo, os

Mφs podem induzir mecanismos de eliminação como formação do fagolisossomo,

liberação de moléculas reativas de oxigênio e RNI, limitação do uso do ferro ou

apoptose (LEEMANS et al., 2005). Durante a fase aguda, as micobactérias se replicam

nos Mφs alveolares, estabelecendo a formação do granuloma pulmonar com

predomínio de neutrófilos e Mφs (TSAI et al., 2006). Enquanto isso acontece, as DCs

migratórias podem reconhecer Ags e cumprir a função de APCs nos pulmões, o que

acontece raramente, ou transportar os Ags até os linfonodos drenantes mediastinais

(LNMDs) conduzidas pela expressão de CCR7 nas células desses órgãos linfóides

(OLMOS; STUKES; ERNST, 2010). Ao atingir os LNMDs, as DCs residentes não

infectadas capturam os antígenos do ambiente extracelular para também cumprir a

função de APC (SRIVASTAVA; ERNST, 2014; WOLF et al., 2007). Assim, as DCs

tanto nos pulmões como nos LNMDs são as principais APCs, expressando níveis mais

altos de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 em comparação aos Mφs

alveolares e intersticiais (WOLF et al., 2007). Entre 4-27 semanas após adquirir a

infecção, o camundongo desenvolve a fase crônica apresentando o granuloma com

predomínio de LT e não mais de neutrófilos e Mφs (TSAI et al., 2006). Durante esta

fase, o transporte de antígenos dos pulmões aos LNMD pelas DCs diminui (WOLF et

al., 2007), assim como a taxa de replicação e morte de micobactérias (GILL et al.,

19

2009; MCDANIEL et al., 2016). Nos camundongos resistentes, a fase crônica se

caracteriza pelo controle da infecção por até dois anos, e a partir desse período a

resposta de LT CD4 diminui e se observa a progressão da doença (BEAMER;

TURNER, 2005).

O Mtb como patógeno intracelular promove principalmente uma resposta de

tipo Th1 (como em humanos) para resolver a infecção tanto na fase aguda como na

fase crônica (TSAI et al., 2006). A apresentação de antígenos ocorre e como

consequência os LT CD4 aparecem nos LNMDs entre 7-14 dias após a infecção com o

pico entre 21-28 dias (GALLEGOS; PAMER; GLICKMAN, 2008; WOLF et al.,

2007), o que confirma o aumento de IL-2, IFN-γ e TNF-α, citocinas liberadas pelos

LT CD4. A IL-12 é a citocina responsável pela polarização Th1, o subtipo de LT CD4,

a mais importante na resposta imune celular induzida contra o Mtb.

A subpopulação Th1 é a fonte principal de IFN-γ e TNF-α, os quais agem nos

Mφs, promovendo sua função microbicida (LADEL et al., 1997). Camundongos IFN-γ

KO (nocaute, do inglês “Knock out”) infectados com dose de Mtb subletal via aerossol

e via endovenosa, apresentam múltiplas áreas necróticas no baço, pulmões, fígado e

rins; pouco recrutamento de neutrófilos e Mφs em granuloma não organizado; maior

carga bacilar e ausência de síntese de NOS2 (necessário na função microbicida dos

Mφs). De forma similar, é possível perceber que o IFN-γ age melhor em Mφs com alta

carga bacilar, provocando necrose e apoptose (LEE; KORNFELD, 2010), e quando se

apresentam deficiências na produção de IFN-γ, observa-se um aumento da

susceptibilidade a infecção por Mtb (LYADOVA; PANTELEEV, 2015). O que não

acontece no camundongo WT (camundongos com genótipo original, do inglês “Wild

type”), que consegue controlar a infecção, demonstrando a função protetora do IFN-γ

(COOPER et al., 1993; FREMOND et al., 2005; PEARL et al., 2001). Cabe mencionar

que o IFN-γ, ao invés de protetor poder ser letal se for produzido em excesso, como

foi demonstrado em camundongos PD-1 KO, um inibidor da produção de IFN-γ

(SAKAI et al., 2016). Do mesmo modo, o TNF-α exerce função protetora.

Camundongos TNF KO ou WT com tratamento anti-TNF apresentaram maior

susceptibilidade a infecção por Mtb. O TNF-α de membrana age na fase aguda junto

ao IFN-γ, aumentando a atividade microbicida dos Mφs (aumento de NOS2) e

participando na resposta pró-inflamatória, recrutando células para formar o granuloma

(FREMOND et al., 2005; SAUNDERS; BRISCOE; BRITTON, 2004). Enquanto na

20

fase crônica tanto TNF de membrana e solúvel participam no controle da infecção

(FREMOND et al., 2005).

A subpopulação Th17 também apresenta um perfil protetor na infecção por

Mtb. As citocinas IL-6, IL-21 e IL-23 ativam o fator de transcrição STAT 3, que induz

a expressão de ROR-γt, o qual aumenta a expressão do receptor do IL-23 e polariza o

perfil de LT CD4 na subpopulação Th17 (LYADOVA; PANTELEEV, 2015). Th17

não são a principal fonte da citocina IL-17, podendo ser produzida pelas células γδ.

Além da IL-17 (IL-17A), também é produzida IL-17F, IL-21 e IL-22. Em geral, a

subpopulação Th17 tem a função de recrutar neutrófilos que podem ajudar aos Mφs na

eliminação de bacilos ou na formação do granuloma (KHADER et al., 2007;

LYADOVA; PANTELEEV, 2015; TORRADO; COOPER, 2011).

1.4.1 Avaliação da reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em

modelo murino

A avaliação da reação de DTH em camundongos se realiza mediante um teste

cutâneo com o objetivo de identificar a exposição prévia a um antígeno. A aplicação

mais conhecida de um teste cutâneo é a prova tuberculínica (PT) a qual utiliza a

técnica de Mantoux. O teste cutâneo apresenta duas fases: uma primeira fase de

sensibilização e uma segunda fase de elicitação. A fase de sensibilização consiste no

contato primário com o antígeno (microrganismos, proteínas ou haptenos) por

diferentes vias de inoculação segundo o objetivo do estudo. A fase de elicitação

consiste na inoculação do antígeno ao qual se teve exposição prévia na fase de

sensibilização (ALLEN, 2013). Ao término dessas duas fases, a reação de DTH gerada

se avalia pela leitura, com ajuda de um paquímetro em milímetros (mm), do inchaço

no local de inoculação (ALLEN, 2013; FAQI, 2013; PAIS et al., 1998). A nível

imunológico na fase de sensibilização o antígeno injetado na derme é reconhecido

pelas APCs do local, as células de Langerhans na sua maioria por ser uma inoculação

de tipo intradérmica, as quais processam e apresentam esses antígenos aos LT

residentes nos linfonodos drenantes (AKBAR et al., 2013; SMITHEY et al., 2015). Os

LT de memória ou efetores devido a infecção ativa migram cerca de 24-72 horas para

o local de entrada do antígeno (injeção intradérmica). Na fase de elicitação, os LT de

memória reconhecem o antígeno e conseguem responder com produção de citocinas e

recrutamento de células, que irão formar a induração (SMITHEY et al., 2015).

21

O modelo animal mais utilizado na avaliação da resposta de DTH para

tuberculose é a cobaia. Entre as desvantagens se podem mencionar o risco de choque

tuberculínico (KUBICA; DUNBAR; KIM, 1973; REECE et al., 2005). O choque

tuberculínico se caracteriza pelos níveis elevados de TNF-α dentro das 24 horas após a

elicitação de resposta, o que pode provocar letargia, diminuição da temperatura e até a

morte (REECE et al., 2005). Os camundongos apresentam as vantagens de serem

menores, ocupar menos espaço, não gerar úlceras após a inoculação do PPD e ter-se

ampla informação sobre aspectos imunológicos que podem ser facilmente associados a

resposta de DTH observada em humanos (FAQI, 2013; KUBICA; DUNBAR; KIM,

1973). Diante dessas características, o teste cutâneo mediante a técnica de Mantoux

continua a ser usado no camundongo principalmente para conferir ou complementar a

avaliação de respostas de tipo Th1 (OBIEGLO et al., 2016; REECE et al., 2005;

WANG Y. et al., 2016). Porém os locais de inoculação, via intradérmica, que podem

ser realizados no coxim plantar ou no pavilhão da orelha apresentam dificuldades de

inoculação. As duas vias de inoculação necessitam de uma pessoa treinada para evitar

grande variabilidade na técnica, além da necessidade de anestesia quando o pavilhão

da orelha for o local de escolha (ALLEN, 2013).

1.5 Desenvolvimento de testes cutâneos para o diagnóstico de Tuberculose

A procura de biomarcadores mais específicos e econômicos no diagnóstico de

TB latente continua sendo relevante (ARINAMINPATHY; DOWDY, 2015).

Considerando que a PT induz uma reação de DTH, os antígenos do bacilo que possam

estar envolvidos na imunidade celular podem ser promissores para substituir o PPD, o

reagente usado na PT (MÅLEN; SØFTELAND; WIKER, 2008).

Tendo em vista os problemas de especificidade da PT com o uso do PPD

quando os indivíduos são vacinados com a BCG ou apresentam exposição a MNTs, os

antígenos candidatos promissores são aqueles ausentes tanto na BCG como nas MNTs.

O ESAT-6, é um dos antígenos mais importantes na virulência das micobactérias,

localizado na região de diferenciação (RD) 1, o qual na forma de proteína

recombinante conseguiu induzir uma reação de DTH positiva comparável ao PPD em

cobaias (MORADI et al., 2015). No mesmo modelo, quando usado o ESAT-6

associado ao CFP-10, observou-se associação indireta do tamanho da induração e a

sobrevivência dos animais, quanto menor a induração maior a sobrevida

(WELDINGH; ANDERSEN, 2008). Porém, o uso do CFP-10 de forma individual

22

apresentou a desvantagem de provocar choque tuberculínico sem desenvolver a reação

de DTH (REECE et al., 2005).

Outra fonte importante de candidatos para substituir o PPD, são os antígenos

do próprio PPD. Cho e colaboradores, identificaram o conteúdo do PPD em nível

proteômico, observando algumas proteínas de forma abundante, as chaperonas DnaK,

GroEL2, GroES e HspX (CHO et al., 2012). Essas proteínas de forma individual e em

coquetel foram aplicadas em teste cutâneo em cobaias. Como foi possível observar que

de forma individual não conseguiu induzir DTH, as proteínas foram utilizadas em

coquetel. Assim, os coqueteis DnaK+GroEL2+Rv0009 e DnaK+GroEL2+Rv0685

induziram uma reação de DTH comparável ao PPD (YANG et al., 2011). Assim

também, diferentes antígenos em coquetel vêm sendo avaliados. Usando o coquetel de

CFP-10+ESAT-6+MPT64 para o teste cutâneo em cobaias infectadas com Mtb

inativado (STAVRI et al., 2012) ou o coquetel ESAT-6+CFP-

10+TB10.3+TB10.4+MTSP11+MPT70+MPT83 (MALAGHINI et al., 2011),

observa-se uma reação de DTH similar ou melhor que a gerada pelo PPD, o que não

foi observado quando as proteínas recombinantes foram usadas individualmente

(MALAGHINI et al., 2011; STAVRI et al., 2012). Além disso, o uso de coquetel a

partir de peptídeos (P1+P8) de uma proteína como o ESAT-6, também apresentaram

vantagens frente ao uso da proteína recombinante de forma individual (ELHAY;

OETTINGER; ANDERSEN, 1998).

Além de aplicar a PT nos humanos, para os bovinos o teste cutâneo é parte da

triagem básica de diagnóstico de M. bovis, e algumas proteínas avaliadas apresentam

semelhança genética ao M. tuberculosis, o que pode ser de utilidade na avaliação de

novas formulações de um PPD em humanos. O uso de CFP-10+ESAT-6+TB10.4 e

CFP-10+ESAT-6+Rv3872+MPT63, apresentaram uma reação de DTH específica

(XIN et al., 2013). Outros dois coquetéis (C1: ESAT-6+CFP-10+MPB83 e C2: ESAT-

6+CFP-10+MPB83+TB10.3+HspX+MPB70) avaliados no teste cutâneo em cobaias e

gado, apresentaram melhor resultado com adição de antígenos imunodominantes do

PPD-B (CFP2, FixB, PepA). Dessa forma, para o reconhecimento de infecção por M.

bovis em bovinos, o C1 obteve uma reação de DTH específica, e quando acrescentado

o FixB, além de específico apresentou maior sensibilidade quando comparado ao PPD

convencional (MON et al., 2014). Diante da vantagem do uso de proteínas em

coquetel, também foi produzida uma proteína de fusão (ESAT-6_CFP-

23

10_Rv3615c_Rv3020c) em beads, o que aumentou a sensibilidade do teste para

bovinos infectados com M. bovis (PARLANE et al., 2016).

Concluindo, as proteínas recombinantes são de produção fácil, qualidade

controlada (CASAL et al., 2012; MALAGHINI et al., 2011) e apresentam a

possibilidade de aumentar sua sensibilidade (PARLANE et al., 2016).

1.6 Proteínas de fusão rCMX e rECMX

As proteínas de fusão rCMX e rECMX, foram construídas previamente por

nosso grupo, a parceria do Laboratório de Imunopatologia e Doenças Infecciosas, e

Laboratório de Bacteriologia Molecular. Ambos do Instituto de Medicina Tropical e

Saúde Pública (IPTSP), UFG.

A rCMX foi produzida a partir de sequências do Ag85C (Rv0129c), MPT51

(Rv3803c) e a sequência completa do HspX (Rv2031c), as quais foram amplificadas

do genoma do Mtb H37Rv para obtenção da proteína de fusão de ~32 kDa (DE

SOUSA et al., 2012).

O complexo Ag85 é uma família de três proteínas (Ag85A, Ag85B e Ag85C),

as quais são as proteínas mais abundantes na cultura do Mtb, essenciais na

sobrevivência do bacilo nos Mφs, consideradas como um importante fator de

virulência (HUYGEN, 2014; SUNDAR et al., 2015). Estas proteínas possuem

atividade micolil transferase, e são responsáveis pela formação da trealose dimicolato

(TDM) e trealose monomicolato (TMM), glicolipídeos da parede do Mtb que não são

sintetizados pelo hospedeiro (HUYGEN, 2014; WIKER; HARBOE, 1992). Foi

proposto que o complexo Ag85 é reconhecido pela lectina ligadora de manose (MBL)

e mais fortemente por ficolinas (tipo 1 e 3) (ŚWIERZKO et al., 2016), e se liga a

domínios de elastina e tropoelastina (componentes do tecido pulmonar) o que

facilitaria a entrada do bacilo (KUO et al., 2013). Além disso, observa-se a interação

do complexo Ag85 com a proteína HupB, a qual está presente na cultura anaeróbica de

Mtb e na TB latente (SUNDAR et al., 2015).

O MPT-51 ou Ag85D, é 40% idêntico ao complexo Ag85, e se caracteriza por

estar em maior quantidade no complexo Mycobacterium, incluindo o Mycobacterium

tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae e Mycobacterium avium. O

antígeno, pode estar envolvido na ligação de hidratos de carbono e fibronectina

(WILSON et al., 2004) e na reciclagem de trealose (SUNDAR et al., 2015). Quando

usado em diagnóstico, o MPT51 consegue ser reconhecido por anticorpos IgM de

24

pacientes com TB ativa em população endêmica (MELO CARDOSO ALMEIDA et

al., 2008).

O HspX ou Rv2031c, é induzido em condições de estrese como: hipóxia, altas

concentrações de óxido nítrico, baixa concentração de ferro, baixo pH, etc. O gene

HspX que codifica a proteína, está entre os 48 genes mais abundantes expressos na

fase de latência da TB (SINGH; SARAAV; SHARMA, 2014; SMITH, 2003). A partir

de analise in silico, o HspX agiria como chaperona interagindo com a proteína DnaK

(Rv0350), ambas participando na manutenção da estrutura do Mtb em condições de

estresse (MUSHTAQ et al., 2015).

Diante da importância de cada proteína utilizada na construção da rCMX. De

Sousa e colaboradores (2012) avaliaram a imunogenicidade da proteína in vivo.

Quando camundongos BALB/c foram imunizados com a rCMX e CpG DNA em

lipossomas, foi possível observar que a rCMX conseguiu induzir mais LT CD4+IFN-γ+

e TNF-α+, em comparação ao grupo controle salina. Além disso, os camundongos

imunizados apresentaram anticorpos IgG específicos para rCMX. Da mesma forma, a

rCMX, usada em ELISA, conseguiu discriminar pacientes com TB ativa de controles

saudáveis, a partir dos níveis de anticorpos IgG (Sensibilidade: 92,45%,

Especificidade: 71,79%) e IgM (Sensibilidade: 80%, Especificidade: 61,54%)(DE

SOUSA et al., 2012). Tendo em vista que a rCMX induziu uma resposta celular e

humoral específica, foi proposto seu uso em diferentes modelos vacinais. Quando a

rCMX foi expressa por M. smegmatis, uma micobactéria de crescimento rápido

denominou mc2-CMX. Em camundongos vacinados com a mc2-CMX, foi induzida

uma resposta humoral IgG2a e IgG1 maior em comparação ao controle salina. Assim

também, as células do baço e pulmões de camundongos vacinados, foram capazes de

induzir mais LT CD4+ e LT CD8+ produtores de IFN-γ, IL-17, TNF-α e IL-12, em

comparação ao grupo controle salina (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013). Ante a

resposta humoral e celular induzidas com a mc2-CMX, esse modelo vacinal foi

comparado com a BCG, onde a mc2-CMX apresentou redução na lesão pulmonar e

inflamação provocada pela infecção, tanto quanto a BCG (OLIVEIRA et al., 2016).

No entanto, a vacina mc2-CMX quando aplicada em bovinos, não foi capaz de induzir

LT CD4+ específicos para rCMX e provocou hiperplasia folicular nos linfonodos

cervicais, mas não interferiu com a PT (ALVES et al., 2014). Outra forma de melhorar

o uso da rCMX em um modelo vacinal, consistiu na construção de uma BCG

recombinante, a rBCG-CMX. Da Costa e colaboradores (2014), avaliaram Mφs

25

peritoneais infectados com a rBCG-CMX in vitro, os quais apresentaram maior

quantidade de bacilos fagocitados que os infectados com BCG, mas níveis de óxido

nítrico similares entre ambos. Após 30 dias da imunização, a rBCG-CMX induziu

maior número de LT CD4+IFN-γ+ e IL-17+, que a BCG. Além disso, conseguiu a

redução da extensão das lesões pulmonares e carga bacilar em comparação aos

vacinados com BCG (DA COSTA et al., 2014). Para melhorar o entendimento da

resposta imune inata induzida frente a rBCG-CMX, Mφs de diferentes tipos

(pulmonares, peritoneais, alveolares e derivados de medula óssea de camundongos),

foram estimuladas com os antígenos que compõem a rCMX, a rBCG-CMX e a BCG

como controle. Reconhecendo que os Mφs têm função pró-inflamatória (M1) ao

produzir oxido nítrico (NO), ou anti-inflamatória (M2) ao produzir ureia. Se observou

que todos os tipos de Mφs produziram elevados níveis de NO e ureia frente a rCMX,

elevados níveis de ureia (M2) frente a rBCG-CMX e elevados níveis de NO (M1)

quando utilizada a BCG como controle (DA COSTA et al., 2016). Da análise dos

modelos vacinais utilizando rCMX, Oliveira e colaboradores observaram que células

pulmonares de camundongos infectados reconhecem a proteína recombinante

(OLIVEIRA et al., 2016), fato importante para seu uso na indução de DTH em nosso

estudo.

Outra proteína promissora desenvolvida por nosso grupo é a rECMX,

produzida a partir da ligação da rCMX (Ag85C_MPT51_HspX) e a sequência

completa da ESAT-6 com o intuito de melhorar a imunogenicidade. O gene que

codifica a ESAT-6 foi fusionada a rCMX mediante clonagem heteróloga, de gene

inserido em plasmídeo pET23a e expresso em células competentes de E.coli

BL21(DE3)(pLysS) (BEILNER, 2015; patente depositada).

A ESAT-6, é uma proteína codificada pelo gene ESAT-6, o qual está

localizado na região de diferenciação 1 (RD1) e está presente em cepas do

Mycobacterium como M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M.

marinum, M. szulgai e M. flavescens (GANGULY; SIDDIQUI; SHARMA, 2008). O

gene produz o fator de virulência mais importante para o Mtb, a proteína de 6 kDa

(ESAT-6), a qual interage com linfócitos, Mφs e DCs. Assim, na fase inicial da TB, a

ESAT-6 é o alvo mais importante da resposta imune celular em humanos e

camundongos (BRODIN et al., 2004). Em 90% dos pacientes com TB ativa e em

todos aqueles com escarro positivo, foi identificado a ESAT-6 de forma intracelular

(POULAKIS et al., 2015). E ao ser utilizada como estímulo de DCs do sangue

26

periférico, a ESAT-6, favoreceu a produção de IL-23 e IL-1β induzindo um perfil de

resposta Th17 (WANG et al., 2012). Já em modelo murino, observa-se a interação da

ESAT-6 e os Mφs derivados de medula óssea induzindo a produção de MCP-1, a qual

é importante na patogenia da TB, isso de forma dose dependente e melhorada na

presença de IL-4 (MA et al., 2016).

Diante da capacidade imunogênica da rCMX e rECMX, e as limitações da

prova tuberculínica, o estudo visa a possibilidade de avaliar essas proteínas

recombinantes em camundongos infectados com Mtb na sua capacidade de induzir

uma resposta imune celular específica que possa ser utilizada na reação de

hipersensibilidade do tipo tardia observada na prova tuberculínica.

27

2 JUSTIFICATIVA

A doença infectocontagiosa que causa mais mortes no mundo é a Tuberculose,

superando ao HIV (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). As pessoas

saudáveis conseguem conter a infecção, e cerca de 90-95% mantém a doença na sua

forma de latência consequentemente somente 5-10% dos indivíduos desenvolvem a

doença na sua forma ativa (PAI et al., 2016; PICCINI et al., 2014). Cerca de 1/3 da

população mundial apresenta TB latente, portanto a identificação e o tratamento

preventivo de indivíduos com TB latente são cruciais para o controle da tuberculose.

Por muitos anos, a PT foi utilizada na identificação dos casos de TB latente. No

entanto, a OMS sugeriu a descontinuidade de seu uso devido aos diversos resultados

falsos positivos em indivíduos vacinados com BCG a menos de 5-10 anos (SEDDON

et al., 2016) ou indivíduos expostos a MNTs. E também pelo fato de apresentar

resultados falsos negativos quando utilizada em indivíduos imunossuprimidos

(GONZÁLEZ-MARTÍN et al., 2010). O IGRA (ensaio de liberação de IFN-γ)

melhorou a falta de especificidade da PT utilizando os antígenos ESAT-6 e CFP-10, os

quais estão ausentes na vacina BCG e em algumas MNT (GANGULY; SIDDIQUI;

SHARMA, 2008; WHITWORTH et al., 2013). Entretanto, o alto custo e maior

complexidade para a sua realização, limita seu uso. Desde que o IGRA foi aprovado

para uso comercial, em 2011, outras limitações vêm sendo observadas. Observa-se por

exemplo: falta de reprodutibilidade entre as diferentes versões do IGRA, tempo maior

de conversão de negativo para positivo em comparação a PT, alguns casos de reversão

de positivo a negativo, e a limitação de uso em populações com alta incidência de TB

(JONES-LÓPEZ et al., 2015; RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2014).

Nosso grupo construiu duas proteínas com antígenos imunodominantes do

Mtb, a rCMX (Ag85C_MPT-51_HspX) (DE SOUSA et al., 2012) e a rECMX (ESAT-

6_rCMX) (BEILNER, 2015). A rCMX vêm sendo avaliada como parte de

formulações vacinais assim como em ensaios de ELISA indireto para o diagnóstico de

TB ativa (DA COSTA et al., 2014; DE SOUSA et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2016).

Durante as avaliações, observou-se que tanto os animais infectados com Mtb quanto o

soro de indivíduos com tuberculose ativa apresentavam linfócitos ou anticorpos

capazes de reconhecer a proteína de fusão recombinante, indicando que a mesma

poderia ser utilizada no diagnóstico da TB (OLIVEIRA et al., 2016). No caso da

rECMX que contêm a rCMX ligada a proteína ESAT-6 (BEILNER, 2015), acredita-se

28

que o reconhecimento pelas células e moléculas do sistema imune também ocorreriam

e portanto poderia melhorar a resposta obtida pela rCMX. Neste trabalho

hipotetizamos que as proteínas recombinantes rCMX e rECMX poderiam ser

utilizadas em teste cutâneo para o diagnóstico de Tuberculose.

29

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar a resposta imune celular específica anti-rCMX e anti-rECMX, e

sua capacidade de gerar uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia

(DTH) em camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis.

3.2 Objetivos específicos

Avaliar a resposta imune celular específica anti-rCMX nos pulmões,

baço e linfonodos drenantes de camundongos BALB/c infectados com

Mycobacterium tuberculosis.

Avaliar a resposta imune celular específica anti-rECMX nos pulmões,

baço e linfonodos drenantes de camundongos BALB/c infectados com

Mycobacterium tuberculosis.

Avaliar a capacidade da proteína rCMX de gerar uma reação de

hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos BALB/c

infectados Mycobacterium tuberculosis.

Avaliar a capacidade da proteína rECMX de gerar uma reação de

hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos BALB/c

infectados Mycobacterium tuberculosis.

30

4 METODOLOGIA

4.1 Delineamento do estudo

O estudo utilizou 42 animais distribuídos em grupos de 6 animais cada, com

repetição dos experimentos sendo um total de 84 animais. Em um primeiro momento,

12 animais foram divididos em um grupo salina e infecção (I). Após 45 dias da

infecção (I), os baços, pulmões e linfonodos drenantes foram coletados para avaliação

da resposta imune celular por citometria de fluxo. Em um segundo momento, 30

animais foram utilizados (infecção II). O grupo PPD - controle negativo não foi

infectado com Mtb, enquanto os outros grupos foram infectados. No dia 45 após a

infecção se realizou o teste cutâneo nos grupos: PPD – controle negativo, PPD 2 UT -

controle positivo, rCMX (25µg), rECMX (15µg) e rECMX (25µg). Cada

denominação do grupo referiu-se ao antígeno a ser avaliado e as concentrações

utilizadas foram otimizadas em base a experimentos anteriores. A leitura da espessura

e inchaço induzidos no coxim plantar, foi realizada 24 e 48 horas depois do início do

teste cutâneo. Nos dias 1 e 47 após a infecção (II), três camundongos infectados foram

utilizados para avaliar a carga bacilar nos pulmões (contagem de UFC = unidades

formadoras de colônia). E o baço de um camundongo representativo por grupo foi

coletado para observação macroscópica (Figura 5).

Figura 5 - Delineamento do estudo. Camundongos BALB/c (n=42) entre 6-8 semanas de idade foram

utilizados. A avaliação da resposta imune celular foi feita 45 dias após a infecção (I) mediante

citometria de fluxo de células do baço, pulmões e linfonodos drenantes (LNDs). O teste cutâneo foi

realizado 45 dias após a infecção (II) com leitura da reação as 24 e 48 horas. Nesse último ponto, aos 47

dias após a infecção se comprovou a carga bacilar nos pulmões de camundongos infectados mediante a

contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em condições similares ao 1° dia após infecção. O

baço de um camundongo por grupo experimental foi coletado para observação macroscópica. O

experimento foi repetido duas vezes.

31

4.2 Produção de proteínas rCMX e rECMX

As proteínas rCMX e rECMX utilizadas no estudo foram produzidas

previamente por nosso grupo no Laboratório de Bacteriologia Molecular e

Imunopatologia das Doenças Infecciosas, IPTSP. Para este estudo, a partir de DNA

plasmidial, as proteínas foram produzidas em grande escala. A proteína rCMX está

composta pela sequência parcial dos antígenos imunodominantes do Ag85C e MPT-

51, e a sequência completa do antígeno HspX (DE SOUSA et al., 2012). Enquanto, a

rECMX foi produzida pela adição da sequência codificante do gene ESAT-6 a rCMX

(BEILNER, 2015).

Transformação. A partir do DNA plasmidial codificante para rCMX e

rECMX, a produção dessas proteínas começou pelo processo de transformação. A

transformação bacteriana consiste na inserção do DNA plasmidial em E.coli

competentes, nesse caso mediante eletroporação. Para cada proteína foi realizado um

sistema de transformação. Primeiro, as cubetas do eletroporador foram esterilizados

com álcool 70% e exposição à luz UV antes do uso. Foi utilizada uma cubeta para

cada sistema de transformação, o qual consistiu em 2 µL de DNA plasmidial

codificante da proteína rCMX (Ag85C_MPT-51_HspX) ou rECMX (ESAT-6_CMX)

no vetor de expressão pET23a (Novagen/Biosciences), inseridos em 50 µL de células

competentes de E.coli BL21 (DE3) pLysS. O método de eletroporação de pulsação

(Bio-Rad®) foi realizado nas condições de 2,5KV, 25 µF e 1000Ω. Esse método

permitiu a entrada do DNA plasmidial nas células competentes. Logo, para

restabelecer as membranas destas células, cada sistema de transformação foi inoculado

em 1 mL de meio SOC (extrato de levadura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mM, KCl 2,5

mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, Glicose 20 mM) foi incubado a 37°C durante 1

h sob agitação. Após a incubação, para obter as colônias expressando as proteínas

rCMX ou rECMX, 100 µL de cada sistema transformante foi plaqueado em duplicata

em meio LB (Luria-Bertani) com cloranfenicol (20 µg/mL) e ampicilina (100 µg/mL),

e incubados a 37°C durante 18 h.

Indução da expressão das proteínas recombinantes com IPTG (Isopropyl-

β-D-1-thiogalactopyranoside). Os transformantes isolados foram selecionados para

prosseguir com a indução com IPTG. Foram preparadas duas placas de meio LB para

cada sistema de transformação, seguindo a ordem de uma gride. Uma placa com meio

LB e antibióticos (cloranfenicol 20 µg/mL e ampicilina 100 µg/mL) e a outra com

meio LB, antibióticos e IPTG (400 µM). O IPTG foi utilizado para induzir a máxima

32

expressão e produção da proteína de cada sistema transformante. Sendo que uma

colônia representa um clone de um sistema transformante, dez colônias isoladas foram

selecionadas e inoculadas em um spot na placa sem IPTG e no spot correspondente na

placa com IPTG. As placas foram incubadas a 37°C durante 18 h.

Preparação do pré-inóculo. Foram escolhidas as colônias da placa sem IPTG

correspondentes às colônias que conseguiram a maior produção de proteína na placa

induzida com IPTG. Para o pré-inóculo, a colônia escolhida foi ressuspendida em

meio LB em caldo com antibióticos (cloranfenicol 20 µg/mL e ampicilina 100

µg/mL), seguido por incubação a 37°C durante 18-24 h sob agitação.

Indução com IPTG. A indução à grande escala foi feita em meio 2YT (1.6%

triptona de peptona, 1% extrato de levadura e 0.5% NaCl) com antibióticos

(cloranfenicol 20 µg/mL e ampicilina 100 µg/mL). Foi colocado 5 mL do pré-inóculo

em 500 mL de meio LB com antibióticos incubados a 37°C sob agitação até o

crescimento bacteriano atingir uma O.D.600 de 0.4-0.6. Após essa incubação,

acrescentou-se o IPTG (400 µM) e se incubou novamente a 37°C durante 4 h sob

agitação.

Coleta da proteína. Os 500 mL de meio LB contendo as bactérias produtoras

das proteínas induzidas, foram centrifugados continuamente em alíquotas de 50 mL.

Cada centrifugação a 5000 rpm durante 10 minutos a 4°C foi repetida até obter um

sedimento único, contendo o concentrado de proteínas. Assim, o sobrenadante foi

descartado e o sedimento armazenado a -20°C até a purificação.

Purificação de proteínas rCMX e rECMX. A purificação das proteínas foi

feita em condições desnaturantes, usando cromatografia de afinidade (Ni-NTA Protein

Purification System – QIAGEM). O tampão de desnaturação (100 mM NaH2PO4, 10

mM Tris base, 8 M ureia), foi utilizado a diferentes pH, com o objetivo de reter a

proteína de interesse pela captura da cauda de histidina, através das partículas de

níquel da coluna de purificação. O tampão de desnaturação com pH 8.0 foi utilizado

como tampão de lise, com pH 6.3 como tampão de lavagem e com pH 4.5 como

tampão de eluição. O pH foi aferido a temperatura ambiente no momento de uso. A

partir do sedimento contendo a proteína de interesse, foram acrescentados 10 mL de

tampão de lise a cada 15 minutos sob agitação durante 2 h, seguida por uma

centrifugação a 10.000 g durante 45 minutos a 22°C. O sobrenadante passou pela

coluna de purificação para obter o filtrado do lisado, logo adicionou-se 4 mL de

tampão de lavagem para obter o filtrado da lavagem 1, mais 4 mL de tampão de

33

lavagem para obter o filtrado da lavagem 2, mais 1 mL de tampão de eluição para

obter o filtrado da eluição 1, e por último, mais 1 mL de tampão de eluição para obter

o filtrado da eluição 2 (Figura 6).

Figura 6 - Esquema de purificação de proteínas mediante cromatografia de afinidade. A proteína

produzida ressuspendida em tampão de desnaturação é o lisado, o qual passa pela coluna de purificação

para obter o filtrado do lisado. O tampão de lavagem (LG) é adicionado duas vezes (lavagem 1 e 2),

seguido pela adição do tampão de eluição (E) por duas vezes (eluição 1 e 2).

A coluna de purificação foi armazenada com metanol 30% a 4°C, e cada

filtrado obtido foi armazenado a -20°C. A fim de conferir a purificação da proteína de

interesse, todas as frações da purificação foram submetidas à corrida eletroforética em

gel de poliacrilamida e duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A partir do filtrado da

eluição 1 (maior concentração da proteína), a concentração das proteínas foi

determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad® Protein Assay) usando albumina

bovina sérica (BSA) como referência. Além disso, realizou-se uma corrida

eletroforética para conferir os pesos moleculares das proteínas rCMX (32 kDa) e

rECMX (42 kDa), utilizando um marcador de peso molecular de 10-225 kDa

(Promega) (Figura 7).

Figura 7 - Gel SDS-PAGE das proteínas rCMX e rECMX. Na primeira coluna se observa o

marcador de peso molecular de 225 kDa, do lado direito dela a proteína rCMX de 32 kDa e na última

coluna a proteína rECMX de 42 kDa.

34

4.3 Animais utilizados

Para o estudo foram utilizados 84 camundongos BALB/c entre 6-8 semanas de

idade, fornecidos pelo Biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

(IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG). Os animais foram mantidos em

micro-isoladores, em condições ad libitum, sob ciclos de luz/escuridão de 12 h, a

temperatura de 20-26°C e humidade relativa de 40-60%. As condições de manutenção

seguiram as orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de

Laboratório (SBCAL/COBEA). O protocolo para este trabalho é parte do projeto

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de

Goiás, com número CEUA 229/11.

4.4 Infecção experimental

A cepa de Mtb foi fornecida pela Universidade Estadual do Colorado

(Colorado State University, Fort Collins, Colorado, Estados Unidos), a qual foi

mantida no meio de cultura Middlebrook 7H9 suplementado com OADC e Tween 80

a 0.05% até a fase de crescimento logarítmico. Alíquotas a -80°C foram armazenadas,

para um mês depois ser plaqueadas em meio de cultura Middlebrook 7H11

suplementado com OADC, e quantificadas. No dia da infecção, o inóculo foi diluído

em PBS-Tween 80 a 0.05%, na concentração indicada (106 UFC/mL). Os animais

foram infectados por via endovenosa por meio do plexo retro orbital com 106 UFC/mL

de suspensão de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, contendo assim 105

UFC/animal. A infecção foi realizada em dois momentos. A infecção I para os grupos

salina e infecção com o objetivo de avaliar a resposta imune celular específica anti-

rCMX e anti-rECMX. E a infecção II para os grupos experimentais submetidos ao

teste cutâneo. Após a infecção, sob o nível de biossegurança três (BL3), os animais

foram mantidos em microisoladores acoplados a rack ventilada.

4.5 Avaliação da resposta imune celular específica anti-rCMX e anti-

rECMX em células de baços, pulmões e linfonodos drenantes de

camundongos infectados com Mtb.

Para avaliar a resposta imune celular específica, após 45 dias da infecção I,

dois grupos, salina e infecção, foram comparados. Os seis animais de cada grupo

foram eutanasiados por deslocamento cervical para coletar o baço, pulmões e

linfonodos drenantes (LNDs). Para obter a suspensão celular do baço, foi feito o

35

homogenato do órgão com meio RPMI (Gibco®, Life Technologies, USA) com ajuda

de uma seringa sob uma peneira de nylon de 70 µm (Corning®). Acrescentou-se uma

solução de lise de eritrócitos (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3) e as células foram

ressuspendidas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de

piruvato (Sigma®, São Paulo), 1% de L-glutamina (LGC Biotecnologia), 1%

penicilina e estreptomicina, e 1% de aminoácidos não essenciais (Sigma®, São Paulo).

Os LNDs seguiram o mesmo processamento das células do baço sem o uso da solução

de lise. Enquanto, os pulmões foram processados em forma de homogenato submetido

à digestão com colagenase III (30 µg/mL, Sigma-Aldrich®) e DNAse IV 1% (30

µg/mL, Sigma-Aldrich®) a 37°C durante 30 minutos, para depois seguir o mesmo

processamento do baço. As suspensões celulares dos órgãos processados foram

submetidas ao teste de viabilidade celular com Trypan blue e ajustadas a 1x106

células/mL.

4.6 Citometria de fluxo

A citometria de fluxo foi realizada para identificar as populações de LT CD4+ e

CD8+ produtores de IFN-γ anti-rCMX e anti-rECMX em camundongos infectados

com Mtb. Depois do processamento dos órgãos, 200 μL de suspensão celular foram

distribuídos em placa de cultura celular de 96 poços (Kasvi K12-096) por cada órgão

coletado. As células foram cultivadas sem estímulo (controle negativo), com ConA a

25 µg/mL (controle positivo), ou com os estímulos rCMX e rECMX (10 µg/mL). Para

promover a estimulação antigênica se acrescentou anti-CD3 (eBioscience®; clone

17A2) e anti-CD28 (eBioscience®; clone 37.51). Logo, as placas foram incubadas a

37°C em estufa de CO2 a 5% durante 4 h. Após este período, foi acrescentado

monensina como inibidor de transporte de proteínas (3 μM; BD Bioscience®), e as

placas foram novamente incubadas durante 6 h. As células foram tratadas com PBS-

azida sódica 0.1% a temperatura ambiente por 30 minutos. Ao término, as placas

foram centrifugadas e as células foram marcadas com anticorpos anti-CD4 FITC (BD

PharmingenTM, clone RM4-5) e anti-CD8a PE (eBioscience®; clone 53-6.7) por 30

minutos. Continuou-se com a permeabilização das células com Perm Fix/Perm Wash

(BD PharMingenTM) e a lavagem com PBS-azida sódica 0,1%. Para identificar a

liberação de IFN-γ as células foram marcadas intracelularmente com anti-IFN-γ APC

(eBioscience®; clone XMG1.2) e anti-IL17 PercP-Cy TM (BD PharMingenTM),

durante 30 minutos. Todas as aquisições foram realizadas com 50.000 eventos por

36

amostra no citômetro de fluxo BD Biosciences FACSVerse (Laboratório Multiusuário

de Cultivo Celular PPGCA/EVZ/UFG) e os dados foram analisados com o software

FlowJo_V10. A análise dos LT gerados após a estimulação antigênica foi selecionada

em base nas características de tamanho (FSC, do inglês "forward scatter") e

granulosidade (SSC, do inglês "side scatter").

4.7 Prova da infecção com Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Para avaliar a reação de DTH, foi feita a infecção (II), a qual foi comprovada

um dia após a infecção. Três camundongos escolhidos aleatoriamente foram

eutanasiados por deslocamento cervical e coletaram-se os pulmões, os quais foram

processados em PBS-Tween 80 a 0.05% para obter o homogenato do tecido. O

homogenato foi plaqueado em meio de cultura Middlebrook 7H11 suplementado com

OADC, e incubado em atmosfera úmida de CO2 5% a 37°C durante 21 dias. Ao

término da incubação, as unidades formadoras de colônias (UFC) foram

contabilizadas. No dia 47 após a infecção, além de realizar o homogenato do tecido

pulmonar, coletou-se o baço de um camundongo representativo por grupo

experimental para observação macroscópica indicativa de infecção.

4.8 Teste cutâneo pela técnica de Mantoux

Depois de 45 dias da infecção (II), deu-se início ao teste cutâneo mediante a

técnica de Mantoux para avaliar a reação de DTH em camundongos infectados com

Mtb. Como controle negativo, um grupo não foi infectado, mas recebeu PPD RT 23

SSI a 2 UT/mL (Statens Serum Institute- Lote n° 1497A) e como controle positivo, um

dos grupos infectados recebeu o mesmo PPD. Os grupos experimentais, que também

foram infectados com Mtb, receberam como antígenos a rCMX 25 µg, rECMX 15 µg

ou a rECMX 25 µg. O teste cutâneo apresenta duas fases: uma primeira fase de

sensibilização considerada como a infecção com Mtb, e uma segunda fase de

elicitação, onde se procura após a inoculação intradérmica de antígenos que

apresentaram previa exposição, uma reação de DTH. A técnica de Mantoux consiste

na inoculação intradérmica de 100 µL do antígeno. No camundongo, a inoculação foi

realizada com uma seringa de tuberculina de 1 mL e agulha de 26 G, no coxim plantar.

O coxim plantar esquerdo recebeu a inoculação do antígeno (PPD, rCMX ou rECMX)

e o coxim plantar direito recebeu a inoculação de PBS. Assim, para avaliar a reação de

DTH, para cada camundongo a diferença entre a leitura entre o coxim plantar esquerdo

37

e direito (Δ), foi realizada para os parâmetros de espessura e inchaço. Essas leituras

foram realizadas com um paquímetro de 15 mm (ZAAS Precision, Paquímetro

analógico 6”) após 24 e 48 horas da inoculação, por duas pessoas diferentes. A reação

de DTH positiva foi definida quando a diferença (Δ) da espessura ou inchaço resultou

maior ou igual ao resultado obtido pelo controle positivo PPD 2 UT.

4.9 Análise estatística

Os resultados da citometria de fluxo após a análise no programa FlowJo,

seguiram a análise no programa GraphPad Prism mediante o teste T Student com pós

teste de Mann-Whitney-Wilconxon para avaliar a heterogeneidade dos dados.

Enquanto, os resultados obtidos a partir do teste cutâneo foram tabulados no programa

Excel e analisados no programa GraphPad Prism. Cada dado foi apresentado pelo

valor ± desvio padrão, seguido pela análise de variança (ANOVA) não paramétrico

com comparações múltiplas e pós-teste de Kruskal-Wallis.

38

5 RESULTADOS

5.1 Resposta imune celular anti-rCMX e anti-rECMX em células do baço,

pulmões e linfonodos drenantes de camundongos infectados com Mtb.

As proteínas rCMX e rECMX foram construídas com sequências parciais ou

completas de antígenos imunodominantes do Mycobacterium tuberculosis. Como

nosso objetivo era avaliar a capacidade dessas proteínas na geração de reação de DTH,

nos perguntamos primeiro se os camundongos infectados com Mtb poderiam

reconhecer de forma específica as proteínas rCMX e rECMX. Após 45 dias de

infecção, os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical para

obtenção do baço, pulmões e linfonodos drenantes. Os órgãos foram processados para

cultura celular e posterior avaliação por citometria de fluxo.

Os valores da média e desvio padrão para cada resposta imune celular

específica são apresentados na Tabela 1. A estratégia de separação de populações

celulares para elaborar os resultados apresentados se baseou no tamanho (FSC, do

inglês "forward scatter") e granulosidade (SSC, do inglês "side scatter"). Dessa forma,

foi selecionada primeiro a população de linfócitos entre 50-100 K de tamanho e 0-50

K de granulosidade, seguida pelas subpopulações com marcação extracelular anti-

CD4+ e anti-CD8+, e a partir de cada uma delas foram consideradas as marcações

intracelulares anti-IFN-γ+ e anti-IL-17+. A estratégia de separação de populações

celulares é mostrada para as células do baço (Figura 8A), pulmões (Figura 8B) e

linfonodos drenantes (Figura 8C).

39

Tabela 1 - Valores da média para cada resposta imune celular específica no baço, pulmões e linfonodos drenantes (LNDs) de camundongos infectados com Mtb.

Valores da média ± desvio padrão para os resultados obtidos por citometria de fluxo de subpopulações de linfócitos T CD4+IFN-γ+, CD8+IFN-γ+, CD4+IL17+ e CD8+IL17+.

São apresentados os valores para o grupo salina e infecção (I) e a diferença significativa entre ambos (*p<0.05).

40

Figura 8A - Estratégia de separação de populações celulares do baço de camundongos infectados

com Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Após a seleção de linfócitos por tamanho (FSC, do inglês

"forward scatter") e granulosidade (SSC, do inglês “side scatter”), se apresenta a seleção de LT CD4+ e

CD8+. Seguida pelas subpopulações produtoras de IFN-γ+ e IL-17+ de uma amostra representativa da

cultura in vitro sem estímulo (salina) e com estímulo (rCMX e rECMX).

41

Figura 8B - Estratégia de separação de populações celulares dos pulmões de camundongos

infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Após a seleção de linfócitos por tamanho e

granulosidade, se apresenta a seleção de LT CD4+ e CD8+. Seguida pelas subpopulações produtoras de

IL-17+ e IFN-γ+ de uma amostra representativa da cultura in vitro sem estímulo (salina) e com estímulo

(rCMX e rECMX).

42

Figura 8C - Estratégia de separação de populações celulares dos linfonodos drenantes de

camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Após a seleção de linfócitos por

tamanho e granulosidade, se apresenta a seleção de LT CD4+ e CD8+. Seguida pelas subpopulações

produtoras de IL-17+ e IFN-γ+ de uma amostra representativa da cultura in vitro sem estímulo (salina) e

com estímulo (rCMX e rECMX).

43

Após a análise foi possível observar que nas células do baço de camundongos

infectados houveram mais LT CD4+IFN-γ+, LT CD8+IFN-γ+ e LT CD8+IL17+ anti-

rCMX, que nas células do grupo salina (Figura 9A, B, D; *p<0.05), no entanto, não

houve aumento dos LT CD4+IL17+ neste órgão (Figura 9 C). As respostas específicas

para rECMX dos linfócitos T CD4+IFN-γ+, T CD4+IL17+ e T CD8+IL17+ também

foram maiores quando comparadas ao grupo salina (Figura 9 E, G, H; *p<0.05), no

entanto diferente da resposta específica ao rCMX os LT CD8+IFN-γ+ anti-rECMX não

estavam aumentados (Figura 9F).

44

Figura 9 - Resposta imune celular induzida no baço após 45 dias da infecção com Mtb em

camundongos BALB/c. Após eutanásia dos camundongos, o baço foi processado e cultivado com a

proteína rCMX 10 µg (A, B, C e D) e rECMX 10 µg (E, F, G, H) para avaliação de linfócitos T (LT)

CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ+ e IL17+. Foram utilizados seis animais por grupo experimental.

Diferença significativa, *p<0.05.

Para avaliar a resposta imune celular anti-rCMX e anti-rECMX, além de

avaliar os órgãos linfóides secundários, uma forma de conferir a resposta efetora dos

LT ativados foi avaliar os pulmões por ser o órgão alvo da infecção. A Figura 10

apresenta a resposta imune celular nos pulmões de animais infectados. Pode ser

45

observado que todas as subpopulações de linfócitos avaliados induzidos pela infecção

com Mtb foram capazes de reconhecer especificamente rCMX e rECMX (LT

CD4+IFN-γ+, LT CD8+IFN-γ+, LT CD4+IL17+ e LT CD8+IL17+; Figura 10; *p<0.05).

Figura 10 - Resposta imune celular induzida nos pulmões, após 45 dias da infecção com Mtb em

camundongos BALB/c. Após eutanásia dos camundongos, os pulmões foram processados e cultivados

com a proteína rCMX 10 µg (A, B, C e D) e rECMX 10 µg (E, F, G, H) para avaliação de linfócitos T

(LT) CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ+ e IL17+. Foram utilizados seis animais por grupo

experimental. Diferença significativa, *p<0,05.

46

A resposta específica dos linfócitos dos linfonodos drenantes estão mostrados

na figura 11. Como pode ser observado os LT CD4+IFN-γ+, LT CD8+IFN-γ+ e LT

CD4+IL17+ apresentam resposta anti-rCMX e anti-rECMX (*p<0.05).

Figura 11 - Resposta imune celular induzida nos linfonodos drenantes após 45 dias da infecção

com Mtb em camundongos BALB/c. Após eutanásia dos camundongos, os linfonodos drenantes

(LNDs) foram processados e cultivados com a proteína rCMX 10 µg (A, B, C e D) e rECMX 10 µg (E,

F, G, H) para avaliação de linfócitos T (LT) CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ+ e IL17+. Foram

utilizados seis animais por grupo experimental. Diferença significativa, *p<0.05.

47

5.2 Reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos

infectados com Mtb.

Uma vez que comprovamos que as proteínas rCMX e rECMX podem ser

reconhecidas pelo sistema imune de camundongos infectados com Mtb, verificamos se

essas proteínas recombinantes tinham capacidade de induzir uma reação de DTH

positiva similar ou melhor que o PPD convencional. Camundongos BALB/c foram

infectados com Mtb e 45 dias depois, iniciou-se o teste cutâneo mediante a técnica de

Mantoux. A figura 12A apresenta a diferença da espessura registrada 24 h após o teste

cutâneo. Apesar de o controle positivo PPD 2UT (animais infectados e realizados o

teste cutâneo; DTH = 0.27±0.02) não ter sido diferente do controle negativo PPD

(animais não infectados e realizados o teste cutâneo; DTH = 0.26±0.02), todos os

animais injetados intradérmicamente com rCMX (25µg; DTH = 0.37±0.02), rECMX

(15µg; DTH = 0.38±0.03) e rECMX (25µg; DTH = 0.62±0.12) induziram uma reação

de DTH positiva. Como mostrado na figura 12, a rECMX quando utilizada a 25µg por

injeção apresentou melhor desempenho na indução de DTH (*p<0.05).

Figura 12 - Leitura da espessura do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados com Mtb

H37Rv após o teste cutâneo. Os dados representam a diferença (Δ) de leitura da espessura entre o

coxim plantar esquerdo (antígeno) e direito (PBS) para cada animal. Uma reação de hipersensibilidade

do tipo tardia (DTH) foi considerada positiva quando a Δ de leitura resultou maior ou igual ao controle

positivo (PPD 2UT). Segundo o antígeno recebido no teste cutâneo, o grupo controle negativo se define

como PPD e os grupos experimentais como rCMX 25 µg, rECMX 15 µg e rECMX 25 µg. 12A. Leitura

da Δ Espessura 24 h após o teste cutâneo. 12B. Leitura da Δ Espessura 48 h após o teste cutâneo. Foram

utilizados seis animais por grupo em dois experimentos independentes. Diferença significativa

(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0,0001).

Já a Figura 12B, apresenta a diferença da espessura registrada 48 h após o teste

cutâneo, em que a leitura do controle positivo PPD 2UT (DTH = 0.23±0.01) foi maior

que o controle negativo PPD (DTH = 0.07±0.01), mesmo assim sem diferença

48

significativa. Nesse ponto, os melhores resultados foram obtidos pelos grupos rCMX

(25µg; DTH = 0.28±0.03) e rECMX (25µg; DTH = 0.5±0.04), os quais mantiveram a

reação de DTH positiva observada às 24 h (*p<0.05).

A Figura 13 apresenta a leitura da diferença (Δ) do inchaço 24 e 48 h após o

teste cutâneo. Na Figura 13A é possível observar que a Δ Inchaço depois de 24h, não

apresentou diferença significativa entre os grupos, no entanto a rECMX (25µg, DTH =

0.71±0.1) induziu uma reação de DTH positiva maior ao controle positivo PPD 2 UT

(0.54±0.04). Na leitura da Δ Inchaço 48h após o teste cutâneo (Figura 13B), foi

possível observar diferença significativa entre os grupos controle negativo PPD (DTH

= 0.05±0) e positivo PPD 2UT (DTH = 0.55±0.05). Quarenta e oito horas após a

injeção intradérmica de rECMX observa-se reação DTH positiva para todas as

concentrações utilizadas.

Figura 13 - Leitura do inchaço do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados com Mtb

H37Rv após o teste cutâneo. Os dados representam a diferença (Δ) de leitura do inchaço entre o coxim

plantar esquerdo (antígeno) e direito (PBS) para cada animal. Uma reação de hipersensibilidade do tipo

tardia (DTH) foi considerada positiva quando a Δ de leitura resultou maior ou igual ao controle positivo

(PPD 2UT). Segundo o antígeno recebido no teste cutâneo, o grupo controle negativo se define como

PPD e os grupos experimentais como rCMX 25 µg, rECMX 15 µg e rECMX 25 µg. 13A. Leitura da Δ

Inchaço 24 h depois do teste cutâneo. 13B. Leitura da Δ Inchaço 48 h depois do teste cutâneo. Foram

utilizados seis animais por grupo em dois experimentos independentes. Diferença significativa

(*p<0.05, ***p<0.001).

49

Quando analisamos a resposta ao longo do tempo observamos que a rECMX

(25µg) induziu uma reação de DTH positiva melhor que os controles e demais grupos

experimentais (Figura 14).

Figura 14 - Leituras de Δ Espessura (14A) e Δ Inchaço (14B) ao longo do tempo. Os grupos se

definem de forma similar aos dados fonte como: controle negativo PPD, controle positivo PPD 2UT, e

grupos experimentais rCMX 25 µg, rECMX 15 µg e rECMX 25 µg.

50

No final do teste cutâneo, um animal representativo de cada grupo

experimental foi eutanasiado para comprovar a infecção a partir da observação

macroscópica do baço, os quais apresentaram esplenomegalia nos grupos infectados

(PPD 2UT, rCMX (25µg), rECMX (15µg) e rECMX (25µg) em comparação ao grupo

controle negativo sem infecção (Figura 15A). Outra forma de comprovar a infecção foi

a partir da carga bacilar encontrada nos pulmões de camundongos infectados no 1° dia

e no 47° após a infecção (Figura 15B).

Figura 15 - Observação macroscópica do baço e carga bacilar nos pulmões de camundongos

infectados com Mtb. No final do teste cutâneo, um camundongo representativo de cada grupo

experimental foi eutanasiado e o baço coletado. 15A. Observa-se de esquerda à direita os grupos:

controle negativo PPD (sem infecção), controle positivo PPD 2UT, rCMX 25µg, rECMX 15µg e

rECMX 25µg. 15B. Os pulmões de camundongos infectados foram coletados no 1° dia e no 47° dia

após a infecção com Mtb. A carga bacilar é apresentada em Log10.

51

6 DISCUSSÃO

A técnica de Mantoux é uma técnica de imunorreação, que avalia a

hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) frente à inoculação intradérmica de um

antígeno. A aplicação mais conhecida é a prova tuberculínica (PT), que junto ao ensaio

de liberação de IFN-γ (IGRA), são os dois únicos testes disponíveis na identificação

de TB latente. Neste estudo, avaliamos se a infecção com Mtb induz uma resposta

celular capaz de reconhecer as duas proteínas recombinantes construídas por nosso

grupo, a rCMX (Ag85C_MPT-51_HspX) (DE SOUSA et al., 2012) e a rECMX

(ESAT-6_CMX) (BEILNER, 2015), para sua avaliação posterior na capacidade de

gerar uma reação de DTH positiva. Certamente, os camundongos infectados com Mtb

conseguiram responder ante as proteínas recombinantes, que quando usadas no teste

cutâneo, induziram uma reação de DTH positiva comparável, e no caso da rECMX,

melhor que o PPD convencional.

Sabendo que o diagnóstico de TB latente não possui um teste de referência, o

uso do IGRA foi recomendado para substituir ou auxiliar a PT. Todavia, diversas

questões foram originadas sobre as desvantagens do IGRA e a concordância entre

esses dois testes. Assim, observa-se discordância TST/IGRA (15-21%) em contatos de

TB ativa (JONES-LÓPEZ et al., 2015; RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2014), o tempo

mais demorado para obter um resultado de IGRA (4-22 semanas) positivo em

comparação a PT (2-12 semanas), problemas de reprodutibilidade e casos de reversão

de positivo para negativo. No início, o uso do IGRA foi justificado por melhorar a

especificidade em comparação a PT, dessa forma, indivíduos vacinados com BCG

recentemente ou expostos a micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) não

seriam parte dos resultados falsos positivos. Porém, o alto custo do IGRA e a

complexidade necessária para realizá-lo, limitou seu uso em populações de renda alta.

Consequentemente, as avaliações do IGRA eram limitadas em populações com rendas

baixa e média, onde se apresenta alta incidência de TB. Atualmente, se sabe que o

IGRA não supera a sensibilidade da PT nestas populações (AUGUSTE et al., 2016;

JONES-LÓPEZ et al., 2015), e ainda a PT poderia ser utilizado nesses casos

(SHARMA et al., 2017). No entanto, o PPD já não é produzido comercialmente e

antígenos que possam substituí-lo vem sendo avaliados, sendo o único que atingiu

ensaios clínicos em humanos, o antígeno composto por ESAT-6 e CFP-10

(AGGERBECK et al., 2013).

52

A resposta celular anti-rCMX e anti-rECMX gerada pela infecção de

camundongos com Mtb foram avaliadas em baço, pulmões e linfonodos drenantes.

Ressaltando a importância das subpopulações Th1 e Th17 ao serem encontradas na

resposta em humanos e camundongos frente ao Mtb (BEAMER; TURNER, 2005;

O’GARRA et al., 2013; SERBINA; FLYNN, 1999). Apesar das proteínas

recombinantes não serem produzidas naturalmente pelo Mtb, tanto a rCMX como a

rECMX, foram reconhecidas pelo sistema imune de camundongos infectados com

Mtb. Esse resultado era esperado, uma vez que os antígenos liberados pelo Mtb são

importantes na geração de resposta imune celular, como acontece com os componentes

da rCMX, o complexo Ag85C e o MPT-51 são abundantes na cultura do Mtb

(HUYGEN, 2014; SUNDAR et al., 2015) e o HspX o mais abundante na fase de

latência (SINGH; SARAAV; SHARMA, 2014; SMITH, 2003). Além disso, Oliveira e

colaboradores (2016) observaram que células pulmonares de camundongos infectados

com Mtb reconheceram a rCMX (OLIVEIRA et al., 2016).

Já no caso da rECMX, podemos ressaltar que houve mais linfócitos CD4 e

principalmente CD8 produtores de IFN-γ específicos para rECMX, em comparação a

rCMX (Figura 10). Entre as duas proteínas recombinantes, a diferença está na

presença do antígeno ESAT-6, o qual tem sido reconhecido por células pulmonares de

camundongos infectados com Mtb (JUNG et al., 2005) e além do mais esse antígeno

está presente em todas as fases da TB (WINSLOW et al., 2008), esses fatos

explicariam a maior resposta obtida de células específicas para rECMX em

comparação à rCMX. Uma vez que as proteínas recombinantes foram reconhecidas em

nosso modelo murino de infecção com Mtb, pensando na aplicação delas em um teste

cutâneo para humanos, já alguns componentes das proteínas, como HspX e MPT-51,

têm sido reconhecidas por linfócitos de pacientes com TB (SILVA et al., 2014b;

DEENADAYALAN et al., 2013).

A resposta celular específica para rCMX e rECMX foi encontrada de forma

significativa em nosso estudo. Quando o teste cutâneo avaliou a reação de DTH

mediante a leitura da espessura e do inchaço no local de inoculação, as proteínas

recombinantes, induziram uma reação de DTH positiva comparável ao PPD. Assim, a

resposta celular obtida concorda com a reação de DTH, a qual se caracteriza pelo

recrutamento de células e de citocinas pró-inflamatórias liberadas no local de

inoculação, principalmente de linfócitos Th1 IFN-γ+ (VUKMANOVIC-STEJIC et al.,

2006). A reação de DTH positiva ocorre entre 24-48 horas após o teste cutâneo como

53

foi apresentado por outros autores (ALLEN, 2013; OBIEGLO et al., 2016). Já a forma

de avaliação precisa ser esclarecida. A espessura utiliza-se na avaliação de inflamação

diante diversos agentes como lesão por Leishmania (DE LIMA et al., 2014) ou artrite

reumatoide induzida (JUNG et al., 2015), mas também foi utilizado para avaliar a

reação de DTH (FEUERER et al., 2006). Outros autores, não diferenciam entre a

espessura e o inchaço (SMITH; WHITE, 2010). Já o inchaço, avaliado de forma

individual, considera-se como o líquido liberado pela reação de DTH (PONTON,

1983) e é o padrão de leitura para a maioria das avaliações de reação de DTH induzida

em coxim plantar de camundongos (GHOSH; GUPTA; ORTIZ-ORTIZ, 2000;

SMITHEY et al., 2015).

Da mesma forma, nossos resultados sugerem que a melhor avaliação ocorre a

partir da leitura do inchaço, uma vez que a resposta de DTH positiva induzida pela

rCMX e rECMX é mantida ao longo do tempo de avaliação (24-48 h após o teste

cutâneo). Além disso, observou-se que 48 h após o teste cutâneo já é possível

diferençar de forma significativa o resultado obtido entre os camundongos não

infectados que receberam o PPD (controle negativo) e os camundongos infectados que

também receberam PPD (controle positivo) (Figura 13).

Como apresentado na Figura 14, a reação de DTH positiva induzida pela

rECMX (25µg) supera o PPD 2UT (controle positivo), nas formas de avaliação de

espessura e inchaço, ao longo do tempo (24-48 h). Além disso, esses dados sugerem

que a rECMX apresenta uma resposta dose-dependente. Quando a ESAT-6 foi

utilizada para estimular Mφs derivados de medula óssea de camundongos, observou-se

a produção de MCP-1 de forma dose-dependente com o máximo de resposta 24 h após

a estimulação e uma diminuição significativa às 48h (MA et al., 2016). No entanto, a

resposta dose-dependente não é definitiva e pode ser independente da concentração

(DISIS et al., 2004). Sendo ou não dose-dependente, não poderíamos ter certeza da

concentração ótima em nosso modelo sem um teste de potência que possa avaliá-la. O

teste de potência avalia a concentração ótima do antígeno a diferentes diluições

quando comparado ao reagente de referência (PPD), como é frequentemente utilizado

em outros modelos animais, como cobaias (MON et al., 2014; MORADI et al., 2015).

As limitações encontradas no estudo relacionam-se ao modelo animal utilizado

na avaliação da reação de DTH, desde o lugar de aplicação, o volume do antígeno e a

leitura da espessura ou inchaço (FAQI, 2013; KUBICA; DUNBAR; KIM, 1973). O

protocolo de avaliação da reação de DTH em camundongos utiliza o mesmo antígeno

54

na sensibilização e elicitação da resposta (ALLEN, 2013), diferente de nosso modelo,

onde a infecção por via endovenosa com Mtb representou a sensibilização e o teste

cutâneo intradérmico, a elicitação da resposta. Por esse motivo, para reproduzir em

nosso modelo, a reposta em humanos, foi avaliado o teste cutâneo 45 dias após a

infecção, como já foi realizado em camundongos para avaliação de linfócitos de

memória tipo CD4 para KLH/OVA ou CD8 para poxvírus (SMITHEY et al., 2015).

O coxim plantar de camundongos é um dos locais recomendados para avaliar a

reação de DTH. O volume recomendado a ser utilizado em inoculações via

intradérmica em camundongos é de até 50 µL (ALLEN, 2013), volume que foi maior

no caso do estudo para conseguir avaliar de forma comparativa os grupos

experimentais e o PPD convencional. Enquanto à leitura, esta varia entre espessura e

inchaço, às vezes, sem ter diferença entre um ou outro parâmetro (GHOSH; GUPTA;

ORTIZ-ORTIZ, 2000; SMITH; WHITE, 2010; SMITHEY et al., 2015). Por esse

motivo, foram avaliadas a espessura e o inchaço, por duas pessoas diferentes. As

concentrações utilizadas de antígenos variam amplamente desde 1 µg/mL até 1 mg/mL

(MARASSI et al., 2011; MON et al., 2014). No caso do camundongo, é limitado

avaliar a concentração certa a utilizar, devido a quantidade de animais que seriam

necessários. A diferença de outros modelos de animais, onde mais de uma reação de

DTH pode ser avaliada.

O uso de proteínas recombinantes tem a vantagem de uma produção controlada

e de qualidade em comparação ao PPD (MALAGHINI et al., 2011; STAVRI et al.,

2012). Como perspectivas, outros sistemas de produção dessas proteínas

recombinantes podem ser avaliados, a concentração pode ser otimizada e a eficácia

testada em outros modelos animais. Dessa forma, as proteínas recombinantes, rCMX e

rECMX, são propostas como candidatas para substituir o PPD, principalmente usando

a rECMX a 25 µg, diante da sua capacidade de induzir uma reação de DTH positiva,

maior que a observada com o PPD convencional.

55

7 CONCLUSÕES

As proteínas rCMX e rECMX, foram reconhecidas por células do baço,

pulmões e linfonodos drenantes de camundongos BALB/c infectados com

Mycobacterium tuberculosis, e quando utilizadas no teste cutâneo, conseguiram

induzir uma resposta de DTH positiva comparável ao PPD, e superior ao PPD quando

usada a rECMX 25µg. Indicando que as proteínas recombinantes avaliadas, poderiam

ser candidatas na substituição do PPD da Prova Tuberculínica animal ou humana.

56

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68

ANEXOS

Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética

69

70

71

72

73

Anexo 2 – Comprovante do artigo a ser submetido

Artigo - Development of recombinant fusion proteins to substitute PPD in the

tuberculin skin test

Autores - Tatiana Marlene Galvez Sánchez1, Adeliane Castro da Costa1, Monalisa

Martins Trentini 1, André Kipnis 2 and Ana Paula Junqueira Kipnis 1,2

Submissão - Journal Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.

We present the manuscript entitled “Development of recombinant fusion proteins to

replace PPD in the tuberculin skin test” with interest to publicate as basic research in

Journal Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.

Considering latent TB responsible of transmission focus of TB disease, to identify

these 1/3 of the population is relevant but limited in diagnosis with only TST and

IGRA as commercial test. We believe that an improvement on TST based on antigens

of Mtb could be favorable to apply this test in low income populations where high TB

burden is present and limited to IGRA. For this reason, this work evaluated

recombinant fusion proteins containing immunodominant antigens of Mtb in the aim

of generate a new TST in murine model.

We also declare that this information is part of original research without previous

publication and agreement with all authors.

74

Running title: Recombinant proteins CMX/ECMX in mice skin test

Title: Development of recombinant fusion proteins to substitute PPD in the

tuberculin skin test

Tatiana Marlene Galvez Sánchez1, Adeliane Castro da Costa1, Monalisa Martins

Trentini 1, André Kipnis 2 and Ana Paula Junqueira Kipnis 1,2 1Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas, Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil. 2Laboratório de Bacteriologia Molecular, Instituto de Patologia Tropical e Saúde

Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil.

*Corresponding address: Rua 235, S/N. Laboratório de Imunopatologia das Doenças

Infecciosas, sala 325. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Universidade

Federal de Goiás. Setor Universitário, Goiânia- Goiás, Brazil. CEP 74605-050. Phone:

+556232096174; Fax: +55 62 32096363; E-mail: apkipnis@gmail.com.

BACKGROUND: Latent tuberculosis infection (LTBI) could be identified by

tuberculin skin test (TST) or interferon gamma release (IGRA) assay, both with

limitations and lack of gold standar reference to be compared. OBJECTIVES: We

propose to evaluate the fusion proteins rCMX and rECMX in a tuberculin skin test

using the murine model of infection. METHODS: First, we evaluated if T

lymphocytes from BALB/c mice infected with Mycobacterium tuberculosis (Mtb) was

able to recognize the recombinant fusion proteins rCMX and rECMX. Second, we

evaluated the capacity of these recombinant fusion proteins to induce delayed

hypersensitivity (DTH) response in mice infected with Mtb. FINDINGS: CD4+IFN-γ+

and CD8+IFN-γ+ T lymphocytes of spleens, lungs and draining lymph nodes from

infected mice recognized specifically rCMX and rECMX. Skin test performed by

Mantoux technique using rCMX and rECMX, in the footpad, showed a positive DTH

response from infected mice when compared to the response elicited to unifected mice

that received PPD 2UT. The best results were obtained using 25 µg of rECMX at 24 h

and 15-25 µg of rECMX at 48 h pos skin test from footpad swelling evaluation.

MAIN CONCLUSIONS: These findings suggest that rCMX and rECMX could be

further tested as a component of the tuberculosis skin test.

Key words: Skin test, Delayed hypersensitivity, Mycobacterium tuberculosis, animal

model.

Sponsorships: This study received financial support from CNPq - Projeto Universal

(Edital MCT/CNPq Nº 14/2011) and Ana Paula Junqueira-Kipnis received a

productivity fellow from CNPq.