UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO

Caracterização fenotípica e molecular de Acinetobacter baumannii isolados de pacientes de UTIs de Goiânia, com relação à capacidade de formar biofilmes e resistência aos

carbapenêmicos

Goiânia 2013

ii

SUELLEN ROCHA ARAÚJO CASTILHO

Caracterização fenotípica e molecular de Acinetobacter baumannii isolados de pacientes de UTIs de Goiânia, com relação à capacidade de formar biofilmes e resistência aos

carbapenêmicos

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública.

Orientador: Prof. Dr. André Kipnis

Goiânia 2013

iii

iv

DEDICATÓRIA

Ao meu esposo Alexandre, pelo carinho, paciência, compreensão e apoio.

Aos meus pais, Péricles e Suelma, por todo amor a mim dedicado.

Amo vocês!

v

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me capacitar diante de todas as dificuldades enfrentadas e por me

fortalecer a cada manhã. Sei que Ele esteve atento às minhas orações e a Sua resposta se

concretiza com esta grande vitória! “Espera no Senhor, anima-te, e Ele fortalecerá o teu

coração; espera, pois, no Senhor.”

Ao meu esposo Alexandre, que em todo o tempo me apoiou, compreendeu e me

aconselhou, mesmo quando era o principal alvo, e muitas vezes o único, dos meus

surtos e crises de nervosismo e desespero, de modo que por vezes acabou por renunciar

a si mesmo. Não há como mensurar o meu amor, respeito e carinho por você!

Aos meus pais, Péricles e Suelma, que sempre acreditaram em mim. Por vezes vi

as lutas que enfrentaram para garantir minha educação e ajudar na formação da pessoa

que me tornei. Devo minha vida a vocês!

À minha querida irmã Suelenne e meu cunhado Uadson, pelos momentos de

descontração que me proporcionaram e por me deixarem fazer parte da vida de uma

princesa chamada Alice. Amo vocês!

À minha sogra Joasira, por fazer de pequenos instantes em sua companhia

momentos de muita alegria. É um prazer fazer parte de sua família!

A todos os meus familiares, que direta ou indiretamente, contribuíram para eu

alcançar esta vitória. Em especial, minha vovó Eledyr e minhas cunhadas Rosângela e

Solange.

Ao meu orientador, Dr. André Kipnis, pela oportunidade de estágio e vaga na

seleção de Mestrado e por todo apoio e confiança a mim dispensados. Seus

conhecimentos e a dedicação em nos tornar cientistas me fizeram ver além das minhas

limitações! Muito obrigada!

Aos professores, Dra. Carla Afonso S. Bitencourt Braga, Dra. Maria Cláudia

Dantas P. B. André e Dr. Plínio Lázaro Faleiro Naves, que participaram da Banca de

Qualificação e moldaram a minha Dissertação com sugestões, críticas, elogios e

conhecimentos compartilhados.

À professora Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis, pela dedicação em corrigir meu

artigo e me ajudar a vencer os desafios para uma escrita perfeita. Não poderia deixar de

registrar a sua ajuda e apoio! Obrigada!

vi

Ao autor MSc. Arto Baghdayan, da Universidade de Oklahoma (EUA), que

respondeu com carinho aos meus e-mails, dedicando-me um pouquinho de seu tempo e

instruindo-me na realização da técnica de formação de biofilme. I have no words to

thank such attention! Your help was essential for the conclusion of this work! Thanks a

lot!

Às minhas amigas Sanair Santana e Alyne Pereira, por todo o companheirismo e

por estarem sempre atentas ao meu desespero com conselhos de motivação. Espero

contar sempre com vocês!

A todos os meus colegas de laboratório, em especial Déllys Leonora, Bruna

Daniella, Lázaro Moreira, Renato Beilner e Jacqueline Souza, por toda ajuda a mim

prestada para que fosse possível a conclusão deste trabalho, e também aos colegas

Viviane Lopes, Maysa Paula, Fabiana Metzker, Fábio Muniz, Rogério Coutinho e

Aureliano Guedes, por tornarem nossos dias no laboratório mais leves e descontraídos!

É muito bom ter todos vocês ao meu lado!

Aos meus colegas de trabalho da Escola Municipal Senador Darcy Ribeiro, em

especial à Diretora Valéria Alves, por compreender minhas muitas faltas, e também às

colegas Lucilene Camilo, Rosane Vera, Fernanda Padilha, Louise Gonçalves, Isabella

Barbosa, Valéria de Almeida e Jussimária Almeida, por fazerem meus dias na escola

bem mais divertidos e menos estressantes.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

vii

SUMÁRIO

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ix

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS xi

RESUMO xv

ABSTRACT xvi

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1

1.1 TAXONOMIA DO Acinetobacter baumannii 1

1.2 Acinetobacter baumannii E PATOGÊNESE 2

1.3 IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DE Acinetobacter baumannii 4

1.3.1 Identificação fenotípica 4

1.3.2 Identificação genotípica 5

1.4 PERFIL DE RESISTÊNCIA 8

1.4.1 β-lactamases de classe D 12

1.4.1.1 β-lacatamase OXA-23 14

1.4.1.2 β-lactamase OXA-40 14

1.4.1.3 β-lactamase OXA-51 15

1.4.1.4 β-lactamase OXA-58 15

1.4.2 Sequência de inserção ISAba1 16

1.4.3 blaPER-1 17

1.5 FORMAÇÃO DE BIOFILMES 17

1.5.1 Biofilme 20

1.5.2 Formação e maturação do biofilme 20

1.5.3 Sistema quorum-sensing 22

1.5.4 Resistência e Formação de Biofilme 23

1.6 EPIDEMIOLOGIA 26

2 JUSTIFICATIVA 32

3 OBJETIVOS 34

3.1 GERAL 34

3.2 ESPECÍFICOS 34

4 MATERIAL E MÉTODOS 35

4.1 ASPECTOS ÉTICOS 35

viii

4.2 RECRUTAMENTO DOS CASOS E COLETAS DE AMOSTRAS

CLÍNICAS 35

4.3 ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO, SUSCEPTIBILIDADE

MICROBIANA 36

4.4 TESTE DE VIABILIDADE DE Acinetobacter baumannii 37

4.5 EXTRAÇÃO DE DNA CROMOSSOMAL 37

4.6 EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL 38

4.7 TESTE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM POLIESTIRENO 38

4.8 IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA 40

4.8.1 Identificação do gene blaPER-1 41

4.8.2 Identificação dos genes OXA e ISAba1 41

5 RESULTADOS 43

5.1 FORMAÇÃO DE BIOFILME 43

5.2 GENE blaPER-1 43

5.3 RELAÇÃO DO GENE blaPER-1 COM A FORMAÇÃO DE BIOFILME 43

5.4 AMPLIFICAÇÃO DOS GENES OXA E ISAba1 44

5.5 RESISTÊNCIA E FORMAÇÃO DE BIOFILME 48

5.6 RELAÇÃO ENTRE A RESISTÊNCIA E O GENE blaPER-1 49

6 DISCUSSÃO 51

7 CONCLUSÕES 56

REFERÊNCIAS 57

ANEXOS 76

Anexo 1. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 76

Anexo 2. Manuscrito 77

ix

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Tabela 1. Provas de identificação bioquímica para espécies de

Acinetobacter. 4

Tabela 2. Sistema de classificação para bactérias produtoras de β-lactamases

de acordo com o substrato. 11

Tabela 3. Oligonucleotídeos usados para detecção de blaPER-1, β-

lactamases do tipo OXA e ISAba1 em Acinetobacter baumannii. 41

Tabela 4. Relação entre presença do gene blaPER-1 com a formação de

biofilme bacteriano. 44

Tabela 5. Relação entre a intensidade da formação de biofilme e a presença

do gene blaPER-1. 44

Tabela 6. Distribuição de genes β-lactamases do tipo OXA em isolados

Acinetobacter baumannii com perfil de resistência aos

antimicrobianos relacionados.

46

Tabela 7. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii na

presença de genes β-lactamases do tipo OXA. 47

Tabela 8. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii na

presença exclusiva de um dos genes β-lactamases do tipo OXA. 47

Tabela 9. Resultados do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos de

isolados de Acinetobacter baumannii, em porcentagem (%). 48

Tabela 10. Padrão de resistência multidrogas de formadores e não-formadores

de biofilme. 49

Tabela 11. Relação entre a presença do gene blaPER-1 e a resistência à

cefepima. 50

Figura 1. Métodos genotípicos para identificação de espécies Acinetobacter. 7

Figura 2. Mecanismos potenciais de resistência antimicrobiana em

Acinetobacter. 9

Figura 3. Divisão das carbapenemases em Classe A, B e D, de acordo com a

classificação de Ambler. 10

Figura 4. Dendograma obtido para 73 β-lactamases de classe D de acordo

Phillip (clustalW). 13

x

Figura 5. Desenho esquemático mostrando três exemplos de possíveis

pontos de entrada no corpo para biofilmes infecciosos. 19

Figura 6. Conceituação de desenvolvimento de biofilme e comportamento

dinâmico em cada etapa da formação. 21

Figura 7. Representação esquemática das várias etapas de desenvolvimento

de um biofilme de acordo com o modelo aceito para Pseudomonas

aeruginosa.

22

Figura 8. Três hipóteses para os mecanismos de resistência a antibióticos em

biofilme. 25

Figura 9. Países que relataram surtos por Acinetobacter baumannii

resistentes aos carbapenêmicos. 26

Figura 10. Esquema representando a distribuição dos isolados e a disposição

dos controles positivo e negativo e do BRANCO. 39

xi

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

µg Micrograma

µL Microlitro

µM microMolar

AFLP Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (do inglês,

Amplified Fragment Lenght Polymorphism)

AI Autoindutores

AMI Amicacina

AMP/SUL Ampicilina/sulbactam

AmpC Enzima cefalosporinase cromossomal β-lactamase de classe C

ARDRA Análise de Restrição do DNA ribossomal Amplificado (do inglês,

Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)

ARI-1 Acinetobacter resistente ao imipenem (do inglês, Acinetobacter resistant

imipenem)

ATCC Coleção americana de tipos de cultura (do inglês, American Type

Culture Collection)

blaPER-1 Enzima β-lactamase de espectro estendido que hidrolisa cefalosporinas

CAZ Ceftazidima

CcrA Metallo- β-lactamase de Bacteroides fragilis

CFPM Cefepima

CHDL β-lactamases da classe D que hidrolisam carbapenêmicos (do inglês,

Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase)

CLSI Instituto de Padronização Laboratorial Clínica (do inglês, Clinical

Laboratory Standards Institute)

CPX Ciprofloxacina

CRAB Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos (do inglês,

Carbapenem Resistant Acinetobacter baumannii)

CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio (do inglês, cetyl trimethylammonium

bromide)

xii

DNA Ácido Desoxirribonucléico (do inglês, Deoxyribonucleic Acid)

dp Desvio padrão

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês,

ethylenediaminetetraacetic acid)

ELISA Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (do inglês, Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay)

EPS Exopolissacarídeo

ESBL β-Lactamase de Espectro Estendido (do inglês, Extended-Spectrum β-

Lactamase)

g Aceleração de gravidade

GEN Gentamicina

GES Enzima de espectro estendido descrita em Guiana (do inglês, Guiana

Extended Spectrum)

GIM Imipenemase descrita na Alemanha (do inglês, German imipenemase)

HCl Ácido clorídrico

HDT Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad

IMI Enzima β-lactamase que hidrolisa o imipenem (do inglês, Imipenem-

hidrolyzing β-lactamase)

IMP Impenemase

IPM Imipenem

IS Sequência de Inserção (do inglês, Insertion Sequence)

ISAba1 Sequência de Inserção Acinetobacter baumannii (do inglês, Insertion

Sequence Acinetobacter baumannii)

K1 Enzima β-lactamase descrita em Klebsiella

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

LACEN Laboratório Central de Saúde Pública Dr. Giovanni Cysneiros

LB Lúria Bertani

LVX Levofloxacina

MDR Multidroga resistente

xiii

MER Meropenem

mg Miligrama

MIR Enzima β-lactamase mediada por plasmídeo

mL Mililitro

mM miliMolar

MYSTIC Programa de coleção de informações do teste anual de susceptibilidade

ao imipenem (do inglês, Meropenem Yearly Susceptibility Test

Information Collection)

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

NMC-A Enzima β-lactamase que hidrolisa carbapenemases da classe A de

Ambler (do inglês, Not Metalloenzyme Carbapenemase)

OD Densidade óptica (do inglês, Optic Density)

OMP Proteína de Membrana Externa (do inglês, Outer Membrane Protein)

OXA Enzima oxacilinase

pb Pares de base

PBP Proteínas que se ligam à penicilina (do inglês, Penicillin Bilding Protein)

PBS Tampão fosfato-salino (do inglês, Phosphate Buffered Saline)

PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase Chain

Reaction)

PDR Pandroga resistente

pH Potencial hidrogeniônico

PIP/TAZ Piperacilina/tazobactam

POL Polimixina B/colistina

PSE Enzima específica de Pseudomonas (do inglês, Pseudomonas specífic

enzyme)

rDNA DNA ribossomal (do inglês, ribosomal DNA)

RNA Ácido Ribonucleico (do inglês, RiboNucleic Acid)

RNAse Ribonuclease

xiv

rpoB Subunidade β da RNA polimerase (do inglês, RNA polymerase beta-

subunit)

SDS Dodecil Sulfato de Sódio (do inglês, sodium dodecyl sulfate)

SENTRY Programa Internacional de Vigilância em Microbiologia (do inglês,

Worldwide Antimicrobial Surveillance Program)

SHV Cefalosporinase da família sulfidril variável (do inglês, Sulfhydryl

variable)

SIM Imipenase descrita em Seoul (do inglês, Imipenase Seoul)

SME Enzima específica de Serratia marcescens (do inglês, Serratia

marcescens enzyme)

SPM Metallo-β-lactamase descrita em São Paulo (do inglês, São Paulo

metallo-β-lactamase)

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TE Tris EDTA

TEM Enzima β-lactamase pertencente à família Temonieira

TET Tetraciclina

TGC Tigeciclina

TSA Ágar de soja tríptica (do inglês, Triptic Soy Agar)

TSB Caldo de soja tríptica (do inglês, Triptic Soy Broth)

UTI Unidade de Terapia Intensiva

VIM Imipenemase descrita em Verona (do inglês, Verona imipenemase)

xv

RESUMO

A espécie Acinetobacter baumannii é a representante mais importante do gênero, sendo

considerado o patógeno de maior relevância, dentro do complexo A. baumannii – A.

calcoaceticus, para as instituições de saúde mundialmente. Sua importância clínica tem

aumentado nos últimos anos em parte devido a sua notável capacidade de aderência a

superfícies devido a presença de estruturas como pili, produção de EPS

(exopolissacarídeo) e presença de genes que favorecem a formação de biofilme,

proporcionando maior adesão entre as células e consequente resistência aos

antimicrobianos. Outro destaque é sua capacidade de regular ou adquirir resistência, em

particular por meio das oxacilinases, codificadas pelo gene OXA, que apresentam

atividade hidrolítica potente contra penicilinas resistentes às penicilinases. Até o

momento, 250 tipos de OXA já foram descritas. A expressão de genes OXA pode ser

aumentada na presença do elemento de inserção ISAba1, localizado à montante do gene,

conferindo uma vantagem seletiva para o isolado quando este depende da expressão

eficiente de uma variedade de genes de resistência a antibióticos. Na sua ausência, a

resistência geralmente é expressa na presença de dois ou mais genes OXA. A

capacidade de formar biofilme e a presença dos genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40,

OXA-51, OXA-58 e ISAba1 foram investigados em 84 isolados provenientes de 64

pacientes de UTIs de Goiânia. Observou-se que 78,5% dos isolados formaram biofilme,

dos quais 23% apresentaram o gene blaPER-1. A presença do gene OXA-51 foi

detectada em todos os isolados, enquanto que 64,3% dos isolados apresentavam o gene

OXA-23, e em 24% dos isolados foi encontrado o gene OXA-58. O gene ISAba1 foi

detectado à montante dos genes OXA-51, OXA-23 e OXA-58, em 33,3% (28/84),

92,6% (50/54) e 10% (2/20) dos isolados, respectivamente. Nenhum isolado estudado

apresentou o gene OXA-40. Dos 62 isolados resistentes ao imipenem e meropenem,

76% dos isolados possuíam o gene OXA-23 enquanto que 24,2% possuíam o gene

OXA-58. Dentre estes isolados, 79% (49/62) apresentaram a sequência de inserção

ISAba1. No presente estudo, a presença do gene blaPER-1 não foi associada com a

formação de biofilmes, enquanto que a presença de genes OXA estava relacionada à

resistência em Acinetobacter baumannii.

xvi

ABSTRACT

The species Acinetobacter baumannii is the most important representative of the genus,

being globally considered the pathogen of larger relevance, within the complex A.

baumannii – A. calcoaceticus, to healthcare institutions worldwide. Its clinical

significance has increased in recent years partly due to its notable capacity of adherence

to surfaces due to presence of structures such as pili, production of EPS

(exopolysaccharides) and presence of genes that favor biofilm formation, providing

larger adhesion between the cells and consequent resistance to the antimicrobials.

Another important characteristic is its capacity to regulate or to acquire antibiotic

resistance, specifically through oxacilinases, encoded by the gene OXA, that presents

potent hydrolytic activity against penicilinase-resistant penicillins. Until the moment,

250 types of OXA were already described. The expression of OXA genes can be

increased in the presence of the insertion element ISAba1, which when located upstream

of the gene, confer a selective advantage for the isolate when this depends on the

efficient expression of a variety of resistance genes. In its absence, the resistance is

usually expressed in the presence of two or more OXA genes. The capacity of biofilm

formation and the presence of the genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-

58 and ISAba1 were investigated among 84 isolates from 64 patients of the Intensive

Care Units of Goiânia. It was observed that 78.5% of the isolates formed biofilm, of

which 23% presented the gene blaPER-1. The presence of OXA-51 gene was detected

in all isolates, whereas 64.3% of the isolates had the OXA-23 gene and 24.0% of the

isolates had the OXA-58 gene. The ISAba1 gene was detected upstream of the OXA-51,

OXA-23 and OXA-58 genes in 33.3% (28/84), 92.6% (50/54) and 10.0% (2/20) of the

isolates, respectively. None of the isolates studied presented the gene OXA-40. Of the

62 isolates resistant to imipenem and meropenem, 76.0% possessed the OXA-23 gene

while 24.2% of the isolates possessed the OXA-58 gene. Of these isolates, 79.0%

(49/62) presented the gene ISAba1. In the present study, the blaPER-1 gene presence

was not associated with the biofilm formation, while the presence of OXA genes was

related to resistance in Acinetobacter baumannii.

1

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1 TAXONOMIA do Acinetobacter baumannii

A história da descrição do gênero Acinetobacter remonta ao início do século 20, em

1911, quando Beijerinck, um microbiologista holandês, descreveu um organismo

chamado Micrococcus calcoaceticus que foi isolado do solo por enriquecimento em um

meio contendo acetato de cálcio. Nas décadas seguintes, organismos semelhantes foram

descritos e atribuídos a pelo menos 15 gêneros e espécies diferentes, incluindo

Diplococcus mucosus, Micrococcus calcoaceticus, Alcaligenes haemolysans, Mima

polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginocola, Bacterium anitratum, Neisseria

winogradskyi, Achromobacter anitratus e Achromobacter mucosus (Peleg et al. 2008).

A designação atual do gênero, Acinetobacter (do grego akineto, ou seja, sem

motilidade), foi inicialmente proposta por Brisou e Prévot em 1954 para separar micro-

organismos móveis de não-móveis dentro do gênero Achromobacter. Antes mesmo de

1968, esta designação do gênero tornou-se mais amplamente aceita. Baumann et al.

(1968) publicou uma pesquisa abrangente e concluiu que as diferentes espécies listadas

acima pertenciam ao mesmo gênero, para o qual o nome de Acinetobacter havia sido

proposto e que a subclassificação entre espécies diferentes com base em características

fenotípicas ainda não era possível. Estas descobertas resultaram no reconhecimento

oficial do gênero Acinetobacter pela Subcomissão Sobre a Taxonomia de Bactéria

Moraxella e afins em 1971 (Lessel 1971 apud Peleg et al. 2008). Na edição de 1974 do

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Lautrop 1974 apud Peleg et al. 2008) o

gênero Acinetobacer foi listado com a descrição de uma única espécie, Acinetobacter

calcoaceticus, no qual foi recomendado que o gênero compreendesse apenas isolados

oxidase-negativos. Estudos posteriores incluíram A. lwoffi no gênero, com base na

observação de que algumas cepas eram capazes de acidificar a glicose e outras não

(Skerman et al.1980 apud Peleg et al. 2008).

Com base em dados taxonômicos mais recentes, foi proposto que os membros do

gênero Acinetobacter, como ficou definido, deveria ser retirado da família

Neisseriaceae e classificados na nova família Moraxellaceae (Bergogne-Berezin &

Towner 1996; Giamarellou et al. 2008), a qual inclui Moraxella, Acinetobacter,

Psychrobacter e organismos relacionados (Rossau et al. 1991). Um grande avanço na

2

longa e complicada história do gênero foi realizado em 1986 por Bouvet e Grimont que,

baseado na hibridização do DNA, foram delineados 12 grupos de DNA (genoespécies)

de Acinetobacter, dos quais quatro novas espécies foram propostas, A. baumannii, A.

haemolyticus, A. johnsonii e A. junii e a descrição das espécies já conhecidas, A.

calcoaceticus e A. lwoffii, foram feitas (Bouvet & Grimont 1986).

Desde a década de 1980, em paralelo com a descrição de Acinetobacter como

patógeno nosocomial, a taxonomia do gênero tem sido refinada (Dijkshoorn et al.

2007). Até o ano de 2010, o gênero abrangia 19 espécies com nomes validamente

publicados e uma série de espécies com denominações provisórias (Nemec et al. 2010).

Com a recente descrição de Acinetobacter bereziniae (genoespécie 10), A. guillouiae

(genoespécie 11), o gênero compreende 23 espécies nomeadas e 11 espécies com

denominações provisórias (de Breij et al. 2010; Nemec et al. 2010).

Diversos autores relatam pequenas diferenças genômicas entre as espécies do

gênero Acinetobacter, no entanto as espécies 1 (A. calcoaceticus), 2 (A.baumannii),

genoespécie 3 e genoespécie 13TU apresentam uma relação muito estreita, recebendo a

denominação de complexo A. calcoaceticus – A. baumannii devido à dificuldade na

separação destas espécies a partir de testes convencionais (Bouvet & Grimont 1986;

Gerner-Smidt et al. 1991; Bergogne-Berezin & Towner 1996). Este complexo contém

isolados que são, em sua maioria, acidificantes da glicose (Bergogne-Berezin& Towner

1996) e são responsáveis pela maioria das infecções adquiridas quer na comunidade,

quer no hospital (Peleg et al. 2008). A. baumannii é a espécie de maior importância na

medicina humana dentro do complexo A. baumannii – A. calcoaceticus (Tomaras et al.

2003).

1.2 Acinetobacter baumannii E PATOGÊNESE

Em 1986, um sistema de identificação fenotípica de espécies de Acinetobacter foi

descrito por Bouvet e Grimont, possibilitando a identificação de várias espécies do

gênero, em particular o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii (Bouvet & Grimont

1986; Dijkshoorn et al. 2007).

A espécie Acinetobacter baumannii é o representante mais importante, sendo

considerado o patógeno mais relevante para as instituições de saúde mundialmente

(Peleg et al. 2008). São persistentes no ambiente hospitalar e causam uma variedade de

infecções nosocomiais oportunistas (Loehfelm et al. 2008), incluindo infecções no trato

3

respiratório ou urinário, meningite, endocardite, bacteremia, especialmente em pacientes

internados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs), unidades neonatais e enfermarias

de neurocirurgia (Tomaras et al. 2003; Lee et al. 2008; Rao et al. 2008; Nucleo et al.

2009; Tiwari et al. 2012). Frequentemente causam infecções associadas a dispositivos

médicos como, por exemplo, catéteres vasculares, derivações liquóricas, catéteres de

Foley bem como pneumonia associada à ventilação mecânica (Rodriguez-Bano et al.

2008). Sua significância clínica tem sido justificada por sua alta prevalência em

epidemias e situações endêmicas, por sua notável capacidade de regular ou adquirir

resistência aos antibióticos, à dessecação e sua capacidade de formar biofilmes em

dispositivos médicos, contribuindo para a sua persistência no cenário hospitalar

(Roberts et al. 2001; Peleg et al. 2008; de Breij et al. 2010).

O uso extensivo de terapias antimicrobianas em hospitais tem contribuído para o

surgimento e aumento no número de isolados resistentes a uma ampla gama de

antimicrobianos, tornando-se um organismo que ameaça a eficácia dos mesmos (Zarrilli

et al. 2004; Peleg et al. 2008; de Breij et al. 2010).

A. baumannii é responsável por surtos de infecções hospitalares repentinos e de

difícil controle. As circunstâncias locais das unidades de saúde e seu ambiente

determinam o tipo de infecção e, consequentemente, o risco de contaminação, podendo

contribuir para o surgimento de um surto de infecções hospitalares. Esta bactéria é

considerada um agente patogênico de baixa virulência, podendo habitar sobre ou dentro

do corpo humano sem causar doença. Assim, a disseminação por meio das mãos da

equipe de saúde frequentemente não é detectada. Pacientes com sintomas de infecção

por Acinetobacter representam a ponta do iceberg da colonização e disseminação.

Quando as infecções tornam-se aparentes, é provável que o número de pacientes

colonizados já esteja elevado, de modo que se tornam tardias as precauções para evitar

um surto. Uma vez que um surto está estabelecido, todas as superfícies inanimadas no

ambiente podem ser reservatórios de Acinetobacter (Joly-Guillou 2005).

4

1.3 IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DE Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii compreende bactérias em forma cocobacilos Gram-

negativas, ubíquas, aeróbias estritas, catalase-positiva e oxidase-negativa, imóveis

(Bergogne-Berezin & Towner 1996), não fastidiosas, não fermentadoras de glicose

(Peleg et al. 2008), que podem ser recuperadas a partir de diversas fontes, tais como o

solo, água, produtos alimentares e ambientes médicos (Tomaras et al. 2003).

Crescem bem em ágar sangue onde formam colônias branco-acinzentadas ou em

ágar MacConkey com colônias levemente rosadas normalmente cremosas, mas que

podem eventualmente ter aspecto mucóide (Peleg et al. 2008). A. baumannii tem

requisitos de crescimento simples explorando uma variedade de fontes de alimentação e

é adaptável a diferentes temperatura, teores de pH, salinidade e níveis de umidade

(Iacono et al. 2008). Suas colônias assemelham-se às de Enterobacteriaceae, com um

diâmetro de 1,5 a 3 cm após 18 horas de crescimento em meios sólidos, enquanto que a

maioria das outras espécies de Acinetobacter produz colônias menores e mais

translúcidas (Peleg et al. 2008).

1.3.1 Identificação Fenotípica

A identificação bioquímica de A. baumannii compreende provas bioquímicas

básicas, como a fermentação de glicose, redução de nitrato a nitrito, detecção de

hemólise em ágar sangue de carneiro, utilização de citrato e outras fontes de carbono, e

principalmente crescimento em caldo de infusão de cérebro e coração a 42°C (tabela 1)

(Bouvet & Grimont 1986).

Tabela 1. Provas bioquímicas de identificação das espécies de Acinetobacter.

Micro-organismos OXI MOT OFG Cresc.

a 42°C CIT MAL GEL HEM

A. baumannii N N O P P P N N

A. calcoaceticus N N O N P P N N

A. haemolyticus N N I/O N P N P P

A. lwoffii N N I N N N N N

Acinetobacter sp N N I/O N P V V V

OXI: oxidase; MOT: motilidade; CIT: citrato; MAL: malonato; GEL: gelatina

OFG: meio de oxidação fermentação da glicose de Leifson; HEM: hemólise em ágar sangue;

N: negativo; P: positivo; O: oxidativo; I: inerte; I/O: inerte/oxidativo; V: variável

Fonte: Adaptado de ANVISA (2004a).

5

Em particular, as espécies estreitamente relacionadas e clinicamente mais

relevantes A. baumannii e Acinetobacter genoespécie 13TU não podem ser distinguidas

por identificação fenotípica, enquanto que A. calcoaceticus e Acinetobacter genoespécie

3 só podem ser separadas por suas propriedades de crescimento à diferentes

temperaturas. Isto se deve à similaridade genética e fenotípica das espécies (Peleg et al.

2008).

1.3.2 Identificação Genotípica

O método de hibridização de DNA proposto inicialmente por Bouvet e Grimont,

1986, para identificação e separação do gênero Acinetobacter em espécies não tem sido

apropriado, uma vez que o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii é altamente

semelhante, combinando três das espécies clínicas mais relevantes (A. baumannii,

genoespécie 3 e genoespécie 13TU) com uma espécie ambiental (A. calcoaceticus)

(Bouvet & Grimont 1986; Dijkshoorn et al. 2007).

A dificuldade em se distinguir o complexo A. calcoaceticus – A. baumannii têm

levado ao desenvolvimento de métodos genotípicos para a identificação de espécies de

Acinetobacter (Dijkshoorn et al. 2007). Entre eles estão a técnica de Reação em Cadeia

da Polimerase (PCR – Polimerase Chain Reaction) utilizando diferentes

oligonucleotídeos iniciadores; a análise do perfil de restrição do produto amplificado do

16S rDNA (ARDRA); a análise fingerprint de alta resolução por Amplified Fragment

Lenght Polymorphism (AFLP) e o sequenciamento da região intergênica do gene 16S-

23R e ou sequenciamento do gene que codifica a subunidade β da RNA polimerase

(rpoB) (Turton et al. 2006b; Dijkshoorn et al. 2007; Peleg et al. 2008).

A identificação molecular de espécies de Acinetobacter pode ser determinada pelo

sequenciamento de todo o genoma, análise de restrição de uma sequência particular de

DNA e da determinação da sequência de DNA. A figura 1 mostra dois métodos

genotípicos para a identificação de espécies de Acinetobacter: AFLP e ARDRA. AFLP

(figura 1a) compreende os seguintes passos: digestão do DNA celular com duas

enzimas de restrição; ligação dos adaptadores aos fragmentos de restrição; amplificação

seletiva dos fragmentos; eletroforese de fragmentos em um sequenciador; e visualização

dos perfis de restrição. Os perfis são comparados por análise de clusters àqueles de uma

biblioteca de referência de fingerprints de AFLP usando software específico. Este

método usado para a identificação de espécies é útil também para a identificação de

estirpes (tipagem) e clones. ARDRA (figura 1b) compreende a amplificação de

6

sequências de 16S rDNA, seguido de restrição dos fragmentos amplificados com cinco

enzimas de restrição e eletroforese. Os perfis resultantes são comparados com uma

biblioteca de perfis de restrição. Padrões de restrição ARDRA podem ser comparados

entre laboratórios. A análise da sequência de DNA, em particular da sequência 16S

rDNA, é uma abordagem amplamente utilizada para avaliar as relações entre os micro-

organismos, e os dados são universalmente comparáveis. No entanto, algumas espécies

Acinetobacter não relacionadas tem alta similaridade na sequência 16S rDNA, embora

algumas espécies estreitamente relacionadas são encontradas em diferentes ramos da

árvore filogenética 16S rDNA. Mais estudos são necessários para avaliar os níveis de

cut-off das semelhanças intra e interespécies (Dijkshoorn et al. 2007).

A identificação da espécie A. baumannii também pode ser confirmada pela

detecção da presença do gene OXA-51. Este gene foi identificado a partir de uma ampla

coleção de isolados A. baumannii coletados de diversas áreas geográficas. O gene

ocorre naturalmente no cromossomo de A. baumannii, sendo caracterizado como um

gene intrínseco à espécie (Brown et al. 2005; Heritier et al. 2005; Turton et al. 2006a;

Turton et al. 2006b; Feizabadi et al. 2008).

7

Figura 1. Métodos genotípicos para identificação de espécies de Acinetobacter: AFLP (a) e

ARDRA (b).

Fonte: Adaptado de Dijkshoorn et al. (2007)

8

1.4 PERFIL DE RESISTÊNCIA

Inicialmente, A. baumannii foi considerado um patógeno nosocomial de baixa

virulência, no entanto, estudos recentes têm mostrado que este micro-organismo é mais

virulento do que previamente relatado (Smani et al. 2012). O ambiente hospitalar pode

representar um importante reservatório para A. baumannii durante infecções

nosocomiais; em particular pacientes que permanecem em unidades de cuidado por

períodos prolongados, podem ser colonizados por esta bactéria e carregá-la por longos

períodos sem sintomas visíveis. A sua habilidade à persistência está relacionada à

resistência multidrogas, permitindo que a mesma sobreviva a terapias antimicrobianas

prolongadas em pacientes hospitalizados (Nucleo et al. 2009).

Os isolados clínicos de A. baumannii geralmente são multidroga resistentes às

tetraciclinas, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, maioria dos β-lactâmicos e alguns

carbapenêmicos (Dijkshoorn et al. 2007; Shahcheraghi et al. 2011). A resistência é

mediada por uma variedade de mecanismos (figura 2), como modificações do local

alvo, bombas de efluxo, inativação enzimática de antimicrobianos (Nucleo et al. 2009) e

presença de elementos como plasmídeos, integrons e transposons que são adquiridos,

sugestivamente, por transferência horizontal (Dijkshoorn et al. 2007; D'Arezzo et al.

2009).

A resistência aos aminoglicosídeos tem sido atribuída a pelo menos, nove distintas

enzimas modificadoras, que podem ser encontradas em diferentes combinações em

algumas estirpes. Mutações pontuais específicas nos genes que codificam a DNA-girase

e topoisomerase IV, tem sido correlacionadas com a resistência às fluoroquinolonas e a

resistência às tetraciclinas tem sido associada com genes que codificam as bombas de

efluxo tetraciclinas-específicas (Dijkshoorn et al. 2007). A produção de enzimas β-

lactamases tem sido relatada como um importante mecanismo de resistência aos

antibióticos β-lactâmicos, hidrolisando o anel β-lactâmico pela quebra da ligação amida,

perdendo assim, a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana (Williams

1999), neutralizando o efeito de antibióticos como o imipenem, meropenem e

penicilina. Estas enzimas são produzidas por bactérias Gram-negativas como um

importante meio de autodefesa contra antimicrobianos β-lactâmicos e A. baumannii não

é exceção (Tiwari et al. 2012).

Os carbapenêmicos são as drogas de escolha para o tratamento de infecções

causadas por bacilos Gram-negativos multirresistentes (Quale et al. 2003), mas a

9

resistência de A. baumannii aos mesmos tem aumentado em todo o mundo na última

década (Sohrabi et al. 2012).

Figura 2. Mecanismos potenciais de resistência antimicrobiana em Acinetobacter

O Acinetobacter, como outra bactéria Gram-negativa, tem uma membrana externa e uma

membrana citoplasmática, entre as quais (o espaço periplasmático) residem as β-lactamases

(carbapenemases, AmpC β-lactamases e β-lactamases de espectro estendido). As penicillin-

binding proteins (PBPs), localizadas na membrana citoplasmática, constituem o alvo final dos

β-lactâmicos. Uma vez no espaço periplasmático, os β-lactâmicos se ligam às PBPs ou são

ativamente expelidos da estrutura bacteriana através de bombas de efluxo. Acinetobacter pode

abrigar integrons e transposons, elementos genéticos no cromossomo bacteriano ou em

plasmídeos, que podem carregar múltiplos genes de resistência que codificam a síntese de

enzimas (ex: β-lactamases de espetro estendido e metalo β-lactamases).

Fonte: Adaptado de Munoz-Price & Weinstein (2008)

A resistência aos carbapenêmicos em espécies de Acinetobacter ocorre devido à

combinação de vários mecanismos de resistência, incluindo a produção de β-lactamases

10

que pode estar associada com a perda de porinas de membrana externa e/ou super-

expressão da bomba de efluxo ou, mais raramente, com a alteração das proteínas que se

ligam às penicilinas (PBPs – penicillin-binding protein) (Gur et al. 2008). A

combinação de diferentes mecanismos são classificados como enzimáticos e não-

enzimáticos, porém o mecanismo mais importante de resistência a esta classe de

antibióticos é a hidrólise enzimática, mediada por enzimas chamadas carbapenemases.

Estas enzimas pertencem a uma das três classes moleculares, de acordo com a

classificação de Ambler (figura 3) (Opazo et al. 2012). Vários estudos têm relacionado a

presença de enzimas metalo- β-lactamases com a resistência de A. baumannii aos

carbapenêmicos, mas as carbapenemases mais prevalentes nesta espécie são as β-

lactamases de classe D que hidrolisam carbapenêmicos (CHDLs, - carbapenem-

hidrolizing class D β-lactamases) (Mugnier et al. 2008; Opazo et al. 2012).

Figura 3. Divisão das carbapenemases em Classe A, B e D, de acordo com a classificação de

Ambler. As carbapenemases de classe D são representadas pelas Oxacilinases (OXA).

Fonte: Adaptado de Opazo et al. (2012)

As oxacilinases, também conhecidas como β-lactamase de classe D, são compostas

por enzimas com serina no sítio ativo assim como as β-lactamases de classes A e C de

Ambler, que diferem na estrutura de aminoácidos; enquanto as β-lactamases de classe B

são compostas por enzimas com zinco em seu sítio ativo. A maioria das enzimas de

classe D pertence ao grupo 2d do esquema de classificação funcional de β-lactamases de

Bush et al. (1995) (tabela 2). Entre as quatro classes moleculares, a classe D apresenta

maior diversidade de enzimas, a qual é observada tanto nos níveis genético como

11

bioquímico, com enzimas que possuem hidrólise quer de espectro estreito ou estendido.

Além disso, várias β-lactamases de classe D possuem atividade de espectro estendido,

resultante de mutações pontuais (Poirel et al. 2010).

Tabela 2. Sistema de classificação para bactérias produtoras de β-lactamases de acordo

com o substrato alvo.

Grupo Bush,

Jacoby e

Medeiros

Classe

Molecular

Ambler

Substrato alvo Inibida por

Exemplo ACa EDTA

1 C Cefalosporinas - - Enzimas AmpC de bactérias

Gram-negativas; MIR-1

2a A Penicilinas + - Penicilinases de bactérias

Gram-positivas

2b A Penicilinas e Cefalosporinas + - TEM-1, TEM-2, SHV-1

2be A

Penicilinas, Cefalosporinas de

espectro reduzido, Cefalosporinas

de amplo-espectro e

Monobactâmicos

+

- TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a

SHV-6, K1 K. oxytoca

2br A Penicilinas +/- - TEM-30 a TEM-36, TRC-1

2c A Penicilinas e Carbenicilinas + - PSE-1, PSE-3, PSE-4

2d D Penicilinas, Cloxacilina e

Carbapenêmicos +/- - OXA-1 a OXA-11, PSE-2

(OXA-10)

2e A Cefalosporinas + - Cefalosporinases induzíveis

de Proteus vulgaris

2f A Penicilinas, Cefalosporinas e

Carbapenêmicos + - NMC-A de E. cloacae, Sme-

1 de Serratia marcescens

3 B Maioria β-lactâmicos, incluindo

Carbapenêmicos

- + L1 de Stenotrophomonas

maltophilia, CcrA de

Bacterioides fragilis

4 Não determinada Penicilinas - ? Penicilinases de B. cepacia aAC. Ácido Clavulânico

Fonte: Adaptado de Bush et al. (1995)

Há diferentes mecanismos envolvidos na resistência aos antibióticos

carbapenêmicos, dentre eles a produção de diferentes β-lactamases do tipo OXA é a

mais prevalente (Sohrabi et al. 2012). A classe D (OXA) tem emergido como a principal

carbapenemase no mundo (Shahcheraghi et al. 2011).

O primeiro surto nosocomial com A. baumannii resistente aos carbapenêmicos

(CRAB – Carbapenem-Resistant A. baumannii) foi relatado nos Estados Unidos em

1991. Desde então, infecções por CRAB e surtos hospitalares têm sido relatados

12

mundialmente (Shahcheraghi et al. 2011). Surtos nosocomiais com isolados de

Acinetobacter que produzem enzimas de resistência OXA tem sido relatados no Brasil,

Polinésia Francesa, Espanha, Sudeste Europeu, Coréia e Argentina (Feizabadi et al.

2008).

1.4.1 β-lactamases de classe D

Originalmente, a denominação oxacilinase (OXA), deveu-se à capacidade deste

grupo de carbapenemases de hidrolisar mais rapidamente a oxacilina, cloxacilina e a

meticilina do que as penicilinas clássicas e ao fato de não serem inibidas pelo ácido

clavulânico e EDTA (Heritier et al. 2005; Opazo et al. 2012). Hoje essa definição não é

válida, uma vez que tem sido descrito, recentemente, que as enzimas inativam

fracamente a cloxacilina e a oxacilina (Opazo et al. 2012) e o grupo é fracamente

inibido pelo ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam, enquanto que a sua atividade

pode ser inibida por NaCl in vitro (Heritier et al. 2005; Poirel et al. 2010). Embora

identificados primeiramente em plasmídeos, tem sido demonstrado que muitas espécies

Gram-negativas possuem naturalmente em seus genomas os genes que codificam as

OXA sendo, portanto, consideradas enzimas residentes (Poirel et al. 2010).

Baseado na identidade de suas sequências de aminoácidos, as carbapenemases

foram divididas em grupos filogenéticos (figura 4), dos quais OXA-23, OXA-40, OXA-

51 e OXA-58 têm sido identificados em A. baumannii.

13

Figura 4. Dendrograma obtido para 73 β-lactamases de classe D de acordo com Phillip

(clustalW). Os comprimentos de ramificação à escala são proporcionais ao número de alterações

no aminoácido. A distância ao longo do eixo vertical não tem qualquer significado. Os

diferentes clusters identificados, permitiram a identificação de nove grupos principais,

considerando que as proteínas de um mesmo grupo têm uma identidade maior que 80% na

sequência de aminoácidos.

Fonte: Adaptado de Poirel et al. (2010)

Até o momento, já foram descritas 250 tipos de OXA

(http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1) as quais apresentam grande divergência em

termos de propriedades bioquímicas. Enquanto algumas enzimas do tipo OXA possuem

espectro hidrolítico restrito às penicilinas e cefalosporinas de primeira e segunda

geração (oxacilinases de espectro limitado), outras são capazes de hidrolisar

14

cefalosporinas de terceira e quarta gerações (ESBL do tipo OXA), e certas variantes

ainda apresentam atividade hidrolítica contra o imipenem (carbapenemases do tipo

OXA) (Picão 2009).

1.4.1.1 β-lactamase OXA-23

A primeira descrição de OXA em A. baumannii foi em 1985, em um hospital

escocês. Inicialmente recebeu o nome de ARI-1 (Acinetobacter Resistent to Imipenem);

mais tarde seu gene foi sequenciado e designado como OXA-23 (Opazo et al. 2012;

Sohrabi et al. 2012). Desde então, essa enzima tem sido relatada em diferentes partes do

mundo (Feizabadi et al. 2008; Sohrabi et al. 2012), porém somente em Acinetobacter

sp., com uma única exceção, uma vez que este gene também foi identificado no

cromossomo de um Proteus mirabilis resistente a carbapenêmicos isolado na França

(Poirel et al. 2010). A enzima apresenta resistência ao ácido clavulânico (Nordmann &

Poirel 2002) e o gene pode estar localizado no cromossomo ou no plasmídeo de A.

baumannii (Mugnier et al. 2008; Mugnier et al. 2010). De acordo com os resultados

apresentados por Poirel e Nordmann, as medições hidrolíticas mostraram baixa

atividade de OXA-23 contra o imipenem; no entanto, em comparação com outras β-

lactamases de classe D, esta hidrólise foi significativa e permitiu definir o novo

subgrupo de OXAs, atualmente chamado CHDL (Poirel & Nordmann 2006a). Brown

detectou em seus experimentos uma lenta hidrólise do imipenem pelo OXA-23, mas não

detectou hidrólise do meropenem. O mesmo foi observado com OXA-40 e OXA-51

(Brown et al. 2005).

1.4.1.2 β-lactamase OXA-40

O grupo OXA-40 (inicialmente denominado OXA-24 devido a um erro de

sequenciamento inicial, ver http://www.lahey.org/Studies/) foi originalmente

identificado no cromossomo de um isolado de A. baumannii resistente a

carbapenêmicos na Espanha. Em seguida o gene foi identificado em diferentes áreas,

especialmente em Portugal, na Espanha e também nos Estados Unidos. O gene tem sido

identificado no cromossomo ou no plasmídeo (Brown et al. 2005; Poirel et al. 2010). O

perfil de atividade hidrolítica é restrito, inclui principalmente as penicilinas. A hidrólise

do imipenem é de baixo nível, e a do meropenem não foi detectada (Joly-Guillou 2005).

O OXA-40 apresenta 60% de similaridade com a sequência de aminoácido do OXA-23

e não é inibido por NaCl (Poirel et al. 2010; Sohrabi et al. 2012).

15

1.4.1.3 β-lactamase OXA-51

Recentes relatos de diferentes países têm mostrado que o gene OXA-51 é intrínseco

à espécie A. baumannii, sendo encontrado no cromossomo desta espécie (Turton et al.

2006a; Turton et al. 2006b; Feizabadi et al. 2008; Gur et al. 2008). Esta enzima não

contribui significativamente para o padrão de resistência natural observada em A.

baumannii, apresentando fraca atividade carbapenemases (Hu et al. 2007; Poirel et al.

2010). Takagi et al. (2009) relataram a combinação entre a expressão deste gene como

os mecanismos responsáveis pela resistência ao imipenem. Nenhuma das cefalosporinas

é hidrolisada por OXA-51, com exceção da cefaloridina. A hidrólise do imipenem é

lenta e meropenem não é hidrolisado por esta enzima (Brown et al. 2005). Os genes que

codificam OXA-51 e derivativos, foram identificados a partir de uma grande coleção de

isolados de A. baumannii recuperados de amplas áreas geográficas. Provavelmente, a

maioria das variantes de OXA-51, se não todas, partilham propriedades bioquímicas

idênticas (Poirel et al. 2010).

1.4.1.4 β-lactamase OXA-58

A ocorrência de OXA-58 em Acinetobacter sp. é generalizada e consistentemente

associada com a resistência não somente aos carbapenêmicos, mas também a muitos

outros antimicrobianos, assim com β-lactâmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos

(Figueiredo et al. 2011). Esta β-lactamase hidrolisa penicilinas e carbapenêmicos em um

nível baixo. Foi identificada pela primeira vez na França, em um isolado A. baumannii

multidroga resistente (Poirel et al. 2010; Sohrabi et al. 2012) e frequentemente é

mediada por plasmídeo, apresenta similaridade superior a 50% com as sequências de

aminoácidos dos outros três grupos (Sohrabi et al. 2012). Turton et al. (2006a)

destacaram em seus resultados a resistência de OXA-58 ao imipenem e meropenem.

Feizabadi et al. (2008) concluíram em seus estudos que a resistência aos

carbapenêmicos está relacionada com a presença de, no mínimo, dois genes do tipo

OXA.

16

1.4.2 Sequência de inserção ISAba1

As sequências de inserção (IS – Insertion Sequence) são os menores e mais

abundantes elementos transponíveis. Estes elementos podem conter fortes promotores

que desempenham um papel importante na expressão dos genes de resistência a

antibióticos, os quais estão localizados próximos ao local de inserção destes elementos.

Recentemente uma sequência de inserção foi identificada em A. baumannii, denominada

ISAba1 ( Insertion Sequence Acinetobacter baumannii) (Sohrabi et al. 2012).

Diferentes IS têm sido descritas em Acinetobacter, cada uma em associação com

genes específicos, desempenhando importante papel no desenvolvimento da resistência

aos carbapenêmicos (Poirel & Nordmann 2006a, 2006b; Turton et al. 2006a; Feizabadi

et al. 2008; Mugnier et al. 2008; Sohrabi et al. 2012). As mais conhecidas são ISAba1,

ISAba2, ISAba3 e ISAba4, onde ISAba1 parece estar relacionada unicamente com a

espécie A. baumannii (Peleg et al. 2008).

A introdução da sequência de inserção ISAba1 pode agir como um forte promotor

aumentando a expressão dos genes (Poirel & Nordmann 2006a; Turton et al. 2006a;

Sohrabi et al. 2012;). Os grupos OXA-23, OXA-51 e OXA-58 possuem com frequência

associação com esses IS. Dentre eles, o OXA-23 é o mais comum e frequentemente

associado aos ISAba1 e ISAba4 (Poirel & Nordmann 2006a; Turton et al. 2006a;

Bogaerts et al. 2008; Mugnier et al. 2010;; Sohrabi et al. 2012). Tem sido relatado a

associação do grupo OXA-51 com os elementos de inserção ISAba1 e ISAba9,

proporcionando sequências promotoras para a expressão de alto nível desta enzima

(Turton et al. 2006a; Figueiredo et al. 2009; Sohrabi et al. 2012). As sequências

promotoras que desempenham importante papel na expressão de OXA-58 foram

descritas como ISAba1, ISAba2 e ISAba3 (Poirel & Nordmann 2006a, 2006b; Turton et

al. 2006a; Bertini et al. 2007; Gur et al. 2008; Sohrabi et al. 2012). A diminuição da

susceptibilidade a carbapenêmicos pode não estar relacionada à presença única de alelos

intrínsecos do tipo OXA-51, sendo uma explicação plausível a regulação mediada por

sequências de inserção ISAba1 (Turton et al. 2006a). No entanto, a detecção de alelos

genéticos que codificam enzimas do tipo OXA-23 e OXA-58 estão associados com, no

mínimo, a diminuição da susceptibilidade aos carbapenêmicos (Woodford et al. 2006).

De acordo com Segal et al. (2005), a abundância de ISAba1 em Acinetobacter sp.

reflete a motilidade do elemento e indica que os eventos de transposição ocorram com

frequência. Sugerem ainda plasticidade do genoma do Acinetobacter como transposição

da sequência de inserção, podendo causar uma variedade de rearranjos genômicos.

17

1.4.3 blaPER-1

O gene blaPER-1 foi identificado pela primeira vez em 1993 na Turquia, em

isolados de Pseudomonas aeruginosa e mais tarde em Salmonella enterica sorovar

Typhimurium e isolados de Acinetobacter (Paterson & Bonomo 2005; Poirel et al.

2005). Um estudo conduzido na Turquia em 1996 revelou uma alta prevalência do gene

blaPER-1 entre isolados nosocomiais de Acinetobacter spp. (46%) e P. aeruginosa

(11%) (Vahaboglu et al. 1997).

Durante anos, pensou-se que a presença de genes que codificam β-lactamases PER

fosse significativa somente na Turquia (PER-1) e na Argentina (PER-2) (Danel et al.

1995; Bauernfeind et al. 1996). No entanto, a identificação do gene blaPER-1 tem sido

relatada recentemente em vários países da Europa (Miro et al. 2005; Hou et al. 2007;

Naas et al. 2007b), Coréia do Sul (Yong et al. 2003; Jeong et al. 2005), China (Hou et

al. 2007) e Japão (Yamano et al. 2006).

Este gene codifica uma enzima que está classificada na classe A de Ambler

(Nordmann & Naas 1994) e confere resistência às penicilinas, cefotaxima, aztreonam

monobactâmico, porém é sensível aos carbapenemas e cefamicinas. A sua atividade é

inibida pelo ácido clavulânico. É um gene comum entre as espécies de Acinetobacter

(Paterson & Bonomo 2005; Poirel et al. 2005).

Estudos recentes têm mostrado uma correlação positiva entre a formação de

biofilme e a presença da β-lactamase de espectro estendido (ESBL – extended spectrum

β-lactamase) codificada pelo gene blaPER-1 entre os isolados de A. baumannii (Sechi et

al. 2004; Lee et al. 2008).

1.5 FORMAÇÃO DE BIOFILMES

Os isolados de A. baumannii têm sido avaliados quanto à capacidade de sobreviver

longos períodos de tempo em superfícies abióticas com habilidade de tolerar a

dessecação (Roberts et al. 2001; Gaddy & Actis 2009), devido a fatores de virulência

como a habilidade em captar o ferro do meio ambiente, sobrevivendo em condições de

déficit de ferro, produção de cápsula polissacarídica, capacidade de aderência a diversas

superfícies e às células do epitélio respiratório por meio de estruturas como pili,

fímbrias, proteínas de membrana externa (OMP) e presença de genes relacionados à

formação de biofilme (Tomaras et al. 2003; Wroblewska et al. 2008; Smani et al. 2012).

18

A potencial habilidade de A. baumannii para formar biofilmes pode explicar sua

excelente resistência a antibióticos e propriedades de sobrevivência (Tomaras et al.

2003; Rao et al. 2008). Gaddy & Actis (2009) e Lee et al. (2008) relataram a formação

de biofilme de A. baumannii em poliestireno. Vidal et al. (1997) destacam que poucos

estudos têm mostrado a capacidade destes isolados clínicos em formar estruturas de

biofilme em superfícies de vidro. Biofilmes bacterianos, arranjo em que as células são

morfológica, metabólica e fisiologicamente diferentes de suas contrapartes planctônicas,

foram observados associados a dispositivos médicos pela primeira vez em 1980 quando,

por microscopia eletrônica, foram visualizadas bactérias depositadas sobre a superfície

de dispositivos de longa permanência, como catéteres intravenosos e marca-passos. A

formação de biofilme também tem sido observada em tubos de incubação, catéteres,

válvulas cardíacas artificiais, catéteres de diálise peritoneal, linhas de água e

instrumentos (figura 5) (Tomaras et al. 2003; Hall-Stoodley et al. 2004).

Os biofilmes são notoriamente difíceis de erradicar, sendo fonte de muitas

infecções crônicas. Um biofilme maduro pode tolerar uma concentração de antibióticos

na ordem de 10 a 100 vezes maior do que é necessário para matar as bactérias

planctônicas. Bactérias em biofilmes são resistentes à fagocitose, tornando

extremamente difícil a erradicação de biofilmes em hospedeiros (Mohamed & Huang

2007). Pouco se sabe sobre a formação de biofilme em A. baumannii (Rao et al. 2008;

Rodriguez-Bano et al. 2008).

19

Figura 5. Desenho esquemático mostrando três exemplos de possíveis pontos de entrada no

corpo para biofilmes infecciosos. O biofilme pode ser disseminado em todo o corpo, quer por

células individuais ou aglomerados de êmbolos protegidos, os quais podem ganhar a corrente

sanguínea próxima aos pontos de entrada (setas). Desprendimentos esporádicos podem levar a

ciclos de bacteremia.

Fonte: Adaptado de Hall-Stoodley et al. (2004).

20

1.5.1 Biofilme

Biofilme é uma comunidade microbiana séssil altamente estruturada (Tomaras et al.

2003; Lee et al. 2008), que é caracterizado por células que são irreversivelmente ligadas

a superfícies bióticas ou abióticas e incorporadas em uma matriz hidratada de

substâncias exopoliméricas, proteínas, polissacarídeos e ácidos nucleicos (Mohamed &

Huang 2007; Lee et al. 2008).

A formação de biofilme é um processo complexo que envolve o desenvolvimento

de fixação e imobilização sobre uma superfície, a interação célula-a-célula, a formação

de microcolônias, a formação de um biofilme confluente e o desenvolvimento de uma

estrutura tridimensional de biofilme. As bactérias em um biofilme se comportam de

maneira diferente de sua forma livre. A regulação da expressão do gene bacteriano em

resposta à densidade de população celular, chamado quorum-sensing, é realizado

através da produção de moléculas de sinais extracelulares, chamados autoindutores

(Mohamed & Huang 2007; de Breij et al. 2010).

Vários fatores ambientais regulam a formação do biofilme bacteriano, tais como

variações na disponibilidade de nutrientes, de oxigênio e de pH e a concentração de

metabólitos bacterianos, o que provoca diferenças entre os biofilmes, de modo que um

biofilme formado numa corrente difere de um formado sobre tecido biológico (Singh et

al. 2006).

No biofilme as bactérias são protegidas contra as defesas do hospedeiro e contra a

ação de antimicrobianos (Shannon et al. 2010).

1.5.2 Formação e maturação do biofilme

Biofilmes não são simplesmente um conjunto de células passivas que estão presas à

superfície, mas são sistemas biológicos complexos que possuem estrutura e são

dinâmicos (figura 6) (Hall-Stoodley et al. 2004). A formação do biofilme é geralmente

descrita como uma série de fases discretas em um ciclo de vida (figura 7), que se inicia

quando as células planctônicas aderem a uma superfície (Nadell et al. 2009). Após a

fixação inicial ocorre divisão binária, resultando na agregação das células aderidas

(Melchior et al. 2006). A aderência inicial geralmente é reversível, de modo que as

células podem se afastar da superfície se as condições alteram. Algumas bactérias

podem posicionar-se usando pili, permitindo a movimentação entre as bactérias e ao

longo do substrato sólido (Nadell et al. 2009).

21

Estes agregados de células primárias produzem exopolissacarídeos para facilitar a

agregação. Assim a fase inicial da formação de biofilme envolve duas etapas: a primeira

fase compreende a aderência das células a uma superfície, facilitada pelas adesinas

associadas à parede celular, que são produtos de diferentes genes. Nesta etapa ocorre a

liberação de autoindutores do quorum-sensing. A aderência às superfícies poliméricas

nativas é aumentada na presença de proteínas de matriz, incluindo fibronectina e

fibrinogênio. A segunda etapa é caracterizada por multiplicação celular e formação de

uma estrutura madura que consiste em muitas camadas de células, ligadas entre si por

polissacarídeos extracelulares. Finalmente no processo de maturação, os componentes

extracelulares interagem com as moléculas orgânicas e inorgânicas do meio

favorecendo a produção de glicocálice, ocorrendo ligações iônicas e protegendo as

células do biofilme (Melchior et al. 2006).

Figura 6. Conceituação de desenvolvimento de biofilme e comportamento dinâmico em cada

etapa da formação.

Fonte: Adaptado de Hall-Stoodley et al. (2004).

22

Figura 7. Representação esquemática das várias etapas de desenvolvimento de um biofilme de

acordo com o modelo aceito para Pseudomonas aeruginosa.

Fonte: Adaptado de Ghigo (2003)

1.5.3 Sistema quorum-sensing

Quorum-sensing é um mecanismo de sinalização célula-célula que se refere à

capacidade das bactérias para responder a moléculas químicas, chamadas autoindutores

(AI), no seu ambiente de uma forma dependente da dose. Os AI podem ser produzidos a

partir de bactérias de mesma espécie ou de gêneros diferentes (Kaper & Sperandio

2005).

Nos diferentes organismos que realizam o quorum-sensing, o processo segue

essencialmente as mesmas etapas. Quando a concentração de AI atinge um limiar

crítico, as bactérias detectam e respondem a este sinal, alterando a expressão do seu

gene alvo. Este fenômeno permite que as bactérias ajam como uma unidade coletiva

(Kaper & Sperandio 2005). O nível de especificidade e de controle é intrigante, dadas as

complexidades associadas com as comunidades microbianas: os biofilmes bacterianos

geralmente são formados por múltiplas espécies, onde cada uma das espécies pode

produzir múltiplos sinais, e o circuito de resposta utilizado por esses sinais também está

interligado (Jayaraman & Wood 2008).

A primeira caracterização de quorum-sensing foi na bactéria marinha Vibrio

fischeri. Esta espécie vive em associação com diferentes hospedeiros animais marinhos

e pode colonizar o órgão de luz do hospedeiro, na qual cresce a altas densidades

emitindo luminescência. Quando as bactérias encontram-se livres na água do mar, a

luminescência não é observada. Ou seja, V. fischeri produz um complexo enzima

23

luciferase codificado pelos genes luxCDABEGH que é responsável pela produção de

luz. No entanto, a transcrição do operon lux e subsequente produção de luz ocorrem

apenas em altas densidades de V. fischeri, e são reprimidos em baixas densidades

(Kaper & Sperandio 2005: Jayaraman & Wood 2008).

O quorum-sensing é mediado de forma semelhante ao de V. fischeri na maioria das

bactérias Gram-negativas. Esse sistema codifica uma gama de funções, incluindo a

produção de sideróforo, a divisão celular, a síntese de polissacarídeo e motilidade

(Jayaraman & Wood 2008; Christiaen et al. 2011).

1.5.4 Resistência e Formação de Biofilme

Os mecanismos de resistência a antibióticos conhecidos, tais como bombas de

efluxo, enzimas modificadoras e mutações alvo (Walsh 2000), não parecem ser

responsáveis pela proteção de bactérias em um biofilme. Mesmo bactérias sensíveis que

não têm uma base genética conhecida para resistência podem ter a sensibilidade

profundamente reduzida quando elas formam biofilme (Stewart & Costerton 2001).

Quando as bactérias estão dispersas de um biofilme, geralmente tornam-se rapidamente

suscetíveis a antibióticos (Anwar et al. 1989; Williams et al. 1997), o que sugere que a

resistência das bactérias em biofilme não é adquirida através de mutações ou elementos

genéticos móveis. Os mecanismos de resistência a antibióticos convencionais não são

suficientes para explicar a maioria dos casos de infecções de biofilme resistentes a

antibióticos, porém este fato não exclui a possibilidade de que os mecanismos de

resistência convencionais sejam expressos em biofilmes contribuindo para a resistência

a antibióticos. Resistência a antibióticos convencionais pode ser desenvolvida em

biofilmes tratados repetidamente, ou por um longo período de tempo, contribuindo para

a persistência de infecções com biofilmes (Bagge et al. 2000).

Os mecanismos de resistência aos antibióticos no biofilme bacteriano estão

começando a ser elucidados (Mah & O'Toole 2001); a figura 8 mostra três principais

hipóteses. A primeira hipótese é a possibilidade de lenta ou incompleta penetração do

antibiótico no biofilme. A mensuração da penetração de antibióticos em biofilmes in

vitro tem mostrado que alguns antibióticos permeiam facilmente o biofilme bacteriano

(Stewart 1996). Não existe nenhuma barreira genérica para a difusão de solutos, do

tamanho de antibióticos, através da matriz do biofilme, que é principalmente água

(Stewart 1998). No entanto, se o antibiótico é desativado no biofilme, a penetração pode

ser retardada. No biofilme tipo-selvagem, o antibiótico é desativado nas camadas

24

superficiais mais rapidamente do que se difunde. Antibióticos que adsorvem na matriz

do biofilme também podem ter uma penetração retardada, o que pode explicar a

penetração lenta de antibióticos aminoglicosídeos (Kumon et al. 1994; Shigeta et al.

1997). Esses agentes carregados positivamente se ligam a polímeros carregados

negativamente na matriz do biofilme (Gordon et al. 1988; Nichols et al. 1988).

A segunda hipótese depende de um microambiente químico alterado dentro do

biofilme. Microescala de gradientes em concentrações de nutrientes são uma

característica bem conhecida de biofilmes. Resultados de estudos com eletrodos

miniaturizados têm mostrado que o oxigênio pode ser totalmente consumido nas

camadas superficiais de biofilme, levando a nichos anaeróbios em camadas profundas

do biofilme (de Beer et al. 1994). Os aminoglicosídeos são menos eficazes contra o

mesmo organismo em condições anaeróbias do que em condições aeróbias (Tack &

Sabath 1985). Alternativamente, a depleção de substratos ou acúmulo de um produto

inibidor residual podem levar à inibição da expansão de algumas bactérias, protegendo-

as da morte. As penicilinas, que têm como alvo a síntese de parede celular, inibe apenas

o crescimento bacteriano (Tuomanen et al. 1986). Esta segunda hipótese é reforçada

pela visualização experimental direta de zonas metabolicamente inativas dentro de

biofilmes alimentados continuamente (Xu et al. 2000). Além disso, o ambiente

osmótico dentro de um biofilme pode ser alterado, levando à indução de uma resposta

de estresse osmótico (Prigent-Combaret et al. 1999). Tal resposta pode contribuir para

resistência aos antibióticos, alterando as proporções relativas das porinas de uma

maneira que reduz a permeabilidade do envelope celular aos antibióticos (Stewart &

Costerton 2001).

Um terceiro mecanismo da resistência aos antibióticos é que uma subpopulação

de micro-organismos num biofilme forma um único, e altamente protegido, estado

fenotípico – uma diferenciação celular semelhante à formação de esporos. Esta hipótese

está apoiada nos resultados que mostram que há resistência em biofilmes recém-

formados, mesmo que ainda sejam muito finos para representar uma barreira para a

penetração de um agente antimicrobiano ou substratos metabólicos (Das et al. 1998;

Cochran et al. 2000). Além disso, as bactérias no biofilme, mas não todas, são

rapidamente mortas por antibióticos (Goto et al. 1999; Brooun et al. 2000). As bactérias

sobreviventes, que podem consistir de 1% ou menos da população original, persistem

apesar da exposição continuada ao antibiótico. A hipótese de um estado letárgico

semelhante a esporos, aceita para algumas bactérias do biofilme, proporciona uma

25

poderosa e genérica explicação para a redução da susceptibilidade de biofilmes a

antibióticos e desinfetantes (Stewart & Costerton 2001).

Figura 8. Três hipóteses para os mecanismos de resistência a antibióticos em biofilmes. A

superfície de fixação é mostrada na parte inferior e a fase aquosa contendo o antibiótico, na

parte superior.

Fonte: Adaptado de Stewart & Costerton (2001)

26

1.6 EPIDEMIOLOGIA

As infecções por A. baumannii têm sido uma questão clínica substancial em muitas

partes da Europa (figura 9) (Van Looveren & Goossens 2004). Desde o início de 1980,

os surtos de infecções hospitalares por este patógeno na Europa, principalmente na

Inglaterra, França, Alemanha, Itália, Espanha e Holanda (Bergogne-Berezin & Towner

1996; Villegas & Hartstein 2003; Fournier & Richet 2006), foram investigados usando

métodos epidemiológicos de tipagem molecular. Na maioria dos casos, um ou dois

isolados epidêmicos foram detectados num dado contexto epidemiológico. A

transmissão de tais isolados tem sido observada entre hospitais, muito provavelmente

através de transferência de pacientes colonizados (Turton et al. 2004; van den Broek et

al. 2006; Da Silva et al. 2007).

Figura 9. Países que relataram surtos por Acinetobacter baumannii resistentes aos

carbapenêmicos. Em vermelho os surtos relatados antes de 2006, e em amarelo os surtos

relatados após 2006.

Fonte: Adaptado de Peleg et al. (2008)

A propagação de A. baumannii multidrogas resistentes (MDR) não se limita aos

hospitais dentro de uma cidade, mas também ocorre em escala nacional. Exemplos são a

propagação do clone denominado Sudeste e o OXA-23 clones 1 e 2 no Sudeste da

Inglaterra (Coelho et al. 2006; Turton et al. 2004), a disseminação de um clone A.

baumannii mutidroga resistente em Portugal (Da Silva et al. 2007), a propagação inter-

hospitalar do clone A. baumannii produtora de VEB-1 de espectro estendido de um total

de 55 centros médicos no norte e sudeste da França (Naas et al. 2006) e da propagação

27

de um clone A. baumannii resistente à amicacina observada em nove hospitais em várias

regiões na Espanha (Vila et al. 1999). A transferência internacional de pacientes

colonizados tem levado à introdução e disseminação da epidemia subsequente de

isolados A. baumannii MDR do sul em países do norte da Europa, como a Bélgica e a

Alemanha (Schulte et al. 2005; Bogaerts et al. 2006). A propagação intercontinental

também foi descrita entre a Europa e outros países, como consequências de viagem de

avião (Peleg et al. 2006a; Naas et al. 2007a). Estes eventos destacam a importância do

rastreio adequado e possível isolamento de pacientes com altas taxas de organismos

resistentes às drogas.

Na América do Norte há um destaque para os Estados Unidos, onde no período de

1991 e 1992 foram observados surtos de CRAB em um hospital de Nova York (Griffith

et al. 2006). Os organismos neste surto foram MDR, mantendo a susceptibilidade

somente para polimixinas e ampicilina/sulbactam (Griffith et al. 2006). Outros hospitais

de Nova York tiveram surtos clonais de A. baumannii MDR ou pan-drogas resistentes

(PDR) (Durand et al. 1993; Jones et al. 2004; Griffith et al. 2006; Landman et al. 2007),

e surtos semelhantes têm sido frequentemente relatados em muitas outras regiões dos

Estados Unidos (Jones et al. 2004; Maslow et al. 2005; Lolans et al. 2006). Uma

importante contribuição para a epidemiologia das infecções com A. baumannii nos

Estados Unidos foi o retorno de militares que lutaram no Iraque ou no Afeganistão

(Davis et al. 2005; Murray et al. 2006; Scott et al. 2007). Um aumento nas infecções por

A. baumannii foi descrita pela primeira vez em militares americanos em março de 2003,

logo após que as operações de combate começaram no Iraque. Os militares mais

acometidos foram primeiro tratados em hospitais de campanha, antes de serem

encaminhados para o Centro Médico Regional Landstuhl (Alemanha) ou Walter Reed

Army Medical Center (Estados Unidos) (Scott et al. 2007). A maioria destas infecções

foi detectada no momento ou logo após a admissão a essas instituições (Murray et al.

2006; Scott et al. 2007).

Os dados sobre o grau de resistência de A. baumannii na África são em grande parte

limitados à África do Sul, embora hajam relatos esparsos de outros países (Iregbu et al.

2002; Nejjari et al. 2003). Brink et al. (2007) mostraram que cerca de 30% de isolados

de A. baumannii de corrente sanguínea de pacientes na África do Sul são resistentes aos

carbapenêmicos, mais de 40% são resistentes à cefepima e piperacilina/tazobactam, e

mais de 30% são resistentes à ciprofloxacina e levofloxacina. Esses isolados resistentes

28

são endêmicos em algumas unidades, por exemplo queimaduras e UTIs, e foram

disseminados inter institucionalmente (Marais et al. 2004)

Numerosos surtos têm sido documentados em hospitais na Ásia e Oriente Médio

(figura 9), e uma variedade de carbapenemases também tem sido descritas (Afzal-Shah

et al. 2001; Abbo et al. 2005; Ko et al. 2007). Taxas de resistência em isolados

SENTRY (2001 – 2004) na região Ásia-Pacífico, foram superiores a 25% para

imipenem e meropenem, 40% para cefepima e ceftazidima, 40% para

ampicilina/sulbactam, 35% para amicacina e 45% para ciprofloxacina (Gales et al.

2006). A resistência para a tigeciclina (Navon-Venezia et al. 2007) e polimixina B

(Gales et al. 2006; Ko et al. 2007) já foi descrita para essa região.

O primeiro surto australiano descrito de A. baumannii adquirido em hospital foi na

Austrália Ocidental (Riley et al. 1996). Estes isolados foram resistentes à gentamicina,

cefalosporinas e ticarcilinas, com alguns isolados também resistentes à ciprofloxacina.

A análise epidemiológica molecular identificou que 11% das amostras provenientes das

mãos de funcionários foram positivas para o mesmo isolado de A. baumannii que

causou a infecção dos pacientes (Riley et al. 1996). Mais recentemente, surtos de A.

baumannii têm afetado outras grandes cidades ao longo da costa leste da Austrália,

incluindo Brisbane, Sydney e Melbourne (Peleg et al. 2006b; Playford et al. 2007;

Valenzuela et al. 2007). Estes surtos têm envolvido isolados CRAB, com OXA-23

contribuindo para este fenótipo (Valenzuela et al. 2007). Surtos de A. baumannii

resistentes a carbapenêmicos também ocorreram na Polinésia Francesa (Naas et al.

2005).

Segundo Turton et al. (2006b), as taxas de resistência ao imipenem, meropenem,

ceftazidima, piperacilina/tazobactam, ciprofloxacina e gentamicina na América Latina,

parecem estar entre as mais altas do mundo. Em estudo de vigilância envolvendo

Argentina, Brasil, Chile e Colômbia, de 1997 a 2001, as taxas de resistência foram mais

elevadas na Argentina, mas em todos os países foram isolados micro-organismos

multirreristentes (Tognim et al. 2004).

Outra questão é a detecção do gene blaPER-1, que desde 1995 tem se disseminado

na Itália (Docquier et al. 2001) e, mais recentemente, na Bélgica (Claeys et al. 2000),

França (De Champs et al. 2004), Espanha (Miro et al. 2005), Romênia (Naas et al.

2007b), Coréia (Jeong et al. 2005), Japão (Yamano et al. 2006) e China (Hou et al.

2007), sendo mais comumente encontrado em espécies de Pseudomonas aeruginosa. A

presença do gene blaPER-1 em espécies de Acinetobacter, tem sido relatada na Coréia,

29

codificando resistência à cefepima e ceftazidima (Yong et al. 2003) e na Turquia

conferindo resistência à ceftazidima, meropenem e imipenem (Kolayli et al. 2005).

No Brasil não existem muitos dados sobre infecções nosocomiais por

Acinetobacter. De acordo com Turrini & Santo (2002), mesmo com a legislação vigente

no país, os dados sobre infecção hospitalar são pouco divulgados pelo fato de não serem

consolidados por muitos hospitais, o que tem dificultado a aquisição de um diagnóstico

que retrate a dimensão real do problema no país. A Organização Mundial de Saúde

considera um índice médio aceitável de infecção hospitalar entre 9% a 20% por espécies

bacterianas. Segundo o Ministério da Saúde e uma pesquisa realizada e publicada em

1995 no Brasil, a taxa média de infecção hospitalar é cerca de 15%, porém este índice

varia significativamente, já que está diretamente relacionado com o grau de atendimento

e complexidade de cada hospital (ANVISA 2004b).

Em hospitais brasileiros, A. baumannii MDR constituem uma causa grave de

infecção hospitalar, compreendendo 8,8% do total de isolados bacterianos nosocomiais

que causam infecções em pacientes de UTI, de acordo com o Programa Brasil MYSTIC

(Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) (Kiffer et al. 2005). A

este respeito, os carbapenêmicos permanecem como a opção terapêutica de amplo

espectro para o tratamento de tais infecções. Contudo a resistência a esses agentes

antimicrobianos tem aumentado, resultando na utilização de agentes potencialmente

mais tóxicos, tais como as polimixinas (Fernandez-Cuenca et al. 2003). Embora altas

taxas de resistência aos carbapenêmicos entre isolados de Acinetobacter sp. tenham sido

relatadas, muito pouco se sabe sobre os mecanismos de resistência. De acordo com os

relatórios do Programa Brasil MYSTIC, A. baumannii foi o quarto patógeno mais

prevalente isolado de pacientes hospitalizados em 20 centros brasileiros e apresentou

altas taxas de resistência a todos os antimicrobianos testados (Kiffer et al. 2005).

Dalla-Costa et al. (2003) relataram um surto por CRAB produtores da enzima

OXA-23 em dois hospitais de Curitiba (PR), assim como Schimith Bier et al. (2010)

que detectou OXA-23 nos 172 isolados de CRAB , os quais apresentaram sensibilidade

somente à tigeciclina e polimixina B. Em estudo publicado por Carvalho et al. (2009),

foi comum a ocorrência de isolados A. baumannii MDR produtoras de OXA-23

disseminados em hospitais públicos e privados do Rio de Janeiro (RJ), as quais

apresentaram resistência ao meropenem, ciprofloxacina, amicacina, cefepima,

ceftazidima, piperacilina/tazobactam e ampicilina/sulbactam. A detecção desta enzima

em isolados de CRAB também foi relatada por Martins et al. (2009), em estudo

30

realizado na cidade de Porto Alegre (RS), onde todos apresentaram resistência ao

imipenem, meropenem, piperacilina/tazobactam, gentamicina e ciprofloxacina. Além de

detectar OXA-23 em todos os isolados, Werneck et al. (2011b) em estudo realizado em

oito cidades de quatro diferentes regiões geográficas brasileiras, também detectou a

sequência de inserção ISAba1 à montante de OXA-23 em todos os isolados. A

resistência aos carbapenêmicos foi relatada para 83,5% dos isolados que possuíam

OXA-23, porém o autor não destaca quantos, dentre estes, possuíam ISAba1.

Até o momento, o único relato que se tem de OXA-40 no Brasil foi publicado por

Werneck et al. (2011a), o qual foi detectado em um isolado de A. baumannii, sendo este

o único isolado do estudo. O mesmo apresentou susceptibilidade à polimixina B e

colistina, redução de susceptibilidade para ampicilina/sulbactam e resistência para

ceftazidime, cefepime, imipenem, meropenem, ciprofloxacina e amicacina.

A detecção do gene OXA-58 no Brasil, Rio de Janeiro, foi relatada por Figueiredo

et al. (2011), apresentando resistência à amicacina, ceftazidima, ciprofloxacina,

cefepima, gentamicina, imipenem, meropenem e piperacilina/tazobactam e por Gusatti

et al. (2012), apresentando ISAba1 à montante do gene e expressando resistência ao

imipenem.

O gene OXA-51 foi detectado em todos os isolados de A. baumannii mencionados

nos estudos brasileiros supracitados.

Em Goiás foi detectado um surto de infecção hospitalar em fevereiro de 2009 pela

Superintendência de Vigilância Sanitária e Ambiental (Svisa), no Hospital de Urgências

de Aparecida de Goiânia (HUAPA). Foram 83 mortes no período de janeiro de 2009 a

janeiro de 2010. A taxa de infecção hospitalar chegou a 88,23% em abril de 2009. De

acordo com a Sociedade Brasileira de Terapia Intensiva (SOBRATI) a taxa de infecção

em todas as alas de um hospital deve chegar, no máximo, a 2% e nas UTI entre 10 e

15%. A contaminação se deve a vários tipos de bactérias, porém a mais comum, letal e

mais persistente nas UTI são as A. baumannii MDR (SVS 2010).

Um relatório técnico da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) caracterizou, através

de tipagem molecular, os isolados bacterianos de sua rede de monitoramento de

resistência e incluiu 540 amostras enviadas pelos Laboratórios Centrais do Brasil, entre

agosto/2009 e julho/2010. Das 540 amostras recebidas, 165 amostras eram isolados de

A. baumannii. Dos 165 isolados de A. baumannii, 89 amostras foram encaminhadas

pelo LACEN/GO: 13 amostras (de três hospitais de Goiânia) tinham 11 isolados

positivos para OXA-23, e 76 amostras (consideradas de um surto) tinham 66 isolados

31

positivos para OXA-23. Todas as 89 amostras enviadas pelo LACEN/GO pertenciam a

três hospitais públicos goianos e confirmam a presença de padrão genômico de

resistência aos carbapenêmicos no estado de Goiás (FIOCRUZ-Rio de Janeiro, 2010

apud Godoy 2012).

Não foram encontrados relatos sobre a detecção dos genes OXA-40, OXA-58 e

ISAba1 no Estado de Goiás, e do gene blaPER-1 no Brasil.

32

2 JUSTIFICATIVA

Acinetobacter baumannii é um importante patógeno adquirido em hospitais que

causa uma variedade de infecções em seres humanos, especialmente em pacientes

imunocomprometidos (Dalla-Costa et al. 2003; Dijkshoorn et al. 2007). Em hospitais

brasileiros, A. baumannii MDR constituem uma causa significativa de infecção

hospitalar (Kiffer et al. 2005). A resistência a múltiplas drogas mediadas por enzimas do

tipo OXA e a sua capacidade de formar biofilme sob condições de estresse, contribuem

para sua persistência no cenário hospitalar e representam importantes fatores de

virulência (Poirel & Nordmann 2006a, 2006b; Perez et al. 2007; Feizabadi et al. 2008).

Embora seja relevante, poucos estudos tem relacionado a presença do gene blaPER-

1 com a formação de biofilme, cujos resultados já apresentados têm sido conflitantes.

Sechi et al. (2004) relaciona a produção de blaPER-1 com a aderência, enquanto Lee et

al. (2008) sugere que a presença do gene seja altamente significativa para a aderência e

formação de biofilme. Em contrapartida, a ocorrência de CHDLs tem sido relatada entre

isolados clínicos de A. baumannii em todo o mundo. Os primeiros relatos de OXA-23,

OXA-40 e OXA-58 em CRAB no Brasil foram em 2003, 2010 e 2012, respectivamente

(Dalla-Costa et al. 2003; Werneck et al. 2011a; Gusatti et al. 2012).

Na tentativa de justificar a multirresistência dos isolados investigados, este estudo

analisou a capacidade de formação de biofilme em poliestireno a partir de 84 isolados

clínicos, provenientes de pacientes de cinco UTIs de quatro instituições de referência (3

públicas e 1 filantrópica), que adquiriram A. baumannii através de infecção hospitalar.

Através da técnica de biologia molecular de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi

investigada a presença do gene blaPER-1, a qual foi correlacionada com a formação de

biofilme em poliestireno, e dos genes OXA-23, OXA-40, 0XA-51, OXA-58 e ISAba1,

cujas presenças foram relacionadas com a resistência aos antibióticos carbapenêmicos,

tais como imipenem, meropenem, e também à ampicilina/sulbactam,

piperacilina/tazobactam, ceftazidima, amicacina, gentamicina, ciprofloxacina,

levofloxacina, polimixina B/colistina, tetraciclina, tigeciclina e cefepima.

Considerando que não foram encontrados relatos da identificação de alguns

destes genes em A. baumannii no Estado de Goiás, nem mesmo no Brasil para o gene

blaPER-1, e prevendo possível relevância destes achados, este estudo tem como

objetivo contribuir para um melhor entendimento da real prevalência das β-lactamases

33

nos hospitais goianos e, consequentemente, auxiliar nas ações de controle dos isolados e

na redução das infecções por A. baumannii.

Cabe ressaltar a importância deste estudo, de grande relevância para o sistema de

saúde, uma vez que os resultados apresentados possibilitam uma análise qualitativa,

comparativa e complementar a outras abordagens científicas do tema, auxiliando na

implementação de estratégias visando a redução dos surtos hospitalares, bem como na

conscientização dos profissionais de saúde quanto à necessidade de maior rigor na

prescrição de antimicrobianos, contribuindo assim para o bem estar da população.

34

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Analisar a capacidade de formação de biofilme em poliestireno de isolados de

Acinetobacter baumannii e caracterizar, por biologia molecular, a presença dos

genes blaPER-1, blaOXA-23, blaOXA-40, blaOXA-51, blaOXA-58, ISAba1.

3.2 ESPECÍFICOS

Analisar a capacidade dos isolados formarem biofilme em poliestireno;

Investigar a presença do gene blaPER-1 nos isolados;

Avaliar a relação entre a formação (ou não) de biofilme e a presença do gene

blaPER-1;

Avaliar a relação entre a formação (ou não) de biofilme e a resistência aos

antibióticos;

Investigar a prevalência dos genes β-lactamases OXA-23, OXA-40, OXA-51 e

OXA-58 e a presença de ISAba1 à montante dos genes OXA;

Correlacionar a presença de ISAba1 com os níveis de resistência aos

carbapenêmicos.

35

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ASPECTOS ÉTICOS

As coletas das amostras usadas neste estudo foram realizadas de acordo com as

normas de conduta da ética médica, após assinatura do Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido (TCLE), aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa das instituições

envolvidas (Protocolos: CEPACCG N° 005/10; HC/UFG N° 070/2010 e HDT N°

002/2010), pelos pacientes e/ou seus responsáveis, nos quais estavam claros os

procedimentos e objetivos do projeto (Anexo I).

4.2 RECRUTAMENTO DOS CASOS E COLETAS DE AMOSTRAS CLÍNICAS

Trata-se de um estudo transversal de caracterização fenotípica e molecular de

isolados clínicos de Acinetobacter baumannii. Para este estudo foram usados os

isolados clínicos provenientes de um estudo anterior (Infecções por Acinetobacter

baumannii em adultos admitidos em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) de Goiânia

e Aparecida de Goiânia), onde foram coletadas 84 amostras de Acinetobacter

baumannii de 64 pacientes adultos no período de julho a dezembro de 2010 nos

seguintes locais:

UTI de atendimento clínico (UTI-1) e UTI de atendimento cirúrgico (UTI-2), com

oito leitos cada, pertencentes a um hospital universitário com 300 leitos;

UTI (UTI-3) de atendimento clínico com nove leitos, pertencente a um hospital

estadual de referência no tratamento de doenças infecciosas e parasitárias com 126

leitos;

UTI (UTI-4) de atendimento cirúrgico com nove leitos, pertencente a um hospital

filantrópico de referência em câncer no Estado de Goiás, com 211 leitos;

UTI (UTI-5) de atendimento clínico com dez leitos, pertencente a um hospital

estadual de referência em urgências com 75 leitos, em Aparecida de Goiânia.

36

4.3 ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE MICROBIANA

A coleta dos espécimes biológicos ocorreu conforme a indicação da equipe

médica assistente, sendo que todas as UTIs possuíam assistência de médico

infectologista. As amostras foram encaminhadas e identificadas no laboratório de

referência local segundo a rotina de cada unidade hospitalar, por método automatizado

e/ou manual.

As amostras da UTI-3 e UTI-5 foram encaminhadas ao Laboratório Central de

Saúde Pública (LACEN) e as da UTI-4 para o laboratório do próprio hospital, onde as

culturas foram processadas pelo método manual, com isolamento da bactéria em ágar

MacConkey e identificação através da bacterioscopia com coloração pelo método de

Gram e por provas bioquímicas: motilidade (IAL), crescimento a 42°C, utilização do

citrato, OF-glicose, produção de oxidase, urease, hidrólise da bile-esculina, testes de

descarboxilação (lisina, ornitina e arginina) e OF-lactose a 10%. A avaliação da

susceptibilidade do A. baumannii foi realizada por disco-difusão e pelo E-test®

(polimixina com MIC ≥ 4 µg/ml para resistência) (ANVISA 2004a; CLSI 2009 apud

Godoy 2012).

As amostras dos pacientes das UTIs 1 e 2 foram enviadas para o laboratório

próprio do hospital, que utilizou o equipamento Vitek II (sistema automatizado) para

identificação da bactéria pela provas: DP-300, p-cumarico, controle de crescimento,

acetamida, esculina, indican vegetal, manitol, xilose, rafinose, sorbitol, H2S, sacarose,

inositol, adonitol, raminose, L-arabinose, fermentação de ONPG, glicose

(fermentativa), testes de descarboxilação (lisina, ornitina e arginina).

A determinação da susceptibilidade do A. baumannii foi realizada para os

seguintes antimicrobianos: imipenem, meropenem, ampicilina/sulbactam,

piperacilina/tazobactam, ceftazidima, amicacina, gentamicina, ciprofloxacina,

levofloxacina, polimixina B/colistina, tetraciclina, tigeciclina e cefepima. Todos os

laboratórios seguiram os padrões de susceptibilidade recomendados pelo Clinical and

Laboratorial Standards Institute 2009 (CLSI 2009 apud Godoy 2012).

Após os testes, confirmação e isolamento, as amostras de A. baumannii foram

encaminhadas para o Laboratório de Bacteriologia Molecular do Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública (IPTSP)-UFG e armazenadas em freezer -80°C.

37

4.4 TESTE DE VIABILIDADE DE Acinetobacter baumannii

As amostras mantidas no freezer -80°C foram reativadas em meio de cultura

sólido TSA (Tryptic Soy Agar) e incubadas por um período aproximado de 16 horas a

uma temperatura de 37°C. Após incubação, o crescimento foi analisado

microscopicamente pela coloração de Gram, onde observou-se cocobacilos Gram-

negativos, como esperado para confirmar a pureza das culturas de A. baumannii.

Com a confirmação, uma colônia isolada da placa com TSA foi repicada em meio

caldo TSB (Tryptic Soy Broth) e incubada nas mesmas condições supracitadas. Após

crescimento foram realizadas duas etapas, onde parte da cultura foi transferida para um

criotubo contendo glicerol 20%, na concentração de 1:1 (500 µL de cultura em 500 µL

de glicerol 20%) e armazenada em freezer -20°C. Na segunda etapa, foi realizada a

extração de DNA.

4.5 EXTRAÇÃO DE DNA CROMOSSOMAL

O DNA cromossomal foi extraído segundo a técnica de van Soolingen et al. (1994)

com pequenas adaptações. Primeiramente, transferiu-se 1,5 mL de cultura bacteriana

crescida para cada tubo de 1,5 mL tipo Eppendorf previamente identificado com a

respectiva amostra, sendo o mesmo centrifugado a 5000 g por 5 minutos, a 14°C.

Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido no vortex.

Nos mesmos tubos, foram adicionados 400µL de tampão TE, seguido de 6 µL de

lisozima (20mg/mL) e 1µL de enzima RNAse (10mg/mL) em cada. A solução foi

levada ao banho-maria a 37°C por 1,5 horas. Transcorrido este tempo, foi acrescentado

70µL de dodecil sulfato de sódio (10%) e 12 µL de proteinase K (20mg/mL). O sistema

foi então incubado por 10 minutos a 56°C. Posteriormente, adicionou-se 100µL de NaCl

5,0 M e 80µL de solução CTAB/NaCl (10% CTAB, 0,73 M NaCl). A solução foi

agitada lentamente até ficar com aspecto leitoso, sendo incubada por 10 minutos a 65°C.

Posteriormente, acrescentou-se 650 µL de clorofil (clorofórmio/álcool isoamílico, 25:1,

v/v), seguido de leve agitação por 30 segundos. A solução foi centrifugada por 12000 g

por 5 minutos a 10°C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo identificado, e

adicionou-se 400µL de isopropanol gelado e então o sistema foi homogeneizado e

incubado a -20°C por 24 horas.

38

Após o tempo necessário, as amostras foram centrifugadas a 18.000g, a 4°C por 20

minutos. Realizou-se a lavagem com 1mL de álcool etílico a 70% gelado e deixou-se

secar à temperatura ambiente por 30 minutos. O DNA extraído foi ressuspendido em 50

µL de água ultrapura MiliQ e estocado a -20°C.

4.6 EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL

Para extração do DNA plasmidial utilizou-se o método de lise alcalina de

Birnboimand Doly (1979), com pequenas adaptações. Foi transferido 1,5 mL de cultura

bacteriana crescida para tubos tipo Eppendorf, previamente identificados com as

respectivas amostras, sendo os mesmos centrifugados a 5000 g por 10 minutos a 10°C.

O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido com 210 µL da solução

I (150 mM TrisHCl, 10mM EDTA pH 8.0), posteriormente foi adicionando ao mix da

solução 1 µL de RNAse por amostra e em seguida foi homogeneizado em um vortex.

Em seguida foi adicionado 210 µL da solução II (200 mM NaOH, 1% SDS), misturados

por inversão dos tubos e incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Transcorrido

o tempo, foi adicionado 280 µL da solução III (acetato de sódio 3M, ácido Acético 2M,

pH 4,8-5,0), misturados imediatamente 10 vezes por inversão dos tubos e centrifugados

a 12000 g por 10 minutos a 10°C.

O sobrenadante foi transferido para um novo tubo previamente identificado ao qual

adicionou-se 560 µL de isopropanol gelado, o qual foi homogeneizado por inversão dos

tubos e incubados por 10 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram

centrifugados a 12000 g por 15 minutos a 10°C. O sobrenadante foi descartado e o

sedimento foi lavado com 500 µL de etanol a 70% gelado. O DNA extraído foi

ressuspendido em 30 µL água ultrapura MiliQ e estocado a -20°C.

4.7 TESTE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME EM POLIESTIRENO

A formação de biofilme foi analisada de acordo com o método de Tendolkar et al.

(2004) com pequenas alterações.

Os isolados armazenados em freezer-20°C foram reativados em caldo TSB e

incubados a 36°C sob agitação por 16 horas. As cepas A. baumannii ATCC 19606 e

Escherichia coli HB 101 foram usadas como controles positivo e negativo,

respectivamente, sendo cultivadas sob as mesmas condições.

39

Após crescimento, a densidade das culturas bacterianas foi ajustada com a escala

0,5 de McFarland, o que corresponde a um número aproximado de 1,5 x 108 bactérias.

Em uma placa de poliestireno de 96 poços de fundo chato foram pipetados 270 µL

de meio LB (Luria Bertani) diluído em água destilada para ¼ mais glicose a 0,2%

(LB¼-Gli) nos poços das linhas horizontais de A-G. Nos poços da linha horizontal H

foram pipetados 300 µL de LB¼-Gli, os quais foram usados para a leitura do

BRANCO. Foram pipetados 30 µL da cultura ajustada de cada isolado, em réplicas de

4, obtendo uma diluição da cultura bacteriana em 1:10. Nas fileiras horizontais F e G

foram pipetados 30 µL das culturas ajustadas controles positivo e negativo para a

formação de biofilme, respectivamente. A placa foi acondicionada em câmara úmida e

incubada a 29°C por 22 horas. A figura 10 ilustra a distribuição dos isolados em placa

de microtitulação.

Figura 10. Esquema representando a distribuição dos isolados e a disposição dos controles

positivo e negativo e do branco.

Compreendido o período da incubação, foi determinado o crescimento bacteriano

através da leitura da placa em leitor de ELISA em OD405nm. Em seguida, a placa foi

lavada cuidadosamente por 3 vezes com PBS 1X estéril usando pipeta multicanal,

invertida sobre papel toalha e deixada secar por 3 horas a temperatura ambiente.

Posteriormente foram adicionados 300µL de corante cristal violeta a 0,2% em água a

cada poço e a placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente que, depois

40

de aspirado o CV, cada poço foi lavado cuidadosamente 3 vezes com PBS 1X. Após

aspirar todo o PBS, foi adicionado 300µL de etanol-acetona (80:20, v/v) e feita leitura

em OD595nm.

As leituras obtidas nas OD 405 e 595 foram subtraídas pelo branco de cada

ensaio. A formação de biofilme determinada pela leitura a 595nm foi corrigida pelo

crescimento da cultura observada a 405nm, calculando-se a razão dos valores obtidos

(OD595-BRANCO / OD405-BRANCO). Os valores obtidos foram usados para se determinar a

média e o desvio padrão (dp) de cada amostra. A comparação estatística entre os

valores encontrados foi feita pelo teste t de student, e foram considerados valores

significativamente diferentes quando p<0,05.

Cada experimento foi repetido três vezes independentemente.

Para classificar os isolados como formadores de biofilme foram aceitos os

resultados em que o isolado apresentou uma média superior ao do controle negativo,

onde os valores do dp de ambos não se encontravam. Com base nestes resultados, foi

possível afirmar se o isolado formava maior, menor ou a mesma quantidade de biofilme

que o controle positivo, ao comparar a média do isolado em relação ao controle

positivo. Os isolados não-formadores de biofilme receberam esta classificação quando,

ao comparar as médias, os isolados apresentaram valores inferiores ao do controle

negativo ou tiveram o encontro entre os valores do dp. O experimento de cada placa foi

validado quando, pela comparação estatística do teste t do controle positivo em relação

ao controle negativo, o resultado foi inferior a 0,05. Os formadores de biofilme foram

classificados de acordo com a intensidade da formação do biofilme em forte, moderado

e fraco, utilizando a média obtida do quociente das leituras em leitor de ELISA (OD595-

BRANCO/OD405-BRANCO) nos três plaqueamentos e aplicadas à estatística descritiva

QUARTIS. Os valores a seguir foram atribuídos para a determinação de biofilme:

MÉDIA dos quocientes das ODs < 0,96 = FRACO

0,96 < MÉDIA dos quocientes das ODs < 1,92 = MODERADO

1,92 < MÉDIA dos quocientes das ODs = FORTE

4.8 IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA

A presença dos DNAs extraídos foi verificada em gel de agarose a 1% contendo

brometo de etídeo (0,5 µg/mL), visualizadas em fotodocumentador. Foram realizadas

PCRs usando oligonucleotídeos iniciadores para blaPER-1 (Poirel et al. 2005),

41

blaOXA-23, blaOXA-40, blaOXA-51, blaOXA-58 e ISAba1 (Sohrabi et al. 2012), cujas

sequências estão apresentadas na tabela 3.

Os sistemas de PCR foram preparados para um volume final de 20µL, onde em

tubos de 0,2mL foram adicionados 20 ηg de DNA, Tampão Green GoTaq (Promega),

0,47 µM de cada oligonucleotídeo iniciador específico, 250 µM de cada dNTP, e 1U de

Taq DNA Polimerase (Invitrogen).

Tabela 3. Oligonucleotídeos usados para detecção de blaPER-1, β-lactamases do tipo

OXA e ISAba1 em Acinetobacter baumannii.

Primers Tamanho do

produto (pb) Sequência (5’ - 3’)

Temperatura de

anelamento (°C)

blaPER-1 F 924

ATGAATGTCATTATAAAAGC 55

blaPER-1 R AATTTGGGCTTAGGGCAGAA OXA-23 F

1.057 GATGTGTCATAGTATTCGTCGT

50 OXA-23 R TCACAACAACTAAAAGCACTGT OXA-40 F

825 ATGAAAAAATTTATACTTCCTATATTCAGC

50 OXA-40 R TTAAATGATTCCAAGATTTTCTAGC OXA-51 F

641 AACAAGCGCTATTTTTATTTCAG

50 OXA-51 R CCCATCCCCAACCACTTTT OXA-58 F

453 AGTATTGGGGCTTGTGCT

49 OXA-58 R AACTTCCGTGCCTATTTG ISAba1 F

451 CATTGGCATTAAACTGAGGAGAAA

50 ISAba1 R TTGGAAATGGGGAAAACGAA

4.8.1 Identificação do gene blaPER-1

O termociclador modelo MJ96G (Biocycler) foi programado de acordo com

Vahaboglu et al. (1995), com algumas alterações, para uma desnaturação inicial de 95ºC

por 4 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação (90ºC, 30 seg), anelamento (55ºC, 40

seg) e extensão (72ºC, 1 min), com extensão final de 72ºC por 5 min. Os produtos das

PCRs foram analisados em gel de agarose 1,5% contendo brometo de etídeo (0,5μg/mL)

e visualizados em fotodocumentador. O marcador utilizado foi 1Kb plus DNA Ladder

(Invitrogen).

Para avaliar a correlação entre formação de biofilme bacteriano e presença do gene

blaPER-1, utilizou-se o teste de correlação e o teste exato de Fisher.

4.8.2 Identificação dos genes OXA e ISAba1

O termociclador modelo MJ96G (Biocycler) foi programado para uma desnaturação

inicial de 94°C por 4 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação (92°C, 1 min),

anelamento (temperatura de acordo com o oligonucleotídeo usado, ver tabela 3, 1 min) e

extensão (72°C, 1 min), com extensão final de 72°C por 5 min. Isolados que

42

apresentaram presença de qualquer um dos genes OXA pesquisados, foram re-

analisados quanto a associação entre ISAba1 e OXA-23, OXA-51 e OXA-58 em A.

baumannii. Para tanto os pares de oligonucleotídeos usados, foram uma combinação do

ISAba1 forward com um dos oligonucleotídeos reverse para OXA-23, OXA-51 e OXA-

58. Os produtos das PCRs foram analisados em gel de agarose 1,5%, contendo brometo

de etídeo (0,5μg/mL) e visualizados em fotodocumentador. Os marcadores utilizados

foram 1Kb plus DNA Ladder (Invitrogen), 1Kb Ladder DNA marker (Axygen) e 100bp

Ladder DNA marker (Axygen).

43

5 RESULTADOS

Este estudo é complementar ao trabalho de Godoy (2012), onde no período de

junho a dezembro de 2010 foram coletados espécimes biológicos em pacientes

hospitalizados em cinco UTIs de quatro hospitais. Dentre as amostras analisadas, 71

culturas coletadas de 57 pacientes foram positivas para Acinetobacter baumannii,

totalizando 10 pacientes com mais de uma amostra positiva.

5.1 FORMAÇÃO DE BIOFILME

Os isolados foram submetidos ao teste de formação de biofilme em placa de

poliestireno de 96 poços onde, dos 71 isolados clínicos, 57 foram classificados como

formadores de biofilme e 14 foram classificados como não-formadores de biofilme.

Entre os formadores de biofilme, 10% (6/57) foram classificados como fortes (>1,9),

10% (6/57) como moderados (1,9>0,95) e 79% (45/57) como fracos (<0,95).

5.2 GENE blaPER-1

Foram consideradas amostras positivas para o gene blaPER-1 aquelas onde seus

produtos obtidos por PCR apresentaram tamanho esperado de 924 pares de bases (pb).

Dentre os 71 isolados clínicos, o gene blaPER-1 foi detectado em 21 isolados.

5.3 RELAÇÃO DO GENE blaPER-1 COM A FORMAÇÃO DE BIOFILME

A relação entre a presença do gene blaPER-1 com a formação de biofilme pode ser

observada na tabela 4. Nesta, percebe-se que 45 amostras capazes de formarem biofilme

não contêm o gene blaPER-1.

44

Tabela 4. Relação entre presença do gene blaPER-1 com a formação de biofilme

bacteriano.

Formação de Biofilme Não Formação de

Biofilme Total

Presença do gene

blaPER-1 12 09 21

Ausência do gene

blaPER-1 45 05 50

Total 57 14 71

Relacionando a presença do gene blaPER-1 com a intensidade de formação de

biofilme, o gene blaPER-1 foi detectado em 33% (2/6) dos isolados que formaram

biofilmes moderados e 22% (10/45) dos isolados que formaram biofilmes fracos. O

gene não foi detectado nos isolados classificados como fortes formadores de biofilme

(tabela 5).

Tabela 5. Relação entre a intensidade da formação de biofilme e a presença do gene

blaPER-1.

BIOFILME

FORTE MODERADO FRACO

Nº de Isolados 6 6 45

Presença de blaPER-1 0 2 10

Considerando os resultados obtidos na tabela 4, foram aplicados os teste de

correlação obtendo valor de r igual a -0,34 e o teste de Fisher, obtendo valor de p igual

a 0,0025.

5.4 AMPLIFICAÇÃO DOS GENES OXA E ISAba1

Ao investigar a presença dos genes β-lactamases do tipo OXA, o gene OXA-51 foi

encontrado em todas as amostras. Das 71 amostras, 43 (61%) possuíam o OXA-23, e 19

(27%) possuíam o OXA-58. A coexistência de 2 e 3 genes OXA diferentes foi

observada 41% e 20% do isolados analisados, respectivamente. Nenhum isolado

apresentou amplificação para o gene OXA-40. O elemento de inserção ISAba1 foi

detectado em 72% (51/71) dos isolados.

45

Ao comparar os resultados com os testes de sensibilidade realizados em trabalho

precursor (Godoy 2012), foi observado que 96% (68/71) dos isolados expressaram

resistência a algum dos antibióticos testados e 76% (53/70) dos isolados foram

resistentes ao imipenem. O teste de sensibilidade para o imipenem não foi realizado em

01 isolado. Os resultados dos testes mostraram que a menor taxa de resistência foi

percebida contra polimixina B/colistina (10%) e tigeciclina (8%).

Dos isolados sensíveis ao imipenem, 41% (7/17) apresentaram somente o OXA-51

e em 53% (9/17) foi detectado o gene ISAba1 à montante do gene OXA, onde dois

isolados apresentaram os genes OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + ISAba1/OXA-58 e

ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + OXA-58, os quais estão classificados como fraco

e moderado formadores de biofilme, respectivamente. Em contrapartida, dos 53

isolados que expressaram resistência ao imipenem, 24% (13) possuíam somente OXA-

51 + ISAba1/OXA-23, 23% (12) possuíam somente ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-

23 e 19% (10) possuíam somente OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + OXA-58.

A tabela 6 mostra a distribuição de genes β-lactamases do tipo OXA em isolados de

A. baumannii na resistência aos antibióticos, onde 756% (53/70) apresentaram

resistência ao imipenem e 60% (42/70) dos isolados se destacaram na resistência

multidrogas ao imipenem, meropenem, cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina e

piperacilina/tazobactam, dentre os demais carbapenêmicos testados. Nenhum isolado

resistente aos antibióticos supracitados apresentou ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-58

ou ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 + ISAba1/OXA-58.

46

Tabela 6. Distribuição de genes β-lactamases do tipo OXA em isolados Acinetobacter

baumannii com perfil de resistência aos antimicrobianos relacionados.

Alelos OXA Resistência ao

IPM

Resistência ao IPM, MER, CPX,

CAZ, CFPM,

PIP/TAZ

Sensibilidade

ao IPM

Somente OXA-51 10 (19%) 9 (21%) 7 (41%)

Somente ISAba1/OXA-51 3 (6%) 3 (7%) 3 (18%)

OXA-51 + OXA-23 1 (2%) 0 0

OXA51 + OXA-58 1 (2%) 0 1 (6%)

ISAba1/OXA-51 + OXA-58 1 (2%) 0 0

ISAba1/OXA-51 + OXA-23 2 (4%) 2 (5%) 0

OXA-51 + OXA-58 + ISAba1/OXA-

23 10 (19%) 10 (24%) 1 (6%)

OXA-51 + ISAba1/OXA-23 13 (24%) 8 (19%) 1 (6%)

OXA-51 + ISAba1/OXA-58 0 0 1 (6%)

OXA-51 + ISAba1/OXA-23 +

ISAba1/OXA-58 0 0 2 (12%)

ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 12 (23%) 10 (24%) 0

ISAba1/OXA-51 + ISAba1/OXA-23 +

OXA-58 0 0 1 (6%)

TOTAL 53 (100%) 42 (100%) 17 (100%)

Dos 51 isolados em que o gene ISAba1 foi detectado, 78% (40/51) estavam

associados ao gene OXA-23, 45% (23/51) ao gene OXA-51 e 8% (4/51) ao gene OXA-

58 (tabela 7). A resistência à cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina, imipenem e

meropenem foi observada em 82% (33/40) dos isolados com ISAba1/OXA-23 e em

74% (17/23) dos isolados com ISAba1/OXA-51. Já os isolados com ISAba1/OXA-58

apresentaram sensibilidade ao imipenem e meropenem.

Três isolados expressaram resistência a todos os antimicrobianos testados, onde os

isolados ABs09 amplificou somente para ISAba1/OXA-51, ABs10 amplificou somente

para OXA-51 e o ABs15 amplificou somente para OXA-51 e ISAba1/OXA-23. Em

contrapartida, um isolado foi sensível a todos os antibióticos testados, amplificando

somente para OXA-51.

As tabelas 7 e 8 mostram o perfil de resistência dos isolados a diferentes

antimicrobianos e presença de genes β-lactamases do tipo OXA. A tabela 8 relaciona na

47

exclusividade dos genes OXA-51 e ISAba1/OXA-51. Nos isolados em que o gene

OXA-58 foi detectado, houve a presença de um ou mais genes OXA.

Tabela 7. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii na presença de genes

β-lactamases do tipo OXA.

OXA-51

(n=71)*

ISAba1/

OXA-51

(n=23)*

OXA-23

(n=43)*

ISAba1/

OXA-23

(n=40)*

OXA-58

(n=19)*

ISAba1/

OXA-58

(n=4)*

AMI 19 (27%) 3 (13%) 10 (23%) 10 (25%) 9 (47%) 3 (75%)

AMP/SUL 44 (62%) 17 (74%) 31 (72%) 29 (72%) 11 (58%) 0

CFPM 68 (96%) 23 (100%) 42 (98%) 39 (98%) 13 (68%) 4 (100%)

CAZ 66 (93%) 23 (100%) 42 (98%) 39 (98%) 13 (68%) 4 (100%)

CPX 65 (91%) 22 (96%) 40 (93%) 37 (92%) 17 (90%) 4 (100%)

GEN 39 (55%) 13 (56%) 23 (54%) 22 (55%) 9 (47%) 2 (50%)

IPM 53 (75%) 18 (78%) 38 (88%) 35 (88%) 12 (63%) 0

LVX 31 (44%) 10 (43%) 19 (44%) 18 (45%) 11 (58%) 4 (100%)

MER 53 (75%) 18 (78%) 38 (88%) 35 (88%) 12 (63%) 0

PIP/TAZ 50 (70%) 20 (87%) 33 (77%) 31 (78%) 11 (58%) 1 (25%)

POL 7 (9%) 3 (13%) 4 (9%) 4 (10%) 0 0

TET 34 (48%) 7 (30%) 22 (51%) 21 (52%) 12 (63%) 3 (75%)

TGC 6 (8%) 2 (9%) 4 (9%) 4 (10%) 0 0

*n representa o número de isolados positivos para o gene OXA ou ISAba1/OXA

Tabela 8. Relação entre a resistência de Acinetobacter baumannii aos β-lactâmicos na

presença ou não do elemento ISAba1 à frente do gene OXA-51.

Antibióticos OXA-51

(n=17)

ISAba1/

OXA-51

(n=6)

Cefepima 15 (88%) 6 (100%)

Ceftazidima 14 (82%) 6 (100%)

Imipenem 10 (59%) 3 (50%)

Meropenem 10 (59%) 3 (50%)

48

5.5 RESISTÊNCIA E FORMAÇÃO DE BIOFILME

Com base no teste de sensibilidade realizado com os 71 isolados, 68 apresentaram

resistência a algum dos antibióticos testados. Dos 57 isolados formadores de biofilme,

55 apresentaram resistência a algum dos antibióticos e 2 foram sensíveis a todos os

antibióticos. Dos isolados formadores de biofilme que apresentaram resistência, 100%

(55/55) expressaram resistência à cefepima, seguido de 96% (53/55) para ceftazidima e

ciprofloxacina, e 76% (42/55) para imipenem e meropenem.

Observa-se, na tabela 9, que os isolados formadores de biofilme apresentaram

maior resistência contra a cefepima, ceftazidima e ciprofloxacina, seguido do imipenem

e meropenem. A menor resistência (9%) foi observada para tigeciclina, seguido da

polimixina B/colistina (10%).

Tabela 9. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Acinetobacter

baumannii, em porcentagem (%).

ANTIBIÓTICOS

RESISTÊNCIA

Isolados

formadores de

biofilme

(n=57)

Isolados não-

formadores de

biofilme

(n=14)

Resistência de

todos os

isolados

(n=71)

Amicacina 30 14 27

Ampicilina/Sulbactam 66 43 62

Cefepima 96 93 96

Ceftazidima 93 93 93

Ciprofloxacina 93 86 91

Gentamicina 58 43 55

Imipenem 74 78 75

Levofloxacina 47 28 44

Meropenem 74 78 75

Piperacilina/Tazobactam 74 57 70

Polimixina B/Colistina 10 7 10

Tetraciclina 51 36 48

Tigeciclina 9 7 8

49

A tabela 10 mostra o padrão de resistência multidroga dos isolados formadores de

biofilme, onde 5% apresentaram resistência a todos os antibióticos testados. Dos 57

isolados formadores de biofilme, 74% (42) expressaram resistência contra o imipenem e

meropenem.

Tabela 10. Padrão de resistência multidrogas de formadores e não formadores de

biofilme.

Perfil de Resistência

Formadores de biofilme

que apresentaram

resistência (n=55)

Não formadores de

biofilme que

apresentaram

resistência (n=13)

Todos antibióticos testados 3 (5%) 0

AMI, AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, GEN,

IPM, LVX, MER, PIP/TAZ, POL, TET 5 (9%) 0

AMI, AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, GEN,

IPM, LVX, MER, PIP/TAZ, TET 8 (14%) 1 (8%)

AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, GEN, IPM,

MER, PIP/TAZ 21 (38%) 4 (31%)

AMP/SUL, CFPM, CAZ, CPX, IPM, MER,

PIP/TAZ 34 (62%) 6 (46%)

CFPM, CAZ, CPX, IPM, MER, PIP/TAZ 36 (65%) 7 (54%)

CFPM, CAZ, CPX, IPM, MER 41 (74%) 10 (77%)

Dados clínicos indicam atividade microbiana altamente eficaz das polimixinas e

tigeciclinas contra isolados A. baumannii. Dentre os isolados classificados como

formadores de biofilme, 10% (6/57) e 9% (5/57) expressaram resistência às polimixinas

e tigeciclinas, respectivamente. Dentre os não-formadores de biofilme, somente um

isolado expressou resistência aos antimicrobianos mencionados.

5.6 RELAÇÃO ENTRE A RESISTÊNCIA E O GENE blaPER-1

Todos os 21 isolados que possuíam o gene blaPER-1 (tabela 4) expressaram

resistência à cefepima (tabela 11). A resistência à ceftazidima e imipenem também foi

comparada, onde 95% (20/21) e 90% (19/21) dos isolados com o gene expressaram

resistência, respectivamente. A resistência concomitante à cefepima, ceftazidima e

imipenem foi observada em 19 isolados (90%) que possuíam o gene blaPER-1. Dois

isolados foram sensíveis ao imipenem, sendo 01 sensível também à ceftazidima. A

50

sensibilidade concomitante aos três antibióticos mencionados foi observada em apenas

3 isolados, e nenhum possuía o gene blaPER-1.

Tabela 11. Relação entre a presença do gene blaPER-1 e a resistência à cefepima. Resistência à

cefepima

Sensibilidade à

cefepima Total

Presença do gene blaPER-1 21 0 21

Ausência do gene blaPER-1 47 03 50

Total 68 03 71

Vale destacar que não houve relação entre a presença do gene blaPER-1 e os óbitos

dos pacientes, uma vez que dentre os 21 pacientes infectados com A. baumannii

carregando o gene blaPER-1, 76% (16/21) foram a óbito, enquanto que o índice de

óbitos entre os pacientes infectados por A. baumannii não-produtora de blaPER-1 foi de

60% (30/50).

51

6 DISCUSSÃO

As infecções por A. baumannii representam um desafio médico global. São

patógenos oportunistas e são, particularmente, bem sucedidos em colonizar e persistir

no ambiente hospitalar. São capazes de resistir à dessecação e sobreviver em superfícies

inanimadas por anos (Jain & Danziger 2004; Jeong et al. 2006; Dijkshoorn et al. 2007).

O interesse por este organismo tem crescido rapidamente devido ao aparecimento

de isolados MDR, alguns dos quais são PDR aos agentes antimicrobianos (Prashanth &

Badrinath 2004; Van Looveren & Goossens 2004; Dijkshoorn et al. 2007;). Ele também

está entre as causas mais comuns de infecção nosocomial relacionada a dispositivos

médicos, sendo resultado da capacidade do organismo de resistir à desinfecção química

e física, muitas vezes formando biofilme. A formação de biofilme tem sido uma

característica chave na patogenicidade, especialmente em relação às infecções na linha

intravascular e pneumonia associada à ventilação mecânica. Geralmente duas

propriedades são frequentemente associadas com a produção de biofilme: o aumento da

síntese de exopolissacarídeo (EPS) e o desenvolvimento de resistência aos antibióticos

(Costerton et al. 1999). Assim, as infecções devidas às bactérias que formam biofilme

são um problema clínico tenaz.

Optamos por investigar a capacidade de formação de biofilme em poliestireno por

isolados clínicos de A. baumannii e a resistência a múltiplas drogas entre elas, assim

como a presença de genes relacionados com a formação de biofilme e resistência a

antimicrobianos, a saber: blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58 e a

sequência de inserção ISAba1.

Para a identificação do produto do gene blaPER-1, das 71 amostras analisadas, 21

mostraram positivas para o gene blaPER-1. Destas, 12 apresentaram formação de

biofilme.

No presente estudo, o método quantitativo para formação de biofilme mostrou 6

(7,5%) isolados como fortes formadores de biofilme, porém na ausência do gene

blaPER-1. O resultado de Fisher revela que há diferença estatística entre os grupos,

admitindo-se pelo teste de correlação que existe uma correlação negativa entre a

presença do gene blaPER-1 e a formação de biofilme, sugerindo que o gene tem efeito

inibidor na formação de biofilme, sendo aceita a possibilidade de que outros fatores

estão mais fortemente associados com a formação de biofilme dos mesmos, tais como a

52

presença de pili, estruturas semelhantes à fímbrias, OmpA (proteínas de membrana

externa) e proteínas que se ligam à fibronectina, conhecidas como FBPs (fibronectin-

binding proteins), as quais facilitam a adesão e invasão bacteriana em células

hospedeiras (Gohl et al. 2006; Lee et al. 2006; Gaddy et al. 2009; Henderson et al.

2011). Sechi et al. (2004) e Rao et al. (2008), relacionam a produção de blaPER-1 com a

aderência bacteriana, mas não com a formação do biofilme. No entanto, Lee et al.

(2008) mostraram em seus resultados que os isolados que possuem esse gene,

apresentam capacidade altamente significativa para adesão e formação de biofilme,

quando comparado aos isolados que não carregavam o gene. Em relação à resistência,

todos os isolados que amplificaram para o gene blaPER-1 apresentaram resistência

contra a cefepima, compartilhando de resultados semelhantes apresentados por Yong et

al. (2003). Observa-se, portanto, que a presença do gene blaPER-1 estava associada a

multirresistência às drogas testadas neste trabalho, uma vez que a sensibilidade

concomitante à cefepima, ceftazidima e imipenem foi observada somente na ausência

do gene blaPER-1 (Tabela 11).

Os isolados formadores de biofilme expressaram resistência à cefepima,

ceftazidima, ciprofloxacina, imipenem e meropenem. Em relação aos não-formadores

de biofilme, nosso estudo detectou resistência altamente significativa aos mesmos

antibióticos. O aumento da resistência em isolados não-formadores de biofilme também

foi relatado por Rao et al. (2008). Esta característica pode estar associada à presença de

genes que promovem a resistência, bem como a ação de mecanismos não-enzimáticos

como super-expressão de bombas de efluxo, alteração de porinas e impermeabilidade da

membrana (Gur et al. 2008).

A seleção apropriada do antibiótico para o tratamento de infecções associadas ao

biofilme, assim como a simples presença de A. baumannii, é extremamente importante.

Os carbapenêmicos têm sido as drogas de escolha para o tratamento de infecções

causadas por este organismo (Quale et al. 2003), mas a resistência aos mesmos tem se

tornado comum, diminuindo as opções terapêuticas existentes (Sohrabi et al. 2012).

Neste estudo, 75% (53/71) dos isolados foram resistentes ao imipenem e meropenem,

sendo estes os antibióticos mais comumente prescritos nos hospitais. Além disso, a alta

porcentagem de resistência também foi observada à ciprofloxacina (91%). Em

concordância com outros estudos, foi observado que dos seis isolados classificados

como fortes formadores de biofilme, 67% (4/6) apresentaram resistência a quase 60%

dos antibióticos testados (Siroy et al. 2006; Rodriguez-Bano et al. 2008). Assim,

53

adquirir a capacidade de formar biofilme torna-se uma boa estratégia para aumentar a

sobrevivência e persistência sob condições de estresse, por exemplo, durante a invasão

hospedeiro ou após o tratamento antibiótico (Rao et al. 2008). Como consequência do

desenvolvimento de biofilme, afirma-se que a capacidade de Acinetobacter para a

transferência de genes é horizontal, facilitando a disseminação de resistência aos

antibióticos nessas micro-comunidades (Lee et al. 2008). No entanto, ainda não se sabe

muito sobre o mecanismo que desencadeia o desenvolvimento de biofilme em A.

baumannii (Lee et al. 2008).

O gene OXA-51 foi detectado nos 71 isolados, corroborando com estudos que

sugerem a presença do gene em todos os isolados de A. baumannii, uma vez que o gene

OXA-51 é intrínseco à espécie (Heritier et al. 2005; Turton et al. 2006b; Sohrabi et al.

2012).

Surtos por isolados de CRAB produtores de OXA-23 têm sido relatado em diversos

países, sendo encontrado disseminado em todo o mundo (Mugnier et al. 2010). Nos

estudos conduzidos por Mak et al. (2009), Zhou et al. (2007) e Figueiredo et al. (2011),

87,5%, 94% e 75% dos isolados resistentes ao imipenem tinham o gene OXA-23,

respectivamente. Neste estudo, 72% (38/53) dos isolados resistentes ao imipenem

possuíam o gene em questão.

Não foi detectada a presença do gene OXA-40 dentre os isolados analisados,

concordando com os resultados apresentados por Sohrabi et al. (2012) realizado no

noroeste do Irã, onde apenas em 1 em cada 100 isolados foi detectado o gene. A alta

prevalência deste gene tem sido relatada em países da Europa (Quinteira et al. 2007;

Ruiz et al. 2007). O único achado deste gene no Brasil foi relatado em um estudo

conduzido por Werneck et al. (2011a), onde OXA-40 foi detectado no único isolado de

A. baumannii avaliado no estudo.

Dos 71 isolados investigados, 27% apresentaram o gene OXA-58. Estes achados

apresentam maior porcentagem de isolados com o gene do que os resultados

apresentados por Sohrabi et al. (2012), Feizabadi et al. (2008) e Taherikalani et al.

(2009), com 3,6%, 9% e 9%, respectivamente. Os isolados avaliados naqueles estudos

foram provenientes do Irã e, portanto, pode ser que exista uma relação geográfica. No

entanto, é equivalente aos resultados apresentados por Ruiz et al. (2007) na Espanha e

Vahaboglu et al. (2006) na Turquia, com 19% e 17% dos isolados contendo o gene

OXA-58, respectivamente. Figueiredo et al. (2011) detectou OXA-58 em 1 isolado, de

um total de 20 isolados estudados no Rio de Janeiro.

54

Recentemente uma sequência de inserção chamada ISAba1 foi identificada em A.

baumannii (Corvec et al. 2003) e associada com a super-expressão de genes de

resistência como AmpC, OXA-23 e OXA-51, que conferem resistência aos

carbapenêmicos (Corvec et al. 2003; Corvec et al. 2007; Turton et al. 2006a). A

amplificação por PCR neste estudo detectou a presença de ISAba1 em 72% dos

isolados. Este resultado está de acordo com outros estudos em que ISAba1 foi

encontrado na maioria do isolados, como por exemplo, Ruiz et al. (2007), Turton et al.

(2006a) e Sohrabi et al. (2012) que detectaram ISAba1 em 74,7%, 84% e 90% dos

isolados provenientes da Espanha, Reino Unido e Irã, respectivamente. Neste estudo, os

resultados revelaram ainda que a maioria, ou seja, 57% (39/68) dos isolados de A.

baumannii resistentes a algum dos antibióticos testados tinham ISAba1 à montante do

gene OXA-23.

Dos isolados resistentes ao imipenem, 77% (41/53) possuíam o gene ISAba1 à

montante do gene OXA, cujo resultado é similar aos estudos conduzidos por Mak et al.

(2009), Turton et al. (2006a) e Zhou et al. (2007), onde 52,6%, 86% e 94% de isolados

A. baumannii resistentes ao imipenem tinham ISAba1, respectivamente. Ainda em

relação aos isolados resistentes ao imipenem, 66% (35/53) tiveram o gene ISAba1 à

montante do gene OXA-23, similar ao resultado apresentado por Sohabi et al. (2012),

com 74,2%. Estes resultados indicam que ISAba1 quando associado ao gene OXA-23

pode estar envolvido na resistência ao imipenem. Vale destacar que a associação entre

ISAba1 e o gene OXA-58 não resultou em resistência ao imipenem.

Dos 43 isolados que continham o gene OXA-23, 93% (40/43) possuíam o gene

ISAba1 à montante deste gene. Zhou et al. (2007) e Turton et al. (2006a) relataram que

97,5% e 100% dos isolados com OXA-23 continham o gene ISAba1 à montante do

OXA-23.

Turton et al.(2006a) relataram que dentre os 20 isolados que possuíam somente

OXA-51, 8 apresentaram ISAba1 associado ao gene e expressando resistência ao

imipenem ou meropenem, concluindo que a expressão do gene OXA-51 é baixa na

maioria dos casos. Sohrabi et al. (2012) relatou que enquanto 3 isolados que foram

resistentes ao imipenem tinham ISAba1 à montante de OXA-51, somente 1 isolado com

apenas OXA-51 expressou resistência ao imipenem, sugerindo que a presença do gene

OXA-51 sozinho não é suficiente para expressar resistência contra os antibióticos

carbapenêmicos. Neste estudo, a presença isolada do gene OXA-51, ou associada ao

ISAba1 (6), foi identificada em 23 isolados. Dentre eles, 56% (13/23) dos isolados

55

foram resistentes ao imipenem e meropenem, onde 23% (3/13) apresentaram a

sequência de inserção ISAba1 à montante do gene. Percebe-se, portanto, que estes

achados indicam uma discordância com os resultados apresentados por Turton et al.

(2006a) e Sohrabi et al. (2012), pois a resistência ao imipenem e meropenem foi

expressa em 10 isolados que possuíam somente o gene OXA-51. Este resultado sugere a

presença de outros genes β-lactamases do tipo OXA que não foram pesquisados neste

estudo, explicando a resistência ao imipenem dos isolados contendo somente o gene

OXA-51.

Este estudo detectou, através da amplificação por PCR, a presença de ISAba1 à

montante do OXA-58 em 4 isolados, porém em 3 isolados o elemento de inserção

estava presente também à montante do gene OXA-23 ou OXA-51. Em um foi detectado

ISAba1/OXA-51 e no outro foi detectado OXA-51 e ISAba1/OXA-23. Todos os quatro

isolados foram sensíveis ao imipenem. Sohrabi et al. (2012) relatam não ter encontrado

ISAba1 à montante do gene OXA-58 nos dois isolados onde OXA-58 foi detectado. Em

estudo realizado no sul do Brasil, Gusatti et al. (2012) relatou encontrar a sequência de

inserção ISAba1 localizada à montante do gene OXA-58 (Gusatti et al. 2012).

Observou-se que a resistência em isolados contendo ISAba1 associado a algum dos

genes OXA foi significativa, sugerindo que ISAba1 é importante na expressão destes

genes. A facilidade em superexpressar genes com este elemento móvel pode ser de

grande vantagem, proporcionando um mecanismo para expressar os genes somente

quando existe uma vantagem seletiva para o fazer. A presença de ISAba1 reflete em A.

baumannii, de modo que o organismo se ligue rapidamente ao DNA, dando-lhe uma

maleabilidade que pode contribuir muito para o seu sucesso (Turton et al. 2006a).

56

7 CONCLUSÕES

Este estudo revelou, pela primeira vez, a ocorrência do gene blaPER-1 em isolados

de A. baumannii no Brasil e o primeiro relato do gene OXA-58 e da sequência de

inserção ISAba1 em isolados de Acinetobacter baumannii no Estado de Goiás.

A maioria dos isolados clínicos de A. baumannii analisados possuiam capacidade

para formação de biofilme, porém, neste estudo, a correlação entre a presença do gene

blaPER-1 e a capacidade de formar biofilme foi negativa, uma vez que a detecção do

gene foi maior nos isolados que apresentaram fraca formação de biofilme, sendo

também detectado na maioria dos isolados não-formadores de biofilme.

Foi observada resistência à cefepima, ceftazidima, ciprofloxacina, imipenem e

meropenem em isolados formadores de biofilme. Porém, o mesmo foi observado em

isolados não-formadores de biofilme, sugerindo que essa resistência esteja relacionada à

presença do gene blaPER-1 nesses isolados.

Os genes OXA-51, OXA-23, OXA-58 e ISAba1 foram detectados em alguns

isolados de Acinetobacter baumannii, sendo maior a prevalência do OXA-23, uma vez

que o OXA-51 é um gene intrínseco à espécie. A sequência de inserção ISAba1 foi

detectada na maioria dos isolados que apresentaram algum dos genes OXA e a

resistência concomitante à cefepima, ceftazidima, imipenem e meropenem foi mais

prevalente entre os isolados que possuíam o gene ISAba1.

57

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1076-1080.

76

ANEXOS

Anexo 1. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa

77

Anexo 2. Manuscrito

Acinetobacter baumannii PRODUTORES DE blaPER-1 ISOLADOS DE

PACIENTES DE UTIS DE GOIÂNIA E SUA CORRELAÇÃO COM A

FORMAÇÃO DE BIOFILME E RESISTÊNCIA MULTIDROGAS NA

PRESENÇA DE GENES TIPO OXA

Autores:

Suellen Rocha Araújo Castilho a

Cássia Silva de Miranda Godoy a, b

Adriana Oliveira Guilarde a

Ana Paula Junqueira-Kipnis a

André Kipnis a

a Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás b Hospital de Doenças Tropicais / Hospital Anuar Auad

78

Acinetobacter baumannii PRODUTORES DE blaPER-1 ISOLADOS DE

PACIENTES DE UTIS DE GOIÂNIA E SUA CORRELAÇÃO COM A

FORMAÇÃO DE BIOFILME E RESISTÊNCIA MULTIDROGAS NA

PRESENÇA DE GENES TIPO OXA

blaPER01 Producing Acinetobacter baumannii isolates form patients at ICUs of

Goiania and correlation between biofilm formation and multidrug resistance in the

presence of OXA genes.

Abstract

Background: Gram negative bacilli are one of the major causes of nosocomial

infections worldwide. Among them, non-fermenting Gram Negative bacilli play a

considerable part. Acinetobacter baumannii is one of the main representatives of this

group. Purpose: To investigate by a quantitative method the biofilm formation and to

examine the correlation between biofilm and antibiotic resistance among clinical

isolates of A. baumannii. The association between biofilm formation and presence of

extended spectrum β-lactamases blaPER-1, as well as correlation between biofilm and

presence of OXA-type genes to understand the antibiotic resistance among isolates were

also analyzed. Methods: A total of 71 clinical isolates of A. baumannii were subjected

to identification testing by Gram staining and biochemical tests, and drug susceptibility

testing by disc diffusion. The biofilm production was done by quantitative method in

microtitre plate assay. The presence of blaPER-1 and OXA-type genes was detected by

PCR. Results: In our study, 29% of the isolates presented blaPER-1 gene, and all of

them were resistant to cefepime. The concomitant resistance to cefepime, ceftazidime,

ciprofloxacin, and imipenem was observed in 81% of the blaPER-1 positive isolates.

Fifty seven of the 71 isolates were able to form biofilm. Almost 60% of the blaPER-1

positive isolates formed biofilm. Also, most of the isolates (90%) that did not have

blaPER-1 formed biofilm. The majority of the isolates that were capable of forming

biofilm also presented resistance to several classes of antimicrobial drugs. Among the

55 isolates biofilm producers that were resistant to some antibiotics, 20% had only the

OXA-51 gene, 62% had OXA-23 gene, 56% had ISAba1/OXA-23, 40% had

ISAba1/OXA-51, 24% had OXA-58 and 5% had ISAba1/OXA-58. Conclusion: The

blaPER-1 gene promotes resistance to cefepime, but the presence of this gene was not

related to the biofilm formation among the isolates evaluated. This study detected a high

percentage of ISAba1/OXA-23 producers isolates among the biofilm formation,

suggesting that the antibiotic resistance of isolates in question also relates to the

expression of these genes.

Resumo

Bacilos Gram-negativos são uma das principais causas de infecções hospitalares em

todo o mundo. Entre eles, os bacilos Gram-negativos não fermentadores desempenham

um papel considerável. O Acinetobacter baumannii é um dos principais representantes

desse grupo. Objetivo: Investigar por método quantitativo a formação de biofilme e

examinar a correlação entre biofilme e resistência antimicrobiana entre os isolados

clínicos de A. baumannii. Foi verificado também a associação entre biofilme e a

presença da β-lactamase de espectro estendido blaPER-1, bem como a correlação entre

79

biofilme e a presença de genes do tipo OXA a fim de compreender a resistência

multidrogas entre os isolados. Métodos: Um total de 71 isolados clínicos de A.

baumannii foram submetidos a testes de identificação por coloração de Gram e provas

bioquímicas, e susceptibilidade microbiana pelo método de disco difusão. A produção

de biofilme foi feita pelo método quantitativo em placa de microtitulação. A presença de

blaPER-1 e dos genes tipo OXA foram detectados por PCR. Resultados: Em nosso

estudo, 29% dos isolados apresentaram o gene blaPER-1, e todos eles foram resistentes

à cefepima. A resistência concomitante à cepepima, ceftazidima, ciprofloxacina e

imipenem foi observada em 81% dos isolados positivos para blaPER-1. Para formação

de biofilme, 57 dos 71 isolados foram capazes de formar biofilme. Quase 60% dos

isolados blaPER-1 positivos formaram biofilme. No entanto, a maioria dos isolados

(90%) que não tinham blaPER-1, também formaram biofilme. A maioria dos isolados

que foram capazes de formar biofilme também apresentaram resistência à várias classes

de antimicrobianos. Dentre os 55 isolados formadores de biofilme que apresentaram

resistência a algum antibiótico, 20% possuíam apenas o gene OXA-51, 62% possuíam

OXA-23, 56% possuíam ISAba1/OXA-23, 40% possuíam ISAba1/OXA-51, 24%

possuíam OXA-58 e 5% possuíam ISAba1/OXA-58. Conclusão: O gene blaPER-1

promove resistência à cefepima, porém a presença deste gene não está relacionada com

a formação de biofilme dentre os isolados avaliados. Este estudo apresenta uma alta

porcentagem de isolados produtores de ISAba1/OXA-23 entre os formadores de

biofilme, sugerindo que a resistência antimicrobiana dos isolados em questão também

esteja relacionada com a expressão destes genes.