UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS ...‡ÃO... · Profa. Dra. Dulcinéia Saes...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

ESCOLA DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS FUNCIONALIZADAS PARA DIRECIONAMENTO

DE FÁRMACOS: ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO E APLICAÇÕES NO

ENCAPSULAMENTO DE FÁRMACOS ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI E ANTI-

ATEROGÊNICO

GIANI MARTINS GARCIA

OURO PRETO

Setembro de 2011

ii

Giani Martins Garcia

NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS FUNCIONALIZADAS PARA

DIRECIONAMENTO DE FÁRMACOS: ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO E APLICAÇÕES

NO ENCAPSULAMENTO DE FÁRMACOS ANTI-TRYPANOSOMA. CRUZI E ANTI-

ATEROGÊNICO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da Escola de Farmácia da

Universidade Federal de Ouro Preto,

como requisito à obtenção do grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profª Drª Vanessa Carla

Furtado Mosqueira

Co-Orientador: Prof. Dr. Patrice Hildgen

(Université de Montréal –Canadá)

Ouro Preto

Setembro de 2011

iii

Catalogação: [email protected]

G216n Garcia, Giani Martins.

Nanopartículas poliméricas funcionalizadas para direcionamento de

fármacos [manuscrito] : estudo físico-químico e aplicações no

encapsulamento de fármacos anti-Trypanosama cruzi e anti-aterogênico /

Giani Martins Garcia – 2011.

159 f.: il. color.; grafs., tabs.

Orientadora: Profª Drª Vanessa Carla Furtado Mosqueira.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de

Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.

Área de concentração: Fármacos e Medicamentos.

iv

Este trabalho contou com a colaboração de:

Profa. Dra. Dulcinéia Saes Parra Abdalla

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP-SP.

Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta

Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, UFPE-PE

Drª Margareth Spangler de Andrade

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG.

Dr José Mário Carneiro Vilela

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG.

Msc. Líliam Teixeira Oliveira

Laboratório Multiusuário/Cromatografia Líquida de Alta Eficiência; CIPHARMA,

UFOP-MG

GARCIA, GM DEDICATÓRIA

v

“Dedico este trabalho aos meus amados pais

por serem o alicerce da minha vida e por

fazerem dos meus sonhos os deles, e ao

meu irmão pela amizade e companheirismo.”

GARCIA, GM AGRADECIMENTOS

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus, razão de tudo, por iluminar meus caminhos e decisões;

Aos meus pais, que acreditaram em mim e tornaram possíveis todos os

meus sonhos. Sem vocês nada disso seria possível;

Ao meu irmão e melhor amigo Geovani, pelos conselhos e incentivo sempre;

A minha família, vó, tios e primos, pela torcida;

A minha orientadora Vanessa, pela oportunidade, ensinamentos,

disponibilidade e ótima convivência durante todos esses anos;

Aos amigos do LDGNano, Raquel C., Raquel A., Renata, Bruno, Carina,

Alessandra, Diego, Emily, Larissa, Samantha, Daline e Leonardo, por

dividirem comigo os problemas e as conquistas, e pelos bons momentos no

laboratório. Em especial a Líliam, que esteve ao meu lado em todos os

momentos, dentro e fora do laboratório, pelo carinho, amizade e

companheirismo, e por não medir esforços para que tudo saísse da melhor

forma possível;

Aos colegas de pós-graduação, em especial Patrícia Goto e Rodrigo

Moreira, pela amizade e boas conversas;

Aos professores do Programa pelos ensinamentos compartilhados;

Ao professor Vilela, pela ajuda na obtenção nas imagens de microscopia de

força atômica;

Aos professores Patrice Hildgen, Dulcinéia Abdalla e Ivan Pitta pela

colaboração;

As minhas queridas irmãs da República Hangar, pela amizade, apoio e

torcida, e por sempre entenderem meus momentos de reclusão;

Aos demais amigos pelo incentivo, em especial a Kyrla, pela amizade

incondicional;

GARCIA, GM AGRADECIMENTOS

vii

A Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, e ao

Programa de Pós-Graduação em Ciência Farmacêuticas/CIPHARMA pela

formação acadêmica;

Ao INCT-if e a Rede NanoBioMG/FAPEMIG pelo auxílio financeiro;

A todas as outras pessoas que com críticas, sugestões e elogios contribuíram

de forma direta ou indireta para conclusão deste trabalho.

GARCIA, GM

viii

Nunca, jamais desanimeis, embora venham ventos contrários!

(Santa Paulina)

GARCIA, GM RESUMO

9

RESUMO

Neste trabalho foi realizado o estudo de caracterização físico-química de nanopartículas

poliméricas (NP), produzidas a partir dos copolímeros do ácido polilático (PLA) ligados

covalentemente ao polietilenoglicol (PEG). Foram utilizados polímeros com arquitetura do

tipo dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), com ou sem funcionalização, ao longo

da cadeia de PLA. Os grupamentos hidroxila, benzila foram inseridos ao longo da cadeia

de PLA, os quais permitiram a funcionalização do polímero com um ligante para o

receptor selectina-E (LSE), presente no endotélio dos vasos. Foram encapsulados dois

fármacos: o itraconazol, representando a classe de fármacos azólicos com promissores

resultados no tratamento da doença de Chagas experimental e uma nova substância sob

investigação pré-clínica da classe das tiazolidinodionas (TZD), denominada Lyso-7, que

vem apresentando resultados promissores na melhoria dos fatores associados a doenças

cardiovasculares, como a aterosclerose. As nanoestruturas foram analisadas e

caracterizadas quanto ao tamanho, índice de polidispersão (IP), potencial zeta e cinética

de liberação in vitro. As análises morfológicas foram realizadas por microscopia de força

atômica (MFA). Os resultados relacionados às nanoesferas (NS) mostram que foram

obtidas populações monodispersas (IP<0,20) com tamanho médio variando entre 116 a

284 nm, antes e após a associação de 0,5 mg/mL de itraconazol. A utilização de

copolímeros dibloco e tribloco conduziu a uma redução significativa no tamanho das

partículas, 116 e 146 nm, respectivamente, quando comparado ao tamanho daquelas

preparadas a partir do homopolímero PLA (206 nm). A redução de tamanho sugere a

presença de cadeias de PEG organizadas na superfície das NS. A introdução de grupos

hidroxila ou benzila induziu um aumentou significativo do tamanho médio das NS para

151 nm e 284 nm, respectivamente, indicando aumento do volume interno da matriz

polimérica para acomodação de grupamentos funcionais volumosos. A redução

significativa do potencial zeta em aproximadamente -16 mV para todas as formulações,

após inclusão do itraconazol, sugere interferência do fármaco na organização superficial

dos constituintes das NS. A porcentagem de encapsulação foi próxima de 100% para o

itraconazol na concentração de 0,5 mg/mL. Observou-se a presença de um forte contraste

nas imagens de fase, na superfície das NS contendo blocos de PEG, quando analisada

por AFM, que é sugestivo da presença de um material macio. Esse contraste não foi

observado em NS de homopolímero de PLA. As formulações contendo os polímeros

GARCIA, GM RESUMO

10

tribloco, dibloco e PLA liberaram aproximadamente 90, 75 e 40% do fármaco,

respectivamente, após 24h com perfis que obedecem ao modelo de liberação descrito por

Higuchi. Foram também desenvolvidas nanocápsulas (NC) com núcleo oleoso para

encapsulamento da Lyso-7. Os copolímeros dibloco e tribloco também induziram redução

significativa (p < 0,05) do tamanho das NC, 214 nm e 181 nm, respectivamente, quando

comparado ao tamanho médio das NC de PLA, 295 nm. A introdução de grupos hidroxila

ou benzila induziu o aumento do tamanho médio das NC para 225 nm e 227 nm,

respectivamente, como também observado para as NS. A associação da Lyso-7 a 0,5

mg/mL, induziu um aumento do tamanho médio das NC, para 240 e 212 nm, com os

polímeros dibloco e tribloco, respectivamente. As NC funcionalizadas com LSE

apresentaram tamanhos médios superiores aos das NC não funcionalizadas, 275 nm, o

que está provavelmente relacionado à sua organização na interface, o que induziu

variação no raio hidrodinâmico das NP. Foi realizado estudo farmacocinético da Lyso-7

livre e associada à NC de PLA. A área sob a curva, concentração versus tempo da Lyso-7

associada às NC aumentou 5,5 vezes em relação à Lyso-7 livre, sendo a depuração

reduzida de 75,27 para 19,08 mL/min.Kg. Além disso, observou-se uma dramática

diminuição dos efeitos tóxicos da Lyso-7 quando administrada por via intravenosa,

aumentando-se a DL100 para valores superiores a 2,17 mg/Kg de camundongo. Os

resultados apresentados neste estudo se mostraram promissores para posterior

investigação do efeito das NP in vitro e in vivo em modelos experimentais de inflamação

crônica de tecidos, especialmente associados à doença de chagas e à aterosclerose.

GARCIA, GM LISTA DE FIGURAS

11

ABSTRACT

In this study we present a study of the physicochemical characterization of polymeric

nanoparticles (NP), produced from copolymers of polylactic acid (PLA) covalently linked to

polyethylene glycol (PEG). We used polymer with diblock (PLA-PEG) and triblock (PLA-

PEG-PLA) architecture, with or without functionalization along the PLA chain. The hydroxyl

and benzyl groups were inserted along the PLA chain, which allowed the functionalization

of the polymer with a ligand for the receptor E-selectin (LSE), present in the endothelium

of blood vessels. Two drugs were encapsulated: itraconazole, representing the azole class

of drugs with promising results in treatment of experimental Chagas' disease and a new

substance in preclinical research of tiazolidinodionas class (TZD), called Lyso-7, which

has shown results promising in improving risk factors for cardiovascular disease such as

atherosclerosis. The nanostructures were analyzed and characterized according to size,

polydispersity index (PI), zeta potential and release kinetics in vitro. The morphological

analysis were performed by atomic force microscopy (AFM). The results regarding

nanospheres (NS) show that monodispersed populations were obtained (PI <0.20) with

average size ranging from 116 to 284 nm before and after the association of 0.5 mg / mL

of itraconazole. The use of diblock and triblock copolymers led to a significant reduction in

particle size, 116 and 146 nm, respectively, when compared to the size of those prepared

from the PLA homopolymer (206 nm). The reduction in size suggests the presence of PEG

chains arranged on the surface of NS. The introduction of hydroxyl or benzyl groups

induced a significant increase in the average size of the NS to 151 nm and 284 nm,

respectively, indicating increased internal volume of the polymer matrix to accommodate

the bulky functional groups. The significant reduction of the zeta potential of approximately

-16 mV for all formulations after addition of itraconazole, suggests the interference of the

drug in the organization of the constituents of the NS surface. The percentage of

encapsulation was close to 100% for itraconazole at a concentration of 0.5 mg/ml. We

observed the presence of a strong contrast in phase images, on the surface of NS

containing PEG blocks, when analyzed by AFM, which is suggestive of the presence of a

soft material. This contrast was not observed in the NS homopolymer PLA. The

formulations containing triblock, diblock and PLA polymers released about 90, 75 and 40%

of the drug, respectively, after 24 hours with profiles that follow the model described by

Higuchi release. We also developed nanocapsules (NC) with oily core for encapsulation of

Lyso-7. The diblock and triblock copolymers also induced a significant size reduction


12

(p<0.05) of NC, 214 nm and 181 nm, respectively, when compared to the average size of

PLA NC, 295 nm. The introduction of hydroxyl or benzyl groups led to an increase in the

average size of the NC to 225 nm and 227 nm, respectively, as also observed for the NS.

The association of 0.5 mg/ml Lyso-7, induced an increase in the average size of NC for

240 and 212 nm, with the diblock and triblock polymers, respectively. The NC

functionalized with LSE had higher average sizes compared with non-functionalized NC,

275 nm, which is probably related to your organization at the interface, which induced

variation in the hydrodynamic radius of the NC. Pharmacokinetic study was conducted of

Lyso-7 free and associated with PLA NC. The area under the curve, concentration versus

time, associated to Lyso-7 NC increased 5.5 times compared to the free Lyso-7, and the

clearance reduced of 75.27 to 19.08 ml/min.kg. In addition, we observed a dramatic

decrease of the toxic effects of Lyso-7 when administered intravenously, increasing the

DL100 to values greater than 2.17 mg/kg of mice. The results of this study showed promise

for further investigation of the effect of NP in vitro and in vivo experimental models of

chronic inflammation of tissues, especially associated with Chagas disease and

atherosclerosis.


13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática de NC e NS poliméricas: a) fármaco dissolvido no

núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c) fármaco

retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na

matriz polimérica. ............................................................................................................... 32

Figura 2: Esquema representativo da dupla camada elétrica (Hotza, 1997). ................... 35

Figura 3: Arquitetura de copolímeros lineares (adaptado de Qui & Bae, 2006). ............... 38

Figura 4: Representação química dos copolímeros dibloco (A) e tribloco (B) e suas

funcionalizações. ............................................................................................................... 39

Figura 5: Esquema simplificado do início de um processo inflamatório demonstrando da

ativação de células do endotélio vascular e aumento da expressão de selectina-E (A) e o

processo de internalização de leucócitos (B) após a adesão dos mesmos mediados por

selectina-E. ........................................................................................................................ 41

Figura 6: Estrutura química do ligante natural de selectina-E, o Syalil-Lewis X (sLex). ... 42

Figura 7: Estrutura química do ligante sintético de selectinas E e P. ............................... 42

Figura 8: Estrutura química do itraconazol. ...................................................................... 45

Figura 9: Estrutura química do fármaco Rosiglitazona e Pioglitazona. Em vermelho a

tiazolidina-2,4-dionas, estrutura comum em todas as TZD. ............................................... 47

Figura 10: Estrutura química da Lyso-7. ........................................................................... 48

Figura 11:Cromatograma dos polímeros das diferentes NS: preto (tribloco-OH); vermelho

(dibloco-OBZ); verde (dibloco); azul (tribloco); laranja (dibloco-OH); marrom (tribloco-

OBz); cinza ITZ 10 µg/mL. ................................................................................................. 54

Figura 12: Curva de calibração do ITZ com detecção DAD no comprimento de onda de

260 nm; R2 = coeficiente de correlação linear. .................................................................. 54

Figura 13: Cromatograma do itraconazol nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 e 10

µg/mL com detecção DAD. ................................................................................................ 55

Figura 14: Curva de calibração do ITZ com detecção FLU a 320 nm de excitação e 380

nm de emissão; R2 = coeficiente de correlação linear. ...................................................... 56

Figura 15: Cromatograma do itraconazol na concentração de 0,1 µg/mL com detecção

FLU. ................................................................................................................................... 56

Figura 16: Etapas da Preparação de Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na

solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O

solvente e o excesso de água são evaporados. ................................................................ 63


14

Figura 17: Representação esquemática das dosagens de ITZ realizadas nas formulações

de NS para determinação da porcentagem de encapsulação e eficiência de encapsulação.

........................................................................................................................................... 65

Figura 18: Representação dos polímeros dibloco (A) e tribloco (B) com os grupos

hidroxila (-OH) e benzila (-OBz) ligados covalentemente ao longo da cadeia. ............. Erro!

Indicador não definido.

Figura 19: Tamanho das NS dibloco recém-preparadas e após 12 meses de

armazenamento. ................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 20: Tamanho das NS tribloco recém-preparadas e após 12 meses de

armazenamento. ................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 21: Imagens de MFA de nanoesferas de PLA, altura (A) e imagem de fase (B).

Escaneamento de 5 µm x 5 µm. Z range: 1000 nm. ............. Erro! Indicador não definido.

Figura 22: Imagem de MFA de NS de PLA; (A) altura das nanoesferas e (B) perfil

topográfico (setas vermelhas) e diâmetro (setas verdes). .... Erro! Indicador não definido.

Figura 23: Imagens por MFA de nanoesferas de PLA, altura (a) e imagem de fase (b).

Escaneamento de 450 nm x 450 nm. Z range: 1000. ........... Erro! Indicador não definido.

Figura 24: Imagens de MFA de NS brancas. Visualização tridimensional (A e C) e

tamanho (B e D) usando os copolímeros dibloco (A e B) e tribloco (C e D). Escaneamento

de 1 µm × 1 µm. .................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 25: Imagens de MFA de NS dibloco (PLA-PEG) (a) e o perfil topográfico (b)

demonstrando a altura das nanoesfeiras (setas vermelhas) e o diâmetro (setas verdes).

.............................................................................................. Erro! Indicador não definido.

Figura 26: Imagens de fase de NS preparadas com polímeros PLA (a), tribloco PLA-PEG-

PLA (b) e dibloco PLA-PEG (c). ............................................ Erro! Indicador não definido.

Figura 27: Imagen por MFA de NS tribloco com ITZ 0,5 mg/mL, altura (a) e imagem de

fase (b). Escaneamento de 1 µm x 1 µm. Z range: 500 nm. . Erro! Indicador não definido.

Figura 28: Imagen por MFA de NS tribloco com ITZ 0,5 mg/mL, altura (a) e imagem de

fase (b). Escaneamento de 1 µm x 1 µm. Z range: 500 nm. . Erro! Indicador não definido.

Figura 29: Mecanismos de liberação: (A) difusão através de poros preenchidos com

água; (B) difusão através do polímero; (C) bombeamento osmótico e (D) erosão

(Fredenberg et al, 2011). ...................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 30: Perfil de liberação in vitro de NS de ITZ na concentração de 0,5 mg/mL em

PBS, utilizando os polímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), e ácido

polilático (PLA). ..................................................................... Erro! Indicador não definido.


15

Figura 31: Representação esquemática da estrutura de constituição das nanoesferas. (a)

NS convencional, (b) NS peguilada dibloco e (c) NS peguilada tribloco (adaptado de Essa

et al, 2010). ........................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 32: Perfil de liberação in vitro do ITZ em nanoesferas na concentração de 0,5

mg/mL em PBS, utilizando os diferentes copolímeros dibloco.Erro! Indicador não

definido.

Figura 33: Perfil de liberação in vitro do ITZ em nanoesferas na concentração de 0,5

mg/mL em PBS, utilizando os diferentes copolímeros tribloco.Erro! Indicador não

definido.

Figura 34: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS PLA.


Figura 35: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS dibloco.


Figura 36: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS tribloco.


Figura 37: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS dibloco-

OH. ....................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 38: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS tribloco-

OH. ....................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 39: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS dibloco-

OBz. ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 40: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS tribloco-

OBz. ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 41: Cromatograma do polímero PLA (preto) e da Lyso-7. ................................... 104

Figura 42: Curva de calibração da Lyso-7 no comprimento de onda de 385 nm; R2 =

coeficiente de correlação linear. ...................................................................................... 104

Figura 43: Cromatogramas do plasma branco (vermelho) e da Lyso-7 (preto) com padrão

interno (PI), demonstrando maior escala (A) e menor escala (B). ................................... 108

Figura 44: Cromatogramas demonstrando uma adequada resolução entre a Lyso-7 e seu

padrão interno (PI). (A) Lyso-7 0,01 µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul e (B) Lyso-7 5

µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul. .............................................................................. 108

Figura 45: Curva de calibração do método bioanalítico para quantificação de Lyso-7 em

plasma por cromatografia líqüida de alta eficiência. ........................................................ 111


16

Figura 46: Cromatograma da Lyso-7 a 5 µg/mL (preto) e a 10 µg/mL (azul), ambos com

padrão interno (PI). .......................................................................................................... 111

Figura 47: Perfil de dissolução/liberação in vitro da Lyso-7 livre e em nanocápsulas de

PLA (NC-PLA) na concentração de 0,35 µg/mL em PBS. ............................................... 128

Figura 48: Perfil da concentração plasmática da Lyso-7 após administração intravenosa

das doses: 1,55 mg/Kg de Lyso-7 livre e 2,17 mg/Kg de NC-PLA (média ± erro padrão, n =

6). *** p < 0,001, ** p < 0,05 usando two-way ANOVA. ................................................... 131

Figura 49: Cromatograma de amostra de plasma coletado 5 min após injeção de 300 µL

da suspensão de NC-PLA com 0,5 mg/mL de Lyso-7. .................................................... 132

GARCIA, GM LISTA DE TABELAS

17

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de

Kanwar et al, 2011). ........................................................................................................... 31

Tabela 2: Parâmetros relativos à curva de calibração média do método analítico para

quantificação de ITZ com detecção FLU ........................................................................... 55

Tabela 3: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por

CLAE-DAD a 260 nm ......................................................................................................... 56

Tabela 4: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por

CLAE-FLU com 320 nm de excitação e 380 nm de emissão ............................................. 57

Tabela 5: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção DAD ....................... 58

Tabela 6: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção FLU ........................ 58

Tabela 7: Limites de detecção e quantificação do ITZ com detecção DAD e FLU ............ 58

Tabela 8: Diâmetro hidrodinâmico médio de nanoesferas de ITZ obtidas a partir de

diferentes polímeros ............................................................. Erro! Indicador não definido.

Tabela 9: Comparação de tamanho entre as NS brancas produzidas com polímeros

dibloco e tribloco com e sem o ligante de selectina. ............. Erro! Indicador não definido.

Tabela 10: Quadro comparativo do efeito do ITZ nas propriedades de tamanho e carga

superficial das NS ................................................................. Erro! Indicador não definido.

Tabela 11: Eficiência de encapsulação e porcentagem de encapsulação de formulações

de NS com 0,5 mg/ml de ITZ ................................................ Erro! Indicador não definido.

Tabela 12: Tamanho das NS brancas analisadas por PCS e MFAErro! Indicador não

definido.

Tabela 13: Tabela valores de R2 (coeficiente de correlação linear) referentes a cinética de

liberação do ITZ em PBS, obtidos através da construção de gráficos para modelo de

Ordem 0 (t x QNL ), 1ª Ordem (t x log %NL ), e Higuchi (√ t x %L ). Os valores em negrito


Tabela 14: Valores de n (coeficiente de liberação) para as amostrasErro! Indicador não

definido.

Tabela 15: Preparo da curva de calibração ..................................................................... 102

Tabela 16: Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo .................... 103

Tabela 17: Resultados do teste de precisão intra-dia para validação do doseamento por

CLAE-DAD da Lyso-7 a 385 nm ...................................................................................... 105

Tabela 18: Exatidão do método de doseamento da Lyso-7 ............................................ 106

Tabela 19: Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo .................... 109

GARCIA, GM LISTA DE TABELAS

18

Tabela 20: Recuperação média do procedimento de extração das amostras de plasma de

controle de qualidade adicionadas de Lyso-7 (padrão) e benznidazol® (padrão interno).

Cada valor representa a média de seis determinações. DP = desvio padrão,

CV=coeficiente ................................................................................................................. 110

Tabela 21: Resultados de precisão e exatidão intra e inter-ensaios do método analítico

para quantificação de Lyso-7 em plasma. Os resultados expressam a média da análise de

6 amostras, durante 3 dias .............................................................................................. 113

Tabela 22: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas após permanência

à temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três

determinações ................................................................................................................. 114

Tabela 23: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente

após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de

congelamento e descongelamento (n = 5) ....................................................................... 115


após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de

congelamento e descongelamento, (n = 5) ...................................................................... 115


após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de

congelamento e descongelamento, (n = 5) ...................................................................... 115

Tabela 26: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, purificadas e mantidas a

temperatura ambiente por 24 horas, (n = 5) .................................................................... 116

Tabela 27: Comparação do tamanho entre as NC brancas com diversos polímeros ..... 125

Tabela 28: Comparação de tamanho entre as NC com 0,5 mg/mL de Lyso-7 produzidas

com polímeros PLA, dibloco e tribloco, com e sem ligante de selectina .......................... 126

Tabela 29: Eficiência de encapsulação e rendimento de encapsulação de formulações de

NC com 0,5 mg/ml de Lyso-7 .......................................................................................... 127

Tabela 30: Tabela valores de R2 (coeficiente de correlação linear) referentes a cinética de

liberação de PLA-NC da Lyso-7 em PBS, obtidos através da construção de gráficos para

modelo de Ordem 0 (t x QND ), 1ª Ordem (t x log %ND ), e Higuchi (√ t x %D ) ............. 129

Tabela 31: Valores de n (coeficiente de liberação) para as amostras ............................. 129

Tabela 32: Parâmetros farmacocinéticos da Lyso-7 em diferentes formulações após

administração intravenosa ............................................................................................... 131

GARCIA, GM LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

19

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ζ- potencial zeta

ANOVA – análise de variância

ANVISA - agência nacional de vigilância sanitária

AUC – área sob a curva

CETEC - Centro Tecnológico de Minas Gerais

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Cmédia - concentração média determinada

Cl= clearence

CLAE-DAD = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Associada a arranjos diidos

CLAE-FLU = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Associada a Fluorescência

CQA - controle de qualidade concentração alta

CQB - controle de qualidade concentrações baixa

CQ - controle de qualidade

CQM - controle de qualidade concentração média

CV(%) - coeficiente de variação em porcentagem

DMSO = dimetilsulfóxido

DP - desvio-padrão

FDA - Food and Drug Administration

FLU - fluorescência

ITZ = itraconazol

I.P - índice de polidispersão

kHz – kilohertz

kDa – kilodaltons

Kd - constante de distribuição

LD - limite de detecção

LIQ - limite inferior de quantificação

LQ - limite de quantificação

LSQ - limite superior de quantificação

MFA - microscopia de força atômica

mg/Kg – miligrama por kilo

mg/mL – miligramas por mililitro

mV – milivolt

NC – nanocápsulas

GARCIA, GM LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

20

NP – nanopartícula

NS - nanoesferas

PA – padrão analítico

PBS – tampão fosfato salina

PI - padrão interno

PCL - poli-ε-caprolactona

PK/PD – correlação entre farmacocinética e farmacodinâmica

ECF - espectroscopia de correlação de fótons

PEG - polietilenoglicol

PLA – ácido poliláctico

PLGA – ácido poli(lático-co-glicólico)

QND – quantidade não dissolvida

QNL – quantidade não liberada

rpm - rotações por minuto

SFM - sistema fagocítico mononuclear

T. cruzi = Trypanosoma cruzi

TGI = trato gastrointestinal

TZD = tiazolidona

UV = ultravioleta

GARCIA, GM SUMÁRIO

21

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... vi

RESUMO ............................................................................................................................. 9

ABSTRACT ....................................................................................................................... 11

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... 13

LISTA DE TABELAS......................................................................................................... 17

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................... 19

SUMÁRIO .......................................................................................................................... 21

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 25

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 29

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 30

2.1 Sistemas Vetorizados ............................................................................................... 30

2.2 Polímeros e copolímeros utilizados no preparo de nanopartículas .......................... 35

2.3 Direcionamento ativo de fármacos: funcionalização ................................................. 39

2.3.1 As selectinas como alvo do direcionamento ativo de fármacos ......................... 40

2.3.2 Inflamação associada à patogênese da doença de Chagas .............................. 43

2.3.3 Inflamação associada à patogênese da aterosclerose ....................................... 46

OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 41

CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 42

VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DOSEAMENTO DO ITRACONAZOL ................................................................................................................. 42

1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 51

2 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 52

2.1 Materiais ................................................................................................................... 52

2.2 Equipamentos ........................................................................................................... 52

2.3 Validação de metodologia analítica para quantificação do itraconazol nas nanoesferas poliméricas por CLAE-DAD e para avaliação da cinética de liberação in vitro por CLAE-FLU ........................................................................................................ 52

2.3.1 Condições cromatográficas ................................................................................ 52

2.3.2 Parâmetros de validação .................................................................................... 53

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 53

3.1 Especificidade .......................................................................................................... 53

3.2 Linearidade ............................................................................................................... 54

3.3 Precisão.................................................................................................................... 56

GARCIA, GM SUMÁRIO

22

3.4 Exatidão.................................................................................................................... 57

3.5 Limite de detecção e limite de quantificação ............................................................ 58

4 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 59

CAPÍTULO II ..................................................................................................................... 60

Preparo de formulações e caracterização das nanopartículas contendo o itraconazol ........................................................................................................................................... 60

1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 61


2.1 Materiais ................................................................................................................... 62

2.2 Preparação das nanoesferas .................................................................................... 62

2.3 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas ................................................. 63

2.3.1 Distribuição de Tamanho ................................................................................... 63

2.3.2 Potencial Zeta (ζ) ............................................................................................... 64

2.3.3 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ...................................................... 64

2.3.4 Análise Morfológica das Nanopartículas ............................................................ 65

2.3.5 Avaliação da solubilidade do itraconazol em PBS .............................................. 66

2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro .......................................................... 66

2.4 Análise Estatística dos Dados .................................................................................. 67

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................ Erro! Indicador não definido.

3.1 Preparo das nanopartículas......................................... Erro! Indicador não definido.

3.2 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas .... Erro! Indicador não definido.

3.2.1 Distribuição de Tamanho ...................................... Erro! Indicador não definido.

3.2.2 Estabilidade físico-química .................................... Erro! Indicador não definido.

3.2.3 Potencial Zeta (ζ) .................................................. Erro! Indicador não definido.

3.2.4 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ......... Erro! Indicador não definido.

3.2.5 Avaliação morfológica das nanoesferas ................ Erro! Indicador não definido.

2.2.6 Avaliação da solubilidade do itraconazol ............... Erro! Indicador não definido.

2.2.7 Avaliação da cinética de liberação in vitro ............. Erro! Indicador não definido.

4 CONCLUSÕES ..................................................................... Erro! Indicador não definido.

CAPÍTULO III .................................................................................................................... 97

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA E BIOANALÍTICA PARA DOSEAMENTO DA LYSO-7 ....................................................... 97

1 OBJETIVOS ................................................................................................................... 98


2.1 Materiais ................................................................................................................... 99

GARCIA, GM SUMÁRIO

23

2.2 Validação analítica por CLAE-DAD .......................................................................... 99

2.2.1 Padrões de calibração ........................................................................................ 99

2.2.2 Condições cromatográficas ................................................................................ 99

2.3 Validação Bioanalítica em plasma por CLAE-DAD ................................................. 100

2.3.1 Padrões de calibração ...................................................................................... 100

2.3.2 Condições cromatográficas .............................................................................. 100

2.3.3 Animais ............................................................................................................ 101

2.3.4 Preparo das amostras de plasma padrão para a curva de calibração ............. 101

2.3.5 Desenvolvimento do método de extração da Lyso-7 ........................................ 102

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 103

3.1 Validação analítica por CLAE-DAD ........................................................................ 103

3.1.1 Especificidade .................................................................................................. 103

3.1.2 Linearidade....................................................................................................... 104

3.1.3 Precisão ........................................................................................................... 105

3.1.4 Exatidão ........................................................................................................... 105

3.1.5 Limite de quantificação e limite de detecção .................................................... 106

3.2 Validação bioanalítica em plasma por CLAE-DAD ................................................. 107

3.2.1 Especificidade .................................................................................................. 107

3.2.2 Recuperação .................................................................................................... 108

3.2.3 Linearidade....................................................................................................... 110

3.2.4 Precisão ........................................................................................................... 112

3.2.5 Exatidão ........................................................................................................... 112

3.2.6 Limite de quantificação e limite de detecção .................................................... 113

3.2.7 Estabilidade ...................................................................................................... 113

3.2.7.1 Estabilidade de curta duração ....................................................................... 114

3.2.7.2 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento ...................... 114

3.2.7.3 Estabilidade pós-processamento .................................................................. 116

4 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 117

CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 118

PREPARO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO FARMACOCINÉTICO DAS NANOCÁPSULAS CONTENDO LYSO-7 ....................................................................... 118

1 OBJETIVOS ................................................................................................................. 119

2 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 120

2.1 Materiais ................................................................................................................. 120

GARCIA, GM SUMÁRIO

24

2.2 Preparo das nanocápsulas ..................................................................................... 120

2.3 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas ............................................... 121

2.3.1 Distribuição de tamanho ................................................................................... 121

2.3.2 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação .................................................... 121

2.3.3 Avaliação da solubilidade da Lyso-7 em óleo e PBS ....................................... 122

2.3.4 Avaliação da cinética de liberação in vitro ........................................................ 122

2.3.5 Estudo farmacocinético da Lyso-7 ................................................................... 123

2.4 Análise Estatística dos Dados ................................................................................ 124

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 124

3.1 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas ............................................... 124

3.1.1 Distribuição de tamanho ................................................................................... 124

3.1.2 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação .................................................... 127

2.3.5 Avaliação da solubilidade da Lyso-7 ................................................................ 127

2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro ........................................................ 128

3.3 Estudo farmacocinético da Lyso-7 nanoencapsulado ............................................ 130

4 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 132

CONCLUSÃO .................................................................................................................. 133

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 136

ANEXOS - Resumos apresentados em congressos científicos: .............................. 149

INTRODUÇÃO

26

O conceito de vetorização surgiu como alternativa a certos obstáculos

apresentados pela terapia sistêmica convencional. Assim, as características físico-

químicas do vetor, e não mais aquelas do fármaco isoladamente, passam a governar o

perfil de distribuição tecidual da molécula ativa. Os sistemas utilizados são de natureza

variável, mas o princípio geral da vetorização é o mesmo e consiste na liberação do

fármaco de forma preferencial no órgão ou célula-alvo, permitindo deste modo, acentuar o

efeito farmacológico e reduzir os efeitos colaterais adversos (Mohanraj & Chen, 2006).

A utilização de vetores para o controle da liberação de fármacos em sítios

específicos de ação permite o aprimoramento da velocidade de liberação e do regime de

dosagem das substâncias e assim, tem sido uma área de intensa pesquisa nos últimos

vinte anos. Dentre os vetores, incluem-se as micropartículas e os sistemas coloidais

(lipossomas e nanopartículas) (Schaffazick & Guterres, 2003). A vetorização apresenta

múltiplas aplicações, como por exemplo, no tratamento de infecções parasitárias, no

tratamento de inflamações crônicas e agudas, no tratamento do câncer, entre outros

(Brigger et al., 2002; Mosqueira et al., 2004; Pereira et al., 2009).

As NP poliméricas são sistemas carreadores de fármacos que apresentam

diâmetro inferior a 1 µm. O termo nanopartícula inclui as nanocápsulas (NC) e as

nanoesferas (NS), as quais diferem entre si segundo a composição e organização

estrutural. As NC são constituídas de um núcleo oleoso e uma camada externa

polimérica, com surfactantes lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface. Por outro lado,

as NS, que não apresentam óleo em sua composição, são formadas por uma matriz

polimérica, onde o fármaco pode ficar retido ou adsorvido (Takino et al., 1994).

As propriedades das nanopartículas poliméricas podem ser controladas pela

modificação das propriedades físico-químicas dos polímeros empregados. Polímeros tais

como o ácido poli-D,L-láctico (PLA), ácido poli-lático-co-glicólico (PLGA), os

polihidroxialcanoatos (PHAs), poli-ε-caprolactona (PCL), quitosana e seus derivados

(Prego et a.l, 2005) e copolímeros são os mais comumentes utilizados por serem

biodegradáveis e biocompatíveis (Couvreur et al., 2002). Os sistemas nanoparticulados

preparados a partir de tais polímeros permitem a encapsulação de fármacos com vistas à

liberação controlada dos mesmos ou ainda fornecer uma atividade terapêutica mais eficaz

quando comparada com aquela produzida pela administração do fármaco livre. Além

disso, tais sistemas possibilitam a administração intravenosa de moléculas hidrofóbicas,

em elevadas concentrações, melhorando ainda a estabilidade proporcionada pela

27

presença da barreira polimérica, frente à degradação química e enzimática em meio

fisiológico (Mosqueira et al., 2001, Pereira et al., 2009).

Quando administrados por via endovenosa, os vetores nanoparticulares

convencionais são rapidamente removidos da circulação sanguínea pelo sistema

fagocítico mononuclear (SFM), principalmente representado pelas células de Kupffer do

fígado e macrófagos do baço. Esta remoção da circulação geralmente ocorre através do

reconhecimento destes vetores pelos receptores celulares, em um mecanismo

intermediado pela adsorção de proteínas plasmáticas (opsonisação) nas partículas. Deste

modo, a remoção realizada pelo SFM é a maior limitação para a vetorização de fármacos

destinados a outros sítios no corpo humano, apesar deste fenômeno ter sido

vantajosamente empregado no tratamento de infecções intracelulares no fígado e baço

(Barratt et al., 2000).

Muitas técnicas têm sido desenvolvidas e testadas para a modificação da

superfície das nanopartículas para impedir a adsorção das proteínas plasmáticas. Os

polietilenoglicóis (PEG) são os polímeros mais utilizados para modificar a superfície

destas partículas (Gref et al., 1995; Gref et al., 2000; Li et al., 2001;

Mosqueira et al., 2001). Estes polímeros são não imunogênicos, hidrofílicos, pouco

tóxicos e neutros, aprovadas pelo Food and Drug Administration (FDA) para uso interno

humano, podendo ser adsorvido fisicamente ou ligado covalentemente na superfície das

nanocápsulas (Mosqueira et al., 2001). O mecanismo é baseado na formação de um

revestimento hidrofílico, que impede estericamente a opsonização pelas proteínas

plasmáticas (Gref et al., 1995). Estas partículas denominadas furtivas escapam da

captura pelos macrófagos apresentando um aumento do seu tempo de circulação

sanguínea e consequentemente uma maior concentração de fármaco atinge os tecidos

alvos.

A nanotecnologia associada ao uso de polímeros faz parte dos desafios para

se alcançar o direcionamento de fármacos. A possibilidade de sintetizar polímeros com

estruturas e composição bem definidas abre caminhos para a obtenção de NP com

propriedades específicas (Qiu & Bae, 2006). A importância da relação

arquitetura/propriedades do polímero tem sido progressivamente enfatizada, uma vez que

descreve a forma de uma única molécula do mesmo, que muitas vezes determina as

propriedades físico-químicas do vetor. Copolímeros em bloco são definidos como

polímeros que têm dois ou mais segmentos ou blocos organizados na cadeia principal e

podem ser classificados de acordo com sua arquitetura (Qiu & Bae, 2006). As

28

características específicas de cada bloco estão correlacionadas com a arquitetura do

copolímero em bloco, o que auxilia no ajuste das propriedades físico-químicas do

polímero para acrescentar novas funcionalidades ao núcleo ou a superfície de tais

arranjos.

Uma estratégia terapêutica que tem se mostrado promissora para o

direcionamento ativo de fármacos é pilotá-los para as células do endotélio vascular

ativado para modular, dentre outros processos, a resposta inflamatória

(Kessner et al., 2001). O mecanismo é baseado no acoplamento de ligantes na superfície

das NPs. Estes ligantes, que podem ser naturais ou sintéticos, são específicos para

moléculas que possuem sua expressão aumentada durante o processo inflamatório. Uma

vez que selectina-E é expressa na fase aguda e crônica da inflamação, ela pode ser

considerada como um bom candidato para o direcionamento de fármacos. Os ligantes

naturais de selectina E e P são conhecidos por estarem presentes em membranas

plasmáticas de leucócitos circulantes (Ehrhardt et al., 2004; Magnani, 2004). Análogos

sintéticos destes ligantes naturais têm sido investigados devido a sua habilidade de

bloquear a inflamação (Ehrhardt et al., 2004; Simanek et al., 1998;

Kaila & Thomas, 2002). Alguns desses análogos têm demonstrado ter alta afinidade ao

alvo se comparado com o ligante natural, tornando-os moléculas muito atrativas no

desenvolvimento de vetores para o direcionamento ativo de fármacos (funcionalização)

(Essa et al., 2008).

Portanto, neste trabalho objetiva-se o desenvolvimento e caracterização

físico-química de nanopartículas poliméricas produzidas a partir do ácido polilático (PLA)

ligado covalentemente ao polietilenoglicol (PEG) formando diblocos (PLA-PEG) e triblocos

(PLA-PEG-PLA), ambos apresentando ou não funcionalização ao longo da cadeia

(hidroxila, benzila ou selectina-E). Foi avaliada a influência das propriedades de superfície

desses polímeros nas características físico-químicas das nanopartículas, além da

capacidade de tais nanopartículas em modificar o perfil farmacocinético do fármaco a elas

associados. Para tal, foram testadas a encapsulação de dois fármacos: o itraconazol, com

promissores resultados para o tratamento da doença de Chagas; e uma nova substância

da classe das tiazolidonas (TZD), denomina Lyso-7. As TDZs possuem reconhecida

capacidade de melhoria dos fatores associados a doenças cardiovasculares, como a

aterosclerose. Métodos analíticos foram desenvolvidos utilizando cromatografia líquida de

alta eficiência para a quantificação desses fármacos nas nanopartículas e em matriz

biológica.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

GARCIA, GM REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

30

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Sistemas Vetorizados

Nos últimos anos, estudos têm demonstrado que uma abordagem eficaz

para aperfeiçoar a ação farmacológica dos fármacos é associar a molécula ativa em um

sistema de liberação nanoestruturado (Piñon-Segundo et al., 2005). A nanotecnologia tem

sido aplicada no desenvolvimento desses novos sistemas de liberação controlada, que

muitas vezes são veículos de fármacos para aplicações no tratamento do câncer,

doenças parasitárias, entre outras enfermidades (Mohanraj & Chen, 2006), além de

aplicação na cosmetologia. São exemplos destes tipos de veículos as nanopartículas (NP)

poliméricas, os dendrímeros, os lipossomos, as nanopartículas magnéticas, as

nanopartículas contendo ácidos nucleicos e as nanopartículas virais (Kanwar et al, 2011;

Alexis et al., 2008) (Tabela 01). Esses sistemas têm o potencial de aperfeiçoar o índice

terapêutico de diversos fármacos já disponíveis no mercado, aumentando a sua eficácia,

diminuindo a sua toxicidade e atingindo níveis plasmáticos constantes por um período

prolongado. Além disso, os nanocarreadores possibilitam a administração endovenosa de

substâncias de baixa solubilidade em água e a protegem de possíveis degradações. Tais

características permitem o desenvolvimento de novas formas farmacêuticas veiculando

entidades químicas que não haviam ultrapassado as fases pré-clínica e clínica devido às

suas propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e de biodisponibilidade (Alexis et al.,

2008).

Nanopartículas poliméricas podem ser definidas como sistemas coloidais ou

como carreadores sólidos de fármacos preparados a partir de polímeros naturais ou

sintéticos (Brigger et al., 2002; Reis et al., 2006). Esse tipo de sistema vetorizado possui a

habilidade de atingir órgãos ou tecidos específicos e, além disso, atuar como carreadores

de DNA, vacinas, proteínas e peptídeos, que por serem instáveis em meios biológicos

apresentavam testes pouco viáveis (Soppimath et al., 2001; Hans & Lowman, 2002).


31

Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de Kanwar et al., 2011). Nome Estrutura Composição Perspectivas e usos Ref.

Nanotubos de carbonos

Composto de fulerenos (compostos C60) e/ou outros carbonos formando estruturas ocas

Aumentam o volume interno, fácil de modificações funcionais das superfícies internas e externas. Com uma camada superficial é usado para direcionar fármacos e genes, e duas camadas para transfecção

Foley et al., 2002; Martin & Kohli, 2003

Lipossomas

Lipídeos anfifílicos Alteram o perfil farmacocinético de fármacos encapsulados

Rawat et al., 2006

Nanopartículas lipídica sólida

Lipídeos anfifílicos Podem ser usadas como adjuvantes em vacinas e como agentes para transfecção não-viral

Cevc, 2004

Nanopartículas poliméricas

Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis

Eles permitem maior controle da farmacocinética do fármaco carreado, gerando níveis mais constantes dos mesmos

Rawat et al., 2008; Mahidhara et al. 2011

Micelas poliméricas

Lipídeos anfifílicos São formadas em meio hidrofóbico sendo adequadas para carrear fármacos insolúveis em água devido à composição do núcleo

Torchilin et al., 2003

Dendrímeros Monômeros do tipo ABn

Oferecem vantagens como tamanho nanométrico, fácil modificação e preparo. Podem ser usados como agentes de revestimento com proteção e direcionamento de fármacos para vários sítios

Choi et al., 2005

Nanopartículas funcionalizadas

Metais inorgânicos, anticorpos, ligantes específicos

Podem ser incorporadas propriedades fluorescentes para uso como biosensores, e também são usados como marcador em biologia molecular e direcionamento específico de fármacos

Schneider et al., 2000


32

As principais características a serem levadas em consideração no

desenvolvimento de NP são a composição, o tamanho, suas propriedades superficiais e o

perfil de liberação de agentes farmacologicamente ativos. Estas características físico-

químicas irão modificar a biodistribuição do fármaco no organismo, aumentando sua

concentração no local de ação e promovendo o aprimoramento da terapêutica, com

redução de doses e dos possíveis efeitos colaterais (Mohanraj & Chen, 2006).

As NP poliméricas são sistemas carreadores de fármacos que apresentam

diâmetro inferior a 1 µm. O termo nanopartícula inclui as nanocápsulas (NC) e as

nanoesferas (NS), as quais diferem entre si segundo a composição e organização

estrutural (Fig. 1).

Figura 1: Representação esquemática de NC e NS poliméricas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c) fármaco retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica.

As NC são constituídas de um núcleo, geralmente oleoso e uma camada

externa polimérica, com surfactantes lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface. Vários

tipos de óleos podem ser utilizados na preparação das NC, como óleos vegetais e

minerais. O principal fator para a escolha do óleo é a solubilidade do fármaco a ser

encapsulado no núcleo oleoso. Em geral, fármacos que possuem um valor de coeficiente

de partição (log Poc/a) elevado são mais promissores a serem associadas às NC e

administradas por diferentes vias com obtenção de liberação controlada

(Takino et al., 1994). Por outro lado, as NS, que não apresentam óleo em sua

composição, são formadas por uma matriz polimérica, onde o fármaco pode ficar retido ou

adsorvido. A nanoencapsulação tornou-se uma estratégia adequada para aumentar a

biocompatibilidade e a dispersão em escala nanométrica de compostos lipofílicos em

meio aquoso e biológico (Deda et al., 2009).

Existem diversos métodos de preparo de nanopartículas descritos na

literatura e, dependendo das características físico-químicas do fármaco e do polímero,

deve-se escolher um método adequado obter uma encapsulação eficiente do fármaco


33

(Reis et al., 2006). Os métodos mais comuns são emulsificação e evaporação do

solvente, polimerização do monômero, nanoprecipitação e salting-out (Valthier &

Bouchemal, 2009).

A nanoprecipitação, também conhecida como deposição de um polímero

pré-formado seguida de evaporação do solvente, é uma técnica simples, reprodutível e

facilmente transponível para a produção de nanopartículas em grande escala

(Couvreur et al., 2002, Fessi et al, 1989; Legrand et al., 1999, Pereira et al., 2009). Este

método consiste basicamente em verter uma solução contendo o fármaco e polímero,

dissolvidos num solvente orgânico miscível em água, numa fase aquosa contendo um

tensoativo hidrofílico como estabilizante. Imediatamente após a injeção, o solvente

orgânico difunde-se na água, dando origem a uma suspensão coloidal de nanoesferas.

Para a obtenção de nanocápsulas, um óleo e um tensoativo lipofílico são adicionados à

fase orgânica da preparação. Após a formação das partículas, as suspensões são

submetidas à evaporação para remoção do solvente orgânico e concentração até o

volume desejado (Fessi et al, 1989).

Após o preparo, o estudo de caracterização das NP é uma importante etapa

em seu desenvolvimento, uma vez que as características do polímero como hidrofobia,

carga superficial e perfil de biodegradação das substâncias adjuvantes, assim como as

características do fármaco associado, como seu peso molecular, carga e localização nas

nanopartículas, seja por adsorção ou incorporação, têm grande influência nos processos

de absorção, biodistribuição e eliminação do fármaco veiculado ao nanocarreador (Reis et

al., 2006). Os principais fatores que devem ser avaliadas são o tamanho, a carga

superficial (potencial zeta) das nanopartículas, a eficiência de encapsulação e o perfil de

liberação do fármaco encapsulado (Hans & Lowman, 2002).

A técnica de espalhamento dinâmico da luz ou espectroscopia de correlação

de fótons baseia-se na determinação das flutuações na intensidade da luz espalhada

pelas partículas, em função do tempo, e no cálculo da respectiva função de

autocorrelação. Partículas em um meio líquido movem-se ao acaso (movimento

Browniano), devido a colisões com as moléculas do meio de dispersão. Partículas

menores se movimentam mais rapidamente que partículas grandes, portanto, possuem

coeficiente de difusão (D) maior. Para uma dispersão de partículas com viscosidade η, em

uma temperatura constante T, o coeficiente de difusão D é inversamente proporcional ao

diâmetro hidrodinâmico dH das partículas, como mostra a equação de Stokes-Einstein,


34

D = k T 3πηdH

onde k é a constante de Boltzmann (constante física que relaciona

temperatura e energia de moléculas). As flutuações de intensidade de luz espalhada ao

longo do tempo são representadas através de uma função de correlação. No caso de

partículas pequenas, essa função de correlação entre as intensidades diminui mais

rapidamente com o tempo, do que no caso de partículas grandes. No tempo t = t0 = 0, a

intensidade de espalhamento e a função de correlação possuem um valor máximo. Com o

passar do tempo, a intensidade de espalhamento em um tempo (t0 + τ) estará cada vez

menos correlacionada com a intensidade de espalhamento inicial, e a média dos produtos

das intensidades tende a zero. Para partículas esféricas e monodispersas, a função decai

exponencialmente num intervalo de tempo t, e a constante de decaimento da curva

exponencial gerada pela função de correlação está relacionada com o coeficiente de

difusão translacional das partículas. A constante de decaimento depende do índice de

refração do líquido que dispersa as partículas, do ângulo de detecção da luz espalhada e

do comprimento de onda da luz incidente (Calvo et al., 1995).

As medidas de potencial zeta se baseiam no fenômeno relacionado à carga

líquida na superfície da partícula que afeta a distribuição de íons na sua vizinhança,

aumentando a concentração de contraíons junto à superfície. Assim, forma-se uma dupla

camada elétrica na interface da partícula com o líquido. Essa dupla camada divide-se em

duas regiões: uma região interna que inclui íons fortemente ligados à superfície e uma

região exterior onde a distribuição dos íons é determinada pelo equilíbrio entre forças

eletrostáticas e movimento térmico. Dessa forma, o potencial nessa região decai com o

aumento da distancia da superfície até uma distância suficientemente grande, atingir o

potencial da solução. Esse potencial é convencionado como potencial zero. Em um

campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e os íons mais fortemente

ligados à mesma se movem como uma unidade, e o potencial no plano de cizalhamento

entre essa unidade e o meio circundante é chamado potencial zeta (Fig. 16).

Quando uma camada de macromoléculas é adsorvida na superfície da

partícula, ela move o plano de cisalhamento para longe da superfície, alterando o

potencial zeta. O potencial zeta é função da carga superficial da partícula, de qualquer

camada adsorvida na interface com o meio e da natureza e composição do meio que a

circunda.


35

Figura 2: Esquema representativo da dupla camada elétrica (Hotza, 1997).

2.2 Polímeros e copolímeros utilizados no preparo de nanopartículas

As NP podem ser preparadas a partir de polímeros biodegradáveis naturais

ou sintéticos. Atualmente, o uso destes polímeros para a liberação controlada de agentes

terapêuticos já é bem estabelecido (Birnbaum et al., 2000). Para a aplicação biológica, o

polímero de escolha não deve causar reação inflamatória ou resposta tóxica quando

administrado, apresentar tempo de vida plasmático prolongado, possuir tempo de

degradação em acordo com o processo em que está sendo utilizado, ter permeabilidade

adequada nas membranas biológicas e gerar produtos de degradação que não sejam

tóxicos e que sejam biotransformados e eliminados do organismo (Nair & Laurencin,

2007).

Os polímeros sintéticos têm sido mais utilizados nessa área que os

polímeros naturais e podem apresentar variações na pureza (Hans & Lowman, 2002). Os

polímeros sintéticos mais utilizados são os poliésteres alifáticos, como o ácido

poliglicolítico (PGA), o ácido polilático (PLA), o ácido poli-(D,L-lático-co-glicólico) (PLGA) e

o poli-ε-caprolactona (PCL) (Sinha et al., 2004).

O PLA é um polímero amplamente utilizado em formulações de nano e

micropartículas, tendo sido aprovado pela Agência Regulatória Americana (FDA, Food

and Drug Adminstration) para uso intravenoso e intramuscular (Mosqueira et al, 2001).

Este polímero é hidrofóbico, insolúvel em água e solúvel em vários solventes orgânicos e

pode ser considerado como um poli-metabólito, pois seu produto de degradação é o ácido

láctico gerado pela quebra da porção terminal da cadeia polimérica. Nas células, o ácido

láctico é convertido em piruvato pela lactato desidrogenase presente como diferentes

isoenzimas no coração, músculos e fígado, e sua eliminação ocorre via ciclo de Krebs,


36

principalmente pelos pulmões e rins, na forma de dióxido de carbono e água (Dellacherie

et al., 2001; Makino et al., 2002).

O PLA tem sido amplamente usado na produção de NP devido à sua alta

capacidade de encapsulação de fármacos hidrofóbicos. Entretanto, a rápida captação

dessas nanopartículas convencionais, sem modificação de superfície, pelo sistema

fagocitário mononuclear (SFM) após a administração intravenosa é um grande problema

para se alcançar um direcionamento efetivo para locais específicos do corpo, além do

fígado e baço (Moghimi et al., 2001). Portanto, o desenvolvimento de NP de circulação

sanguínea prolongada (furtiva) surgiu como uma tentativa de escapar do reconhecimento

pelas células fagocíticas do sangue (Raghavan et al., 2000). A estratégia mais

comumente utilizada para desenvolver NP furtivas, capazes de evadir ao SFM, é a

introdução de um revestimento hidrofílico flexível nas superfícies hidrofóbicas,

protegendo-as contra a adsorção de proteínas plasmáticas, que é o primeiro passo do

mecanismo de depuração de partículas pelas células fagocitárias do sangue. As NP

convencionais (sem revestimento) concentram os fármacos nelas encapsulados em

células do SFM (fígado e baço), enquanto as NP furtivas representam um tipo especial de

carreador com cadeias de PEG ligadas covalentemente à superfície, tornando-as mais

hidrofílicas, prolonagando sua permanência no sangue e aumentando a possibilidade do

vetor se acumular em outros tecidos (Mosqueira et al, 2001).

Devido à natureza protéica dos componentes sanguíneos, os fatores que

determinam a adsorção de proteínas nas superfícies sólidas, como composição química,

carga e hidrofilicidade do polímero, sem dúvida desempenham um papel importante na

opsonização das NP. A carga da superfície das partículas influencia a sua interação

eletrostática com os componentes do meio circundante, sendo esta determinada pelas

propriedades eletrostáticas do polímero. É reconhecido que superfícies carregadas

negativamente conduzem à maior eliminação das partículas da circulação sistêmica

quando comparada às neutras. A hidrofilia/hidrofobia da superfície afeta sua força

atrativa, influenciando desse modo no processo de opsonização e na força de interação.

Assim, quanto mais hidrofóbica a partícula, maior é a adsorção de proteínas e mais rápida

é a sua remoção da circulação (Stolnik et al, 1995).

As propriedades do PEG têm sido exploradas para a modificação da

superfície das NP com o objetivo de prevenir a opsonização, após administração

endovenosa, uma vez que aumenta a hidrofilia da superfície. Para uma partícula

apresentar comportamento furtivo, dois critérios devem ser consideramos: o polímero


37

adsorvido não deve ser removido facilmente pelo fluxo in vivo e a densidade da barreira

estérica imposta por ele deve ser suficientemente grande para suprimir a opsonização

endógena ou prevenir a interação da superfície com os potenciais receptores dos

macrófagos (Moghimi & Hunter, 2001). Para tal, cadeias de PEG são ligadas

covalentemente na superfície das nanopartículas. Além disso, a flexibilidade das cadeias

de PEG permite a sua mobilidade na superfície devido à presença de água de solvatação,

resultando numa densa nuvem de várias conformações intercambiáveis. Isto faz com que

o sistema imune tenha dificuldades em modelar um anticorpo em volta desta estrutura

flexível. Este fenômeno explicaria a razão pela qual uma molécula hidrofílica, porém mais

rígida, como o dextrano, ligada à superfície das partículas, não aumenta o tempo de

permanência das mesmas na circulação sanguínea (Allen, 1994; Jeon et al, 1991a,

1991b).

Recentemente, aumentou-se o interesse pelos copolímeros em bloco. Estes

são definidos como polímeros que têm dois ou mais segmentos ou blocos ligados

covalentemente na cadeia principal (Fig. 2) e podem ser classificados de acordo com sua

arquitetura em diblocos tipo AB, tribloco tipo ABA ou BAB e multibloco tipo (ABA)n, onde

A representa o bloco solúvel em um solvente selecionado e B designa o bloco insolúvel.

Como exemplo tem-se os copolímeros dibloco PLA-PEG, onde uma cadeia de PEG

(bloco hidrofílico) encontra-se ligada covalentemente e na extremidade da cadeia de PLA

(bloco hidrofóbico), bem como os copolímeros tribloco PLA-PEG-PLA, onde cada bloco

também se encontra ligado a outro linear e covalentemente (Fig. 2). Existem variações

deste tipo de copolímeros, onde os blocos de PEG encontram-se grafitadas na cadeia de

PLA, formando assim, copolímeros não lineares (Essa et al., 2010). Além disso, outros

grupamentos químicos podem ser grafitados covalentemente aos copolímeros do tipo

dibloco e tribloco como os grupos funcionais hidroxila e benzila. Objetivas-se assim,

alterar as propriedades físico-químicas do polímero e consequentemente a

farmacocínetica do nanocarreadores com eles preparado (Fig. 3).

Devido às interações intrínsecas de afinidade desses segmentos e mesmas

propriedades físico-químicas, os copolímeros em bloco mostram muitas vezes uma

tendência de se auto-organizar em solventes orgânicos. No entanto, a mobilidade de cada

bloco é bastante restrita por razões estéricas e os domínios automontáveis compostos por

blocos idênticos, consequentemente, caem em escala nanométrica, ou micrométricas e

são segregados em estado mais entropicamente estabilizado. As características

detalhadas dos domínios automontáveis são sensíveis à arquitetura do copolímero em


38

bloco. Isso é prático para ajustar as propriedades físico-químicas do polímero para

acrescentar novas funcionalidades ao núcleo ou a superfície de tais arranjos

(Qiu & Bae, 2006).

Como diversos nanossistemas têm sido desenvolvidos para a veiculação de

fármacos, a importância da relação arquitetura/propriedades do polímero tem sido

progressivamente enfatizada. A arquitetura do polímero descreve a forma de uma única

molécula do mesmo, que, muitas vezes, determina suas propriedades físico-químicas

(Qiu & Bae, 2006).

Figura 3: Arquitetura de copolímeros lineares (adaptado de Qui & Bae, 2006).

A natureza polimérica do vetor nanoparticulado desempenha um importante

papel no perfil de distribuição in vivo e consequentemente, na eficácia terapêutica do

fármaco carreado. Em particular, a natureza da superfície da partícula e a carga

superficial são parâmetros determinantes, pois influenciam a travessia pelas barreiras

biológicas favorecendo ou impedindo a penetração em células específicas

(Dellacherie et al, 2001). O tamanho e as características de superfície das NP

desempenham um papel importante na sua opsonização e depuração sanguínea

(Owens & Peppas, 2006). Como já relatado, uma vez administrado por via intravenosa, as

NP com superfície hidrofóbica são reconhecidas pelo SFM, devido à opsonização por

proteínas do sistema do complemento. Partículas maiores que 250 nm também são

rapidamente depuradas do sangue porque elas ativam o sistema complemento. As NP

com estas características tendem a se acumular nos tecidos de endotélio mais fenestrado

como no fígado, baço e medula óssea, ressaltando, assim, a aplicabilidade da

manipulação da superfície das nanopartículas poliméricas com intuito de controlar suas

interações e seu destino dentro do sistema biológico.


39

O

O

O

O

O

O

O

O

O

d,l-PLAPEO

d,l-PLA

O

O

HO

O

O

O

O

O

O

O

OH

d,l-PLAR

R=

x y

zn

R

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

HO

CH3

R

x

n

z

,OH

Figura 4: Representação química dos copolímeros dibloco (A) e tribloco (B) e suas funcionalizações.

2.3 Direcionamento ativo de fármacos: funcionalização

O interesse no desenvolvimento de sistemas coloidais direcionados a um

alvo específico tem crescido durante as últimas décadas. Estes carreadores objetivam

liberar a fármaco próximo ao sítio de ação, protegendo a substância ativa da rápida

degradação e eliminação, possibilitando a redução da dose e evitando efeitos colaterais

(Banquy et al., 2008). Diversas abordagens, tais como formas farmacêuticas

imunoconjugadas (contendo anticorpos), bioconjugadas (contendo genes), lipossomas,

dendrímeros, micelas, ou NP revestidas (com carboidratos, lecitina ou ligantes) têm sido

propostas para alcançar o direcionamento de fármacos de forma ativa ou passiva

(Allen et al., 2004). No entanto, quando comparadas a outros sistemas carreadores de

fármacos, as NP poliméricas oferecem a possibilidade de encapsular vários tipos de

moléculas e protegê-las da degradação enzimática. Os polímeros que formam as NP

carreadoras são geralmente muito estáveis em meio fisiológico e permitem a liberação

controlada por degradação da matriz polimérica (Banquy et al., 2008).

A abordagem geral para conferir as capacidades de direcionamento ativo de

NP é funcionalizar a superfície das mesmas com um ligante específico. Esta abordagem é

fortemente limitada pela estabilidade da ligação entre o ligante e a superfície da NP. Se

A

B


40

esta ligação não é estável o suficiente nos meios fisiológicos, a liberação do ligante (por

hidrólise, por exemplo) da superfície NP pode ser rápida. Para contornar este grave

problema e para melhorar as propriedades de ligação do ligante ao polímero, novas

estratégias de ligação estão sendo investigadas, dentre elas o uso de ligantes sintéticos

(Banquy et al., 2008).

Um exemplo do direcionamento de fármacos por meio da funcionalização do

polímero foi descrito por Oh et al., (2007). Este estudo demonstrou o direcionamento de

nanopartículas funcionalizadas com anticorpo aminopeptidase P específico para caveolina

em endotélio pulmonar de ratos. A caveolina funciona como uma bomba, transportando a

nanopartícula conjugada com o anticorpo do sangue através do endotélio no tecido

pulmonar. Aproximadamente 80% da dose injetada foi captada em 30 min, com um

mínimo de captação por outros tecidos. Estas abordagens abrem uma nova perspectiva

para melhorar direcionamento tecidual de nanopartículas para o coração

(Romero & Morilla, 2010).

O direcionamento de fármacos específicos para células do endotélio

vascular ativado a fim de se modular a resposta inflamatória tem sido uma estratégia

terapêutica válida. Lipossomas contendo anticorpos imunoconjugados que reconhecem

moléculas que atuam no processo inflamatório assim como os lipossomas que incorporam

ligantes específicos destas moléculas estão entre os métodos mais descritos para se

regular a inflamação. Todos eles apresentam a desvantagem de utilizar ligantes naturais,

que competem com o homólogo livre presente na corrente sanguínea e assim, não

conseguem aumentar a interação com o alvo (Kessner et al., 2001).

2.3.1 As selectinas como alvo do direcionamento ativo de fármacos

A inflamação é um mecanismo de defesa natural do organismo após a

exposição a antígenos específicos, substâncias químicas, infecções e estresse físico. É

caracterizada por diversos eventos que ocorrem dentro ou perto da área lesada, incluindo

a ativação de células do endotélio vascular (CEV) e acúmulo de leucócitos (Fig. 4). As

CEV, após ativação por citocinas pró-inflamatórias, aumentam a expressão de moléculas

de adesão celular (MAC) em um processo altamente regulado e sequencial. Esta

sequência envolve a expressão das moléculas de adesão que são responsáveis pela

migração de leucócitos ao longo da parede do vaso sanguíneo (Simon & Green, 2005).


41

Figura 5: Esquema simplificado do início de um processo inflamatório demonstrando da ativação de células do endotélio vascular e aumento da expressão de selectina-E (A) e o processo de internalização de leucócitos (B) após a adesão dos mesmos mediados por selectina-E.

As selectinas são moléculas responsáveis pela adesão celular, e sua família

possui dois membros principais, selectina-E (selectina endotelial) e selectina-P (selectina

plaquetária). Estas moléculas têm como ligante um carboidrato sialilado, o Syalil-Lewis X

(sLex) (Fig. 5)(Ehrhardt et al., 2004; Magnani, 2004). Este ligante constitui o sacarídeo

terminal de muitas glicoproteínas da superfície celular, principalmente na superfície de

leucócitos. Assim sendo, a superfície da membrana celular dos leucócitos possui

oligossacarídeos do tipo sLex e estes se ligam a moléculas de adesão, as selectinas.

Quando há uma ativação deste processo, no decurso da inflamação, as selectinas são

expostas em maior quantidade na superfície do endotélio e o sLex dos leucócitos

circulantes têm assim, maior capacidade de ligação sobre o endotélio. Esta ligação entre

o sLex e as E e P-selectinas constituem o início para o processo descrito como rolamento,

que culminará com a migração leucocitária para a região com inflamação

(Janeway et al., 2001).

(A)

(B)


42

Figura 6: Estrutura química do ligante natural de selectina-E, o Syalil-Lewis X (sLex).

Após a estimulação inflamatória, selectina-P aparece rapidamente na

superfície da célula, devido ao seu armazenamento intracelular. Por outro lado, os níveis

máximos de selectina-E são alcançadas de 4-6 horas após a ativação, devido à síntese

de novo (Colden-Stanfield & Gallin, 1998). Uma vez que selectina-E é expressa na fase

aguda e crônica da inflamação, ela pode ser considerada como um bom candidato para o

direcionamento ativo de fármacos. Além disso, as citocinas IL-1β e TNFα, assim como o

lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), também são capazes de estimular a expressão da

selectina-E (Ye et al., 1995).

Análogos sintéticos (Fig. 6) destes ligantes de selectinas vêm sendo

investigados devido a sua habilidade de interagir com as CEV ativado

(Banquy et al, 2008) e bloquear a inflamação (Ehrhardt et al., 2004; Simanek et al., 1998;

Kaila & Thomas, 2002). Alguns desses análogos têm demonstrado ter alta afinidade ao

alvo se comparado com o ligante natural, tornando-os moléculas muito atrativas no

desenvolvimento de formas farmacêuticas nanoestruturadas para o direcionamento ativo

de fármacos.

Figura 7: Estrutura química do ligante sintético de selectinas E e P.


43

Brunk & Hammer, (1997), utilizaram microesferas recobertas com selectina-

E e com o seu ligante natural, sLex, em células que apresentam expressão de moléculas

similar aos leucócitos no processo de rolamento após estímulo do endotélio. Foi

evidenciado que a velocidade de rolamento é mais sensível à presença de selectina-E na

superfície das microesferas. Além disso, eles sugerem que outros carboidratos do tipo

Lewis são mais efetivos na mediação do processo de rolamento, ou seja, um ligante

sintético. Dickerson et al., (2001), desenvolveram microesferas de PCL estabilizadas com

PVA (álcool polivinílico). As microsesferas foram encubadas com anticorpo monoclonal

anti selectinas E e P (denominado HuEP5C7.g2 ou HuEP) e sua capacidade de adesão

foi estudada in vitro. Relatou-se que microesferas contendo o anticorpo exibiram adesão

específica a células endoteliais ativadas, e pouca adesão às células endoteliais não

ativadas. Baseado nestes dados, Blackwell et al., (2001) utilizaram nanoesferas

recobertas pelo mesmo anticorpo anti selectina-E e os ensaios de adesão revelaram que

estas NS exibiram adesão específica aumentada para expressão de selectina em células

mononucleares. Ham et al., (2009) desenvolveram micropartículas peguiladas revestidas

com HuEP e avaliaram o aumento da especificidade da ligação com selectina-P. A

inserção das cadeias de PEG deixou os anticorpos mais acessíveis, aumentando assim a

viabilidade de sua ligação com o alvo.

Respostas inflamatórias exageradas e/ou prolongadas estão associadas a

um grande número de doenças agudas e crônicas, incluindo isquemia de órgãos,

reperfusão, asma alérgica, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, infecção por

determinados parasitas e na aterosclerose (Ehrhardt et al., 2004).

2.3.2 Inflamação associada à patogênese da doença de Chagas

Algumas infecções parasitárias podem ocasionar respostas inflamatórias

exacerbadas, como na doença de Chagas, que é uma condição clínica associada ao

parasito Trypanosoma cruzi, onde além da infecção pelo parasito, existe um processo

inflamatório intenso, principalmente no tecido cardíaco, culminando em lesões neste

tecido, que são posteriormente substituídas por tecido fibroso, aumentando a resistência

da musculatura cardíaca (Teixeira et al., 2006). É observado que ocorre um aumento de

mais de 900% no número de monócitos no sangue periférico de animais infectados em

até 12 dias após a infecção (Melo et al., 2001). Descrito pioneiramente pelo Dr. Carlos


44

Chagas, esta doença atualmente afeta aproximadamente 16 milhões de pessoas no

continente americano, restrito à América do Sul, América Central e México (WHO, 2009).

Na doença de Chagas, a infecção pelo parasita é a maior causa de

miocardite aguda e crônica e cardiomiopatia nas áreas endêmicas na América Latina. A

patogênese do dano cardíaco associada com esta infecção é multifatorial. A manifestação

clínica da infecção por T. cruzi pode resultar em isquemia, resposta autoimune e invasão

direta do parasita nas células do miocárdio, os quais podem promover a inflamação do

miocárdio (Huang et al., 1999).

Huang et al., (1999) demonstraram que nas células endoteliais a infecção

por T. cruzi é associada com a ativação de NF-kB (desempenha um papel fundamental na

regulação da resposta imune a infecção) e expressão das moléculas de adesão

(selectina-E) nas células endoteliais. Esses achados sugerem um possível mecanismo de

recrutamento de leucócitos circulantes, que é um fator crítico para o início de uma

resposta inflamatória, como resultado da infecção por T. cruzi (Tanowitiz et al., 1996). A

origem de uma resposta inflamatória aguda é importante no controle inicial da infecção

aguda, mas pode ser prejudicial se persistir por períodos prolongados e pode contribuir

para a lesão do miocárdio.

Garcia et al. (2005) avaliaram o efeito do tratamento de camundongos com

cardiomiopatia chagásica. Eles constataram que os corações dos animais submetidos ao

tratamento com benzonidazol tiveram queda no parasitismo e na miocardite quando

comparado com os corações dos animais não tratados. Apesar do grupo de animais

infectados, submetidos ou não ao tratamento, apresentarem alterações significativas em

seus eletrocardiogramas em comparação com os animais não infectados, os animais não

tratados tiveram maiores alterações em relação aos tratados. Além disso, foi observada

correlação entre a queda na inflamação e o parasitismo do tecido cardíaco nos animais

submetidos ao tratamento, reforçando a importância do parasita no desenvolvimento da

cardiomiopatia chagásica. Neste contexto, é importante ressaltar, que os eventos

imunológicos desencadeados pela presença do parasita são múltiplos e incluem diversos

processos efetores e reguladores que resultam em um balanço entre resistência

e patogênese.

Estudos anteriores demonstram que alguns derivados azólicos já disponíveis

comercialmente, como o itraconazol (Fig. 7), apesar de muito efetivo no tratamento das

infecções fúngicas, não são suficientemente eficazes na erradicação do parasito causador

da doença de Chagas (T. cruzi) em modelo murino e humano (McCabe et al., 1986;


45

Moreira et al., 1992). Entretanto, segundo Apt et al. (1998; 2003), o itraconazol

administrado a 6mg/Kg/dia durante 120 dias a pacientes chagásicos crônicos foi capaz de

reduzir significativamente o número de testes xenodiagnósticos positivos, além de regredir

em 50% dos casos ou prevenir em 97,8% dos casos anormalidades eletrocardiográficas.

Apesar de todos os pacientes tratados apresentarem testes sorológicos positivos, após 9

anos de acompanhamento, os resultados sugerem uma expressiva redução na carga

parasitária desses pacientes, o que corrobora a hipótese de necessidade de tratamento

de pacientes na fase crônica da doença (Tarleton, 2001), sendo o itraconazol uma das

alternativas.

Figura 8: Estrutura química do itraconazol.

O itraconazol (ITZ) é um derivado triazólico fracamente básico (pKa=3,7) e

altamente hidrofóbico, com um coeficiente de partição octanol/água de logP=5,66 em

pH=8,1 (Chasteigner et al., 1996a, 1996b). É pouco solúvel em água (0,001 mg/mL em

pH=7,1) e por isso pode ser administrado somente por via oral. Consequentemente, tem-

se relatado uma alta variação interindividual e intraindividual de sua biodisponibilidade

oral, influenciada principalmente pela acidez gástrica e o estado prandial do paciente

(Heykants et al., 1989) compromentendo o tratamento, o qual já é longo e de difícil

adesão pelo paciente. Assim sendo, o desenvolvimento de uma forma farmacêutica

nanoencapsulada e injetável para o tratamento da doença de Chagas, além de inédita,

pode ser extremamente útil para superar as desvantagem do tratamento convencional e

alcançar a dose terapêutica necessária de forma mais eficiente. Além disso, o

direcionamento ativo do fármaco nanoencapsulado através o uso de ligantes sintéticos

para selectinas nas regiões inflamadas do endotélio cardiovascular pode auxiliar no

tratamento da doença em sua fase crônica.


46

2.3.3 Inflamação associada à patogênese da aterosclerose

As doenças cardiovasculares também estão associadas a uma desordem

inflamatória crônica, onde a aterosclerose é a etiologia primária. Esta, por sua vez, é

caracterizada pelo acúmulo de monócitos/macrófagos, células musculares lisas e

linfócitos dentro da parede arterial em resposta à liberação de moléculas pró-inflamatórias

(Milioti et al., 2008). Esse acúmulo resulta na formação de placa aterosclerótica, a qual

está associada à disfunção endotelial, ativação de moléculas de adesão e propriedades

anticoagulantes prejudicadas. Suas complicações surgem da oclusão trombótica das

artérias, consecutiva à ruptura da placa aterosclerótica, e suas manifestações estão

diretamente relacionadas às síndromes coronarianas agudas, infarto do miocárdio e

derrame (Costopoulos et al., 2008).

Entretanto, uma vez que a doença aterosclerótica oclusiva desenvolve-se, o

tratamento padrão inclui angioplastia, enxerto de derivação (by-pass) na artéria coronária,

ou transplante cardíaco. Todas essas abordagens são limitadas pela quantidade de falhas

e re-oclusão do lúmen arterial (Gizard & Bruemmer, 2008), ocasionado principalmente

pela proliferação de células musculares lisas (Dzau et al., 2002), além de serem

tratamentos bem agressivos, necessitarem de internação ambulatorial do paciente e

apresentarem risco cirúrgico. Portanto, a terapia ideal para doença vascular oclusiva

ainda está para ser estabelecida.

As tiazolidina-2,4-dionas (TZD) são uma classe de fármacos com

reconhecida capacidade em melhorar a sensibilidade à insulina, e têm sido utilizadas

sozinhas ou em combinação com outros fármacos hipoglicêmicos para o tratamento do

diabetes mellitus tipo 2 (Patel et al., 2006). Novos dados surgem a cada dia sugerindo

uma boa eficácia das TZD em diversos fatores de risco associados a doenças

cardiovasculares. Um exemplo está em sua importante função na adipogênese,

modulando a diferenciação dos adipócitos, aumentando a sensibilidade desses à insulina,

e induzindo a transferência de gordura de depósitos viscerais para subcutâneos, um

padrão associado a um menor risco cardiovascular (Adams et al., 1997). Rosiglitazona e

pioglitazona (Fig. 8), TZD livremente comercializadas, interferem com o metabolismo dos

lipídeos aumentando as concentrações de lipoproteínas de alta densidade (HDL) e

lipoproteínas de baixa densidade (LDL), e reduzindo a proporção LDL/HDL, podendo

assim interferir na formação da placa aterosclerótica (Goldberg et al., 2005).


47

Figura 9: Estrutura química do fármaco Rosiglitazona e Pioglitazona. Em vermelho a tiazolidina-2,4-dionas, estrutura comum em todas as TZD.

TZD também apresentam efeitos vasculares, como melhorar a vasodilatação

dependente de endotélio, por aumentar a liberação de óxido nítrico endotelial

(Scherrer & Sartori, 1997), e diminuir a circulação de marcadores inflamatórios como

TNFα, proteína C reativa, proteína de quimioatração de monócitos (MCP-1), matrix

metaloprotease (MMP-9), e contagem de células brancas do sangue

(Mohanty et al., 2004). Elas ainda inibem a expressão de moléculas de adesão, (MAC)

nas células endoteliais (Mehta et al., 2006), e são potentes inibidores de migração e

proliferação celular, importantes contribuintes da aterosclerose (Atkins et al., 2005).

Em 1997, o FDA aprovou a troglitazona (Rezulin®), a primeira

tiazolidinadiona avaliada na fase clínica nos Estados Unidos e Japão. Sérios efeitos

colaterais ocorreram com troglitazona, como necrose hepática maciça seguida de morte.

Sua interdição em alguns países motivou os pesquisadores a desenvolver novas

glitazonas. Assim, em 1999, o FDA aprovou dois novos fármacos da classe das TZD: o

maleato de rosiglitazona (Avandia®) e o hidrocloreto de pioglitazona (Actos®) (Fig. 8).

Apesar das TZD representarem uma inovação dentro do tratamento do diabetes mellitus

tipo 2, a retenção de fluidos, apresentada como rápido ganho de peso corporal e a

formação de edemas tem sido considerado o efeito colateral mais comum da rosiglitazona

(Zhang et al., 2005).

Várias TZD têm sido sintetizadas e muitas outras se encontram em estágios

pré-clínicos e clínicos de desenvolvimento. Todas elas compartilham uma estrutura

tiazolidina-2,4-diona substituída, na qual se têm realizado modificações químicas

seletivas, na tentativa de melhorar a eficácia farmacológica e minimizar os efeitos

colaterais desses agentes. Trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Planejamento e


48

Síntese de Fármacos (LPSF), filiado ao Grupo de Pesquisa em Inovação Terapêutica

(GPIT) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) (http://www.ufpe.br/gpit) têm

explorado como “esqueleto” o anel tiazolidínico como novas entidades químicas com

potencial atividade biológica. Para avaliar a afinidade das TZD por reagentes orgânicos e

biomacromoléculas foram feitas modificações em sua estrutura química visando

derivatizações comportando diversos substituintes, de modo a obter espaçamento entre

os grupos funcionais para facilitar interações intermoleculares com sistemas biológicos.

Para tanto, o LPSF desenvolve vias de obtenção de novas TZD bioativas, o que culminou

com a construção de uma importante coleção de moléculas bioativas, incluindo a TDZ

utilizada neste trabalho (Fig. 9), denominada Lyso-7.

Figura 10: Estrutura química da Lyso-7.

Portanto, TZD são seguras e efetivas no tratamento de hiperglicemia

associada a diabetes mellitus tipo 2, como monoterapia ou em combinação com terapias

já existentes. Os aparentes efeitos cardiovasculares pleiotrópicos destes fármacos têm

promovido otimismo com respeito ao seu uso no tratamento de doenças cardiovasculares

entre populações de alto risco.

Em virtude dos fatos abordados e os promissores resultados até então

obtidos com o direcionamento ativo de fármacos para regiões que apresentam processos

inflamatórios, este estudo tem como objetivo desenvolver e avaliar os parâmetros físico-

químicos de nanopartículas poliméricas utilizando copolímeros derivados do PLA

funcionalizados com ligante de selectina-E ou grupos hidroxila e benzila, contendo os

fármacos itraconazol e uma nova tiazolidona denominada Lyso-7.

NH

S

N

O

O

Cl

Br

GARCIA, GM OBJETIVO GERAL

OBJETIVO GERAL

Desenvolver e caracterizar físico-químicamente NS poliméricas produzidas a partir do

PLA ligado linear e covalentemente PEG formando copolímeeros do tipo dibloco (PLA-

PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), ambos apresentando ou não funcionalização ao longo

da cadeia (hidroxila, benzila ou selectina-E). Objetiva-se também avaliar a influência das

propriedades de superfície desses polímeros nas características físico-químicas das NS,

além da capacidade das mesmas em modificar o perfil de liberação. Para tal, serão

testadas a encapsulação de dois fármacos: o itraconazol, com promissores resultados

para o tratamento da doença de Chagas e uma nova substância da classe das

tiazolidonas (TZD), denomina Lyso-7.

GARCIA, GM OBJETIVO GERAL

CAPÍTULO I Validação de metodologia analítica para doseamento do itraconazol

GARCIA, GM CAPÍTULO I

51

1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Desenvolver uma metodologia analítica para o doseamento do itraconazol por

cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos diiodos (CLAE-DAD) e

com detector de fluorescência (CLAE-FLU);

• Validar a metodologia analítica para o doseamento do itraconazol livre e associado

a nanoesferas por CLAE-DAD e para avaliação de sua cinética de liberação in vitro por

CLAE-FLU;


52

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Materiais

Para o desenvolvimento e validação das metodologias foram utilizados:

Itraconazol [(±)-2-sec-butil-4-[4-(4-{4-[(2R*,4S*)-2-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il-

metil)-1,3-dioxolan-4-ilmetoxi]fenil}-piperazin-1-il)fenil-2,4-dihidro-1,2,4-triazol-3-ona] PM

705,64 g/mol (Sigma, Alemanha); acetonitrila e metanol grau CLAE (Tedia, EUA). A água

ultrapura (Milli-Q) foi purificada no sistema Direct-Q, da Millipore®.

2.2 Equipamentos

O sistema cromatográfico utilizado consistiu de uma bomba de módulo de

separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna,

detector de arranjo de diodos (DAD) Waters 2996 e detector de fluorescência (FLU)

Waters 2475. A separação foi realizada em uma coluna C18 Macherey-Nagel com

partícula de 4 µm, 150 mm x 4,6 mm, protegido por uma pré-coluna de segurança

Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 mm).

2.3 Validação de metodologia analítica para quantificação do itraconazol nas

nanoesferas poliméricas por CLAE-DAD e para avaliação da cinética de liberação in

vitro por CLAE-FLU

2.3.1 Condições cromatográficas

As condições cromatográficas foram as mesmas para os dois tipos de

detecção (DAD e FLU), sendo a fase móvel composta da mistura dos solventes metanol e

água (75:25 v/v), e utilizando acetonitrila para solubilizar as amostras. As soluções das


53

amostras e de estoque foram preparadas no momento da sua utilização. O volume de

injeção foi de 50 µL e 25 µL para detecção no DAD e FLU, respectivamente. As condições

de operação foram adaptadas de Redmann & Charles (2006), com vazão de 1 mL min-1,

tempo de corrida de 13 min, temperatura de 40ºC e detecção no DAD em 260 nm e na

FLU a 320 nm de excitação e 380 nm de emissão.

2.3.2 Parâmetros de validação

Para a validação dos métodos foram determinadas a especificidade na

presença dos constituintes das nanoesferas, a linearidade, a precisão (inter e intradia), a

exatidão, o limite de detecção e o limite de quantificação, segundo os critérios de

aceitação estabelecidos pelo Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH

Harmonised Tripartite guideline, 2005). A curva de calibração do ITZ (curva padrão) foi

realizada contendo oito pontos de concentrações conhecidas do fármaco: 0,5; 1,0; 2,5;

5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100 µg/mL para detecção por DAD, e 0,075; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75,

1,0; 5,0; 10,0 µg/mL para detecção por FLU. A partir da curva de calibração foi possível

determinar a concentração de ITZ em uma amostra com concentração desconhecida.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Especificidade

A especificidade é definida como a capacidade do método em distinguir a

substância analisada de outras presentes na amostra (Causon, 1997). A interferência dos

componentes presentes nas nanopartículas (polímeros) na leitura das absorbâncias do

ITZ foi avaliada quando amostras de NS brancas (sem o fármaco) a 5% foram

solubilizadas em acetonitrila. A figura 10 demonstra, através do cromatograma, que no

comprimento de onda de 260 nm a absorbância do fármaco não sofre interferência dos

outros constituintes das NS no tempo de retenção do fármaco, aproximadamente 9

minutos. Portanto o método foi utilizado para o doseamento do ITZ na presença e na


54

ausência dos outros constituintes das NS, sem que o resultado sofresse interferências. A

acetonitrila é capaz de dissolver os diversos polímeros, o que elimina a turbidez das

amostras. A

U

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

Minutes

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00

Figura 11:Cromatograma dos polímeros das diferentes NS: preto (tribloco-OH); vermelho (dibloco-OBZ); verde (dibloco); azul (tribloco); laranja (dibloco-OH); marrom (tribloco-OBz); cinza ITZ 10 µg/mL.

3.2 Linearidade

A curva padrão do ITZ com detecção no DAD, construída a partir das médias

da área sob a curva dos picos referentes ao ITZ nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0;

10,0; 25,0; 50,0 e 100 µg/mL, a equação da reta e o coeficiente de correlação linear (R2)

estão representados na figura 11.

Figura 12: Curva de calibração do ITZ com detecção DAD no comprimento de onda de 260 nm; R2 = coeficiente de correlação linear.


55

A equação da reta foi y = 19484x + 10673, onde o valor associado à variável x

corresponde à inclinação da reta (a = 19484) e 10673 ao intercepto da reta (b) com o eixo

das ordenadas. De acordo com o Guia da Conferência Internacional de Harmonização

(ICH Harmonised Tripartite guideline, 2005), os resultados de linearidade se encontraram

dentro do critério de aceitação, ou seja, o valor do coeficiente de variação (CV) foi abaixo

de 5%. A figura 12 demonstra o cromatograma do ITZ nas concentrações de 0,5 a

10,0 µg/mL com detecção DAD e a figura 14 o cromatograma do ITZ a 0,1 µg/mL na FLU.

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

0,090

0,100

Minutes

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00

Figura 13: Cromatograma do itraconazol nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 e 10 µg/mL com detecção DAD.

Devido à maior sensibilidade do detector de fluorescência, a curva padrão do

ITZ foi construída com pontos de menor concentração, sendo obtida a partir das médias

da área sob a curva dos picos nas concentrações de 0,075; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 5,0;

10,0 µg/mL. A curva de calibração do ITZ com detecção FLU está representada na figura

13 e os parâmetros da mesma estão na tabela 2.

Tabela 2: Parâmetros relativos à curva de calibração média do método analítico para quantificação de ITZ com detecção FLU

Parâmetro Valor

Coeficiente angular (a) 3406968

Coeficiente linear (b) 1404110

Coeficiente de correlação (r) 1


56

Figura 14: Curva de calibração do ITZ com detecção FLU a 320 nm de excitação e 380 nm de emissão; R2 = coeficiente de correlação linear.

Figura 15: Cromatograma do itraconazol na concentração de 0,1 µg/mL com detecção FLU.

3.3 Precisão

A tabela 3 mostra os valores de área dos picos correspondentes aos

padrões de controle de concentrações 2,5; 10,0 e 50,0 µg/mL, obtidas em triplicata e em

um mesmo dia, e o CV de cada delas por detecção no DAD.

Tabela 3: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por CLAE-DAD a 260 nm

Concentração

nominal de

ITZa (µg/mL)

CVb Intra-

dia

Concentração

real intra-dia

Desvio

padão

intra dia

CVb

Inter-dia

Concentração

real inter-dia

Desvio

padrão

inter-dia

2,5 2,03 2,56 0,06 3,05 2,52 0,06

10,0 2,70 10,03 0,28 1,02 10,18 0,10

50,0 1,15 49,12 0,57 2,80 49,24 1,36 an = 3;

bCV = coeficiente de variação, dado por: (DP/área média) x 100.


57

O método apresentou CV intradia na faixa de 1,15 a 2,7% para as

concentrações controle analisadas, e CV interdia entre 1,02 e 3,05%, sendo que valores

abaixo de 3% estão de acordo com o critério de aceitação estabelecido para a precisão

no Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH Harmonised Tripartite

guideline, 2005).

Os dados de precisão intra e interdia para a validação do ITZ por CLAE-FLU

estão apresentados na tabela 4. O coeficiente de variação para as análises intra e interdia

também se mantiveram com valores inferiores a 3% mostrando assim uma boa precisão

do método.

Tabela 4: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por CLAE-FLU com 320 nm de excitação e 380 nm de emissão

Concentração

de ITZa

(µg/mL)

CVb Intra-

dia

Concentração

real intra-dia

Desvio

padrão

intra-dia

CVb

Inter-dia

Concentração

real inter-dia

Desvio

padrão

inter-dia

0,25 0,25 0,25 0,002 0,14 0,29 0,001

0,75 0,49 0,75 0,005 0,24 0,76 0,001

5,0 1,45 4,96 0,078 1,02 4,75 0,045 an = 3;

2CV = coeficiente de variação, dado por: (DP/área média) x 100.

3.4 Exatidão

A exatidão foi avaliada comparando-se os valores de concentração obtidos

em triplicata a partir das áreas correspondentes aos picos de ITZ com detecção DAD nas

concentrações de 2,5; 10,0 e 50,0 µg/mL com seus valores teóricos, conforme mostra a

tabela 5.

Os resultados mostraram que os valores obtidos para exatidão variaram de

98,23% a 102,34% para as concentrações de 50,0 e 2,5 µg/mL, respectivamente. Esses

dados mostram que os valores encontrados nos experimentos diferiram cerca de 2,34%

dos valores teóricos, indicando uma boa exatidão para o doseamento por CLAE-DAD do

ITZ.


58

Tabela 5: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção DAD

ITZ (µg/mL) Área Médiaa ± DP1 Concentração

experimental (µg/mL) Exatidão (%)

2,5 34098 ± 1110 2,56 102,34

10,0 177791 ± 1913 10,03 100,31

50,0 911461 ± 25735 49,12 98,23 an = 3;

1DP = desvio padrão.

Também para as análises de exatidão utilizando o detector FLU o método

apresentou-se dentro dos parâmetros estabelecidos pelo guia (Tabela 6).

Tabela 6: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção FLU

Concentração

de ITZa (µg/mL) Área Médiaa ± DPb

Concentração


0,25 3465994 ± 1042369 0,25 101,42

0,75 5054309 ± 949108 0,75 99,85

5 18556826 ± 637951 4,96 99,23 an = 3;


3.5 Limite de detecção e limite de quantificação

O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as

condições experimentais estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da

análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor

nível detectável (Tabela 7).

Tabela 7: Limites de detecção e quantificação do ITZ com detecção DAD e FLU

Detector Limite de detecção

(ng/mL)

Limite de quantificação

(ng/mL)

DAD 10 500

FLU 1 75


59

Já o limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma

amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições

experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise

de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível

determinável com precisão e exatidão aceitáveis (Tabela 7).

4 CONCLUSÕES

Os métodos de doseamento, utilizando o detector de arranjos diiodos e

fluorescência apresentaram linearidade na faixa de 0,5 a 100 µg/mL e 0,075 a 10 µg/mL,

respectivamente, e foram precisos e exatos. Os CV intra e interdias da calibração dos

métodos foram baixos e dentro dos limites máximos estabelecidos. Como esperado, a

utilização do detector de fluorescência aumentou a sensibilidade do método,

proporcionando a quantificação precisa e exata de amostras com baixa concentração do

fármaco, necessário para o estudo do perfil de liberação in vitro do mesmo a partir das

NP. Os métodos foram, portanto, considerados validados para quantificação do fármaco

nas amostras a serem analisadas e foram utilizados nos estudos subsequentes.

CAPÍTULO II Preparo de formulações e caracterização das nanopartículas contendo o itraconazol

GARCIA, GM CAPÍTULO II

61

1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Preparar suspensões coloidais de nanoesferas contendo itraconazol a partir dos

polímeros do ácido polilático (PLA), dos copolímeros do ácido polilático-co-

polietilenoglicol (PLA-PEG, dibloco) e do ácido polilático-co-polietilenoglicol-co-

ácido polilático (PLA-PEG-PLA, tribloco). Também foram utilizados oligopoliméros

dos polímeros dibloco e tribloco modificados por funcionalização (grupamentos

hidroxila (-OH) ou benzila (-OBz) desses polímeros ao longo da cadeia polimérica

do PLA e com acoplamento covalente de um ligante de selectina-E.

• Caracterizar as nanoesferas preparadas à partir desses polímeros quanto ao

tamanho médio, índice de polidispersão da população das partículas e

determinação do potencial zeta;

• Avaliar a morfologia e as características da superfície das nanoesferas preparadas

com os diferentes polímeros por microscopia de força atômica;

• Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de ITZ encapsulado nas nanoesferas;

• Avaliar o perfil de liberação in vitro do itraconazol a partir das nanoesferas em

condições sink.

62


2.1 Materiais

Para a preparação das NS foram utilizados os copolímeros do ácido

polilático (PLA) ligados covalentemente ao poli(etileno)glicol (PEG; PM 2000 g/mol) do

tipo dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA) com grupos hidroxila (-OH) ou benzila

(-OBz) ligados ao longo do bloco de PLA, por inserção randômica de grupamentos

alilglicidil éter (oligômeros). Estes polímeros foram sintetizados e caracterizados na

Universidade de Montreal (Canadá) pelos professores Patrice Hildgen e Vanessa

Mosqueira como previamente descrito por Mosqueira et al., 2009a;

Mosqueira et al., 2009b). Os solventes utilizados, como acetona PA, foram adquiridos da

Vetec, Brasil. O Itraconazol [(±)-2-sec-butil-4-[4-(4-{4-[(2R*,4S*)-2-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-

1,2,4-triazol-1-il-metil)-1,3-dioxolan-4-ilmetoxi]fenil}-piperazin-1-il)fenil-2,4-dihidro-1,2,4-

triazol-3-ona] PM 705,63 g/mol, foi adquirido da Sigma-Aldrich (EUA). A água ultra pura

(MilliQ) foi purificada no sistema Direct-Q, da Millipore®.

2.2 Preparação das nanoesferas

As nanoesferas de PLA (convencionais) foram preparadas pelo processo de

deposição interfacial de um polímero pré-formado, descrito por Fessi et al., 1989. As

nanoesferas furtivas (NS contendo PEG) foram preparadas pelo método descrito por

Mosqueira et al., 2001. O processo consiste da mistura de uma fase orgânica miscível em

água em uma solução aquosa contendo ou não um surfactante hidrofílico (Fig. 15).

Uma solução contendo 2% (p/v) de polímero e diferentes concentrações de

ITZ (0,5 e 1 mg) foram dissolvidos em 4 mL de acetona com o auxílio de um agitador

magnético, sem aquecimento. A solução obtida foi transferida para a fase aquosa (8 mL),

sem a presença de tensoativo. A mistura foi então mantida sob agitação durante 10

minutos com auxílio de um agitador magnético (modelo PC-200, Corning, EUA), a

500 rpm. Posteriormente, o excesso de solvente foi evaporado a pressão reduzida em

rotavapor (Laborota 4000/4001 Heidolph Instruments, Alemanha) a uma temperatura de

45˚C até o volume final de 2 mL. Para o preparo das formulações contendo o ligante de

GARCIA, GM CAPÍTULO III

63

selectina foi adicionada a fase orgânica 0,02% (p/v) do polímero funcionalizado e 1,8%

(p/v) do polímero sem funcionalização. Com isso, o polímero contendo ligante de selectina

correspondeu a 10% da quantidade total de polímero na formulação.

Figura 16: Etapas da Preparação de Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O solvente e o excesso de água são evaporados.

A influência da presença do diferentes grupos ligados ao longo da cadeia

dos copolímeros, na eficiência de encapsulação, no índice de polidispersão, no potencial

zeta e no perfil de liberação in vitro do ITZ foi avaliada para as suspensões coloidais.

2.3 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas

2.3.1 Distribuição de Tamanho

O tamanho médio das NS e o índice de polidispersão das suspensões de

nanopartículas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons (PCS),

utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As

medidas de tamanho foram realizadas em quadruplicata em alíquotas da mesma amostra

e os resultados obtidos foram expressos como média + desvio padrão. O índice de

polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no tamanho das


64

nanopartículas presentes na amostra, sendo que as amostras que apresentaram índice

de polidispersão inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas, segundo instruções do

fabricante do equipamento (Beckmann Coulter).

O diâmetro médio efetivo das partículas e sua dispersão foram

determinados através da técnica de espalhamento dinâmico de luz, a um ângulo de

detecção da luz espalhada fixo em 90°, na temperatura de 20°C em meio aquoso.

2.3.2 Potencial Zeta (ζ)

O potencial zeta foi determinado pela técnica de microeletroforese associada

à anemometria de laser dopler (ALD) utilizando-se um equipamento Zetasizer 3000 HS

(Malvern Instruments, UK). As amostras foram analisadas diluindo-se 20 µL da suspensão

de nanopartículas em 4980µL de NaCl 1 mM, obtendo-se, assim, suspensões coloidais

com forças iônicas semelhantes (1,2 ± 0,2 mS/cm2). As medidas de potencial zeta foram

realizadas em triplicata em alíquotas da mesma amostra e os resultados obtidos foram

expressos como média + desvio padrão.

2.3.3 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação

As análises foram feitas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) no aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de arranjo de diodos

(DAD) Waters 2996, por um método de doseamento previamente validado, descrito no

capítulo 1. A porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor de fármaco

incorporado à nanopartícula em relação ao total de fármaco adicionado no preparo da

formulação. A porcentagem é calculada pela diferença entre a quantidade total de ITZ na

suspensão coloidal e a quantidade de ITZ livre solúvel na fase aquosa externa, dividida

pela quantidade total de ITZ na suspensão após a filtração x 100. A porcentagem de

encapsulação foi calculada, portanto, pela seguinte equação:

% encapsulação = (ITZ total na suspensão (mL) - ITZ no ultrafiltrado (mL) x 100 ITZ total na suspensão (mL)

O fármaco total foi determinado pela completa dissolução de 80 µL da

suspensão de NP em acetonitrila. O ITZ livre solúvel na fase externa aquosa foi obtido

pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 200 µL da suspensão de NP a 500 × g por


65

30 minutos em unidades AMICON (membranas MICROCON de 100 kDa, Millipore®)

(Fig. 17). A quantidade de ITZ ligado à membrana foi determinada após a

ultrafiltração/centrifugação. Para tal, a membrana do AMICON foi retirada, lavada com

água MilliQ, imersa em 500 µL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao vórtex por 15

minutos, centrifugada e o ITZ dosado no sobrenadante. A eficiência de encapsulação das

NP foi calculada pela quantidade de ITZ encapsulado em 80 µL de suspensão de NP

dividido pela quantidade de ITZ pesado e adicionado ao preparo da suspensão de NP x

100. A eficiência de encapsulação foi calculada, portanto, pela seguinte fórmula:

Eficiência de Encapsulação % = _Quantidade total de ITZ encapsulado (mL) x 100 Quantidade de ITZ pesado colocado na NP (mL)

Figura 17: Representação esquemática das dosagens de ITZ realizadas nas formulações de NS para determinação da porcentagem de encapsulação e eficiência de encapsulação.

2.3.4 Análise Morfológica das Nanopartículas

A análise morfológica é obtida por microscopia de força atômica (MFA). As

imagens de MFA foram coletas nos equipamentos Multimode e Dimension 3000, ambos

monitorados por controlador Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa Bárbara, EUA), no

Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC, MG). As imagens foram obtidas no modo

de contato intermitente (tapping mode) utilizando sondas de silício de comprimento de

228 µm, com uma freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m

e raio de curvatura de 5 nm a 10 nm.

Para obtenção das imagens das NPs, aproximadamente 5 µL das amostras

foram depositados em superfícies atomicamente planas de mica clivadas no momento do


66

uso. As amostras foram desidratadas e espalhadas com um jato de argônio unidirecional.

A varredura foi efetuada em uma velocidade de 1Hz com resolução de 512 x 512 pixels. A

análise das amostras foi realizada utilizando o programa de análise do sistema (Section

Analysis).

2.3.5 Avaliação da solubilidade do itraconazol em PBS

A solubilidade do ITZ em meio tampão fosfato (PBS) foi determinada num

período de 24 horas. Para isso, 2 mg de ITZ foram precisamente pesados e

acrescentados a tubos eppendorfs. A esses tubos foram adicionados 2 mL de PBS e o

sistema foi mantido em agitação a 37°C. Em tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min,

3, 6, 12 e 24 horas) coletou-se 100 µL do meio, ultracentrifugou-se a 8.000 rpm por 5

minutos, retirou-se 50 µL do sobrenadante e diluiu-se com 250 µL de metanol. Essa

solução foi agitada em vórtex por 10 minutos e novamente ultracentrifugada a 8.000 rpm.

O sobrenadante foi quantificado por CLAE. Esse experimento foi realizado em três

réplicas (n = 3) e os resultados foram expressos como média e desvio padrão.

2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro

As formulações preparadas usando os diferentes polímeros foram avaliadas

quanto à liberação in vitro de ITZ em triplicata em tampão fosfato salina (PBS pH 7,4).

Para o doseamento o ITZ liberado utilizou-se a técnica de diálise reversa. Para tal, sacos

de diálise contendo 1 mL de PBS foram completamente imersos em 500 mL de PBS e

deixados em equilíbrio por 3 horas sob agitação a 37ºC. Em seguida, adicionou-se a

formulação ao meio externo. Nos tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min, 3, 6, 12 e 24

horas) retirou-se um saco de diálise do meio e alíquotas de 500 µL foram coletadas,

solubilizadas em 500 µL de acetonitrila e o ITZ liberado foi quantificado em CLAE com

detector de fluorescência. A solubilidade do ITZ em PBS foi determinada previamente e a

quantidade de formulação adicionada respeitou a condição sink ( < 20% da concentração

de saturação no meio).


67

Os dados obtidos dos perfis de dissolução foram submetidos a tratamentos

matemáticos para a determinação de cinética de liberação/dissolução e para isso foram

aplicados três modelos matemáticos:

• Cinética de ordem zero: para cada formulação foram construídos gráficos de tempo

versus quantidade total menos a quantidade liberada/dissolvida do fármaco, ou

seja, quantidade não liberada de fármaco (t x QNL).

• Cinética de primeira ordem: para cada formulação foram construídos gráficos de

tempo versus ln da porcentagem não liberada (t x ln %NL).

• Modelo de Higuchi: para cada formulação foram construídos gráficos da raiz

quadrada do tempo versus porcentagem liberada (√t x %D)

Foi também aplicado o modelo de cinética desenvolvido por Korsemeyer et

al. (1983), que permite calcular o exponencial de liberação do fármaco. Este prevê uma

avaliação mais detalhada sobre o mecanismo de transporte do fármaco. O expoente de

liberação (n) foi calculado a partir da construção de gráficos de log do tempo pelo log da

porcentagem de fármaco não liberada (log t x log %NL).

2.4 Análise Estatística dos Dados

O diâmetro médio e o potencial zeta das NS vazias e contendo o fármaco

foram comparados por análise da variância (ANOVA) utilizando o programa Prisma®

versão 5.0. Adotou-se intervalo de confiança de 95%, sendo os valores de p<0,05 aceitos

como estatisticamente significativos.

CAPÍTULO III Desenvolvimento e validação de metodologia analítica e bioanalítica para doseamento da Lyso-7


98

1 OBJETIVOS

• Desenvolver e validar uma metodologia analítica para o doseamento da Lyso-7 livre e

associada a nanopartículas por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de

arranjos diiodos (CLAE-DAD);

• Desenvolver e validar uma metodologia bioanalítica para extração e quantificação da

Lyso-7 em plasma de camundongo por cromatografia líquida de alta eficiência com

detector de arranjos diiodos (CLAE-DAD);


99


2.1 Materiais

Para o desenvolvimento e validação das metodologias foram utilizados:

Lyso-7 [(5Z)-5-[(5-bromo-1H-indol-3-il)metileno]-3-(4-clorobenzil)-tiazolidina-2,4-diona] PM

447,73 g/mol, sintetizada, purificada e gentilmente cedidas pelo professor Dr. Ivan da

Rocha Pitta (UFPE); benzonidazol (BZ) (N-benzil-2-nitroimidazolacetamida) (Sigma

Aldrich), acetonitrila, metanol e acetato de etila grau CLAE (Tedia, EUA).

Dimetilacetamida (DMA), PEG 300, TWEEN 80 e Dimetilsulfóxido foram fornecidos pela

Vetec. A água ultrapura (MilliQ) foi purificada no sistema Direct-Q, da Millipore®.

2.2 Validação analítica por CLAE-DAD

2.2.1 Padrões de calibração

Foi preparada uma solução estoque de 1 mg/mL de Lyso-7 em metanol e

acetato de etila (80:20 v/v). A curva de calibração da Lyso-7 (curva padrão) foi realizada

através de diluições da solução estoque, contendo oito pontos de concentrações

conhecidas do fármaco: 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100 µg/mL. A partir da curva

de calibração foi possível determinar a concentração de Lyso-7 em uma amostra com

concentração desconhecida.


O sistema cromatográfico utilizado consistiu de uma bomba de módulo de

separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna e

detector de arranjo de diodos Waters 2996. A separação foi realizada em uma coluna C18


100

Macherey-Nagel, 150 mm x 4,6 mm com tamanho de partícula de 4 µm, protegido por

uma pré-coluna de segurança Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 µm).

A fase móvel utilizada foi composta da mistura dos solventes metanol e água

(90:10 v/v). As condições de operação foram vazão de 1 mL min-1, volume de injeção de

50 µl, temperatura de 35ºC e detecção no DAD em 385 nm.

Para a validação do método foram determinadas a especificidade, na

presença dos constituintes das nanocápsulas, a linearidade, a precisão (inter e intradia), a

exatidão, o limite de detecção e o limite de quantificação, segundos os critérios de

aceitação estabelecidos pelo Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH

Harmonised Tripartite guideline, 2005).

2.3 Validação Bioanalítica em plasma por CLAE-DAD

2.3.1 Padrões de calibração

Foi preparada uma solução estoque de 1 mg/mL de Lyso-7 em acetato de

etila, e o fármaco benznidazol® foi utilizado como padrão interno (PI). A curva de

calibração da Lyso-7 (curva padrão) foi construída utilizando soluções de trabalho nas

concentrações de 0,1; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 µg/mL. Estas soluções de

trabalho foram preparadas por diluição seriada à partir da solução estoque e todas as

soluções foram armazenadas a -80ºC.


O sistema cromatográfico utilizado foi o mesmo mencionado na validação

analítica. A fase móvel foi composta da mistura dos solventes metanol e água (90:10, v/v).

As condições de operação foram vazão de 1 mL min-1, volume de injeção de 25 µl, tempo

de corrida de 7 min, temperatura do forno de coluna de 35ºC e detecção no DAD no

comprimento de onda de 385 nm.


101

2.3.3 Animais

Os experimentos in vivo foram aprovados pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (protocolo nº 2009/29).

Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas pesando de 29,5 g a 30,5 g com comida e

água ad libitum.

2.3.4 Preparo das amostras de plasma padrão para a curva de calibração

Foi utilizado plasma de animais sadios para validação do método. O sangue

de camundongos anestesiados foi coletado pelo plexo sinu-orbital em tubos eppendorf

contendo heparina e o plasma foi imediatamente separado por centrifugação a 400 × g

por 10 minutos e estocado a -80ºC. As amostras de plasma padrão da curva de

calibração foram preparadas a cada dia de análise a partir de soluções-padrão de 0,5 a

100 µg/mL de Lyso-7 em acetato de etila, conforme descrito na Tabela 15. Em todas as

análises adicionou-se 10 µL de solução-padrão de benznidazol® na concentração de 500

µg/mL (padrão-interno), 10 µL das soluções de trabalho de Lyso-7 e 80 µL de plasma

branco. As amostras foram homogeneizadas em agitador de tubo tipo vórtex por 15

segundos, e submetidas ao procedimento de extração imediatamente após o preparo.


102

Tabela 8: Preparo da curva de calibração

Concentração da Solução de trabalho (µg/mL)

Volume de solução-padrão

(µL)

Volume de plasma (µL)

Concentração final presente na curva de calibração

(µg/mL) 1,0 10 80 0,1 2,5 10 80 0,25 5,0 10 80 0,5 10,0 10 80 1,0 25,0 10 80 2,5 50,0 10 80 5,0 75,0 10 80 7,5 100,0 10 80 10,0

Aos tubos foram adicionados 10 µl da solução estoque de PI.

2.3.5 Desenvolvimento do método de extração da Lyso-7

Para a extração da Lyso-7 em plasma de camundongo foram testados os

métodos de extração líquido-líquido e precipitação das proteínas do plasma. A extração

líquido-líquido foi realizada adicionando 300 µl de acetato de etila aos 80 µL de plasma

contendo 10 µL da solução de trabalho (100 µg/mL) de Lyso-7 e 10 µL de PI, e

homogeneizando-se em agitador vórtex em tempos variados (Tabela 16). Após

centrifugação a 900 × g por 10 minutos, o sobrenadante resultante foi filtrada em unidade

filtrante Millex com membrana Durapore® de 13 mm de diâmetro e poro de 0,45 µm. Este

procedimento foi repetido mais duas vezes. O solvente foi evaporado sob baixa pressão

em dessecador ao abrigo da luz. Ressuspendeu-se o resíduo em 100 µL de fase móvel

para injeção em CLAE. A extração por precipitação das proteínas do plasma foi realizada

adicionando acetonitrila ou metanol de acordo com a tabela 2, homogeneizando em

agitador vórtex por 2 min e centrifugando a 900 × g por 10 min. O solvente foi evaporado

sob baixa pressão em dessecador ao abrigo da luz e o resíduo foi ressuspendido em 100

µL de fase móvel para injeção em CLAE.


103

Tabela 9:Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo

Método de extração Solvente Volume (µL)

Agitação em vórtex (min)

Líquido-líquido Acetato de Etila 300 1



Precipitação de proteínas Acetonitrila 500 2

Precipitação de proteínas Acetonitrila 1000 2

Precipitação de proteínas Metanol 500 2

Precipitação de proteínas Metanol 1000 2

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 Validação analítica por CLAE-DAD

3.1.1 Especificidade

A interferência dos outros componentes do sistema nanoestruturado

(polímeros) na leitura das absorbâncias da Lyso-7 foi avaliada quando amostras de NC

brancas (sem o fármaco) a 5% foram solubilizadas em acetonitrila. A figura 41 demonstra,

através do cromatograma, que no comprimento de onda de 385 nm a absorbância do

fármaco não sofre interferência dos outros constituintes das NC nas concentrações de 5%

próxima do tempo de retenção da Lyso-7 (aproximadamente 4,8 minutos). Portanto o

método foi utilizado para o doseamento da Lyso-7 na presença e na ausência dos outros

constituintes das NC, sem que o resultado sofresse interferências. A acetonitrila é capaz

de dissolver os diversos polímeros, o que elimina a turbidez das amostras.


104

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Minutes

2,00 4,00 6,00

Figura 18: Cromatograma do polímero PLA (preto) e da Lyso-7.

3.1.2 Linearidade

A linearidade indica a faixa de concentração do fármaco em que as

respostas obtidas pela metodologia são diretamente proporcionais à quantidade de

fármaco presente na amostra (United States Pharmacopeia, 2007). A avaliação foi

realizada por meio da construção de três curvas de calibração com soluções Lyso-7 que

variaram de 0,5 µg/mL a 100 µg/mL.

A curva padrão da Lyso-7, construída a partir das médias da área sob a

curva dos picos referentes a Lyso-7 nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0;

50,0 e 100 µg/mL, a equação da reta e o coeficiente de correlação linear (R2) estão

representados na figura 42.

Figura 19: Curva de calibração da Lyso-7 no comprimento de onda de 385 nm; R2 = coeficiente de correlação linear.

O valor de R2 encontrado significa que 99,99% dos dados são explicados

pela curva. A curva de calibração apresentou valor do coeficiente de correlação

Lyso-7


105

R2 = 0,9997, demonstrando a existência de correlação linear entre as concentrações e a

área sob a curva, na faixa de 0,5 a 100 µg/mL. A equação da reta foi

y = 119817x + 8229,4, onde o valor associado à variável x corresponde à inclinação da

reta (a = 119817) e 8229,4 ao intercepto da reta (b) com o eixo das ordenadas. De acordo

com o Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH Harmonised Tripartite

Guideline, 2005), os resultados se mostraram lineares e dentro dos parâmetros de

aceitação, ou seja, o coeficiente de variação (CV) abaixo de 2%.

3.1.3 Precisão

A precisão de um método indica o grau de concordância entre resultados

individuais obtidos pela aplicação repetitiva do método à mesma amostra (United States

Pharmacopeia, 2007). A tabela 17 demonstra a avaliação deste parâmetro analisado em

três diferentes concentrações, baixa, média e alta (1,0; 10,0 e 75,0 µg/mL), em réplicas de

três, num mesmo dia (precisão intra-ensaio).

Tabela 10: Resultados do teste de precisão intra-dia para validação do doseamento por CLAE-DAD da Lyso-7 a 385 nm

Lyso-7 (µg/mL) Área Médiaa ± DP1 CV

1,0 258859 ± 3013 1,16

10,0 2073509 ± 41330 1,99

75,0 14926111 ± 64278 0,43 an = 3;

1DP = desvio padrão;

2CV = coeficiente de variação, dado por: (DP/absorbância média) x 100.

O método apresentou CV intradia na faixa de 0,43 a 1,99% para todas as

concentrações analisadas, sendo que valores abaixo de 2% estão de acordo com o

critério de aceitação estabelecido para a precisão no Guia da Conferência Internacional

de Harmonização. Esses valores demonstram a boa precisão do método quanto à

repetibilidade.

3.1.4 Exatidão


106

A exatidão foi avaliada comparando-se os valores de concentração obtidos

em triplicata a partir das áreas correspondentes aos picos de Lyso-7 nas concentrações

de 1,0; 10,0 e 75,0 µg/mL com seus valores teóricos, conforme mostra a tabela 18.

Os resultados mostraram que os valores obtidos para exatidão variaram de

um valor mínimo de 98,10% para a concentração de 75 µg/mL, até um valor máximo de

99,74%, para a concentração de 10 µg/mL, sendo o valor médio de 99,08 %. Esses dados

mostram que os valores encontrados nos experimentos diferiram menos de 2% dos

valores teóricos, indicando uma boa exatidão para o doseamento por CLAE-DAD da Lyso-

7.

Tabela 11: Exatidão do método de doseamento da Lyso-7

Lyso-7

(µg/mL) Área Médiaa ± DP1

Concentração


1,0 258859 ± 3013 0,99 99,40

10,0 2073509 ± 41330 9,97 99,74

75,0 14926111 ± 64278 73,58 98,10 an = 3;


3.1.5 Limite de quantificação e limite de detecção

O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as

condições experimentais estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da

análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor

nível detectável. Nas condições estabelecidas, o limite de detecção deste método foi de

50 ng/ml.

Já o limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma

amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições

experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise

de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível

determinável com precisão e exatidão aceitáveis. Nas condições estabelecidas, o limite

de quantificação deste método foi de 500 ng/ml.


107

O método de doseamento CLAE-DAD desenvolvido apresentou linearidade

na faixa de 0,5 a 100 µg/mL, e foi preciso e exato. Os CV intra e interdias da calibração do

método foram baixos e dentro dos limites máximos estabelecidos. O método foi, portanto,

considerado validado para quantificação do fármaco nas amostras a serem analisadas e

foi utilizado nos estudos subsequentes. Foram avaliados todos os parâmetros indicados

pelo Guia da Conferência Internacional de Harmonização, e estes se encontraram dentro

dos critérios de aceitação.

3.2 Validação bioanalítica em plasma por CLAE-DAD

3.2.1 Especificidade

A especificidade é definida como a capacidade do método em distinguir a

substância analisada de outras presentes na amostra (Causon, 1997). Na análise de

amostras biológicas, interferentes potenciais incluem componentes endógenos,

metabólitos, produtos de decomposição ou medicação administrada concomitantemente

ao estudo, além dos anticoagulantes, quando utilizados.

Tal parâmetro foi investigado pela análise de seis amostras de plasma

branco (plasma obtido de seis animais sadios), sendo quatro plasmas normais e dois

plasmas hemolisados para verificação da existência de interferência por parte de

componentes endógenos (US Food and Drug Administration, 2001). A amostra de plasma

hemolisado foi obtida por congelamento do sangue e posterior centrifugação por 10

minutos a 300 × g.

A seletividade e/ou especificidade de um método bioanalítico é um

importante parâmetro a ser avaliado para garantir que a quantificação do analito de

interesse não seja afetada pela presença de metabólitos, produtos de degradação,

fármacos co-administrados ou compostos endógenos

(Lang et al., 1991, Buick et al., 1990). O método desenvolvido apresentou boa separação

dos analitos (Padrão e PI) entre si e entre estes e os componentes do plasma branco e

hemolisado (Fig. 43). Os sinais cromatográficos referentes à Lyso-7 e seu padrão interno


108

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Minutes

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

apresentaram adequada resolução, com tempos de retenção de aproximadamente 1,8 e

4,85 minutos respectivamente (Fig. 44). A comparação entre os cromatogramas obtidos

de plasma branco normal e hemolisado e plasma obtido após adição de padrão de

referência de Lyso-7 e padrão-interno não revelaram a presença de interferentes nos

tempos de retenção dos mesmos.

Figura 20: Cromatogramas do plasma branco (vermelho) e da Lyso-7 (preto) com padrão interno (PI),

demonstrando maior escala (A) e menor escala (B).

Figura 21: Cromatogramas demonstrando uma adequada resolução entre a Lyso-7 e seu padrão interno (PI). (A) Lyso-7 0,01 µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul e (B) Lyso-7 5 µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul.

3.2.2 Recuperação

A recuperação indica a eficiência do procedimento de extração das amostras

estabelecido no método e indica a quantidade do fármaco obtida após a amostra de

plasma ser processada, ou seja, avalia se as condições empregadas no método são

adequadas o suficiente para extrair o princípio ativo da amostra. Assim, a recuperação

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Minutes

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Lyso-7 Lyso-7

PI PI


109

corresponde ao resultado obtido após análise de amostra de plasma “branco” acrescida

de padrão (PA), submetida ao pré-tratamento, expresso como porcentagem do resultado

obtido após análise de padrão puro, não submetido ao pré-tratamento (Causon, 1997). O

método de extração escolhido foi precipitação de proteínas do plasma utilizando 1000 µL

de acetonitrila uma vez que foi este que apresentou a maior porcentagem de recuperação

(tabela 19).

Tabela 12: Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo

Método de extração

Solvente Volume (µL) Agitação (min) % Recuperação

Líquido-líquido Acetato de Etila 300 1 67,5



Precipitação de proteínas

Acetonitrila 500 2 99,26


Acetonitrila 1000 2 100,72


Metanol 500 2 90,8


Metanol 1000 2 91,53

Esse parâmetro foi determinado comparando-se resultados de análises de

amostras de controle de qualidade submetidas ao processo de extração a resultados de

análises de amostras de soluções padrões não submetidos a esse processo, mas que

foram adicionadas as amostras de plasmas brancos submetidas ao processo de

purificação. A resposta das amostras não submetidas ao processo de extração representa

a quantidade total de fármaco presente na amostra de plasma, ou seja, 100%, enquanto

que a resposta das amostras submetidas ao processo de extração representa a

porcentagem recuperada. Embora porcentagens próximas a 100% de recuperação sejam

desejáveis, admitem-se valores menores de recuperação, desde que o método seja

preciso e exato (US Food and Drug Administration, 2001).

A recuperação foi investigada em três diferentes concentrações em cinco

repetições, conforme recomendado pelo Guia de Validação de Métodos Bioanalíticos do

FDA (US Food and Drug Administration, 2001).


110

Nos métodos bioanalíticos, a recuperação deve ser também avaliada para

os compostos utilizados como padrão interno, independente da concentração usada.

Aceita-se uma variação de até 15% do valor de recuperação determinado para os analitos

8de interesse.

A recuperação média do procedimento de purificação de amostras de plasma

está apresentada na tabela 20. O padrão-interno utilizado no presente trabalho foi o

beznidazol® que apresentou adequadas sensibilidade, seletividade e % de recuperação

nas amostras de plasma de camundongo.

Tabela 13: Recuperação média do procedimento de extração das amostras de plasma de controle de qualidade adicionadas de Lyso-7 (padrão) e benznidazol® (padrão interno). Cada valor representa a média de seis determinações. DP = desvio padrão, CV=coeficiente

Concentração Recuperação (%)

(µg/mL) PA PI

0,25 99,94 106,24

2,5 95,73 101,69

7,5 96,72 104,88

Média 97,46 104,27

DP 2,20 2,34

CV 2,26 2,24

3.2.3 Linearidade

A curva de calibração corresponde ao modelo matemático que estabelece

uma relação entre a resposta instrumental (área/altura da banda cromatográfica) e a

concentração do analito. É necessário elaborar uma curva de calibração para cada analito

que se deseja determinar e para cada corrida analítica, de acordo com ANVISA e FDA.

O modelo de calibração deve ser construído a partir da análise de, no

mínimo, 6 a 8 concentrações conhecidas do analito (padrões de calibração) adicionadas

na mesma matriz biológica para a qual o método foi desenvolvido e será aplicado

(superposição de matriz) (Ribani, et al., 2004). As concentrações estabelecidas devem

contemplar o intervalo de variação esperado, desde o limite de quantificação (LQ) até

120% da máxima concentração que se pretende analisar (US Food and Drug


111

Administration, 2001). Além disso, deve-se realizar análise da amostra branca (matriz

isenta da adição do analito e do padrão interno, quando for o caso) e da amostra zero

(matriz adicionada do padrão interno, quando for o caso).

Os critérios para aceitação da curva de calibração seguem normas

estabelecidas por guias de validação publicados por agências reguladoras oficiais. De

acordo com as normas atualmente em vigor, da ANVISA e FDA, se aceita um coeficiente

de variação menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal para o LQ e menor

ou igual a 15% para as demais concentrações. Além disso, o coeficiente de correlação

linear (r2) deve ser igual ou superior a 0,98.

Obteve-se correlação linear entre concentração de fármaco e resposta do

método na faixa de concentração de 0,1 µg/mL a 10 µg/mL de Lyso-7 em plasma. A figura

45 apresenta a curva de calibração definida no método, e a figura 46 apresenta o

cromatograma da Lyso-7 nas concentrações de 5 e 10 µg/mL com o padrão interno.

Figura 22: Curva de calibração do método bioanalítico para quantificação de Lyso-7 em plasma por

cromatografia líqüida de alta eficiência.

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Minutes

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Figura 23: Cromatograma da Lyso-7 a 5 µg/mL (preto) e a 10 µg/mL (azul), ambos com padrão interno (PI).

Lyso-7

PI


112

3.2.4 Precisão

A precisão de um método analítico representa o grau de concordância dos

resultados obtidos quando um procedimento analítico é aplicado repetidamente, sendo

expressa como coeficiente de variação (CV) dessas medidas. A precisão intradia refere-

se ao CV obtido por repetição do método com o mesmo analista, utilizando o mesmo

equipamento e os mesmos reagentes, em curto intervalo de tempo (por exemplo, no

mesmo dia). A precisão interdia é obtida por meio de alteração das condições, como

mudança de analista ou reagente e utilização do método durante várias semanas ou

meses (Causon, 1997). Este parâmetro foi determinado analisando-se amostras de

plasma de controle de qualidade em três concentrações diferentes e em cinco réplicas no

mesmo dia (precisão intradia) e em dias consecutivos (precisão interdias).

A precisão do método esteve entre 0,012% e 0,071% para amostras de

plasma analisadas no mesmo dia (intraensaio) e entre 3,28% e 5,95% para amostras

analisadas em dias diferentes (interensaios). Os resultados estão apresentados na Tabela

21.

3.2.5 Exatidão

A exatidão de métodos analíticos é uma medida de erro sistemático e é

definida como concordância entre o valor determinado e o valor real (Causon, 1997). O

referido parâmetro foi determinado pela análise de amostras de plasma de controle de

qualidade em três diferentes concentrações e em cinco repetições em um mesmo dia

(exatidão intradia) e em dias diferentes (exatidão interdia).

Todas as amostras de controle de qualidade em plasma adicionadas de

Lyso-7 apresentaram desvios em relação aos valores nominais menores que 15%. A

exatidão do método para amostras analisadas no mesmo dia variou de 98,86% a

103,59% e para amostras analisadas em diferentes dias variou de 100,47% a 104,20%.

Os resultados estão resumidos na Tabela 21.


113

Tabela 14: Resultados de precisão e exatidão intra e inter-ensaios do método analítico para quantificação de Lyso-7 em plasma. Os resultados expressam a média da análise de 6 amostras, durante 3 dias

Concentração Precisão (%) Exatidão (%)

µg/mL Intra-ensaio Inter-ensaios Intra-ensaio Inter-ensaios

0,25 0,012 5,95 103,59 100,47

2,5 0,064 3,68 99,09 104,20

7,5 0,071 3,28 98,86 103,40

3.2.6 Limite de quantificação e limite de detecção

O limite de quantificação foi de 100 ng/mL, com precisão e exatidão de

0,065% e 109,45%, respectivamente, para o plasma. Valores adquiridos a partir da curva

de linearidade para o plasma. O limite de detecção foi de 50 ng/mL.

3.2.7 Estabilidade

A determinação da estabilidade de um fármaco numa matriz biológica

depende de vários fatores, tais como propriedades químicas do fármaco, condições de

armazenamento da amostra, tipo de matriz biológica e material de acondicionamento. A

determinação da estabilidade de uma amostra é fundamental para garantir que a

concentração da substância a ser analisada não sofreu alteração entre a sua coleta e o

momento da análise (Causon, 1997). Assim, é importante que se determine a estabilidade

das amostras de Lyso-7 em plasma em temperatura ambiente, em ciclos de

congelamento e descongelamento e após longos períodos de armazenamento. A

avaliação da estabilidade pós-processamento das amostras permite que amostras

processadas possam ser avaliadas após longos períodos de espera no autoinjetor do

sistema cromatográfico. Além disso, o monitoramento da estabilidade das soluções-

padrão é fundamental para garantir a confiabilidade dos resultados obtidos das análises

das amostras de plasma de voluntários. Conforme recomendado pelo Guia de Validação

de Métodos Bioanalíticos do FDA (US Food and Drug Administration, 2001), foram

determinadas as estabilidades descritas a seguir.


114

3.2.7.1 Estabilidade de curta duração

Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle de qualidade

em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas a descongelamento natural e

mantidas à temperatura ambiente durante 4 horas e submetidas ao processo de

purificação. Os resultados foram comparados com amostras descongeladas e

imediatamente analisadas. Os resultados da avaliação da estabilidade de curta duração

mostraram que amostras de plasma de controle de qualidade mantidas à temperatura

ambiente por 4 horas mantiveram-se estáveis (Tabela 22).

Tabela 15: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas após permanência à temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três determinações

Conc. Amostras processadas Amostras processadas após 4 horas à

nominal imediatamente após o preparo temperatura ambiente

(µg/mL) Conc.det. Precisão Exatidão Conc.det. Precisão Exatidão Desvio

(µg/mL) (%) (%) (µg/mL) (%) (%) (%)

0,25 0,26 0,01 103,59 0,23 11,23 91,37 0,01

2,5 2,48 0,06 99,09 2,75 2,13 109,81 0,02

7,5 7,41 0,07 98,86 8,14 1,83 108,53 0,05

3.2.7.2 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento


(CQ) em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas às seguintes condições:

congelamento a –80°C por, no mínimo, 12 horas, descongelamento e recongelamento

por, no mínimo, 12 horas e assim sucessivamente até completar três ciclos. A

concentração do fármaco nas amostras de plasma padrão de controle de qualidade foi

determinada nos três ciclos, inclusive no tempo zero, correspondente à preparação das

amostras de plasma de controle de qualidade e análise das mesmas sem submetê-las ao

congelamento.


115

A avaliação dos resultados da estabilidade das amostras de plasma de

controle de qualidade avaliadas por três ciclos de congelamento e descongelamento

mostrou que estas se mantiveram estáveis (tabelas 23, 24, 25).

Tabela 16: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de congelamento e descongelamento (n = 5)

Conc. Amostras processadas Ciclo 1

Nominal imediatamente após o preparo


(µg/mL) (%) (%) (µg/mL) (%) (%) (%)

0,25 0,26 0,01 103,59 0,22 12,03 88,70 0,01

2,5 2,48 0,06 99,09 2,52 3,62 100,65 0,03

7,5 7,41 0,07 98,86 7,75 3,67 103,37 0,09

Tabela 17: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de congelamento e descongelamento, (n = 5)

Conc. Amostras processadas

Ciclo 2 Nominal imediatamente após o preparo


(µg/mL) (%) (%) (µg/mL) (%) (%) (%)

0,25 0,26 0,01 103,59 0,23 13,44 93,99 0,01

2,5 2,48 0,06 99,09 2,64 11,77 105,65 0,1

7,5 7,41 0,07 98,86 8,07 2,80 107,61 0,07

Tabela 18: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de congelamento e descongelamento, (n = 5)

Conc. Amostras processadas

Ciclo 3 Nominal imediatamente após o preparo


(µg/mL) (%) (%) (µg/mL) (%) (%) (%)

0,25 0,26 0,01 103,59 0,22 10,81 89,27 0,01

2,5 2,48 0,06 99,09 2,34 6,01 93,50 0,04

7,5 7,41 0,07 98,86 6,91 9,19 92,18 0,2


116

3.2.7.3 Estabilidade pós-processamento

Problemas de instabilidade podem ocorrer não somente na matriz biológica

e/ou durante o tratamento das amostras, mas também nas amostras processadas.

Portanto, é necessário testar a estabilidade do analito no solvente em que foram extraídos

ou reconstituídos, na temperatura do auto-injetor e também em temperaturas mais baixas

(sob refrigeração), caso os extratos das amostras sejam armazenados antes das análises.

Em relação ao tempo, o mesmo deve ser superior ao esperado para a duração da análise

cromatográfica, o que possibilita, se necessário, a reinjeção dos extratos ou um tempo de

espera devido a circunstâncias não previstas como, por exemplo, o mau funcionamento

do sistema cromatográfico.


em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas a descongelamento natural, a

temperatura ambiente, e analisadas na mesma temperatura e condições em que foram

analisadas as amostras de plasma dos animais. A avaliação deste parâmetro contemplou

o período máximo de espera das amostras processadas no auto-injetor do cromatógrafo

(até 24 horas).

Foi avaliada a estabilidade pós-processamento por 24 horas a temperatura

ambiente. Os resultados estão apresentados na tabela 26. As amostras de controle de

qualidade de plasma não apresentaram variações acima de 15% comparando com as

amostras processadas logo após o preparo.

Tabela 19: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, purificadas e mantidas a temperatura ambiente por 24 horas, (n = 5)

Conc. Amostras processadas Amostras analisadas 24 horas

após a extração (µg/mL) Conc.det. Precisão Exatidão Conc.det. Precisão Exatidão Desvio

(µg/mL) (%) (%) (µg/mL) (%) (%) (%)

0,25 0,26 0,01 103,59 0,23 9,34 93,99 0,01

2,5 2,48 0,06 99,09 2,64 4,23 105,65 0,03

7,5 7,41 0,07 98,86 8,07 2,05 107,61 0,05

Diante dos resultados apresentados o método foi considerado validado, pois

permitiu a análise de todos os parâmetros necessários que se encontraram dentro dos

limites de especificação. Embora a Lyso-7 seja um analito de difícil quantificação, pois


117

possui baixa solubilidade nos meios utilizados, esse método permitiu sua detecção em

concentrações aceitáveis para sua posterior aplicação em estudos in vivo.

4 CONCLUSÕES

Os parâmetros dos métodos desenvolvidos, analítico e bioanalítico, se

encontraram dentro dos critérios de aceitação estabelecidos pelas agências reguladoras.

Dessa forma, eles podem ser usados com confiabilidade para a quantificação da Lyso-7

nos sistemas coloidais (analítico) e em plasma de camundongo (bioanalítico). Até o

presente trabalho não foi encontrada na literatura nenhum método cromatográfico para

quantificação da Lyso-7 [(5Z)-5-[(5-bromo-1H-indol-3-il)metileno]-3-(4-clorobenzil)-

tiazolidina-2,4-diona]. Portanto, tanto o método analítico quanto o bioanalítico são

inéditos. Isto permite os estudos pré-clínicos de desenvolvimento deste novo princípio

ativo e avaliação de seus efeitos biológicos em posteriores avaliações de PK/PD. O

método de extração desenvolvido e validado para recuperação da substância de plasma

de camundongos foi eficiente, simples, de alto rendimento e de rápida execução.

CAPÍTULO IV Preparo, caracterização e estudo farmacocinético das nanocápsulas contendo Lyso-7

GARCIA, GM CAPÍTULO IV

119

1 OBJETIVOS

• Preparar suspensões coloidais de nanocápsulas contendo Lyso-7 a partir dos

polímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), funcionalizados ao longo da

cadeia de PLA, contendo ou não o ligante de selectina-E ligado covalentemente;

• Caracterizar as nanocápsulas preparadas quanto ao tamanho, índice de

polidispersão e potencial zeta, avaliando a influência das diferenças químicas e

arquiteturais dos polímeros nesses parâmetros;

• Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de Lyso-7 nas nanocápsulas;

• Comparar os perfis farmacocinéticos da Lyso-7 livre em solução e encapsulada em

NC quando administrados por via endovenosa em camundongos saudáveis.


120


2.1 Materiais

Para a preparação das NC foram utilizados o ácido poly(D,L-lactide) (PLA)

Mw 42.000Da (Sigma-Aldrich), os copolímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PEG; PM

2000 g/mol) com grupos hidroxila (-OH) ou benzila (-OBz) ligados ao longo da cadeia.

Estes copolímeros foram sintetizados na Universidade de Montreal (Canadá) e

gentilmente cedidos pelos professores Dr. Patrice Hildgen e Dra. Vanessa Mosqueira.

Acetona PA (Vetec, Brasil). Lyso-7 [(5Z)-5-[(5-bromo-1H-indol-3-il)metileno]-3-(4-

clorobenzil)-tiazolidina-2,4-diona] PM 447,73 g/mol, sintetizada, purificada e gentilmente

cedida pelo professor Dr. Ivan da Rocha Pitta (UFPE). Epikuron 170 (fosfatidilcolina de

soja, ≈70% fosfatidilcolina), Lucas Meyer (França); Synperonic PE/F68 [PM 8400,

poloxamer 188, ICI Surfactants (Cleveland, UK)]; triglicerídeos de cadeia média (Miglyol

810N ,Hulls, Alemanha). A água ultra pura (Milli-Q) foi purificada no sistema Simplicity, da

Millipore®.

2.2 Preparo das nanocápsulas

As nanocápsulas de PLA foram preparadas pelo processo de deposição

interfacial de um polímero pré-formado, descrito por Fessi et al., 1989 e segundo

metodologia descrita por Mosqueira et al, 2009 (conforme documento técnico PI0905627-

0). As nanocápsulas furtivas (NC contendo PEG) foram preparadas pelo método descrito

por Mosqueira et al., 2001, o qual é semelhante ao arterior.

A influência da presença do diferentes grupos ligados ao longo da cadeia

dos copolímeros na eficiência de encapsulação dos respectivos fármacos, no índice de

polidispersão e no potencial zeta foi avaliada para as suspensões de NC de PLA, dibloco

e tribloco, com e sem ligante de selectina.


121

2.3 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas

2.3.1 Distribuição de tamanho

O tamanho médio das NC e o índice de polidispersão das suspensões de

nanopartículas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons (ECF),

utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As

medidas de tamanho foram realizadas em quadruplicata em alíquotas da mesma amostra

e os resultados obtidos foram expressos como média + desvio padrão. O índice de

polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no tamanho das

nanopartículas presentes na amostra, sendo que as amostras que apresentaram índice

de polidispersão inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas, segundo instruções do

fabricante do equipamento (Beckmann Coulter).


As análises foram feitas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) no aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de arranjo de diodos

(DAD) Waters 2996, por um método de doseamento validado e descrito anteriormente. A

porcentagem de encapsulação e a eficiência de encapsulação foram realizados de acordo

com a metodologia descrita por Mosqueira et al, 2006. A porcentagem de encapsulação

objetiva determinar o teor de Lyso-7 incorporado à nanocápsulas em relação ao total de

Lyso-7 adicionado no preparo da formulação e foi calcula pela seguinte fórmula:

% encapsulação = (Lyso-7 total na suspensão (mL) – Lyso-7 no ultrafiltrado (mL) x 100

Lyso-7 total na suspensão (mL)

O fármaco total foi determinado pela completa dissolução de 80 µL da

suspensão de NC em acetonitrila. A Lyso-7 livre solúvel na fase externa aquosa foi obtida

pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 200 µL da suspensão de NP a 500 × g por

30 minutos em unidades de ultrafiltração. A quantidade de Lyso-7 ligado à membrana foi

determinada após a ultrafiltração/centrifugação. Para tal, a membrana do AMICON foi


122

retirada, lavada com água MilliQ, imersa em 500 µL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao

vórtex por 15 minutos, centrifugada e o Lyso-7 dosado no sobrenadante. A eficiência de

encapsulação foi calculada pela seguinte fórmula:

Eficiência de Encapsulação% = Quantidade total de Lyso-7 encapsulado (mL) x 100

Quantidade de Lyso-7 pesado colocado na NP (mL)

2.3.3 Avaliação da solubilidade da Lyso-7 em óleo e PBS

A solubilidade da Lyso-7 em tampão fosfato (PBS) foi determinada num

período de 24 horas. Para isso, 2 mg de Lyso-7 foram precisamente pesados e

acrescentado a tubos Eppendorf®. A esses tubos foram acrescentados 2 mL de PBS e o

sistema foi mantido em agitação a 37°C. Em tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min,

3, 6, 12, 24 e 48 horas) coletou-se 100 µL do meio, ultracentrifugou-se a 8.000 rpm por 5

minutos, retirou-se 50 µL do sobrenadante e diluiu-se com 250 µL de metanol. Essa

solução foi vórtexada por 10 minutos e novamente ultracentrifugada a 8.000 rpm. O

sobrenadante foi quantificado por CLAE. Esse experimento foi realizado em três réplicas

(n=3) e os resultados foram expressos como média e desvio padrão.

Para a avaliação da solubilidade em óleo (Mygliol), pesou-se 2 mg de Lyso-7

e acrescentou-se a tubos Eppendorf® contendo 2 mL do óleo. Esses tubos foram

mantidos em agitação a 37ºC por 24 horas. Ao final deste tempo, coletou-se 50 µL do

meio, que foi diluído volumetricamente com metanol até um volume de 2 mL. Desta

diluição foram retiras alíquotas de 300 µL e quantificadas por CLAE, em réplicas de três

(n=3) sendo os resultados também expressos como média e desvio padrão.


A formulação preparada usando o polímero PLA foi avaliada quanto à

liberação in vitro de Lyso-7, na concentração de 0,35 µg/mL no meio, em triplicata, em

tampão fosfato salina (PBS pH 7,4). Para o doseamento da Lyso-7 liberada utilizou-se a

técnica de diálise reversa. Para tal, sacos de diálise contendo 1 mL de PBS foram

emergidos em 500 mL de PBS e deixados em equilíbrio por 3 horas sob agitação a 37ºC.


123

Em seguida, adicionou-se a formulação ao meio externo (350 µL da suspensão de NC

contendo 0,5 mg/mL de Lyso-7). Nos tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min, 3, 6, 12,

24 e 48 horas) retirou-se um saco de diálise do meio e alíquotas de 500 µL foram

coletadas, solubilizadas em 500 µL de acetonitrila e a Lyso-7 liberado foi quantificado em

CLAE-DAD. A solubilidade da Lyso-7 em PBS foi determinada previamente e a

quantidade de formulação adicionada respeitou a condição sink (20% da concentração de

saturação no meio).

Os dados obtidos dos perfis de dissolução foram submetidos a tratamentos

matemáticos para a determinação de cinética de liberação/dissolução e para isso foram

aplicados os mesmos modelos matemáticos descritos no capítulo II, sendo eles o modelo

de ordem zero, o modelo de primeira ordem, o modelo de Higuchi e o modelo de cinética

desenvolvido por Korsemeyer et al. (1983).

2.3.5 Estudo farmacocinético da Lyso-7

Realizou-se o estudo farmacocinético com a Lyso-7 livre e encapsulada em

nanocápsulas de ácido poli-lactico (NC-PLA). A solução da Lyso-7 livre foi preparada

solubilizando 2 mg da substância em 400 µL de DMA, 600 µL de PEG 300, 20 µL de

Tween 80 e 20 µL de DMSO. Após agitação por 10 min em vórtex, esta solução foi

centrifugada por 5 min a 900 × g, o sobrenadante foi coletado e diluído em solução de

glicose 5% até uma concentração final de 0,5 mg/mL de Lyso-7. A solução de Lyso-7 e a

suspensão de NC-PLA encapsulando 0,5 mg/ml de Lyso-7 foram filtradas em filtro estéril

de 0,8 µm e administrou-se 300 µL e 200 µL, respectivamente, por via endovenosa. Nos

intervalos de tempos de 5, 20, 40, 60 min e 2, 3 horas após a injeção, o sangue (200 µL)

foi coletado em tubos heparinizados, centrifugado por 15 min a 800 × g separando-se 50

µL de plasma e adicionando 10 µL da solução de PI. As amostras foram então extraídas,

o solvente foi evaporado e o resíduo ressuspenso com 100 µL de fase móvel. Para

determinar a quantidade total de Lyso-7 no plasma, foi assumido que o volume de plasma

por camundongo é 4,9% do peso total (Auletta, 1995). Os resultados foram expressos

como média da porcentagem da dose administrada ± erro padrão (n=6 camundongos).

Para comparar as diferentes formulações, a área sob a curva (AUC) (concentração x

tempo) da Lyso-7 livre e encapsulada em NC-PLA foi calculada pelo método trapezoidal


124

durante o tempo experimental (AUC[0-3]). A área extrapolada (AUC[t-ω]) pode ser calculada

pela divisão da última concentração experimental (Ct) pela constante de eliminação (K),

porém uma vez que esta representa aproximadamente 1% da AUC experimental, ela foi

retirada dos cálculos. Assim, a estimativa da depuração plasmática (Cl) foi calculada

através da seguinte equação: Cl = Doseiv/AUC0–3

2.4 Análise Estatística dos Dados

Os dados de farmacocinética foram comparados por two-way ANOVA. O

diâmetro médio e o potencial zeta das NC vazias e contendo os fármacos foram

comparadas por análise da variância (ANOVA), utilizando o programa Prisma® versão

5.0. Adotou-se intervalo de confiança de 95%, sendo os valores de p<0,05 aceitos como

estatisticamente significativos.

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas

3.1.1 Distribuição de tamanho

A técnica de espectroscopia de correlação de fótons (ECF), como já

relatado, fornece o diâmetro médio das nanoestruturas e o índice de polidispersão (I.P.)

da população analisada.

A determinação do raio hidrodiâmetro das nanopartículas é uma das

importantes análises para a caracterização físico-química das formulações. Através desta,

é possível acompanhar a estabilidade das formulações e a tendência das partículas

presentes na suspensão coloidal de se agregarem e de sedimentarem

(Magenheim e Benita, 1991). O tamanho das partículas representa um aspecto

importante, também, para sua biodistribuição e eliminação, sendo que partículas maiores

(acima de 300 nm) são mais rapidamente reconhecidas pelo sistema fagocitário


125

mononuclear e facilmente retirado da circulação sanguínea. Além disso, quando se

pretende uma administração intravenosa, está análise deve ser estritamente controlada,

pois os pequenos capilares sanguíneos do corpo humano possuem de 4 a 7 mm de

diâmetro e partículas maiores que 4 mm podem causar sua oclusão (Chorny et al., 2002),

clinicamente conhecida como embolia. O tamanho das nanocápsulas produzidas por

nanoprecipitação, geralmente, varia de 100 a 500 nm e depende de vários fatores, como

o método de preparação, a concentração do polímero e do fármaco encapsulado, a

proporção entre solvente orgânico e água e da velocidade de difusão da fase orgânica na

aquosa (Legrand et al., 1999 e Mosqueira et al., 2001).

Os resultados obtidos na avaliação do tamanho médio das NC brancas (sem

o fármaco) e contendo Lyso-7 são demonstrados nas tabelas 27 e 28. Populações

monodispersas de partículas foram obtidas com a utilização de todos os polímeros antes

e após encapsulamento da substância. Além disso, o tamanho médio das partículas e o

índice de polidispersão obtidos são considerados aceitáveis para a utilização dessas

nanopartículas in vivo, comparando-se com outras nanocápsulas dentro de uma mesma

escala de tamanho (Mosqueira et al., 2001).

Tabela 20: Comparação do tamanho entre as NC brancas com diversos polímeros

NC Brancasa Tamanho médio ± DPb I.Pc ± DP

PLA 295,50 ± 5,17 0,14 ± 0,04

Dibloco 214,20 ± 3,03* 0,18 ± 0,04

Tribloco 181,80 ± 0,98* 0,14 ± 0,02

Dibloco-OH 225,70 ± 2,86* 0,13 ± 0,02

Tribloco-OH 198,10 ± 1,38* 0,16 ± 0,04

Dibloco-OBz 227,80 ± 2,28* 0,19 ± 0,03

Tribloco-OBz 215,80 ± 4,67* 0,11 ± 0,06 aVolume final de 2 mL;

bDP= desvio padrão (n=4);

camostras monodispersas (abaixo de 0,3);

*significativamente diferente das formulações com PLA (p<0,05).

A utilização de copolímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA) e

dos copolímeros funcionalizados com grupamentos hidroxila ou benzila conduziu a uma

redução significativa no tamanho das partículas quando comparado ao tamanho daquelas

preparadas a partir do homopolímero de PLA. Esta redução no tamanho das NC,

produzida pela presença das cadeias de PEG covalentemente ligadas na superfície das

nanocápsulas, também foi observada por outros autores (Tobio et al., 1998; Ameller et al.,


126

2003; Essa et al., 2010), e está provavelmente associada à característica anfifílica do

copolímero que conduz à redução da tensão interfacial do sistema. A introdução de

grupos hidroxila ou benzila aumentou o tamanho das NC, comparado às NPs preparadas

com os copolímeros dibloco e tribloco, devido à dificuldade de acomodação de grupos

volumosos no interior do núcleo das NC (benzila). No caso das hidroxilas há um provável

aumento da camada de solvação no entorno das cadeias de PLA funcionalizado.

Tabela 21: Comparação de tamanho entre as NC com 0,5 mg/mL de Lyso-7 produzidas com polímeros PLA, dibloco e tribloco, com e sem ligante de selectina

Formulaçãoa Tamanho médio ± DPb I.Pc ± DPb

PLA 273,6 ± 1,20 0,177 ± 0,019

Dibloco 240,7 ± 2,54* 0,147 ± 0,016

Tribloco 212,6 ± 2,99* 0,178 ± 0,022

Dibloco-g-ligante 275,7 ± 0,17 0,164 ± 0,035

Tribloco-g-ligante 229,3 ± 2,30* 0,183 ± 0,020 aVolume final de 2 mL;

bDP= desvio padrão (n=4);

camostras monodispersas (abaixo de 0,3);

*significativamente diferente das formulações com PLA (p<0,05).

Foi observada uma diferença significativa (p < 0,05) no aumento do tamanho

das formulações coloidais dos dois tipos básicos de polímeros utilizados, PLA-PEG e

PLA-PEG-PLA, quando foi incorporado a Lyso-7 às formulações quando comparado com

as formulações brancas, sem o fármaco. Para explicar o aumento do tamanho quando

adicionamos o fármaco há algumas hipóteses: a presença de Lyso-7 no meio altera o

tamanho crítico das gotas na separação de fase, o que pode indicar maior solvatação pela

água (cadeias mais relaxadas expõem melhor os grupos carboxilato para o exterior) ou

maior adsorção de poloxamer na superfície de partículas bastante hidrofóbicas pela

presença de Lyso-7. Há também a hipótese mais provável de acomodação das moléculas

do fármaco no núcleo oleoso que aumenta consequentemente o volume interno das NC.

Na literatura vários casos de aumento no tamanho das NC após incorporação do fármaco

são encontrados (Govender et al., 1999; Guterres et al., 1995). A incorporação do ligante

de selectina provocou um aumento significativo (p<0,05) no tamanho das nanocápsulas,

comparado com a mesma formulação, porém sem ligante, o que está provavelmente

associado a sua organização na interface, que pode alterar o diâmetro hidrodinâmico

medido por PCS.


127


A concentração de fármaco associada às nanoestruturas é calculada pela

diferença entre as concentrações de fármaco total, após dissolução das NC em solvente e

da quantidade de fármaco livre disperso ou dissolvido na fase externa.

As NC são constituídas de um núcleo oleoso, no qual o fármaco lipofílico

pode estar dissolvido ou disperso, revestido por uma parede polimérica

(Legrand et al., 1999). Devido ao elevado caráter hidrofóbico da Lyso-7, as NC

mostraram-se carreadores adequados para a incorporação desse fármaco, pois todas as

formulações apresentaram um teor de encapsulação próximo de 100%. Não foi

encontrado Lyso-7 livre solúvel na fase aquosa da suspensão coloidal, ou aderida à

membrana de ultrafiltração utilizada para a separação das NP, em concentrações

detectáveis (tabela 29). Por outro lado, a eficiência de encapsulação, que leva em conta

as perdas do processo de preparo das NC variou de acordo com a formulação utilizada. O

valor de 100% de encapsulação possibilita a utilização dessas formulações de NC in vitro

e in vivo, sem necessidade de processos de purificação adicionais.

Tabela 22: Eficiência de encapsulação e rendimento de encapsulação de formulações de NC com 0,5 mg/ml de Lyso-7

Formulação de NCa Eficiência de encapsulação ± DPb (%)

% encapsulação

PLA 82,85 ± 0,012 98,97 Dibloco 88,50 ± 0,003 99,37 Tribloco 94,30 ± 0,015 99,41

aVolume final de 2 mL;

bDP= desvio padrão (n=4).

2.3.5 Avaliação da solubilidade da Lyso-7

A solubilidade da Lyso-7 em PBS e em Mygliol foi determinada por CLAE.

Dessa forma, após 24 horas de incubação a 37°C sob agitação pode-se verificar que a

solubilidade da Lyso-7 no Miglyol é de 2,74 ± 0,13 mg/mL e após 48 horas de incubação a

solubilidade no PBS é de 1,66 ± 0,45 µg/mL. Baseando-se neste resultado, é possível

explicar os altos teores de encapsulação da Lyso-7 no núcleo oleoso das NC.


128


Observa-se que ambos os perfis, de dissolução e de liberação da Lyso-7,

mostraram-se semelhantes. Na liberação a partir das NC há um efeito “burst” até 12

horas. Mais de 82% da substância foi dissolvida em 12h, tempo no qual apenas 58% de

Lyso-7 foram liberados da formulação de NC.

Figura 24: Perfil de dissolução/liberação in vitro da Lyso-7 livre e em nanocápsulas de PLA (NC-PLA) na concentração de 0,35 µg/mL em PBS.

A partir desse tempo ocorre uma dissolução/liberação lenta em ambos os

casos, até o tempo de 48h com a dissolução completa da Lyso-7 livre e uma quantidade

inferior a 77% de liberação da Lyso-7 a partir das NC (Fig. 47). Esta segunda fase

controlada pode ser dependente principalmente da difusão do fármaco e da erosão da

matriz, fenômenos esses que ocorrem mais lentamente devido à hidrofobia do polímero

(Fredenberg et al., 2011), além de poder ser atribuída à densidade do polímero com baixa

porosidade, mas também pelas interações polímero-fármaco e fármaco-fármaco que

inibem a liberação do mesmo (Blanco and Alonso, 1997; Kang et al., 2008; Kang and

Schwendeman, 2007).

Na tabela 30 estão apresentados os valores de coeficiente de correlação

linear (R2) obtidos através de construção de gráficos nos modelos de Ordem Zero (tempo

em função da quantidade não liberada de fármaco) comparados com Primeira Ordem


129

(tempo em função do log da % não liberada de fármaco) e Higuchi (raiz quadrada do

tempo em função da % liberada).

Tabela 23: Tabela valores de R2 (coeficiente de correlação linear) referentes a cinética de liberação de PLA-NC da Lyso-7 em PBS, obtidos através da construção de gráficos para modelo de Ordem 0 (t x QND ), 1ª Ordem (t x log %ND ), e Higuchi (√ t x %D )

Formulação Modelo Matemático

Ordem Zero Primeira Ordem Higuchi Equação da cinética

PLA 0,5056 0,6810 0,8573 y = 27,038ln(x) – 38,374*

Dissolução 0,6158 0,9562 0,7765 y = 1,9249e-0,059x**

* R2 = 0,9371; ** R2 = 0,8774

Todos os perfis apresentaram diferentes valores de coeficiente de

correlação, o que facilita a escolha de um modelo ideal. De acordo com os dados, a

liberação das NC-PLA segue o modelo matemático de Higuchi, o qual prediz que a

liberação ocorre pela difusão do fármaco através da matriz das NC e da erosão da

mesma.

Também foi calculado o n (coeficiente de liberação) de cada perfil, através

da equação de Korsemeyer et al. (1983). Essa equação é geralmente utilizada para

interpretar e descrever a liberação do fármaco quando o mecanismo que prevalece não é

bem conhecido ou resulta da combinação de dois processos aparentemente

independentes: um devido ao transporte de fármaco que obedece as leis de Fick ou

transporte Fickiano, e outro em consequência dos fenômenos de inchamento/relaxamento

das cadeias (expansão dinâmica) e que envolve a transição de um estado semi-rígido a

outro mais flexível, chamado transporte Caso II. De acordo com a forma geométrica da

preparação, variam os valores de n usados para interpretar e caracterizar o mecanismo

de liberação. A tabela 31 mostra os valores de n encontrado para cada perfil de liberação.

Tabela 24: Valores de n (coeficiente de liberação) para as amostras

Formulação N

PLA 0,3952

Dissolução 0,1920

Aplicado a formas farmacêuticas esféricas, um valor de n até 0,43 indica que

a liberação se dá pelo mecanismo de difusão Fickiana. Quando os valores de n estão

entre 0,43 e 0,85 o mecanismo de liberação é tipo anômalo, ou seja, envolvendo


130

fenômenos de difusão e erosão, e para valores de n a partir de 0,85 o mecanismo

controlador da liberação do fármaco é do tipo transporte caso II. Para a determinação do

n é usada somente a porção da curva de liberação onde a razão Mt/M∞ tem valores

menores que 0,6 (Costa & Lobo, 2001).

Tanto o perfil de liberação da PLA-NC quanto à dissolução da Lyso-7

apresentaram um valor de n inferior a 0,43, indicando que o mecanismo de

liberação/dissolução que prevalece para estas formulações é a difusão de Fick.

3.3 Estudo farmacocinético da Lyso-7 nanoencapsulado

A avaliação do perfil farmacocinético foi inicialmente realizada com a

suspensão de PLA-NC com 0,5 mg/mL de Lyso-7. Injetou-se por via endovenosa 300 µL

da suspensão (2,17 mg/Kg de Lyso-7 em NC-PLA) e o sangue foi coletado nos tempos já

indicados. Porém, a injeção de 300 µL da solução contendo a mesma dose de Lyso-7 livre

levou a morte imediata de todos os animais (n = 6). Com isso, avaliou-se o perfil

plasmático da Lyso-7 livre injetando uma dose menor da mesma (1,55 mg/Kg de Lyso-7

livre). Para avaliar se os solventes e adjuvantes utilizados no preparo da solução de Lyso-

7 foram os responsáveis pela letealidade da formulação, um mesmo veículo foi preparado

sem Lyso-7 e administrado por via endovenosa em camundongos, sendo que não foi

observada nenhuma reação anormal ou posterior morte dos mesmos.

Como os volumes e consequentemente as doses administradas do princípio

ativo foram diferentes nos dois grupos, os valores plasmáticos foram expressos em

porcentagem da dose administrada, sendo que a Lyso-7 foi quantificada tanto na

suspensão coloidal quanto na solução para corresponder exatamente a 100% da dose

administrada.

Os perfis farmacocinéticos obtidos após a administração intravenosa da

solução de Lyso-7 e de Lyso-7 encapsulado em NC-PLA estão demonstrados da figura

48. A concentração plasmática da Lyso-7 em NC-PLA foi significativamente maior

(p<0,001) que a sua concentração livre após 5 (Fig. 49) e 20 minutos de injeção,

sugerindo uma rápida depuração plasmática da substância. Após 1h a concentração de

ambas as formulações assumiram um perfil similar indicando que a Lyso-7 foi

provavelmente liberada das NC ou as NC de PLA foram fagocitadas pelas células do


131

SFM. Pode ser observado que as nanocápsulas modificaram o perfil plasmático da Lyso-

7, como demonstrado na tabela 32. A AUC foi aumentada estatisticamente (p<0,001)

aproximadamente 5,5 vezes e a depuração foi reduzida pela encapsulação da Lyso-7

neste nanocarreador polimérico.

Por esse estudo farmacocinético foram evidenciadas algumas das

vantagens da utilização de sistemas vetorizados. A primeira foi a modificação do perfil

farmacocinético do princípio ativo e a segunda, a diminuição da toxicidade da substância,

que foi letal quando administrada livre em solução na mesma concentração que nas

nanocápsulas poliméricas. Assim sendo, a nanoencapsulação da Lyso-7 viabiliza sua

administração por via endovenosa em doses maiores que quando veiculada em outros

tipos de formulações.

Figura 25: Perfil da concentração plasmática da Lyso-7 após administração intravenosa das doses: 1,55 mg/Kg de Lyso-7 livre e 2,17 mg/Kg de NC-PLA (média ± erro padrão, n = 6). *** p < 0,001, ** p < 0,05 usando two-way ANOVA.

Tabela 25: Parâmetros farmacocinéticos da Lyso-7 em diferentes formulações após administração intravenosa

Parâmetro Lyso-7 livre NC-PLA

AUC[0-3] (µg.min/mL) 20,54 *** 113,60

Depuração (mL/(min.Kg)) 75,27 *** 19,08

AUC, área sob a curva; NC, nanocápsulas. Doses administradas: 1,55 mg/Kg de Lyso-7 livre e 2,17 mg/Kg de NC-PLA. *** p < 0,0001.


132

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

Minutes

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Figura 26: Cromatograma de amostra de plasma coletado 5 min após injeção de 300 µL da suspensão de NC-PLA com 0,5 mg/mL de Lyso-7.

Trabalhos posteriores serão realizados para verificar o perfil farmacocinético

e a biodistribuição corpórea de NC com superfície modificada, preparadas a partir de

polímeros distintos; como os peguilados e os funcionalizados.

4 CONCLUSÕES

Neste estudo foi observada a influência da arquitetura dos polímeros sobre o

tamanho e o potencial zeta das mesmas. Durante o desenvolvimento dos

nanocarreadores foi avaliado a produção de NC e NS. Entretanto, estas não

apresentaram uma boa encapsulação, sendo observada a formação de precipitado logo

após a evaporação do solvente. Assim sendo, as NC se apresentaram como uma opção

para o encapsulamento da Lyso-7, uma vez que por apresentarem um núcleo oleoso,

pode facilitar a encapsulação de fármacos pouco solúveis em água. Além disso, a

funcionalização dos polímeros pode ser útil para a ligação de grupos químicos

responsáveis pelo reconhecimento celular, tal como foi feito com o ligante da selectina.

Por fim, os estudos farmacocinéticos das NC encapsulando a Lyso-7 mostraram que as

mesmas modificaram o perfil da substância em plasma de camundongo após a

administração endovenosa aumentando o tempo de meia vida plasmática e diminuindo

sua depuração. Além disso, as NC diminuíram a toxicidade da Lyso-7, que se mostrou ser

tóxica e letal aos animais quando administrada numa mesma dose da substância

encapsulada. Dessa forma, as nanocápsulas de Lyso-7 são uma opção como forma

farmacêutica que viabiliza a possibilidade de administração endovenosa dessa substância

em concentrações maiores reduzindo a toxicidade geral.

PI Lyso-7

CONCLUSÃO

GARCIA, GM CONCLUSÃO

134

• O preparo das suspensões coloidais de nanoesferas contendo o itraconazol a partir

do homopolímero do ácido poliláctico (PLA) e de seus copolímeros com cadeias de

polietilenoglicol (PEG) mostraram-se viáveis, resultando em formulações

monodispersas que se mantiveram estáveis durante os 12 meses avaliados. A

diferença na arquitetura desses copolímeros influenciou no tamanho das

nanoesferas, sendo que aquelas produzidas a partir do copolímero dibloco

apresentaram diâmetro médio inferior se comparado com as tribloco. O fármaco

itraconazol foi eficientemente associado às nanoesferas e as formulações

produzidas apresentaram porcentagem de encapsulação próximos de 100%, o que

indica que o sistema foi adequado para associação do ITZ;

• As diferentes nanoesferas apresentaram perfis de liberação diferenciados, isso

devido às diferentes interações que podem ocorrer entre polímero/fármaco. Assim,

essas diferenças podem ser úteis no delineamento de sistemas de liberação

controlada obtidos a partir destes polímeros, visando aumentar ou reduzir as

interações entre fármaco e polímero, obetendo um maior controle da velocidade de

liberação.

• Foi desenvolvida e validada uma metodologia inédita para a quantificação da Lyso-

7 em plasma por CLAE-DAD. O método desenvolvido se apresentou sensível,

simples, estável e adequado para quantificação da Lyso-7 em amostras de plasma.

A validação do método garantiu a qualidade e a confiabilidade dos resultados

obtidos no estudo in vivo, justificando seu uso na avaliação da farmacocinética

desta substância associada a outros nanocarreadores;

• A Lyso-7 foi eficientemente associada às nanocápsulas com diferentes copolímeros

e as formulações se mantiveram estáveis durante os experimentos. Especialmente

as formulações produzidas com os copolímeros dibloco e tribloco encapsularam o

fármaco com porcentagem de encapsulação próximos de 100%, o que indica que o

sistema foi adequado para associação da Lyso-7;

• Através da farmacocinética da Lyso-7, livre e nanoencapsulada em nanocápsulas

de PLA, foi observado que as mesmas modificaram o perfil plasmático da Lyso-7

reduzindo significativamente a depuração da mesma neste nanocarreador

polimérico. Além disso, durante estes experimentos observou-se que nanocápsulas

de PLA reduziram o efeito tóxico da Lyso-7 por via endovenosa, uma vez que a

mesma dose da substância livre levou os camundongos a óbito;

GARCIA, GM CONCLUSÃO

135

• Por fim, o presente trabalho ressalta a importância do uso de nanopartículas

poliméricas como um sistema controlado de liberação de fármacos. A

funcionalização dos polímeros pode ser útil para a ligação de grupos químicos

responsáveis pelo reconhecimento celular, tal como foi feito com o ligante da

selectina. Também o uso de ligantes interfere nas propriedades físico-químicas das

nanoesferas carreadoras, efeitos estes que devem ser investigados para melhorar

as chances de sucesso no carreamento direcionado de fármacos (targeting).

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GARCIA, GM ANEXOS

ANEXOS

GARCIA, GM ANEXOS

ANEXOS - Resumos apresentados em congressos científicos:

Simpósio Nacional de Cromatografia e Métodos Afins – Campos do Jordão/SP ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO

ITRACONAZOL Giani Martins GARCIA, Líliam Teixeira OLIVEIRA, Vanessa Carla Furtado MOSQUEIRA Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanobiotecnologia, CiPharma, Universidade

Federal de Ouro Preto, Campus Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, Brasil

O itraconazol é um fármaco antifúngico com característica química de um bis-triazólico.

Apresenta amplo espectro de ação sendo empregado no tratamento de micoses sistêmicas, como aspergilose e candidíase, micoses superficiais como candidíase oral e dermatofitoses e mais recentemente seu uso vem sendo avaliado para o tratamento da doença de Chagas. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição da síntese do ergosterol, um componente vital da membrana da célula de fungos e parasitas. A conseqüência do bloqueio desta síntese é um aumento da permeabilidade da membrana celular, desencadeando alterações morfológicas que resultam em necrose celular. O itraconazol é altamente lipofílico (pKa = 3,7), apresentando baixa solubilidade em soluções aquosas e rápida absorção oral. Métodos analíticos de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e espectrofotometria ultravioleta foram desenvolvidos e validados para a quantificação do itraconazol em diferentes formulações de nanoesferas poliméricas. O sistema cromatográfico utilizado consistiu de uma bomba de módulo de separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna e detector de arranjo de diodos Waters 2996. A separação foi realizada em uma coluna C18 Macherey-Nagel com partícula de 4 µm, 150 mm x 4,6 mm, protegido por uma pré-coluna de segurança Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 mm). A fase móvel consistiu de uma mistura de metanol:água (75:25 v/v). As condições de operação foram vazão de 1 ml/min, tempo de corrida de 13 min, volume de injeção de 50 µl e detecção no DAD em 260 nm. Para espectrofotometria foi utilizado o aparelho Heλios α, Thermo Spectronic, com detecção no UV-Vis em 260 nm. O tempo de retenção obtido foi de 9,75 min. O método foi linear nas concentrações variando de 500 ng/ml a 100 µg/ml, com um coeficiente de correlação linear R2 = 0,9999 (y = 19299x + 11155) para CLAE, e nas concentrações de 500 ng/ml a 50 µg/ml com o coeficiente R2 = 0,9996 (y = 0,0519x + 0,001) para espectrofotometria. A precisão e exatidão dos métodos tiveram valores adequados (variação inferior a 5% nas amostras para análise). O limite de quantificação foi de 500 ng/ml para ambos os métodos analíticos. Já o limite de detecção foi de 10 ng/ml e 50 ng/ml para CLAE-DAD e espectrofotometria, respectivamente, ressaltando a maior sensibilidade do método cromatográfico. Além disso, nenhum polímero constituinte das formulações de nanoesferas apresentaram picos interferentes no mesmo tempo de retenção do itraconazol. Os métodos propostos foram desenvolvidos seguindo os protocolos e valores determinados pela ANVISA e FDA e mostraram-se eficientes para o uso em quantificações do itraconazol nas formulações nanoestruturadas propostas.

GARCIA, GM ANEXOS

2nd Conference Innovation in Drug Delivery – França

ITRACONAZOLE ASSOCIATION WITH FUNCTIONALIZED NANOSPHERES IS INFLUENCED BY CHEMICAL GROUPS LINKED TO PLA

Giani Martins Garcia1, Patrice Hildgen2, Jean-Michel Rabanel2 and Vanessa Carla Furtado Mosqueira1*

1Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.

Faculté de Pharmacie, Université de Montreal, QC, Canada. *email: [email protected]

Purpose: The drug loading and encapsulation efficiency of itraconazole in PLA derivatives nanospheres (NS) were investigated. Methods: The oligopolymers containing functional groups (-OH or -benzyl) grafted in linear chain of PLA were prepared by ring opening polymerization of dilactides in the presence of PEG or methoxi-PEG producing block olipolymers with different characteristics. Results: All the polymers used produces NS with very low polydispersity (<0.1) using polymer deposition method followed by solvent displacement. However, NS made of diblock homopolymers have lower size (116nm, 0.080) than triblock (146nm, 0.083). Introducing benzyl groups in the polymer increases significantly the size of NS (180-285nm). The itraconazole association with these nanospheres is high and loading yielding was always near 100% at 2.5-5% w/w. Hydrophilicity of polymer slightly reduces itraconazole loading. However, loading efficiency was lower with the polymers functionalized with benzyl groups (64-68%) compared to hydroxyl groups (73%), indicating that probably steric constraints with itraconazole large molecule could occurs, which reduces drug association with the carrier. This fact was reinforced when encapsulation efficiency was compared with non-functionalized groups (95-100%). Conclusions: This investigation open up a wide range of possibilities in chemical modification of biodegradable polymers in order to improve loading efficiency of different types of molecules, by increasing hydrophobic and hydrophilic interactions with rationally functionalized polymers. This work was supported by Nanobiotechnology Network-FAPEMIG and INCT-if scholarship from Brazil Science and Technology Ministry.

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AU

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Minutes

2,00 4,00 6,00

23rd Internacional Symposium of Pharmaceutical & Biomedinal Analysis – João Pessoa/PB

Validation of HPLC-DAD analytical method for determining a new thiazolidine-2,4-dione

in polymeric nanocapsules Giani M. Garciaa, Líliam T. Oliveiraa, Ivan R. Pittab, Dulcinéia S. P. Abdallac, Vanessa C. F.

Mosqueiraa a-Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Ouro

Preto, MG, Brazil b–Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, PE, Brazil c–Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, SP, Brazil

Keywords: thiazolidinones, HPLC-DAD, nanocapsules

INTRODUCTION

The clinical use of non-steroidal anti-inflammatory drugs is associated with significant toxicity particularly in the gastrointestinal tract and kidney. Novel thiazolidinones (TZD) have been synthesized and exhibited anti-inflammatory activity [1]. An analytical method for quantitative analysis of a new TZD in polymeric nanocapsules (NC) was developed and validated using high-performance liquid chromatography with diodes array detection (HPLC-DAD).

MATERIALS AND METHODS

All solvents used were HPLC grade and were purchased from Tedia (Brazil) and the new TZD (GMG-7) was kindly given by Prof. Ivan Pitta. The different NC formulations were prepared according to Fessi et al.[2]. The HPLC system employed consisted of a Water Alliance 2695 separation module with DAD detection (Waters 2996), using a C18-RP column (150mm×4.6mm) protected by a security guard C18 column (2mm×4.6mm, 3µm). The isocratic mobile phase is consisted of a mixture of methanol/water (90:10), pumped 1ml/min. The analysis was performed at 35ºC and the volume injection was 50µl. The column eluent was monitored at 385nm. The amount of GMG-7 loaded on the different formulations were determined according to Mosqueira et al.[3].

RESULTS AND DISCUSSION

It was evaluated selectivity (Fig.1), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ), linearity, accuracy and precision, and all parameters were in accordance with International Conference on Harmonization (ICH) guidelines [4]. The linearity was over 0.5-100µg/ml, and the slopes, intercepts and the coefficients of determination were found to be 119817 (a), 8229.4 (b), 0.9997 (r2), respectively. The LOD was 50ng/ml and the LOQ was 500ng/ml. Due to the hydrophobic character of GMG-7, the NCs proved to be suitable carriers for the incorporation of this drug, as all formulations showed a level of near 100% encapsulation (Table 1).

Fig.1-Chromatogram of GMG-7 loaded PLA-NC.

Table 1 - Quantitative analysis of different GMG-7 nanocapsules.

a 0.5mg/ml; b PLA = polylactide; c PEG = poly(ethylene)glycol CONCLUSIONS A specific, accurate, and precise isocratic reverse-phase HPLC-DAD method was described for the determination of new TZD in polymeric nanocapsules formulations.

NC formulationa Encapsulation efficiency(%) Drug loading(%)

PLAb 82.85 98.97 PLA-PEGc 88.50 99.37

PLA-PEG-PLA 94.30 99.41

GMG-7

GARCIA, GM ANEXOS

ACKNOWLEDGMENTS

This work was funded by Rede de Nanobiotecnologia-FAPEMIG and supported by the scholarship to the first author from INCT-if (MCT-CNPq).

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23rd Internacional Symposium of Pharmaceutical & Biomedinal Analysis – João Pessoa/PB HPLC-DAD bioanalytical method to quantify nanocapsules with a new thiazolidine-2,4-

dione in mice plasma and application in pharmacokinetic study Giani M. Garciaa, Líliam T. Oliveiraa, Ivan R. Pittab, Dulcinéia S.P. Abdallac, Vanessa

C.F. Mosqueiraa a-Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de

Ouro Preto, MG, Brazil b–Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, PE, Brazil c–Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, SP, Brazil

Keywords: thiazolidinones, HPLC-DAD, nanocapsules

INTRODUCTION

The clinical use of non-steroidal anti-inflammatory drugs is associated with significant toxicity particularly in the gastrointestinal tract and kidney. Novel thiazolidinones (TZD) have been synthesized and exhibited anti-inflammatory activity [1]. Nanoparticles are able to entrap poor water soluble drugs, protected them from degradation and reduce side effects. A new bioanalytical method for quantitative analysis of a new TZD in mice plasma and pharmacokinetic (Pk) study was developed and validated using high-performance liquid chromatography with diodes array detection (HPLC-DAD).

MATERIALS AND METHODS

All solvents used were HPLC grade and were purchased from Tedia (Brazil) and the new TZD (GMG-7) was kindly given by Prof. Ivan Pitta. The polylactide NC formulations (PLA-NC) was prepared according to Fessi et al.[2]. The HPLC system employed consisted of a Water Alliance 2695 separation module with DAD detection (Waters 2996), using a C18-RP column (150mm×4.6mm) protected by a security guard C18 column (2mm×4.6mm, 3µm). The isocratic mobile phase is consisted of a mixture of methanol/water (90:10), pumped 1ml/min. The analysis was performed at 35ºC, the volume injection was 20µl and monitored at 385nm. Female Swiss mice received a single i.v. dose of free (1.55mg/kg) and PLA-NC GMG-7 loaded (2.17mg/kg) for evaluation of Pk parameters. Internal standard (IS) (Benznidazole® 5µg/ml) was added in plasma samples (90µl).

RESULTS AND DISCUSSION

It was evaluated selectivity (Fig.1), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ), linearity, recovery, stability, accuracy and precision, and all parameters were in accordance with FDA guideline [3]. The linearity was over 0.1-10µg/ml, and the slopes, intercepts and coefficients of were found to be 1 (a), 0 (b), 0.9998 (r2), respectively. The LOD was 50ng/ml and the LOQ was 100ng/ml. The samples extractions were performed by protein precipitation with acetonitrile and the recovery was 92% (GMG-7) and 96% (IS). While the encapsulated drug does not demonstrated toxicity, the same dose of free drug was lethal. The Pk study showed that NC were able to modified the plasmatic profile of GMG-7 (Fig.2).

GARCIA, GM ANEXOS

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Fig.1 - Chromatogram of GMG-7 loaded PLA-NC extracted from plasma.

Fig.2 - Plasmatic concentration profiles of free and encapsulated GMG-7. CONCLUSIONS

A new specific, accurate, and precise isocratic reverse-phase HPLC-DAD bioanalytical method was described for the determination of new TZD in mice plasma and application in Pk study.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was funded by Rede de Nanobiotecnologia-FAPEMIG and supported by the scholarship to the first author from INCT-if (MCT-CNPq).

REFERENCES

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