UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SARAH RAQUEL GOMES DE LIMA-SARAIVA

EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE ESPÉCIES DE BROMELIACEAE NATIVAS

DA CAATINGA: UM ESTUDO COMPARATIVO

RECIFE

2012




Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pernambuco, como parte das

exigências do Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof.ª Dr.ª Elba Lúcia

Cavalcanti de Amorim

Co-orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto

Guedes da Silva Almeida

RECIFE

2012

Lima-Saraiva

Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: um estudo comparativo / Sarah Raquel Gomes de Lima-Saraiva. – Recife: O Autor, 2012.

210 folhas: il., fig.; tab. Graf.30 cm.

Orientador: Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2012.

Inclui bibliografia, anexo e apêndice.

1. Atividade Antinociceptiva. 2.Bromeliaceae.

3.Toxicidade Aguda. 4. Toxicologia. I. Amorim, Elba Lúcia

Cavalcanti de. II. Título.

UFPE

615.4 CDD (20.ed.) CCS2012-036




Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pernambuco, como parte das

exigências do Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

APROVADA: 24 de fevereiro de 2011.

_________________________________________________

Prof.: Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

(Co-orientador)

(UNIVASF)

_________________________________________________

Prof.: Dra. Jane Sheila Higino

(1° Examinador)

(UFPE)

_________________________________________________

Prof.: Dra. Terezinha Gonçalves da Silva

(2° Examinador)

(UFPE)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Reitor

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Vice-Reitor

Prof. Dr. Sílvio Romero de Barros Marques

Pró-Reitor para assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos

Diretor do Centro de Ciências da Saúde- CCS

Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde- CCS

Profa. Dra. Vânia Pinheiro Ramos

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Prof. Dr. Dalci José Brondani

Vice- Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas

Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães

Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas

Profª. Drª. Ana Cristina Lima Leite

Dedico este trabalho aos meus familiares, e em

especial, aos meus pais Antônio Francisco e

Maria da Conceição e ao meu esposo

Henrique Saraiva que me apoiaram em todos

os momentos, sempre com muito amor e carinho.

AGRADECIMENTOS

Grande é a minha lista de agradecimentos, e por isso me considero uma

pessoa de sorte. Primeiramente, agradeço a Deus, o meu supremo guia e

protetor, que está sempre presente em minha vida.

À minha orientadora, a professora Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de

Amorim por ter me aceito como aluna. Sem ela não teria concretizado este

trabalho.

Ao Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, o meu co-

orientador, agradeço não só pela oportunidade e atenção, mas também pela

valiosa orientação. Sua competência e dedicação servirão sempre de exemplo

para mim. A ti, o meu profundo respeito e admiração!

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, e a

todos os professores que de alguma forma contribuíram para minha formação.

A Antônio Francisco de Lima e Maria da Conceição Gomes de Lima,

meus pais, que são os pilares da minha vida, sempre me proporcionaram

educação, mesmo com dificuldades. E se cheguei até aqui, foi fruto de

sacrifício e renúncia deles. Eles são para mim exemplo de perseverança. Só

tenho a agradecer por isso.

Ao meu companheiro de todas as horas, meu esposo Henrique César

Costa Saraiva, obrigada por todo o carinho, amor, paciência, compreensão,

pelo incentivo diário, pelas noites e fins de semana perdidos comigo no

laboratório e principalmente pela mão amiga que esteve presente nos

momentos de angústia sempre me confortando e me fazendo acreditar que eu

sou capaz. Eu só tenho a agradecer por você existir em minha vida. Amo-te,

muito!

A todos da minha linda Família, Tias, Tios, Primos e em especial aos

meus irmãos, Lívia, Guilherme e Pedro Henrique.

À UNIVASF e ao Magnífico Reitor o Dr. Julianeli Tolentino de Lima,

gostaria de agradecer de maneira especial pelo acolhimento e apoio

concedido.

A todos do Colegiado de Ciências Farmacêuticas (UNIVASF), e aos

professores, principalmente ao Professor Dr. Luciano Ribeiro.

Ao Professor MSc. Fabrício Souza Silva, pela ajuda na realização do

estudo da toxicidade aguda.

À professora Dra Maria Helena Tavares de Matos, e as alunas Vanessa

Raquel Pinto de Barros e Vanúsia Gonçalves Menezes, pela confecção e

coloração das lâminas.

Aos professores, Dr. Carlos Eduardo de Queiroz Lima, Dr. Diógenes

Luiz da Mota e Dr. Ricardo Santana de Lima, pela análise histopatológica.

Ao CRAD/UNIVASF na pessoa do Professor Dr. José Alves de

Siqueira Filho, pela sugestão das espécies para estudo.

Ao Prof. Alexsandro Branco, da Universidade Estadual de Feira de

Santana (UEFS), pela obtenção dos cromatogramas.

Ao Botânico André Paviotti Fontana, pela identificação do material

botânico.

Aos Técnicos: Silvio Alan, Anne, Leonardo e Fernando pela ajuda e

amizade, e principalmente a Roniere A. Oliveira pela contribuição nas análises

hematológicas e bioquímicas do sangue dos animais.

Ao pessoal do biotério Leonardo, Euda e Elenildo, quanta gratidão.

À Francisca e Sr. Cícero sempre me proporcionando alegria até na

hora de ir buscar as chaves do laboratório.

A todos do Laboratório de Produtos Naturais (LAPRONAT),

principalmente a Dani Cabral, Valéria, Valerium, Tadeu e Tiago.

A todos do Núcleo de Estudos e Pesquisa de Plantas Medicinais,

(NEPLAME) e aos meus colegas de laboratório, Camila Araújo, Clara

Rafaela, Grasielly Rocha, Raimundo Júnior, Pedro Guilherme e Tâmara

Diniz, e principalmente às técnicas Amanda e Ana Paula.

À Alessandra Gomes Marques Pacheco, pela enorme ajuda e

amizade.

Aos colegas de Turma, Rayana Muniz, Larissa Rolim, Magna

Vanessa, Pablo, Januária, Otávio, Danilo, Bruno, Iggor, Luise Lopes,

Hugo, Rafinha e Vitória.

Ao amigo Wagner Reis (padre), pelas orações e apoio físico e espiritual

concedido.

Por último, mas não em último, agradeço imensamente a minha amiga

Juliane Cabral Silva, a minha companheira de laboratório, e sem a qual não

teria terminado os experimentos. Eu gosto de você de graça, te levarei comigo

para sempre. Simplesmente obrigada!

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento e Científico e Tecnológico

(CNPq), pela bolsa de mestrado e pelo auxílio financeiro (Processo 476770/

2010-6).

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de

Pernambuco (FACEPE) pelo auxílio financeiro (Processo APQ-0542-4.03/10).

Agradeço a todos que contribuíram de forma direta ou indiretamente

com mais essa conquista.

Muito obrigada!

“No meu mundo não há fadas,

mas a mão de Deus me alcança.”

(Pe Fábio de Melo)

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: x um estudo comparativo.

RESUMO

Bromeliaceae é uma família de monocotiledôneas de grande importância pela sua

diversidade ecológica. Possui 57 gêneros e cerca de 3.000 espécies, das quais 40%

podem ser encontradas no Brasil. A família apresenta uma longa história de uso

etnobotânico, como fonte de fibras, alimentos e medicamentos. Foram selecionadas

para o estudo três espécies de Bromeliaceae, Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH),

Encholirium spectabile (Es-EtOH) e Bromelia laciniosa (Bl-EtOH), todas com domínio

fitogeográfico na caatinga. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo

do extrato etanólico bruto dessas espécies em camundongos, utilizando estímulos

químicos (teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético e teste da

formalina) e térmico (teste da placa quente), bem como realizar o estudo de

toxicidade aguda, a fim de assegurar a utilização dos extratos e servir de parâmetros

para o desenvolvimento de futuros medicamentos. Quanto à atividade

antinociceptiva, os extratos demonstraram efeito em todos os ensaios experimentais.

Nv-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente o comportamento

nociceptivo dos animais no teste das contorções abdominais. Este extrato também

reduziu o tempo em que os animais lamberam a pata na 1ª e 2ª fase do teste da

formalina, além de aumentar o tempo de permanência dos animais na placa quente,

efeito este que foi revertido pela naloxona, sugerindo a participação dos receptores

opióides no mecanismo de ação do extrato. Es-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.)

reduziu significativamente as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. O

extrato também mostrou efeito significativo em reduzir o tempo de lambida em

ambas as fases do teste da formalina. Já no teste da placa quente, a administração

de Es-EtOH não alterou o tempo de permanência dos animais sobre a placa quente,

sugerindo para o extrato um possível mecanismo de ação periférico. Bl-EtOH (100,

200 e 400 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente o número de contorções no teste

das contorções abdominais. Este extrato também reduziu o tempo em que o animal

lambeu a pata na 1ª e 2ª fase do teste da formalina. Quando foi utilizado o teste

da placa quente, de uma maneira geral, a administração do extrato não induziu

alterações no tempo de latência, porém na dose de 100 mg/kg, no tempo de 60

minutos, o extrato apresentou aumento no tempo de latência. Esse efeito não foi

revertido pela naloxona. Este estudo mostrou que os extratos possuem atividade

antinociceptiva em diversos modelos experimentais. Porém, o mecanismo exato pelo

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xi um estudo comparativo.

qual exercem esse efeito ainda está sendo elucidado. Dessa forma, novos estudos

são necessários para se chegar ao mecanismo de ação exato, bem como quais

constituintes químicos são responsáveis pelo efeito antinociceptivo dos extratos. Na

avaliação da toxidade aguda, a administração dos extratos nas doses de 2 e 5 g/kg

pelas vias oral e intraperitoneal, respectivamente, não provocou morte nem

alterações significativas nos parâmetros bioquímicos e hematológicos do sangue,

assim, podemos considerar os extratos, de baixa toxicidade. Porém, de acordo com

a análise histopatológica dos órgãos dos animais tratados com os extratos, a

avaliação mostrou que houve algumas lesões, sobretudo no fígado e nos rins.

Assim, faz-se necessário a realização de outros ensaios de toxicidade sub-crônica e

crônica a fim de determinar o perfil de segurança dos extratos.

Palavras-chave: Atividade antinociceptiva, Bromelia laciniosa, Bromeliaceae,

Encholirium spectabile, Neoglaziovia variegata, Toxicidade aguda.

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xii um estudo comparativo.

ABSTRACT

Bromeliaceae is a family of monocotyledons of great importance for its ecological

diversity. It has 57 genera and about 3.000 species, of which 40% can be found in

Brazil. The family has a long history of ethnobotanical use as a source of fiber, food

and drugs. Were selected for study three species of Bromeliaceae, Neoglaziovia

variegata (Nv-EtOH), Encholirium spectabile (Es-EtOH) and Bromelia laciniosa (Bl-

EtOH), all with phytogeographic area in the caatinga. The aim of this study was to

evaluate the antinociceptive effect of crude ethanolic extract of these species in mice

using chemical stimuli (test of abdominal contortions induced by acetic acid and

formalin test) and thermal (hot plate test) and perform the acute toxicity study in order

to ensure the use of extracts and serve as guidelines for the development of future

medicines. As for antinociceptive activity, the extracts showed effects in all

experimental trials. Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg / kg, i.p.) significantly reduced

the nociceptive behavior of animals in the abdominal writhing test. This extract also

reduced the time the animals licked their paws in the 1st and 2nd phase of the

formalin test, in addition to increasing the length of stay of animals in the hot plate, an

effect that was reversed by naloxone, suggesting the involvement of opioid receptors

in the mechanism of action of the extract. Es-EtOH (100, 200 and 400 mg / kg, i.p.)

significantly reduced the action of acetic acid, used to induce abdominal contortions.

The extract also showed significant effect in reducing the duration of licking in both

phases of the formalin test. In the hot plate test, the administration of Es-EtOH did

not alter the length of stay of the animals on the hot plate, suggesting to extract a

possible peripheral mechanism of action. Bl-EtOH (100, 200 and 400 mg / kg, i.p.)

significantly reduced the number of contortions in the abdominal writhing test. This

extract also reduced the time the animal licked his paw in the 1st and 2nd phase of

the formalin test. When we used the hot plate test, in general, the administration of

the extract did not induce changes in the latency time, but at a dose of 100 mg / kg in

60 minutes, the extract showed an increase in latency time. This effect was reversed

by naloxone, suggesting the involvement of opioid receptors in the effect of the

extract. This study showed that the extracts have antinociceptive activity in several

experimental models. The exact mechanism by which exert this effect is still being

elucidated. Further studies are needed to reach the exact mechanism of action as

well as chemical constituents which are responsible for the antinociceptive effect of

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xiii um estudo comparativo.

the extracts. In the evaluation of acute toxicity, the administration of the extracts at

doses of 2 and 5 g / kg by oral and intraperitoneal routes, respectively, did not cause

death or significant changes in biochemical and hematological parameters of the

blood, so we can consider the extracts, low toxicity. However, according to the

histopathological analysis of organs from animals treated with the extracts, the

evaluation showed that there are some lesions, especially in the liver and kidneys.

Thus, it is necessary to further testing of sub-chronic and chronic toxicity to determine

the safety profile of the extracts.

Keywords: Acute toxicity, Antinociceptive activity, Bromelia laciniosa, Bromeliaceae,

Encholirium spectabile, Neoglaziovia variegata.

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xiv um estudo comparativo.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 01 - Desenho esquemático do nociceptor 34

Figura 02 - Terminações nervosas livres, Fibras Aδ e C 35

Figura 03 - Via nociceptiva de transmissão da dor 36

Figura 04 - Representação esquemática da percepção da dor 38

Figura 05 - Processo de dor inflamatória resultante de lesão tecidual 39

Figura 06 - Representação esquemática do processo fisiopatológico

da reação inflamatória 39

Figura 07 - Distribuição fitogeográfica de Neoglaziovia variegata 44

Figura 08 - Foto de Neoglaziovia variegata 45

Figura 09 - Distribuição fitogeográfica de Encholirium spectabile 46

Figura 10 - Foto de Encholirium spectabile 46

Figura 11 - Distribuição fitogeográfica de Bromelia laciniosa 47

Figura 12 - Foto de Bromelia laciniosa 48

Figura 13 - Cromatograma do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata obtido

por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo

de diodo (CLAE-DAD) em 322 nm 61

Figura 14 - Cromatograma do extrato etanólico de Encholirium spectabile obtido



LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xv um estudo comparativo.

Figura 15 - Cromatograma do extrato etanólico de Bromelia laciniosa obtido



Figura 16 - Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata no modelo de

contorções abdominais induzidas por ácido acético. 64

Figura 17 - Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata na primeira e

segunda fase do teste da formalina. 65

Figura 18 - Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata no teste da

placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração 66

Figura 19 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Nv-EtOH

durante 14 dias 68

Figura 20 - Consumo de líquido pelos animais tratados com Nv-EtOH

durante 14 dias 68

Figura 21 - Ganho de peso dos animais tratados com Nv-EtOH durante 14

dias 69

Figura 22 - Fotomicrografias do histopatológico de rim de animais

representativos do extrato da N.variegata 72

Figura 23 - Fotomicrografias do histopatológico de fígado de animais

representativos do extrato de N.variegata 72

Figura 24 - Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile no

modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético 73

Figura 25 - Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile na primeira

e segunda fase do teste da formalina 75

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xvi um estudo comparativo.

Figura 26 - Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile no teste da

placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração 76

Figura 27 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Es-EtOH

durante 14 dias 77

Figura 28 - Consumo de líquido pelos animais tratados com Es-EtOH

durante 14 dias 78

Figura 29 - Ganho de peso dos animais tratados com Es-EtOH durante 14

dias 79

Figura 30 - Fotomicrografias do histopatológico de fígado do animal

tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.) 80

Figura 31 - Fotomicrografias do histopatológico de rim do animal

tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.) 80

Figura 32 - Fotomicrografias do histopatológico de pulmão do animal

tratado com Es-EtOH (5 g/kg, v.o.) 81

Figura 33 - Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa no modelo de

contorções abdominais induzidas por ácido acético 82

Figura 34 - Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa na primeira e

segunda fase do teste da formalina 83

Figura 35 - Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa no teste da placa

quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração 84

Figura 36 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Bl-EtOH

durante 14 dias 86

Figura 37 - Consumo de líquidos pelos animais tratados com Bl-EtOH

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xvii um estudo comparativo.

durante 14 dias 87

Figura 38 - Ganho de peso dos animais tratados com Bl-EtOH durante 14

dias 88

Figura 39 - Fotomicrografias do histopatológico de fígado do animal

tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.) 90

Figura 40 - Fotomicrografias do histopatológico de rim do animal

tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.) 91

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xviii um estudo comparativo.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários dos extratos das três espécies

de Bromeliaceae por cromatografia em camada delgada 52

Tabela 2 - Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das três

espécies da família Bromeliaceae 60

Tabela 3 - Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados

com o extrato etanólico bruto de Neoglaziovia variegata

(toxicidade aguda) 70

Tabela 4 - Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos

tratados com o extrato etanólico bruto de Neoglaziovia

variegata (toxicidade aguda) 71

Tabela 5 - Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados

com extrato etanólico bruto de Bromelia laciniosa

(toxicidade aguda) 89

Tabela 6 - Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos

tratados com o extrato etanólico bruto de Bromelia

laciniosa (toxicidade aguda) 90

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xix um estudo comparativo.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Aα Fibras do tipo A alfa

Aβ Fibras do tipo A beta

Aδ Fibras do tipo A delta

AAS Ácido acetilsalicílico

AINES Anti-inflamatório não esteroidais

ALT Alanina aminotrasnferase

AMPc Monofosfato cíclico de adenosina

ANOVA Análise de variância

AST Aspartato aminotransferase

Bl-EtOH Extrato etanólico de Bromelia laciniosa

CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

COX Enzima cicloxigenase

CRAD Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga

DAD Detector de arranjo de diodo

Es-EtOH Extrato etanólico de Encholirium spectabile

HCM Hemoglobina corpuscular média

HVASF Herbário do Vale do São Francisco

IASP “ International Association for the Study of Pain “

i.pl. Intraplantar

LOX Enzima lipoxigenase

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xx um estudo comparativo.

Morf. Morfina

NLX Naloxona

NMDA N-metil-D-aspartato

Nv-EtOH Extrato etanólico de Neoglaziovia variegata

PKA Proteína quinase A

PKC Proteína quinase C

TGO Transaminase glutâmico oxalacética

TGP Transaminase glutâmico pirúvica

TNF Fator de necrose tumoral

VCM Volume corpuscular médio

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxi um estudo comparativo.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ………….…………..........…………….…………………….….......... 27

2 OBJETIVOS .…….………………………..........……………………………….…....... 30

2.1 Objetivo geral ..……………….………….……........……………………….…....... 31

2.2 Objetivos específicos .…………………...........……………………..…….…....... 31

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .…………………..........………………………....... 32

3.1 Considerações sobre a dor .……………….….………..........………………....... 33

3.1.1 Dor e nocicepção ................……………….….……………….........………........ 33

3.1.2 Nociceptores .......................……………….….……………………..........…....... 33

3.1.3 Fibras e vias nociceptivas ...……………….….………………………................. 34

3.1.4 Mecanismo da dor central .....………….........……………………………..….......36

3.1.5 Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória ................................................ 37

3.2 Considerações sobre analgesia ……………………….........…….…….….........40

3.2.1 Analgesia e vias da analgesia ………………………..........................................40

3.2.2 Drogas analgésicas ………………………........................................................41

3.3 Considerações sobre a família e sobre as espécies selecionadas para o

estudo........................................................................................................................42

3.3.1 Considerações sobre a família Bromeliaceae ……………………..…................42

3.3.2 Considerações sobre a espécie Neoglaziovia variegata .............…………..….44

3.3.3 Considerações sobre a espécie Encholirium spectabile …………............…….45

3.3.4 Considerações sobre a espécie Bromelia laciniosa ……………...……….........47

4 PARTE EXPERIMENTAL ……………………………………………….......…...........49

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxii um estudo comparativo.

4.1 Material vegetal…………………………….........…………………………...………50

4.1.1 Neoglaziovia variegata…………………………..........…………………………….50

4.1.2 Encholirium spectabile…………………………………..........…………………….50

4.1.3 Bromelia laciniosa………………………………………………..........……….……50

4.2 Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) das folhas das espécies

selecionadas………………………………………………………….........…….......51

4.3 Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos….….…..........51

4.4 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)………...............53

4.5 Animais…………………………………………………………………….….............54

4.6 Testes de atividade antinociceptiva………………….....……………..…...........54

4.6.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético …...….............54

4.6.2 Teste da formalina……………………………………………………….............….54

4.6.3 Teste da placa quente…………………………………………………...…............55

4.7 Toxicidade aguda …………………….…………………………………...…...........55

4.7.1 Triagem comportamental………………………………………………...…...........56

4.7.2 Análises dos parâmetros hematológicos e bioquímicos………….................….56

4.7.3 Análise histopatológica dos órgãos………………………………...……..............56

4.8 Análise estatística…………………………………..........……………………..…...57

5 RESULTADOS........................................................................................................58

5.1 Triagem fitoquímica. ……………………….........................................................59

5.2 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)..........................60

5.2.1 Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata...................60

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxiii um estudo comparativo.

5.2.2 Análise em CLAE do extrato etanólico de Encholirium spectabile....................61

5.2.3 Análise em CLAE do extrato etanólico de Bromelia laciniosa...........................62

5.3 Resultados de Neoglaziovia variegata ….....................………….…………........63

5.3.1 Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata. …..........…………….......63

5.3.1.1 Contorções abdominais induzidas por ácido acético ……..........………....…63

5.3.1.2 Teste da formalina.... ………….…………….......…………….......................…64

5.3.1.3 Teste da placa quente “Hot plate” ……….………………................................66

5.3.2 Toxicidade aguda de Neoglaziovia variegata …..........……………………........67

5.3.2.1 Avaliação comportamental ………………………............................................67

5.3.2.2 Consumo de alimento e água ….……………………......................................67

5.3.2.3 Variação do peso corporal. ………………………...........................................68

5.3.2.4 Parâmetros hematológicos. ………………………..........................................69

5.3.2.5 Parâmetros bioquímicos. ………………………..............................................70

5.3.2.6 Avaliação histopatológica ………….…………….............................................71

5.4 Resultados de Encholirium spectabile …….............…………………..................73

5.4.1 Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile …………………...............73

5.4.1.1 Contorções abdominais induzidas por ácido acético ……………..................73

5.4.1.2 Teste da formalina ………………………........................................................74

5.4.1.3 Teste da placa quente “Hot plate” ……………………….................................76

5.4.2 Toxicidade aguda de Encholirium spectabile ……….………………..................76

5.4.2.1 Avaliação comportamental dos camundongos ……………………….............77

5.4.2.2 Consumo de alimento e água ….……………………......................................77

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxiv um estudo comparativo.

5.4.2.3 Variação do peso corporal ………………………............................................78

5.4.2.4 Avaliação histopatológica. ………….……………............................................79

5.5 Resultados de Bromelia laciniosa ............……………………….........................81

5.5.1 Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa ………………………..............81

5.5.1.1 Contorções abdominais induzidas por ácido acético ….………………..........81

5.5.1.2 Teste da formalina ………………………........................................................82

5.5.1.3 Teste da placa quente “Hot plate” .....……………………...............................84

5.5.2 Toxicidade aguda de Bromelia laciniosa ………………………..........................85

5.5.2.1 Avaliação comportamental dos camundongos ……………………….............85

5.5.2.2 Consumo de alimento e água ……………………….......................................85

5.5.2.3 Variação do peso corporal. ………………………...........................................87

5.5.2.4 Parâmetros hematológicos. ………………………..........................................87

5.5.2.5 Parâmetros bioquímicos ………………………...............................................88

5.5.2.6 Avaliação histopatológica ………………………..............................................89

6 DISCUSSÕES.........................................................................................................92

6.1 Triagem fitoquímica e análise dos extratos por CLAE ........................................93

6.2 Efeito antinociceptivo ...........................................................................................93

6.3 Toxicidade aguda ................................................................................................97

7 CONCLUSÃO.......................................................................................................102

8 REFERÊNCIAS ....................................................................................................104

APÊNDICES ............................................................................................................111

APÊNDICE A – Artigo I ..........................................................................................112

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxv um estudo comparativo.

APÊNDICE B – Artigo II .........................................................................................133

APÊNDICE C – Artigo III ........................................................................................159

APÊNDICE D – Artigo IV ........................................................................................169

ANEXOS..................................................................................................................203

ANEXO A – Carta de submissão dos artigos .........................................................204

ANEXO B – Tabela de triagem comportamental ....................................................208

ANEXO C – Certificado de aprovação do comitê de ética......................................209

ANEXO D – Certificado ..........................................................................................210

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: x um estudo comparativo.

1. INTRODUÇÃ O

LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 28 um estudo comparativo.

1. INTRODUÇÃO

Ao longo da história, o homem tem sido atormentado pela dor, e as causas e

os tratamentos para os estados dolorosos foram buscados desde as mais primitivas

civilizações (CARVALHO, 1999). Dessa forma, o alívio da dor tem sido uma

preocupação constante, e em relação aos processos dolorosos, as plantas

medicinais têm sido, com frequência, a melhor das opções de tratamento para a

população de baixa renda.

Ademais, é inegável que os mais potentes e eficazes medicamentos

analgésicos são derivados de plantas, a exemplo da salicinina, por um lado, que por

algum tempo foi usada para combater a dor e mais tarde serviu como base para a

síntese do ácido acetilsalicílico, em 1899, como também, por outro lado, o ópio, que

é originário da Papaver somniferum, uma planta popularmente conhecida como

“papoula” e de onde foi obtida a morfina, substância com potente atividade

analgésica (VOHORA; DANDIYA, 1992).

Entretanto, muitos tipos de dores, especialmente dores crônicas, apresentam

terapêutica de difícil utilização devido aos efeitos colaterais oriundos do tratamento.

Desta forma, a pesquisa de princípios ativos isolados de plantas medicinais com

propriedades analgésicas continua sendo uma constante (CALIXTO et al., 2000;

CARLINI, 2003).

O Brasil destaca-se no ranking mundial de países “megadiversos” e é

considerado o país de maior diversidade biológica (PEIXOTO; MORIM, 2003). Abriga

cerca de 14% da diversidade de plantas do mundo, e estima-se em 49 mil o número

de espécies de plantas descritas (SHEPHERD, 2002; LEWINSOHN; PRADO, 2002).

Dentre os biomas brasileiros, a Caatinga, embora seja a área menos estudada

dentre as regiões naturais brasileiras, merece destaque, pois é a única grande

região natural brasileira cujos limites estão inteiramente restritos ao território

nacional, além de possuir uma proporção expressiva de plantas endêmicas, sendo,

diversas destas, comumente utilizadas pela população por suas propriedades

terapêuticas e representando, assim, uma importante fonte de recursos naturais.

Contrastando com a sua relevância biológica, o bioma da Caatinga pode ser

considerado um dos ambientes naturais mais ameaçados do Brasil (LEAL et al.,

2005).


As três espécies selecionadas para este estudo (Neoglaziovia variegata,

Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa) pertencem à família Bromeliaceae, e

todas possuem o seu domínio fitogeográfico na caatinga. Estas plantas foram

incluídas, juntamente a outras plantas, no “Centro de Recuperação da Flora nas

Áreas Prioritárias da Bacia do Rio São Francisco – O Bioma Caatinga”, programa de

referência em conservação vegetal, e pouco se conhece acerca da etnofarmacologia

dessas espécies (CARVALHO et al., 2010).

A família Bromeliaceae fascina pela exuberância, diversidade e beleza das

suas espécies (ROCHA, 2010) e, apesar de possuir várias aplicabilidades e possuir

um inegável potencial econômico, poucas espécies desta família foram estudadas,

química e farmacologicamente até o momento.

Nesse contexto, o estudo farmacológico da atividade antinociceptiva de

plantas da família Bromeliaceae é de grande importância, bem como o estudo de

sua toxicidade, a fim de assegurar sua utilização e servir de parâmetros para o

desenvolvimento de futuros medicamentos. Assim, haverá uma maior estruturação

no conhecimento a respeito destes vegetais, espécies tão próximas dos nordestinos

sertanejos da caatinga e indispensáveis para sua sobrevivência.


2. OBJETIVOS


2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Contribuir para o estudo farmacológico de espécies de plantas da família

Bromeliaceae do semiárido (bioma caatinga): Neoglaziovia variegata, Encholirium

spectabile e Bromelia laciniosa.

2.2. Objetivos específicos

- Realizar triagem fitoquímica para a identificação das principais classes de

constituintes químicos;

- Avaliar o potencial antinociceptivo das espécies Neoglaziovia variegata,

Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa da família Bromeliaceae;

- Avaliar o perfil de segurança, através do estudo de toxicidade aguda do extrato

etanólico bruto das espécies;

- Realizar um estudo comparativo com os resultados das plantas avaliadas;

- Contribuir para a farmacologia da família Bromeliaceae, fornecendo subsídios para

estudos posteriores, visando ao isolamento dos constituintes químicos bioativos.


3. FUNDÃMENTÃÇÃ O

TEO RICÃ


3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Considerações sobre a dor

3.1.1. Dor e Nocicepção

A dor é um sintoma muito importante para a sobrevivência do homem, é

necessária e tão imprescindível que a “American Pain Society” insere a dor como

sendo o quinto sinal vital, tão indispensável quanto os outros: temperatura, pulso,

respiração e pressão arterial. Esses quatro sinais são facilmente mensuráveis e

desde muito tempo fazem parte de uma conduta já automatizada e universal. Mas a

dor não pode ser objetivamente determinada, pois, é considerada como uma

experiência subjetiva e pessoal (SOUZA, 2002).

O significado da palavra “dor” denota sofrimento, que vem do latim dolore. Na

literatura a dor é definida de várias formas, e habitualmente é descrita pela

Associação Internacional para Estudos da Dor (IASP) como uma “experiência

sensorial e emocional desagradável associada à lesão tecidual real ou potencial, e

descrita em função de tal” (WIESENFELD-HALLIN, 2005; COSTA et al., 2007; PRO;

GARZA, 2010).

Os fisiologistas distinguem os termos dor e nocicepção, onde a dor é uma

experiência emocional desagradável, enquanto a nocicepção se caracteriza como

sendo um mecanismo pelo qual os estímulos nocivos chegam ao sistema nervoso

central. Assim, quando se trata de animais, o termo correto a ser utilizado é

nocicepção, já que há dificuldade de se avaliar o caráter subjetivo da dor nestes

sujeitos.

3.1.2. Nociceptores

Os nociceptores (Figura 1), de acordo com Fein (2011) são neurônios, cuja

função básica é de transmitir informações sobre a lesão tecidual ocasionada por

estímulos nocivos, térmicos, mecânicos ou químicos. Várias possibilidades podem

explicar como estes diferentes estímulos resultariam na sensação de dor. A primeira

possibilidade é que os nociceptores individuais são sensíveis a todos esses

estímulos diferentes. A outra é que existem vários tipos de nociceptores, e cada um


é sensível a um estímulo específico, atualmente, contudo, se evidenciam ambas as

possibilidades.

Os chamados nociceptores foram descritos em quatro classes: os mecânicos,

térmicos, polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos respondem a

pressão intensa; os nociceptores térmicos respondem a temperaturas extremas,

quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C); já os nociceptores polimodais respondem aos

estímulos nocivos mecânicos, térmicos ou químicos. Os nociceptores silenciosos

são ativados por estímulos químicos, mediadores inflamatórios, e respondem a

estímulos mecânicos e térmicos somente depois de serem ativados (FEIN, 2011).

Figura 1. Desenho esquemático do nociceptor (FEIN, 2011; Disponível em:

http://www.dol.inf.br/nociceptores).

3.1.3. Fibras e vias nociceptivas

As fibras nociceptoras são terminações nervosas livres predominantemente

mielinizadas (Aδ, Aα, Aβ), e podem ser não-mielinizados (fibras C) (Figura 2)

(RUSSO; BROSE, 1998; MILLAN, 1997). Na maioria dos livros atuais se considera

que apenas as fibras nervosas de diâmetros menores e mais lentas são sentidas

como dor, as fibras C e Aδ e que transportam os sinais aferentes dos nociceptores.


Figura 2. Terminações nervosas livres, Fibras Aδ e C (Disponível em

www.xlsistemas.com - Miniatlas de Dor).

Os sinais dolorosos, por sua vez, são enviados para o cérebro por meio de

duas vias diferentes: o feixe neoespinotalâmico e o feixe paleoespinotalâmico. A

maior parte das fibras do feixe neoespinotalâmico se encaminha diretamente para o

tálamo, terminando no complexo ventrobasal. A partir dessas áreas, os sinais são

transmitidos para outras áreas basais do cérebro e para o córtex sensorial somático

(Figura 3). A via paleoespinotalâmica, por outro lado, é um sistema muito mais antigo

e transmite os sinais dolorosos conduzidos, principalmente, pelas fibras periféricas

de dor lenta do tipo C, cujo neurotransmissor liberado é a substância P (GUYTON;

HALL, 2011). Nas pontas dorsais da medula, onde as fibras nervosas periféricas

dessa via terminam, a maior parte dos sinais passa através de um ou mais

neurônios internunciais de fibras curtas. Os neurônios aí localizados originam

axônios longos que se juntam às fibras da via de dor rápida, passando para o lado

oposto da medula pela comissura anterior e se dirigindo para o cérebro pela mesma

via anterolateral.

http://www.xlsistemas.com/


Figura 3. Via nociceptiva de transmissão da dor (Disponível em www.xlsistemas.com

- Miniatlas de Dor).

3.1.4. Mecanismo da Dor Central

A lesão tecidual provoca a liberação de algumas substâncias, tais como:

glutamato, aspartato, substância P, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina,

somatostatina, neurocinina-A. Esses neurotransmissores se ligam a receptores

específicos e se relacionam com a ativação de potenciais pós-sinápticos excitatórios

(ROCHA, 2007). Esses receptores se localizam nas células posteriores da medula

espinhal e sua ativação se relaciona com a transmissão das fibras aferentes

nociceptivas, possivelmente as fibras Aδ e C (NEIRA; ORTEGA, 2004).

Após a liberação de aminoácidos excitatórios, peptídeos e neurotrofinas e sua

interação com receptores específicos, há a ativação de enzimas e segundos

mensageiros, como por exemplo, AMPc, PKA, PKC, fosfotidilinositol, fosfolipase C e

fosfolipase A2. Isto promove a abertura de canais para cálcio, e, conseqüentemente,



a produção de prostaglandinas e óxido nítrico. Isto estimula a liberação de

neurotransmissores excitatórios, glutamato e aspartato, no corno dorsal da medula

espinhal e produz a despolarização, ocorrendo, dessa forma, aumento da

condutividade ao cálcio e a resposta à dor.

3.1.5. Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória

A dor pode estar associada a diversos processos que geram danos, lesões,

respostas teciduais ou reações inflamatórias, levando às desordens do sistema

nervoso condutor, associados a estímulos sensoriais envolvidos na transdução dos

sinais dolorosos, que atuam nos nociceptores e permite a condução e a percepção

da dor. Neste contexto, há estímulos sensoriais próprios, tais como deformação

mecânica do tecido, e aumento ou diminuição da temperatura no tecido; existem

alterações locais no meio extracelular devido à liberação de substâncias do tecido

ferido, onde elas normalmente se encontram no meio intracelular; e há substâncias

liberadas como parte de uma resposta inflamatória no local da lesão(ROCHA, 2007).

As citocinas são peptídeos liberados no local da lesão por células do sistema

imunológico, atuando através de sinalização parácrina ou autócrina. Tais substâncias

influem sobre as células do sistema imunológico e controlam a produção e a

atividade de outras citocinas, maximizando ou minimizando a resposta inflamatória

(KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006).

Para que a dor seja percebida e interpretada pelo córtex cerebral, no sistema

nervoso central, ela, a dor, e transdutores de seu estímulo percorrem um longo

caminho até que finalmente seja compreendida. Dessa forma, tal estímulo percorre

uma trajetória que atravessa a medula e toda a extensão dos nervos periféricos,

interconectando os sistemas nervosos centrais e periféricos (FEIN, 2011). A origem

se dá nas extremidades das fibras nervosas periféricas, onde se localizam os

nociceptores, aonde agem os estímulos dolorosos térmicos, químicos e mecânicos

que, ao fim de todo processo, converge para a geração de um potencial de ação

nestas fibras, e a condução desse estímulo elétrico transduzido (Figura 4).


Figura 4. Representação esquemática do mecanismo de percepção da dor.

Assim, através desse processo, a dor de origem inflamatória atua por meio de

substâncias químicas (denominadas algiogênicas), como a acetilcolina, bradicinina,

histamina, serotonina, leucotrienos, substância P, fator de ativação plaquetário,

radicais, ácidos, íons potássio, prostaglandinas, tromboxanos, interleucinas, fator de

necrose tumoral (TNFα), fator de crescimento nervoso e monofosfato cíclico de

adenosina (AMPc); sensibilizando os nociceptores (ROCHA, 2007). O processo

inflamatório é necessário para se iniciar a reparação dos tecidos lesados, e é graças

a esse tecido que a inflamação ocorre, bem como a dor decorrente dela (Figura 5).


Figura 5. Processo de dor inflamatória resultante de lesão tecidual (Disponível em

www.xlsistemas.com - Miniatlas de Dor).

As células lesadas liberam enzimas intracelulares capazes de oxidar ácidos

graxos de cadeias longas no meio extracelular, originando como produtos as cininas,

As cininas compõem outras enzimas plasmáticas, ativadas pela inflamação e capaz

de originar a bradicinina - um importante componente da propagação inflamatória e

potente vasodilatador arteriolar, que aumenta a permeabilidade capilar (Figura 6).

Figura 6. Representação esquemática do processo fisiopatológico da reação

inflamatória.

A B



A fosfolipase A2, por sua vez, é uma enzima intramembranar cuja função e atuação

enzimática gera como produto, o ácido araquidônico intracelular. A partir daí, o ácido

poderá servir como substrato metabólico para três vias principais: a primeira é ser

metabolizado pela enzima cicloxigenase em três produtos, (prostanglandinas,

prostaciclinas e tromboxanos); a segunda é ser metabolizado pela enzima

lipoxigenase em leucotrienos e lipoxinas; e, por fim, pelo citocromo P450,

denominada via da epoxigenase (ROCHA, 2007). Esses compostos resultantes

diminuem o limiar de excitabilidade dos nociceptores, tornando-os mais sensíveis a

captação e a propagação dos estímulos dolorosos.

Em suma, ocorre um acúmulo de metabólitos do ácido araquidônico, em

especial as prostaglandinas e os leucotrienos, resultantes de uma agressão tecidual

inicial, e são responsáveis pela degranulação de mastócitos e ativação de fibras

nervosas, macrófagos e linfócitos, ocorrendo alterações na permeabilidade vascular,

fluxo sanguíneo e produzindo os cinco sinais flogísticos clássicos da inflamação: dor,

calor, rubor, edema e perda de função.

3.2. Considerações sobre analgesia

3.2.1. Analgesia e vias da analgesia

É muito variável o grau com que cada pessoa reage à dor. Isso resulta, em

parte, da capacidade que possui o próprio cérebro de controlar o grau de entrada

dos sinais dolorosos no sistema nervoso, pela ativação do sistema de controle da

dor, chamado sistema da analgesia (GUYTON; HALL, 2011).

O sistema da analgesia consiste em três componentes principais: a área

periaquedutal cinzenta que circunda o aqueduto de Sylvius. Os neurônios dessa

área enviam seus sinais até o núcleo magno da rafe, localizado na parte inferior da

ponte e na parte superior do bulbo, que recebe sinais provenientes dos neurônios

localizados na área cinzenta periaquedutal. Desse núcleo, os sinais são transmitidos

em direção à medula, pelas colunas dorsolaterais, para o complexo para a inibição

da dor localizado nas pontas dorsais da medula espinhal. Nesse ponto os sinais de

analgesia são capazes de bloquear os sinais dolorosos antes que eles cheguem ao

encéfalo.


Várias substâncias transmissoras estão envolvidas no sistema da analgesia,

especialmente a encefalina e a serotonina. Grande parte das fibras nervosas

provenientes, tanto dos núcleos periventriculares como da área cinzenta

periaquedutal, secretam encefalina por seus terminais. Dessa maneira, a maior parte

das terminações das fibras no núcleo magno da rafe libera encefalina. (GUYTON;

HALL, 2011). As fibras que se originam nesses núcleos e terminam nas pontas

dorsais da medula espinhal secretam serotonina por suas terminações. A serotonina

liberada atua, por sua vez, sobre grupos de interneurônios localizados na medula,

que, ao que parece, liberam encefalina. A encefalina parece causar inibição pré-

sináptica nas junções medulares das fibras de dor tipo C e Aδ. O mecanismo dessa

ação está provavelmente ligado ao bloqueio dos canais de cálcio nas membranas

das terminações nervosas. O bloqueio desses canais provoca diminuição na entrada

de íons cálcio nos terminais, com a conseqüente diminuição da quantidade de

transmissor liberado na sinapse. Portanto, o sistema da analgesia é capaz de

bloquear os sinais dolorosos em seus pontos de entrada na medula espinhal.

3.2.2. Drogas analgésicas

O analgésico tem a finalidade de aliviar a dor, podendo agir perifericamente

no local da dor, ou no sistema nervoso central, modificando o processamento dos

sinais que o cérebro recebe através dos nervos. O conceito de dor, que é o alvo de

atuação dos analgésicos é muito amplo, sendo difícil de ser definido (RANG et al.,

2007).

Os analgésicos já foram denominados narcóticos, hipnoanalgésicos,

narcoanalgésicos, termos que, atualmente, são considerados impróprios (GOZZANI,

1994 apud DUARTE, 2005), haja vista que o alívio ou o cessar da dor deverá ocorrer

sem perda da consciência. Atualmente existem diversas classes de fármacos

analgésicos disponíveis no mercado, que podem ser divididos em: analgésicos

periféricos, ou seja, os fármacos antiinflamatórios não esteroidais (AINES), como o

ácido acetilsalicílico (AAS) e a dipirona, inibidores da síntese das prostaglandinas,

que atuam diminuindo a sensibilidade das fibras aferentes primárias (RANG et al.,

2007). Há também analgésicos de ação central, também chamados opióides, a

exemplo da morfina, que tem como característica aumentar o limiar neuronal ao

estímulo nocivo ou até mesmo erradicar a sensação dolorosa (ALMEIDA, 2006).


Há casos especiais em que os analgésicos tradicionais não têm boa

atividade, como no caso de dor de origem neuropática (RANG et al., 2007),

necessitando, assim, de uma maior variedade de classes de analgésicos. Dessa

forma, a pesquisa por novos analgésicos tem sido prioridade para farmacologistas e

indústria farmacêutica, na tentativa de obter medicamentos mais eficazes e reduzir

os efeitos colaterais (ALMEIDA, 2006).

3.3. Considerações sobre a família Bromeliaceae e as espécies selecionadas

para estudo

3.3.1. Considerações sobre a família Bromeliaceae

A descrição desta família é atribuída ao padre francês Charles Plumier que,

no final do século XVII, se deparou com um conjunto de plantas diferentes e

resolveu batizá-las de bromélias, em homenagem ao botânico sueco Olaf Bromel.

Em 1789, foi estabelecida formalmente a reunião destas plantas, que se designou

por Bromelie (BENZING, 1980; MANETTI et al., 2009). Bromeliaceae é uma família

de monocotiledôneas de grande importância para a flora ecológica, e se destaca

pela grande diversidade genérica e específica, com 57 gêneros, 80% ocorrem no

território brasileiro, com 3.086 espécies (LUTHER, 2006). Estima-se que do total de

espécies, cerca de 40% podem ser encontradas no Brasil, colocando o país entre os

mais importantes em termos de diversidade na família (LEME, 1997). A família é

tradicionalmente dividida em três subfamílias: Pitcairnioideae, Tillandsioideae e

Bromelioideae (SMITH; DOWNS, 1974; BENZING, 2000).

A família Bromeliaceae apresenta uma longa história de uso etnobotânico,

associada aos povos americanos nativos, como fonte de fibras, alimentos, forragens

e medicamentos, além de uso ornamental e místico (BENNETT, 2000). Estas

categorias refletem, principalmente, antigas aplicações e percepções indígenas e

nem sempre coincidem com seu uso moderno (BENZING, 2000).

Muitas bromeliáceas ganharam popularidade entre paisagistas e jardineiros

justamente devido à beleza de suas formas e cores, durabilidade das

inflorescências, baixa demanda de cuidados e fácil adaptação a pequenos jardins

(BENZING, 2000).


Apesar do nome desta família estar intimamente associado às bromélias, o

abacaxi (Ananas comosus) é a espécie de Bromeliaceae mais conhecida, pelo seu

sabor e aromas marcantes, sendo o único desta família utilizado como fonte de

alimento. Seus frutos contêm a bromelina, uma enzima que os protege da

depredação por larvas de insetos, a qual apresenta grande valor comercial devido a

sua aplicabilidade na indústria farmacêutica (atividade anti-helmíntica,

antiinflamatória e anticancerígena) (MAURER, 1999) e na indústria alimentícia

(amaciante de carnes vermelhas, hidrolizante de complexos proteína-taninos, na

produção de cerveja, pães, leite de soja e ovos desidratados) (FREIMAN, 1999).

Além da bromelina, muitas outras enzimas já foram isoladas e identificadas de

diferentes bromeliáceas, as quais também apresentam grande potencialidade de ser

empregada nestes ou em outros segmentos industriais (VALLÉS et al., 2007).

Considerando o grande número de espécies da família Bromeliaceae, poucas

delas foram estudadas quimicamente até o momento. Apesar disto, há uma

quantidade considerável de compostos identificados, os quais pertencem

principalmente às classes dos triterpenóides e flavonóides. Outras classes de

compostos como esteróis, diterpenos, ácidos cinâmicos, gliceróis substituídos,

lignanas, compostos nitrogenados, entre outros, também foram identificados nesta

família, embora em número bastante reduzido (MANETTI et al., 2009). Do ponto de

vista farmacológico, também há poucos trabalhos descritos na literatura (MANETTI

et al., 2009). Dessa forma, estudos mostraram que o extrato de Nidularium procerum

apresentou propriedades anti-alérgicas (VIEIRA-DE-ABREU et al., 2005), bem como

propriedades analgésicas e anti-inflamatória (AMENDOEIRA et al., 2005), como

também foi demonstrada atividade antiulcerogênica em outros extratos de plantas da

família (CARVALHO et al., 2010).


3.3.2. Considerações sobre a espécie Neoglaziovia variegata

A espécie Neoglaziovia variegata Mez. é uma Bromeliaceae endêmica do

Brasil, conhecida popularmente como “caroá”, amplamente distribuída na região da

caatinga por todo o Semiárido do Nordeste brasileiro (RIBEIRO, 2007), e parte da

região Sudeste (Minas Gerais) (Figura 7) (FORZZA et al., 2011). Pode ser

encontrada no interior de matas mais fechadas até as áreas mais abertas, em solos

compactos e pouco profundos. Esta planta possui folhas longas que medem de 100

a 200 cm, com espinhos nos bordos curvados para o ápice da folha, nervuras

paralelinérveas, face adaxial esparsamente pruinosa-lepidota, face abaxial glabra,

verde com manchas irregulares cinza; inflorescência de 18 a 30 cm, racemosa,

ereta, multiflora e flores pedicelada 1 cm, com pétalas avermelhadas e anteras

amarelas.

Figura 7. Distribuição fitogeográfica de Neoglaziovia variegata (Disponível em

http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2011).

O caroá apresenta potencialidades econômicas centradas nas folhas, as

quais se constituem de fibras de alta resistência e na década de 40, o extrativismo

do caroá alcançou níveis mais significativos (PEREIRA; QUIRINO, 2008). Nessa

época a espécie foi bastante importante para a economia nordestina, porém, sua

exploração foi abandonada com o surgimento das fibras sintéticas (RIBEIRO, 2007).

Atualmente, as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de emprego

e renda para diversas famílias nordestinas, com a fabricação artesanal de chapéus,

bolsas, entre outros produtos.

http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2011/


Figura 8. Foto de Neoglaziovia variegata (ARAÚJO; CARVALHO-SOBRINHO, 2009)

Disponível em: http://www.univasf.edu.br/~hvasf

3.3.3. Considerações sobre a espécie Encholirium spectabile

O gênero Encholirium é exclusivamente brasileiro, possui diversas espécies, e

a Encholirium spectabile Mart. é a mais conhecida do gênero, devido à freqüência

com que é encontrada nos afloramentos rochosos ao longo de toda a caatinga

brasileira, com a mais ampla distribuição geográfica dentro do gênero, ocorrendo por

quase toda a Região Nordeste do Brasil e tem como limite sul a região de Milagres,

na Bahia, e ao norte o município de Buriti dos Lopes, no Piauí (FORZZA, 2005).

Esta planta possui vários domínios fitogeográficos, e pode ser localizada na

transição da Caatinga-Cerrado e Caatinga-Mata Atlântica (Figura 9) (FORZZA et al.,

2010).

A espécie Encholirium spectabile Mart. é uma Bromeliaceae endêmica do

Brasil conhecida popularmente como “Macambira de flecha” (SIQUEIRA-FILHO;

LEME, 2006).

A planta possui de 1,2 a 2,5 m de altura, formando grande touceira, o rizoma

apresenta ramificações laterais com roseta de 0,5 a 1,1 m de diâmetro. Esta espécie

ainda se caracteriza por possuir folhas ereto-patentes com bainha foliar de 25 a 84

cm de comprimento e 2,2 a 4,7 cm de largura cuja face abaxial e adaxial cinéreas de

http://www.univasf.edu.br/~hvasf


coloração muito variada, são carnosas, densamente espinhosas, com acúleos de 0,6

a 1,2 cm de comprimento. (FORZZA, 2005).

Figura 9. Distribuição fitogeográfica de Encholirium spectabile (Disponível em


A planta também possui uma haste floral fibrosa, dura, cilíndrica, e sua

inflorescência pode atingir até 1,8 m de comprimento, cujas flores possuem um

cálice verde, corola amarelada e estames amarelos. Esta planta é comumente

utilizada como planta ornamental, e como forrageira. Na literatura há relato sobre a

atividade farmacológica da espécie, pois o extrato de Encholirium spectabile

apresentou uma excelente atividade antiulcerogênica (CARVALHO, 2010).

Figura 10. Foto de Encholirium spectabile (SIQUEIRA-FILHO, 2009) Disponível em:





3.3.4. Considerações sobre a espécie Bromelia laciniosa

Bromelia laciniosa Mart. ex Shult. é uma planta da família das Bromeliaceae

conhecida popularmente como “macambira”, “macambira de porco” e “macambira de

cachorro”, está presente nas áreas secas do Nordeste, desde a Bahia até o Piauí, e

é utilizada na alimentação nos longos períodos de seca, na região do semiárido

nordestino (Figura 11) (FORZZA et al., 2010).

Figura 11. Distribuição fitogeográfica de Bromelia laciniosa (Disponível em


As espécies do gênero Bromelia podem ser reconhecidas por possuírem

folhas com acúleos curvos, bainha foliar coberta por tricomas muitas vezes lineares,

pétalas carnosas e unidas ao tubo estaminal, apêndices petalíneos ausentes e

sementes nuas (SMITH; DOWNS, 1979 apud MONTEIRO, 2009). Possuem raízes

finas, caule de forma cilíndrica e folhas com presença de espinhos, dispostas em

roseta em torno do caule (constituídas de duas partes distintas: base dilatada e

limbo), acumula água, possui raiz tipo fasciculada e, por conta dessa característica,

pode ser utilizada no combate à erosão (ANGELIM, 2007).

O tamanho da planta é variado, e o seu fruto é uma baga de três a cinco

centímetros de comprimento e diâmetro, variando de 10 a 20 milímetros. Quando

maduras, as bagas são amarelas, lembrando um cacho de pequenas bananas. A

macambira cresce debaixo de outras árvores ou nas clareiras.



Figura 12. Foto de Bromelia laciniosa (SOBRINHO, 2009; FONTANA, 2010)

Disponível em: http://www.univasf.edu.br/~hvasf

É aproveitada na alimentação dos animais (ou até mesmo do homem) durante

os longos períodos de seca. Da base das folhas é extraída uma massa, da qual se

fabrica um tipo de pão.

A B. laciniosa é uma espécie que pouco se tem referências, apesar de ser

vista como uma das alternativas oferecidas pela Caatinga, para pequenos criadores

do Nordeste como complementação alimentar de suas criações (caprinos, ovinos e

suínos) e, assim, durante o período de estiagem, reduzir seus custos através de um

manejo adequado e sustentável. Ela possui na sua parte aérea, 4,9% de proteína

bruta, 2,8% de amido e 1,1% de cálcio (MANERA, 2001; ANGELIM, 2007).

Tendo em vista a ampla distribuição dessas espécies no bioma

caatinga e a ausência de estudos químicos e farmacológicos, esse trabalho

apresenta pela primeira vez, os resultados da avaliação da atividade antinociceptiva

de Neoglaziovia variegata, Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa. Assim,

pretendemos fornecer informações a respeito das propriedades farmacológicas

dessas espécies, visando à realização de novos estudos nas áreas de química e

farmacologia, bem como contribuir para a conservação e manejo sustentável das

mesmas na região do semiárido, bioma Caatinga.



4. PÃRTE EXPERIMENTÃL


4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Material vegetal

4.1.1. Neoglaziovia variegata

As folhas de Neoglaziovia variegata foram coletadas no município de

Petrolina, Estado de Pernambuco em janeiro de 2010. O material botânico foi

identificado pelo biólogo André Paviotti Fontana do Centro de Referência para

Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da planta

está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade

Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o código 6441.

4.1.2. Encholirium spectabile

As folhas de Encholirium spectabile foram coletadas no município de

Petrolina, Estado de Pernambuco em janeiro de 2010. O material botânico foi

identificado pelo biólogo André Paviotti Fontana do Centro de Referência para

Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da planta

está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da UNIVASF sob o

código 6443.

4.1.3. Bromelia laciniosa

As folhas de Bromelia laciniosa foram coletadas no município de Petrolina,

Estado de Pernambuco em Janeiro de 2010. O material botânico foi identificado pelo

biólogo André Paviotti Fontana do Centro de Referência para Recuperação de Áreas

Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da planta está depositada no

Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da UNIVASF sob o código 6442.


4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) das folhas das espécies

selecionadas

O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração fracionada

com etanol 95%. Foram realizadas 4 extrações com intervalos de 72 horas entre

cada extração. A solução foi filtrada e concentrada em evaporador rotatório. Após

evaporação do solvente em rotavapor, obteve-se o extrato etanólico bruto das

plantas estudadas. A partir de:

- 1.174 g do pó seco de Neoglaziovia variegata foi obtido 45 g do extrato

etanólico bruto (3,83% de rendimento em relação ao peso seco da planta).

- 1.196 g do pó seco de Encholirium spectabile foi obtido 64 g do extrato

etanólico bruto (5,35% de rendimento em relação ao peso seco da planta).

- 874 g do pó seco de Bromelia laciniosa foi obtido 39 g do extrato etanólico

bruto (4,39% de rendimento em relação ao peso seco da planta).

4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos

Os extratos foram avaliados em placas cromatográficas de sílica gel com

suporte de alumínio, aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de

solventes, conforme descrito por Wagner e Bladt (1996), procurando-se evidenciar

os principais grupos do metabolismo secundário (Tabela 1).


Tabela 1. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários dos extratos das três espécies de Bromeliaceae

por cromatografia em camada delgada (Wagner; Bladt, 1996).

Classe

química

Sistema eluente Padrão Revelador

Alcalóides

gerais

Tolueno:acetato de

etila:dietilamina

(70:20:10)

Yoimbina

Quinina Dragendorff

Antocininas

Acetato de etila:ácido

fórmico:ácido acético

glacial:água

(100:11:11:26)

Azul de

metileno Anisaldeído sulfúrico

Antraquinonas

agliconas

Éter de Petróleo:acetato de

etila:ácido fórmico

(75:25:1)

Antraquinona

Ácido fosfomolíbdico/

H2SO4 etanólico 10%

Flavonóides


fórmico:ácido acético

glacial:água

(100:11:11:26)

Rutina

Quercetina NEU

Cumarinas

Tolueno:éter etílico

(1:1 saturado com ácido

acético 10%)

Escopoletina KOH etanólico 10%

Derivados

antracênicos

Acetato de

etila:metanol:água

(100:13,5:10)

Aloína KOH etanólico 10%

Lignanas Clorofórmio:metanol:água

(70:30:4)

Estrato de

linhaça Vanilina fosfórica

Naftoquinonas Tolueno:ácido fórmico

(99:1)

Biflorina

Lapachol

KOH etanólico 10%

Continua


Tabela 1 (Continuação)

Saponinas

Clorofórmio:ácido

acético:metanol:água

(64:32:12:8)

Saponina Anisaldeído sulfúrico

Taninos

condensados


acético glacial:ácido

fórmico:água

(100:11:11:26)

Catequina

Epicatequina Vanilina clorídrica

Taninos

hidrolisáveis

n-Butanol:acetona:tampão

fosfato

(40:50:10)

Ácido gálico

Ácido tânico

Sulfato de ferro

amoniacal( 1%)

Triterpenos e

esteróides

Tolueno:clorofórmio:etanol

(40:40:10)

Lupeol

Sitosterol Lieberman-Burchard

Xantinas

Acetato de

etila:Metanol:água

(100: 13,5: 10)

Cafeína Iodo- KI-HCl

4.4. Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD)

A análise do perfil de compostos fenólicos foi realizada em CLAE, modelo

Lachrom Elite, coluna de fase reversa LiCospher RP18 (5 mm) com dimensões (150

mm x 04 mm) Merck equipado com detector de arranjo de diodo (DAD). A fase

móvel utilizada foi uma solução de H2O/H3PO4 0,1 % (A) e MeOH (B),

inicialmente 75% de A e 25% de B, por 25 minutos. A temperatura da coluna foi

mantida constante em 30 °C com um fluxo de 1,0 mL/min. Para o extrato foi utilizado

um volume de injeção de 20 μl. Os dados espectrais foram registrados em 320-

322 nm durante a corrida inteira. A análise em CLAE-DAD foi realizada no

Laboratório de Fitoquímica da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS),

Bahia.


4.5. Animais

Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) de ambos os

sexos, pesando entre 25-35 g, todos procedentes do Biotério Setorial da UNIVASF,

Campus Petrolina. Antes dos experimentos, todos os animais foram mantidos em

gaiolas de polipropileno com ventilação e temperatura (22 ± 2 °C) controladas e

constantes e ciclo claro-escuro de 12 horas, com a fase de luz iniciando às 6:00 e

terminando às 18:00 horas, sob rigoroso controle alimentar com uma dieta

balanceada a base de ração tipo “pellets” (Labina®) com livre acesso à água

(disponível em frascos de plástico com bicos apropriados) até 60 minutos antes dos

experimentos. Todos os experimentos foram realizados no período de 07:00 às

14:00 horas. Os procedimentos obedeceram às normas do Colégio Brasileiro De

Experimentação Animal (COBEA), e os protocolos experimentais foram aprovados

pelo comitê de ética em pesquisa da UNIVASF sob o número 21051023.

4.6. Testes de atividade antinociceptiva

4.6.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Koster,

Anderson e Beer (1959). Grupos de 6 animais receberam veículo (salina), morfina

(10 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e os extratos de Neoglaziovia

variegata (Nv-EtOH), Encholirium spectabile (Es-EtOH) e Bromelia laciniosa (Bl-

EtOH) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg em relação ao peso do corpo dos

animais. Os extratos foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) 30 minutos

antes da administração de uma solução de ácido acético (0,9% v/v). O número de

contorções abdominais produzidas em cada grupo foi registrado durante 10 minutos,

iniciando-se 5 minutos após a administração do ácido acético.

4.6.2. Teste da formalina

O método utilizado foi semelhante ao descrito por Vianna et al. (1998). Os

animais foram tratados com veículo (salina), morfina (10 mg/kg), ácido acetilsalicílico

(AAS 200 mg/kg) e os extratos de Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), Encholirium


spectabile (Es-EtOH) e Bromelia laciniosa (Bl-EtOH) nas doses de 100, 200 e 400

mg/kg em relação ao peso do corpo dos animais. Os extratos foram administrados

por via intraperitoneal (i.p.) 1 hora antes da administração subplantar de 20 µL de

formalina 2,5% (em salina). Para avaliar a participação de receptores opióides no

efeito do extrato, foi administrado naloxona (1,5 mg/kg), um antagonista desses

receptores. Foi considerado como indicativo de dor, lambidas realizadas pelo animal

na pata que sofreu a injeção. Registrou-se o tempo de lambidas no intervalo de 0 a 5

minutos (fase 1 – dor neurogênica) e no intervalo de 15 a 30 minutos (fase 2 – dor

inflamatória). Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho

montado em três lados para permitir a visão das patas.

4.6.3. Teste da placa quente

Nesse teste, foi considerado como latência de resposta, o tempo que os

animais permaneciam sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até

reagirem ao estímulo térmico, caracterizado pelo comportamento de levantar ou

lamber as patas (TITA et al., 2001). As aferições foram realizadas em 30, 60, 90 e

120 minutos após a administração de salina (grupo controle), Nv-EtOH, Es-EtOH e

Bl-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) e morfina (10 mg/kg). Naloxona também foi

administrada para avaliação da participação de receptores opióides.

4.7. Toxicidade Aguda e determinação da DL50

Na investigação da toxicidade aguda, os camundongos foram divididos em

grupos de 5 machos e 5 fêmeas (n = 10). O grupo controle recebeu veículo (salina).

Os demais receberam pré-tratamento com uma dose única do extrato etanólico bruto

das plantas, na dose de 2000 mg/kg e 5000 mg/kg por via intraperitoneal e via oral,

respectivamente. Posteriormente, os animais foram observados durante 14 dias para

avaliar a presença de mortes e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais como:

variação de peso corporal, consumo de alimento e água foram avaliados

diariamente, durante todo o estudo.


4.7.1. Triagem comportamental

A triagem comportamental dos camundongos foi realizada seguindo os

parâmetros descritos por Almeida et al. (1999). Os animais foram observados em

0,5, 1, 2, 3 e 4 h após a administração do extrato etanólico bruto das espécies

estudadas. Comportamentos específicos (piloereção, ptose palpebral, contorções

abdominais, convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras,

sedação, ambulação aumentada, a resposta ao toque diminuída, movimentação

intensa das vibrissas, agressividade, estereotipia, analgesia e defecação) foram

observados e classificados.

4.7.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos

Ao final dos 14 dias do experimento, os animais foram anestesiados

(cetamina 90 mg/kg e xilasina 5 mg/kg), e o sangue foi retirado para análise. Para a

avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos do sangue, foi utilizada a

metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e Araújo et al. (2008) com

modificações. O sangue foi retirado puncionando-se o plexo braquial (0,9 mL de

sangue), para análise laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de

eritrócitos (106/mm3), hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular

médio (MCV, μ3), hemoglobina corpuscular média (MCH, g), concentração de

hemoglobina corpuscular média (CHCM,%), leucócitos (103/mm3), linfócitos (%),

monócitos (%) e plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos analisados em

amostras de soro foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL), triglicérides (mg/dL),

AST/TGO (U/L), ALT/TGP (U/L), uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL). Para a

determinação dos parâmetros hematológicos foi utilizado analisador de hematologia

Sysmex XT-2000, já para os parâmetros bioquímicos foi utilizado um analisador

semi-automático Wiener BT 3000 Plus.

4.7.3. Análise histopatológica dos órgãos

Após a coleta do sangue, os animais ainda sob anestesia profunda, foram

removidos fragmentos (medindo aproximadamente:1,0cm X 1,0cm) dos seguintes

órgãos: rins, fígado, coração, pulmão, pâncreas e estômago, lavados imediatamente


em solução salina (soro fisiológico) e a seguir para se proceder à Fixação os

mesmos foram imersos em solução de formol a 10%, tamponado (tampão fosfato

0,1 M pH 7,2) por 18 h. Decorrido este tempo, os fragmentos foram lavados em água

corrente e em seguida imersos em álcool a 70% e transportados ao Laboratório de

Biologia Celular, Histologia e Citologia, no Campus de Ciências Agrárias da

UNIVASF. Para desidratação destes utilizou-se etanol em série crescente (80, 95 e

100%), sendo posteriormente clarificados em xilol, impregnados com parafina

histológica em estufa à 58ºC e finalmente incluídos em parafina histológica,

obtendo-se desta forma os blocos. Cada bloco de parafina foi submetido à

microtomia e as seções de 7 µm de espessura obtidas foram estiradas em banho

histológico e em seguida montadas em lâminas de vidro. Para análise histológica as

preparações foram coradas com hematoxilina e eosina (H.E.) e examinadas em

microscópio de luz 400 x. (Microscópio Binocular Zeiss Axiolab - Laboratório de

Citologia e Histologia Quantitativa do Dep.Ciências Farmacêuticas,CCS-UFPE).

4.8. Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad Prism, versão

4.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos foram calculadas pela aplicação de

uma análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Dunnett, ou pelo teste t de

Student, conforme exigido pelo protocolo experimental. Foram considerados

significativos os valores de p < 0,05, quando comparados com o controle negativo.


5. RESULTÃDOS


5. RESULTADOS

5.1. Triagem fitoquímica

As análises fitoquímicas dos extratos etanólicos brutos de N. variegata, E.

spectabile e B. laciniosa revelaram que, entre todos os constituintes avaliados, os

flavonóides mostraram-se mais fortemente presentes em todas as amostras (Tabela

2).

Outras substâncias foram detectadas como as antocianinas, terpenóides,

embora, a presença tenha sido igualmente moderada, enquanto a de saponinas foi

fraca para os três extratos. Não foram detectados em nenhum dos extratos

analisados os seguintes constituintes: alcalóides, taninos condensados, cumarinas,

lignanas, naftoquinonas, triterpenos, esteróides e xantinas. O extrato de N. variegata

mostrou fortemente a presença de antraquinonas, perfil diferente do encontrado para

a E. spectabile, cuja presença foi moderada, e para a B. laciniosa, que se mostrou

ausente. Foram encontrados traços moderados de taninos hidrolisáveis no extrato

de N. variegata, e traço fraco na E. spectabile. Já em relação aos derivados

antracênicos, a concentração maior foi encontrada no Es-EtOH, embora tenha sido

moderada, ao mesmo tempo em que no Nv-EtOH e em Bl-EtOH foram encontrados

traços fracos.


Tabela 2. Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das três espécies da

família Bromeliaceae.

Grupo metabólico Nv-EtOH Es-EtOH Bl-EtOH

Alcalóides gerais - - -

Antocianinas ++ ++ ++

Antraquinonas agliconas +++ ++ -

Taninos condensados - - -

Taninos hidrolisáveis ++ + -

Flavonóides +++ +++ +++

Cumarinas - - -

Derivados antracênicos + ++ +

Lignanas - - -

Naftoquinonas - - -

Saponinas + + +

Triterpenos e esteróides - - -

Xantinas - - -

Resultados: Ausente (-); Baixo (+); Moderado (++); Forte (+++)

5.2. Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD)

5.2.1. Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata

Os perfis fenólicos avaliados em 322 nm para o Nv-EtOH são apresentados

na Figura 13. O cromatograma mostra a presença de oito picos com tempos de

retenção diferentes: 9,60 (1), 10,89 (2), 11,80 (3), 14,44 (4), 15,16 (5), 15,58 (6),

16,69 (7) e 17,62 (8). Com base nos dados espectrais de UV-Vis e nos tempos de

retenção, os compostos têm características da banda de UV para derivados do ácido

cinâmico, cumarinas ou flavonóides. Estes compostos estão sob investigação.


Figura 13: Cromatograma do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata obtido por

cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE-

DAD) em 322 nm.

5.2.2. Análise em CLAE do extrato etanólico de Encholirium spectabile

Os perfis fenólicos em 320 nm para o Es-EtOH avaliados são apresentados

na Figura 14. O cromatograma mostra a presença de dez picos com tempos de


15,16 (7) 15,58 (8), 16,68 (9) e 17,63 (10). Com base nos dados espectrais de UV-

Vis e nos tempos de retenção, os compostos têm características da banda de UV

para derivados do ácido cinâmico, cumarinas ou flavonóides. Estes compostos estão

sob investigação.

1

3

5

7

82

4

6

1

3

5

7

82

4

6


Figura 14: Cromatograma do extrato etanólico de Encholirium spectabile obtido por


DAD) em 320 nm.

5.2.3. Análise em CLAE do extrato etanólico de Bromelia laciniosa

Os perfis fenólicos a 320 nm para o Bl-EtOH avaliados são apresentados na

Figura 15. O cromatograma mostra a presença de nove picos com tempos de


18,09 (7) 19,01 (8) e 19,89 (9). Com base em seus dados espectrais de UV-Vis e

seus tempos de retenção, os compostos têm características da banda UV para

derivados do ácido cinâmico, cumarinas e flavonóides. Estes compostos estão sob

investigação.

1 3 5

78

9

2

4

6

101 3 5

78

9

2

4

6

10


Figura 15: Cromatograma do extrato etanólico de Bromelia laciniosa obtido por


DAD) em 320 nm.

5.3. Resultados de Neoglaziovia variegata

5.3.1. Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata

5.3.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético

Através do teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético foi

possível comprovar que Nv-EtOH possui atividade antinociceptiva. O efeito foi

evidenciado pela redução significativa no número de contorções (p < 0,01) em todas

as doses do extrato (100, 200 e 400 mg/kg), apresentando percentuais de inibição

de 89,50, 71,34 e 87,42 %, respectivamente, quando comparado ao grupo controle

(Figura 16). O grupo tratado com morfina na dose de 10 mg/kg obteve um percentual

de inibição de 100%, enquanto o grupo tratado com ácido acetilsalicílico na dose de

200 mg/kg obteve 99,28% de inibição, quando comparado ao grupo controle.

1

2 3 4

5

6 7

8

9


Figura 16. Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH 100, 200 e

400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no modelo

de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Valores são expressos como

média ± erro padrão da média, n = 6. **p < 0,01 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).

5.3.1.2. Teste da formalina

No teste da formalina, o extrato etanólico da espécie analisada (Nv-EtOH)

apresentou atividade antinociceptiva em ambas as fases do teste. Na primeira fase,

o Nv-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) inibiu 46,67, 44,23 e 41,81 % , respectivamente

(Figura 17). Porém, na segunda fase do teste, a inibição no tempo de lambida foi

mais pronunciada, apresentando percentuais de inibição todos superiores a 69%,

quando comparados ao grupo controle: 70,14, 69,43 e 90,28 %, respectivamente. O

melhor resultado do efeito de Neoglaziovia variegata no método de dor induzida por

formalina, foi observado na concentração de 400 mg/kg, chegando ao percentual de

inibição de 90,28 %, em relação ao grupo controle. O grupo tratado com morfina, na

dose de 10 mg/kg obteve percentual de inibição no tempo de lambida da pata na

primeira fase do teste de 60%, e na segunda fase 82,68%. Já no grupo que foi

administrado ácido acetilsalicílico na dose de 200 mg/kg, o percentual de inibição no

tempo de lambida da pata foi de 52,72% e 89,75% na primeira e segunda fase,

respectivamente.

0

10

20

30

**

**

**

** **

Controle

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

Nú

mero

de c

on

torç

ões



400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Nv-EtOH

(400 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5

mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos

como média ± erro padrão da média, n = 6. **p < 0,01 significativamente diferente do

grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).

O percentual de inibição no tempo de lambida da pata, após o pré-tratamento

com naloxona (1,5 mg/kg) foi de 29,81% e 10%, na primeira e segunda fase,

respectivamente, para o grupo de animais que utilizou a morfina (10 mg/kg). Já para

o grupo experimental de Nv-EtOH ( 400 mg/kg), o pré-tratamento com a naloxona,

não provocou nenhum percentual de inibição na primeira fase, ou seja, o efeito foi

completamente revertido pelo uso da naloxona. Porém, na segunda fase do teste da

Primeira fase

0

10

20

30

40

50

60

70

****

***

Controle

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morfina + NLX

Nv-EtOH + NLX

*

Tem

po

de l

am

bid

a d

a p

ata

(s)

Segunda fase

0

50

100

150

**

** **

Controle

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morfina + NLX

Nv-EtOH + NLX**

****

Tem

po

de l

am

bid

a d

a p

ata

(s)


formalina o grupo dos animais que receberam Nv-EtOH ( 400 mg/kg) com pré-

tratamento da naloxona, apresentou um percentual de inibição significativo (p <0,01)

de 72,32% no tempo de lambida da pata, quando comparado ao grupo controle.

5.3.1.3. Teste da placa quente (hot plate)

No teste da placa quente, Nv-EtOH foi capaz de aumentar o tempo de latência

quando comparado com o grupo controle, fazendo com que os animais

permanecessem por mais tempo sobre a placa aquecida (Figura 18). O efeito foi

mais pronunciado nos tempos de 60, 90 e 120 minutos após a administração do

extrato, principalmente no tempo de 120 minutos nas doses de 200 e 400 mg/kg,

cujo tempo de latência foi elevado a valores muitos próximos aos apresentados pela

morfina. O pré-tratamento dos animais com a naloxona reverteu o efeito

antinociceptivo provocado pelo Nv-EtOH.


400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Nv-EtOH


mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua

administração. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. *p <

0,05; **p < 0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo

teste de Dunnett).

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morfina + NLX

Nv-EtOH + NLX

***

* *

****

**

**

*

Tempo (min)

Tem

po d

e latê

ncia

(s)


5.3.2. Toxicidade aguda de Neoglaziovia variegata

Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico de Neoglaziovia

variegata, não foram observadas alterações comportamentais e fisiológicas, nem a

morte dos animais nas doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal, e de 5 g/kg por via

oral, respectivamente, indicando baixa toxicidade do extrato. Neste experimento foi

observado que Nv-EtOH tem DL50 > 2,0 g/kg quando administrado pela via

intraperitoneal e > 5,0 g/kg quando administrado pela via oral.

5.3.2.1. Avaliação comportamental dos camundongos

A triagem comportamental dos animais foi realizada em 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após

a administração de Nv-EtOH nas doses de 2,0 e 5,0 g/kg (peso corporal) por via

intraperitoneal e por via oral, respectivamente. Os animais não apresentaram

mudanças significativas no comportamento. Os animais não mostraram qualquer

sinal de toxicidade, ou alteração comportamental ou de outras atividades

fisiológicas.

5.3.2.2. Consumo de alimento e água

O consumo de alimentos e água pelos camundongos tratados com Nv-EtOH

mostrou alterações significativas, principalmente naqueles em que foi administrada a

dose de 5 g/kg via oral. A quantidade de alimentos consumidos no final do

experimento foi de 53,69 ± 1,64 g para o grupo controle, enquanto o grupo tratado

com a dose de 5 g/kg v.o. foi de 29,62 ± 0,86 g (p < 0,001) (Figura 19).

A quantidade de água consumida no final do experimento foi de 94,38 ± 3,15

ml para o grupo controle, enquanto o grupo tratado com a dose de 5 g/kg v.o. foi de

65,77 ± 3,41 mL (p < 0,001) (Figura 20).


Figura 19. Consumo de alimentos pelos animais tratados com Nv-EtOH durante 14

dias (n =10).

Figura 20. Consumo de líquido pelos animais tratados com Nv-EtOH durante 14

dias (n = 10).

5.3.2.3. Variação do peso corporal

Houve mudanças significativas (p < 0,001) no peso corporal dos camundongos

do 1 ao dia 14 no grupo tratado com o extrato na dose de 5 g/kg v.o. No final do

experimento, a média do grupo controle foi de 40,44 ± 0,27 g, enquanto a do grupo

tratado com a dose de 5 g/kg foi de 34,59 ± 0,22 g. A variação de peso ao longo do

experimento pode ser vista na Figura 21.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1520

30

40

50

60

70Controle

Nv-EtOH 2 g/kg i.p.

Nv-EtOH 5 g/kg v.o.

Dias

Co

nsu

mo

de r

ação

(g

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1525

50

75

100

125Controle

Nv-EtOH 2 g/kg i.p.

Nv-EtOH 5 g/kg v.o.

Dias

Co

nsu

mo

de l

íqu

ido

(m

l)


Figura 21. Ganho de peso dos animais tratados com Nv-EtOH durante 14 dias (n =

10).

5.3.2.4. Parâmetros hematológicos

Analisando os resultados para os parâmetros hematológicos (Tabela 3), é

possível observar que, após a administração de doses de 2,0 g/kg i.p. e 5,0 g/kg

v.o., não houve variação significativa nos parâmetros hematológicos (glóbulos

vermelhos, hemoglobina, VCM, HCM, CHCM, leucócitos e plaquetas).

Apenas algumas alterações estatisticamente significativas (p < 0,05) foram

encontradas nos parâmetros hematológicos, tais como o aumento do percentual de

hematócrito, linfócitos e monócitos. No entanto, o significado clínico deste aumento

está sendo investigado.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530

35

40

45Controle

Nv-EtOH 2 g/kg i.p.

Nv-EtOH 5 g/kg v.o.

Dias

Peso

co

rpo

ral

(g)


Tabela 3. Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados com 2,0

g/kg por via intraperitoneal (i.p.) e 5,0 g/kg por via oral (v.o.) do extrato etanólico

bruto de Neoglaziovia variegata após 14 dias (toxicidade aguda).

Parâmetros Grupos

Controle Após 2 g/kg i.p. Após 5 g/kg v.o.

Eritrócitos (106/mm3) 8,47 ± 0,10 8,50 ± 0,08 8,62 ± 0,15

Hemoglobina (g/dL) 12,90 ± 0,20 13,03 ± 0,23 13,13 ± 0,12

Hematócrito (%) 34,40 ± 0,66 35,05 ± 0,32 34,70 ± 0,18*

VCM (μ3) 41,20 ± 0,48 42,35 ± 0,46 40,40 ± 0,84

HCM (μg) 15,77 ± 0,21 15,70 ± 0,19 15,25 ± 0,16

CHCM (%) 37,40 ± 0,33 37,37 ± 0,61 37,93 ± 0,47

Leucócitos (103/mm3) 2,98 ± 0,16 2,98 ± 0,21 3,11 ± 0,15

Linfócitos (%) 63,23 ± 2,00 69,73 ± 0,58* 62,01 ± 2,62

Monócitos (%) 1,45 ± 0,41 1,57 ± 0,26 2,25 ± 0,25*

Plaquetas (103/mm3) 471,50 ± 48,66 447,00 ± 65,91 341,50 ± 59,31

Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 8. Teste t de Student

p < 0,05.

5.3.2.5. Parâmetros Bioquímicos

Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados mostram que a glicose,

colesterol, triglicérides, aspartato amino transferase (AST/TGO), creatinina e uréia

não têm significância estatística em comparação ao grupo controle (Tabela 5). Os

níveis de alanina amino-transferase (ALT/TGP) após a dose de 2,0 g/kg i.p. foram

significativamente menores que o grupo controle (p < 0,05). Os animais tratados com

uma dose de 5 g/kg v.o. mostraram aumento dos níveis de AST e creatinina, embora

este não foi estatisticamente significativo.


Tabela 4. Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos tratados

com 2,0 g/kg por via intraperitoneal (i.p.) e 5,0 g/kg por via oral (v.o.) do extrato

etanólico bruto de Neoglaziovia variegata após 14 dias (toxicidade aguda).

Parâmetros Grupos


Glicose (mg/dL) 131,00 ± 10,08 132,00 ± 8,94 141,00 ± 16,67

Colesterol (mg/dL) 118,20 ± 8,20 107,70 ± 6,32 121,80 ± 5,74

Triglicérides (mg/dL) 142,80 ± 23,64 135,70 ± 19,08 148,80 ± 8,98

AST/TGO (U/L) 170,00 ± 11,07 197,30 ± 18,25 236,70 ± 28,26

ALT/TGP (U/L) 84,93 ± 5,82 65,72 ± 5,22* 86,40 ± 12,00

Uréia (mg/dL) 73,50 ± 6,81 63,83 ± 3,16 69,75 ± 7,47

Creatinina (mg/dL) 0,73 ± 0,09 0,62 ± 0,05 0,85 ± 0,02

Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n= 8. Teste t de Student –

p < 0,05.

5.3.2.6. Análise Macroscópica e Histológica

Os órgãos dos animais tratados com extrato etanólico bruto de Neoglaziovia

variegata, não exibiram macroscopicamente alterações na forma, coloração e

dimensões quando comparados aos órgãos do grupo controle. A análise histológica

dos rins mostrou infiltrado inflamatório perivascular e no interstício de intensidade

variável (Figura 22).

Na figura 22 (A), observam-se glomerúlos e túbulos com estrutura histológica

preservada, enquanto na figura 22 (B) nota-se um infiltrado de células inflamatórias

(seta). Na figura 22 (C) a seta aponta pra um pequeno acúmulo de célula

inflamatótias entre os túbulos coletores.


Figura 22. Fotomicrografias dos rins de animais representativos dos três grupos

estudados: (A) controle, (B) Nv-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.).

(coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400 x ).

No fígado eram evidentes os infiltrados de células inflamatórias , localizados

em torno do vasos sanguíneos (perivasculares), assim como focos isolado no

parênquima hepático e algumas vezes no septos interlobulares (Figura 23).

Estas alterações microscópicas estavam presentes em ambos os grupos

tratados com doses de 2 g/kg i.p. e 5 g/kg v.o. Os dados obtidos mostraram que

as doses empregadas não provocaram a morte de animais, mas apresentaram

alterações no fígado e nos rins, sem alterar, contudo, os demais órgãos analisados.

Figura 23. Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais

representativos dos três grupos estudados. (A) grupo controle, (B) Nv-EtOH (2

g/kg i.p.) e (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.) (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400

x ).

A B C

A B C


5.4. Resultados de Encholirium spectabile

5.4.1. Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile


A administração intraperitoneal de Es-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) diminuiu

significativamente (p<0,01) a ação do ácido acético utilizado para induzir as

contorções abdominais em camundongos. Os percentuais de inibição provocados a

partir da administração de Es-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) foram de 68,59, 79,33 e

65,28%, respectivamente, quando comparado ao grupo controle. O ácido

acetilsalicílico (200 mg/kg) também inibiu significativamente (p<0,01) as contorções,

com percentual de inibição de 99,33%, enquanto a morfina aboliu completamente os

números de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, com percentual de

inibição de 100%, quando comparado ao grupo controle. Os resultados podem ser

vistos na Figura 24.

Figura 24. Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile (Es-EtOH 100, 200 e

400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no modelo

de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média , n= 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do



0

10

20

30

**

**

**

** **

Controle

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Nú

mero

de c

on

torç

ões


O extrato da planta (Es-EtOH) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg injetado 60

min antes da formalina, mostrou um efeito significativo em reduzir o tempo de

lambida da pata em ambas as fases deste teste. Na primeira fase (dor neurogênica)

os efeitos foram dose-dependentes, com porcentagens de inibição de 34,14, 52,61 e

60,97%, respectivamente. O efeito foi mais significativo na segunda fase (dor

inflamatória), cujos percentuais de inibição foram de 89,56, 79,90 e 96,71%,

respectivamente. Da mesma forma, a morfina (10 mg/kg) causou inibição

significativa, cujo percentual de inibição foi de 61,67 % na primeira fase e de 81,06%

na segunda fase. O AAS (200 mg/kg) causou inibição de 54,70% e 88,79% na

primeira e segunda fase deste teste, respectivamente. Os resultados do teste da

formalina são mostrados na Figura 25.


com naloxona (1,5 mg/kg) foi de 32,75% e 4,00%, na primeira e segunda fase,


o grupo experimental de Es-EtOH (400 mg/kg), o pré-tratamento com a naloxona,

provocou um percentual de inibição na primeira fase de 33,44% ou seja, o efeito foi

revertido pelo uso da naloxona. Porém, na segunda fase do teste da formalina o

grupo dos animais que receberam Es-EtOH com pré-tratamento da naloxona,

apresentou um percentual de inibição significativo (p <0,01) de 95,97 % no tempo de

lambida da pata, quando comparado ao grupo controle.



400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Es-EtOH


mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do


Primeira fase

0

10

20

30

40

50

60

70

**

**

*

Controle

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg** **

Morf + NLX

Es-EtOH + NLX

(a)T

em

po

de l

am

bid

a (

s)

Segunda fase

0

25

50

75

100

125

**

****

Controle

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

****

Morf + NLX

Es-EtOH + NLX**

(b)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)



Utilizando o teste da placa quente, de uma maneira geral, a administração

do extrato não induziu alterações no tempo de latência, quando comparado ao grupo

controle. O extrato inibiu a nocicepção neste método somente no tempo de 60 min,

na dose de 100 mg/kg. Os resultados são mostrados na Figura 26.


400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Es-EtOH


mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua

administração. Valores são expressos como média ± erro padrão da média, n = 6. *p

< 0,05; **p < 0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido

pelo teste de Dunnett).

5.4.2 Toxicidade aguda de Encholirium spectabile

Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico de Encholirium

spectabile não foram observadas alterações comportamentais e fisiológicas, nem a

morte dos animais nas doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal, e de 5 g/kg por via

oral, respectivamente, indicando, portanto, baixa toxicidade do extrato.


30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morf + NLX

Es-EtOH + NLX

***

** ****

Tempo (min)

Tem

po

de l

atê

ncia

(s)


A triagem comportamental dos animais foi realizada em 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após

a administração de Es-EtOH 2,0 e 5,0 g/kg (peso corporal) por via intraperitoneal e

por via oral, respectivamente. Os animais não apresentaram mudanças significativas

no comportamento. Os animais não mostraram qualquer sinal de toxicidade, ou

alteração comportamental ou de outras atividades fisiológicas.


O consumo de alimentos pelos camundongos durante os 14 dias de

experimento mostrou alterações significativas (p < 0,01) entre o grupo tratado por via

oral, e o grupo controle. A média no consumo de ração para o grupo controle foi de

57,92 ± 1,81 g, enquanto que para o grupo tratado com Es-EtOH na dose de 2 g/kg

i.p. foi de 46,92 ± 3,73 g, já para o grupo tratado com Es-EtOH (5g/kg, v.o) a média

do consumo de ração foi de 32,23 ± 2,46 g. O gráfico da variação do consumo de

ração pode se mostrado abaixo (Figura 27).

Figura 27. Consumo de alimentos pelos animais tratados com Es-EtOH durante 14

dias (n = 10).

Em relação ao consumo de água durante os 14 dias de experimentos, a

ingestão de água foi semelhante entre o grupo controle e o grupo tratado com Es-


EtOH (2g/kg, i.p.), ou seja, não houve significância estatística entre os perfis de

consumo entre esses grupos. Já para o Es-EtOH (5 g/kg, v.o), houve diferença

estatística (p < 0,0001) no consumo de líquido dos animais tratados por via oral em

relação ao grupo controle. O grupo controle consumiu uma média de 88,54 ± 3,40

mL, enquanto que o grupo tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p) consumiu em média um

volume de 84,15 ± 4,10 ml, e o grupo tratado com Es-EtOH (5 g/kg, v.o.) foi de 66,77

± 4,20ml (Figura 28).

Figura 28. Consumo de líquido pelos animais tratados com Es-EtOH durante 14

dias (n = 10).


Houve mudanças significativas (p <0,001) no peso corporal dos camundongos

a partir do dia 1 ao dia 14 nos dois grupos de camundongos tratados com os

extratos de E. spectabile, quando comparados ao grupo controle, principalmente na

dose de 5 g/kg v.o. Em ambas as doses de Es-EtOH, houve diminuição

estatisticamente significativa no peso corporal dos camundongos, de modo que, a

média de peso corporal do grupo controle permaneceu acima de 40 g, enquanto a

dos grupos tratados com extrato não passaram de 35 g. Ao final do experimento, a

média do grupo controle foi de 39,87 ± 0,26 g, enquanto a do grupo tratado com a

dose de 2 g/kg i.p. foi de 33,91 ± 0,30 g, e com a dose de 5 g/kg v.o. foi de 31,80 ±

0,34 g. A variação de peso ao longo do experimento pode ser vista na Figura 29.


Figura 29. Ganho de peso dos animais tratados com Es-EtOH durante 14 dias (n

= 10).


A análise das lâminas do fígado dos animais tratados com o extrato etanólico

bruto de Encholirium spectabile revelou a presença de poucos focos inflamatórios no

parênquima hepático, isolados em torno do ducto hepático, na região periductal e no

espaço porta (Figura 30). A estrutura dos lóbulos hepáticos apresentou-se

preservada, com os hepatócitos e sinusóides hepáticos dispostos em arranjo radial

típico dentro da normalidade. O estroma do órgão, também mostrou-se preservado.


Figura 30. Fotomicrografia do fígado de animal tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.).

Observam-se numerosas células inflamatórias (seta) aglomeradas na margem de

um vaso hepático. (Coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400 x )

As preparações examinadas dos rins dos animais tratados com o extrato

etanólico de Encholirium spectabile apresentam infiltrados inflamatórios no interstício

e no parênquima renal. Além disso, observaram-se a presença de células

inflamatórias também no glomérulo e diminuição do espaço subcapsular (Figura 31).

A estrutura histológica dos túbulos renais mostrou-se preservada.

Figura 31. Fotomicrografia do rim de animal tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.).

Notam-se glomérulos renais de aspecto condensado devido ao grande número de

células mesangiais. (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400x)

Os cortes examinados do pâncreas exibiram estrutura glandular preservada,

tanto a porção endócrina quanto a exócrina, o mesmo observando-se em relação ao

estroma do órgão (ácinos e ilhotas pancreáticas), no qual não houve alterações.


Nos cortes examinados do pulmão, percebeu-se a presença de células

inflamatórias no parênquima e na parede dos bronquíolos. Dentre a maioria dos

animais analisados, as estruturas do pulmão encontravam-se preservadas, contudo,

observou-se, em um único animal, a presença de grandes áreas inflamatórias

(nódulos) distribuídos por todo o parênquima pulmonar.

Figura 32: Fotomicrografia do pulmão de animal tratado com Es-EtOH (5 g/kg, v.o.).

A seta assinala um pequeno nódulo na parede bronquiolar (coloração: hematoxilina-

eosina; aumento: 400x).

Nenhuma alteração pode ser vista no miocárdio, e as demais estruturas do

coração encontraram-se dentro dos parâmetros da normalidade. No estômago, foi

observada a presença de focos de células inflamatórias na mucosa e na submucosa

do órgão, mas essas alterações não foram consideradas significativas.

5.5. Resultados de Bromelia laciniosa

5.5.1. Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa


A administração intraperitoneal de Bl-EtOH diminuiu significativamente (p <

0,01) a ação do ácido acético, utilizado para induzir as contorções abdominais em

camundongos, quando comparado ao grupo controle. Os percentuais de inibição

provocados pela administração de Bl-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) foram de 91,80,


93,44 e 78,68%, respectivamente. O ácido acetilsalicílico (200 mg/kg) também inibiu

significativamente (p < 0,01) o número das contorções abdominais, com percentual

de inibição de 95,08%, enquanto que a morfina (10 mg/kg) aboliu completamente o

número de contorções induzida pelo ácido acético. Os resultados podem ser vistos

na Figura 33.

Figura 33. Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa (Bl-EtOH 100, 200 e 400

mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no modelo de

contorções abdominais induzidas por ácido acético. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média , n = 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do



O extrato da planta (Bl-EtOH) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg injetado 60

min antes da formalina mostrou um efeito significativo (p < 0,01) em reduzir o tempo

de lambida da pata em ambas as fases deste teste. Na primeira fase (dor

neurogênica), os percentuais de inibição no tempo de lambida da pata foram de

60,86, 62,84 e 66,79%, respectivamente, em relação ao grupo controle. O efeito foi

mais significativo na segunda fase (dor inflamatória), cujos percentuais de inibição

foram 91,93, 82,18 e 88,73%, respectivamente. Da mesma forma, a morfina (10

mg/kg) causou inibição significativa, cujo percentual de inibição foi de 60,47% na

primeira fase e de 86,21% na segunda fase. O AAS (200 mg/kg) causou um

percentual de inibição na primeira fase de 28,45% (p < 0.05), e de 92,77% (p < 0,01)

0

10

20

30

** **

**

****

Controle

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Nú

mero

de c

on

torç

ões


na segunda fase deste teste. Os resultados do teste da formalina são mostrados na

Figura 34.


mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Bl-EtOH (100

mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) na

primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em média ±

erro padrão da média, n = 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).


com naloxona (1,5 mg/kg) foi de 23,71% e 17,14%, na primeira e segunda fase,


Primeira fase

0

10

20

30

40

50

60

** **

Controle

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg** **

* *

Morf + NLX

Bl-EtOH + NLX

(a)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Segunda fase

0

50

100

150

**** **

Controle

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

AAS 200 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

****

** Morf + NLX

Bl-EtOH + NLX

(b)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)


o grupo experimental de Bl-EtOH (100 mg/kg), o pré-tratamento com a naloxona,

provocou um percentual de inibição na primeira fase de 27,66% (p < 0,05) ou seja, o

efeito foi parcialmente revertido pelo uso da naloxona. Porém, na segunda fase do

teste da formalina o grupo dos animais que receberam Bl-EtOH com pré-tratamento

da naloxona, apresentou um percentual de inibição significativo (p < 0,01) de 77,47

% no tempo de lambida da pata, quando comparado ao grupo controle.


Utilizando o teste da placa quente, a administração do extrato (Bl-EtOH) não

alterou o tempo de permanência dos animais tratados na placa quente, quando

comparado ao grupo controle, principalmente nos primeiros 30 minutos. Contudo, na

dose de 100 mg/kg, no tempo de 60 minutos, o extrato etanólico da planta

apresentou elevação no tempo de latência dos animais no teste da placa quente. O

efeito antinociceptivo não foi revertido quando, o grupo tratado com Bl-EtOH (100

mg/kg), recebeu pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg). Os resultados são

mostrados na Figura 35.


mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Bl-EtOH (100

mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) no

teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores

são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05; **p < 0,01

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morf + NLX

Bl-EtOH + NLX

**

***

**

**

**

Tempo (min)

Tem

po

de l

atê

ncia

(s)


significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de

Dunnett).

5.5.2. Toxicidade aguda de Bromelia laciniosa

Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico de Bromelia laciniosa

não foram observadas alterações comportamentais e fisiológicas, nem a morte dos

animais nas doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal, e de 5 g/kg por via oral,

respectivamente, indicando baixa toxicidade do extrato.


A triagem farmacológica comportamental dos animais foi realizada em 0,5, 1,

2, 3 e 4 h após a administração de Bl-EtOH 2,0 e 5,0 g/kg (peso corporal) por via

intraperitoneal e por via oral, respectivamente. Os animais não apresentaram

mudanças significativas no comportamento. Os animais não mostraram qualquer

sinal de toxicidade, ou alteração comportamental ou de outras atividades

fisiológicas.


O consumo de alimentos pelos camundongos durante os 14 dias de

experimento mostrou alterações significativas (p < 0,01) entre o grupo tratado por via

oral, e o grupo controle. A média no consumo de ração para o grupo controle foi de

42,46 ± 1,18 g, enquanto que para o grupo tratado com a dose de 2 g/kg i.p. foi de

44,00 ± 2,13 g, já para o grupo tratado com Bl-EtOH (5g/kg, v.o) a média do

consumo de ração foi de 49,46 ± 1,47 g. O gráfico da variação do consumo de ração

pode se observado abaixo (Figura 36).


Figura 36. Consumo de alimentos pelos animais tratados com Bl-EtOH durante 14

dias (n = 10).

Em relação ao consumo de água durante os 14 dias de experimentos, a

ingestão de água foi semelhante entre o grupo controle e o grupo tratado com Bl-

EtOH (5 g/kg, v.o), ou seja, não houve significância estatística entre os perfis de

consumo entre esses grupos. Já para o Bl-EtOH (2 g/kg, i.p), houve diferença

estatística (p < 0,01) no consumo de líquido dos animais tratados por via i.p. em

relação ao grupo controle. O grupo controle consumiu uma média de 71,85 ± 2,09

mL, enquanto que o grupo tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p) consumiu em média um

volume de 62,77 ± 2,40 Ml, e o grupo tratado com Bl-EtOH (5 g/kg, v.o.) foi de 71,62

± 3,02 mL (Figura 37).


Figura 37. Consumo de líquido pelos animais tratados com Bl-EtOH durante 14

dias (n = 10).


Houve mudança significativa no peso corporal dos camundongos tratados

com o extrato por via oral, em relação ao controle. Em ambas as doses de Bl-EtOH,

houve uma elevação no peso corporal dos camundongos, de modo que, a média de

peso corporal dos três grupos não ultrapassou os 37,5 g. Ao final do experimento, a

média do grupo controle foi de 40,44 ± 0,27 g, enquanto a do grupo tratado com a

dose de 2 g/kg i.p. foi de 39,26 ± 0,22 g, e com a dose de 5 g/kg v.o. foi de 34,59 ±

0,21 g. A variação de peso ao longo do experimento pode ser vista na Figura 38.


Figura 38. Ganho de peso dos animais tratados com Bl-EtOH durante 14 dias (n =

10).

5.5.2.4. Parâmetros Hematológicos

Analisando os resultados para os parâmetros hematológicos (Tabela 5), é

possível observar que, após a administração de doses de 2,0 g/kg i.p. e 5,0 g/kg

v.o., não houve nenhuma variação significativa nos parâmetros hematológicos

(eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, VCM, HCM, CHCM, leucócitos, linfócitos e

plaquetas).


Tabela 5. Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados com 2,0

g / kg por via intraperitoneal e 5,0 g / kg por via oral do extrato bruto etanólico de

Bromelia laciniosa após 14 dias (toxicidade aguda).

Parâmetros Grupos


Eritrócitos (106/mm3) 8,05 ± 0,49 8,43 ± 0,15 8,09 ± 0,09

Hemoglobina (g/dL) 13,40 ± 0,91 12,88 ± 0,68 13,06 ± 0,27

Hematócrito (%) 42,41 ± 2,48 43,33 ± 1,25 42,84 ± 0,40

VCM (μ3) 52,60 ± 1,36 51,88 ± 0,45 52,86 ± 0,46

HCM (μg) 16,60 ± 0,22 16,43 ± 0,18 16,78 ± 0,15

CHCM (%) 31,69 ± 0,83 31,88 ± 0,34 32,06 ± 0,40

Leucócitos (103/mm3) 6,25 ± 0,57 5,88 ± 0,41 6,97 ± 0,59

Linfócitos (%) 88,93 ± 5,36 88,53 ± 1,08 88,55 ± 1,35

Plaquetas (103/mm3) 883,70 ± 108,30 856,90 ± 71,14 911,30 ± 73,18

Valores são expressos em médias ± erro padrão da média, n = 8. Teste t de Student

p < 0,05.

5.5.2.5. Parâmetros Bioquímicos

Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados mostram que os níveis

séricos de triglicérides, aspartato aminotransferase (AST/TGO), alanina amino-

transferase (ALT/TGP) e uréia todos se apresentam dentro do perfil de normalidade,

incluindo os níveis séricos da creatinina, embora tenha apresentado diferença

estatística no grupo tratado com Bl-EtOH (5 g/kg, v.o.), essa alteração não

apresenta significância clínica.


Tabela 6. Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos tratados

com 2,0 g/kg por via intraperitoneal (i.p.) e 5,0 g/kg por via oral (v.o.) do extrato

etanólico bruto de Bromelia laciniosa após 14 dias (toxicidade aguda).

Parâmetros Grupos


Triglicérides (mg/dL) 133,30 ± 5,57 111,17 ± 15,21 141,80 ± 14,14

AST/TGO (U/L) 123,10 ± 11,23 111,70 ± 25,05 116,70 ± 12,61

ALT/TGP (U/L) 75,29 ± 8,58 60,23 ± 8,08 66,30 ± 7,22

Uréia (mg/dL) 66,44 ± 4,40 65,89 ± 6,16 67,56 ± 4,84

Creatinina (mg/dL) 0,36 ± 0,01 0,42 ± 0,11 0,26 ± 0,02**

Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 8. Teste t de Student

**p < 0.01.


As preparações examinadas revelaram que no fígado dos animais do grupo

tratado com o extrato da B. laciniosa, a estrutura dos lóbulos hepáticos apresentou-

se preservada, com os hepatócitos e sinusóides hepáticos dispostos no arranjo

dentro da normalidade. Áreas de infiltração de células inflamatórias foram vistas no

espaço porta, assim como entre os hepatócitos (Figura 39) e principalmente em

torno dos vasos sanguíneos e ductos biliares (inflamação periductal).

Figura 39. Fotomicrografia do fígado de animal tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.). A

seta assinala um foco inflamatório. (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400x).


Quanto à estrutura histológica dos rins foram observadas áreas de inflamação

no interstício renal, bem como hipercelularidade nos glomérulos devido a presença

de um maior número de células mesangiais (Figura 40). A estrutura histológica dos

túbulos renais mostrou-se preservada.

Figura 40. Fotomicrografia do rim de animal tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.).

Notam-se glomérulos renais de aspecto condensado com núcleos de células

mesangiais em destaque. (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400 x ).

Na análise histológica do pâncreas, os cortes exibiram estruturas dentro dos

parâmetros da normalidade, tanto no estroma quanto nas estruturas glandulares,

endócrina e exócrina.

Nos cortes examinados do pulmão, dentre a maioria dos animais analisados,

as estruturas do órgão encontravam-se preservadas. Em alguns animais foram

encontrados áreas de infiltrados inflamatórios entre os alvéolos, bem como na

parede dos bronquíolos.

Nos cortes examinados do coração, nenhuma alteração foi vista no miocárdio,

e as demais estruturas se encontravam dentro dos parâmetros da normalidade.

No estômago glândular, de maneira geral, apresentou áreas com infiltrados de

células inflamatórias tanto na mucosa, como na submucosa.


6. DISCUSSO ES


6. DISCUSSÕES

6.1. Triagem fitoquímica e análise dos extratos por CLAE

A partir dos dados obtidos na triagem fitoquímica, foi possível identificar

que, entre os constituintes químicos que estavam presentes, os compostos fenólicos

estavam em maior quantidade. Este dado foi corroborado a partir dos resultados

obtidos através da análise por CLAE, pois os dados espectrais de UV-Vis e os

respectivos tempos de retenção dos picos, caracterizam os compostos como sendo

derivados do ácido cinâmico, derivados cumarínicos ou derivados de flavonóides.

Estes compostos estão sob investigação. Serão utilizados padrões para se chegar à

determinação dos mesmos através de cromatografia líquida de alta eficiência. Vale

destacar principalmente a presença de flavonóides em todos os extratos das plantas

analisadas, após a triagem fitoquímica. Os flavonóides compõem uma classe de

substâncias de origem natural com extensa diversidade estrutural, e, atualmente, já

foram identificadas mais de 9 mil substâncias pertencentes a este grupo (MARTENS;

MITHOFER, 2005). A fitoquímica da família também apresenta flavonóides como

constituintes químicos de diversas espécies de Bromeliaceae (MANETTI et al.,

2009). Além disso, diversos ensaios vêm comprovando variadas atividades

biológicas dos flavonóides, e de acordo com Simões et al. (2004), esses compostos

podem apresentar atividades antioxidantes, antiinflamatória, cicatrizante, analgésica,

antialérgica, anti-tumoral, protetor cardíaco e anti-diabético.

A similaridade entre os perfis cromatográficos obtidos para os diferentes

extratos das espécies analisadas foi avaliada através da comparação dos tempos de

retenção dos sinais cromatográficos observados. A identificação das substâncias

flavonoídicas e derivados de ácidos fenólicos foi realizada por comparação com

banco de dados de padrões, contendo tempo de retenção e espectro no UV obtidos

nas mesmas condições dos nossos experimentos.

6.2. Efeito antinociceptivo

O presente estudo mostrou o efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto

das espécies Neoglaziovia variegata, Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa em

diferentes métodos nociceptivos, utilizando estímulos químicos e térmicos. Três


modelos animais diferentes foram utilizados neste estudo. Tais métodos foram

selecionados com base em sua capacidade de investigar a resposta analgésica

tanto em nível central, como em nível periférico.

Inicialmente, foi utilizado o modelo das contorções abdominais induzidas pelo

ácido acético, que é considerado um modelo de nocicepção simples e pouco

específico, e que permite avaliar a atividade antinociceptiva de várias substâncias

que atuam em nível central e periférico (PERAZA et al., 2007). Tal método

experimental caracteriza-se por induzir as contrações e rotação do abdômen dos

camundongos, seguida pela extensão de uma ou ambas as patas traseiras. Esta

resposta decorre da aplicação intraperitoneal do ácido acético na concentração de

0,9%, que age como um estímulo álgico. Os resultados obtidos através desse

modelo experimental servem apenas como uma triagem inicial, e não é possível

avaliar com maior precisão os mecanismos de ação envolvidos. O estímulo químico

do ácido acético provoca nos camundongos uma sensibilização dos nociceptores

(ROCHA et al., 2007), e desencadeia um potencial de ação que culmina na liberação

de substâncias, como: acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrienos,

prostaglandinas, tromboxanos, interleucinas, fator de necrose tumoral (TNFα), entre

outros. Os nociceptores são sensíveis à ação de drogas antiinflamatórias não

esteroidais, como o ácido acetilsalicílico, e a analgésicos opióides, como a morfina,

daí ser considerado como um método inespecífico de nocicepção.

Após a verificação inicial de que os extratos possuíam ou não atividade

antinociceptiva, foi realizado o teste da formalina a fim de distinguir entre a ação

antinociceptiva central ou periférica. Desta forma, se seguiu com o teste da

formalina, que é um modelo experimental confiável e sensível para várias classes de

drogas analgésicas. Este método foi inicialmente descrito por Dubuison e Dennis

(1997) e consiste na aplicação por via intraplantar de uma substância irritante

(formalina) em uma das patas traseiras do camundongo, determinando o surgimento

de alterações comportamentais, traduzidas por respostas motoras que permitem

avaliar a intensidade da resposta nociceptiva ao estímulo químico. A resposta

nociceptiva é medida pela observação do tempo que o animal permanece lambendo

a pata na qual o estímulo foi aplicado. Com o modelo experimental, são

evidenciadas duas fases de sensibilidade dolorosa distintas. A primeira fase ou

aguda (0-5 min), quando a dor neurogênica é causada pela ativação direta das fibras

aferentes nociceptivas do tipo C, liberando neuropeptídeos como a substância P,


entre outros. A segunda fase ou tônica (15-30 min) é caracterizada como dor

inflamatória, relacionada à liberação de mediadores químicos como a histamina,

serotonina, bradicinina, prostaglandinas e aminoácidos excitatórios, que pode ser

inibida por medicamentos analgésicos e antiinflamatórios (TJOLSEN et al., 1992;

PEREIRA et al., 2010)

Para análise mais criteriosa do mecanismo de ação dos extratos estudados,

foi realizado, posteriormente, o teste da placa quente “hot plate”. Este modelo

experimental foi descrito inicialmente por Woolfe; Macdolnad (1944) como modelo

específico para a detecção de sustâncias analgésicas de efeito central. Ou seja, a

resposta no teste da placa quente fornece uma confirmação para o efeito central das

drogas estudadas pelo método. Embora o uso do analgésico central e periférico

responda pela inibição do número de contrações provocadas por estímulos de dor

química, apenas os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da

placa quente (GARCIA et al., 2004). Este modelo utiliza a temperatura como

estímulo nociceptivo. Então, os nociceptores (fibras C e Aδ) são estimulados após a

ativação dos receptores vanilóides, especificamente os receptores do tipo VR-1, que

possuem limiar de ativação em 43 ºC e os receptores do tipo VRL-1, que possuem

limiar de ativação em 52 ºC. Estes últimos são mais importantes na medição da

resposta a estímulos térmicos nocivos, pois são responsáveis pela resposta ao

aumento da temperatura (JULIUS; BASBAUM, 2001; apud BENEDITO, 2009).

A administração intraperitoneal do extrato etanólico de N. variegata nas doses

de 100, 200 e 400 mg/kg inibiu significativamente (p< 0,01) o número das contorções

induzidas pelo ácido acético com percentuais de inibição de 89,50, 71,34 e 87,42 %,

respectivamente. O resultado revela que o Nv-EtOH apresenta uma potente

atividade antinociceptiva. O teste de contorções induzidas pelo ácido acético é

amplamente utilizado como teste de triagem de drogas analgésicas, e somente com

este método não é possível se identificar a ação exata do extrato, pois é um método

inespecífico. Para distinguir entre a ação antinociceptiva central ou periférica, o teste

da formalina foi utilizado. Os resultados desse método para o Nv-EtOH mostraram

que o extrato apresentou efeito em todas as doses administradas (100, 200 e 400

mg/kg) nas duas fases do teste, sendo mais significativo na segunda fase, quando

comparado ao grupo controle. O efeito do extrato na primeira e segunda fase do

teste da formalina sugere que a atividade pode ser resultado de sua ação central,

pois, geralmente, drogas que possuem mecanismo de ação central, como a morfina,


apresentam efeitos em ambas as fases do teste da formalina. O pré-tratamento com

a naloxona reverteu a atividade antinociceptiva de Nv-EtOH na primeira fase do

teste. O resultado sugere a possibilidade do envolvimento dos receptores opióides

no efeito do extrato. O teste da placa quente, com o uso prévio da naloxona, foi

realizado com o intuito de averiguar o possível mecanismo de ação do extrato, pois

o teste da placa quente é seletivo somente para drogas que possuem efeito

analgésico central. Os resultados de Nv-EtOH no referido teste mostraram que o

extrato foi capaz de aumentar o tempo de latência dos animais sobre a placa,

quando comparados ao grupo controle, fazendo com que permanecessem por mais

tempo sobre a placa quente. Este efeito foi mais pronunciado na dose de 400 mg/kg

no tempo de 120 minutos. Além disso, o efeito antinociceptivo foi revertido pelo uso

da naloxona, o que sugere o efeito central, bem como a participação dos receptores

opióides no mecanismo de ação do extrato. Porém, não podemos descartar a

hipótese da droga possuir ação periférica, pois o extrato possuiu um efeito

significativo na segunda fase do teste da formalina.

Para o extrato etanólico bruto de Encholirium spectabile, a administração

intraperitoneal nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg inibiu significativamente (p< 0,01)

o número das contorções induzidas pelo ácido acético com percentuais de inibição

de 68,59, 79,33 e 65,28 %, respectivamente. O resultado revela que o Es-EtOH

apresenta atividade antinociceptiva. No teste da formalina, o extrato apresentou

efeito em todas as doses administradas (100, 200 e 400 mg/kg) nas duas fases do

teste, diminuindo significativamente (p < 0,01) o tempo de lambida da pata, quando

comparado ao grupo controle. O pré-tratamento com a naloxona reverteu a atividade

antinociceptiva de Es-EtOH na primeira fase do teste. O resultado sugere a

possibilidade do envolvimento de receptores opióides no efeito do extrato.

Entretanto, no teste da placa quente, o extrato de Encholirium spectabile, não

provocou alterações significativas (p<0,01) no tempo de latência dos animais sobre a

placa. Tampouco, provocou reversão do efeito antinociceptivo após o uso da

naloxona. Os resultados obtidos no teste da placa quente descartam a hipótese

inicial de que o Es-EtOH possuía mecanismo de ação central e, dessa forma, o

resultado indica que o efeito antinociceptivo do extrato é realmente por mecanismos

periféricos.

Para o extrato etanólico bruto de Bromelia laciniosa, a administração

intraperitoneal nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg inibiu significativamente (p< 0,01)


o número das contorções induzidas pelo ácido acético com percentuais de inibição

de 91,80, 93,44 e 78,68 %, respectivamente. O resultado revela que o Bl-EtOH

apresenta atividade antinociceptiva. No teste da formalina, o extrato apresentou

efeito em todas as doses administradas (100, 200 e 400 mg/kg) nas duas fases do

teste, diminuindo significativamente (p < 0,01) o tempo de lambida da pata, quando

comparados ao grupo controle. O pré-tratamento com a naloxona reverteu a

atividade antinociceptiva de Bl-EtOH na primeira fase do teste. O resultado sugere a

possibilidade do envolvimento de receptores opióides no efeito do extrato. O teste da

placa quente, com o uso prévio da naloxona, mostrou que o extrato etanólico bruto

de Bromelia laciniosa de maneira geral, não alterou o tempo de permanência na

placa quente quando comparado ao grupo controle, contudo, na dose de 100 mg/kg

no tempo de 60 min, o Bl-EtOH apresentou uma elevação no tempo de latência no

teste da placa quente. Esse efeito não foi revertido pelo uso da naloxona, dessa

forma, pode-se sugerir que o mecanismo de ação antinociceptiva do extrato é

central. Porém, não podemos descartar a hipótese da droga possuir ação periférica,

pois o extrato apresentou um efeito significativo na segunda fase do teste da

formalina.

Ao fazer uma análise comparativa, percebeu-se que todos os extratos

possuíram atividade antinociceptiva, porém, os mecanismos pelo qual exercem os

seus efeitos são diferentes, pois Encholirium spectabile possui um mecanismo de

ação periférico, enquanto que Neoglaziovia variegata e Bromelia laciniosa, possuem

mecanismo de ação central. Porém, para o Nv-EtOH e Bl-EtOH, não se pode

descartar, também, a hipótese de ação periférica destes extratos. A justificativa para

a participação dos extratos em dois mecanismos de ações distintos se explica

porque não se trabalhou com substâncias isoladas, uma vez que a amostra

experimental é um extrato bruto, possuindo diferentes constituintes químicos. Dessa

forma, se faz necessário o aprimoramento dos estudos, utilizando as frações

isoladas dos extratos, a fim de determinar os mecanismos de ação moleculares

exatos dos extratos. O estudo biomonitorado pode levar ao isolamento dos

constituintes químicos responsáveis pela atividade antinociceptiva dos extratos.


6.3. Toxicidade Aguda

A toxicidade aguda pode ser definida como efeito adverso produzido em um

curto período de tempo após administração de uma dose única de uma substância.

Neste experimento foi observado que o extrato etanólico de N. variegata, bem como

o de E. spectabile e B. laciniosa apresentam a DL50> 5000 mg/kg, quando

administrado por via oral, e DL50> 2000 mg/kg, quando administrado por via

intraperitoneal. Assim, podem ser considerados praticamente não-tóxicos, ou de

baixa toxicidade. A tendência atual, segundo Barros; Davino (1996) é substituir a

determinação da DL50 pelo teste de dose fixa, onde a substância a ser testada é

administrada em uma dose específica (ALMEIDA, 2006). Os órgãos governamentais

de diversos países empregam testes toxicológicos no controle biológico de diversas

substâncias para a averiguação de efeitos colaterais e tóxicos. Geralmente, entre

todos os possíveis sinais de toxicidade, os que são habitualmente observados são o

número de mortes, além dos efeitos sobre o comportamento, tais como:

agressividade, ambulação aumentada, contorções abdominais, convulsões,

estereotipia, movimentação intensa das vibrissas, piloereção, defecação, paralisia

das patas dianteiras, analgesia, tremores, catatonia, ptose palpebral, resposta ao

toque diminuída e sedação (ALMEIDA, 2006).

Os animais dos grupos tratados com os extratos de N. variegata, E. spectabile

e B. laciniosa não mostraram sinais significativos de toxicidade, alterações

comportamentais ou outras atividades fisiológicas. Também foram avaliados os

parâmetros de mudança do peso corporal e a ingesta de alimentos e água, a fim de

monitorar diariamente os sinais de toxicidade.

Com relação a mudanças no peso corporal dos animais nos quais se

administrou o extrato etanólico de N. variegata, houve uma diminuição bastante

significativa na ingesta de alimento, de tal forma que foi evidenciada uma diminuição

significativa no peso dos animais, principalmente no grupo tratado com a dose de

5g/kg. O consumo de água também mostrou uma diminuição significativa. Da

mesma forma ocorreu com o Es-EtOH, onde houve uma diminuição significativa para

os dois grupos de animais tratados com o extrato, na ingesta de alimentos e água,

além de diminuição do peso corporal, principalmente no grupo tratado com a dose

de 5g/kg. Contudo, para o grupo de animais tratados com o Bl-EtOH, não houve

uma variação significativa em tais parâmetros.


Geralmente, as alterações no peso corporal de camundongos tratados com

substâncias refletem seus efeitos tóxicos, e têm sido utilizadas como indicadores de

efeitos adversos de medicamentos e produtos químicos, especialmente se tal perda

for maior do que 10% do peso inicial (SUBRAMANION, 2011). A análise da ingestão

de alimentos e água em uma experimentação animal é importante para investigar a

segurança das substâncias estudadas com intuito terapêutico (MUKINDA; EAGLES,

2010).

Com relação às análises dos parâmetros hematológicos, não houve

alterações significativas de uma forma geral, apenas alterações estatisticamente

pouco significativas foram encontradas. A análise do sistema hematopoiético é muito

importante, pois é altamente sensível a substâncias tóxicas no sangue, servindo

assim como um importante parâmetro para analisar o estado fisiológico e patológico

em animais (ADENEYE, 2006).

Em relação aos paramentos bioquímicos, os níveis de ALT/TGP após a dose

de 2g/kg foram menores, em comparação ao grupo controle, mas de pouca

significância estatística e clínica. Já na dose de 5g/kg por via oral houve aumento

nos níveis de AST/TGO e creatinina, embora estatisticamente insignificante. AST e

creatinina são bons indicadores de funções hepáticas e renais, respectivamente.

Alterações em seus níveis sugerem modificações nestes órgãos. Transaminases

(TGO e TGP) são enzimas hepáticas localizadas dentro dos hepatócitos e são

usadas como marcadores bioquímicos de substâncias potencialmente tóxicas, já

que seus valores bioquímicos são elevados quando ocorre uma lesão no

parênquima hepático (RAHMAN, 2001).

Em relação ao estudo histopatológico, o exame macroscópico inicial dos

órgãos dos animais tratados com os extratos não mostrou alterações na cor em

relação ao controle. Na histopatologia do tecido renal, contudo, se observou a

presença do maior número de alterações para os animais tratados com o extrato de

N. variegata, no qual se observou lesões restritas e discretas, mas multifocais em

áreas grandes e extensas, com presença de edema, áreas de necrose e

aparecimento de uma massa de crescimento celular desorganizado e intensa, além

de infiltrado perivascular. Para os animais tratados com o Es-EtOH, a histopatologia

demonstrou infiltrados inflamatórios no interstício e no parênquima renal, assim

como no extrato Bl-EtOH, no qual também se percebeu infiltrados no parênquima da

região entre os túbulos e glomérulos renais. Glomérulos estes, nos quais houve a


presença de células inflamatórias para o extrato de E. spectabile. Para os dois

extratos a estrutura histológica dos túbulos renais se mostrou preservada.

Na histopatologia do fígado, se observou a presença de infiltrados celulares

com lesões leves, com a característica diferencial de ser perivascular e mais extensa

no parênquima do fígado dos animais tratados com o extrato da N. variegata, em

ambos os grupos de concentrações de dose, e isolados em torno do ducto hepático,

na região periductal e no espaço porta (inflamação periductal) no parênquima

hepático dos animais tratados com os extratos da E. spectabile e B. laciniosa. De um

modo geral, o Nv-EtOH gerou alterações apresentadas no fígado dos animais com ele

tratados, enquanto para os outros dois extratos a estrutura dos lóbulos hepáticos se

apresentou preservada, com os hepatócitos e sinusóides hepáticos dispostos no

arranjo dentro da normalidade, e com o estroma do órgão preservado.

Na histopatologia do pâncreas, para os três extratos das plantas analisadas, se

percebeu estrutura glandular preservada, tanto a porção endócrina quanto a exócrina,

o mesmo se observando em relação ao estroma do órgão (ácinos e ilhotas

pancreáticas), no qual não houve alterações.

Na histopatologia do pulmão, para os animais tratados com os extratos de

E.spectabile e B. laciniosa, se percebeu a presença de células inflamatórias no

parênquima e parede dos bronquíolos, embora dentre a maioria dos animais

analisados, as estruturas do órgão encontraram-se preservadas. Para o Es-EtOH

foram encontrados a presença de grandes áreas inflamatórias (nódulos) distribuídos

por todo o parênquima pulmonar, enquanto para o Bl-EtOH, em um caso particular,

em um dos animais do grupo no qual se administrou 5 g/kg do extrato, foram

encontradas grandes áreas compactas devido a presença de nódulos volumosos em

várias áreas do parênquima. Nos animais tratados com o Nv-EtOH não se evidenciou

nenhuma alteração no pulmão.

Nenhuma alteração pode ser vista no miocárdio, e as demais estruturas do

coração encontraram-se dentro dos parâmetros da normalidade para os animais

tratados com os três extratos. Na histopatologia do estômago foram observadas a

presença de focos de células inflamatórias na mucosa e na submucosa do órgão dos

animais tratados com E. spectabile e B. laciniosa, com a particularidade deste último

ter sido restrito a porção glandular, enquanto com a N. variegata não se observaram

alterações.


De um modo geral, o teste de toxicidade aguda é empregado para o

delineamento de doses a serem utilizadas nos estudos de toxicidade sub-crônica e

crônica. Além disso, fornece informações preliminares sobre o modo de ação tóxica e

possíveis órgãos alvo da substância.

Tomados juntos, os resultados do presente estudo mostraram que o extrato

etanólico das espécies Neoglaziovia variegata, Encholirium spectabile e Bromelia

laciniosa apresentam efeito antinociceptivo, e podem ser considerados de baixa

toxicidade. Das três espécies estudadas, apenas B. laciniosa tem uso na medicina

popular, e as informações aqui apresentadas servirão de base para estudos

farmacológicos posteriores.

Nossos resultados comprovam o potencial farmacológico de espécies de

Bromeliaceae nativas da caatinga, o que poderá contribuir para as políticas de

conservação e manejo adequado dessas espécies, visto que, além do potencial

econômico, elas podem vir a ser exploradas como fontes de novas substâncias

biologicamente ativas.


7. CONCLUSO ES


7. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que os

extratos brutos das espécies de Bromeliaceae, nas doses e concentrações utilizadas

apresentam excelente atividade antinociceptiva. Os extratos de Neoglaziovia

variegata e Bromelia laciniosa, além de possuírem atividade analgésica periférica,

possuem também atividade central, e o mecanismo pelo qual os extratos exercem os

seus efeitos envolvem possivelmente o sistema opióide. Por outro lado, para o extrato

etanólico de Encholirium spectabile, sua atividade analgésica é possivelmente

mediada por mecanismos de ação periféricos. No entanto, mais estudos são

necessários para a melhor elucidação do mecanismo de ação dos extratos.

Com relação ao perfil de segurança dos extratos, no teste de toxicidade aguda,

os extratos foram considerados de baixa toxicidade, pois todos apresentaram DL50

maior que 2 e 5 g/kg por via i.p. e v.o, respectivamente. As análises dos parâmetros

hematológicos e bioquímicos também revelaram certo perfil de segurança para os

extratos, mas o mesmo não ocorreu com as análises histopatológicas, pois apontam

uma possível sobrecarga renal e hepática. Dessa forma, faz-se necessário a

realização de outros ensaios de toxicidade sub-crônica e crônica a fim de realmente

determinar o perfil de segurança dos extratos e, assim, para que futuramente tais

extratos possam se tornar agentes seguros para uso terapêutico.

Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para as

espécies em estudo, dessa forma, demos uma importante contribuição para a

farmacologia de plantas do bioma caatinga, em especial às espécies da família

Bromeliaceae.


8. REFERE NCIÃS


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11 nov. 2011.


ÃPE NDICES


APENDICE A – Artigo I

Artigo I:

ANTINOCICEPTIVE EFFECT OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF

Neoglaziovia variegata (BROMELIACEAE) IN MICE


ARTIGO I

Artigo submetido à:

Revista: Journal of Pharmacy and Pharmacology

Título: Antinociceptive effect of the ethanolic extract of Neoglaziovia variegata

(Bromeliaceae) In Mice

Autores: Sarah R.G. de Lima-Saraiva, Henrique C.C. Saraiva, Juliane C. Silva, Julianeli T. de

Lima, José A. de Siqueira-Filho, Patrícia K.F. Damasceno, Carla R.C. Branco, Alexsandro

Branco, Elba L.C. Amorim, Jackson R.G.S. Almeida


Antinociceptive effect of the ethanolic extract of Neoglaziovia

variegata (Bromeliaceae) in mice

Sarah R.G. de Lima-Saraivaa, Henrique C.C. Saraiva

b, Juliane C. Silva

b, Julianeli T. de Lima

b,

José A. de Siqueira-Filhob, Patrícia K.F. Damasceno

c, Carla R.C. Branco

c, Alexsandro Branco

c;

Elba L.C. Amorima, Jackson R.G.S. Almeida

b,*

aFederal University of Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brazil;

bFederal University of São

Francisco Valley, Petrolina, Pernambuco, Brazil; cState University of Feira de Santana, Feira

de Santana, Bahia, Brazil

*Correspondence

Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

Universidade Federal do Vale do São Francisco

Postal code: 56.304-205

Petrolina, PE, Brazil

Tel/Fax + 55-87-21016862

E-mail: [email protected]


Abstract

Objectives This study was carried out to evaluate the antinociceptive effects of ethanolic

extract from Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH) in mice using models of nociception.

Methods The evaluation of antinociceptive activity was carried out by the acetic acid-induced

writhing, formalin and hot plate tests. HPLC was used to determine the fingerprint

chromatogram of the Nv-EtOH.

Key findings In the acetic acid-induced writhing test, the Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg,

i.p.) reduced the number of writhing by 89.50, 71.34 and 87.42%, respectively. Additionally,

the extract decreased by 46.67, 44.23 and 41.81%, respectively, the paw licking time in the first

phase of the formalin test, as well as 70.14, 69.43 and 90.28%, respectively, in the second

phase of this test. The effect of Nv-EtOH on hot plate response provides a confirmation of its

central effect. The effects of Nv-EtOH and morphine in the formalin and hot plate tests were

inhibited by naloxone. The presence of phenolic compounds in the extract was confirmed using

HPLC.

Conclusions Results based from formalin and hot plate tests indicated that the extract has

compounds that interact with the opioid system. Pharmacological and chemical studies are

continuing in order to characterize the mechanism responsible for this effect.

Keywords: antinociceptive activity; Neoglaziovia variegata; Bromeliaceae


Introduction

Sensory systems have the role of informing the brain about the state of the external

environment and the internal milieu of the organism. Pain is a perception, and as such, it is one

of the outputs of a system in more highly evolved animals – the nociceptive system – which

itself is a component of the overall set of controls responsible for homeostasis.[1]

Pain is a

sensorial modality which in many cases represents the only symptom for the diagnosis of

several diseases. It often has a protective function. Throughout history man has used many

different forms of therapy for the relief of pain, among them, medicinal herbs are highlighted

due to their wide popular use.[2]

The effective treatment of the pain continues to be one of the major challenges in healthcare.

While analgesics that target the central opioid system are highly effective, these drugs are

associated to respiratory-depressant effects as well as the development of tolerance to

prolonged applications.[3]

Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), steroidal drugs and

immuno-supressant drugs, which have been used usually in the relief of pain and inflammatory

diseases by the people of the world for a long time. However, these drugs were often associated

with severe adverse side effects, such as gastrointestinal bleeding and peptic ulcers.[4]

Recently,

many natural medicines derived from plants, marine organisms, etc, were considered as the

effective and safer for the treatment of various diseases including inflammation and pain.[5]

Medicinal plants are alternative options to conventional therapies to many diseases, and Brazil

with its enormous biodiversity can contribute to the search of new natural products and

bioactive molecules.[6]

The Brazilian flora remains poorly studied with regard to its chemical

and pharmacological potential. Thus, the purpose of this study was to evaluate the

pharmacological potential of Neoglaziovia variegata, a species belonging to the family

Bromeliaceae.


The Bromeliaceae, one of the largest botanical families of the New World, is distributed

extensively in tropical America.[7]

This family comprises 58 genera and 3172 speies.[8]

Considering the large number of species of the Bromeliaceae family few have been studied

chemically so far. Despite this, there is a considerable amount of identified compounds, which

mostly belong to the class of triterpenoid and flavonoids. Other classes of compounds such as

sterols, diterpenes, cinnamic acids, glycerol replaced, lignans, nitrogen compounds, among

others, were also identified in this family, although greatly reduced in number. From the

pharmacological standpoint, there are also few studies in the literature.[9]

Extracts of

Nidularium procerum showed anti-allergic properties[6]

as well as analgesic and anti-

inflammatory properties.[10]

Antiulcer activity of ethanolic extract of Encholirium spectabile

was also demonstrated.[11]

The family Bromeliaceae fascinates by the exuberance, diversity and beauty of its species.[12]

Neoglaziovia variegata is a species native to the lower stratum of the Brazilian Caatinga. It has

striped leaves, flowers protected by bracts with bright coloration and fruits as juicy berries.

This species is known in the Northeast Region of Brazil as “caroá” and constitutes one of the

most used raw material for use in craftsmanship in the region, generating jobs and income for

many families. Its leaves are used in fiber extraction which is used for manufacturing string,

hats, purses, rugs, hammocks, fishing nets and fabrics. The caroá plant, however, has been

collected directly in the Caatinga in a extrativism manner, without any systematization of

cultivation, having practically disappeared in some regions.[13]

There is no previous report on the analysis of the antinociceptive activity of Neoglaziovia

variegata. In our continuing search of the medicinal plants from Brazilian Caatinga for

combine biodiversity conservation with drug discovery, the aim of this study was to evaluate

the antinociceptive activity of ethanolic extract of N. variegata in experimental models.


Materials and Methods

Plant material

The leaves of Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez were collected in the city of Petrolina,

State of Pernambuco, Brazil, in January of 2011. The samples were identified by André

Paviotti Fontana, a botanist from Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga

(CRAD). A voucher specimen (6441) was deposited at the Herbarium Vale do São Francisco

(HVASF) of the Federal University of São Francisco Valley.

Extraction

The leaves dried and pulverized (1.174 g) were macerated with ethanol 95% at room

temperature for 72 h. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a

rotatory evaporator oven at 50 oC, producing 45 g of crude ethanol extract (Nv-EtOH).

Analysis of Nv-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)

The analysis of phenolic compounds profile were performed in liquid chromatograph Hitachi

model Lachrom Elite, colunm LiCospher 100 RP18 (5 mm) with dimensions (150 mm x 04

mm) Merck equipped with Diode Array Detector (DAD). The mobile phase used was a

solution of H2O/H3PO4 0.1% (A) and MeOH (B) provided initial 75% of A and 25% of B for

25 minutes. The column temperature was kept constant at 30 °C with a flow of 1.0 ml/min. For

the extract was used an injection volume of 20 μl. Spectral data were recorded in 322 nm

during the whole run.

Animals


Male and female adult albino Swiss mice (25-35 g), were used throughout this study. The

animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/ dark cycle

(lights on at 6:00 a.m.) with free access to food and water. When necessary, animals were

deprived of food 12 h prior to the experiments. They were used in groups of five or six animals

each. All nociception tests were carried out by the same visual observer. Experimental

protocols and procedures were approved by the Federal University of São Francisco Valley

Animal Care and Use Committee by number 21051023.

Acute toxicity

In the inquiry of the acute toxicity, groups of five male and five female Swiss mice (n=10) were

administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0 g/kg orally of the crude ethanol extract of N.

variegata (Nv-EtOH). Control group received vehicle. Mortality in each group within 72 h was

recorded and the animals were observed during a period of 14 days for the presence of toxicity

signals.

Acetic acid-induced writhing in mice

This test was performed as described by Koster et al.[14]

with modifications. Mice (n=6) were

intraperitoneally pre-treated 30 min before the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 10

ml/kg). Vehicle (saline), Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, body weight), acetylsalicylic acid

(ASA, 200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered before acetic acid injection.

Following the injection of acetic acid, the intensity of nociceptive behavior was quantified by

counting the total number of writhes (a response consisting of contraction of the abdominal

wall, pelvic rotation followed by hind limb extension) occurring between 5 and 15 min after

stimulus injection.[15]


Formalin test

The method used was similar to that described previously.[16,17,18]

Twenty microlitres of 2.5%

formalin was injected subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds)

spent in licking and biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain

response. Responses were measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic

phase) and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory phase). Nv-EtOH

(100, 200 and 400 mg/kg), ASA (200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered

intraperitoneally 60 min before formalin injection. Control animals received the same volume

of saline. Mice were observed in the chambers with a mirror mounted on three sides to allow

view of the paws.

Hot plate test

Mice were pre-selected on the hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the

parameters of observation. Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or

jumping) greater than 20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline,

0.1 ml/10 g), morphine (10 mg/kg) and Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p. Latency

time (in seconds) for each mice was determined on the hot plate during the maximum period of

20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min after the administration of the extract.[19]

Statistical analysis

The data obtained from animal experiments were analyzed using the GraphPad Prism program

version 4.0 and expressed as mean ± S.E.M. Statistically significant differences between groups

were calculated by the application of analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s

test. Values were considered significantly different at p < 0.05.


Results

Analysis of Nv-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)

Phenolic profiles at 322 nm for the Nv-EtOH evaluated are presented in Figure 1. The

chromatogram shows the presence of eight peaks with different retention times: 9.60 (1), 10.89

(2), 11.80 (3), 14.44 (4), 15.16 (5), 15.58 (6), 16.69 (7) and 17.62 (8). Based on their UV-Vis

spectral data and their retention time, the compounds have UV band characteristic for cinnamic

acid, coumarin and flavonoid derivatives. These compounds are under investigation.

INSERT FIGURE 1

Acute toxicity

In the acute toxicity evaluation of Nv-EtOH, behavioral and physiological alterations were not

observed neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally,

respectively, indicating low toxicity of the extract. Further studies will be carried out to confirm

the absence of acute and chronic toxicity through histopatological analysis and determination of

hematological and biochemical parameters of blood.


Figure 2 shows that the i.p. administration of Nv-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) decreased

significantly (p < 0.01) the number of writhing movements induced by the i.p. administration of

the acetic acid compared with the control group. The inhibitions of writhes in percentage were

89.50, 71.34 and 87.42%, respectively. Acetylsalicylic acid (200 mg/kg) and morphine (10

mg/kg), which are non-steroidal anti-inflammatory and opioid drugs, respectively, and which


were used as positive controls, also produced significant inhibition of the response to acetic

acid-induced writhing. Morphine abolished the nociceptive response.

INSERT FIGURE 2

Formalin test

The formalin test revealed an antinociceptive effect of the extract (Figure 3a and 3b). Nv-EtOH

caused a significant inhibition of both neurogenic and inflammatory phases in the licking

induced by formalin. The result was most significative in the inflammatory phase. Nv-EtOH

(100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) decreased by 46.67, 44.23 and 41.81%, respectively, the paw

licking time in the first phase, as well as 70.14, 69.43 and 90.28%, respectively, in the second

phase of the formalin test. The treatment with acetylsalicylic acid and morphine was also able

to inhibit the first and second phases. The pretreatment with naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) reversed

the antinociceptive activity of the extract at dose of 400 mg/kg in the first phase of this test.

The effect of morphine (10 mg/kg) was also reversed by naloxone. The results suggest a

possible involvement of opioid receptors in the antinociceptive effect of the extract.

INSERT FIGURE 3

Hot plate test

In the hot plate test (Figure 4), the animals treated with Nv-EtOH at dose of 200 mg/kg showed

an increase in latency time at 60 and 120 min. This effect was most significant at a dose of 400

mg/kg, which showed a marked increase latency time in 60, 90 and 120 minutes. Trying to

elucidate the mechanism by which Nv-EtOH induces antinociception, animals were pre-treated


with naloxone. The effects of Nv-EtOH and morphine were inhibited by naloxone, which

completely reversed the antinociceptive effect in the hot plate model.

INSERT FIGURE 4

Discussion

The present study showed the antinociceptive effect of the Neoglaziovia variegata extract in

different nociceptive responses generated by a chemical or thermal noxious stimulus. Three

different animal models were used in this study to investigate the potential antinociceptive of

the ethanolic extract. The methods for investigating antinociception were selected based on

their capacity to investigate both centrally and peripherally mediated effects. The abdominal

constriction induced by acetic acid and the hot plate methods investigate peripheral and central

activity, respectively, while the formalin test investigates both.[15]

The extract intraperitoneally administered significantly inhibited (p < 0.01) the acetic

acid-induced writhings in mice. Intraperitoneal injection of acetic acid produced 23.83 ± 2.60

writhes in the control group for 10 min after injection. The groups previously treated with 100,

200 and 400 mg/kg of Nv-EtOH exhibited a significant reduction in the number of writhings of

89.50, 71.34 and 87.42%, respectively. The results revealed that Nv-EtOH has a potent

antinociceptive activity in this method. The acetic acid-induced writhing test was commonly

considered as classical peripheral analgesic animal model and widely used for screening

analgesic drugs.[20]

Although this test is a nonspecific model of nociception, it is widely used

for analgesic screening and involves local peritoneal receptors, which are thought to be

partially responsible for abdominal constriction response. Some researchers have associated

this method with prostanoids in general, i.e., increased levels of PGE2 and PGF2α, as well as


lypoxigenase products in peritoneal fluids.[21]

However, it is important to note that other type of

analgesics, such as the opioids, are also effective in this test without inhibiting COX or LOX.

In order to distinguish between the central and peripheral antinociceptive action, the

formalin test was performed. The formalin test is a valid and reliable model of nociception and

is sensitive for various classes of analgesic drugs. Formalin test produced a distinct biphasic

response and different analgesics may act differently in the early and late phases of this test.

Intraplantar injection of formalin makes two phases of painful sensitivity evident. The first or

acute phase (0 – 5 min) when the neurogenic pain is caused by direct activation of type C

nociceptive afferent fibers, releasing neuropeptides such as substance P, among others. The

second or tonic phase (15 – 30 min) is characterized as inflammatory pain, related to release of

chemical mediators such as histamine, serotonin, bradykinin, prostaglandins and excitatory

aminoacids, which can be inhibited by painkillers and anti-inflammatory drugs.[22, 23]

This test

is a very useful method for not only assessing the antinociceptive drugs but also helping in the

elucidation of the action mechanism.[16]

Centrally acting drugs such as narcotics inhibit both

phases. Peripheral acting drugs such as NSAIDs and corticoids inhibit mainly the second phase.

The extract was able to block both phases of the formalin response although the effect was

more pronounced in the second phase. The effect of extract on the first and second phases of

formalin test suggests that its activity may be resulted from its central action when compared

with morphine activity in this respect. The pretreatment with naloxone reversed the

antinociceptive activity of the extract in the first phase of this test. The results suggest a


The effect of Nv-EtOH on hot plate response provides a confirmation of its central effect. In

addition, the antinociceptive effect could be blocked by naloxone, indicating an interaction with

brain opioid mechanisms. The hot plate test is a central model that has selectivity for opioid-

derived analgesics, such as morphine. Although the central and peripheral analgesics respond


by inhibiting the number of contractions provoked by chemical pain stimuli, only the central

analgesics increase the time of response in the hot plate test.[24]

These results induce to think

that the antinociceptive action of the extract, probably is more related to a central mechanism

than with a peripheral mechanism.

Conclusions

Taken together, the results of our work suggest that the ethanolic extract from the leaves of

Neoglaziovia variegata possess an antinociceptive effect, which probably is related with a

central mechanism. The exact mechanism and the bioactive principles responsible for this

effect remain to be explained. Pharmacological and chemical studies are continuing in order to

characterize the mechanism responsible for this effect.

Declarations

Conflict of interest

The authors declare that they have no conflict of interest to disclose.

Funding

This work was supported by grants from CNPq and FACEPE.

Acknowledgments

The authors wish to express their thanks to Centro de Referência para Recuperação de Áreas

Degradadas (CRAD/UNIVASF) for collection and botanical identification of the plant

material.


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20. Negus SS et al. Preclinical assessment of candidate analgesic drugs: recent advances and

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21. Verma PR et al. Antinociceptive activity of alcoholic extract of Hemidesmus indicus R. Br.

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22. Tjolsen A et al. The formalin test: an evaluation of the method. Pain 1992; 51: 5-17

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24. Garcia MD et al. Antinociceptive and anti-inflammatory effect of the aqueous extract from

leaves of Pimenta racemosa var. ozua (Mirtaceae). J Ethnopharmacol 2004; 91: 69-73.


Figure 1 High performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD)

profiles of Neoglaziovia variegata ethanolic extract recorded at 322 nm.

1

3

5

7

82

4

6

1

3

5

7

82

4

6


Figure 2 Effect of ethanolic extract of the Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), acetylsalicylic

acid (ASA) and morphine on acetic acid induced writhing test. Values are mean ± S.E.M. **p <

0.01, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

0

10

20

30

**

**

**

** **

Control

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs


Figure 3 Effect of ethanolic extract of Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), acetylsalicylic acid

(ASA), morphine, morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Nv-EtOH +

NLX (400 mg + 1.5 mg/kg) on formalin test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01,

significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

First phase

0

10

20

30

40

50

60

70

****

***

Control

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Morph + NLX

Nv-EtOH + NLX

*

(a)

Lic

kin

g t

ime (

s)

Second phase

0

50

100

150

**

** **

Control

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Morph + NLX

Nv-EtOH + NLX**

****

(b)

Lic

kin

g t

ime (

s)


Figure 4 Effect of ethanolic extract of Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), morphine,

morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Nv-EtOH + NLX (400 mg + 1.5

mg/kg) on hot plate test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly

different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Nv-EtOH 100 mg/kg

Nv-EtOH 200 mg/kg

Nv-EtOH 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Morph + NLX

Nv-EtOH + NLX

***

* *

****

**

**

*

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)


APENDICE B – Artigo II

Artigo II:

ANTIOXIDANT ACTIVITY AND ACUTE TOXICITY OF Neoglaziovia

variegata (BROMELIACEAE)


ARTIGO II


Revista: Latin American Journal of Pharmacy

Título: Antioxidant activity and acute toxicity of Neoglaziovia variegata

(Bromeliaceae)

Autores: Sarah Raquel G. de Lima-Saraiva, Amanda L. Guimarães, Ana P. de Oliveira,

Henrique C. C. Saraiva, Raimundo G. de Oliveira-Júnior, Vanessa R. P. de Barros, Roniere A.

de Oliveira, Fabrício S. Silva, Ricardo S. Lima, Maria H. T. de Matos, Elba L. C. Amorim,

Jackson R.G. da S. Almeida


Antioxidant Activity and Acute Toxicity of Neoglaziovia variegata

(Bromeliaceae)

Sarah R.G. de LIMA-SARAIVA1, Amanda L. GUIMARÃES

2, Ana P. de OLIVEIRA

2,

Henrique C. C. SARAIVA2, Raimundo G. de OLIVEIRA-JÚNIOR

2, Vanessa R. P. de

BARROS2, Roniere A. de OLIVEIRA

2, Fabrício S. SILVA

2, Ricardo S. LIMA

2, Maria H. T.

de MATOS2, Elba L. C. AMORIM

1, Jackson R.G. da S. ALMEIDA

2,1

1Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil

2Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Farmácia, 50.740-521, Recife,

Pernambuco, Brazil

SUMMARY. Antioxidant activities of N. variegata were evaluated by using DPPH radical

scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching and compared with ascorbic acid, BHA

and BHT. The total phenolics content of the extracts was determined by the Folin-

Ciocalteu method. Total flavonoid was also determined. The most significant total

phenolic content was of 543.50 ± 9.38 mg of gallic acid equivalent/g for AcOEt extract,

which presented the best antioxidant activity (IC50 5.08 ± 0.20 µg/ml) for DPPH

scavenging. The acute toxicity of Nv-EtOH was performed 2.0 g/kg intraperitoneally and

5.0 g/kg orally in mice. No mortality and no toxicity signs were observed, indicating low

toxicity of the extract. Blood was removed after 14 days for laboratory analysis of

hematological and biochemical parameters. Alterations of AST and creatinine were

observed. The data obtained showed that the doses induced microscopic alterations in the

liver and kidney. In conclusion, the Nv-EtOH can be considered of low toxicity.

1 Corresponding author: Tel/fax + 55-87-21016862. E-mail: [email protected]


Keywords: Antioxidant activity, acute toxicity, Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae

INTRODUCTION

Neoglaziovia variegata belongs to the family Bromeliaceae, subfamily Bromelioideae, and is

known popularly as “caroá”. This species can be commonly found in the Brazilian Caatinga.

Presents economic potential centered on the leaves, which are constituted by high resistance

fibers. The extraction of caroá reached significant levels in the 40's, before the advent of

synthetic fibers, caused by the expansion of sisal plantations1. This species, which, although

endemic of Caatinga and of proven economic importance, has not been studied as to their

chemical and pharmacological properties.

Some studies have demonstrated that species of the Bromeliaceae family have pharmacological

properties such as antioedematogenic and free radical scavenging2, antinociceptive and anti-

inflammatory3, anti-allergic

4, antiulcer

5 and cytotoxic activity

6.

Despite of the large number of species of this family, few have been studied chemically so far.

However, there is a considerable amount of identified compounds, which belong mainly to the

classes of flavonoids. These compounds polyphenolic are antioxidants7 and help to prevent

diseases associated with oxidative stress8,9

.

Oxidative stress, caused by an imbalance between reactive oxygen species (ROS) and the anti-

oxidative defense systems is considered to be a major etiological or pathogenic agent of

cardiovascular and neurodegenerative diseases, cancers, Alzheimer’s, diabetes and aging.

Because they inhibit or delay the oxidative process by blocking both the initiation and

propagation of oxidizing chain reactions, antioxidants for the treatment of cellular

degenerations are beginning to be considered10

.


Antioxidants stabilize or deactivate free radicals, often before they attack targets in biological

cells. Although almost all organisms possess antioxidant defense and repair systems to protect

against oxidative damage, they cannot prevent the damage entirely.

Nowadays, the interest in naturally occurring antioxidants has considerably increased for use in

food, cosmetic and pharmaceutical products, replacing synthetic antioxidants which are often

restricted due to carcinogenic effects11

.

On the other hand, it is necessary to carry out toxicological studies to evaluate safety

parameters which are not observed by the popular use of the plants. Toxicological studies help

to decide whether a new drug should be adopted for clinical use or not. The toxicological

analysis of plant extracts is of fundamental importance, since it characterizes the deleterious

effects of toxic compounds produced from its administration.

There is no previous report on the analysis of the antioxidant activity and acute toxicity of

Neoglaziovia variegata. In our continuing search of the medicinal plants from Brazilian

Caatinga for combine biodiversity conservation with drug discovery, the aim of this study was

to evaluate the antioxidant activity and possible toxic effects of ethanolic extract of N.

variegata in mice.

MATERIALS AND METHODS

Plant material

The leaves of Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez were collected in the city of Petrolina,



(CRAD). A voucher specimen was deposited at the Herbarium of São Francisco Valley, of the

Federal University of São Francisco Valley, with the code (6441).


Preparation of extracts

The leaves of Neoglaziovia variegata dried and pulverized (1.174 g), were subjected to

maceration with 95% EtOH for 72 hours. The solution was filtered and concentrated in a

rotatory evaporator oven at 50 oC, producing 45 g of crude ethanol extract (Nv-EtOH). For the

evaluation of antioxidant activity, the ethanolic extract was suspended in MeOH:H2O (3:7) and

partitioned with hexane, chloroform (CHCl3) and ethyl acetate (AcOEt) in crescent order of

polarity to obtain the respective extracts.

Total phenolic content

Total phenolic contents were assayed using the Folin-Ciocalteu reagent, it is based on the

method reported by Slinkard and Singleton12

, only the volumes have been adjusted13

. An

aliquot (40 μl) of a suitable diluted extracts was added to 3.16 ml of distilled water and 200 μl

of the Folin-Ciocalteu reagent, and mix well. The mixture was shaken and allowed to stand for

6 min, before adding 600 μl of sodium carbonate solution, and shake to mix. The solutions

were left at 20 °C for 2 hours and the absorbance of each solution was determined at 765 nm

against the blank and plot absorbance vs. concentration. Total phenolic contents of the extracts

(three replicates per treatment) were expressed as mg gallic acid equivalents per gram (mg

GAE/g) through the calibration curve with gallic acid. The calibration curve range was 50-1000

mg/l (R² = 0.9938). All samples were performed in triplicates.

Total flavonoid content

Total flavonoid content was measured by the aluminum chloride colorimetric assay14

. An

aliquot (300 µl) of Nv-EtOH, ethyl acetate extract or standard of catechin was added to flask

containing 1.5 ml of distilled water. To the flask was added 90 µl NaNO2 (5%). After 6 min,

180 µl AlCl3 (10%) was added. After 5 min, 600 µl 1M NaOH was added and the total volume


was made up with 330 µl of distilled water. The solution was mixed well and the absorbance

was measured against prepared reagent blank at 510 nm. Total flavonoid contents were

expressed as mg catechin equivalents per gram (mg CE/g) through the calibration curve with

catechin. The calibration curve range was 50-1000 mg/L (R² = 0.9784). All samples were

performed in triplicates.

Antioxidant activity

DPPH Free Radical Scavenging Assay

The free radical scavenging activity was measured using the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazil

(DPPH) assay15,16

. Sample stock solutions (1.0 mg/ml) of the extracts were diluted to final

concentrations of 243, 81, 27, 9, 3 and 1 µg/ml, in ethanol. One ml of a 50 µg/ml DPPH

ethanol solution was added to 2.5 mL of sample solutions of different concentrations, and

allowed to react at room temperature. After 30 min the absorbance values were measured at

518 nm and converted into the percentage antioxidant activity (AA) using the following

formula: AA% = [(absorbance of the control – absorbance of the sample)/ absorbance of the

control] x 100. Ethanol (1.0 ml) plus plant extracts solutions (2.5 ml) were used as a blank.

DPPH solution (1.0 ml) plus ethanol (2.5 ml) was used as a negative control. The positive

controls (ascorbic acid, BHA and BHT) were those using the standard solutions. Assays were

carried out in triplicate.

β-Carotene Bleaching Test

The β-carotene bleaching method is based on the loss of the yellow colour of β-carotene due to

its reaction with radicals formed by linoleic acid oxidation in an emulsion11

. The rate of β-

carotene bleaching can be slowed down in the presence of antioxidants. β-carotene (2 mg) was

dissolved in 10 ml chloroform and to 2 ml of this solution, linoleic acid (40 mg) and Tween 40


(400 mg) were added. Chloroform was evaporated under vacuum at 40 ºC and 100 ml of

distilled water was added, then the emulsion was vigorously shaken during two minutes.

Reference compounds (ascorbic acid, BHA and BHT) and sample extracts were prepared in

ethanol. The emulsion (3.0 ml) was added to a tube containing 0.12 ml of solutions 1 mg/ml of

reference compounds and sample extracts. The absorbance was immediately measured at 470

nm and the test emulsion was incubated in a water bath at 50 ºC for 120 min, when the

absorbance was measured again. Ascorbic acid, BHA and BHT were used as positive control.

In the negative control, the extracts were substituted with an equal volume of ethanol. The

antioxidant activity (%) was evaluated in terms of the bleaching of the β-carotene using the

following formula: % Antioxidant activity = [1 - (A0 – At) / (A00 – At

0)] x 100; where A0 is the

initial absorbance and At is the final absorbance measured for the test sample, A00

is the initial

absorbance and At0

is the final absorbance measured for the negative control (blank). The

results are expressed as percentage of antioxidant activity (% AA). Tests were carried out in

triplicate.

Animals

Male and female adult albino Swiss mice (30-40 g and aged 8-10 weeks), were used throughout

this study. The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/

dark cycle (lights on at 6:00 a.m.) with free access to food and water. When necessary, animals

were deprived of food 12 h prior to the experiments. Experimental protocols and procedures

were approved by the Federal University of Vale do São Francisco Animal Care and Use

Committee by number 21051023.

Acute toxicity


In the inquiry of the acute toxicity, animals were randomly divided in groups of five male and

five female Swiss mice (n=10). Animals were administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0

g/kg orally of the crude ethanol extract of Neoglaziovia variegata. Control group received

vehicle. Subsequently, the animals were observed for 14 days to evaluate the presence of signs

of toxicity. Mortality in each group within 72 h was recorded. LD50 was estimated by the

method described by Litchfield & Wilcoxon17

. Were assessed daily throughout the study the

parameters of body weight variation, consumption of food and water.

Behavioural screening

The behavioral screening of the mice was performed following parameters described by

Almeida et al.18

. The animals were observed at 0.5, 1, 2, 3 and 4 h after administration of Nv-

EtOH. Specific behaviors (piloerection, palpebral ptosis, abdominal contortions, locomotion,

hypothermia, muscular tonus, trembling, forepaws paralysis, sedation, ambulation reduction,

response to touch, analgesia and defecation) were observed and graded).

Hematological and biochemical parameters analysis of blood

For the evaluation of hematological and biochemical parameters of blood was utilized the

methodology described by Vasconcelos et al.19

and Araújo et al.20

with modifications. Blood

was removed after 14 days through brachial plexus for laboratory analysis of hematological

parameters: count of erythrocytes (106/mm

3), hemoglobin (g/dL), hematocrit (%), the mean

corpuscular volume (MCV, μ3), the mean corpuscular hemoglobin (MCH, μg), the mean

corpuscular hemoglobin concentration (MCHC, %), leukocytes (103/mm

3), lymphocites (%),

monocytes (%) and platelets (103/mm

3). The biochemical parameters analyzed in serum

samples were glucose (mg/dL), cholesterol (mg/dL), triglycerides (mg/dL), AST/TGO (U/L),

ALT/TGP (U/L), urea (mg/dL) and creatinine (mg/dL). For the determination of hematological


parameters was used hematology analyser Sysmex XT-2000, for the biochemical parameters

was used an automatic analyser Wiener BT 3000 Plus.

Histopathological Analysis

Sections of tissues such as kidney and liver were obtained for histopathological studies. The

organs were fixed in 10% buffered formaldehyde for 18 h. After fixation, the organ was

immersed in 70% alcohol and transported to the Laboratory of Cell Biology, Histology and

Cytology, Campus of Agricultural Sciences of UNIVASF. It was then dehydrated in increasing

series of ethanol (80, 95 and 100%) subsequently clarified in xylene, and even embedded in

paraffin histology. From each paraffin block containing the tissue samples, sections of 7 µm

were cut in microtome and mounted on glass slides, which were stained with hematoxylin and

eosin for further evaluation of tissues structure in light microscope (400 x).


The data obtained were analyzed using the GraphPad Prism® version 4.0 and expressed as

mean ± S.E.M or mean ± S.D. as appropriate. Statistically significant differences between

groups were calculated by the application of Student’s t-test. Values were considered

significantly different at p < 0.05.

RESULTS AND DISCUSSION

Total phenolic, total flavonoid contents and antioxidant activity

Table 1 summarizes the results from the quantitative determination of phenolic (TP) and

flavonoids (TF) as well as the effect of extracts from Neoglaziovia variegata, ascorbic acid,

BHA and BHT on the DPPH free radical scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching


test. The extracts were evaluated by comparing with ascorbic acid, BHA and BHT, which are

well-known commercial antioxidants.

The total phenolic contents of the extracts were determined by Folin-Ciocalteu method as gallic

acid equivalents in milligrams per gram (mg GAE/g) while total flavonoid contents were

calculated as catechin equivalents in milligrams per gram (mg CE/g). Among the four extracts,

ethyl acetate extract (AcOEt) was containing highest (543.50 ± 9.38) amount of phenolic

compounds followed by CHCl3 extract (203.90 ± 10.23) and crude ethanol extract (65.13 ±

1.25). Numerous publications applied the total phenols assay often found excellent linear

correlations between the total phenolic profiles and the antioxidant activity21

. For the total

flavonoid content, the highest value was observed in AcOEt extract (262.30 ± 1.33) while the

CHCl3 and crude ethanol extract (EtOH) presented 32.52 ± 4.19 and 7.82 ± 10.28 mg CE/g,

respectively.

In the present study, the antioxidant ability of the N. variegata extracts was investigated

through some in vitro models such as radical scavenging activity using, 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) method and β-carotene-linoleate model system. Antioxidant activity on

method of DPPH was expressed as IC50 which is defined as the concentration sufficient to

obtain 50% of a maximum effect estimate in 100%. Lower IC50 value indicated higher

antioxidant activity. In β-carotene-linoleate model system the antioxidant activity was

expressed as percentage of antioxidant activity (%AA).

The DPPH reactivity is one popular method for screening of the free radical-scavenging ability

of compounds that has been extensively used for screening antioxidants from plant extracts.

DPPH is a stable free radical that reacts with compounds that can donate a hydrogen atom. This

method is based on the scavenging of DPPH through the addition of a radical species or an

antioxidant that decolourizes the DPPH solution. The degree of color change is proportional to

the concentration and potency of the antioxidants22

. The data showed that the AcOEt and


CHCl3 extracts exhibited excellent free radical scavenging activity. The AcOEt extract showed

better antioxidant activity than BHT using by DPPH method, with a value of IC50 of 5.08 ±

0.20 µg/ml. BHA was the most effective antioxidant, with a value of IC50 of 3.50 ± 3.17 µg/ml.

It appears that N. variegata have compounds with a strong hydrogen-donating capacity and can

efficiently scavenge DPPH radicals.

The antioxidant activity of extracts was also evaluated by the β-carotene/linoleate bleaching

method. This method is based on the loss of the yellow colour of β-carotene due to its reaction

with radicals formed by linoleic acid oxidation in an emulsion. β-carotene in this model system

undergoes rapid discoloration in the absence of an antioxidant. The rate of the β-carotene

bleaching can be slowed down in the presence of antioxidants23

. This method is one of the

antioxidant assays suitable for plant extracts. All extracts had lower antioxidant activity than

BHT and BHA.

Acute toxicity

Neoglaziovia variegata is a plant that has not broad popular use. However, studies are needed

to prove the safety of its use, as well as the analysis of acute toxicity is fundamentally

important to identify the doses that could be used, and to reveal the possible clinical signs

caused by the extract under investigation.

In the acute toxicity of Nv-EtOH, behavioral and physiological alterations were not observed

neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally,

respectively, indicating low toxicity of the extract. In this experiment was observed that the Nv-

EtOH has LD50 > 5000 mg/kg. According to Kennedy et al.24

, substances that present LD50

higher than 5.0 g/kg by oral route can be considered practically non-toxic.

There were significant changes (p < 0.001) in body weight of mice from day 1 to day 14 in

group treated with the extract at dose of 5 g/kg v.o. At the end of the experiment, the average of


control group was of 40.44 ± 0.27 g, while the treated group was of 34.59 ± 0.22 g. The

variation of weight along of the experiment could be seen in Figure 1. Generally, alterations in

body weight gain of mice treated with substances reflect toxic effects, and have been used as an

indicator of adverse effects of drugs and chemicals, especially if weight loss is greater than

10% of initial weight in the mices25

. Food and water consumption also showed significant

alterations (Figures 2 and 3). The amount of food consumed at the end of the experiment was of

53.69 ± 1.64 g for the control group, while the treated group was of 29.62 ± 0.86 g (p < 0.001).

The amount of water consumed at the end of the experiment was of 94.38 ± 3.15 ml for the

control group, while the treated group was of 65.77 ± 3.41 ml (p < 0.001). The analysis of food

and water intake in an animal experimentation is important to investigate the safety of

substances studied for therapeutic purposes26

.

Behavioural screening

The behavioural screening of animals was realized at 0.5, 1, 2, 3 and 4 h after

administration of Nv-EtOH 2.0 and 5.0 g/kg (body weight) intraperitoneally and orally,

respectively. The animals did not display significant changes in behavior. The animals did not

show any sign of toxicity or change in behavioral or other physiological activities.


Analyzing the results to hematological parameters (Table 2), it is possible to observe that, after

administration of doses of 2.0 g/kg i.p. and 5.0 g/kg v.o., there was no significant variation in

hematological parameters (red blood cells, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC, leukocytes and

platelets); only a few changes were found statistically significant (p < 0.05) in hematological

parameters such as increase of percentage of hematocrit, lymphocytes and monocytes.

However, the clinical significance of this increase is being investigated. This analysis is very


important because the hematopoietic system is highly sensitive to toxic substances in the blood,

serving thus as an important parameter to analyze the physiological and pathological status in

animals27

.

Regarding the biochemical parameters, the results show that the glucose, cholesterol,

triglycerides, aspartate amino transferase (AST/TGO), creatinine and urea have not statistical

significance compared to the control group (Table 3). The levels of alanine amino transferase

(ALT/TGP) after the dose of 2.0 g/kg i.p. were significantly lower than control group (p <

0.05). The animals treated with a dose of 5 g/kg v.o. showed increased levels of AST and

creatinine, although this was not statistically significant. AST and creatinine are good

indicators of liver and kidney functions, respectively. Alterations in their levels suggest

alterations in these organs. Transaminases (AST and ALT) are liver enzymes located within the

hepatocytes and are used as biochemical markers to potentially toxic substances, since their

biochemical values are high when an injury occurs in the liver parenchymal28

.

Histopathological Analysis

Macroscopic examination of the organs of the animals treated with extract showed no changes

in color compared to control. In the histopathology the kidney tissue showed perivascular

infiltrates and parenchymal cells of varying intensity, with expansive characteristics well

defined, discrete lesions restricted, but multifocal lesions in large and extensive areas, and the

presence of edema, areas of necrosis and the appearance of a mass of disorganized cell growth

and intense (Figure 4). In the liver, it was evident cellular infiltrates, with the same

characteristics, injuries ranging from mild to more extensive perivascular and parenchymal

liver. In some animals the lesions are quite clear and expansive nature (Figure 5). These

microscopic changes were present in both groups treated with doses of 2 g/kg i.p. and 5 g/kg


v.o. The data obtained showed that the doses did not induce death of animals, but showed

alterations in the liver and kidney.

Toxic effects of substances can reach all systems and organs, however, the liver and kidneys

are the organs most commonly affected because the kidneys are the organs responsible for

excretion of metabolic wastes and control of homeostasis. The liver is the main organ for drug

metabolism and detoxification.

CONCLUSIONS

The present study was designed to further investigate the antioxidant activity and toxicity of

ethanolic extract of N. variegata by using acute toxicity analysis. To our knowledge, this

species is being investigated for the first time.

N. variegata could be a good source of antioxidant phenolics. It was demonstrated that the

extracts contains high content of phenolic compounds and flavonoids. The antioxidant activity

presented by the extracts is related to the presence of these compounds.

Based on the results presented, we conclude that the Nv-EtOH may be considered of low

toxicity, since the acute administration intraperitoneally and orally produced no deaths or signs

of toxicity in animals. The extract not induced significant alterations in almost all biochemical

and hematological parameters observed. The levels of AST and creatinine were altered,

indicating that there may be potential liver and kidney damage. This hypothesis was confirmed

by histopathological analysis of organs. However, further long-term toxicological studies

(chronic toxicity) are needed in order to establish it as medicine.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from CNPq and FACEPE. The authors wish to

express their thanks to Prof. Dr. José Alves de Siqueira Filho and André Paviotti Fontana of


Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) for collection and

botanical identification of the plant material.

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TP (mg GAE/g) TF (mg CE/g) DPPH (IC50,

µg/ml)

β-carotene

bleaching (% AA)

EtOH 65.13 ± 1.25 7.82 ± 10.28 243.70 ± 69.99 41.87 ± 3.20

Hexane --- --- 517.30 ± 152.30 56.15 ± 2.73

CHCl3 203.90 ± 10.23 32.52 ± 4.19 48.31 ± 1.65 29.84 ± 13.49

AcOEt 543.50 ± 9.38 262.30 ± 1.33 5.08 ± 0.20 40.31 ± 7.61

Ascorbic acid --- --- 4.72 ± 2.67 7.50 ± 2.12

BHA --- --- 3.50 ± 3.17 80.93 ± 3.45

BHT --- --- 17.87 ± 2.98 86.77 ± 1.14

Table 1. Total phenolics (TP), total flavonoids (TF) and antioxidant activity of extracts from

Neoglaziovia variegata. The IC50 values were obtained by interpolation from linear regression

analysis with 95% of confidence level. IC50 is defined as the concentration sufficient to obtain

50% of a maximum effect estimate in 100%. Values are given as mean ± SD (n=3).


Parameters Groups

Control After 2 g/kg i.p. After 5 g/kg v.o.

Erythrocytes (106/mm

3) 8.47 ± 0.10 8.50 ± 0.08 8.62 ± 0.15

Hemoglobin (g/dL) 12.90 ± 0.20 13.03 ± 0.23 13.13 ± 0.12

Hematocrit (%) 34.40 ± 0.66 35.05 ± 0.32 34.70 ± 0.18*

MCV (μ3) 41.20 ± 0.48 42.35 ± 0.46 40.40 ± 0.84

MCH (μg) 15.77 ± 0.21 15.70 ± 0.19 15.25 ± 0.16

MCHC (%) 37.40 ± 0.33 37.37 ± 0.61 37.93 ± 0.47

Leukocytes (103/mm

3) 2.98 ± 0.16 2.98 ± 0.21 3.11 ± 0.15

Lymphocites (%) 63.23 ± 2.00 69.73 ± 0.58* 62.01 ± 2.62

Monocytes (%) 1.45 ± 0.41 1.57 ± 0.26 2.25 ± 0.25*

Platelets (103/mm

3) 471.50 ± 48.66 447.00 ± 65.91 341.50 ± 59.31

Table 2. Hematological parameters of blood of Swiss mice treated with 2.0 g/kg

intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Neoglaziovia variegata after 14

days (acute toxicity). Values are mean ± S.E.M, n = 8. *p < 0.05; Student’s t-test at 5 %

probability.


Parameters Groups


Glucose (mg/dL) 131.00 ± 10.08 132.00 ± 8.94 141.00 ± 16.67

Cholesterol (mg/dL) 118.20 ± 8.20 107.70 ± 6.32 121.80 ± 5.74

Triglycerides (mg/dL) 142.80 ± 23.64 135.70 ± 19.08 148.80 ± 8.98

AST/GOT (U/L) 170.00 ± 11.07 197.30 ± 18.25 236.70 ± 28.26

ALT/GPT (U/L) 84.93 ± 5.82 65.72 ± 5.22* 86.40 ± 12.00

Urea (mg/dL) 73.50 ± 6.81 63.83 ± 3.16 69.75 ± 7.47

Creatinine (mg/dL) 0.73 ± 0.09 0.62 ± 0.05 0.85 ± 0.02

Table 3. Biochemical parameters obtained from the serum of Swiss mice treated with 2.0 g/kg

intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Neoglaziovia variegata after 14

days (acute toxicity). Values are mean ± S.E.M, n = 8. *p < 0.05; Student’s t-test at 5 %

probability.


Figure 1. Body weight gain for animals treated with Nv-EtOH during 14 days (n= 10).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530

35

40

45Control

After 2 g/kg i.p.

After 5 g/kg v.o.

Days

Bo

dy w

eig

ht

gain

(g

)


Figure 2. Consumption of food for animals treated with Nv-EtOH during 14 days (n= 10).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1520

30

40

50

60

70Control

After 2 g/kg i.p.

After 5 g/kg v.o.

Days

Co

nsu

mp

tio

n o

f fo

od

(g

)


Figure 3. Consumption of liquid for animals treated with Nv-EtOH during 14 days (n= 10).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1525

50

75

100

125Control

After 2 g/kg i.p.

After 5 g/kg v.o.

Days

Co

nsu

mp

tio

n o

f w

ate

r (m

l)


Figure 4. Photomicrographs of kidney histopathology from representative animals. (A) Control

group, (B) Nv-EtOH (2 g/kg i.p.) and (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.) (hematoxylin-eosin stain).

A B C


Figure 5. Photomicrographs of liver histopathology from representative animals. (A) Control

group, (B) Nv-EtOH (2 g/kg i.p.) and (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.) (hematoxylin-eosin stain)

A B C


APENDICE C – Artigo III

Artigo III:

ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF

Encholirium spectabile (BROMELIACEAE) IN MICE


ARTIGO III


Revista: Records of Natural Products

Título: Antinociceptive Activity of the Ethanolic Extract of Encholirium

spectabile (Bromeliaceae) in Mice

Autores: Sarah R. G. de Lima-Saraiva, Henrique C. C. Saraiva, Juliane C. Silva, José A. de

Siqueira-Filho, Patrícia K. F. Damasceno, Carla R. C. Branco, Alexsandro Branco, Elba Lúcia

C. Amorim and Jackson Roberto G. da S. Almeida


Rec. Nat. Prod. x:x (2012) xxx-xxx

Antinociceptive Activity of the Ethanolic Extract of Encholirium

spectabile (Bromeliaceae) in Mice

Sarah R. G. de Lima-Saraiva1, Henrique C. C. Saraiva

2, Juliane C. Silva

2,

José A. de Siqueira-Filho2, Patrícia K. F. Damasceno

3, Carla R. C. Branco

3,

Alexsandro Branco3, Elba Lúcia C. Amorim

1 and Jackson Roberto G. da S.

Almeida2*

1 Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Farmácia, 50.740-521, Recife, Pernambuco,

Brazil.

2 Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

3 Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de Santana,

44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil

(Received January xx, 2012; Revised xxxxx xx, 2012; Accepted xxxxxx xx, 2012)

Abstract: This study was carried out to evaluate the antinociceptive effects of ethanolic extract of the leaves from

E. spectabile (Es-EtOH) in mice using chemical (writhing and formalin) and thermal (hot plate) models of

nociception. HPLC was used to determine the fingerprint chromatogram. The Es-EtOH was examined for its

intraperitoneal (i.p.) antinociceptive activity at the doses of 100, 200 and 400 mg/kg body weight. In the acetic

acid-induced writhing test, the Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) reduced the number of writhings by 68.59,

79.33 and 65.28%, respectively. Additionally, Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) decreased by 34.14, 52.61

and 60.97%, respectively, the paw licking time in the first phase, as well as 89.56, 79.90 and 96.71%, respectively,

in the second phase of the formalin test. In a general manner, Es-EtOH did not show effect in the hot plate test, the

extract increase the latency time only at dose of 100 mg/kg after 60 min. The presence of phenolic compounds in

the extract was confirmed using HPLC. These results indicate that Es-EtOH has antinociceptive activity, probably

of peripheral origin. The mechanism involved is not completely understood, at least in part, there is the

participation of opioid receptors.

Keywords: antinociceptive activity; Encholirium spectabile; Bromeliaceae.

1. Introduction

Herbal drugs have been used since ancient times as medicines for the treatment of a range of diseases.

Medicinal plants have played a key role in world health. In spite of the great advances observed in

* Corresponding author: E-Mail: [email protected]; Phone/Fax: +55-87-21016862.

mailto:[email protected]


modern medicine in recent decades, plants still make an important contribution to health care [1].

Natural products of plant origin are still a major part of traditional medicinal systems in developing

countries. There is also a resurgence of interest in herbal medicines in western countries as an

alternative source of drugs often for diseases as inflammation and pain [2]. The need for safer and

effective analgesic drugs justifies the interest in the study of medicinal plants because many species of

plants are used worldwide for the relief of pain.

The Bromeliaceae family is predominantly Neotropical and comprises 58 genera and approximately

3172 species [3]. The phytochemistry of this family is characterized by the presence of flavonoids,

triterpenoids, steroids, diterpenes, cinnamic acid derivatives, lignans, nitrogen compounds among others

[4]. Some studies have demonstrated that species of the Bromeliaceae family have pharmacological

properties such as antioedematogenic and free radical scavenging [5], antinociceptive and anti-

inflammatory [6], anti-allergic [7] and cytotoxic activity [8].

Encholirium is a Brazilian genus of Bromeliaceae which occurs exclusively in rocky landscapes in areas

of Cerrado, Caatinga and Atlantic Forest and is constituted by 23 species. This genus is exclusively

Brazilian and has restricted distribution of most endemic species [9-10].

Encholirium spectabile is the species best known of the genus because the frequency with which it is

found in outcrops rocky throughout the Brazilian Caatinga [11]. Is popularly known as “macambira-de-

flecha” and “macambira-de-pedra” [12]. It is one of the plants that have been included in a conservation

program of the “Reference Center for Recovery of Flora in Priority Areas of the San Francisco River

Basin – The Caatinga Biome”.

Little is known about the chemistry and pharmacology of Encholirium species. Previous study realized

by our research group demonstrated that the ethanolic extract of Encholirium spectabile has

gastroprotective activity against gastric mucosal damage induced by ethanol, HCl/ethanol, ibuprofen,

ischemia and reperfusion, which suggests that the extract may activate cytoprotective mechanisms that

increase the release of prostaglandins. The presence of phenolic compounds, mainly flavonoids,

contributes to the gastroprotective activity of the extract [13]. Except this study, so far no other

biological studies were carried out on Encholirium spectabile.

One of most important side effects of conventional analgesic and anti-inflammatory drugs (NSAIDs, for

example) is their ulcerogenic activity. Flavonoids are good analgesic and anti-inflammatory compounds

and are also able to protect the gastric mucose against a variety of ulcerogenic agents. Many studies

were performed examining the antiulcerogenic activity of flavonoids using both naturally derived and

synthetic compounds. Flavonoids are reported to act in the gastrointestinal tract as antisecretory and

antiulcer agents [14].

Considering the effect shown by the ethanolic extract of E. spectabile using different standard

experimental models of induced acute gastric ulceration, the objective of this work was to evaluate the

antinociceptive effect of the extract of this plant in mice using experimental models of pain. There is no

previous report on the analysis of the antinociceptive activity of Encholirium spectabile.

2. Materials and Methods

2.1. Plant material The leaves of Encholirium spectabile Mart. ex Schult. f. were collected in the city of Petrolina, State of

Pernambuco, Brazil, in January of 2010. The samples were identified by André Paviotti Fontana, a

botanist from Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). A voucher specimen

(6443) was deposited at the Herbarium Vale do São Francisco (HVASF) of the Federal University of

São Francisco Valley.

2.2. Extraction The leaves dried and pulverized (1196 g) were macerated with ethanol 95% at room temperature for 72

h. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a rotatory evaporator oven at 50 oC, producing 64 g of crude ethanol extract (Es-EtOH).


2.3. Analysis of Es-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC) The analysis of phenolic compounds profile were performed in liquid chromatograph Hitachi

model Lachrom Elite, colunm LiCospher 100 RP18 (5 mm) with dimensions (150 mm x 04 mm) Merck

equipped with Diode Array Detector (DAD). The mobile phase used was a solution of H2O/H3PO4 0.1%

(A) and MeOH (B) provided initial 75% of A and 25% of B for 25 minutes. The column temperature

was kept constant at 30 °C with a flow of 1.0 ml/min. For the extract was used an injection volume of

20 μl. Spectral data were recorded in 322 nm during the whole run.

2.4. Animals Male and female adult albino Swiss mice (25-35 g), were used throughout this study. The animals were

randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/ dark cycle (lights on at 6:00 a.m.)

with free access to food and water. When necessary, animals were deprived of food 12 h prior to the

experiments. They were used in groups of five or six animals each. All nociception tests were carried

out by the same visual observer. Experimental protocols and procedures were approved by the Federal

University of São Francisco Valley Animal Care and Use Committee by number 21051023.

2.5. Acute toxicity In the inquiry of the acute toxicity, groups of five male and five female Swiss mice (n=10) were

administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0 g/kg orally of the crude ethanol extract of E. spectabile

(Es-EtOH). Control group received vehicle. Mortality in each group within 72 h was recorded and the

animals were observed during a period of 14 days for the presence of toxicity signals.

2.6. Acetic acid-induced writhing in mice This test was performed as described by Koster et al. [15] with modifications. Mice (n=6) were

intraperitoneally pre-treated 30 min before the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 10 ml/kg).

Vehicle (saline), Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, body weight), acetylsalicylic acid (ASA, 200

mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered before acetic acid injection. Following the injection

of acetic acid, the intensity of nociceptive behavior was quantified by counting the total number of

writhes (a response consisting of contraction of the abdominal wall, pelvic rotation followed by hind

limb extension) occurring between 5 and 15 min after stimulus injection [16].

2.7. Formalin test The method used was similar to that described previously [17-19]. Twenty microlitres of 2.5% formalin

was injected subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds) spent in licking and

biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain response. Responses were

measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic phase) and 15-30 min after formalin

injection (second phase, inflammatory phase). Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg), ASA (200 mg/kg)

and morphine (10 mg/kg) were administered intraperitoneally 60 min before formalin injection. Control

animals received the same volume of saline. Mice were observed in the chambers with a mirror

mounted on three sides to allow view of the paws.

2.8. Hot plate test Mice were pre-selected on the hot plate at 55 ± 0.5

oC. Licks on the rear paws were the parameters of

observation. Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or jumping) greater than

20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline, 0.1 ml/10 g), morphine (10

mg/kg) and Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p. Latency time (in seconds) for each mice was

determined on the hot plate during the maximum period of 20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min

after the administration of the extract [20].

2.9. Statistical analysis The data obtained from animal experiments were analyzed using the GraphPad Prism program version

4.0 and expressed as mean ± S.E.M. Statistically significant differences between groups were calculated


by the application of analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test. Values were

considered significantly different at p < 0.05.

3. Results and Discussion Phytochemical screening showed that the ethanolic extract of leaves from E. spectabile (Es-EtOH)

contains phenols, flavonoids, steroids and terpenoids. Phenolic profiles at 320 nm for the Es-EtOH

evaluated are presented in Figure 1. The chromatogram shows the presence of ten peaks with different

retention times: 10.89 (1), 11.12 (2), 11.78 (3), 12.86 (4), 13.37 (5), 14.44 (6), 15.16 (7) 15.58 (8), 16.68

(9) and 17.63 (10). Based on their UV-Vis spectral data and their retention time, the compounds have

UV band characteristic for cinnamic acid, coumarin and flavonoid derivatives. These compounds are

under investigation.

Figure 1. High performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) profiles of

Encholirium spectabile ethanolic extract recorded at 320 nm.

Acute toxicity results showed no signs of toxicity and mortality of the animals. Therefore, an

LD50 > 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally may be assumed.

The intraperitoneal administration of Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) decreased

significantly the action of acetic acid used to induce writhes in mice, when compared to the control

group. The percentages of inhibition were of 68.59, 79.33 and 65.28%, respectively. ASA (200 mg/kg)

also significant inhibited the writhes, while the morphine abolished the nociception induced by acetic

acid. The results can be seen in Figure 2.

The acetic acid-induced writhing reaction in mice has been largely used as screening tool for

assessment of analgesic or anti-inflammatory properties of new agents as well as a typical model for

visceral inflammatory pain [21-22]. The local irritation provoked by a test agent in the intraperitoneal

cavity triggers a variety of mediators, such as bradykinin, substance P and prostaglandins, especially

PGI2, as well as some cytokines such as IL-1β, TNF-α and IL-8 [23]. Es-EtOH was able to reduce the

writhing in all doses tested, suggesting that its antinociceptive effect could be related to inhibition of

mediators released in response to acetic acid.

1 3 5

78

9

2

4

6

101 3 5

78

9

2

4

6

10


Figure 2. Effect of ethanolic extract of the Encholirium spectabile (Es-EtOH), acetylsalicylic acid

(ASA) and morphine on acetic acid induced writhing test. Values are mean ± S.E.M. **p < 0.01,


The extract (100, 200 and 400 mg/kg) injected 60 min before formalin showed a significant

effect to reduce the licking time in both phases of this test. In the first phase (neurogenic pain) the

effects were dose-dependent with percentages of inhibition of 34.14, 52.61 and 60.97%, respectively.

The effect was more significant in the second phase (inflammatory pain), 89.56, 79.90 and 96.71%,

respectively. Similarly, morphine (10 mg/kg) caused significant inhibition of 61.67 and 81.06% of

formalin-induced nociceptive behavior in the first and second phases, respectively. ASA (200 mg/kg)

caused inhibition of 88.79% in the second phase of this test. The results of formalin test are showed in

Figure 3.

The formalin test is believed to represent a significant model of clinical pain. This test allows

the evaluation of two distinct phases. It is known that the first phase is result of the direct chemical

activation of myelenated and unmyelenated nociceptive afferent fibers while the second phase response

is considered as a consequence of noxious stimulus-evoked long term changes in the properties of spinal

dorsal horn neurons [24]. The first phase occurs during the first 5 min after the formalin injection and is

characterized by the direct stimulation of nociceptors presents on afferent C and in part by Aδ fibers

(glutamate and substance P release). The second phase occurs between the 15th and 30

th min after

formalin injection and is putatively caused by the release of pro-inflammatory mediators such as

adenosine, bradykinin, histamine, prostaglandins and serotonin. The results presented in this test

(inhibition of both phases, although higher inhibition was seen in the second phase) suggest that the Es-

EtOH might possess anti-inflammatory activity. The extract exerts its antinociceptive effects connected

with peripheral mechanisms. However, the inhibition presented in the first phase suggests a disruption

of either the production or release of some central neurotransmitters [25].

In another set of experiments, naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) was injected 30 min before the morphine (10

mg/kg) and Es-EtOH (400 mg/kg). The pre-treatment of animals with naloxone had significant effect on

the antinociception of the first phase. The naloxone reverted the effect caused by morphine in both

phases of formalin-induced licking. At least in part, the antinociceptive effect presented by the extract

may involve the participation of opioid receptors.

0

10

20

30

**

**

**

** **

Control

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs


Figure 3. Effect of ethanolic extract of Encholirium spectabile (Es-EtOH), acetylsalicylic acid (ASA),

morphine, morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Es-EtOH + NLX (400 mg +

1.5 mg/kg) on formalin test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different

from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

Using the hot plate test, in a general manner, the administration of the extract did not induce

alterations in the latency time when compared to the control. The hot plate is a method used to

investigate central antinociceptive activity. Interestingly, the extract at the doses which inhibited the

nociception caused by acetic acid and formalin, has no effect on the hot plate test. The effect was

observed only at time of 60 min with a dose of 100 mg/kg. The present study lead us to the conclusion

that the opioid system, at least in part, is involved in the antinociceptive effect of the extract. However,

in this method, the pre-treatment with naloxone, a non-selective opioid receptor antagonist, not reversed

significantly the antinociceptive effect presented by the extract. This could indicate that the effect is

really by peripheral mechanisms. The results are shown in Figure 4.

First phase

0

10

20

30

40

50

60

70

**

**

*

Control

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg** **

Morph + NLX

Es-EtOH + NLX

(a)

Lic

kin

g t

ime (

s)

Second phase

0

25

50

75

100

125

**

****

Control

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

****

Morph + NLX

Es-EtOH + NLX**

(b)

Lic

kin

g t

ime (

s)


Figure 4. Effect of ethanolic extract of Encholirium spectabile (Es-EtOH), morphine, morphine +

naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Es-EtOH + NLX (400 mg + 1.5 mg/kg) on hot plate

test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA

followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

In summary, we demonstrated that the ethanolic extract of Encholirium spectabile exhibit antinociception

when assessed in chemical models of nociception in mice. Novel antinociceptive agents could be discovered

from medicinal plants containing a wide variety of phytoconstituents. The presence of phenolic compounds

in the extract was confirmed using HPLC. The results indicate that Es-EtOH has antinociceptive activity,

probably of peripheral origin. The mechanism involved is not completely understood, at least in part, there is

the participation of opioid receptors. Further research would be of interest to explain the exact mechanism of

this antinociceptive effect.

Acknowledgments

This work was supported by grants from Brazilian agencies CNPq (Process 476770/2010-6) and

FACEPE (Process APQ-0542-4.03/10).

Supporting Information

Supporting Information accompanies this paper on http://www.acgpubs.org/RNP

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30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Es-EtOH 100 mg/kg

Es-EtOH 200 mg/kg

Es-EtOH 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Morph + NLX

Es-EtOH + NLX

***

** ****

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)

http://www.acgpubs.org/RNP


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APENDICE D – Artigo IV

Artigo IV:

PHENOLIC CONTENT, ANTIOXIDANT AND ANTINOCICEPTIVE

PROPERTIES AND ACUTE TOXICITY OF ETHANOLIC EXTRACT OF

Bromelia laciniosa (BROMELIACEAE)


ARTIGO IV


Revista: Journal of Medicinal Food

Título: Phenolic Content, Antioxidant and Antinociceptive Properties and Acute

Toxicity of Ethanolic Extract of Bromelia laciniosa (Bromeliaceae)

Autores: Sarah R. G. de Lima-Saraiva, Amanda L. Guimarães, Ana P. de Oliveira, Clara R.R.

Santana, Henrique C. C. Saraiva, Juliane C. Silva, José A. de Siqueira-Filho, Patrícia K. F.

Damasceno, Carla R. C. Branco, Alexsandro Branco, Elba Lúcia C. Amorim e Jackson Roberto

G. da S. Almeida


Phenolic Content, Antioxidant and Antinociceptive Properties and

Acute Toxicity of Ethanolic Extract of Bromelia laciniosa

(Bromeliaceae)

Sarah R.G. Lima-Saraiva1, Amanda L. Guimarães

2, Ana P. de Oliveira

2, Clara R.R. Santana

2,

Henrique C.C. Saraiva2, Juliane C. Silva

2, José A. de Siqueira-Filho

2, Patrícia K.F.

Damasceno3, Carla R.C. Branco

3, Alexsandro Branco

3, Elba Lúcia C. Amorim

1, Jackson

Roberto G.S. Almeida2,2

1Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Farmácia, 50.740-521, Recife,

Pernambuco, Brazil.

2Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

3Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de

Santana, 44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil.

Running title: Pharmacologic effects of Bromelia laciniosa

2 Correspondence to: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, Universidade Federal do Vale do São Francisco,

Postal code: 56.304-205, Petrolina, PE, Brazil. Tel/Fax + 55-87-21016862. E-mail: [email protected]


ABSTRACT The phenolic content, antioxidant and antinociceptive activity as well as the

acute toxicity of Bromelia laciniosa were evaluated. An HPLC fingerprint of phenolic

compounds was developed and the total phenolics content of extracts was determined by the

Folin-Ciocalteu method. Total flavonoid content also was measured. Antioxidant activities

were evaluated by using DPPH radical scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching and

compared with ascorbic acid, BHA and BHT. The antinociceptive effects of ethanolic extract

(Bl-EtOH) in mice were carried out using chemical (writhing and formalin) and thermal (hot

plate) models of nociception. The acute toxicity of Bl-EtOH was performed 2.0 g/kg

intraperitoneally and 5.0 g/kg orally in mice. Blood was removed for laboratory analysis of

hematological and biochemical parameters. The AcOEt extract showed better antioxidant

activity than BHT using by DPPH method (IC50 = 6.51 ± 0.14 µg/ml). Bl-EtOH (100, 200 and

400 mg/kg, i.p.) reduced the number of writhing (91.80, 93.44 and 78.68%, respectively) and

the number of paw licks during the first (60.86, 62.84 and 66.79%) and second phase (91.93,

82.18 and 88.73%) of the formalin test. Naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) antagonized the

antinociceptive action of Bl-EtOH (100 mg/kg), and this finding suggests participation of the

opioid system. The effect of Bl-EtOH on hot plate response provides a confirmation of its

central effect. Peripheral, and at least in part, central mechanisms, may be involved in this

antinociceptive effect. The results of acute toxicity support the concept that the ethanolic

extract from leaves is safe for human use.

KEY WORDS: phenolic content, antioxidant activity, antinociceptive activity, acute toxicity,

Bromelia laciniosa, Bromeliaceae.


INTRODUCTION

The caatinga biome (semi-arid vegetation) is a highly threatened biome covering a vast area in

Northeastern Brazil, and is the source of many little studied natural resources.1 Many medicinal

plants species from the caatinga are widely known and used in folk medicine and for

commercial manufacturing of phytotherapeutic products. Few ethnobotanical and

pharmacological studies have been undertaken in this region, however, in spite of the great

cultural and biological diversity to be found there.2 In the Brazilian Northeastern, the caatinga

has fundamental importance in the lives of people that inhabit this region because it offers a

wide variety of animals and plants that are used for food, fuel, building materials and medicinal

purposes.3

The Bromeliaceae, one of the largest botanical families of the New World, is distributed

extensively in tropical America.4 This family comprises 58 genera and 3172 species.

5

Considering the large number of species of the Bromeliaceae family few have been studied

chemically so far. Despite this, there is a considerable amount of identified compounds, which

mostly belong to the class of triterpenoid and flavonoids. Other classes of compounds such as

sterols, diterpenes, cinnamic acids, glycerol replaced, lignans, nitrogen compounds, among

others, were also identified in this family, although greatly reduced in number. From the

pharmacological standpoint, there are also few studies in the literature.6

Some studies have demonstrated that species of the Bromeliaceae family have pharmacological

properties such as antioedematogenic and free radical scavenging7, antinociceptive and anti-

inflammatory8, anti-allergic

9, antiulcer

10, cytotoxic

11, antioxidant and antimycobacterial

activities.12

Bromelia is one of the most diverse genera within Bromeliaceae and includes 56

species.5 Some species of this genus are used in traditional medicine as a vermifuge, anti-


helmintic, diuretic, in cases of respiratory and kidney problems, intestinal disorders, diabetes,

among others.13

Bromelia antiacantha is one of the most studied species.14

Bromelia laciniosa is a species native to the Brazilian Caatinga. This species is known in the

Northeast Region of Brazil as “macambira” and is used in the alimentation of man and

domestic animals, especially in times of drought.15

From the base of the leaves is extracted a

mass, which is produces a type of bread.16

The main therapeutic indications are for treat child

colic, diarrhea, fever, jaundice, dandruff and hepatitis.2 The decoction of the roots is also

popularly used against hepatitis and intestinal disorders, as a diuretic, while the dried and

powdered leaves are used in cooking as a source of protein.6,13

Considering the popular use and because of the scarcity of chemical and pharmacological

studies about this species, this study evaluated the phenolic content, antioxidant and

antinociceptive activities as well as the acute toxicity of the ethanolic extract from leaves of

Bromelia laciniosa in mice.

MATERIAL AND METHODS

Plant material

The leaves of Bromelia laciniosa Mart. ex Schult. f. were collected in the city of Petrolina,



(CRAD). A voucher specimen (6442) was deposited at the Herbarium of São Francisco Valley,

of the Federal University of São Francisco Valley.

Preparation of extracts

The leaves of B. laciniosa dried and pulverized (874 g), were subjected to maceration with 95%

EtOH for 72 hours. The solution was filtered and concentrated in a rotatory evaporator oven at


50 oC, producing 39 g of crude ethanol extract (Bl-EtOH). For the evaluation of antioxidant

activity, the ethanolic extract was suspended in MeOH:H2O (3:7) and partitioned with hexane,

chloroform (CHCl3) and ethyl acetate (AcOEt) in crescent order of polarity to obtain the

respective extracts.

Chemicals

Folin-Ciocalteu reagent, catechin, β-carotene, butylated hydroxyanisole (BHA) and butylated

hydroxytoluene (BHT) were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) was purchased from Fluka. Ascorbic acid was purchased

from Dinâmica, Brazil. Linoleic acid and gallic acid were obtained from Vetec, Brazil.

Recordings were made in a UV-VIS Spectrometer QUIMIS, Brazil. Acetic acid and

formaldehyde were purchased from Vetec, Brazil. Polyoxyethylenesorbitan monolate (Tween

80) and acetylsalicylic acid were purchased from Sigma. Morphine and naloxone were

purchased from União Química. All reagents and solvents were of analytical grade.

Analysis of Bl-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)

The analysis of phenolic compounds profile were performed in liquid chromatograph Hitachi

model Lachrom Elite, colunm LiCospher 100 RP18 (5 mm) with dimensions (150 mm x 04

mm) Merck equipped with Diode Array Detector (DAD). The mobile phase used was a

solution of H2O/H3PO4 0.1% (A) and MeOH (B) provided initial 75% of A and 25% of B for

25 minutes. The column temperature was kept constant at 30 °C with a flow of 1.0 ml/min. For

the extract was used an injection volume of 20 μl. Spectral data were recorded in 322 nm

during the whole run.

Total phenolic content


Total phenolic contents were assayed using the Folin-Ciocalteu reagent, it is based on the

method reported by Slinkard and Singleton17

, only the volumes have been adjusted.18

An

aliquot (40 μl) of a suitable diluted extracts was added to 3.16 ml of distilled water and 200 μl

of the Folin-Ciocalteu reagent, and mix well. The mixture was shaken and allowed to stand for

6 min, before adding 600 μl of sodium carbonate solution, and shake to mix. The solutions

were left at 20 °C for 2 hours and the absorbance of each solution was determined at 765 nm

against the blank and plot absorbance vs. concentration. Total phenolic contents of the extracts

(three replicates per treatment) were expressed as mg gallic acid equivalents per gram (mg

GAE/g) through the calibration curve with gallic acid. The calibration curve range was 50-1000

mg/l (R² = 0.9938). All samples were performed in triplicates.

Total flavonoid content

Total flavonoid content was measured by the aluminum chloride colorimetric assay.19

An

aliquot (300 µl) of Bl-EtOH, ethyl acetate extract or standard of catechin was added to flask

containing 1.5 ml of distilled water. To the flask was added 90 µl NaNO2 (5%). After 6 min,

180 µl AlCl3 (10%) was added. After 5 min, 600 µl 1M NaOH was added and the total volume

was made up with 330 µl of distilled water. The solution was mixed well and the absorbance

was measured against prepared reagent blank at 510 nm. Total flavonoid contents were

expressed as mg catechin equivalents per gram (mg CE/g) through the calibration curve with

catechin. The calibration curve range was 50-1000 mg/L (R² = 0.9784). All samples were

performed in triplicates.

DPPH Free Radical Scavenging Assay

The free radical scavenging activity was measured using the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazil

(DPPH) assay.20,21

Sample stock solutions (1.0 mg/ml) of the extracts were diluted to final


concentrations of 243, 81, 27, 9, 3 and 1 µg/ml, in ethanol. One ml of a 50 µg/ml DPPH

ethanol solution was added to 2.5 mL of sample solutions of different concentrations, and

allowed to react at room temperature. After 30 min the absorbance values were measured at

518 nm and converted into the percentage antioxidant activity (AA) using the following

formula: AA% = [(absorbance of the control – absorbance of the sample)/ absorbance of the

control] x 100. Ethanol (1.0 ml) plus plant extracts solutions (2.5 ml) were used as a blank.

DPPH solution (1.0 ml) plus ethanol (2.5 ml) was used as a negative control. The positive

controls (ascorbic acid, BHA and BHT) were those using the standard solutions. Assays were

carried out in triplicate.

β-Carotene Bleaching Test

The β-carotene bleaching method is based on the loss of the yellow colour of β-carotene due to

its reaction with radicals formed by linoleic acid oxidation in an emulsion.22

The rate of β-

carotene bleaching can be slowed down in the presence of antioxidants. β-carotene (2 mg) was

dissolved in 10 ml chloroform and to 2 ml of this solution, linoleic acid (40 mg) and Tween 40

(400 mg) were added. Chloroform was evaporated under vacuum at 40 ºC and 100 ml of

distilled water was added, then the emulsion was vigorously shaken during two minutes.

Reference compounds (ascorbic acid, BHA and BHT) and sample extracts were prepared in

ethanol. The emulsion (3.0 ml) was added to a tube containing 0.12 ml of solutions 1 mg/ml of

reference compounds and sample extracts. The absorbance was immediately measured at 470

nm and the test emulsion was incubated in a water bath at 50 ºC for 120 min, when the

absorbance was measured again. Ascorbic acid, BHA and BHT were used as positive control.

In the negative control, the extracts were substituted with an equal volume of ethanol. The

antioxidant activity (%) was evaluated in terms of the bleaching of the β-carotene using the

following formula: % Antioxidant activity = [1 - (A0 – At) / (A00 – At

0)] x 100; where A0 is the


initial absorbance and At is the final absorbance measured for the test sample, A00

is the initial

absorbance and At0

is the final absorbance measured for the negative control (blank). The

results are expressed as percentage of antioxidant activity (% AA). Tests were carried out in

triplicate.

Animals

Male and female adult albino Swiss mice (25-35 g and aged 8-10 weeks), were used throughout

this study. The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/

dark cycle (lights on at 6:00 a.m.) with free access to food and water. When necessary, animals

were deprived of food 12 h prior to the experiments. Experimental protocols and procedures

were approved by the Federal University of Vale do São Francisco Animal Care and Use

Committee by number 21051023.


This test was performed as described by Koster et al.23

with modifications. Mice (n=6) were

intraperitoneally pre-treated 30 min before the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 10

ml/kg). Vehicle (saline), Bl-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, body weight), acetylsalicylic acid

(ASA, 200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered before acetic acid injection.

Following the injection of acetic acid, the intensity of nociceptive behavior was quantified by

counting the total number of writhes (a response consisting of contraction of the abdominal

wall, pelvic rotation followed by hind limb extension) occurring between 5 and 15 min after

stimulus injection.24

Formalin test


The method used was similar to that described previously.25

Twenty microlitres of 2.5%

formalin was injected subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds)

spent in licking and biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain

response. Responses were measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic

phase) and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory phase). Bl-EtOH

(100, 200 and 400 mg/kg), ASA (200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered

intraperitoneally 60 min before formalin injection. Control animals received the same volume

of saline. Mice were observed in the chambers with a mirror mounted on three sides to allow

view of the paws.

Hot plate test

Mice were pre-selected on the hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the

parameters of observation. Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or

jumping) greater than 20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline,

0.1 ml/10 g), morphine (10 mg/kg) and Bl-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p. Latency

time (in seconds) for each mice was determined on the hot plate during the maximum period of

20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min after the administration of the extract.26

Acute toxicity

In the inquiry of the acute toxicity, animals were randomly divided in groups of five male and

five female Swiss mice (n=10). Animals were administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0

g/kg orally of the crude ethanol extract of Bromelia laciniosa. Control group received vehicle.

Subsequently, the animals were observed for 14 days to evaluate the presence of signs of

toxicity. Mortality in each group within 72 h was recorded. LD50 was estimated by the method


described by Litchfield & Wilcoxon.27

Were assessed daily throughout the study the parameters

of body weight variation, consumption of food and water.

Behavioral screening

The behavioral screening of the mice was performed following parameters described by

Almeida et al.28

The animals were observed at 0.5, 1, 2, 3 and 4 h after administration of Bl-

EtOH. Specific behaviors (piloerection, palpebral ptosis, abdominal contortions, locomotion,

hypothermia, muscular tonus, trembling, forepaws paralysis, sedation, ambulation reduction,

response to touch, analgesia and defecation) were observed and graded).


For the evaluation of hematological and biochemical parameters of blood was utilized the

methodology described by Vasconcelos et al.29

and Araújo et al.30

with modifications. Blood

was removed after 14 days through brachial plexus for laboratory analysis of hematological

parameters: count of erythrocytes (106/mm

3), hemoglobin (g/dL), hematocrit (%), the mean

corpuscular volume (MCV, μ3), the mean corpuscular hemoglobin (MCH, μg), the mean

corpuscular hemoglobin concentration (MCHC, %), leukocytes (103/mm

3), lymphocites (%)

and platelets (103/mm

3). The biochemical parameters analyzed in serum samples were

triglycerides (mg/dL), AST/TGO (U/L), ALT/TGP (U/L), urea (mg/dL) and creatinine

(mg/dL). For the determination of hematological parameters was used hematology analyser

Sysmex XT-2000, for the biochemical parameters was used an automatic analyser Wiener BT

3000 Plus.



The data obtained were analyzed using the GraphPad Prism® version 4.0 and expressed as

mean ± S.E.M or mean ± S.D. as appropriate. Statistically significant differences between

groups were calculated by the application of Student’s t-test. For animal experiments,

significant differences between groups were calculated by the application of analysis of

variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test. Values were considered significantly different

at p < 0.05.

RESULTS

Analysis of Bl-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)

Phenolic profiles at 320 nm for the Bl-EtOH evaluated are presented in Figure 1. The

chromatogram shows the presence of nine peaks with different retention times: 11.79 (1), 14.44

(2), 15.44 (3), 15.57 (4), 16.67 (5), 17.62 (6), 18.09 (7), 19.01 (8) and 19.89 (9). Based on their

UV-Vis spectral data and their retention time, the compounds have UV band characteristic for

coumarin and flavonoid derivatives. These compounds are under investigation.

INSERT FIGURE 1

Total phenolic, total flavonoid contents and antioxidant activity

Table 1 summarizes the results from the quantitative determination of phenolic (TP) and

flavonoids (TF) as well as the effect of extracts from Bromelia laciniosa, ascorbic acid, BHA

and BHT on the DPPH free radical scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching test. The

extracts were evaluated by comparing with ascorbic acid, BHA and BHT, which are well-

known commercial antioxidants.


INSERT TABLE 1

The total phenolic contents of the extracts were determined by Folin-Ciocalteu method as gallic

acid equivalents in milligrams per gram (mg GAE/g) while total flavonoid contents were

calculated as catechin equivalents in milligrams per gram (mg CE/g). Among the four extracts,

ethyl acetate extract (AcOEt) was containing highest (234.00 ± 67.15) amount of phenolic

compounds followed by CHCl3 extract (181.40 ± 12.78) and crude ethanol extract (50.26 ±

1.28). For the total flavonoid content, the highest value was observed in AcOEt extract (101.70

± 4.89) while the crude ethanol extract (EtOH) presented 10.07 ± 6.23 mg CE/g.

In the present study, the antioxidant ability of the B. laciniosa extracts was investigated through

some in vitro models such as radical scavenging activity using, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

(DPPH) method and β-carotene-linoleate model system. Antioxidant activity on method of

DPPH was expressed as IC50 which is defined as the concentration sufficient to obtain 50% of a

maximum effect estimate in 100%. Lower IC50 value indicated higher antioxidant activity. In β-

carotene-linoleate model system the antioxidant activity was expressed as percentage of

antioxidant activity (%AA).

The data showed that the AcOEt and CHCl3 extracts exhibited excellent free radical scavenging

activity. The AcOEt extract showed better antioxidant activity than BHT using by DPPH

method, with a value of IC50 of 6.51 ± 0.14 µg/ml. BHA was the most effective antioxidant,

with a value of IC50 of 2.11 ± 0.13 µg/ml. It appears that B. laciniosa have compounds with a

strong hydrogen-donating capacity and can efficiently scavenge DPPH radicals.

The antioxidant activity of extracts was also evaluated by the β-carotene/linoleate bleaching

method. This method is one of the antioxidant assays suitable for plant extracts. All extracts

had lower antioxidant activity than BHT and BHA.



Bl-EtOH significantly reduced writhing and stretching induced by 0.9% acetic acid. The

significant protective effects were observed as 91.80, 93.44 and 78.68% (p < 0.01) at 100, 200

and 400 mg/kg of the extract, respectively, while ASA (200 mg/kg) had 95.08%. Morphine (10

mg/kg) abolished the nociceptive response (Fig. 2).

INSERT FIGURE 2

Formalin test

Bl-EtOH had analgesic effects on both the first (0-5) and second phase (15-30) of

formalin-induced pain. These phases corresponded to neurogenic and inflammatory pains,

respectively. The result was most significative in the inflammatory phase. Bl-EtOH (100, 200

and 400 mg/kg, i.p.) decreased by 60.86, 62.84 and 66.79%, respectively, the paw licking time

in the first phase, as well as 91.93, 82.18 and 88.73%, respectively, in the second phase of the

formalin test (Fig. 3). The treatment with acetylsalicylic acid and morphine was also able to

inhibit the first and second phases. The pretreatment with naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) reversed

the antinociceptive activity of the extract at dose of 100 mg/kg in the first phase of this test.

The effect of morphine (10 mg/kg) was also reversed by naloxone. The results suggest a


INSERT FIGURE 3


Hot plate test

Figure 4 shows the results of the hot plate test. The reaction time parameter was only

significantly increased at a dose of 100 mg/kg in 60 min. The effect of morphine was reverted

by naloxone.

INSERT FIGURE 4

Acute toxicity

In the acute toxicity of Bl-EtOH, behavioral and physiological alterations were not observed

neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally,

respectively, indicating low toxicity of the extract. The administration of the extract did not

cause any appreciable alterations in water and food intake in any of the groups. Moreover, body

weight gain during the observation period among the treated animals with 5 g/kg v.o. was

statistically different when comparable to control group (Fig. 5).

INSERT FIGURE 5

Behavioral screening

The animals did not display significant changes in behavior. The animals did not show any sign

of toxicity or change in behavioral or other physiological activities.


The administration of intraperitoneal and oral doses of Bl-EtOH did not cause

erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, MCV, MCH, MCHC, leukocytes, lymphocites and

platelets level to change (Table 2).


INSERT TABLE 2

Likewise, the values of triglycerides, AST/GOT, ALT/GPT and urea (mg/dL) showed no

significant changes. However, a significant decrease in the creatinine in the group treated with

5 g/kg by oral rout was observed when compared to the control group (Table 3).

INSERT TABLE 3

DISCUSSION

The present study showed that the ethanolic extract of Bromelia laciniosa has phenolic

compounds, which are possibly responsible for their antioxidant and antinociceptive properties.

An HPLC fingerprint of phenolic compounds was developed and total phenolics through Folin-

Ciocalteau method and total flavonoids were evaluated. Numerous publications applied the

total phenols assay often found excellent linear correlations between the total phenolic profiles

and the antioxidant activity.

The antioxidant activity of the extracts of B. laciniosa by assessment of their capacity to

scavenge the DPPH radical was carried out. DPPH radical is a stable chromogen (purple)

radical with maximum absorption ranging from 515 to 517 nm, which can readily undergo

reduction by an antioxidant leading to its discoloration. The degree of color change is

proportional to the concentration and potency of the antioxidants. Because of the ease and

convenience of this reaction it has been used to free radical-scavenging activity assessment of

several kinds of samples.20

The data showed that the AcOEt extract exhibited excellent free radical scavenging activity.

The AcOEt extract showed better antioxidant activity than BHT using by DPPH method, with a


value of IC50 of 6.51 ± 0.14 µg/ml. Previous study investigated the antiradical potential of

twenty different extracts from six Brazilian Bromeliaceae species.31

In a general way, the polar

rhizome extracts from Bromeliaceae representatives showed better antioxidant results than the

extracts from leaves and fruits of the same species. B. laciniosa may be considered a good

source of antioxidant compounds.

In the β-carotene bleaching assay, linoleic acid produces hydroperoxides as free radicals during

incubation at 50 °C. The presence of antioxidants in the extracts minimizes the oxidation of β-

carotene by hydroperoxides. The degradation rate of β-carotene-linoleate depends on the

antioxidant activity of the samples being analyzed. There was a correlation between

degradation rate and the bleaching of β-carotene, the extract with the lowest β-carotene

degradation rate exhibited the highest antioxidant activity.32

All extracts showed lower

antioxidant activity than BHT and BHA.

Bromelia laciniosa showed antinociceptive activity in different nociceptive responses

generated by a chemical or thermal noxious stimulus. The first test to evaluate the

antinociceptive activity of Bl-EtOH was the writhing induced by acetic acid. Acetic acid-

induced writhing is a standard, simple, and sensitive test for measuring analgesia induced by

both opioids and peripherally acting analgesics. Additionally, although this test is a nonspecific

model (e.g. anticholinergic and antihistaminic and other agents show activity in this test) it is

widely used for analgesic screening and involves local peritoneal receptors (cholinergic and

histaminic receptor).33

Bl-EtOH significantly reduced the acetic acid-induced writhing in mice.

These results support the hypothesis of Bl-EtOH participation in the inhibition of prostaglandin

synthesis, as the nociceptive mechanism involves the process or release of arachidonic acid

metabolites via cyclooxygenase (COX), prostaglandin biosynthesis or other peripherally

pathway.34

A positive result with this test is indicative of antinociceptive activity in the extract

under investigation, which may be of central or peripheral origin.


In order to distinguish between the central and peripheral antinociceptive action, the formalin

test was performed. Subcutaneous injection of formalin into the animal hind paw evokes an

array of stereotyped behaviors. The nociceptive response to formalin occurs in a biphasic

pattern; there is an initial acute period (phase 1) and, after a short period of remission, phase 2

begins and consists of a longer period of sustained activity. The phase 1 corresponds to acute

nociceptive neurogenic pain, and is sensitive to analgesic drugs that interact with opioid

system. The phase 2 corresponds to an inflammatory pain, dependent of several inflammatory

mediators release and action, and the expression of nociceptive behavior in this phase is very

sensitive to non-steroid anti-inflammatory drugs as the cyclooxygenase inhibitors. Drugs that

act primarily as central analgesics inhibit both phases while peripherally acting drugs inhibit

only the second phase.35

The extract was able to block both phases of the formalin response

although the effect was more pronounced in the second phase. The effect of extract on the first

and second phases of formalin test suggests that its activity may be resulted from its central

action when compared with morphine activity in this respect. The pre-treatment with naloxone

reversed the antinociceptive activity of the extract in the first phase of this test. The results

suggest a possible involvement of opioid receptors in the antinociceptive effect of the extract.

The evaluation of Bl-EtOH on hot plate response show that, in general, the extract did not

present effect in the hot plate test, the extract increase the latency time only at dose of 100

mg/kg after 60 minutes. As the hot plate test is a specific central antinociceptive test, it is

possible that Bl-EtOH exert their antinociceptive effect at least in part through central

mechanisms, as observed in the formalin test by inhibition of both phases of the test.

The use of medicinal plants has been very significant in several populations, especially in the

Northeast of Brazil. However, the popular or traditional uses are not sufficient to validate the


herbal medicines as effective and safety. It is necessary to carry out toxicological studies to

evaluate safety parameters which are not observed by the popular use of these plants.36

The tests for acute toxicity of Bl-EtOH did not demonstrate signs of lethality in mice at doses

tested. A 2.0 and 5.0 g/kg body weight administered by via intraperitoneal and oral,

respectively, dose were considered as the “limit test”, as recommended by acute toxicity testing

procedures.29,30

In the acute toxicity of Bl-EtOH, behavioral and physiological alterations were

not observed neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg

orally, respectively, indicating low toxicity of the extract. In this experiment was observed that

the Bl-EtOH has LD50 > 5000 mg/kg. According to Kennedy et al.37

, substances that present

LD50 higher than 5.0 g/kg by oral route can be considered practically non-toxic.

There was no significant variation in hematological parameters in the groups treated with the

extract compared to control. In regard to biochemical parameters a significant decrease in the

creatinine in the group treated with 5 g/kg by oral rout was observed when compared to the

control group. Creatinine is a good indicator of kidney function. Alterations in their levels

suggest alterations in this organ. Histopathological analysis of the kidneys revealed that the

histological structure of renal tubules showed preserved (data not shown).

CONCLUSION

In conclusion, the present work indicates that Bromelia laciniosa is a source of phenolic

compounds and exhibit antioxidant and antinociceptive properties. Peripheral and, at least in

part, central mechanisms may be involved in the antinociceptive effect. Further studies

currently in progress will enable as to understand the mechanisms of action underlying the

effects observed in this investigation. The results obtained so far show that the plant is non-


toxic at the doses used because there was no death or alterations of hematological and

biochemical parameters. The results of the present study support the concept that the ethanolic

extract from leaves is safe for human use.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by grants from Brazilian agencies CNPq (Process 476770/2010-6)

and FACEPE (Process APQ-0542-4.03/10). The authors wish to express their thanks to Centro

de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD/UNIVASF) for collection and

botanical identification of the plant material.

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FIG. 1. High performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD)

profiles of Bromelia laciniosa ethanolic extract recorded at 320 nm.

1

2 3 4

5

67

8

9

1

2 3 4

5

67

8

9


FIG. 2. Antinociceptive activity of Bromelia laciniosa (Bl-EtOH 100, 200 and 400 mg/kg),

acetylsalicylic acid (ASA 200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) on acetic acid induced

writhing test. Values are mean ± S.E.M. **p < 0.01, significantly different from control;

ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).


FIG. 3. Effect of ethanolic extract of Bromelia laciniosa (Bl-EtOH), acetylsalicylic acid

(ASA), morphine, morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Bl-EtOH +

NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on formalin test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01,


First phase

0

10

20

30

40

50

60

** **

Control

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg****

* *

Morph + NLX

Bl-EtOH + NLX

(a)

Lic

kin

g t

ime (

s)

Second phase

0

50

100

150

**** **

Control

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

ASA 200 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

****

** Morph + NLX

Bl-EtOH + NLX

(b)

Lic

kin

g t

ime (

s)


FIG. 4. Effect of ethanolic extract of Bromelia laciniosa (Bl-EtOH), morphine, morphine +

naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Bl-EtOH + NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on

hot plate test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from

control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Bl-EtOH 100 mg/kg

Bl-EtOH 200 mg/kg

Bl-EtOH 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Morph + NLX

Bl-EtOH + NLX

**

***

**

**

**

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)


FIG. 5. Body weight gain for animals treated with Bl-EtOH during 14 days (n= 10).


TABLE 1. Total phenolics (TP), total flavonoids (TF) and antioxidant activity of extracts from

Bromelia laciniosa.

TP (mg GAE/g) TF (mg CE/g) DPPH (IC50,

µg/ml)

β-carotene

bleaching (% AA)

EtOH 50.26 ± 1.28 10.07 ± 6.23 61.04 ± 1.63 46.97± 1.01

Hexane 1.81 ± 0.514 --- > 243 59.53 ± 6.53

CHCl3 181.40 ± 12.78 --- 28.66 ± 0.81 53.14 ± 0.95

AcOEt 234.00 ± 67.15 101.70 ± 4.89 6.51 ± 0.14 46.08 ± 4.89

Ascorbic acid --- --- 2.43 ± 0.27 9.26 ± 1.66

BHA --- --- 2.11 ± 0.13 80.92 ± 3.45

BHT --- --- 7.24 ± 0.49 86.77 ± 1.14

The IC50 values were obtained by interpolation from linear regression analysis with 95% of

confidence level. IC50 is defined as the concentration sufficient to obtain 50% of a maximum

effect estimate in 100%. Values are given as mean ± SD (n=3).


TABLE 2. Hematological parameters of blood of Swiss mice treated with 2.0 g/kg

intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Bromelia laciniosa after 14

days (acute toxicity).

Parameters Groups


Erythrocytes (106/mm

3) 8.05 ± 0.49 8.43 ± 0.15 8.09 ± 0.09

Hemoglobin (g/dL) 13.40 ± 0.91 12.88 ± 0.68 13.06 ± 0.27

Hematocrit (%) 42.41 ± 2.48 43.33 ± 1.25 42.84 ± 0.40

MCV (μ3) 52.60 ± 1.36 51.88 ± 0.45 52.86 ± 0.46

MCH (μg) 16.60 ± 0.22 16.43 ± 0.18 16.78 ± 0.15

MCHC (%) 31.69 ± 0.83 31.88 ± 0.34 32.06 ± 0.40

Leukocytes (103/mm

3) 6.25 ± 0.57 5.88 ± 0.41 6.97 ± 0.59

Lymphocites (%) 88.93 ± 5.36 88.53 ± 1.08 88.55 ± 1.35

Platelets (103/mm

3) 883.70 ± 108.30 856.90 ± 71.14 911.30 ± 73.18

Values are mean ± S.E.M, n = 8. Student’s t-test at 5 % probability.


TABLE 3. Biochemical parameters obtained from the serum of Swiss mice treated with 2.0

g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Bromelia laciniosa after

14 days (acute toxicity).

Parameters Groups


Triglycerides (mg/dL) 133.30 ± 5.57 111.17 ± 15.21 141.80 ± 14.14

AST/GOT (U/L) 123.10 ± 11.23 111.70 ± 25.05 116.70 ± 12.61

ALT/GPT (U/L) 75.29 ± 8.58 60.23 ± 8.08 66.30 ± 7.22

Urea (mg/dL) 66.44 ± 4.40 65.89 ± 6.16 67.56 ± 4.84

Creatinine (mg/dL) 0.36 ± 0.01 0.42 ± 0.11 0.26 ± 0.02**

Values are mean ± S.E.M, n = 8. **p < 0.01; Student’s t-test at 5 % probability.


ÃNEXOS


ANEXO A – Carta de submissão dos artigos

Carta A


Carta B


Carta C


Carta D


ANEXO B – Tabela de triagem comportamental

Triagem Farmacológica (Modelo retirado de Almeida et al., 1999)

PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_____________DATA:____/_____/_____

VIA DE ADMINISTRAÇÃO:_____________________ANIMAIS:______________________________

RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________ GRUPOS:________________________

ATIVIDADE FARMACOLÓGICA

Quantificação dos efeitos

(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso

até 30` 1h 2h 3h 4h

1 - SNC

a - Estimulante

Hiperatividade

Irritabilidade

Agressividade

Tremores

Convulsões

Piloereção

Movimento intenso das vibrissas

Outras_____________________

b - Depressora

Hipnose

Ptose

Sedação

Anestesia

Ataxia

Reflexo do endireitamento

Catatonia

Analgesia

Resposta ao toque diminuído

Perda do reflexo corneal

Perda do reflexo auricular

c - Outros comportamentos

Ambulação

Bocejo excessivo

Groming

Rearing

Escalar

Vocalizar

Sacudir a cabeça

Contorções abdominais

Abdução das patas do trem posterior

Pedalar

Estereotipia

2 - SN AUTÔNOMO

Diarréia

Constirpação

Defecação aumentada

Respiração forçada

Lacrimejamento

Micção

Salivação

Cianose

Tono muscular

Força para agarrar

3 - MORTE

obs.:_________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________


ANEXO C – Certificado de aprovação do comitê de ética


ANEXO D – Certificados.

Certificado A

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