UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO …...nos programas de melhoramento das principais culturas de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUACÃO EM GENÉTICA

MARCELO OLIVA SANTANA

EXPRESSÃO GÊNICA DA RESPOSTA À SECA EM CANA-

DE-AÇÚCAR (Saccharum spp.)

Recife

2011

MARCELO OLIVA SANTANA

EXPRESSÃO GÊNICA DA RESPOSTA À SECA EM CANA-

DE-AÇÚCAR (Saccharum spp.)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação Strictu sensu do Departamento de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Pernambuco como parte dos requisitos exigidos

para obtenção do título de Mestre em Genética.

Orientador: Prof. Dr. Tercilio Calsa Jr.

Coorientadora: Dra. Maria Clara Pestana Calsa

Recife

2011

Santana, Marcelo Oliva Expressão gênica da resposta à seca em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) / Marcelo Oliva Santana. – Recife: O Autor, 2011. 91 folhas : il., fig., tab.

Orientador: Tercilio Calsa Jr Co-Orientador: Maria Clara Pestana Calsa

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2011.

Inclui bibliografia, anexo e apêndices

1. Regulação de expressão gênica 2. Cana-de-açúcar – Melhoramento genético 3. Plantas – Efeito da seca I. Título.

572.865 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2011-129

4

Aos meus pais, Angela Cristina e José Carlos, pelo amor e dedicação incondicionais.

À minha esposa, Luciana Oliveira Oliva,

pelos momentos de companheirismo.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, José Carlos e Angela Cristina, por terem me criado com muito amor,

carinho, dedicação, sempre me ensinando, apoiando-me e estando presentes em

todos os momentos da minha vida. A vocês, dedico o meu maior agradecimento.

A minha esposa, Luciana Oliveira Oliva, companheira de todas as horas, que

sempre me deu amor, carinho e força para seguir em frente. Com você, posso dizer

que sou muito feliz e é com você que quero passar o resto da minha vida. A você,

dedico o meu amor incondicional.

Ao meu orientador Prof. Dr. Tercilio Calsa Junior e minha co-orientadora Dra. Maria

Clara Pestana Calsa do Laboratório de Genômica e Proteômica de

Plantas/Genética/UFPE pela oportunidade e importantes ensinamentos na pesquisa

científica e auxílio em todo o desenvolvimento do projeto. A vocês, meus sinceros

agradecimentos.

À Profa. Dra. Rejane Mansur (Laboratório de Fisiologia Vegetal/Biologia/UFRPE), ao

Prof. Dr. Marcos Morais (Laboratório de Genética Molecular de

Microorganismos/Genética/UFPE) e a Profa. Dra. Ana Christina (Laboratório de

Genética e Biotecnologia Vegetal/Genética/UFPE) pelas importantes contribuições

como membros da banca.

À Profa. Dra. Rejane Mansur agradeço também por ter disponibilizado os

equipamentos de análise fitofisiológica bem como aos seus orientados pela ajuda no

desenvolvimento do trabalho em casa de vegetação.

Ao Prof. Dr. Marcos Morais também pelas importantes contribuições da pré-banca

além de permitir o uso do equipamento fotodocumentador. Aos seus orientados

Adauto e Rafael pela ajuda na utilização deste equipamento.

Ao Prof. Dr. Antônio Carlos (Laboratório de Terapia Experimental/Genética/UFPE)

por ter permitido a utilização dos equipamentos espectrofotômetro e Rotor Gene

6000, importantes para a realização dos experimentos in vitro. Além disso, agradeço

a técnica Heide, deste mesmo laboratório, pelas imensas contribuições para a

realização das análises de RT-qPCR.

À Estação Experimental de Cana-de-açúcar de Carpina/RIDESA por ter fornecido os

materiais vegetais.

À todos do Laboratório de Genômica e Proteômica de Plantas (LGPP), em especial

a Cinthya por ter ajudado imensamente nos meus experimentos em casa de

vegetação e laboratório.

Ao meu irmão, Marcio Oliva, por transmitir um pouco do seu conhecimento e

experiência profissional sempre que nos encontramos.

Às minhas avós, D. Laurinete, que hoje não está mais presente, porém continua viva

em nossos corações, e D. Bernadete, que toda vez que a encontro é sempre uma

alegria.

Aos meus sogros, José Carlos e Edna Lucia, pelo carinho e amizade, sempre me

tratando como um filho.

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE) pela

concessão da bolsa de Mestrado e pelo apoio financeiro dado ao projeto.

Ao CNPq pelo apoio financeiro dado ao projeto.

A todos os meus familiares e amigos que de maneira direta ou indireta contribuíram

para que este sonho se tornasse realidade...

A todos aqueles que torceram por mim... O meu sincero, obrigado!

“No meio da dificuldade encontra-se a oportunidade”.

Albert Einstein.

RESUMO

O cultivo de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é de grande importância econômica para o Brasil pela produção de açúcar e etanol, sendo o déficit hídrico um dos principais fatores limitantes do crescimento e produtividade desta cultura. A crescente demanda por biocombustíveis tem exigido o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar geneticamente melhoradas e mais eficientes no uso da água. A partir de dados SAGE de cana-de-açúcar previamente anotados, oriundos de bibliotecas de amostras de colmo de plantas cultivadas em campo, e contrastantes para época chuvosa ou seca, foram identificados in silico transcritos potencialmente associados a respostas ao estresse hídrico. Destes, vinte e um genes (incluídos três genes de referência) foram selecionados para análise de expressão gênica e validação via transcrição reversa seguida de PCR em tempo-real (RT-qPCR) utilizando duas variedades de cana-de-açúcar contrastantes à resposta ao estresse hídrico, RB92579 (tolerante) e RB72454 (sensível). Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação sob dois tratamentos hídricos diferentes (seco e irrigado). Para cada gene, três réplicas biológicas foram executadas, sendo cada RT-qPCR realizada em triplicata. A especificidade e ausência de contaminação foram avaliadas pela curva de dissociação das PCRs e controles negativos, respectivamente. Para a normalização e processamento dos dados de RT-qPCR, foram utilizados três genes de referência sendo estes analisados quanto a estabilidade utilizando o software geNorm. Da coleção de 46.536 tags distintas analisadas em SAGE, 45,0% mostraram-se inibidas pela seca, 6,3% induzidos pela seca, e 48,7% não apresentaram variação de ratio significativa (0,5 < ratio < 2,0). Dos 21 transcritos selecionados para validação experimental como potencialmente responsivos ao estresse hídrico somente 15 e 12 genes foram monitorados via RT-qPCR em folha e raiz respectivamente. Essas análises resultaram que 2/3 dos genes estudados (Dhyn_98, ERD4, Sip, Dgt, MARK, Pox,

Hd-zip, Hsp70, PPlase e DnaK) foram diferencialmente expressos sob seca (p<0,05), sendo que 40% e 33,3% deles apresentaram, nas variedades tolerante e sensível, respectivamente, a mesma tendência de expressão que aquela já descrita via SAGE para a espécie. Além disso, em função dos resultados de RT-qPCR, dois genes mais associados com a resposta de tolerância à seca foram selecionados para futura determinação de suas sequências nucleotídicas completas e construções gênicas. Os genes identificados para tolerância a seca poderão ser utilizados não só nos programas de melhoramento das principais culturas de importância econômica, mas também poderão ajudar a entender as redes gênicas envolvidas na tolerância das plantas ao estresse hídrico.

Palavras-chave: RT-qPCR, SAGE, estresse hídrico, seca.

ABSTRACT

The cultivation of sugarcane (Saccharum spp.) is of great economic importance to Brazil by the production of sugar and ethanol, but water deficit is one of the main limiting factors for growth and productivity of this crop. Growing demand for biofuels has recquired the development of sugarcane varieties genetically improved and more efficient in water use. Based on previous sugarcane SAGE annotated data, from stem samples of plants grown in the Field, and contrasting for rainy or dry cultivation season, were identified in silico transcripts potentially associated to drought tolerance responses. From these, twenty-one genes (including three reference genes) were selected for expression analysis through reverse transcription followed by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) on two sugarcane varieties contrasting for drought tolerance, RB92579 (tolerant) and RB72454 (sensitive). The experiments were conducted in greenhouse under two different water treatments (irrigated and dry). For each gene, three biological replicates were performed, and each RT-qPCR was performed in triplicates. The specificity and absence of contamination were assessed by dissociation curve of PCR and negative controls, respectively. For normalization and RT-qPCR data processing, three reference genes were used, whose stability was analyzed using software geNorm. From the collection of 46,536 distinct tags analyzed in SAGE database, 45.0% showed to be inhibited by drought, 6.3% were drought-induced, and 48.7% showed no significant variation ratio (0.5 < ratio < 2.0). Out from 21 transcripts selected for experimental validation as potentially responsive to water stress, only 15 and 12 were monitored by RT-qPCR in leaves and roots, respectively. These analyses resulted that 2/3 of studied genes (Dhyn_98, ERD4, Sip, Dgt, MARK, Pox, Hd-zip, Hsp70, PPlase e

DnaK) were differentially expressed under drought (p<0,05), and 40% and 33.3% of them presented, respectively in tolerant and sensitive varieties, the same expression profile than that already described via SAGE for the species. In addition, according to RT-qPCR results, two genes more associated to drought tolerance response were selected to future determination of their complete nucleotide sequences and gene constructions. Genes identified for drought tolerance may be used not only in breeding programs of main crops of economic importance, but also to help the understanding the gene networks involved in plant tolerance to water stress. Key words: RT-qPCR, SAGE, water stress, drought.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1 – Ilustração de uma cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

evidenciando o sistema de numeração foliar de van Dillewijn

(1952)..............................................................................................................

20

Figura 2 – Cultivo dos rebolos em bandejas de polietileno e transferência

das plantas juvenis de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para

vasos...............................................................................................................

35

Figura 3 – Medição do potencial hídrico foliar em câmara de pressão

Scholander (A) e coleta de solo para cálculo da medida da umidade

relativa do solo (B)..........................................................................................

36

Figura 4 – Esquema ilustrativo do procedimento de coleta de folha e raiz

de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para as análises moleculares. A e B

– corte de folha e raiz, respectivamente; C e D – acondicionamento em

tubos Falcon; E – conservação do material vegetal em nitrogênio

líquido..............................................................................................................

37

Figura 5 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de

folha.................................................................................................................

38

Figura 6 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de raiz.... 39

Figura 7 – Número de tags identificados como sendo inibidos (ratio ≤ 0,5),

sem variação (0,5 < ratio < 2,0) e induzidos (ratio ≥ 2,0) pela seca, a partir

do banco de dados SAGE para cana-de-açúcar (Saccharum spp.) (CALSA

Jr., 2006)…………………………………….......................................................

43

Figura 8 – Análise de eletroforese em gel de agarose 1% a partir de RT-

PCR mostrando a amplificação dos genes para teste dos primers................

47

Figura 9 – Potencial hídrico foliar das duas variedades (RB92579 e

RB72454) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) sob os tratamentos

irrigado e seco................................................................................................. 47

Figura 10 – Umidade relativa do solo das duas variedades (RB92579 e

RB72454) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) sob os tratamentos

irrigado e seco.................................................................................................

48

Figura 11 – Sinais visíveis em cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

submetidas aos tratamentos de irrigação (I) e seca (S). (A) Parte aérea;

(B) solo e (C) sistema radicular.......................................................................

48

Figura 12 – Integridade do RNA total extraído de folha das variedades

RB92579 e RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da

análise por eletroforese em gel de agarose 1%..............................................

50

Figura 13 – Integridade do RNA total extraído de raiz das variedades

RB92579 e RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da

análise por eletroforese em gel de agarose 1%..............................................

50

Figura 14 – Confirmação da síntese de cDNA em amostras de folha via

RT-PCR utilizando o gene HK.rpl35_4...........................................................

50

Figura 15 – Confirmação da síntese de cDNA em amostras de folha via

RT-PCR utilizando o gene HK.rpl35_4...........................................................

51

Figura 16 – Valores médios de estabilidade de expressão (M) dos genes

selecionados como possíveis genes de referência em folha para cana-de-

açúcar (Saccharum spp.)................................................................................

54

Figura 17 – Valores médios de estabilidade de expressão (M) dos genes

selecionados como possíveis genes de referência em raiz para cana-de-

açúcar (Saccharum spp.)................................................................................

55

Figura 18 – Genes diferencialmente expressos por seca nas variedades

tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da

expressão quantitativa relativa em folha via PCR em tempo real...................

56

Figura 19 – Genes diferencialmente expressos por seca nas variedades

tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da

expressão quantitativa relativa em raiz via PCR em tempo real.....................

57

Figura 20 – Genes que não se expressaram significativamente por seca

nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum

spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em folha via PCR em

tempo real.......................................................................................................

58

Figura 21 – Genes que não se expressaram significativamente por seca

nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum

spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em raiz via PCR em tempo

real..................................................................................................................

59

Figura 22 – Modelo molecular e fisiológico representativo (adaptado de

WANG et al., 2003) dos mecanismos de resposta ao déficit hídrico para os

genes que apresentaram diferenças significativas na expressão em folha.

O tamanho das setas é proporcional ao nível de indução do gene por seca

na variedade tolerante (verde) e sensível (vermelha). Os números

sobrescritos indicam as participações desses genes nos tipos de

mecanismos de resposta à seca.....................................................................

67

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 – Agrupamento por categoria e anotação das tags/genes no

banco de dados TIGR Gene Index de cana-de-açúcar selecionadas a partir

de bibliotecas SAGE para a análise de expressão gênica via RT-

qPCR...............................................................................................................

44

Tabela 2 – Pares de iniciadores (primers) desenhados pela seleção in

silico a partir dos dados SAGE associados a genes de resposta à

seca.................................................................................................................

46

Tabela 3 – Quantificação e qualidade do RNA extraído de amostras de

folha e raiz de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), sob seca ou irrigação

nas variedades tolerante (RB92579) e sensível

(RB72454).......................................................................................................

49

Tabela 4 – Eficiências das reações e R2 (coeficiente de correlação de

Pearson) correspondentes aos genes utilizados via RT-

qPCR...............................................................................................................

51

Tabela 5 – Valores médios ± desvio padrão de Cqs resultantes das

análises de RT-qPCR em tempo real quantitativa em folha e raiz dos genes

selecionados a partir do banco de dados

SAGE..............................................................................................................

53

Tabela 6 – Razão de expressão entre os tratamentos seca/irrigado dos

genes significativamente expressos por seca via RT-qPCR e

SAGE..............................................................................................................

60

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

Sigla Definição

cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar ao mRNA

cDNA-AFLP cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfismo de

tamanho de fragmento amplificado

EECAC Estação Experimental de Cana-de-Açúcar do Carpina

EST Etiqueta de sequência expressa

IVB Índice de Velocidade de Brotação

mRNA Acido ribonucléico mensageiro

pb Pares de base

PCR Reação em cadeia da polimerase

qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativo

RT-PCR Transcrição reversa seguida de PCR

RT-qPCR Transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo-real

SAGE Serial Analysis of Gene Expression - Análise serial da expressão

gênica

TIGR The Institute for Genome Research - Instituto de Pesquisas

Genômicas

Tm Temperatura de dissociação

TPT Tags por mil

SUMÁRIO

Página

DEDICATÓRIA……………………………………………………………… iv

AGRADECIMENTOS………………………………………………………. v

EPÍGRAFE………………………………………………………………….... vii

RESUMO……………………………………………………………………... viii

ABSTRACT…………………………………………………………………... ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES…………………………………………………. x

LISTA DE TABELAS……………………………………………………….. xiii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS........................... xiv

1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 17

2. REVISÃO DA LITERATURA.............................................................. 19

2.1. Importância econômica da cana-de-açúcar (Saccharum spp.)........ 19

2.2. Aspectos gerais e melhoramento da cana-de-açúcar ..................... 20

2.3. Estresse hídrico e mecanismos de resposta em plantas................. 22

2.4. Ferramentas de análises transcricionais.......................................... 25

2.5. Aspectos gerais da metodologia RT-qPCR..................................... 26

3. OBJETIVOS........................................................................................ 31

3.1. Objetivo Geral.................................................................................. 31

3.2. Objetivos Específicos....................................................................... 31

4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 32

4.1. Identificação e seleção de transcritos in silico................................. 32

4.2. Desenho de iniciadores.................................................................... 33

4.3. Material vegetal e tratamentos hídricos........................................... 34

4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA.............................................. 37

4.5. Eficiência da amplificação e RT-qPCR............................................ 41

4.6. Seleção do gene de referência, normalização e análise de RT-

qPCR.......................................................................................................

42

5. RESULTADOS................................................................................... 43

5.1. Identificação e seleção de transcritos in silico................................. 43

5.2. Desenho de iniciadores………………………………………………... 45

5.3. Material vegetal e tratamentos hídricos........................................... 47

5.4. Extração de RNA e síntese de cDNA.............................................. 49

5.5. Eficiência da amplificação e RT-qPCR............................................ 51

5.6. Seleção do gene de referência, normalização e análise de RT-

qPCR.......................................................................................................

54

6. DISCUSSÃO....................................................................................... 62

7. CONCLUSÕES................................................................................... 69

8. REFERÊNCIAS.................................................................................. 70

9. APÊNDICES………………………………………………………………. 79

10. MEMORIAL……………………………………………………………… 88

11. ANEXOS.......................................................................................... 89

11.1. Atividades complementares........................................................... 89

11.2. Resumos publicados em anais de congressos durante o

desenvolvimento do mestrado................................................................

90

SANTANA, M.O Expressão gênica da resposta à seca...

17

1. INTRODUÇÃO

O crescimento e a produtividade das plantas são adversamente afetados por

vários fatores bióticos e abióticos de estresse, sendo os últimos as principais causas

da diminuição do rendimento nas principais culturas. As plantas são frequentemente

expostas a várias condições simultâneas de estresse tais como baixas ou altas

temperaturas, salinidade, seca, inundações, aquecimento, estresse oxidativo e

toxidade por metais pesados. Várias atividades antropogênicas têm acentuado a

existência desses fatores. (MAHAJAN e TUTEJA, 2005).

O déficit hídrico destaca-se como principal fator limitante do crescimento das

plantas e da produtividade agrícola. As previsões de alteração climática e escassez

de água em diversas regiões e a crescente demanda por biocombustíveis tornam

necessário o desenvolvimento de variedades de espécies vegetais fonte de

biomassa e bioenergia mais eficientes no uso da água. Assim, genótipos de cana-

de-açúcar, por exemplo, capazes de sustentar os níveis de produtividade em

condições de restrição de água, contribuirão para sustentabilidade e viabilidade

econômica, uma vez que evitarão o aumento do uso de irrigação.

Um desafio atual é explorar a grande quantidade de informações

disponibilizadas pelo desenvolvimento de bibliotecas ESTs e SAGE de cana-de-

açúcar, a fim de produzir cultivares melhoradas e aumentar o conhecimento sobre a

complexa fisiologia da planta. Além disso, identificar os genes regulados pelo

estresse hídrico constitui uma excelente estratégia para o aumento da tolerância das

plantas a períodos prolongados de seca ou menor disponibilidade hídrica, permitindo

assim a seleção de variedades aptas ao cultivo nos ambientes que apresentam tais

condições edafo-climáticas.

O presente estudo objetivou a identificação e seleção de genes de resposta à

seca a partir de blibliotecas SAGE disponíveis para cana-de-açúcar, bem como a

validação experimental via RT-qPCR utilizando variedades com maior e menor

tolerância ao déficit hídrico para essa espécie. Os resultados esperados poderão ser

úteis como marcadores funcionais para seleção de genótipos de cana-de-açúcar

mais tolerantes à deficiência hídrica. Tal abordagem favorecerá o desenvolvimento

de novas estratégias nos programas de melhoramento e da agroindústria canavieira


18

na região semiárida do Nordeste. Além disso, as respostas gênicas diferenciais entre

as cultivares contrastantes poderão ser úteis visando à identificação e a

incorporação de características morfofisiológicas de tolerância em cultivares novas.


19

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Importância econômica da cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

A cultura de cana-de-açúcar apresenta raízes antigas na economia brasileira.

Mudas dessa planta chegaram ao Brasil por volta de 1515, vindas da Ilha de

Madeira (Portugal). O primeiro engenho de açúcar foi construído em 1532, na

capitania de São Vicente, mas foi no Nordeste, principalmente em Pernambuco e

Bahia, que os engenhos se multiplicaram atuando como os maiores produtores e

fornecedores mundiais de açúcar até o século XVII. Devido à enorme capacidade de

acumular sacarose nos entrenós, a cana-de-açúcar transformou-se em uma

importante fonte de energia para o homem e conseqüentemente, de potencial

econômico (MOORE, 2005).

O potencial de produção da cana-de-açúcar para a geração de subprodutos

(açúcar, etanol e energia elétrica, entre outros) faz dessa cultura uma das mais

importantes atividades da agroindústria nacional (BEAUCLAIR et al., 2009). Países

como Brasil, Índia e China são considerados os maiores produtores mundiais de

cana-de-açúcar. O primeiro responde sozinho por 45% de todo açúcar mundial

comercializado, enquanto que para o etanol, juntamente com os EUA, é responsável

por 70% da produção (GRIVET e ARRUDA, 2002; MING et al., 2006).

De acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab) e o

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), foi realizado o terceiro

levantamento da safra 2010/11 de cana-de-açúcar no Brasil que chegou a 624,99

milhões de toneladas em uma área de 8,1 milhões de hectare, sendo 46,2 %

destinados a produção de açúcar e os 53,8% restantes, a produção de etanol. Entre

os estados produtores de açúcar destacam-se São Paulo (61%), Minas Gerais

(8,39%), Paraná (7,93%), Alagoas (6,08%), Goiás (4,74%), Pernambuco (4,25%) e

Mato Grosso do Sul (3,85%). Já a produção de etanol é concentrada principalmente

nas regiões centro-oeste e sudeste que respondem por 87,46% produzido no País,

sendo os maiores produtores os estados de São Paulo (54,26%), Goiás (11,61%),

Minas Gerais (10,35%) e Mato Grosso do Sul (7,39%) (CONAB, 2011).


20

2.2. Aspectos gerais e melhoramento da cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar (Saccharum spp., Poaceae) é uma gramínea perene e

alógama encontrada em mais de 90 países principalmente nas regiões tropicais e

subtropicais dentro da faixa de latitide de 30° do Equador (MING et al., 2006). Os

primeiros registros de que se tem sobre a cana-de-açúcar encontram-se nas

escrituras mitológicas dos hindus. A teoria mais aceita sobre a origem da cana-de-

açúcar considera que esta seja uma espécie nativa das ilhas Arquipélago da

Polinésia, sendo Saccharum robustum (espécie mais primitiva) originada no centro

de expansão da Nova Guiné (CESNIK e MIOCQUE, 2004).

Embora seja uma planta de reprodução sexuada, quando cultivada

comercialmente é multiplicada assexuadamente por propagação vegetativa

(CAIEIRO et al., 2010). É caracterizada por apresentar inflorescência do tipo

panícula, flor hermafrodita, caule cilíndrico composto de nós e entrenós, folhas

alternas, opostas, presas aos nós dos colmos, com lâminas de sílica nas bordas, e

bainha aberta (MILLER e GILBERT, 2009). As folhas são ordenadas através do

sistema de Kuijper (Figura 1) onde a primeira folha de cima para baixo com a lígula

exposta recebe a denominação de folha+1 enquanto que as folhas que estão abaixo

dela são denominadas sucessivamente de +2, +3, +4 etc. A primeira folha acima da

folha+1 recebe a denominação de folha 0 e as que estão acima dela são

denominadas de folha -1, -2, -3 e assim, sucessivamente (van DILLEWIJN, 1952).

Figura 1 – Ilustração de uma cana-de-açúcar (Saccharum spp.) evidenciando o sistema de numeração foliar de van Dillewijn (1952).


21

Devido a sua origem multiespecífica, cultivares atuais de cana-de-açúcar são

complexos híbridos interespecíficos (Saccharum spp., 2n=100 a 130) resultante do

cruzamento entre S. officinarum, S. barbieri, S. sinense, S. robustum e S.

spontaneum (D'HONT et al., 1996; GOVERNMENT, 2004; MING et al., 2006). Para

a maioria dos melhoristas de cana-de-açúcar, a espécie S. officinarum, que

apresenta alto teor de açúcar, originou-se através da domesticação da espécie S.

robustum. Essa domesticação caracterizou-se como resultado de uma introgressão

entre S. spontaneous, Eriathus arundinaceus e Miscanthus sinensis (AUSTRALIAN

GOVERNMENT, 2004). Da Nova Guiné, a espécie propagou-se para Indonésia,

Malásia, China, Índia, Micronésia e Polinésia durante a pré-história. Os produtores

holandeses em Java chamavam S. officinarum de cana nobre, e “nobilização” o

processo de retrocruzamento entre os híbridos S. spontaneum de S. officinarum

(MING et al., 2006).

Antes dos programas de melhoramento da cana-de-açucar, as cultivares

nobres mais importantes utilizadas pelos povos antigos eram “Otaheite” (Tahiti),

“Cheribon” (Java) e “Caledonia” (New Hebrides). O primeiro programa a ser iniciado

no mundo ocorreu somente em meados do século XIX (Java e Barbado) com plantas

capazes de produzir sementes viáveis (MING et al., 2006). Em seguida foram

desenvolvidos programas em diferentes países, por instituições governamentais e

particulares ou em sistemas cooperativos formados pelos próprios produtores.

Nesse período, houve um intercâmbio muito intenso de material genético de

diferentes espécies de cana-de-açúcar entre várias equipes de melhoristas, inclusive

no Brasil, o que resultou na disseminação de doenças endêmicas que antes eram

encontradas somente em determinadas áreas (CESNIK e MIOCQUE, 2004). Os

ataques constantes de doenças, a baixa produtividade e concorrência do açúcar

produzido em outros países propiciaram uma preocupação do setor açucareiro

brasileiro com relação à melhoria da qualidade da cana como um todo, fazendo-se

assim necessárias pesquisas sistemáticas na área. Assim, várias estações

experimentais foram criadas tais como a de Campos (RJ), PLANALSUCAR,

COPERSUCAR, entre outras (BEAUCLAIR et al., 2009).

Em todo o mundo os programas de melhoramento genético buscam obter

cultivares de cana-de-açúcar mais produtivas exibindo tolerância a fatores bióticos e

abióticos. No Brasil, três grandes programas de melhoramento da cana-de-açúcar

têm sido realizados nas últimas décadas: Rede Interuniversitária de


22

Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (RIDESA), o Centro de Tecnologia

Canavieira (CTC) e o Instituto Agronômico de Campinas (IAC) (BEAUCLAIR et al.,

2009). Nesses programas, são realizados preferencialmente cruzamentos

biparentais entre cultivares elites. Os clones resultantes das diversas fases de

seleção são avaliados quanto ao seu desempenho sob diversas condições

ambientais. No entanto, o desenvolvimento de uma nova cultivar comercial de cana-

de-açúcar torna-se um processo que demanda muito tempo, podendo levar em

média 12 anos para estar disponível comercialmente (ALBINO et al., 2006).

2.3. Estresse hídrico e mecanismos de resposta em plantas

A disponibilidade de água inadequada é uma limitação crucial para o

rendimento de várias culturas de importância econômica na maioria dos ambientes,

e tem sido o foco de melhoramento genético por muitos anos (SINCLAIR et al.,

2004). O conhecimento das relações hídricas de cultivares modernas utilizadas

pelos produtores é fundamental para o manejo em regiões com baixa disponibilidade

de água (INMAN-BAMBER e SMITH, 2005).

O estresse é a condição fisiológica alterada provocada por fatores que

tendem a causar o desequilíbrio na planta. As reações das plantas ao estresse

hídrico diferem significativamente em vários níveis de organização, uma vez que

depende da intensidade e duração do mesmo, bem como das espécies de plantas e

seus estágios de desenvolvimento (CHAVES et al., 2003). Além disso, esse fator

abiótico pode surgir de duas condições, ou devido ao excesso de água, ou por déficit

hídrico. O fator hídrico mais comum encontrado é o estresse por déficit hídrico

conhecido também como estresse por seca. O déficit hídrico pode ser definido como

uma situação em que o potencial hídrico da planta e turgescência são reduzidos o

suficiente para interferir em suas funções normais (SHAO et al., 2008).

Embora os efeitos gerais da seca no crescimento das plantas sejam

conhecidos razoavelmente bem, os efeitos primários do déficit hídrico em níveis

bioquímicos e moleculares ainda não são bem entendidos (CHAVES et al., 2003;

YAMAGUCHI-SHINOZAKI e SHINOZAKI, 2005). O déficit hídrico em plantas inicia-

se a partir de uma complexa via de respostas, começando com a percepção do


23

estresse, o qual desencadeia uma cascata de eventos moleculares, sendo finalizada

em vários níveis de respostas fisiológicas, metabólicas e de desenvolvimento

(BRAY, 1993).

As respostas celulares são iniciadas principalmente pelas interações entre os

componentes extracelulares e as proteínas da membrana plasmática. A molécula

extracelular é chamada de ligante (ou elicitor) e a proteína de membrana, a qual se

liga e interage com a mesma, é chamada de receptor. Vários sinais de estresses

abióticos, bem como bióticos, servem como ligantes às proteínas de membranas

celulares das plantas. Os caminhos sinalizantes de estresse ativam os receptores de

membrana celular cujos sinais são transduzidos, gerando mensageiros secundários

que incluem cálcio, espécies reativas de oxigênio (ROS) e fosfato inositol. O fosfato

inositol modula os níveis intracelulares de cálcio que são percebidos pelos sensores

de cálcio. Estes, por sua vez, interagem com outras proteínas levando normalmente

a uma cascata de fosforilação, o que resulta na ativação dos principais genes ou

fatores de transcrição que controlam os genes de tolerância ao estresse. Assim, os

produtos gênicos, em última instância, levam à adaptação da planta e ajudam-na a

sobreviver e a superar as condições desfavoráveis. Com isso, as plantas respondem

inicialmente ao estresse como células individuais e sinergicamente como um

organismo inteiro (MAHAJAN e TUTEJA, 2005).

Os processos metabólicos que são ativados em resposta ao estresse

aumentam a concentração de solutos na célula, resultando na diminuição do

potencial osmótico e aumento da turgescência foliar. Assim, muitos componentes

são sintetizados para a manutenção do equilíbrio osmótico, da proteção de

membrana e macromoléculas. Estes componentes incluem prolina, glutamato,

glicina-betaina, carnitina, manitol, sorbitol, fructans, poliois, trealose, sacarose,

oligossacarídeos e íons inorgânicos como K+ (MAHAJAN e TUTEJA, 2005). Além

disso, as kinases de histidina (MAPKK, MAPKK e MAPK) também respondem ao

estresse hídrico, ajudando a restabelecer o balanço osmótico e induzindo a ativação

de outros genes de resposta ao estresse tais com as proteínas abundantes em fase

tardia da embriogênese (LEA) (MAHAJAN e TUTEJA, 2005).

Os vários genes responsivos ao estresse podem ser amplamente

categorizados em genes de resposta inicial e genes de resposta tardia. Os genes de

resposta inicial são induzidos dentro de minutos após a percepção do sinal e


24

normalmente a expressão ocorre de forma transitória. Vários genes transdutores de

sinais e reguladores tais como os fatores de transcrição (TF), proteínas kinases,

proteínas fosfatases, enzimas envolvidas no metabolismo dos fosfolipídios e outras

moléculas sinalizantes (ex. proteínas ligantes de calmodulina), estão incluídos nessa

lista. Em contraste, a maioria dos genes ativados mais tardiamente (após horas da

percepção ao estresse) possui uma expressão normalmente contínua. Esses genes

que mais provavelmente funcionam diretamente na tolerância ao estresse incluem

as chaperonas, proteínas responsivas a desidratação, proteínas responsivas e

induzidas por frio, proteínas LEAs, osmotinas, proteínas anti-congelantes, proteínas

ligantes de mRNA, enzimas chaves para biossíntese de osmólitos, proteínas de

canais de água, transportadores de açúcar e prolina, enzimas de detoxificacão,

várias proteases, entre outros (SHINOZAKI et al., 2003; MAHAJAN e TUTEJA, 2005;

SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007).

Estudos genômicos e moleculares têm mostrado que vários genes com

diversas funções são induzíveis por estresse a seca e frio, e que vários fatores de

transcrição estão envolvidos na regulação desses genes (SHINOZAKI et al., 2003).

Os fatores de transcrição induzidos por estresses inclui membros da família de

proteínas ligantes a elementos responsíveis a desidratação (DREB), a famílias dos

fatores ligantes a elementos responsíveis a etileno (ERF), a família dedo de zinco, a

família WRKY, a família MYB, a família hélice volta hélice básica (bHLH), a família

zíper de leucina de domínio básico (bZIP), a familia NAC e a família dos fatores de

transcrição de homeodomíneos. Esses genes podem regular vários genes induzidos

por estresse cooperativamente ou separadamente, e pode constituir muitas redes

gênicas (SHINOZAKI et al., 2003).

Os fatores de transcrição que desempenham papéis fundamentais na

resposta da planta ao estresse (SEKI et al., 2003) são agrupados em duas vias ABA

dependentes (I e II) e outras duas ABA não dependentes (III e IV). A via ABA

dependente tipo I requer a síntese de certas proteínas para ativar os fatores de

transcrição MYC/MYB (ABE et al., 1997) e/ou bZIP, os quais se ligam a regiões do

DNA como os ABREs – Elemento responsível a ABA e elementos tais como CE1 e

CE3 – Elemento de acoplamento (SHEN et al., 1996). A via ABA dependente tipo II

ativa o fator de transcrição bZIP (NAKAGAWA et al., 1996), o qual aciona a

expressão gênica pela ligação com os elementos ABA responsivos ABREs. A via

ABA não dependente tipo III compreende alguns genes induzidos pela seca que não


25

respondem à ABA nem ao frio. Estes genes incluem o ERD1 – Resposta inicial a

desidratação 1, que codifica para uma subunidade regulatória da protease Clp

(ClpD). A via ABA não dependente tipo IV induz a expressão gênica pela ativação de

DREBP – Proteína ligante de resposta a desidratação que se liga ao elemento de

resposta à seca DRE/CRT – Elemento de resposta a seca / C-repetido, conduzindo

para a indução de genes estimulados por seca e frio. (NAKASHIMA et al., 1998).

O promotor do gene induzido por seca, frio e alta salinidade

RD29A/COR78/LTI78 contém dois principais elementos de ação cis, o elemento

ABRE e o elemento DRE/C-repeat que estão envolvidos na expressão de genes

induzidos por estresses (SHINOZAKI et al., 2003; VALLIYODAN e NGUYEN, 2006).

A identificação de genes responsáveis por promover qualidades agronomicamente

desejáveis e sua posterior manipulação por meio de técnicas de biologia molecular

pode ajudar a obtenção de variedades bem sucedidas, reduzindo drasticamente as

perdas na agricultura, bem como, permitir o aproveitamento de solos até então não

utilizáveis.

2.4. Ferramentas de análises transcricionais

Os maiores avanços nas tecnologias de quantificação da expressão global

ocorreram na última década. Diversas metodologias foram desenvolvidas tais como

ESTs (Expressed Sequence Tags), macro e microarranjos de cDNA, SAGE (Serial

Analysis of Gene Expression ), cDNA-AFLP (cDNA amplified fragment length

polymorphism) e MPSS (Massive Parallel Signature Sequencing), porém com

limitações específicas as quais produzem bancos de dados distintos, nem sempre

interconversíveis ou comparáveis. Além disso, essas tecnologias induzem a

necessidade de integrar a biologia molecular, automação e sistemas de manejo das

informações de laboratório (LIMS) e análise de dados (DONSON et al., 2002;

CALSA JR et al., 2004).

Em cana-de-açúcar, análises de expressão gênica em larga escala via ESTs

(VETTORE et al., 2003), microarranjos (PAPINI-TERZI et al., 2005; ROCHA et al.,

2007); e SAGE (CALSA JR e FIGUEIRA, 2007) identificaram genes envolvidos na

sinalização celular, resistência a pragas, metabolismo, desenvolvimento e resposta a


26

estresses bióticos e abióticos, inclusive a seca. A tecnologia SAGE (VELCULESCU

et al., 1995), ou análise serial da expressão gênica, baseia-se na contagem em alta

escala de regiões específicas (tags) constituídas por 9 -10 pb, obtidas de uma

população de transcritos. As principais vantagens da SAGE são a medida absoluta

da expressão gênica ao invés de análise relativa, a geração de conjuntos de

dados digitais passíveis de novas inclusões e o menor custo de

sequenciamento por transcrito amostrado. Comparativamente à análise de ESTs, a

SAGE é cerca de 10 vezes mais eficiente para a detecção de transcritos raros

(CALSA JR et al., 2004).

A tecnologia de microarranjos, útil em identificar genes alvos para fatores de

transcrição relacionados ao estresse, abre também caminhos na análise de redes

gênicas em resposta a estresse abiótico. Um exemplo disso, foi a utilização de

microarranjo de cDNA de comprimento máximo para monitorar o perfil de expressão

de 7000 genes de Arabidopsis sob condições de estresse a seca, frio, alta salinidade

e tratamentos com ABA (SEKI, M. et al., 2002; SEKI, MOTOAKI et al., 2002). Um

desafio atual é explorar a grande quantidade de informações obtidas pelo

desenvolvimento de bibliotecas ESTs e SAGE e microarranjos de cana-de-açúcar, a

fim de aumentar o conhecimento sobre a complexa fisiologia da planta. Além disso,

identificar os genes regulados por estresse hídrico constitui uma excelente

ferramenta para o estabelecimento de estratégias visando ao aumento da tolerância

das plantas a períodos prolongados de seca, permitindo assim, o desenvolvimento

de variedades aptas ao cultivo em ambientes que apresentam tal condição edafo-

climática.

2.5. Aspectos gerais da metodologia RT-qPCR

A transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR)

difere da PCR convencional (ou endpoint) por medir o produto de PCR amplificado a

cada ciclo durante a reação. Ao contrário da PCR convencional, a RT-qPCR permite

que a amplificação seja seguida em tempo real durante a fase exponencial da

reação bem como determinada a quantidade cDNA alvo inicial. Além disso, uma das

principais vantagens dessa metodologia é a sua rapidez em provê dados confiáveis

(GACHON et al., 2004).


27

A RTqPCR é o principal método de análise de expressão gênica. Em geral,

duas estratégias de quantificação podem ser executadas nessa metodologia:

quantificação absoluta ou relativa. Na primeira, determina-se com precisão o número

de cópias do RNA alvo pela comparação com uma curva padrão apropriada,

enquanto que, na última expressa-se em termos de quantidade relativa de

transcritos em relação a um outro gene adotado como referência (PFAFFL, 2004).

Este último método é na maioria das vezes adequado para a investigação das

mudanças fisiológicas da planta baseadas nos padrões de expressão gênica

(GACHON et al., 2004). Contudo, etapas que antecedem as análises de expressão

tais como desenho de iniciadores (primers), extração de RNA e síntese de cDNA são

procedimentos importantes para a obtenção de dados de expressão confiáveis.

Durante a etapa de desenho de primers, os iniciadores devem ser

cuidadosamente desenhados e avaliados quanto a presença de estruturas

secundárias indesejáveis (alças, auto-complementariedade, dímeros e dímeros

cruzados) a fim de facilitar a obtenção da eficiência de amplificação máxima. Além

disso, as sequências do par de primers devem ser específicos a um produto de

amplificação (BUSTIN et al., 2005). Na etapa de extração de RNA, é importante

observar a integridade e qualidade do RNA total extraído. A primeira pode ser

avaliada pela visualização em gel das bandas 18S e 28S do RNA ribossomal e a

última, pela observação dos valores da razão de absorbância 260/280 acima de 1.8

(FLEIGE e PFAFFL, 2006; FLEIGE et al., 2006). Na etapa de síntese de cDNA, três

tipos de primer podem ser utilizados (primers randômicos, oligo-dT, gene-

específico), bem como a combinação de dois (oligo-dT e randômico). A escolha do

primer ideal é baseada nos tipos de experimentos e/ou resultados que se deseja

chegar. Para a análise de quantificação relativa em função dos níveis de expressão

gênica, em geral, o primer oligo-dT sozinho, é o mais utilizado (VETTORE et al.,

2003; RODRIGUES et al., 2009).

A RT-qPCR é um método que requer detecção precisa e sensível dos

produtos de amplificação (FRAGA et al., 2008). A alta sensibilidade para detectar

DNA ou cDNA é devido à combinação da amplificação feita pela etapa de PCR e do

sistema de detecção. A detecção é baseada na medida de florescência emitida por

sondas ou agentes intercalantes em função dos produtos da PCR formados

(amplicons). Agentes intercalantes (SYBR Green I) e sondas fluorogênicas (TaqMan

Molecular Beacons, Scorpions) são os dois tipos de moléculas utilizados para


28

detectar amplicons. Ensaios com SYBR Green I geram detecção mais precisa e

produz um sinal de decaimento mais linear do que a detecção por TaqMan além de

possuir um custo mais baixo (SCHMITTGEN et al., 2000). O SYBR Green I

indiscriminadamente se liga ao DNA fita dupla bem como outros produtos da PCR,

tais como dímeros de primer podendo ser detectados junto com o gene alvo. Para

verificar a detecção de apenas um produto de PCR, as amostras são submetidas a

realização da curva de dissociação (melting) ao final de cada reação de PCR

(RAJEEVAN et al., 2001).

A conversão de RNA em cDNA é considerada um importante contribuinte

para a variabilidade e falta de reprodutibilidade frequentemente observada nos

exprerimentos de RT-qPCR. Como muitos experimentos não apresentam 100% de

eficiência de amplificação, é importante avaliar a eficiência exata dos genes antes

das análises de expressão para minimizar as possíveis variações que possam ter

ocorridas na etapa de sítese de cDNA. As três principais razões são: (i) o estado

dinâmico das células promovem variações inerentes em RNA extraídos de amostras

biológicas; (ii) os RNA purificados podem ser de qualidades variáveis e (iii) a

eficiência da conversão do RNA em cDNA é dependente da abundância do RNA

alvo (BUSTIN et al., 2005). Existem duas abordagens para a construção da curva

padrão a fim de estimar a eficiência da reação: (1) o uso de diluições seriadas de

uma das amostras de cDNA sob investigação, e (2) o uso de uma série crescente de

quantidades de RNA total como entrada na etapa de transcrição reversa

(RAMAKERS et al., 2003). A primeira abordagem, em geral, é a mais utilizada,

sendo que valores de eficiência e coeficiente de correlação de Pearson acima de

90% e 0,99, respectivamente, são considerados valores adequados para as análises

de expressão gênica (BIOSYSTEMS, 2002).

A RT-qPCR, cada vez mais utilizada em pesquisas biológicas, está se

tornando o principal método de escolha para perfil de expressão de genes

selecionados (VANDESOMPELE et al., 2002; JAIN et al., 2006). A alta sensibilidade

em detectar transcritos raros, especificidade e simplicidade, juntamente com a

introdução permanente de novas químicas, instrumentação e protocolos mais

confiáveis, têm feito dela a metodologia de referência para a detecção e/ou

comparação dos níveis de expressão gênica (SCHMITTGEN et al., 2000; BUSTIN et

al., 2005).


29

O maior obstáculo da técnica de RT-qPCR não é o isolamento do mRNA, nem

a síntese de cDNA em si, mas a coordenação dos experimentos e a organização

eficiente dos dados coletados (MULLER et al., 2002). A PCR é composta por três

fases características: a fase exponencial, fase linear e fase de platô. Na fase

exponencial da amplificação existe uma relação direta entre a quantidade de DNA

complementar alvo inicial e o produto da reação a qual é utilizada para quantificar

com reprodutibilidade e confiabilidade (PFAFFL, 2004). O ciclo de amplificação no

qual a fluorescência detectada na amostra excede o limite (threshold) definido acima

da fluorescência de fundo (background) é denominado ciclo de quantificação (Cq)

sendo o valor gerado, utilizado para realizar a análise de expressão quantitativa

(HEID et al., 1996; BUSTIN e NOLAN, 2004). Valores de Cq obtidos na fase

exponencial são inversamente proporcional a quantidade de amostra-alvo inserida

na reação pois uma amostra que contém mais cópias de cDNA alvo deverá atingir o

threshold em ciclos mais cedo do que àquela amostra com baixo número de cópias

alvos (SCHMITTGEN et al., 2000). Contudo, é importante observar as variações

intraespecífica que pode ocorrer entre as réplicas experimentais. Valores de Cq

entre as réplicas são considerados similares e com boa reprodutibilidade quando os

desvios padrões estão abaixo de 0,5 (HEID et al., 1996). Desvios muito altos tendem

a ser gerados por erro de pipetagem (BIOSYSTEMS, 2004).

Antes da análise quantitativa relativa da expressão é necessário normalizar

os dados utilizando um gene de referência para controlar as variações não

específicas internas da RT-qPCR tais como diferenças na quantidade de RNA total

inserido na etapa de síntese de cDNA e variações das eficiências de amplificações

(HUGGETT et al., 2005). Há um fluxo constante de publicações defendendo o uso

de um ou mais genes de referência, geralmente para mais e mais aplicações

especializadas (VANDESOMPELE et al., 2002; PFAFFL et al., 2004;

VANDESOMPELE et al., 2009; MAROUFI et al., 2010). Estas por sua vez, destacam

o fato de que nenhum único gene é capaz de cumprir todos os critérios exigidos de

um gene de referência universal. Assim, todos os genes são regulados até certo

ponto nos mais variados tipos de células e/ou órgãos, ou condições experimentais.

Para avaliar a estabilidade do gene de referência, diversos softwares (geNorm,

General, Pattern, Recognition, BestKeeper entre outros) estão disponíveis para a

utlização, sendo o geNorm o software mais utilizado nas pesquisas com RTqPCR

(VANDESOMPELE et al., 2009). Para as análises de quantificação relativa, testes


30

estatísticos como o Kruskal-Wallis podem ser utilizados (WEN et al., 2005; WALTER

et al., 2008), admitindo-se como níveis de significância valores de p≤0,05.

Vários fatores têm contribuído para a transformação desta tecnologia em uma

importante ferramenta de pesquisa como: (i) é um ensaio homogêneo, que evita a

necessidade de processamento pós-PCR; (ii) possui ampla faixa dinâmica (> 107

vezes) que permite comparar diretamente diferenças de abundância de RNA e (iii)

apresenta potencial inerente de transformar a PCR quantitativa em qualitativa.

Comparado a técnica de northern blot, a PCR em tempo real apresenta alta

velocidade e especificidade nas análises de expressão gênica. Isto tem resultado em

extensivas aplicações de estudos de genômica funcional, medicina molecular,

forense, virologia, microbiologia e biotecnologia (GACHON et al., 2004; NOLAN et

al., 2006). A quantificação dos níveis de expressão gênica pode render valiosas

pistas sobre a função gênica. Por meio desse método, podem ser revelados níveis

de expressão individual em um estado biológico definido (doença, desenvolvimento,

diferenciação, etc), detecção de alterações no nível de expressão gênica em

resposta a estímulos biológicos específicos (fator de crescimento, agente

farmacológico, estresse bióticos e abióticos em plantas etc) e detecção do tipo de

célula ou órgão onde o gene está sendo expresso (FRAGA et al., 2008).


31

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Identificar diferentes genes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) associados

com a tolerância ao déficit hídrico e validar experimentalmente esta correlação.

3.2. Objetivos Específicos

Identificar in silico e selecionar sequências transcritas associadas a genes de

resposta à seca.

Desenhar iniciadores para análise quantitativa da expressão dos genes

selecionados.

Validar experimentalmente a correlação da expressão dos genes

selecionados, em folha e raiz de variedades de cana-de-açúcar mais e menos

tolerantes à seca.

Selecionar dois genes de tolerância à seca para estabelecer construções

gênicas, úteis para transformação genética de cana-de-açúcar e análises

funcionais in vivo.


32

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Identificação e seleção de transcritos in silico

A identificação in silico e a seleção de sequências transcritas (tags)

potencialmente associados a genes de resposta à seca foram realizadas com base

em quatro bibliotecas SAGE de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) (CALSA JR,

2006). Estas bibliotecas totalizam aproximadamente 46.000 tags únicas oriundas

de amostras de colmo, exceto epiderme lignificada, derivadas de plantas F1 de

cruzamento entre duas variedades comerciais SP/CTC (Centro de Tecnologia

Canavieira, Piracicaba, SP).

As etapas a seguir foram realizadas em planilha utilizando o software

Microsoft Excel 2007 (Microsoft). As frequências das tags das bibliotecas

analisadas foram normalizadas separadamente em tags por mil (TPT). Em seguida,

foi determinada para cada tag, a razão de variação entre as médias das freqüências

normalizadas em cada época de coleta (média dos dois genótipos com alto e dois

com baixo teor de sacarose), comparando-se a média no período seco (S) com a do

período chuvoso (C). O valor da razão de variação (ratio) foi obtido por S/C. Valores

de ratio ≤ 0,5 foram considerados indicativos de inibição da transcrição; entre 0,5 e

2,0 indicando tags sem variação significativa; e ratio ≥ 2,0 referidos como

indicadores de indução transcricional.

Além do parâmetro ratio, foram consideradas para a identificação dos genes

as anotações e ontologias gênicas presumíveis publicadas para este banco de

dados. Foram realizadas buscas de palavras-chave (drought, water deprivation,

dehydration, irrigation e dehydrin). Após a identificação, os genes/transcritos foram

selecionados e agrupados segundo a anotação (conhecida ou desconhecida),

ontologia gênica (estresse oxidativo, fator de transcrição ou proteínas de choque

térmico) e referência (sem variação de ratio). Exceto para a categoria referência, o

critério de inserção das tags nos grupos propostos foi possuir os maiores ou os

menores ratios.

As tags selecionadas foram alinhadas contra o banco de dados de acesso

público do Instituto de Pesquisas Genômicas (TIGR) Gene Index/Saccharum


33

(http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/Blast/index.cgi), específico para cana-de-

açúcar, através do programa SAGE14. Para cada tag, foi identificado o cluster

(agrupamento de ESTs alinhados) ou singleton (EST não agrupado em cluster) mais

associado, e cuja sequência consenso foi utilizada para o desenho de iniciadores

específicos (primers). Foram consideradas as anotações presumíveis de cada

cluster/singleton disponíveis no TIGR/Gene Index/Saccharum.

4.2. Desenho de iniciadores

A partir das sequencias consenso obtidas do TIGR/ Gene Index/Saccharum,

pares de primers específicos para os genes selecionados foram desenhados in silico

utilizando o programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3). Em geral, foram

utilizados parâmetros padronizados, exceto: tamanho do amplicon variando entre

100 e 350 pb; tamanho do primer entre 18 e 22 pb (ótimo a 20 pb); temperatura de

melting do primer (Primer Tm) entre 50 e 60ºC (ótimo a 55ºC); conteúdo de GC%

entre 40 e 60% (ótimo a 50%); fator de autocomplementariedade máxima igual a 3; e

fator de auto-complementariedade máxima na região 3´ igual a 0.

Após serem desenhados, os pares de primers foram avaliados quanto a

formação de estruturas secundárias indesejáveis (alças, auto-complementariedade,

dímeros e dímeros cruzados) e especificidades de anelamento nas sequências

gênicas. Para o primeiro foi utilizado o programa NetPrimer

(http://www.premierbiosoft.com/netprimer), enquanto que para o segundo, foi usada a

ferramenta de alinhamento de sequências de nucleotídeos (Blastn) no banco de

dados TIGR Gene Index de cana-de-açúcar. Os iniciadores foram considerados

adequados quando não apresentaram estruturas secundárias e anelaram em

apenas um gene.

Os iniciadores liofilizados (Invitrogen) foram ressuspendidos para

concentração estoque de 100 μM em água ultrapura (Milli-Q) estéril. Desta solução,

foi preparada outra para uso, diluída a concentração de 5 μM. Ambas as soluções

(estoque e uso) foram armazenadas a -20ºC. A integridade dos primers foi verificada

em eletroforese de 1 µg em gel de agarose 1%. Todos os pares de primers foram

http://frodo.wi.mit.edu/primer3

http://www.premierbiosoft.com/netprimer


34

testados experimentalmente via RT-PCR utilizando-se amostras de cDNA de folha e

raiz.

4.3. Material vegetal e tratamentos hídricos

O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, no Departamento de

Genética da Universidade Federal de Pernambuco (Recife, PE, 08º03´03"S e

34º56´54"W), no período de 25 de março a 24 de maio de 2010. Os segmentos de

colmo, contendo uma gema lateral (rebolos) de cana-de-açúcar, utilizados foram

gentilmente cedidos pela Estação Experimental de Cana-de-acúcar de Carpina, PE

(EECAC), da Universidade Federal Rural de Pernambuco, vinculada ao Programa de

Melhoramento Genético de Cana-De-Açúcar da Rede Interuniversitária para o

Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (PMGCA-RIDESA).

Inicialmente, foram cultivadas duas variedades: uma conhecidamente

tolerante à seca (RB92579), com 30 rebolos, e outra sensível (RB72454) com 28

rebolos. Estas variedades são o resultado de genealogias e seleção para várias

características de importância agroindustriais tais como brotação, maturação,

florescimento, perfilhamento, teor de açúcar, teor de fibras, entre outros, inclusive

tolerância a seca. De modo geral, os rebolos cultivados tiveram em média 2,8 cm

(variação de 2,0 cm a 3,6 cm) de diâmetro e 4,9 cm (3,2 cm a 6,0 cm) de

comprimento onde foram distribuídos de forma eqüidistante (~4,5 cm) em bandejas

de polietileno (41 cm x 27 cm x 4 cm) contendo terra vegetal composta comercial

(Viva o Verde ). Em seguida, estes foram regados diariamente com água fornecida

pela Companhia de Abastecimento de Água de Pernambuco (Compesa) uma vez

por dia, no horário compreendido entre 8 h e 10 h da manhã.

Um mês após o plantio dos rebolos, nove plantas de cada variedade com

tamanhos similares (~ 10 cm) foram transferidas para vasos contendo

aproximadamente 7 kg de substrato, onde foram cultivadas três plantas (Figura 2).

Os experimentos foram conduzidos a 32±1°C e 71±4% UR (umidade relativa do ar),

sendo estes parâmetros mensurados diariamente no mesmo período da rega com o

auxílio de termo-higrômetro digital (CE).


35

Figura 2 – Cultivo dos rebolos em bandejas de polietileno e transferência das plantas juvenis de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para vasos.

Os experimentos foram realizados sob dois tratamentos hídricos distintos: o

primeiro, consistindo de suspensão de rega durante 15 dias consecutivos,

denominado no presente estudo, de tratamento seco (TS); e o segundo, no qual a

rega foi diária, sendo por isso denominado tratamento irrigado (TI). Este último foi

considerado como situação controle do experimento. Do total de nove réplicas

utilizadas para cada cultivar, seis foram destinadas à condição de seca e três para a

de irrigado.

No 15º dia após aplicação dos tratamentos citados foram determinados ao

meio-dia o potencial hídrico foliar e a umidade relativa do solo, sendo então coletado

o material vegetal (folhas e raízes). O potencial hídrico foliar foi verificado em

câmara de pressão Scholander (Soilmoisture Equipment Corp., Santa Barbara, CA,

USA) para a folha 0 (Figura 1). O valor do potencial foi registrado no momento em


36

que houve a exsudação inicial da seiva bruta devido à pressão exercida pelo gás

nitrogênio no interior da câmara (Figura 3A).

A umidade relativa do solo foi determinada coletando-se amostra do substrato

dos vasos com o auxílio de gabarito cilíndrico em PVC (1,5 cm de diâmetro x 25 cm

de comprimento) (Figura 3B). Esta amostra foi acondicionada em frasco de vidro

limpo e com tampa, sendo conduzida ao laboratório para pesagem em balança

analítica (ANDHR 200) no mesmo dia. Após a medição dos pesos, os frascos

contendo as amostras foram colocados em estufa a 60ºC até peso constante a fim

de obter o solo seco para nova pesagem. O valor final da umidade do solo foi obtido

subtraindo-se o peso do solo úmido com o peso do solo seco.

Figura 3 – Medição do potencial hídrico foliar em câmara de pressão Scholander (A) e coleta de solo para cálculo da medida da umidade relativa do solo (B).

A coleta do material vegetal foi realizada após a medição do potencial hídrico

e umidade relativa do solo, cortando-se com tesoura, as folhas +1 e raízes nas

regiões próximas ao pecíolo e rebolo, respectivamente. O material coletado foi

A

B


37

acondicionado em tubos do tipo Falcon de 50mL (Fisherdrand) e imediatamente

imersos em nitrogênio líquido, sendo posteriormente armazenado em freezer -80°C

(Figura 4). Para cada variedade e tratamento hídrico, foram separadas três réplicas

biológicas (plantas do mesmo vaso), tomando-se como critério a menor variação do

valor do potencial hídrico foliar entre elas. Estas réplicas foram posteriormente

utilizadas para as análises de expressão gênica.

Figura 4 – Esquema ilustrativo do procedimento de coleta de folha e raiz de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para as análises moleculares. A e B – corte de folha e raiz, respectivamente; C e D – acondicionamento em tubos Falcon; E – conservação do material vegetal em nitrogênio líquido.

4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA

As amostras de folha e raiz coletadas a partir das duas variedades foram

devidamente identificadas em códigos e esquematizadas conforme as Figuras 5 e 6

de modo que estes códigos serão utilizados a partir deste ponto.

A

C

B

D

E


38

Figura 5 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de folha.


39

Figura 6 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de raiz.


40

Para a extração do RNA total, o material vegetal foi previamente macerado

em nitrogênio líquido a fim de romper de modo mecânico a estrutura da parede

celular, bem como, minimizar a degradação do RNA. O material macerado de folha e

raiz foi distribuído em quantidades de 100 mg em tubos do tipo eppendorf de volume

igual a 1,5 mL. Em cada tubo foi adicionado o reagente comercial TRIzol® RNA

Isolation (Invitrogen) observando-se as orientações do fabricante. Ao final do

procedimento de extração, o volume final de RNA total obtido foi de 20 µL. Testes

preliminares com raiz utilizando-se 100 mg, 200 mg e 400 mg de material vegetal

macerado revelaram baixos níveis de concentração de RNA fazendo com que a

quantidade de 600 mg da planta fosse utilizada para os experimentos do órgão em

questão.

A quantificação das amostras foi realizada a fim de que em cada reação de

análise de expressão houvesse a mesma quantidade inicial de cDNA. Este

procedimento foi feito no equipamento NanoVueTM Plus (GE Life Sciences), em

colaboração com o Laboratório de Terapia Experimental, Departamento de Genética,

UFPE, utilizando-se 2 µL sendo calculada de acordo com a fórmula abaixo:

Onde:

A260 = absorbância da luz ultravioleta (UV) no comprimento de onda de 260

nm. Indica o nível de concentração de ácidos nucléicos na amostra.

A320 = absorbância da UV no comprimento de onda de 320 nm. É a

compensação dos efeitos de absorbância causada pela turbidez, partículas

estranhas e soluções tampão.

A qualidade do RNA total extraído (grau de pureza) foi analisada no mesmo

aparelho citado anteriormente, utilizando-se a mesma amostra, conforme a equação:


41

Onde:

A280 = absorbância da UV no comprimento de onda de 280 nm. Reflete o

nível de concentração de proteínas.

A260* e A280* são as absorbâncias compensadas da luz ultravioleta nos

comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm, respectivamente.

Valores obtidos a partir da razão A260*/A280* próximos de 1,8 indicaram os

índices de pureza do RNA total. Para avaliar a integridade do RNA, uma nova

alíquota de 2 µL de cada amostra, foi submetida a eletroforese em gel de agarose

(1%). Com base na concentração de RNA obtida na etapa de quantificação foi

definida a concentração final a ser utilizada na síntese de cDNA para os órgãos de

folha e raiz. Esta por sua vez, foi fixada em 100 ng/µL (folha) e 200 ng/µL (raiz) em

10 µL de água deionizada ultrapura (água mili-Q) devidamente tratada com

dietilpirocarbonato (DEPC).

A síntese de cDNA foi realizada via transcrição reversa conforme o protocolo

do Kit First Strand cDNA Synthesis (Fermentas Life Sciences ). Devido à cauda

poli-A majoritariamente presente nos mRNAs transcritos de genes nucleares,

oligonucleotídeos poli-T18 foram utilizados. Para confirmar a síntese de cDNA,

alíquotas dessas amostras foram analisadas por PCR convencional (RT-PCR)

seguida de eletroforese em gel de agarose 1%, e quando necessário, por PCR em

tempo real (RT-qPCR). Para isso, foi utilizado um gene previamente selecionado a

partir das bibliotecas SAGE.

4.5. Eficiência da amplificação e RT-qPCR

A eficiência dos primers para amplificação foi determinada por meio de três

diluições seriadas (2:10, 2:100 e 2:1000) de cDNA. A curva padrão gerada por essa

análise forneceu o valor relacionado à eficiência da amplificação e o coeficiente de

correlação de Pearson (R2).

As reações de RT-qPCR foram realizadas no equipamento Rotor-GeneTM

6000 (Corbett Life Science) sendo cada amostra de cDNA analisada em triplicata.


42

Para cada análise, um gene foi utilizado e 36 reações realizadas por vez, tanto para

folha quanto para raiz. Em cada uma das análises foram acrescentadas duas

amostras sem a presença de cDNA que serviram como controles negativos da

reação. Todas as análises foram realizadas seguindo o protocolo do Rotor-Gene

SYBR Green PCR Kit (Qiagen) com modificações: utilização da metade do volume

final/reação de 25 µL para 12,5 µL e o programa de amplificação de “Two step”

(ativação da enzima HotStarTaq DNA polymerase ocorrendo a 95ºC por 5 min,

seguidas de 35 a 40 ciclos de 95ºC por 5 s e anelamento e extensão a 60ºC ) para

“Three step” - ativação da enzima HotStarTaq DNA polymerase ocorrendo a 95ºC

por 5 min, seguidas de 38 ciclos de 95ºC por 15 s, temperatura de dissociação

(melting) ótima de cada par de primer por 15 s e 60ºC por 10 s. Este último

programa foi utilizado devido a variações existentes nas temperaturas de melting do

par de primer associado a cada um dos genes previamente selecionados. A partir

das reações de RT-qPCR foram gerados ciclos de quantificação (Cq) os quais foram

utilizados para as análises de expressão gênica.

4.6. Seleção do gene de referência, normalização e análise de RT-qPCR

A seleção do gene de referência foi feita utilizando-se o software geNorm

versão 3.5 (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/), assumindo-se valores de

estabilidade (M) abaixo de 1,5 como descrito por Maroufi et al., (2010). O critério de

escolha do gene de referência mais estável utilizado foi o que apresentou o menor

valor de M e menor coeficiente de variação. Para a normalização e análise dos

dados de PCR em tempo real foi utilizado o método 2-ΔCt (LIVAK e SCHMITTGEN,

2001), o qual é baseado na quantificação relativa da transcrição do gene alvo em

relação ao gene de referência na mesma amostra. Para identificar diferenças dos

níveis de expressão de cada gene entre os tratamentos (seca e irrigado) em cada

variedade, foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis admitindo-se como níveis de

significância valores de p≤0,05. Os testes foram realizados utilizando o programa

BioEstat5.0

(http://www.mamiraua.org.br/download/index.php?dirpath=./BioEstat%205%20Portug

ues&order=0).

http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/

43

5. RESULTADOS

5.1. Identificação e seleção de transcritos in silico

Da coleção de 46.536 tags únicas analisadas in silico a partir de bibliotecas

SAGE, 45% mostraram-se inibidas pela seca (ratio ≤ 0,5), 6,3% induzidas pela seca

(≥ 2,0) e 48,7% não apresentaram variação (0,5 < ratio < 2,0) de indução ou inibição

por seca (Figura 7).

Figura 7 - Número de tags identificados como sendo inibidos (ratio ≤ 0,5), sem variação (0,5 < ratio < 2,0) e induzidos (ratio ≥ 2,0) pela seca, a partir do banco de dados SAGE para cana-de-açúcar (Saccharum spp.) (CALSA Jr., 2006).

Diante do elevado número de sequências transcricionais identificadas,

foram selecionadas 21 tags associadas a genes de resposta à seca. Sua

distribuição dentro dos grupos bem como o ratio calculado estão sumarizadas na

Tabela 1.


44

Tabela 1 – Agrupamento por categoria e anotação das tags/genes no banco de dados TIGR Gene Index de cana-de-açúcar selecionadas a partir de bibliotecas SAGE para a análise de expressão gênica via RT-qPCR

Consenso Símbolos Anotação presumível Categorias* Tags (SAGE) Ratio Classe / Ratio

TC122998 Dhyn_98 Deidrina 98 Conhecido CATGGACAAGATAC 0,26 Inibido

TC144449 Dhyn_49 Deidrina 49 Conhecido CATGGAGGACGAGA 0,28 Inibido

CA162094 ERD4 Proteína de resposta precoce a desidratação 4 Conhecidos CATGTATATTGAGT 2,29 Induzido

TC121509 SIP Proteína induzida por estresse Conhecidos CATGTTTGTGGCAC 2,83 Induzido

CA076923 Os700 Proteína Hipotética Os03g08077006 Desconhecidos CATGGAGTGCACGC 0,08 Inibido

CA086281 Unk_ptn Proteína desconhecida Desconhecidos CATGTGTTTCTAAA 0,04 Inibido

TC114816 Dgt_L Proteína similar à dirigente Desconhecidos CATGCATTAAGCTC 15,27 Induzido

TC143667 Dgt Proteína dirigente Desconhecidos CATGTACATATTCT 18,55 Induzido

TC135383 MARK Receptor kinase atípico ( MARK) Estresse oxidativo CATGTCACTGTACT 5,71 Induzido

TC134955 Pox Peroxidase Estresse oxidativo CATGTTTTTCATCG 5,71 Induzido

CA073039 RNApol Subunidade 14.5 kD RNA polimerase II Fator de transcrição CATGACAAAACAAT 0,12 Inibido

TC116495 Hd-Zip Proteína com homeodomínio zíper de leucina Fator de transcrição CATGAAAATGTATA 0,16 Inibido

TC130358 CHR4 Proteína de ligação ao DNA Fator de transcrição CATGGCTAACATAT 5,77 Induzido

TC130425 ATPase Ativador da HSP90/ATPase Fator de transcrição CATGGGGGTTTAAA 8,00 Induzido

TC136491 Hsp70 Proteína de choque térmico 70 kDa HSP CATGCGCAACACGA 0,16 Inibido

TC123494 eIF-3 Proteína de interação Sub. 6 eTIF-3 HSP CATGCGACTTAGTT 0,18 Inibido

TC80513 PPlase Peptidil-prolil isomerase 70 kDa HSP CATGGCTTTTGGGG 12,55 Induzido

TC98760 DnaK DnaK/chaperona molecular HSP70 HSP CATGGAAGAGGATG 5,91 Induzido

TC142330 HK. h740 Proteína hipotética 03g013740 Referência* CATGATGTATGTGT 1,00 Referência

TC57186 HK.rpl35_4 Proteína ribossômica 60S L35-4 Referência* CATGAGGAAGTATG 1,04 Referência

TC126281 HK.Tic32 Desidrogenase de cadeia curta Tic32 Referência* CATGGGTGCAATGT 1,00 Referência 3Categoria associada a anotação e ontologia SAGE


45

5.2. Desenho de iniciadores

Para cada gene selecionado foi desenhado um par de primer (forward e

reverse) (Tabela 2). Os resultados obtidos para estes primers via RT-PCR revelaram

amplificação de 18 dos 21 genes selecionados. Esses testes foram realizados

utilizando-se a mesma réplica de folha no tratamento irrigado para a variedade

sensível (FISe1). Os genes Os700, Dhyn_49 e Dgt_L não apresentaram

amplificação (Figura 8), apesar de ter sido realizado o mesmo teste mais de uma vez

e foram excluídos das análises de RT-qPCR.


46

Tabela 2 – Pares de iniciadores (primers) desenhados pela seleção in silico a partir dos dados SAGE associados a genes de resposta à seca.

Símbolos Primer Forward (5´- 3´) Primer Reverse (5´- 3´) Produto (pb) Tm (ºC) F Tm (ºC) R

Dhyn_98 CGGATGGCAAGGAGAAGA CCAAAGCCTACACAAGCAAC 294 59,9 58,4

Dhyn_49 ACCAGGAGGAGGAGCACA CGGTCGGAAACAAGGAAA 225 59,3 59,6

ERD4 GATTCCGACCCATTGTATTT ACCTGTGCTCCTTGTTCTT 315 56,3 54,8

SIP GACCCGAACAACCAGGAA TAACAAAGCCAAGCACAAGG 333 59,5 59,0

Os700 ACCCTCTTCCCTATCCAC GACCTCGCCTTGAAACAG 286 53,7 56,8

Unk_ptn TGACATTGAAAACACAGG CTAAAACTTGCTTGATACGA 196 50,6 51,0

Dgt_L TCGCACTGGATGAGAAAGA TCCTCTGGCTTGGTTTGA 213 58,0 57,8

Dgt ACGCCAGACCAACCATAA TACTCGCAGAACTTGACAGA 157 57,4 54,6

MARK GGCAACATCAAATCCTCCA GCACCATCTCCTCCTCCA 349 59,4 59,7

Pox GTTCCCGTCGTTCCTCAA AGAAATCCTCATCCCACA 187 59,6 53,5

RNApol GTGAACCCAAAGATGTCC ACCCTTCTCAGTCCCTCCA 195 53,4 59,6

Hd-Zip GACCGACTATGACCACCTC ACCACCATCCTCTTCCTCT 295 55,3 56,0

CHR4 CGAGCAGAGTAAAGATTCCA CCTTCCCTATCAAACAACAA 258 55,7 55,2

ATPase GTGGTAGAGAACACGGAGAG AGAACTGGGAGCAAGGAA 263 54,8 55,8

Hsp70 CGAGGACAAGATGAAGGAG CAACCAACCACAGATAACAA 247 55,8 54,4

eIF-3 AGCAACACTAAGGTCAATCC ACAAAGGGCACAAACATAAC 325 54,4 55,2

PPlase CTTGTCACGATTCCTCCT ATTCCCTTCCTCTTTCTTCT 189 53,3 53,8

DnaK CAAGGGTGAGGAGAAGCA CTCTGTGAGTCGTTGAAGTAGG 144 57,3 56,7

HK. h740 TAATGCTCCTTGAGACGATG CACCTCTGTGACTGTTGCT 231 56,5 54,6

HK.rpl35_4 CTGAAGACGGAGAGGGAAAA GGCGAAGAGAAACTAACACCA 264 59,0 59,0

HK.Tic32 GTCAGAGGGGCACAGATT AAGGTTCGTGATAATGGAG 205 55,9 52,5


47

Figura 8 – Análise de eletroforese em gel de agarose 1% a partir de RT-PCR mostrando a amplificação dos genes para teste dos primers.

5.3. Material vegetal e tratamentos hídricos

Com base nos valores obtidos para o potencial hídrico foliar (Figura 9), em

cada uma das variedades foi possível observar que durante o tratamento seco estas

apresentaram potenciais hídricos menores que os apresentados durante o

tratamento irrigado. No primeiro foi observado valor médio de -1,53 e o no último o

valor de -0,73.

Figura 9 – Potencial hídrico foliar das duas variedades (RB92579 e RB72454) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) sob os tratamentos irrigado e seco.

Para a umidade relativa do solo (Figura 10) foi observado acúmulo de água

no substrato em cada uma das variedades durante o tratamento irrigado acima de

3,5 g e valor abaixo de 1,0 g para o tratamento seco.

-0,85

-0,60

-1,55 -1,50-1,80

-1,60

-1,40

-1,20

-1,00

-0,80

-0,60

-0,40

-0,20

0,00

RB92579 RB72454

Po

ten

cial

híd

rico

folia

r (M

pa)

Variedades

Potencial hídrico foliar

Irrigado

Seco


48

Figura 10 – Umidade relativa do solo das duas variedades (RB92579 e RB72454) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) sob os tratamentos irrigado e seco.

Observando as imagens das partes aéreas, raízes e solo, sinais visíveis de

estresse hídrico puderam ser visualizados: folhas secas, crescimento reduzido das

plantas, raízes longas e solo seco (Figura 11).

Figura 11 – Sinais visíveis em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) submetidas aos tratamentos de irrigação (I) e seca (S). (A) Parte aérea; (B) solo e (C) sistema radicular.

A B

C

I S

I

I S

I

S

I

I

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

RB92579 RB72454Um

idad

e r

ela

tiva

do

so

lo (

g)

Variedades

Umidade relativa do solo

Irrigado

Seco


49

5.4. Extração de RNA e síntese de cDNA

De modo geral, a extração de RNA de folha para as variedades apresentou

maior concentração, qualidade e integridade quando comparada aquela de raiz

(Tabela 3 e Figuras 12 e 13). Foram registrados para a razão de absorbância de

260*/280*, em média, valores iguais a 1,88±0,02 (variação de 1,74 a 1,94) e

1,64±0,03 (1,47 a 1,87) para folha e raiz, respectivamente. Com a finalidade de

tentar otimizar as extrações de RNA de raiz foram realizados testes utilizando o

reagente LiCl conforme o protocolo sugerido por Chang et al. (1993) com

modificações, resultando em qualidade e integridade mais baixa do que a utilização

do reagente TRIzol (dados não mostrados).

Tabela 3 – Quantificação e qualidade do RNA extraído de amostras de folha e raiz de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), sob seca ou irrigação nas variedades tolerante (RB92579) e sensível (RB72454).

Órgão vegetal Amostras Concentração (ng/µL) A260 A280 A320 260*/280*

Folha FIT1 746,00 21,39 12,72 2,74 1,87 Folha FIT2 555,60 14,82 8,16 0,93 1,92 Folha FIT3 293,20 8,23 4,88 0,90 1,84 Folha FST1 278,00 7,58 4,33 0,63 1,88 Folha FST2 630,40 16,61 9,99 1,85 1,94 Folha FST3 338,00 9,52 5,57 1,07 1,88 Folha FISe1 624,80 16,16 8,68 0,54 1,92 Folha FISe2 542,00 14,75 8,28 1,20 1,91 Folha FISe3 223,60 6,17 3,69 0,58 1,80 Folha FSSe1 289,60 8,13 5,05 0,89 1,74 Folha FSSe2 418,00 11,56 6,02 1,11 1,90 Folha FSSe3 726,00 20,76 11,98 2,61 1,94 Raiz RIT1 212,00 8,40 6,60 3,10 1,51 Raiz RIT2 248,80 18,42 15,79 12,20 1,73 Raiz RIT3 126,00 11,06 10,06 7,91 1,47 Raiz RST1 364,00 27,51 24,05 18,41 1,61 Raiz RST2 252,00 14,03 11,88 7,73 1,52 Raiz RST3 256,00 18,83 16,45 12,43 1,59 Raiz RISe1 427,60 27,60 22,63 16,91 1,87 Raiz RISe2 393,20 25,29 21,01 15,46 1,77 Raiz RISe3 180,00 10,79 8,92 6,29 1,71 Raiz RSSe1 994,00 63,90 54,54 39,06 1,61 Raiz RSSe2 486,00 34,28 29,70 22,12 1,60 Raiz RSSe3 545,00 36,16 30,80 22,54 1,65


50

Figura 12 – Integridade do RNA total extraído de folha das variedades RB92579 e RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da análise por eletroforese em gel de agarose 1%.

Figura 13 – Integridade do RNA total extraído de raiz das variedades RB92579 e RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da análise por eletroforese em gel de agarose 1%.

Testes realizados via RT-PCR utilizando-se o gene HK.rpl35_4, confirmaram

a síntese de cDNA para todas as amostras de folha (Figuras 14), e somente para

quatro amostras de raiz RIT1, RISe1, RISe2 e RISe3 (Figura 15). As amostras de

raiz que não foram visualizadas a amplificação foram submetidas a um novo teste,

porém, via RT-qPCR, mantendo-se as mesmas condições da técnica anterior, sendo

desta forma comprovada a síntese de cDNA nas oito amostras testadas (dados não

mostrados).

Figura 14 – Confirmação da síntese de cDNA em amostras de folha via RT-PCR utilizando o gene HK.rpl35_4.


51

Figura 15 - Confirmação da síntese de cDNA em amostras de raiz via RT-PCR utilizando o gene HK.rpl35_4.

5.5. Eficiência da amplificação e RT-qPCR

Quando observadas as eficiências de amplificação, de modo geral, estas

foram consideradas aceitáveis uma vez que apresentaram valores de eficiência

próximos de 1,0 (100%) e R2 superior a 0,99 (Tabela 4 e Apêndice C).

Tabela 4 – Eficiências das reações e R2 (coeficiente de correlação de Pearson) correspondentes aos

genes utilizados via RT-qPCR

Genes cDNA Eficiência R2

Dhyn_98 FIT2 1,00 0,99669

ERD4 FIT2 0,96 0,99973

SIP FIT2 1,03 0,99252

Unk_ptn nd nd nd

Dgt FST2 1,00 0,99860

MARK nd nd nd

Pox FST2 1,00 0,99729

RNApol FIT2 0,93 0,99974

Hd-Zip FST2 1,06 0,99662

CHR4 FIT2 1,01 0,99300

ATPase FIT2 1,08 0,99996

Hsp70 FST2 1,00 0,99785

eIF-3 FST2 1,00 0,99340

PPlase FIT1 1,00 0,99993

DnaK nd nd nd

HK. h740 nd nd nd

HK.rpl35_4 FIT1 1,02 0,99898

HK.Tic32 FST2 1,01 0,99639 Nd = não determinada.


52

Do total de 21 genes selecionados para análise de expressão via RT-qPCR,

18 foram avaliados em folha e 15 em raiz. Os valores médios de Cq obtidos variaram

de 17 a 33 ciclos para o primeiro, enquanto que, para o segundo, esta variação foi

de 24 a 35 ciclos (Tabela 5). O valor da fluorescência de detecção da amplificação

(fluorescência normalizada) no threshold resultou em 0,032 para folha e 0,02 para

raiz. É importante observar que as análises de PCR em tempo real em raiz para os

genes ERD4, SIP, Unk_ptn, Pox e Hsp70 mostraram que alguns deles não

apresentaram expressão em determinadas amostras de cDNA sendo considerados,

assim, como expressão nula (Tabela 5). É possível que amostras com RNA

degradado apresentem um impacto nos resultados de RT-qPCR por promover a

perda de detecção de transcritos raros.


53

Tabela 5 – Valores médios ± desvio padrão de Cqs resultantes das análises de RT-qPCR em tempo real quantitativa em folha e raiz dos genes selecionados a partir do banco de dados SAGE.

Amost/Gene FIT FST FISe FSSe RIT RST RISe RSSe

Dhyn_98 23,72±0,25 20,62±0,67 22,16±0,47 17,87±0,55 27,13±4,18 29,2±1,92 24,62±2,92 29,75±1,99

ERD4 30,84±0,72 29,62±1,53 28,69±1,24 28,89±0,98 nula nula 29,57±0,8 nula

SIP 26,34±2,56 24,61±1,3 23,07±0,66 22,89±0,27 30,73±1,48 nula 29,87±1,34 nula

Unk_ptn 24,62±1,3 25,06±0,43 25,05±1,19 24,23±1,44 nula nula nula nula

Dgt 32,83±1,27 31,43±0,91 33,37±0,57 30,68±0,38 32,72±1,95 30,19±2,14 30,28±1,49 31,24±2,08

MARK 30,05±1,78 27,82±0,66 26±1,1 25,78±0,81 nd nd nd nd

Pox 24,86±2,11 22,38±1,14 22,9±2,06 21,85±0,36 nula nula 30,99±1,58 nula

RNApol 27,15±1,01 26,49±0,8 24,08±1,37 25,79±1,56 29,63±2,18 nd±nd 28,46±1,6 32,11±nd

Hd-Zip 22,14±0,98 21,43±1,2 21,11±0,42 19,98±0,17 27,52±1,61 29,85±0,56 27,82±1,79 29,27±0,31

CHR4 28,22±2,88 25,57±0,85 24,46±0,44 24,67±0,8 33,24±3,27 32,87±0,64 30,35±2,01 33,9±1,55

ATPase 29,02±2,68 26,9±1,43 24,35±1,56 24,27±0,67 nd nd nd nd

Hsp70 24,81±0,37 24,25±0,8 22,46±0,67 22,97±1,06 nula nula 27,14±1,49 nula

eIF-3 25,34±1,05 24,93±1,46 22,52±1,02 23,08±0,92 nd nd nd nd

Pplase 27,35±1,82 27,31±1,04 25,47±1,06 26,09±0,64 36,28±1,27 35,93±2,35 30,7±0,31 32,3±1,33

DnaK 29,72±1,03 29,43±1,69 27,25±0,76 26,96±0,28 32,71±0,99 32,66±0,34 30,39±0,66 31,68±0,98

HK. h740 31,23±2,85 33,46±2,53 29,32±1,3 29,78±2,22 34,89±3,63 34,12±nd 31,33±1,54 35,8±nd

HK.rpl35_4 24,49±1,66 25,15±0,85 23,72±0,88 23,71±0,61 30,04±3,02 32,69±1,92 28,08±1,29 32,16±1,24

HK.Tic32 21,05±1,44 21,17±1,08 20,62±0,9 20,76±1,09 32,69±0,4 32,89±0,52 26,8±1,58 31,01±nd Nula - Não houve expressão gênica; Nd - Expressão gênica não determinada; As amostras foram organizadas em códigos sendo F – folha; R – raiz; I – irrigado; S – seco; T – variedade tolerante à seca e Se – variedade sensível.


54

Para verificar se houve a detecção de apenas um produto de PCR, as

amostras foram submetidas a realização da curva de melting ao final de cada reação

de PCR. Baseado nos resultados via RT-qPCR obtidos (Apêndices A e B) todos os

genes apresentaram alta especificidade dos produtos de amplificação, porém

presenças visíveis de dímeros de primers foram observadas nos genes Dgt, Pox e

DnaK. Apesar de terem sido observados dímeros nestes genes, estes em geral

apresentaram eficiência máxima da reação (Tabela 4).

5.6. Seleção do gene de referência, normalização e análise de RT-qPCR

Comparados os valores de M registrados para folha e raiz, foi possível

observar que uma maior variação foi encontrada para o primeiro (de 0,7 a 3,7) em

contraste com o segundo (1,4 a 1,6) (Figuras 16 e 17). Embora esta observação

tenha sido feita, o gene de referência utilizado para as análises de expressão em

folha (HK.rpl35_4) mostrou-se mais estável do que aquele utilizado em raiz

(HK.h740). O menor valor observado para o coeficiente de variação destes genes foi

igual a 4,58 e 7,88 para folha e raiz, respectivamente.

Figura 16 – Valores médios de estabilidade de expressão (M) dos genes selecionados como

possíveis genes de referência em folha para cana-de-açúcar (Saccharum spp.).


55

Figura 17 – Valores médios de estabilidade de expressão (M) dos genes selecionados como possíveis genes de referência em raiz para cana-de-açúcar (Saccharum spp.).

Após a normalização dos dados, a análise da expressão quantitativa relativa

revelou que 100% dos genes analisados (15) se expressaram em folha, enquanto

que, 92% (12) em raiz. Dos genes analisados nos dois órgãos, 66,6% deles

(Dhyn_98, ERD4, SIP, Dgt, MARK, Pox Hd-zip, Hsp70, PPlase e DnaK)

apresentaram expressão significativa (p≤0,05) de indução ou inibição por seca,

sendo representados em todas as categorias (conhecidos, desconhecidos, estresse

oxidativo, fator de transcrição e proteína de choque térmico).

Dos genes significativamente expressos em folha, seis (Dhyn_98, ERD4, Dgt,

MARK, Pox e PPlase) mostraram-se diferencial para a variedade tolerante

(RB92579) comparando-se os tratamentos de seca e irrigado, e dois genes

(Dhyn_98 e Dgt) foram diferentes para a variedade sensível (RB72454) (Figura 18).

Assim como no órgão foliar, nas mesmas condições descritas anteriormente, foi

possível também observar expressão significativamente diferencial de seis genes em

raiz. Apesar disso, nem todas as amostras e/ou tratamentos apresentaram

expressão. Dos seis genes expressos por seca em raiz, dois (ERD4 e Pox) se

expressaram apenas na variedade sensível sob o tratamento irrigado (RISe) (Figura

19). Nas condições experimentais deste trabalho, nove genes não se expressaram

significativamente em folha (Figura 20) e seis não se expressaram em raiz (Figura

21), contudo, o gene Unk_ptn não se expressou em nenhuma das amostras de raiz.


56

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

ERD4CA162094

0,0000

0,0020

0,0040

0,0060

0,0080

0,0100

0,0120

0,0140

0,0160

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct)

Amostra

DgtTC143667

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a(2

-ΔCt )

Amostra

Dhyn_98 (TC122998)

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

PoxTC134955

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

PplaseTC80513

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

MARK TC135383

Figura 18 – Genes diferencialmente expressos por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em folha via PCR em tempo real.


57

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

ERD4CA162094

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

DgtTC143667

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

DnaKTC98760

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

PoxTC134955

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

800,0

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

Hd-zipTC136491

Figura 19 – Genes diferencialmente expressos por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em raiz via PCR em tempo real.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

SIPTC121509


58

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

Unk_ptnCA086281

0,00

0,50

1,00

1,50

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-

ΔCt )

Amostra

RNA polCA073039

0,000,501,001,502,002,503,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

SIPTC121509

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

ATPaseTC130425

0,000,200,400,600,801,001,20

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

CHR4TC130358

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

Hd-zipTC136491

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

eIF-3 TC123494

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

DnaKTC98760

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

FIT FST FISe FSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

Hsp70TC136491

Figura 20 – Genes que não se expressaram significativamente por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em folha via PCR em tempo real.


59

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

RNA polCA073039

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

CHR4TC130358

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

Dhyn_98TC122998

0,005,00

10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,00

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

Hsp70TC136491

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

RIT RST RISe RSSe

Qu

an

tifi

cação

rela

tiv

a (

2-Δ

Ct )

Amostra

PplaseTC80513

Figura 21 – Genes que não se expressaram significativamente por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em raiz via PCR em tempo real.


60

O cálculo da razão entre a expressão dos genes sob tratamento seco e

irrigado em folha variou entre 1,65 a 9,38 para a variedade tolerante e 10,35 a 15,37

para a variedade sensível (Tabela 6).

Tabela 6 – Razão de expressão entre os tratamentos seca/irrigado dos genes significativamente expressos por seca via RT-qPCR e SAGE.

PCR em tempo real

Folha Raiz

Colmo

Genes Tolerante Sensível

Tolerante Sensível

SAGE*

Dhyn_98

9,38 15,37

- -

-3,85

ERD4

3,44 -

- nd

2,29

SIP

- -

- nd

2,83

Dgt

3,58 10,35

- 22,82

18,55

MARK

7,82 -

- -

5,71

Pox

3,40 -

- nd

5,71

Hd-Zip

- -

-15.81 8,12

-6,25

Hsp70

- -

- -

-6,25

PPlase

1,65 -

- -

12,55

DnaK - - - 8,90 5,91 Nota: Valores positivos indicam quantas vezes mais os genes foram induzidos por seca, enquanto, negativos demonstram

inibição por seca; *Os valores dos genes inibidos por seca em SAGE foram transformados em valores negativos através do cálculo 1/ratio.

Observando-se os valores de expressão obtidos para folha, percebe-se que o

gene da Dhyn_98 apresentou maiores níveis de indução por seca em folha nas duas

variedades em relação aos outros genes, sendo contrário ao resultado obtido em

SAGE (inibido). O gene que apresentou menor nível de indução (PPlase),

correspondente à variedade tolerante, foi quase oito vezes menos expresso sob

seca do que aquele apresentado em SAGE. No entanto, o gene Dgt foi quase três

vezes mais expresso por seca na variedade sensível do que na tolerante e quase o

dobro menos expresso do que em SAGE. Os genes ERD4, MARK e Pox, expressos

por seca somente na variedade tolerante, apresentaram níveis de expressão muito

similares aos obtidos em SAGE não chegando a duas vezes de diferença (Tabela 6).

Quando comparadas as variedades em raiz, os seis genes significativamente

expressos (SIP, ERD4, Pox, Dgt, DnaK e Hd-zip) tiveram sua maioria (quatro)

observada na variedade sensível. Os genes SIP, ERD4 e Pox apresentaram inibição

nesta mesma cultivar, porém não foi possível avaliar a razão de expressão entre os

tratamentos, devido à expressão nula durante o período seco (Tabela 6). No gene


61

Hd-zip, foi observada padrão de expressão contrária entre as variedades, visto que

na tolerante foi inibida por seca e na sensível foi induzida. A inibição desse gene

também foi observada em SAGE, porém na variedade tolerante essa inibição foi

quase o triplo quando comparado em SAGE (Tabela 6).

Fazendo uma correlação dos padrões de expressão dos genes em folha e

SAGE, seis genes (Dgt, DnaK, ERD4, MARK, Pox e Pplase) apresentaram

expressões similares de indução por seca enquanto que em raiz, dois genes (Dgt e

DnaK) apresentaram padrões similares de indução e dois (Hd-zip e Pox) de inibição

por seca. Já analisando os padrões de expressão entre variedades em folha, dois

genes (Dhyn_98 e Dgt) apresentaram expressões similares de indução por seca

sendo que para raiz, não houve expressão similar entre as mesmas. O gene Dgt foi

o único apresentar padrão de expressão similar entre as variedades e em SAGE,

porém essa expressão foi observada somente em folha. Em função das análises dos

genes significativamente expressos por seca, Dhyn_98 e MARK foram considerados

como os mais associados com a tolerância à seca por apresentarem maiores níveis

de indução observados na variedade tolerante (RB92579).


62

6. DISCUSSÃO

A partir das análises das bibliotecas SAGE de genótipos de cana-de-açúcar

contrastantes para teor de sacarose no colmo (Calsa Jr., 2006), várias tags tiveram

sua anotação presumível diretamente associada a genes de resposta à seca

enquanto que outras não apresentaram similaridade com sequências gênicas

conhecidas (no hit).

Diante dos resultados obtidos para o potencial hídrico foliar, observa-se que

de fato, as plantas encontravam-se sob estresse hídrico. Isso foi visualizado no

momento em que valores maiores para o potencial foram encontrados durante o

tratamento irrigado. Comparando-se os valores registrados para a umidade relativa

do solo nas variedades, foi possível confirmar também a condição de estresse sob

seca já observada anteriormente a partir do potencial hídrico. Durante os

tratamentos hídricos, as plantas apresentaram sinais visíveis de estresse tanto na

parte aérea como no sistema radicular. Estudos realizados com seca revelaram que

em situações onde o déficit hídrico torna-se muito intenso ou prolongado, as plantas

podem ter suas células murchas e sofrer encolhimento podendo levar a limitações

mecânicas na membrana celular. A tensão causada na membrana é um dos efeitos

severos da seca implicados em fisiologia de plantas. Isto em particular influencia o

funcionamento dos íons e transportadores bem como as enzimas associadas a

membrana (MAHAJAN e TUTEJA, 2005). De fato, o sistema radicular profundo é

fundamental para os mecanismos de adaptação a seca, pois aumenta a habilidade

da planta em capturar água (SHAO et al., 2008).

A tolerância a seca é uma característica complexa e envolve a ativação de

uma ampla variedade de respostas na planta, que vai desde a expressão alterada

de genes e o metabolismo celular até mudanças na taxa de crescimento e

produtividade da planta (SHAO et al., 2008). Considerando os 15 e 12 genes

submetidos à validação via RT-qPCR em folha e raiz, respectivamente, foram

observadas correlações variáveis nas variedades aqui analisadas (RB92579 e

RB72454) quando comparados aos resultados obtidos via SAGE (CALSA JR, 2006).

Obviamente, eram esperadas essas variações, uma vez que as variedades, épocas,

desenho experimental e órgãos utilizados no estudo via SAGE foram diferentes

daqueles analisados no presente estudo. Apesar das diferenças, alguns resultados

semelhantes entre os dois estudos (RT-qPCR e SAGE) foram obtidos, sendo


63

observadas correlações similares entre o padrão de expressão de alguns genes,

principalmente em folha para a variedade tolerante e em raiz para a variedade

sensível. Além disso, a partir dos resultados obtidos via RT-qPCR foi esperado que

variedades com menor ou maior tolerância mostrassem diferenças nos níveis de

expressão que possivelmente estivessem correlacionados com a tolerância ao déficit

hídrico. Baseado nos eventos de adaptação das plantas ao estresse ambiental, os

genes diferencialmente expressos Dhyn_98, ERD4, SIP, Dgt, MARK e Pox

estiveram dentro da categoria dos genes responsivos por seca.

A deidrina considerada uma das proteínas mais estudadas que se acumulam

em resposta a vários estresses abióticos nas plantas superiores fazem parte do

grupo 2 das proteínas LEA. Em geral, três motifs (Y, K e S) estão associados a

essas proteínas, sendo o motif K (rico em lisina) considerado a “sequência de

assinatura” que define esta família de proteínas. Durante o estresse, as deidrinas

desempenham funções de proteção via diversos mecanismos diferentes tais como

aumento ou proteção da atividade enzimática sob condições de frio ou seca,

eliminação de radicais livres, ou como estabilizadores de membrana (SAAVEDRA et

al., 2006; BASSETT et al., 2009).

Níveis altos de indução do gene Dhyn_98 associados à seca foram

confirmados em folha para as duas variedades (RB92579 e RB72454) no presente

estudo. Como esse gene apresentou maior indução por seca na variedade sensível,

é possível que nesta o gene esteja sendo mais expresso devido à ocorrência de

maiores danos ocasionado pelo déficit hídrico. Além disso, é também demonstrado

que algumas vias de sinalização em resposta a esse estresse podem ser

conservadas tanto em espécies sensíveis quanto em espécies tolerantes. Quando

observada a expressão em SAGE, esse gene foi inibido por seca, tendo sido

contrário a outras pesquisas realizadas com colmo de cana-de-açucar, utilizando

tratamentos de estresse hídrico (PAPINI-TERZI et al., 2009; ISKANDAR et al.,

2011). No entanto, é provável também que esse gene codifique uma isorforma da

deidrina e que seja induzido especificamente no órgão foliar da cana-de-açúcar.

Embora haja forte associação do gene Dhyn_98 com uma maior tolerância ao

estresse abiótico (particularmente desidratação e frio), ainda faltam evidências

genéticas mostrando o papel direto da proteína codificada por ele na tolerância à

seca em plantas. Segundo Saavedra et. al. (2006), a dificuldade em saber a função

exata se dá devido às diferentes respostas originadas de um órgão específico ou


64

tipo de célula durante as condições de estresse e pelo fato da deidrina ser codificada

por múltiplos genes com possíveis funções sobrepostas.

Os genes ERD4, MARK, Pox e Pplase que apresentaram indução por seca

em folha somente na variedade tolerante, são considerados fortes candidatos a

atuar na tolerância à seca. O gene ERD4 é caracterizado por codificar uma proteína

integral de membrana do cloroplasto, porém a análise funcional correspondente ao

gene ainda é desconhecida. Em estudos realizados, esse gene apresentou o

envolvimento em mecanismos moleculares de resposta ao estresse hídrico e ao

estresse salino (HUANG et al., 2008; LIU et al., 2009). O gene Dgt, potencialmente

envolvido na lignificação e respostas de defesa (DAMAJ et al., 2010), apresentou o

maior nível de expressão em relação aos outros genes tanto em raiz como em colmo

(CALSA JR, 2006) sendo também observados dados similares em outro estudo

utilizando colmo (DAMAJ et al., 2010). Como houve maior indução desse gene na

variedade sensível, é provável também que o maior acúmulo desses transcritos no

genótipo sensível esteja diretamente relacionado a um maior efeito danoso

provocado pela seca visto que no genótipo tolerante, esse efeito pode ter sido

relativamente menor.

O gene Pox, representante de uma ampla família da Classe III das

peroxidades específicas de planta, apresentou nível de indução em folha, no

presente estudo, muito similar ao obtido em SAGE. Pesquisas têm evidenciado que

essas enzimas peroxidases têm participação em diversos processos fisiológicos, tais

como lignificação, suberização, catabolismo de auxinas, defesas contra infecção de

patógenos e tolerância à salinidade (HIRAGA et al., 2001). Já que a maioria dos

genes que são expressos sob estresse salino, são também expressos por seca,

existe uma grande possibilidade do gene Pox ter uma atuação na tolerância à seca,

uma vez que no atual estudo a expressão foi observada somente na variedade

tolerante. Além disso, quando esse é inibido em raiz, é possível que tenha uma ação

contrária ao que foi observada em folha, isto é, atue na diminuição da tolerância à

seca.

O gene MARK codifica um tipo de receptor kinase específico de planta (RLK).

Vários estudos têm sugerido que os mecanismos de ativação das RLKs são

similares aos observados em animais (RTKs), porém são independentes de

fosforilação. Eles possuem um domínio extracelular e o outro no citoplasma


65

contendo o domínio kinase conservado. Esses RLK interagem com as MAPK

desencadeando sua cascata (CASTELLS e CASACUBERTA, 2007). As MAPK por

sua vez, ativam os fatores de transcrição que são responsáveis por regular os genes

de resposta a seca (BARTELS e SUNKAR, 2005).

No cenário dos genes associados à regulação de genes de resposta ao

estresse hídrico, Hd-zip, Hsp70, Pplase e DnaK foram incluídos nessa categoria e

apresentaram expressão diferencial por seca. Os genes Hd-zip representados como

fatores de transcrição, são únicos de planta. Proteínas oriundas desses genes são

caracterizadas por apresentar dois domínios funcionais, um que interage na

molécula de DNA e o outro que interage com outras proteínas. Apesar das suas

sequências apresentarem similaridades entre si dentro desse grupo de proteínas,

estas participam de variados processos durante o crescimento e desenvolvimento da

planta tais como respostas relacionadas a estresse abiótico, ABA, luz azul,

desestiolamento e embriogênese (ELHITI e STASOLLA, 2009). Nas análises de RT-

qPCR, esse gene foi inibido por seca na variedade tolerante (resultados similares em

SAGE) e induzido na variedade sensível, sendo expresso somente em raiz. Por ser

um fator de transcrição, é possível que sua indução esteja associada a ativação de

genes que tenham ações contrárias para a tolerância à seca. Este resultado

levantou também a hipótese sobre a existência de genes codificando isoformas de

proteínas pertencentes à mesma família de modo que quando induzidos, sejam

responsáveis por promover a tolerância à seca na cana-de-açúcar. Em estudo

realizado com alguns grupos dessa família, foram observadas induções por ABA e

por estresse hídrico (SON et al., 2010).

As proteínas Hsp70, originalmente identificada como a mais abundante

produzida por estresse em resposta a temperaturas elevadas são conhecidas

também serem induzidas sob várias formas de estresse celular e essencial para o

crescimento normal da planta. Elas funcionam como chaperonas moleculares

protegendo as proteínas contra a agregação durante os seus estados inativos.

Entretanto, no atual estudo, esse gene não foi diferencialmente expresso por seca

em nenhuma das variedades, sugerindo a codificação de uma isoforma que não está

associada ao déficit hídrico. O gene DnaK, representante da mesma família das

Hsp70, porém inserido na subfamília de DnaK, ao contrário da Hsp70, foi induzido

por seca mas somente na variedade sensível e em raiz. Este gene codifica uma

proteína com atividades protetoras conferindo tolerância ao calor, à escassez de


66

glicose e à seca (SUNG e GUY, 2003). É interessante observar que não só o gene

DnaK, mas também outros genes descritos anteriormente (Dgt, Dhyn_98), foram

mais expressos na variedade sensível possivelmente devido aos maiores danos

provocados pelo déficit hídrico. No entanto, a sensibilidade ao estresse observada

em cana-de-açúcar pode ser decorrente da ausência de genes que codificam

proteínas-chave envolvidas tanto na transdução de sinais moleculares, quanto na

ação direta de algumas proteínas na proteção contra injúrias especificamente

causadas por esse tipo de estresse.

O gene Pplase, apesar de ser categorizado como Hsp a partir da anotação

SAGE, este está dentro do grupo das imunofilinas. Esse gene codifica uma enzima

que realiza a isomeração na cadeia polipeptídica de outras proteínas ao redor dos

resíduos de prolina. O papel fisiológico dessa proteína ainda é desconhecido

(EDVARDSSON et al., 2007), porém no atual contexto, esse gene esteve associado

à tolerância a seca visto que foi diferencialmente expresso (induzido) somente na

variedade tolerante. Em função das análises dos genes de resposta à seca, foi

proposto um modelo esquemático adaptado de Wang et. al. (2003) para tentar

explicar os caminhos funcionais dos genes que estiveram mais associados com a

tolerância à seca em folha para as variedades tolerante e sensível (Figura 22). A

expressão induzida do gene MARK durante o período de déficit hídrico no genótipo

tolerante pode ter influenciado a ativação da MAPK, e consequentemente,

desencadeada a cascata MAPK bem como a ativação dos fatores de transcrição

importantes para a ativação dos genes de tolerância seca (Dhyn_98, Dgt, Pplase,

ERD4 e Pox). Futuras análises experimentais fornecerão informações adicionais

sobre as funções desses genes e sua real importância para o processo de tolerância

da cana-de-açúcar à seca.

A análise de genes de resposta à seca tem sido conduzida em diversas

culturas e vários genes e proteínas envolvidos com a resposta à seca, bem como

genes sem nenhuma homologia descrita, já foram identificados. Por exemplo, em

estudos realizados com variedades de arroz contrastantes à seca foi possível

observar genes expressos exclusivamente na variedade tolerante sendo em geral,

relacionados com a manutenção do turgor e integridade celular; em contrapartida, na

variedade sensível foi observada que a expressão de genes envolvidos na proteção

contra possíveis danos à célula, não foi significativa (RABELLO et al., 2008).


67

Figura 22 - Modelo molecular e fisiológico representativo (adaptado de WANG et al., 2003) dos mecanismos de resposta ao déficit hídrico para os genes que apresentaram diferenças significativas na expressão em folha. O tamanho das setas é proporcional ao nível de indução do gene por seca na variedade tolerante (verde) e sensível (vermelha). Os números sobrescritos indicam as participações desses genes nos tipos de mecanismos de resposta à seca.


68

Segundo Sinclair (2004) existem duas abordagens para aumentar o potencial

de rendimento das culturas: (i) aumentar a capacidade global da fisiologia de plantas

para produzir o rendimento da colheita, e (ii) atenuar as consequências negativas de

estresses abióticos nas plantas, de modo a aumentar o rendimento.

O perfil de expressão diferencial em resposta aos tratamentos seco e irrigado

indica que a cana-de-açúcar possui distintos mecanismos de sinalização em

resposta ao estresse por seca entre as variedades e entre os órgãos analisados.

Além disso, foi possível identificar induções, bem como uma inibição, específicos da

variedade tolerante e ainda validar a correlação da expressão de alguns dados

SAGE via RT-qPCR. De fato, este trabalho abre novas possibilidades para a

elucidação dos mecanismos envolvidos na resposta ao estresse por seca, não

somente de cana-de-açúcar, mas também de outras espécies vegetais. A partir das

análises de expressão, os genes MARK e Dhyn_98 foram escolhidos como os mais

promissores em promover tolerância a seca em cana-de-açúcar. Assim, espera-se,

que possívelmente esses genes possam ser sequenciados e utilizados nos

programas de melhoramento das principais culturas de planta.


69

7. CONCLUSÕES

A correlação da expressão em SAGE dos genes Dgt, DnaK, ERD4, MARK,

Pox, Pplase, Hd-zip e Hsp70 foi validada via RT-PCR nos genótipos

RB92579 e/ou RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.);

Espera-se que os genes Dhyn_98 e MARK possam ser úteis como

marcadores funcionais para seleção de genótipos de cana-de-açúcar mais

tolerantes à deficiência hídrica, bem como também úteis nos programas de

melhoramento desta cultura e em estratégias de transformação genética;

Segundo o modelo molecular e fisiológico de resposta ao déficit hídrico

sugerido para os genes diferencialmente expressos por seca em folha, o gene

MARK pode ter um papel importante para a ativação de vários genes de

tolerância à seca na variedade RB92579.


70

8. REFERÊNCIAS

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79

9. APÊNDICES

Curva de quantificação (NF) Curva de melting

Dhyn_98

ERD4

SIP

Unk_ptn

Dgt

Apêndice A - Gráficos de amplificação e curva de melting dos genes analisados via RT-qPCR em órgão foliar.


80


MARK

Pox

RNApol

Hd-Zip

CHR4

Apêndice A (cont.) - Gráficos de amplificação e curva de melting dos genes analisados via RT-qPCR em órgão foliar.


81


ATPase

Hsp70

eIF-3

Pplase

DnaK



82


HK. h740

HK.rpl35-4

HK.Tic32



83


Dhyn_98

ERD4

SIP

Unk_ptn

Dgt

Apêndice B - Gráficos de amplificação e curva de melting dos genes analisados via RT-qPCR em órgão radicular.


84


Pox

RNApol

Hd-Zip

CHR4

Hsp70

Apêndice B (cont.) - Gráficos de amplificação e curva de melting dos genes analisados via RT-qPCR em raízes.


85


Pplase

DnaK

HK. h740

HK.rpl35-4

HK.Tic32

Apêndice B (cont.) - Gráficos de amplificação e curva de melting dos genes analisados via RT-qPCR em órgão radicular


86

Eficiência da Reação

ERD4 CHR4

HK.rpl35_4 Dhyn_98

Pox Hsp70

Hd-Zip PPlase

Apêndice C - Eficiências de amplificação e R

2 correspondentes para os pares de primers utilizados

em RT-qPCR.


87

Eficiência da reação

Dgt ATPase

RNApol SIP eIF-3 HK.Tic32

Apêndice C (cont.) - Eficiências de amplificação e R2 correspondentes para os pares de primers

utilizados em RT-qPCR


88

10. MEMORIAL

Graduado em Ciências Biológicas/Bacharelado pela Universidade Federal de

Pernambuco em 2008, é mestrando do Programa de Pós-Graduação em Genética

na mesma Universidade Genética Molecular Vegetal, desenvolvendo o projeto

EXPRESSÃO GÊNICA DA RESPOSTA À SECA EM CANA-DE-AÇÚCAR

(Saccharum spp.). As experiências durante o Mestrado contribuíram para aprimorar

os conhecimentos teórico-práticos dentro das pesquisas científicas. Além disso, os

contatos com excelentes professores, participações em congressos e cursos

realizados, resultaram em incentivos de aprofundar mais e mais os conhecimentos à

luz da ciência.


89

11. ANEXOS

11.1. Atividades complementares

No que concerne à aquisição de créditos requerida pelo Programa de Pós-

Graduação em Genética da UFPE, o número mínimo exigido (24 créditos) foi obtido

com êxito. Com a finalidade de aprendizagem e atualização na área de

desenvolvimento do projeto, foram realizadas no ano de 2010, participações em

diversos eventos: Potencial Biotecnológico da Caatinga (Recife, 26 e 27 de abril), II

Seminário Biodiesel (Recife, 3 e 4 de maio), Reunião do Consórcio GenoSoja

(Recife, 27 de maio), V Reunião Regional FeSBE 2010 (Aracaju, 27 a 29 de maio) e

na 3ª Reunião Nordestina de Botânica (Aracaju, 30 de junho a 3de julho). Foi

realizada também a participação no 56º Congresso Brasileiro de Genética no qual

aconteceu de 14 a 17 de setembro, na cidade do Guarujá-SP.

Ao total, quatro trabalhos (resumos) científicos foram apresentados como

autor principal: (1) “Identificação e caracterização in silico de sequências transcritas

de feijão-caupi (Vigna unguiculata) associadas a inibidores de protease/proteinase

(IPP)” na V Reunião Regional FeSBE 2010, onde foi recebido o prêmio (certificado)

de Menção Honrosa por melhor apresentação; (2) “Avaliação da brotação de quatro

variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) em terra vegetal composta” e (3)

“Análise comparativa da brotação de quatro variedades de cana-de-açúcar

cultivadas em substrato arenoso”, ambos apresentados na 3ª Reunião Nordestina de

Botânica e (4) “Análise transcricional in silico de cana-de-açúcar para a identificação

de genes de resposta à seca” no 56º Congresso Brasileiro de Genética. Além

destes, a participação como co-autor foi desenvolvida no resumo “Gas exchanges in

sugarcane genotypes under salinity stress’ o qual foi apresentado durante o 2nd Pan

American Congress on Plants and Bioenergy.

Durante o período de realização dos eventos acima, três participações em

cursos foram feitas: (1) “Como Redigir um Artigo Científico, um Projeto de Pesquisa

e Aspectos de Autoria (V Reunião Regional FeSBE 2010), (2) “Biotecnologia” (3ª

Reunião Nordestina de Botânica) e (3) “MicroRNAs e câncer: atualizações” (56º

Congresso Brasileiro de Genética).


90

11.2. Resumos publicados em anais de congressos durante o desenvolvimento

do mestrado

1. Marcelo Oliva Sanatana ; Cinthya Mirella Pacheco ; Luciana Oliveira Oliva ; Maria

Clara Pestana-Calsa ; Rejane Jurema Mansur Custódio Nogueira ; Tercilio Calsa

Junior . Avaliação da brotação de quatro variedades de cana-de-açúcar em terra

vegetal composta. In: XXXIII Reunião Nordestina de Botânica, 2010, Aracaju.

2. Marcelo Oliva Sanatana ; Cinthya Mirella Pacheco ; David Barbosa Medeiros ;

Luciana Oliveira Oliva ; Maria Clara Pestana-Calsa ; Rejane Jurema Mansur

Custódio Nogueira ; Tercilio Calsa Junior . Análise comparativa da brotação de

quatro variedades de cana-de-açúcar cultivadas em substrato arenoso. In: XXXIII

Reunião Nordestina de Botânica, 2010.

3. SANTANA, M. O. ; RÔXO, J. S. P. ; PESTANA-CALSA, M.C. ; CALSA JR, T. .

Identificação e caracterização in silico de sequências transcritas de feijão-caupi

(Vigna unguiculata) associadas a inibidores de protease/proteinase (IPP).. In: V

Reunião Regional FeSBE 2010, 2010, Aracaju, SE..

4. SANTANA, M. O. ; PESTANA-CALSA, M.C. ; CASTRO, RC ; MANSO, TC ;

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