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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM HETEROZIGOSE PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE DO RECEPTOR DO HORMÔNIO LIBERADOR DO GH ARACAJU 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA
EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM HETEROZIGOSE
PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE DO RECEPTOR DO
HORMÔNIO LIBERADOR DO GH
ARACAJU
2014
ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA
EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM
HETEROZIGOSE PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE
DO RECEPTOR DO HORMÔNIO LIBERADOR DO GH
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade Federal de
Sergipe, como requisito parcial à obtenção do grau
de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar-Oliveira
ARACAJU
2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
P436e
Pereira, Rossana Maria Cahino Efeito da idade no fenótipo em heterozigose para mutação nula
no gene do receptor do hormônio liberador do GH / Rossana Maria Cahino Pereira; orientador Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira. – Aracaju, 2014.
000 f. : il.
Tese (Doutorado em Ciências da Saúde - Núcleo de Pós-Graduação em Medicina), Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2014.
1. Nanismo hipofisário. 2. Glândula pituitária - Doenças. 3. Mutação (Biologia). 4. Fenótipo. 5. Endocrinologia. I. Oliveira, Manuel Hermínio de Aguiar, orient. II. Título.
CDU 616.432
ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA
EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM
HETEROZIGOSE PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE
DO RECEPTOR DO HORMÔNIO LIBERADOR DO GH
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade Federal de
Sergipe, como requisito parcial à obtenção do grau
de Doutor em Ciências da Saúde.
APROVADA EM: ______ / ______ / _______
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________________________
Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio Aguiar-Oliveira
_________________________________________________________________________
1º Examinador: Prof. Dr. Marco Antônio Prado Nunes
_________________________________________________________________________
2º Examinador: Prof. Dr. Joselina Luzia Menezes Oliveira
________________________________________________________________________
3º Examinador: Prof. Dr. Francisco de Assis Pereira
______________________________________________________________________
4ª Examinador: Prof. Dr. Carla Raquel Oliveira Simões
PARECER
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a DEUS e a TODA a ESPIRITUALIDADE que me
acompanha em todos os momentos de minha vida, pois sei que NUNCA ESTOU SÓ!
Aos meus pais de sangue Mário e Edna (sempre presentes), e meus pais do coração
Eustáquio (sempre presente) e Naniza, pois tive o privilégio de ter dois pais amorosos e duas
mães generosas exemplos a serem seguidos.
Aos meus irmãos: Thiago, Sandra, Antônio Henrique, Ana Cristina, Simone e Naná
obrigado por tudo!
Aos Cunhados um abraço pelo apoio e incentivo.
Aos meus pequenos sobrinhos: Júlia, Natália, Davi, Antônio Manuel, Sofia e
Leonardo um beijo muito especial.
Aos meus amigos, que estão sempre me apoiando e incentivando e sei que muito
torceram para que este momento chegasse.
Ao meu querido amigo Júnior Costa que está sempre disponível, apoiando e torcendo
em todos os momentos, bem como todos que fazem parte da nossa Casa Espiritual.
Aos colegas do Doutorado desejo que todos concluam sua caminhada.
A equipe da “Pesquisa do Prof. Hermínio” todo meu carinho, pois cada participante é
uma peça importante e todos juntos temos uma força que conseguimos romper barreiras e
seguir em frente.
Aos nossos “amigos e também pacientes” de Itabaianinha muito obrigada pela
presteza que sempre atendem ao chamado da ciência colaborando com todas as nossas
pesquisas mostrando que a confiança é recíproca.
Universidade Federal de Sergipe, ao Núcleo de Pós Graduação em Medicina, aos
Professores e amigos que lá fiz.
As instituições de apoio, todas elas incentivadoras da ciência. Meu agradecimento
especial a FAPITEC- Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de
Sergipe, onde por um tempo fui bolsista durante o doutorado.
Aos professsores que participaram de minha qualificação, Drª Joselina, Dr Francisco e
Drª Carla Raquel.
Ao Dr Evandro Portes agradeço pela disponibilidade e também as oportunas sugestões
que contribuiram para melhorar nosso trabalho.
Ao Dr Marco Prado Nunes pela presteza em aceitar em participar de minha Banca de
Doutorado quando houve a necessidade de substituição do Dr Evandro Portes. Meu muito
obrigada, pois sem a sua presença não seria possível a realização de minha Defesa.
Meu agradecimento especial vai para o Meu Orientador, o prof. Dr Manuel Hermínio,
que para mim foi mais que um orientador, ele foi irmão, amigo, companheiro nesta jornada,
que teve altos e baixos durante estes quatro anos. Sempre me incentivou mesmo quando eu
estava totalmente sem estímulo e forças para seguir em frente. Sempre tinha uma palavra,
algo que me acalmava e me fazia repensar tudo e assim seguir em frente. Se estou aqui neste
momento devo muito ao Meu Mestre e Amigo. Ele sempre me inspira, sempre generoso,
sempre atencioso, sempre positivo.
"Trago no coração alguns medos,
Uns quietos segredos,
Um tanto de dor...
Mas tanto de amor,
Que se cala que abraça...
Que delicadamente enlaça
Cada esperança, cada sonho, cada sentimento.
Que por todo momento me aninha...
Enquanto o tempo caminha...”
Cláudia Salles
INSTITUIÇÕES DE APOIO:
UFS- Universidade Federal de Sergipe
JHSM- Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore – USA
NIH- National Institute of Health
CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
FAPITEC- Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de
Sergipe
ASCRIN- Associação do Crescimento Físico e Humano de Itabaianinha
RESUMO
Pereira, R.M.C. Efeito da idade no fenótipo em heterozigose para mutação nula no gene do receptor do
hormônio liberador do GH. Tese de Doutorado em Ciências da Saúde. Núcleo de Pós-Graduação em
Medicina. Universidade Federal de Sergipe. Aracaju-Sergipe, 2013.
Várias doenças recessivas cursam com fenótipo em heterozigose. Em Itabaianinha, Sergipe,
reside uma grande coorte com a mutação homozigótica c.57 +1 G>A no gene do receptor do
GHRH (GHRHR) cursando com baixa estatura acentuada. Estudo prévio mostrou que os
indivíduos heterozigotos adultos (MUT/N) para esta mutação apresentam altura, fator de
crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I) e percentual de massa gorda similares, mas
redução de peso, do índice de massa corpórea (IMC) e da massa muscular (MM). Contudo
apenas 10% destes tinham mais de 60 anos. Redução moderada na atividade do eixo GH-IGF-
I pode ter um impacto maior no período de envelhecimento, quando a atividade deste eixo
naturalmente diminui. Questionamos se a heterozigose para a referida mutação traduziria em
um fenótipo parcial nos indivíduos idosos dessa coorte. Realizamos um estudo transversal em
843 indivíduos divididos em dois grupos (jovens, 20-40anos de idade, e idosos, 60-80 anos
de idade) de indivíduos heterozigotos (MUT/N) e controles normais (N/N). A altura (cm),
peso (Kg), pressão arterial diastólica e sistólica (PAD e PAS mmHg) e o IMC (Kg/m2) foram
analizados. Os dados foram expressos em média, desvio padrão e escore desvio padrão
(EDP). O EDP do peso foi menor [0,13 (1,40) e -0,56 (1,80), p=0,03], e IMC apresentou uma
tendência de redução [0,08 (1,40) e 0,33 (1,40), p=0,060] no grupo MUT/N jovem em
comparação N/N jovem. O EDP da altura foi menor nos indivíduos MUT/N idosos em
comparação aos N/N idosos [-2,79 (1,10) e -2,37(1,00), p=0,04], correspondendo a uma
redução de 4,16 cm. Estes achados reforçam os dados anteriores de redução no peso e IMC
em adultos jovens MUT/N e mostram redução na estatura em indivíduos idosos, sugerindo
efeitos diferentes da heterozigose nos diferentes grupos etários. A redução da massa muscular
já presente em adultos jovens, agravada pelo envelhecimento, pode contribuir para esta
redução estatural. A mutação heterozigótica pode ser um fator contribuinte para fragilidade no
idoso.
Descritores: Receptor do GHRH; mutação; heterozigose; fenótipo.
ABSTRACT
Pereira, R.M.C. Effect of age on phenotype in heterozygous null mutation on in receptor gene in GH
hormone releasing receptor gene. Doctoral thesis in Health Sciences, Nucleus of post graduation in
Medicine. Federal University of Sergipe. Aracaju-Sergipe, 2013.
Several recessive diseases present heterozygous phenotype. In Itabaianinha, Brazil, there is a
big cohort with the homozygous mutation c.57 +1 G> A in the GHRH receptor (GHRHR)
gene, leading to severe short stature. Previous study shows that heterozygous individuals
(MUT/N) exhibit similar height, insulin like growth factor type 1 (IGF - I) and percentage of
fat mass, but reduced weight, body mass index (BMI) and muscle mass. However, only 10 %
of these were 60 or more years old. Moderate reduction in the GH/ IGF-I axis activity may
have a greater impact on the aging period, when the activity of this axis naturally decreases. We question whether the study of heterozygosity for the mutation would result in a partial
phenotype in the elderly cohort individuals. 843 individuals were analyzed in a cross sectional
study by height, weight, systolic and diastolic blood pressure and BMI in two groups (young,
20-40 years of age) and old (60-80 years) of MUT/N individuals, and compared to a large
number of individuals of normal genotype (N/N). SDS weight was lower [-0.13 (1.4) and -
0.56 (1.8), p=0.03], and BMI had a trend toward reduction [0.08 (1.40) and 0.33 (1.4),
p=0.060] in young MUT/N in comparison to young N/N. SDS height was lower in older
MUT/N individual vs. N/N [-2.79 (1.1) and -2.37(1.0), p=0.04], corresponding to a reduction
of 4.16 cm. We conclude the previous data reduction in weight and BMI in young and show
reduced stature in older MUT/N subjects, suggesting different effects of heterozygosis
through the ages. The reduction of muscle mass already present at young age, aggravated by
aging may contribute to this reduction in height. Heterozygous GHRHR mutations may be a
factor contributing to frailty in elderly.
Key words: GHRH receptor, mutation, heterozygosis, phenotype.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema da regulação intrínseca do eixo GH-IGF-I........................................ 19
Figura 2. Mutação homozigótica no sítio de “splicing” do íntron 1 no gene do receptor
do hormônio liberador do hormônio do crescimento, ocorrendo troca de bases,
Guanina (G) por Adenina (A) c.57+1G>A, WT (indivíduo normal – N/N), MUT
(indivíduo mutado – MUT/MUT)......................................................................................
21
Figura 3. Mapa da Região de Itabaianinha, Sergipe, Brasil............................................. 30
Figura 4. Equipe de alunos coletando dados..................................................................... 33
Figura 5. Apoio armado na Praça da Igreja Matriz para coleta de dados......................... 33
Figura 6. Professor Dr Manuel Hermínio solicitando a adesão da população durante a
missa católica na Igreja Matriz da Imaculada Conceição de Itabaianinha........................
34
Figura 7. Esquema representativo das bandas após DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis) em indivíduos de Itabaianinha-SE. Indivíduos Homozigóticos normais
(N/N) apresentaram uma única banda, indivíduos Homozigóticos afetados (MUT/MUT),
uma única banda mais lenta e os Heterozigóticos (MUT/N), quatro bandas, a do alelo
normal e a do alelo mutante e duas bandas mais lentas que representam heterodímeros
gerados pelo anelamento das fitas anterior e posterior dos alelos de G (Guanina) e A
(Adenina) durante amplificação do PCR.............................................................................
36
Figura 8. Representação gráfica da altura (cm), EDP da altura, peso (Kg) e EDP do
peso nos indivíduos jovens (A) e idosos (B).......................................................................
42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Indicadores de Consumo de Álcool................................................................. 37
Tabela 2. Valores absolutos e escore desvio padrão (EDP) da altura, peso, índice de
massa corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão
arterial diastólica (PAD) média (Desvio padrão) por genótipo no grupo jovem (20 – 40
anos)...............................................................................................................................
38
Tabela 3. Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e
diabetes por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos)...................................................
39
Tabela 4. Valores absolutos e Escore desvio padrão (EDP) da Altura, Peso, Índice de
Massa Corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão
arterial diastólica (PAD) média (Desvio padrão) por genótipo no grupo idoso (60 – 80
anos)..................................................................................................................................
40
Tabela 5. Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e
diabetes por genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos)......................................................
41
ABREVIATURAS
A Adenina
DGH Deficiência do Hormônio do Crescimento
DIGH Deficiência Isolada do Hormônio do Crescimento
DMO Densidade Mineral Óssea
DMOv Densidade Mineral Óssea Volumétrica
G Guanina
GH Hormônio do Crescimento
GH/IGF-I Eixo do Hormônio do Crescimento/Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 1
GHRH Hormônio Liberador do GH
GHRHR Receptor do Hormônio Liberador do GH
GHRHR Gene do Receptor do Hormônio Liberador do GH
HDL Lipoproteína de alto peso molecular
HOMAIR Modelo Homeostático do Índice de Resistência a Insulina
IGFBPs Proteínas Carreadoras de IGF
IGF-I Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 1
IGF-II Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 2
IGF-IR Receptor de IGF-I
IGFs Fatores de Crescimento Semelhantes à Insulina
IMC Índice de Massa Corpórea
LDL Lipoproteína de Baixo Peso Molecular
MG Massa Gorda
% MG Percentagem de Massa Gorda
MM Massa Muscular
MUT/MUT Indivíduos Homozigóticos Afetados
MUT/N Indivíduos Heterozigóticos
N/N Indivíduos Homozigóticos Normais
PAD Pressão Arterial Diastólica
PAS Pressão Arterial Sistólica
LISTA DE SÍMBOLOS
< menor do que
> maior do que
menor ou igual do que
maior ou igual do que
% porcentagem
micro
beta
cm centímetro
m metro
m2 metro quadrado
mg/dL miligrama/decilitro
mg/L miligrama/litro
mm milímetro
mmHg milímetro de Mercúrio
ng/mL nanograma/mililitro
p probabilidade de significância
Kg quilograma
Kg/m2 quilograma/metro quadrado
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 15
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................... 18
2.1. Hormônio de crescimento (GH)........................................................................................ 18
2.2 Deficiência de GH.......................................................................................................... 19
2.3 Aspectos fenotípicos da mutação homozigótica no gene do GHRHR................................. 21
2.4 Relação entre GH, perfil ósseo, envelhecimento e longevidade......................................... 22
2.5 Fenótipo dos indivíduos heterozigotos............................................................................. 24
2.6 Envelhecimento e mudanças posturais no idoso.........................…..........………………….. 25
2.7 Justificativa................................................................................................................. 28
3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 29
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS..................................................................................... 30
4.1 População do estudo...................................................................................................... 30
4.2 Critérios de inclusão...................................................................................................... 30
4.3 Tipo de estudo............................................................................................................... 31
4.4 Métodos ....................................................................................................................... 31
4.5 Análise Estatística....................................................................................................... 37
5 RESULTADOS............................................................................................................ 38
6 DISCUSSÃO................................................................................................................ 44
7 CONCLUSÕES............................................................................................................ 48
REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 49
ANEXO 1 Ofício ao TRE de Itabaianinha........................................................................... 57
ANEXO 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)......................................... 58
ANEXO 3 Entrevista ....................................................................................................... 66
ANEXO 4 Parecer do CEP e CONEP.................................................................................. 67
APÊNDICE 1 Artigo “Longevity in Untreated Congenital Growth Hormone
Deficiency Due to a Homozygous Mutation in the GHRH Receptor Gene” ...................
69
APÊNDICE 2 Artigo “Old heterozygous individuals for a null GH releasing
hormone receptor mutation loose more height that normal homozygous. Contribution
to frailt? ............................................................................................................................
77
APÊNDICE 3 Artigo “The consequences of growth hormone-releasing hormone
receptor haploinsufficiency for bone quality and insulin resistance ................................
91
APÊNDICE 4 Artigo “Lifetime congenital isolated GH deficiency does not protect
from the development of diabetes” ..................................................................................
97
15
1 INTRODUÇÃO
Por sua facilidade de medição a altura é um dos fenótipos mais estudados na infância
pelo retardo ou avanço estatural; na idade adulta pela estatura final de indivíduos ou grupos
populacionais; na senescência e pela redução estatural do envelhecimento. A definição da
altura em todas as idades guarda um sincronismo com a atividade do eixo do hormônio do
crescimento (GH)/Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I), com ativação na
infância, pico no final da adolescência, e subsequente redução progressiva da atividade
durante a vida adulta (JULL, et al., 1994). No envelhecimento, a altura diminui devido ao
achatamento dos discos e dos corpos vertebrais e a acentuação da curvatura sagital da coluna
vertebral associados à redução da densidade mineral óssea (DMO), e da quantidade da massa
muscular (MM) do idoso (LÉGER, 1994). Em homens e mulheres entre 60 e 80 anos, a taxa
média de diminuição da estatura é de cerca de dois centímetros por década, podendo atingir
até 12 cm nos casos mais extremos de perda óssea total (GUCCIONE, 2002).
Muitas regiões genômicas têm sido associadas à variação na altura, mas poucos dados
foram confirmados em estudos populacionais (GUDBJARTSSON et al., 2008; LETTRE et
al., 2008; LIU et al., 2008; WEEDON et al., 2008). Variações haplotípicas no gene do
receptor do hormônio liberador do GH (GHRHR) constituem um fator importante para a
variação da altura em populações normais. Recentemente foi demonstrado redução na altura
de até 3,8 cm, em dois grupos populacionais independentes na Escandinávia (JOHANSSON
et al., 2009).
Mutações homozigóticas no GHRHR são importantes causas genéticas de baixa
estatura (MARTARI & SALVATORI, 2009), sendo a mutação homozigótica c.57+1G>A no
GHRHR que acomete cerca de 100 indivíduos na região de Itabaianinha, no nordeste do
Brasil, a mais prevalente (SALVATORI, et al., 1999). Além da baixa estatura acentuada,
quando adultos, os indivíduos homozigóticos afetados (MUT/MUT) apesentam aumento do
percentual de gordura de predomínio central, com redução acentuada da MM (OLIVEIRA et
al., 2010), porém com DMO volumétrica (DMOv) corrigida para o tamanho corporal, normal,
em indivíduos abaixo (EPITÁCIO-PEREIRA. et al., 2013) e acima de 60 anos de idade
(SOUZA, et al., 2013). Também o número de fraturas vertebrais por indivíduo acima de 60
anos foi menor nos indivíduos MUT/MUT que nos indivíduos normais, indicando um
fenótipo ósseo benéfico nos indivídiuos MUT/MUT (SOUZA, et al., 2013), adaptado ao
reduzido tamanho dos ossos e ao esforço muscular que desempenham, de acordo com a teoria
do mecanostato (SCHOENAU, 2007).
16
Devido a existência de um grande número de indivíduos heterozigóticos (MUT/N) é
relevante verificar se a falta de um alelo funcionante do GHRHR causa redução na altura,. Um
trabalho anterior abordou esta questão em familiares paquistaneses dos “Anões do Sindh”,
MUT/MUT para a mutação c.214 G>T no exon 3 do GHRHR. Neste trabalho foram
examinados 22 indivíduos MUT/N e cinco homozigóticos normais (N/N) e não foi encontrado
diferença na altura entre os dois grupos, sendo o escore de desvio padrão (EDP) da altura dos
adultos maior que o das crianças e adolescentes (MAHESHAWARI, et al., 1998), sugerindo
que a haploinsuficiência para o GHRHR pode causar atraso no crescimento ao invés de baixa
estatura na idade adulta.
A possível explicação para esse achado pode advir do efeito compensatório provocado
pela ativação tardia do eixo GH/IGF-I, aliado a um possível aumento do tempo de
crescimento, haja vista que indivíduos adultos MUT/N para a mutação c.57+1G>A no
GHRHR não apresentam redução significativa na altura, nem do nível sérico de IGF-I
(HAYASHIDA, et al., 2000; PEREIRA, et al., 2007). Neste último trabalho estudamos 76
indivíduos MUT/N entre 25 e 75 anos de idade para esta mutação e comparamos com 77
indivíduos N/N da mesma população. O modelo homeostático do índice de resistência à
insulina (HOMAIR) do grupo MUT/N foi menor em relação ao N/N.
O peso, o índice de massa corpórea (IMC), e massa muscular (MM), pregas cutâneas e
circunferência do quadril e abdômen estavam reduzidos no grupo de indivíduos MUT/N.
Enquanto a quantidade da massa gorda (MG) apresentou uma tendência de redução no grupo
MUT/N em relação ao N/N, a percentagem de MG (% MG) e a relação cintura/quadril foram
semelhantes entre os dois grupos (PEREIRA, R.M.C. et al, 2007).
Por outro lado não houve diferença nos valores da resistência óssea, medida por
ultrassonografia do calcâneo, entre os indivíduos MUT/MUT e N/N embora somente 10 %
destes indivíduos tivessem mais de 60 anos de idade (GÓIS-JÚNIOR, et al., 2012). É possível
que o efeito benéfico ósseo nos indivíduos MUT/MUT, se perca nos indivíduos MUT/N, que
apresentam estatura adulta normal, e MM diminuída, com ossos mais frágeis em relação aos
tamanhos corporais, e mais susceptíveis aos efeitos danosos do envelhecimento.
Nossa hipótese é que a redução do eixo GH/IGF-I no grupo MUT/N presente na fase
adulta pode se agravar na senescência contribuindo para redução de MM e ou alterações
posturais, conduzindo a maior redução da altura nestes indivíduos. Neste trabalho serão
estudados a estatura, o peso, índice de massa corpórea e pressão arterial e condições, como
alcoolismo, tabagismo e diabetes, que podem influenciar a redução estatural nos indivíduos
17
MUT/N com mais de 60 anos, comparando-os com indivíduos adultos jovens. A frequência
de heterozigose nos grupos jovens e idosos será comparada.
A presente tese é um desdobramento da dissertação de mestrado “Composição
corporal, perfil metabólico e inflamatório na heterozigose para uma mutação no gene do
receptor do GHRH” e apresenta quatro artigos elaborados durante o doutorado em Ciências
da Saúde. O primeiro artigo, “Longevity in untreated congenital growth hormone deficiency
due to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene” (AGUIAR-OLIVEIRA et al.,
2010) mostra que a longevidade dos indivíduos homozigotos afetados (MUT/MUT) e MUT/N
é igual aos indivíduos normais (N/N) (Apêndice 1). O segundo “Old heterozygous individuals
heterozygous for a null GH releasing hormone receptor mutation loose more height that
normal subjects. Contribution to frailty?” (PEREIRA et al., 2014) foi submetido para
publicação na Revista Endocrine é o núcleo da presente tese (Apêndice 2). Dois outros
artigos completam o fenótipo dos MUT/N, “The consequences of growth hormone-releasing
hormone receptor haploinsufficiency for bone quality and insulin resistance” (GOIS JUNOR,
et al., 2012) mostra que mutações hetrozigóticas no GHRHR não tem impacto sobre
parâmetros ultrassonométricos ósseos em indivíduos adultos jovens, porém estes indivíduos
exibem um fenótipo magro e uma vantagem na sensibilidade à insulina, avaliada pelo
HOMAIR (Apêndice 3). O quarto artigo, “Lifetime congenital isolated GH deficiency does not
protect from the development of diabetes” (VICENTE, et al., 2013) mostra função da célula
beta e sensibilidade insulínica normais nos indivíduos MUT/N (Apêndice 4).
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 HORMÔNIO DE CRESCIMENTO (GH)
O GH é secretado pelos somatotrofos e têm na sua estrutura molecular 191
aminoácidos com peso molecular de 22.000 daltons. Em uma hipófise normal
encontramos aproximadamente 3 a 5 mg de GH.
A secreção diária de GH fica em
torno de 400 a 700 μg, ocorre em pulsos, principalmente durante o sono. A sua meia-
vida é de aproximadamente 20 minutos. (GREENSPAN; GARDNER; SOBACK,
2007
O GH é produzido no lobo anterior da hipófise, ou seja, na adenohipófise e
tem como principal órgão alvo o fígado. A secreção hipofisária de GH é determinada
por um triplo controle hipotalâmico exercido pelo GHRH, secretado em pulsos com
ritmo circadiano, cuja amplitude e frequência aumentam, em crianças e adultos, uma
hora após o sono profundo (SALVATORI et al., 1999), pela somatostatina e pela
grelina (ROSICKA et al., 2002). A somatostatina participa da regulação da secreção
de GH controlando a frequência dos pulsos de GH sem afetar a biossíntese do GH,
enquanto o GHRH atua através de seu receptor específico (GHRHR), estimulando a
secreção de GH (GIUSTINA; VELDHUIS, 1998). A grelina, um peptídeo encontrado
nas células do estômago e no hipotálamo, dentre outros tecidos (ROSICKA et al.,
2002), também estimula diretamente a secreção de GH. Uma vez secretado, o GH age
através do seu receptor (GHR) estimulando a produção do IGF-I (AGUIAR-
OLIVEIRA et al., 1999) (CORONHO; PETROIANER; MATOS SANTANA, 2001).
(Figura 1).
O GH exerce sua ação principalmente através do estímulo da produção de
IGF-I. O IGF-I é produzido em diversos tecidos do organismo, principalmente no
fígado, condrócitos, músculos, hipófise e trato gastrointestinal. Ele tem papel
fundamental no desenvolvimento pré e pós-natal e exerce todos os seus efeitos
fisiológicos por ligação com os receptores IGF-IR (LE ROITH, 1997). A ligação do
GH com seu receptor hepático estimula a expressão e liberação do peptídeo IGF-I na
circulação (DELAFONTAINE, 1995; JONES et al., 1995, LE ROITH, 1997). Seus
efeitos são modulados por diversas proteínas carreadoras, as IGFBPs (JONES et al.,
19
1995). O IGF-I circulante é gerado pelo fígado sob o controle do GH. A grande
semelhança entre o IGF-I e a pró-insulina humana sugere a existência de um gene
ancestral comum, o que pode explicar o fato da insulina ter ação semelhante ao IGF-I,
desempenhando importante papel no crescimento fetal.
Figura 1 – Esquema da regulação intrínseca do eixo GH-IGF-I.
2.2 DEFICIÊNCIA DE GH
A deficiência do hormônio do crescimento (DGH) pode ser classificada
como esporádica (congênita, adquirida, variante e idiopática) ou familiar
(SALVATORI et al., 1999; 2001). A DGH familiar pode ser isolada (DIGH) ou
associada à deficiência de múltiplos hormônios hipofisários. A DIGH é pouco
frequente, ocorrendo em cerca de 1:4.000 a 1:10.000 nascidos vivos, e tem uma
ocorrência familial em 5 a 30 % dos casos. Vários modelos de herança têm sido
descritos, sendo o mais frequente o autossômico recessivo (MULLIS, 2005).
HIPOTÁLAMO
HIPÓFISE
GH
EFEITOS DIRETOSEFEITOS INDIRETOS
FÍGADO
IGF-I
MÚSCULO/OSSO/CORAÇÃO
TECIDO ADIPOSO
Receptor do GHRH
Receptor do IGF-I
Receptor do GH
(-)
(-)GHRH
(+)
Somatostatina
(-)
(+)
(+)
Grelina
20
No caso da DIGH genética, três diferentes tipos de herança são descritas
(PHILIPS et al., 1981):
Tipo I – Autossômica recessiva:
o Tipo Ia - com níveis séricos ausentes de GH
o Tipo Ib - com níveis séricos bastante reduzidos de GH
Tipo II - Autossômica dominante
Tipo III - Ligada ao cromossomo X
O tipo Ia ocorre por deleção do gene GH-1, sendo comum o aparecimento
de anticorpos anti-GH o que frustra a possibilidade de tratamento com GH. É a forma
mais severa de DIGH, com retardo do crescimento já aparente nos primeiros seis
meses de vida, algumas vezes associado com episódios de hipoglicemia. Já o tipo Ib é
a forma mais frequente, sendo causada por mutações no gene GH-1 ou mais
frequentemente por mutações homozigóticas ou heterozigóticas compostas do
GHRHR, na qual os pacientes têm níveis baixos de GH, mas detectáveis. Estes
pacientes não produzem anticorpos anti-GH em quantidades suficientes para impedir
a resposta terapêutica ao GH exógeno. (COGAN et al., 1994).
A primeira mutação no GHRHR, c.214 G>T no exon 3, levando a DIGH tipo
Ib, foi descrita em três famílias do subcontinente indiano, das quais a mais conhecida
é a dos “Anões de Sindh” (MAHESHAWARI et al., 1998 , NETCHINE et al., 1998).
O “nanismo de Sindh” representa o homólogo humano do “little mouse” descrito em
1976, em que a mutação no GHRHR abole o sítio de ligação para o GHRH, o que
leva a uma resistência à sua ação, hipoplasia pituitária e deficiência isolada de GH
(BAUMANN et al., 1997). O segundo tipo de mutação no GHRHR foi descrito em
105 indivíduos da região de Carretéis e arredores, em Itabaianinha-SE. Trata-se de
uma mutação homozigótica tipo “splice” no início do íntron I no sítio doador de
emendas, onde a G (Guanina) foi substituída pela A (Adenina) (c.57+1G>A), figura
2. Essa mutação impede a síntese de RNA mensageiro (RNAm) do receptor de
GHRH, resultando em um receptor de GHRH completamente truncado, o que conduz
a uma deficiência severa de GH (SALVATORI et al., 1999).
21
Figura 2. Mutação homozigótica no sítio de “splicing” do íntron 1 no gene do receptor do
hormônio liberador do hormônio do crescimento, ocorrendo troca de bases, Guanina (G) por
Adenina (A) c.57+1G>A, WT (indivíduo normal – N/N), MUT (indivíduo mutado –
MUT/MUT).
Os indivíduos DIGH tipo II apresentam níveis séricos de GH baixos, mas
detectáveis, geralmente com boa resposta ao tratamento com GH. A DIGH tipo III
apresenta manifestações clínicas distintas nas diferentes famílias. Alguns pacientes
podem apresentar agamaglobulinemia associada à deficiência de GH, sugerindo que o
tipo III de DIGH pode se dever a defeitos em genes contíguos ou a mutações em
múltiplos locus (BOGUSZEWSKI et al., 2001).
2.3 ASPECTOS FENOTÍPICOS DA MUTAÇÃO EM HOMOZIGOSE
NO GHRHR
Em Itabaianinha os indivíduos homozigóticos (MUT/MUT) para esta
mutação apresentam um aspecto fenotípico marcante, associado à redução acentuada
dos níveis de IGF-I, IGF-II, ALS e IGFBP-3 (AGUIAR-OLIVEIRA et al., 1999). As
características mais marcantes da DIGH foram: baixa estatura importante (escore de
desvio padrão da altura entre -4 e -8, altura final em homens foi entre 117 e 137
centímetros e em mulheres entre 107 e 126 centímetros), fronte proeminente, voz com
timbre alto e agudo (SOUZA et al., 2004), redução da massa muscular com aumento
do percentual de gordura abdominal, e aumento do LDL colesterol em crianças e
adultos (BARRETO et al., 1999; GLESSON et al., 2007>). Além disto, foi observado
aumento da pressão sistólica quando comparadas à adultos normais para mesma
idade e sexo (BARRETO-FILHO et al., 2002) porém sem evidências de aterosclerose
22
prematura (OLIVEIRA et al., 2006) ou resistência insulínica (BARRETO-FILHO et
al., 2002; OLIVEIRA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2010) encontradas em outros
modelos de DGH de inicio na vida adulta (AMATO et al., 1993; GOLA et al., 2005).
Um estudo recente com indivíduos MUT/MUT mostrou longevidade normal
(AGUIAR-OLIVEIRA et al., 2010). A DMO volumétrica, corrigida para o tamanho
corporal foi normal nos indivíduos MUT/MUT, abaixo (EPITÁCIO-PEREIRA et al.,
2013) e acima de 60 anos de idade (SOUZA et al., 2013). Também o número de
fraturas vertebrais por indivíduos foi menor nos indivíduos MUT/MUT que nos
indivíduos normais, indicando um fenótipo ósseo benéfico nos indivídiuos
MUT/MUT (SOUZA et al., 2013), adaptado ao tamanho dos ossos e ao esforço
muscular, em acordo com a teoria do mecanostato ( SCHOENAU, 2007).
2.4 GH, PERFIL ÓSSEO, ENVELHECIMENTO E LONGEVIDADE.
A partir do começo da década de 80, houve um crescente número de estudos
envolvendo o fenótipo ósseo e o eixo GHRH-GH-IGF-I. Pesquisas in vitro
(OHLSSON et al., 1998), em ratos (KALU et al., 1984; WRIGHT et al., 1995) e em
macacos (SASS et al., 1997) foram realizadas com o objetivo de verificar os
possíveis efeitos do GH, IGF-I e GHRH na manutenção ou possível ganho de massa
óssea em indivíduos com DGH de início na idade adulta. Alguns estudos,
demonstraram que o eixo GH/IGF-I representa um importante papel no metabolismo
e na resistência óssea, e que a deficiência do GH predispõe a perda da massa óssea
(YAKAR et al., 2002; PETEL et al., 2005) e aumento do risco de fratura (ROSEN et
al., 1997; HOLMER et al., 2007). A queda do IGF-I observada no processo de
envelhecimento seria um mecanismo envolvido com a perda de massa óssea após a
sexta década de vida, passível de correção pela administração do GH exógeno
(KATZMANN et al., 1998; ROSEN & DONAHUE, 1998).
Em humanos, a DGH nos adultos causa mudanças que são similares ao
envelhecimento normal, incluindo aumento na massa de gorda, redução na massa e
força muscular, piora da qualidade de vida, redução da densidade mineral óssea,
aumento do colesterol total e LDL e o espessamento das paredes arteriais (MOLITCH
et al., 2006). A maioria destas mudanças é revertida com a terapia de substituição do
23
GH. Embora o aumento da mortalidade tenha sido observado em pacientes com
hipopituitarismo com terapia de substituição dos hormônios hipofisários sem o GH
(ROSEN et al., 1990), nenhum estudo mostrou claramente que aquela mortalidade é
causada pela falta de GH, ou que esta situação se inverteu com a terapia de
substituição com GH exógeno.
Desde que o envelhecimento normal foi associado com a redução progressiva
de secreção de GH (somatopausa), e algumas das mudanças do envelhecimento
podem ser revertidas com a terapia de GH (BLACKMAN et al., 2002), foi proposto
que a somatopausa seja pelo menos em parte responsável pelo processo de
envelhecimento. Por esta razão, a terapia de reposição com GH é defendida
frequentemente como um tratamento antienvelhecimento. Porém, a relação entre o
declínio na secreção de GH e envelhecimento em humanos ainda é controverso. De
forma interessante, a razão para o declínio da secreção do GH relacionado com a
idade não está em alterações de função das células somatotróficas, mas na alteração
do controle hipotalâmico da secreção de GH, possivelmente com uma combinação de
redução da secreção GHRH e aumento da secreção da somatostatina. Como
previamente demonstrado, nos idosos as células somatotróficas permanecem
normalmente responsivas ao GHRH (GHIGO et al., 1990).
A pergunta se o status de DGH tem um efeito positivo ou negativo no tempo
de vida dos seres humanos ainda não foi respondida. Besson e outros mostraram
recentemente que os 11 componentes de duas famílias da Suíça do século 19 com
DIGH (devido à deleção do gene GH1) viveram menos que seus irmãos. Entretanto,
este estudo retrospectivo é limitado pelo tamanho da amostra (BESSON et al., 2003).
No único estudo prospectivo publicado até o momento, foi relatada uma população
portadora de hipopituitarismo com a taxa de mortalidade aumentada e risco
cardiovascular de 1:8 comparados com a população geral (TOMLINSON et al.,
2001). Embora somente uma minoria destes pacientes tenha sido testada para DGH, é
provável que a maioria deles seja portadora de DGH, porque o GH é geralmente o
primeiro hormônio cuja produção é reduzida na presença de doença pituitária
(HARTMAN et al., 2002). Entretanto estes indivíduos eram altamente heterogêneos,
e uma grande porcentagem deles foi submetida a cirurgia ou radioterapia da região
hipotalâmica hipofisária, que por si só influencia a sobrevida (principalmente a
24
radioterapia) (BRADA et al., 2002). Outros autores não confirmaram um aumento da
mortalidade associado com o hipopituitarismo (BATES et al., 1999).
A maioria dos estudos humanos foi realizada em pacientes portadores de
panhipopituitarismo, com terapias múltiplas de substituição hormonal (glicorticóides,
L-tiroxina e esteroides sexuais) e sofreram cirurgia ou irradiação pituitária ou
hipotalâmica. Por isso, é possível que os efeitos sobre a mortalidade, sejam pelo
menos em parte, secundária a terapias anteriores ou imprecisão na substituição
terapêutica. Em adição, propôs-se que a mortalidade cerebrovascular nos pacientes
com tumores pituitários pode estar ligada a radioterapia, que pode causar danos
vasculares diretos (BRADA et al., 2002). Consequentemente, permanece obscuro se o
aumento da morbimortalidade cardiovascular esta associado com o tratamento de
panhipopituitarismo e de DGH não tratada, ou de fatores adicionais de confusão.
Desde que a DGH isolada (DIGH) é rara, é difícil estudar pacientes que tenham
deficiência exclusiva de GH.
Nossos dados demonstram que na DIGH congênita e grave, devido a uma
mutação no GHRHR, não apresenta evidência de aterosclerose prematura (MENEZES
OLIVEIRA et al., 2006) ou redução da longevidade (AGUIAR-OLIVEIRA et al.,
2010). A longevidade nessa família é normal apesar da presença de fatores de risco
óbvios para doença cardiovascular com pressão sanguínea aumentada, colesterol total
e LDL aumentado, proteína C reativa aumentada e adiposidade abdominal
(BARRETO-FILHO et al., 2002).
2.5 FENÓTIPO DOS INDIVÍDUOS HETEROZIGOTOS
O conceito de que uma doença recessiva requer um mau funcionamento de
ambos os alelos, paterno e materno, tem sido desafiado por alguns exemplos
mostrando que indivíduos MUT/N para a mutação recessiva exibem um fenótipo
intermediário entre os indivíduos MUT/MUT e N/N. Mutações inativadoras em
homozigose do gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL) causam
hipercolesterolemia severa e doença arterial coronariana prematura, enquanto MUT/N
levam a hipercolesterolemia moderada e doença arterial coronariana em uma idade
mais tardia (JANSEN et al., 2002). Mutações em homozigose do gene do receptor
sensor do cálcio causam hiperparatiroidismo neonatal severo enquanto as mutações
25
em heterozigose causam hipercalcemia e hipocalciúrica familiar benigna (HENDY et
al., 2000). Mutação em homozigose do gene do receptor B do peptídeo atrial
natriurético causa displasia óssea severa (displasia acromesomélica) enquanto
indivíduos MUT/N apresentam apenas uma baixa estatura discreta (OLNEY et al.,
2006). Finalmente, a obesidade é mais acentuada em indivíduos MUT/MUT que em
indivíduos MUT/N portadores de mutações do gene do receptor da melanocortina
tipo quatro (FAROOQI et al., 2003).
Previamente estudamos 76 indivíduos portadores da mutação c.57+1G>A ,em
apenas um dos alelos, no GHRHR (MUT/N). Apesar de estatura normal e níveis
sanguíneos normais de IGF-I, eles mostraram redução significativa na massa
muscular. Semelhantemente aos indivíduos com DGH, eles apresentaram índice de
modelo homeostático de avaliação da resistência à insulina (HOMAIR) menor que os
indivíduos N/N, sugerindo que indivíduos MUT/N para a mutação GHRHR tenha
sensibilidade à insulina aumentada (PEREIRA et al., 2007). Outro aspecto de
heterozigose é a redução do volume da tireóide em valor absoluto e mesmo
corrigido para superfície corporal (ALCANTARA et al., 2006).
2.6 ENVELHECIMENTO E MUDANÇAS POSTURAIS NO IDOSO
O envelhecimento pode ser definido como um processo irreversível,
caracterizado por alterações funcionais e estruturais de diversos órgãos e sistemas que
variam de um indivíduo para outro. A senescência é o processo natural de
envelhecimento ao nível celular ou o conjunto de fenômenos associados a este
processo. Este conceito se opõe à senilidade, também denominado envelhecimento
patológico, e que é entendido como os danos à saúde associados com o tempo, porém
causados por doenças ou maus hábitos de saúde. O crescimento da população de
idosos é um fenômeno mundial e está sendo enfatizado, principalmente nas
implicações sociais e em termos de saúde pública. A Organização Mundial de Saúde
(OMS) previu que, em 2025, a população mundial de pessoas com mais de 60 anos
será de, aproximadamente, 1,2 bilhões, sendo que os muitos idosos (com 80 anos ou
mais) constituem o grupo etário de maior crescimento (WHO, 2004). Segundo
estimativa do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em uma série de
projeções populacionais, baseada no Censo de 2010, a população com faixa etária
26
acima de 65 anos deve passar dos atuais 7,4% do total, para mais de 14% em 2025
(CENSO DEMOGRÁFICO, 2000. RIO DE JNANEIRO. INSTITUTO BRASILEIRO
DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE), 2000). Nesta época o Brasil terá uma
proporção de idosos semelhante à que é hoje registrada em países desenvolvidos
(COELHO FILHO & RAMOS, 1999).
Dentre as alterações do envelhecimento, destaca-se a redução da massa óssea
devido a desproporção entre as funções dos osteoblastos e osteoclastos, a partir da
quarta década de vida, presente em ambos os sexos, porém com maior intensidade no
sexo feminino, principalmente nas pós-menopáusicas em virtude da redução nos
níveis estrogênicos (GALI, 2001; GUCCIONE, 2002).
Neste período, a reabsorção óssea começa a preponderar sobre o processo de
formação do osso, levando à diminuição da massa óssea. Esse desequilíbrio na
remodelagem óssea de forma mais intensa predispõe a osteoporose. A redução na
densidade dos ossos dá-se mais precocemente na coluna vertebral que nos membros.
A perda óssea em mulheres é mais prematura, a partir dos 35 anos de idade e
apresenta um índice de perda de aproximadamente 1% ao ano enquanto que em
homens acontece em uma taxa média de perda de 0,4% por ano, iniciando-se entre os
50 ou 55 anos de idade. Em homens e mulheres entre 60 e 80 anos, a taxa média de
diminuição na altura é de cerca de dois centímetros por década, podendo atingir até
12 cm nos casos mais extremos de perda óssea (GUCCIONE, 2002).
De acordo com CAROLYN KISNER (2000), a coluna, considerada pilar
anatômico, é constituída por corpos vertebrais e discos intervertebrais, é a porção
hidráulica, sustentadora de peso e absorvedora de choques. Os pilares posteriores,
constituídos pelos processos articulares e facetas articulares, são o mecanismo
deslizante para o movimento. Também, parte da unidade posterior é constituída de
arcos vertebrais, dois processos transversos e um processo espinhoso posterior
central. Os músculos inserem-se nos processos a partir de onde conduzem o
movimento.
Segundo GUCCIONE (2002), com o processo do envelhecimento, a
arquitetura óssea que compõe e sustenta o corpo humano sofre uma considerável
alteração, no que diz respeito tanto a densidade mineral quanto a microarquitetura
óssea, que altera as propriedades e a proporção relativa dos elementos do tecido
27
conjuntivo do disco intervertebral. A elastina torna-se menos distensível e pode sofrer
fragmentações sucessivas.
A diminuição de massa óssea está associada à diminuição ou aumento nas
concentrações de hormônios (estrogênio, hormonio tireoideano, dentre eles a
calcitonina, hormônio da paratireoide, corticosteroides e progesterona), a fatores
nutricionais (deficiência de vitamina D, e de cálcio), a imobilidade (fraturas,
sedentarismo), as doenças osteoarticulares (artrite reumatóide) e a fatores genéticos
relacionados a biótipo, raça e peso. (MAZO, LOPES E BENEDETTI, 2001;
MATSUDO, 2001) .
Segundo MAGEE (2002) “postura é um composto das posições das diferentes
articulações do corpo num dado momento. A postura correta é a posição na qual um
mínimo de estresse é aplicado em cada articulação”. Já para PALMER & APLER
(2002) “a postura correta consiste no alinhamento do corpo com eficiências
fisiológicas e biomecânicas máximas, o que minimiza os estresses e as sobrecargas
sofridas ao sistema de apoio pelos efeitos da gravidade”, portando a postura é muito
particular para cada indivíduo e estão envolvidos diversos fatores como fraqueza
muscular, baixa autoimagem, tensão emocional ou psicossocial e também a imitação
dos hábitos dos pais . Tudo isso pode levar a má postura fazendo com que a pessoa
curve-se para diante (BARRIE PICKLES, 2000). As alterações posturais se iniciam
após os quarenta anos de idade que contribui para a posição inclinada e a redução da
estatura que caracteriza as pessoas idosas (BARRIE PICKLES, 2000).
Durante o processo natural de envelhecimento, ocorre diminuição das reservas
funcionais do organismo em todos os aparelhos e sistemas. A velocidade e extensão
desse declínio variam muito entre os diversos tecidos e funções, como variam
também entre indivíduo. As perdas observadas ao nível dos sistemas refletem a perda
de células em decorrência da idade, ou diminuição da capacidade de um grupo de
células no exercício de sua função especializada. Considera-se que o envelhecimento
traz modificações físicas que aparecem em um dado momento de forma quantificável.
A pessoa vê sua estatura diminuir. O tamanho do esqueleto diminui devido a um
duplo fenômeno: o achatamento dos discos e dos corpos vertebrais e a acentuação da
curvatura sagital da coluna vertebral. A largura dos ombros e os diâmetros
biacromiais se reduzem. O diâmetro ântero-posterior do tronco aumenta (LÉGER,
1994). A cifose torácica é a mais frequente entre as anomalias posturais que se
28
instalam com o avançar da idade. Este aumento da curvatura torácica acompanha-se
de alterações da lordose lombar, ampliação do ângulo de flexão do joelho; o
deslocamento da articulação coxofemoral para trás; e a inclinação do tronco para
diante, acima dos quadris. (BARRIE PICKLES, 2000).
A alteração da postura corporal é um dos problemas mais frequentes
relacionados ao envelhecimento, pois há uma dificuldade na execução dos
movimentos com rapidez. Desta forma, o equilíbrio corporal fica mais difícil, sendo
de extrema importância que se conheçam as transformações que ocorrem na postura
corporal com o processo de envelhecimento, de modo que possam ser adotadas
medidas preventivas e até corretivas desta postura, a fim de evitar dores,
deformidades, dificuldades de locomoção e equilíbrio, melhorando a qualidade de
vida desses indivíduos.
2.7 JUSTIFICATIVA
O estudo do efeito entre idade e fenótipo na heterozigose para a mutação de
Itabaianinha, pode ser ampliado para a compreensão da longevidade e do fenótipo na
senescência ou senilidade em indivíduos aparentemente normais, porém
heterozigóticos para a mutação c.57+1G>A no GHRHR.
29
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estudar o efeito da idade no fenótipo em heterozigose (MUT/N) para a
mutação c.57+1G>A no gene do receptor do hormônio liberador do GH.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito da idade na altura dos indivíduos MUT/N
Analisar o efeito da idade no peso dos indivíduos MUT/N
Verificar o efeito da idade no IMC nos indivíduos MUT/N
Verificar o efeito da idade na pressão arterial nos indivíduos MUT/N
Avaliar a longevidade dos indivíduos MUT/N para a mutação c.57+1G>A
30
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS
4.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO
A população estudada situa-se no município de Itabaianinha, região oeste do
centro-sul do estado de Sergipe. Possui, cerca de, 39 mil habitantes (IBGE, 2010) e
extensão territorial de 478 Km2, onde a agricultura prevalece como atividade
econômica para sustento das famílias (Figura 3). Nessa região, a DIGH é doença
autossômica recessiva com grau de consanguinidade alto (SALVATORI, et al., 1999;
SOUZA et al., 2004), cuja frequência fenotípica é bastante elevada, cerca de 1:279,
torna-se maior ainda se considerarmos Carretéis, berço dos anões, que é um
aglomerado rural a 14 km ao norte da sede do município (composto de treze
povoados), aonde chega a 1:32 (SOUZA, 1997).
Figura 3- Mapa da Região de Itabaianinha, Sergipe, Brasil.
4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO DO ESTUDO
Os critérios de inclusão foram:
- O indivíduo ser natural de Itabaianinha e arredores;
- Não ser parente de DIGH em primeiro, segundo e terceiro grau
(primeiro grau seriam os pais, filhos e irmãos; segundo grau os avós, netos, tios e
31
sobrinhos e o terceiro grau primos, bisavós e bisnetos), com objetivo de excluir
que outros genes para estatura ou longevidade posam estar hiper-representados na
amostra.
- Estar entre 20 e 40 anos (grupo jovem) e 60 a 80 anos (grupo idoso).
4.3 TIPO DE ESTUDO
Um estudo transversal foi realizado em 843 indivíduos para comparar a
frequência de MUT/N e N/N para a mutação c.57 + 1 G>A no GHRHR em dois
grupos aparentemente normais: um grupo jovem com idade entre 20-40 anos (500
jovens, sendo 245 homens e 255 mulheres), e outro idoso, com idade entre 60 a 80
anos (343 idosos, sendo 179 homens e 164 mulheres) residentes na cidade de
Itabaianinha.
4.4 MÉTODOS
Foram realizadas reuniões na “Associação do Crescimento Físico e Humano
de Itabaianinha - ASCRIM” e solicitados aos anões que divulgassem na comunidade
a necessidade de voluntários para este novo trabalho que iríamos realizar. As coletas
foram realizadas em duas etapas com viagens à Itabaianinha. Para sensibilizar a
população a aderirem como voluntários, contamos com anúncios em rádios da cidade
(AM e FM), faixas foram colocadas em pontos estratégicos da cidade (em praças
públicas: na Praça da Igreja Matriz e na feira) para que chamasse atenção da
população, a comparecerem nos dias das coletas divulgados previamente (Figura 4).
Em cada viagem contamos com uma equipe de alunos do curso de Medicina que
auxiliaram na coleta de dados, todos foram previamente treinados e estavam
uniformizados com camisetas identificadas com o nome da Universidade Federal de
Sergipe (Figura 4 e 5).
A amostra foi selecionada aleatoriamente durante a votação do processo
eleitoral de Outubro de 2008. Fizemos uma solicitação à Juíza Dra. Aline Cândido
Costa da 10ª Zona Eleitoral de Itabaianinha/SE, para fazermos uma coleta para nosso
estudo durante as Eleições de 2008 e a resposta foi positiva (ANEXO 1).
32
Foi montada um ponto de apoio na praça central de Itabaianinha próximo ao
supermercado G. Barbosa que foi identificada com faixa da Universidade Federal de
Sergipe. Nesta barraca, uma equipe de aproximadamente 21 pessoas, formando 7
grupos de três pessoas, identificadas com camisas da UFS, acolhia os indivíduos
interessados em participarem da pesquisa. As tendas continham todo material
necessário (mesas, cadeiras, formulários das entrevistas, balanças digitais portáteis,
estadiômetros portáteis afixados em paredes de madeira, material para coleta de DNA
com swabs bucais e aparelhos para aferir a pressão), todos participantes assinaram os
Termos de Consentimento Livre e Esclarecidos (TCLE) (ANEXO 2). A autora
armazenou e recolheu todo o material colhido acondicionando as entrevistas e os
Termos de Consentimento em caixas específicas e os swabs bucais em recipiente de
isopor apropriado. Ao mesmo tempo uma equipe volante convidava as pessoas nas
áreas próximas aos postos de coleta para participar do estudo.
O indivíduo era convidado a participar do estudo, caso concordasse, era
apresentado o TCLE e obtido sua assinatura. Em seguida começava o procedimento
da coleta de dados que consistia na resposta do participante a entrevista onde ele
respondia diversas perguntas, dentre elas: nome, endereço, data de nascimento, idade,
peso e altura (eram aferidos pelo pessoal treinado), diagnóstico de diabetes (auto
aferido com resposta de sim ou não), parentesco com DIGH, qual o tipo de
parentesco, se era fumante e indicadores de alcoolismo (ANEXO 3). Não foi
realizado a glicemia capilar, analizada em outro trabalho anterior (VICENTE et al.,
2013). Cada grupo de três participantes mediu a altura, o peso, a pressão arterial e
colheu o esfregaço bucal. Foram obtidos 793 indivíduos nesta etapa.
33
Figura 4: Equipe de alunos coletando dados.
Figura 5: Apoio armado na Praça da Igreja Matriz para coleta de dados.
Após a eleição, fizemos uma nova coleta, para aumentarmos o número de
indivíduos idosos, envolvemos as Igrejas Católica a 1ª Igreja Batista, após
consentimento dos respectivos responsáveis. Nesta etapa solicitamos apoio para
coleta dentro das igrejas (Figura 6). Fizemos coletas logo após os horários das missas
e cultos no sábado e domingo. Nesta etapa foram obtidos 50 indivíduos.
34
A medição da altura (cm) foi realizada em estadiômetro compacto vertical
portátil afixado em uma parede de madeira da marca Wiso-Brasil. Esta medida foi
realizada com o indivíduo descalço sobre a plataforma, calcanhares juntos, nádegas e
ombros em contato com o eixo vertical do instrumento e foi exercida leve pressão no
processo mastóide para cima com a média de três medidas consecutivas realizada pela
mesma pessoa (BARRETTO et al., 1999; BARRETO-FILHO et al., 2002). O
estadiômetro Wiso é um dispositivo para medição de altura fixo na parede, seu campo
de medição é de 0 a 210 cm. É um instrumento preciso, com resolução em
milímetros, de alta resistência, fácil de usar e de ser instalado o que foi de extrema
importância para nosso estudo. Ele é composto basicamente de três partes: o suporte
de fixação, a fita e a base com o visor. Para montá-lo escolhemos uma parede de
Figura 6: Professor Dr Manuel Hermínio solicitando a adesão da
população durante a missa católica na Igreja Matriz da Imaculada
Conceição de Itabaianinha.
35
madeira para fixação do aparelho, em seguida esticamos a fita até que a mesma
atingisse a marca "0" (zero). A base com o visor estava junto à parede, na parte de
baixo da mesma, encostando suas faces, no chão e na parede. Com o auxílio de uma
escada, encostamos o suporte de fixação, na parte superior da parede e deixamos a
fita totalmente esticada, de cima para baixo, e verificamos se o visor apontava
exatamente para a marca "0" (zero).
A pesagem (Kg) em balança digital (marca Tech Line-Brasil) com o indivíduo
descalço e uma média de três pesagens. A balança digital Tech Line-Brasil tem a
capacidade de pesar até 180 Kg, conta com visualização de modo digital de 100 em
100 g e funciona com uma bateria de lítio, é leve e de fácil transporte.
O índice de massa corpórea (IMC) foi calculado através da fórmula
Peso/(Altura)2 kg/m
2. O IMC foi expresso em valore absoluto.
A coleta do DNA foi realizada através de swab bucal da seguinte maneira: o
indivíduo era instruído para bochechar três vezes com água e em seguida, a pessoa,
treinada para coleta, introduzia na cavidade oral do indivíduo, um swab com borda
em escova e fazia uma fricção suave na face interna de cada bochecha por
aproximadamente 30 segundos. O esfregaço era colhido em duplicata sendo uma
amostra enviada para genotipagem na Universidade Jonhs Hopkins e outra guardada
em refrigerador. Assim que a genotipagem era concluída descartava-se a segunda
amostra. Ao ser acondicionado no invólucro o swab, que já deveria estar identificado
com o nome do indivíduo e data da coleta e só então era lacrado e acondicionado em
refrigeração.
A genotipagem através do produto de PCR para a mutação c.57 + 1 G>A no
GHRHR (rs2302022) foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular de Dr
Roberto Salvatori na Universidade Johns Hopkins, em Baltimore/EUA, utilizando o
sistema TaqMan® SNP Genotyping Assay C__15757069_10 (Applied Biosystems,
Foster City, CA). A PCR e a detecção da fluorescência final foram realizadas no
sequenciador Prism ABI 7900HT, com protocolos fornecidos pelos fabricantes. Nos
resultados observados, os indivíduos N/N apresentaram uma única banda, os
indivíduos MUT/MUT, também apresentaram uma única banda de migração, contudo
mais lenta que os indivíduos N/N. Os indivíduos MUT/N, apresentaram quatro
bandas: o alelo normal e o alelo afetado e duas bandas correspondentes a
36
heterodímeros gerados durante a amplificação por PCR (SALVATORI et al., 1999)
(Figura 7).
N/N MUT/MUT MUT/N
Figura 7 – Esquema representativo das bandas após DGGE (Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis) em indivíduos de Itabaianinha-SE. Indivíduos Homozigóticos normais
(N/N) apresentaram uma única banda, indivíduos Homozigóticos afetados (MUT/MUT), uma
única banda mais lenta e os Heterozigóticos (MUT/N), quatro bandas, a do alelo normal e a
do alelo mutante e duas bandas mais lentas que representam heterodímeros gerados pelo
anelamento das fitas anterior e posterior dos alelos de G (Guanina) e A (Adenina) durante
amplificação do PCR. SALVATORI et al, J Clin Metab, v.84, n.3, p.917-923, 1999.
A aferição da pressão arterial (mmHg) foi realizada com a média de três
medidas obtidas no braço não dominante do indivíduo, depois de 10 minutos de
repouso na posição sentada por pessoal treinado previamente utilizando um
esfigmomanômetro de mercúrio composto pelo manômetro e manguito que deve ter
um tamanho adequado para o braço de um adulto e com a ajuda de um estetoscópio
descrita pela VI Diretriz Brasileira de Hipertensão (2010).
As variáveis estudadas foram: altura, peso, IMC, pressão arterial diastólica
(PAD) e pressão arterial sistólica (PAS). O EDP do peso, EDP da altura e EDP do
IMC de cada indivíduo de ambos os grupos, foi calculado usando o site
http://www.phsim.man.ac.uk/SDSCalculator/SDSCalculator.aspx.
Com referência aos indicadores de consumo de álcool por quantidade semanal
de uso foi perguntado aos entrevistados qual das opções abaixo ele responderia
(Tabela 1).
37
Tabela 1: Indicadores de Consumo de Álcool
Quantidade Semanal Classificação
Nada Não Consome
Até 3 doses (destilada) ou
garrafas (fermentadas) Consumo leve
De 3 a 7 doses (destilada) ou
garrafas (fermentadas) Consumo moderado
Acima de 7 doses (destilada) ou
garrafas (fermentadas) Consumo elevado
O atual trabalho faz parte do projeto de pesquisa “Consequências da
deficiência isolada e vitalícia do GH” e foi submetido aos Comitês de Ética e
Pesquisa, da Universidade Johns Hopkins e da Universidade Federal de Sergipe tendo
sido aprovado com o parecer número 043/204, e registro no CONEP sob o número
10212 (ANEXO 4).
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As variáveis foram comparadas pelo teste T de student. O teste de qui
quadrado comparou a proporção de indivíduos MUT/N nos dois grupos. O teste de
Fisher foi usado para comparar os possíveis fatores que influenciam o fenótipo de
cada grupo, ou seja, o alcoolismo, tabagismo e diagnóstico auto-referido de diabetes.
Estimamos um p de 0,05 ou menos para ser considerado estatisticamente significante.
38
5 RESULTADOS
A tabela 2 mostra os valores absolutos e do EDP da altura, do peso, do IMC e
os valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica
(PAD) por genótipo no grupo jovem.
Tabela 2: Valores absolutos e Escore desvio padrão (EDP) da altura, peso, índice de massa
corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial
diastólica (PAD) por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos)
20 a 40 anos
N/N
N=461
MUT/N
N=39
p
Altura (cm) 163,1 (8,7) 160,8 (9,4) 0,16
EDP Altura -1,2 (1) -1,4 (1,2) 0,30
Peso (Kg) 65,3 (12,8) 62,5 (20,3) 0,49
EDP Peso -0,1 (1,4) -0,6 (1,8) 0,03
IMC (Kg/m2) 24,4 (4,4) 24,2 (6,5) 0,24
EDP IMC 0,3 (1,4) 0,1 (1,4) 0,06
PAS (mmHg) 122,5 (18) 122,2 (16,7) 0,75
PAD (mmHg) 79,6 (13,3) 78,5 (10,4) 0,49
39
A tabela 3 mostra as frequências referidas das categorias de tabagismo, uso e
consumo de álcool e diabetes mellitus por idade e por genótipo no grupo jovem.
Tabela 3: Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes
por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos)
20 a 40 anos
N/N
N=461
MUT/N
N=39
p
Tabagismo – n (%)
Não Fumante 363 (84) 17 (85) 0,17
Fumante atual 66 (15) 2 (10)
Fumante anterior 3 (1) 1 (5)
Sem resposta 29 19
Consumo de Álcool – n (%)
Não consome álcool 188 (44) 13 (65) 0,15
Consumo leve 136 (32) 2 (10)
Consumo moderado 61 (14) 2 (10)
Consumo alto 40 (9) 3 (15)
Etilista anterior 5 (1) 0 (0)
Sem resposta 31 19
Diabetes Mellitus– n (%)
Não é diabético 441 (99) 34 (100) > 0,99
É diabético 5 (1) 0 (0)
Sem resposta 15 5
40
As tabelas 4 e 5 mostram os mesmos dados das tabelas 2 e 3 para o grupo
idoso. Observa-se redução do EDP do peso (p=0,03) , enquanto o IMC apresentou
uma tendência de redução (p=0,06) no grupo MUT/N jovem. Não houve diferença
entre alcoolismo, tabagismo e diagnóstico auto-referido de diabetes.
Tabela 4: Valores absolutos e escore desvio padrão (EDP) da altura, peso, índice de massa
corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial
diastólica (PAD) por genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos).
60 a 80 anos
N/N
N=319
MUT/N
N=24
p
Idade 68,3 (6,90) 68,0 (7,72) 0,84
Altura (cm) 155,9 (8,7) 151,8 (8,0) 0,02
EDP Altura -2,4 (1) -2,8 (1,1) 0,04
Peso (Kg) 62,8 (12,4) 59,8 (13,0) 0,25
EDP Peso -0,5 (1,6) -0,8 (1,9) 0,52
IMC (Kg/m2) 25,8 (4,5) 26,2 (6,1) 0,67
EDP IMC 0,7 (1,4) 0,7 (1,4) 0,96
PAS (mmHg) 143,9 (22,2) 147,1 (23,2) 0,65
PAD (mmHg) 84,8 (13,9) 86,5 (12,4) 0,46
41
Tabela 5: Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes por
genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos)
60 a 80 anos
N/N
N=319
MUT/N
N=24
p
Tabagismo – n (%)
Não Fumante 230 (74) 12 (75) 0,87
Fumante atual 68 (22) 4 (25)
Fumante anterior 11 (4) 0 (0)
Sem resposta 10 8
Consumo de Álcool – n (%)
Não consome álcool 233 (75) 11 (73) 0,15
Consumo leve 55 (18) 1 (7)
Consumo moderado 12 (4) 2 (13)
Consumo alto 5 (2) 1 (7)
Etilista anterior 5 (2) 0 (0)
Sem resposta 9 9
Diabetes – n (%)
Não é diabético 262 (85) 23 (96) 0,23
É diabético 48 (15) 1 (4)
Sem resposta 9 0
42
A figura 8 mostra a representação gráfica da altura e EDP da altura, peso e
EDP do peso, no grupo jovem e no grupo isoso.
Figura 8: Representação gráfica da altura (cm), EDP da altura, peso (Kg) e
EDP do peso nos indivíduos jovens (A) e idosos (B).
43
A diferença de altura encontrada entre o grupo N/N e MUT/N jovem; 2,35
cm menor nos indivíduos MUT/N que nos N/N; não apresentou estatística. O grupo
MUT/N idoso apresentou redução estatural sendo 4,16 cm menor que o N/N
(p=0,02). O EDP da altura também foi menor nos indivídos idosos MUT/N vs N/N, (-
2,79 ±1,1 e -2,37 ±1,0, p=0,04).
Não houve diferença na prevalência do genótipo MUT/N nos dois grupos:
jovem 39/500 (7,8%) e idoso 24/343 (7,0%) sugerindo efeito nulo da heterozigose da
mutação c.57 +1 G> A no GHRHR na longevidade. Demonstrou-se um fenótipo
diferenteda estatura na vida adulta a na senescência.
44
6 DISCUSSÃO
Enquanto as maiorias das doenças autossômicas recessivas manifestam
fenótipo apenas quando ambos os alelos são defeituosos, existem muitos exemplos de
fenótipo parcial causadas por um defeito de um único alelo ("efeito de dosagem de
gene"). Exemplos incluem, entre outros, as mutações nos genes que codificam o
receptor de sensor do cálcio (BROWN, 2007), do receptor do peptídeo atrial
natriurético (OLNEY et al., 2006), e do receptor de melanocortina tipo 4 (FAROOQI
et al., 2003).
Já foi relatado que indivíduos adultos que transportam um único alelo mutante
para o GHRHR têm baixo peso corporal devido a uma combinação de massa
muscular reduzida e uma tendência à redução da massa gorda (kg), mas apresentam
estatura adulta normal (PEREIRA et al., 2007).
Os presentes dados mostram um fenótipo diferente de altura na idade adulta e
senescência, durante o qual os indivíduos MUT/N são mais baixos do que os
controles pareados por idade. Esta descoberta sugere que fatores genéticos podem
contribuir para a perda de estatura com o envelhecimento, um fenômeno associado à
sarcopenia, osteoporose e fragilidade, condições que são muito prevalentes e
associados com os altos custos dos cuidados de saúde (GIOVANNINI et al., 2008).
Portanto, a compreensão dos mecanismos de perda de altura em idosos é muito
relevante em termos de saúde pública.
A redução da altura dos indivíduos MUT/N idosos pode ser mediada por
alterações em dois fatores interrelacionados, a composição corporal e a DMO.
Recentemente, mostramos que os indivíduos MUT/MUT abaixo (EPITÁCIO-
PEREIRA et al., 2013) e acima de 60 anos de idade (SOUZA et al., 2013) apresentam
DMO volumétrica, corrigida para o tamanho das vertebras e com o tamanho do fêmur
normal. Por outro lado, os indivíduos idosos com DIGH têm um número inferior de
fraturas vertebrais do que indivíduos homozigotos normais, indicando um efeito
benéfico sobre o fenótipo ósseo nos indivíduos MUT/MUT durante o
envelhecimento.
45
Uma possível explicação é que esses indivíduos têm ossos bem adaptados à
redução da massa muscular e força. A teoria mecanostática propõe que ossos se
adaptam a força para manter a tensão das cargas fisiológicas exercidas pelo músculo
próximo ao ponto de ação, dependendo da força necessária para suportar o estresse
causado por cargas fisiológicas a um nível próximo de um ponto de ajuste, levando a
uma relação entre a resistência óssea e, força muscular e o tamanho do osso
(SCHOENAU, 2007). Assim, os indivíduos afetados MUT/MUT, que vivem com GH
e IGF-I sérico muito baixo, podem ser bem adaptados ao tamanho do seu corpo,
deixando seus ossos adaptados ao seu tamanho e forças de carga ao longo da vida
(SOUZA et al., 2013).
Nossa hipótese é que os indivíduos MUT/N se comportam como deficiência
de GH de inicio na idade adulta, porque, tendo altura adulta normal e dimensões
ósseas normais, com a redução do eixo GH-IGF-I com a idade exibem músculos mais
fracos e declínio da função neuromusculoesquelética consequentemente maior
redução estatural. Futuros estudos serão necessários para confirmação destes dados.
A redução da altura encontrada no grupo jovem, 2,35 centímetros (não
significativo) e no grupo de idosos 4,16 centímetros (p = 0,02) foi semelhante ao
encontrado em duas coortes independentes na Escandinavia (Suécia e Finlândia) com
haplótipos GHRHR peculiares (1,2 - 3,8 cm) (JOHANSSON et al., 2009). Estes
indivíduos tinham variação da idade entre 15 e 87 anos, e a estratificação etária não
foi fornecida. É possível que eles tivessem encontrado uma diferença mais acentuada
se tivessem focado em indivíduos com idade maior que 60 anos.
A sinalização reduzida no eixo GH/IGF-I retarda o envelhecimento e o
aumento da longevidade em diferentes modelos animais, e muito recentemente, foi
relatado que ratos que envelhecem lentamente com knockout no gene do receptor de
hormônio de crescimento (GHR-KO) estão protegidos contra indução da fragilidade
neuromusculoesquelética induzida pela idade (ARUM et al., 2013), um achado
similar aos nossos indivíduos MUT/MUT com a mutação c.57 +1 G> A no GHRHR
(SOUZA et al., 2013; AGUIAR-OLIVEIRA et al., 2010).
No entanto, os indivíduos MUT/N parecem ser mais propensos a
consequencias incapacitantes do envelhecimento do que os indivíduos N/N, talvez
devido ao aparente agravamento da diminuição fisiológica do eixo GH/IGF-I, em
pessoas com estatura normal na idade adulta. Embora as evidências clínicas
46
disponíveis não recomendem o uso de terapia de GH recombinante como
antienvelhecimento, em muitos estudos sugerem o uso potencial da terapia de GH no
tratamento da sarcopenia e fragilidade em idosos (BARTKE, 2009; SCHOENAU,
2007). É possível que os indivíduos MUT/N possam se beneficiar desta terapia.
Por outro lado, o comportamento da pressão arterial foi semelhante em ambos
os grupos de jovens e idosos, com o aumento esperado na pressão sanguínea com o
envelhecimento em ambos os grupos, nos individuos MUT/N e nos N/N. O padrão de
pressão sanguínea normal, combinada com a função de células beta normal, e
aumento da sensibilidade à insulina (OLIVEIRA, et al., 2012) podem contribuir para
a longevidade normal dos indivíduos MUT/N. Não encontramos diferenças entre os
grupos MUT/N e N/N em nenhum dos grupos etários, na frequencia de fatores que
poderiam levar a maior redução estatural no idoso, como tabagismo, alcoolismo e
diabetes mellitus, todos autoreferenciados. A frequencia auto referida de diabetes no
grupo idoso normal (15%) foi similar a dados brasileiros de 60 a 69 anos (MALERBI
et al., 1992). Neste trabalho, infelizmente não realizamos a glicemia capilar.
Assim, a avaliação de indivíduos idosos MUT/N não inclui a extensão da
vida, mas a melhoria da sua qualidade de vida, se a redução da altura, de fato, puder
antecipar a sarcopenia e fragilidade do idoso. No futuro, um painel de outros
marcadores genéticos, incluindo haplótipos GHRHR ou mutações, pode ser útil para
estabelecer medidas de prevenção ou tratamenento de tais condições.
Uma limitação do nosso trabalho é que não avaliamos o estágio puberal,
lactação e idade da menopausa em mulheres. Nos indivíduos MUT/MUT com a
DIGH de Itabaianinha, a puberdade é atrasada, o início do climatério é precoce, o
número de gestações é diminuído e o período de lactação é normal (MENEZES et al.,
2008). Homens MUT/MUT apresentam aumento da testosterona total devido ao
aumento da proteína transportadora dos hormônios sexuais (SHBG) com testosterona
livre normal (MENEZES et al., 2013). O papel destes fatores na perda estatural dos
indivíduos MUT/N idosos merecem novos estudos. Uma limitação adicional é que
não utilizamos no questionário uso de drogas que possam interferir no metabolismo
ósseo, conforme foi utilizado na avaliação da DMO dos indivíduos MUT/MUT
jovens (EPITÁCIO-PEREIRA et al., 2013) e idosos (SOUZA et al., 2013) onde foi
demonstrado em ambos os grupos uma DMO volumétrica, corrigida pelo tamanho
ósseo, normal.
47
Finalmente, a redução estatural encontrada nos indivíduos idosos MUT/N
demonstra que a expressão do fenótipo de uma mutação no gene do GHRHR pode ser
manifesta mais obviamente nos estágios tardios da vida, o que pode traduzir a
redução da atividade do eixo GH-IGF-I com o envelhecimento. A diminuição da
massa muscular presente nos adultos jovens MUT/N, agravada pelo envelhecimento
pode contribuir para esta diminuição da estatura.
48
7 CONCLUSÕES
A heterozigose (MUT/N) para a mutação c.57+1G>A no GHRHR:
Foi associada a:
o redução da estatura em indivíduos idosos.
o redução do peso em indivíduos adultos jovens.
Não foi associada:
o com efeito da idade no IMC.
o com alterações da pressão arterial em nenhum dos grupos
etários.
o com alterações na longevidade.
49
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57
ANEXO 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO
SERVIÇO DE ENDOCRINOLOGIA
CAMPUS DA SAÚDE PROF. JOÃO CARDOSO NASCIMENTO JR
Rua Cláudio Batista S/N – Bairro Sanatório
CEP: 49060-100 Aracaju -SE – Fone: (79) 2105-1805 Fone/Fax: (79) 3215-2076
Projeto: “Consequências de deficiência isolada e vitalícia do GH”
Número da Ordem de Compra JHU: 8410-62955-7
Ofício nº 086-JHU Aracaju, 20 de agosto
de 2008.
Excelentíssima Senhora Juíza,
Após os contatos com Excelentíssimo Senhor Presidente do Tribunal Regional
Eleitoral de Sergipe, Des. Cláudio Dinart Deda Chagas, e suas Assessorias Jurídicas e
de Comunicação, estamos apresentando a Vossa Excelência o delineamento da
pesquisa “Longevidade nos indivíduos heterozigotos para a mutação de Itabaianinha”,
cujo objetivo é verificar se indivíduos de estatura normal de Itabaianinha, que
apresentam uma herança para o gene do nanismo (heterozigoto) são mais longevos
dos que não apresentam nenhuma herança para o nanismo:
1- Será montada uma tenda (barraca) na praça central de Itabaianinha próximo ao
Supermercado G. Barbosa que será identificada com faixa da Universidade
Federal de Sergipe. Nesta barraca, uma equipe de aproximadamente 21
pessoas, formando 7 grupos de 3 pessoas, identificadas com camisas da UFS,
acolherá os indivíduos interessados em participar da pesquisa, que são
indivíduos de estatura normal com idade entre 20 a 40 anos e indivíduos
maiores que 60 anos, num total aproximado de 700 indivíduos;
2- Cada grupo de três participantes irá medir altura, pesar, medir a pressão
arterial e colher um esfregaço bucal de 100 indivíduos estimado em um tempo
de 3 minutos para cada pessoa. O esfregaço bucal é indolor, será para verificar
quantas pessoas de estatura normal do grupo apresentam uma herança
(heterozigoto) ou nenhuma herança para a mutação que causa o nanismo em
Itabaianinha;
3- Será feita uma divulgação por rádio e carro de som pelas ruas da cidade,
bastante intensa, para explicar os objetivos da pesquisa e garantir o número de
pessoas necessárias para a mesma.
Caso Vossa Excelência concorde com esta pesquisa, solicitamos a fineza de
enviar por fax e correio a declaração correspondente para ser anexada ao processo de
submissão da pesquisa ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFS.
Aguardamos a autorização para que possamos tomar as providências da
logística, haja vista a proximidade das eleições.
Atenciosamente,
Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira
Gestor do Projeto
Ex.ma Srª
Juíza Aline Cândido Costa
Juíza da 10ª Zona Eleitoral
58
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO
Local da pesquisa:
Universidade Federal de Sergipe,
Bairro Sanatório, S/N
Aracaju, SE/ Brasil-49.060-100
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título de projeto: Conseqüências de deficiência de hormônio de crescimento isolada
vitalícia parte II (Termo de Consentimento dos Heterozigotos/Normais)
Número da Aplicação: NA_00018533
Patrocinador: Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos da América
Investigador principal: Roberto Salvatori, MD.
Data: 26 de junho de 2008
1. O que você deve saber sobre este estudo:
Estão lhe pedindo que participe de um projeto de pesquisa.
Este termo de consentimento explica o projeto de pesquisa e sua participação
no projeto.
Por favor, leia cuidadosamente e leve o tempo que você achar necessário.
Por favor, faça perguntas qualquer hora a por qualquer coisa que você não
entenda.
Você é um voluntário. Se você participar do estudo, você pode mudar de
idéia depois. Você pode desistir a qualquer momento. Não haverá nenhuma
penalidade ou perda de benefícios se você decidir deixar o estudo.
Durante o estudo, nós lhe diremos qualquer informação nova que viermos a
aprender e que poderia alterar seu desejo de continuar no estudo.
Durante este estudo, você não terá acesso a certas informações médicas e
resultados de teste coletados para propósitos de estudo. Se uma emergência
acontecer enquanto você estiver no estudo, as informações médicas precisas
ou necessárias para seu tratamento serão disponíveis para seu médico.
Identificação do Paciente
59
Quando o estudo for completado, todas as informações em seu registro
médico estarão disponíveis para você.
2. Por que esta pesquisa está sendo realizada?
Esta pesquisa está sendo feita para determinar as conseqüências que a falta de
hormônio de crescimento por muitos anos pode causar além da baixa estatura. Além
disso, nós desejamos estudar se as pessoas de estatura normal, que portam o gene que
causa baixa estatura em Itabaianinha têm alterações no corpo delas, comparados com
pessoas que não portam este gene. Pessoas com baixa estatura devido à deficiência
de hormônio de crescimento, seus parentes de estatura normal, e as pessoas normais
que residem em
Itabaianinha e municípios vizinhos podem se unir a este estudo. Um total de cerca de
930 pessoas entrará no estudo, embora lhes possam participar de diferentes testes.
3. O que acontecerá se você participar deste estudo?
Se você concordar em participar deste estudo, nós lhe pediremos que faça uma ou
mais das seguintes coisas abaixo: (somente as indicadas e não aquelas cruzadas):
Para alguns voluntários só será pedido responder algumas perguntas sobre o estado de
saúde deles e se eles têm parentesco com uns anões. Você será medido e será pesado,
e se for selecionado para a pesquisa, nós coletaremos algumas células dentro de sua
boca esfregando um cotonete de algodão suavemente na sua bochecha por
aproximadamente 30 segundos. Isto nos permitirá obter seu DNA (material genético)
para determinar se você pode transmitir a sua descendência, o gene alterado que causa
a baixa estatura nos anões de Itabaianinha.
Baseado no resultado do teste genético nós podemos lhe pedir que leve adiante uma
segunda fase do estudo. Nós lhe pediremos que seja examinado em Itabaianinha ou na
Universidade Federal de Sergipe em Aracaju. Nós organizaremos um transporte de
carro à noite antes da prova ou mesmo no dia da prova para participantes serem
deslocados para Aracaju, e transporte de retorno ao término de teste. Se você passar a
noite, você ficará sem nenhum custo no Hospital Universitário da Universidade
Federal de Sergipe. Nós lhe pediremos que faça os testes indicados (nós colocaremos
um “x” nos testes você não será solicitado para fazer):
( )Será medida sua pressão sanguínea, estatura, dobras de pele
( )Colher seis colheres de chá de sangue
( )Nós lhe perguntaremos se você poderá estar grávida. Se você responder
que sim será pedido para você colher uma amostra de sua urina, onde
realizaremos um teste para saber se você está grávida
( )Medir a força de seus ossos e a distribuição da gordura em seu corpo por
um teste chamado “densitometria óssea por absorção de raios X de dupla
energia (DXA)”
( )Realize um teste para medir a quantidade de hormônio de crescimento que
você produz durante a noite enquanto você dorme. Você será transportado
para o Hospital Universitário em Aracaju, você receberá um jantar grátis.
60
Depois do jantar, uma veia será puncionada com um escalpe e uma agulha
será colocada no antebraço. Será tirado então sangue, à noite com intervalo de
vinte minutos a partir de 22:00 horas até às 8:00 horas da manhã seguinte,
enquanto você dorme em uma cama de hospital. Um máximo de 4 colheres de
sopa de sangue será coletado.
( )Realize um teste de Tolerância a glicose para medir o aumento no sangue
do nível de um hormônio chamado insulina, depois que nós injetarmos açúcar
em sua veia. De manhã cedo, você será transportado para o Hospital
Universitário em Aracaju. Você será solicitado para não comer nada antes da
meia-noite, até o fim do teste. Serão puncionadas duas veias e colocados dois
escalpes onde serão colocadas duas agulhas em seus antebraços. A metade de
colher de chá de sangue será tirada novamente através do escalpe nos tempos
15, 10 e 1 minuto antes da administração do açúcar, e 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90,
120 e 180 minutos depois da administração do açúcar. O total de sangue
puncionado não será mais que 2 colheres de sopa. O único efeito negativo que
a água e açúcar podem causar é um aumento ou diminuição dos níveis de
açúcar no sangue.
( )Voce realizará uma ultrasonografia abdominal total para verificar o nível
de gordura na parede abdominal, através de um procedimento indolor próximo
ao seu umbigo.
Uma parte de seu sangue será armazenada para possível repetição das provas
ou estudos futuros.
Você só receberá os resultados do estudo se nós descobrirmos qualquer
problema médico que pode precisar de tratamento.
Quanto tempo você estará no estudo? Você estará neste estudo por um tempo
máximo de 24 horas.
4. Quais os riscos ou desconfortos do estudo?
A coleta do material bucal, o exame médico, medida das dobras da pele,
pressão sanguínea e a ultra-sonografia não levam a nenhum risco.
A coleta de sangue, só leva ao risco de um pequeno sangramento, mas este
procedimento será realizado por pessoal treinado, com material estéril para
minimizar riscos.
Se for realizado o DXA (Densitometria óssea), este estudo de pesquisa
incluirá exposição à radiação de radiografias ou raios gama. Esta exposição
de radiação só é para propósitos de pesquisa e não é parte de seu tratamento
médico. Radiografias e raios gama podem danificar células, mas em baixas
doses, o corpo pode normalmente reverter este quadro. A exposição de
radiação que você entrará em contato neste estudo de pesquisa é 0.02 rem (um
rem é uma unidade de radiação absorvida). Isto é menos que o 0.3 rem que a
pessoa comum nos Estados Unidos obtém cada ano de fontes naturais como o
sol, espaço exterior, ar, comida, e terra. O risco da exposição de radiação neste
estudo de pesquisa é muito pequeno. A exposição de radiação descrita aqui é
somente a que você obterá neste estudo de pesquisa. Não inclui nenhuma
exposição que você pode ter recebido ou receberá de outros testes médicos
fora deste estudo que é uma parte de seu tratamento médico. Se você tem
61
perguntas sobre o total de radiação que você estará recebendo, você deverá
perguntar para seu médico.
Se você realizar o teste de tolerância de glicose, há um risco pequeno que o
açúcar em seu sangue possa ficar muito baixo. Se isto acontecer, você pode
notar que as batidas do seu coração se tornarão mais rápida, você poderá
começar a suar muito e perder um pouco a concentração. Se isto acontecer,
você deverá nos informar imediatamente, e nós administraremos açúcar
(Glicose) em sua veia, e o teste será parado, voltando tudo ao normal.
Você pode se sentir cansado ou entediado enquanto nós estivermos lhe
fazendo perguntas ou você estiver completando questionários. Você não tem
que responder qualquer pergunta você não queira responder.
Pode haver efeitos colaterais e desconfortos que ainda não são conhecidos.
Durante este estudo, você será comunicado sobre qualquer fato novo que
poderia afetar a sua continuidade neste estudo.
5. Há riscos relacionados à gravidez?
Mulheres grávidas não podem fazer parte neste estudo. Se você for mulher e
desconfie que pode estar grávida, você tem que ter um teste de gravidez. Os
resultados deste teste deve ser negativos para que você continue no estudo. Se você
ficar grávida (ou tiver suspeita de gravidez) antes do estudo ser completado, você
tem que informar ao médico responsável pelo estudo. Porém, esta pesquisa pode
lesar um embrião ou feto de modo que nós não sabemos atualmente.
6. Há benefícios de estar no estudo?
Não há nenhum benefício direto a você de estar neste estudo.
Voce poderá ajudar a outros no futuro.
7. Quais as opções se você não quiser fazer parte neste estudo?
Você é livre para decidir se você quer participar deste estudo. Em nenhum momento
será negado cuidado médico futuro a você porque se recusou a entrar neste estudo.
Você não tem que participar deste estudo. Se você não participar, seu atendimento na
Johns Hopkins University ou Universidade Federal de Sergipe não será afetado.
8. Você teria alguma despesa para participar deste estudo?
Não.
9. Você será pago para participar deste estudo?
Você não será pago para participar deste estudo. Se lhe pedirem para ir à Aracaju,
serão providenciados transporte e alimentação gratuitamente. Voce poderá receber
diária pelo dia de trabalho perdido.
10. Você pode deixar o estudo mais cedo?
Você pode concordar estar no estudo agora e depois mudar de idéia.
Se você desejar parar, por favor, nos fale imediatamente.
62
Você deixando o estudo mais cedo não terá seu tratamento médico
interrompido.
Se você deixar o estudo mais cedo, o Johns Hopkins pode usar ou distribuir a
informação sobre sua saúde que já tem mesmo que você não dê seguimento ao
estudo.
11. O que nos levaria a retirá-lo mais cedo do estudo?
Você pode ser levado para sair do estudo se:
Ficar no estudo for prejudicial a sua saúde.
Você precisa de tratamento não permitido no estudo.
Você não seguir as instruções.
Você ficar grávida.
O estudo for cancelado.
Pode haver outras razões que nós não sabemos neste momento para retirá-lo
deste estudo.
12. Como sua privacidade será protegida?
Algumas informações de sua saúde coletadas neste estudo serão enviadas para os
Estados Unidos.
Há uma lei nos Estados Unidos que protegem esta informação. A lei diz que
informações médicas sobre você só podem ser usadas seguindo regras rígidas.
Estamos lhe pedindo que nos deixe usar e distribuir detalhes sobre sua saúde como
permitido por esta lei norte americana. Você não tem que concordar em permitir que
façamos isto. Se você não estiver de acordo, você não entrará neste estudo. Se você
concordar em nos deixar usar e distribuir informação sobre sua saúde você poderá
mudar de ideia a qualquer momento. Caso você mude de ideia, por favor, nos fale e
nos dê documento por escrito dizendo que mudou de ideia quanto a participar do
estudo. Desta data em diante nós não coletaremos mais novas informações sobre sua
saúde. Seu cancelamento não afetará as informações já coletadas anteriormente neste
estudo.
13. O estudo exigirá que outros provedores de assistência médica
compartilhem de suas informações de saúde com os pesquisadores deste estudo?
Como parte deste estudo, os pesquisadores podem pedir para ver seus registros
médicos de outros provedores de assistência médica. Nós pediremos para que este
outro provedor de assistência médica nos forneça qualquer informação sobre seu
estado de saúde e cuidados médicos.
14. Que custos de tratamento serão pagos se você ficar doente neste estudo?
O governo federal e Johns Hopkins não têm programas para pagar se você for lesado
ou tenha outras reações ruins por estar no estudo. Porém, os cuidados médicos no
Johns Hopkins e a Universidade Federal de Sergipe estarão abertos a você como é a
todas as pessoas doentes ou feridas.
63
- Se você tem plano médico de saúde: Serão faturados os custos para qualquer
tratamento ou cuidado hospitalar que você receba como o resultado de um dano
relacionado ao estudo. Qualquer valor que não for coberto pelo seu plano de saúde
será faturado em seu nome.
- Se você não tem plano médico de saúde: Será faturado em seu nome qualquer custo
para qualquer tratamento ou cuidado hospitalar que você receba como o resultado de
um dano relacionado ao estudo.
15. Que outras coisas você deveria saber sobre este estudo de pesquisa?
A) O que é o Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) e como o protege?
O CEP do Johns Hopkins Medicine e da Universidade Federal de Sergipe são
compostos de :
Médicos
Enfermeiras
Conselho de Ética
Não cientistas
E pessoas da comunidade local.
O CEP revisa estudos de pesquisa em seres humanos. Protege os direitos e bem-estar
das pessoas que participam nesses estudos. Você pode contatar o CEP se você tiver
perguntas sobre seus direitos como participante ou se você pensa que você não foi
tratado devidamente. O número do telefone do CEP da Universidade Federal de
Sergipe é (079) 2105-1805, falar com Maria do Carmo Queiroz Gouveia. Você
também pode ligar para este número para retirar outras dúvidas sobre a pesquisa.
B. O que você faz se tiver perguntas sobre o estudo?
Ligue para o investigador, Dr. Manuel H. Aguiar-Oliveira no número 079 - 3227-
3026. Se você não puder localizar o investigador principal pode falar com outra
pessoa, ligue para o Comitê de Ética em Pesquisa no Hospital Universitário da
Universidade Federal de Sergipe pelo telefone (79) 2105-1805.
C. O que deveria fazer você se você se sentir doente como resultado de estar
neste estudo?
Ligue para Dr. Manuel H. Aguiar-Oliveira, pelo telefone (079) 3227-3026 ou pelo
celular (79) 8803-9726, se você tiver um problema médico urgente relacionado à sua
participação neste estudo.
Ligue para o investigador local, Dr. Dr. Manuel Aguiar-Oliveira, ou telefone para
(079) 3227-3026 ou o celular (79) 8826.6335 se você pensa que você está doente por
causa deste estudo. O tratamento médico na Universidade Federal de Sergipe está
aberto a você como a qualquer pessoa doente.
D. O que acontece a Dados, Tecidos, Amostras de Sangue que são coletados no
estudo?
64
A Universidade Johns Hopkins e a Universidade Federal de Sergipe são dedicadas à
descoberta das causas e curas das doenças. As informações, tecidos, amostras de
sangue coletadas de seu corpo durante este estudo são importantes para o mesmo e
para pesquisas futuras.
16. O que significa sua assinatura neste termo de consentimento?
Sua assinatura neste termo significa que:
Você entende a informação contida neste termo de consentimento
Você aceita as condições deste termo de consentimento
Você concorda em participar do estudo
Você não desistirá de nenhum direito legal por assinar este termo de
consentimento.
NÓS LHE DAREMOS UMA CÓPIA DESTE TERMO DE CONSENTIMENTO
ASSINADA E DATADA.
Este Termo de Consentimento foi aprovado em: 15/07/2008 até 14/07/2009.
Não assine depois da data de vencimento de: 14/07/2009.
PARA ADULTOS CAPAZES DE DAR CONSENTIMENTO:
_______________________________________________________________
Assinatura do Participante Data
PARA ADULTOS NÃO CAPAZES DE DAR CONSENTIMENTO:
Assinatura do Representante/guardião/cuidador de saúde Data
ASSINATURA(S):
_______________________________________________________________
Assinatura de Pessoa que Obtém o Termo de Consentimento Data
(Investigador pó pessoas designada pelo CEP)
_______________________________________________________________
Assinatura de Testemunha para Consentir Procedimentos Data
NOTA: UMA CÓPIA DO TERMO DE CONSENTIMENTO ASSINADA DEVE
SER MANTIDA PELO INVESTIGADOR PRINCIPAL, UMA CÓPIA DEVE SER
DADA AO PACIENTE E SE APROPRIADO, UMA CÓPIA DO TERMO DE
65
CONSENTIMENTO PODE SER COLOCADA NO PRONTUÁRIO MÉDICO DO
PARTICIPANTE.
PARA USO DE ESCRITÓRIO SÓ: ESTUDO APROVADO PARA MATRÍCULA DE: ( x ) Só Adultos ( ) Adultos e Crianças ( ) Só Crianças
66
ANEXO 3
Entrevista
Nº ______________
Nome: ____________________________________________________________
Endereço:
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
Data de Nascimento: _______ / _______ / _____________
Idade: __________ anos
Parentesco com Anão:
Não ( ) Sim ( ) Qual: _____________________________
Fumante: Não ( ) Sim ( ) Quantos cigarros por dia: ________________
Diabético: Não ( ) Sim ( ) Não sabe: ( )
Indicadores do Consumo de Álcool:
QUANTIDADE (SEMANAL) CLASSIFICAÇÃO MARCAR
Nada Não Consome
Até 3 doses (destilada) ou garrafas
(fermentadas) Consumo leve
De 3 a 7 doses (destilada) ou garrafas
(fermentadas)
Consumo
moderado
Acima de 7 doses (destilada) ou garrafas
(fermentadas) Consumo elevado
Peso: 1._________ Kg 2._________ Kg 3._________ Kg
Altura: 1._________cm 2._________cm 3._________cm
Pressão Arterial: 1.______ X ______mm/Hg 2.______ X ______mm/Hg
3.______ X ______mm/Hg
Coleta do Swab Bucal: Sim ( ) Não ( ) Porque:_________________________
Entrevistado por: ____________________________
Equipe: ____________________________________
67
ANEXO 4
Parecer do CEP e CONEP
PARECER CONSUBSTANCIADO – CEP 043/2004
Título: Consequências da deficiência isolada e vitalícia do hormônio o crescimento.
Finalidade: Projeto em parceria UFS-Jonh Hopkins. Pesquisadores responsáveis: Prof Dr Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira
(graduado em Medicina, Mestre e Doutor em Clínica Médica/Endocrinolog<a) e Prof Dr Roberto Salvatori, (graduado em Medicina, especialista em Medicina Interna e Endocrinologia, Diabete e Metabolismo, pós-graduado pela Cornell University Medicai College e pela Jonh Hopkins University, na qual é Professor Assistente).
Data de entrada no CEP: 29/04/04. Data de análise: 07/05/04.
1) Folha de Rosto: adequadamente preenchida. 2) Projeto: o Projeto de Pesquisa apresentado apresenta-se adequado nos seus
tópicos: Introdução, Objetivos, Revisão Bibliográfica, Metodologia e Referências Bibliográficas.
3) Consta do projeto a Previsão Orçamentaria, bem como o patrocinador (Jonh Hopkins University).
4) Consta Cronograma de Execução, segundo o qual a coleta de dados deve ter início no segundo semestre/2004.
5) Consta detalhado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, de acordo com a Resolução CNS 196/96, bem como a aprovação pelo CEP da instituição parceira.
6) Todos os documentos originariamente em inglês foram traduzidos para a
Língua Portuguesa.
Conclusão: consideramos que o projeto acima deva ser aprovado por este CEP.
Rosana Cipolotti
68
MINISTÉRIO DA SAÚDE Conselho Nacional de Saúde Comissão Nacional de Ética em Pesquisa - CONEP
PARECER N° 1361/2004
Registro CONEP : 10212 (Este nu deve ser citado nas correspondências referentes a este projeto)
Registro CEP: 043/2004 Processo n° 25000.064789/2004-90
Projeto de Pesquisa: "Consequências da deficiência isolada e vitalícia do hormônio
do crescimento". Pesquisador Responsável: Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira. Instituição: Universidade Federal de Sergipe/SE
Área Temática Especial: Genética humana c/c cooperação estrangeira.
Ao se proceder à análise das respostas ao Parecer CONEP n° 112/2004, relativo
ao projeto em questão, considerou-se que:
a- Foram atendidas as solicitações do referido parecer. 1
b- O projeto preenche os requisitos fundamentais das Resoluções CNS 1S6/96 e
292/99, sobre Diretrizes. e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo
Seres Humanos:
c- O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição
supracitada.
Diante do exposto, a Comissão Nacional de Ética em Pesquisa - CONEP, de acordo
com as atribuições definidas na Resolução CNS 196/96, manifesta-se pela
aprovação do projeto de pesquisa proposto.
Situação: Projeto aprovado .
Brasília, 15 de julho de 2004.
WILLIAM SAAD HOSSNE
Coordenador da CONEP/CNS/MS
69
APÊNDICE 1
70
71
72
73
74
75
76
77
APÊNDICE 2
From: [email protected]
[mailto:[email protected]] On Behalf Of
Endocrine (ENDO)
Sent: Wednesday, January 22, 2014 10:23 AM
To: Roberto Salvatori
Subject: ENDO - Submission Confirmation
Dear Dr. Roberto Salvatori,
Thank you for submitting your manuscript, Older individuals heterozygous for a null
GHRH receptor gene mutation loose more height that normal subjects. Contribution
to frailty?, to Endocrine.
During the review process, you can keep track of the status of your manuscript by
accessing the following web site:
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Should you require any further assistance please feel free to e-mail the Editorial
Office by clicking on "Contact Us" in the menu bar at the top of the screen.
With kind regards,
Springer Journal‟s Editorial Office
Endocrine
Now that your article will undergo the editorial and peer review process, it is the right
time to think about publishing your article as open access. With open access your
article will become freely available to anyone worldwide and you will easily comply
with open access mandates. Springer's open access offering for this journal is called
Open Choice (find more information on www.springer.com/openchoice). Once your
article is accepted, you will be offered the option to publish through open access. So
you might want to talk to your institution and funder now to see how payment could
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Although for now you don't have to do anything, we would like to let you know about
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78
Older individuals heterozygous for a null GHRH receptor gene mutation loose
more height that normal subjects. Contribution to frailty?
Rossana M. C. Pereira, Roberto Salvatori, Carla R. P. Oliveira, Anita H. O. Souza,
Elenilde G. Santos, Viviane C. Campos, Eugênia H. O. Valença, Francielle T. de
Oliveira, Luiz A. Oliveira-Neto, Miburge B. Gois-Junior, Francisco A. Pereira and
Manuel H. Aguiar-Oliveira.
Department of Medicine, Federal University of Sergipe (R.M.C.P.,C.R.P.O.,
A.H.O.S., E.G.S., V.C.C., E.H.O.V., F.T.O., L.A.O.-N., M.B.G.-J., F.A.P.,M.H.A.-
O.), Aracaju, Sergipe, Brazil 49060-100; and the Division of Endocrinology,
Diabetes and Metabolism, Department of Medicine (R.S), The Johns Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, Maryland 21287;
Corresponding author:
Roberto Salvatori, MD,
Division of Endocrinology,
Johns Hopkins University School of Medicine,
1830 East Monument street suite #333,
Baltimore, MD 21287
Fax (410) 955-3921 Phone (410) 955-3921
e-mail: [email protected]
Short title: Height in old heterozygous individuals
Key words: GHRH receptor, mutation, heterozygosis, frailty
Word count: 1510
79
Abstract
Purpose: When compared to normal subjects, adult individuals heterozygous for the
c.57+1G>A mutation in GHRH receptor gene (GHRHR) (MUT/N) have similar
height, but reduced weight and body mass index (BMI). However, only 10 % of the
previously studied individuals were older than 60 years of age. We study here
whether older MUT/N have an additional phenotype.
Methods: In a cross sectional study we studied height, weight, systolic and diastolic
blood pressure and BMI in two groups (young, 20-40 years of age) and old (60-80
years) of MUT/N individuals, and compared to a large number of individuals of
normal genotype (N/N). In order to compare both genders, data were expressed as
standard deviation scores (SDS).
Results: SDS weight was lower [-0.13 (1.4) and -0.56 (1.8), p=0.03], and BMI had a
trend toward reduction [0.08 (1.40) and 0.33 (1.4), p=0.060] in young MUT/N in
comparison to young N/N. SDS height was lower in older MUT/N individual vs. N/N
[-2.79 (1.1) and -2.37(1.0), p=0.04], corresponding to a reduction of 4.16 cm.
Conclusions: These data confirm reduction in weight and BMI in young and show
reduced stature in older MUT/N subjects, indicating different effects of heterozygosis
through the ages. The reduction of muscle mass already present at young age,
aggravated by aging may contribute to this reduction in height. Heterozygous
GHRHR mutations may be a factor contributing to frailty in elderly.
80
Introduction
Aging is associated with a progressive decline in muscle mass (MM) and
function, resulting in loss of autonomy and decreased morbidity. A better
understanding of the causes of MM decline and strategies to prevent it represents a
public health priority. The correlation between the age-dependent decline of growth
hormone (GH) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) levels and changes in body
composition, bone status and physical function have suggested that the GH/IGF-I axis
decline may promote frailty by contributing to the reduction of MM and bone
mineral density (BMD) [1, 2, 3]. Aging-related height reduction is caused by
flattening of vertebral disks and bodies, and the accentuation of sagittal curvature of
the spinal column associated to the reduction of both MM and BMD. Between 60 and
80 years of age, height reduction is nearly two cm per decade 4. This predicts
disability, a late outcome of the frailty syndrome of the elderly 5.
Homozygous GHRHR mutations are an important genetic cause of GH
deficiency (GHD) resulting in short stature 6. Haplotype GHRHR variations are also
important genetic factors for the height variation in normal populations 7.
The c.57+1G>A GHRHR mutation, found in Itabaianinha, Brazil, is the one
with the highest number of affected (MUT/MUT) individuals 8. The untreated
adults present severe short stature, increase in fat mass percentage, and marked
reduction in MM 9, but normal volumetric BMD both in individuals below 10 and
above 60 years of age 11.
While the consequences of bi-allelic GHRHR mutations are obvious, the
heterozygous carriers do not appear readily distinguishable from homozygous normal
(N/N) subjects. In a previous study, we have shown that MUT/N subjects have
reduced weight, body mass index (BMI) and MM, but their adult stature is not
significantly shorter than matched local controls 12. However, only 10 % of these
individuals were ≥60 years of age. We hypothesized that the reduction of MM can
worsen during senescence, leading to bone and postural changes and eventually
height reduction. The main objective of this work was to assess the stature of older
MUT/N individuals. Secondary aims were to evaluate the consequences of
heterozygosity in the aging on weight, BMI and blood pressure.
81
Subjects and Methods
A transversal study was carried out to compare height, body weight, BMI and,
in two groups of genotyped normal-appearing subjects, young (20 to 40 yrs) and old
(60 to 80 yrs) residing in Itabaianinha County, Sergipe Brazil, where the c.57+1G>A
GHRHR mutation is highly prevalent. Advertising by broadcast and loud speakers,
we invited people to volunteer on the day of the October 2008 municipal elections. A
total of 843 normal appearing subjects volunteered, 500 young (255 females, 51%)
and 343 old (164 females, 48%). They were all genotyped from buccal swabs as
previously described 13.
Height (cm) and body weight (kg) were measured with a portable stadiometer
and a portable scale. Body mass index (BMI) was calculated using the formula:
weight in kg/height m2. BMI was expressed in absolute values and standard deviation
scores (SDS), calculated using the British 1990 Growth Reference Data, by using the
site http://www.phsim.man.ac.uk/SDSCalculator/SDSCalculator.aspx.
Blood pressure was the mean value of three measurements after 10 min in
seated position.
Data are expressed in mean (SD). Student‟s t test was used to compare the
groups, and Fisher test was used to compare possible factors influencing the
phenotype in each group, namely alcoholism, smoking and self-reported diagnosis of
diabetes. Institutional Review Boards of both the Johns Hopkins University and the
Federal University of Sergipe approved the protocol, and all subjects provided written
informed consent.
82
Results
Results are shown in table 1. There was no difference in the prevalence of the
MUT/N genotype in the two groups: young 39/500 (7.8%) and older 24/343 (7.0%).
SDS height was lower in older MUT/N individuals vs. N/N [-2.79 (1.1) and -2.37
(1.0), p=0.04] corresponding to a height reduction of 4.16 cm (p = 0.02). There was
no difference in SDS height in young MUT/N [-1.4 (1.2) and -1.2 (1) vs. N/N],
corresponding to 2.35 cm. Weight SDS was lower in younger (p = 0.03) MUT/N
while difference in BMI did not reach statistical significance (p = 0.06). No
difference was found in prevalence of alcoholism, smoking and self-reported
diagnosis of diabetes between MUT/N and N/N in any age group.
83
Discussion
While most autosomal recessive disease manifest a phenotype only when both
alleles are defective, there are many examples of partial phenotype caused by a single
allele defect “(“gene dosage effect”). Examples, among others, include mutations in
genes encoding the calcium-sensing receptor 14, the natriuretic peptide receptor-B
15, and the melanocortin 4 receptor 16. Accordingly, we have previously reported
that adult subjects carrying a single mutated GHRHR allele have low body weight due
to a combination of reduced muscle mass and a trend toward a reduction in fat mass
(Kg), but normal adult stature 12.
Age-related height loss is a phenomenon associated with sarcopenia,
osteoporosis and frailty, conditions that are very prevalent and of high health care
cost 1. Therefore, understanding the mechanisms of height loss in the elderly is very
relevant in terms of public health. These data of different height phenotype in young
adulthood and senescence (when the MUT/N subjects appear shorter than controls)
provides evidence that genetic factors may contribute to age-related loss of stature.
The height reduction of elderly MUT/N can be mediated by changes in two
interrelated factors, body composition and bone strength. We recently reported that
both young 10 and old [11] GHD individual with bi-allelic GHRHR mutation have
normal volumetric BMD, and the older GHD subjects actually have a lower number
of vertebral fractures than in normal homozygous subjects, suggesting a beneficial on
bone phenotype during aging. A possible explanation is that the GHD individuals
have bones well adapted to their reduced muscle mass and strength. The mechanostat
theory proposes that bones adapt depending on the strength required to withstand the
stress caused by physiological loads at a level close to a set point, leading to a
relationship between bone strength, and muscle strength and bone size 17. Thus, the
short GHD individuals may be well adjusted to the size of their body, with bones that
throughout life are well adapted to their reduced loading forces 11. We do not have
data on GH secretion in MUT/N, but we hypothesize that the MUT/N old phenotype
resembles adult onset GH deficiency, who have an increased risk of fractures 18. In
this condition, subjects with normal adult height and bone dimensions, and with
decline in the GH/ IGF-I axis, may have weaker muscles and neuro-muscular
function decline. As they cannot revert into a smaller size, their body and habitual
84
loading forces are excessive for their weakened musculoskeletal system [19].
Obviously, further studies need to confirm this hypothesis.
The height reductions found in the young group, 2.35 cm (not significant) and
in the elderly group 4.16 cm (p = 0.02) are of a degree similar to that found in two
independent Scandinavian cohorts with specific GHRHR haplotypes (1.2 to 3.8 cm)
7. The subjects in that study were of broad age (between 15 and 87 years), and no
age stratification was provided. It is possible that a more marked difference would
have been found if they had focused on individuals > 60 yrs. As several families have
been reported with GHD due to compound heterozygosity for two distinct GHRHR
mutations [6], it is conceivable that these defective GHRHR alleles are rather
common in the general population. It is therefore conceivable that in the future a
panel of genetic markers, including GHRHR haplotypes or mutations, may be useful
to stratify risk of height loss or other aging- associated phenomena.
Reduced signaling in the GH/IGF-I slows down the aging and increased
longevity in different animal models, and very recently it was reported that the GH
receptor gene-disrupted (GHR-KO) mouse is protected from age-induced
neuromusculoskeletal frailty [20], a finding similar to our MUT/MUT individuals
11, 13. However, MUT/N individuals seem to be more prone to the consequences of
aging than N/N, possibly due to more marked worsening of the physiological
decrease of GH/IGF–I. Although present clinical evidence does not recommend the
use of recombinant GH therapy as anti-aging, some investigators have suggested a
potential utility of GH therapy in the treatment of sarcopenia and frailty in the elderly
[2, 21]. It is possible that older MUT/N individuals could benefit from this therapy.
Contrarily to stature, blood pressure was similar in both young and elderly
groups, with the expected increase in blood pressure with aging in both MUT/N and
N/N group. The normal blood pressure pattern, combined with normal beta cell
function and increased insulin sensitivity [22, 23] may contribute to the normal
longevity of MUT/N individuals [13].
In conclusion, the reduced height found in the elderly MUT/N shows that the
phenotypic expression of heterozygosity for a GHRHR mutation can be seen more
clearly in later stages of life, possibly reflecting the reduced activity of the GH-IGF-I
axis in aging. The decreased muscle mass already present in young MUT/N adults,
exacerbated by aging may contribute to this decrease in height.
85
Acknowledgements
We thank the Tribunal Electoral de Sergipe and the Catholic Roman and First
Baptist churches in Itabaianinha for allowing us to perform this work.
Ethical standards
Institutional Review Boards of both the Johns Hopkins University and the
Federal University of Sergipe approved the protocol. Written informed consent was
obtained from all subjects. Experiments comply with the current laws of Brazil and
USA.
Conflict of interest
The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived
as prejudicing the impartiality of the research reported.
86
References
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receptor (GHRHR) mutations, Prog Mol Biol Transl Sci. 88, 57-84 (2009)
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Valença EH, Araújo VP, Farias NT, Silveira DC, Vieira JG, Barreto-Filho JA
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deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 95, 693-698 (2010)
10. C.C. Epitácio-Pereira, G.M. Silva, R. Salvatori, J.A. Santana, F.A. Pereira, M.B.
Gois-Junior, A.V. Britto, C.R. Oliveira, A.H. Souza, E.G. Santos, V.C. Campos, R.M.
Pereira, E.H. Valença, R.A. Barbosa, M.I. Farias, F.J. de Paula, T.V. Ribeiro, M.C.
Oliveira, M.H. Aguiar-Oliveira et al. Isolated GH deficiency due to a GHRH receptor
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Pereira, F.A. de Paula, E.H.O. Valença, E.V. Melo, R.A.A. Barbosa, R.M.C. Pereira,
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due to a GH-releasing hormone receptor mutation has beneficial consequences on
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V.C. Campos, C.T. Farias, T.A. Vicente, M.B. Gois-Junior, J.L. Oliveira, C.
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mutation in the growth hormone-releasing hormone receptor gene does not influence
adult stature, but affects body composition. J Clin Endocrinol Metab. 92, 2353-2357
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13. M.H. Aguiar-Oliveira, F.T. Oliveira, R.M.C. Pereira, C.R. Oliveira, A. Blackford,
E.H. Valença, E.G. Santos, M.B. Gois-Junior, R.A. Meneguz-Moreno, V.P. Araujo,
L.A. Oliveira-Neto, R.P. Almeida, M.A. Santos, N.T. Farias, D.C. Silveira, G.W.
Cabral, F.R. Calazans, J.D. Seabra, T.F. Lopes, E.O. Rodrigues, L.A. Porto, I.P.
Oliveira, E.V. Melo, M. Martari, R. Salvatori, Longevity in untreated congenital
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hormones? Endocr Rev. 33, 314-377 (2012)
22. C.R.P. Oliveira, R. Salvatori, J.A. Barreto-Filho, I.E. Rocha, A. Mari, R.M.C.
Pereira, V.C. Campos, M. Menezes, E. Gomes, R.A. Meneguz-Moreno, V.P. Araújo,
N.T. Leite, A.C. Nascimento-Junior, M.I. Farias, T.A. Vicente, R.D. Araújo, E.V.
Melo, M.H. Aguiar-Oliveira, Insulin sensitivity and cell function in adults with
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deficiency does not protect from the development, Endocrine Conections. 2, 112-117,
(2013)
90
Table 1: Absolute and standard deviation score (SDS) of height, weight, body mass
index (BMI), absolute values of systolic blood pressure (SBP), diastolic blood
pressure (DBP), mean (standard deviation) and frequencies of categories of smoking,
alcohol use and diabetes by age and genotype.
Age 20 - 40 years Age 60 - 80 years
N/N
N=461
MUT/N
N=39
P value N/N
N=319
MUT/N
N=24
P value
Height (cm) 163.1 (8.7) 160.8 (9.4) 0.16 155.9 (8.7) 151.8 (8.0) 0.02
SDS Height -1.2 (1) -1.4 (1.2) 0.30 -2.4 (1) -2.8 (1.1) 0.04
Weight (Kg) 65.3 (12.8) 62.5 (20.3) 0.49 62.8 (12.4) 59.8 (13.0) 0.25
SDS Weight -0.1 (1.4) -0.5 (1.8) 0.03 -0.6 (1.6) -0.8 (1.9) 0.52
BMI (Kg/m2) 24.4 (4.4) 24.2 (6.5) 0.24 25.8 (4.5) 26.2 (6.1) 0.67
SDS BMI 0.3 (1.4) 0.1 (1.4) 0.06 0.7 (1.4) 0.7 (1.4) 0.96
SBP (mmHg) 122.5 (18) 122.2 (16.7) 0.75 143.9 (22.2) 147.1 (23.2) 0.65
DBP (mmHg) 79.6 (13.3) 78.5 (10.4) 0.49 84.8 (13.9) 86.5 (12.4) 0.46
Tobacco Use
no. (%)
Non-smoker 363 (84) 17 (85) 0.17 230 (74) 12 (75) 0.87
Current Smoker 66 (15) 2 (10) 68 (22) 4 (25)
Former Smoker 3 (1) 1 (5) 11 (4) 0 (0)
Unanswered 29 19 10 8
Alcohol Use –
no. (%)
No alcohol 188 (44) 13 (65) 0.15 233 (75) 11 (73) 0.15
Mild 136 (32) 2 (10) 55 (18) 1 (7)
Moderate 61 (14) 2 (10) 12 (4) 2 (13)
High 40 (9) 3 (15) 5 (2) 1 (7)
Former user 5 (1) 0 (0) 5 (2) 0 (0)
Unanswered 31 19 9 9
Diabetes –
no. (%)
Not diabetic 441 (99) 34 (100) > 0.99 262 (85) 23 (96) 0.23
Diabetic 5 (1) 0 (0) 48 (15) 1 (4)
Unanswered 15 5 9 0
91
APÊNDICE 3
92
93
94
95
96
97
APÊNCICE 4
98
99
100
101
102
