UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

NAIANNE REZENDE GONÇALVES

MARCADOR DE PROLIFERAÇÃO AGNOR E SUA RELAÇÃO COM TIPO E

GRAU HISTOLÓGICO EM TUMORES MAMÁRIOS CANINOS

Uberlândia - MG

Novembro 2018

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

NAIANNE REZENDE GONÇALVES

MARCADOR DE PROLIFERAÇÃO AGNOR E SUA RELAÇÃO COM TIPO E

GRAU HISTOLÓGICO EM TUMORES MAMÁRIOS CANINOS

Trabalho de conclusão de curso para

obtenção do título de graduação em

Medicina Veterinária na Universidade

Federal de Uberlândia - UFU

Orientadora: Prof1. Dr3. Alessandra

Aparecida Medeiros

Uberlândia - MG

Novembro 2018

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NAIANNE REZENDE GONÇALVES

MARCADOR DE PROLIFERAÇÃO AGNOR E SUA RELAÇÃO COM TIPO E

GRAU HISTOLÓGICO EM TUMORES MAMÁRIOS CANINOS

Trabalho de conclusão de curso para

obtenção do título de graduação em

Medicina Veterinária na Universidade

Federal de Uberlândia - UFU

Uberlândia, ____ de __________ de _____.

BANCA EXAMINADORA

Professora Doutora Alessandra Aparecida Medeiros Ronchi

Professor Matias Pablo Juan Sazabó

Professora Mestranda Lígia Fernandes Gundim

3

Agradecimentos

Agradeço a DEUS em primeiro lugar que me iluminou meu caminho dando força e

saúde para seguir em frente superando as dificuldades.

Agradeço à minha mãe, a minha irmã e aos meus primos que me ajudaram me apoiando

para nunca desistir e chegar até essa etapa da minha vida.

Ao meu pai, que onde quer que esteja, sei que me fortalece e me guia.

Agradeço a minha orientadora pelo convívio, pelo apoio, pela compreensão, pelo

aprendizado e principalmente pela paciência e tempo no desenvolvimento desse trabalho.

Aos meus amigos que me incentivam desde os primeiros dias na faculdade.

Enfim, o meu muito obrigado a todas as pessoas que fizeram parte dessa etapa decisiva

em minha vida.

4

Resumo

As neoplasias mamárias em cadelas são de importância significativa em medicina

veterinária, devido à alta frequência, sendo modelo de estudo para o câncer de mama em

humanos. Com diferentes padrões histológicos e comportamento biológico, torna essa doença

mais complexa e urgente a sua identificação por fatores de prognostico, possibilitando

diagnosticar e tratar com eficiência os animais portadores de neoplasias mamarias. Os

marcadores de proliferação, estão presentes nos tumores, no sangue ou em líquidos biológicos,

podendo alterar concentrações relacionadas ao crescimento celular tumoral, levando, nos

últimos anos, a intensificação dos estudos para identificar marcadores celulares que ocorrem

durante a evolução neoplásica. Com isso, nesse trabalho objetivou-se avaliar a técnica de

imunohistoquímica do marcador de proliferação AgNOR com o tipo e com o grau histológico

das cadelas que foram atendidas no Hospital Veterinário da Universidade Federal de

Uberlândia, de janeiro a maio de 2017

Palavra chave: cão, tumor mamário, proliferação celular.

Abstract:

Mammary neoplasms in female dogs are of significant importance in veterinary

medicine due to the high frequency, being a study model for mammary cancer in humans. With

different histological patterns and biological behavior, it makes this disease more complex and

urgent to be identified by prognostic factors, making it possible to diagnose and treat effectively

the animals with mammary neoplasms. Proliferation markers are present in tumors, blood or

biological fluids, and may alter concentrations related to tumor cell growth, leading in recent

years to the intensification of studies to identify cell markers that occur during neoplastic

evolution. Thereby, the objective of this study was to evaluate the immunohistochemical

technique of the AgNOR proliferation marker with the type and histological grade of the female

dogs that were treated at the Veterinary Hospital of the Federal University of Uberlândia from

January to May 2017.

Key words: dog, breast tumor, cell proliferation.

5

SUMARIO:

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 07

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 08

2.1 Morfologia das Glândulas Mamárias nas Cadelas .......................................... 08

2.2 Neoplasias Mamárias em Cadelas ................................................................... 09

2.3 Marcadores de Proliferação Celular ................................................................. 12

2.4 AgNOR ............................................................................................................ 12

3. MATERIAIS E MÉTODOS ...............................................................................14

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 15

REFERÊNCIAS ................................................................................................. 21

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1. INTRODUÇÃO

As neoplasias mamárias em cadelas são frequentes, principalmente em cadelas não

castradas, sendo que os tumores de mama compreendem 50% a 70% de todos neoplasmas que

acometem esses animais (MOE, 2001), sendo assim uma enfermidade muito importante na

espécie canina devido a alta taxa de mortalidade e morbidade nestes animais (ZUCCARI et al.,

2008).

Estudos realizados em vários países indicaram que 41% a 53% dos tumores mamários

na cadela são malignos, e dentre eles, 90% são carcinomas (GAMBA et al., 2017). MISDORP

(2002) afirma que é o tipo histológico o fator principal no prognóstico dos tumores de mama.

De acordo com ZUCCARI et al. (2001), os tumores malignos tem desenvolvimento

rápido, e entre os critérios de malignidade mais observados estão os tumores com células

epiteliais atípicas e os com células pleomórficas. Segundo alguns autores a graduação

histológica é atribuível ao grau de malignidade, para corresponder a um tumor, os parâmetros

de avaliação são a formação de túbulos, a presença de núcleos com tamanhos diferentes

(anisocariose) e número de mitoses por campo (objetiva de 40X) (BLOOM & RICHARDSON,

1957).

Fatores de prognóstico são definidos como uma ou várias características clínicas,

patológicas e biológicas dos indivíduos e dos seus tumores que podem ser utilizadas para prever

a evolução clínica de cada caso e também o tempo de sobrevida do animal (FERREIRA et al.,

2017). Dentre os fatores de prognóstico estabelecidos para tumores mamários em cadelas estão

estádio clinico, tamanho tumoral (ITO et al., 1996), grau histológico (HUGHES, DOBSON,

2012), taxa de mitose (HUGHES, DOBSON, 2012) e invasão de linfonodos e vasos (SEIXAS

et al., 2011).

A técnica AgNOR (Regiões Nucleolares Organizadas coradas pela Prata [Ag]) tem

sido utilizada em patologia oncológica para avaliação da agressividade de tumores malignos e

do seu prognóstico (DERENZINI, 2000), sendo que a atividade proliferativa da célula é

representada pelo aumento das AgNOR's, refletindo o estágio de mitose (MELLO, ALVES,

1999).

SARLI et al. (2002) avaliaram o papel do marcador de proliferação AgNOR em

tumores mamários em cadelas e verificaram que altas taxas de proliferação celular estavam

relacionadas a maior progressão da doença, confirmando o valor prognóstico do AgNOR.

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Considerando a importância dos tumores mamários na rotina médico veterinária, além

do fato das neoplasias mamárias nas cadelas servirem de modelo para o estudo de tumores

mamários em mulheres (JESEN-JAROLIM et al., 2015), esse trabalho teve como objetivo

avaliar a relação do marcador de proliferação celular AgNOR com o tipo e grau histológico

tumoral.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Morfologia das Glândulas Mamárias nas Cadelas

As cadelas apresentam cinco pares de glândulas mamarias: torácicas craniais, torácicas

caudais, abdominais craniais, abdominais caudais e inguinais, (ZUCCARI et al., 2002) que

possuem a mesma estrutura formadas por lóbulos separadas por septos conjuntivos onde

drenam para os canais secretores calibrosos, os denominados ductos lactíferos, estes se abrem

nos mamilos em números variados (ZUCCARI et al., 2002; MURPHY, 2008).

O seio lactífero encontra-se antes dos ductos, que são dilatações ampolares formadas

pelos ductos (BANKS, 1993). O epitélio de revestimento dos ductos, antes de se ramificarem

são de dupla camada de células epiteliais cubicas ou cilíndricas baixas e à medida que vão se

ramificando se transformam em simples cubico ou cilíndrico, para formar os ductulos

intralobulares (NOGUEIRA; CASTRO, 2017).

Os alvéolos dessas glândulas são formados por epitélio cilíndrico simples, que sintetiza

e secreta proteínas lácteas e lipídeos durante a lactação (PELETEIRO, 1994). Os ductos e os

alvéolos são circundados por células mioepiteliais contratáteis, semelhantes a fibras musculares

lisas, que sobre a influência da ocitocina e se contrai secretando o leite (NOGUEIRA;

CASTRO, 2017).

A comunicação linfática é feita pelas glândulas abdominais craniais e torácicas

caudais, as abdominais craniais são as únicas que drenam simultaneamente para o linfonodo

axilar acessório e para o inguinal superficial porém todas as mamas tem drenagem independente

para o linfonodo próximo a elas (RASOTTO et al., 2011).

Durante a vida do animal a glândula mamária sofre diferenciação em seu

desenvolvimento em estágios (NOGUEIRA; CASTRO, 2017). Quando a fêmea está no estágio

impúbere, a glândula é formada por um sistema tubular ramificado rudimentar conectados aos

ductos lactíferos (PENA et al., 2014) que sobre o efeito do estrógeno, na puberdade se

8

desenvolve aumentando discretamente por células adiposas, e com a progesterona atuando

sobre as glândulas e no tipo de ciclo estral, que determina a ação prolongada desse hormônio

durante o metaestro, retornando ao seu nível basal dias após o início do estro (SORENMO et

al., 2011).

Nas cadelas gestantes, a progesterona promove proliferação de células epiteliais da

porção final dos dúctulos lactíferos, que irá desenvolver as glândulas mamarias. De forma

subsequente forma-se os alvéolos secretores formados por epitélio cilíndrico simples com

entremeado de células mioepiteliais. Durante a fase de lactação, junto com vários outros

hormônios, os ductos e os alvéolos secretores ficam distendidos, alguns cheios e outros vazios

de leite, e ao fim da lactação a maioria desses alvéolos são reabsorvidos e o volume da mama

diminuí (NOGUEIRA; CASTRO, 2017).

Então, as glândulas mamarias vão se diferenciar e evoluirão repetidas vezes em cada

ciclo, tendo modificações na organização do tecido glandular e modificações fisiológicas

levando ao desenvolvimento desse tecido, especialmente na região epitelial, que leva a

alterações neoplásicas diversas (SORENMO et al., 2011).

2.2 Neoplasias Mamárias em Cadelas

As neoplasias mamárias são comumente diagnosticadas em cadelas

(GOLDSCHMIDT et al., 2017). Fêmeas entre 7 a 12 anos de idade e com o envolvimento de

uma ou mais de uma glândula mamaria é a apresentação clássica deste tipo de neoplasia

(VARALLO et al., 2012).

Segundo LANA et al. (2007), a idade do animal e a probabilidade de desenvolvimento

de tumores mamários variam numa razão direta, sendo que a idade média de manifestação

tumoral, nas cadelas, ocorre por volta dos 10 e os 11 anos, sendo rara em idades inferiores a 4

anos. Do mesmo modo, MISDORP (2002) relata que as neoplasias mamárias ocorrem com

maior frequência em cadelas adultas a idosas, entre 9 e 11 anos de idade e que não foram

castradas, sendo menos frequente em animais com menos de 5 anos de idade.

Além disso, todas as raças podem ser afetadas, incluindo animais sem raça definida

(ROCHA; TOSTES, 2005). A predisposição racial ainda não está clara, mais já foi observado

um maior surgimento em vários exemplares das raças Spaniel e em alguns estudos também no

Caniche e Dachshund (RUTTEMAN et al., 2001). Outros autores apontam para uma maior

incidência no Poodle, Retrievers, Spaniel inglês, Setter inglês, Pointer, Cocker Spaniel, Fox

9

Terrier e Terrier de Boston (MITCHELL et al., 1974; RUTTEMAN et al., 2001; MEUTEN,

2002). Curiosamente, os animais das raças Boxer e Beagle são referidos como aqueles que

apresentam menor risco de desenvolverem tumores de mama (WITHROW; MACEWEN, 1996;

QUEIROGA; LOPES, 2002). A incidência também é baixa em raças mestiças quando

comparadas às raças puras (DE NARDI et al., 2008), sendo as principais raças acometidas:

Poodle, Pastor Alemão, Cocker Spaniel e cães sem raça definida (DE NARDI et al., 2009).

Segundo NUNES et al. (2017), as mamas mais acometidas são as inguinais e as

abdominais caudais, provavelmente ao maior parênquima nessas mamas e a atividade

proliferativa de respostas ao estrógeno.

Vários fatores são indicados como predisponentes para o desenvolvimento neoplásico

e estes incluem a idade, dieta, influência hormonal e predisposição genética (QUEIROGA;

LOPES, 2002).

Estrógeno, progesterona e o hormônio do crescimento são hormônios que influenciam

na formação desses tumores (NUNES et al., 2017) e a influência hormonal pode ser

comprovada a partir do efeito protetor da castração precoce em cadelas. O risco de

aparecimento desse tumor nas cadelas castradas antes do primeiro cio é de 0,05%, 8% após o

primeiro cio, e após o segundo o risco aumenta para 26% (SCHNEIDER et al., 1969).

Tratamentos com anticoncepcionais também podem aumentar o risco do desenvolvimento

desses tumores (NUNES, 2017).

Quanto à morfologia, as neoplasias mamárias podem se apresentar como nódulos

pequenos ou grandes, aderidos ou móveis, únicos ou múltiplos, ulcerados, circunscritos,

dependendo do comportamento biológico do tumor (COUTO, 2010; JASCKSTET, 2013;

GRANDI, 2017). Em relação à mobilidade, podem ser móveis ou aderidos, com envolvimento

cutâneo e muscular. Ao corte, podem ter aspecto sólido, cístico ou misto, com possíveis focos

de necrose (RUTTEMAN et al., 2001).

Microscopicamente, as células podem variar de populações de células epiteliais,

mioepiteliais e/ou mesenquimais, com formato colunar, cuboide, ou com formato fusiforme e

dendrítico, e os núcleos redondos a ovais com cromatina fina e um nucléolo evidente e

pequenos. O tumor pode apresentar contagem mitótica aumentada, de duas ou mais células em

mitose por campo, podendo exibir necrose em pequenas áreas multifocais ou em grande área

central, presença de células inflamatórias no tecido conectivo ou intraneoplásico, sendo comum

a invasão de vasos linfáticos e veias (GRANDI, 2017).

10

SORENMO (2003) correlacionou o tipo tumoral, a diferenciação histológica e outros

fatores de prognóstico com o risco de disseminação. Em geral, a metástase dos tumores

epiteliais ocorre pela circulação linfática que carreia células neoplásicas para linfonodos

regionais e depois para os pulmões, enquanto os tumores de origem mesenquimal são

disseminados pela via hematógena indo diretamente para os pulmões (SORENMO, 2003).

Sendo assim, os principais órgãos acometidos pelas metástases são os linfonodos regionais,

principalmente os inguinais e os axilares, e os pulmões, e com menor frequência rins, fígado,

baço, pele, adrenais, encéfalo, olhos, esqueleto (CAVALCANTI; CASSALI, 2006; PIEKARZ,

2007), além de coração, rins, pele, cérebro e ossos (DE NARDI et al., 2009; KLOPFLEISCH

& GRUBER, 2009).

Propostas de classificação para as neoplasias mamárias têm sido descritas a fim de

contribuir com a avaliação prognóstica, já que por vezes o subtipo histológico demonstra-se

correlacionado a uma pior sobrevida (SOLANO-GALLEGO, 2012; RASOTTO et al., 2017).

Ao longo dos anos, essa classificação tem sido aprimorada a fim de facilitar sua aplicação.

Em 1974, a Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou a primeira classificação

histológica internacional de tumores dos animais domésticos, incluindo neoplasias e displasias

da glândula mamária, baseada nas classificações propostas em três estudos anteriores

(MISDORP et al., 1971; MISDORP et al., 1972; MISDORP et al., 1973) sofrendo modificações

posteriores, baseadas em MISDORP et al. (1999).

Em 2011, baseado na classificação para a OMS realizada por MISDORP et al. (1999),

uma proposta de classificação das neoplasias mamárias foi realizada por CASSALI et al.

(2011), sendo reavaliada em 2013 (CASSALI et al., 2013). Ainda, GOLDSCHMIDT et al.

(2011) também propuseram classificação para as neoplasias mamárias baseada na classificação

da OMS de 1974 e 1999, sendo as neoplasias primariamente dividas em: epitelial maligna, tipos

especiais de neoplasia epitelial maligna, mesenquimais malignas, mista maligna,

hiperplasia/displasia, neoplasias do teto e hiperplasia ou displasia do teto (melanose)

(GOLDSCHMIDT et al., 2011). Atualmente, GOLDSCHMIDT et al. (2017) classifica as

alterações mamárias caninas em hiperplasia/displasia, neoplasias benignas (adenoma - simples

e complexo, adenoma ductal, fibroadenoma, mioepitelioma e tumor misto benigno) e malignas

(epiteliais, mesenquimais e mistas - epiteliais e mesenquimais). As neoplasias mamárias

epiteliais malignas são as mais frequentes, podendo ser citadas dentre elas o carcinoma in situ,

carcinoma simples (tubular, tubulopapilar, cístico-papilar e cribiforme), complexo,

11

micropapilar, sólido, comedocarcinoma, anaplásico, em tumor misto, mioepitelioma maligno,

ductal, intraductal.

2.3 Marcadores de Proliferação Celular

A identificação de marcadores moleculares que estão envolvidos em eventos celulares

durante a carcinogênese de tumores de mama em cadelas, como diferenciação e crescimento

celular, proliferação, invasão e metástase tem sido motivo de estudos em oncologia veterinária

(ZUCCARI et al., 2008; RAKHA et al., 2009).

Estes marcadores permitem a distinção do comportamento biológico do tumor,

podendo fornecer informações sobre grau de malignidade, presença ou não de metástase, taxa

de progressão tumoral, resposta à terapias e a sobrevida do paciente (PAPAIOANNOU et al.,

2009).

A proliferação celular de tumores relaciona-se com o prognóstico, sendo considerada

como inversamente proporcional à sobrevida de pacientes com neoplasias mamárias,

principalmente carcinomas (FERREIRA et al., 2017).

O Ki-67 é um dos marcadores de proliferação celular mais estudados (ZUCCARI,

2004). Segundo BROWN E GATTER (1990) o Ki-67 é um antígeno nuclear presente em todas

as fases ativas do ciclo celular, sendo uma proteína não histona expressa nas fases ativas do

ciclo celular como a fase G1, na fase S e na mitose (exceto na fase G0) (ZUCCARI, 2004).

Tumores positivos ao Ki-67 são correlacionados a prognóstico ruim (BARBOSA et al., 2003).

PENA et al. (2014) relataram que o aumento da expressão do Ki-67 além de correlação

positiva para metástases, tem também correlação positiva para mortes pelo tumor e menor

tempo de sobrevida (FERREIRA et al., 2017). FREYTAG (2017) também demonstraram que

cadelas com neoplasias com valores elevados de Ki-67 tem maior probabilidade de óbito.

Outro marcador de proliferação celular é o PCNA (antígeno nuclear de proliferação

celular), que é uma proteína nuclear não histônica, atuando como co-fator de DNA polimerase

delta e sua presença é observada no ciclo celular no final da fase G1, com pico na fase S e

declínio na fase G2 e M (MIGHELL, 1995).

2.4 AgNOR

É um método de contagem da região organizadora nucleolar (NOR), que pode

demonstrar a atividade proliferativa de tumores malignos (MARTIN, 1994). Essas NORs são

12

regiões de cromatina fracamente coradas em torno das quais, no fim da telófase, nucléolos são

reformados após seu desaparecimento durante a fase mitótica da célula. As NORs contêm genes

ribossômicos que codificam RNA ribossomal (rRNA) (GALL E PARDUE, 1969), que estão

ativos em nucléolos (PLOTON, 1994).

Um grupo peculiar de proteínas ácidas que são altamente argirófilas estão localizadas

nos mesmos locais que as NORs, permitindo assim que as NORs sejam muito claramente e

rapidamente visualizadas por procedimentos de coloração por nitrato de prata

(GOODPASTURE e BLOOM, 1975).

As regiões organizadoras de nucléolos coradas pela prata (AgNORs), nas células

eucarióticas, são definidas como proteínas ácidas não-histonas localizadas próximas a

segmentos cromossômicos nos quais o rRNA é codificado (RÜSCHOFF et al., 1989).

SARLI et al. (2002) disseram que uma elevada sensibilidade prognostica do indicie AgNOR

pode ser pela quantidade de AgNOR em interfase que está relacionada com a taxa de duplicação celular,

ou seja, quanto mais rápida a proliferação celular, maior é a quantidade de AgNOR em interfase.

No cão, as AgNORs estão exclusivamente localizadas nas regiões teloméricas dos

cromossomos 7, 8, 27 e algumas vezes no 38 (KOPP et al., 1982). As regiões análogas no

núcleo interfásico podem ser facilmente demonstradas usando o mesmo processo de coloração

pela prata (RÜSCHOFF et al., 1989).Para predizer o desfecho clínico de tumores mais agressivos o AgNOR é útil, porque ele

relaciona elevados valores de taxa de proliferação celular com a progressão rápida das neoplasias

mamárias em cadelas (SARLI et al., 2002).

À microscopia óptica, as AgNORs apresentam- se como pontos escuros bem definidos,

medindo de 0,5 a 1,0 pm de diâmetro, em número e formas variáveis, primariamente no

nucléolo, e também como “satélites” no núcleo. Nas células em interfase os pontos estão

distribuídos exclusivamente através do nucléolo corado (AUBELE et al., 1994). Cada grânulo

de AgNOR pode ser considerado como uma unidade transcricionalmente ativa (PLOTON,

1994).

A avaliação das AgNORs pode ser feita através de contagem, mensuração de sua área

e análise de sua distribuição no núcleo (RÜSCHOFF et al., 1994).

Sob ponto de vista estatístico, as células cancerígenas têm uma quantidade AgNORs

em interfase que células benignas ou normais e, portanto, uma lesão maligna pode

frequentemente ser distinguida de uma lesão benigna do mesmo tecido pela avaliação

quantitativa de interfase AgNOR (DERENZINI, 2000).

13

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Seleção dos animais do estudo

Foram selecionadas cadelas, de variadas raças e idades, castradas ou não, que foram

encaminhadas voluntariamente para atendimento clínico-cirúrgico no Hospital Veterinário da

Universidade Federal de Uberlândia (UFU), no período de janeiro a maio de 2017.

Após avaliação clínica e conforme recomendação médico veterinária, as cadelas foram

submetidas a tratamento cirúrgico pelas técnicas de mastectomia unilateral ou bilateral total,

com retirada dos linfonodos regionais.

Processamento das amostras dos carcinomas

Imediatamente após a excisão cirúrgica, a cadeia mamária foi enviada ao Laboratório

de Patologia da UFU e submetida à palpação para identificação de nódulos palpáveis, que foram

mensurados com auxílio de paquímetro (Zaas®) e classificados de acordo com o tamanho em

T1 (< 3 cm), T2 (de 3 a 5 cm) e T3 (> 5 cm). Em seguida foram coletadas amostras das mamas

afetadas por nódulos ou massas palpáveis e armazenada separadamente em frasco com solução

de formol 10% tamponado.

O processamento das amostras para confecção das lâminas será realizado segundo

TOLOSA et al. (2003) e secções histológicas de 4uin serão coradas pela técnica de HE.

O diagnóstico foi realizado em estudo duplo cego por dois patologistas segundo

GOLDSCHMIDT et al. (2017). O grau histológico foi atribuído de acordo com o sistema

Nottingham modificado por ELSTON e ELLIS (1991).

AgNOR

A contagem de AgNOR foi realizada em cortes histológicos (5um) corados de acordo

com a técnica preconizada por VALDOVOCH et al. (2004). As regiões organizadoras

nucleolares argirofílicas foram identificadas como grânulos pretos ou marrom-escuros

presentes no interior do núcleo das células neoplásicas. Para a quantificação das AgNORs foi

realizada a contagem direta à microscopia ótica dos grânulos argentafins no interior dos

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núcleos. Foram selecionados cinco campos representativos e aleatórios em aumento de 1000x,

procedendo-se a contagem dos grânulos em 100 células neoplásicas (20 células cada campo).

A frequência individual em cada neoplasma foi obtida dividindo-se o número total de grânulos

contados por 100. A contagem foi realizada por dois observadores, em momentos distintos, em

estudo duplo cego.

Análise estatística

Para a análise dos AgNORs, os dados foram confrontados utilizando-se o teste não

paramétrico de Kruskal-Wallis, utilizando-se o programa IBM SPSS Statistics, sendo

considerados estatisticamente significativos quando p<0,05.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram selecionadas 50 cadelas portadoras de neoplasias mamárias, com idade média

de 9,71 anos, variando de 4 a 15 anos de idade. ANDRADE et al. (2017) relataram média de

idade de 9,99 anos em cadelas com tumor de mama (incluindo tumores benignos e malignos),

sendo que a média foi de 9,66 anos para cadelas com tumores benignos e 10,07 para aquelas

com tumores malignos. Estes autores também verificaram que os tumores foram mais

frequentes em animais idosos (55,3%) do que em animais adultos (44,3%). Para SARLI et al.

(2002), relatou que a média de idade foi de 10,01 anos das cadelas com tumores mamários, e

no estudo de LOHR et al. (1997) a média de idade dos cães foi de 9,05 anos. Mas no presente

estudo não houve uma relação entre o tipo histológico e seu grau com as variáveis idades.

Com relação às raças, a maioria das cadelas era sem raça definida (SRD) (40%),

seguido pela raça Poodle (26%), as outras raças não tiveram frequência relevante. O mesmo foi

encontrado em ANDRADE et al. (2017), com a prevalência de 39,56% de SRD e o Poodle de

33,4%. Já para SARLI et al. (2002), separou em raças mestiças (33,33%) e raças puras

(63,33%), e duas raças não conhecidas, sendo que as raças mestiças também teve alta frequência

de tumores mamários em cadelas. E também em PASCOLI et al. (2017) as cadelas SRD foram

as mais acometidas com tumores mamários (29,41%, n=5/17), seguidas pela raça Poodle

(17,64, 3/17). Mas neste no presente estudo, não houve relação entre raça e o tipo histológico.

15

Tabela 1 - Frequência de cadelas com tumores mamários de acordo com a raça e tipo

histológico.

Raça

SRD 20 (40%)

Poodle 13 (26%)

Pinscher 4 (8%)

Shihtzu 4 (8%)

Basset 2 (4%)

Ni 2 (4 %)

Maltes 1 (2%)

Rottweil 1 (2%)

Pitibull 1 (2%)

Cocker 1 (2%)

Golden 1 (2%)

Tipo histológico

Malignos

Carcinoma complexo 16 (32%)

Carcinoma tubulopapilar 10 (20%)

Carcinoma em tumor misto 9 (18%)

Carcinoma solido 5 (10%)

Carcinoma tubular 2 (4%)

Carcinoma micropapilar 2 (4%)

Benignos

Tumor misto benigno 3 (6%)

Adenoma complexo 2 (4%)

Adenoma simples 1 (2%)

16

Tabela 2 - Frequência de Graduação Histológica dos Tumores Mamários.

Grau histológico

I 19 (43%)

II 23 (52%)

III 2 (5%)

Das 50 amostras, em relação aos tumores malignos, o tipo histológico mais frequente

foi Carcinoma Complexo (32% - 16/50) seguido por Carcinoma Tubulopapilar (20% - 10/50)

o Carcinoma em Tumor Misto também teve frequência alta (18% - 9/50). Dentre os carcinomas

em cães, os mais comuns são os Tubulopapilares (MISDORP, 2002), já para BRATULIC et al.

(1996) o mais frequente são os Carcinomas Tubulares e para ANDRADE et al., foram os

Carcinomas Simples, o qual não foi presenciado neste estudo. E observou-se que o Carcinoma

Complexo foi o mais frequente no presente estudo, como revela a Tabela 1 relacionada com a

raça.

Com relação ao grau histológico dos tumores, foram analisados em 44 tumores

mamários, onde 52% (23/44) era do grau II, 43% (19/44) do grau I e 5% (2/44) do grau III

(Tabela 2). Foi observado no estudo feito por MENDES (2014), que a maior frequência do grau

histológico nos tumores de mama o de grau I (40%), seguido pelo grau III (15%) e por último

o grau II (10%), revelou uma diferencia do presente estudo onde os carcinomas de grau II foi o

mais frequente. Em SARLI et al. (2002), o grau com maior frequência era o de grau I (55%)

seguido pelo grau II (16,66%), não tendo nenhum caso do grau III, também diferente deste

estudo. Já em outro estudo, o grau que mais predominou foi o II, com 45% dos casos, seguidos

do grau I de apenas 30%, mostrando uma semelhança com o que foi coletado neste estudo.

Correspondendo assim a natureza invasiva desses tumores malignos, em que pelo menos um

linfonodo regional tenha apresentado a presença ou ausência de metástases, mais neste estudo

os linfonodos regionais não foram recolhidos para exame histopatológico. Entre as variáveis

clinicas e histológicas, o grau histológico demonstra valores inquestionáveis no prognostico de

tumores de mama (PÉREZ et al., 1995).

Segundo PICH et al. e TRERE et al. (2004), a avaliação de quantidade de AgNOR

contados nos núcleos das células é a única ferramenta na obtenção de informações da

biogêneses ribossomal em preparações citohispatológicas. No presente estudo, das 50 amostras

de tumor mamário, 23 foram avaliadas de acordo com AgNOR, onde houve a contagem dos

17

nucléolos fragmentados dos núcleos das células neoplásicas, e revelou em algumas das lâminas

excelente qualidade de coloração, aparecendo pontos pretos a amarronzados claros, de

diferentes formas e tamanhos, dispersos no fundo nuclear claro (Figura 1 e 2).

Figura 1: Coloração AgNOR, com nucléolos corados pela prata. Autoria Propria.

Figura 2: Coloração AgNOR

18

A contagem média de AgNOR para todos os tumores individuais variou de 5,4 a 1,66

por núcleo e relacionado com o diagnostico histológico (Tabela 3), essa contagem poderia ser

correlacionada com o aumento do grau de malignidade com elevadas contagens de AgNOR,

mas devido a não leitura de todas as lâminas, fica difícil chegar a essa conclusão. Mas em

relação as neoplasias benignas, que era esperado, todas as contagens foram baixas.

Tabela 3 - Correlação entre diagnóstico histopatológico e região organizadora nucleolar

(AgNOR) para as cadelas com neoplasias mamárias.

Diagnóstico Histológico Número

de cães em

Grupo

Média de

Contagem de

AgnOR por

Núcleo

Carcinoma em tumor misto 9 5,54

Carcinoma complexo 16 3,61

Carcinoma micropapilar 2 3,9

Carcinoma tubulopapilar 10 4,32

Carinoma solido 5 3,44

Carcinoma tubular 2 3,62

Adenoma simples 1 2,8

Adenoma compelxo 2 0

Tumor misto benigno1 1,66

Total 50

Essa NORs coram com nitrato de prata por causa da presença de altas concentrações

de proteínas associadas ao enxofre em locais de montagem de RNA ribossomal (r RNA)

correlacionado com a taxa de proliferação celular (BOSTOCK et al., 1992). Neste estudo, as

19

contagens foram feitas por observação direta em microscópio (objetiva 100X), o tempo da

coloração deve ser controlado, devido sua importância, mas podendo ser devido exposição curta

à solução de nitrato de prata ou por superexpansão das proteínas coradas, neste trabalho levaram

algumas laminas a uma coloração pálida e de outras houve produção de grande deposito de

corante, nessas observaram o AgNOR de forma individual, devido a vários nucléolos corados

dentro de uma célula. Em seu trabalho, DZIMIRA et al. (2005), concluíram que essa coloração

de prata das NORs, além de simples é um método barato, com a confirmação de baixa ou alta

malignidade em exames de histopatologia.

Neste trabalho houve diferenças nas contagens das medias dos tumores mamários que

foram corados pelo AgNOR, que segundo VALDOVICH et al. (2004), podem ser devido a

diferenças no tempo de processamento das laminas, pela concentração de pH da formalina, pelo

procedimento de desparafinação e reidratação, pelo fixador, devido ao tempo para a preparação

da solução de prata, pelo tempo dessa coloração e pela eficácia da lavagem, levando a redução

do número de AgNORs individuais visíveis e formação de excesso de precipitado de prata,

complicando a análise.

BOSTOCK et al., (1992) afirmaram que as contagens de AgNOR pode fornecer um

método útil de avaliar malignidade. Porém BRATULIC et al. (1996) mostraram em seu estudo

que os AgNORs não parecem ter um valor de prognostico para determinação de tumores

malignos de mama e que possam levar a metástases distantes, mas se usados corretamente a

classificação hitopatológica pode ser um índice confiável de malignidade. SARLI et al. (2002),

correlaciona a sensibilidade prognostica do índice AgNOR com a invasidade histológica,

devido a quantidade de AgNOR em interfase relacionada com taxa de proliferação celular,

porque quanto mais rápida essa proliferação maior é a quantidade de AgNOR em interfase.

LOHR et al. (1997), confirmaram que um elevado impacto de diagnostico

histopatológico na experiência realizada em seu estudo, levou a uma estimativa crucial de

prognostico, sobrevida, tempo de vida e reaparecimento tumoral. E SARLI et al. (2002),

confirmaram que é de grande importância as informações fornecidas pela graduação histológica

e pelo índice AgNOR, prevendo resultados pós-cirurgicos nos tumores mamários malignos.

Com isso, este estudo leva a conclusão que não houve significância nem para tipo e

nem para a graduação histológica das 23 lâminas que foram concluídas e contadas os AgNORs,

mas poderia ter chegado a um resultado significante se todas as 50 amostras coletadas pudessem

ter corado e os AgNORs contados sem erros e que a correlação de malignidade não está correta

daquelas observadas em outros estudos.

20

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