i

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PS-

GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

Pigmentos Naturais Produzidos por Fungos Filamentosos

Isolados de Theobroma grandiflorum (Willd. Ex Spreng.)

Schum. (cupuau)

GABRIELA FERREIRA ZANETTE, MsC.

Manaus/Amazonas

Junho 2013

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PS-

GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

GABRIELA FERREIRA ZANETTE

Pigmentos Naturais Produzidos por Fungos Filamentosos

Isolados de Theobroma grandiflorum (Willd. Ex Spreng.)

Schum. (cupuau)

Tese apresentada ao Programa Multi-Institucional de Ps-Graduao em Biotecnologia, da Universidade Federal do Amazonas, como requisito para obteno do ttulo de Doutor em Biotecnologia, rea de Concentrao: Conservao e Uso de Recursos Genticos Microbianos da Amaznia.

ORIENTADOR: Prof. Dr. JOS ODAIR PEREIRA

Manaus/Amazonas

Junho 2013

iii

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Dr. Jos Odair Pereira

_______________________________________

Dr. Cecilia Veronica Nunez

_______________________________________

Dr. Joo Lcio de Azevedo

_______________________________________

Prof. Dr. Doriane Picano Rodrigues

_______________________________________

Dr. Aldo Rodrigues de Lima Procpio

iv

AGRADECIMENTOS

Deus pela fora e oportunidade de estar completando mais esta

etapa do meu desenvolvimento acadmico e profissional.

Ao Programa de Ps-Graduao Multi-Institucional de

Biotecnologia por possibilitar a realizao deste trabalho.

Ao CNPq pelo apoio financeiro atravez da concesso de bolsa de

estudos.

Ao Prof. Dr. Jos Odair Pereira, pela valiosa orientao, apoio,

pacincia, amizade, e incentivo em todas as etapas deste trabalho.

Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia, por

todos os ensinamentos que contriburam para a minha formao, em

especial a Prof. Dr. Doriane Picano Rodrigues, pelas sugestes,

conselhos e amizade.

Prof. Dr. Ceclia Vernica Nunez, por gentilmente ceder espao

no Laboratrio de Fitoqumica (INPA) para a realizao das anlises

bioqumicas.

Ao meu melhor amigo e marido Ivan Fernandes Vieira, por todo o

carinho, pacincia, discusses e divagaes, apoio e presena

constante.

v

minha famlia, Agenor, Neide e Jeruza, pelo incentivo, amparo e

amor. Obrigada por vocs estarem presentes em minha vida.

D. Regina, pelos cafezinhos na hora do relaxamento, risadas, boas

conversar, carinho e ateno, muito obrigada.

Aos amigos e companheiros, Prof. Dr. Cristina Maki, Claudia

Dantas Comandolli e Prof. Dr. Mayra Martins pela amizade

adquirida, incentivo e bons momentos.

s minhas amigas queridas de Cuiab Cris Aguiar, Liz Busatto e

Tathi Vinhal, que sempre me incentivaram e me deram todo o carinho

e amizade de que precisei nos momentos estressantes.

Floresta Amaznica, por ser to complexa e instigante.

todas as pessoas que de alguma forma contriburam para a realizao

deste trabalho.

vi

Ao amanhecer, todas as confuses de ontem

so coisas do passado. Hoje inicia-se um dia que nunca existiu.

Edward Bach

vii

RESUMO

A biodiversidade microbiana representa uma fonte importante de recursos genticos para o avano da biologia e biotecnologia. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar e identificar os micro-organismos isolados de frutos de cupuau (Theobroma grandiforum) que apresentaram produo de pigmentos; analisar os pigmentos obtidos por meio da tcnica de Cromatografia em Camada Delgada de Slica Gel, Cromatografia Lquida de Alta Eficincia e Ressonncia Magntica Nuclear; avaliar o potencial para consumo humano dos pigmentos obtidos realizando ensaios de citotoxicidade; caracterizar os isolados produtores quanto ao seu potencial para a produo de micotoxinas; e caracterizar os pigmentos obtidos em relao presena de atividade antioxidante. Foram obtidos 207 fungos filamentosos de frutos de T. grandiflorum, destes 85 apresentaram potencial para a produo de pigmentos. Em anlise morfologica e molecular, 17 foram identificados taxonomicamente como Penicillium purpurogenum, todos produtores de um pigmento vermelho extracelular. O pigmento obtido foi produzido pelos isolados em curto perodo de incubao, na ausncia ou presena de luz, em temperatura ambiente e incubao meio BDA. Os ensaios de estabilidade realizados demonstraram que o pigmento possui alta estabilidade em relao a mudanas de temperatura, pH e luminosidade, inclusive em condies extremas como congelamento, liofilizao e aquecimento em forno de micro-ondas. Os bioensaios realizados demonstraram que o pigmento no possui atividade antibitica para os micro-organismos testadores (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi e Candida albicas), assim como tambm no apresentou citotoxicidade para Artemia salina. Observou-se que a frao butanlica do extrato apresentou atividade antioxidante. As anlises cromatogrficas e espectromtricas realizadas indicam que este pigmento seja da famlia das antraquinonas. Faz-se necessrio nova purificao do pigmento e que as anlises em CLAE e RMN sejam refeitas para obter-se a determinao estrutural da molcula. Os resultados obtidos com o pigmento vermelho demonstram que este apresenta um grande potencial para sua utilizao como colorante de cosmticos e alimentos, pois possui estabilidade qumica, solubilidade em gua, atividade antioxidante, produo em um curto espao de tempo e no possui toxicidade. Estas anlises forneceram subsdios para confirmar a viabilidade de fontes naturais produtoras de pigmentos, contribuindo efetivamente com o avano na utilizao de tecnologias apropriadas para aquisio de novas fontes de compostos naturais com pouco ou sem nenhum impacto ambiental.

Palavras Chave: Fungos filamentosos, prospeco, pigmentos naturais,

Cromatografia, RMN.

viii

ABSTRACT

An important source of genetic resources is microbial biodiversity for the advancement of biology and biotechnology. The present study aimed to characterize and identify microorganisms isolated from cupuau fruit (Theobroma grandiforum) that showed pigment production; analyze the pigments obtained by the technique of Thin Layer Chromatography in Silica Gel, High Performance Liquid Chromatography and Nuclear Magnetic Resonance; evaluate the pigment potential for human use by performing cytotoxicity assays; characterize the isolates for their potential to produce mycotoxins, and characterize the pigments obtained in relation to the presence of antioxidant activity. Were obtained 207 filamentous fungi from T. grandiflorum fruit, 85 of these showed potential for pigments production. On morphological and molecular analysis, 17 were taxonomically identified as Penicillium purpurogenum, all producers of an extracellular red pigment. The pigment was produced by the isolates in a short period of incubation in the absence or presence of light, at room temperature and on PDA. The stability assays performed showed that the pigment has high stability in relation to changes in temperature, pH and brightness, even in extreme conditions such as freezing, freeze-drying and heating in a microwave oven. Bioassays have shown that the pigment does not have antibiotic activity for testers micro-organisms (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi and Candida albicas) and also showed no cytotoxicity against Artemia salina. It was observed that butanol fraction of the extract showed antioxidant activity. The spectroscopic and chromatographic analyzes performed indicate that this pigment belongs to anthraquinones family. It is necessary further purification of the pigment, HPLC analyzes and NMR to be redone to obtain the structural determination of the molecule. The results obtained show that the red pigment presents a great potential for use as cosmetic and food coloring. Since it has chemical stability, water solubility, antioxidant activity, production in a short time and has no toxicity. These results provided information to confirm the feasibility of natural sources for producing pigments, effectively contributing to the advancement in the use of appropriate technologies to acquire new sources of natural compounds that occurs without less or any environmental impact.

Keywords: Filamentous fungi, exploration, natural pigments, chromatography,

NMR.

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Isolados de T. grandiflorum selecionados por apresentarem

produo de pigmentos durante o cultivo em BDA ........................................ 58

Figura 02. Isolados produtores de pigmentos em meio de cultivo BD. A:

CIAM 045, P. purpurogenum, e B: AIAM 006, Fusarium sp........................... 59

Figura 03. Cultivo de CIAM045 em meio Caldo Batata Dextrosado e Caldo

Batata Dextrosado acrescido de Peptona (2%), mostrando a no produo

do pigmento vermelho na presena de peptona........................................ 61

Figura 04. Cultivos lquidos de CIAM045 em diferentes fontes de carbono. 62

Figura 05. Partio Lquido-Lquido do extrato bruto de CIAM 045

mostrando a fase BuOH superior e a fase aquosa inferior............................. 64

Figura 06. Cromatoplaca das fraes DCM e AcOEt da PLL dos extratos

de CIEAM2001, CIAM045, AIAM006 e CIAM042, com sistema de eluio

DCM/AcOEt. ................................................................................................... 65

Figura 07. Cromatoplaca das fraes butanlicas da PLL dos extratos de

CIAM045, AIAM006 e CIAM 042 com sistema de eluio MeOH.................. 66

Figura 08. Cromatoplaca das fraes butanlicas da PLL dos extratos de

CIAM045, AIAM006 e CIAM 042 com sistema de eluio, AcOEt/MeOH...... 67

Figura 09. Cromatoplaca dos extratos obtidos de exudado da colnia

fngica dos isolados CIAM045 e CIAM042, com sistema de eluio AcOEt. 69

Figura 10. Cromatoplaca das fraes butanlicas da PLL dos extratos de 70

x

CIAM045, CIAM 042 e CIEAM 2001 e do Meio BD, com sistema de eluio

AcOEt/MeOH.................................................................................................

Figura 11. Cromatoplaca das fraes butanlicas da PLL dos extratos de

CIAM045, CIAM 042 e AIAM 006, com sistema de eluio BAW.................. 70

Figura 12. Cromatoplaca das fraes butanlicas da PLL dos extratos de

CIAM045, CIAM 042 e AIAM 006, com sistema de eluio BEW.................. 71

Figura 13. Espectro da purificao em CLAE da frao butanlica obtida

na PLL do extrato do isolado CIAM045......................................................... 74

Figura 14. Espectro de anlise em CLAE do extrato puro exudado do

cultivo do isolado CIAM045........................................................................... 74

Figura 15. Espectro de RMN de 1H (500 MHz) de gfz.2, DMSO-d6 ............. 76

Figura 16. Espectro de RMN de 1H (500 MHz) de gfz.4, DMSO-d6 ............. 79

Figura 17. Espectro de RMN de 13C (125 MHz) de gfz.4, DMSO-d6 ........... 80

Figura 18. Mapa de Contorno de HMQC (500/125 MHz) de gfz 5, DMSO-

d6 81

Figura 19. Espectro de RMN de 1H (500 MHz) de gfz.5, DMSO-d6 ............ 82

Figura 20. Espectro de RMN de 13C (125 MHz) de gfz.5, DMSO-d6 ............ 82

Figura 21 Mapa de Contorno de HMQC (500/125 MHz) de gfz 5, DMSO-

d6

83

Figura 22. Bquer contendo larvas de Artemia salina com 48 h................... 87

Figura 23. Resultado da PCR para a amplificao do gene otanpksPN do

poliquetdeo de ocratoxina A...................................................................... 90

Figura 24. Resultado da PCR para a amplificao do gene otanpsPN do

peptdeo de ocratoxina A............................................................................... 90

Figura 25. Resultado da PCR para a amplificao do gene idh, enzima 92

xi

desidrogenase isoepoxydon.......................................................................

Figura 26. Resultado da PCR para a amplificao do gene aflR, gene

regulador de aflatoxina................................................................................. 94

Figura 27. Resultado da PCR para a amplificao do gene stcE, gene de

esterigmatocistina....................................................................................... 94

Figura 28. Resultado da PCR para a amplificao do gene nor1, gene para

o cido norsolorinico, mostrando resultado positivo para o isolado

AIAM023..................................................................................................... 95

Figura 29. Resultado da PCR para a amplificao do gene ver1, gene para

versicolorina................................................................................................ 95

Figura 30. Resultado da PCR para a amplificao do gene omtA, gene

para O-metilesterigmatocistina................................................................... 95

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Lista de primers que sero utilizados para a identificao

molecular de produtores de micotoxinas........................................................ 49

Tabela 02. Resultado do Isolamento de frutos de T. grandiflorum................. 55

Tabela 03. Resultado da identificao taxonmica por mtodo clssico de

caracterizao morfolgica............................................................................. 56

Tabela 04. Listagem de isolados j identificados por taxonomia molecular. 57

Tabela 05. Amostras submetidas a anlise em CLAE e condies da

corrida............................................................................................................. 73

Tabela 06. Deslocamentos qumicos observados nos espectros de RMN

de 1H, da frao gfz.2.................................................................................... 77

Tabela 07. Deslocamentos qumicos observados nos espectros de RMN

de 1H e 13C, da frao gfz.4.......................................................................... 79

Tabela 08. Deslocamentos qumicos observados nos espectros de RMN

de 1H e 13C das frao gfz.5........................................................................... 84

Tabela 09. Resultado dos ensaios de atividade antioxidante com radical

DPPH dos extratos obtidos do cultivo do isolado CIAM 045.......................... 86

Tabela 10. Ensaio de citotoxicidade da frao butanlica do extrato

pigmentado de CIAM045 .............................................................................. 87

xiii

LISTA DE APNDICES

Apndice 01. CIAM 045 - Seqncia de regio ITS, contraste com o

GenBank com o programa Blast................................................................... 105

Apndice 02. AIAM 006 - Seqncia de regio ITS, contraste com o

GenBank com o programa Blast. ................................................................. 108

Apndice 03 Listagem de DNA de isolados enviados para

sequenciamento ........................................................................................... 110

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

ACN Acetonitrila

AcOEt Acetato de etila

BD Caldo Batata Dextrosado

BDA Batata Dextrose gar

BuOH Butanol

CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CG Cromatografia em Fase Gasosa

CL50 Concentrao Letal de 50% dos indivduos

CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

DCM Diclorometano

DMSO- d6 - Dimetilsulfxido deuterado

DNA cido desoxirribonuclico

DPPH 1,1-difenil-2-picril-hidrazil

EDTA - cido Etilenodinitrilotetractico sal dissdico

EROS Espcies Reativas de Oxignio

EtOH Etanol

H2O gua

INPA Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia

MeOH Metanol

PCR Reao em Cadeia de Polimerase

PLL- Partio Lquido Lquido

rDNA cido desoxirribonuclico ribossomal

Rf Fator de reteno

RMN Ressonncia Magntica Nuclear

TRIS-HCl Tampo Trizma base

UFAM Universidade Federal do Amazonas

UV Luz ultra-violeta

xv

SUMRIO

BANCA EXAMINADORA ............................................................................................. iii

RESUMO ....................................................................................................................... vii

ABSTRACT .................................................................................................................. viii

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... ix

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... xii

LISTA DE APNDICES ............................................................................................... xiii

LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................xiv

SUMRIO....................................................................................................................... xv

1. INTRODUO .............................................................................................................1

2. REVISO DE LITERATURA .......................................................................................4

2.1. Micro-organismos Endofticos .................................................................................4

2.2. Metablitos Produzidos por Micro-organismos ........................................................6

2.3. Pigmentos Naturais Produzidos por Micro-organismos ............................................9

2.4. Micotoxinas........................................................................................................... 16

2.5. Atividade Antioxidante.......................................................................................... 20

2.6. Atividade Toxicolgica ......................................................................................... 24

2.7. CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia ................................................ 25

2.7. Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) ................................................................ 27

3. OBJETIVOS ................................................................................................................ 30

3.1. Objetivo Geral ....................................................................................................... 30

3.2. Objetivos Especficos ............................................................................................ 30

4. MATERIAL E MTODOS .......................................................................................... 32

4.1. Coleta, Isolamento, Identificao e Conservao ................................................... 32

4.1.1. Isolamento de fungos filamentosos ................................................................. 33

4.1.2. Conservao dos isolados ............................................................................... 34

4.1.3. Seleo dos isolados produtores de pigmentos ................................................ 35

xvi

4.1.4. Identificao taxonmica clssica dos isolados ............................................... 35

4.1.5. Identificao taxonmica molecular dos isolados ............................................ 35

4.2. Anlises Bioqumicas ............................................................................................ 38

4.2.1. Ensaios de condies de cultivo ...................................................................... 38

4.2.2. Obteno dos pigmentos ................................................................................. 39

4.2.3. Ensaios de estabilidade dos extratos pigmentados ........................................... 39

4.2.4. Partio lquido - lquido ................................................................................ 40

4.2.5. Anlise cromatogrfica em camada delgada dos extratos ................................ 42

4.2.6. Anlises e purificao em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) .... 43

4.2.7. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear ........................................... 44

4.3. Ensaios Biolgicos ................................................................................................ 44

4.3.1 Ensaio antioxidante - metodologia empregando o DPPH ................................. 44

4.3.2. Ensaio de toxicidade utilizando Artemia salina ............................................... 46

4.3.3. Ensaios de atividade antimicrobiana ............................................................... 47

4.3.4. Metodologia molecular de caracterizao de produo de micotoxinas ........... 48

4.4. Meios de Cultivo e Solues.................................................................................. 50

4.4.1. gar Batata Dextrose ...................................................................................... 50

4.4.2. gar Sabouraud .............................................................................................. 51

4.4.3. Soluo NaCl 0,85% (p/v) .............................................................................. 51

4.4.4. cido Etilenodinitrilotetractico sal dissdico (EDTA) 0,5M pH 8,0 ............. 51

4.4.5. Tampo Tris-HCl pH 8,0 1M ....................................................................... 52

4.4.6. Clorofane ........................................................................................................ 52

4.4.7. Clorofil ........................................................................................................... 52

4.4.8. Tampo de extrao ........................................................................................ 52

xvii

4.4.9. Tampo de corrida TEB 10X .......................................................................... 53

4.4.10. Tampo da amostra ....................................................................................... 53

4.4.11. Gel de agarose (0,7% e 1,4%) ....................................................................... 53

4.5. Esterilizao .......................................................................................................... 54

5. RESULTADOS E DISCUSSES ................................................................................ 55

5.1. Coleta, Isolamento e Identificao dos Isolados Fngicos ...................................... 55

5.1.1. Identificao taxonmica dos isolados ............................................................ 55

5.1.2 Seleo dos isolados produtores de pigmentos ................................................. 56

5.2 Anlises Bioqumicas ............................................................................................. 58

5.2.1 Obteno do pigmento ..................................................................................... 59

5.2.2. Ensaios de condies de cultivo ...................................................................... 59

5.2.3 Ensaios de estabilidade .................................................................................... 62

5.2.4 Partio lquido-lquido ................................................................................... 63

5.2.5. Anlise cromatogrfica em camada delgada dos extratos ................................ 64

5.2.6. Anlises e purificao em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) .... 73

5.2.7. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear ........................................... 76

5.3 Ensaios Biolgicos ................................................................................................. 85

5.3.1 Ensaio antioxidante - metodologia empregando o DPPH ................................. 85

5.3.2 Ensaios de atividade antimicrobiana ................................................................ 87

5.3.3. Ensaios de toxicidade utilizando Artemia salina ............................................. 87

5.4. Ensaios Moleculares .............................................................................................. 90

6. CONCLUSES ........................................................................................................... 97

7. REFERNCIAS ........................................................................................................... 99

8. APENDICES ............................................................................................................. 108

1

1. INTRODUO

Tratando-se de micro-organismos, sabe-se que so fontes capazes de

produzir substncias qumicas resultantes do metabolismo primrio e secundrio,

envolvendo vias metablicas responsveis pela sntese de produtos naturais

(MELO, 2002). Potencialmente, possuem importncia biotecnolgica como

produtores de novos compostos farmacuticos, compostos aromticos e

pigmentos entre outras caractersticas, que podem ser encontradas por meio de

uma maior explorao dos mesmos (AZEVEDO et al., 2000). Estes micro-

organismos apresentam diversidade gentica e desempenham funes nicas e

cruciais na manuteno de ecossistemas e na produo de produtos

biotecnolgicos.

A maioria dos pigmentos naturais usados hoje para colorir alimentos vem

da famlia das Magnoliophyta (plantas frutferas). No entanto, pigmentos naturais

tambm so obtidos de outras fontes como insetos (cochinilia e lac), fungos

(Blakeslea trispora e Monascus spp.) e cianobactrias (Arthrospira spp.)

(MORTENSEN, 2006). O grande entrave em relao a produo/obteno de

pigmentos a partir de plantas e insetos o custo de produo, alm da

dependncia de condies climticas favorveis. O que torna os micro-

organismos fonte mais rentvel, segura e limpa de produo, uma vez que

atravs de tcnicas de fermentao em bioreatores (j bem estabelecidas e

utilizadas em larga escala) pode-se obter uma produo controlada e com

garantia de alta produtividade em qualquer poca do ano.

2

A deteco de metablitos bioativos o ponto inicial para uma estratgia

de abordagem na pesquisa por substncias com potencial para o uso em

frmacos, cosmticos, aditivos alimentcios e etc. Segundo Larsen e Hansen

(2008), fungos filamentosos, como Aspergillus, Fusarium e Penicillium produzem

alguns dos mais bem conhecidos e economicamente importantes produtos

naturais de origem fngica, incluindo substncias farmacuticas famosas como a

penicilina, o redutor de colesterol mevinolin, produzido por vrias espcies de

Aspergillus, e o antifngico e anticancergeno griseofulvina.

Pigmentos naturais podem ser obtidos de plantas ou micro-organismos,

estes ltimos sendo de grande interesse devido estabilidade do pigmento

produzido, baixo custo de produo e produtividade alta. Segundo Mortensen

(2006), os pigmentos alimentares podem ser divididos em quatro categorias: (1)

pigmentos naturais, (2) pigmentos idnticos aos naturais, (3) pigmentos sintticos

e, (4) pigmentos inorgnicos.

Por muitos anos, a maioria dos qumicos naturalistas estava mais

preocupada em isolar e elucidar a estrutura de molculas provenientes do

metabolismo secundrio do que em seu potencial como bioativos. Modernos

avanos nas tcnicas de separao e espectroscopia forneceram ferramentas

para a purificao e anlise estrutural que alcanaram nveis extraordinrios de

sensibilidade e sofisticao. De posse dessas ferramentas, qumicos de produtos

naturais se aventuraram em ensaios biolgicos para o isolamento de metablitos,

e esto agora guiando sua ateno para a bioatividade destas substncias

naturais (GHISALBERTI, 2008).

3

Na maioria dos pases, o uso de aditivos alimentares (incluindo pigmentos)

regulada por uma legislao bem restrita. Essa legislao especifica quais

pigmentos podem ser usados, a fonte desses pigmentos, a pureza da substncia,

em quais alimentos podem ser adicionados e a concentrao e quantidade desse

pigmento que pode ser adicionada em cada alimento. Isso se deve ao cuidado

dos rgos reguladores em evitar intoxicaes em massa ou a utilizao de

produtos que poderiam trazer algum tipo de problema a sade humana, como por

exemplo, a presena de micotoxina em cereais, gros e raes. Mtodos rpidos

e eficientes de deteco da presena de linhagens produtoras de micotoxinas so

importantes para a produo de controle de alimentos que sejam

toxicologicamente seguros para consumo humano e animal. Segundo Geisen

(1996) uma das tcnicas utlizadas comumente utilizadas para a deteco da

presena de micro-organismos patognicos e toxignicos em vrios substratos,

inclusive alimentos da PCR Reao em Cadeia da Polimerase.

Tendo em vista a grande importncia econmica e a demanda de consumo

dos pigmentos naturais, pelas indstrias, pretende-se buscar micro-organismos

isolados de frutos de Theobroma grandiflorum (cupuau), que gerem compostos

com potencial biotecnolgico. Em complementao a essa pesquisa, ampliar as

perspectivas para novos estudos sobre a Biodiversidade de Micro-organismos

isolados por tcnicas de cultivo tradicionais de plantas frutferas da Regio

Amaznica.

4

2. REVISO DE LITERATURA

2.1. Micro-organismos Endofticos

Evolutivamente as plantas vm desenvolvendo complexos mecanismos

adaptativos, muitos destes, somente possveis graas s interaes com os

micro-organismos. Destes micro-organismos destacam-se os endofticos que, em

pelo menos uma fase do seu ciclo de vida, habitam o interior de tecidos vegetais,

sem causar dano aparente aos mesmos (PEIXOTO NETO et al., 2004). Esta

classificao possui um cunho puramente didtico, onde, de acordo com Azevedo

et al. (2000), h um gradiente com interfaces entre endfito, patgeno e epiftico.

As interaes entre planta e endofticos ainda no so bem

compreendidas, mas podem ser: simbiticas, neutras ou antagnicas. Nas

interaes simbiticas o micro-organismo produz ou induz a produo de

metablitos primrios e secundrios que podem conferir diversas vantagens

planta, tais como: diminuio da herbivoria e do ataque de insetos, aumento da

tolerncia a estresses abiticos e o controle de outros micro-organismos.

(RODRIGUES & DIAS-FILHO, 1996). Por exemplo, a planta fornece carbono para

o desenvolvimento do fungo que em contrapartida, pode proteger a planta contra

o ataque de mamferos ou insetos herbvoros, produzindo alcalides e/ou outros

componentes txicos (COSTA PINTO et al., 2000).

O primeiro relato de isolamento de fungos endofticos em plantas tropicais

foi feito por Dreyfuss & Petrini (1984) em Araceae, Bromeliaceae e Orchidaceae

da Guiana Francesa, Brasil e Colmbia. Depois disso, alguns grupos de plantas

5

foram investigados para a presena de endofticos, principalmente palmeiras e

rvores frutferas (AZEVEDO et al., 2000). Sieber et al. (1988) relataram que a

presena de fungos endofticos um fenmeno geral e comum aos vegetais, pelo

fato de que, em todas as plantas j investigadas foram encontrados tais micro-

organismos.

Endofticos examinados a partir de uma gama enorme de fontes

demonstraram que uma grande quantidade destes produzem produtos naturais

com potencial para muitas aplicaes. Essa afirmao se faz especialmente

correta, quando esses endofticos provem de plantas superiores existentes em

florestas tropicais, uma vez que existe uma enorme variedade microbiolgica

nessas regies (STROBEL & CASTILLO, 2008).

Com o avano de tecnologias, o conhecimento das potencialidades e uso

dos fungos endofticos vem aumentando a motivao em pesquisas, evidenciando

muitas aplicaes biotecnolgicas. Os micro-organismos asssociados s espcies

de plantas, as quais so fontes riqussimas de produtos metablicos

(anticancergenos, antimicrobianos, antivirticos, agentes anticancergenos)

podem, em determinado momento, dispor da matria prima com potencial to

elevado quanto aqueles disponveis pelos seus hospedeiros, sugerindo a

importncia da planta hospedeira, influenciando o metabolismo dos endfitos

(STROBEL & DAISY, 2003).

A consolidao de estudos com espcies tropicais tem-se intensificado na

Amaznia por meio de pesquisas desenvolvidas em palmeiras (RODRIGUES,

1994), Theobroma grandiflorum (MEDEIROS-GALVO, 1998), Copaifera

multijuga (CASSA-BARBOSA, 2001), Bactris gasipaes (COSTA NETO, 2002),

6

Manihot esculenta Crantz (RONDON, 2003) e Paulicorea longiflora e Strychnos

cogens (SOUZA, et al., 2004), todas desenvolvidas na Universidade Federal do

Amazonas.

O aumento dos estudos com plantas tropicais, possibilitar uma melhor

compreenso dos mecanismos simbiticos desenvolvidos, e um melhor

aproveitamento do seu potencial biotecnolgico, principalmente com relao ao

metabolismo secundrio. Tendo em vista a grande biodiversidade vegetal de

clima tropical em pases da Amrica Latina, estima-se que cada espcie vegetal

possua micro-organismos endofticos ainda no classificados. E portanto

apresentando diversidades genticas capazes de prover compostos

estruturalmente diversificados com atividades biolgicas pouco conhecidas,

gerando um potencial de aplicao para a produo em escala de compostos de

alto valor agregado, alm de possibilitar o avano de estudos, no que se refere s

interaes desses metablitos com o ecossistema (PEIXOTO NETO et al., 2004).

2.2. Metablitos Produzidos por Micro-organismos

Sabe-se que os micro-organismos so fontes capazes de produzir

substncias qumicas resultantes do metabolismo primrio e secundrio,

envolvendo vias metablicas responsveis pela sntese de produtos naturais,

sendo derivados dos precursores, gerados atravs da energia do metabolismo

primrio (MELO, 2002). A produo destes metablitos pode ser aumentada a

partir da otimizao dos componentes que participam dos meios de crescimento,

das condies em que se realiza a fermentao e da otimizao do processo de

7

downstream, etapas estas, fundamentais para o processo de recuparao do

produto final, de melhor qualidade e em maior concentrao (PADILLA, 2002).

Metabolismo secundrio est comumente associado com processos de

esporulao e produo de metablitos. Metablitos secundrios podem ser

organizados em trs diferentes categorias: (i) metablitos que controlam a

esporulao, (ii) pigmentos necessrios para as estruturas de esporulao, e (iii)

metablitos txicos secretados pelas colnias em crescimento mais ou menos no

mesmo momento em que ocorre a esporulao (micotoxinas) (SANZANI, et al.,

2012).

Baseando-se em todos os avanos de tcnicas biotecnolgicas, por meio

do conhecimento da fisiologia de crescimento do micro-organismo, do

desenvolvimento de novos equipamentos e dos avanos da biologia molecular e

engenharia gentica, tem-se conseguido incrementos substanciais na produo e

caracterizao de compostos de aromas, leos, frmacos etc, a partir do cultivo

de micro-organismos. Entre os micro-organismos isolados e estudados para a

bioprospeco de compostos bioativos, destacam os endofticos. O grande

interesse nos micro-organismos endofticos est associado ao seu potencial

biotecnolgico.

Fungos filamentosos possuem propriedades que podem desempenhar um

papel importante no estilo de vida dos humanos e no ambiente, participando da

produo de alimentos, produtos de sade e reciclando compostos orgnicos na

biosfera. O potencial bioqumico e a adaptao a condies extremas de vida so

fatores importantes no ciclo de vida dos micro-organismos e tm sido explorados

8

na produo de molculas como antibiticos, enzimas, cidos orgnicos e

pigmentos (HAJJAJ et al., 2000).

Endofticos isolados, como Xylaria sp possuem fatores de crescimento

como a giberelina ou ainda, substncias antitumorais como o taxol, encontradas

em Taxomyces andreanae (STROBEL & DAISY, 2003). Vrios outros estudos

podem ser citados como aqueles desenvolvidos com a planta aqutica

Rhyncholacis penicillata, onde o estudo de endofticos desta espcie, revelou a

existncia da bactria Serratia marcescens que possua como metablito bioativo

um potente antifngico (STROBEL et al., 1999). Ainda dentro dos trabalhos

realizados com micro-organismos isolados da Floresta Tropical, temos o fungo

endoftico Colletotrichum dematium, isolado da planta Pteromischum sp., que

apresenta um peptdeo imunossupressor, a Colutellin A com grande potencial

farmacolgico (REN et al., 2008). Outros metablitos produzidos pelos endfiticos

so as toxinas, identificadas a partir de tecidos fngicos, tais como os alcalides,

N-formil e N-acetil lolina, eramina, lolitrem B, ergovalina, dentre outras. A

produo destes metablitos pode ser influenciada por fatores biticos e/ou

abiticos, estando relacionados com a situao fisiolgica do prprio hospedeiro

(AZEVEDO et al., 2000).

Recentemente, endofticos do gnero Colletotrichum foram isolados de

Artemisia annua, erva medicinal de onde se extrai a droga antimalrica

artemisinina, sendo detectada a sntese de pelo menos 11 compostos produzidos

pelo endfito onde a maioria exibiu atividade in vitro antifngica e bactericida (LU

et al., 2000). Strobel & Daisy (2003) citam Pestalotiopsis microspora como um

endfitico tipicamente tropical, mostrando grande diversidade bioqumica,

9

consequentemente maior produo de metablitos secundrios pelas mais

diversas linhagens deste micro-organismo. Um endfitico desta espcie foi

isolado de Torreya taxifolia, produzindo vrias combinaes de metablitos com

atividade antifngica, incluindo pestalosideo, um aromtico -glucosdio, e duas

pironas: pestalopirona e hidroxipestalopirona. Estes produtos tambm apresentam

propriedades fitotxicas.

2.3. Pigmentos Naturais Produzidos por Micro-organismos

A utilizao de pigmentos naturais em alimentos tem aumentado nos

ltimos anos em razo das vantagens de marketing em utilizar ingredientes

naturais e em razo da preocupao do consumidor sobre eventuais efeitos

prejudiciais que os pigmentos sintticos possam causar. Como por exemplo o

Fast Green, pigmento amplamente utilizado como colorante em alimentos, foi

demonstrado como sendo um agente imunotxico (ALI & BASHIER, 2006).

A atual preferncia do consumidor por corantes de origem natural est

associada com a imagem de que estes so saudveis e de boa qualidade.

Pigmentos naturais tem aumentado sua popularidade por que os pigmentos

sintticos tendem a ser vistos como indesejveis ou prejudiciais sade; alguns

sendo considerados como responsveis por alergias e reaes de intolerncia

(WISSGOTT & BORTLIK, 1996). A cor possui um importante papel no alimento

que consumimos. Por exemplo, quando confrontado com uma cor no atraente, o

consumidor assume que o alimento pobre ou estragado. Em contrapartida,

10

alimentos com cores atpicas por exemplo, queijo verde ou bebidas azuis na

maioria das vezes so rejeitadas pelo consumidor (DUFOSS, 2006).

Ao final do sculo XIX, o desenvolvimento da indstria de alimentos levou

produo de inmeros corantes sintticos, os quais chegaram a totalizar o

nmero de 700. Prevaleceram razes de ordem esttica em detrimento da

qualidade do produto. Seguiu-se ento a formulao de leis para uso destes

corantes, com o objetivo de proteger a sade do consumidor. Assim, no incio do

sculo XX, uma lista dos corantes permitidos foi divulgada nos EUA e hoje,

apenas sete corantes sintticos so permitidos (MORITZ, 2005).

No existem estatsticas confiveis sobre o tamanho do mercado de

pigmentos, entretanto, em uma escala global, estima-se que gire em torno de 940

milhes de dlares por ano, dos quais 250 milhes de dlares so voltados para a

produo de pigmentos naturais (DOWNHAM & COLLINS, 2000). As vendas

totais de corantes e pigmentos da indstria qumica brasileira foram de US$ 274

milhes, em 1995, tendo decrescido em relao a 1990, quando atingiu US$ 391

milhes. Das indstrias brasileiras de corantes, cerca de 60% so produtoras de

corantes naturais e 10% de sintticos. Dentre os corantes naturais, o urucum o

mais produzido. Essas empresas, na sua grande maioria, no so exportadoras

(MAIMOM, 2000).

Quase todos os pigmentos naturais presentes nos alimentos possuem

estruturas complexas com diferentes grupos funcionais nas molculas. Os

principais tipos de pigmentos naturais esto agrupados pelo tipo de estrutura

bsica em: porfirinas, betalanas, flavonides, antocianinas (cores azul e

vermelho), antoxantinas, (cores nos tons amarelos), leucoantocianidinas

11

(incolores), carotenides, taninos e outros pigmentos (quinonas cido carmnico,

polifenis, Monascus - Monascin, etc.) (BOBBIO e BOBBIO, 1995). Como plantas,

fungos filamentosos sintetizam produtos naturais por possurem uma funo

ecolgica e so de algum valor para o produtor. Dependendo do tipo de

substncia, ela possui diferentes funes- variando entre uma funo de proteo

contra foto-oxidao a proteo contra estresse ambiental, ou agindo como um

co-fator na catalise de enzimas (MAPARI, et al., 2005).

Pesquisadores na rea de desenvolvimento de produtos alimentcios

freqentemente buscam novas fontes alternativas de materiais para corar

alimentos (WISSGOTT & BORTLINK, 1996). Ao contrrio das plantas, fungos so

adequados para a produo biotecnolgica de pigmentos devido ao fato de

crescerem usando tcnicas de cultura conhecidas (DURAN, et al., 2004).

Considerando a estabilidade de derivados do gnero Monascus durante o

processamento de alimentos e da extraordinria diversidade de pigmentos

fngicos, os fungos prometem ser a fonte mais provvel de novos pigmentos

(WISSGOTT & BORTLINK, 1996). Pigmentos de origem microbiana possuem a

vantagem de serem produzidos em condies que independem do clima, no

requerem uma grande rea para seu crescimento e podem ser produzidos em

qualquer quantidade e em um curto perodo de tempo (FRANCIS, 1987).

Uma rota alternativa para a produo de colorantes naturais para alimentos

a utilizao de aplicao de ferramentas biotecnolgicas de micro-organismos

(MAPARI, et al., 2005). Pigmentos naturais, produzidos por micro-organismos,

vem ganhando ateno pela industria de alimentos na Europa e Estados Unidos

devido a estabilidade do pigmento produzido, a possibilidade de produo

12

industrial e a viabilidade da tecnologia de cultivo que pode ser otimizado para

grandes quantidades (MAPARI, et al., 2006).

Algas unicelulares e fungos so melhores opes para novos pigmentos

derivados de biotecnologia. Um recente desenvolvimento foi o do -caroteno

produzido pelo fungo Blakeslea trispora. Carotenos so produzidos por

fermentao em reatores. Este tem sido atualmente comercializado como um

colorante natural de alimentos por Gist Brocades (DSM Gist Brocades Delf,

Heerlen, The Netherlands) (DOWNHAM & COLLINS, 2000).

Pigmentos caractersticos so produzidos por uma grande variedade de

fungos. Espcies de Drechslera produzem hidroxiantraquinonas (pigmentos

marrom, vermelho, bronze), ou o composto similar, eritroglaucina (vermelho), que

produzido por Aspergillus glaucus produtor tambm de auroglaucina (laranja) e

flavoglaucina (amarelo). Muitas micotoxinas so pigmentadas, p. ex.,

naftoquinonas de Penicillium e Aspergillus (Duran, et al., 2004). Pigmentos

vermelhos de Monascus e/ou pigmentos amarelos so eficientemente produzidos

por vrias linhagens comercialmente importantes (SHIN, 1998).

Os mais importantes pigmentos, as antraquinonas, foram por muito tempo,

de crucial importncia na indstria de corantes (HOBSON & WALES, 1998).

Esses metablitos seguramente so secundrios e no possuem funo clara no

crescimento celular. Eles so sintetizados por um perodo finito por clulas que

no so mais de crescimento vegetativo. Ao contrrio, o metabolismo primrio

inclui todos os processos anablicos e catablicos que esto finamente

equilibrados para manter o organismo vivo. Existe uma srie de metablitos

secundrios que so usados pela Biotecnologia moderna e foram principalmente

13

obtidos de plantas, p. ex., ndigo, cido carmnico, conina, etc, que foram

aplicados em corantes, perfumes, condimentos, compostos txicos, agentes

farmacolgicos e cosmticos (DURAN, et al., 2004).

Naftoquinonas so amplamente distribudas na natureza e tm sido

encontradas tambm em fungos (PARISOT et al., 1990) e em actinomicetos

(TANAKA, et al. 1975). Em fungos, os pigmentos naftoquinmicos so muito

comuns e tm sido alvo de numerosos estudos. Os pigmentos naftoquinmicos

relacionados fusarubina obtida do fungo Fusarium solani (Mart) (PARISOT et

al., 1990) tm sido descritos em detalhes. Pigmentos de isolados do gnero

Monascus solveis em gua so de grande interesse biotecnolgico

(MARGALITH, 1992). Recentemente Jiang et al. (2005) isolaram um Penicillium

sp endoftico produtor de um pigmento vermelho solvel em gua e termoestvel

com estrutura semelhante ao policetdeo vermelho produzido por isolados do

gnero Monascus.

No s micro-organismos endofticos foram identificados como produtores

de pigmentos. O fitopatgeno, Fusarium verticillioies isolado do solo apresentou

produo de naftoquinmicos e estudos comparativos para otimizao da

produo em meio lquido mostraram uma produtividade excelente

(BOONYAPRANAI, et al., 2008). O fungo entomopatognico Cordyceps

unilateralis foi identificado como produtor de seis pigmentos extracelulares

naftoquinmicos (UNAGUL, et al., 2005).

Recentemente Mapari, et al. (2009) realizaram estudos com espcies de

ascomicetos produtores de pigmentos, avaliando seu potencial para a produo

de pigmentos associado ou no com a produo de micotoxinas. Estes estudos

14

mostraram que os isolados de Penicillium purpurogenum testados produziram um

pigmento similar a N-glutarylmonascorubramine, o pigmento vermelho

termoestvel produzido por Monascus, mas sem a produo de micotoxinas.

Monascus pode produzir pigmentos amarelos, alaranjados e vermelhos, mas

estes no so hidrosolveis, so instveis em pH extremo (2 e 14), em calor e

exposio luz. Outra desvantagem que o gnero conhecido por produzir

micotoxinas como citrinina (HAJJAJ, et al., 2000).

Ascolor s.r.o. (Repblica Checa) possui vrias patentes relacionadas a uma

linhagem fngica de P. oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 produtora de um

pigmento vermelho que pode ser aplicado na indstria alimentcia e cosmtica.

Linhagem que foi obtida do solo e produz um cromforo do famlia das

antraquiinonas. Arpink Red foi aprovado para uso pela Comisso do Codex

Alimentarius (2002) para uso em carnes e produtos anlogos de carnes, bebidas

no alcolicas, sorvetes e derivados de leite (DUFOSS, et al., 2005).

A indstria de corantes vem sofrendo com o aumento dos custos das

matrias-primas e da energia para a sntese, bem como com a presso para

minimizar os danos ao ambiente causados pelo processo de produo, o qual

gera efluentes. Logo, as indstrias esto buscando vias mais econmicas e

amigveis ao ambiente para os corantes existentes. Por meio de tcnicas

biotecnolgicas, antraquinonas tem sido isoladas de inmeros fungos, p. ex.,

Trichoderma, Drechslera, Aspergillus, Curvularia (HOBSON et al., 1997; GILL,

2003). Uma grande variedade de vegetais, plantas, animais e micro-organismos

produzem pigmentos. Sua forma de produo variada e a tecnologia utilizada

para sua produo, depende principalmente, do agente empregado neste

15

processo (MORITZ, 2005). Explorando a sntese fngica de antraquinonas,

observam-se vrias vantagens em comparao com os mtodos qumicos

utilizados atualmente que requerem altas temperaturas, altos custos energticos e

a utilizao de cidos e alcalis, pouco amigveis da sntese orgnica, no so

necessrios (DURAN,et al., 2004).

Apesar do enorme potencial econmico do pigmento de Monascus, este

no levado para explorao comercial no mundo ocidental, devido a ignorncia

e tambm a relutncia a mudanas pelas agncias pblicas de alimentos. Na

verdade essas agncias no aprovam o uso de pigmentos de Monascus para seu

uso na indstria de alimentos apesar de aparentarem no serem txicos com seu

uso frequente. Apesar de que espcies de Monascus tem sido consumidas no

Oriente por muitos anos, isso no ajuda o pigmento a ganhar aprovao pelas

Unio e Europia e Estados Unidos (DUFOSS, et al., 2005).

Enquanto os pigmentos sintticos esto sendo reduzidos, o mercado de

pigmentos naturais est em expanso. Neste contexto, os mtodos mais

adequados de produo e extrao destes pigmentos merecem ser estudados. A

base cientfica brasileira deve ser incrementada para a industrializao e

introduo destes produtos de origem biotecnolgica principalmente no mercado

nacional. Porm, mesmo nos pases da Unio Europeia, a fermentao submersa

para a produo de pigmentos, ainda um campo a ser explorado (MORITZ,

2005). Alm de promover diversidade funcional ao hospedeiro, esses pigmentos

exibem uma estrutura nica e diversidade qumica com uma extraordinria gama

de cores. Como esses pigmentos so solveis em gua eles no requerem

16

modificaes qumicas ou o uso de carreadores e estabilizantes para disperso

em alimentos (MAPARI, et al., 2005).

Os corantes vermelhos produzidos por culturas em meios slidos (arroz,

por exemplo) so os mais estudados na sia, por diversas espcies do gnero

Monascus; utilizados principalmente para colorir alimentos fermentados

(PASTRANA, et al., 1995). Tal fato demonstra que os pases em

desenvolvimento tambm podem investir neste campo de conhecimento,

buscando competir neste mercado, principalmente o Brasil devido a sua imensa

biodiversidade. Suas propriedades teraputicas e sua relativa estabilidade com

respeito ao pH e temperatura so aspectos importantes para que possam

substituir os corantes sintticos (MORITZ, 2005).

2.4. Micotoxinas

Fungos produzem uma grande gama de substncias, com uma enorme

variedade de estruturas qumicas e atividade biolgica. Certos metablitos

fngicos so altamente desejveis em alguns alimentos como queijos, enquanto

outros so importantes antibiticos, como penicilina, por exemplo. Entretanto,

alguns fungos podem produzir substncias que so potentes toxinas ou

carcinognicos tanto para animais como para seres humanos. Esses agentes

txicos so comumente chamados de micotoxinas, um termo reservado para

descrever toxinas produzidas por fungos filamentosos (SHIBAMATO &

BJELDANES, 1993). A contaminao de alimentos e produtos alimentares por

micotoxinas um problema mundial. Alguns fungos so capazes de produzir mais

17

de uma micotoxinas, e algumas micotoxinas so produzidas por mais de uma

espcie fngica (HUSSEIN & BRASEL, 2001).

Segundo Shibamato & Bjeldanes (1993), o impacto desses fungos em

doenas humanas tambm tem sido reconhecido por sculos, mas o seu papel

como possveis carcinognicos tem sido tema de pesquisas apenas a partir da

dcada de 1960. Centenas de micotoxinas foram identificadas e so produzidas

por mais de 200 espcies, dentro dos gneros de fungos Aspergillus, Penicillium e

Fusarium. So fungos que so encontrados no ambiente e fazem parte da flora

microbiana de plantas (FORSYTHE, 2002). As micotoxinas so metablitos

secundrios poliquetideos, cuja estrutura carbnica proveniente do acetato e do

malonato (JAY, 2005).

A toxicidade das micotoxinas est classificada em quatro classes: aguda,

resultando em danos aos rins e fgado; crnica, resultando em cncer de fgado;

mutagnica, causando danos ao DNA; e teratognica, causando maformao

congnita (FORSYTHE, 2002).

No que tange indstria de alimentos os novos corantes devem ser

submetidos a ensaios toxicolgicos para garantir a segurana do seu uso

(MASCARENHAS, 1999). Para que um aditivo alimentar ou coadjuvante de

tecnologia seja aprovado no Brasil so consideradas referncias

internacionalmente reconhecidas, como o Codex Alimentarius, a Unio Europia

e, de forma complementar, a U.S. Food and Drug Administration FDA. Esse

critrio estabelecido pela legislao brasileira Portaria SVS/MS n. 540/1997

e pelo MERCOSUL GMC/RES. N 52/98.

18

Como o objetivo deste trabalho buscar pigmentos que possam ser

utilizados na indstria alimentcia e cosmtica, faz-se necessria a identificao

de linhagens produtoras dessas substncias txicas. Pois linhagens que

produzam pigmentos, mas que tambm produzam micotoxinas, no podem ser

utilizadas para consumo humano, inviabilizando sua utilizao. Uma das

metodologias utilizadas para avaliar se um micro-organismo produz ou possui o

potencial para a produo de determinadas micotoxinas por identificao do

gene por tcnicas moleculares. Essa metodologia emprega o uso de PCR

(Reao em Cadeia da Polimerase) para a identificao dos genes produtores ou

de genes que faam parte da via biosinttica de cada micotoxina.

Segundo Paterson e colaboradores (2006), ocratoxina A talvez a mais

importante toxina produzida pelo taxon Peniciilium. Patulin a segunda mais

importante micotoxina do gnero e possui legislao bem restrita em relao a

sua presena principalmente em alimentos para bbes a base de frutas pela

Unio Europeia (2004).

As ocratoxinas consistem em um grupo de pelo menos sete metablitos

secundrios relacionados estruturalmente, do quais a ocratoxina A a mais

conhecida e txica. produzida por um grande nmero de fungos, incluindo

Aspergillus ochraceus, Aspergillus ostianus, Aspergillus mellus, entre outras

espcies de Aspergillus. Entre os fungos do gnero Penicillium que produzem a

ocratoxina, esto Penicillium viridicatum, Penicillium cyclopium e Penicillium

variable (JAY, 2005). Ocratoxina A uma micotoxina com efeito nefrotxico que

tambm possui propriedades hepatotxica, imunognica e teratognica

(HOHLER, 1998). Tambm classificada como um carcinognico de classe II

19

pela Organizao Mundial da Sade (PTZINGER & ZIEGLER, 2000).

predominantemente nefrotxica e est relacionada a epidemiologia da

nefropatologia em sunos e possivelmente na nefropatologia endmica em

humanos em Balkan, tambm sendo evidente seu efeito carcinognico (MOSS,

2002).

A patulina foi isolada pela primeira vez por Birkinshaw e colaboradores em

1943 de Penicillium griseofulvum e Penicillium expansum. Esse trabalho fez parte

do esforo em buscar por novas molculas com propriedades antibiticas

produzidas por fungos, em meio ao entusiasmo que a descoberta da penicilina

por Fleming causou (PUEL, et al., 2010). Mas estudos posteriores demonstraram

que a patulina possua efeitos txicos no s contra fungos e bactrias, mas

tambm em animais. Apesar de que a patulina produzida por diferentes gneros

de fungos e espcies (MOAKE, et al., 2005), na maioria das vezes associada a

P. expansum, o agente causal do mofo azul de frutos do tipo pomo,

principalmente mas ( SANZANI, et al., 2012). a toxina mais comumente

encontrada em mas, produtos derivados de maa como sucos, cidra, compotas

e alimentos direcionados a alimentao infantil. A exposio a essa micotoxina

est associada a problemas imunolgicos, neurolgicos e gastro-intestinais. O

conhecimento dos riscos a sade humana devido a exposio a patulina levaram

muitos pases a organizar medidas reguladoras de qualidade dos alimentos

(PUEL, et al., 2010).

As aflatoxinas so as micotoxinas mais amplamente estudadas, so

conhecidas desde 1960, quando mais de 100 mil perus morreram na Inglaterra

aps ingerirem rao contendo amendoim importado da frica e Amrica do Sul.

20

A partir da rao, foram isolados Aspergills flavus e a toxina que este produzia (A-

fla-toxina Toxinda do Aspergillus flavus) (JAY, 2005). As aflatoxinas produzem

necrose aguda, cirrose e carcinoma no fgado em diversas espcies animais:

nenhuma espcie animal resistente aos efeitos agudos das aflatoxinas, portanto

lgico assumir que humanos podem ser afetados da mesma forma

(FORSYTHE, 2002). Aflatoxinas so metablitos secundrios txicos e

carcinognicos produzidos primeiramente pelo fungo filamentoso Aspergillus

flavus e Aspergillus parasiticus (YU, et al., 2004). As aflatoxinas de maior

interesse so caracterizadas como B1, B2, G1 e G2, pela fluorescncia de cor azul

(B) ou verde (G) que ocorre quando visualizadas sob luz ultravioleta. Essas

toxinas so usualmente encontradas juntas em diversos alimentos e raes e em

vrias propores. Entretanto, a aflatoxina B1 a mais encontrada e a mais txica

(FORSYTHE, 2002). Um total de 25 genes envolvidos na biosntese da aflatoxina

j foram identificados. A descoberta dos genes envolvidos na formao da

aflatoxina aumentam o entendimento sobre a sua biosntese (YU, et al., 2004).

Explorar a diversidade qumica dos fungos por uma metodologia qumico-

taxonmica, onde a pr-seleo de linhagens no toxicognicas e no

patognicas assegurada, uma forma de identificao de potenciais fungos

produtores de pigmentos como fonte de colorantes para a indstria alimentcia

(MAPARI, et al., 2006).

2.5. Atividade Antioxidante

21

Tem aumentado s evidncias de que muitos componentes alimentares

apresentam benefcios funcionais adicionais ao corpo humano. Nossa preferncia

instintiva em ingerirmos alimentos naturalmente coloridos (como frutas e vegetais)

ao invs de alimentos coloridos est relacionada ao pensamento de que a

natureza pode nos oferecer, em nossa dieta, certas substncias fito-qumicas com

micronutrientes e vitaminas, que estariam naturalmente presentes nesses

alimentos. Antioxidantes naturais so agora conhecidos por sua possvel

capacidade de prevenir doenas ocidentais como cncer e doenas cardacas,

uma vez que essas doenas estariam associadas a falta da ingesto de frutas e

vegetais na dieta. Apesar da maioria das pessoas saber que recomendada a

ingesto de pelo menos 5 pores de frutas e vegetais por dia, menos de 10% da

populao alcana essa meta (DOWNHAM & COLLINS, 2000).

Os radicais livres so tomos ou molculas produzidas continuamente

durante os processos metablicos e atuam como mediadores para a transferncia

de eltrons em vrias reaes bioqumicas, desempenhando funes relevantes

no metabolismo. As principais fontes de radicais livres so as organelas

citoplasmticas que metabolizam o oxignio, o nitrognio e o cloro, gerando

grande quantidade de metablitos (MENDEZ & RODRIGUEZ, 1997).

O estresse oxidativo o desequilbrio entre a gerao de Espcies

Reativas de Oxignio (EROs) e os mecanismos de defesa do organismo. EROs

em excesso podem originar no organismo, atravs de falha na respirao

mitocondrial, ativao de polimorfismo nuclear, cido araquidnico, ativao-

inibio de sistemas enzimticos, e catlise da ligao de ferro ou cobre (fatores

endgenos) (NUEZ-SELLS, 2005).

22

O aumento de radicais livres, assim, est relacionado com o processo de

envelhecimento do corpo humano, assim como o aparecimento de tumores e o

dano tecidual (WILHEM-FILHO et al., 2001). Dessa forma, j se conhece bastante

sobre o papel dos radicais livres nos processos gerao de doenas, buscando-

se agora tentativas de interveno que possam minimizar os danos causados.

Tais intervenes precisam, obviamente, assumir a forma de um ataque aos

radicais livres, e este se d pelo uso de substncias com atividade antioxidante

(BALESTRIN, 2006). Os melhores produtos antioxidantes so os que impedem o

excesso de EROs, atravs da estimulao do mecanismo de reparo antioxidante,

ou atravs da doao ou captura de eltrons para a estabilizao do radical livre

(NUEZ-SELLS, 2005). Os antioxidantes podem definir-se como substncias

que, em uma concentrao consideravelmente menor que a do substrato

oxidvel, retardam o estresse oxidativo, diminuindo a velocidade da reao ou

prolongando o seu perodo de induo.

As leses causadas pelos radicais livres nas clulas podem ser prevenidas

ou reduzidas por meio da atividade de antioxidantes, sendo estes encontrados em

muitos alimentos (PAPAS, 1999). Os antioxidantes podem agir diretamente na

neutralizao da ao dos radicais livres ou participar indiretamente de sistemas

enzimticos com essa funo. Dentre os antioxidantes esto a vitamina C, a

glutationa, o cido rico, a vitamina E os carotenides (HALLIWELL &

GUTTERDGE, 1999). Estudos mostram que o licopeno pigmento vermelho

usualmente encontrado no fruto do tomate e em frutas vermelhas - protege

molculas de lipdios, lipoprotenas de baixa densidade, protenas e DNA contra o

23

ataque dos radicais, tendo um papel essencial na proteo de doenas (SHAMI &

MOREIRA, 2004).

Os componentes de muitos frutos vermelhos como uvas, cereja, mirtilios e

framboesas so conhecidos por representarem um significante papel na

preveno ou retardo do aparecimento de muitas doenas. Os componentes

fenlicos presentes incluem: antocianinas, cidos fenlicos, flavanides e taninos

(DOWNHAM & COLLINS, 2000).

Extratos que possuem atividade antioxidante usualmente contm

substncias fenlicas, por exemplo, cumarinas, flavonides, e catequinas

(DAPKEVICIUS et al., 1998). cidos orgnicos, carotenides, tocoferis,

protenas, taninos podem estar presentes e terem atividade como antioxidantes

ou ter um efeito sinrgico com substncias fenlicas. Estudos recentes vm

demonstrando que a atividade antioxidante est relacionada com o nmero de

grupos hidroxilas livre (MOSADDIK et al. , 2004). Pode estar relacionado,

tambm, com o tamanho da cadeia carbnica com ligaes duplas conjugadas

(SHAMI & MOREIRA, 2004). Duas substncias, pestacin e isopestacin, foram

obtidas de culturas lquidas de Pestalotiopsis microspora, um endoftico isolado de

uma planta da famlia Combretacea, Terminalia morobensis. Tanto pestacin como

isopestacin apresentaram atividade antioxidante (STROBEL & CASTILLO, 2008).

Antocianinas so flavanides que em frutas e vegetais lhes conferem uma

colorao viva que vai do vermelho ao azul. O consumo de antocianinas na dieta

alto, devido sua grande distribuio em vegetais. Baseado em muitos estudos

com linhagens de clulas, estudos com animais e triagens clnicas em humanos,

tem sido sugerido que as antocianinas possuem atividade antiinflamatria e anti-

24

carcinognica, previnem doenas cardiovasculares, controlam obesidade e o

aumento de diabetes, todas elas associadas em maior ou menor nvel com sua

potente capacidade antioxidante (HE & GIUSTI, 2010).

2.6. Atividade Toxicolgica

Com o objetivo de avaliar a toxicidade de extratos, fraes e substncias

atravs de um bioensaio com um sistema de screening rpido e sensvel, novas

metodologias foram desenvolvidas (GONZLES et al., 2007), entre elas o ensaio

empregando larvas Artemia salina.

Artemia salina um organismo sensvel a um amplo espectro de

substncias com atividades biolgicas, sendo que o bioensaio utilizando este

organismo foi inicialmente proposto por Michael e colaboradores (1956), onde se

avaliou a toxicidade de inseticidas. O ensaio permite a avaliao de metablitos e

extratos txicos e tambm para a determinao da concentrao que a

porcentagem de mortalidade seja de 50% dos indivduos (CL50) (GONZLES et

al., 2007).

Artemia salina um microcrustceo da ordem Anostraca que vive em lagos

de gua salgada e salinas de todo o mundo, e como utilizado como alimento

para peixes, cistos (ovos) de A. salina so facilmente encontrados em lojas de

aquaristas. Alm disso, os ovos no eclodidos so metabolicamente inativos, e

podem ser conservados por longos perodos se mantidos desidratados e a baixas

temperaturas (MICHAEL et al., 1956). Quando reidratados, os cistos de A. salina

25

eclodem em cerca de 24 horas, sendo que o ciclo de vida relativamente curto

favorece seu uso em ensaios de toxicidade (McLAUGHLIN et al., 1998).

Esse ensaio mais utilizado em laboratrios com recursos limitados e

fornece uma metodologia particularmente til na deteco de substncias

bioativas. Tem sido utilizado para avaliar plantas com potencial atividade

farmacolgica, para guiar o isolamento de novas substncias bioativas

(GHISALBERTI, 2008).

2.7. CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

A cromatografia envolve uma srie de processos de separao de

misturas. A cromatografia acontece pela passagem de uma mistura atravs de

duas fases: uma estacionria (fixa) e outra mvel. A grande variabilidade de

combinaes entre as fases mvel e estacionria faz com que a cromatografia

tenha uma srie de tcnicas diferenciadas (DEGANI et al., 1998).

A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia CLAE, um tipo de

cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais

especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sob altas presses. Ela

tem a capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas de uma grande

quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de

tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade

(COLLINS et al., 1993).

O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a

utilizao de suportes com partculas diminutas responsveis pela alta eficincia,

26

as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso para a eluio da

fase mvel, devido sua baixa permeabilidade. As fases mveis utilizadas em

CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros

gases dissolvidos, sendo filtradas e degaseificadas antes do uso. A bomba deve

proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade,

possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado (SKOOG & LEARY,

1992).

O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de

ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de ndice de

refrao, eletroqumicos, entre outros. O registro de dados pode ser feito atravs

de um registrador, um integrador ou um microcomputador (DEGANI et al., 1998).

O suporte mais comumente utilizado a slica. O uso de fases

estacionrias lquidas adsorvidas a um suporte no tem grande aplicao devido

perda de fase estacionria, mas o uso de suportes modificados, os quais foram

desenvolvidos como conseqncia do problema acima, possibilita a produo de

uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de

seletividade. As fases assim obtidas so chamadas de quimicamente ligadas.

Essas fases, dependendo da modificao feita ao suporte, podem atuar no modo

normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionria

mais polar que a fase mvel, e em fase reversa, a fase mvel mais polar

(YUNES & CALIXTO, 2001)

O sistema mais freqentemente utilizado em Cromatografia Lquida (CL)

a fase reversa, o qual separa por partio e adsoro, atravs de grupos silanol

no protegidos. Neste sistema, os compostos so adsorvidos fase estacionria

27

(de menor polaridade) at serem eludos pela fase mvel com adequada

polaridade (DEGANI et al., 1998).

A versatilidade desta tcnica reside no grande nmero de fases

estacionrias existentes, as quais possibilitam anlises e separaes de uma

ampla gama de compostos com alta eficincia. Tem sido utilizada em vrias reas

da cincia, no acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas,

ferormnios, no isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e

controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes

(COLLINS et al., 1993). A CLAE apresenta a capacidade de realizar separaes

de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras,

em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e

sensibilidade. Alm de permitir excelente separao, esta tcnica possibilita

simultaneamente, separar e quantificar pigmentos sem requerer purificao

excessiva dos extratos (YUNES & CALIXTO, 2001).

2.7. Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)

A espectroscopia o estudo da interao da energia com a matria.

Quando a energia aplicada matria, ela pode ser absorvida, ser emitida,

provocar uma variao qumica ou ser transmitida. A absoro de energia por

molculas que foram colocadas em um campo magntico forte a espectroscopia

de ressonncia magntica nuclear (RMN). A RMN uma tcnica de fsica

experimental conhecida h cerca de 50 anos. Ela tem vrias aplicaes, no s

na fsica, mas tambm na qumica, na biologia e na medicina. Na qumica e na

28

biologia, a RMN tem sido um poderoso auxiliar para o estudo das estruturas de

molculas complexas, como polmeros, protenas, etc (SILVERSTEIN et al.,

2007).

Os ncleos de determinado elemento, incluindo os ncleos de 1H e os

ncleos de 13C (carbono 13) comportam-se como se fossem ims girando em

torno de um eixo. Quando uma substncia contendo prtons ou ncleos de

carbono 13 colocado em um campo magntico muito forte e o irradia

simultaneamente com energia eletromagntica de freqncia apropriada, os

ncleos do composto absorvem energia atravs de um processo chamado

ressonncia magntica. A absoro de energia quantizada e produz um

espectro caracterstico para a substncia denominado espectro de RMN

(SOLOMONS & FRYHLE, 2009).

Os ims de campo alto utilizados nesse instrumento so ims

supercondutores, ou seja, a espiral magntica do im supercondutor conduz

eletricidade com resistncia essencialmente zero. Para a espiral ser

supercondutora, entretanto, ela deve ser mantida em temperaturas muito baixas.

Se a temperatura do espiral se eleva constantemente, a resistncia no fio cresce

e gerado calor e o campo magntico extinto (SOLOMONS & FRYHLE, 2009).

Para manter a supercondutividade do espiral, o im inteiro colocado no

que chamado de cmara de Dewar. A parte mais interna da cmara mantm o

hlio lquido. Nessa cmara apia-se o espiral do im supercondutor. Ao redor do

compartimento de hlio est uma cmara concntrica com nitrognio lquido e ao

redor desta, est um invlucro de vcuo. Em espectros de RMN, quanto maior o

29

im, melhor o instrumento, maior sensibilidade da amostra e sinais mais definidos

(SOLOMONS & FRYHLE, 2009).

O espectro de RMN fornece informaes valiosas sobre a estrutura

molecular que podem nos auxiliar a confirmar a identidade de uma substncia ou

elucidar a estrutura de uma substncia desconhecida (SILVERSTEIN et al.,

2007). Alm disso, uma das vantagens da tcnica que ela no degrada a

amostra, permitindo que esta seja reutilizada em anlises posteriores.

30

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Isolar, analisar e investigar os fungos filamentosos endofticos e epifticos

do fruto de Theobroma grandiflorum, cultivveis que apresentem produo de

pigmentos e investigar a viabilidade para o uso destes compostos na indstria

alimentcia e cosmtica.

3.2. Objetivos Especficos

Isolar e investigar fungos filamentosos endofticos e epifticos de frutos de

Theobroma grandiflorum utilizando metodologia tradicional de isolamento

de micro-organismos, com o cultivo direto em meio de cultura especficos.

Caracterizar e identificar os fungos que apresentem produo de

pigmentos e analisar esses compostos por meio das tcnicas de

Cromatografia em Camada Delgada de Slica Gel (CCD), Cromatografia

Lquida de Alta Eficincia - CLAE (HPLC High Performance/Pressure

Liquide Chromatography) e Ressonncia Magntica Nuclear (RMN).

Fornecer subsdios para a viabilidade de fontes naturais produtoras de

pigmentos, contribuindo efetivamente com o avano na utilizao de

tecnologias apropriadas para aquisio de novas fontes de compostos

naturais;

31

Realizar ensaios de estabilidade dos pigmentos obtidos para avaliar a

viabilidade para a sua utilizao como colorante de alimentos e

cosmticos, frente a variaes de temperatura e pH.

Avaliar o potencial para consumo humano dos pigmentos obtidos,

realizando ensaios de toxicidade utilizando tcnicas moleculares;

Caracterizar os pigmentos obtidos em relao presena de atividade

antioxidante;

Publicar os resultados obtidos: metablitos identificados (pigmentos)

associando a diversidade biolgica com a diversidade qumica dos

compostos.

32

4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Coleta, Isolamento, Identificao e Conservao

O conhecimento da comunidade endoftica comea com o isolamento

seguido da caracterizao destes micro-organismos. Para tanto, diferentes

tcnicas devem ser utilizadas, possibilitando o isolamento de grupos distintos com

diferentes exigncias nutricionais e taxa de crescimento (ARAJO et al., 2002).

Foram coletados frutos de Theobroma grandiflorum na Zona Rural da cidade de

Manaus - Estado do Amazonas, e transportados para o laboratrio de Produtos

Bioativos de Origem Microbiana FCA - Universidade Federal do Amazonas

(UFAM). Foram selecionados trs indivduos de T. grandiflorum. Para o

isolamento dos fungos filamentosos presentes na casca (epicarpo e mesocarpo).

Os protocolos de isolamento utilizados foram os descritos por Arajo et al., (2002)

com modificaes.

Os frutos maduros, de aparncia sadia e que tinham recm cados do

cupuauzeiro, foram imediatamente levados para o Laboratrio de Gentica de

Micro-organismos - UFAM os quais foram lavados em gua corrente

cuidadosamente e aps com gua destilada esterelizado. Para cada um dos trs

frutos selecionados foram preparadas 10 placas de isolamento a partir do

mesocarpo e seis placas para o isolamento dos endofticos e epifticos do

epicarpo.

33

4.1.1. Isolamento de fungos filamentosos

Epicarpo. Com a ajuda de um bisturi esterelizado o epicarpo foi raspada

at a camada clorofilada, abaixo dos plos ferrugneos. O material dessa

raspagem foi transferido para tubos do tipo eppendorf de 2 mL contendo soluo

salina e prolas de vidro. A soluo foi homogeneizada em vrtex, para

fragmentao e macerao do material vegetal. Aps esse processo, os tubos

passaram por centrifugao por 10 minutos a 1000 g. Aps a centrifugao,

alquotas de 0,1 mL da soluo sobrenadante foram inoculadas, em duplicatas,

em cada um dos meios de cultivo utilizados, como descrito no item 4.4.

Mesocarpo. O mesocarpo foi raspado com ajuda de estilete ou bisturi

esterelizadoizado e os fragmentos foram dispostos diretamente nos meios de

cultivo Batata Dextrose gar (BDA) e gar Saboraud (SB). Em cada placa foram

inoculados 6 fragmentos de mesocarpo de cada fruto, e para cada fruto foram

inoculadas 5 placas de cada meio de cultivo.

Todo o material foi incubado em estufas de crescimento microbiolgico a

26 C + 2 e/ou em temperatura ambiente.

Assim que comearam a aparecer os primeiros indcios de crescimento

micelial, foram realizados os repiques, para cada isolado, com o auxlio de uma

agulha de inoculao, em tubos de ensaio contendo o mesmo meio de cultivo da

placa de isolamento. Aps o crescimento nos tubos, foi realizada a purificao

dos isolados. Cada um dos isolados foi inoculado em placa de Petri contendo

meio de cultivo, aps 7 dias de crescimento as colnias que no apresentavam

produo de condios foram raspadas, de forma a causar injrias no miclio e

34

estimular, por choque mecnico, a produo de condios. A cada colnia foram

ento acrescentados 5 mL de gua destilada autoclavada, para obteno de uma

suspenso de condios. Essa suspenso foi diluda (por tcnica de diluio em

srie) e ento inoculada em placa de cultivo para a obteno de colnias

monospricas de cada isolado.

4.1.2. Conservao dos isolados

Aps o isolamento e purificao dos isolados, os mesmos foram

conservados pelo mtodo de leo mineral e/ou gua destilada. O mtodo de leo

mineral consiste em recobrir culturas jovens, desenvolvidas pelo mtodo clssico

em tubos de ensaio, com uma camada de leo mineral esterilizado. Previne-se

assim a desidratao do meio de cultura, reduzindo a atividade metablica dos

organismos preservados. Isso possvel pela reduo do oxignio disponvel,

uma vez que o leo permite uma lenta difuso de gases (FIGUEIREDO, 2001).

A metodologia com gua destilada (Mtodo Castelani) consiste em cultivar

cada isolado em placas de Petri contendo meio apropriado por tempo suficiente

para que ocorra a produo de condios, ento cada colnia fragmentada com o

auxlio de um bisturi esterelizado. Os fragmentos so transferidos para tubos de

criognio com tampa de rosca e ao tubo adicionada a gua destilada at

recobrir totalmente os fragmentos. Desta forma o material pode ser conservado

em geladeira (~4 C) ou em temperatura ambiente.

35

4.1.3. Seleo dos isolados produtores de pigmentos

As linhagens foram cultivadas em placas de Petri contendo meio de cultura

BDA e meio de cultura BDA acrescido de 2% de peptona microbiolgica, e

incubadas em temperatura ambiente. Aps o crescimento, os isolados que

apresentaram produo de pigmentos foram identificados taxonomicamente,

classificados e selecionados para os ensaios qumicos.

4.1.4. Identificao taxonmica clssica dos isolados

Para a identificao dos isolados produtores de pigmentos foi realizado o

micro-cultivo e observados os aspectos macro e micro-morfolgicos das

estruturas vegetativas e reprodutivas. A identificao dos fungos baseia-se em

observar as caractersticas da colnia (cor da superfcie e reverso; textura;

topografia), mas tambm as estruturas microscpicas produzidas, como

conidifaros, condeos e esporos.

4.1.5. Identificao taxonmica molecular dos isolados

Todos os isolados que apresentaram produo de pigmento em cultivo

foram encaminhados para a identificao molecular, mesmo aps a

caracterizao morfolgica. Esta foi realizada por meio de extrao de cidos

nucleicos, PCR e seqenciamento do DNA dos isolados. Para as reaes de PCR

foram utilizados primers de genes ribossomais eucariotos. Foram utilizados

36

primers para amplificao dos fragmentos de ITS do rDNA, onde estes

fragmentos foram submetidos ao seqenciamento de DNA e as seqncias foram

contrastadas com as sequencias j depositadas no GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), por meio do programa Blast.

Os isolados foram cultivados em meio BD para a obteno do miclio e

posterior extrao de DNA total. A extrao de DNA se procedeu pelo mtodo

fenol-clorofrmio e aps a extrao o DNA total passou por purificao com o

auxlio do Iillustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE). Todo o

material foi encaminhado para sequenciamento na Central Analtica do Centro de

Apoio Multidisciplinar CAM, da Universidade Federal do Amazonas, sob direo

do Prof. Dr. Spartaco Astolfi Filho. O sequenciamento foi realizado em um

equipamento MegaBACETM 1000 DNA Sequencing System (Amercham

Biosciences).

4.1.5.1 Extrao de cidos Nuclicos

Para a extrao de cidos nucleicos, as linhagens foram crescidas em BD,

por 7 dias sob agitao (90 rpm) a 25C. O miclio foi filtrado em gaze, lavado

com gua destilada esterilizada e pesado. O miclio foi macerado com nitrognio

lquido e transferido para um tubo e para cada 0,5 g de miclio foram adicionados

800 L de Tampo de extrao (descrito no item 4.4.8). Essa mistura foi incubada

por 45 minutos em banho-maria a 65C. Aps o perodo de incubao, foi

adicionado 800 L de fenol, as fases foram misturadas e centrifugadas a 12.000

rpm por 10 minutos. A fase aquosa foi transferida cuidadosamente para outro

37

tubo, onde foi acrescentado igual volume de clorofane (item 4.4.6). A solu foi

misturada por inverso cuidadosa e centrifugado por 10 minutos a 12.000 rpm. A

fase aquosa foi novamente transferida para outro tubo e a ela foi adicionado igual

volume de clorofil (item 4.4.7) e repetiu-se a centrifugao anterior. Para a

precipitao do DNA a fase aquosa foi transferida para um tubo contendo 2

volumes de etanol absoluto gelado (-20C) e 1/10 do volume de NaCl 3M. O tubo

foi incubado overnight em freezer e ento centrifugado por 15 minutos a 12.000

rpm. O sobrenadante foi descartado e ao precipitado foram adicionados 300 L de

entanol 70% e repetiu-se a centrifugao anterior. O sobrenadante foi descartado

e aps a secagem do DNA temperatura ambiente, este foi ressuspendido em

100 L de H2O destilada.

O DNA extrado foi quantificado com o auxlio de fluormetro e sua

integridade foi avaliada em gel de agarose 0,7%. O DNA extrado foi mantido a -

20C.

4.1.5.2. Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

As reaes foram realizadas em volume final de 25 L contendo: 20 ng de

DNA; 2,5 mM de MgCl2; 0,25 mM de dNTP; 2,0 mM de cada primer, ITS 1 (5

TTC CGT AGG TGA ACC EGC GG 3) e ITS 4 (5 TCC TCC GCT TAT TGA TAT

GC) (Invitrogen); 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil) e 10mM de

Tampo Tris-HCl pH8,3 e 50 mM de KCl. As reaes foram realizadas em

termociclador nas seguintes condies: 94C por 4 minutos; 30 ciclos de 94C por

45 seg, 55C por 55 seg e 72C por 35 seg; e uma extenso final de 10 min

38

72C. Todas as reaes foram realizadas em termociclador MasterCycler

(Eppendorf). Para a anlise dos produtos das PCRs, 5 L de cada reao foram

submetidos em gel de agarose a 1,3%.

4.2. Anlises Bioqumicas

4.2.1. Ensaios de condies de cultivo

Durante o processo de seleo dos isolados produtores de pigmentos, o

isolado Penicillium purpurogenum CIAM045 foi selecionado por apresentar uma

produo mais intensa do pigmento em meio lquido e slido. Com o intuito de

avaliar as melhores condies de cultivo para a produo do pigmento vermelho

produzido pelo isolado de P. purpurogenum CIAM045, ensaios com diferentes

meios de cultivo e condies ambientais foram realizados. Dessa forma foi

possvel determinar qual seria a melhor e mais econmica forma de cultivo para a

produo do pigmento.

Na primeira etapa ensaiou-se a produo do pigmento em meio Sabouraud

Lquido, Caldo Batata Dextrosado, Caldo Batata Dextrosado acrescido de

Peptona (2%) e Meio Aveia Lquido (40%). Na segunda etapa ensaiou-se a

mudana de fonte de carboidratos, alterando-se a composio do meio Batata

Dextrose, substituindo a dextrose por sacarose e D-arabnose. Tambm foram

ensaiados o meio Caldo Batata sem a adio da dextrose e meio Aveia lquido

com a adio de 10 % de dextrose. Esses meios foram inoculados com dois

fragmentos de agarose do cultivo em placa de Petri com Meio Batata Dextrose

39

gar do isolado P. purpurogenum CIAM045 e incubados na ausncia total de luz

28C e com regime de fotoperodo de 12hs em temperatura de 28C. Outros

ensaios realizados foram para avaliar se havia diferena na produo do

pigmento se este era cultivado em meio esttico ou sob agitao (135 rpm),

30C e ausncia de luz.

4.2.2. Obteno dos pigmentos

Os isolados que apresentaram produo de pigmentos foram inoculados

em meio lquido - BD ou Sabouraud - para fermentao. Os inculos foram

realizados em frascos Erlenmeyers de 500 a 1000 mL, contendo de 250 a 500 mL

do meio especfico e incubados em condies favorveis para a produo do

composto, dependendo de cada isolado e de suas caractersticas de cultivo, que

para a melhor produo do pigmento, tais como, composio qumica do meio de

cultivo, temperatura de incubao, condies de luminosidade, entre outros.

Aps o perodo de incubao necessrio para a produo do pigmento (de

7 a 15 dias), o cultivo foi filtrado em gaze esterelizado e filtro de papel tipo

Whatman para a remoo do miclio. O filtrado, foi ento, submetido a partio

(Item 4.2.4).

4.2.3. Ensaios de estabilidade dos extratos pigmentados

Ensaios de estabilidade dos pigmentos em diferentes temperaturas foram

realizados em tubos de ensaio contendo 10 mL do extrato do pigmento. Os tubos

40

foram individualmente incubados em banho-maria a 40, 50, 60,70, 80, 90 e 100

C, por 10 minutos. Aps o perodo de incubao, todos os tubos foram retirados

do banho e resfriados. Os tubos resfriados foram analisados em relao a

mudanas de colorao.

Para os ensaios de estabilidade em diferentes pHs foram preparados

tubos de ensaio contendo 10 mL do extrato do pigmento. Foi ajustado o pH dos

extratos para 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 e 14.0, cada tubo foi mantido em

temperatura ambiente e observado por 10 minutos para a avaliao de mudana

ou no da cor do pigmento ou de sua intensidade pudesse ser realizado.

Alm desses ensaios, tubos de ensaio contendo 10 mL do extrato de

pigmento fngico foram incubados em diferentes situaes de estresse como

forno de micro-ondas at a fervura e congelamento em freezer (-20C).

4.2.4. Partio lquido - lquido

Os extratos que apresentaram estabilidade sob pHs, e temp