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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TATIANA NUNES MASCARENHAS SÁ

PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO UTILIZANDO GLICEROL RESIDUAL DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL COMO SUBSTRATO

FORTALEZA/CE

2011

TATIANA NUNES MASCARENHAS SÁ

PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO UTILIZANDO GLICEROL RESIDUAL DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL COMO SUBSTRATO

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Engenharia Química, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química.

Orientadora: Profª. Drª. Sueli Rodrigues

FORTALEZA – CE

2011

S115p Sá, Tatiana Nunes Mascarenhas Produção de ácido cítrico utilizando glicerol residual da produção de biodiesel como substrato / Tatiana Nunes Mascarenhas Sá .

83 f: il. color. enc.

Orientadora: Profa. Dra. Sueli Rodrigues Área de concentração: Processos Químicos e Bioquímicos. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia. Depto. de Engenharia Química, Fortaleza, 2011.

1. Ácido cítrico 2. Biodiesel 3. Fermentação 4. Glicerol I. Rodrigues, Sueli (orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química III.Título

CDD 660

Dedico esta dissertação aos meus pais Valter e

Otaciana e ao meu noivo Edilson, pessoas que

sempre estiveram ao meu lado, pelo apoio e amor

incondicional que foram imprescindíveis em

minha vida.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, em primeiro lugar, a Deus, meu Senhor e Salvador, por guiar-me e por

ter-me concedido saúde e disposição para os estudos e execução deste trabalho.

Aos meus pais, Otaciana e Valter, por estarem sempre presentes em minha vida,

pela dedicação, amor, carinho, cuidado, apoio e por toda a educação e princípios ensinados.

Ao grande amor de minha vida, amigo, companheiro, meu noivo e, em breve

esposo, Edilson, por estar comigo nesses doze anos, e por todo amor, compreensão, auxílio e

paciência dedicada a mim. Aos seus pais Edilson Ferreira e Maria do Socorro, por serem tal

uma segunda família para mim.

Às minhas lindas e amadas irmãs Ticiana e Luciana por todos os momentos que

passamos juntas, pela amizade e companheirismo que desfrutamos todos esses anos.

À professora Dra. Sueli Rodrigues, por receber-me no laboratório em que trabalha

e ensina, pela paciente orientação e oportunidade de aprender. Pelos ensinamentos preciosos

que tanto estimularam e contribuíram para a formação desta pesquisa, os quais certamente

significaram e seguirão por significar um marco em minha vida pessoal, profissional e

acadêmica.

Ao meu grande amigo Tiago, que tanto me apoiou e ajudou, desde a graduação, e

que participou ativamente deste projeto. Agradeço por toda amizade, inclusive para além das

portas do laboratório, e por toda a ajuda durante a realização dos experimentos.

A todos que acreditam em minha capacidade e apóiam meus estudos. Aos amigos

que conheci durante a caminhada da vida, em especial: Ana Laryssa, Adrinaldo, José Cláudio,

Danielle Pessoa, Renatinha, Alexandre. As minhas tias Otacione e Ione por todas as orações e

apoio.

Aos membros do Laboratório de Microbiologia Ambiental da UFC, com quem

desfrutei de três anos de convivência, em especial Profª. Dra Suzana Silveira, Profª. Dra

Claudia Miranda. Sou grata por toda orientação e apoio durante a graduação. Obrigada por

acreditarem em mim e por estimular meu crescimento acadêmico e pessoal. Aos amigos

Genilton, Raíssa, Márcia e Rivalda, pela amizade e por terem participado de meu crescimento

acadêmico.

Aos amigos “colabioradores” do Laboratório de Biotecnologia: Tiago, Rosy,

Cláudia, Luiz Carlos, Mariana, Simone, Imilena, Cristiane, Soraya, Ana Laura, Tatiane

Maciel, Mayra, Jonas, Niedla, Diva, Micael, Raquel, Rayanne e Thatyane Vidal. Obrigada

pelo companheirismo, ajuda e amizade no ambiente de trabalho e fora da universidade.

Aos colegas do Departamento de Engenharia Química, em especial Francisca

Maria, Milena, Janaina, Jefferson, Kerolaine, Assis, Cleiton, Valeria, Márcio e Álvaro.

Aos membros da banca examinadora, Profª. Dra. Luciana e Dra. Gorete, que

aceitaram o convite para participar da banca de avaliação deste trabalho.

Aos os professores do Departamento de Engenharia Química pela competência,

ensinamentos e colaboração durante o curso de mestrado.

À secretária do curso de Pós-Graduação, Maria, pela amizade e pela dedicação e

ajuda no decorrer do curso

À Universidade Federal do Ceará, pela possibilidade de cursar o mestrado e seguir

a carreira acadêmica.

Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos durante todo o curso, que em muito

viabilizou a pesquisa

RESUMO

Devido aos incentivos governamentais, os quais impulsionam a produção de biodiesel, tal combustível tem sido produzido em larga escala. Entretanto, o referido crescimento tem se revelado exacerbado, fazendo surgir um preocupante fator: o destino do glicerol excedente da produção de biodiesel. Tal inquietação se mostra clara ao se revelar um importante dado: para cada tonelada de biodiesel obtido, são gerados 100 Kg de glicerol, o que provoca efeitos adversos à economia do biodiesel. Neste contexto, teme-se que o excesso de glicerina produzida, a qual provoca um elevado nível de poluição, possa ser descartada de maneira irresponsável no meio ambiente. Sendo assim, têm-se desenvolvido pesquisas destinadas à busca de alternativas para a utilização do volume excedente de glicerol. A bioconversão de glicerol por via fermentativa é uma alternativa que agrega um valor significativo para a produtividade da indústria de biodiesel. O glicerol pode ser utilizado por inúmeros micro-organismos, em processos metabólicos, como fonte de carbono. Leveduras como as da espécie Yarrowia lipolytica, quando cultivadas em meio com limitação de nitrogênio, são capazes de produzir quantidades significantes de ácido cítrico a partir do glicerol. O ácido cítrico é, atualmente, um dos mais importantes ácidos orgânicos produzidos por via fermentativa. Devido às suas características, tem sido amplamente utilizado na indústria de alimentos e bebidas e também como aditivo em detergentes, produtos farmacêuticos, cosméticos e de higiene pessoal. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo avaliar, através de fermentação, rotas de bioconversão do glicerol residual da produção de biodiesel com elevados níveis de impurezas, para obtenção de ácido cítrico. Para isso, foram utilizadas, inicialmente, duas cepas de leveduras potencialmente produtoras do ácido: Yarrowia lipolytica NRRL YB 323 e Yarrowia lipolytica NRRL YB 423. Utilizando a Metodologia de Planejamento Experimental e Análise da Superfície de Resposta, foram investigadas as concentrações iniciais de fonte de carbono e fontes de nitrogênio orgânico (extrato de levedura) e inorgânico (sulfato de amônio) em frascos agitados. Os resultados revelaram que a concentração inicial ideal de glicerol residual do biodiesel como fonte de carbono, dentro da faixa estudada, foi de 20g.L-1. Quanto às fontes de nitrogênio, pôde-se constatar que estas não apresentaram notável influência para a produção do ácido. Também verificou-se que a adição de Tiamina ao meio não promoveu o aumento na quantidade de ácido cítrico acumulado. A levedura Yarrowia lipolytica NRRL YB 423 se revelou mais eficaz na produção do ácido. Foram realizados ensaios em fermentador de bancada para avaliar- se a melhor concentração de oxigênio dissolvido no meio. Viu-se que as concentrações mais elevadas de oxigênio dissolvido no meio fermentativo favorecem a produção de ácido cítrico. Para níveis de oxigênio de 50%, observou-se um menor rendimento, enquanto que, para 70%, a produção de ácido cítrico foi favorecida. O rendimento percentual final para a produção de ácido cítrico obtido a partir de 20g.L-1 de glicerol residual do biodiesel adicionado inicialmente ao meio foi de 24,80% em três dias de fermentação.

Palavras chave: ácido cítrico, fermentação, biodiesel, glicerol, Yarrowia lipolytica

ABSTRACT

Due to government financial incentives, which boost the production of biodiesel,

there has been a large scale production of this fuel. However, this growth has proved to be exaggerated, rising a worrying factor: the destination of the glycerol excess from biodiesel production. Such concern is clearly shown to prove an important fact: for every ton of biodiesel produced, 100 kg of glycerol are generated, which leads to adverse effects on the biodiesel economy. In this context, it is feared that the over-produced glycerine, which causes a high level of pollution, can be discarded irresponsibly into the environment. So, researches have been being developed, aiming to find other alternatives for the use of the extra volume of glycerol. The bioconversion of glycerol by fermentation is good option that adds significant value to the productivity of the biodiesel industry. Glycerol can be used by several microorganisms in metabolic processes, as a carbon source. Some yeasts species, such as Yarrowia lipolytica, when grown on a media with a limited source of nitrogen, are able to produce significant amounts of citric acid from glycerol. Citric acid is currently one of the most important organic acids produced by fermentation. Due to its characteristics, it has been widely used in food and beverage industry and also as an additive for detergents, pharmaceuticals, cosmetics and toiletries. Thus, this study aimed to evaluate, through fermentation, bioconversion routes of residual glycerol from biodiesel production with high levels of impurities, in order to obtain citric acid. For this, two potential acid-producing yeast strains (Yarrowia lipolytica NRRL YB 323 and Yarrowia lipolytica NRRL YB 423) were initially used. Using the Methodology of Experimental Design and Response Surface Analysis, it was investigated the initial concentrations of carbon sources as well as organic (yeast extract) and inorganic (ammonium sulfate) nitrogen sources in shake flasks. The results obtained showed that the optimal initial concentration of glycerol from waste biodiesel as carbon source, within the studied range, was 20 g L-1. As to the nitrogen sources, they were proved having no remarkable influence on the acid production. It was also found that thiamine addition to the media did not promote the increase on the amount of the previously accumulated citric acid. Yarrowia lipolytica NRRL YB 423 was proved more effective on the acid production. The tests which were carried out in the fermenter aimed to evaluate the optimal concentration of dissolved oxygen in the media. It was observed that highest concentrations of dissolved oxygen in fermentation media, promotes the production of citric acid. For levels of 50% oxygen, there was a lower yield, while for 70%, citric acid production was favored. The final percentage yield for the production of citric acid obtained from 20 g L-

1 of residual glycerol from the biodiesel initially added to the media was 24.80%, at the end of three days of fermentation.

Keywords: citric acid, fermentation, biodiesel, glycerol, Yarrowia lipolytica

i

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura do Glicerol (ARRUDA et al. 2006) ................................ 7

FIGURA 2 Fórmula estrutural do ácido cítrico.................................................. 12

FIGURA 3 Microscopia ótica das estirpes estudadas, utilizando a objetiva de

100x. Em A Yarrowia lipolytica YB-323 e em B Yarrowia

lipolytica YB-423 ............................................................................

19

FIGURA 4 Fermentador TECNAL, modelo TEC-BIO R1.5 de 1,0L 27

FIGURA 5 Resultados da fermentação realizada em shaker, a qual se baseou

nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol

analítico a uma concentração inicial de 40 g.L-1............................

31

FIGURA 6 Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de

ácido cítrico para a fermentação realizada em shaker, baseada nos

experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol

analítico, a uma concentração inicial de 40 g.L-1. .........................

32

FIGURA 7 Resultados da fermentação realizada em shaker, utilizando

glicerol residual do biodiesel a uma concentração inicial de 40

g.L-1. ............................................................................................

33

FIGURA 8 Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de

ácido cítrico, para a fermentação realizada em shaker, utilizando

glicerol residual do biodiesel a uma concentração inicial de 40

g.L-1...............................................................................................

34

FIGURA 9 Diferenças entre os rendimentos apresentados pela levedura

Yarrowia lipolytica YB 323 para as três concentrações de

glicerol, em meios com e sem tiamina ...........................................

36

FIGURA 10 Diferenças entre os rendimentos apresentados pela levedura

Yarrowia lipolytica YB 423 para as três concentrações de

glicerol, em meios com e sem tiamina...........................................

37

FIGURA 11 Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) das

variáveis testadas no planejamento experimental DCCFC, para a

produção de ácido cítrico (%) por Yarrowia lipolytica YB 323......

40

FIGURA 12 Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) das

ii

variáveis testadas no planejamento experimental DCCFC, para a

produção de ácido cítrico (%), por Yarrowia lipolytica YB 423.....

40

FIGURA 13 Superfície de resposta para as variáveis: extrato de levedura e

glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB-323............

43

FIGURA 14 Superfície de resposta para as variáveis sulfato de amônio e

glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB-323............

44

FIGURA 15 Superfície de resposta para as variáveis extrato de levedura e

glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB – 423......... 44

FIGURA 16 Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-323 para os

ensaios 1 a 9, com pH inicial ajustado para 6,0...............................

45


ensaios 10 a 17, com pH inicial ajustado para 6,0...........................

46


ensaios 1 a 9, com pH inicial ajustado para 6,0.............................

47

FIGURA 19 Figura 19. Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-423

para os ensaios 10 a 17, com pH inicial ajustado para 6,0...........

47

FIGURA 20 Variação de pH para Y. lipolytica YB-323 para os ensaios de 1 a

17..................................................................................................

48

FIGURA 21 Variação de pH para Y. lipolytica YB-423 para os ensaios de 1 a

17 ..................................................................................................

49

FIGURA 22 Rendimento percentual de ácido cítrico para Y. lipolytica NRRL

323 nos diferentes meios utilizados...............................................

50

FIGURA 23 Rendimento percentual de ácido cítrico para Y. lipolytica NRRL

423 nos diferentes meios utilizados................................................

51

FIGURA 24 Comparação do rendimento final de ácido cítrico para as

leveduras Y lipolytica 323 e Y lipolytica 423 em meio contendo

20g.L-1 de glicerol, suplementado e não suplementado com

fontes de nitrogênio (extrato de levedura, sulfato de amônio)........

53

FIGURA 25 Dorna do fermentador com formação de

espuma.............................................................................................. 55

FIGURA 26 Produção de ácido cítrico sob diferentes concentrações de

oxigênio dissolvido ......................................................................... 57

iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Produção e distribuição nacional de biodiesel ......................................... 6

Tabela 2 Aplicações de ácido cítrico .................................................................... 14

Tabela 3 Composição do meio TSB (Trypticase Soy Broth) ................................ 20

Tabela 4 Composição do meio Agar batata Dextrose (HIMEDIA) ........................ 21

Tabela 5 Meio fermentativo adaptado de Levison et al. (2007) ............................. 22

Tabela 6 Composição do meio Fermentativo (Mineral) ....................................... 23

Tabela 7 Variáveis utilizadas no DCCFC 23 para produção de ácido cítrico.......... 24

Tabela 8 Matriz do planejamento DCCFC (23)...................................................... 24

Tabela 9 Meio utilizado para investigação da supressão de fontes de nitrogênio .. 26

Tabela 10 Variação de pH, biomassa, rendimento de ácido cítrico e fator de

conversão, para meios com e sem tiamina, a 48 h de fermentação - YB-

323.......................................................................................................

35

Tabela 11 Biomassa, rendimento de ácido cítrico e fator de conversão, para meios

com e sem tiamina, a 48 h de fermentação - YB-423. ...........................

36

Tabela 12 Matriz do planejamento DCCFC 23 (valores codificados), resposta para

a produção de ácido cítrico em rendimento(%) e fator de conversão de

biomassa em produto (Yp/x) para YB 323 .............................................

38

Tabela 13 Matriz do planejamento DCCFC 23 (valores codificados), resposta para

a produção de ácido cítrico em rendimento(%) e fator de conversão de

biomassa em produto (Yp/x) para YB 423 ..............................................

39

Tabela 14 Coeficiente de regressão para a resposta de produção de ácido cítrico,

em rendimento percentual. (48h de produção) – YB-323 .......................

41

Tabela 15 Coeficiente de regressão para a resposta de produção de ácido cítrico,

em rendimento percentual (48h de produção) – YB-423. ..................... 41

Tabela 16 ANOVA para resposta produção de ácidos – YB-323. ....................... 42

Tabela 17 ANOVA para produção de ácidos – YB-423 55.................................... 42

Tabela 18 Resultados da fermentação de meio contendo 20g.L-1 de glicerol –

YB323 e YB 423 ...................................................................................

52

Tabela 19 Resultados da fermentação de meio contendo 20g.L-1 de glicerol em

Erlenmeyer de 500mL – YB323 e YB423 ..........................................

54

Tabela 20 Resultados da fermentação de meio mineral contendo 20g.L-1 de

glicerol, em fermentador de bancada de 1L, com de 50% de Oxigênio

iv

dissolvido no meio................................................................................. 56

Tabela 21 Resultados da fermentação de meio mineral contendo 20g.L-1 de

glicerol, em fermentador de bancada de 1L, com de 70% de Oxigênio

dissolvido no meio................................................................................... 56

v

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................... i

LISTA DE TABELAS.................................................................................................. iii

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 01

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................... 04

2.1 O Biodiesel no Brasil ......................................................................................... 04

2.2 Glicerol ................................................................................................................ 07

2.3 Yarrowia lipolytica............................................................................................... 09

2.4 Ácido cítrico...................................................................................................... 12

2.4.1 Fatores químicos que influenciam a produção de ácido cítrico........................... 16

2.4.2 Fontes de Carbono e Nitrogênio........................................................................ 16

2.4.3 Fontes de Fosfato.................................................................................................. 17

2.4.4 Aeração e agitação ............................................................................................. 17

2.4.5 Demanda de Ácido Cítrico ................................................................................. 18

3 METODOLOGIA............................................................................................... 19

3.1 Micro-organismos Utilizados ............................................................................ 20

3.1.1 Ativação do micro-organismo.............................................................................. 20

3.1.2 Preparo de cultura-estoque de Y. lipolytica NRRL 323 e Y. lipolytica NRRL

423........................................................................................................................ 21

3.2 Preparo do Inóculo ............................................................................................ 21

3.3 Ensaios com glicerol analítico e residual do Biodiesel..................................... 21

3.4 Efeito da Tiamina .............................................................................................. 23

3.5 Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das

fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica ......................................................

23

3.6 Testes sem adição de extrato de levedura e sulfato de amônio na

composição do meio ...........................................................................................

25

3.7 Utilização de Erlenmeyer de 500mL................................................................. 26

3.8 Ensaios em fermentador ................................................................................... 26

3.9 Métodos Analíticos ............................................................................................ 28

3.9.1 Avaliação da Biomassa (g.L-1) ........................................................................... 28

3.9.2 Análise do pH ...................................................................................................... 28

3.9.3 Acidez Total Titulável ......................................................................................... 28

vi

3.9.4 Determinação de ácido cítrico ............................................................................. 29

3.10 Calculo do rendimento...................................................................................... 29

3.11 Determinação de parâmetros cinéticos............................................................ 29

3.11.1 Velocidades especificas........................................................................................ 29

3.11.2 Fator de conversão (Yp/x) ..................................................................................... 30

4 RESULTADOS .................................................................................................. 31

4.1 Ensaios com Glicerol analítico e Residual do Biodiesel ................................. 31

4.2 Efeito da Tiamina ............................................................................................. 34

4.3 Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das

fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica .....................................................

37

4.3.1 Crescimento em Biomassa (g.L-1) ....................................................................... 45

4.3.2 Variação de pH..................................................................................................... 48

4.3.3 Produção de ácido cítrico...................................................................................... 49

4.4 Fermentação com Supressão de Fontes de Nitrogênio ................................... 52

4.5 Utilização de Erlenmeyer de 500ml .................................................................. 53

4.6 Fermentação em Bioreator ............................................................................... 54

4.6.1 Ensaio em fermentador de bancada, teste de aeração .......................................... 55

5 CONCLUSÕES .................................................................................................. 58

6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ........................................... 59

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 60

ANEXOS............................................................................................................................ 68

1 Capítulo 1 – Introdução Sá, T.N.M

1. INTRODUÇÃO

Em razão das limitações oriundas das fontes de energia fósseis e das crescentes

preocupações ambientais, tem sido dada uma grande atenção, nos últimos anos, às fontes

alternativas de energia. O desenvolvimento de energias alternativas é uma escolha inevitável

para o crescimento econômico sustentável na sociedade. Dessa forma, tem aumentado a

demanda por biocombustíveis. Como exemplos, podem-se citar o etanol e o biodiesel obtidos

a partir de matérias-primas renováveis, como a cana-de-açúcar, materiais lignocelulósicos,

oleaginosas, gordura animal, dentre outras, cuja utilização permite uma maior redução das

emissões de monóxido de carbono, quando comparados a combustíveis derivados do petróleo

(LIN et al., 2011).

As rotas de obtenção de biodiesel são craqueamento, esterificação e

transesterificação, sendo esta última a predominantemente utilizada. O processo consiste na

reação entre um material graxo, de origem vegetal ou animal, e um álcool de cadeia curta

(metanol ou etanol) na presença de um catalisador. Os principais resíduos gerados são tortas e

farelos, oriundos da extração do óleo vegetal, e a glicerina, resultante da reação de

transesterificação (YAZDANI e GONZALEZ, 2007).

O Brasil se destaca no panorama mundial do biodiesel, devido à sua grande

diversidade em grãos, de onde é extraído o óleo vegetal, e à sua destacável criação de animais

bovinos, que fornecem gordura animal e sebo. Frente a esse grande potencial produtivo, o

Governo Federal, ao final do século XX, intensificou as discussões sobre a produção e uso do

biodiesel, tendo sido efetuados vários estudos por comissões interministeriais em parceria

com universidades e centros de pesquisa. Muitas estratégias foram traçadas pelo governo

brasileiro. Dentre elas, destaca-se a criação do Programa Brasileiro de Desenvolvimento

Tecnológico do Biodiesel (PROBIODIESEL), que visa à gradual substituição do diesel

proveniente do petróleo pelo biodiesel (POUSA et al., 2007).

Até o ano de 2005, já havia sido realizada a substituição de todo diesel

consumido no Brasil pelo B5 (composto de 5% de biodiesel e 95% de diesel). Estima-se que

em aproximadamente 15 anos o B20 (composto de 20% de biodiesel e 80% de diesel) será

introduzido no mercado de combustíveis brasileiro (POUSA et al., 2007).

Devido aos incentivos governamentais, os quais impulsionam a produção de

biodiesel, tal combustível tem sido produzido em larga escala. Entretanto, o referido

crescimento tem se revelado exacerbado, fazendo surgir um preocupante fator: o destino do


glicerol excedente da produção de biodiesel. Tal inquietação se mostra clara ao se revelar um

importante dado: para cada tonelada de biodiesel obtido, são gerados 100 Kg de glicerol, o

que provoca efeitos adversos à economia do biodiesel (BOWKER et al., 2008).

Segundo Miguel Rossetto, presidente da Petrobrás Biocombustível, em entrevista

à Agência Estado, a produção de biodiesel foi quadruplicada no final de 2010, chegando a 495

milhões de litros (O ESTADO DE SÃO PAULO, 2010).

Neste contexto, teme-se que o excesso de glicerina produzida, a qual provoca um

elevado nível de poluição, possa ser descartada de maneira irresponsável no meio ambiente

(COSTA, 2008). Sendo assim, têm-se desenvolvido pesquisas destinadas à busca de

alternativas para a utilização do volume excedente de glicerol. A bioconversão de glicerol por

via fermentativa é uma alternativa que agrega significativo valor à produtividade da indústria

de biodiesel (SILVA et al., 2009).

O glicerol pode ser utilizado por inúmeros micro-organismos, em processos

metabólicos, como fonte de carbono. Leveduras como as da espécie Yarrowia lipolytica,

Cândida tropicalis, Klebsiella pneumoniae e algumas espécies de Rhodorula sp., quando

cultivadas em meio com limitação de nitrogênio, são capazes de produzir quantidades

significantes de ácido cítrico em diversas fontes de carbono, tais como: açúcares, alcanos,

álcoois, óleos, amido hidrolisado e glicerol (NÉMETH et al., 2003, VENTER et al., 2004).

O ácido cítrico tem sido produzido em grande quantidade, com uma taxa de

produção global estimada em cerca de 1,6 milhões de toneladas em 2007. É utilizado para

conferir um agradável sabor a alimentos e bebidas e também como aditivo em detergentes,

produtos farmacêuticos, cosméticos e de higiene pessoal (BEROVIC e LEGISA, 2007).

Em geral, é produzido por fermentação microbiana submersa de melaço usando o

fungo Aspergillus niger. Este processo, apesar de ser amplamente utilizado, apresenta alguns

aspectos desfavoráveis, tais como a degeneração do ácido cítrico após determinado período de

tempo e a necessidade de um longo período de fermentação – superior a sete dias - para a

produção de quantidades significativas de produto, o que o encarece. Ante a isso, nos últimos

anos surgiu considerável interesse em encontrar alternativas à produção deste ácido, como a

investigação de leveduras potencialmente produtoras e fontes de carbono de baixo custo

(SOCCOL et al., 2006).

Estudos demonstram que leveduras do gênero Candida podem produzir ácido

cítrico em quantidades apreciáveis, sob condições aeróbias. Em termos gerais, as leveduras


apresentam ainda algumas vantagens em relação aos fungos, como maior taxa de conversão e

produtividade, permitem um maior controle do processo em razão de serem unicelulares e a

utilização de fontes de carbono alternativas que são mais acessíveis, economicamente, que a

glicose (ANASTASSIADIS et al., 2008).

A produção de ácido cítrico por leveduras ocorre em duas fases. Na primeira, o

crescimento microbiano é favorecido através de um meio com composição adequada, onde as

condições de cultivo são ótimas e na segunda ocorre a produção propriamente dita, onde o

meio é limitado em fontes nitrogênio orgânico e/ou inorgânico o que resulta em uma

multiplicação celular pequena, com acúmulo alto de ácido cítrico (IMANDI et al., 2007).

Papanikolaou e seus colaboradores, em 2007, relataram que a levedura Yarrowia

lipolytica cresce em glicerol, produzindo ácido cítrico. Concluiu-se que o glicerol pode ser um

substrato adequado para a produção do ácido. Essa levedura produziu até 35g.L-1 de ácido

cítrico com uma alta concentração inicial de glicerol sendo utilizado no meio de cultura. Os

parâmetros de crescimento e produção de ácido cítrico em glicerol foram semelhantes àqueles

obtidos com a glicose.

Deste modo, o presente estudo teve como objetivo geral avaliar, através de

fermentação, rotas de bioconversão do glicerol residual da produção de biodiesel com

elevados níveis de impurezas, visando à obtenção de ácido cítrico. Os objetivos específicos

foram:

� Estudar a influência da concentração inicial de glicerol adicionado ao meio

fermentativo.

� Definir a composição do meio de cultivo para produção de ácido cítrico em escala

de bancada.

� Identificar as variáveis de influência para o processo fermentativo na produção de

ácido cítrico por leveduras utilizando o glicerol residual do biodiesel como

substrato.

4 Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Sá, T.N.M

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. O Biodiesel no Brasil

Conforme o art. 4ª da Lei nº 11.097/2005, que modificou o art. 6º, XXV da Lei nº

9.478/97, o biodiesel é um “combustível derivado de biomassa renovável para uso em

motores a combustão interna ou, conforme regulamento, para outro tipo de geração de

energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem fóssil”.

Os combustíveis fósseis esgotam-se progressivamente, sendo necessário encontrar

um combustível alternativo para suprir a demanda energética mundial (BASHA et al., 2008).

Os atuais esforços em prol da redução da poluição ambiental e a crise energética

têm estimulado o mercado mundial de biocombustíveis. A economia global tem mantido o

seu crescimento e a demanda por energia limpa e recursos renováveis encontra-se em

contínuo aumento (BILGEN et al., 2008).

A utilização dos biocombustíveis, em geral apresenta destacáveis benefícios,

incluindo sustentabilidade, energia renovável, o que diminui a dependência do petróleo,

redução dos gases estufa, contribuindo para a redução da poluição atmosférica

desenvolvimento regional, social e agrícola, podendo-se destacar ainda seu alto ponto de

fulgor e excelente lubricidade. (DEMIRBAS, 2007). Assim, o uso de biocombustíveis, como

o biodiesel, tem sido visto como uma alternativa viável.

Neste sentido, a busca intensiva por combustíveis alternativos ao petróleo, aqui se

enquadrando o biodiesel, apresenta grande importância, principalmente para os países

economicamente emergentes (OLIVEIRA et al., 2006). É fundamental que tal combustível

mantenha uma correlação harmoniosa com o desenvolvimento sustentável, conservação de

energia, eficiência e preservação ambiental (AGARWAL, 2007).

O biodiesel representa uma evolução na tentativa de substituição do óleo diesel

por derivados da biomassa, iniciada pelo aproveitamento de óleos vegetais, e pode ser

definido também como um combustível biodegradável derivado de fontes renováveis, como


óleos vegetais e gorduras animais. O referido combustível não apresenta emissão de gases

tóxicos, mostrando-se ambientalmente benéfico (KARMAKAR, et al., 2010).

No Brasil, a produção e comercialização de biodiesel apresenta importantes

vantagens, no que se refere à disponibilidade de matéria-prima para sua produção e ao

crescimento contínuo da indústria de óleos vegetais e etanol (OLIVEIRA et al., 2006; OISTI.

2007).

A produção de biodiesel encontra-se significativamente acelerada. O governo

brasileiro estabeleceu a obrigatoriedade da adição de biodiesel ao combustível de petróleo,

mediante o art. 2º da Lei nº 11097/2005, que introduz o biodiesel na matriz energética

brasileira, sendo fixado em 5% (cinco por cento), em volume, o percentual mínimo

obrigatório de adição de biodiesel ao óleo diesel comercializado ao consumidor final, em

qualquer parte do território nacional.

O art. 1º da Resolução ANP (Agência Nacional de Petróleo) nº 04/2010, publicada

no Diário Oficial da União de 03 de fevereiro e retificada do Diário de 22 de fevereiro do

mesmo ano, que alterou o art. 1º, parágrafo único da Resolução ANP nº 07/2008, determinou

que o biodiesel deveria ser adicionado ao óleo diesel na proporção de 5%, em volume, a partir

de 1º de janeiro de 2010.

De acordo com “Boletim Mensal de Biodiesel” divulgado pela ANP, em maio de

2010 existiam 64 plantas, produtoras de biodiesel, autorizadas pela Agência para operação no

país, o que corresponde a uma capacidade autorizada de 14.086,03 m3/dia. Há ainda duas

novas plantas autorizadas para construção e quatro plantas autorizadas para ampliação de

capacidade produtora (ANP, 2010). A Tabela 1 mostra a distribuição e capacidade de

produção das plantas de biodiesel autorizadas para operação e comercialização no Brasil.

A transesterificação é o processo mais utilizado atualmente para a produção de

biodiesel. Consiste em uma reação química dos óleos vegetais ou gorduras animais com o

álcool comum (etanol) ou o metanol, estimulada por um catalisador, da qual também se extrai

a glicerina, produto de diversas aplicações na indústria química (MARCHETTI et al., 2007).


Tabela 1. Produção e distribuição nacional de biodiesel

Estado Quantidade de plantas

processadoras Capacidade Autorizada de Operação (m3/dia)

Representatividade por Estado (%)

RS

GO

SP

MT

BA

PR

TO

MG

MA

CE

PA

RJ

MS

RO

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05

07

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03

04

02

06

01

02

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01

02

02

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2257,70

1981,65

1361,96

996,71

513,00

441,00

410,11

360,00

304,11

115,00

60,00

41,00

37,00

25,24

19,00

16,69

11,47

8,39

4,32

3,71

3,45

3,03

2,56

0,97

0,51

0,35

0,31

TOTAL 64 11876,57 100

*Fonte: ANP, 2010

Além da glicerina, a cadeia produtiva do biodiesel gera vários outros co-produtos

(torta, farelo etc.), que podem agregar valor e constituírem-se outras fontes de renda

importantes para os produtores (GONÇALVES et al., 2006; YAZDANI e GONZALEZ,

2007).

No entanto, existe crescente preocupação com a problemática da assimilação da

grande quantidade de glicerina pelo mercado mundial, que em excesso necessita ser

queimada, sendo que a queima parcial de glicerina gera acroleina, produto suspeito de ser

cancerígeno (ARISSETO, 2007).


2.2. Glicerol

“Glicerol” é o nome comum do composto orgânico 1,2,3-propanotriol (Figura 1),

descoberto por Carl W. Scheele, em 1779, durante a separação de uma mistura aquecida de

óxido de chumbo (PbO) preparada com óleo de oliva. Seus sinônimos são: glicerina,

trihidroxipropano, glicil álcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano. (RYWIŃSKA, A et

al.2010). Pasteur (1958) também observou a formação de glicerol como subproduto da

fermentação alcoólica, em concentrações de 2,5 - 3,6% do conteúdo de etanol (REHM, 1988).

Figura 1. Estrutura do Glicerol (ARRUDA et al., 2006)

Na natureza, o glicerol está presente em vegetais (soja, mamona, babaçu, girassol,

palma, algodão, coco, dendê e pinhão manso) e animais em formas combinadas de glicerina

com ácidos graxos. É um composto fundamental para o metabolismo de micro-organismos,

atuando como precursor de numerosos compostos e regulador de mecanismos bioquímicos

intracelulares (SILVA et al., 2009). Apesar de ser encontrado em diferentes espécies, é

extremamente incomum encontrar-se glicerol em sua forma “livre” (ARRUDA et al., 2006).


O glicerol é o principal subproduto gerado na produção de biodiesel, sendo que

aproximadamente 10% do volume total de biodiesel produzido correspondem a glicerol

(DASARI et al., 2005; JOHNSON E TACONI 2007).

Com o intuito de prevenir-se futuros problemas derivados da acumulação de

glicerol e para tornar a produção de biodiesel mais competitiva, torna-se necessário a busca de

alternativas para o uso do glicerol bruto gerado nesta produção. Este subproduto, em sua

forma pura, possui inúmeras aplicações industriais, como aditivos para a indústria de

alimentos, química e farmacêutica. O glicerol obtido, resultante da transesterificação de

triglicerídios com álcool, apresenta impurezas como água, sais, ésteres, álcool e óleo residual,

que lhe conferem um baixo custo (OOI et al.,2004).

Na indústria de alimentos, o glicerol é utilizado como aditivo alimentar, agindo

como estabilizante, antioxidante, sequestrante, emulsificante e umectante. Na indústria

farmacêutica, é utilizado em xaropes, devido à sua viscosidade (MORRISON, 1994).

Também é um agente crioprotetor em micro-organismos, não permitindo a formação de

cristais de gelo dentro da célula e mantendo a estabilidade celular e viabilidade durante o

processo de conservação por congelamento (BRISSON et al, 2001).

A glicerina constitui uma fonte de matéria-prima para produtos de alto valor

agregado, como polímeros, obtidos através de conversão química ou bioquímica (rotas

fermentativas), aditivos para combustíveis, como ésteres e éteres de glicerina, antibióticos,

analgésicos e leishmanicidas (KARINEN et al., 2006 e YAZDANI E GONZALEZ, 2007).

A rentabilidade de vários processos depende, em parte, da venda dos subprodutos,

o que permite a redução dos custos de produção e, consequentemente, do preço final do

produto. Assim, há um grande interesse na purificação do glicerol ou no seu reaproveitamento

direto, sem tratamento, que proporcionará a viabilização do processo de produção de

biodiesel, permitindo que este se torne competitivo no crescente mercado de biocombustíveis.

Os processos destinados à sua purificação incluem filtração, destilação a vácuo, descoloração

e troca de íons para a remoção, principalmente, de K+ e Na+ utilizados como catalisadores

(YONG et al. 2001).

A conversão microbiana de glicerol por processos biotecnológicos em produtos de

maior valor agregado, como biomassa e biomoléculas, é uma alternativa relevante para a

maior valorização da produção de biodiesel. Isso se torna possível em razão de o glicerol ser


considerado uma fonte de carbono altamente assimilável por bactérias e leveduras sob

condições aeróbicas e anaeróbicas (ITO et al., 2005).

2.3. Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica é um micro-organismo estritamente aeróbio, eucariótico, do

reino Fungi, pertencente à classe dos Ascomicetos, subclasse Hemiascomicetos. Foi

originalmente classificada como Candida lipolytica e depois reclassificada como

Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica e, finalmente, Yarrowia lipolytica

(BARTH e GAILLARDIN, 1997).

Normalmente, é isolada de ambientes contaminados por compostos oleosos, como

a Baía de Guanabara, Brasil, em indústrias de laticínios, participando da flora de queijos

picantes (BARTH e GAILLARDIN, 1997), de produtos avícolas crus (ISMAIL et al., 1999),

e é particularmente adaptada a substratos hidrofóbicos. Acredita-se que, evolutivamente,

leveduras que vivem em meios aquosos onde a fonte de carbono é hidrofóbica e, portanto, se

encontra dispersa no meio, sob a forma de gotas, tenham desenvolvido mecanismos para

facilitar o acesso a este substrato devido à pequena probabilidade de contato das gotas de

óleo, em constante movimento, com os micro-organismos.

Essa levedura é diferente dos modelos celulares mais estudados - Saccharomyces

cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe (consideradas leveduras “convencionais”) - em

relação à fisiologia, genética e biologia molecular e, portanto, pertence ao grupo das leveduras

“não-convencionais”, sendo a espécie mais estudada desse grupo (BARTH e GAILLARDIN,

1997).

Não sendo considerada patogênica, já foi utilizada em aplicações industriais,

como na produção de proteínas de micro-organismos unicelulares, flavour de pêssego e ácido

cítrico, em processos considerados pela American Food and Drug Administration como

GRAS (Generally Regarded As Safe) (TSUGAWA et al., 1969). Além disso, excreta várias

enzimas, como proteases, lipases, esterases e fosfatases, de grande interesse biotecnológico

(NICAUD et al., 2002).


Convém destacar ainda a produção de proteínas heterólogas, campo de estudo que

tem sido explorado, em relação às leveduras não-convencionais, para pesquisa básica e

aplicações biomédicas.

Historicamente, a Saccharomyces cerevisiae foi usada como hospedeiro para

produção de proteínas heterólogas, levedura sobre a qual a literatura já acumulou vasto

conhecimento, mas que apresenta, neste caso, baixa produtividade, pobre estabilidade de

plasmídeo e baixa capacidade de excreção (MADZAK et al., 2004). Muller et al. (1998)

testaram quatro leveduras não-convencionais e S. cerevisiae na produção de seis enzimas

fúngicas, as não-convencionais, em sua totalidade, foram mais eficientes que a levedura

convencional, sendo que Y. lipolytica foi o hospedeiro que apresentou melhor performance e

reprodutibilidade.

Diferentemente de S. cerevisiae, na maioria das leveduras não-convencionais,

como Y. lipolytica, a respiração em presença de oxigênio é essencial para o uso de açúcares.

Y. lipolytica, sendo aeróbio restrito, não possui taxa de respiração, conteúdo de citocromos ou

propriedades mitocondriais afetados por altas concentrações de glicose (FLORES et al., 2000;

BANKAR et al., 2009).

Kawasse (2001), em sua revisão, mencionou a importância do conhecimento da

regulação do metabolismo de glicogênio para monitorar e controlar as condições de cultura de

leveduras utilizadas em biotecnologia. Um decréscimo na amplitude das oscilações do reciclo

de glicogênio foi o resultado obtido pelo mesmo autor, ao aplicar estresse oxidativo na fase

exponencial de crescimento de células de Y. lipolytica.

O autor também observou o decréscimo do conteúdo de glicogênio intracelular

nessas condições, concomitantemente à redução da atividade lipolítica intracelular e ao

aumento da atividade extracelular. Para o experimento, que não foi submetido ao estresse, o

conteúdo de glicogênio manteve-se oscilando em torno de um valor constante e as atividades

lipolíticas intra e extracelular não variaram. Os referidos resultados sugerem que uma possível

interação entre a lipase e o glicogênio tenha influenciado a excreção da enzima, o que já foi

observado in vivo e in vitro (PEREIRA-MEIRELLES, 1997).

Y. lipolytica revelou-se um importante micro-organismo, para efeitos biológicos e

aplicações biotecnológicas. Ácidos orgânicos, enzimas (proteases, lipases, esterases e


fosfatases), proteínas unicelulares e biosurfactantes são os principais produtos obtidos a partir

deste micro-organismo (FINOGENOVA et al., 2005)

O fungo tem sido utilizado como um sistema modelo em estudos relacionados à

fisiologia, genética, manipulação gênica, (FICKERS et al., 2006; BEOPOULOS et al., 2009).

Embora essas avaliações tenham considerado diversos aspectos da Y. lipolytica, muitos

progressos foram alcançados em áreas não-convencionais, relacionadas às aplicações

ambientais e industriais desta levedura, no últimos anos.

Yarrowia lipolytica possui a capacidade de produzir moléculas dotadas de

propriedades tensoativas, como demonstram alguns estudos desenvolvidos pela literatura

especializada. Tais pesquisas apontam uma ampla diversidade entre as fontes de carbono

utilizadas para produção de biossurfactante (AMARAL et al, 2006)

Em 2008, RUFINO et al. produziram biossurfactante utilizando glicose como

fonte de carbono, a partir da levedura C. lipolytica UCP 0988, tendo-se apresentado alta

atividade de emulsificação. AMARAL et al. (2006) utilizaram, igualmente, como fonte de

carbono a glicose para a síntese do biossurfactante denominado Yansan, a partir de Y.

lipolytica IMUFRJ 50682.

Devido à potencialidade em degradar alcanos, ácidos graxos e óleo, não é

surpreendente que cepas de Y. lipolytica emirjam de vários estudos independentes como

agente promissor no tratamento da poluição causada por óleos minerais e por resíduos

oriundos da indústria de petróleo (FICKERS et al., 2006).

Diversos estudos têm mostrado que Y. lipolytica também é capaz de degradar

glicerol, convertendo-o em produtos de interesse industrial, tais como ácido cítrico, ácido

pirúvico e lipídeos. PAPANIKOLAOU et al. (2007) cultivaram Yarrowia lipolytica LGAM

S(7)1 em glicerol cru (proveniente da produção de biodiesel) sob condições limitantes de

nitrogênio e verificaram que, em elevadas concentrações iniciais de glicerol, ocorreu a

produção de, aproximadamente, 35 g/L de ácido cítrico, com um rendimento (YP/S) de 0,42 a

0,44 g/g. RYMOWICZ et al, (2006) também utilizaram glicerol cru como substrato para três

cepas mutantes de Y. lipolytica e observaram que, para a concentração inicial de 200 g/L de

glicerol, Y. lipolytica 1.31 foi capaz de produzir 124,5 g/L de ácido cítrico, obtendo-se um

rendimento (YP/S) de 0,62 g/L.


O glicerol também tem sido usado por Y. lipolytica como fonte de carbono para

produção de biossurfactantes. Fontes (2008) utilizou glicerol bruto (proveniente da produção

de biodiesel) como substrato para o crescimento celular e produção de biossurfactante e

obteve resultados satisfatórios, com uma redução da tensão superficial de 22mN/m e um

índice de emulsificação de 70,22%.

2.4. Ácido cítrico

O ácido cítrico (ácido 2-hidroxipropano-1,2,3-tricarboxílico), de fórmula química

C6H8O7 e fórmula estrutural representada na Figura 2, é intermediário do ciclo dos ácidos

tricarcarboxílicos. Foi isolado, do suco de limão, por Sheele, pela primeira vez em 1884,

sendo o principal constituinte dos frutos cítricos. (MATTEY, 992).

Figura 2. Fórmula estrutural do ácido cítrico

O acúmulo do ácido cítrico por alguns fungos foi descoberto por volta de 1893,

quando Wehmer descobriu que o Citromyces possuía a capacidade de acumular este ácido

durante seu cultivo (SIEBERT e SCHULZ, 1979).

Foi produzido para o comércio exclusivamente através do processo fermentativo

com Aspergillus niger e largamente utilizado na indústria de alimentos e bebidas, química,

farmacêutica, dentre outras (WANG e LIU, 1996). Sua descoberta é atribuída ao alquimista

islâmico Jabir Ibn Hayyan no século VIII dC.

Sua produção global alcançou 1,4 milhões de tonelada por ano e existe um

crescimento anual de 3,5 – 4 % do consumo de ácido cítrico (RYMOWICZ et al.,2008).


Possui grande utilidade para as indústrias farmacêutica e alimentícia, pois suas

características de sabor agradável, baixa toxidade e fácil assimilação permitem muitas

aplicações (GREWAL e KALRA, 1995). É utilizado na indústria de alimentos para estimular

o flavor natural de frutas, na fabricação de bebidas (principalmente refrigerantes), para

prevenir a cristalização da sacarose em balas e age como estabilizante em sucos, emulsificante

em sorvetes, bem como evita o escurecimento de alguns vinhos brancos.

Na indústria farmacêutica, é empregado no preparo de sais efervescentes, como

antioxidante, tampão, acidificador, sendo utilizado em xampus e loções. Também pode ser

adicionado em produtos de limpeza como detergentes biodegradáveis, limpadores e polidores

de aço inoxidável e outros metais (MATTEY, 1992). A Tabela 2 destaca algumas das

aplicações do ácido cítrico, segundo Soccol et al. (2006).


Tab

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A produção de ácido cítrico depende, primordialmente, do potencial de síntese do

micro-organismo utilizado. Porém, as condições do processo e a composição do meio

fermentativo são variáveis importantes que, quando otimizadas, podem promover um

acréscimo do rendimento (MILLIS, 1985).

Múltiplos fatores podem afetar o processo de produção de ácido cítrico. Os mais

estudados são: concentração de íons metálicos (principalmente Mn2+), tipo de substrato

(melaço ou sacarose), quantidade e tempo de inoculação. Contudo, poucos estudos foram

desenvolvidos para verificar a influência das fontes de nitrogênio na produção de ácido

cítrico.

O ácido cítrico provém do metabolismo de energia e sua acumulação é

dependente de condições de desbalanceamento metabólico. Muitas leveduras também podem

ser utilizadas para produção de acido cítrico. Dentre as leveduras mais empregadas, destacam-

se as das espécies Yarrowia lipolytica, Cândida tropicalis e algumas espécies de Rhodorula

sp (ROHER et al., 1996, VENTER et al., 2004).

Essas leveduras, quando cultivadas em meio com limitação de nitrogênio, são

capazes de produzir quantidades significantes de ácido cítrico em diversas fontes de carbono,

tais como açúcares, alcanos, alcoóis, óleos, amido hidrolisado e glicerol (ROHER et al., 1996,

VENTER et al., 2004). O nitrogênio tem influência na síntese de enzimas que regulam o

ciclo de Krebs e a via glicolítica, e o carbono na formação de produto e biomassa (PANDA et

al., 1984).

A principal limitação do uso de leveduras na produção de acido cítrico é a

formação de ácido isocítrico, que pode atingir níveis de até 50% do produto obtido.

Entretanto, de acordo com Rhoer et al. (1996), a produção de ácido isocítrico

depende da espécie, da fonte de carbono e das condições de cultivo. A presença de acetato foi

citada como benéfica para a levedura Yarrowia lipolytica UOFS Y-701 (VENTER et al.,

2004).

Diversos autores reportaram o uso de substratos alternativos para produção de

ácido cítrico, tais como: casca de milho, casca de abacaxi, casca de mandioca, bagaço de

cana, melaços, dentre outros (HANG E WOODAMS, 2000; ADHAM, 2002; KUMASR et

al., 2003a; KUMASR et al., 2003b; ANGUMEENAL E VENKAPPAYYA, 2005).


2.4.1. Fatores químicos que influenciam a produção de ácido cítrico

A acumulação de ácido cítrico é bastante influenciada pela fonte de carbono

(SOCCOL et al., 2003). Algumas estirpes de leveduras podem utilizar um largo espectro de

fontes de carbono como substrato para produção de ácidos orgânicos. Uma condição especial

para produção de ácidos orgânicos por Y. lipolytica é o excesso de fonte de carbono e

limitação de nitrogênio, sais minerais ou tiamina. Para a produção de ácido cítrico,

especificamente, a limitação de nitrogênio favorece o rendimento produtivo (FORSTER et al.,

2007).

2.4.2. Fontes de Carbono e Nitrogênio

Os açúcares representam a fonte de carbono mais facilmente metabolizada pelos

micro-organismos (ARMILIATO, 2000). Dentre os carboidratos metabolizados, a sacarose é

a fonte de carbono mais favorável, seguido de glicose, frutose e galactose (SOCCOL et al.,

2003 ). Diversos trabalhos desenvolvidos demonstram a potencialidade de cepas de Yarrowia

para metabolizar outras fontes de carbono, incluindo glicerol procedente da indústria do

biodiesel (HOLZ et al., 2009; RYWIŃSKA et al., 2010).

Algumas leveduras são capazes de utilizar diversas fontes de carbono para

produção de ácido cítrico. Dentre as mesmas, encontram-se: n-parafinas, óleos naturais,

ácidos graxos, etanol, glicose, sacarose e lactose (MATTEY, 1992; DARVISHI et al., 2009).

A fonte de nitrogênio é fornecida, geralmente, através do sulfato de amônio ou

extrato de levedura (ARMILIATO, 2000). Segundo Mattey (1992), o nitrogênio é fornecido,

geralmente, na forma de sulfato de amônio, extrato de levedura ou nitrato, a concentração

ideal de nitrogênio varia de 1 a 3g.L-1, e a adição de quantidades maiores provavelmente não é

economicamente viável.

Klasson et al., (1991), demonstraram que a produção de ácido cítrico por

Saccharomycopsis lipolytica Y 7576, iniciou a baixas concentrações de sulfato de amônio e

após o esgotamento deste, o crescimento celular foi reduzido e o organismo rapidamente

alcançou fase estacionária. Enquanto havia açúcar no meio observou-se a produção do ácido.


Darvishi et al. (2009) estudaram a influência de diversas fontes de nitrogênio na

produção de ácido cítrico, como NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4H2PO4, caseína, uréia,

peptona, farinha de soja, extrato de carne e extrato de malte, concluindo que a uréia foi a

melhor fonte de nitrogênio para produção do ácido.

Vários estudos apontam a produção elevada de ácido cítrico por Yarrowia

lipolytica utilizando glicerol da produção do biodiesel como fonte de carbono. Papanikolaou

et al., (2002) e Papanikolaou et al., (2008) conseguiram uma produção alta de ácido cítrico

após limitar o nitrogênio no meio. Levinson et al., (2007) apontam que a composição do meio

de crescimento e a relação carbono/nitrogênio afetam a proporção dos ácidos cítrico e

isocítrico produzidos e que é necessário estabelecer uma relação entre estes dois compostos

para otimizar a produção de ácido cítrico.

2.4.3. Fontes de Fosfato

Em alguns trabalhos, verificou-se que a presença de fosfato no meio tem amplo

efeito sobre o rendimento da produção de ácido cítrico. Baixos níveis de fosfato no meio tem

efeito positivo na produção do ácido. Esse efeito atua em nível enzimático e não em nível de

expressão genética. Paralelamente, o excesso de fosfato pode resultar na diminuição da

fixação de dióxido de carbono, elevando a formação de certos ácidos e estimulando o

crescimento, diminuindo a produção de ácido cítrico (GREWAL E KALRA, 1995; SOCCOL

et al., 2006).

2.4.4. Aeração e agitação

A agitação e aeração são fatores de maior importância quanto às fermentações,

visto que a maioria das fermentações de interesse industrial são aeróbias e necessitam de

grande quantidade de oxigênio. Essa precisão não se demonstra apenas para o crescimento

celular, mas também para a produção de substâncias que necessitam de oxigênio para que


bons rendimentos sejam obtidos. A fermentação de ácido cítrico é um processo

essencialmente aeróbio e os micro-organismos requerem abundante suprimento de oxigênio

para crescimento.

RANE E SIMS (1993) estudaram o efeito do oxigênio dissolvido para a produção

de ácido cítrico por Cândida lipolytica Y1095. Durante a produção, a concentração de

oxigênio dissolvido foi aumentada de 20% para 80%. Durante a fase inicial de produção, o

oxigênio dissolvido não influenciou a produção do ácido. Entretanto, após a fase inicial de

fermentação, com a elevação do oxigênio o rendimento aumentou em aproximadamente 50%.

2.4.5. Demanda de ácido cítrico

Devido à sua larga gama de aplicações, a demanda por ácido cítrico tem crescido

diariamente. Sua produção mundial ultrapassa 800 mil ton/ano, sendo os maiores produtores a

Europa e os Estados Unidos. O mercado cresce em torno de 4% ao ano e seu emprego em

alimentos representa entre 55% e 65% do mercado total de acidulantes. A utilização de ácido

fosfórico abrange de 20% a 25%, enquanto que o ácido málico envolve 5% do mesmo

mercado. Pelas razões apresentadas, a indústria tem se dedicado à busca de novos substratos e

processos tecnológicos, visando a diminuir o custo de produção do ácido cítrico (HAQ et al.,

2004; GRAF, 2007).

Neste sentido, o uso de matérias primas regionais e excedentes agrícolas como

substrato para produção de ácido cítrico vem ao encontro da tendência mundial de busca por

processos mais econômicos com vistas ao desenvolvimento sustentável através do

aproveitamento do excedente agrícola e de matérias primas de baixo custo.

Capítulo 3 – Metodologia

3. METODOLOGIA

Os ensaios deste trabalho foram desenvolvidos inicialmente em frascos agitados

onde realizou-se um Planejamento Fatorial para i

processo fermentativo, e em fermentador de bancada, onde a concentração inicial de glicerol,

e oxigênio dissolvido no meio foram investigados

relatadas como produtoras de ácido cítrico.

3.1. Micro-organismos Utilizados

Foram avaliadas inicialmente duas linhagens da levedura

NRRL YB-423 e NRRL YB

(ARS Culture Collection, Peoria, Illinois, USA

inicialmente, por apresentar os melhores resultados dentre outras linhagens já estudadas na

produção de ácido cítrico a partir de glicerol puro, s

YB 323 foi incluída, para efeito comparativo

sido estudada, para a produção de ácido cítrico

linhagens, foi escolhida a

trabalhos.

Figura 3. Microscopia ótica das estirpes estudadasYarrowia lipolytica YB-323


um Planejamento Fatorial para investigar as variáveis de influê


e oxigênio dissolvido no meio foram investigados. Foram testadas duas cepas de leveduras

relatadas como produtoras de ácido cítrico.

organismos Utilizados

Foram avaliadas inicialmente duas linhagens da levedura

423 e NRRL YB-323, fornecidas pelo Northern Regional Rese

ARS Culture Collection, Peoria, Illinois, USA) (Figura 3). A linhagem YB 423 foi escolhida

por apresentar os melhores resultados dentre outras linhagens já estudadas na

trico a partir de glicerol puro, segundo Levison et al.

para efeito comparativo, junto a YB 423, pois a mesma ainda não havia

para a produção de ácido cítrico, a partir de glicerol. Dentre

foi escolhida a de melhor desempenho para ser utilizada no prosseguimento dos

3. Microscopia ótica das estirpes estudadas, utilizando a objetiva de 323 e em B Yarrowia lipolytica YB-423.

A

19 Sá, T.N.M


nvestigar as variáveis de influência para o


Foram testadas duas cepas de leveduras

Foram avaliadas inicialmente duas linhagens da levedura Yarrowia lipolytica:

Northern Regional Research Laboratory.

) (Figura 3). A linhagem YB 423 foi escolhida,

por apresentar os melhores resultados dentre outras linhagens já estudadas na

et al. (2007). A linhagem

junto a YB 423, pois a mesma ainda não havia

a partir de glicerol. Dentre as duas citadas

para ser utilizada no prosseguimento dos

objetiva de 100x. Em A

B

20 Capítulo 3 – Metodologia Sá, T.N.M

3.1.1. Ativação do micro-organismo

As culturas liofilizadas de Y. lipolytica NRRL 323 e Y. lipolytica NRRL 423

foram transferidas para um Erlenmeyer de 50mL contendo 10mL de caldo TSB - Trypticase

Soy Broth - (HIMEDIA - Tabela 3), previamente esterilizado à temperatura de 121ºC, durante

15 minutos. Em seguida, os frascos foram incubados a 28ºC em shaker orbital (SOLAB), a

200rpm de agitação, por 24h.

Posteriormente, todo o conteúdo dos frascos foi transferido para Erlenmeyers de

100mL contendo 40mL do caldo TSB estéril. Os mesmos foram novamente incubados à

temperatura de 28ºC em shaker orbital, a 200rpm de agitação, por 24 horas.

Tabela 3. Composição do meio TSB (Trypticase Soy Broth)

Componentes Composição (gL-1)

Triptona

Soitona

Dextrose

Cloreto de sódio

Fosfato de potássio dibásico

17,0

3,0

2,5

5,0

2,5

pH ajustado para 6,0 ±0,2

3.1.2. Preparo de cultura-estoque de Y. lipolytica NRRL 323 e Y. lipolytica NRRL 423

As leveduras foram estocadas sob duas formas de conservação. A primeira em

tubos contendo 4mL de Agar Batata Dextrose (HIMEDIA – Tabela 4) inclinado, onde as

culturas ativadas foram repicadas para os tubos contendo Agar inclinado e incubadas a 28°C

por 24h. Após esse período, as culturas foram armazenadas à temperatura de 4,0 °C

(SOARES et al., 1991). A segunda técnica de preservação utilizada consistiu na conservação

das células em glicerol analítico, acrescentando-se 5mL do glicerol estéril e 5mL de meio

TSB fermentado (conforme descrito no item 3.1.1) a tubos de ensaio estéreis, sendo os


mesmos armazenados à temperatura de -20,0°C. A renovação das culturas foi realizada a cada

três semanas.

Tabela 4. Composição do meio Agar batata Dextrose (HIMEDIA)


Infusão de batata

Dextrose

Agar

20,0

20,0

15,0

pH final 5,6 ±0,2

3.2. Preparo do Inóculo

Para o preparo do inóculo, a cultura congelada, mantida em caldo TSB com 50%

de glicerol, foi assepticamente transferida para um Erlenmeyer contendo 100ml de caldo TSB,

com pH ajustado para 6,0 com HCl 1,0 N. A incubação foi realizada em shaker orbital

(SOLAB) a 200 rpm, e 28,0°C por 24h (OSWAL et al., 2002). Após este período, para os

testes iniciais com glicerol analítico e residual do biodiesel, foi utilizado inóculo na proporção

de 1% (v/v). Os demais ensaios foram realizados com inóculo na proporção de 10% (v/v),

com o intuito de se atenuar o tempo de fermentação.

3.3. Ensaios com Glicerol Analítico e Residual do Biodiesel

De acordo com Levison et al. (2007), a levedura por ele estudada, Yarrowia

lipolytica NRRL 423, foi capaz de produzir até 21,6g.L-1 de ácido cítrico, a partir de 40g.L-1

de glicerol analítico em meio mineral, obtendo, dessa forma, 54% de rendimento, tendo como

referência a concentração inicial de glicerol.

Objetivou-se realizar dois testes, com as mesmas condições de cultivo utilizadas

por esses autores. No entanto, para o primeiro teste utilizou-se o glicerol analítico (Meio 1) e,


para o segundo teste, o glicerol residual do biodiesel (Meio 2), a fim de investigar-se a

produção de ácido cítrico a partir deste resíduo. A composição dos meios analisados está

disposta da Tabela 5.

Tabela 5. Meio fermentativo adaptado de Levison et al. (2007)

Componentes Composição (g.L-1)

Meio 1 Meio 2

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4.7H2O

Glicerol analítico

Glicerol residual

Extrato de levedura

Sulfato de amônio

Tiamina

1,7

12

1,25

40

-

0,25

0,25

0,006

1,7

12

1,25

-

40

0,25

0,25

0,006

pH inicial 6,0 ±0,4

O micro-organismo Yarrowia lipolytica NRRL 423 foi ativado em meio TSB, por

24 horas, e inoculado a 1% em Erlenmeyers de 250mL, contendo 50mL de meio para

fermentação. Este foi esterilizado em autoclave a 121°C, por 15 minutos. A Tiamina foi

esterilizada separadamente por filtração e, posteriormente, adicionada assepticamente ao meio

frio.

Em seguida, os meios inoculados foram incubados em shaker orbital durante 10

dias. Alíquotas foram retiradas, a cada 24h, para leitura de biomassa, pH e produção de ácido

cítrico. O pH foi ajustado assepticamente, adicionando-se ao meio NaOH a cada leitura

realizada, de forma que permanecesse disposto no intervalo de 5,0 a 6,0. A análise de ácido

cítrico foi realizada através da metodologia de Cromatografia Líquida de Alta Performance

(HPLC), conforme o item 3.9.4.


3.4. Efeito da Tiamina

Estudou-se o possível efeito da tiamina na produção de ácido cítrico. Para tal,

utilizou-se o Meio 2 descrito na Tabela 5, variando a concentração inicial de glicerol residual

do biodiesel adicionado ao meio em 20g.L-1, 40 g.L-1 e 60 g.L-1 com e sem a adição da

Tiamina. Ambas as cepas foram investigadas neste teste, tendo se dado o preparo do inóculo

de acordo com o item 3.2. Com o intuito de se reduzir o tempo de fermentação, o meio foi

inoculado com 10% (v/v) de inóculo, em vez de 1% (v/v), como utilizado anteriormente.

O pH foi ajustado, primeiramente, para 6,0, sendo mantido, durante a

fermentação, no intervalo de 5,0 a 6,0. Os dados de variação de pH e produção de biomassa

foram registrados, a produção de ácido cítrico foi verificada através da metodologia de acidez

total titulável.

3.5. Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das fontes de

nitrogênio orgânica e inorgânica

Visando-se a averiguar as concentrações iniciais ideais de glicerol residual do

biodiesel e das fontes de nitrogênio orgânico (extrato de levedura) e inorgânico (sulfato de

amônio), realizou-se um Planejamento Experimental variando as concentrações destes três

componentes. Além das variáveis do planejamento, o meio de ensaio continha a composição

apresentada na Tabela 6, (Levison et al 2007).

Tabela 6. Composição do meio Fermentativo (Mineral)


KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4.7H2O

1,7

12

1,25

Levison et al (2007)


As variáveis foram avaliadas por meio de um Delineamento Composto Central

Face Centrada (DCCFC), 23, incluindo 3 repetições no ponto central, totalizando, assim, 17

ensaios, conforme apresentado nas Tabelas 7 e 8.

Tabela 7. Variáveis utilizadas no DCCFC 23 para produção de ácido cítrico

Variáveis Código Concentrações (g/L)

-1* 0* +1*

Glicerol X1 20 40 60

Extrato de levedura X2 0,1 0,3 0,5

Sulfato de amônio X3 0,1 0,3 0,5

* Níveis codificados: Nível Superior: +1; Nível inferior: -1; Ponto central: 0.

Tabela 8. Matriz do planejamento DCCFC (23)

Ensaios Variáveis codificadas

X1 X2 X3

1 - - - 2 - - + 3 - + - 4 - + + 5 + - - 6 + - + 7 + + - 8 + + + 9 - 0 0 10 + 0 0 11 0 - 0 12 0 + 0 13 0 0 - 14 0 0 + 15* 0 0 0 16* 0 0 0 17* 0 0 0

*Pontos centrais x1 – Glicerol; x2 Extrato de levedura; x3 Sulfato de amônio

As fermentações foram conduzidas em Erlenmeyer de 250mL, contendo 50mL de

meio estéril. Esses frascos foram incubados em shaker orbital por 120h, a 28 °C e 200 rpm de

agitação. Amostras de 5mL foram retiradas assepticamente a cada 24 horas para análise de


crescimento celular, pH e ácido cítrico através do método da acidez total titulável. A

concentração de inóculo adicionado aos meios foi de 10% (v/v)

A abordagem experimental consistiu na alternação de todas as variáveis

concomitantemente. Isso se dá em razão de as variáveis poderem se influenciar mutuamente e

o valor ideal para uma delas poder depender do valor de outra. Este comportamento,

denominado “interação entre variáveis”, é um fenômeno ocorrido frequentemente, sendo raras

as ocasiões em que duas variáveis atuam de forma independente.

Para a constituição da matriz de ensaios, foram consideradas 3 variáveis

independentes, nos níveis máximo (+) e mínimo (-), expressas nas Tabelas 06 e 07 com seus

respectivos níveis. A variável dependente, ou resposta estudada, foi a produção de ácido

cítrico. A análise estatística foi realizada através do programa Statistica (Statsoft) versão 7.0.

3.6. Testes sem adição de extrato de levedura e sulfato de amônio na composição do

meio

Visando a diminuir os custos despendidos com o meio de fermentação, foram

realizados testes em frascos agitados, suprimindo as fontes de nitrogênio orgânica e

inorgânica, com a concentração inicial de glicerol residual a 20g.L-1 para cada micro-

organismo estudado.

A finalidade deste teste foi avaliar se o meio contendo apenas glicerol como fonte

de carbono e os demais componentes minerais (exceto fontes de nitrogênio), ao ser inoculado

com o micro-organismo em fase exponencial, passaria de forma mais acelerada à fase de

produção, visto que a fonte de nitrogênio, essencial para a multiplicação celular, seria

somente aquela remanescente do meio de crescimento.

Os testes foram conduzidos em Erlenmeyer de 500ml, contendo 100mL de meio

de fermentação (Tabela 9) sem extrato de levedura e sulfato de amônio. Para estes ensaios, o

meio de fermentação não foi esterilizado, objetivando-se avaliar a necessidade de

esterilização do meio.


Tabela 9. Meio utilizado para investigação da supressão de fontes de nitrogênio


KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4.7H2O

Glicerol

1,7

12

1,25

20

Adaptado de Levison et al (2007)

Aos frascos foram adicionados 10mL de inóculo, sendo em seguida incubados a

28ºC e 200rpm de agitação por 72h. Durante esse intervalo de tempo de incubação, as

amostras foram retiradas a cada 24h. Realizaram-se as leituras das absorbâncias, a 600nm,

para determinação da massa seca. As amostras foram centrifugadas em centrifuga (Excelsa I

206 – FANEM) por 10 minutos. O sobrenadante foi utilizado para determinação de ácido

cítrico.

3.7. Utilização de Erlenmeyer de 500ml

Objetivando-se avaliar uma maior superfície de contato do micro-organismo com

o oxigênio, foram utilizados Erlenmeyers de 500mL, contendo 50 mL de meio mineral (a

mesma quantidade utilizada em frascos de 250mL). A concentração de 20g.L-1 de glicerol foi

investigada para as duas cepas.

No processo fermentativo, os meios minerais (não-estéreis) contendo 20g.L-1

glicerol foram inoculados com 10% de inóculo e, posteriormente, incubados, a 28ºC e

200rpm, por um período de 72h. Diariamente, alíquotas de 5mL foram retiradas para

medições de pH, produção de ácido cítrico e densidade ótica.

3.8. Ensaios em fermentador

Os ensaios foram realizados em batelada em Fermentador (TECNAL, modelo

TEC-BIO R1.5) com dorna de 1,0 L. O fermentador possuía um módulo de aeração, um

módulo de bomba peristáltica com quatro saídas, um módulo de banho termostatizado e um


módulo de medição e atuação com sensor de pH e O2, nível de espuma, temperatura e

controle de agitação, sendo tudo conectado e um computador e controlado pelo software

TECBIOSOFT. Nos experimentos realizados foram utilizados controle de temperatura,

agitação e adição de hidróxido de sódio para controle de pH..

A aeração foi realizada, inicialmente, através de ar comprimido injetado no

fermentador, por meio de um filtro HEPA. Após as primeiras 16h de fermentação, foi

empregado oxigênio puro, também injetado no fermentador, e monitorado através do eletrodo

de O2. Fixou-se a temperatura em 28°C e pH inicial de 6,0. Na Figura 04, vê-se o fermentador

utilizado nos experimentos.

Figura 4. Fermentador TECNAL, modelo TEC-BIO R1.5 de 1,0L

Realizaram-se fermentações, nas quais o oxigênio dissolvido no meio foi fixado

em 50% e 70%. A alimentação de O2, para as primeiras 16 horas de fermentação, foi

cumprida utilizando-se ar comprimido e agitação a 200rpm. Posteriormente, utilizou-se

alimentação com O2 puro e agitação, para serem mantidos os níveis de oxigênio nos valores

desejados.


Para cada fermentação, foram preparados 450mL de meio com 20g.L-1 de glicerol

residual do biodiesel e 50 mL de inóculo, formando-se, assim, 10% (v/v) de concentração do

inóculo. Amostras de 5mL foram retiradas a cada quatro horas de fermentação para as

primeiras 24h, após esse período as amostras foram retiradas diariamente, e após a leitura das

absorbâncias para determinação da biomassa, foram centrifugadas e o sobrenadante utilizado

para determinação de glicerol e ácido cítrico por HPLC.

3.9. Métodos Analíticos

3.9.1. Avaliação da Biomassa (g.L-1)

Amostras das leveduras cultivadas em caldo TSB durante 24h foram

centrifugadas, sendo o precipitado utilizado para a determinação da massa seca (biomassa).

As concentrações celulares foram indiretamente determinadas por mensuração da densidade

ótica das suspensões celulares, a 600nm. Os precipitados celulares foram lavados com água

destilada e secos em estufa de circulação de ar, a 80°C. Em seguida, obteve-se, por regressão

linear, as relações entre concentração celular e densidade ótica, a 600nm. As curvas de

calibração e as equações estão em anexo.

3.9.2. Análise do pH

O pH foi determinado por leitura direta em potenciômetro (Marconi, modelo

PA200), calibrado a cada utilização, com soluções tampão de pH 4,0 e pH 7,0 (AOC, 1992).

3.9.3. Acidez Total Titulável

Para ensaios de investigação do efeito da Tiamina, planejamento experimental,

supressão das fontes de nitrogênio e ampliação da superfície de contato com o O2 utilizando

frascos agitados em shaker, a produção de ácido cítrico foi verificada por meio de titulação

utilizando NaOH e fenolftaleína como indicador (BRASIL, 1986).


3.9.4. Determinação de ácido cítrico por HPLC

Na determinação de ácido cítrico produzido por meio dos testes iniciais - com

glicerol analítico e residual do biodiesel e em fermentador, empregou-se a metodologia de

cromatografia líquida de alta performance (HPLC), utilizando-se a coluna BioRad HPX 87H,

com as seguintes condições: fase móvel consistiu de ácido sulfúrico a 0,01N, temperatura da

coluna 50°C, fluxo 0,6 mL/min. e detector de UV a 210 nm. Essas condições de análise foram

baseadas nas recomendações do fabricante das colunas. A identificação, integração e

quantificação dos compostos realizou-se por meio de um software de aquisição e

processamento de dados, comparando-se com os padrões adequados.

3.10. Cálculo do rendimento.

O rendimento das fermentações foi calculado, utilizando-se os valores de ácido

cítrico produzido (g.L-1) e de glicerol (analítico ou residual) inicial (g.L-1), pela Equação 3.

�� %� Á�� í�� .��

�� !��.�� " 100 %&'(çã� 1

3.11. Determinação de parâmetros cinéticos

3.11.1. Velocidades específicas

As equações 5 e 6 apresentam as expressões utilizadas para calculo das

velocidades específicas de crescimento microbiano e formação de produto, respectivamente

(SCHMIDELL et al., 2001).


+, 1

-·�-

�� %&'(çã� 2

+0 1

-·�1

�� %&'(çã� 3

3.11.2. Fator de conversão Yp/x

A capacidade de formação de produto pela massa celular foi definida como Yp/x,

calculado pela razão entre o produto obtido (g/L) e a massa celular formada (g/L).

30/, 1� 5 16-� 5 -6

�1

�- %&'(çã� 4

Onde:

Yp/x :Fator de conversão de biomassa em produto (g.g-1)

Xm: Biomassa máxima

X0: Biomassa inicial

Pm: Produto final formado

P0: Produto inicial formado

31 Capítulo 4 – Resultados Sá, T.N.M

4. RESULTADOS

4.1. Ensaios com Glicerol Analítico e Residual do Biodiesel

A Figura 5 mostra a variação dos valores de pH, biomassa (g.L-1) e ácido cítrico

produzido (g.L-1) para uma fermentação de 10 dias, em relação ao Meio 1, (Tabela 5 do item

3.3 de Materiais e métodos) referente ao glicerol analítico.

Figura 5 – Resultados da fermentação realizada em shaker, a qual se baseou nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol analítico a uma concentração inicial de 40 g.L-1.

Através das Figuras 5 observa-se que o pH apresentou uma variação entre 3,0 e

6,0, a produção de ácido cítrico teve inicio a partir de 24h de fermentação, onde ainda se

verifica a multiplicação celular, no entanto, após as 96h de fermentação, onde se torna

evidente a fase estacionária de crescimento microbiano, pode-se observar que a produção do

ácido se demonstra acentuada.

Este comportamento, frente à produção de ácido cítrico pela levedura é

característico de uma produção parcialmente associada ao crescimento. A Figura 6 apresenta

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

pH, B

iom

assa

(g.

L-1)

e Á

cido

Cít

rico

(g.

L-1)

Tempo (h)

pH Biomassa Ácido Cítrico


as velocidades especificas para a produção de biomassa e produto, observa-se que o micro-

organismo iniciou a fermentação com uma pequena taxa de reprodução celular seguida pela

transição à fase de crescimento onde a velocidade específica de crescimento foi máxima e

chegando à fase de desaceleração. Após a fase de desaceleração o micro-organismo entrou na

fase estacionária onde a taxa de crescimento celular foi quase nula, nesta fase a produção de

ácido é mais evidenciada, no entanto também há uma pequena produção durante a fase de

crescimento.

Figura 6 – Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de ácido cítrico para a fermentação realizada em shaker, baseada nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol analítico, a uma concentração inicial de 40 g.L-1.

A análise dos resultados obtidos neste ensaio inicial, revelam que o rendimento

máximo obtido de 15,18g.L-1 foi inferior ao obtido por Levison et al (2007), que obteve em

seus estudos 21,6 g.L-1. Porém, verifica-se que o pH, ajustado adicionando-se ao meio NaOH

a cada leitura realizada, de forma que permanecesse no intervalo de 5,0 a 6,0, pode ter se

configurado um fator primordial para a produção do ácido, uma vez que, a despeito do

controle realizado, o potencial hidrogeniônico não se conservou constante neste intervalo.

FORSTER, A. et al 2007, em estudos realizados com sacarose como fonte de

carbono, ajustou o pH inicial no cultivo em 6,8. O pH médio durante o processo fermentativo

encontrou-se entre 5,5 e 6,0, segundo esses autores esta é a faixa ótima para a produção do

ácido.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

Vel

ocid

ades

esp

ecifi

cas

Tempo

µx

µp


Para o ensaio realizado com o glicerol residual do biodiesel, observa-se, através

da Figuras 7 que, quanto à biomassa, constatou-se um desempenho semelhante em ambos os

testes, com pico de crescimento em 48h de fermentação. Observa-se que apesar de utilizar um

resíduo industrial como fonte de carbono, o crescimento celular não foi afetado. A maior

produção de ácido também se configurou durante a fase estacionaria de crescimento celular da

referida levedura. O pH também se mostrou dentro da faixa de 6.0 e 3,0.

Figura 07 – Resultados da fermentação realizada em shaker, utilizando glicerol residual do biodiesel a uma concentração inicial de 40 g.L-1.

A Figura 08 apresenta as velocidades especificas para a produção de biomassa e

produto, para a glicerol residual do biodiesel como fonte de carbono, observa-se que a maior

velocidade de crescimento microbiano (µx) foi em 24h de fermentação, a maior velocidade

especifica de produção do ácido (µp) foi em 48h. Observa-se uma semelhança, entre os perfis

das duas velocidades especificas, de forma que as mesmas se correlacionam bem,

configurando um comportamento característico de formação de produto parcialmente

associado ao crescimento.

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400

2

4

6

8

10

12

0

2

4

6

8

10

12

pH Biomassa Ácido Cítrico

pH, B

iom

assa

(g.

L-1)

e Á

cido

Cít

rico

(g.

L-1

)

Tempo (h)


Figura 08 – Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de ácido cítrico, para a fermentação realizada em shaker, utilizando glicerol residual do biodiesel a uma concentração inicial de 40 g.L-1.

A produção de 10,07g.L-1 de ácido cítrico, equivalente a um rendimento

alcançado de 25,18%, foi inferior àquele no qual se utilizou glicerol analítico, quando se

obteve 15,18g.L-1, equivalente a 37,95% de rendimento. Esperava-se tal constatação, uma vez

que o glicerol residual do biodiesel possui impurezas e sua concentração não equivale a 100%

de glicerol. No entanto, vale ressaltar que por se tratar de um resíduo, apesar de demonstrar

um rendimento inferior ao glicerol analítico, o glicerol residual do biodiesel se configura uma

matéria prima mais barata e mais acessível.

Constatou-se, assim como no teste anterior, que ocorreram quedas de pH em

relação ao intervalo desejado (5,0 a 6,0), o que pode ter cooperado para a diminuição do

rendimento.

4.2. Efeito da Tiamina

Estudos realizados até então não encontram um consenso sobre o uso de Tiamina

como suplemento para o metabolismo de leveduras. Levisson et al (2007) utilizaram 6,0

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

Vel

ocid

ades

esp

ecifi

cas

Tempo

µx

µp


mg.L-1 de tiamina, em seus estudos, para a produção de ácido cítrico a partir de glicerol

analítico.

Semelhantemente, Ilchenko et al (2010) concluíram que o cultivo da levedura Y.

lipolytica em etanol, sob deficiência de tiamina, ocasiona estresse adaptativo nas células,

induzindo alterações metabólicas que podem desfavorecer a produção de ácidos orgânicos.

No entanto, apontou-se que a necessidade do uso da tiamina está associada também ao micro-

organismo.

Forster et al., 2007 relataram que uma condição especial para produção de ácidos

orgânicos por Y. lipolytica é o excesso de fonte de carbono e limitação de nitrogênio, sais

minerais e, inclusive, de tiamina. Costa (2000), que avaliou a influência da adição de tiamina

na produção de ácido cítrico por Candida lipolytica Y 1095, admitiu que a influência não se

apresentou significativa, tendo excluído esse componente da composição do meio em seu

experimento.

Sendo assim, a investigação da influência desta vitamina para a produção de ácido

cítrico pelas leveduras estudadas se torna relevante, com o intuito de averiguar se estas cepas,

em particular, requerem esse componente no meio. A fermentação foi conduzida durante

cinco dias de fermentação.

As Tabelas 10 e 11 indicam os resultados obtidos para a fermentação utilizando-se

meio fermentativo nas concentrações iniciais de glicerol residual de 20 g.L-1, 40 g.L-1 e

60g.L-1, com e sem a adição de tiamina.

Tabela 10. Variação de pH, biomassa, rendimento de ácido cítrico e fator de conversão, para meios com e sem tiamina, a 48 h de fermentação - YB-323.

Glicerol (g.L-1)

Sem tiamina Com tiamina Biomassa

(g.L-1) Ácido

Cítrico (%) Yp/x

Biomassa (g.L-1)

Ácido Cítrico (%)

Yp/x

*20 7,16±0,21 17,27a±0,10 0,50 9,51±0,12 6,95b

±0,10 0,15 *40 7,83±0,17 8,63a

±0,11 0,46 9,41±0,20 5,75b±0,14 0,25

*60 7,65±0,15 6,98a±0,10 0,53 9,26±0,14 5,06b

±0,10 0,38 *Concentração inicial de glicerol adicionado ao meio / pH inicial – (5,0 – 6,0) As médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.


Tabela 11. Biomassa, rendimento de ácido cítrico e fator de conversão, para meios com e sem tiamina, a 48 h de fermentação - YB-423.

Glicerol (g.L-1)

Sem tiamina Com tiamina Biomassa

(g.L-1) Ácido

Cítrico (%) Yp/x

Biomassa (g.L-1)

Ácido Cítrico (%)

Yp/x

*20 6,83±0,17 25,89a±0,12 1,23 8,41±0,21 7,67b

±0,12 0,19 *40 4,53±0,24 11,51a

±0,14 1,04 9,45±0,21 7,67b±0,11 0,29

*60 4,92±0,20 8,63a± 0,12 1,07 10,67±0,18 6,13b

±0,14 0,36 *Concentração inicial de glicerol adicionado ao meio. / pH inicial – (5,0 – 6,0) As médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Para todas as formulações estudadas, a partir da adição de tiamina, a produção de

ácido foi reduzida, quando comparada aos meios nos quais a adição do componente não foi

efetivada. O teste de Tukey a 5% de significância, revela que existe uma diferença expressiva

entre todos os rendimentos, para cada concentração estudada (Tabelas 10 e 11).

Para os meios contendo 20 g.L-1, as reduções no rendimento foram mais drásticas.

Para a levedura YB-323, o rendimento de 17,27% foi reduzido a 6,95% (Figura 9). Para YB –

423, o rendimento foi reduzido de 25,89% para 7,67% (Figuras 10). O fator de conversão de

produto em massa celular (Yp/x - Tabelas 10 e 11) também se apresentou inferior nos meios

onde continha tiamina. A redução se revelou ainda mais expressiva para o micro-organismo

YB 423.

Figura 9. Diferenças entre os rendimentos apresentados pela levedura Yarrowia lipolytica YB 323 para as três concentrações de glicerol, em meios com e sem tiamina.

20(g.L-1) 40(g.L-1) 60(g.L-1)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Ren

dim

ento

de

Áci

do C

ítric

o (%

)

Concentração de inicial de glicerol (g.L-1)

SemTiamina ComTiamina


Figura 10. Diferenças entre os rendimentos apresentados pela levedura Yarrowia lipolytica YB 423 para as três concentrações de glicerol, em meios com e sem tiamina.

Constatou-se, então, que a adição de tiamina não alterou positivamente a

produção de ácido cítrico durante a fermentação das duas cepas estudadas. O resultado obtido

foi compatível com aquele encontrado por Costa (2000).

Diante dos resultados encontrados, comprova-se que a adição de tiamina em meio

de cultura para produção de ácido cítrico, nas condições expostas e avaliadas, não é

necessária, podendo, portanto, ser suprimida por ocasião de estudos vindouros.

4.3. Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das fontes de

nitrogênio orgânica e inorgânica

Para avaliar as variáveis nutricionais referentes as concentrações iniciais ideais de

glicerol residual do biodiesel, extrato de levedura e sulfato de amônio, realizou-se um

Planejamento Experimental variando as concentrações destes três componentes.

As matrizes com os valores codificados das variáveis independentes e os

resultados do planejamento experimental DCCFC - em termos da resposta para a produção de

ácido cítrico em rendimento percentual - estão apresentados nas Tabelas 12 e 13.

20g/L 40g/L 60g/L0

5

10

15

20

25

Ren

dim

ento

de

Áci

do C

ítric

o (%

)

Concentração de inicial de glicerol (g.L-1)

SemTiamina ComTiamina


Tabela 12. Matriz do planejamento DCCFC 23 (valores codificados), resposta para a produção de ácido cítrico em rendimento(%) e fator de conversão de biomassa em produto (Yp/x) para YB 323

Ensaios Variáveis codificadas Ácido Cítrico

(%) Yp/x X1 X2 X3

1 - - - 23,02 ±0,12 1,25 2 - - + 20,14±0,10 1,17 3 - + - 17,27±0,05 1,00 4 - + + 20,14±0,10 0,58 5 + - - 5,76 ± 0,05 0,68 6 + - + 5,36 ± 0,15 0,72 7 + + - 5,36 ± 0,1 0,73 8 + + + 7,67 ± 0,10 0,59 9 - 0 0 17,27±0,10 0,40

10 + 0 0 6,71 ± 0,11 0,33 11 0 - 0 9,35 ± 0,06 0,69 12 0 + 0 8,63 ± 0,07 0,62 13 0 0 - 9,35 ± 0,08 0,46 14 0 0 + 11,51±0,11 0,73 15 0 0 0 8,63 ± 0,04 0,58 16 0 0 0 8,64 ± 0,05 0,41 17 0 0 0 8,69 ± 0,05 0,46

x1 – Glicerol; x2 Extrato de levedura; x3 Sulfato de amônio

Tabela 13. Matriz do planejamento DCCFC 23 (valores codificados), resposta para a produção de ácido cítrico em rendimento(%) e fator de conversão de biomassa em produto (Yp/x) para YB 423

Ensaios Variáveis codificadas Ácido Cítrico

(%) Yp/x X1 x2 X3 1 - - - 28,78±0,12 1,65 2 - - + 27,48±0,14 1,43 3 - + - 23,02±0,10 0,88 4 - + + 25,90±0,10 1,00 5 + - - 10,55±0,05 0,85 6 + - + 8,63 ± 0,05 0,83 7 + + - 9,59 ± 0,11 0,76 8 + + + 9,59 ± 0,10 0,67 9 - 0 0 25,90±0,04 1,11

10 + 0 0 8,63 ± 0,6 0,98 11 0 - 0 12,95±0,06 0,74 12 0 + 0 14,39±0,05 0,52 13 0 0 - 12,95±0,05 0,88 14 0 0 + 12,95±0,10 0,45 15 0 0 0 14,39±0,05 0,89 16 0 0 0 11,51±0,07 0,66 17 0 0 0 12,95±0,07 0,64



O maior rendimento percentual observado para a levedura YB 323 foi de 23,02%,

no ensaio 1, onde as variáveis independentes glicerol residual, extrato de levedura e sulfato de

amônio, apresentavam os menores níveis da faixa investigada. Igualmente para a levedura YB

423 o maior rendimento percentual observado foi de 28,78 %, também para o ensaio 1.

Observa-se que esses ensaios também expressam os maiores fatores de conversão de

biomassa em produto (Yp/x), sendo, assim, de 1,25 (g/g) para Yarrowia lipolítica YB 323 e de

1,65 para YB 423.

Os menores rendimentos percentuais para a levedura YB 323 (Tabela 12)foram

obtidos nos ensaios 6 e 7, sendo ambos de 5,36% o ensaio 5 também apresentou um dos

menores rendimentos ficando bem próximo destes com 5,76%. Nestes experimentos

encontrava-se a maior concentração de glicerol residual. O mesmo foi observado para a

levedura YB 423 (Tabela 13) onde nos ensaio 6 e 8, foi obtido rendimento de 8,63 % para

ambos, nestes ensaios a variável glicerol também se encontrava no maior nível (60g.L-1).

Em razão da ampla variabilidade inerente aos bioprocessos que envolvem micro-

organismos, foram considerados significativos os parâmetros com p – valores menores que

10% (p < 0,1). As análises foram realizadas com a matriz codificada e o rendimento

percentual de ácido cítrico.

O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das

variáveis possuem sobre a produção de ácido cítrico, estabelecendo quais destes efeitos

encontram-se dentro do intervalo de confiança estabelecido para a análise estatística (90%).

Em análise à Figura 11 a qual apresenta o Diagrama de Pareto para a levedura Y.

lipolytica YB-323, pode-se verificar que as variáveis “glicerol” e “sulfato de amônio”, bem

como as interações desta duas variáveis e da variável extrato de levedura com sulfato de

amônio (p <0,10) influenciaram significativamente a produção do ácido. Observa-se, também

que a variável independente glicerol apresentou efeito negativo para a produção de ácido

cítrico (p<0,10), de forma que quanto maior a concentração desta fonte de carbono, menor é o

rendimento .


Figura 11. Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) das variáveis testadas no planejamento experimental DCCFC, para a produção de ácido cítrico (%) por Yarrowia

lipolytica YB 323.

Para Y. lipolytica YB-423, observa-se através do gráfico de Pareto (Figura 12)

que a produção do ácido foi influenciada significativamente pelas variáveis glicerol e extrato

de levedura, bem como pelas interações desta duas variáveis. A variável independente,

glicerol, apresentou efeito negativo para a produção de ácido cítrico. O efeito da variável

extrato de levedura também foi negativo, no entanto apresentou um efeito bem menor que a

de glicerol (p<0,10).

Figura 12. Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) das variáveis testadas no planejamento experimental DCCFC, para a produção de ácido cítrico (%), por Yarrowia

lipolytica YB 423.

-,028787

,6421413

1,220491

-1,36408

2,200896

2,568565

2,568565

4,616386

-19,815

p=,1

Estimativa do efeito padronizado (valor absoluto)

Extrato de levedura(Q)

1L por 3L

(3)Sulfato de amonio(L)

(2)Extrato de levedura(L)

Sulfato de amonio(Q)

1L por 2L

2L por 3L

Glicerol(Q)

(1)Glicerol(L)

,066502

,2606268

1,078283

-1,45695

1,456948

-1,9547

2,622507

6,137189

-23,1958

p=,1

Estimativa do efeito padronizado (valor absoluto)

Sulfato de amonio(Q)

(3)Sulfato de amonio(L)

Extrato de levedura(Q)

1L por 3L

2L por 3L

(2)Extrato de levedura(L)

1L por 2L

Glicerol(Q)

(1)Glicerol(L)


Para ambas as leveduras estudadas, pode-se afirmar que a concentração de

20 g.L-1 de glicerol residual do biodiesel seria mais favorável que as concentrações de 40 e

60g.L-1. Semelhantemente, menores concentrações de extrato de levedura foram requeridas

para a conversão em ácido.

As Tabelas 14 e 15 descrevem os coeficientes do modelo de regressão, a partir da

matriz codificada, apresentando os principais efeitos e a interação das variáveis estudadas,

para a reposta produção de ácidos. Para a resposta analisada, as variáveis apresentaram

significância de 10%.

Tabela 14. Coeficiente de regressão para a resposta de produção de ácido cítrico, em rendimento percentual. (48h de produção) – YB-323

Fatores Coeficiente de regressão

Erro padrão t(7) p-valor

Estimativas por intervalo (90%)

Limite inferior Limite superior

Média 8,84926 0,451982 19,5788 0,000000 7,78049 9,91803

x1(L) -6,61871 0,334025 -19,8150 0,000000 -7,40855 -5,82886

x1(Q) 2,97902 0,645316 4,6164 0,002437 1,45309 4,50495

x2(L) -0,45564 0,334025 -1,3641 0,214779 -1,24548 0,33421

x2(Q) -0,01858 0,645316 -0,0288 0,977837 -1,54451 1,50735

x3(L) 0,40767 0,334025 1,2205 0,261793 -0,38217 1,19752

x3(Q) 1,42027 0,645316 2,2009 0,063647 -0,10566 2,94620

x1x2 0,95923 0,373451 2,5686 0,037085 0,07616 1,84230

x1x3 0,23981 0,373451 0,6421 0,541232 -0,64326 1,12288

x2x3 0,95923 0,373451 2,5686 0,037085 0,07616 1,84230


Tabela 15. Coeficiente de regressão para a resposta de produção de ácido cítrico, em rendimento percentual (48h de produção) – YB-423.

Fatores Coeficiente de regressão

Erro padrão

t(7) p-valor

Estimativas por intervalo (90%)

Limite inferior

Limite superior

Média 12,92263 0,498021 25,9480 0,000000 11,74500 14,10026

x1(L) -8,53717 0,368049 -23,1958 0,000000 -9,40747 -7,66688

x1(Q) 4,36383 0,711048 6,1372 0,000473 2,68247 6,04519

x2(L) -0,71942 0,368049 -1,9547 0,091532 -1,58972 0,15087

x2(Q) 0,76671 0,711048 1,0783 0,316656 -0,91465 2,44807

x3(L) 0,09592 0,368049 0,2606 0,801880 -0,77437 0,96622

x3(Q) 0,04729 0,711048 0,0665 0,948838 -1,63408 1,72865

x1x2 1,07914 0,411491 2,6225 0,034284 0,10612 2,05216

x1x3 -0,59952 0,411491 -1,4569 0,188478 -1,57254 0,37350

x2x3 0,59952 0,411491 1,4569 0,188478 -0,37350 1,57254



A análise de variância (ANOVA - Tabelas 16 e 17) indicou uma porcentagem de

variação explicada de 98,19, para a produção de ácidos por YB 323, e de 98,89 para YB 423.

O F calculado (tabelas 16 e 17) para a regressão de ambas as cepas foi consideravelmente

superior ao tabelado. Para YB-323, foi 14,06 vezes maior, enquanto que, para YB-423, foi

18,84 vezes maior. Ante o demonstrado, vê-se que o modelo ajusta-se satisfatoriamente aos

dados experimentais.

Tabela 16. ANOVA para resposta produção de ácidos – YB-323.

Fonte de variação

Soma dos quadrados

Graus de liberdade

Quadrado médio

Fcalc p-valor

Regressão 519,4162 9 486,1755 66,5074 <0,0001 Resíduos 7,8101 7 1,1157

Total 527,2263 16

% variação explicada (R²) = 98,19 F7;16;0,05 = 3,68

Tabela 17. ANOVA para produção de ácidos – YB-423.

Fonte de variação

Soma dos quadrados

Graus de liberdade

Quadrado médio

Fcalc p-valor

Regressão 845,2082 9 801,7700 89,1363 <0,0001 Resíduos 9,4822 7 1,3546

Total 854,6904 16

% variação explicada (R²) = 98,89 F7;16;0,05 = 3,68

Deste modo, as equações codificadas que expressam a produção de ácido cítrico em

g.L-1, em função das variáveis estudadas, são:

YB 323

8. 9. :, :< 5 =, =>?@ A >, B:?@> 5 C, D=?> 5 C, C>?>

> A C, D@?E A @, D>?E> A C, B=?@?> A C, >D?@?E

A C, B=?>?E

Equação 5

YB 423

8. 9. @>, B> 5 :, <D?@ A D, E=?@> 5 C, F>?> A C, FF?>

> A C, CB?E A C, C<?E> A @, C:?@?> 5 C, <B?@?E

A C, <B?>?E

Equação 6

Onde

x1 – Glicerol; x2 – Extrato de levedura; x3 – Sulfato de amônio


As Figuras 13 a 15 apresentam os gráficos de superfície de resposta e curvas de

contorno para a produção em porcentagem de ácido cítrico, relacionada a concentração de

glicerol e extrato de levedura, no que se refere a YB-323 e YB-423.

Os valores de ácido cítrico estão expressos em rendimento percentual, tendo sido

calculada a quantidade de ácido cítrico em relação à quantidade inicial de glicerol utilizado

(20, 40 ou 60 g.L-1).

Para a cepa YB 323, as variáveis estudadas glicerol e sulfato de amônio foram

estatisticamente significativas, bem como as interações entre glicerol e extrato de levedura; e

sulfato de amônio e extrato de levedura.

Através da análise dos gráficos da superfície de resposta. (Figuras 13 e 14), verifica-se

que aumentos nessas variáveis acarretam menor rendimento percentual de ácido cítrico.

Figura 13. Superfície de resposta para as variáveis extrato de levedura e glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB-323.

Para valores de glicerol em torno de 20g.L-1 obtém-se maior rendimento quando a

concentração de extrato de levedura se encontra em nível mínimo. Para a fonte de nitrogênio

inorgânica, sulfato de amônio, para a mesma concentração de glicerol, tanto no nível mínimo

(-1) de sulfato de amônio como no máximo (+1) pode-se obter elevada produção percentual


de ácido cítrico. Porém, revela-se mais economicamente viável a opção de uma menor

concentração, posto que em ambas a produção do ácido é favorecida.

Figura 14. Superfície de resposta para as variáveis sulfato de amônio e glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB-323.

Figura 15. Superfície de resposta para as variáveis extrato de levedura e glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB - 423.


Para a cepa YB 423, apenas as variáveis glicerol e extrato de levedura se

mostraram estatisticamente significativas. Semelhantemente ao que se verifica em relação à

cepa YB 323, os mais acentuados rendimentos encontram-se onde as concentrações de

glicerol e extrato de leveduras são mínimas, segundo demonstram os gráficos da superfície de

resposta e curvas de contorno (Figura15)

A partir do planejamento experimental realizado, foram feitas análises dos perfis

de crescimento em biomassa, variação do pH e produção de ácidos.

4.3.1. Crescimento em Biomassa (g.L-1)

De acordo com Armiliato (2004), a concentração de biomassa no fermentador

deve ser alta e constante, encontrando-se a reprodução e o crescimento na fase estacionaria,

visto que as leveduras produzem ácido cítrico somente em condições limitadas de nitrogênio.

Observou-se alta produção de biomassa nos ensaios 6 e 10 para Y. lipolytica YB-

323 (Figuras 16 e 17). Para os ensaios 1 a 4, que continham em sua composição 20g.L-1 de

glicerol, observa-se menor multiplicação celular e pico de crescimento em 48h,

permanecendo em fase estacionária até o termino da fermentação. Estes mesmos ensaios

apresentaram os maiores rendimentos na produção de ácido cítrico (23,02 %, 20,14%, 17,27

%, 20,14%, respectivamente)

Figura 16. Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-323 para os ensaios 1 a 9, com pH inicial ajustado para 6,0.

0 20 40 60 80 100 120

0.1

1

10

Log

X

Tempo (h)

Ensaio1 Ensaio2 Ensaio3 Ensaio4 Ensaio5 Ensaio6 Ensaio7 Ensaio8 Ensaio9


Figura 17. Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-323 para os ensaios 10 a 17, com pH inicial ajustado para 6,0

As Figuras 18 e 19 apresentam a variação da produção de biomassa obtida nas

120h de fermentação para Y. lipolytica YB-423. Um estudo dos ensaios apresentados

evidencia que em 96h ocorreu o máximo crescimento em biomassa na maior parte dos ensaios

realizados, conforme demonstra o respectivo gráfico. No mesmo período, o ensaio 8

apresentou biomassa mais elevada que os demais ensaios, permanecendo em fase de

crescimento até o término da fermentação.

Em termos gerais, as biomassas apresentadas pelos ensaios variaram de 4 a

23g.L-1 em 120h de fermentação. No período de 48h, a maior biomassa atingida foi de

aproximadamente 12g.L-1 para ambas as cepas.

Armiliato (2004), analisando a produção de ácido cítrico por Candida lipolytica

NRRL 1095, observou que a mesma atingiu, em 48h de fermentação, biomassa em torno de

18 g.L-1. Y. lipolytica YB-423 também foi investigado pelo autor, tendo atingido biomassa em

torno 8g.L-1. Entretanto, a fonte de carbono fornecida foi glicose, e não

glicerol.

0 20 40 60 80 100 120

0,1

1

10

Log

X

Tempo (h)

Ensaio10 Ensaio11 Ensaio12 Ensaio13 Ensaio14 Ensaio15 Ensaio16 Ensaio17




0 20 40 60 80 100 120

0,1

1

10

Log

X

Tempo (h)

Ensaio1 Ensaio2 Ensaio3 Ensaio4 Ensaio5 Ensaio6 Ensaio7 Ensaio8 Ensaio9

0 20 40 60 80 100 120

0,1

1

10

Log

X

Tempo (h)

Ensaio10 Ensaio11 Ensaio12 Ensaio13 Ensaio14 Ensaio15 Ensaio16 Ensaio17


4.3.2. Variação de pH

O pH possui extrema importância para a produção de ácido cítrico. Tratando-se de

leveduras, o ponto ótimo encontra-se entre 5,0 e 6,0 (Costa 2008). As Figuras 20 e 21 expõem

a variação do pH ao longo das fermentações.

Não se observou ampla variação de pH nos meios inoculados com Y.lipolytica

YB-323 (Figura 20). O nível mínimo de pH atingido esteve em 5,66 para o meio 10, contendo

este inicialmente 60g.L-1 de glicerol residual, 0,3 g.L-1 de sulfato de amônio e 0,3 g.L-1 de

extrato de levedura. Para esta levedura, o pH se encontrou no intervalo desejado, sem que

ocorresse qualquer controle do mesmo.

Figura 20. Variação de pH para Y. lipolytica YB-323 para os ensaios de 1 a 17

Quanto à cepa YB-423 (Figura 21), observa-se uma maior variação do pH, onde o

valor mínimo atingiu o nível de 3,23 para o meio 1, cuja concentração inicial de glicerol

residual era de 20 g.L-1, sulfato de amônio 0,1 g.L-1 e extrato de levedura 0,1 g.L-1. A

0 20 40 60 80 100 1202,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

pH

Tempo (h)

Ensaio1 Ensaio2 Ensaio3 Ensaio4 Ensaio5 Ensaio6 Ensaio7 Ensaio8 Ensaio9 Ensaio10 Ensaio11 Ensaio12 Ensaio13 Ensaio14 Ensaio15 Ensaio16 Ensaio17


variação de pH para a cepa YB 423 se dá em consequência da maior produção de ácido, o

que faz com que o pH decaia.

Figura 21. Variação de pH para Y. lipolytica YB-423 para os ensaios de 1 a 17

4.3.3. Produção de ácido cítrico

Em relação à cepa YB 323, vê-se que o pico de produção ocorreu, quanto à maior

parte dos ensaios, em até 48h de fermentação, de acordo com a Figura 22. Os ensaios 1,2,3,4 e

9 apresentaram rendimento superior aos demais. Os mesmos continham, inicialmente, 20 g.L-1

de glicerol como fonte de carbono. As fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico variaram

entre 0,1 g.L-1 e 0,5 g.L-1, conforme a matriz do Planejamento Experimental (Tabelas 6 e 7).

Convém destacar ainda o ponto 1, onde o rendimento percentual do ácido atingiu seu maior

nível: 23,02%. Neste ponto, o meio, além da concentração inicial de glicerol mencionado,

continha também 0,1g.L-1 de extrato de levedura e 0,1g.L-1 de sulfato de amônio. Tais valores

correspondem ao nível mínimo (-1) do planejamento experimental, de forma que esses

0 20 40 60 80 100 1202,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

pH

Tempo (h)

Ensaio1 Ensaio2 Ensaio3 Ensaio4 Ensaio5 Ensaio6 Ensaio7 Ensaio8 Ensaio9 Ensaio10 Ensaio11 Ensaio12 Ensaio13 Ensaio14 Ensaio15 Ensaio16 Ensaio17


resultados confirmam que a produção de ácido cítrico, nas concentrações mínimas estudadas

para estes componentes alcança rendimento percentual máximo.

Figura 22. Rendimento percentual de ácido cítrico para Y. lipolytica NRRL 323 nos diferentes meios utilizados.

A Figura 23, revela que o rendimento para Y. lipolítica 423 apresentou pico de

produção de ácidos também em 48h de fermentação, o que se evidencia através dos ensaios

1,2,3,4 e 9. Os mesmos possuem o mesmo nível de concentração de glicerol residual

mencionado, anteriormente, para a YB 323. Destaque-se o ponto 1, que apresentou

rendimento percentual de 28,78%, sendo que este meio também possuía, em sua concentração

inicial de fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico, valores correspondentes ao nível

mínimo (-1) do planejamento experimental.

0 20 40 60 80 100 1200

5

10

15

20

25

30

1

2

3 4 56

Ren

dim

ento

de

ácid

o di

tric

o (%

)

Tempo (%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1 17


Figura 23. Rendimento percentual de ácido cítrico para Y. lipolytica NRRL 423 nos diferentes meios utilizados.

Entretanto, esses mesmos ensaios apresentaram uma queda na concentração de

ácido cítrico após 48h de fermentação. Possivelmente o mesmo foi empregado como substrato

para manutenção celular, visto que esses meios continham apenas 20gL-1de glicerol como

fonte de carbono. COSTA (2000) observou o mesmo a respeito da produção de ácido cítrico

por leveduras a partir de glicose, sendo que, em concentrações de 25gL-1 e 50gL-1, os

rendimentos decresceram entre quatro e seis dias de fermentação.

Nas concentrações de 40g.L-1 (ensaios 11 a 17) e 60gL-1 (ensaios 5,6,7,8,9 e 10 –

Figura 23) de glicerol, o rendimento se mostrou menos expressivo quando comparado aos

ensaios de concentração 20g.L-1. É possível sugerir que o glicerol em elevadas quantidades

tenha se configurado um fator limitante para a produção de ácidos.

Deste modo, constatou-se que, embora haja uma queda de rendimento de ácido

cítrico na concentração de 20g.L-1, não se demonstra recomendável a elevação da

concentração de glicerol, posto que os resultados apontam para a possibilidade de inibição da

produção pelo substrato.

0 20 40 60 80 100 1200

5

10

15

20

25

30

1

23 4

5

6

Ren

dim

ento

de

ácid

o ci

tric

o (%

)

Tempo (horas)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1 17


4.4. Fermentação com Supressão de Fontes de Nitrogênio

A partir dos resultados obtidos com o planejamento inicial, examinou-se a

necessidade da realização de um teste utilizando-se apenas o glicerol residual do biodiesel

como fonte de carbono e nitrogênio.

Verificou-se o crescimento das leveduras em meio mineral - Tabela 05 - com

20/L, 40/L e 60g/L de glicerol residual do biodiesel, sem adição extra de fontes de nitrogênio

ou suplementos (extrato de levedura, sulfato de amônio ou tiamina).

Assim como nos experimentos anteriores, padronizou-se o pH inicial para 6,0 em

todos os meios.

Em 72 horas de fermentação, para o meio contendo 20g.L-1 de glicerol residual do

biodiesel (Tabela 18 e Figura 24), a produção de ácido cítrico no meio não-suplementado -

cujo rendimento foi de 26,46% para YB 323 e de 31,65% para YB 423, mostrou-se maior,

quando comparado ao meio suplementado, para o qual se obteve 18,76% para YB 323 e

21,58% para YB 423, em rendimento percentual. Através do teste de Tukey a 5% de

significância, demonstrou-se expressiva diferença entre os dois rendimentos.

A biomassa final, cuja concentração inicial era inicial foi de 0,55g.L-1, também foi

afetada. Ao término da fermentação, as cepas multiplicaram-se menos, fato que pode

favorecer os resultados, visto que a produção de ácido cítrico se dá em maior escala na fase

estacionária de crescimento microbiano. (LEVINSON et al. 2007)

Tabela 18 – Resultados da fermentação de meio contendo 20g.L-1 de glicerol – YB323 e YB 423

Cepas Tempo Sem suplementos Com suplementos

Biomassa (g.L-1)

Ácido Cítrico (%)

Biomassa (g.L-1)

Ácido Cítrico (%)

YB 323

24h 3,24±0,18 17,30a±0,19 6,65±0,29 17,26a

±0,15 48h 4,92±0,19 23,02a

±0,11 9,45±0,28 18,05b±0,14

72h 5,21±0,19 26,46a±0,12 9,02±0,23 18,76b

±0,15

YB 423

24h 3,88±0,17 25,89a±0,13 5,86±0,21 27,33b

±0,19 48h 4,15±0,18 28,78a

±0,12 5,78±0,18 28,77a±0,16

72h 4,01±0,18 31,65a±0,14 6,03±0,22 21,58b

±0,11 As médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.


Figura 24. Comparação do rendimento final de ácido cítrico para as leveduras Y lipolytica 323 e Y lipolytica 423 em meio contendo 20g.L-1 de glicerol, suplementado e não suplementado com fontes de nitrogênio (extrato de levedura, sulfato de amônio).

Diante desses resultados, pode-se sugerir que é possível suprimir estes componentes

(extrato de levedura e sulfato de amônio) do meio fermentativo, o que favorece a

potencialização da produção de ácido cítrico, não afetando negativamente, portanto, o referido

processo.

4.5. Utilização de Erlenmeyer de 500ml

Relevantes pesquisas apontam que o efeito do oxigênio dissolvido na produção de

ácido cítrico por leveduras é fator primordial para o aumento do rendimento de ácido cítrico.

A partir de concentrações de oxigênio dissolvido superiores a 50%, demonstrou-se que, a

despeito de o oxigênio dissolvido não exercer considerável influência na produção do ácido

durante a fase inicial de produção, este tem sua produtividade volumétrica (gramas de ácido

cítrico/L.h) acrescida, a partir de 20h de fermentação (COSTA 2008).

Analisando a Tabela 19 em 20g.L-1 de glicerol, o rendimento percentual de ácido

cítrico apresenta aumento de 3,44 pontos percentuais para YB 323 e de 5,76 para YB 423, em

YB 232 YB 4230

5

10

15

20

25

30

Áci

do C

itri

co (

%)

Cepas estudadas

Não suplementado Suplementado


72h de fermentação. Embora os resultados finais não se revelem expressivos, constata-se uma

produção mais acelerada, posto que, já a partir de 24h, as cepas adentraram a fase

estacionária, produzindo, assim, mais ácidos nas primeiras horas de fermentação.

Tabela 19 – Resultados da fermentação de meio contendo 20g.L-1 de glicerol em Erlenmeyer de 500mL – YB323 e YB423

Cepas Tempo Erlenmeyer de 500mL Erlenmeyer de 250mL

Biomassa (g.L-1)

Ácido Cítrico (%)

Biomassa (g.L-1)

Ácidos Cítrico (%)

YB 323

24h 5,18±0,28 18,02a±0,12 3,24±0,27 17,59a

±0,14 48h 5,16±0,14 24,46a

±0,19 4,92±0,16 23,52a±0,18

72h 7,81±0,14 29,90a±0,16 5,21±0,17 26,16b

±0,16

YB 423

24h 4,50±0,17 28,78a±0,11 3,88±0,17 25,89b

±0,12 48h 6,71±0,31 33,66a

±0,12 4,15±0,34 28,78b±0,11

72h 6,98±0,25 37,41a±0,15 4,01±0,28 31,65b

±0,15 As médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Tal fato favorece o processo de fermentação pois no âmbito industrial, o fator

tempo é fundamental para a valorização de um produto. Os mencionados resultados

confirmam que a elevação da concentração de oxigênio é capaz de elevar a produção e o

rendimento de ácido cítrico.

4.6. Fermentação em Bioreator

Para fermentação em bioreator, realizaram-se ensaios apenas com a cepa YB 423,

em razão de a mesma apresentar melhor rendimento percentual nos estudos em frascos

agitados. Os ensaios foram conduzidos de acordo com o item 3.8 do capítulo 3 –

Metodologia, neste trabalho. No que se refere ao tempo de fermentação, através dos ensaios

realizados e acima citados, nos quais o inóculo inicial adicionado ao meio esteve em de 10%

(v/v), viu-se que a maior produção do ácido ocorre entre 48h e 72h de fermentação. Após esse

período, não se verificou aumento do rendimento. Em alguns testes, ocorreu decréscimo no

rendimento. Assim sendo, o tempo de fermentação em bioreator foi de 72h.

Durante a primeira fermentação realizada, ocorreu a formação de espuma, o que

acarretou na diminuição na produção do ácido. A formação de espuma se iniciou durante as


primeiras 16 horas de fermentação, tendo se elevado em 24h, o que impossibilitou o término

da fermentação. A Figura 25 mostra a dorna do fermentador e a espuma formada durante a

fermentação.

Figura 25. Dorna do fermentador co formação de espuma.

A levedura Yarrowia lipolytica se demonstra uma potencial produtora de

biosurfactante de alto poder espumante e emulsificante. Essa produção se dá a partir de

glicerol bruto (proveniente da produção de biodiesel). Para a produção de ácidos orgânicos, a

espuma se mostra um fator limitante, uma vez que a células da levedura podem aderir às

paredes da dorna do fermentador, reduzindo, assim, o rendimento dos ácidos (FONTES,

2008).

Desta forma, a espuma foi controlada com a adição de 1µL de Dimeticona®.

(75mg/mL). Objetivou-se testar as condições de agitação e aeração ideal e quantidade de

oxigênio dissolvido no meio.

4.6.1. Ensaio em fermentador de bancada, teste de aeração.

Ante aos resultados obtidos com os testes em shaker, optou-se por avaliar

inicialmente o meio mineral (Tabela 05), com a utilização da concentração de 20gL-1 de

glicerol residual do biodiesel, sem a adição das fontes de nitrogênio. Apenas a levedura

Yarrowia lipolytica NRRL YB 423 foi investigada em fermentador, por apresentar melhor

desempenho nos ensaios anteriores.


Manteve-se o oxigênio a uma concentração de 50%, com agitação de 200rpm.

Alíquotas de 5mL foram retiradas, a cada 24h de fermentação, para leitura da biomassa, pH e

ácido cítrico. Os resultados obtidos estão delineados na Tabela 20.

Tabela 20 – Resultados da fermentação de meio mineral contendo 20g.L-1 de glicerol, em fermentador de bancada de 1L, com de 50% de Oxigênio dissolvido no meio.

Tempo (h)

pH BIOMASSA (g.L-1)

Ácido cítrico (g.L-1)

Ácido cítrico (%)

0h 6,00 ±0,22 0,38 ±0,03 0,00±0,22 0,00 24h 5,88 ±0,09 2,88 ±0,03 1,72±0,17 8,60 48h 5,79 ±0,14 2,29 ±0,02 2,14±0,21 10,70 72h 5,55 ±0,11 2,40 ±0,04 3,01±0,18 15,05

Não se perceberam elevadas alterações do pH de ambos os experimentos,

mantendo-se o mesmo no intervalo ótimo de produção do ácido (entre 5,0 e 6,0).

Quanto à biomassa, os resultados não apresentaram significantes diferenças entre

os dois estudos realizados. O pico de crescimento celular se deu em 24h de fermentação e

manteve-se constante nas demais horas. A partir desse pico, iniciou-se a produção de ácido

cítrico, sabendo-se que a levedura estava a adentrar a fase estacionária de crescimento.

Kamzolova, S. V.(2006) verificou que a transição para a fase estacionária,

ocasionada pela exaustão do nitrogênio, coincidiu com o início da síntese de ácidos. Até o

final do cultivo (96 h), as concentrações de CA atingiram o ponto máximo de rendimentos.

Após o teste com 50% de oxigênio dissolvido no meio, conduziu-se um ensaio

conforme as mesmas condições descritas, no entanto, as concentrações de oxigênio dissolvido

no meio alcançaram um nível de até 70%, e os resultados para produção de biomassa e ácido

cítrico, nessas condições, além de perfis de pH estão descritos na Tabela 21.

Tabela 21 – Resultados da fermentação de meio mineral contendo 20g.L-1 de glicerol, em fermentador de bancada de 1L com de 70% de Oxigênio dissolvido no meio.

Tempo (h)

pH BIOMASSA (g.L-1)

Ácido cítrico (g.L-1)

Ácido cítrico (%)

0h 6,00 ±0,02 0,41 ±0,04 0,00±0,14 0,00 24h 6,07 ±0,04 3,12 ±0,03 1,03±0,16 5,17 48h 5,78 ±0,04 3,28 ±0,02 2,92±0,21 14,6 72h 5,34 ±0,02 3,29 ±0,07 4,96±0,12 24,8


Semelhantemente ao ocorrido no teste com 50% de oxigênio dissolvido no meio,

os valores de pH e biomassa não sofreram significantes alterações. O pH manteve-se em faixa

ótima de produção e a biomassa em pico de produção em 24h de fermentação.

Entretanto, para a produção de ácido cítrico verificou-se aumento de quase 10%,

reforçando estudos realizados por outros autores que também encontraram que em

concentrações mais elevadas de oxigênio puro dissolvido no meio ocorre um aumento

considerável da produção de ácido cítrico por leveduras (ARMILIATO, 2004; COSTA,

2000).

A Figura 26 evidencia a importância do oxigênio no acumulo de ácido cítrico por

leveduras, pois um incremento de 20% na quantidade do gás dissolvido no meio fermentativo

foi suficiente para aumentar a produção de ácido de 15,05% para 24,8% em meio não

suplementado com fontes de nitrogênio.

Figura 26. Produção de ácido cítrico sob diferentes concentrações de oxigênio dissolvido.

YB 423 --0

5

10

15

20

25

30

Áci

do C

itri

co (

%)

Cepas estudadas

50% de O2

70% de O2

58 Capítulo 5 – Conclusões Sá, T.N.M

5. CONCLUSÕES

Percebe-se, a partir dos estudos e experimentos realizados no presente estudo que:

� Em todos os ensaios realizados verificou-se que a produção de ácido cítrico é mais

acentuada quando cessa o crescimento celular.

� A adição de tiamina aos meios testados, não influenciou positivamente a produção de

ácido cítrico. Dessa maneira, a tiamina pode, sem prejuízo dos resultados obtidos, ser

suprimida da formulação do meio, por razões tecnológicas e econômicas;

� Através do Planejamento experimental foi possível concluir que:

• A concentração de 20g.L-1 de glicerol se mostrou mais efetiva para a produção de

ácidos

• As concentração de 40g.L-1 e 60 g.L-1, se mostraram limitantes ao processo

• Níveis mínimos (0,1g.L-1) de fonte de nitrogênio orgânica e inorgânica favorecem

a produtividade do processo fermentativo.

� A levedura YB-423 teve potencial para produção de ácidos superior a YB-323, sendo

mais adequada para estudos posteriores;

� A formação de espuma é um fator negativo para produção de ácido em fermentador com o

suplemento de oxigênio;

� Para obtenção do produto desejado, ácido cítrico, é necessário longo período de

fermentação, pois a levedura somente inicia a produção do ácido após atingir a fase

estacionária de crescimento. Entretanto, nesta pesquisa, o tempo de fermentação foi

reduzido de 10 para 3 dias, tendo sido a concentração inicial do inóculo elevada de 1%

(v/v) para 10%(v/v);

� O meio otimizado para produção de ácido cítrico em escala de bancada possui a seguinte

composição (em g.L-1 de água destilada): KH2PO4 – 1,7; , Na2HPO4 – 12; MgSO4.7H2O

1,25; Glicerol – 20.

� As concentrações mais elevadas de oxigênio dissolvido no meio fermentativo, favorecem

a produção de ácido cítrico. Para níveis de oxigênio de 50% observou-se um menor

rendimento, enquanto que para 70% a produção de ácido cítrico é favorecida.

59 Capítulo 6 – Sugestões para Trabalhos Futuro Sá, T.N.M

6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Pesquisas vindouras podem ser desenvolvidas com o intuito de se examinar a

possibilidade da elevação do percentual de rendimento de ácido cítrico, a partir de uma fonte

de carbono, provinda de um resíduo industrial, embora os resultados apresentados e discutidos

no presente estudo - em relação ao que se obteve a partir da utilização de glicerol puro como

fonte de carbono - ainda não se revelem consideravelmente satisfatórios:

� Conduzir novos estudos em fermentador de bancada utilizando batelada alimentada.

� Utilização de outras cepas potencialmente produtoras de ácido cítrico

� Estudar um melhoramento genético do micro-organismo já estudado visando um

incremento na produção de ácido cítrico.

60 Capítulo 7 – Referências Bibliográficas Sá, T.N.M

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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68

ANEXOS

69

Curvas de calibração da biomassa para Yarrowia lipolytica NRRL 323 e Yarrowia

lipolytica NRRL 423.

y = 1,6772x + 0,0766

R² = 0,9906

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

AB

S (

60

0n

m)

Concentração (g/L)

Curva de Calibração YB-423

y = 1,3813x + 0,1333

R² = 0,9714

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

AB

S (

60

0n

m)

Concnetração (g/L)

Curva de Calibração YB-323

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE … · ter-me concedido saúde e disposição para...

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