UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS ... · LISTA DE SIGLAS ... 9.2. Atividade...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA

Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

KIRLEY MARQUES CANUTO

Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química Orgânica, como requisito parcial, para a obtenção do Título de Doutor.

Fortaleza-Ceará


i2007

Este trabalho científico foi realizado sob a orientação do Prof. Edilberto Rocha Silveira, no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, da Universidade Federal do Ceará.


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“Onde estiver vosso tesouro, Aí estará também vosso coração.” Mt 6, 21

À Deus, em quem deposito a confiança de conduzir-me sempre por caminhos de felicidade. À minha mãe Dagmar (in memorian), ainda “viva” em minha memória. Aos meus pais, pelos referenciais cristãos e por terem priorizado minha educação. Aos irmãos, amigos e familiares, por compartilharem solidariamente a alegria das vitórias e o dissabor dos insucessos. À Carol, minha maior conquista e credora do meu amor, carinho e respeito.


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AGRADECIMENTOS

Neste momento sublime da carreira acadêmica, gostaria de expressar o meu apreço por todos aqueles que contribuíram, mesmo que modestamente, para a obtenção deste título de Doutor, pois se hoje posso orgulhar-me deste feito, é porque encontrei pessoas dotadas de sensibilidade para compreender o desafio, disposição para colaborar e confiança no meu potencial para concretizar este projeto. No entanto, certas pessoas se notabilizaram por suas relevantes e despretensiosas cooperações, por isso terão seus nomes merecidamente mencionados, como forma de perpetuar suas valiosas participações. Meu grato reconhecimento:

Ao Prof. Edilberto Rocha Silveira, pesquisador obstinado e perfeccionista, pelo seu esmero e dedicação na transmissão de conhecimentos científicos agregados a valores éticos (elementos fundamentais para uma boa qualificação profissional) e pelas oportunidades concedidas para meu aperfeiçoamento acadêmico, as quais têm me permitido acessar novos campos de estudo. “Espero corresponder às suas expectativas.”

À Profª. Otília Deusdênia P. Cavalcante, pela sua disposição em cooperar e propor novos desafios, possibilitando o aprimoramento técnico e o enriquecimento curricular. “Obrigado pelos toques de classe nas sugestões e intervenções.”

Aos professores Profª. Mary Anne Souza Lima, Profª Telma Leda G. Lemos e Prof. Francisco José Queiroz Monte, sempre solícitos quando precisei de auxílio material ou teórico para a viabilização de algum experimento. “Tentarei retribuir-lhes quando solicitado.”

Aos professores Profª. Maria Conceição Oliveira Ferreira, Profª. Gilvandete Maria Pinheiro Santiago, Prof. Marcos Carlos de Matos e Prof. Manoel Andrade Neto por terem introduzido, didaticamente, fundamentos teóricos essenciais para um bom rendimento acadêmico. “Comprometo-me a difundir e compartilhar os conhecimentos adquiridos onde estiver.”

Ao amigo Dr. Daniel Esdras de A. Uchoa, por ter me treinado e repassado parte de seu know-how em duas importantes técnicas analíticas (HPLC e RMN), além das orientações extras, permitindo-me realizar minha pesquisa com um relativo grau de independência. “Espero ser útil quando precisar de mim.”

Aos amigos Prof. Dr. Fco. Geraldo Barbosa, Prof. Dr. José Galberto M. da Costa, Dr. Adriano Nunes Cunha, Profª. Dra. Regina Cláudia M. Dourado, Profª. Dra. Nirla Romero, Profª. Dra. Nilce Gramosa, Prof. José Hélder Filgueiras Jr., por terem me ensinado muito sobre suas experiências em Química de Produtos Naturais, durante o período de Graduação e Pós-Graduação, cujo aprendizado acelerou o amadurecimento da minha formação científica. “Sou grato pelas informações que produziram atalhos, e pelo apoio emocional que fortaleceu-me durante a caminhada.”

Ao Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra, pelo cultivo e beneficiamento primário das plantas jovens de A. cearensis, atividades árduas que lhe exigiam grande dedicação de tempo e esforço físico, mas que não lhe deixavam abater, semeando alegria e energia para o trabalho. “Meu franco reconhecimento pela profícua parceria, a qual certamente atenua sua dor crônica de colher fracassos futebolísticos.”

À Prof. Luzia Kalyne de A. Moreira Leal, pela realização de um incontável número de testes farmacológicos (extratos e substâncias puras de A. cearensis), cujos resultados da pesquisa me renderam uma parcela significativa da minha produção científica. “Que sua obstinação científica gere novos projetos em conjunto.”

Aos professores Prof. Carlos Roque D. Correia (UNICAMP) e Prof Norberto Peporini (USP- Ribeirão Preto), pela realização de espectros de massas, imprescindíveis para a elucidação estrutural das substâncias isoladas inéditas na literatura.


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Ao colega de Pós-Graduação João Carlos, pela presteza na realização dos espectros de massa (baixa resolução).

Às agências de fomento à pesquisa (CAPES, CNPq, FUNCAP, FINEP), ao Banco do Nordeste e à Selachii por terem viabilizado financeiramente o estudo, através de recursos para custeio de materiais de consumo, viagens para congressos e aquisição de equipamentos e produtos para melhoria da infra-estrutura laboratorial. Ao CNPq, pela bolsa concedida desde o período de Iniciação Científica, sem a qual não teria condições de dedicar-me e persistir na carreira científica.

Aos companheiros de laboratório e Pós-graduação, dos quais guardo lembranças memoráveis pelas boas relações de amizade, cujo convívio salutar tornava as jornadas de trabalho mais agradáveis e menos cansativas: Francigláuber, Maria Conceição (“Lobinha”), Hélcio, Rosa Virgínia, Mônica, Flávio, Lincoln Davi, Gizelle, Grazielle, Sammy, Fátima, Renata Paiva, Renata Mendonça, Arthur, Jackson, Jefferson, Alexandre Praxedes, Alexandre Oliveira, Érica, Rogério, Fábio (“El Larvagol”), Leopoldina, Juliana (“Juju”). E sobretudo aos amigos de “boa cepa” Jacqueline, Cláudio e Henrique, com os quais compartilhava sucessos e infortúnios.

Aos funcionários da UFC (Raimunda -“Mundinha”, Aurilana-“Lana”, Sr. Paulo, Célia e Orlando) e terceirizados (Rogério, Sr. Raimundo, Paula e Cícero), pessoas cordiais e bem-humoradas, pela qualidade nos préstimos de seus serviços.

A todos, meu eterno obrigado e pedido de desculpas pelas gozações, nem sempre bem compreendidas. “Faz parte.”


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SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS...................................................................................................................X LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................XI LISTA DE TABELAS...........................................................................................................XVI LISTA DE FLUXOGRAMAS.............................................................................................XVII LISTAS DE QUADROS ....................................................................................................XVIII LISTA DE GRÁFICOS......................................................................................................XVIII RESUMOS.............................................................................................................................XIX ABSTRACT............................................................................................................................XX CAPÍTULO I INTRODUÇÃO ...............................................................................................1 CAPÍTULO II CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS...............................................................6 2.1 Família Leguminosae Papilionoideae (Fabaceae).....................................................6 2.2 Considerações botânicas sobre a espécie Amburana cearensis A.C. SMITH .........7 Referências....................................................................................................................12 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA CAPÍTULO III- BIFLAVONÓIDES....................................................................................13 3.1 Características Fundamentais e Relevância............................................................13 3.2 Ressonância magnética nuclear de 13C...................................................................16

3.2.1 Subclasses de biflavonóides.................................................................................16 3.2.2 Aspectos Estereoquímicos....................................................................................50 3.2.3 Metilação e Acetilação.........................................................................................54 3.2.4 Glicosilação..........................................................................................................54 3.2.5 Conectividade.......................................................................................................54 3.2.6 Sulfatação.............................................................................................................55 3.2.7 Biflavonóides atípicos..........................................................................................55

3.3 Atividade biológica.................................................................................................57 Referências....................................................................................................................60

CAPÍTULO IV- VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA..............................69

4.1. Seletividade............................................................................................................69 4.2. Linearidade............................................................................................................69 4.3. Sensibilidade..........................................................................................................69 4.4. Precisão..................................................................................................................69 4.5. Limite de Detecção (LD).......................................................................................70 4.6. Limite de Quantificação (LQ)................................................................................71 4.7. Exatidão.................................................................................................................71 Referências....................................................................................................................71

RESULTADOS E DISCUSSÃO CAPÍTULO V- DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL ........................................................72

5.1. Amburanina A (ACCE-5)......................................................................................72 5.2. Amburanina B (ACCE-6)......................................................................................84


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5.3. Amburosídio A (ACS-7)........................................................................................95 5.4. Acetato de 6”-amburosila- (ACS-8)....................................................................100 5.5. Protocatecuato de 6”-amburosila (ACS-9)..........................................................108 5.6. Ferulato de 6”-amburosila (ACS-10)...................................................................117 5.7. Vanilato de 6”-amburosila (ACS-11) .................................................................127 5.8. Sinapato de 6”-amburosila (ACS-12) .................................................................134 5.9. Galato de 6”-amburosila (ACS-2) ......................................................................143 5.10. Amburosídio B (ACPa-6) .................................................................................154 5.11. Ácido (E)-o-cumárico glicosilado (ACPa-7) ....................................................162 5.12. Ácido (Z)-o-cumárico glicosilado (ACX-1) .....................................................171 5.13. Formononetina (ACCE-9) .................................................................................180 5.14. Aiapina (ACPa-4) .............................................................................................187 5.15. 6-hidroxi-cumarina (ACS-5) .............................................................................192 5.16. Protocatecuato de- 6-cumarila (ACCE-8) .........................................................199 5.17. Ácido protocatecuico (ACCE-2) .......................................................................209 5.18. Ácido vanílico (ACCE-4) .................................................................................213 5.19. Ácido p-hidroxi-benzóico (ACPa-5) .................................................................218 5.20. Ácido (E)-o-cumárico (ACS-6) ........................................................................221 5.21. Quercetina (ACCE-1) .......................................................................................225 5.22. Isocampferídio (ACCE-7) .................................................................................229 5.23. Cumarina (ACS-1 e ACPa-2) ...........................................................................233 Referências..................................................................................................................237

CAPÍTULO VI- PROPOSTA BIOGENÉTICA DE FORMAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE A. CEARENSIS.........................................................................................239

6.1. Amburosídios.......................................................................................................242 6.2. Cumarinas............................................................................................................242 6.3. Flavonóides..........................................................................................................243 6.4. Isoflavonóides......................................................................................................246 Referências..................................................................................................................246

CAPÍTULO VII- VALIDAÇÀO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO......................247

7.1. Validação.............................................................................................................247 7.2. Doseamento..........................................................................................................251

CAPÍTULO VIII- BREVE ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DO ESTUDO INTERDISCIPLINAR DE A. cearensis .............................................................................264

8.1. Avaliação da atividade farmacológica dos extratos etanólicos de espécimens jovens......................................................................................................................................264

8.2. Avaliação da atividade farmacológica de substâncias isoladas de A. cearensis..267 Referências..................................................................................................................269

CAPÍTULO IX- ATIVIDADE ALELOPÁTICA .............................................................270

9.1. Alelopatia.............................................................................................................270 9.2. Atividade alelopática do extrato aquoso das sementes de A. cearensis...............270 Referências..................................................................................................................271


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CAPÍTULO X PARTE EXPERIMENTAL ......................................................................272 10.1. ESTUDO QUÍMICO DOS CONSTITUINTES DE A. CEARENSIS................272 10.1.1. MATERIAL BOTÂNICO..............................................................................272 10.1.2. METODOLOGIA AGRONÔMICA..............................................................272 10.1.3 Métodos cromatográficos................................................................................273 10.1.3.1. Cromatografia de adsorção.........................................................................273 10.1.3.2. Cromatografia de exclusão..........................................................................273 10.1.3.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE≈ HPLC) .......................274 10.1.3.4. Extração em Fase Sólida (EFS ≈ SPE) .......................................................274 10.1.4. Métodos espectroscópicos..............................................................................274 10.1.4.1. Espectroscopia na região do infravermelho (IV) .......................................274 10.1.4.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Prótio (RMN 1H) e de

Carbono-13 (RMN 13C) ..........................................................................................................274 10.1.4.3. Espectrometria de massa (EM) ...................................................................274 10.1.5. Métodos físicos...............................................................................................276 10.1.5.1. Determinação do ponto de fusão (pf) .........................................................276 10.1.5.2 Determinação da rotação óptica (α)............................................................277 10.1.6. Estudo Fitoquímico da casca do caule de A. cearensis...................................277 10.1.6.1. Obtenção do extrato etanólico da casca do caule (ACCE1) ........................277 10.1.6.2. Partição líquido-líquido do extrato etanólico ACCE1..................................277 10.1.6.3. Fracionamento de ACCEAM1.....................................................................278 10.1.6.4. Cromatografia em sílica de ACCE1AM/CA ...............................................278 10.1.6.5. Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACCE1AM/CA(24-31)- Isolamento

de ACCE-1 (quercetina) .......................................................................................................279 10.1.6.6. Isolamento de ACCE-2 ACCE- 3 e ACCE-4 (ácido protocatecuico,

amburosídio A e ácido vanílico) ..........................................................................................279 10.1.6.7. Isolamento de ACCE-5 (Amburanina A) ..................................................279 10.1.6.8. Isolamento de ACCE-6 (Amburanina B) ..................................................279 10.1.6.9. Obtenção e partição de ACCE2....................................................................281 10.1.6.10. Fracionamento de ACCE2AM...................................................................282 10.1.6.11. Cromatografia em sílica de ACCE2AM/CA..............................................282 10.1.6.12. Isolamento de ACCE-7 e ACCE-8 (protocatecuato de 6-cumarila e

isocampferídio) .....................................................................................................................282 10.1.6.13. Isolamento de ACCE-9 (formononetina).................................................282 10.1.7. Estudo Fitoquímico das Sementes de A. cearensis 10.1.7.1. Obtenção dos extrato etanólico das sementes (ACS)- Isolamento de ACS-1

(cumarina)..............................................................................................................................283 10.1.7.2. Partição do extrato etanólico ACSE............................................................283 10.1.7.3.Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACSEA..........................................284 10.1.7.4. Isolamento de ACS-2 (galato de amburosila)............................................285 10.1.7.5. Cromatografia em sílica de ACSEA(2-11)(11-18)-Isolamento de ACS-3 e

ACS-4......................................................................................................................................286 10.1.7.6. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-5 e ACS-6 (6-hidroxi-cumarina

e ácido (E)-o-cumárico)........................................................................................................286 10.1.7.7. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-(7-12).......................................287 10.1.8.Obtenção dos extratos etanólicos dos xilopódios e das partes aéreas de plantas

cultivadas (ACX e ACPA)......................................................................................................290 10.1.8.1. Partição do extrato etanólico E7-ACX.........................................................290 10.1.8.2. Fracionamento de ACXQ.............................................................................292


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10.1.8.3. Separação por HPLC de ACXQ/B- Isolamento de ACX-1 (ác. (E)-o-cumárico glicosilado) ....... .....................................................................................................293

10.1.8.4. Tratamento cromatográfico de E7-ACXAM- Isolamento de ACX-2 (amburanina B) ....................................................................................................................293

10.1.8.5. Partição do extrato etanólico E7-ACPa.......................................................294 10.1.8.6. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD....................................................295 10.1.8.7. Cromatografia em Sephadex LH-20 de E7-ACPaAD(3-6) (1,8 g)- Isolamento

de ACPa-1 (ácido vanílico)....................................................................................................295 10.1.8.8. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD(4-6)-Isolamento de ACPA-2-4

(cumarina, e aiapina)............................................................................................................296 10.1.8.9. Isolamento de ACPa- 5 e ACPa-6 (ácido p-hidroxi benzóico e amburosídio

B).............................................................................................................................................296 10.1.8.10. Fracionamento de E7-ACPaQ....................................................................296 10.1.8.11. Purificação por HPLC- Isolamento de E7-ACPa-7 (ácido (E)-o-cumárico

glicosilado)..............................................................................................................................297 10.2. Validação do método de quantificação de 4 substâncias presentes nos extratos de

Amburana cearensis................................................................................................................299 10.2.1. Preparo das Soluções......................................................................................299 10.2.2. Condições analíticas........................................................................................300

CAPÍTULO XI- CONCLUSÃO..........................................................................................302


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LISTA DE SIGLAS ABNT- Associação Brasileira de Normas Técnicas

ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CCD- Cromatogragia de Camada Delgada

CNPq- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

COSY- Correlation Spectroscopy

COX- Cicloxigenase

CPD- Composite Pulse Decoupling

CV- Coeficiente de Variação

DAD- Diode-array Detector

DEPT- Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO- Dimetilsulfóxido

EM- Espectrometria de Massas

FUNCAP- Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico

GABA- Ácido γ-aminobutírico

HMBC- Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC- Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence

HPLC- High Performance Liquid Chromatoghraphy

HSQC- Heteronuclear Single Quantum Correlation

IDH- Índice de Deficiência de Hidrogênio

IE- Impacto Eletrônico

IES- Ionização por Electrospray

INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

IUPAC- International Union of Pure and Applied Chemistry

IV- Infravermelho

LD- Limite de Detecção

LQ- Limite de Quantificação

NOESY- Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

PAL- Phenylalanine Ammonia Lyase

PLP- Pyridoxal 5’-phosphate

RMN- Ressonância Magnética Nuclear

SAM- S-adenosil-metionina

SPE- Solid Phase Extraction

TC- Temperatura de coalescência

tR- Tempo de retenção


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Fotos digitais das formas exploradas comercialmente de A. cearensis, com fins medicinais: casca (à dir.) e xarope (à esq.).................................................................................4 Figura 2– Mapa de distribuição de espécimens de A. cearensis na América do Sul.................8 Figura 3- Fotos digitais de diferentes partes de A. cearensis: (A) sementes, (B e C) flores, (D e E) frutos, (F) galhos...............................................................................................................10 Figura 4- Fotos digitais de um espécimem adulto silvestre de A. cearensis: estação chuvosa (esq.) e período de estiagem (dir.).............................................................................................10 Figura 5- Fotos digitais de A. cearensis cultivada: canteiro (esq.) e espécimens colhidos aos 6 meses de desensvolvimento (dir.).............................................................................................11 Figura 6- Fotos de Dipterix odorata (esq.) e Commiphora leptophloeos (dir.).......................11 Figura 7- Estruturas químicas da biflavona amentoflavona, numeradas sob duas formas......15 Figura 8- Espectros de RMN 13C de GB-1 (148) registrados em diferentes temperaturas e solventes, obtidos num espectrômetro Bruker (HAN et al., 2005)...........................................53 Figura 9- Espectro de absorção na região de infravermelho de ACCE-5................................77 Figura 10- Espectro de RMN 1H de ACCE-5 (DMSO-d6, 500 MHz).....................................77 Figura 11- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5.........................78 Figura 12- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)........................78 Figura 13- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)..................79 Figura 14- Espectro RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5.......................79 Figura 14a- Expansão da região δ 5,5-7,5 x 95,0-133.............................................................80 Figura 15- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5........................80 Figura 15a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 6,4-7,6 x 112-131; (II) δ 9,0-13,4 x 153-172; (III) δ 9,0-13,4 x 103-120..............................................................................81 Figura 15b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 5,5-7,5 x 95,0-133; (II) δ 5,8-7,4 x 152-171............................................................................................................................82 Figura 16- Espectro de massa de ACCE-5 (Ionização por Impacto Eletrônico).....................83 Figura 17- Espectro RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5......................83 Figura 18- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-6.............................89 Figura 19- Espectro de RMN 1H de ACCE-6 (DMSO-d6, 500 MHz).....................................89 Figura 20- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-6.........................90 Figura 21- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-6 (DMSO-d6, 125 MHz)........................90 Figura 22- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-6 (DMSO-d6, 125 MHz)..................91 Figura 23- Espectro RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6.......................91 Figura 24- Espectro de massa de ACCE-6 (Ionização por Impacto Eletrônico).....................92 Figura 25- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6........................92 Figura 25a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 5,5-7,6 x 77-108; (II) δ 11,5-13,6 x 89-110; (III) δ 6,4-8,4 x 111-135..................................................................................93 Figura 25b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 11,4-13,4 x 160-169; (II) δ 5,7-8,4 x 126-172......................................................................................................................94 Figura 26- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 300 MHz) de ACS-7...........................................98 Figura 27- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7...................................98 Figura 28- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7...........................99 Figura 29- Espectro de RMN 1H de ACS-8 (CD3OD, 500 MHz).........................................103 Figura 30- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz).............................104 Figura 30a- Expansão da região δ 98-125 do espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-8........104 Figura 31- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz)......................105


xiFigura 32- Espectro de massa de ACS-8 (Ionização por Electron-spray).............................105

Figura 33- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8.............................106 Figura 33a- Expansões do espectro HSQC de ACS-8: (I) δ 3,3-5,4 x 62-81; (II) δ 6,7-7,5 x 114-133...................................................................................................................................106 Figura 34- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8............................107 Figura 34a- Expansões do espectro HMBC de ACS-8: (I) δ 6,7-7,5 x 115-135; (II) δ 6,7-7,5 x 143-162................................................................................................................................107 Figura 35- Espectro de RMN 1H de ACS-9 (CD3OD, 500 MHz).........................................112 Figura 36- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-9........................112 Figura 36a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 6,5-7,7..............................................................112 Figura 37- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-9 (MeOD, 125 MHz)..............................113 Figura 38- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-9 (CD3OD, 125 MHz).......................113 Figura 39- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9.............................114 Figura 39a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 104-134............................................................114 Figura 40- Espectro de massa de ACS-9 (Ionização por Electron-spray).............................114 Figura 41- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9............................115 Figura 41a- Expansões do espectro HMBC de ACS-9: (I) δ 6,6-7,7 x 143-163; (II) δ 4,3-7,5 x 164-173................................................................................................................................116 Figura 42- Espectro de RMN 1H de ACS-10 (CD3OD, 500 MHz).......................................121 Figura 43- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-8.............................122 Figura 43a- Expansão da região δ 6,2-7,7 x 6,2-7,7..............................................................121 Figura 44- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz)...........................122 Figura 44a- Expansão da região δ 108-135 do espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz)................................................................................................................122 Figura 45- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz).....................123 Figura 46- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-10...........................123 Figura 46a- Expansão da região δ 6,3-7,5 x 110-135............................................................123 Figura 47- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-10..........................124 Figura 47a- Expansões do espectro HMBC de ACS-10: (I) δ 6,7-7,5 x 142-162; (II) δ 6,3-7,8 x 120-136; (III) δ 6,9-8,0 x 108-121......................................................................................125 Figura 48- Espectro de massa de ACS-10 (Ionização por Electron-spray)...........................126 Figura 49- Espectro de RMN 1H de ACS-11 (CD3OD, 500 MHz).......................................130 Figura 50- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-11 (CD3OD, 125 MHz)...........................130 Figura 50a- Expansão da região δ 102-135...........................................................................130 Figura 51- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-11 (CD3OD, 125 MHz).....................131 Figura 52- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-11...........................131 Figura 53- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11...........................132 Figura 53a- Expansão da região δ 6,5-7,7 x 6,5-7,7..............................................................132 Figura 54- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11..........................132 Figura 54a- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 4,2-7,8 x 173-165; (II) δ 6,7-7,7 x 142-156................................................................................................................................133 Figura 55- Espectro de RMN 1H de ACS-12 (CD3OD, 500 MHz).......................................138 Figura 55a- Expansões do espectro de RMN 1H de ACS-12: (I) δ 6,3-7,8; (II) δ 63,1-5,3..138 Figura 56- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-12...........................139 Figura 56a- Expansão da região δ 6,3-7,7 x 6,3-7,7..............................................................139 Figura 57- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-12 (CD3OD, 125 MHz)...........................139 Figura 58- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-12 (CD3OD, 125 MHz).....................140 Figura 59- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-12...........................140 Figura 59a- Expansão da região δ 6,3-7,5 x 106-132............................................................140 Figura 60- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-12..........................141 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

xii

Figura 60a- Expansão da região δ 4,3-7,8 x 165-173............................................................141 Figura 60b- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,5 x 137-160; (II) δ 6,4-7,7 x 114-135..........................................................................................................................142 Figura 61- Espectro de RMN 1H de ACS-2 (CD3OD, 500 MHz).........................................149 Figura 61a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACS-2: (I) δ 3,1-5,3..............................149 Figura 62- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-2.............................150 Figura 63- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-2 (CD3OD, 125 MHz).............................150 Figura 64- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz)........................................151 Figura 65- Espectro de massa de ACS-2 (Ionização por Electron-spray).............................151 Figura 66- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-2.............................152 Figura 67- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-2............................152 Figura 67a- Expansão da região δ 6,7-7,5 x 153-172............................................................153 Figura 68- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-6.............................158 Figura 69- Espectro de RMN 1H de ACPa-6 (CD3OD, 500 MHz).......................................158 Figura 70- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz)...........................159 Figura 71- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz).....................159 Figura 72- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6...........................160 Figura 73- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6..........................160 Figura 74- Espectro de RMN 1H de ACPa-7 (CD3OD), 500 MHz)......................................166 Figura 74a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACPa-7 da região de: (I) δ 3,2-4,0........166 Figura 75- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACPa-7...........................167 Figura 76- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-7 (MeOD, 125 MHz)............................167 Figura 77- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-7 (CD3OD, 125 MHz).....................168 Figura 78- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7...........................168 Figura 79- Espectro de massa de ACPa-7 (Impacto eletrônico)............................................169 Figura 80- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-7.............................169 Figura 81- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7..........................170 Figura 81a- Expansão da região δ 6,3-8,4 x 124-144............................................................170 Figura 82- Espectro de RMN 1H de ACX-1 (CD3OD, 500 MHz).........................................175 Figura 83- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACX-1.............................175 Figura 84- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACX-1 (CD3OD, 125 MHz)............................176 Figura 85- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACX-1......................176 Figura 86- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1.............................177 Figura 87- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1...........................177 Figura 87a- Expansão do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,8 x 110-145..................178 Figura 88- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACX-1..............................178 Figura 89- Espectro de massa de ACX-1 (Impacto Eletrônico)............................................179 Figura 90- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz)...........................183 Figura 91- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz).................183 Figura 92- Espectro de RMN 1H de ACCE-9 (C5D5N, 500 MHz)........................................184 Figura 93- Espectro RMN-HSQC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9............................185 Figura 93a- Expansão do espectro HSQC de ACCE-9: δ 7,0-8,5 x 100-133........................185 Figura 94- Espectro RMN-HMBC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9...........................186 Figura 95- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-4.............................189 Figura 96- Espectro de RMN 1H de ACPa-4 (CDCl3, 500 MHz).........................................189 Figura 97- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz).............................190 Figura 98- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz).......................190 Figura 99- Espectro de massa de ACPa-4 (Impacto Eletrônico)...........................................191 Figura 100- Espectro de RMN 1H de ACS-5 (CD3COCD3, 500 MHz).................................195


xiiiFigura 101- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)....................195

Figura 102- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)..............196 Figura 103- Espectro RMN-HSQC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5....................196 Figura 104- Espectro de massa de ACS-5 (Impacto Eletrônico)...........................................197 Figura 105- Espectro RMN-HMBC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5...................197 Figura 106- Espectro de RMN 13C (CPD) de umbeliferona (CD3COCD3, 125 MHz)..........198 Figura 107- Cromatograma de HPLC de 6-hidroxi-cumarina (254 nm)...............................198 Figura 108- Cromatograma de HPLC de umbeliferona (7-hidroxi-cumarina: 254 nm)........198 Figura 109- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-8..........................203 Figura 110- Espectro de RMN 1H de ACCE-8 (DMSO-d6, 500 MHz).................................203 Figura 111- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8.....................204 Figura 112- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)....................204 Figura 113- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)..............205 Figura 114- Espectro de RMN 13C (gated) de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)...................205 Figura 115- Espectro de massa de ACCE-8 (Impacto Eletrônico)........................................206 Figura 116- Espectro RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8.....................206 Figura 116a- Expansão da região δ 6,4-7,5 x 113-124..........................................................206 Figura 117- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8....................207 Figura 117a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-8: (I) δ 6,9-8,1 x 140-157; (II) δ 6,4-8,2 x 113-132..........................................................................................................................208 Figura 118- Espectro RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8..................208 Figura 119- Espectro de RMN 13C (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2...................................211 Figura 120- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2..................211 Figura 121- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-2....................................212 Figura 122- Espectro de absorção na região do IV de ACCE-4 (pastilha de KBr)...............215 Figura 123- Espectro de RMN 1H de ACCE-4 (CD3OD, 500 MHz)....................................215 Figura 124- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)........................216 Figura 125- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)..................216 Figura 126- Espectro de massa de ACCE-4 (Impacto Eletrônico)........................................217 Figura 127- Espectro bidimensional de correlação heteronuclear (HMBC) de ACCE-4......217 Figura 128- Espectro de RMN 1H de ACPa-5 (CD3OD, 500 MHz).....................................219 Figura 129- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz).........................219 Figura 130- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz)...................220 Figura 131- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-6 (CD3OD, 125 MHz)...........................223 Figura 132- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-6 (CD3OD, 125 MHz).....................223 Figura 133- Espectro de absorção na região do IV de ACS-6...............................................224 Figura 134- Espectro de RMN 1H de ACS-6 (CD3OD, 500 MHz).......................................224 Figura 135- Espectro de RMN 1H de ACCE-1 (500 MHz, DMSO-d6).................................227 Figura 136- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-1 (125 MHz, DMSO-d6)....................227 Figura 137- Espectro RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-1.....................228 Figura 138- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-7....................................231 Figura 139- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7..........................231 Figura 140- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7..................232 Figura 141- Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de ACS-1.........................................235 Figura 142- Espectro de RMN 13C-CPD (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1.................................235 Figura 143- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1.........................236 Figura 144- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da casca do caule (ACCE)- sohxlet.....256 Figura 145- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (9 m)....256 Figura 146- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (9 m)..256 Figura 147- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (7 m)....257 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

xiv

Figura 148- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (7 m)..257 Figura 149- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (4 m)....257 Figura 150- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (4 m)..258 Figura 151- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (2 m)....258 Figura 152- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (2 m)..258 Figura 153- Cromatograma de HPLC do ácido p-hidroxi-benzóico......................................260 Figura 154- Cromatograma de HPLC do ácido cumárico.....................................................260 Figura 155- Cromatograma de HPLC do ácido (Z)-cumárico glicosilado.............................260 Figura 156- Cromatograma de HPLC do ácido (E)-cumárico glicosilado............................261 Figura 157- Cromatograma de HPLC da aiapina..................................................................261 Figura 158- Cromatograma de HPLC da cumarina...............................................................261 Figura 159- Cromatograma de HPLC do ácido vanílico.......................................................262 Figura 160- Cromatograma de HPLC do Amburosídio B.....................................................262 Figura 161- Cromatograma de HPLC do Amburosídio A.....................................................262 Figura 162- Cromatograma de HPLC do ácido protocatecuico.............................................263 Figura 163- Detalhe das plântulas normais (esq.), anormais (centro) e sementes não germinadas (dir.) observadas no bioensaio com ext. aquoso das sementes de cumaru..........271 Figura 164- Cromatograma de HPLC da fração ACCE1AM/CA(24-31)(19-33)(5-12)........280 Figura 165- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(13-17)....................287 Figura 166- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)....................288 Figura 167- Cromatograma de HPLC do pico 4 da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)....288 Figura 168- Cromatograma de HPLC da fração ACXQ(3)B................................................293 Figura 169- Cromatograma de HPLC da fração E7-ACPaQ(7)(2-3)....................................297 Figura 170- Cromatograma dos quatro padrões (conc.= 60 µg/mL) utilizados na validação de amostras de A. cearensis: A- ácido protocatecuico, B- ácido vanílico, C- cumarina e D- amburosídio A.........................................................................................................................301


xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Relação dos biflavonóides descritos na literatura, contendo os tipos de conectividade, as fontes botânicas, os solventes empregados para obtenção dos espectros de RMN e as referências correspondentes....................................................................................46 Tabela 2- Relação das atividades biológicas demonstradas por biflavonóides.......................59 Tabela 3- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e floretina, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989)...............................76 Tabela 4- Dados de RMN 13C de ACCE-5 e ACCE-6.............................................................87 Tabela 5- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e campferol, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).............................88 Tabela 6- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio A, registrado na literatura (BRAVO et al., 1999)................................................97 Tabela 7- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-8 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................102 Tabela 8- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................111 Tabela 9- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-10 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................120 Tabela 10- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-11 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................129 Tabela 11- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-12 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................137 Tabela 12- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-2 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................146 Tabela 13- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-8, 10 e 11 e substâncias análogas (192-194) isoladas de Ilex litsaefolia .....................................................................................147 Tabela 14- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio B, registrados na literatura ................................................................................157 Tabela 15- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................165 Tabela 16- Dados de RMN 1H e 13C de ACX-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................174 Tabela 17- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de formononetina, registrados na literatura.................................................................................182 Tabela 18- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aiapina, registrados na literatura ..........................................................................................................188 Tabela 19- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, registrados na literatura ............................................................................194 Tabela 20- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-5 com dois registros de deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, encontrados na literatura................194 Tabela 21- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................202


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Tabela 22- Dados de RMN 13C de ACCE-2 e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido protocatecuico, registrados na literatura ...........................................................210 Tabela 23- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido vanílico, registrados na literatura ...........................................................................................214 Tabela 24- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido p-hidroxi-benzóico, registrados na literatura .............................................................................218 Tabela 25- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido (E)-o-cumárico, registrados na literatura..........................................................................................222 Tabela 26- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de quercetina, registrados na literatura ..........................................................................................................226 Tabela 27- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de isocampferídio, registrados na literatura ................................................................................230

Tabela 28- Dados de RMN 13C de ACS-1 e comparação com deslocamentos químicos de 13C de cumarina, registrados na literatura ....................................................................................234

Tabela 29- Equações e coef. de correlação das retas dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ác. protocatecuico, ác. vanílico, cumarina e amburosídio A.............................248 Tabela 30- Parâmetros de desempenho analítico dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A.........................250 Tabela 31- Concentração dos quatro principais constituintes químicos detectados em diferentes extratos de A. cearensis, expressos em relação à massa de extrato e de material botânico...................................................................................................................................255 Tabela 32- Relação das substâncias químicas identificadas, segundo seus tempos de retenção registrados em análises por HPLC, nos extratos de A. cearensis: planta adulta (casca do caule) e espécimens jovens (xilopódio e parte aérea)........................................................................259 Tabela 33- Acompanhamento mensal das massas (g) e dos rendimentos (%) dos extratos etanólicos da parte aérea e do xilopódio de A. cearensis........................................................291

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1- Concentração dos quatro constituintes majoritários em extratos etanólicos das cascas do caule de A. cearensis, obtidos por maceração e soxhlet.........................................251 Gráfico 2- Concentrações de ácido vanílico e cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis (valores expressos em relação à massa de extrato e à biomassa)................................................................................................................................252 Gráfico 3- Concentração de ácido vanílico em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento...........................................................253 Gráfico 4- Concentração de cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento...........................................................253 Gráfico 5- Concentração de amburosídio A em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento...........................................................254


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LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Esqueletos básicos das diferentes subclasses de flavonóides.................................14 Quadro 2- Estruturas de flavonóides farmacologicamente ativos...........................................58 Quadro 3- Proposta biogenética de formação de ácidos fenólicos simples e aminoácidos aromáticos...............................................................................................................................240 Quadro 4- Proposta biogenética de formação de amburosídios e derivados dos ácido benzóico e cinâmico................................................................................................................241 Quadro 5- Proposta biogenética de formação de ác. cumáricos glicosilados e cumarinas....243 Quadro 6- Proposta biogenética de formação de flavonóis e biflavonóides..........................244 Quadro 7- Proposta mecanística de formação da amburanina A...........................................245 Quadro 8- Proposta biogenética de formação da isoflavona formononetina.........................246

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1- Partição líquido-líquido do extrato etanólico das cascas do caule de A. cearensis..................................................................................................................................278 Fluxograma 2- Metodologia de Isolamento de 6 substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis. ..............................................................................................281 Fluxograma 3- Metodologia de Isolamento de 3 substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis. ..............................................................................................283 Fluxograma 4- Obtenção dos extratos hexânico e etanólico das sementes de A. cearensis. Isolamento de ACS-1. ............................................................................................................284 Fluxograma 5- Partição do extrato etanólico das sementes de A. cearensis.........................285 Fluxograma 6- Metodologia de isolamento das 9 substâncias obtidas do extrato etanólico das sementes de A. cearensis. .......................................................................................................289 Fluxograma 7- Partição do extrato etanólico do xilopódio da planta jovem (7 meses) de A. cearensis. ...............................................................................................................................292 Fluxograma 8- Metodologia de isolamento de duas substâncias isoladas do xilopódio das plantas jovens de A. cearensis (7 meses)................................................................................294 Fluxograma 9- Partição do extrato etanólico da parte aérea da planta jovem (7 meses) de A. cearensis..................................................................................................................................295 Fluxograma 10- Metodologia de isolamento das 7 substâncias isoladas da parte aérea das plantas jovens de A. cearensis (7 meses)................................................................................298


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RESUMO

Amburana cearensis A.C. Smith (sin. Torresea cearensis Fr. All) é uma árvore típica da caatinga nordestina, popularmente conhecida como imburana-de-cheiro ou cumaru, caracterizada por sua casca vermelho-pardacenta e odor peculiar agradável, atribuído à cumarina. Apresenta relevante importância econômica, sobretudo na carpintaria e perfumaria, e inestimável valor medicinal (propriedades terapêuticas contra afecções respiratórias cientificamente comprovadas), todavia esta espécie sofre ameaça de extinção devido ao extrativismo predatório. Em virtude da necessidade de elaboração de um modelo de exploração auto-sustentável de A. cearensis, foi proposto um estudo integrado Química-Agronomia-Farmacologia. Este trabalho relata a abordagem fitoquímica da pesquisa interdisciplinar, visando o isolamento, a purificação e a caracterização estrutural de novos constituintes químicos da planta adulta (silvestre), bem como a identificação e a quantificação de compostos químicos já conhecidos, considerados biomarcadores, em espécimens jovens de diferentes meses de desenvolvimento (cultivados). As investigações químicas da planta silvestre de A. cearensis foram realizadas com os extratos etanólicos da casca do caule, coletadas no município de Quixeramobim-CE, e das sementes, adquiridas no comércio de Fortaleza-CE. Os extratos etanólicos foram submetidos a partições líquido-líquido, cromatografias convencionais (adsorção-gel de sílica e exclusão- gel de dextrana) e modernas (HPLC-fase reversa), resultando no isolamento e identificação de: A. Cumarinas- 6-hidroxi-cumarina e protocatecuato de 6-cumarila; B. Ácidos fenólicos- ácido vanílico e ácido (E)-o-cumárico; C. Flavonóides- quercetina, formononetina, e os biflavonóides amburanina A e B; Amburosídios- amburosídio A, ferulato de 6”-amburosila, protocatecuato de 6”-amburosila, galato de 6”-amburosila, acetato de 6”-amburosila, sinapato de 6”-amburosila e vanilato de 6”-amburosila. Os espécimens cultivados de A. cearensis, divididos em parte aérea e xilopódio, foram extraídos com etanol e submetidos a uma metodologia química semelhante à adotada para a planta silvestre. Da parte aérea foram obtidos cumarina, aiapina, amburanina B, isocampferídio, ácido vanílico e ácido (E)-o-cumárico glicosilado, enquanto que do xilopódio foram isolados ácido p-hidroxi-benzóico, ácido (Z)-o-cumárico glicosilado e amburosídio B. As substâncias químicas isoladas tiveram suas estruturas elucidadas por métodos físicos (ponto de fusão e rotação óptica) e espectrométricos (Espectrometria na região do Infravermelho, Espectrometria de Massa e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, incluindo técnicas uni e bidimensionais), além de comparação com dados da literatura. Os extratos etanólicos da planta silvestre (casca do caule) e de espécimens cultivados (parte aérea e xilopódio) foram quimicamente comparados através de análises por HPLC, empregando-se método cromatográfico validado (linearidade, precisão, exatidão, fator de recuperação aceitáveis) e utilizando-se padrões de ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A, obtidos em estudos anteriores. Amburosídio A foi o constituinte majoritário do extrato da planta silvestre. Nos espécimens jovens, ácido vanílico e cumarina revezaram-se como principais componentes, dependendo da parte e da idade da planta estudada.


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ABSTRACT

Amburana cearensis A.C. Smith is a typical tree of the northeastern Brazil flora designated “caatinga”. It is popularly known either as “imburana-de-cheiro” or “cumaru” and characterized by its red-gray bark of peculiar and pleasant smell due to coumarin. Despite A. cearensis relevant economical (particularly for carpentry and perfumery) and medicinal importance (therapeutic properties against respiratory affections scientifically proved), it is one of the plant species treated of extinction due to predatory extractivism. Taking in account the necessity of elaborating a sustainable plan of exploitation it was suggested an integrated study covering the chemical, agronomical and pharmacological aspects of A. cearensis. This work reports the phytochemical component of the interdisciplinary study pursuing the isolation, purification and structure characterization of new secondary metabolites of the wild adult plant, as well as the identification and quantification of the already known chemicals, considered the plant biomarkers, from young cultivated specimens at different developmental stages. The chemical investigation of adult wild plants was performed with the ethanol extract from barks of A. cearensis collected at Quixeramobim County, Ceará state, and the hexane extract of seeds purchased from herbal stores at Fortaleza. The ethanol extracts were submitted to liquid-liquid partition, conventional (silica gel adsorption and gel exclusion with dextran) and modern (HPLC) chromatography leading to the isolation and characterization of: A. Coumarins 6-hydroxy-coumarin, 6-coumaryl protocatechuate, acid; B. Phenol Acids- vanillic acid, o-coumaric; C. Flavonoids- quercetin, formononetin, amburanin A and B; Amburosídes- amburoside A, 6”-amburosyl-ferulate, 6”-amburosyl-protocatechuate, 6”-amburosyl-galate, 6”-amburosyl-acetate, 6”-amburosyl-sinapate and 6”-amburosyl-vanillate. The cultivated specimens, separated in aerial part and xylopode, were extracted with ethanol and submitted to the same methodology employed for the wild plant. From the aerial part were isolated coumarin, ayapin, amburanin B, isokaempferide, vanillic acid, (E)-o-coumaric acid glucoside, while from the xylopode were isolated p-hydroxy-benzoic acid, (Z)-o-coumaric acid glucoside and amburoside B. All chemical substances had their structures elucidated through physical (mp and optical rotation) and spectroscopical methods (IR, MS and NMR, including uni and bidimensional techniques) and comparison to the literature wherever the case. The ethanol extracts from either wild or cultivated (aerial part and xylopode) plants were compared by HPLC through a validated chromatographic method (acceptable linearity, precision, accuracy and recovering factor) using as standard the protocatechuic acid, vanillic acid, coumarin and amburoside A, obtained from the previous studies. Amburoside A was the major component of wild plant, while coumarin and vanilic acid take turns as the principal metabolites of cultivated young plants depending on the plant part and plant age.


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I. INTRODUÇÃO

Amburana cearensis A.C. Smith (sin. Torresea cearensis Fr. All), pertencente à

família das Leguminoseae Papilionoideae (Fabaceae), é uma árvore frondosa, típica da

caatinga nordestina, especialmente do Ceará, onde é conhecida como imburana-de-cheiro,

cerejeira e cumaru. Embora nativa do sertão nordestino, A. cearensis pode ser encontrada em

praticamente toda América do Sul (do Peru à Argentina), juntamente com a outra

representante do gênero, Amburana acreana, presente principalmente no sudoeste da Floresta

Amazônica. A. cearensis pode atingir até 15 m de altura e 50 cm de diâmetro, caracterizando-

se por possuir flores brancas, vagem achatada e escura, além da casca aromática com odor

peculiar de cumarina. Suas sementes são escuras, aladas e exalam também um forte cheiro de

cumarina (semelhante à baunilha) (CARVALHO, 1994).

Do ponto-de-vista econômico, A. cearensis apresenta valiosa importância comercial

dado às suas várias aplicações, particularmente empregada em carpintaria e perfumaria.

Comercializada com o nome de cerejeira-do-nordeste, sua madeira é utilizada na fabricação

de móveis, portas, e caixotaria devido à sua reconhecida durabilidade. As sementes servem

como aromatizantes e repelentes de insetos para roupas e estantes (MAIA, 2004). Aquino et

al. (2005) propõem a aplicação do pó da madeira em tonéis de aguardente de cana-de-açúcar

com o objetivo de acelerar o processo de maturação da bebida, devido à riqueza de compostos

fenólicos. Na medicina popular, a casca do caule é utilizada na preparação de "lambedôs"

caseiros para o tratamento de doenças respiratórias. Industrialmente, a forma farmacêutica

disponível é o xarope de cumaru o qual é produzido pelo Programa Farmácias Vivas,

Farmácia-Escola/UFC e empresas privadas como a Selachii e Bionatus (MATOS, 2002).

Em virtude do difundido uso de A. cearensis para fins terapêuticos, tornou-se

indispensável a realização de estudos científicos que justificassem a sua indicação para o

tratamento de afecções respiratórias. Assim, desde o início dos anos 90, são realizados testes

farmacológicos visando à determinação das propriedades terapêuticas desta planta. Através de

ensaios pré-clínicos, foram comprovadas as atividades broncodilatadora, analgésica,

antiinflamatória do extrato hidroalcoólico das cascas do caule de A. cearensis, o qual

demonstrou ser isento de toxicidade, em doses terapêuticas, garantindo eficácia e segurança

ao seu uso no tratamento de asma, bronquite, gripes e resfriados (LEAL et al., 1997 e 2003).

Ao passo que se avançavam as pesquisas farmacológicas, paralelamente, surgiu a

necessidade de se conhecer melhor a química desta espécie, até então limitada à cumarina,


1

isocampferídio e alguns poucos compostos químicos (3,4-dimetoxi-cinamato de metila,

afrormosina, 7-hidroxi-8,4’-dimetoxi-isoflavona, 24-metilenocicloartanol, β-sitosterol e 6-

hidroxi-cumarina), sendo a primeira apontada a priori como única responsável pelas

propriedades biológicas descritas (BASTOS, 1983).

Deste modo, a fim de se descobrir os supostos princípios ativos de A. cearensis, foi

proposta a realização de um estudo químico, concomitante aos ensaios farmacológicos,

visando o isolamento, purificação e a caracterização estrutural de substâncias químicas

presentes na casca do caule e sementes, devido ao emprego medicinal destas partes botânicas.

A casca do caule, coletada no município de Quixeramobim-CE, e as sementes, adquiridas no

comércio de Fortaleza-CE foram pulverizadas e submetidas à extração com etanol,

separadamente. Cromatografias convencional, gel de sílica ou dextrana, e moderna (HPLC-

fase reversa), foram adotadas para o isolamento e purificação das substâncias, sendo suas

estruturas químicas elucidadas por métodos físicos (ponto de fusão e rotação óptica) e

espectrométricos (Espectroscopia na região do Infravermelho, Ressonância Magnética

Nuclear de 1H e 13C e Espectrometria de Massa), além de comparação com dados da

literatura.

A investigação química da casca do caule de A. cearensis resultou no isolamento

de 7 substâncias: amburosídio A, protocatecuato de 6-cumarila, ácido vanílico, quercetina,

formononetina, e os biflavonóides amburanina A e B. A prospecção das sementes revelou a

presença de 9 substâncias: 6-hidroxi-cumarina, ácido (E)-o-cumárico, ácido vanílico, e seis

amburosídios (C-H), acetato de 6”-amburosila, protocatecuato de 6”- amburosila, ferulato de

6”-amburosila, galato de 6”-amburosila, vanilato de 6”-amburosila e sinapato de 6”-

amburosila.

A abundante ocorrência de flavonóides descrita para A. cearensis motivou a

realização de um levantamento bibliográfico sobre a ocorrência botânica, tipos estruturais e

atividades biológicas exibidas por biflavonóides. Esta revisão propiciou ainda a construção de

um banco de dados de RMN 13C de biflavonóides, representando uma atualização do livro

“Carbon-13 of Flavonoids”- (Autor: AGRAWAL, P.K. Editora: Elsevier. Ano: 1989),

principal fonte de consulta de dados espectroscópicos desta classe química.

O êxito alcançado nas pesquisas químicas e farmacológicas do extrato de A.

cearensis e seus constituintes intensificou o uso medicinal desta planta, tanto a nível caseiro

como pela produção de seu fitoterápico, em escala industrial (Fig. 1, p. 4). Esta crescente


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demanda no emprego da casca do caule de A. cearensis tem provocado uma séria ameaça para

a existência da espécie num futuro não muito distante, visto que a mesma já é classificada

como espécie em perigo de extinção (HILTON-TAYLOR, 2000 apud RAMOS et al., 2004).

A fim de evitar possíveis conseqüências nefastas do extrativismo predatório de A.

cearensis, foi desenvolvido um projeto de pesquisa interdisciplinar Agronomia-Química-

Farmacologia visando à proposição de um modelo de exploração racional e auto-sustentável

de A. cearensis. Desta iniciativa surgiu a proposta de substituição da planta adulta silvestre

por espécimens jovens, cultivados sob parâmetros agronômicos controlados, de forma a

conciliar a preservação da espécie e o seu uso comercial, sobretudo pelo mercado

farmacêutico. Além de que a produção de mudas poderia ser utilizada no reflorestamento de

áreas degradadas. Faz-se míster salientar que a idéia da troca da planta silvestre pela cultivada

foi inicialmente aventada pelo Prof. Francisco José de Abreu Matos, a exemplo do que foi

idealizado para Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão) no seu livro sobre implantação

do programa Farmácias Vivas (MATOS, 2002).

Este estudo integrado e multidisciplinar, financiado pelo Banco do Nordeste, CNPq,

CAPES e pela FUNCAP, constou de três fases:

Fase 1 (agronomia)- germinação de sementes e produção de plantas jovens, realizada pelo

Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra, no Departamento de Fitotecnia-UFC.

Fase 2 (química)- no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, foram efetuados a

preparação e fracionamento dos extratos etanólicos das plantas jovens; quantificação dos

teores de substâncias químicas comuns aos extratos da planta silvestre e da planta cultivada

(ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A); e isolamento e

caracterização estrutural de substâncias presentes nos extratos das plantas jovens: amburanina

B, isocampferídio, aiapina, amburosídio B, ácido p-hidroxi-benzóico, ácido (E)-o-cumárico

glicosilado e o seu estereoisômero ácido (Z)-o-cumárico glicosilado.

Fase 3 (farmacologia)- avaliação farmacológica comparativa entre o extrato da planta

silvestre e os extratos das plantas cultivadas em diferentes estágios de crescimento, realizada

pela Profª. Luzia Kalyne de Almeida Moreira Leal, no Departamento de Farmacologia-UFC.

Em virtude da falta de padronização crônica dos fitoterápicos nacionais, a pesquisa

contemplou ainda o desenvolvimento de um método de análise química qualitativa e

quantitativa para extratos e produtos comerciais de A. cearensis, como mecanismo de garantia

de qualidade e atoxicidade dos mesmos, em doses terapêuticas. Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

3

Além disso, A. cearensis teve seu potencial bio-herbicida investigado num ensaio de

inibição da germinação de alface, efetuado pelo Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra. O

extrato aquoso das sementes, dotado de atividade alelopática, foi quimicamente caracterizado

(BEZERRA et al., 2001).

O presente trabalho, confeccionado segundo as normas preconizadas pela ABNT

(Associação Brasileira de Normas Técnicas), é composto por onze capítulos: Introdução

(cap. I), Considerações Botânicas- Família Leguminoseae Papilionoideae e a Espécie A.

cearensis (cap. II), Revisão Bibliográfica- Biflavonóides (cap. III), Validação de

Metodologia Analítica (cap. IV), Resultados e Discussão: Determinação Estrutural (cap V),

Proposta Biogenética de Formação das Substâncias Isoladas (cap. VI), Validação de Método

Cromatográfico (cap VII), Breve Abordagem Farmacológica do Estudo Interdisciplinar de A.

cearensis (cap. VIII) e Atividade Alelopática (cap. IX), Parte Experimental (cap. X) e

Conclusão (cap. XI).

Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira

Figura 1- Fotos digitais das formas exploradas comercialmente de A. cearensis, com fins medicinais: casca (à dir.) e xarope (à esq.)

OBJETIVOS DO ESTUDO QUÍMICO DE A. CEARENSIS

• Continuação do estudo fitoquímico das cascas do caule e sementes;

• Avaliação química comparativa dos extratos etanólicos de A. cearensis (planta

silvestre e cultivada);

• Validação de método cromatográfico para doseamento de 4 constituintes de extratos

de A. cearensis;

• Análise quantitativa e caracterização química dos extratos de plantas jovens

farmacologicamente ativos.


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REFERÊNCIAS

AQUINO, F. W. B.; RODRIGUES, S.; NASCIMENTO, R. F.; CASIMIRO, A. R. S. Phenolic compounds in imburana (Amburana cearensis) powder extracts. Eur. Food Res. Technol., v. 221, p. 739-745, 2005.

BASTOS, C. R. V. Contribuição ao conhecimento químico de Torresea cearensis (Fr. All.) Departamento de Química Orgânica e Inorgânica. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 1983.

BEZERRA, A. M. E.; CANUTO, K. M.; SILVEIRA, E. R; FREITAS, J. B. S.; MEDEIROS-FILHO, S. Efeito do extrato aquoso das sementes de cumaru na germinação de alface. Hortic. Bras., v. 19, n. 2, p. 243, 2001.

CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Brasília: EMBRAPA, 1994, 640 p.

HILTON-TAYLOR, C. 2000 IUCN Red List of Threatned Species. IUCN, Cambridge-UK, 2000.

LEAL, L. K. A. M; MATOS, M. E.; MATOS, F. J. A.; RIBEIRO, R. A.; FERREIRA, F. V.; VIANA, G. S. B. Antinociceptive and antiedematogenic effects of the hydroalcoholic extract and coumarin from Torresea cearensis Fr. All. Phytomedicine, v. 4, n. 3, p. 221-227, 1997.

LEAL, L. K. A. M; OLIVEIRA, F. G.; FONTENELE, J. B.; FERREIRA, M. A. D.; VIANA, G. S. B. Toxicological study of hydroalcoholic extract from Amburana cearensis in rats. Pharmac. Biol., v. 41, n. 4, p. 308-314, 2003.

MAIA, G. N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. São Paulo: D & Z Editora, 2004. 413 p.

MATOS, F. J. A. Farmácias vivas: sistema de utilização de plantas medicinais projetado para pequenas comunidades. 4ª ed., Fortaleza: Editora UFC, 2002. 267 p.

RAMOS, K. M. O.; FELFILI, J. M.; FAGG, C. W.; SOUSA-SILVA, J. C.; FRANCO, A. C. Desenvolvimento inicial e repartição de biomassa de Amburana cearensis (All.) A. C. Smith, em diferentes condições de sombreamento. Acta. Bot. Bras., v. 18, n. 2, p. 351-358, 2004.


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II. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

2.1. Considerações botânicas sobre a família Leguminoseae papilionoideae (Fabaceae)

A família Leguminoseae, também denominada Fabaceae, é caracterizada pelo fruto

na forma de vagem, sendo composta por cerca de 740 gêneros inseridos em três subfamílias,

facilmente distinguíveis por caracteres vegetativos:

• Mimosoideae- apresenta folhas bipinadas e glândulas, suas flores são actinomórficas;

• Caesalpinoideae- apresenta folhas paripinadas, sem glândulas, suas flores são

variáveis;

• Papilionoideae- apresenta folhas imparipinadas e flores zigomórficas

Leguminoseae Papilionoideae é a mais numerosa das subfamílias, detendo

aproximadamente 500 gêneros e mais de 10.000 espécies divididas em 31 tribos. Seus

representantes estão distribuídos em todo o globo terrestre, majoritariamente nos trópicos

americanos e africanos (RIBEIRO et al., 1999). Esta subfamília é tida como a mais evoluída,

sendo ainda caracterizada pela prefloração imbricado-descendente da corola e a posição

infletida do eixo radícula-hipocótilo, em relação aos cotilédones (BARROSO, 1991). As

espécies apresentam folhas compostas, alternas, raramente opostas (somente Platymiscium e

Taralea), com um pulvino na base do pecíolo e um pulvínulo para cada folíolo. Geralmente,

apresentam estípulas na base das folhas e estipelas entre os folíolos. Os folíolos podem ser

opostos, subopostos ou alternos de margem inteira. Possuem um folíolo terminal, isto é, são

imparipinadas. Exsudação vermelha é comum, mas rara nas outras duas subfamílias

(RIBEIRO et al., 1999).

A inflorescência pode ser racemo ou panícula, normalmente portando brácteas e

bractéolas. As flores são bissexuais, zigomórficas, com cinco sépalas unidas (RIBEIRO,

1999). A corola possui de uma a cinco pétalas livres, formando um arranjo papilionáceo, ou

seja, semelhante a uma borboleta, sendo considerado o tipo mais evoluído. Há uma pétala

superior chamada de estandarte ou vexilo, o qual pode ser oblongo, reniforme ou orbicular.

As pétalas laterais são denominadas alas e as inferiores são as carenas (BARROSO, 1991).

As flores típicas são lilases e bem vistosas à luz ultravioleta, são providas de néctar e

pólen como recompensa para os visitantes. Há um só carpelo, o ovário é súpero, podendo

haver mais de um óvulo.


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Por tratar-se de uma leguminosa, o fruto é uma vagem com uma ou mais sementes,

podendo ser deiscente ou não. A superfície pode ser glabra ou pubescente, até urticante. O

fruto pode ser espesso ou achatado, seco ou carnoso, sendo, às vezes, alado.

As sementes e frutos de muitos gêneros são fontes nutricionais ricas em

carboidratos, proteínas e vitaminas, como é caso do feijão, da soja e da ervilha. As madeiras

de espécies de Dipteryx, Hymenolobium e Dalbergia são empregadas na construção civil e na

marcenaria (RIBEIRO et al., 1999).

2.2. Considerações botânicas sobre Amburana cearensis A.C. Smith

O táxon Amburana é formado por apenas duas espécies, A. acreana Ducke e A.

cearensis A.C. Smith, as quais possuem grande importância econômica e medicinal.

Enquanto que a primeira espécie apresenta-se na forma arborescente de alto fuste, ocorrendo

em matas altas e fechadas, A. cearensis assume a forma arbustiva de fuste curto,

predominando em formações vegetais tropicais a subtropicais secas (CARVALHO, 1994).

Nativa do sertão nordestino, A. cearensis é encontrada ainda nos Estados de Minas

Gerais, Espírito Santo, Tocantins e da Região Centro-Oeste. Contudo, a outra espécie do

gênero, A. acreana, tem sua distribuição restrita ao sudoeste da floresta amazônica (Rondônia,

Acre e Amazonas) (LORENZI, 1992). Há registros de sua ocorrência em outros países:

Argentina (norte), Bolívia (sul), Paraguai e Peru (nordeste) (LEITE, 2005). A figura 2 mostra

o mapa de distribuição da espécie na América do Sul (Fig 2, p. 8).

De acordo com Pio Corrêa (1984), A. cearensis pode ser descrita como:

Árvore regular, até 15 m de altura e 50 cm de diâmetro; casca grossa, suberosa, gordurosa, aromática, vermelho-pardacenta e que se desprende em finas lâminas; ramos novos cilíndricos; folhas alternas, irregularmente pinadas, composta de 11-15 folíolos alternos, peciolados, ovados, arredondados no ápice e na base, inteiros, nervura dorsal saliente; flores brancacentas ou branco-amareladas, ou amarelo-pálido, aromáticas, pequenas, dispostas em racimos axilares, multiflorida; ovário longo-estipitado; fruto vagem achatada, escura, quase preta, contendo uma semente alada e rugosa. Fornece madeira de alburno branco-acinzentado e cerne amarelo-castanho, normalmente avermelhado e com tons verde-azeitona, assetinada, raios e poros fracamente visíveis.

Carvalho (1994) descreve A. cearensis como árvore caducifólia que demonstra

certas particularidades dependendo do habitat. Na Caatinga, seu porte é de 3-10 m de altura e

a copa é achatada e curta, todavia na Floresta Pluvial Tropical, esta planta pode atingir até 40

m, sendo sua copa alta, larga e umbeliforme (Fig 3, p. 10).


7

Figura 2– Mapa de distribuição de espécimens de A. cearensis na América do Sul: 1. Nordeste (BRA); 2. Sudeste (BRA); 3 e 4. Centro-Sul (BRA); 5. Oeste (BRA, ARG e PAR) e 6. Oeste (BRA, BOL e PER). (LEITE, 2005).

A. cearensis recebe diferentes designações populares em diversas localidades:

ambaurana (SP), baru (SE), cumaru-do-ceará, cumaru-das-caatingas (MG), imburana-de-

cheiro (CE, BA, PE, RN e SE), louro-ingá, umburana (BA, RN), angelim (MS), cerejeira-

rajada, cumaré (CE, BA, PE, RN e PB), roble criollo (ARG), tumi (BOL) e palo trébol (PAR).

(CARVALHO, 1994).

No Nordeste, o período de floração de A. cearensis ocorre no início da estação seca,

entre maio e julho, e a frutificação se dá de agosto a outubro, após a perda de suas folhas

(MAIA, 2004) (Fig 4, p. 10). A floração e a frutificação são observadas após 10 anos de

plantio. No Brasil, os espécimens são encontrados numa faixa de altitude entre 20-800 m, em

regiões nas quais o índice pluviométrico e a temperatura média anual podem variar de 500-

1700 mm e 19-29 °C, respectivamente. Mesmo sendo uma espécie heliófila, A. cearensis


8

cresce favoravelmente em níveis de sombra acima de 56%, em sua fase inicial de

desenvolvimento (CARVALHO, 1994).

As plântulas de A. cearensis desenvolvem uma hipertrofia subterrânea, denominada

xilopódio, que contribui para reserva de água e nutrientes necessários para o desenvolvimento

da espécie, nos primeiros anos de vida (LIMA, 1989). Cunha e Ferreira (2003) confirmam que

a tuberosidade da raiz constitui-se numa estratégia adaptativa, a qual dota a planta de um alto

poder de rebrotamento, em caso de dano à parte aérea. O xilopódio apresenta-se carnoso,

napiforme e de coloração vermelha. Aos 9 meses, o tubérculo atinge 3 cm de diâmetro e emite

numerosas raízes fibrosas, longas e finas (CARVALHO, 1994) (Fig. 5, p. 11).

A. cearensis é freqüentemente confundida com a espécie Dipteryx odorata devido à

denominação popular comum cumaru, além de ser equivocadamente classificada como

pertencente aos gêneros Pterodon ou Stryphnodendron (PIO CORRÊA, 1984). Já o termo

imburana costuma provocar iguais equívocos na identificação, por se referir também à

Commiphora leptophloeos (Burseraceae), conhecida comumente como imburana-de-espinho

(MAIA, 2004) (Fig. 6, p. 11).


9


A D

E

B C

F

Figura 3- Fotos digitais de diferentes partes de A. cearensis: (A) sementes, (B e C) flores, (D e E) frutos, (F) galhos. Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira

Figura 4- Fotos digitais de um espécimem adulto silvestre de A. cearensis: estação chuvosa (à esq.) e período de estiagem (à dir.)


10


Figura 5- Fotos digitais de A. cearensis cultivada: canteiro (à esq.) e espécimens colhidos aos 6 meses de desensvolvimento (à dir.)

Extraído de MAIA, 2004

Figura 6- Fotos de Dipterix odorata (à esq.) e Commiphora leptophloeos (à dir.).


11

REFERÊNCIAS

BARROSO, G. M. Sistemática de angiospermas do Brasil. Viçosa: Imprensa Universitária-Universidade Federal de Viçosa, v. 3, 1991.

CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Brasília: EMBRAPA, 1994.

CUNHA, M. C. L.; FERREIRA, R. A. Aspectos morfológicos da semente e do desenvolvimento da planta jovem de Amburana cearensis A.C. Smith - Cumaru - Leguminosae Papilionoideae. Rev. Bras. Sementes, v. 25, n. 2, p. 89-96, 2003.

LEITE, E. J. State-of-knowledge of Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (Leguminosae: Papilionoideae) for genetic conservation in Brazil. J. Nat. Conservat., v. 13, p. 49-65, 2005.

LIMA, D. A. Plantas das caatingas. Rio de Janeiro: Academia Brasileira de Ciências, 1989. 243 p.

LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 1992.

MAIA, G. N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. São Paulo: D & Z Editora, 2004. 413 p.

PIO-CORRÊA, M. Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Brasília: Ministério da Agricultura, 1984.

RIBEIRO, J. E. L. S.; HOPKINS, M. J. G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C. A.; COSTA, M. A. S.; BRITO, J. M.; SOUZA, M. A. D.; MARTINS, L. H. P.; LOHMANN, L. G.; ASSUNÇÃO, P. A. C. L.; PEREIRA, E. C.; SILVA, C. F.; MESQUITA, M. R.; PROCÓPIO, L. C. Flora da Reserva Ducke: guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia Central. Manaus: INPA, 1999. 816 p.


12

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA III. BIFLAVONÓIDES 3.1. Características fundamentais e Relevância

Os flavonóides figuram entre as classes de substâncias químicas de maior ocorrência

botânica, sendo contabilizados em números superiores a seis mil exemplares (HARBORNE e

WILLIAMS, 2000). Sua estrutura química é facilmente reconhecida pela presença de um

esqueleto aromático C6-C3-C6, um anel cromano (anel benzênico-A + anel heteronuclear-C)

ligado a um anel benzênico (anel B) (ROBBERS et al., 1997). Fisicamente, apresentam-se

geralmente como sólidos amarelos, justificando o emprego do termo grego flavus, porém são

encontrados também com coloração vermelha, azul e até mesmo incolor (SIMÕES et al.,

1999).

Biossinteticamente, os flavonóides são obtidos pela convergência de duas vias

biogenéticas formadas a partir da acetil-CoA e do ácido chiquímico, as quais geram

respectivamente os duas unidades fundamentais para a origem dos flavonóides: malonil-CoA

(3 moléculas) e p-cumaroil-CoA (ROBBERS et al., 1997).

Nas plantas, os flavonóides assumem importantes papéis fisiológicos como: defesa

contra insetos e microorganismos, proteção contra raios ultravioleta, ação alelopática, inibição

de enzimas e atração de agentes polinizadores, entre outros (HARBORNE e WILLIAMS,

2000).

Sob o ponto de vista econômico, os flavonóides despertam grande interesse

comercial por parte das indústrias alimentícias, corantes e sobretudo farmacêutica, devido às

suas comprovadas atividades farmacológicas: antiinflamatória, antioxidante, antitumoral,

antiviral, etc (HARBORNE e WILLIAMS, 2000).

As inúmeras possibilidades de arranjos estruturais, em virtude dos diferentes padrões

de oxigenação, metilação, glicosilação e dimerização dos flavonóides resultam numa gama

elevada de compostos flavonoídicos, os quais podem ser classificados nas seguintes

categorias: aurona, chalcona, flavana, flavanol, flavanona, flavanonol, flavona, flavonol,

isoflavona e antociano (Quadro 1, p. 14).

1. Auronóide- composto derivado da 2-benzilidenocumaranona, o qual pode exibir

estereoquímica (E) ou (Z).


13

2. Chalconóide- composto formado pelo núcleo fundamental 1,3-diarilpropano, o qual pode

ser carbonilado, olefínico ou hidroxilado.

3. Flavana-estrutura química contendo uma fenila ligada ao anel benzopirano, na posição 2.

4. Flavanol- flavana hidroxilada na posição 3.

5. Flavanona (di-hidro-flavona)- flavonóide cetônico com carbonila na posição 4.

6. Flavanonol (di-hidro-flavonol)- flavanona hidroxilada na posição 3.

7. Flavona- anel heterocíclico com carbonila α,β-insaturada.

8. Flavonol- flavona hidroxilada na posição 3.

9. Isoflavonóide- flavonóide portando a fenila posicionada no carbono 3.

10. Antociano- flavonóide catiônico, cuja carga positiva se encontra posicionada no oxigênio

do anel heterocíclico.

Quadro 1- Esqueletos básicos das diferentes subclasses de flavonóides

Auronóide (1) Chalconóide (2) Flavana (3)

Flavanol (4) Flavanona (5)

Flavanonol (6) Flavona (7)

Flavonol (8) Antociano (10)Isoflavonóide (9)

O

O

23

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O23

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

45

O

OH

236

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O

O

23

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O

O

OH

23

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O

O

OH

23

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'23

45

6

7

89

101'

2'

3'

4'

5'

6'

O

O

O+

23

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O

2

3

4

5

6 1

1'

2'

3'4'

5'

6'

α

β

β'

O

O

23

45

6

7

89

10

1' 2'

3'

4'5'

6'

AA

BB

CC


14

Os biflavonóides são espécies diméricas formadas por monômeros idênticos ou

distintos, os quais podem ainda ser mistos quanto à categoria das unidades e podem

apresentar vários tipos de conectividades entre si. A possiblidade de atropisomerismo

(estereoisomeria de eixo) entre os monômeros também contribui para a diversidade de

estruturas biflavonoídicas (SIMÕES et al., 1999).

Estima-se que a quantidade de biflavonóides seja superior a duzentas substâncias,

dispersas principalmente entre as plantas gimnospermas e angiospermas, das quais se

destacam as famílias Guttiferae, Ochnaceae e Anacardiaceae. Entre os gêneros, os

biflavonóides são abundantes nas espécies de Selaginella (Selaginellaceae), Calycopteris

(Combretaceae), Daphne (Thymelaeaceae), Lophira e Ochna (Ochnaceae) (BARBOSA,

2003).

A nomenclatura dos biflavonóides é feita de modo análogo a dos flavonóides

monoméricos, obedecendo a mesma ordem de numeração. No entanto, há duas possibilidades

de denominação dos anéis aromáticos: na primeira, as unidades são referidas através de

algarismos romanos (I e II), na segunda, a estrutura é subdividida em dois conjuntos de anéis

(1- A, B e C; 2- D, E e F). As posições são diferenciadas apenas pelo acréscimo de linhas

sobrescritas (”). Os carbonos 9 e 10 também podem ser chamados 8a e 4a, respectivamente

(SIMÕES et al., 1999).

O

O

O

O

OH

OH

CH3

OH O

OH

2

3

45

6

7

89

10

1'

2'

3'

4'5'

6'

2''3''

4''

5''6''

7''8''

9''

10''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

A C

B

D

E

FO

O

O

OOH

OH

OHOH

OH

I-2

I-3

I-4I-5

I-6I-7

I-8I-9

I-10

I-1'

I-2'

I-3'

I-4'

I-5'

I-6'

II-2II-3

II-4

II-5II-6

II-7II-8

II-9

II-10

II-1'

II-2'

II-3'

II-4'

II-5'

II-6'

H

Figura 7- Estruturas químicas da biflavona amentoflavona, numeradas sob duas formas

Os biflavonóides são substâncias polares, solúveis em solventes hidrofílicos

(metanol, DMSO, piridina), por isso suas metodologias de isolamento, em geral, requerem a

aplicação de cromatografias de adsorção de fase reversa (octadecilsilano, ciano) e de exclusão

(Sephadex LH-20) (SIMÕES et al., 1999).


15

3.2. Ressonância Magnética Nuclear de 13C Tendo em vista que o livro intitulado “Carbon-13 of Flavonoids” (AGRAWAL,

1989), uma das fontes bibliográficas mais completas de dados de RMN 13C de biflavonóides,

encontrava-se bastante defasado quanto à descoberta de dezenas de novos exemplares da

classe, foi efetuada uma minuciosa revisão bibliográfica de biflavonóides, visando uma

atualização dos dados espectroscópicos de 13C das novas entidades químicas desta classe.

O Scifinder, uma base de dados que reúne informações registradas no Chemical

Abstracts, foi a ferramenta de pesquisa empregada para catalogar os 188 biflavonóides

naturais, de origem vegetal, descritos na literatura no período de 1988-2006, resultando num

banco de dados cujos deslocamentos químicos estão localizados juntos aos respectivos

carbonos, existentes em cada estrutura química. É válido ressaltar que, no levantamento, não

constam biflavonóides inéditos cujos dados de RMN 13C não estavam disponibilizados nas

publicações correspondentes ou ainda de títulos cuja aquisicão tornou-se impraticável ou

inacessível, em virtude da parca distribuição do periódico. Além disso, foram incluídos

também biflavonóides conhecidos cujos dados não haviam sido descritos entre os 69

biflavonóides da referência supra-citada.

Na tabela 1 (p. 46), foram listados os números correspondentes às estruturas

biflavonoídicas, as quais foram divididas em subclasses (Quadro 1, p. 14) e classificadas por

tipo de conectividade, juntamente com o nome da espécie botânica da qual foi obtida a

substância, a referência consultada e o solvente deuterado utilizado no experimento.

A seguir são apresentados os deslocamentos químicos de RMN 13C característicos

de cada subclasse de flavonóides e comentados os possíveis efeitos de (des)blindagem que

justificam os valores encontrados. Esta discussão foi baseada no livro “Carbon-13 of

Flavonoids” (AGRAWAL, 1989)

3.2.1. Subclasses de biflavonóides

a. Aurona

A absorção da carbonila (C-4) é registrada geralmente entre δ 185-178. Os carbonos

C-2 (monohidrogenado e exocíclico- δC-2 148-145) e C-3 (não-hidrogenado- δC-3 113-105) são

carbonos olefínicos, os quais apresentam uma significativa diferença de deslocamento


16

químico devido à oxigenação do C-3 e à conjugação do oxigênio com a dupla-ligação,

aumentando a densidade eletrônica do C-2 (proteção).

H

109,9

145,5

179,0166,8

97,6

167,4

90,2158,1

102,9

122,4

115,8

145,7 147,5

120,8127,3

109,5

145,9180,1

165,8

108,7165,2

90,5

158,1

102,9

123,7

117,5145,5

147,5

115,8124,0

O

OH

O

OH OH

OH

O

OO

OH

OH OH

Biauronóide

165

103,8162,5

119

12

153,2

OH

OH

127,0131,4

116,2

160,5114,7

,7

,3

134,3

194,1

118,7

144,8

132,9

132,3

5,1

165,0

103,0113,8

166,6

108,3

133,2

39,9

29,9

OH

OHO

OH O

OH

205,6

116,4

Bichalconóide

b. Chalcona

Todos os sinais de uma chalcona são observados entre δ 195-90, sendo a carbonila

facilmente identificada pela absorção entre δ 195-187. O sinal do carbono C-β em δ 147-136

para um carbono sp2 não-funcionalizado é justificado pelo efeito mesomérico retirador da

carbonila. O sinal de C-α aparece em δ 129-116, como não é um valor de δ característico, sua

atribuição é feita sob auxílio do espectro de HMBC. Nas di-hidrochalconas (chalcanona), a

absorção da carbonila se dá em torno de δ 207-203, porque não ocorre blindagem da ligação

dupla como ocorre nas chalconas. Os deslocamentos químicos dos carbonos C- α e C-β,

ambos metilênicos, são observados numa região compatível com a de carbonos sp3: δ 47-39 e

32-29, respectivamente.

c. Flavana

O anel heteronuclear de uma flavana é desprovido de carbonila, logo os sinais

associados aos carbonos C-2, C-3 e C-4 são todos de carbonos sp3 (δC-2 79-74; δC-3 31-29 e

δC-4 26-19). O efeito indutivo retirador do oxigênio, elemento entre os mais eletronegativos,

justifica o maior deslocamento químico para C-2.


17

O

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH78,166,0

29,2100,2

157,9

96,3

158,0

96,3 157,6132,3116,2 145,2

145,4

120,0

125,2

82,368,4

27,4101,2

156,996,3

155,2

108,1 153,3132,5

114,9

146,1

146,1116,0

119,9

Biflavanol

O

O

OCH3

O

O

OCH3

OCH3

OH

OCH3

128,5

126,1

140,8

73,937,6

58,9

105,1

152,0

109,1

152,7136,7

151,1

70,9

33,3

137,3132,0

184,4

105,0

171,286,9 56,7

61,4

60,9

54,5140,7

125,8

128,5128,0

105,6

Biflavana

d. Flavanol

Em virtude de sua hidroxilação, o C-3 (δ 70-65) de um flavanol torna-se nitidamente

desblindado, quando comparado ao carbono correlato de uma flavana. Contudo, seu

deslocamento químico ainda mostra-se inferior (∆δ= 12-15) ao exibido por C-2 (δ 82-77), em

virtude deste último carbono, também monoxigenado, sofrer maior influência dos efeitos α e

β de desproteção do anel B. O carbono metilênico (C-4) apresenta um sutil incremento no seu

deslocamento químico (δ 33-24), em relação ao C-4 da flavana (δ 26-19), em razão do efeito

β de desproteção da hidroxila .

e. Flavanona

Tendo em vista que as flavanonas possuem o anel C saturado e um grupo cetona

postado na posição 4, os deslocamentos químicos característicos deste tipo de flavonóides são

atribuídos ao carbono oximetínico (C-2: δ 80-71), ao carbono metilênico (C-3: δ 47-39), e à

carbonila (C-4: δ 198-186). No entanto, a absorção de C-2 depende de substituintes presentes

nas posições 2’ e 6’ (anel B). Sendo o anel B não substituído nestas posições, a absorção fica

em torno de δ 79, enquanto que C-2’ ou C-6’ oxigenados, C-2 se torna mais blindado (δ 75)

em razão de um efeito γ de proteção, exercido pelos oxigênios. A absorção da carbonila sofre

forte desblindagem por uma hidroxila posicionada no C-5, devido à possibilidade de

quelação.


18

H

O

O

OCH3

OCH3

OH

H3CO

OCH3

O

O

OCH3

OH

H3CO

OCH3

89,0

89,0

78,2

78,2

200,4162,9

104,9

161,3

92,3 158,5

102,7

102,7

122,7

130,3

114,5

162,2

200,5163,8

98,1

164,8

102,6156,7

121,7

108,8

146,4152,7

111,8

119,7

56,0

56,2

55,5

56,3

56,4

56,0

55,3

Biflavanonol

105,7

OO

OO

O

OH

OCH3

H3CO

OCH3

60,4

59,986,2

194,6

109,2131,7

111,6

166,7

165,9

132,7

86,4

200,1

109,3164,9

97,3

167,5

99,4166,0

122,5

129,2

114,6

160,7

56,3

55,5

158,5

116,0

129,6

56,2

Biflavanona

f. Flavanonol

A hidroxilação na posição 3 produz uma desblindagem no carbono C-3 (∆δ +30),

mas também no carbono C-2 (∆δ +5), em relação a uma flavanona. O deslocamento químico

da carbonila permanece praticamente inalterado.

g. Flavona

A dupla-ligação entre os carbonos C-2 e C-3 provoca um incremento significativo

nos valores de deslocamento químico destes carbonos (∆δ +86 e + 64, respectivamente),

quando comparados aos registrados para flavanona. C-3 apresenta absorção compatível com a

de carbono sp2 (δ 113-102), todavia C-2 em razão de ser oxigenado exibe maior desblindagem

(δ 166-157). Como a carbonila se torna α,β-insaturada, percebe-se uma blindagem em relação

ao C-4 de uma flavanona (∆δ -13), atribuída ao efeito mesomérico doador, produzido pela

conjugação com o enol-éter (C-4: δ 183-175).

O

OOH

OH

OH

OCH3

O

OOH

OH

OCH3

OH

146,3135,7

176,3

158,4

97,8

162,1

104,5 153,8

102,9

30,7

123,6

129,2

113,9

160,3 55,3

Biflavonol

102,

O

O

OH

OH

OHO

O

OH

OH

OH

OH

OH

166,5

106,4

181,7

161,1

98,6

163,7

93,0157,2

9

124,0

118,7

144,3

148,3

114,6

120,5

163,8

102,4

181,1

160,398,3

161,4

103,5 154,3

103,2

121,7

113,5

145,7149,4

115,5

118,9

Biflavona


19

h. Flavonol

A introdução de uma hidroxila no carbono C-3 afeta sensivelmente as absorções de

C-2 (∆δ +17) e C-3 (∆δ +32) e apenas levemente C-4 (∆δ +5), em relação aos deslocamentos

químicos observados para uma flavona. Entretanto, até mesmo no carbono C-9 observa-se o

efeito da hidroxilação (∆δ -5).

i. Isoflavona

Os deslocamentos químicos dos carbonos C-2 e C-3 são particularmente afetados

pela troca da posição de ligação da fenila: δ 155-150 e 126-122, respectivamente. Isto é, os

carbonos sofrem efeitos opostos, (∆δC2 +10 e ∆δC3 -10). A absorção da carbonila (C-4) não se

altera (δ 181-174), a menos que exista uma hidroxila no carbono C-2’, a qual pode provocar

uma desblidagem (∆δC4 +3), decorrente da possível formação de ponte de hidrogênio

intramolecular entre a hidroxila e a carbonila. No entanto, a técnica de RMN 13C- DEPT135

permite a identificação inequívoca de uma isoflavona através da exibição de um sinal em δ

155-150, associado a carbono sp2 oxigenado e hidrogenado (C-2).

111,5

61,0

194,7

165,3

97,3

167,1

95,9160,9

100,9 116,3

161,499,2

156,6

110,5128,1

156,3

122,1

181,9163,6

100,0

165,2

94,5

159,0

105,9

110,7

157,8

104,8

160,6

120,3

132,7

O

OH

OH

O

OHOH

O O

OH

OH

O

OH

Bi-isoflavonóide


20

Auronóide-flavanol

OO

OH

OH

OH

OHOO

OH

OH

82,286,5

28,8102,7

163,2

91,1

160,7

103,8

153,3

130,9

129,0

116,0

158,192,7 95,9

197,2

104,6

158,6

97,2169,9

91,3

173,6

125,4130,2

116,0

159,1

OO

OH

OH

OH

OHOO

OH

OH

82,168,5

28,9102,9

163,1

91,1

160,7

104,1

153,2

130,8

128,7

115,9

158,092,4 96,2

196,7

104,6

158,6

97,7170,1

91,2

173,6

125,5130,1

116,1

159,1

1 2

Auronóide-flavanona 114,5

10897,5

90,5122,0

179,1167,0

167,5

158,2

102,9

123,7

115,9

145,5147,4

145,9

78,5

42

104

94,5

114,5

115,5

118

196,3

101,6161,6164,6

161,1

145,2

145,8

O

OOH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH OH

145,2

178,9166,8

97,6

167,4

90,2158,1

102,9

122,4

115,9

145,7 146,3120,7

127,4

109,9

106,1

196,3

78,4

42,2

161,6164,6

94,5

161,1

101,6

129,5

114,3

145,2

145,8

115,3

117,9

O

O

OH OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH OH

3 4

Biauronóide

O

O

OCH3

O OCH3

O

H3CO OCH3

OCH3

H3CO

OCH3

91,3

197,5158,5

92,2

169,2

88,3174,5

106,2

41,6

127,2

132,2

113,4

158,4

55,2

55,6

56,2

109,7

194,4

160,1

89,4

169,4103,4

171,6

105,3

40,852,6

125,6

132,1

113,9158,9

56,3

56,6 56,7

O

O

OCH3

O OCH3

O

H3CO OCH3

OCH3

H3CO

OCH3

91,1

197,7158,5

92,2

169,1

88,3174,4

106,4

41,4

126,9

132,2

113,4

158,4

55,5

56,1

56,4

110,0

194,3

160,2

89,5

169,3103,7

172,0

105,4

40,952,8

125,7

132,1

113,9158,9

56,6

56,6 56,7 5 6

109,9

145,5

179,0166,8

97,6

167,4

90,2158,1

102,9

122,4

115,8

145,7 147,5

120,8127,3

109,5

145,9180,1

165,8

108,7165,2

90,5

158,1

102,9

123,7

117,5145,5

147,5

115,8124,0

O

OH

O

OH OH

OH

O

OOH

OH

OH OH

7


21

Bichalconóide

133,5128,3

1115,6

157,2

86,160,8

83,955,7

36,9 204,0114,9

166,7

103,4

165,7

130,6

130,9116,1

156,5

OOH

O

OH

OH

OH

OH

OH

119,1158,9

130,9

158,0

108,3

133,9

117,2157,1

103,8

159,4

107,9130,3

81,855,5

84,057,0

203,7 197,7130,2

132,0

116,0

163,0

114,7

166,4103,3

165,7

108,8 134,7

O

O

OHOH

O

OH

OH

OH

OH

129,8

129,5

115,4

157,9

8 9

131,0129,0

116,0

158,4

84,956,1

83,957,3

202,3 203,4114,1

166,9

103,4

166,5

114,4

166,1103,1

165,8

108,7 134,4

O

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

129,7

129,6

115,2

157,8

109,0

134,2

129,2130,1

116,2

159,0

85,051,8

85,051,8

191,6 191,6115,2

164,2

103,4

165,4

115,2

164,2103,4

165,4

111,3 129,9

O

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

129,2130,1

116,2

159,0

111,3

129,9

10 11

O

O OH

OH

OH

OCH3

OH

OH

OCH3

OH

162,7

115,9

132,7130,7

197,6144,6

126,4113,3

146,6142,5

147,1133,135,8

199,0

128,9132,9

116,1

163,750,5

123,2

127,8

147,0

139,7

146,6

120,1

111,4

60,6

60,4

114,6

167,5

103,9

166,7

108,8133,2

192,8

119,3

144,8

129,3

126,9

132,1

132,1

158,9111,0

113,8

165,7104,1

163,2

109,7

134,7 201,4

57,6

88,6129,3

128,7

116,5158,9

OH

OH

OH O

O

O

OH

OH

12 13

129,3

126,9132,1

158,9111,0

132,1

119,3

144,8

192,8

114,7

167,7

103,9

166,7

108,8

133,2

57,688,6

201,4

113,8

165,6

104,0163,2

109,7

134,7

129,3

128,7

116,5158,9

OH

O

OO

OH

OH

OH

OH

137,9

120,7129,7

153,0111,6

126,6

40,5

30,9

204,8

113,8

165,5

103,5

165,5

108,7

133,6

156,5

114,4

196,4

114,4

166,5

103,5166,5

109,1

136,5

121,7

130,1

116,5159,9OH

O

OO

OH

OH

OH

OH 14 15


22

O

O

OH O

OH

OOH

OH

H

129,3126,9

132,1

158,9111,0

132,1

144,8

119,3

192,8

114,7167,7

103,9

166,7

108,8

133,2129,3

128,7

116,5

158,9

88,6

57,6

201,4

113,8165,6

104,0

163,2

109,7

134,7

134,4

125,7127,2

159,1110,0

130,2

40,2

29,5

204,7

113,8

165,1

103,5

166,4

108,7

133,5

87,057,8

201,5

113,6

166,1

103,8

167,2

109,5

134,6

132,5

128,4

116,2158,4

OH

O

OO

OH

OH

OH

OH 16 17

114,3

167,5103,7

165,6

109,0

133,2

128,2

132,6

110,0163,9

128,9126,3

134,4

127,6

116,0157,8

116,8

157,9

103,2159,2

107,9

130,2

145,3

117,7

192,4

88,7

56,9

81,156,8

OH

OOH

OH O OCH3

OH

OH

O

O

OH O

OH

OOH

OH

OH

H

129,4128,7

132,0

163,7111,3

133,4

144,9

119,2

192,8

114,5167,5

103,7

165,7

108,1

133,4127,5

129,3

115,5

158,4

96,7

91,1200,8

112,8167,5

103,1

165,5

108,1

136,8

18 19

127,7

131,6

116,9161,1

145,1123,0

190,6 102,5155,0 115,4

167,199,7158,6

121,7

129,3

116,7

159,5

153,5113,7 196,7

115,4 166,2

103,3

166,3109,1

136,8

O

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

OHO

OH

OH

OH

132,1129,5

115,9

156,4

30,4

45,0

203,0

101,7

158,0

111,5166,1

99,4

165,7121,3

129,1 116,5

159,3153,3

113,3

196,5 115,3

166,1

103,3

166,1

109,0

136,5

20 21

153,2

136,7113,6

195,7

115,3

158,7

115,9

166,2

103,3

166,3

109,1

121,7

129,2 116,7

159,5O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH O

OH

H

167,0

154,9

155,0

101,5190,6

123,0

145,1

125,7

131,6

116,1

166,1

OH OCH3 OH

O

OH OCH3

OH

40,0

27,3

37,2

29,5

43,1123,2

155,9

99,7

157,5

120,8130,1

138,3

132,0

116,2

163,6

124,8

159,6

99,8

157,3

107,5

131,1130,1

130,0

115,7

155,1

202,1

55,6 55,7

22 23


23

127,0131,4

116,2

160,5114,7

165,7

103,8162,5

119,3

134,3

194,1

118,7

144,8

132,9

132,3

125,1

153,2

165,0

103,0113,8

166,6

108,3

133,2

39,9

29,9

OH

OHO

OH

OH

O

OH

OH

205,6

116,4

Bichalconóide

144,0

152,8

118,2

128,4

128,4122,6

117,2

143,2

192,4

165,6

103,7

167,3

108,8

114,2

130,9

160,9

117,2

129,8

129,8 143,2

117,2

192,4

114,2165,7

103,7

167,3

108,8131,5 OH

OHO

O

OH

OOH

OH

24 25

127,0131,4

116,2

160,6114,2

166,4

103,7163,1

116,2

134,3

192,6

117,9

144,9

127,2

132,3

126,2

158,4

167,1

103,2114,0

165,1

108,2

132,9

118,1

144,7

OH

OHO

OH

OH

O

OH

OH

192,4

130,7

116,9

O

OH

OH

O

OH

OHO

OH

129,3

130,9

116,2

161,5

165,2

103,2113,9

166,7

108,3

132,9

192,2

119,2

143,9

129,3131,5

116,2

160,6113,5

163,9

104,9157,7

134,9

124,6

192,3

117,7

145,4

26 27

O

OH

H3CO

O

OH

OHO

OH

129,4

130,9

116,0

161,5

167,3

103,5113,4

167,2

109,2

132,7

191,7

119,5

143,4

126,6131,7

116,4

161,4113,5

164,6

101,8159,4

135,5

124,1

192,4

117,3

145,8

56,2

O

OH

H3CO

O

OCH3

OHO

OH

129,4

130,7

115,8

158,6

166,6

101,1113,9

166,1

107,7

130,9

191,5

118,6

143,8

128,9130,3

116,0

160,9113,0

164,6

101,5158,8

135,1

122,8

191,5

117,4

144,9

55,6 56,2

28 29

O

OH

H3CO

O

OH

OH

OOH

114,5

132,2

101,2

166,6

116,2

128,4

162,4130,9

192,5

118,3

144,7

127,1131,0

116,3

160,4109,9

166,6

105,4166,6

137,2

123,2

189,8

118,5

143,0

56,6 107,5

166,6

O

O

CH3

CH3

O

OH

OH

CH3

OH O

OH

H

H

76,842,0

38,3

52,3 29,0

30,5

29,2

135,6

116,4115,6

154,3

208,5 112,4163,9

108,9

161,4

109,4

130,9

16,7

32,3

76,1

27,1

128,5

131,0

158,3

128,7113,5

163,9115,7

160,5109,6

129,7

192,4

118,4

144,4

27,3

30 31


24

Biflavana 128,0

O

O

OCH3

O

O

OCH3

OCH3

OH

OCH3

128,5

126,1

140,8

73,937,6

58,9

105,1

152,0

109,1

152,7136,7

151,1

70,9

33,3

137,3132,0

184,4

105,0

171,286,9 56,7

61,4

60,9

54,5140,7

125,8

128,5128,0

105,6

Biflavana

O

O

OCH3

O

O

OCH3

OH

OH

OCH3

OCH3

127,9

128,4

126,2

140,6

72,938,6

56,9

101,6

151,6

104,3

148,2130,5

149,7

70,6

32,2

138,2139,1

181,0

131,4

158,687,1 60,4

61,2

53,1141,1

126,2

128,5126,2

103,2

60,2

32 33

OO

O

O

OHH3CO

H3CO

OH

OCH3

H3CO

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128,6

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128,5

128,4

60,9

61,2

54,6

51,4

O

O

OCH3

O

O

OCH3

OH

H3CO

OCH3

OCH3

128,0

128,5

126,2

141,1

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66,9

99,4

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104,1

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33,1

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61,0

53,6140,5

125,8

128,6128,0

56,1

61,0

103,3

34 35

OO

OCH3

OCH3

O

OCH3

OCH3

OCH3

O

OH

74,137,7

59,0

152,1

109,4

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151,2

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128,0

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33,4

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132,0

61,4

61,0

61,0

61,6

54,3140,8

125,9

128,6

128,1

O

O

OCH3

O

O

OH

OCH3

H3CO

OCH3

OCH3

128,0

128,4

126,1

140,7

73,133,1

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105,4

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131,1

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61,6

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128,4128,0

103,3

55,9

60,5

36 37


25

O

O

OCH3

O

O

OCH3

OH

H3CO

OCH3

OCH3

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128,3

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180,9

131,2

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126,4

128,3126,4

103,1

55,2

60,2

OO

OCH3

OCH3

O

OCH3

OCH3

OCH3

O

H3CO

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66,7

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108,8

152,4139,9

152,0

102,1

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128,5

70,7

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137,4

181,4

136,4

158,988,3

103,5

131,9

61,5

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60,8

61,3

54,2140,9

126,1

128,4

128,5

56,2

38 39

OO

O

O

OHH3CO

H3CO

OH

OCH3

OCH3

H3CO

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128,4

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193,7

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128,4

60,9

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54,8

53,5

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OO

O

O

OHH3CO

H3CO

OH

OCH3

OCH3

H3CO

128,0

128,6

126,1

140,5

73,937,6

59,0

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36,8

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128,6

128,0

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55,7

51,7

59,4

40 41

OO

O

O

OHH3CO

H3CO

OCH3

OCH3

OCH3

H3CO

128,0

128,5

126,1

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59,0

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151,7

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126,2

128,6

128,4

76,4

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190,9

79,3

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167,9

111,7

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128,7

128,4

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OCH3

OCH3

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O

OHH3CO

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26

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151,9

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34,5

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168,2

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128,7

128,1

OH3CO

OCH3

OCH3

OOCH3

O

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H3COO

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61,0

59,7

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O

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH78,166,0

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157,9

96,3

158,0

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145,4

120,0

125,2

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27,4101,2

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155,2

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132,5

114,9

146,1

146,1116,0

119,9

O

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH78,065,8

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157,7

96,0

157,7

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119,9

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131,9

115,0

145,0

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119,6

45 46

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

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25,761,4

62,3

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76,5

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77,2

76,9

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96,4

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102,7

103,0

107,8

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145,6

153,9

154,0

155,7

155,9

157,0

157,3

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH76,0

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110,3

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145,8144,5

131,1

115,5

145,1

145,1

116,7

119,8

47 48

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

79,5

67,2

74,0115,1119,3

109,6

132,7

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109,6

133,3

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106,8

114,2

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114,4

129,4

129,7

136,3

137,5149,2

155,5

160,3

O

CH3COO

CH3COO

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OCH3

O

OCH3

H3CO

OCOCH3

OCH3

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27

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155,2

159,9

O

CH3COO

CH3COO

H3COOCH3

OCH3

O

OCH3

H3CO

OCOCH3

OCH3

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73,5

74,7

107,1

114,1

114,4

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128,5

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153,3

160,3

64,5

67,874,2

108,2111,3

129,4

129,1

140,0

137,8151,1

155,0

160,1

O

CH3COO

CH3COO

H3COOCH3

OCH3

O

OCH3

H3CO

OCOCH3

OCH3

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115,1

129,2

130,1

136,8

137,5149,7

155,2

159,8

O

CH3COOCH3COO

H3COOCH3

OCH3

O

OCH3

H3CO

OCH3

OCH3

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OO

OHO

O

OH

OCH3

H3CO

OCH3

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114,6

160,7

56,3

55,5

158,5

116,0

129,6

56,2

OO

OHO

O

OH

OCH3

H3CO

OCH3

OH

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59,284,5

198,2

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166,4

99,3165,6

132,0

84,5

198,2

108,6 164,6

96,6

166,4

99,3165,6

122,5

129,2

114,6

160,7

55,7

55,3

155,6

115,3

128,3

55,3

54 55

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96

95

114,5

116,5

7942103,5

94,5

114,5

115,5

118

196,3161,6

164,6

161,1

101,6

129,5 145,2145,8

O

OH

OOH

OHOH

O

O

OH

OH

OH

OH

O

O

O

O

OCH3

OH

OH

OH

OH

OH

H

H196,7

196,848,282,4

164,4

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165,5

96,1

168,5

97,4

164,3

102,8

130,2

130,8

116,6 162,1

55,9

56 57


28

O

O

O

O

OCH3

OH

OH

OH

OH

OH

H

H196,0

198,550,882,9

165,1

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168,3

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165,4

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128,6114,7

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96,0

168,2

97,1

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105,0

130,1

128,5

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55,7

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166,3

96,0

163,6101,4

196,5

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128,0

128,7

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165,1

101,4

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195,6

130,8

126,8

113,6

158,9

55,1

42,6

O

O

OCH3

OH

OH

O

OOH

OH

OH

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78,542,1

196,2

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101,8

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125,6

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115,7

130,2

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O

OH

OH

O

OH

OOH

OH O

OH

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OOH

OH O

OH

O

O

O

OH

OH 60 61

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103,2 165,396,9

167,4

95,9164,2

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129,0159,2

117,4

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OH O

OH

O

O

O

OH

OH

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42,4

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166,8

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115,1

128,0

121,0

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102,0

164,7

95,1 160,1

129,0

127,3

115,6160,1

O

OH

OOH

OH

O

OH

OH

OH O

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129,1

97,0

167,0

43,5

O

OH

OH

O

O

O

O

OH

OH

OH

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197,4

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O

O

O

OH

H3CO

OHO

OH

OCH3

O

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29

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196,7

106,0163,1

97,8

164,7

164,9105,7 128,0

128,9 157,5

115,1

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

79,6

43,4

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165,2

96,9

167,3

95,9164,2 133,2

128,8

115,7

159,3

O

O

OOH

OH

O

O

OH

OH

OH

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198,1

103,4156,7

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129,6

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66 67

198,3

161,4

158,9

156,9

130,4

129,1

124,7

116,2

103,8

92,8

80,5

56,2

43,4

197,5

168,8

165,0

164,1

159,7132,9128,8

115,6

103,795,5

94,6

79,8

56,9

43,4

O

O

OH

H3CO

OHO

O

OH

H3CO

O

68 Biflavanonol

147,8

137,0176,9

165,0

95,5

167,1108,3

152,8

105,9 122,8

130,7116,3 160,4

93,4

103,8

186,3

165,697,9

170,2

96,2164,0

99,9

126,0130,3

115,9

159,0

O

O

O

O OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OOH

OH

OH

84,673,5

198,0

101,7165,0

97,4

168,4

96,4165,0 130,1

114,9

146,9143,9

127,2

123,0

69 70

O

O

OCH3

OCH3

OH

H3CO

OCH3

O

O

OCH3

OH

H3CO

OCH3

89,0

89,0

78,2

78,2

200,4162,9

104,9

161,3

92,3 158,5

102,7

102,7

122,7

130,3

114,5

162,2

200,5163,8

98,1

164,8

102,6156,7

121,7

108,8

146,4152,7

111,8

119,7

56,0

56,2

55,5

56,3

56,4

56,0

55,3

71 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

30

Biflavona

167,0

105,6

181,2

160,8

98,5

163,5

93,3 157,4

102,0

123,8

119,6

145,5149,0

113,2

121,4

O

OOH

OH

OH

OOH

OH

OOH

OH

163,8

102,4181,1

158,6

109,0

162,8

94,5156,5

103,3

120,7

128,2

115,8

161,2

181,6

166,3

106,2

161,2

98,6

163,6

93,1 157,3

102,8

123,7

119,7

144,2148,2

114,3

121,5

O

OOH

OH

OHOH

OOH

OH

OOH

OH

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161,8

93,3156,2

103,3

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113,3

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116,0

118,9

107,9

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93,0

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120,0

102,599,0

113,0

111,5

118,0

56,0

O

OCH3

OH

OOH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OHO

O

OH

OH

OH

OH

OH

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106,4

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161,1

98,6

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102,9

124,0

118,7

144,3

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114,6

120,5

163,8

102,4

181,1

160,398,3

161,4

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103,2

121,7

113,5

145,7149,4

115,5

118,9

74 75

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182,2

159,8

98,8

164,0

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102,8

124,0

129,6

115,2

161,5

164,4

103,0

181,6

162,9106,2

159,5

93,5157,3

104,1

121,4113,4

145,8

149,8

116,1

119,0

O

O

OH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

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174,0

160,8

96,5

161,5

94,9162,4

106,5

123,7

129,3

115,0

55,9

159,1

163,8

102,9

181,7

159,5106,1

159,3

93,3156,5

103,4

121,6113,4

145,8

149,7

116,1

119,0

O

O

OH

OH

OH

OH

OOH

OCH3 O

OH

76 77

O

O

O

OOH

H3CO

OH

OH

H3CO

OCH3

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180,5162,0

98,2

165,6

92,355,8

157,8

105,3

124,3

129,7

115,2

159,5

164,1

104,0

181,2159,0

105,5163,3

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158,0

105,0

122,9

128,0

114,4

162,7

55,4

O

O

O

OOH

H3CO

OCH3

OH

H3CO

OCH3

163,5111,8

180,2162,3

97,9

165,4

92,155,5

157,8

105,3

125,5

129,5

113,5

161,2

56,2

163,8

104,3

181,1159,5

105,5163,3

90,355,8

157,9

105,1

123,2

127,8

114,4

162,6

55,3 78 79

181,4

161,2

98,6

163,8

93,8157,1

103,5

121,0 125,5

129,7

158,5

116,1

127,2

163,6

102,9

O O

OHO

OH

O

OH

OH

OH

O H

163,4103,5

181,8

161,1

98,8

164,0

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103,8

122,4

130,3

122,6

160,6

111,7

127,9

55,8

163,7

102,9

181,7

158,9

108,6161,4

93,4156,4

103,8

121,2

128,5

115,9

161,1

O

O

OH

OH

OHO

OCH3

OOH

OH

80 81


31

163,7

103,1

181,6161,4

98,8

164,1

94,0157,3

103,7

121,0

130,7120,5

160,8116,1

127,6

163,9

102,8

181,9

158,1109,3

162,990,6

156,8

104,6

121,1

128,5

116,0161,3

56,3

O

OH

O

H3CO

OHO

OOH

OH

OH

94,1

164,1

98,8

161,4103,9

157,0

181,7

163,4

103,3

122,3

128,0

111,8

130,2

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55,9

108,8161,5

93,6156,4

103,7158,7

182,0

103,4

164,0

122,6

115,8

162,4

55,6

128,3

O

O

OCH

OH

OH

O

OOH

OH

OCH3

3

82 83

163,7103,7

181,8

161,1

98,2

165,2

92,7157,4

104,8

122,2

130,3

122,7

160,8

111,8

128,0

55,9

56,1

163,7

102,8

182,0

158,9

108,6161,2

93,5156,4

103,4

121,2

128,5

116,0

161,1

O

O

OH

OH

OHO

OCH3

OOH

H3CO

163,5

103,2

181,8

161,4

98,9

164,2

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103,8

122,2

130,2

122,5

160,5

111,8

128,0

55,9

182,0

164,0

103,6

157,9

109,1

162,8

90,8156,4

104,6

121,1

128,6

116,0

161,356,4

O

OH

OH

H3CO

OO

OH

OH

OCH3

O

84 85

163,3

103,8

181,7

161,4

98,8

164,1

94,1157,3

103,5

122,4

130,2

122,1

160,5

164,0

103,1

181,9

157,9

90,8162,7

103,5

156,9

104,6

121,1

128,6

116,0

161,356,4

O

OH

O

H3CO

OH

O

OOH

OH

OCH3111,7

128,0

55,8

92,8

165,0

98,3

161,1104,7

157,3

181,8

163,6

103,5

122,3

128,0

111,8

130,3

160,6122,656,1

55,9

108,7161,3

93,5156,4

103,8158,8

182,0

103,7

163,9

122,8

114,6

162,355,5128,2

O

O

OCH3

OH

OH

O

OOH

H3CO

OCH3

86 87

O

OH

OH

OH

OH

O

OOOH

OH

OH

163,7

102,7

181,7

161,198,7

164,0

93,8 157,3

103,4

121,0

121,9

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145,7

111,6

164,0

102,7181,5

159,1

109,0

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156,3

103,6

121,2

128,4115,9

161,4

163,3

103,7

181,7

161,7

98,8

161,4

94,0157,4

103,7

122,4

130,9

121,6

160,4

111,7

128,0

55,9

163,5

102,6

182,0

160,6

98,5161,7

103,6

154,3

103,6

121,2

128,2

116,1

161,056,4

O

OH

O

OH

OH

O

OOH

OH

OCH3

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165,0103,2

183,3

103,9161,599,7

166,7

94,8158,4 121,6

128,6

121,3

159,4

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165,799,7

162,8

128,8164,7103,1

115,2

162,3

104,1

O

OCH3

OH

OH O

O

O

OH

OH

OH133,1

117,7

121,6

55,7

O

O

O OH

OH

O

OH

OH

OH

OH OH

OH

167,1

108,9

181,6160,4

98,6

163,4

103,1 154,6

102,7

125,5

119,1144,4

147,0

113,9118,7

90 91


32

O

O

OOH

OH

OH

O

OHOH

OH

OH

OH

163,9

102,9

181,9

161,498,7

164,0

93,8 157,3

103,6

120,6

122,2

120,0148,2

145,5

112,1

164,0

102,5

181,5

160,498,6

161,7104,0

154,5

103,6

121,8

118,6

115,5

149,4

113,7

145,8

O

OOH

H3CO

OCH3

O

OOH

H3CO

OCH3

95,6

95,2

99,4104,9

102,8

104,2

103,4

161,2104,2

111,4

114,6

121,8

122,0 123,6

127,9

128,2

131,3

155,8

158,2

160,9

162,7

161,8

162,3

163,6

164,4

165,0

183,4

182,6

92 93

O

OOH

H3CO

OH

O

OOH

H3CO

OCH3

92,4

95,2

98,2102,8

103,5

104,4

104,6

162,5105,5

111,2

116,1

121,8

122,0 123,2

127,8127,9

130,9

154,2

157,7

160,6

161,0

162,0

162,3

164,1

164,3

165,4

182,3

182,8

55,7

55,8

56,2

O

O

O

OHO

OH

O

OH

OH

OH

CH3

CH3

165,4

104,5

183,7

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29,0

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121,2161,6

117,7128,9

132,9165,1

104,2

183,3

122,8 117,4

163,4

129,4163,7

100,6

166,4

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105,5

94 95

165,1

104,4

183,1

105,4163,4

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164,8

94,8 158,9123,5

133,0

120,5

162,1

112,6

129,4

165,0

103,8

183,5

103,9164,9

112,7

159,8104,4

154,1

123,5

129,1

116,7

161,7

123,3131,8

26,0

22,5

O

OOH

OH

OH

CH3

CH3

O

OOH

OH

OH

165,3103,8

183,2

105,7163,1

98,7

166,5

93,2158,7

123,1

132,5

160,2

117,4

128,856,3

120,6

165,2104,3

183,6

105,8157,0

106,1

157,8 106,0

155,3

116,0129,3

79,2

28,4

28,6

123,1

129,2116,8

162,0

OOCH3

CH3

O

OH

OH

O

OH

OOH

H3CO

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165,1103,7

183,1

104,8163,4

99,8

164,8

94,8158,9

122,4

132,0

124,0

161,9

112,3

129,3

56,3

165,0104,7

183,6

105,4156,9

106,0

157,6 105,7

155,0

116,0129,2

79,2

28,5

28,6

123,1

129,0

116,8

161,7

OOCH3

CH3

O

OH

OH

O

OCH3

OOH

OH

O O

O

CH3

CH3

OH

OCH

O

OOH

H3CO

OH

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104,5

183,5

106,3163,3

99,0

166,8

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132,8

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117,7

129,1

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183,0

106,0157,3

106,5

158,2104,7

155,6

116,2129,6

79,4

28,7

28,9

124,5

129,2

115,6

164,0

56,6

56,2

98 99


33

165,4

104,4

183,2

105,6163,5

100,0

165,2

95,0 159,1123,4 121,9

160,5

117,7

128,8

19,0

132,8

165,1

103,8

183,7

105,3160,4

110,9

162,6105,3

154,8

123,5

129,3

116,9

162,0

77,1

148,2

30,0

110,8

O

OOH

OH

OH

CH2

CH3OH

O

OOH

OH

OH

O O

O

CH3

CH3

OH

OH

O

OOH

H3CO

OCH3

165,3

104,0

183,5

106,2163,4

99,0

166,9

93,6 159,0123,4

132,3

122,7

162,1

112,6

129,4

165,3

104,0

183,8

105,8157,1

106,3

157,9105,1

155,2

116,2129,5

79,4

28,7

28,9

124,2

129,3

117,1

162,2

56,7

56,6

100 101

163,1

104,8

182,5

105,0161,1

99,9

166,1

94,7157,7 125,1

124,8121,4

118,8

154,7 144,4

116,5

161,0128,4

125,8

163,4105,0

182,5

104,7161,1

99,9

166,1

94,7157,4

OO

OH

OH

OH O

O

OH

OH

O

162,9

104,9

182,4

104,1162,7

99,5

165,8

94,7158,2 124,7

125,3121,2

113,6

154,9143,3

161,3

55,1

116,2128,5

125,3

163,3105,1

182,4

104,1162,9

99,5

165,9

94,7158,2O

OH

OH

O

O

O

OCH3

OH

OH O

102 103

163,5

103,7

161,9109,2

166,494,5

158,0

104,2

121,1161,3

116,2

128,9

182,8

91,7

24,9

71,2

25,7

26,1

116,1

157,5

97,5

163,9102,8

181,8

161,593,5

120,9128,5

161,3

104,1

164,2

O O

OH

OHO

O

O

OH

OCH3

CH3

OH

163,1

103,9

181,7

161,3

98,9

162,2

94,0 157,1

103,8

124,1

128,3

115,3

161,4

O

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

164,2

102,6182,1

153,1

124,7 157,3

104,1

121,1

128,5

116,0

160,6

94,6

153,7

104 105

O

O

O

O

OH

OH

O

OH

OH OH163,3

103,7

181,6

161,2

99,2

162,9

94,0 157,2

103,6

124,6

128,0

115,5

161,4

164,2102,8

181,7

156,9

98,9157,7

120,7 148,9

104,0

121,1128,4

115,8

160,9

O

O

H3CO

OH O

O

OH O

O

OH

H163,5

161,6

165,4

157,9

104,2

124,6161,2

104,498,2

92,9

128,8

115,7

163,5

181,8

157,4156,9121,4

149,1

103,1

120,9

161,4

103,1

99,4

128,2

116,1

56,2

106 107


34

O

O

H3CO

OH O

O

OH O

O

OCH3

H163,5

182,1

161,6

165,4

157,9

104,2

124,6161,2

104,498,2

92,9

128,8

115,7

163,1

181,8

157,4156,9121,4

149,1

103,1

120,8

162,1

103,1

99,4

128,1

114,6

55,8

56,2

O

O

O

O

OH

OCH3

H3CO

OH

OH

OH

164,4

103,7181,2 159,5

102,8166,7

94,1157,2

104,3

121,2

128,3

116,2

161,7

163,6

103,7182,5161,2

102,5

163,2

95,5154,2

102,2

120,9

128,3116,2

162,2

56,5

56,5

108 109

O

O

OCH3

OH

OH

O

OH

O

OH

OH

165,0

105,6

183,5161,8

162,9

95,0158,6

104,6

123,6

129,1

124,5 56,1

164,2

164,7

105,2

183,2

161,7

103,9

156,6

104,0

103,9

128,9

116,8

161,8

104,6162,9 100,1

O

O

OCH3

OH

OH

O

OCH3

O

OH

OH

163,5

103,9

182,5160,199,7

162,8

94,0157,2

104,1

123,4

128,8

123,5

56,0163,7

163,3

103,7

182,3

161,1

99,899,2

155,3

104,0

123,4

128,3

123,5

163,556,0

110 111

OO

O

OH

OH OCH3

OH

H3CO

O

OH

163,2

102,2

181,6161,2

107,5

170,396,2

157,2

102,2

121,8

128,8116,4

159,1163,2

102,7

182,2

161,4

101,5

169,6

102,5

154,8

101,7

122,0

128,5

116,1

160,7

56,5

56,5

182,4

163,9 162,6

161,4

161,2

155,2

128,1

121,5116,2

104,1

103,0 98,9

182,4

163,5

163,0

162,6

161,4

155,1

128,3

123,1114,9

104,2103,798,9

98,7

98,7

55,9

O

O OH

OH

OHO

OH O

OH

OCH3

112 113

99,8

76,469,6

77,0

60,6

73,2

163,0103,7

160,9

98,8

163,0

98,8 154,9

103,8

124,1160,2

116,6

127,7

182,1

O

O

O

OH

OH

OOH

OHOH

OH

O

OOH

OH

OH

163,5

102,6

182,1160,9

98,9

163,5

98,6154,8

103,7

121,3

128,0

115,8

161,1

99,8

76,4

77,0

60,6

73,2

162,9103,6

160,8

98,8

162,9

98,8 154,9

103,6

124,0160,2

116,6

127,6

182,0

69,5

O

O

O

OH

OH

OOH

OHOH

OH

O

OOH

OH

OH

163,5

102,6

182,0160,8

98,9

163,5

98,6154,8

103,6

121,1

127,9

115,8

161,0

114 115


35

Biflavonol

O

O

OH

O

OCH3

OH

OH

OO

OHOH

OH

OHOO

O OH

OH

OO

CH3

OH

OH

OO

OH

OHOH

OH

114,6 114,6

130,9 130,9160,9 161,1126,3 126,3

157,1157,1

134,2134,2

179,1 179,0

105,9 105,6161,5 161,5

98,5 98,5

164,6 164,6

93,493,4158,5 158,5

103,1

74,3

75,7

67,1

76,670,1

100,9

70,8 70,6 72,4

68,6 16,4104,0

71,573,6

73,9

68,2

65,9

100,4

69,971,572,5

16,6 68,2

116

O

OOH

OH

OH

OCH3

O

OOH

OH

OCH3

OH

146,3135,7

176,3

158,4

97,8

162,1

104,5 153,8

102,9

30,7

123,6

129,2

113,9

160,3 55,3

117 Bi-isoflavona

111,5

61,0

194,7

165,3

97,3

167,1

95,9160,9

100,9 116,3

161,499,2

156,6

110,5128,1

156,3

122,1

181,9163,6

100,0

165,2

94,5

159,0

105,9

110,7

157,8

104,8

160,6

120,3

132,7

O

OH

OH

O

OHOH

O O

OH

OH

O

OH

118 Chalcona-flavana

OH O

OH

OCH3

OH

OH

43,137,2

29,4

78,8

31,3

25,7

113,6

129,2126,3

154,6

103,8154,0

134,4157,9

116,0

128,3123,2

159,4

99,7

157,3

107,4

130,9

138,1

129,9

115,4

155,8

55,6

OH O

OH

OCH3

OH OH

43,037,0

29,4

70,6

35,9

30,5

113,2

129,6126,1

154,6

103,3155,7

130,8

156,5

115,8131,7

123,2

159,4

99,7

157,3

107,4

130,9

138,2

115,4

155,8

55,6

37,9

129,8

119 120

OH OOH

H3CO

OH

OCH3

OH

43,237,2

29,4

78,6

31,4

25,4

113,7

129,3126,3

154,8

103,7154,6

136,5148,5

112,5

118,4

147,4

114,2123,2

159,6

99,7

157,4

107,5

131,0

138,1

130,0

115,6

155,9

55,6

56,4

121 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

36

Chalcona-flavanona

154,8113,2

197,1

103,3

156,3

116,1

166,3

103,4

166,3

109,1

136,7

121,7

129,6

116,6159,5

163,5

99,4

157,7

188,2

129,1158,6

131,0

115,4

116,1

80,9

45,0OH

O

OOH

OH O

O

O

OH

H

OH

OH O

O

OH

OH

OH

O

114,5

167,5

103,8

165,6

108,8133,1

192,8

118,4

145,1

124,8

133,8

130,3158,5

116,7

130,4

115,2

164,4

103,7

165,4

111,4

130,1

191,4

55,983,9

127,6 129,8

115,8

158,8

122 123

OH

OH O

OH

O

O

OH O

OH

H

107,9

132,4

113,7

166,8

103,0

164,8

191,0

117,6144,2

126,8

129,8

115,8

157,9123,1

133,4

157,7

115,0

129,2

129,1

82,5

54,3

197,0 102,2

163,5

95,0

166,496,2

164,8

107,9

132,4

113,6

166,9

103,5

164,7

191,8

117,7144,1

126,8

129,8

115,8

157,8122,8

133,4

157,8

115,0

129,2

128,982,7

54,3

197,6 102,8

163,2

95,6

166,4

97,0

165,8

OH

OH

OH O

OH

O

O

OH OOH

OOHOH

OH

100,3 77,1 61,6

70,276,8

73,6

124 125

Chalcona-flavonol

OH

OOH

CH3

H3CO

OOH

OH O

OCH3

156,1

140,2

179,8

162,6

101,1

163,2

107,9

155,7

105,7

18,8

124,6

130,7

114,8

162,1

143,5129,8

126,8

31,847,5

207,2

110,1161,7

114,3165,3

109,0

163,29,4

61,0

60,9

130,0

OH

OOH

CH3

H3CO

OOH

OH O

OH

OCH3

146,8

136,7

176,9

160,1

98,9

162,1

106,2

155,1

104,6

17,5

124,6

130,7

114,8

162,1

142,7129,2

126,7

31,447,3

207,3

108,9

159,2

112,8164,4

110,5

160,49,2

55,861,1

129,3

126 127

OH

O

O

OHH3CO

CH3

OH

OH

OH O

OCH3

155,1139,6

165,4

101,2

161,3

108,0 154,9

103,7

18,6

131,1

129,4

130,2

132,5

133,8

130,2114,7

30,9

47,7

207,7

110,0161,0

114,4164,9

106,3

163,08,7

60,3

60,4

178,9

O

OOH

OH

OH

OCH3

OH

OOH

H3CO

CH3

146,4135,7

176,3

158,3

97,9

161,8

105,5 153,7

103,0

30,3

123,5

129,5

113,8

160,3 55,3

141,5128,3

125,9

46,2

206,3

108,9158,3

112,3

163,5

108,2

159,0

60,1

9,2

30,3

128 129


37

OH

O

O

OHOCH3

H3CO

CH3

OH

OH

OH O

OH

146,9136,9

176,9

160,3

98,9

162,0

106,9 155,1

104,6

17,4

124,5

130,2

114,8

162,0 55,7

133,2

130,1115,9

30,6

47,7

207,6

108,9159,3

112,7164,4

110,5

160,89,1

61,0

OH

O

O

OHOCH3

H3CO

CH3

OH

OH

OH O

OCH3

155,0138,7

178,7

165,0

101,3

161,3

108,2 154,8

103,4

18,8

124,8

131,0

114,7

161,0 55,4

134,0

130,2115,9

31,0

47,7

207,7

110,2162,3

114,7163,0

105,4

163,08,7

60,2

60,3

130 131

Flavana-Flavanonol

78,030,4

20,1105,2

154,3

92,1

158,1

108,3

159,7

133,8

127,9

116,2

159,9118,782,4

194,4

100,1

161,2

95,8

OO

OO

OH

OH

OH

OH

OHOH

163,4

97,5

165,5

126,4

129,8115,8

168,4

77,929,3

20,4105,6

154,4

92,2

158,1

108,5

159,7

133,2

128,4

116,1

159,9118,982,2

194,4

100,1

161,1

95,8

OO

OO

OH

OH

OH

OH

OHOH

163,3

97,5

165,4

126,4

129,8115,9

168,4

132 133

OO

O

H3CO

O

O

OCH3

H3CO

OCH3H3CO

78,428,9

17,5112,2

187,3

101,9

167,984,9 167,5

132,2

126,2113,5

163,3

90,779,9

184,7

102,2

162,6 94,3

160,3

94,0158,9

123,6129,1

113,7

158,1 56,4

56,0

55,3

55,3Artificialmente metilados

OO

O

H3CO

O

O

OCH3

H3CO

OCH3H3CO

78,327,9

17,2112,8102,0

168,184,9 167,4

131,7

126,3113,7

163,2

91,079,9

184,6

102,1

163,2 94,0

162,3

93,9159,0

123,7128,9

113,7

157,9 56,4

55,9

55,3

55,5

134 135

OO

O

OH

OH

OH

O

OH

OHOH

78,0

30,4

20,1105,2

154,392,1

158,1

108,3

159,7

133,8

127,9116,2

159,9

118,782,4

194,6

100,1

161,2

95,8163,4

97,5

165,5

126,4

129,8115,8

168,4

OO

O

OH

OH

OH

O

OH

OHOH

77,9

29,3

20,4105,6

154,492,2

158,2

108,5

159,7

133,2

128,4116,2

159,9

118,982,2

194,4

100,1

161,1

95,8163,3

97,5

165,4

126,4

129,8

168,4

115,9

136 137


38

Flavana-flavona

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

76,5

29,018,9

100,4155,8

94,9

154,2

98,9 154,2 132,2

127,1114,8

156,7

162,0

113,3181,6

103,3

161,8

98,5

164,093,3

157,3

123,9

129,8114,9

159,4

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

76,4

29,318,7

100,6156,0

95,0

153,9

98,8 155,0 132,6

127,0115,1

156,9

162,1

113,3181,8

103,5

162,1

98,7

164,493,5

157,6

124,0

130,3115,2

159,9

138 139

Flavanol-Flavanonol

OO

O

OH

O

O

OH

OH

OH

OHOH

82,366,6

27,0109,6

186,9

100,8

169,185,3 157,2

128,3

127,7114,8

158,5

90,280,0

191,1

100,2

163,8 97,3

168,1

96,5160,6

122,4130,2

115,0

158,6

OO

O

OH

O

O

OH

OH

OH

OHOH

82,165,3

25,5109,9

187,0

101,1

169,184,9 157,2

128,2

127,8114,9

157,9

90,780,3

191,0

99,6

163,397,1

167,8

96,1160,8

122,3130,1

114,9

158,7

140 141

82,268,1

28,7103,9

159,9

92,5

161,4

108,0

153,4

131,1

129,1

116,1

158,3118,982,2

194,5

100,0

165,5

97,6

OO

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

168,4

95,7

163,4

126,4

129,8115,9

159,9

82,367,7

28,9104,3

159,9

92,4

161,3

108,1

153,7

130,8

129,6

116,0

158,4118,882,2

194,1

100,1

165,4

97,5

OO

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

168,3

95,8

163,3

126,4

129,8115,9

159,8

142 143

Flavanol-flavona

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

80,8

66,427,2

99,2156,2

95,3

153,8

98,7 154,4 130,4

128,3114,8

157,0

162,5

113,4182,0

103,5

162,1

98,7

164,393,5

157,6

124,0

130,4115,1

159,7

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

80,8

66,627,7

99,0155,6

95,0

152,6

98,3 154,9 129,9

127,9114,5

156,5

161,6

112,8181,2

103,0

161,5

98,7

164,693,4

157,2

123,7

129,9114,9

159,5

144 145


39

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

27,5

66,380,7

93,8

95,2

98,9

99,0

99,4102,0

112,8

114,6

114,8

123,9

128,0

129,9

130,1

153,5

154,2

155,8

156,7

156,7

157,6

159,4

161,4161,6

181,0

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

28,1

66,880,9

93,9

95,1

98,7

99,5

99,0102,4

112,5

114,6

114,9

123,9

128,0

129,9

130,1

152,7

155,0

155,7

156,7

156,7

157,5

159,7

161,0161,5

180,8

146 147

Flavanona-Flavanonol

81,247,3

195,9101,1163,3

95,8

165,9

95,5162,4 127,9

128,1

114,5

157,2

159,5101,2

164,4

94,6161,7

82,471,7

127,2

128,3

114,5

157,2

99,8

196,6

O

OH

OH

OH O

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH80,047,3

196,4

104,0164,597,5

163,0

98,5 165,0 128,0

126,5

116,0

158,0

80,070,2

196,8

105,5164,0

97,8

164,0

165,5102,0 128,0

128,5

115,1

158,0

148 149

O

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

79,645,2

194,5

105,7160,297,5

160,7

96,6 162,7 125,9

126,9

115,8

155,7

80,870,0

106,0161,7

97,8

164,6

164,4101,2 126,1

124,4

142,8

158,0

118,4

118,4

O

O

OH

OCH3

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

82,747,3

197,4

105,5166,4

101,3

164,6

101,8 163,7 129,8

128,8

114,8

157,7

82,770,1

196,5

106,0163,1

97,8

162,7

162,4105,7 126,7

128,8

140,5146,2

114,8

111,8

55,6

150 151

84,147,3

163,0

96,3

166,6

95,2162,4

101,2

127,3158,0

115,0

129,4

196,8

160,4

96,3

81,471,9

197,8

162,4

99,9

163,8

127,9107,0

145,9

133,8

101,2

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

83,447,1

163,0

96,3

166,6

95,2162,4

101,5

127,5158,0

115,2

128,8

196,8

160,4

96,3

81,772,2

197,8

162,4

100,4

163,8

101,5

127,9107,0

145,9

133,8

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

152 153


40

O

O

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

H

164,096,0

167,7

97,0

164,7101,4

197,9

73,1

83,9

132,1

130,3

116,9

159,4 143,2122,3

130,4

126,3

117,8

150,6

83,8

73,0

197,9

101,4

164,7

97,0

167,796,0

164,0

154 Flavanona-flavona

O

OH

OH

OOH

OH

O

OOH

OH

OH

OH166,7

106,2

181,3161,2

98,6

163,8

93,3157,3

103,3

124,0

120,2

144,2148,2

113,8

119,9

78,1

42,3

195,9162,6

95,7

162,6

104,2 160,0

101,5

129,3

113,9

144,9145,2

115,1

117,1

O

O

OH

OH

OHO

O

OH

OH

OH

OH

OH

77,1

44,5

196,0

163,6

95,6

166,5

94,7163,1

101,5

129,4

118,4

143,6

145,2

114,8

117,1

163,6

102,5

182,0

160,398,5

161,7

103,8 154,9

102,1

121,7

113,6

145,6149,6

115,6

118,6

155 156

O

O

O OH

OH

O

OH

OH

OH

OH OH

OH

OH102,6

48,7

194,3

160,8

94,5

164,3

104,1 156,7

100,2

129,4

119,6144,7

145,3

113,7119,9

108,6

168,0

182,0

158,2

98,5

162,4

103,8154,8

103,1

126,4

118,3144,4

146,7

113,1117,4

OH

O

O OH

OH

O

OH

OH

OH

OH OH

OH

O200,0

55,3

195,2

162,2

95,0

165,3

105,1 149,3

100,5

132,1

120,9144,7

145,8

114,5122,5

109,0

168,4

182,3

160,0

98,5

162,5

104,1155,1

103,7

127,1

118,3144,4

147,0

113,6117,4

157

166,896,2

163,9

95,2

162,9101,5

195,5

128,6

128,5

114,2

157,1

80,948,5

104,4

157,7

102,5

159,8105,2

154,5

182,1

164,1

102,5

120,6

129,0

116,1

161,5

129,0

OHO3SO

OH O

OHOOH

OH O

OH

166,696,3

164,0

95,4

163,0101,6

195,6

128,5

128,7

114,4

157,3

81,148,7

104,3

157,7

102,5

160,0105,3

154,5

182,1

164,2

102,6

121,0

113,6

145,8

150,0116,3

119,7

OHO3SO

OH O

OH

OHOOH

OH O

OH

158 159

78,5

42,0

196,3

163,9

95,7

166,6

94,9162,9

101,7

128,6 130,1

126,6

155,4

115,7

127,1

181,6

163,4

102,8

161,498,8

164,0

93,9157,3

103,7

120,6

129,8

124,9

159,3

116,4

127,2

O O

OHO

OH

O

OH

OH

OH

OH

94,6

164,7

99,5

161,8104,3

182,2

103,9

163,9

122,7

121,2

125,3

118,4

153,8

142,9

116,3

158,4128,8

132,8

78,6

42,4

196,8

102,3 163,4

96,6

167,1

95,6163,3O

O

OH

OH

O

O

O

OH

OH

OH

160 161


41

O

O

OH

OH

OH

O

O

O

OHH3CO

163,6

104,4

182,6104,6

162,3

99,8

164,7

94,9158,2

123,1

121,8143,2

154,3118,7

125,7

79,142,9

197,5

103,5

164,095,6

168,3

94,7

163,6

133,0

129,2

116,6

158,9

56,8

79,4

43,4

197,3

103,7165,195,5

168,8

94,6 163,9 132,1

121,5

142,7

150,6118,4

125,556,0

164,4

105,0

183,0

105,3 163,399,8

164,9

94,8158,8

125,9

129,1162,1

117,4OH3CO

OH O

OH

O

O

O

OH

OH

162 163

79,542,8

197,2

104,5163,199,5

166,1

94,7161,7 130,7

115,8114,4

118,8

129,1

159,1

159,496,4

157,695,7

165,2

128,9164,5103,3

116,6

162,0

106,4

182,9

122,2O

OH

OH

OH O

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH O

78,8

42,1

196,3

163,1

95,7

166,6

94,9163,0

101,8

127,5

120,7

145,0

148,6112,2

121,4

163,5

102,6181,6

159,0110,3

156,2

94,0

121,4

128,3

115,9

161,0

163,0

102,6

164 165

163,7103,6

181,9

161,1

98,2

165,2

92,7157,3

104,8

122,1

130,4

122,7

160,9

111,7

127,9

55,8

56,1

78,3

41,9

196,6

160,9

105,4164,3

94,5161,9

101,5

128,9

128,4

115,2

157,8

O

O

OH

OH

OHO

OCH3

OOH

H3CO

163,6103,7

181,9

161,1

98,1

165,2

92,7157,3

104,7

122,2

130,2

122,4

160,8

111,7

128,056,0

78,6

41,9

197,1

159,6

106,1165,0

91,5162,9

102,3

128,7

128,4

115,2

157,856,3

O

O

OH

H3CO

OHO

OCH3

OOH

H3CO

166 167

80,842,3

196,6

102,1168,098,4

168,2

98,0164,5 128,6

132,1

121,2157,5127,3

118,8

158,8105,9

163,7100,4

161,6

128,2163,1103,2

114,4

162,5

103,4

183,4

124,0

56,7

O

OCH3

OH

OH O

O

O

OH

OH

OH

78,6

42,1

196,7

102,5163,1

94,6

167,3

93,6162,9 128,5

131,2

118,6155,9

115,4

127,855,7

105,7

162,695,3

161,0 104,0

153,4 163,9

102,3

182,3

121,2

128,3

115,7

161,1

56,2

OH3CO

OH O

OHO

O

OH

H3CO

OH

168 169

O

O

OOH

OH

OH

O

OHOH

OH

OH

78,2

42,1

195,3

163,195,5

166,2

94,7 162,6

101,6

128,6

120,9

119,2145,1

143,9

112,8

163,4

102,1

181,6

160,598,4

161,4

104,5

154,2

103,5

121,3

127,7

115,4

160,0

78,6

42,3

196,7

102,5163,1

94,6

167,3

93,7162,8 129,6

131,3

111,1

128,155,9

55,6

120,6

157,3

162,298,6

104,5

160,4 103,6

154,4 163,7

102,8

182,1

121,4

128,4

115,8

161,1

OOH

OH O

OHO

O

OCH3

H3CO

OH

170 171 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

42

O

O

OOH

OH

OH

O

OHOH

OH

OH

OH

78,2

42,1

195,4

163,195,5

166,2

94,7 162,6

101,6

128,5

120,8

119,2145,1

143,9

112,8

163,6

102,1

181,5

160,098,4

161,5104,6

154,2

103,5

121,8

118,4

115,4

149,1

113,5

145,2

78,5

42,2

196,6

102,4163,2

94,6

167,2

93,6162,8 129,7

131,3

120,5

157,2

111,0

128,0

162,595,4

55,8

56,2

55,5

105,5

161,1 103,9

153,5 163,8

102,4

182,3

121,3

128,3

115,8

161,2

OH3CO

OH O

OHO

O

OCH3

H3CO

OH

172 173

181,9

163,1

103,8

124,1

128,4

115,1

160,8

157,3

103,7161,198,2

165,2

92,756,1

160,1

122,5

92,5160,1 153,9

102,6

197,5

79,0

41,9

128,7

128,4

115,2

157,856,7

O

OH

OOH

H3CO

O

O

O

H3CO

OH

79,1

42,0

197,7

157,8

122,5160,1

92,5153,9

102,6

128,6

128,5

115,2

160,256,7

O

OH

O

H3CO

OHO

O

OOH

OH163,1

103,9

161,4

98,9

164,3

94,0157,3

103,8

124,2

128,4

115,0

160,8

174 175

163,0

79,2

43,4

196,2

106,3153,9

126,6

159,1

91,9154,7

132,9

129,0

115,5

159,156,6

165,1

103,8102,5

162,2

105,0166,2

95,0161,3

121,9128,6

7,6

116,9

O

OOH

CH3

OH

O

O

OOH

H3CO

OH

176 Flavanona-Flavonol

80,947,6

163,2

95,9

166,1

94,7162,3

102,5

127,7156,8

114,1

127,4

153,5

97,6

195,3 146,6134,6

175,2

159,1

99,7

161,2

121,1128,5

114,8

158,5

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH101,3

OOH

OH O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH O

80,9

47,7

195,5

163,3

95,9

166,1

94,8162,4

128,8

127,6

114,2

156,9

146,5134,7

175,2

159,1

97,5

163,3

101,3 153,6121,5

114,7

144,5147,1

115,0

115,1

177 178


43

Flavanona-isoflavana

O O

O

OCH3

CH3

O

OH

CH3

CH3

OH

OH

OH

CH3

CH3

H

H

H

113,263,4

189,0

128,3124,6

164,0

103,4159,9

112,2

129,3

128,0

128,5

156,6115,5

125,5

28,2

122,9

133,1

17,8

25,9

28,6

122,7

133,4

17,7

25,8

111,293,550,4

131,9

111,6 159,4

106,8

152,3113,1

118,3 159,3

111,3158,4

110,2

123,

3

22,8

122,7 131,8

17,7

25,8

179 Flavanonol-Flavona

O

O

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

H

158,894,8

165,1

99,7

163,7105,0

182,9

105,2

164,7

130,5

129,1

117,4

162,1 142,3122,4

130,4

126,9

118,0

150,6

83,7

73,0

197,6

101,5

164,7

97,2

168,296,0

164,0

83,385,5

198,0

103,0167,5

97,0

164,2

96,0165,3

130,4

131,0

124,1162,0128,2

116,7

159,2

110,1

128,0

108,3

165,1

164,8

115,9

104,4106,8

158,6

183,0

130,0

124,0O

OH O

OHO

O

OH

OH

OH

OH

180 181

164,8

103,3

182,2

104,5162,6

98,8

163,5

93,8157,7 122,1

131,7

116,5

127,4

120,3155,1

104,8

163,996,4

160,8 100,9

163,4 83,272,2

197,8

122,1

129,1

114,9

158,0

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

182 Flavona-Flavonol

163,9103,9

182,0161,1

98,0

165,2

92,7157,4

105,0

122,5 122,1160,9

111,8

128,4

56,1

55,9

131,0

164,2

103,8

182,2

161,0

98,2

160,1

105,9 153,6

104,8

121,0128,2

116,1

160,6

99,7

73,076,769,7

77,2

60,6 OOH

OHOH

OH

O O

O

OH

OH

O

O

OCH3

OH

OH

H3CO

99,7 162,7103,6

161,3

99,7

160,2

94,7157,7

102,4

123,0

131,3

120,6159,8

111,4

127,976,769,5

77,1

60,6

73,3

181,2

55,8

163,6

103,3 182,3

160,9

98,0

160,8

105,2153,6

104,9

122,6

127,9

114,6

162,4

55,5

OH

O

O

H3CO

OH

OOH

OHOH

OH

O

O

OCH3

OH

OH

O

183 184


44

O

O

OCH3

OH

H3CO

OH

O O

OCH3

OH

OHO

164,6

103,6

183,0104,9

153,3

132,2

153,695,2

158,3122,1

129,3

116,8

162,0

164,6103,2

182,9

104,9153,3

132,2153,6

95,1

158,3

122,4

111,0

148,9

151,6

116,6

121,2

60,8

60,8

56,8

O

O

OCH3

OH

H3CO

OCH3

O O

OCH3

H3CO

OHO

164,6

104,4

183,4106,1

152,5

130,7

153,593,8

155,4124,2

128,4

114,9

163,0

164,5104,1

183,3

106,1152,5

130,7153,5

93,7

155,3

123,9

109,2

149,7

152,7

111,6

120,5

61,3

61,4

56,5

55,9

185 186

Flavona-isoflavona 111,9

58,8

193,3

165,2

97,5

167,0

96,3160,5

101,0 117,5

160,998,5

157,2

110,1128,2

O O

OH

OH

O

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

155,2

122,0

182,2

163,3

100,1

163,2

105,3160,1 104,4

159,9

108,1

132,8

106,2

110,3

157,8

159,2

100,0 165,1

94,9164,4

156,1

117,0

122,2

106,0

156,0

181,0

122,0127,2

O

OH

O

OH

OO

O

OH

OH

OH

165,0

105,1

183,0

105,2162,9

99,8

163,1

94,8 158,9 129,0

131,0

144,8149,1129,1

116,0

187 188


45

Tabela 1- Relação dos biflavonóides descritos na literatura, contendo os tipos de conectividade (conectiv.), as fontes botânicas (espécie), os solventes empregados para obtenção dos espectros de RMN e as referências correspondentes.

Biflavonóide Conectiv. Espécie Solvente Referência

Daphne odora 1-2 CD COCD TANIGUCHI et al, 1996 (3→8) 3 3

Pilotrichella flexilis 3 CD SOCD BRINKMEIER et al, 2000 (2’→6) 3 3

Cycas beddomei 4 CD COCD RANI et al, 1998 (3’→6) 3 3

Berchemia zeyheri 5-6 CDCl BEKKER et al, 2000 (3→9) 3

Aulacomnium palustre 7 CD SOCD HAHN et al, 1995 (5→5’) 3 3

Lophira lanceolata 8 CD COCD TIH et al, 1988 (α→α) 3 3

Ochna macrocalyx 9 CD COCD TANG et al, 2003 3 3

Lophira lanceolata 10-11 CD COCD TIH et al, 1990 3 3

Glycyrrhiza uralens 12 MeOD BAI et al, 2003

Lophira lanceolata 13 CD COCD TIH et al, 1989 (α→3) 3 3

Ochna afzelii 14-15 CD COCD PEGNYEMB et al, 2001 3 3

Ochna calodendron 16 CD COCD MESSANGA et al, 1994 3 3

Ochna afzelii 17 CD COCD PEGNYEMB et al, 2001 3 3

Lophira alata 18 CD COCD MURAKAMI et al, 1992 3 3

Ochna calodendron 19 CD COCD MESSANGA et al, 1994 3 3

Ochna calodendron 20-21 CD COCD MESSANGA et al, 1994 (α→5’) 3 3

Ouratea flava 22 CD COCD MBING et al, 2003 3 3

Dracaena cinnabari 23 MeOD MASAOUD et al, 1995 (β→3’)

Rhus pyroides 24 CD COCD MDEE et al, 2003 (3→3’) 3 3

25 (3→4) Luxemburgia octandra CD COCD CARVALHO et al, 2004 3 3

26 (3→5’) Rhus pyroides 3 3

27-28 3 3

29

(4→5’)

CD COCD MDEE et al, 2003

Rhus pyroides CD COCD MDEE et al, 2003

Rhus pyroides CDCl MASESANE et al, 2000 3

Rhus pyroides 30 CD COCD MDEE et al, 2003 (4’→5’) 3 3

Dorstenia prorepens 31 CDCl ABEGAZ et al, 2002 3

Calycopteris floribunda 32 CDCl MAYER, 2004 3

Calycopteris floribunda 33 CD SOCD WALL et al, 1994 3 3

Calycopteris floribunda 34-35 CDCl MAYER, 2004 3

Calycopteris floribunda 36 CDCl MAYER et al, 1999 3

37-38 Calycopteris floribunda CDCl3 WALL et al, 1994

39 Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER et al, 1999

40 Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER, 2004

41 Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER et al, 1999

42 Calycopteris floribunda 3 MAYER, 2004

43-44

(6→8)

Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER et al, 1999

CDCl


46

Biflavonóide Conectiv Espécie Solvente Referência

45-46 Vitis vinifera MeOD FOO et al, 1998

47

(2’→8)

Potentilla viscosa CD3COCD3 ZHANG et al, 1998

48-49 (4→4) Acacia melanoxylon CD3COCD3 FOO, 1989

50-53 (4→5) Acacia galpinii C6D6 BENNIE et al, 2002

54-55 (2→2) Ochna macrocalyx CD3COCD3 TANG et al, 2003

56 (2’→6) Pilotrichella flexilis CD3SOCD3 BRINKMEIER et al, 2000

57-58 (3→3) Wikstroemia indica MeOD NUNOME et al, 2004

59 (3→8) Garcinia livingstonei MeOD MBWAMBO et al, 2006

60 (3’→3’) Pilotrichella cuspidata CD3SOCD3 SEEGER et al, 1992

61 Ochna obtusata CD3COCD3 RAO et al, 1997

62

(3’→4’)

Ochna beddomei CD3COCD3 JAYAPRAKASAM et al, 2000

63 (3’→6) Schinus tebenthefolus MeOD KASSEM et al, 2004

64-65 (3’→7) Quintinia acutifolia CD3COCD3 ARYASENA, 2004

66 (3’→8) Lophira lanceolata CD3COCD3 TIH et al, 1989B

67 Cycas beddomei CD3COCD3 RANI et al, 1998

68

(4’→6)

Cycas beddomei CD3COCD3 JAYAPRAKASAM et al,2000b

69 (2→8) Vahlia capensis CD3COCD3 MAJINDA et al, 1997

70 (2’→4’) Pseudotsuga menzitsii MeOD FOO et al, 1992

71 (6→8) Ouratea multiflora CDCl3 FELICIO et al, 2001

72-73 (2’→6) Plagiomnium undulatum CD3SOCD3 RAMPENDAHL et al, 1996

74 Mnium hornum CD3SOCD3 BRINKMAIER et al, 1999

75

(2’→8)

Philonotis fontana CD3SOCD3 GEIGER et al, 1989

76-77 Aristolochia ridicula CD3SOCD3 MACHADO et al, 2005

78-79

(3→6)

Stephania tetrandai CDCl3 SI et al, 2001

80 (3’→3’) Homolothecium lutescens CD3SOCD3 SEEGER et al, 1993

81 Selaginella delicatula CD3SOCD3 LIN et al, 2000

82 Selaginella willdenowii CD3SOCD3 SILVA et al, 1995

83 Selaginella delicatula CD3SOCD3 CHEN et al, 2005

84 Selaginella delicatula CD3SOCD3 LIN et al, 2000

85 Dysoxylum lenticellare CD3SOCD3 HE et al, 1996



88

(3’→6)

Rhytidiadelphus squarrosus CD3SOCD3 SEEGER et al, 1990


90 Caesalpinia pyramidalis CD3COCD3 BAHIA et al, 2005

91 Bartramia stricta CD3SOCD3 GEIGER et al, 1995

92

(3’→8)

Plagiomnium cuspidatum MeOD ANHUT et al, 1989


47

Biflavonóide Conectiv. Espécie Solvente Referência

93-94 Araucaria angustifolia MeOD FONSECA et al, 2000

95 Calophyllum inophylloide C5D5N GOH, 1992

96 Calophyllum venulosum CD3COCD3 CAO et al, 1997

97-98 Calophyllum venulosum CD3COCD3 CAO et al, 2001

99-101

(3’→8)

Calophyllum venulosum CD3COCD3 CAO et al, 1997

102-103 Lonicera japonica C5D5N KUMAR et al, 2005

104

(4’→4’)

Origanum syriacum CD3SOCD3 EL-DESOKY et al, 2004

105-106 Lanaria lanata CD3SOCD3 DORA et al, 1991

107-108

(4’→8)

Ouratea semiserrata CD3SOCD3 VELANDIA et al, 2002

109 (6→6) Ouratea spectabilis CD3SOCD3 FELICIO et al, 1995

110 (6→8) Ouratea nigroviolacea CD3COCD3 MBING et al, 2006

111 (6→8) Ouratea nigroviolacea CD3SOCD3 MBING et al, 2006

112 (6→8) Ouratea spectabilis CD3SOCD3 FELICIO et al, 1995

113 Cupressocyparis leylandii CD3SOCD3 K.-BARANOWSKA et al, 1999

114-115

(8→8)

Juniperus communis CD3SOCD3 INATOMI et al, 2005

116 (7→7) Chimarris turbinata MeOD CARDOSO et al, 2005

117 (8→8) Pentagramma triangularis CD3SOCD3 ROITMAN et al, 1993

118 Lupinus albus MeOD SAKASAI et al, 2000

119-121

(β→6)

Dracaena cinnabarii MeOD MASAOUD et al 1995

122 (α→6) Ouratea flava CD3COCD3 MBING et al, 2003

123 Lophira lanceolata CD3COCD3 TIH et al, 1989

124-125

(3→3)

Ochna integerrima CD3COCD3 KAEWAMATAWONG et al, 2002

126-127 Pentagramma triangularis CD3COCD3 IINUMA et al, 1994

128 Pentagramma triangularis CD3COCD3 IINUMA et al, 1997

129 Pentagramma triangularis CD3SOCD3 ROITMAN et al, 1993

130-131

(3’→8)

Pentagramma triangularis CD3COCD3 IINUMA et al, 1997

132-133 Daphne odora CD3COCD3 TANIGUCHI et al, 1996

134-135

(2→8)

Daphne acutiloba CD3COCD3 TANIGUCHI et al, 1998

136-137 Daphne odora CD3COCD3 BABA et al, 1995

138-139

(3→8)

Wikstroemia sikokiana CD3SOCD3 BABA et al, 1994

140-141 Daphne genkwa CD3SOCD3 BABA et al, 1993

142-143

(2→8)

Daphne odora CD3COCD3 TANIGUCHI et al, 1996

144-145 Wikstroemia sikokiana CD3SOCD3 BABA et al, 1994

146-147 Stellera chamaejasme CD3SOCD3 FENG et al, 2003

148 Garcinia kola CD3SOCD3 HAN et al, 2005

149-151 Garcinia kola CD3SOCD3 KAPADIA et al, 1994

152-153

(3→8)

Gnidia involucrata CD3SOCD3 FERRARI et al, 2003

154 (3’→4’) Ouratea sulcata CD3COCD3 PEGNYEMB et al, 2005


48

Biflavonóide Conectiv Espécie Solvente Referência

155 (2’→8) Mnium hornum CD3SOCD3 BRINKMAIER et al, 1999

156 (2’→8) Philonotis fontana CD3SOCD3 GEIGER et al, 1989

157 (2’→8) Bartramia pomiformis CD3COCD3 SEEGER et al, 1991

158-159 (3→8) Rheedia acuminata CD3SOCD3 LI et al, 2002

160 (3’→3’) Homalothecium lutescens CD3SOCD3 SEEGER et al, 1993

161 Luxemburgia nobilis MeOD OLIVEIRA et al, 2002

162 Ochna integerrima CD3SOCD3 LIKHITWITAYAWUID, 2001

163

(3’→4’)

Ochna obtusata CD3COCD3 RAO et al, 1997

164 Caesalpinia pyramidalis CD3COCD3 BAHIA et al, 2005

165 Plagiomnium undulatum CD3SOCD3 RAMPENDAHL et al, 1996

166-167

(3’→6)

Selaginella delicatula CD3SOCD3 LIN et al, 2000

168 Cycas beddomei CD3COCD3 DAS et al, 2005

169 Amentotaxus yunnanensis CD3SOCD3 LI et al, 2003

170 Bartramia pomiformis CD3COCD3 SEEGER et al, 1991


172 Plagiomnium cuspidatum MeOD ANHUT et al, 1989

173-174

(3’→8)

Selaginella delicatula CD3SOCD3 CHEN et al, 2005


176

(4’→6)

Cephalotaxus wilsoniana C5D5N KUO et al, 2002

177 Garcinia kola CD3SOCD3 TERASHIMA et al, 1995

178

(3→8)

Calophyllum panciflorum CD3SOCD3 ITO et al, 1999

179 (3→4) Glycyrrhiza glabra CD3COCD3 LI et al, 2000

180 (3’→4’) Ouratea sulcata CD3COCD3 PEGNYEMB et al, 2005

181 (3’→7) Lophira alata CD3COCD3 TIH et al, 2006

182 Aristolochia contorta CD3COCD3 YU et al, 2005

183-184

(3’→8)

Ginkgo biloba CD3SOCD3 HYUN et al, 2005

185-186 (7→7) Lippia alba CD3COCD3 BARBOSA et al, 2005

187 (3→8) Lupinus albus MeOD SAKASAI et al, 2000

188 (3→7) Lophira alata CD3COCD3 TIH et al, 2006


49

3.2.2 Aspectos Estereoquímicos

Atropisomerismo

O espectro de RMN 13C de um biflavonóide costuma provocar dubiedade na sua

interpretação devido ao elevado número de sinais, levando quase sempre o espectroscopista a

suspeitar de que a amostra é uma mistura de flavonóides monoméricos. Evidentemente que

um simples experimento de espectrometria de massa seria suficiente para dirimir esta dúvida.

Entretanto, a análise se torna substancialmente complexa quando ocorre pareamento dos

sinais, em virtude da presença de atropisômeros.

Atropisômeros (grego: a= não; tropos= giro, rotação) são estereoisômeros

conformacionais cuja quiralidade é atribuída ao impedimento na rotação em torno de uma

ligação simples, devido à existência de grupos volumosos. Os exemplos clássicos são as

bifenilas. Em 1983, M. Oki definiu arbitrariamente as condições de atropisomerismo:

isômeros separáveis com meia-vida de pelo menos 1000 s (16,7 min), não importando o valor

da barreira energética, a qual varia com a temperatura (ELIEL et al., 1994).

O atropisomerismo em biflavonóides é bem freqüente em estruturas cujas unidades

estão interligadas através dos carbonos C-3→ C-8” (Ex.: estruturas 59, 129-139, 144-153,

158-159, 177-178 e 187), tão comum que passou a ser característico para este tipo de

biflavonóide (HAN et al., 2005), muito embora este fenômeno também seja observado em

estruturas conectadas pelos carbonos (C-8→ C-8”) (Ex.: 114 e 115) (INATOMI et al., 2005).

162,095,0

166,3

96,0

163,6101,4

196,5

47,381,2

128,0

128,7

114,6

157,5

162,6

95,2101,4

165,1

101,4

159,6 78,0

195,6

130,8

126,8

113,6

158,9

55,1

42,6

O

O

OCH3

OH

OH

O

OOH

OH

OH

C-3C-8"

59

Em geral, um experimento realizado sob aquecimento a 90 °C simplifica o espectro

devido ao desaparecimento das linhas espectrais duplicadas, facilitando a elucidação

estrutural. Em alguns casos, como o da garcianina (177), os experimentos são efetuados a

150 °C (TERASHIMA et al., 1995).


50

HAN et al (2005) realizaram um monitoramento do comportamento rotamérico por

espectroscopia de RMN 13C de uma amostra do biflavonóide GB-1 (148), obtido de Garcinia

kola, em diferentes temperaturas (-50, -30, 21, 23 e 90 °C). À temperatura ambiente (21 e 23

°C), foram observados sinais pareados referentes à mistura de rotâmeros. Entretanto, em

extremos térmicos (-50 e 90 °C) foi constatada a existência de apenas um conjunto de sinais.

Este estudo, denominado de RMN dinâmica, foi desenvolvido com diferentes solventes

deuterados (DMSO, piridina e acetona), sendo em todos observado o mesmo comportamento

(Fig 8, p. 53).

Estudos de RMN dinâmica permitem uma boa compreensão sobre a restrição na

rotação da ligação entre os anéis C-I (C-3) e A-II (C-8”), originado do impedimento estérico

de substituintes aromáticos, os quais restrigem a rotação em torno desta ligação. Desta forma,

à temperatura ambiente coexiste um par de confôrmeros, em razão da lenta interconversão

causada pela elevada barreira energética, resultando num espectro de RMN mais complexo,

cujos sinais aparecem dobrados. Entretanto, à medida que se eleva a temperatura, observa-se

que os sinais duplos tendem a se aproximar (alargamento dos picos), coalescerem (pico único

alargado) e por último obtem-se um sinal simples cuja absorção corresponde a uma freqüência

central às duas existentes anteriormente. Isto acontece porque o aquecimento acelera a

velocidade de interconversão, fazendo com que seja superada mais facilmente a barreira

energética, favorencendo a formação exclusiva de um dos confôrmeros. O resfriamento pode,

em certos casos, gerar preferencialmente o confôrmero mais estável, implicando igualmente

numa simplificação do espectro de RMN. Este tipo de investigação pode ser feita tanto para 1H como para 13C, todavia como a faixa de deslocamento químico deste último é mais ampla,

a temperatura de coalescência (TC) ocorre em temperaturas mais altas. Além disso a

temperatura de coalescência é dependente da freqüência de análise do espectrômetro: quanto

maior a freqüência do aparelho, maior será TC (FRIEBOLIN, 1991).

Da espécie Juniperus communis, foi isolado e purificado pela primeira vez um par

de atropisômeros (P e M-114 e 115) de fonte natural, os quais mostraram estabilidade em

DMSO, mesmo submetidos a aquecimento a 50 °C (INATOMI et al., 2005).


51

Estereoquímica E/Z

A configuração da dupla ligação de uma aurona pode ser determinada através do

deslocamento químico do carbono C-α, conforme o raciocínio aplicado por Geiger e

Markham (1992) para definição da estereoquímica Z para campylopusaurona, uma aurona-

flavanona isolada de Campylopus clavatus. Segundo estes autores, um deslocamento químico

de δ 109,9 é compatível com C-α pertencente à dupla ligação com configuração Z. Ao

contrário, o deslocamento químico previsto seria ao menos 10 ppm mais desblindado, devido

aos fatores estéricos.

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

Campylopusaurona


52

Figura 8- Espectros de RMN 13C de GB-1 (148) registrados em diferentes temperaturas e solventes, obtidos num espectrômetro Bruker (HAN et al., 2005). Observação: os parâmetros de aquisição e processamento dos experimentos não foram divulgados.

Extraído do artigo “Complete NMR assignments of the antibacterial biflavonoid GB1 from Garcinia kola.” Chem. Pharm. Bull., v. 53, n. 8, p. 1034-1036, 2005.


53

3.2.3 Metilação e Acetilação

Em virtude da alta polaridade dos biflavonóides, durante muito tempo os artifícios

utilizados para o isolamento e a caracterização destes compostos foram a metilação ou a

acetilação das hidroxilas fenólicas.

A acetilação de bichalconas isoladas de Dracaena cinnabari (23 e 119-121)

produziu fortes efeitos de blindagem no carbono ipso e de desblindagem nos carbonos orto e

para, da ordem de 4 -7 ppm (MASAOUD et al., 1995).

3.2.4 Glicosilação Biflavonóides glicosilados são tipos estruturais de ocorrência muito rara, existindo

poucos relatos sobre a existência de heterosídeos naturais: chimarrosídeo (116)- Chimarris

turbinata (CARDOSO et al., 2005), (P) e (M) –cupressuflavona-4’-O-β-glicosídeo (114 e

115)- Juniperus communis (INATOMI et al., 2005), ginkgetina e isoginkgetina-7-O-β-

glicosídeo - Ginkgo biloba (183 e 184) (HYUN et al., 2005), 6’”-hidroxilofirona B-4’”-O-β-

glicosídeo (125) - Ochna integerrima (KAEWAMATAWONG et al., 2002) e procianidina B-

3, 3’-O-β-glicosídeo - Potentilla viscosa (47) (ZHANG et al., 1998). No sítio de glicosilação

do chimarrosídeo, localizado no C-3 do fragmento de campferol, foram evidenciadas as

desblindagens do C-2 (∆δ +9) e C-4 (∆δ +2) e a blindagem do C-3 (∆δ -3), em relação aos

valores encontrados para a aglicona (CARDOSO et al., 2005).

3.2.5 Conectividade

É sabido que a técnica de RMN bidimensional HMBC, quase sempre, fornece

inequivocamente a informação da conectividade entre as unidades flavonoídicas, entretanto

um simples espectro de RMN 13C-CPD pode ser útil também para proposição da interligação.

Como os carbonos C-6 e C-8 não substituídos, em biflavonóides 5,7-dioxigenados,

apresentam absorções entre δ 90-100, deslocamentos químicos com incrementos de 6,0-9,6

ppm (CHARI, 1977 apud SI et al., 2001), são indícios de que a conexão entre os monômeros

se faz através destes carbonos, respectivamente. Desta forma, Si et al. previram a

conectividade de biflavonóides isolados de Stephania tetranda (SI et al., 2001).

Além disso, a conectividade pode ser muitas vezes determinada pelo conhecimento

prévio do tipo de ligação dos biflavonóides relatados no gênero da espécie estudada.

Geralmente, espécies de Selaginella possuem biflavonóides interligados por carbonos C-

3’→C-6 ou C-8” (81-84, 89, 166-167, 173-174) (LIN et al.,1999).


54

3.2.6 Sulfatação

O espectro de RMN 13C de um biflavonóide sulfatado é muito similar ao de um

análogo não-sulfatado, sendo quase superponíveis. No entanto, a identificação de um grupo

sulfato é tranquilamente possível devido aos significativos efeitos do grupo aniônico sobre os

carbonos ipso, orto e para. Morelloflavona-7-sulfato (158) e volkensiflavona-7-sulfato (159)

exibiram diferenças de deslocamentos químicos no carbono ipso (∆δ -6), orto (∆δ +4) e para

(∆δ +2) em relação aos seus congêneres hidroxilados no carbono C-7 (Li et al., 2002).

3.2.7 Biflavonóides atípicos

166,896,2

163,9

95,2

162,9101,5

195,5

128,6

128,5

114,2

157,1

80,948,5

104,4

157,7

102,5

159,8105,2

154,5

182,1

164,1

102,5

120,6

129,0

116,1

161,5

129,0

OHO3SO

OH O

OHOOH

OH O

OH

158

As bartramiaflavonas (91 e 157), biflavonóides isolados do musgo Bartramia

pomiformis e B. stricta, chamam a atenção dos pesquisadores pela sua estrutura macrocíclica,

inédita na natureza, a qual sob aquecimento a 250 °C ou solução fervente de H2SO4 20%,

converte-se numa forma acetal (SEEGER et al., 1991).

O

O

O OH

OH

O

OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH

O

O OH

OH

O

OH

OH

OH

OH OH

OH

OBartramiaflavona

157

As calycopteronas (32-44) exibem esqueleto original devido à existência de uma

carbonila no anel A, implicando em perda de aromaticidade, e conectividade entre os

monômeros por meio de um anel tetra-hidrofurano. Propriedades citotóxicas são atribuídas a Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

55

estas biflavanas, descritas apenas em Calycopteris floribunda (Combretaceae) (WALL et al.,

1994). Substâncias semelhantes somente são encontradas na espécie Daphne genkwa

(Thymelaeaceae), as quais recebem a denominação de genkwanóis (140-143), todavia estes

últimos são biflavonóides mistos (flavana + flavanonol) (BABA et al., 1993).

H

O

O

OCH3

O

O

OCH3

OCH3

O

OCH3OO

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

Calycopterona32

Genkwanol 142

A

A

B

B

C

C

Comumente, os biflavonóides são interligados através de ligações diretamente entre

os carbonos aromáticos (C-C) ou ligações éter (C-O-C). No entanto, há sete compostos (117 e

126-131), obtidos exclusivamente de Pentagramma triangularis (Pteridaceae), conectados por

ponte metilênica (IINUMA et al., 1994 e 1997; ROITMAN et al., 1993).

Identificado em Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), a licoagrodina (179) é um

biflavonóide de estrutura química singular em razão da presença de dois anéis tetra-

hidrofuranos e três grupos isoprenilas (Li et al., 2000).

OH

OH

O

O

OHH3CO

CH3

OH

OH O

OCH3

O O

O

OCH3

CH3

O

OH

CH3

CH3

OH

OH

OH

CH3

CH3

H

H

H

Flavonóide metilênico (128) Licoagrodina (179)


56

3.3. Atividade Biológica

Os biflavonóides são substâncias reconhecidamente de alto valor farmacológico,

conforme se pode verificar através da abundância de relatos de atividades biológicas

atribuídas aos mesmos (Tab. 2, p. 59).

Dentre os biflavonóides farmacologicamente ativos, merecem destaque a

amentoflavona, agathisflavona, ginkgetina, hinokiflavona, robustaflavona, rhusflavanona e

GB-1 (Quadro 2, p. 58), em razão do expressivo número de trabalhos científicos que

demonstram suas atividades farmacológicas.

A amentoflavona e agathisflavona apresentaram afinidade por receptores

GABAA/benzodiazepínicos, sendo fortes candidatos para o controle da epilepsia

(SVENNINGSEN et al., 2006). Atividades antivirais foram determinadas para os compostos

amentoflavona, agatisflavona, rhusflavanona e robustaflavona, em ensaios frente aos vírus

Myxovirus influenzae (gripe), Herpes simplex (LIN et al., 1999) e HIV (LIN et al., 1997). A

ação antiinflamatória da ginkgetina foi demonstrada por meio do seu mecanismo de inibição

da fosfolipase A2 e cicloxigenase-2 (COX-2), representando uma alternativa promissora para

o tratamento de dermatites crônicas (LIM et al., 2006).

Os efeitos antiaterogênico (ADARAMOYE et al., 2005) e antioxidante (FAROMBI;

NWAOKEAFOR, 2005) exibidos por GB-1 (148) sugerem eficácia deste biflavonóide na

prevenção de distúrbios cardiovasculares. GB-1 mostrou atividade antibacteriana contra cepas

de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (HAN et al., 2005), enquanto que seu

derivado permetilado foi eficaz contra Mycobacterium tuberculosis, bactéria causadora da

tuberculose (LIN et al., 2001).

O potencial antineoplásico destes biflavonóides e análogos já foi avaliado com

sucesso, em testes de citotoxicidade frente a linhas de células tumorais (CHEN et al., 2005),

(LIN et al., 2000), (SILVA et al., 1995), (LIN et al., 1989) e mediante ensaios de inibição da

enzima DNA topoisomerase (GRYNBERG et al., 2002).


57

Quadro 2- Estruturas de flavonóides farmacologicamente ativos

O

O

O

ORO

OH

OHOH

OH

R

R= H- AmentoflavonaR= OCH3- Ginkgetina

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

Agathisflavona

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

Cupressuflavona

O

O

OH

OH

OH

O

O

O

OH

OH

Hinokiflavona

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

Robustaflavona

O

OH

OH

OH O

OH

O

O

OH

OH

OH

GB-1


58

Tabela 2- Relação das atividades biológicas demonstradas por biflavonóides.

Atividade Biológica Referência Antiaterogênica ADARAMOYE et al, 2005

Antibacteriana PEGNYEMB et al, 2005

HAN et al, 2005

TANG et al, 2003

MAJINDA et al, 1997

VERDI et al, 2004

BASILE et al, 1999

Anticonvulsivante SVENNINGSEN et al, 2006

Antifúngica K.-BARANOWSKA et al, 1999

Anti-HIV LIN et al, Y. 1997

Antiinflamatória SELVAM et al, 2004

LIM et al, 2006

Antimalárica NUNOME et al, 2004

WENIGER et al, 2004

WENIGER et al, 2006

Antiosteoporose LEE et al, 2006

Antioxidante YAMAGUCHI et al, 2005

FAROMBI et al, 2005

Antituberculose LIN, Y et al. 2001

Antitumoral ITO et al, 1999

MURAKAMI et al, 1992

Antiviral LIN, Y et al, 1999

Citotóxica TANG et al, 2003

LIN, L.C et al, 2000

MAYER et al, 1999

SILVA et al, 1995

WALL et al, 1994

KUO et al, 2000

KUO et al, 2002

LIN, Y. et al1989

Inibidor de aflatoxina FELICIO et al, 2001

Inibidor da aldose -redutase FELÍCIOet al, 1995

Inibidor da DNA-topoisomerase OLIVEIRA et al, 2005

GRYNBERG et al, 2002

Leishmanicida WENIGER et al, 2004

WENIGER et al, 2006

Tripanocida MBWAMBO et al, 2006

WENIGER et al, 2006


59

REFERÊNCIAS ABEGAZ, B. M.; NGADJUI, B. T.; DONGO, E.; NGAMENI, B.; NINDI, M. N.; BEZABIH, M. Chalcones and other constituents of Dorstenia prorepens and Dorstenia zenkeri. Phytochemistry, v. 59, p. 877-883, 2002.

ADARAMOYE, O. A.; NWANERI, V. O.; ANYANWU, K. C.; FAROMBI, E. O.; EMEROLE, G. O. Possible anti-atherogenic effect of kolaviron (a Garcinia kola seed extract) in hypercholesterolaemic rats. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., v. 32, p. 40-46, 2005.

AGRAWAL, P. K. Carbon-13 of Flavonoids. New York: Elsevier, 1989, 564 p.

ANHUT, S.; SEEGER, T.; ZINSMEITER, H. D. New dihidrobiflavones from the moss Plagiomnium cuspidatum. Z. Naturforsch., v. 44c, p. 189-192, 1989.

ARIYASENA, J.; BAEK, S. H.; PERRY, N. B.; WEAVERS, R. T. Ether-linked biflavonoids from Quintinia acutifolia. J. Nat. Prod., v. 67, n. 4, p. 693-696, 2004.

BABA, K.; TANIGUCHI, M.; Three biflavonoids from Daphne odora. Phytochemistry, v. 42, n. 5, p. 1447-1453, 1996.

BABA, K.; TANIGUCHI, M.; KOZAWA, M. A third spirobiflavonoid genkwanol C from Daphne genkwa. Phytochemistry, v. 33, n. 4, p. 913-916, 1993.

BABA, K.; TANIGUCHI, M.; KOZAWA, M. Three biflavonoids from Wikstroemia sikokiana. Phytochemistry, v. 37, n. 3, .p. 879-883, 1994.

BABA, K.; YOSHIKAWA, M.; TANIGUCHI, M.; KOZAWA, M. Biflavonoids from Daphne odora. Phytochemistry, v. 38, n. 4, p. 1021-1026, 1995.

BAHIA, M. V.; SANTOS, J. B.; DAVID, J. P.; DAVID, J. M. Biflavonoids and other phenolics from Caesalpinia pyramidalis (Fabaceae). J. Braz. Chem. Soc., v. 16, n. 6B, p. 1402-1405, 2005.

BAI, H.; KOIKE, K.; DOU, D.; PEI, Y.; CHEN, Y.; NIKAIDO, T. A novel biflavonoid from roots of Glycyrrhiza uralensis cultivated in China. Chem. Pharm. Bull.,v. 51, n. 9, p. 1095-1097, 2003.

BARBOSA, F. G. Contribuição ao Conhecimento Químico de Três Quimiotipos de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown Cultivados no Horto de Plantas Medicinais da UFC. Departamento de Química Orgânica e Inorgânica. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 1983.

BARBOSA, F. G.; LIMA, M. A. S.; SILVEIRA, E. R. Total NMR assignments of new [C7-O-C7'']-biflavones from leaves of the limonene-carvone chemotype of Lippia alba (Mill) N.E. Brown. Magn. Reson. Chem., v. 43, p. 334-338, 2005.

BASILE, A.; GIORDANO, S.; LÓPEZ-SÁEZ, J. A.; COBIANCHI, R.C. Antibacterial activity of pure flavonoids isolated from mosses. Phytochemistry, v. 52, p. 1479-1482, 1999

BEKKER, R.; FERREIRA, D.; SWART, K. J.; BRANDT, E. V. Biflavonois. Part 5: structure and stereochemistry of the first bibenzofuranoids. Tetrahedron, v. 56, p. 5297-5302, 2000.

BENNIE, L.; COETZEE, J.; MALAN, E.; FERREIRA, D. Structure and stereochemistry of dimeric proteracacinidins possessing the rare C-4(C) → C-5(D) interflavanyl linkage. Phytochemistry, v. 59, p. 673-678, 2002.

BENNIE, L; MALAN, E.; COETZEE, J.; FERREIRA, D. Structure and synthesis of ether-linked proteracacinidin and promelacacinidin proanthocyanidins from Acacia caffra. Phytochemistry, v. 53, p. 785-793, 2000.


60

BOTHA, J. J.; FERREIRA, D.; ROUX, D. G. Condensed tannins: direct synthesis, structure, and absolute configuration of four biflavonoids from black wattle bark (‘Mimosa’) extract. J. Chem. Soc. Chem. Comm., n. 1283, p. 700-702, 1978.

BRINKMEIER, E.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D. Biflavonoids and 4,2’-epoxy-3-phenylcoumarins from the moss Mnium hornum. Phytochemistry, v. 52, p. 297-302, 1999.

BRINKMEIER, E.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D. The cooccurrence of different biflavonoid types in Pilotrichella flexilis. Z. Naturforsch., v. 55c, p. 866-869, 2000.

CAO, S. G.; SIM, K. Y.; GOH, S. H. Biflavonoids of Calophyllum venulosum. J. Nat. Prod, v. 60, n. 12, p. 1245-1250, 1997.

CAO, S. G.; SIM K. Y.; GOH, S. H. Minor methylated pyranoamentoflavones from Calophyllum venolosum. Nat. Prod. Lett., v. 15, p. 291-297, 2001

CARDOSO, C. L.; SILVA, D. H. S.; CASTRO-GAMBOA, I.; BOLZANI, V. S. New biflavonoid and other biflavonoids from leaves of Chimarrhis turbinate and their antioxidant activities. J. Braz. Chem. Soc., v. 16, n. 6B, p. 1353-1359, 2005.

CARNEIRO, F. J. C.; BORALLE, N.; SILVA, D. H. S.; LOPES, L. M. X. Bi- and tetraflavonoids from Aristolochia ridicula. Phytochemistry, v. 55, p. 823-832, 2000.

CARVALHO, M. G.; ALVES, C. C. F.; SILVA, K. G. S.; EBERLIN, M. N.; WERLE, A. A. Luxenchalcone, a new bichalcone and other constituents from Luxemburgia octandra. J. Braz. Chem. Soc., v. 15, n. 1, p. 146-149, 2004.

CHARI, V. M.; ILYAS, M.; WAGNER, H.; NESZMELYI, A.; CHEN, F. C.; CHEN, L. K.; LIN, Y. C.; LIN, Y. M. 13C-NMR spectroscopy of biflavonoids. Phytochemistry, v. 16, p. 1273-1278, 1977.

CHEN, J. J.; DUH, C. Y.; CHEN, J. F. New cytotoxic biflavonoids from Selaginella delicatula. Planta Med., v. 71, p. 659-665, 2005.

DAS, B.; MAHENDER, G.; RAO, Y. K.; PRABHAKAR, A.; JAGADEES, B. Biflavonoids from Cycas beddomei. Chem. Pharm. Bull., v. 53, n. 1, p. 135-136, 2005.

DORA, G.; EDWARDS. J. M. Taxonomic status of Lanaria lanata and isolation of a novel biflavone. J. Nat. Prod, v. 54, n. 3, p. 796-801, 1991.

EL-DESOKY, S. K.; SHARAF, M. A new prenylated biflavone from Origanum syriacum. Rev. Latinoamer. Quim., v. 32, n. 1, p. 21-24, 2004.

ELIEL, E. L.; WILEN, S. H.; MANDER, L. N. Stereochemistry of organic compounds. New York: John Wiley & Sons, 1994, 1267 p.

ELSOHLY, M. A.; CRAIG, J. C.; WALLER, C. W.; TURNER, C. E. Biflavonoids from fruit of poison ivy Toxicodendron radicans. Phytochemistry, v. 17, p. 2140-2141, 1978.

FAROMBI, E. O.; NWAOKEAFOR, I. A. Anti-oxidant mechanisms of kolaviron: studies on serum lipoprotein oxidation, metal chelation and oxidative membrane damage in rats. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., v. 32, p. 667-674, 2005.

FELICIO, J. D.; GONÇALEZ, E.; BRAGGIO, M. M.; CONSTATINO, L.; ALBASINI, A.; LINS, A. P. Inhibition of lens aldose reductase by biflavones from Ouratea spectabilis. Planta Med., v. 61, p. 217-220, 1995.


61

FELICIO, J. D.; ROSSI, M. H.; PARK, H. R.; GONÇALEZ, E.; BRAGGIO, M. M.; DAVID, J. M.; CORDEIRO, I. Biflavonoids from Ouratea multiflora. Fitoterapia, v. 72, p. 453-455, 2001.

FENG, B; PEI, Y.; HUA, H; WANG, T.; ZHANG, Y. Biflavonoids from Stellera chamaejasme. Pharmac. Biol., v. 41, n. 1, p. 59-61, 2003.

FERRARI, J.; TERREAUX, C.; KURTAN, T.; SZIKSZAI-KISS, A.; ANTUS, S.; MSONTHI, J. D.; HOSTETTMANN, K. Isolation and on-line LC/CD analysis of 3,8"- linked biflavonoids from Gnidia involucrata. Helv. Chim. Acta, v. 86, p. 2768-2778, 2003.

FONSECA, F. N.; FERREIRA, A. J. S.; SARTORELLI, P.; LOPES, N. P.; FLOH, E. I. S.; HANDRO, W.; KATO, M. J. Phenylpropanoid derivatives and biflavones at different stages of differentiation and development of Araucaria angustifolia. Phytochemistry, v. 55, p. 575-580, 2000.

FOO, L. Y. Isolation of [4-O-4]-linked biflavonoids from Acacia melanoxylon: first examples of a new class of single ether-linked proanthocyanidin dimmers. J. Chem. Soc. Chem. Commun., n. 20, 1989

FOO, L. Y.; HELM, R.; KARCHESY, J. [5',5']- Bisdihydroquercetin: a B-ring linked biflavonoid from Pseudotsuga menziesii. Phytochemistry, v. 31, n. 4, p. 1444-1445, 1992.

FOO, L. Y.; LU, Y.; WONG, H. Biphenyl-linked biflavanoids from grape pomace. Phytochemistry, v. 47, n. 6, p. 1137-1140, 1998.

GEIGER, H.; BOKEL, M. Die biflavonoidausstattung von Chimarrhis turbinate (Hedw). Z. Naturforsch., v. 44c, p. 559-562, 1989.

FRIEBOLIN, H. Basic one and two-dimensional NMR spectroscopy. Weiheim: VCH, 1991, 344 p.

GEIGER, H.; MARKHAM, K. R. Campylopusaurone, an auronoflavanone biflavonoid from the mosses Campylopus clavatus and Campylopus holomitrium. Phytochemistry, v. 31, n. 12, p. 4325-4328, 1992.

GEIGER, H.; VOIGT, A.; SEEGER, T.; ZINSMEISTER, H. D.; LÓPEZ-SAEZ, J. A.; PÉREZ-ALONSO, M. J.; VELASCO-NEGERÚELA, A. Cyclobartramiatriuteolin, a unique triflavonoid from Bartramia stricta. Phytochemistry, v. 39, n. 2, p. 465-467, 1995.

GOH, S. H. Neoflavonoid and biflavonoid constituents of Calophyllum inophylloide. J. Nat. Prod., v. 55, n. 10, .p. 1415-1420, 1992.

GÓMEZ-GARIBAY, F.; CALDERÓN, J. S.; QUIJANO, L.; TÉLLEZ, O.; OLIVARES, M.D.S.; RIOS, T. An unusual prenyl biflavanol from Tephrosia tepicana. Phytochemistry, v. 46, n. 7, p. 1285-1287, 1997.

GÓMEZ-GARIBAY, F.; CALDERÓN, J. S.; ARCINIEGA, M. L. O.; CÉSPEDES, L.; TÉLLES-VALDÉS, O.; TABOADA, J. An unusual isopropenyldihidrofuran biflavanol from Tephrosia crassifolia. Phytochemistry, v. 52, p. 1159-1163, 1999.

GONÇALEZ, E.; FELICIO, J. D.; PINTO, M. M. Biflavonoids inhibit the production of aflatoxin by Aspergillus flavus. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 34, p. 1453-1456, 2001.

GRYNBERG, N. F.; CARVALHO, M. G.; VELANDIA, J. R.; OLIVEIRA, M. C.; MOREIRA, I. C.; BRAZ-FILHO, R.; ECHEVARRÍA, A. DNA topoisomerase inhibitors: biflavonoids from Ouratea species. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 35, p. 819-822, 2002.

HAHN, H.; SEEGER, T.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D.; MARKHAM, K. R.; WONG, H. The first biaurone, a triflavone and biflavonoids from two Aulacomnium species. Phytochemistry, v. 40, n. 2, p. 573-573, 1995.


62

HAN, Q. B.; LEE, S. F.; QIAO, C. F.; HE, Z. D.; SONG, J. Z.; SUN, H. D.; XU, H. X. Complete NMR assignments of the antibacterial biflavonoid GB1 from Garcinia kola. Chem. Pharm. Bull., v. 53, n. 8, p. 1034-1036, 2005.

HARBORNE, J. H.; WILLIAMS, C. A. Advances in flavonoids research since 1992. Phytochemistry, v. 55, p. 481-504, 2000.

HE, K.; TIMMERMANN, N.; ALADESANMI, A. J.; ZENG, L. A biflavonoid from Dysoxylum lenticellare gillespie. Phytochemistry, v. 42, n. 4, p. 1199-1201,1996.

HYUN, S. K.; KANG, S. S.; SON, K. H.; CHUNG, H. Y.; CHOI, J. S. Biflavone glucosides from Ginkgo biloba yellow leaves. Chem. Pharm. Bull.,v. 53, n. 9, p. 1200-1201, 2005.

IINUMA, M.; KAKUTO, Y.; TANIDA, N.; TANAKA, T.; LANG, F. A. Unusual biflavonoids in the farinose exudate of Pentagrama triangularis. Phytochemistry, v. 44, n. 4, p. 705-710, 1997.

IINUMA, M.; TANAKA, T.; SUZUKI, K.; LANG, F. A. Two biflavonoids in the farinose exudate if Pentagrama triangularis. Phytochemistry, v. 35, n. 4, p. 1043-1047, 1994.

INATOMI, Y.; IIDA, N.; MURATA, H.; INADA, A.; MURATA, J.; LANG, F. A.; IINUMA, M.; TANAKA, T.; NAKANISHI, T. A pair of new atropisomeric cupressuflavone glucosides isolated from Juniperus communis var. depressa. Tetrahedron Lett., v. 46, p. 6533-6535, 2005.

ITO, C.; ITOIGAWA, M.; MIYAMOTO, Y.; RAO, K. S.; TAKAYASU, J.; OKUDA, Y.; MUKAYANAKA, T.; TOKUDA, H.; NISHINO, H.; FURUKAWA, H. A new biflavonoid from Calophyllum panciflorum with antitumor-promoting activity. J. Nat. Prod., v. 62, n. 12, p. 1668-1671, 1999.

IWU, M.M.; IGBOKO, O.A. Biflavonoid constituents of Garcinia kola roots. Fitoterapia, v. LXI, n. 1, p. 178-181, 1990.

JAYAPRAKASAM, B.; DAMU, A. G.; RAO, K. V.; GUNASEKAR, D.; BLOND, A.; BODO, B. A biflavanone from Cycas beddomei. Phytochemistry, v. 53, p. 515-517, 2000.

JAYAPRAKASAM, B.; DAMU, A. G.; RAO, K. V.; GUNASEKAR, D.; BLOND, A.; BODO, B. 7-O-Methyltetrahydroochnaflavone, a new biflavanone from Ochna beddomei. J. Nat. Prod., v. 63, n. 4, p. 507-508, 2000.

KAEWAMATAWONG, R.; LIKHITWITAYAWUID, K.; RUANGRUNGSI, N.; TAKAYAMA, H.; KITAJIMA, M.; AIMI, N. Novel Biflavonoids from the stem bark of Ochna integerrima. J. Nat. Prod., v. 65, n. 7, p. 1027-1029, 2002.

KAPADIA, G. J.; OGUNTIMEIN, B.; SHUKLA, Y. N. High-speed counter-current chromatographic separation of biflavonoids from Garcinia kola seeds. J. Chromatogr. A, v. 673, p. 142-146, 1994.

KASSEM, M.E.S.; EL-DESOKY, S.K.; SHARAF, M. Biphenyl esters and biflavonoids from fruits of Schinus terebenthefolus. Chem. Nat. Comp., v. 40, n. 5, p. 447-450, 2004.

KOLODZIEJ, H. The first natural biflavonoid with flavanol and dihydroflavanol constituents units coupled at the B-ring. J. Chem. Soc., Chem. Commun., n. 1258, p. 205-206, 1987.

KRAUZE-BARANOWSKA, M.; CISOWSKI, W.; WIWART, M.; MADZIAR, B. Antifungical biflavones from Cupressocyparis leylandii. Planta Med., v. 65, p. 512-573, 1999.


63

KUMAR N.; SINGH, B.; BHANDARI, P.; GUPTA, A. P.; UNIYAL, S. K.; KAUL, V. K. Biflavonoids from Lonicera japonica. Phytochemistry, v. 66, p. 2740-2744, 2005.

KUO, Y. H.; HWANG, S. Y.; KUO, L. M. Y.; LEE, Y. L.; LI, S. Y. SHEN, Y. C. A novel cytotoxic C-methylated biflavone, taiwanhomoflavone-B-from the twigs of Cephalotaxus wilsoniana. Chem. Pharm. Bull.,v. 50, n. 12, p. 1607-1608, 2002.

KUO, Y. H.; LIN, C. H.; HWANG, S. Y.; SHEN, Y. C.; LEE, Y. L.; LI, S. Y. A novel cytotoxic C-methylated biflavone from the stem of Cephalotaxus wilsoniana. Chem. Pharm. Bull., v. 48, p. 440-441, 2000.

LEE, M. K.; LIM, S. W.; YANG, H.; SUNG, S. H.; LEE, H.; PARK, M. J.; KIM, Y. C. Osteoblast differentiation stimulating activity of biflavonoids from Cephalotaxus koreana. Biorg. Med. Chem. Lett., v. 16, p. 2850-2854, 2006.

LI, S. H.; ZHANG, H. J.; NIU, X. M.; YAO, P.; SUN, H. D.; FONG, H. H. S. Chemical constituents from Amentotaxus yunnanensis and Torreya yunnanensis. J. Nat. Prod., v. 66, n. 7, p. 1002-1005, 2003.

LI, X. C.; JOSHI, A. S.; TAN, B.; ELSOHLY, H. N.; WALKER, L. A.; ZJAWIONY, J. K.; FERREIRA, D. Absolute configuration, conformation, and chiral properties of flavanone-(3→8")-flavone biflavonoids from Rheedia acuminate. Tetrahedron, v. 58, p. 8703-8717, 2002.

LI, W.; ASADA, Y.; YOSHIKAWA, T. Flavonoid constituents from Glycyrrhiza glabra hairy root cultures. Phytochemistry, v. 55, p. 447-456, 2000.

LIKHITWITAYAWUID, K.; RUNGSERICHAI, R.; RUANGRUNGSI, N.; PHADUNGCHAROEN, T. Flavonoids from Ochna integerrima. Phytochemistry, v. 52, p. 353-357, 2001.

LIM, H.; SON, H. H.; CHANG, H. W.; KANG, S. S.; KIM, H. P. Effects of Anti-inflammatory biflavonoid, ginkgetin, on chronic skin inflammation. Biol. Pharm. Bull., v. 29, n. 5, p. 1046-1049, 2006.

LIN, L. C.; KUO, Y. C.; CHOU, C. J. Cytotoxic biflavonoids from Selaginella delicatula. . J. Nat. Prod.,v. 63, n. 5, p. 627-630, 2000.

LIN, Y.; ANDERSON, H.; FLAVIN, M. T.; PAI, Y. S. In vitro anti-HIV activity of biflavonoids isolated from Rhus succedanea and Garcinia multiflora. J. Nat. Prod.,v. 60, n. 9, p. 884-888, 1997.

LIN, Y.; CHEN, F. C.; LEE, K. Hinokiflavone, a cytotoxic principle from Rhus succedanea and the cytotoxic of the related biflavonoids. Planta Med., v.55, p. 166-168, 1989.

LIN, Y.; FLAVIN, M. T.; CASSIDY, C. S.; MAR, A.; CHEN, F. Biflavonoids as novel antituberculosis agents. Biorg. Med. Chem. Lett., v. 11, p. 2101-2104, 2001.

LIN, Y.; FLAVIN, M. T.; SCURE, R.; CHEN, F. C.; SIDWELL, R.; BARNARD, D. L.; HUFFMAN, J. H.; KERN, E. R. Antiviral activities of biflavonoids. Planta Med., v.65, p. 120-125, 1999.

MACHADO, M. B.; LOPES, L. M. X. Chalcone-flavone tetramer and biflavones from Aristolochia ridicula. Phytochemistry, v. 66, p. 669-674, 2005.

MAJINDA, R. R. T.; MOTSWALEDI, M.; WAIGH, R. D.; WATERMAN, P. G. Phenolic and antibacterial constituents of Vahlia capensis. Planta Med., v. 63, p. 268-270, 1997.


64

MASAOUD, M.; RIPPERGER, H.; HIMMELREICH, U.; ADAM, G. Cinnabarone, a biflavonoid from dragon’s blood of Dracaena cinnabari. Phytochemistry, v. 38, n. 3, p. 751-753, 1995.

MASAOUD, M.; HIMMELREICH, U.; RIPPERGER, H.; ADAM, G. New biflavonoids from dragon’s blood of Dracaena cinnabari. Planta Med., v. 61, p. 341-344, 1995.

MASESANE, I. B.; YEBOAH, S. O.; LIEBSCHER, J.; MUGGE, C.; ABEGAZ, B. M. A bichalcone from the twigs of Rhus pyroides. Phytochemistry, V. 53, p. 1005-1008, 2000.

MAYER, R. Five biflavonoids from Calycopteris floribunda (Combretaceae). Phytochemistry, v. 65, p. 593-601, 2004.

MAYER, R. Calycopterones and calyflorenones, novel biflavonoids from Calycopteris floribunda. J. Nat. Prod, v. 62, n, 9, p. 1274-1278, 1999.

MBING, J. N.; ENGUEHARD-GUEIFFIER, C.; ATCHADÉ, A. T.; ALLOUCHI, H.; GANGOUÉ-PIÉBOJI, J.; MBAFOR, J. T.; THI, R. G.; POTHIER, J.; PEGNYEMB, D. E.; GUEIFFIER, A. Two flavonoids from Ouratea nigroviolacea. Phytochemistry, v. 67, p. 2666-2670, 2006.

MBING, J. N.; PEGNYEMB, D. E.; THI, R. G.; SONDENGAM, B. L.; BLOND, A.; BODO, B. Two flavonoids from Ouratea flava stem bark. Phytochemistry, v. 63, p. 427-431, 2003.

MBWAMBO, Z. K.; KAPINGUN, M. C.; MOSHI, M. J.; MACHUMI, F.; APERS, S.; COS, P.; FERRERA, D.; MARAIS, J. P. J.; BERGHE, D. V.; NAES, L.; VLIETINCK, A.; PIETERS, L. Antiparasitic activity of some xanthones and biflavonoids from root bark of Garcinia livingstonei. J. Nat. Prod., v. 69, n.3, p. 369-372, 2006.

MDEE, L. K.; YEBOAH, S. O.; ABEGAZ, B. M. Rhuschalcones II-VI, five new bichalcones from the root bark of Rhus pyroides. J. Nat. Prod., v. 66, n. 5, p. 599-604, 2003.

MESSANGA, B.; TIH, G. R.; KIMBU, S.; SONDENGAM, B. L. Calodenone, a new isoflavonoid from Ochna calodendron. J. Nat. Prod., v. 55, n. 2, p. 245-248, 1992.

MESSANGA, B.; TIH, G. R.; SONDENGAM, B. L.; MARTIN, M. T.; BODO, B. Biflavonoids from Ochna calodendron. Phytochemistry, v. 35, n. 3, p. 791-794, 1994.

MURAKAMI, A.; TANAKA, S.; OHIGASHI, H.; HIROTA, M.; IRIE, R.; TAKEDA, N.; TATEMATSU, A.; KOSHIMIZU, K. Possible anti-tumor promotes: bi- and tetraflavonoids from Lophira alata. Phytochemistry, v. 31, n. 8, p. 2689-2693, 1992.

NUNOME, S.; ISHIYAMA, A.; KOBAYASHI, M.; OTOGURO, K.; KIYOH HARA, H.; YAMADA H.; OMURA, S. In vitro antimalarial activity of biflavonoids from Wikstroemia indica. Planta Med., v. 70, p. 72-76, 2004.

OLIVEIRA, M. C.; CARVALHO, M. G.; GRYNBERG, N. F.; BRIOSO, P. S.; A biflavonoid from Luxemburgia nobilis as inhibitor of DNA topoisomerase. Planta Med., v. 71, p. 563-566, 2005.

OLIVEIRA, M. C.; CARVALHO, M. G.; SILVA, C. J.; WERLE, A. A. New biflavonoid and other constituents from Luxemburgia nobilis (EICHL). J. Braz. Chem. Soc., v. 13, n. 1, p. 119-123, 2002.

PEGNYEMB, D. E.; MBING, J. N.; ATCHADÉ, A. T.; THI, R. G.; SONDENGAM, B. L.; BLOND, A.; BODO, B. Antimicrobial biflavonoids from the aerial parts of Ouratea sulcata. Phytochemistry, v. 66, p. 1922-1926, 2005.


65

PEGNYEMB, D. E.; THI, R. G.; SONDENGAM, B. L.; BLOND, A.; BODO, B. Biflavonoids from Ochna afzelii. Phytochemistry, v. 57, p. 579-582, 2001.

RAMPENDAHL, C.; SEEGER, T.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D. The biflavonoids of Plagiomnium ondulatum. Phytochemistry, v. 41, n. 6, p. 1621-1624, 1996.

RANI, M. S.; RAO, C. V.; GUNASEKAR, D.; BLOND, A.; BODO, B. A biflavonoid from Cycas beddomei. Phytochemistry, v. 47, n. 2, p. 319-321, 1998.

RAO, K. V.; SREERAMULU, K.; RAO, C. V. GUNASEKAR, D. Two new biflavonoids from Ochna obtusata. J. Nat. Prod., v. 60, n. 6, p. 632-634, 1997.

ROBBERS, J. E.; SPEEDIE, M. K.; TYLER, V. E. Farmacognosia e Farmacobiotecnologia. Colômbia: Editorial Premier, 1997, 352 p.

ROITMAN, J. N.; WONG, R. Y.; WOLLENWEBER, E. Methylene bisflavonoids from frond exudates of Pentagrama triangularis ssp triangularis. Phytochemistry, v. 34, n. 1, p. 297-301, 1993.

SAKASAI, M.; FUKUI, H.; YAMANE, H.; KYAW, A. N.; TAHARA, S. A new class of biflavonoids: 2’-hydroxygenistein dimmers from the roots of white lupin. Z. Naturforsch., v. 55c, p. 165-174, 2000.

SEEGER, T.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D. Bartramiaflavone, a macrocyclic biflavonoid from the moss Bartramia pomiformis. Phytochemistry, v. 30, n. 5, p. 1653-1656, 1991.

SEEGER, T.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D. 3',3'''- Binaringenin, a new biflavonoid from Pilotrichella cuspidata (Meteoriaceae, Musci). Z. Naturforsch., v. 47c, p. 667-669, 1992.

SEEGER, T.; ZINSMEISTER, H. D. The biflavonoid pattern of Rhytidiadelphus squarrosus (Hedw.) Warnst. Z. Naturforsch., v. 45c, p. 583-586, 1990.

SEEGER, T.; GEIGER, H.; ZINSMEISTER, H. D.; ROZDZINSKI, W. Biflavonoids from the moss Homalothecium lutescens. Phytochemistry, v. 34, n. 1, p. 295-296, 1993.

SELVAM, C.; JACHAK, S. M. A cyclooxygenase (COX) inhibitory biflavonoid from the seeds of Semecarpus anacardium. J. Ethnopharmacol., v. 95, p. 209-212, 2004.

SI, D.; ZHONG, D.; SHA, Y.I., LI, W. Biflavonoids from aerial part of Stephania tetrandra. Phytochemistry, v. 58, p. 563-566, 2001.

SILVA, G. L.; CHAI, H. C.; GUPTA, M. P.; FARNSWORTH, N. R.; CORDELL, G. A.; PEZZUTO, J. M.; BEECHER, C. W. W.; KINGHORN, D. Cytotoxic biflavonoids from Selaginella willdenowii. Phytochemistry, v. 40, n. 1, p. 129-134, 1995.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis: Eds. UFRGS e UFSC, 1999, 820 p.

SVENNINGSEN, A. B.; MADSEN, K. D.; LILJEFORS, T.; STAFFORD, G. I.; VAN STADEN, J.; JAGER, A. K. Bioflavones from Rhus species with affinity for the GABAA/benzodiazepine receptor. J. Ethnopharmacol., v. 103, p. 276-280, 2006.

TANG, S.; BREMNER, P.; KORTENKAMP, A.; SCHLAGE, C.; GRAY, A. I.; GIBBONS, S.; HEINRICH, M. Biflavonoids with cytotoxic and antibacterial activity from Ochna macrocalyx. Planta Med., v. 69, p. 247-253, 2003.


66

TANIGUCHI, M.; BABA, K. Three biflavonoids from Daphne odora. Phytochemistry, v. 42, n. 5, p. 1447-1453, 1996.

TANIGUCHI, M.; FUJIWARA, A.; BABA, K.; WANG, H. N. Two biflavonoids from Daphne acutiloba. Phytochemistry, v. 49, n. 3, p. 863-867, 1988.

TERASHIMA, K.; AQIL, M.; NIWA, M. Garcinianin, a novel biflavonoid from the roots of Garcinia kola. Heterocycles, v. 41, n. 10, p. 2245-2250, 1995.

THI, A. E.; GHOGOMU, R. T.; SONDENGAM, B. L.; CAUX, C.; BODO, B. Minor biflavonoids from Lophira alata leaves. J. Nat. Prod., v. 69, n. 8, p. 1206-1208, 2006.

THI, R.G.; THI, G.; SONDENGAM, M. T.; MARTIN, M. T.; BODO, B. A new chalcone dimmer from Lophira alata. Tetrahedron Lett., v. 29, n. 5, p. 5797-5800, 1988.

THI, R. G.; SONDENGAM, M. T.; Lophirones D and E: two new cleaved biflavonoids from Lophira lanceolata. J. Nat. Prod., v. 52, n. 2, p. 284-288, 1989.

THI, R. G.; SONDENGAM, M. T.; MARTIN, M. T.; BODO, B. Structure of the chalcone dimmers lophirone F, G and H from Lophira lanceolata stem bark. Phytochemistry, v. 29, n. 7, p. 2289-2293, 1990.

THI, R. G.; SONDENGAM, M. T.; MARTIN, M. T.; BODO, B. Structure of Lophirones B and C, biflavonoids from the bark of Lophira lanceolata. Phytochemistry, v. 28, n. 5, p. 1557-1559, 1989.

THI, R. G.; SONDENGAM, M. T.; MARTIN, M. T.; BODO, B. Structures of isombamichalcone and lophirochalcone, bi- and tetra-flavonoids from Lophira lanceolata. Tetrahedron Lett., v. 30, n. 14, p. 1807-1810, 1989.

VELANDIA, J. R.; CARVALHO, M. G.; BRAZ-FILHO, R.; WERLE, A. A. Biflavonoids and a glucopyranoside derivative from Ouratea semiserrata. Phytochem. Anal., v. 13, p. 283-292, 2002.

VERDI, L. G.; PIZZOLATTI, M. G.; MONTANHER, A. B. P.; BRIGHENTE, M. C. JÚNIOR, A. S.; SMÂNIA, E. F. A.; SIMIONATTO, E. L.; MONACHE, F. D. Antibacterial and brine shrimp lethality of Rheedia gardneriana. Fitoterapia, v. 75, p. 360-363, 2004.

WALL, M .E.; WANI, M. C.; FULLAS, F.; OSWALD, J. B.; BROWN, D. M.; SANTISUK, T.; REUTRAKUL, V.; MCPHAIL, A. T.; FARNSWORTH, N .R.; PEZZUTO, J. M.; KINGHORN, D.; BESTERMAN, J. Plant antitumor agents. 31. The calycopterones, a new class of biflavonoids with novel cytotoxicity in a diverse panel of human tumor cell lines. J. Med. Chem., v. 37, n. 10, p. 1465-1470, 1994.

WENIGER, B.; SÉNÉCHEAU, C. V.; ARANGO, G. J.; KAISER, M.; BRUN, R.; ANTON, R. A bioactive biflavonoid from Campnosperma panamense. Fitoterapia, v. 75, p. 764-767, 2004.

WENIGER, B.; SÉNÉCHEAU, C. V.; KAISER, M.; BRUN, R.; ANTON, R. Comparative antiplasmodial, leishmanicidal and antitrypanosomal acitivities of several biflavonoids. Phytomedicine, v. 13, p.176-180, 2006.

WOLLWNWEBER, E.; KRAUT, L.; MUES, R.; External accumulation of biflavonoids on gymnosperm leaves. Z. Naturforsch., v. 53c, p. 946-950,1998.

YAMAGUCHI, L. F.; VASSÃO; D. G.; KATO, M. J.; DI MASCIO, P. Biflavonoids from Brazilian pine Araucaria angustifolia as potential protective agents against DNA damage and lipoperoxidation. Phytochemistry, v. 66, p. 2238-2247, 2005.


67

YU, L. L.; HUANG, R.; L. V, Y.; ZHAO, Y.; CHEN, Y. A New Biflavonoid from Aristolochia contorta. Pharmazie, v. 60, n. 10, p. 789-791, 2005.

ZHANG, B.; NONAKA, G. I.; NISHIOKA, I. Potentillanin, a biflavonoid and a procyanidin glycoside from Potentilla, viscosa. Phytochemistry, v. 27, n. 10, p. 3277-3280, 1988.


68

4. VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA

Validação é o processo de certificação da credibilidade de um método analítico,

tendo como finalidade a obtenção de evidência documentada de que o mesmo realiza a tarefa

para o qual é indicado. A validação representa uma ferramenta imprescindível para o controle

de qualidade de produtos industrializados ou in natura, para os quais espera-se que estejam

em conformidade com a legislação e atendendo aos desejos e exigências do consumidor.

Desta forma, faz-se necessária a adoção de metodologias analíticas que permitam a

comparabilidade e rastreabilidade dos produtos e a confiabilidade dos resultados das

medições, levando-se em consideração custo e praticidade (LEITE, 2002).

A validação requer a avaliação dos seguintes parâmetros: seletividade, linearidade,

precisão, sensibilidade, limite de quantificação e detecção e exatidão (RIBANI et al., 2004).

4.1. Seletividade

A seletividade é a capacidade de um método analítico de propiciar a separação e a

detecção das substâncias de interresse, mesmo na presença de interferentes. Assim sendo, em

cromatografia, um pico deve corresponder a um único componente sob investigação (RIBANI

et al., 2004).

4.2. Linearidade

Um método apresenta linearidade quando produz respostas diretamente

proporcionais às concentrações da substância em análise. Essa relação é observada através da

construção de uma curva de calibração, a partir das áreas dos sinais e suas respectivas

concentrações, sendo necessários no mínimo 5 pontos (não incluindo o ponto zero na curva).

A curva gerada pode ser descrita por uma equação do tipo y= ax + b (RIBANI et al., 2004).

4.3. Sensibilidade

A sensibilidade significa a capacidade do método de discriminar amostras contendo

teores de analito próximos. Entre dois métodos, o mais sensível é aquele que possui a curva

de calibração com maior inclinação (LEITE, 2002).

4.4. Precisão

A precisão é a avaliação do grau de dispersão dos resultados obtidos entre ensaios

independentes e repetidos de uma mesma amostra. Sua aferição é feita através da

determinação do desvio padrão absoluto (σ) ou de sua estimativa (s), em razão do pequeno


69

número de medições. Além disso, há a possibilidade de “s” ser expresso em termos

percentuais, desvio padrão relativo (RSD%), também denominado de coeficiente de variação

(CV).

( )1

2

−

−= ∑

nxx

s i RSD (%) ou 100×=xsCV

Na validação de métodos, a precisão pode ser analisada em três níveis:

repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade.

• Repetitividade (INMETRO) ou repetibilidade (ANVISA)- concordância entre os

resultados de medições sucessivas de um mesmo método, realizadas sob as mesmas condições

analíticas (procedimento, analista, instrumento, local), em um curto período. As medições da

repetitividade são efetuadas a partir da mesma amostra, mas em preparações diferentes, sendo

também denominada de precisão intra-ensaio ou intra-corrida. Entretanto, é comum a

confusão com outro termo adotado em validação: a precisão instrumental, a qual é medida

pela determinação do “s” das respostas de injeções repetitivas de uma mesma preparação (≥

10) (RIBANI et al., 2004).

• Precisão intermediária- é a avaliação das variações percebidas de um dia de análise em

relação a outro ou resultantes da troca de um analista, visando à garantia de que o método

funciona satisfatoriamente, no laboratório.

• Reprodutibilidade- concordância entre os resultados das medições de uma mesma

amostra efetuadas sob condições variadas (mudança de laboratório) A IUPAC recomenda que

as análises sejam reproduzidas em pelo menos cinco laboratórios.

4.5. Limite de Detecção (LD)

Representa a menor concentração da substância de interesse que pode ser detectada,

mas não necessariamente quantificada. Na prática, é determinado como sendo a concentração

que produz um sinal equivalente a três vezes o nível do ruído produzido por uma solução-

controle (“branco” analítico) ou estimado por parâmetros da curva analítica (RIBANI et al.,

2004).

LD= 3,3 x s / S

Onde: s- estimativa do desvio padrão da resposta ou coeficiente linear da reta e S- inclinação

da curva analítica.


70

4.6. Limite de Quantificação (LQ)

O limite de quantificação (LQ) refere-se ao menor valor de concentração

determinado para a substância de interesse, respeitando-se a precisão e a exatidão do método

(LEITE, 2004). A determinação do LQ pode ser feita através da relação sinal-ruído

(influenciável por condições experimentais) e parâmetros da curva analítica (estatisticamente

mais confiável) (RIBANI et al., 2004).

LQ= 10 x s / S

Onde: s- estimativa do desvio padrão da resposta ou coeficiente linear da reta e S-

inclinação da curva analítica.

4.7. Exatidão

A exatidão corresponde ao grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência, aceito como verdadeiro. A

avaliação da exatidão pode ser realizada através do uso de material de referência, comparação

de métodos, ensaios de recuperação e adição de padrão. As determinações são efetuadas em

três níveis de concentração (baixo, médio e alto), estando sempre associadas a valores de

precisão (RIBANI et al., 2004).

REFERÊNCIAS

LEITE, F. Validação em análise química. 4ª. ed. Campinas: Editora Átomo, 2002, 275 p.

RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C.

M. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quim. Nova, v. 27, n. 5, p. 771-

780, 2004.


71

5. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL

5.1. Amburanina A (ACCE-5)

Cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20 da fração ACCE1AM, obtida por

partição líquido-liquido do extrato etanólico das cascas do caule de A. cearensis, forneceu 61

mg de um sólido amorfo amarelo (pf. > 300 °C; [α]25D = -3,2°, MeOH, c 0,05), denominado

ACCE-5 (ítem 10.1.6.7, p. 278).

O espectro de absorção na região do infravermelho (Fig. 9, p. 77) mostrou uma

banda larga em 3335 cm-1, correspondente à deformação axial de ligação O-H, caracterizando

a presença de hidroxila; absorção em 1641 cm-1 relativa à deformação axial C=O,

evidenciando a existência de carbonila; bandas esqueletais em 1512 e 1440 cm-1 de C=Carom.;

absorção em 1252 e 1171 cm-1 referentes às deformações axiais C-O e bandas em 955 e 829

cm-1 relacionadas à deformação angular Carom-H.

O espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, Fig. 10, p. 77) mostrou quatro

dupletos em δ 7,25; 7,02; 6,72 e 6,62 (2H, J = 8,4 e 8,7 Hz), compatíveis com dois sistemas

aromáticos para-dissubstituídos. Dupletos em δ 5,95 (H-6) e 5,86 (H-8) (1H, J = 2,0 Hz)

foram associados a hidrogênios meta-posicionados. Foram exibidos dois sinais como tripletos

em δ 3,29 (H-α) e 2,87 (H-β) (2H, J = 7,7 Hz) e ainda sete sinais simples em δ 13,17; 11,70;

9,77; 9,17; 6,51; 5,96 (1H) e δ 11,02 (2H). O espectro gs-COSY (Fig. 11, p. 78) permitiu

distinguir os hidrogênios pertencentes a cada anel benzênico para-dissubstituído, através dos

acoplamentos entre os sinais δ 7,25 (H-2’,6’) e 6,72 (H-3’,5’) (J = 8,4 Hz), bem como entre

os sinais em δ 7,02 (H-2”’,6”’) e 6,62 (H-3”’,5”’) (J = 8,7 Hz).

No espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 12, p. 78) foram

observadas 26 linhas espectrais, quatro das quais, δ 130,0 (C-2”’,6”’); 129,3 (C-2’,6’); 115,9

(C-3”’,5”’) e 115,6 (C-3’,5’), visivelmente mais intensas, foram associadas a carbonos

quimicamente equivalentes de anéis benzênicos para-substituídos, totalizando 30 carbonos.

Dois sinais em δ 203,7 (C-β’) e 192,2 (C-4) foram atribuídos a carbonilas não-conjugadas

(cetona ou aldeído), sugerindo a existência de duas unidades flavonoídicas. Além disso, oito

sinais em δ 167,7 (C-7); 166,7 (C-4”); 164,0 (C-2”); 163,5 (C-5); 162,2 (C-6”); 161,3 (C-9);

159,5 (C-4’) e 156,4 (C-4”’) foram relacionados a carbonos sp2 oxigenados. Como nenhum

destes carbonos apresentava deslocamento químico no intervalo 144 ≤ δC ≤ 148, deduziu-se

que a estrutura não possuia carbonos oxigenados orto-posicionados.


72

O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 13, p. 79) revelou a

existência de dois carbonos metilênicos, ao exibir os sinais em δ 45,3 (C-α) e 30,3 (C-β) com

amplitude negativa, em oposição às sete linhas espectrais de carbonos mono-hidrogenados: os

quatro sinais mais intensos, além dos sinais em δ 98,5 (C-5”); 97,5 (C-6) e 95,5 (C-8). Os

carbonos não-hidrogenados, reconhecidos por subtração dos espectros obtidos pelas duas

técnicas de RMN 13C, foram relacionados aos deslocamentos químicos em δ 131,8 (C-1”’);

124,5 (C-1’); 118,6 (C-2); 108,4 (C-3”); 101,9 (C-1”); 99,4 (C-10) e 80,5 (C-3), além

daqueles referentes aos oito carbonos sp2 oxigenados. A ausência dos sinais em δ 203,7 (C-β’)

e 192,7 (C-4) no DEPT135 confirma que estas absorções são referentes a carbonilas de

cetonas.

A tabela 3 (p. 76) apresenta os deslocamentos químicos de 1H e 13C, correlacionando

os hidrogênios aos seus respectivos carbonos, a partir de informações extraídas do espectro

HMQC (Fig. 14, p. 79), através do qual se pôde notar que o singleto em δ 5,96 (H-5”) foi o

único dos sinais simples a apresentar correlação com um sinal de carbono, δ 98,5 (C-5”). Em

virtude da presença de carbonos aromáticos oxigenados, os demais singletos foram atribuídos

a hidroxilas fenólicas, as quais tiveram suas posições determinadas através do espectro

HMBC (Fig. 15, p. 80), segundo correlações dispostas na mesma tabela.

ACCE-5 apresentou o pico do íon molecular com m/z 558,4983 (calculado m/z

558,4891) no espectro de massa de alta resolução (EM-IE, Fig. 16, p. 83), correspondente à

fórmula molecular C30H22O11 (IDH=20), compatível com um esqueleto de biflavonóide

composto por um fragmento de flavanonol e outro di-hidrochalconoídico.

O espectro HMBC forneceu evidências de uma unidade de flavanonol, através das

correlações entre os hidrogênios em δ 7,25 (H-2’,6’), pertencentes a um dos sistemas para-

substituído, com o sinal de carbono sp3 dioxigenado em δ 118,6 (C-2), o qual se encontrava

correlacionado ao hidrogênio hidroxílico do carbono HO-C-3 (δ 6,51). Este mesmo

hidrogênio mostrou-se acoplado com o carbono carbonílico em δ 192,2 (C-4). O anel A do

flavanonol foi identificado por meio das correlações entre o dupleto em δ 5,86 (H-8) com os

sinais de carbonos aromáticos oxigenados em δC 167,7 (C-7) e 161,3 (C-9), o dupleto em δ

5,95 (H-6) com o sinal de carbono aromático oxigenado em δ 163,5 (C-5) e ambos os

dupletos com o sinal de carbono não hidrogenado em δ 99,4 (C-10).


73

A presença de um fragmento di-hidrochalconoídico foi evidenciada pelos

acoplamentos a longa distância dos hidrogênios metilênicos (δ 3,29 e 2,87; CH2-α e CH2-β)

com a carbonila mais desblindada (δC-β’ 203,7; C-β’). Tal hipótese foi reforçada através das

correlações dos hidrogênios de um dos sistemas para-substituídos (δ 7,02; H-2’”,6’”) com o

carbono metilênico na posição β à carbonila (δ 30,3; C-β’). Também foi importante a

correlação do sinal da hidroxila em δ 13,17 (HO-C-6”) com os sinais de carbonos aromáticos

em δC 101,9 (C-1”); 98,5 (C-5”) e os carbonos aromáticos oxigenados em δC 162,2 (C6”) e

166,7 (C-4”), sendo este último através de um acoplamento em “W” (4J). O acoplamento

entre o H-5” (δ 5,96) com o C-4” (δ 166,7) também foi observado.

Os dois fragmentos que formam a estrutura biflavonoídica de ACCE-5

correspondem aos resíduos dos flavonóides aromadendrina (189) e floretina (190)

(AGRAWAL, 1989), cujos deslocamentos químicos de RMN 13C apresentam um alto grau de

concordância com os registrados para ACCE-5 (Tab. 3, p. 76). No entanto, restando ainda

uma insaturação para completar o IDH calculado, foi sugerida a formação de um anel di-

hidrofurânico entre os carbonos C-2 (δ 118,6) e C-3 (δ 80,5) do fragmento aromadendrina

com os carbonos C-3” (δ 108,4) e C-4” (δ 166,7) do fragmento floretina. O indício que apoiou

esta hipótese foi o acoplamento em “W” (4J) entre o H-5” (δ 5,96), pertencente ao fragmento

da di-hidrochalcona floretina com o C-3 (δC-3 80,5), membro do fragmento do flavanonol

aromadendrina.

A estrutura química de ACCE-5, inédita na literatura, mostrou-se nitidamente

semelhante às estruturas exibidas pelas dafnodorinas (132, 133, 142, 143) (BABA et al.,

1995) (136 e 137) (TANIGUCHI et al., 1996), substâncias isoladas de Daphne odora. ACCE-

5 foi denominada amburanina A (2”,3,4’,4”’,5,6”,7-heptahidroxi-2-O-4”:3-3”-flavanona-

dihidrochalcona).


74


75

O

O

OH

OH

OH

OH

189OOH

OHOH

OH

190

101,9

98,5

162,2

203,7

45,3

118,680,5

192,2

163,5

97,5

167,7

95,5161,3

99,4

124,5

129,3

115,6

159,5

164,0

108,4

166,7

30,3

131,8

130,0

115,9156,4

O O

OOH

OH

OH

OOH

OH

OH

OH

13,175,95

5,867,25

5,96

6,72

7,02

6,629,17

6,5111,02

9,77

3,29

O O

OO

O

OH

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

OH

2,87

11,02

11,70

2

456

7

89

103

3'

4'

5'

6' 2'

1'

1"2"

3"

4"5"

6"

1"'2"'

5"'6"'

3"'

4"'

αβ

β'

Tabela 3- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HMQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e floretina, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).

# C

Aromadendrina- Floretina♣ δC (ppm)

ACCE-5 δC (ppm) DMSO-d6

HMQC* δH (ppm)

HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

2 85,0 118,6 7,25; 6,51 3 73,7 80,5 6,51 (5,96) 4 198,4 192,2 6,51 5 165,3 163,5 5,95 6 97,5 97,5 5,95 (1H, d, 2,0 Hz) 5,86 7 168,8 167,7 5,86 8 96,4 95,5 5,86 (1H, d, 2,0 Hz) 5,95 9 164,6 161,3 5,86 10 101,9 99,4 5,95; 5,86 1' 129,4 124,5 6,72

2', 6' 130,4 129,3 7,25 (2H, d, 8,7 Hz) 3', 5' 116,3 115,6 6,72 (2H, d, 8,7 Hz) 9,77

4' 159,2 159,5 9,77 1" 105,3 101,9 13,17 2" 166,0 164,0 11,70 3" 95,7 108,4 6,51 4" 165,8 166,7 5,96; 5,86 (13,17) 5" 95,7 98,5 5,96 (1H, s) 13,17 6" 166,0 162,2 13,17 β' 206,5 203,7 3,29 2,87 α 47,1 45,3 3,29 (2H, t, 7,7 Hz) 2,87 β 31,4 30,3 2,87 (2H, t, 7,7 Hz) 7,02

1'" 134,0 131,8 2,87 3,29 2'", 6'" 130,2 130,0 7,02 (2H, d, 8,4 Hz) 2,87 3'", 5'" 116,1 115,9 6,62 (2H, d, 8,4 Hz) 9,17

4'" 156,2 156,4 7,01 HO-C3 6,51 HO-C5 11,02 HO-C7 11,02 HO-C2” 11,70 HO-C6” 13,17 HO-C4’ 9,77 HO-C4”’ 9,17 ♣CD3OD

*(int., multip, JH,H)


76


77

Figura 9- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-5 (pastilhas de KBr)

Figura 10- Espectro de RMN 1H de ACCE-5 (DMSO-d6, 500 MHz)

13,175,95

5,867,25

5,96

6,72

7,02

6,629,17

6,5111,02

9,77

3,29

O O

OO

O

OH

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

OH

2,87

11,02

11,70

2

456

7

89

103

3'

4'

5'

6' 2'

1'

1"2"

3"

4"5"

6"

1"'2"'

5"'6"'

3"'

4"'

αβ

β'


78

Figura 11- Espectro de RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5

Figura 12- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)


79

Figura 13- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)

Figura 14- Espectro de RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5


80

Figura 14a- Expansão da região δ 5,5-7,5 x 95,0-133 do espectro HMQC.

Figura 15- Espectro de RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5

18

25

2223

11

16

7

26

17

19

9

28


81

Figura 15a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 6,4-7,6 x 112-131; (II) δ 9,0-13,4 x 153-172; (III) δ 9,0-13,4 x 103-120.

21

20

4 30

O O

OOH

OH

OH

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

OH

1

2

3

31

5

6

7

89

10

11 12

13

15

17

18

19

20

2122

23

14

16

24

25

2627

28

4

29

30

29

34

15 6

12

10

24

8

27

5 14

3

13

2 1


82

Figura 15b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 5,5-7,5 x 95,0-133; (II) δ 5,8-7,4 x 152-171.

O O

OOH

OH

OH

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

OH

1

2

3

31

5

6

7

89

10

11 12

13

15

17

18

19

20

2122

23

14

16

24

25

2627

28

4

29

30


83

Figura 16- Espectro de massa de ACCE-5 (Ionização por Impacto Eletrônico)

Figura 17- Espectro de RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5

5.2. Amburanina B (ACCE-6)

A fração ACCE1AM, sólido marrom originado da partição líquido-líquido do extrato

etanólico das cascas do caule, foi submetida a cromatografias de adsorção e exclusão e

purificada em HPLC (fase reversa), resultando na obtenção de um sólido amarelo (23 mg)

com tR = 8,82 min, sendo denominado ACCE-6 (pf. > 300° C; [α]25D = +4,0°- MeOH, c 0.05)

(ítem 10.1.6.8, p. 278).

A notória similaridade observada entre os espectros de IV (Fig. 18, p. 89) de ACCE-

5 e ACCE-6 sinalizou a uma estreita semelhança estrutural entre eles, confirmada pela

identificação dos mesmos grupos funcionais: hidroxila (3433 cm-1), carbonila (1640 cm-1),

anel aromático (1517 e 1473 cm-1) e carbonos oxigenados de fenol, enol-éter e álcool (1329,

1258 e 1168 cm-1).

O espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, (Fig. 19, p. 89) de ACCE-6

apresentou um par de dupletos em δ 5,95 (H-6) e 5,92 (H-8) (1H, J = 2,0 Hz), associados a

hidrogênios meta-posicionados, um conjunto de dupletos em δ 8,16; 7,28; 6,94 e 6,79 (2H,

J = 8,7 Hz), relacionados a dois sistemas aromáticos para-dissubstituídos, e um conjunto de

singletos em δ 13,30; 11,80; 10,20, 9,78; 9,66; 6,96 e 6,71, cujas integrações foram estimadas

como equivalentes a um hidrogênio, cada sinal. Os dupletos com Jorto foram agrupados

segundo acoplamentos observados no espectro COSY (Fig. 20, p. 90), permitindo

correlacionar os sinais de hidrogênio correspondentes a cada anel benzênico: δ 8,16 (H-

2”’,6”’) com 6,94 (H-3”’,5”’) e δ 7,28 (H-2’,6’) com 6,79 (H-3’,5’). O espectro de RMN 1H

de ACCE-6 demonstrou uma visível semelhança com o obtido para ACCE-5, exceto pela

ausência dos hidrogênios metilênicos em δ 3,29 e 2,87.

O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 21, p. 90) de ACCE-6

também exibiu 26 linhas espectrais, sendo quatro delas mais intensas do que as demais: δ

131,0 (C-2”’,6”’); 129,2 (C-2’,6’); 116,3 (C-3”’,5”’) e 115,7 (C-3’,5’). No entanto, a faixa de

deslocamento químico tornou-se mais estreita (δ 191,8-80,8), devido à inexistência de

carbonos metilênicos e o deslocamento do sinal referente à carbonila, δ 203,7 para 177,1 (C-

4”), compatível com carbonila de cetona conjugada.

Desta forma, o espectro de DEPT135 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 22, p. 91) tornou-

se mais simples (somente sinais com amplitude positiva), fazendo-se útil apenas para a

distinção entre os carbonos mono-hidrogenados daqueles não-hidrogenados, tendo passado a


84

contar com dois carbonos sp2 a mais, δ 148,3 (C-2”) e 136,9 (C-3”), sendo ao menos um deles

oxigenado.

Salvo o singleto em δ 6,71 (H-6”) que se correlacionou com o sinal de carbono em δ

95,6 (C-6”), o espectro de RMN-HMQC de ACCE-6 (Fig. 23, p. 91), tal qual o de ACCE-5,

não mostrou qualquer correlação envolvendo os sinais de carbono e os demais singletos,

sugerindo corresponderem a hidroxilas.

A fórmula molecular C30H18O12 para ACCE-6 foi obtida a partir do íon molecular

com m/z 570,5736 (calculado m/z 570,4567) no espectro de masssa de alta resolução (EM-IE,

Fig. 24, p. 92), correspondente a um Índice de Deficiência de Hidrogênio com duas

insaturações a mais do que a calculada para ACCE-5.

Tendo em vista que as diferenças estruturais entre ACCE-6 e ACCE-5 foram

resultantes de divergências verificadas no fragmento chalconoídico, foi proposta uma

estrutura biflavonoídica, na qual flavanonol (aromadendrina) se encontrava ligado a um

flavonol. Esta hipótese foi justificada através de uma suposta ciclização seguida de oxidação

do aducto floretina, o qual foi convertido num resíduo de campferol (vide proposta

biogenética, p. 244), ou resultante da condensação de duas moléculas de campferol,

atendendo às seguintes evidências espectroscópicas: aumento do IDH, aparecimento de

carbonos sp2 oxigenados e a presença de carbonila conjugada.

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 25, p. 92) corrobora com a proposição estrutural à

medida que revela importantes acoplamentos a longa distância (Tab. 5, p. 88), entre eles, o

acoplamento existente entre os hidrogênios H-2”’,6”’ (δ 8,16) e o carbono C-2” (δ 148,3),

através do qual se pôde inferir a substituição do carbono metilênico (δ 30,3; C-β), existente

em ACCE-5, por um carbono sp2 oxigenado.

É válido atentar para as maiores desblindagens sentidas pelos núcleos de hidrogênios

H-2”’,6”’e HO-C-4”’ em ACCE-6 (δ 8,16; H-2”’,6”’ e δ 10,20; OH-4”’) quando comparados

aos de ACCE-5 (δ- 7,01; H-2”’,6”’e δ 9,17; OH-4”’), resultantes do efeito mesomérico

retirador da carbonila C-4” (conjugada com a dupla ligação α,β) exercido sobre o anel

aromático que suporta estes hidrogênios, nas posições orto e para, respectivamente.

Além disso, os dados de deslocamento químico de 13C do campferol descritos na

literatura foram bem parecidos com os valores encontrados para ACCE-6 (AGRAWAL,


85


86

1989), exceto aqueles referentes aos carbonos (C-2, C-4, C-5” e C-10”) situados próximos à

junção dos dois fragmentos.

Em alusão à espécie botânica da qual foi isolada, a estrutura química inédita de

ACCE-6 foi denominada amburanina B (3,3”,4’,4”’,5,5”,7-heptahidroxi-2-O-7”:3-8”-

flavanona-flavona).

O

O

OH

OH

OH

OH

191

O O

OOH

OH

OH

OO

OH

OH

OH

OH

118,780,8

191,8164,3

97,8168,4

96,0 161,3

99,6

124,5

129,2

115,7

159,6

106,1152,1

106,9

165,795,6

164,7

177,1

122,2

131,0

116,3160,4

148,3136,9

5,95

5,927,28

6,79

6,71

8,16

6,94

11,80

9,80

6,96

10,20

13,30

9,66

O O

OO

O

OH

OO

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

1023

45

67

8

9

1'2'

3'

4'5'

6'

2" 3"4"

5"

6"7"

8"9" 10"

1"'

2"'

3"'4"'

5"'

6"'


87

Tabela 4- Dados de RMN 13C de ACCE-5 e ACCE-6.

# C

ACCE-5 δC (ppm)-DMSO-d6

# C

ACCE-6 δC (ppm)-DMSO-d6

2 118,6 2 118,7 3 80,5 3 80,8 4 192,2 4 191,8 5 163,5 5 164,3 6 97,5 6 97,8 7 167,7 7 168,4 8 95,5 8 96,0 9 161,3 9 161,3 10 99,4 10 99,6 1' 124,5 1' 124,5

2', 6' 129,3 2', 6' 129,2 3', 5' 115,6 3', 5' 115,7

4' 159,5 4' 159,6 1" 101,9 2" 148,3 2" 164,0 3" 136,9 3" 108,4 4" 177,1 4" 166,7 5" 164,7 5" 98,5 6" 95,6 6" 162,2 7” 165,7 β' 203,7 8” 106,9 α 45,3 9” 152,1 β 30,3 10” 106,1

1'" 131,8 1'" 122,2 2'", 6'" 130,0 2'", 6'" 131,0 3'", 5'" 115,9 3'", 5'" 116,3

4'" 156,4 4'" 160,4 HO-C3 HO-C3 HO-C5 HO-C5 HO-C7 HO-C7 HO-C2” HO-C4’ HO-C6” HO-C3” HO-C4’ HO-C5” HO-C4”’ HO-C4”’

Tabela 5- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HMQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e campferol, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).

# C

Aromadendrina- Campferol♣ δC (ppm)

ACCE-6 δC (ppm)

HMQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)

HMBC 2J

HMBC 3J

2 85,0 118,7 7,28 3 73,7 80,8 6,96 4 198,4 191,8 6,51 5 165,3 164,3 6 97,5 97,8 5,95 (1H, d, 2,0 Hz) 11,80 7 168,8 168,4 5,95 8 96,4 96,0 5,92 (1H, d, 2,0 Hz) 5,95 9 164,6 161,3 5,92

10 101,9 99,6 5,92; 11,80 1' 129,4 124,5 6,72

2', 6' 130,4 129,2 7,28 (2H, d, 8,7 Hz) 3', 5' 116,3 115,7 6,79 (2H, d, 8,7 Hz) 9,78

4' 159,2 159,6 9,78; 6,79 2" 146,8 148,3 8,16 3" 135,6 136,9 4" 175,9 177,1 5" 160,7 164,7 13,30 6" 98,2 95,6 6,71 (1H, s) 13,30 7” 163,9 165,7 6,71 8” 93,5 106,9 9” 156,2 152,1

10” 103,1 106,1 13,30 1'" 121,7 122,2 6,94

2'", 6'" 129,3 131,0 8,16 (2H, d, 8,7 Hz) 3'", 5'" 115,3 116,3 6,94 (2H, d, 8,7 Hz) 10,20

4'" 159,0 160,4 8,16 HO-C3 6,96 HO-C5 11,80 HO-C7 9,80 HO-C4’ HO-C3” 9,66 HO-C5” 13,30 HO-C4”’ 10,20 ♣CD3OD


88


89

Figura 18- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-6 (pastilha de KBr)


5,95

5,927,28

6,79

6,71

8,16

6,94

11,80

9,80

6,96

10,20

13,30

9,66

O O

OO

O

OH

OO

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

1023

45

67

8

9

1'2'

3'

4'5'

6'

2" 3"4"

5"

6"7"

8"9" 10"

1"'

2"'

3"'4"'

5"'

6"'


90

Figura 20- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-6



91


Figura 23- Espectro RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6


92

Figura 24- Espectro de massa de ACCE-6 (Ionização por Impacto Eletrônico)

Figura 25- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6

19

9


93

Figura 25a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 5,5-7,6 x 77-108; (II) δ 11,5-13,6 x 89-110; (III) δ 6,4-8,4 x 111-135.

O O

OO

O

OH

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

O

OH

1

2

3 4

5

6

7

89

10

11

12

1315

17

1819

20

21

14

16

23

22

2411 24

18

7

15

6

22

16

13 12

3

17 4

20

23

10

21

8

14 5

1


94

Figura 25b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 11,4-13,4 x 160-169; (II) δ 5,7-8,4 x 126-172.

O O

OO

O

OH

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

O

OH

1

2

3 4

5

6

7

89

10

11

12

1315

17

1819

20

21

14

16

23

22

24

Amburosídios

Cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20 da fração ACSEA, gerada pela

partição H2O/AcOEt do extrato etanólico das sementes, conduziram à obtenção de um sólido

marrom denominado ACSEA(2-11)(11-18)(18-20), o qual foi injetado em HPLC (fase

reversa), resultando na separação de 5 picos: pico 1 (tR = 6,65 min, ACS-7), pico 2 (tR = 9,36

min, ACS-8), pico 3 (tR = 11,06 min, ACS-9), pico 4 (tR = 12,50 min) e pico 5 (tR = 13,57

min, ACS-10). O pico 4 foi reinjetado e desdobrado em dois novos picos: pico 4.1. (tR = 11,69

min, ACS-11) e pico 4.2 (tR = 13,54 min, ACS-12). Este conjunto de picos foi caracterizado

como uma série de amburosídios e identificados como sendo os amburosídios A, C-H.

5.3. Amburosídio A (ACS-7)

A coleta do pico 1 da separação por HPLC forneceu um sólido rosado intitulado

ACS-7 (p.f. 197,8-199,1 °C; [α]20D = -6,8° MeOH, c 0,05) (ítem 10.1.6.6, p. 278).

O espectro de RMN 1H (CD3OD, 300 MHz, Fig. 26, p. 98) de ACS-7 apresentou

dois sinais duplos em δ 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz) em δ 7,11 (2H, d, J = 8,5 Hz), associados a

hidrogênios aromáticos pertencentes a um sistema para-substituído; um singleto em δ 5,22

(2H, s), atribuído a hidrogênios homotópicos de éster benzílico; sinais numa região

característica de hidrogênios de açúcar (δ 4,93-3,37), bem como um sistema ABX formado

pelos sinais em δ 7,44 (1H, d, J = 2,0 Hz), δ 7,40 (1H, dd, J = 8,2 e 2,0 Hz) e em δ 6,80 (1H,

d, J = 8,2 Hz).

No espectro de RMN 13C-CPD de ACS-7 (75 MHz, CD3OD, Fig. 27, p. 98), foram

exibidas dezoito linhas espectrais, sendo uma delas atribuídas a carbonila de éster (δ 168,3, C-

7’), três foram associadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 159,1 (C-4); 151,9 (C-4’);

146,3 (C-3’). O espectro de RMN 13C-DEPT135 (75 MHz, CD3OD, Fig. 28, p. 99) revelou a

presença de dez carbonos mono-hidrogenados, dos quais metade foi relacionada a carbonos

aromáticos: δ 130,8 (C-2,6); 123,8 (C-6’); 117,9 (C-3,5); 116,0 (C-5’); e 117,6 (C-2’). O

restante foi associado a carbonos de hexose, δ 102,3 (C-1”); 78,2 (C-5”); 78,1 (C-3”); 75,0

(C-2”) e 71,5 (C-4”) e 62,6 (C-6”), atribuídos como pertencentes a um resíduo de glicose,

além de uma absorção em δ 67,3 (C-7), relacionada a carbonos metilênico oxigenado. As

demais absorções de 13C em δ 131,8 (C-1) e 122,7 (C-1’), ausentes no espectro DEPT135,

foram reconhecidas como pertencentes a carbonos aromáticos não-hidrogenados.


95


96

A fórmula molecular C20H22O10, deduzida dos dados de RMN, foi compatível com a

estrutura de um glicosídio di-aromático, identificado como sendo o amburosídio A (lit.: p.f.

195-197 °C; [α]20D = -39°, MeOH, c 0,76), confirmada por co-cromatografia com uma

amostra autêntica em CCD e comparação com espectros de RMN 1H e 13C (CD3OD)

(BRAVO et al., 1999) (Tab. 6, p. 97). O amburosídio A (protocatecuato de 4-O-β-D-

glicopiranosil-benzila) já havia sido isolado das cascas do caule de A. cearensis (BRAVO et

al., 1999; CANUTO et al., 2006).

131,9

130,8

117,9

159,1

67,2

122,8168,3

117,6

146,3151,9

116,0

123,8

102,3

75,078,1 71,5

62,6

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OH78,2

7,37

7,11

4,93

7,44

6,80

7,40 5,22

3,463,48

3,70

3,37

3,443,90

1

23

4

567

1'2'

3'4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"6"

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OHH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

Tabela 6- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio A, registrado na literatura (BRAVO et al., 1999).

# C

Amburosídio AδC (ppm) CD3OD

ACS-7 δC (ppm) CD3OD

HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)

1 131,7 131,9 2,6 130,7 130,8 7,37 (2H, d, 8,5 Hz) 3,5 117,7 117,9 7,11 (2H, d, 8,5 Hz) 4 158,9 159,1 7 67,0 67,2 5,22 (2H, s) 1’ 122,6 122,8 2’ 117,4 117,6 7,44 (1H, d, 2,0 Hz) 3’ 146,1 146,3 4’ 151,7 151,9 5’ 115,9 116,0 6,80 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 123,7 123,8 7,40 (1H, dd, 8,2; 2,0 Hz) 7’ 168,1 168,3 1” 102,1 102,3 4,93 (1H, d, 6,5 Hz)) 2” 74,8 75,0 3,46 (1H, m) 3” 77,9 78,1 3,48 (1H, td) 4” 71,3 71,5 3,37 (1H, m) 5” 78,0 78,2 3,44 (1H, m) 6” 62,4 62,6 3,90 (1H,m); 3,70 (1H, m)


97

Figura 26- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 300 MHz) de ACS-7

Figura 27- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7


98

Figura 28- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7


99

5.4. Acetato de 6”-amburosila- (ACS-8)

O pico 2 (tR = 9,36 min) apresentou-se como um sólido marrom (pf. 110,2-114,3 °C;

[α]25D= -34°, MeOH, c 0,22), denominado de ACS-8 (ítem 10.1.7.7, p. 286). No espectro de

RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 29, p. 103) de ACS-8, foi caracterizada a presença de um

anel aromático para-dissubstituído [δ 7,37 (H-2,6) e 7,08 (H-3,5); 2H, d, J = 8,6 Hz), um anel

aromático trissubstituído [(δ 7,43; 1H, d, J = 2,1 Hz, H-2’); (7,41; 1H, dd, J = 8,4 e 2,1 Hz, H-

6’), (6,79; 1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’)], um grupo oximetilênico (δ 5,23; 2H, s, H-7), um resíduo

de açúcar (δ 4,91-3,39) e um grupo acetila (δ 2,02; 3H, s, H-2”’).

Vinte linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD de ACS-8 (125

MHz, CD3OD, Fig. 30, p. 104), sendo duas delas atribuídas a carbonilas de éster, δ 172,9 (C-

1”’) e 168,3 (C-7’) e três associadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 159,0 (C-4); 151,9

(C-4’) e 146,3 (C-3’).

O espectro RMN 13C-DEPT135 de ACS-8 (125 MHz, CD3OD, Fig. 31, p. 105)

revelou a presença de dez sinais atribuídos a carbonos mono-hidrogenados, dos quais metade

foi relacionada a carbonos aromáticos: δ 130,8 (C-2,6); 123,9 (C-6’); 118,0 (C-3,5); 117,6 (C-

2’); 116,1 (C-5’). O restante foi associado a carbonos glicosídicos, δ 102,3 (C-1”); 78,0 (C-

3”); 75,6 (C-5”); 75,0 (C-2”) e 72,0 (C-4”), juntamente com o carbono metilênico oxigenado

em δ 67,2 64,8 (C-6”). A absorção em δ 20,9 (C-2”’) ratificou a existência de uma metila. As

absorções de 13C, δ 132,1 (C-1) e 122,9 (C-1’), ausentes no espectro DEPT 135, foram

reconhecidas como pertencentes a carbonos aromáticos não hidrogenados.

No espectro de massa de ACS-8 (EM-IES, Fig. 32, p. 105) foi detectado o íon

[M+Na]+ em m/z 487,1322, correspondente à fórmula molecular C22H24O11. O IDH, calculado

como sendo igual a onze, sugere que as insaturações correspondem a três anéis (dois

benzênicos e um glicosídico) e a duas carbonilas.

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 33, p. 106) forneceu as correlações dos

hidrogênios ligados diretamente aos seus carbonos, permitindo atribuir as absorções

pertencentes a cada sistema aromático e à unidade de açúcar (Tab. 7, p. 102).

O espectro RMN-HMBC (Fig. 34, p. 107) demonstrou a posição de ligação do

grupo acetila com o resíduo de glicose, através das correlações entre os hidrogênios metílicos

H-2”’ (δ 2,02) com o carbono C-6” (δ 64,8), e entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δ 4,39


100

e 4,24) com o carbono carbonílico C-2”’ (δ 172,9).


101

ACS-8 foi identificada como sendo protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-

acetilglicopiranosil)-benzila também denominada amburosídio D. Esta substância inédita

corresponde a um derivado acetilado do amburosídio A, glicosídio fenólico já isolado das

cascas do caule desta mesma espécie (BRAVO et al., 1999).

132,1

130,8

118,0

159,0

67,2

122,9 168,3117,6

146,3151,9

116,1

123,9

102,3

75,078,0

72,0

75,6

64,8

20,9172,9

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

OCH3

7,37

7,08

4,91

7,43

6,79

7,41 5,23

3,46

3,47

4,39

3,39

3,64 4,241

23

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

2"'

1"'

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

2,02

Tabela 7- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-8 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.

# C



HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

1 132,1 5,23 7,08 2,6 130,8 7,37 (2H, d, 8,6 Hz) 5,23 3,5 118,0 7,08 (2H, d, 8,6 Hz) 4 159,0 7,08 7,37 7 67,2 5,23 (2H, s) 7,37 1’ 122,9 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 2,1 Hz) 7,41 3’ 146,3 7,43 6,79 4’ 151,9 6,79 7,41 5’ 116,1 6,79 (1H, d, 8,4 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, dd, 8,4 e 2,1 Hz) 7,43 7’ 168,3 7,43; 7,41; (6,79); 5,23 1” 102,3 4,91 (1H, d, 7,4 Hz) 2” 75,0 3,46 (1H, m) 3” 78,0 3,47 (1H, td) 3,46; 3,39 4” 72,0 3,39 (1H, m) 4,39; 3,46 5” 75,6 3,64 (1H, m) 4,24 6” 64,8 4,39 (1H, d); 4,24 (1H, dd) 3,39; 2,02 1”’ 172,9 2,02 4,39; 4,24 2”’ 20,9 2,02 (3H, s)


102


103

Figura 29- Espectro de RMN 1H de ACS-8 (CD3OD, 500 MHz)

7,37

7,08

4,91

7,43

6,79

7,41 5,23

3,46

3,47

4,39

3,39

3,64 4,241

23

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

2"'

1"'

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

2,02


104

Figura 30- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz)

Figura 30a- Expansão da região δ 98-125 do espectro de RMN 13C-CPD de ACS-8

132,1

130,8

118,0

159,0

67,2

122,9 168,3117,6

146,3151,9

116,1

123,9

102,3

75,078,0

72,0

75,6

64,8

20,9172,9

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

OCH3


105

Figura 31- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz)

Figura 32- Espectro de massa de ACS-8 (Ionização por Electrospray)

311.1169

377.1289

416.3467

487.1322

200 300 400 500 600 m/z0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

12ACS-p2.d: +MS, 100%=223607


106

Figura 33- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8

Figura 33a- Expansões do espectro HSQC de ACS-8: (I) δ 3,3-5,4 x 62-81; (II) δ 6,7-7,5 x 114-133.


107

Figura 34- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8

Figura 34a- Expansões do espectro HMBC de ACS-8: (I) δ 6,7-7,5 x 115-135; (II) δ 6,7-7,5 x 143-162.

4

3

14 12

2

1

1

2

3

45

67

8

910

11 12

1314 15O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

16

11

6

10

8

5,7

13

16 9 15

5.5. Protocatecuato de 6”-amburosila (ACS-9)

Denominado ACS-9 (ítem 10.1.7.7, p. 286), o pico 3 (tR = 11,06 min) correspondeu

a um sólido marrom (pf. 126,1-129,0 °C; [α]25D = -26°, MeOH, c 0,12) cujo espectro de RMN

1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 35, p. 112) mostrou um conjunto de sinais na faixa de δ 4,92-

3,50, associados a hidrogênios glicosídicos, um singleto em δ 5,18 (2H, H-1), atribuído a

hidrogênios de carbono oximetilênico. No espectro COSY (Fig. 36, p. 112), foram

observadas correlações entre os sinais na região de aromáticos formando dois sistemas ABX

[I-δ 7,43 (d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,41 (dd, J = 8,1 Hz; J = 2,0 Hz, H-6’) e 6,79 (d, J = 8,1 Hz,

H-5’); II-7,47 (d, J = 2,0 Hz, H-2”’), 7,45 (dd, J = 8,2 Hz; J= 2,0 Hz, H-6”’) e 6,83 (d, J = 8,2

Hz, H-5”’)], todos os sinais com integração para um hidrogênio, e um sistema AA’BB’ [δ

7,26 (H-2,6) e 7,06 (H-3,5) (2H, d, J = 8,6 Hz].

No espectro de RMN 13C de ACS-9 (CPD-125 MHz, CD3OD, Fig. 37, p. 113)

foram observadas 25 absorções, duas das quais associadas a carbonilas de éster, δ 168,3 (C-

7’) e 168,2 (C-7”’), e cinco relacionadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 158,9 (C-4);

152,0 (C-4”’); 151,9 (C-4’); 146,4 (C-3”’) e 146,3 (C-3’), sendo os dois últimos

deslocamentos químicos característicos de catecóis (FRIEBOLIN, 1991). O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, MeOD, Fig. 38, p. 113) exibiu 13 linhas espectrais atribuídas a

carbonos mono-hidrogenados, das quais oito foram relacionadas a carbonos aromáticos (δ

130,9; 124,0; 123,9; 118,0; 117,8; 117,6; 116,6 e 116,0) e cinco foram consideradas como

pertencentes a carbonos oxigenados sp3: δ 102,3 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,8 (C-5”); 75,0 (C-2”)

e 72,1 (C-4”). Outras duas linhas espectrais foram associadas a carbonos oximetilênicos δ

67,2 (C-7) e 65,0 (C-6”). Subtração dos espectros de RMN 13C- CPD e DEPT135 permitiu

associar as absorções em δ 131,9 (C-1); 122,8 (C-1’) e 122,7 (C-1”’) a carbonos aromáticos

não-hidrogenados. Através da comparação dos dados de RMN 13C do fragmento de açúcar

com os descritos na literatura, foi possível confirmar a existência do resíduo de glicose na

estrutura (BREITMAIER, 1974).

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 39, p. 114) revelou as correlações dos hidrogênios

ligados diretamente a seus respectivos carbonos, como o sinal de hidrogênio em δ 5,18 (H-7)

com o sinal de carbono metilênico oxigenado em δ 67,2 (C-7) e o dupleto em δ 4,92 (H-1”’)

com a absorção do carbono anomérico em δ 102,3 (C-1”), permitindo também atribuir os

sinais de hidrogênios pertencentes a cada anel aromático (Tab. 8, p. 111).


108

A fórmula molecular C27H26O13 foi deduzida através dos picos dos adutos

moleculares [M+Na]+ com m/z 581,1386 e [M+K]+ com m/z 597,1115, observados no

espectro de massas EM-IES (Fig. 40, p. 114), sendo compatível com uma estrutura formada

pelos grupamentos identificados por RMN: três anéis aromáticos (um para-dissubstituído e

dois catecóis), dois grupos ésteres, um carbono oximetilênico e uma glicose.

A presença de um fragmento benziloxi foi constatada a partir das correlações entre

os hidrogênios aromáticos H-2,6 (δH 7,26) com o carbono oximetilênico (C-7) e

reciprocamente entre os hidrogênios oximetilênicos H-7 (δH 5,18) com os carbonos

aromáticos C-2,6 (δC 130,9), e C-1 (δC 131,9), verificados no espectro de RMN-HMBC (Fig.

41, p. 115).

As correlações entre os hidrogênios do grupo catecol H-2’ e H-6’ (δH 7,43 e 7,41)

com a carbonila C-7’ (δC 168,3) e os acoplamentos entre hidrogênios catecólicos H-2”’ e H-

6”’ (δ 7,47 e 7,45) com a carbonila C-7”’ (δC 168,2) revelaram a existência de dois

fragmentos protocatecuoílas (3,4-di-hidroxi-benzoil). Esterificações envolvendo os

fragmentos protocatecuoílas com o fragmento benziloxi e o resíduo de glicose (na posição 6”)

foram deduzidas através das correlações entre os hidrogênios metilênicos H-7 (δH 5,18) com a

carbonila C-7’ (δC 168,3) e entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δH 4,63 e 4,38) com a

carbonila C-7”’ (δC 168,2), respectivamente. Por fim, o acoplamento entre o hidrogênio

anomérico H-1” (δH 4,92) e o carbono aromático oxigenado C-4 (δC 158,9) forneceu

evidência irrefutável da ligação heterosídica entre o fragmento benziloxi e o resíduo de

glicose, na posição1.

A estrutura química de ACS-9 não tem precedentes de registro na literatura,

justificando a designação comum de amburosídio E [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-

protocatecuoilglicopiranosil)-benzila].


109


110

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HHH

H

7,26

7,06

4,92

7,43

6,79

7,41 5,18

3,50

3,514,63

3,45

3,734,38

7,47

1

23

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'

2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'7,456,83

132,0

130,8

118,1

159,0

67,1

122,8168,3117,6

146,3151,9

116,0123,8

102,4

75,078,1

72,0

75,7

64,7

122,7

168,2

117,8

146,4

152,0O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

116,6

124,0


# C



HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

1 131,9 5,18 7,06 2,6 130,9 7,26 (2H, d, 8,6 Hz) 7,06 5,18 3,5 118,0 7,06 (2H, d, 8,6 Hz) 7,26 4 158,9 7,06 7,26; 4,92 7 67,2 5,18 (2H, s) 7,26 1’ 122,8 7,43 6,79 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 2,0 Hz) 7,41 3’ 146,3 6,79 4’ 151,9 7,43; 7,41 5’ 116,0 6,79 (1H, d, 8,1 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, d, 8,1; 2,0 Hz) 7,43 7’ 168,3 7,43; 7,41; 5,18; (6,79) 1” 102,3 4,92 (1H, d, 7,4) 3,50 3,77 2” 75,0 3,50 (1H, m) 3” 78,1 3,51 (1H, td) 3,45 4,38 4” 72,1 3,45 (1H, m) 4,63; 4,38 5” 75,8 3,77 (1H, m) 4,92; 3,77 6” 65,0 4,63 (1H, m); 4,38 (1H, m) 3,45; 3,77 1”’ 122,7 6,83 2”’ 117,8 7,47 (1H, d, 2,0 Hz) 7,45 3”’ 146,4 6,83 4”’ 152,0 7,47; 7,45 5”’ 116,6 6,83 (1H, d, 8,2 Hz) 6”’ 124,0 7,45 (1H, d, 8,2; 2,0 Hz) 7,47 7”’ 168,2 7,47; 7,45 4,63; 4,38; (6,83)


111


112


Figura 36- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-9.

Figura 36a- Expansão da região δ6,7-7,7 x 6,5-7,7

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HHH

H

7,26

7,06

4,92

7,43

6,79

7,41 5,18

3,50

3,514,63

3,45

3,734,38

7,47

1

23

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'

2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'7,456,83


113

Figura 37- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-9 (MeOD, 125 MHz)



114

Figura 39- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9


299.0809

329.0934 349.1898

365.1627393.2179

416.3436

444.3760

487.1301503.1048

517.1296

533.1161

581.1386597.1115

300 350 400 450 500 550 600 m/z0

1

2

3

4

5

4x10Intens.

13acs-p3.d: +MS, 100%=48536

Figura 39a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 104-134


115

Figura 41- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

16

18

O

OH

OH

H

H

H

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

17

19

20

2122

10

6

118

13

15

17 4

18

16

19

22

1

2

14

12

3 21

5

7

9

15


116


1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

16

18

O

OH

OH

H

H

H

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

17

19

20

2122

5.6. Ferulato de 6”-amburosila (ACS-10)

Um sólido marrom (pf. 108,7-112,2 °C; [α]25D = -33° MeOH, c 0,60) denominado

ACS-10 (ítem 10.1.7.7, p. 286), foi isolado por HPLC a partir da fração ACSEA(2-11)(11-

18)(18-20), resultante de sucessivas cromatografias gravitacionais da fração acetato de etila

do extrato etanólico das sementes, tendo sido o último pico a ser coletado (tR = 13,57 min).

O espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 42, p. 121) de ACS-10 apresentou

um par de dupletos em δ 7,61 (H-7”’) e 6,37 (H-8”’) (1H, J = 16,0 Hz), referentes a

hidrogênios olefínicos com estereoquímica trans, outro par de dupletos em δ 7,28 (H-2,6) e

7,07 (H-3,5) (2H, J = 8,7 Hz), característicos de anel benzênico para-dissubstituído, dois

singletos agudos em δ 5,09 (2H, H-7) e 3,86 (3H, H-3”’), sendo este último compatível com

hidrogênios metoxílicos, enquanto que o mais desblindado foi relacionado a hidrogênios

ligados a carbono oxigenado. Foram ainda observados um conjunto de sinais numa região

característica de hidrogênios de açúcar (δ 4,90-3,43) e duas tríades de sinais, atribuídos a

hidrogênios pertencentes a anéis aromáticos 1,2,4-trissubstituídos: (A) δ 7,40; 7,37 e 6,77- (B)

δ 7,16; 7,04 e 6,79, assim reunidos após análise do espectro COSY (Fig. 43, p. 121) .

Vinte oito linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD (125

MHz, CD3OD, Fig. 44, p. 122), sendo duas delas atribuídas a carbonilas de ésteres, δ 169,1

(H-9”’) e 168,2 (C-7’) e cinco associadas a carbonos sp2 oxigenados: δ 158,9 (C-4); 151,9 (C-

4’); 150,8 (C-4”’); 149,5 (C-3”’) e 146,3 (C-3’).

O espectro RMN 13C-DEPT135 de ACS-10 (125 MHz, CD3OD, Fig. 45, p. 123)

revelou a presença de quinze carbonos mono-hidrogenados, dos quais dez foram relacionados

a carbonos sp2 (δ 147,3; 130,9; 124,4; 123,9; 118,0; 117,6; 116,6; 116,0; 115,4 e 111,8) e o

restante foi associado a carbonos sp3 oxigenados: δ 102,3 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,7 (C-5”);

75,0 (C-2”) e 72,0 (C-4”), confirmando uma estrutura heterosídica, tendo o carbono em δ

102,3 como provável carbono anomérico (C-1”). Absorções em δ 67,2 (C-7) e 64,7 (C-6”)

foram atribuídas a carbonos metilênicos oxigenados, já a absorção em δ 56,6 (4”’-OMe)

ratificou a existência de uma metoxila. As demais absorções de 13C em δ 131,9 (C-1); 127,8

(C-1”’) e 122,8 (C-1’), ausentes no espectro DEPT135, foram reconhecidas como sendo de

carbonos aromáticos não-hidrogenados.

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 46, p. 123) mostrou correlações dos sinais de


117

hidrogênios olefínicos em δH 7,61 (H-7”’) e 6,37 (H-8”’) com os sinais de carbono em δC

147,2 (C-7”’) e 115,4 (C-8”’), respectivamente, sugerindo que a olefina estivesse conjugada a

uma das carbonilas, devido às significativas diferenças de deslocamentos químicos

homonucleares (∆δH7”’,8”’ = 1,24 e ∆δC7”’,8”’ = 31,8). A correlação entre as absorções δ 5,09 (H-

7) e δ 67,2 (C-7) elucidou o caráter oxigenado do carbono metilênico, formando

possivelmente um grupo éster. A atribuição feita ao carbono anomérico foi corroborada pela

correlação entre as absorções em δ 4,90 (H-1”) e 102,3 (C-1”), sendo sua configuração

determinada como β através da constante de acoplamento JH,H = 7,4 Hz. O açúcar foi

identificado como glicose, após comparação dos seus dados de RMN 13C com os registrados

na literatura (BREITMAIER, 1974).

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 47, p. 124), através dos acoplamentos

heteronucleares a longa distância (2J e 3J), forneceu as informações necessárias para a

conexão de cada fragmento identificado (Tab. 9, p. 120): três anéis fenólicos (um para-

dissubstituído e outros dois 1,2,4-trissubstituídos, sendo um deles metoxilado), dois grupos

ésteres, um carbono oximetilênico, uma carbonila α,β-insaturada e um fragmento de glicose,

resultando na fórmula molecular C30H30O13, a qual foi ratificada pela presença dos picos dos

adutos moleculares [M+Na]+ m/z 621,1726 e [M+K]+ m/z 637,1472, no espectro de massa de

ACS-10 (EM-IES, Fig. 48, p. 126).

A correlação entre o singleto em δH 5,09 (H-7) com o sinal de carbono em δC 168,2

(C-7’) reforçou a existência de um grupo éster ligado a um dos anéis fenólicos

trissubstituídos, conforme evidências obtidas pelas correlações entre as absorções em δH 7,40

e 7,37 (H-2’,6’) com δC 168,2 (C-7’). Correlações entre o singleto em δH 5,09 (H-7) com os

sinais de carbonos aromáticos em δC 131,9 (C-1) e 130,9 (C-2,6), bem como o acoplamento

entre os hidrogênios aromáticos em δH 7,28 (H-2,6) com o carbono metilênico em δC 67,2 (C-

7) justificaram a ligação do anel benzênico para-dissubstituído à porção oximetilênica do

éster.

Os sinais de hidrogênios olefínicos em δH 7,61 (H-7”’) e 6,37 (H-8”’)

correlacionaram-se com a carbonila em δC 169,1 (C-9”’), corroborando com a presença de

uma carbonila α,β-insaturada. As correlações envolvendo os hidrogênios olefínicos H-7”’ e

H-8”’ (δH 7,61e 6,37) e o hidrogênio aromático H-5”’ (δH 6,79) com o carbono aromático

não-hidrogenado C-1”’ (δC 127,8), além das correlações dos hidrogênios aromáticos H-2”’ e

H-6”’ (δH 7,16 e 7,04) com o carbono olefínico C-7”’ (δC 147,2) revelaram a existência de um


118fragmento cinamoíla. Como a metoxila foi posicinada no C-3”’, devido ao acoplamento entre


119

os hidrogênios metílicos H-3”’ (δ 3,86) e este carbono aromático C-3”’ (δ 149,5), o fragmento

cinamoíla foi caracterizado precisamente como sendo feruloíla.

O acoplamento entre o hidrogênio anomérico H-1” (δ 4,90) com o carbono

oxigenado do anel aromático para-dissubstituído C-4 (δ 158,9) definiu um dos pontos de

ligação do resíduo de açúcar (glicose) com uma das agliconas, uma vez que também foram

observadas correlações entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δ 4,52 e 4,38) e a carbonila do

fragmento feruloíla C-9”’ (δ 169,1), justificando o desblindagem destes mesmos hidrogênios.

A substância ACS-10 é nova na literatura, merecendo a denominação trivial de

amburosídio F [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-feruloilglicopiranosil)-benzila].

131,9

130,9

118,0

158,9

67,2

122,8168,2117,6

146,3151,9

116,0

123,9

102,3

75,078,1

72,0

75,7

64,7

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

147,2

115,4

169,1

127,8

111,8

149,5

116,6150,8

124,4

56,6

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H

H

HH

HH

7,28

7,07

4,90

7,40

6,77

7,37 5,09

3,50

3,514,52

3,43

3,76 4,38

6,37

7,61

7,16

6,79

7,041

2

3

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"6"

1"'2"'

3"'

4"'

5"'

6"' 7"'8"'

9"'

3,86


# C


HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)

HMBC 2J

HMBC 3J

1 131,9 7,07 2,6 130,9 7,28 (2H, d, 8,7 Hz) 5,09 3,5 118,0 7,07 (2H, d, 8,7 Hz) 7,28 4 158,9 7,07 7,28; 4,90 7 67,2 5,09 (2H, s) 7,28 1’ 122,8 6,77 2’ 117,6 7,40 (1H, d, 2,0 Hz) 7,37 3’ 146,3 7,40 6,77 4’ 151,9 7,40; 7,37 5’ 116,0 6,77 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 123,9 7,37 (1H, dd, 8,2 e 2,0 Hz) 7,40 7’ 168,2 5,09 7,40; 7,37 1” 102,3 4,90 (1H, d, 7,4) 3,50 3,76 2” 75,0 3,50 (1H, m) 3” 78,1 3,51 (1H, td) 3,50; 3,43 4,38 4” 72,0 3,43 (1H, m) 3,76 4,38; 3,50 5” 75,7 3,76 (1H, m) 3,43 6” 64,7 4,52 (1H, d); 4,38 (1H, dd) 1”’ 127,8 7,61 6,79; 6,37 2”’ 111,8 7,16 (1H, d, 1,8 Hz) 7,61; 7,04 3”’ 149,5 6,79; 3,86 4”’ 150,8 7,16; 7,04 5”’ 116,6 6,79 (1H, d, 8,2 Hz) 6”’ 124,4 7,04 (1H, dd, 8,2 e 1,8 Hz) 7,61; 7,16 7”’ 147,2 7,61 (1H, d, 16,0 Hz) 7,16; 7,04 8”’ 115,4 6,37 (1H, d, 16,0 Hz) 7,61 9”’ 169,1 6,37

3”’-OMe 56,6 3,86 (3H, s)


120


121


Figura 43- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-8

Figura 43a- Expansão da região δ 6,2-7,7 x 6,2-7,7

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH 3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H

H

HH

HH

7,28

7,07

4,90

7,40

6,77

7,37 5,09

3,50

3,514,52

3,43

3,76 4,38

6,37

7,61

7,16

6,79

7,041

2

3

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"6"

1"'2"'

3"'

4"'

5"'

6"' 7"'8"'

9"'

3,86


122


Figura 44a- Expansão da região δ 108-135 do espectro de RMN 13C-CPD de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz).


123





124


O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H

H

HH

HH

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

1617

1920

21

22

23

24

2518

10

8

24

14

13

91516 5


125

Figura 47a- Expansões do espectro HMBC de ACS-10: (I) δ 6,7-7,5 x 142-162; (II) δ 6,3-7,8 x 120-136; (III) δ 6,9-8,0 x 108-121.

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H

H

HH

HH

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

1617

1920

21

22

23

24

2518

6

17

11

19

25

4 20

22 23

12

18

3

1

2

21


126


203.0568244.2663267.1892

288.2934

316.3247

339.1140

360.3538

377.1073

416.3440

444.3762

463.3113 510.3311 544.3949 569.3204

591.1615

621.1726

637.1472

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z0

1

2

3

4

5

4x10Intens.

14ACS-p5.d: +MS, 100%=51173

5.7. Vanilato de 6”-amburosila (ACS-11)

A reinjeção do quarto pico (tR = 12,50 min) da separação por HPLC de ACSEA(2-

11)(11-18)(18-20), fração oriunda do extrato etanólico das sementes de A. cearensis, permitiu

o isolamento do pico 4.1 (tR = 11,69 min), o qual apresentou-se como um sólido marrom com

pf. 102,6-106,9 °C e [α]25D = -27°, MeOH, c 0,22, sendo denominado ACS-11 (ítem 10.1.7.7,

p. 286).

Os espectros de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 49, p. 130) e 13C (125 MHz,

CD3OD, Fig. 50 e 51, p. 130 e 131) de ACS-11 mostraram-se nitidamente muito semelhantes

aos espectros exibidos por ACS-9, exceto pela existência de sinais em δH 3,83 (3H, s, 3”’-

OMe) e em δC 56,7 (3”’-OMe), os quais foram atribuídos a uma metoxila.

O espectro de RMN-COSY (Fig. 52, p. 131) permitiu a identificação de dois

sistemas aromáticos ABX [I-δ 7,43 (d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,41 (dd, J = 8,2 Hz; J = 2,0 Hz, H-

6’) e 6,79 (d, J = 8,2 Hz, H-5’); II-7,59 (dd, J = 8,2 Hz; J = 1,8 Hz, H-6”’), 7,54 (d, J = 1,8

Hz, 2”’) e 6,87 (d, J = 8,2 Hz, H-5”’)] e um sistema AA’BB’ (δ 7,21 e 7,05-2H, d, J = 8,6 Hz,

H-2,6 e H-3,5).

Através do espectro de RMN-HSQC (Fig. 53, p. 132), foi possível correlacionar os

hidrogênios pertencentes a cada anel aromático com seus respectivos carbonos (Tab. 10, p.

129), bem como confirmar a presença de glicose na estrutura, a partir dos acoplamentos entre

os hidrogênios osídicos (δH 4,93-3,44) e os carbonos sp3 oxigenados: 102,4 (C-1”); 78,1 (C-

3”); 75,8 (C-5”); 75,0 (C-2”); 72,2 (C-4”) e 65,2 (C-6”). A correlação do singleto em δH 5,17

(2H, s, H-7) com o sinal de carbono em δC 67,2 (C-7) ratificou a existência de um grupo

oximetilênico.

A metoxila foi posicionada no carbono C-3”’, em virtude da correlação observada,

no espectro HMBC (Fig. 54, p. 132), entre os hidrogênios metoxílicos (δH 3,83) e o carbono

aromático C-3”’ (δC 148,9).

Intitulada amburosídio G [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-vaniloilglicopiranosil)-

benzila], ACS-11 representa um registro novo para a literatura científica.


127


128

131,9

130,7

117,9

158,9

67,2

122,8168,3117,6

146,3151,9

116,1

123,9

102,4

75,078,1

72,2

75,8

65,2

122,6

168,0

114,0

148,9

153,2O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OCH3

OH

116,2

125,4

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OCH3

OH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HHH

H

7,21

7,05

4,90

7,43

6,79

7,41 5,17

3,50

3,51

4,68

3,44

3,784,40

7,54

1

23

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'7,596,87


# C



HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

1 131,9 5,17 2,6 130,7 7,21 (2H, d, 8,6 Hz) 7,05 5,17 3,5 117,9 7,05 (2H, d, 8,6 Hz) 7,21 4 158,9 7,05 7,21; 4,93 7 67,2 5,17 (2H, s) 7,21 1’ 122,8 7,43 6,79 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 2,0 Hz) 7,41; 6,79 3’ 146,3 7,43 6,79 4’ 151,9 6,79 7,43; 7,41 5’ 116,1 6,79 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, dd, 8,2 e 2,0 Hz) 7’ 168,3 5,17 7,43; 7,41; (6,79) 1” 102,4 4,93 (1H, d, 7,4 Hz) 2” 75,0 3,50 (1H, m) 3,49 3” 78,1 3,51 (1H, td) 3,47; 3,45 4” 72,2 3,44 (1H, m) 5” 75,8 3,78 (1H, m) 4,40 6” 65,2 4,68 (1H, m); 4,40 (1H, m) 1”’ 122,6 7,54 6,87 2”’ 114,0 7,54 (1H, d, 1,8 Hz) 7,59 3”’ 148,9 7,54 6,87; 3,83 4”’ 153,2 6,87 7,59; 7,54 5”’ 116,2 6,87 (1H, d, 8,2 Hz) 6”’ 125,4 7,59 (1H, dd, 8,2 e 1,8 Hz) 7”’ 168,0 7,59; 7,54; (6,87); 4,68

3”’-OMe 56,7 3,83 (3H, s)


129

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OCH3

OH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HHH

H

7,21

7,05

4,90

7,43

6,79

7,41 5,17

3,50

3,51

4,68

3,44

3,784,40

7,54

1

23

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'7,596,87


130



Figura 50a- Expansão da região δ 102-135


131





132

Figura 53- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11


10

6 11 8

20

1314 12



133

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

16

18

O

OH

OCH3

H

H

H

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

17

19

20

21

22


4

17 19

1

2

18 16

3

22

21

5,7 9

15


134

C,H

140), foram feitas as atribuições dos sinais de carbonos hidrogenados pertencentes a cada anel

5.8. Sinapato de 6”-amburosila (ACS-12)

O pico 4.2 (tR = 13,54 min), obtido na segunda tentativa de isolamento dos

componentes coletados no quarto pico do cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-

11)(11-18)(18-20), rendeu um sólido marrom (pf. 126,9-131,4 °C; [α]25D = -27°, MeOH, c

0,20), intitulado ACS-12 (ítem 10.1.7.7, p. 286).

No espectro de RMN 1H de ACS-12 (500 MHz, CD3OD, Fig. 55, p. 138), foram

observados sinais na região de hidrogênios glicosídicos (δ 4,93-3,45), um singleto em δ 5,10

(2H, s, H-7), relacionado a hidrogênio oximetilênico, um par de dupletos em δ 7,30 e 7,08

(2H, J = 8,6 Hz, H-2,6 e H-3,5), compatíveis com um anel benzênico para-dissubstituído, e

uma tríade de sinais em δ 7,39 (H-2’); 7,36 (H-6’) e 6,76 (H-5’), atribuídos a hidrogênios

pertencentes a anel benzênico 1,2,4-trissubstituído, sendo todos os sinais característicos de um

amburosídio. O espectro COSY (Fig. 56, p. 139) ratificou o padrão de substituição. Em

virtude da presença de um par de dupletos em δ 7,62 e 6,42 (1H, J = 15,9 Hz, H-7”’ e H-8”’),

referentes a hidrogênios olefínicos com estereoquímica trans, juntamente com o singleto em δ

6,90 (2H, s, H-2”’,6”’), associado a hidrogênios de anel aromático tetrassubstituído, e δ 3,86

(6H, s, 3”’,5”’-OMe), compatível com hidrogênios metoxílicos, foi sugerida uma estrutura de

um derivado dimetoxi-cinâmico do amburosídio.

Vinte seis linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD de ACS-

12 (125 MHz, CD3OD, Fig. 57, p. 139), sendo duas delas atribuídas a carbonilas de ésteres (δ

169,0, C-9”’ e 168,2, C-7’) e outras cinco foram associadas a carbonos sp2 oxigenados: δ

159,0 (C-4); 151,9 (C-4’); 149,7 (C-3”’,5”’) 146,3 (C-3’) e 140,0 (C-4”’), sendo esta última

absorção característica de carbono aromático oxigenado de derivados do floroglucinol

(FRIEBOLIN, 1991). O sinal em δ 57,1 (C-3”’,5”’) foi atribuído a metoxila. Os sinais em δ

102,4 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,7 (C-5”); 75,0 (C-2”); 72,0 (C-4”) e 64,7 (C-6”) foram

associados ao resíduo de glicose. O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig.

58, p. 140) mostrou apenas dois carbonos metilênicos (δ 67,1, C-7 e 64,7, C-6”), dos quais o

mais desblindado foi relacionado ao carbono oximetilênico ligado ao anel para-dissubstituído

(benziloxi). Subtração dos espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135 revelou as linhas

espectrais relativas aos carbonos aromáticos não-hidrogenados: δ 132,0 (C-1); 126,8 (C-1”’) e

122,8 (C-1’).

Através das correlações existentes no espectro de RMN-HSQC (1J ) (Fig. 59, p.

aromático: anel para-dissubstituído (δC 130,7 e 117,9); anel 1,2,4-trissubstituído (δC 123,9;

117,6 e 116,1) e anel tetrassubstituído (δC 107,2). As correlações dos dupletos em δH 7,62 (H-

7”’) e 6,42 (H-8”’) com os sinais de carbono em δC 147,5 (C-7”’) e 115,9 (C-8”’),

respectivamente, corroboraram a presença de uma olefina.

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 60, p. 141) corroborou a existência de um

fragmento cinâmico, ao revelar os acoplamentos dos hidrogênios olefínicos H-7”’ e H-8”’

com a carbonila C-9”’ (δC 169,0) e com os carbonos aromáticos C-1”’ (δC 126,8) e C-2”’,6”’

(δC 107,2).

As substituições do fragmento cinâmico nas posições 1”’, 3”’, 4”’ e 5” foram

justificadas pelas correlações entre os hidrogênios aromáticos H-2”’,6”’ (δH 6,90) com o

carbono olefínico C-7”’ (δC 147,5) e com os carbonos aromáticos C-1”’ (δC 126,8), C-3”’,5”’

(δC 149,7) e 4”’ (δC 140,0), sendo este padrão de substituição reforçado pela presença de um

singleto no espectro de RMN 1H, com integração para dois hidrogênios (Tab. 11, p. 137).

As metoxilas foram posicionadas nos carbonos C-3”’,5”’ devido à correlação do

singleto agudo em δH 3,86 com o sinal de carbono em δC 149,7, resultando na caracterização

estrutural do fragmento cinâmico sinapoíla.

A evidência do fragmento sinapoíla ligado ao resíduo de glicose, na posição 6”, foi

fornecida pelas correlações entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δH 4,51 e 4,40) e a

carbonila C-9”’ (δ 169,0).

ACS-12, denominada amburosídio H [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-

sinapoilglicopiranosil)-benzila] é uma substância química original, pela primeira vez relatada

na literatura.


135


136

132,0

130,8

118,1

159,0

67,1

122,8168,2117,6

146,3151,9

116,0123,8

102,4

75,078,1

72,0

75,7

64,7

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H3CO 147,5

115,9

169,0

126,8

107,2

149,7

140,0

57,1

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H3CO

H

HH

HH

7,30

7,08

4,93

7,39

6,76

7,36 5,10

3,47

3,49

4,51

3,45

3,73 4,40

6,42

7,62

6,903,86

1

2

3

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'

8"'

9"'


# C



HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

1 132,0 5,10 7,30 2,6 130,8 7,30 (2H, d, 8,6 Hz) 7,08 5,10 3,5 118,1 7,08 (2H, d, 8,6 Hz) 7,30 4 159,0 7,08 7,30; 4,93 7 67,1 5,10 (2H, s) 6,76 1’ 122,8 7,36 2’ 117,6 7,39 (1H, d, 1,9 Hz) 7,39 3’ 146,3 6,76 7,39; 7,36 4’ 151,9 7,36 5’ 116,1 6,76 (1H, d, 8,2 Hz) 7,39 6’ 123,8 7,36 (1H, dd, 8,2 e 1,9 Hz) 7,39; 7,36; 5,10; 4,51 7’ 168,2 1” 102,4 4,93 (1H, d, 7,4) 2” 75,0 3,47 (1H, m) 3,49 3” 78,1 3,49 (1H, td) 3,47; 3,45 4” 72,0 3,45 (1H, m) 5” 75,7 3,73 (1H, m) 4,40 6” 64,7 4,51 (1H, m); 4,40 (1H, m) 1”’ 126,8 7,62 6,90; 6,42

2”’,6”’ 107,2 6,90 (2H, s) (7,62) 3”’,5”’ 149,7 6,90 3,86

4”’ 140,0 6,90 7”’ 147,5 7,62 (1H, d, 15,9 Hz) 6,90 8”’ 115,9 6,42 (1H, d, 15,9 Hz) 7,62 9”’ 169,0 6,42 7,62; 4,51; 4,40

3”’,5”’-OMe 57,1 3,86 (6H, s)


137


138


Figura 55a- Expansões do espectro de RMN 1H de ACS-12: (I) δ 6,3-7,8; (II) δ 63,1-5,3

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H3CO

H

HH

HH

7,30

7,08

4,93

7,39

6,76

7,36 5,10

3,47

3,49

4,51

3,45

3,73 4,40

6,42

7,62

6,903,86

1

2

3

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'

2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'

8"'

9"'



139



132,0

130,8

118,1

159,0

67,1

122,8168,2117,6

146,3151,9

116,0123,8

102,4

75,078,1

72,0

75,7

64,7

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H3CO 147,5

115,9

169,0

126,8

107,2

149,7

140,0

56,6


140





141


O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H3CO

H

HH

HH

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

1617

18

19

20

21

22

23

24

25

10

21

8

13

24Figura 60a- Expansão da região δ 4,3-7,8 x 165-173

5 7

16

9

15

14

4

3

25 12

20

22

23

1

2

19 18

6

11

17


142

Figura 60b- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,5 x 137-160; (II) δ 6,4-7,7 x 114-135.

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

H

H3CO

H

HH

HH

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

1617

18

19

20

21

22

23

24

25

5.9. Galato de 6”-amburosila (ACS-2)

Separações cromatográficas em Sephadex LH-20 e cartucho de SPE da fração

acetato de etila do extrato etanólico das sementes (ACSEA) forneceram um sólido marrom

viscoso (pf. 193,2-197,8 °C; [α]25D = -44°, MeOH, c 0,19), designado ACS-2 (ítem 10.1.7.4,

p. 284).

No espectro de RMN 1H de ACS-2 (500 MHz, CD3OD, Fig. 61, p. 149), foram

observados dupletos em δ 7,29 e 7,06 (2H, d, J = 8,6 Hz, H-2,6 e H-3,5), correspondentes a

um sistema de spin AA’BB’, e um conjunto de sinais em δ 7,43 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-2’);

7,41 (1H, dd, J = 8,0 e 1,7 Hz, H-6’) e 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), referentes a um sistema

de spin ABX, cujas correlações homonucleares foram devidamente ratificadas pelo espectro

COSY (Fig. 62, p. 150). Sinais na faixa de δ 4,90-3,45 foram atribuídos a hidrogênios

osídicos, todavia a presença de duplos dupletos em δ 4,60 (1H, H-6”) e 4,40 (1H, H-6”)

sugeriram um açúcar esterificado através da hidroxila metilênica. Foram encontrados

singletos correspondentes a dois hidrogênios em δ 7,10 (2H, H-2”’,6”’), sugerindo a presença

de um anel aromático tetrassubstituído e simétrico, e em δ 5,19 (2H, H-7), referente a

hidrogênios ligados a carbono oxigenado.

O espectro de RMN 13C-CPD de ACS-2 (125 MHz, CD3OD, Fig. 63, p. 150)

mostrou 23 linhas espectrais, sendo duas delas coincidentemente com os mesmos

deslocamentos químicos (δ 168,3, C-7’ e C-7”’), atribuídas supostamente a carbonilas de

ésteres. Quatro linhas espectrais foram inicialmente associadas a carbonos aromáticos

oxigenados, δ 159,0 (C-4); 151,9 (C-4’); 146,7 (C-3”’,5”’) e 146,3 (C-3’), das quais as duas

últimas foram características de carbonos pertencentes a anéis orto-oxigenados.

O espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-2 (125 MHz, CD3OD, Fig. 64, p. 151)

apresentou onze absorções atribuídas a carbonos monohidrogenados, sendo seis relacionadas

a carbonos sp2 (δ 130,9; 123,9; 117,9; 117,6; 116,1 e 110,4). As outras cinco absorções,

atribuídas a carbonos sp3 oxigenados δ 102,4 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,8 (C-5”); 75,1 (C-2”) e

72,0 (C-4”), juntamente com uma das duas absorções atribuídas a carbonos metilênicos

oxigenados, δ 67,3 (C-7) e 65,0 (C-6”), foram compatíveis com um fragmento de açúcar. As

absorções em δ 140,1 (C-4”’); 131,9 (C-1); 122,8 (C-1’) e 121,6 (C-1”’), inexistentes no

espectro DEPT135, foram relacionadas a carbonos aromáticos não-hidrogenados. Além disso,


143

a atribuição da absorção em δ 140,1 foi retificada, passando a ser associada a um carbono

oxigenado, a fim de atender à evidência de existência de um anel aromático tetrassubstituído.

O pico do íon molecular cationizado [M+Na]+ m/z 597,1356, observado no espectro

de massa de ACS-2 (EM-IES, Fig. 65, p. 151), permitiu a dedução da fórmula molecular

C27H26O14, cuja diferença em relação à formula apresentada por ACS-9 foi de apenas um

oxigênio, sugerindo um análogo estrutural com um dos fragmentos protocatecoíla convertido

em galoíla.

A análise do espectro de RMN-HMBC (Fig. 67, p. 152) permitiu a caracterização do

fragmento galoíla através das correlações entre o singleto em δ 7,10 (H-2”’,6”’) e os sinais

dos carbonos aromáticos em δC 121,6 (C-1”’); 146,7 (C-3”’,5”’), 140,1 (C-4”’) e a carbonila

em δC 168,3 (C-7”’). Os acoplamentos entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (4,60 e 4,40) e

a carbonila C-7”’ (δC 168,3) corroboraram a hipótese da glicose se encontrar esterificada com

o fragmento galoíla. A presença de outro éster na estrutura foi justificada pelas correlações

verificadas entre os hidrogênios oximetilênicos H-7 (δH 5,19) e os hidrogênios aromáticos

H-2’ (δH 7,43) e H-6’ (δH 7,41) com a carbonila C-7’ (δC 168,3), pertencente ao fragmento

protocatecoíla (Tab. 12, p. 146).

As correlações entre o dupleto em δH 7,29 (H-2,6) com o sinal de carbono

oximetilênico em δC 67,3 (C-7), e o singleto em δH 5,19 (H-7) com o sinal de carbono

aromático em δC 130,9 (C-2,6) definiram a ligação do anel benziloxi com o fragmento

protocatecoíla.

A ligação heterosídica entre o anel benzênico para-dissubstituído e a glicose foi

demonstrada através do acoplamento do hidrogênio anomérico H-1” (δH 4,90) com o carbono

aromático oxigenado C-4 (δC 159,0).

O ineditismo de ACS-2 garantiu-lhe a denominação trivial amburosídio C

[protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-galoilglicopiranosil)-benzila].

Os amburosídios são quimicamente muito semelhantes aos litseaefolosidios (192-

194), glicosídios fenólicos isolados de Ilex litsaefolia (Aquifoliaceae), diferindo apenas pela

existência de uma hidroxila no fragmento benziloxi (C-3), implicando em diferenças

significativas de deslocamento químico nos carbonos deste anel aromático, em razão dos

efeitos eletrônicos exercidos pelo oxigênio adicional (efeito mesomérico doador- C-2, C-4 e


144

C-6 e indutivo retirador- C-3), além de afetar a absorção do carbono glicosídico C-2”,


145

possivelmente devido à formação de ponte de H intramolecular (ZHANG et al., 2005) (Tab.

13, p. 147).

131,9

130,9

117,9

159,0

67,3

122,8168,3117,6

146,3151,9

116,1123,9

102,4

75,178,1

72,0

75,8

65,0

121,6

168,3

110,4

146,7

140,1O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HH OH

7,29

7,06

4,90

7,43

6,79

7,41 5,17

3,49

3,494,60

3,45

3,764,40

7,10

1

2

34

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2" 3"4"

5"

6"

1"'2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'


# C



HMBC 2J

HMBC 3J

1 131,9 7,29 2,6 130,9 7,29 (2H, d, 8,6 Hz) 7,06 5,19 3,5 117,9 7,06 (2H, d, 8,6 Hz) 7,29 4 159,0 7,06 7,29; 4,90 7 67,3 5,19 (2H, s) 7,29 1’ 122,8 6,79 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 1,7 Hz) 7,41 3’ 146,3 7,43 6,79 4’ 151,9 6,79 7,41 5’ 116,1 6,79 (1H, d, 8,0 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, dd, 8,0; 1,7 Hz) 7,43 7’ 168,3 7,43; 7,41; 5,19 1” 102,4 4,90 (1H, s, 7,4 Hz) 2” 75,1 3,49 (1H, m) 3” 78,1 3,49 (1H, m) 4,40 3,49 4” 72,0 3,45 (1H, m) 3,76 5” 75,8 3,76 (1H, td) 3,45 6” 65,0 4,60 (1H, m); 4,40 (1H, m) 3,76 1”’ 121,6 7,10

2”’,6”’ 110,4 7,10 (2H, s) 3”’, 5”’ 146,7 7,10

4”’ 140,1 7,10 7”’ 168,3 7,10; 4,60; 4,40


146

Tabela 13- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-8, 10 e 11 e substâncias análogas (192-194) isoladas de Ilex litsaefolia (ZHANG et al., 2005).

# C

192 δC (ppm)

ACS-8 δC (ppm)

193 δC (ppm)

ACS-10 δC (ppm)

194 δC (ppm)

ACS-11 δC (ppm)

1 132,2 132,1 132,0 131,9 131,9 131,9 2 115,8 130,8 115,7 130,9 115,7 130,7 3 147,1 118,0 147,0 118,0 146,9 117,9 4 145,1 159,0 145,1 158,9 145,1 158,9 5 117,3 118,0 117,2 118,0 117,1 117,9 6 119,4 130,8 119,6 130,9 119,3 130,7 7 65,7 67,2 65,7 67,2 65,7 67,2 1’ 121,2 122,9 121,1 122,8 121,1 122,8 2’ 112,2 117,6 112,1 117,6 112,1 117,6 3’ 147,4 146,3 147,3 146,3 147,4 146,3 4’ 151,6 151,9 151,5 151,9 151,7 151,9 5’ 114,6 116,1 114,5 116,0 114,6 116,1 6’ 123,7 123,9 123,7 123,9 123,7 123,9 7’ 166,5 168,3 166,5 168,2 166,5 168,3 1” 102,6 102,3 102,5 102,3 102,5 102,4 2” 73,4 75,0 73,4 75,0 73,4 75,0 3” 76,0 78,0 76,1 78,1 76,1 78,1 4” 70,2 72,0 70,4 72,0 70,6 72,2 5” 74,1 75,6 74,4 75,7 74,4 75,8 6” 63,3 64,8 63,2 64,7 63,6 65,2 1”’ 171,3 172,9 126,3 127,8 121,0 122,6 2”’ 19,3 20,9 113,7 111,8 112,4 114,0 3”’ - 148,3 149,5 147,4 148,9 4”’ - 145,5 150,8 151,5 153,2 5”’ - 115,1 116,6 114,6 116,2 6”’ - 121,7 124,4 123,9 125,4 7”’ - 145,9 147,2 166,4 168,0 8”’ - 113,5 115,4 - 9”’ - 167,5 169,1 -

3’-OMe 55,0 55,0 55,0 3”’-OMe - - 56,6 55,1 56,7

Todas as substâncias foram solubilizadas em CD3OD


147

1

2

3

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

2"'

1"'

O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

O

OCH3

OH

192

O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

OH

1

2

3

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'

6'

7'

1"

2"3"

4"

5" 6"

1"'

2"'

3"'

4"'

5"'

6"' 7"'

8"'

9"'

193

O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

O

O

OCH3

OH

OH

1

23

4

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"

6"

1"'2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'

194


148


149


Figura 61a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACS-2: (I) δ 3,1-5,3

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HHOH

7,29

7,06

4,90

7,43

6,79

7,41 5,17

3,49

3,494,60

3,45

3,764,40

7,10

1

2

34

567

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2" 3"4"

5"

6"

1"'2"'

3"'

4"'5"'

6"' 7"'


150



131,9

130,9

117,9

159,0

67,3

122,8168,3117,6

146,3151,9

116,1123,9

102,4

75,178,1

72,0

75,8

65,2

121,6

168,3

110,4

146,7

140,1O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

O

O

OH

OH

OH


151

Figura 64- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz)


288.2930

416.3466

463.3117

507.3399551.3680

597.1356

639.4223

683.4515

727.4774

771.5040

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z0

1

2

3

4

4x10Intens.

11ACS-gal.d: +MS, 100%=39744


152



10

6 8

18

11 13

9 15


153

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14

15

16

18

O

OH

OH

H

OH

H

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

17

4 17

1

23

14

5, 7

12

16


5.10. Amburosídio B (ACPa-6)

Um sólido marron resinoso (p.f. 132,6-135,4 °C; [α]25D = -35°, c 1,0, MeOH),

intitulado ACPa-6 (ítem 10.1.8.9, p. 295), foi isolado da fração acetato de etila (E7- ACPaA),

gerada pelo particionamento do extrato etanólico da parte aérea de espécimens jovens, através

de tratamento cromatográfico em Sephadex LH-20 e cartucho de SPE.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Fig. 68, p. 158) mostrou uma

banda larga em 3403 cm-1, correspondente à deformação axial da ligação O-H, caracterizando

a presença de hidroxila; absorções intensas em 3065 e 2992 cm-1, referentes a deformação

axial C-H, absorção em 1705 cm-1 relativa à deformação axial C=O, evidenciando a existência

de carbonila de éster; bandas esqueletais em 1603 e 1515 cm-1 de C=Carom.; absorção em 1285,

1225 e 1073 cm-1 referentes às deformações axiais C-O.

ACPa-6 apresentou em seu espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 69, p.

158): dupletos em δ 7,37 (H-2,6) e 7,10 (H-3,5) (2H, d, J = 8,5 Hz), correspondentes a um

anel aromático para-dissubstituído, sinais em δ 7,55 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6’); 7,53 (1H, dd,

J = 8,2 e 2,0 Hz, H-2’) e 6,81 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-5’), referentes a um anel aromático

trissubstituído, um singleto em δ 5,24 (2H, s, H-7), referente a hidrogênios ligados a carbono

oxigenado. Um conjunto de sinais na faixa de δ 4,93-3,45 foi atribuído a hidrogênios osídicos,

exceto um singleto em δ 3,72 (3H, s, 3’-OMe), o qual foi compatível com hidrogênios

metoxílicos.

Dezenove linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-

6 (125 MHz, CD3OD, Fig. 70, p. 159), sendo uma delas atribuídas a carbonila de éster (δ

168,0, C-7’) e três associadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 159,1 (C-4); 153,0 (C-4’)

e 148,8 (C-3’).

O espectro RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig. 71, p. 159) revelou a

presença de dez carbonos mono-hidrogenados, dos quais metade foi relacionada a carbonos

aromáticos: δ 130,9 (C-2,6); 125,2 (C-6’); 117,9 (C-3,5); 116,1 (C-5’); e 113,6 (C-2’). O

restante foi associado a carbonos osídicos, δ 102,3 (C-1”); 78,2 (C-5”); 78,0 (C-3”); 75,0 (C-

2”) e 71,5 (C-4”), juntamente com um dos dois carbonos metilênicos oxigenados, δ 67,3 (C-7)

e 62,6 (C-6”). A absorção em δ 56,6 (3’-OMe) ratificou a existência de uma metoxila. As

demais absorções de 13C em δ 131,8 (C-1) e 122,7 (C-1’), ausentes no espectro DEPT135,


154

foram reconhecidas como pertencentes a carbonos aromáticos não-hidrogenados.

A fórmula molecular C21H24O10, fornecida pelos dados de RMN, foi compatível com

a estrutura de um glicosídio di-aromático monometilado.

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 72, p. 160) revelou os carbonos correspondentes a

cada um dos anéis benzênicos, a partir dos acoplamentos 1J com cada um dos hidrogênios

aromáticos (Tab. 14, p. 157).

A correlação entre o hidrogênio anomérico H-1” (δH 4,93) e o carbono aromático C-

4 (δC 159,1), registrada no espectro de RMN-HMBC (Fig. 73, p. 160), permitiu identificar a

posição da ligação heterosídica. A existência de um fragmento benzílico foi demonstrada

através dos acoplamentos entre os hidrogênios metilênicos H-7 (δH 5,24) com os carbonos

aromáticos C-1 (δC 131,8) e C-2,6 (δC 130,9), mas também entre os hidrogênios aromáticos

H-2,6 (δH 7,37) e o carbono metilênico C-7 (δC 67,3).

Os dois anéis aromáticos foram ligados através de um grupo éster, devido às

correlações dos hidrogênios aromáticos H-2’ (δH 7,53) e H-6’ (δH 7,55) e os hidrogênios

metilênicos H-7 (δH 5,24) com a carbonila C-7’ (δC 168,0). A correlação entre os hidrogênios

metoxílicos (δH 3,72) com o carbono aromático C-3’ (δC 148,8) justificou a posição da

metoxila no carbono 3’ do anel benzênico trissubstituído.

ACPa-6 (lit.: p.f. 130-132 °C) já havia sido identificado nas cascas do caule de A.

cearensis, tendo recebido a denominação comum de amburosídio B (vanilato de 4-O-β-D-

glicopiranosil-benzila) (BRAVO et al., 1999).


155


156

131,8

130,9

117,9

159,1

67,3

122,7

168,0113,6

148,8153,0

116,1

125,2

102,3

75,078,0

71,5

78,2

62,6

O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

OH

56,6

7,37

7,10

4,93

7,53

6,81

7,55 5,24

3,45

3,47

3,70

3,39

3,42 3,861

23

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"6"

O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

OHH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

3,72

Tabela 14- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio B, registrados na literatura (BRAVO et al, 1999).

# C

Amburosídio B δC (ppm) CD3OD

ACPa-6 δC (ppm) CD3OD


HMBC 2J

HMBC 3J

1 130,7 131,8 5,24 7,10 2,6 130,0 130,9 7,37 (2H, d, 8,5 Hz) 5,24 3,5 116,9 117,9 7,10 (2H, d, 8,5 Hz) 7,37 4 157,5 159,1 7,10 7,37 7 66,4 67,3 5,24 (2H, s) 7,37 1’ 121,7 122,7 7,53 6,81 2’ 112,6 113,6 7,53 (1H, d, 2,0 Hz) 7,55 3’ 147,4 148,8 7,53 3,72; 6,81 4’ 151,3 153,0 6,81 7,55; 7,53 5’ 114,9 116,1 6,81 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 124,4 125,2 7,55 (1H, dd, 8,2; 2,0 Hz) 7,53 7’ 167,1 168,0 7,55; 7,53; 5,24 1” 101,0 102,3 4,93 (1H, d, 7,4 Hz) 3,45 2” 73,6 75,0 3,45 (1H, m) 3,47 3” 76,7 78,0 3,47 (1H, td) 3,39 4” 70,1 71,5 3,39 (1H, m) 3,47 3,86; 3,70 5” 76,5 78,2 3,42 (1H, m) 3,70 6” 61,8 62,6 3,86; 3,70 (1H, m)

3’-OMe 56,1 56,6 3,72 (3H, s)


157


158

Figura 68- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-6 (pastilha de KBr)

Figura 69- Espectro de RMN 1H de ACPa-6 (CD3OD, 500 MHz)

7,37

7,10

4,93

7,53

6,81

7,55 5,24

3,45

3,47

3,70

3,39

3,42 3,861

23

4

5

67

1'2'

3'

4'

5'6'

7'

1"

2"3"

4"

5"6"

O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

OHH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

3,72


159

Figura 70- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz)

Figura 71- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz)


160

Figura 72- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6

Figura 73- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6

10

6

11

4 3

5,7

14 12

1 2

8

9

13

15


161

1

2

3

45

67

8

910

11 12

13

14O

O

H3CO

OH

O OOH

OHOH

OHH

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

HH

15

15

5.11. Ácido (E)-o-cumárico glicosilado (ACPa-7)

Cromatografias em Sephadex LH-20 e em cartucho de SPE da fração E7-ACPaQ

(fração aquosa do extrato etanólico da parte aérea de espécimens de 7 meses de cultivo)

permitiram o isolamento de um sólido marrom (tR = 7,20 min), o qual foi purificado por

HPLC, resultando na obtenção de 24 mg de um sólido branco (pf. 234,6-236,1 °C; [α]25D =

-61,7°, MeOH, c 0,78), designado ACPa-7 (ítem 10.1.8.11, p. 296).

O espectro de RMN 1H de ACPa-7 (500 MHz, CD3OD, Fig. 74, p. 166) demonstrou

a presença de dois dupletos em δ 8,12 e 6,52 (1H, J = 16,2 Hz, H-7 e H-8), associados a

hidrogênios olefínicos com estereoquímica trans, um sistema de dois dupletos em δ 7,61 e

7,24 (1H, J = 7,9 Hz, H-6 e H-3, não acoplados) e dois tripletos em δ 7,37 e 7,05 (1H, J = 7,9

Hz, H-4 e H-5), característico de anel aromático orto-dissubstituído, além de um conjunto de

sinais numa faixa de deslocamento químico típica de açúcar (δ 5,00-3,43). No espectro de

RMN-COSY (Fig. 75, p. 167), estes acoplamentos foram ratificados.

Quinze absorções foram observadas no espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz,

CD3OD, (Fig. 76, p. 167), das quais nove foram relacionadas a carbonos sp2 (171,2; 157,6;

141,6; 133,0; 129,0; 125,5; 123,7; 119,7 e 117,1), sendo uma possivelmente pertencente à

carbonila de ácido ou éster (δC-9 171,2) e uma referente a carbono aromático oxigenado (δC-2

157,6). As outras seis absorções foram associadas a carbonos sp3 oxigenados, δ 102,5 (C-1’);

78,4 (C-5’); 78,3 (C-3’); 75,0 (C-2’); 71,4 (C-4’) e 62,6 (C-6’), compatíveis com os

deslocamentos químicos de glicose, relatados na literatura.

A comparação do espectro de RMN 13C-CPD com o espectro DEPT135 (125 MHz,

CD3OD, Fig. 77, p. 168) revelou a diferença de três linhas espectrais, δ 171,2 (C-9), 157,6

(C-2) e 125,5 (C-1), as quais foram relacionadas a carbonos sp2 não-hidrogenados. No

espectro DEPT135, todas as linhas espectrais foram associadas a carbonos mono-

hidrogenados, exceto a absorção em δ 62,6 (C-6’), atribuída a carbono metilênico.

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 78, p. 168) permitiu correlacionar os hidrogênios

olefínicos H-7 e H-8 (δH 8,12 e 6,52) diretamente ligados aos seus respectivos carbonos (δC

141,6 e 119,7), sugerindo a presença de uma olefina adjacente à carbonila devido às

significativas diferenças de deslocamentos químicos, provocadas pelo efeito mesomérico

retirador da carbonila. As atribuições dos sinais de hidrogênios e carbonos aromáticos foram

baseadas nas correlações observadas no espectro HSQC, todavia a multiplicidade e os


162


163

deslocamentos químicos, considerando principalmente os efeitos de blindagem do carbono

oxigenado, foram decisivos para os inequívocos assinalamentos.

O espectro de massa de ACPa-7 (EM-IE, Fig. 79, p. 169) apresentou o pico íon-

molecular apenas detectável (m/z 326) e fragmentos com m/z resultantes de quebras

seqüenciais sofridas pela aglicona: 164 (perda de glicose), 146 (desidratação do ácido o-

cumárico, seguida de lactonização) e 118 (pico base, descarbonilação).

Os dados de RMN e EM forneceram a composição elementar C15H18O8,

correspondendo supostamente a um glicosídio cinâmico, o qual poderia ser referente a um

éster de glicose (orto-hidroxi-cinamato de glicosila, I) ou um ácido cinâmico orto-glicosilado

(II).

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 81, p. 170) demonstrou indubitavelmente a

ligação da porção etilênica ao anel aromático através de diversas correlações como:

acoplamentos do hidrogênios aromáticos H-3 (δH 7,24; 4J) e H-6 (δH 7,61) com o carbono

olefínico C-7 (δC 141,6), acoplamentos dos hidrogênios olefínicos H-7 (δH 8,12) e H-8 (δH

6,52) com o carbono ipso C-1 (δC 125,5), além dos acoplamentos do hidrogênio H-6 (δH 7,61)

com os carbonos aromáticos C-2 (δC 157,6) e C-6 (δC 129,0) (Tab. 15, p. 165).

A existência de uma carbonila α,β-insaturada foi ratificada através das correlações

entre os hidrogênios olefínicos H-7 (δH 8,12) e H-8 (δH 6,52) com a carbonila (δC 171,2),

observadas no espectro HMBC.

A correlação do hidrogênio anomérico H-1’ (δH 5,00) com o carbono aromático

oxigenado C-2 (δC 157,6) foi a prova insofismável de que a estrutura de ACPa-7 correspondia

à proposta II, ou seja, o ác. (E)-cumárico glicosilado, substância nova no gênero.

O OOH

OHOH

OH

CO2H

1

2

34

5

6

7

8

9

1'

2'3'

4'

5'

6'

1

2

34

5

6

7

89 1'

2'3'

4'

5' 6'OOH

OHOH

OH

OH

OO

I II


164

O OOH

OHOH

OH

HH

CO2H

H

H

H

HH

H

H

H

H

H

H

1

2

34

5

6

7

8

9

1'

2'3'

4'

5'

6'

7,24

7,37

7,05

7,61

8,12 6,52

5,00

3,57

3,49

3,43

3,463,89

3,71

O OOH

OHOH

OH

CO2H

119,7

157,6

117,1

133,0

123,7

129,0

141,6

125,5

171,2

102,5

75,078,3

71,4

78,4 62,6

Tabela 15- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.

# C



HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

1 125,5 6,97; 5,97 2 157,6 7,24 8,12; 7,61; 7,37; 5,00 3 117,1 7,24 (1H, d, 7,9 Hz) 7,37 7,05 4 133,0 7,37 (1H, t, 7,9 Hz) 7,24; 7,05 7,61 5 123,7 7,05 (1H, t, 7,9 Hz) 7,37 7,24 6 129,0 7,61 (1H, d, 7,9 Hz) 7,05 8,12; 7,37 7 141,6 8,12 (1H, d, 16,2 Hz) 6,52 7,61; (7,24) 8 119,7 6,52 (1H, d, 16,2 Hz) 8,12 9 171,2 6,52 7,31 1’ 102,5 5,00 (1H, d, 7,8 Hz) 3,49 2’ 75,0 3,57 (1H, m) 3’ 78,3 3,49 (1H, td) 4,94 4’ 71,4 3,43 (1H, m) 5’ 78,4 3,46 (1H, m) 3,46 6’ 62,6 3,89 (1H, m); 3,71 (1H, m)


165


166

Figura 74- Espectro de RMN 1H de ACPa-7 (CD3OD), 500 MHz)

Figura 74a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACPa-7 da região de: (I) δ 3,2-4,0.

O OOH

OHOH

OH

HH

CO2H

H

H

H

HH

H

H

H

H

H

H

1

2

34

5

6

7

8

9

1'

2'3'

4'

5'

6'

7,24

7,37

7,05

7,61

8,12 6,52

5,00

3,57

3,49

3,43

3,463,89

3,71


167

Figura 75- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACPa-7

Figura 76- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-7 (MeOD, 125 MHz)


168


Figura 78- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7


169

Figura 79- Espectro de massa de ACPa-7 (Impacto Eletrônico)

Figura 80- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-7(pastilha de KBr)

1 8

6

3

7

2

13 4

9

5

10

11

12



170

Figura 81- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7

O OOH

OHOH

OH

HH

CO2H

H

H

H

HH

H

H

H

H

H

H

12 3

45

6

7

8

910

11

1213

5.12. Ácido (Z)-o-cumárico glicosilado (ACX-1)

A fração butanólica, originada de cromatografia em Sephadex LH-20 e partição

líquido-líquido do extrato etanólico do xilopódio, rendeu um sólido resinoso amarelo (ítem

10.1.8.3, p. 292) denominado ACX-1 (pf. 98,7-100,0 °C; [α]25D= -43°, MeOH, c 0,32), após

separação obtida por HPLC (fase reversa- tR = 7,87 min).

A análise do espectro de RMN 1H de ACX-1 (500 MHz, CD3OD, Fig. 82, p. 175)

permitiu a identificação de um anel aromático orto-dissubstituído, devido à presença de um

sistema de dois dupletos em δ 7,53 e 7,19 (1H, J = 7,9 Hz, H-6 e H-3; não-acoplados) e dois

tripletos em δ 7,30 e 6,97 (1H, J = 7,9 Hz, H-4 e H-5), um grupo etilênico com

estereoquímica cis [δ 7,31 e 5,97 (1H, d, J = 12,5 Hz, H-7 e H-8)], e um açúcar, justificado

pela existência de um conjunto de sinais na faixa de δ 4,94-3,40. Todos acoplamentos 1H, 1H

foram constatados no espectro de RMN-COSY (Fig. 83, p. 175)

O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 84, p. 176) apresentou

quinze linhas espectrais, cujos deslocamentos químicos foram muito próximos aos observados

para ACPa-7, sendo idênticos os valores atribuídos ao resíduo de glicose: δ 102,7 (C-1’); 78,3

(C-5’); 78,2 (C-3’); 75,0 (C-2’); 71,4 (C-4’) e 62,6 (C-6’). As absorções da aglicona foram

relacionadas a nove carbonos sp2, das quais uma foi atribuída à carbonila de éster ou ácido (δ

170,4, C-9).

As outras oito absorções foram determinadas utilizando-se o espectro de RMN-

HSQC (Fig. 86, p. 177), o qual permitiu identificar os quatro carbonos aromáticos

hidrogenados, δ 116,6 (C-3); 131,5 (C-4); 122,9 (C-5) e 131,7 (C-6), e os dois carbonos

olefínicos, δ 139,7 (C-7) e 121,4 (C-8), a partir das correlações diretas com seus respectivos

hidrogênios δ 7,19 (H-3); 7,30 (H-4); 6,97 (H-5); 7,53 (H-6); 7,31 (H-7) e 6,52 (H-8). Os

sinais em δC 156,7 (C-2) e 126,9 (C-1), desprovidos de correlação, foram atribuídos a

carbonos aromáticos não hidrogenados, sendo o mais desprotegido associado a carbono

oxigenado (Tab. 16, p. 174).

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 87, p. 177) mostrou as correlações dos sinais de

hidrogênios olefínicos em δ 7,31 (H-7) e δ 6,52 (H-8) com o sinal da carbonila em δ 170,4

(C-9), evidenciando a presença de uma carbonila α,β-insaturada. A olefina foi conectada ao

anel aromático devido às correlações entre os sinais de hidrogênios olefínicos em δ 7,31 (H-7)


171

e 6,52 (H-8) com os sinais de carbonos aromáticos em δ 126,9 (C-1), 156,7 (C-2) 131,7 (C-

6), e entre o sinal de hidrogênio aromático em δ 7,53 (H-6) e o sinal de carbono olefínico em

δ 139,7 (C-7). O acoplamento do hidrogênio anomérico H-1” (δH 4,94) com o carbono

aromático C-2 (δC 156,7) revelou a ligação heterosídica entre a glicose e o anel aromático, na

posição orto.

Em virtude da nítida semelhança encontrada entre os dados espectrais de IV (Fig.

88, p. 178) e EM (Fig. 89, p. 179), inclusive resultando na mesma fórmula molecular

C15H18O8, ACX-1 e ACPa-7 foram considerados estereoisômeros, os quais foram distintos

apenas pela configuração da ligação dupla (E e Z, respectivamente), fornecida pela constante

de acoplamento dos hidrogênios olefínicos. Seus espectros de EM apresentam o mesmo

padrão de fragmentação e os de IV exibem absorções semelhantes, sendo a identificação por

estas técnicas inconclusiva. Comparação com dados de RMN 13C disponíveis da literatura

confirmou a proposta estrutural (Vasange et al, 1997)

Os deslocamentos químicos de RMN 1H dos hidrogênios olefínicos de ACPa-7 e

ACX-1, obtidos experimentalmente, foram muito parecidos com os calculados para os

estereoisômeros, segundo a equação de predição de Pascual-Meier-Simon: δH= 5,25 + δgem +

δcis + δtrans, adotando-se como substituintes uma carboxila e um grupo fenila. Através desta

equação, obteve-se a ratificação de que os hidrogênios olefínicos numa configuração E são

mais desblindados do que aqueles com estereoquímica Z, devido aos menores efeitos estéricos

(SILVERSTEIN, 1994).

aH

Hb

OH

O aH

O

OH

Hb

(E) (Z)

Isômero (E) Isômero (Z)

δH = 5,25 + δgem + δcis + δtrans δH = 5,25 + δgem + δcis + δtrans

δHa = 5,25 + 1,35 + 1,35 + 0,0= 7,95 δHa = 5,25 + 1,35 + 0,0 + 0,74= 7,34

δHb = 5,25 + 1,0 + 0,37 + 0,0= 6,62 δHb = 5,25 + 1,00 + 0,0 - 0,10= 6,15


172


173

Os estereoisômeros do ácido o-cumárico glicosilado são possivelmente os

precursores da cumarina, um dos constituintes majoritários de A. cearensis. É sabido que

ácidos do tipo 2-hidroxi-cinâmico podem sofrer isomerização, ou seja, o esteroisômero (E)

pode se converter na forma menos estável (Z), quando exposto à radiação UV. Embora seja

geralmente desfavorável, este processo se desenvolve bem em sistemas completamente

conjugados, pois a absorção de energia luminosa pela ligação dupla promove a transição de

um életron do orbital π para um estado de mais alta energia (π* anti-ligante), transformando-a

temporariamente em ligação simples, a qual possui livre rotação, resultando na formação do

isômero (Z), após dissipação da energia recebida. O isômero (Z) pode sofrer uma lactonização

enzimática e dar origem à cumarina (DEWICK, 2001).

A biossíntese da cumarina pode ocorrer a partir das agliconas ou dos heterosídios de

ambos os estereoisômeros, porque a lactonização pode ser precedida de hidrólise enzimática

do glicosídio. Em espécies de Melilotus alba (Fabaceae) atribui-se a presença de cumarina à

hidrólise enzimática seguida de lactonização dos glicosídios induzidas por danos aos tecidos

da planta durante sua coleta e processamento (DEWICK, 2001).

O OOH

OHOH

OH

CO2H126,9

156,7

116,6

131,5

122,9

131,7

139,7

121,4170,4

102,7

75,078,2

71,4

78,3 62,6

O OOH

OHOH

OH

CO2HH

H

H

H

H

HH

H

H

H

H

H

H

1

2

34

5

6

7

89

1'

2'3'

4'

5'

6'

7,19

7,30

6,97

7,53

7,31

5,97

4,94

3,46

3,49

3,40

3,433,87

3,70


174

1.

Esquema 1- Biossíntese da cumarina a partir dos estereoisômeros do ácido o-cumárico glicosilado.

Tabela 16- Dados de RMN 1H e 13C de ACX-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.

# C

ACX-1 δC (ppm) CD3OD


HMBC 2J

HMBC 3J/(4J)

1 126,9 7,31 6,97; 5,97 2 156,7 7,19 7,53; 7,31; 5,97 (4J); 4,943 116,6 7,19 (1H, d, 7,9 Hz) (7,53); (7,31); 7,30 4 131,5 7,30 (1H, t, 7,9 Hz) 7,19 5 122,9 6,97 (1H, t, 7,9 Hz) 7,19 6 131,7 7,53 (1H, d, 7,9 Hz) 7,30; (7,19); 6,97; (5,97) 7 139,7 7,31 (1H, d, 12,5 Hz) 5,97 7,53 8 121,4 5,97 (1H, d, 12,5 Hz) 7,31 9 170,4 5,97 7,31 1’ 102,7 4,94 (1H, d, 7,4 Hz) 3,49 2’ 75,0 3,49 (1H, m) 4,94 3’ 78,2 3,46 (1H, td) 4,94 4’ 71,4 3,40 (1H, m) 3,43 5’ 78,3 3,43 (1H, m) 3,46 6’ 62,6 3,87 (1H, d); 3,70 (1H, dd)

2.

UDP-glicoseO

OH

OHOH

O

OH

CO2H

CO2H

OH

CO2HOHO O

Luz

hv

O O

Enzima

OOH

OHOH

O

OH

CO2H

OOH

OHOH

O

OH

CO2H


175

Figura 82- Espectro de RMN 1H de ACX-1 (CD3OD, 500 MHz)

Figura 83- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACX-1

O OOH

OHOH

OH

CO2HH

H

H

H

H

HH

H

H

H

H

H

H

1

2

34

5

6

7

89

1'

2'3'

4'

5'

6'

7,19

7,30

6,97

7,53

7,31

5,97

4,94

3,46

3,49

3,40

3,433,87

3,70


176

Figura 84- Espectro de RMN 13C-CPD de ACX-1 (CD3OD, 125 MHz)

Figura 85- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACX-1


177

Figura 86- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1

Figura 87- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1

4

7 2

13 11 10

1 3

12


178

Figura 87a- Expansão do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,8 x 110-145.

Figura 88- Espectro de absorção na região do infravermelho (pastilha de KBr) de ACX-1

4

7

5 8

9

6

O OOH

OHOH

OH

CO2HH

H

H

H

H

HH

H

H

H

H

H

H

1 234

56

7

8

9

10

1112

13


179

Figura 89- Espectro de massa de ACX-1 (Impacto Eletrônico)

5.13. Formononetina (ACCE-9)

A fração metanólica ACCE1AM, obtida por partição líquido-líquido do extrato

etanólico das cascas do caule (ACCE), foi submetida a cromatografias em gel de sílica e

Sephadex LH-20, resultando num precipitado amarelado, que ao ser filtrado e tratado com

MeOH, converteu-se num sólido branco puro (p.f. 240,2-242,9 °C), chamado de ACCE-9

(ítem 10.1.6.13, p. 281).

O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, C5D5N, Fig. 90, p. 183) de ACCE-9 exibiu

catorze linhas espectrais, sendo todas atribuídas a carbonos sp2 (δ 176,2; 164,6; 160,5; 159,1;

153,3; 131,3; 128,7; 125,9; 125,1; 118,4; 116,4; 114,7 e 103,6), exceto a absorção em δ 55,7

(4’-OMe), relacionada a carbono sp3 oxigenado. A absorção em δ 176,2 (C-4) foi associada à

carbonila de cetona conjugada e os sinais em δ 164,6 (C-7); 160,5 (C-4’); 159,1 (C-9) e 153,3

(C-2) foram associados a carbonos sp2 oxigenados.

O espectro RMN 13C-DEPT135 de ACCE-9 (125 MHz, C5D5N, Fig. 91, p. 183)

exibiu sete linhas espectrais, das quais seis relacionadas a carbonos mono-hidrogenados

(δ 153,3; 131,3; 128,7; 116,4; 114,7 e 103,6) e uma pertencente à metoxila (δ 55,7).

Subtração dos espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135 permitiu a identificação dos carbonos

sp2 não-hidrogenados e não-funcionalizados: δ 125,9 (C-1’); 125,1 (C-3) e 118,4 (C-10).

Considerando-se a existência de 16 carbonos, foi sugerida uma estrutura com esqueleto

C6-C3-C6.

O espectro de RMN 1H de ACCE-9 (500 MHz, C5D5N, Fig. 92, p. 184) mostrou um

conjunto de sinais em δ 8,47 (1H, d, J = 8,8 Hz, H-5); 7,26 (1H, dd, J = 8,8 e 2,2 Hz, H-6) e

7,15 (1H, d, J = 2,2 Hz, H-8), referentes a um sistema aromático de spin ABX, dois dupletos

em δ 7,80 e 7,10 (2H, J = 8,8 Hz, H-2’,6’ e H-3’,5’), compatíveis com um sistema aromático

de spin AA’BB’, um sinal simples e agudo em δ 3,71 (3H, s, 4’-OMe), relacionado a

hidrogênios metoxílicos e um singleto em δ 8,18, característico de hidrogênio olefínico de

isoflavona.

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 93, p. 185) reforçou a presença de um anel

benzênico para-dissubstituído, através das correlações entre os dupletos em δH 7,80 (H-2’,6’)

e 7,10 (H-3’,5’) e as absorções de carbono em δC 131,3 (C-2’,6’) e 114,7 (C-3’,5’),

justificando a maior intensidade dos seus sinais. A fórmula molecular obtida foi C16H12O4,


180

compatível com estruturas de isoflavonas dissubstituídas por uma hidroxila e uma metoxila.


181

A proposta estrutural de uma isoflavona foi justificada pelo acoplamento do

hidrogênio olefínico H-2 (δH 8,18) com o carbono olefínico oxigenado C-2 (δC 153,3),

observado no espectro HSQC, mas também pelos acoplamentos à longa distância (espectro

HMBC) do mesmo hidrogênio olefínico (H-2) com o carbono olefínico C-3 (δC 125,1) e com

a carbonila C-4 (δC 176,2) (Tab. 17, p. 182).

A metoxila foi posicionada no anel benzênico para-dissubstituído devido ao

acoplamento 3J, observado no espectro de RMN-HMBC (Fig. 94, p. 186), entre os

hidrogênios metoxílicos (δH 3,71) e o carbono aromático C-4’ (δC 160,5).

Quanto ao posicionamento da hidroxila no anel A (trissubstituído), ela poderia

ocupar as posições 6 ou 7, pois em ambas as proposições, o padrão de multiplicidade dos

sinais de hidrogênio seria mantido.

aromático H-5 (δH 8,47) e a carbonila C-4 (δC 176,2), foi determinante para a definição da

posição da hidroxila, no carbono C-7. Além disso, a absorção em δC 103,6 (C-8) é

perfeitamente compatível com o deslocamento químico de um carbono posicionado entre dois

carbonos aromáticos oxigenados, em virtude da significativa blindagem oferecida pelo efeito

mesomérico doador dos oxigênios, orto a este carbono (FRIEBOLIN, 1991).

A formononetina é um conhecido fitoestrógeno encontrado na soja, sendo apontada

como um de seus componentes alergênicos (PARK et al., 2005). Além disso, exibe atividade

giardicida in vitro cinco vezes mais potente do que a do metronidazol, umas das drogas-

referência (KHAN et al, 2000).

O

OOCH3

OH H

H

H

H

H

H

1'

2

3

456

7

89

102'

3'4'5'

6'

8,18

8,47

7,26

7,15

3,717,80

7,10

O

OOCH3

OH153,3

125,1

176,2

128,7

116,4

164,6

103,6159,1

118,4125,9

131,3114,7

160,5

55,7

No entanto, o acoplamento registrado no espectro HMBC, entre o hidrogênio 8,47

H

OH

H

H O

O

128,7

116,4

164,6

118,4

159,1

103,6

7,15

7,26

8,47H

H

H

OH O

O128,7

116,4

164,6

118,4

159,1103,6

7,26

7,15

Tabela 17- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de formononetina, registrados na literatura (JHA et al., 1980).

# C

Formonetina δC (ppm)

CDCl3/DMSO

ACCE-9 δC (ppm)

C5D5N


HMBC 2J

HMBC 3J

2 152,7 153,3 8,18 (1H, s) 3 123,6 125,1 8,18 4 174,9 176,2 8,47; 8,18 5 127,3 128,7 8,47 (1H, d, 8,8 Hz) 6 115,1 116,4 7,26 (1H, dd, 8,8 Hz e 2,2) 7,15 7 162,7 164,6 8,47 8 102,2 103,6 7,15 (1H, d, 2,2 Hz) 7,26 9 157,7 159,1 7,15 8,47; 8,18 10 116,8 118,4 7,15 1’ 124,4 125,9 8,18; 7,10

2’,6’ 130,0 131,3 7,80 (2H, d, 8,8 Hz) 3’,5’ 113,6 114,7 7,10 (2H, d, 8,8 Hz)

4’ 159,1 160,5 7,10 7,80; 3,71 4’-OMe - 55,7 3,71 (3H, s)


182


183

Figura 90- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz)

Figura 91- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz)

O

OOCH3

OH H

H

H

H

H

H

1'

2

3

456

7

89

102'

3'4'5'

6'

8,18

8,47

7,26

7,15

3,717,80

7,10


184

Figura 92- Espectro de RMN 1H de ACCE-9 (C5D5N, 500 MHz)


185

Figura 93- Espectro de RMN-HSQC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9

Figura 93a- Expansão do espectro HSQC de ACCE-9: δ 7,0-8,5 x 100-133

6

10

5

11 1618

917

1

1415 13

7 82

4

Figura 94- Espectro de RMN-H

OH

H

2

4

57

8

11

3

Aspectos Químicos do Estudo Interdiscipli

12

3

MBC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9

O

OOCH3

H

H

H

H

H

1

69

10

1213

14

15

16 17

18

nar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith 186

5.14. Aiapina (ACPa-4)

Cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20 permitiram a obtenção de cristais

incolores (62,5 mg; p.f. 221-224 °C), denominados ACPa-4 (ítem 10.1.8.8, p. 295), a partir

da fração acetato de etila (E7- ACPaA), resultante da partição H2O/AcOEt do extrato

etanólico da parte aérea de espécimens jovens.

Submetido à análise espectroscópica na região do infravermelho (Fig. 95, p. 189),

ACPa-4 exibiu bandas esqueletais em 1682, 1579 e 1498 cm-1, referentes a deformações

axiais C=Carom, absorções em 1256 e 1224 cm-1, associadas a deformações axiais C-O, bandas

em 940, 881 e 836 cm-1, relacionadas a deformações angulares Carom-H. Absorção em 1705

cm-1 foi atribuída a uma deformação axial C=O, característica de carbonila conjugada.

O espectro de RMN 1H de ACPa-4 (500 MHz, CDCl3, Fig. 96, p. 189) exibiu um

par de dupletos em δ 7,58 e 6,28 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-4 e H-3), associados a hidrogênios

olefínicos com configuração cis, característicos de compostos cumarínicos, dois singletos,

coincidentes, em δ 6,83 (2H, s, H-5 e H-8), relacionados a hidrogênios aromáticos isolados e

um singleto em δ 6,08 (2H, s, 6,7-OCH2O), atribuído à presença de um grupo metilenodioxi.

No espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-4 (125 MHz, CDCl3, Fig. 97, p. 190) foram

visualizados dez sinais, dos quais um foi compatível com carbonila de lactona α,β-insaturada

(δ 161,4, C-2), três foram atribuídos a carbonos aromáticos oxigenados, δ 151,5 (C-7); 151,5

(C-10) e 145,1 (C-6) e dois foram relacionados a carbonos olefínicos, δ 143,7 (C-4) e 113,6

(C-3). Tendo em vista que a absorção em δ 102,6 (6,7-OCH2O) foi a única com amplitude

negativa, no espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-4 (125 MHz, CDCl3, Fig. 98, p. 190),

este sinal foi atribuído ao carbono metilênico dioxigenado, enquanto que as linhas espectrais

em δ 105,2 (C-5) e 98,6 (C-8) foram associadas a carbonos aromáticos hidrogenados. O sinal

de carbono em δ 112,9 (C-9), presente apenas no espectro CPD, foi relacionado a um carbono

aromático não-hidrogenado.

O espectro de massa (Fig. 99, p. 191) forneceu o pico íon molecular com m/z 190, a

partir da qual se deduziu a fórmula molecular obtida C10H6O4, correspondente à estrutura de

uma cumarina dissubstituída por um grupo metilenodioxi, nas posições 6 e 7, devido à

ausência de acoplamento entre os hidrogênios aromáticos. As atribuições dos sinais δC 105,2

(C-5) e 98,6 (C-8) foram baseadas na análise dos efeitos eletrônicos dos substituintes do anel

benzênico, os quais exercem uma maior blindagem no carbono localizado entre dois átomos


187


188

de oxigênio (C-8). Comparação com dados de RMN, já publicados para a cumarina aiapina

(lit. 221-223 °C), confirmou a estrutura proposta (DEBENEDETTI et al., 1998) (Tab. 18).

Isolada pela primeira vez de Eupatorium ayapana (Asteraceae), a aiapina já foi

também descrita em outras espécies da mesma família (Helianthus annus, Artemisia apiacea,

Pterocaulon virgatum e P. polystachyum) (MAES et al., 2005), sendo considerada uma

fitoalexina em razão de sua propriedade fungitóxica (PRATS et al., 2006).

Tabela 18- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aiapina, registrados na literatura (DEBENEDETTI et al., 1998).

# C

Aiapina δC (ppm)

CDCl3

ACPa-4 δC (ppm)

CDCl3


113,6

98,6

145,1

151,5151,5

161,4

143,7

102,6

105,2112,9

O

O

O O

2 161,2 161,4 3 113,4 113,6 6,28 (1H,d, 9,5 Hz) 4 143,4 143,7 7,58 (1H,d, 9,5 Hz) 5 105,0 105,2 6,83 (1H, s) 6 143,4 145,1 7 151,3 151,5 8 98,4 98,6 6,83 (1H, s) 9 112,7 112,9 10 149,4 151,5

6,7-OCH2O 102,3 102,6 6,08 (2H, s)

6,28

7,586,83

6,08

O

O

O O

H

H H

H

2

3

456

78

10

9

6,83


189

Figura 95- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-4 (pastilha de KBr)

Figura 96- Espectro de RMN 1H de ACPa-4 (CDCl3, 500 MHz)

6,28

7,586,83

6,08

O

O

O O

H

H H

H

2

3

456

78

8a

4a

6,83


190

Figura 97- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz)

Figura 98- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz)


191

Figura 99- Espectro de massa de ACPa-4 (Impacto Eletrônico)

5.15. 6-hidroxi-cumarina (ACS-5)

ACS-5, um sólido branco (5 mg; pf. 221,7-222,9 °C, tR = 10,30 min), foi isolado

através de separação em HPLC da fração acetato de etila (ACSEA) do extrato etanólico das

sementes (ítem 10.1.7.6, p. 285), previamente cromatografada em Sephadex LH-20 e gel de

sílica.

O espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3COCD3, Fig. 100, p. 195) de ACS-5 exibiu

um sistema de spin ABX [δ 7,19 (1H, d, J = 8,9 Hz, H-8); 7,10 (1H, dd, J = 8,9 e 2,7 Hz, H-7)

e 7,06 (1H, d, J = 2,7 Hz, H-5)] e um par de dupletos em δ 7,86 e 6,36 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-4

e H-3), associados a hidrogênios olefínicos com estereoquímica cis, característicos de

compostos cumarínicos.

No espectro de RMN 13C-CPD de ACS-5 (125 MHz, CD3COCD3, Fig. 101, p. 195)

foram observados nove sinais, dos quais um foi compatível com carbonila de lactona α,β-

insaturada (δ 161,0, C-2) e dois foram atribuídos a carbonos aromáticos oxigenados (δ 154,8,

C-6 e 148,8, C-10). No espectro RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3COCD3, Fig. 102, p.

196), os cinco sinais existentes foram referentes a carbonos sp2 monohidrogenados: δ 144,4

(C-4); 120,6 (C-7); 118,2 (C-8); 117,6 (C-3) e 113,6 (C-5). Comparação dos espectros de

RMN 13C-CPD e DEPT135 permitiu relacionar a outra absorção em δ 120,6 (C-9) a carbono

não-hidrogenado e não-funcionalizado.

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 103, p. 196) revelou as absorções correspondentes

à olefina, através dos acoplamentos entre os dupletos em δH 7,86 (H-4) e 6,36 (H-3) com os

sinais de carbono em δC 144,4 (H-4) e 117,6 (H-3), respectivamente. Além disso, os sinais de

carbonos aromáticos em δC 120,6 (H-7); 118,2 (H-8) e 113,6 (H-5) foram correlacionados

com seus respectivos sinais de hidrogênio em δH 7,10 (H-7); 7,19 (H-8) e 7,06 (H-5) (Tab.

19, p. 194).

Segundo o espectro de massa (EM-IE, Fig. 104, p. 197), ACS-5 possui uma massa

molecular de 162 Da, compatível com a fórmula molecular C9H6O3 correspondendo à

estrutura de uma cumarina monohidroxilada, na posição 6 ou 7 (umbeliferona), em virtude da

presença de um sistema ABX. Além do pico íon-molecular (m/z 162), somente um fragmento

com m/z 134, resultante da descarbonilação cumarínica, pareceu significativo.

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 105, p. 197) exibiu as correlações do sinal de


192

hidrogênio em δ 7,86 (H-4) com o sinal de carbono em δ 113,6 (C-5, 3J) e o acoplamento do


193

duplo dupleto em δ 7,10 (H-7) com o sinal de carbono em δ 148,8 (C-10, 3J), justificando a

escolha pela proposta I, em detrimento da proposta II cujos acoplamentos seriam ambos

hipoteticamente 4J. Ainda que acoplamentos em “W” sejam observados em compostos

cumarínicos. Além disso, absorções em torno de δC 162-163 e δC 102-103, ausentes no

espectro de ACS-5, são características para os carbonos C-7 e C-8, respectivamente, em

derivados da umbeliferona. No carbono oxigenado há uma desblindagem adicional devido à

conjugação com a carbonila, enquanto que no outro carbono, a proteção ocorre em virtude do

forte efeito mesomérico doador exercido pelos átomos de oxigênio orto a este carbono

(POUCHERT, 1993). O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3COCD3, Fig. 106, p.

198) de uma amostra autêntica de umbeliferona ratifica estas inferições.

Em termos cromatográficos, a 6-hidroxi-cumarina também apresenta

comportamento diferente da umbeliferona (lit. 230-233 °C), conforme pode ser constatado

pelos tempos de retenção nos respectivos cromatogramas de HPLC (Fig. 107 e 108, p.198):

11,7 e 13,10 min.

6-hidroxi-cumarina já foi isolada da parte aérea de Bidens parviflora-Asteraceae

(TOMMASI et al., 1992), das raízes de Paeonia suffruticosa- Paeoniaceae (Wu et al., 2002) e

Hydrangea chinensis-Hydrangeaceae (KHALIL et al, 2003), nesta última espécie foi

identificada também umbeliferona, nas folhas (Tab. 19, p. 194).

Biossinteticamente, as substituições em cumarinas (incluindo hidroxilação) ocorrem

preferencialmente na posição 7, resultando na formação da umbeliferona, devido ao precursor

comum a esta classe de compostos: o ácido p-cumárico, gerado a partir da desaminação da

tirosina ou hidroxilação do ácido cinâmico (ROBBERS, 1997).

Embora as cumarinas 6-monoxigenadas sejam raras na natureza, sendo a ocorrência

delas restritas a um reduzido número de espécies, os dados espectroscópicos obtidos

forneceram evidências incontestáveis de sua existência, mesmo levando a uma proposta

estrutural contraditória à preconizada pela teoria biogenética.

O O

OH

H H

H

H

H O OOH

H

H

H

H

H113,6

154,8

118,2

120,6

120,6148,8

120,6

120,6154,8

113,6

118,2

148,8

I II

6,36

7,867,06

7,19

7,10

7,10

7,19

7,06

6,36

7,86

Tabela 19- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, registrados na literatura (GOTTLIEB, 1979). # C

6-OH-cum δC (ppm)

CD3COCD3

ACS-5 δC (ppm)

CD3COCD3


HMBC 2J

HMBC 3J

2 162,7 161,0 6,36 7,86 3 116,5 117,6 6,36 (1H, d, 9,6 Hz) 7,86 4 144,7 144,4 7,86 (1H, d, 9,6 Hz) 7,06 5 112,8 113,6 7,06 (1H, d, 2,7 Hz) 7,86; 7,10 6 154,4 154,8 7,06 7,19 7 120,7 120,6 7,10 (1H, dd, 8,9 e 2,7 Hz) 7,19; 7,06 8 117,9 118,2 7,19 (1H, d, 8,9 Hz) 9 119,9 120,6 7,06 6,36 10 147,9 148,8 7,86; 7,19; 7,10;7,06

Tabela 20- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-5 com dois registros de deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, encontrados na literatura (GOTTLIEB, 1979 e KHALIL et al., 2003).

# C

6-hidroxi-cumarina* δC (ppm)

CDCl3+CD3OD (2:1)

ACS-5 δC (ppm)

CD3COCD3

6-hidroxi-cumarina♣ δC (ppm) C5D5N

Umbeliferona δC (ppm)

CD3COCD3 2 162,7 161,0 160,6 161,2 3 116,5 117,6 115,4 112,9 4 144,7 144,4 144,2 144,8 5 112,8 113,6 112,3 130,5 6 154,4 154,8 154,5 113,9 7 120,7 120,6 119,8 162,1 8 117,9 118,2 117,2 103,4 9 119,9 120,6 120,2 113,0 10 147,9 148,8 147,8 157,1

* GOTTLIEB, 1979. ♣KHALIL et al., 2003


194


195

Figura 100- Espectro de RMN 1H de ACS-5 (CD3COCD3, 500 MHz)

Figura 101- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)

O O

OH

148,8120,6

118,2

154,8

113,6120,6

161,0

117,6

144,4

O O

OH

H H

H

H

H

6,36

7,867,06

7,19

7,10


196

Figura 102- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)

Figura 103- Espectro de RMN-HSQC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5


197

Figura 104- Espectro de massa de ACS-5 (Impacto Eletrônico)

Figura 105- Espectro de RMN-HMBC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1112 13

O O

OH

H H

H

H

H

10 4

2

12 6

3

1

13 11

9

8

14 7

5


198

Figura 106- Espectro de RMN 13C-CPD de umbeliferona (CD3COCD3, 125 MHz)

Figura 107- Cromatograma de HPLC de 6-hidroxi-cumarina (254 nm)

Figura 108- Cromatograma de HPLC de umbeliferona (7-hidroxi-cumarina: 254 nm)

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

13,10

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

11,70

O OOH 157,1

162,1

103,4

113,9

130,5113,0

161,2

112,9

144,8

5.16. Protocatecuato de- 6-cumarila (ACCE-8)

Sucessivas separações (3x) em Sephadex LH-20 da fração ACCE2AM/CA, obtida

por partições e cromatografias em gel de sílica do extrato etanólico das cascas do caule,

conduziram ao isolamento de um sólido vermelho (pf. 257,6-258,3 °C), chamado de ACCE-8

(ítem 10.1.6.12, p. 281).

Análise do espectro de absorção na região do infravermelho (Fig. 109, p. 203)

conduziu à identificação dos seguintes grupos funcionais: I- hidroxila, devido a uma banda

larga em 3315 cm-1; II- carbonila, evidenciada pela absorção em 1699 cm-1; III- anel

aromático, caracterizado pelas bandas esqueletais em 1609, 1565, 1519 e 1440 cm-1

(deformação axial C=Carom.) e absorções em 936 e 826 cm-1 (deformação angular Carom-H),

IV- carbonos oxigenados, reconhecidos através das absorções em 1305, 1259, 1224 e 1179

cm-1.

No espectro de RMN 1H de ACCE-8 (500 MHz, DMSO-d6, Fig. 110, p. 203), foram

observados dois dupletos δ 8,02 e 6,49 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-4 e H-3), típicos de hidrogênios

olefínicos de cumarina, e dois sistemas de spin ABX: A-[δ 7,40 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8); 7,25

(1H, dd, J = 9,0 e 2,9 Hz, H-7) e 7,21 (1H, d, J = 2,9 Hz, H-5)] e B-[δ 7,69 (1H, dd, J = 8,5 e

2,0 Hz, H-6’); 7,48 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-2’) e 7,06 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5’)], diferenciados

após análise do espectro COSY (Fig. 111, p. 204).

O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 112, p. 204) apresentou

dezesseis linhas espectrais, sendo duas atribuídas a carbonilas de éster e de lactona (δ 166,6,

C-7’ e 160,0, C-2). No espectro RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 113, p. 205),

foram registradas oito linhas espectrais: δ 143,8 (C-4); 127,4 (C-6’); 122,3 (C-2’); 121,3 (C-

7); 117,7 (C-8); 117,1 (C-5’); 116,8 (C-3) e 114,6 (C-5), as quais foram relacionadas a

carbonos sp2 monohidrogenados. Subtração dos espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135

permitiu a identificação de sete carbonos não-hidrogenados: δ 153,6 (C-6); 153,5 (C-4’);

149,0 (C-10); 142,6 (C-3’); 122,3 (C-1’) e 119,5 (C-9), sendo as quatro primeiras absorções

referentes a carbonos aromáticos oxigenados. Através do espectro de RMN 13C-GATED (Fig.

114, p. 205), constatou-se que a absorção em δ 122,3 (C-1’ e C-2’) correspondia a dois

carbonos, um CH e outro não-hidrogenado. O CH apresentou-se como um duplo dupleto

(1JC,H= 122,0 Hz; 3JC,H= 7,2 Hz, C-2’) e o carbono não-hidrogenado exibiu-se na forma de um

dupleto (3JC,H = 7,2 Hz, C-1’).


199

Os dados de RMN permitiram a dedução da fórmula molecular C16H10O6,

condizente com a massa molecular de 298 Da, obtida pelo espectro de massa (EM-IE, Fig.

115, p. 206), sugerindo uma cumarina esterificada, na posição 6 ou 7, com um fragmento

protocatecuoíla, o qual foi proposto devido às evidências de presença de um anel aromático

1,3,4-trissubstituído, provavelmente di-hidroxilado, e a existência de uma carbonila de éster

na estrutura. Além disso, o ácido protocatecuico já havia sido isolado de A. cearensis. No

espectro de EM-IE de ACCE-8 foram detectados picos com m/z: 298 (pico íon-molecular),

254 (eliminação de CO2 da lactona), 146 (perda do fragmento de protocatecuato do composto

original) e 118 (descarbonilação do cátion cumarínico).

O espectro de RMN-HSQC (Fig. 116, p. 206) revelou os carbonos referentes a cada

anel benzênico, a partir de suas correlações com os hidrogênios pertencentes a cada sistema

aromático (Tab. 21, p. 202). Os carbonos olefínicos foram correlacionados com seus

hidrogênios, conforme os acoplamentos observados entre os sinais de carbono em δC 143,8

(C-4) e 116,8 (C-3) e os dupletos em δH 8,02 (C-4) e 6,49 (C-3), respectivamente.

O espectro de RMN-HMBC (Fig. 117, p. 207) permitiu a caracterização do

esqueleto cumarínico, por meio de correlações como as dos hidrogênios olefínicos H-3 (δH

6,49) e H-4 (δH 8,02) com a carbonila lactônica C-2 (δC 160,0), ou através dos acoplamentos

dos hidrogênios aromáticos H-5 (δH 7,21), H-7 (δH 7,25) e H-8 (δH 7,40) e hidrogênios

olefínicos H-3 (δH 6,49) e H-4 (δH 8,02) com os carbonos aromáticos C-9 (δC 119,5) e C-10

(δC 149,0).

A existência do fragmento protocatecuoíla foi ratificada pelas correlações dos

hidrogênios aromáticos H-2’ (δH 7,48), H-5’ (δH 7,06) e H-6’ (δH 7,69) com os carbonos

aromáticos não hidrogenados C-1’ (δC 122,3), C-3’ (δC 142,6) e C-4’ (δC 153,5), mas também

pelos acoplamentos dos hidrogênios aromáticos H-2’ (δH 7,48) e H-6’ (δH 7,69) com o

carbono carbonílico C-7’ (δC 166,6).

As correlações dos sinais de hidrogênio em δH 8,02 e 7,21 com os sinais de carbono

em δC 114,6 e 143,8 (3J), respectivamente, e a correlação do duplo dupleto em δH 7,25 com o

sinal de carbono em δC 149,0 (3J) foram determinantes para a escolha da proposta de

substituição da cumarina, na posição 6 (I), já que na posição 7 (II), estes acoplamentos seriam

hipoteticamente 4J.


200

114,6 143,8

7,21

7,25

8,02

O O

RO

H H

H

H

H

I

149,0

7,21

7,25

8,02

O O

H H

H

H

RO

H

II

143,8

149,0114,6


201

O espectro de RMN-NOESY (Fig. 118) corroborou a proposta I, ao mostrar o

acoplamento homonuclear dipolar entre os dupletos em δH 8,02 (H-4) e 7,21 (H-5).

A estrutura química de ACCE-8, reconhecida como protocatecuato de 6-cumarila, é

inédita na literatura.

O O

O

O

OH

OH114,6

153,6

121,3

119,5

117,7149,0

153,5

166,6

116,8122,3

142,6

160,0

143,8

117,1

122,3

127,4

7,21

7,257,40

6,49

8,02

23

45

67

8

4a

8a O O

H H

H

H

RO

H

II

7,21

7,257,40

6,498,02

23

45

67

8

4a

8a O O

RO

H H

H

H

H

I

7,69

7,48

7,21

7,25

7,40

7,06

6,49

8,02

O O

O

H H

H

H

HO

OH

OH

H

H

H

1'

2'

3'4'

5'

6'

7'

23

45

67

8

4a

8a

Tabela 21- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-8 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.

# C



HMBC 2J

HMBC 3J

2 160,0 6,49 8,02 3 116,8 6,49 (1H, d, 9,6 Hz) 4 143,8 8,02 (1H, d, 9,6 Hz) 7,21 5 114,6 7,21 (1H, d, 2,9 Hz) 8,02 7,25 6 153,6 7,25; 7,21 7,40 7 121,3 7,25 (1H, dd, 9,0 Hz; 2,9 Hz) 7,21 8 117,7 7,40 (1H, d, 9,0 Hz) 9 119,5 8,02 7,40; 6,49 10 149,0 7,40 8,02; 7,25; 721, 1’ 122,3 7,69; 7,48 7,06 2’ 122,3 7,48 (1H, d, 2,0 Hz) 7,69 3’ 142,6 7,48 7,06 4’ 153,5 7,06 7,69; 7,48 5’ 117,1 7,06 (1H, d, 8,5 Hz) 6’ 127,4 7,69 (1H, dd, 8,5 Hz; 2,0 Hz) 7,48 7’ 166,6 7,69; 7,48


202


203

Figura 109- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-8 (pastilha de KBr)


7,69

7,48

7,21

7,25

7,40

7,06

6,49

8,02

O O

O

H H

H

H

HO

OH

OH

H

H

H

1'

2'

3'4'

5'

6'

7'

23

45

67

8

4a

8a


204

Figura 111- Espectro de RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8



205


Figura 114- Espectro de RMN 13C-GATED de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)


206

Figura 115- Espectro de massa de ACCE-8 (Impacto Eletrônico)

Figura 116- Espectro de RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8


1

3

4

2

6

17

5

23

Aspectos Químicos do Estudo cearensis A.C. Smith

207

Figura 117- Espectro de RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8

O O

O

H H

H

H

HO

OH

OH

H

H

H

1238 9

10

1112

13

1718

22

252627

Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana

O O

O

H H

H

H

HO

OH

OH

H

H

H

4

5

6

7

14 15

16

192021

23

24

26

9

21

13

10 15

27 19

16

12

8 22

11 1

3 14

18 24 7 20

6

25


208

Figura 117a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-8: (I) δ 6,9-8,1 x 140-157; (II) δ 6,4-8,2 x 113-132.

Figura 118- Espectro de RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8

H-5 H-4


209

5.17. Ácido protocatecuico (ACCE-2)

Tratamentos cromatográficos sucessivos em gel de sílica e Sephadex LH-20 da

fração acetato de etila, obtida de partição do extrato etanólico das cascas do caule de A.

cearensis, conduziram ao isolamento de cristais aciculares amarelos (p.f. 199,2-200,7 °C), os

quais foram denominados ACCE-4 (ítem 10.1.6.6, p. 278).

No espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 119, p. 211) foram

registradas oito linhas espectrais, sendo uma atribuída a carbonila de éster ou de ácido (δ

170,3, C-7) e duas relacionadas a carbonos aromáticos oxigenados (δ 151,5 C-4 e 146,0, C-3).

Os carbonos hidrogenados foram identificados através da análise do espectro de RMN 13C-

DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig. 120, p. 211), no qual foram visualizados apenas três

sinais, todos referentes a carbonos aromáticos hidrogenados (δ 123,9 C-2; 117,7 C-6; 115,7

C-5). A absorção em δ 123,0 (C-1), ausente no espectro DEPT135, foi atribuída a carbono

aromático não-hidrogenado.

O espectro de RMN 1H de ACCE-4 (500 MHz, CD3OD, Fig. 121, p. 212)

apresentou um sinal múltiplo em δ 7,46-7,43, correspondentes a dois hidrogênios, os quais,

juntamente com um dupleto em δ 6,81 (1H, J = 8,7 Hz, H-5), foram associados a um anel

benzênico trissubstituído.

A fórmula molecular C7H6O4, deduzida a partir da análise dos espectros de RMN,

sugeriram a estrutura de um derivado do ácido benzóico trissubstituído, o qual foi identificado

como sendo o ácido protocatecuico após comparação com dados RMN 13C disponíveis na

literatura (POUCHERT, 1993) (Tab. 22, p. 210).

CO2H

OH

OH

123,0

123,9

146,0

151,5

115,7

117,7

170,3CO2H

OH

OH

H

H

H1

23

4

56

7

6,81

7,43

Tabela 22- Dados de RMN 13C de ACCE-2 e comparação com deslocamentos químicos de 13C do ácido protocatecuico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).

# C

Ác. protocatecuicoδC (ppm) DMSO-d6

ACCE-2 δC (ppm) CD3OD

1 121,6 123,0 2 121,9 123,9 3 144,7 146,0 4 149,9 151,5 5 115,1 115,7 6 116,5 117,7 7 167,2 170,3


210

Figura 119- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2

Figura 120- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2


211

Figura 121- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-2


212

5.18. Ácido vanílico (ACCE-4)

Gerada através de partições líquido-líquido do extrato etanólico das cascas do caule,

ACCEAM foi submetida a cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20, obtendo-se um

sólido marrom escuro (f14-15), que após recristalização em CHCl3/AcOEt 50%, foi

convertido em cristais amarelados (p.f. 204,9-205,8 °C), designados ACCE-4 (ítem 10.1.6.6,

p. 278). Esta mesma substância também foi isolada da fração acetato de etila do extrato

etanólico das sementes.

Os grupos funcionais presentes na estrutura de ACCE-4 foram caracterizados pelas

freqüências das bandas observadas no espectro de absorção na região do infravermelho (Fig.

122, p. 215): 3484 cm-1 (hidroxila), 1683 cm-1 (carbonila conjugada), 1598, 1523 e 1434 cm-1

(anel aromático), e 1280, 1238, 1205 e 1111 cm-1 (carbonos oxigenados).

O espectro de RMN 1H de ACCE-4 (500 MHz, CD3OD, Fig. 123, p. 215)

apresentou um sinal múltiplo em δ 7,57- 7,54, correspondentes a dois hidrogênios, os quais,

juntamente com um dupleto em δ 6,83 (1H, J = 8,7 Hz, H-5), foram associados a um anel

benzênico trissubstituído, além de um singleto agudo em δ 3,89 (3H, s, 3-OMe), relacionado a

hidrogênios metoxílicos .

No espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 124, p. 216) foram

registradas oito linhas espectrais, sendo uma atribuída a carbonila de éster ou de ácido (δ

170,2, C-7) e duas relacionadas a carbonos aromáticos oxigenados (δ 152,8 C-4 e 148,8, C-3).

Os carbonos hidrogenados foram identificados através de análise do espectro de RMN 13C-

DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig. 125, p. 216), no qual foram visualizados quatro sinais:

três referentes a carbonos aromáticos hidrogenados (δ 125,4, C-6; 116,0, C-4 e 114,0, C-2) e

um associado à presença de metoxila (δ 56,5, 3-OMe). A absorção em δ 123,2 (C-1), ausente

no espectro DEPT135, foi atribuída a carbono aromático não-hidrogenado.

O espectro de massa de ACCE-4 (EM-IE, Fig. 126, p. 217) exibiu fragmentos com

m/z 168 (pico íon molecular), 153 (desmetilação), 138 (perda de formaldeído da molécula

original) e 121 (desidratação). A partir da composição elementar C8H8O4, fornecida pelo pico

íon-molecular, foram sugeridos três análogos metilados do ácido protocatecuico: um éster (I)

e dois éteres metílicos, sendo um alquilado na posição 3 (II) e outro na posição 4 (III).


213

OH

OCH3

OHO

OCH3

OH

OHO

OH

OH

OCH3O

148,8 148,8 148,83,89

3,89

3,89

I II III


214

O espectro HMBC (Fig. 127) mostrou o acoplamento entre os hidrogênios metílicos

(δH 3,89, 3-OMe) com o carbono aromático C-3 (δC 148,8), justificando a proposta II. Dados

de RMN, disponíveis na literatura, reforçaram a estrutura proposta do ácido vanílico (lit.: 210

°C) (POUCHERT, 1993) (Tab. 23).

Tabela 23- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido vanílico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).

# C

Ác. vanílico δC (ppm) DMSO-d6

ACCE-4 δC (ppm) CD3OD


1 121,7 123,2 2 112,6 114,0 7,55 (1H, m) 3 147,0 148,8 4 151,0 152,8 5 114,8 116,0 6,83 (1H, d, 8,7 Hz) 6 123,6 125,4 7,55 (1H, m) 7 167,5 170,2

3-OMe 55,6 56,5 3,89 (3H, s)

CO2H

OCH3

OH

123,2

114,0

148,8

152,8

116,0

125,4

170,2

56,5

CO2H

OCH3

OH

H

H

H1

23

4

56

7

7,55

6,83

7,55

3,89


215

Figura 122- Espectro de absorção na região do Infravermelho de ACCE-4 (pastilha de KBr)

Figura 123- Espectro de RMN 1H de ACCE-4 (CD3OD, 500 MHz)

CO2H

OCH3

OH

H

H

H1

23

4

56

7

7,55

6,83

7,55

3,89

CO2H

OCH3

OH

123,2

114,0

148,8

152,8

116,0

125,4

170,2

56,5


216

Figura 124- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)

Figura 125- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)


217

Figura 126- Espectro de massa de ACCE-4 (Impacto Eletrônico)

Figura 127- Espectro bidimensional de correlação heteronuclear (HMBC) de ACCE-4


218

5.19. Ácido p-hidroxi-benzóico (ACPa-5)

O extrato etanólico da parte aérea de espécimens jovens foi particionado com

H2O/AcOEt e cromatografado em Sephadex LH-20 e cartucho de SPE, produzindo um sólido

marrom ACPa-5 (p.f. 176,1-179,2 °C) (ítem 10.1.8.9, p. 295).

No espectro de RMN 1H de ACPa-5 (500 MHz, CD3OD, Fig. 128, p. 219), foram

observados apenas dois dupletos em δ 7,88 e 6,82 (2H, d, J = 9,6 Hz, H-2,6 e H-3,5),

característicos de um sistema aromático para-dissubstituído.

O espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-5 (125 MHz, CD3OD, Fig. 129, p. 219)

mostrou cinco linhas espectrais, das quais uma foi compatível com carbonila de ácido (δ

170,3, C-7) e as outras quatro foram associadas a carbonos aromáticos: δ 163,4 (C-4); 133,1

(C-2,6); 123,1 (C-1) e 116,2 (C-3,5). As absorções em δ 133,1 e 116,2. foram atribuídas a

carbonos hidrogenados, após análise do espectro de RMN 13C-DEPT135. Por subtração dos

espectros de RMN 13C (125 MHz, MeOD, Fig. 130, p. 220), os sinais em δ 163,4 (C-4) e

123,1 (C-1) foram reconhecidos como pertencentes a carbonos não-hidrogenados, sendo a

primeira absorção relacionada a carbono oxigenado.

ACPa-5 foi identificado como sendo o ácido p-hidroxi-benzóico, cujos dados de

RMN foram concordantes com os registrados na literatura (POUCHERT, 1993) (Tab. 24).

Tabela 24- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido p-hidroxi-benzóico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).

# C

Ac. p-hidroxi-benzóicoδC (ppm) DMSO-d6



1 121,4 123,1 2,6 131,5 133,1 7,88 (1H, d, 9,6 Hz) 3,5 115,0 116,2 6,82 (1H, d, 9,6 Hz) 4 161,6 163,4 7 167,5 170,3

CO2H

OH

H

HH

H 1

2

3

4

56

7

6,82

7,88

CO2H

OH

123,1

133,1

116,2

163,4

170,3


219

Figura 128- Espectro de RMN 1H de ACPa-5 (CD3OD, 500 MHz)

Figura 129- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz)

CO2H

OH

123,1

133,1

116,2

163,4

170,3

CO2H

OH

H

HH

H 1

2

3

4

56

7

6,82

7,88


220



221

5.20. Ácido (E)-o-cumárico (ACS-6)

Originada do particionamento do extrato etanólico das sementes, a fração acetato de

etila ACSEA foi submetida a cromatografias convencionais (sílica e Sephadex LH-20) e

moderna (HPLC), levando à obtenção do sólido branco ACS-6 (p.f. 213,6-215,9 °C,

tR = 11,24 min) (ítem 10.1.7.6, p. 285).

Análise do espectro de RMN 13C-CPD de ACS-6 (125 MHz, CD3OD, Fig. 131, p.

223) revelou a existência de nove carbonos sp2, identificados a partir de seus deslocamentos

químicos (δ 171,6; 158,3; 142,4; 132,6; 130,1; 122,9; 120,9; 119,1 e 117,1). O sinal em δ

171,6 (C-9) foi atribuído à carbonila de ácido, enquanto que o sinal em δ 158,3 (C-2) foi

associado a carbono oxigenado. O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig.

132, p. 223) mostrou seis linhas espectrais (142,4; 132,6; 130,1; 120,9; 119,1 e 117,1), sendo

todas pertencentes a carbonos monohidrogenados. Ausente no espectro DEPT135, o sinal em

δ 122,9 (C-1) foi relacionado a carbono não-hidrogenado.

Submetida a uma análise por espectrometria na região do infravermelho (Fig. 133,

p. 224), a amostra de ACS-6 apresentou uma banda larga em 3365 cm-1, referente à

deformação axial de O-H, bandas esqueletais em 1564 e 1459 cm-1 e absorções em 1399 e

1252 cm-1, relativas a deformações axiais C-O. Todavia, não foi verificada nenhuma banda

que pudesse ser associada à carbonila.

Através do espectro de RMN 1H de ACS-6 (500 MHz, CD3OD, Fig. 134, p. 224),

identificou-se a presença de um anel aromático orto-dissubstituído, caracterizado por dois

dupletos em δ 7,48 e 6,84 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6 e H-3) e dois tripletos em δ 7,20 e 6,84 (1H,

t, J = 8,4 Hz, H-4 e H-5), e uma olefina com configuração trans, devido à existência de dois

dupletos em δ 7,94 e 6,54 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7 e H-8), sugerindo uma estrutura de um

derivado cinâmico hidroxilado: ácido (E)-o-cumárico (lit. 210 °C- Catálogo Fluka, 2007).

A concordância entre os deslocamentos químicos de 13C apresentados por ACS-6 e

os descritos na literatura para o ácido o-cumárico reforçaram a proposta estrutural

(POUCHERT, 1993) (Tab. 25, p. 222).

CO2H

OH

H

H

H

H

H

H 7,20

6,84

1

23

4

5

6 7

89

6,54

7,947,48

6,84CO2H

OH

119,1

158,3117,1

132,6

120,9

130,1 142,4122,9

171,6

Tabela 25- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido (E)-o-cumárico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).

# C

Ác. (E)-o-cumárico δC (ppm) CD3OD



1 120,8 122,9 2, 156,5 158,3 3 116,0 117,1 6,84 (1H, d, 8,0 Hz) 4 131,3 132,6 7,20 (1H, t, 8,4 Hz) 5 119,3 120,9 6,84 (1H, t, 8,4 Hz) 6 128,5 130,1 7,48 (1H, d, 8,0 Hz) 7 139,5 142,4 7,94 (1H, d, 16,0 Hz) 8 118,2 119,1 6,54 (1H, d, 16,0 Hz) 9 168,0 171,6


222


223



CO2H

OH

119,1

158,3117,1

132,6

120,9

130,1 142,4122,9

171,6


224

Figura 133- Espectro de absorção na região do IV de ACS-6 (pastilha de KBr)


CO2H

OH

H

H

H

H

H

H 7,20

6,84

1

23

4

5

6 7

89

6,54

7,947,48

6,84


225

5.21. Quercetina (ACCE-1)

Cromatografias de adsorção (sílica) e exclusão (Sephadex LH-20) da fração

metanólica ACCEAM, produzida por particionamento do extrato etanólico das cascas do

caule, permitiram o isolamento de um sólido amarelo (p.f.> 300 °C), denominado ACCE-1

(ítem 10.1.6.5, p. 282), cujo espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, Fig. 135, p. 227)

mostrou um conjunto de sinais em δ 7,67 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,53 (1H, dd, J = 8,5 e 2,1

Hz, H-6’) e 6,88 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2’), referentes a um sistema aromático de spin ABX e

dois dupletos em δ 6,41 e 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8 e H-6), compatíveis com hidrogênios

aromáticos meta-posicionados.

O espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-1 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 136, p. 227)

exibiu quinze linhas espectrais, sendo todas pertencentes a carbonos sp2 (δ 175,8; 163,9;

160,7; 156,2; 147,7; 146,8; 145,1; 135,7; 122,0; 120,0; 115,6; 115,1; 103,0; 98,2 e 93,4). A

absorção em δ 175,8 (C-4) foi associada à carbonila de cetona conjugada, enquanto os sinais

em δ 164,0 (C-7); 160,7 (C-5); 156,2 (C-9); 147,7 (C-2); 146,8 (C-4’); 145,1 (C-3’) foram

associados a carbonos oxigenados. Os carbonos hidrogenados foram identificados por RMN-

HSQC (Fig. 137, p. 228), através das seguintes correlações: os dupletos em δH 6,41 (C-8) e

6,18 (C-6) com os sinais de carbono em δC 93,4 (C-8) e 98,2 (C-6) e o sistema ABX [(δH 7,67

(H-5’); 7,53 (H-6’) e 6,88 (H-2’)] com os sinais de carbono em δC 115,6 (H-5’); 120,0 (H-6’)

e 115,1 (H-2’), respectivamente. Os dados espectroscópicos conduziram à dedução da

fórmula molecular C15H10O7, compatível com a estrutura de um flavonol pentahidroxilado, o

qual foi sugerido corresponder à quercetina (lit. 314 °C). Referências de dados de RMN 13C

deram suporte à proposição estrutural (AGRAWAL, 1989) (Tab. 26, p. 226).

A quercetina é o flavonol mais comumente encontrado em alimentos, sendo sua

ingestão diária estimada em até 38 mg, e a ela são atribuídas ações antioxidante,

anticarcinogênica, antiinflamatória e efeitos antiagregante e vasodilatador (ERLUND, 2004).

1'2

3

456

7

89

10

2'

3'

4'

5'6'

7,67

6,18

6,416,88

7,53

O

O

OH

OH

OH

OH

OHH

H

HH

H

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

147,7

135,7

175,8

160,7

98,2

164,0

93,4156,2

103,1

122,0115,1

145,1

146,8

115,6

120,0

Tabela 26- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de quercetina, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).

# C

Quercetina δC (ppm) CD3OD



2 147,5 146,8 3 136,5 135,7 4 176,5 175,8 5 161,0 160,7 6 99,5 98,2 6,18 (1H, d, 2,0 Hz) 7 166,0 164,0 8 94,5 93,4 6,41 (1H, d, 2,0 Hz) 9 156,7 156,2 10 104,0 103,1 1’ 123,0 122,0 2’ 116,0 115,1 6,88 (1H, d, 2,1 Hz) 3’ 145,7 145,1 4’ 148,1 147,7 5’ 116,5 115,6 7,67 (1H, d, 8,5 Hz) 6’ 121,0 120,0 7,53 (1H, dd, 8,5 Hz; 2,1 Hz)


226


227

Figura 135- Espectro de RMN 1H de ACCE-1 (500 MHz, DMSO-d6)

Figura 136- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-1 (125 MHz, DMSO-d6)

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

147,7

135,7

175,8

160,7

98,2

164,0

93,4156,2

103,1

122,0115,1

145,1

146,8

115,6

120,0

1'2

3

456

7

89

10

2'

3'

4'

5'6'

7,67

6,18

6,416,88

7,53

O

O

OH

OH

OH

OH

OHH

H

HH

H


228

Figura 137- Espectro de RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-1


229

5.22. Isocampferídio (ACCE-7)

A partir do particionamento do extrato etanólico das cascas do caule, obteve-se uma

fração metanólica ACCEAM, que submetida a cromatografias em gel de sílica e Sephadex

LH-20, resultou na obtenção de um sólido amarelo chamado ACCE-7 (p.f. 290,7-292,1 °C)

(ítem 10.1.6.8, p. 278). Esta substância foi descoberta ser quimicamente semelhante ao sólido

amarelo ACPa-3 (5,0 mg), isolado do extrato etanólico das parte aérea de plantas jovens, após

análise por CCD.

Os espectros de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 138, p. 231) de ACCE-7 e

ACPa-3 mostraram dupletos em δ 7,93 e 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’,6’) referentes a um

anel aromático para-dissubstituído, dois dupletos em δ 6,35 e 6,15 (1H, J = 2,0 Hz, H-8 e H-

6), atribuídos aos hidrogênios aromáticos meta-posicionados e um singleto em δ 3,77 (3H, s,

correspondente à metoxila. O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 139, p.

231) exibiu catorze linhas espectrais, das quais uma foi atribuída a carbonila flavonoídica (δ

180,0) e outras cinco foram associadas a carbonos sp2 oxigenados: δ 165,9 (C-7); 163,0 (C-5);

161,7 (C-4’); 158,4 (C-9); 158,0 (C-2) e 139,4 (C-3). No espectro de RMN 13C DEPT135

(125 MHz, CD3OD, Fig. 140, p. 232), foram verificadas absorções associadas a carbonos sp2

hidrogenados: δ 131,4 (C-2’,6’); 116,5 (C-3’,5’); 99,8 (C-6) e 94,8 (C-8). Da subtração dos

espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135, resultaram apenas as absorções relativas aos

carbonos não-hidrogenados: δ 122,6 (C-1’); 105,9 (C-10).

A reunião dos dados espectroscópicos de ACCE-7 permitiu sugerir a fórmula

molecular C16H12O6, com índice de deficiência de hidrogênio igual a onze, correspondente a

um esqueleto flavônico tetrassubstituído, o qual foi identificado como sendo compatível à

estrutura do isocampferídio (lit.: p.f. 299-302 °C) (Djerassi et al, 1994). Dados de RMN 13C

da literatura corroboraram a proposta (AGRAWAL, 1989) (Tab. 27, p. 230).

O

O

OCH3

OH

OH

OH

158,0

139,4

180,0

163,0

99,8

165,9

94,8158,4

105,9

122,4

131,4

116,5

161,7

60,5

1'2

3

456

7

89

10

2'

3'

4'

5'6'

6,89

6,15

6,357,93

7,53

O

O

OCH3

OH

OH

OHH

H

H

H

3,77

Tabela 27- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-7 dispostos segundo as correlações obtidas através do espectro HMQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de isocampferídio, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).

# C

Isocampferidio δC (ppm) CD3OD

ACCE-7δC (ppm)CD3OD

HMQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)

2 157,3 158,0 3 139,4 139,4 4 179,6 180,0 5 163,1 163,0 6 100,7 99,8 6,15 (1H, d, 2,0 Hz) 7 167,1 165,9 8 95,7 94,8 6,35 (1H, d, 2,0 Hz) 9 158,3 158,4 10 105,7 105,9 1’ 122,4 122,6

2’,6’ 131,9 131,4 7,93 (2H, d, 8,5 Hz) 3’,5’ 117,5 116,5 6,89 (2H, d, 8,5 Hz)

4’ 162,1 161,7 3-OMe 61,9 60,5 3,77 (3H, s)


230

Figura 138- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-7

Figura 139- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

231

Figura 140- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7


232


233

5.23. Cumarina (ACS-1 e ACPa-2)

Cromatografia em gel de sílica da fração E7-ACPaAD(4-6) (380 mg) permitiu o

isolamento de 104 mg de cristais brancos sublimáveis (p.f. 67,8-68,7 °C), com odor forte e

peculiar de cumarina, denominados ACPa-2 e ACS-1 (ítem 10.1.7.1, p. 282).

O espectro de RMN 1H de ACPa-2 e ACS-1 (300 MHz, CDCl3, Fig. 141, p. 235)

exibiu dois multipletos em δ 7,51 e 7,29 (2H, m), relacionados aos hidrogênios aromáticos e

dois dupletos em δ 7,71 e 6,42 (1H, d, J = 9,5 Hz), associados aos hidrogênios cis-olefínicos.

O espectro de RMN 13C-CPD (75 MHz, CDCl3, Fig. 142, p. 235) apresentou nove

linhas espectrais, sendo uma delas em δ 160,9 (C-2) compatível com a carbonila lactônica

α,β-insaturada e as demais foram associadas aos carbonos sp2 (δ 154,3 -116,9). A

combinação dos espectros de RMN 13C-CPD e RMN 13C-DEPT135 (75 MHz, CDCl3, Fig.

143, p. 236). revelaram a existência de seis carbonos monohidrogenados [δ 141,6 (C-4);

132,0 (C-7); 128,1 (C-5); 124,6 (C-6); 117,1 (C-3) e 116,9 (C-8)] e três carbonos não

hidrogenados [δ 160,9 (C-2); 154,3 (C-10) e 119,0 (C-9)].

Dedução da fórmula molecular para ACS-1, C9H6O2, foi feita a partir dos seus dados

de RMN. Tendo o seu IDH = 7, foi proposta uma estrutura composta por um anel benzênico

mais um anel lactônico α, β-insaturado, sugerindo tratar-se da cumarina (lit.: p.f. 68-70 °C).

Os dados de RMN 13C descritos na literatura corroboraram a estrutura proposta para ACS-1 e

ACPa-2 (POUCHERT, 1993) (Tab. 28, p. 234).

6,42

7,71

23

45

67

8

4a

8a O O

H H

H

H

H

H

128,1

124,6

132,0

119,0

116,9154,3

117,1160,9

141,6

O O

Tabela 28- Dados de RMN 13C de ACS-1 e comparação com deslocamentos químicos de 13C de cumarina, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).

# C

Cumarina δC (ppm) CDCl3

ACS-1 δC (ppm) CDCl3

2 160,6 160,9 3 116,4 117,1 4 143,3 141,6 5 127,7 128,1 6 124,3 124,6 7 131,6 132,0 8 116,6 116,9 9 118,6 119,0 10 153,8 154,3


234

Figura 141- Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de ACS-1

Figura 142- Espectro de RMN 13C-CPD (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1


235

Figura 143- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1


236

REFERÊNCIAS AGRAWAL, P. K. Carbon-13 of Flavonoids. New York: Elsevier, 1989, 564 p.

BABA, K.; YOSHIKAWA, M.; TANIGUCHI, M.; KOZAWA, M. Biflavonoids from Daphne odora. Phytochemistry, v. 38, n. 4, p. 1021-1026, 1995.

BRAVO, J. A. B.; SAUVAIN, M.; GIMENEZ, A.; MUÑOZ, V.; CALLAPA, J.; LE MEN-OLIVIER, L.; MASSIOT, G.; LAVAUD, C.; Bioactive phenolic glycosides from Amburana cearensis. Phytochemistry, v. 50, p. 71-74, 1999.

BREITMAIER, E; VOELTER, W.; 13C NMR Spectroscopy: methods and applications. Düsseldorf: Verlag Chemie, 1974.

CANUTO, K. M.; SILVEIRA, E. R. Constituintes químicos da casca do caule de Amburana cearensis A.C. Smith. Quim. Nova, v. 29, n. 6, p. 1241-1243, 2006

CUSSANS, N. J.; HUCKERBY, T. N. Carbon-13 NMR of heterocyclic compounds (IV) A 20 MHz study of chemical shifts and carbon-proton coupling constants in a series of hydroxy, methoxy and glucosyl coumarins. Tetrahedron, v. 31, p.2719-2726, 1975.

DEBENEDETTI, S. I.; NADINIC, E. L.; COUSSIO, J. D.; KIMPE, N.; BOCYKENS, M. Two 6,7-dioxigenated coumarins from Pterocaulon virgatum. Phytochemistry, v. 48, n. 4, p.702-710, 1998.

DEWICK, P. M. Medicinal Natural Products: a biosynthetic approach. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, 2002, 515 p.

DJERASSI, C.; CONNOLY, J. D.; FAULKNER, D. J.; MORI, K.; NAKANISHI, K.; OURISSON, G.; RAPHAEL, R. A.; SHAMMA, M.; TAMM, C. H.; Dictionary of Natural Products, 1st ed., London: Chapman & Hall, 1994.

ERLUND, I. A review of the flavonoids quercetin, hesperetin and naringenin. Dietary sources, bioactivities, bioavailabity and epidemiology. Nutrition Res., v. 24, p. 851-874, 2004.

FRIEBOLIN, H. Basic one and two-dimensional NMR spectroscopy. Weiheim: VCH, 1991, 344 p.

GOTTLIEB, H. E. 13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy o 6- and 7- substituted coumarins. Correlation with Hammett constants. J. Chem. Soc. Perkins II, v. 2, n.4, p. 435-437, 1979.

JHA, H. C.; ZILLIKEN, F.; BREITMAIER, E. Carbon-13 chemical shift assignments of chromones and isoflavones. Can. J. Chem., v. 58, p. 1211-1219, 1980.

KHALIL, A. T.; CHANG, F.R.; LEE, Y. H.; CHEN, C. Y.; LIAW, C. C.; RAMESH, P.; YUAN, S. S. F., WU, Y. C. Chemical constituents from the Hydrangea chinensis. Arch. Pharm. Res., v. 26, n. 1, p. 15-20, 2003.

KHAN, I. A.; AVERY, M. A.; BURANDT, C. L.; GOINS, D. K.; MIKELL, J. R.; NASH, T. E.; AZADEGAN, A.; WALKER, L. A. Antigiardial activity of isoflavones from Dalbergia frutescens Bark. J. Nat. Prod., v. 63, n. 10, 1414-1416, 2000.

MAES, D.; VERVISCH, S.; DEBENEDETTI, S. I.; DAVIO, C.; MANGELINCKX, S.; GIUBELLINA, N.; KIMPE, N. Synthesis and structural revision of naturally occurriing derivatives. Tetrahedron, v. 61, n. 9, p. 2505-2511, 2005.


237

POUCHERT, C. J.; BEHNKE, J.; The Aldrich Library of 13C, 1H FT NMR spectra, 1st ed., Milwaukee: Aldrich Chemical Company, v. 2, 1993.


238

PRATS, E.; BAZZALO, M. E.; LEON, A.; JOKKIN, J. V.; Fungitoxic effect of scopolin and related coumarins on Sclerotinia sclerotiorum- a way to overcome sunflower head rot. Euphytica, v. 147, n. 3, p. 451-460, 2006.

ROBBERS, J. E.; SPEEDIE, M. K.; TYLER, V. E. Farmacognosia e Farmacobiotecnologia. Colômbia: Editorial Premier, 1997, 352 p.

SILVERSTEIN, R. M.; BASSLER, G. C.; MORRIL, T. C.; Identificação espectrométrica de compostos orgânicos, 5ª. Ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1994.

TANIGUCHI, M.; BABA, K. Three biflavonoids from Daphne odora. Phytochemistry, v. 42, n. 5, p. 1447-1453, 1996.

TOMMASI, N.; FEO, V.; PIZZA, C.; ZHOU, Z. I. Constituents of Bidens parviflora. Fitoterapia, v. 63, n. 5, p. 470, 1992.

VASANGE, M.; LIU, BOLING; WELCH, C.J.; ROLFSEN, W.; BOHLIN, L. The flavonoid constituents of the polypodium species and their effect on the elastase release in human neutrophils. Planta Medica, v. 63, p. 511-17, 1997.

WU, S.; M. A; Y.; LUO, X.; HAO, X.; WU, D. Studies on chemical constituents in root back of Paeonia suffruticosa. Zhongcaoyao, v. 33, n. 8, p. 679-680, 2002.

ZHANG, A. L.; YE, Q.; LI, B. G.; QI, H. Y.; ZHANG, G. L. Phenolic and triterpene glycosides from the stems of Ilex litseaefolia. J. Nat. Prod., v. 68, n. 10, 2006.

6. BIOSSÍNTESE DE FORMAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS

ISOLADAS DE A. CEARENSIS

A via chiquimato é a principal rota metabólica de gênese de compostos aromáticos,

adotada por microorganismos e plantas. Os metabólitos desta rota não são biossintetizados

por animais, todavia podem ser adquiridos pela dieta. O intermediário central desta via é o

ácido chiquímico, substância isolada originalmente de plantas japonesas do gênero Illicium, o

qual dá origem a dois aminoácidos aromáticos: L-fenilalanina e L-tirosina. A partir destes

aminoácidos, são formados compostos com unidades C6C3 (fenilpropeno) como derivados

cinâmicos, cumarinas, lignanas e flavonóides, os quais são amplamente encontrados em

produtos naturais.

Principal precursor dos compostos fenólicos, O ácido chiquímico é gerado pelo

acoplamento do fosfoenolpiruvato com D-eritose-4-fosfato, resultando no ácido 7-fosfato-3-

desoxi-D-arabino-heptulosonico, o qual sofre eliminação de ácido fosfórico e reação aldólica

intramolecular para produzir o ácido 3-de-hidroquínico. Este intermediário é convertido em

ácido chiquímico após desidratação e redução com NADPH.

O ácido chiquímico pode seguir dois caminhos: dar origem a ácidos fenólicos

simples (ácido protocatecuico e ácido gálico) ou ser convertido em ácido chorísmico, um

intermediário-chave para a biossíntese de aminoácidos (Quadro 3, p. 240).

Os ácidos fenólicos obtidos pela via chiquimato se caracterizam pelo padrão de

hidroxilação preferencialmente para em relação ao grupo da cadeia lateral, na primeira

oxidação, e orto ao grupo hidroxi no caso de poli-hidroxilação. No entanto, através da via

acetato, outra via formadora de compostos fenólicos, o padrão de substituição é tipicamente

meta. Isto permite uma identificação segura da rota metabólica utilizada pela substância

fenólica, na maioria das vezes.

Os aminoácidos L-fenilalanina e L-tirosina, diferenciados apenas por uma hidroxila

da posição 4, são resultantes da descarboxilação sucedida de aromatização do ácido

chorísmico seguida por transaminação, promovida por transaminase dependente de piridoxal-

fosfato. Por sua vez, estes aminoácidos podem se transformar respectivamente em ácido

cinâmico e ácido p-cumárico, após eliminação de amônia da cadeia lateral. Todas as plantas

são capazes de desaminar a fenilalanina, entretanto a degradação da tirosina ocorre de forma

muito limitada em espécies gramíneas. Desta forma, o ácido p-cumárico é mais comumente


239produzido por hidroxilação do ácido cinâmico.


240

Abaixo, seguem propostas biogenéticas para as substâncias isoladas de A. cearensis,

baseadas em evidências biossintéticas descritas da literatura, portanto tratando-se de esquemas

meramente especulativos.

Quadro 3- Rota biossintética de formação de ácidos fenólicos simples e aminoácidos aromáticos.

Através de uma série de reações de oxidação e metilação (promovida pela S-

adenosil-metiltransferase), o ácido p-cumárico pode ser transformado em ácido cafeico, ácido

ferúlico e sinápico. Estes derivados cinâmicos podem originar ácidos fenólicos simples,

utilizando um mecanismo de β-oxidação, semelhante à sofrida por ácidos graxos. Nesta

alternativa, um éster de coenzima A é incorporado aos ácidos cinâmicos e depois é eliminado

na forma de acetilCoA, através de reação de Claisen reversa, para gerar os derivados do ácido

CO2H

OH

OH

OH

CO2H

O

OH

OH

CO2H

OH

OH

OH

CO2H

OH

OH

Oxidação

Enolização

Desidratação

CO2H

OH

O CO2H

CH2

CO2H

OH

CO2H

O

CO2H

OH

CO2H

NH2PLP

OH

CO2H

NH2

CO2H

NH2

DescarboxilaçãoAromatização

Desidroxilação

L-Fenilalanina L-Tirosina

Ác. Protocatecuico

Ác. Gálico

Ác. Chiquímico

Ác. Chorísmico Ác. Prefênico Ác. L-Arogênico

CO2H

R

PAL

R= H- Ác. CinâmicoR= OH- Ác. p-Cumárico

PAL

1

2


241

benzóico: ácido p-hidroxi-benzóico, ácido protocatecuico e ácido vanílico (Quadro 4, p.

245).

Quadro 4- Biogênese de formação de amburosídios e derivados dos ácido benzóico e cinâmico.

O

O

OH

O OOH

OHOH

OH

RO

O

O

RO

OH

OH

UDPGlicose

CO2H CO2H

OH

CO2H

OH

OH

CO2H

OH

H3CO

CO2H

OH

H3CO OCH3

O2/NADPH O2/NADPH O2/NADPHSAMSAM

Ác. p-Cumárico Ác. Cafeico Ác. Ferúlico Ác. Sinápico

Ác. p-Hidroxi-benzóico Ác. Protocatecuico Ác. Vanílico

CO2H

OH

CO2H

OH

OH

CO2H

OH

H3CO

a. HSCoA/ATPb. H2Oc. NAD+

d. Beta-oxidação

+CH2OH

OH

NADPH

3 4

5

R=H- Amburosídio AR= CH3- Amburosídio B

O

O

OH

O OOH

OHOH

OR

OH

1, 2, 3, 4 ou 5+

1- R= Galoil- Amburosídio F2-R= Protocatecoil- Amburosídio D3-R= Feruloil- Amburosídio E4-R= Sinapoil- Amburosídio H5-R= Vaniloil- Amburosídio G

6.1. Amburosídios

Os amburosídios são glicosídios fenólicos encontrados, até o momento,

exclusivamente em A. cearensis. Sua biogênese deve-se iniciar provavelmente com a redução

do ácido p-hidroxi-benzóico a álcool p-hidroxi-benzílico, o qual pode ser esterificado por uma

molécula de ácido protocatecuico, através da hidroxila alcoólica (nucleófilo mais forte do que

a hidroxila fenólica), para render protocatecuato de p-hidroxi-benzila. A glicosilação do éster

com UDPglicose leva à síntese do amburosídio A. Caso a esterificação do álcool p-hidroxi-

benzílico seja feita com ácido vanílico, o heterosídio produzido será o amburosídio B. Os

demais amburosídio isolados são produzidos pela conjugação do amburosídio A com ácidos

fenólicos: ácido ferúlico (amburosídio E), ácido sinápico (amburosídio H), ácido

protocatecuico (amburosídio D), ácido vanílico (amburosídio G) e ácido gálico

(amburosídio F) (Quadro 4, p. 241).

6.2. Cumarinas

Reação de orto-hidroxilação do ácido (E)-cinâmico forma o ácido (E)-o-cumárico, o

qual pode se interconverter no seu estereoisômero ácido (Z)-o-cumárico. A isomerização do

ácido o-cumárico favorece sua lactonização, a partir da qual é obtida a cumarina. Se em vez

de ácido cinâmico, o substrato for o ácido p-cumárico, o produto da lactonização é a

umbeliferona. Portanto, a oxidação do carbono 7 é a posição biogeneticamente preferida,

quando o anel benzênico da cumarina é monossubstituído. Entretanto, a proposta de

ocorrência de 6-hidroxi-cumarina pode ser justificada supostamente pela formação inicial de

aesculetina (6,7-dihidroxi-cumarina), seguida de desidroxilação seletiva da posição 7. A

biossíntese de protocatecuato de 6-cumarila seria facilmente explicada pela esterificação da

6-hidroxi-cumarina com ácido protocatecuico. A reação da aesculetina com formaldeído

geraria aiapina, após desidratação (Quadro 5, p. 241).


242

CO2H CO2H

OH OHCO2H

O O

CO2H

OH

CO2H

OH OH OHCO2H

OHO OOH

O OOH

OH

O O

OH

UDPGlicose UDPGlicose

CO2H

OGlicose OGlicoseCO2H

+

CO2H

OH

OHO O

O

O

OH

OH

O O

O

O

Cumarina

Umbeliferona

Ác. (E)-o-Cumárico glicosilado Ác. (Z)-o-Cumárico glicosilado

Aesculetina

Ácido Protocatecuico

Aiapina

Protocatecuato de 6-cumarila 6-Hidroxi-cumarinaCH2O


243

Quadro 5- Rota biossintética de formação de ácidos cumáricos glicosilados e biogênese de cumarinas 6-monossubstituídas.

6.3. Flavonóides

A condensação de molécula de p-cumaroil-SCoa com mais três moléculas de

malonil-SCoA produz um alongamento da cadeia lateral, a qual se aromatiza após enolização

das carbonilas cetônicas. O produto gerado, a naringenina-chalcona, pode ser reduzida na

porção olefínica para fornecer floretina ou converter-se na forma isomérica de flavanona,

igualmente denominada naringenina. Sucessivas oxidações da naringenina com 2-oxo-

glutarato geram campferol e quercetina. O isocampferídio é obtido através da metilação do

campferol com S-adenosil metionina. O biflavonóide amburanina A é biossintetizado

através da condensação de unidades simples de flavonóides pré-formados: uma molécula de

floretina e outra de campferol (Quadro 6, p. 244). Mecanisticamente, é possível propor que a

formação desta substância seja desencadeada por uma adição de Michael da hidroxila do anel

B da floretina (C-4”) ao carbono olefínico β à carbonila do campferol (C-2). Nesta reação é

gerado um dienol susceptível a dois modos de tautomerização, por meio dos quais poderá ser

formada uma carbonila no C-3 (a) ou no C-4 (b). Em ambas as alternativas, ocorrerá uma

ciclização promovida pelo ataque nucleofílico do carbono aromático C-3”ao carbono C-3,

seguida por restauração da aromaticidade do anel B do fragmento da floretina. No entanto na


244

rota a, estas etapas são sucedidas por oxidação, dando origem à substância isolada

(amburanina A). Enquanto que na rota b, o ataque é sucedido por desidratação, resultando na

formação de um produto alternativo. O biflavonóde amburanina B é produzido pela

dimerização de duas moléculas de campferol, seguindo o mesmo modelo mecanístico da

amburanina A. (Quadro 7, p. 245).

Quadro 6- Biogênese de formação de flavonóis e biflavonóides.

O

CoAS

OH

OH

OO

O SCoA

O

OH

OOH

OH OH

OH

OOH

OH O

OH

OOH

OH O

OH

O2/ 2-oxo-glutarato

OH

OOH

OH O

OH

RO2/ 2-oxo-glutarato

OH

OOH

OH OH

NADPH

R=H- CampferolR= OH- Quercetina

Naringenina-Chalcona

Floretina

Aromadendrina

Naringenina

OH

OOH

OH O

OR1

R

R=H; R1=CH3- Isocampferídio

SAM

OH

OOH

OH OH

OH

OOH

OH O

OH

+O O

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OHAmburanina A

Floretina Campferol

OH

OOH

OH O

OH

OH

OOH

OH O

OH

+

O O

OOH

OH

OH

OO

OH

OH

OH

OH

H

Amburanina BCampferolCampferol


245

Quadro 7- Proposta mecanística de formação da amburanina A.

OH

OH

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

H

OH

O O

OH

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O O

OH

OOH

OH

OH

OH

OH

OH

O

O O

OH

OOH

OH

OH

O+

OH

OH

OH

H

H

O O

OH

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

[O]

O O

OH

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O O

OH

OO

OH

OH

O+

OH

OHH

H

O O

OH

OO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

a

b

Amburanina A

Produto Alternativo

3"

2

34"

3"2

3

4"

B

CampferolFloretina

3"2

3

4"

3"

2

3

4"


246

6.4. Isoflavonóides

A biogênese da formononetina é iniciada com a migração do anel B do carbono C-2

para o C-3 da liquiritigenina (flavanona), através de um mecanismo de oxidação radicalar

promovido enzimaticamente por um átomo de ferro. Após desidratação, forma-se daidzeína, a

partir da qual se obtém a isoflavona desejada por metilação regiosseletiva da hidroxila do

carbono C-4’ (Quadro 8, p. 246).

Quadro 8- Rota biossintética de formação da isoflavona formononetina.

REFERÊNCIAS DEWICK, P.M. Medicinal Natural Products: a biosynthetic approach. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, 2002, 515 p.

OH

OO

O SCoA

ONADPH

OH

OOH

O SCoA

O

Claisen

O

OHOH

OH

O

OOH

OH

O2/NADPH

CH

O

OOH

OH

CH

O

OOH

OH

Enz-Fe=O

Enz-Fe-OH

O

OOH

OH

OH

O

OOH

OH

- H2O

SAM

O

OOH

OCH3Daidzeína Formononetina

LiquiritigeninaIsoliquiritigenina


247

7. VALIDAÇÃO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO

7.1. Validação

O processo de validação da metodologia de quantificação dos quatro principais

constituintes dos extratos de A. cearensis [(ácido protocatecuico (1), ácido vanílico (2),

cumarina (3) e amburosídio A (4)] consistiu na avaliação da maioria dos parâmetros de

desempenho analítico requeridos pelas duas mais importantes agências reguladoras nacionais

(ANVISA- Agência de Vigilância Sanitária e INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia,

Normalização e Qualidade Industrial): seletividade, linearidade, precisão, exatidão e limites

de detecção e quantificação.

O método analítico aplicado para os diferentes extratos de A. cearensis foi

desenvolvido num HPLC/DAD (Waters 1525/2996), munido de uma coluna de fase reversa

(XTerra® 4,6 x 250 mm, 5 µm), utilizando-se um gradiente de eluição de 1mL/min de Et3N-

H3PO4 (pH= 3)/MeOH, variando de 20% para 50% de MeOH em 15 min de corrida. O

método cromatográfico empregado mostrou-se bastante seletivo para as substâncias de

interesse, propiciando uma boa separação entre seus respectivos picos, além de isentos de

interferentes, mesmo tratando-se de amostras quimicamente complexas.

As curvas de calibração analítica, construídas a partir de seis níveis de concentração

dos quatro padrões externos e devidamente ajustadas por regressão linear, apresentaram as

seguintes equações de regressão: y1= 58116x + 30531; y2= 61426x + 36265; y3= 24400x +

O

O

OH

OH

O OOH

OHOH

OH

O O

CO2H

OH

OH

CO2H

OCH3

OH1 2 3

4

58945 e y4= 27160x + 22275. Os coeficientes de correlação (r1 = 0,9945; r2 = 0,9944; r3 =

0,9943; r4 = 0,9933) (Tab. 29, p. 247), obtidos das curvas analíticas, revelaram relações de

proporcionalidade direta entre as concentrações das substâncias analisadas e as áreas dos

picos, detectados a 254 nm. As linearidades exibidas estão em consonância com os valores de

r recomendados pelo INMETRO (> 0,90) e pela ANVISA (> 0,99).

Tabela 29- Equações e coeficientes de correlação das retas dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ác. protocatecuico, ác. vanílico, cumarina e amburosídio A.

Padrão Equação da reta Coeficiente de correlação (r)

Ácido protocatecuico y1= 58116x + 30531 0,9945

Ácido vanílico y2= 61426x + 36265 0,9944

Cumarina y3= 24400x + 58945 0,9943

Amburosídio A y4= 27160x + 22275 0,9933

A precisão foi julgada pelo grau de repetitividade intradia e interdia dos ensaios, ou

seja, por análises repetidas ao longo de um dia e realizadas em três dias não-consecutivos,

respectivamente. Estatisticamente, este parâmetro foi determinado através dos coeficientes de

variação das áreas dos picos dos quatro padrões, contidos em soluções de controle de

qualidade em três níveis de concentração (baixa, alta e média). As determinações mais

precisas foram obtidas nas análises de ácido protocatecuico, intradia (> 2,6 %) e interdia (>

1,4 %). Ácido vanílico, cumarina e amburosídio A apresentaram graus de concordância

inferiores a 5,3; 5,6 e 3,6 %, em experimentos realizados no mesmo dia. Nesta mesma ordem,

a repetitividade interdia foi estimada em 2,7; 4,5 e 3,0 %. Como a ANVISA sugere valores

inferiores a 5 %, as medições do ácido vanílico e da cumarina, repetidas intra-corridas, foram

ligeiramente acima do limite proposto (Tab. 30, p. 249).

A exatidão foi aferida através da comparação entre as concentrações determinadas

experimentalmente e os valores de concentração tidos como verdadeiros (referência) dos

quatro padrões, em três níveis de concentração (baixa, alta e média). Dentre as substâncias de

interesse, os teores de amburosídio A foram os mais exatos, aproximadamente 99 %. Para os

demais, os graus de concordância entre os valores práticos e os de referência foram variáveis

com os níveis de concentração: ácido protocatecuico e ácido vanílico (95,3-102 %) e

cumarina (86,2-95,0 %), sendo que neste último a exatidão foi maior nas soluções mais

concentradas, diferentemente dos resultados observados para os ácidos fenólicos (Tab. 30, p.


248249).


249

Tendo em vista que as amostras eram extratos brutos, os quais requeriam um

tratamento prévio através de cartuchos de Extração de Fase Sólida (SPE), houve a

necessidade de se mensurar as possíveis perdas decorrentes desta operação. Os fatores de

recuperação dos quatro padrões foram determinados pela razão das respostas obtidas para

soluções tratadas em relação às soluções não-tratadas, em três níveis de concentração (baixa,

alta e média). Os melhores rendimentos de extração foram encontrados para a cumarina (95-

99 %), seguida do amburosídio A (90-97 %) e dos ácidos protocatecuico e vanílico (em torno

de 91 %). Uma vez que uma faixa de recuperação entre 80-120 % é plenamente aceitável para

procedimentos analíticos, foi possível constatar a eficiência do método de extração dos

analitos.

A partir dos parâmetros de desempenho analítico investigados, pôde-se verificar que

o método de validação desenvolvido possui seletividade, linearidade, precisão e exatidão

consideradas satisfatórias e que sua aplicação pode gerar resultados confiáveis, visto que

foram obtidos valores em conformidade com os rigorosos limites preconizados pela ANVISA

e pelo INMETRO (Tab. 30, p. 249). O método cromatográfico desenvolvido poderá ser

utilizado para determinação da autenticidade da matéria-prima, para quantificação dos

princípios ativos e avaliação da estabilidade do produto formulado a partir da planta A.

cearensis.

Tabela 30- Parâmetros de desempenho analítico dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A.

Precisão Exatidão Recuperação

Padrão CV (%)

1º.dia

CV (%)

2º.dia

CV (%)

3º.dia

CV (%)

média Cr/Ct (%) Ce/Ci (%)

Ác. protocatecuico

8 1,3 2,2 2,6 2,0 102,0 90,0

30 0,9 1,6 1,0 1,2 95,6 92,0

50 0,8 1,1 2,2 1,4 96,5 92,0

Ac. vanílico

8 0,7 3,7 2,6 2,3 102,0 92,0

30 1,3 3,9 3,0 2,7 95,3 91,0

50 0,5 0,4 5,3 2,1 95,9 91,0

Cumarina

8 3,4 5,6 4,6 4,5 86,2 95,0

30 1,5 5,2 4,3 3,5 91,0 96,0

50 1,3 1,8 5,1 2,7 95,0 99,0

Amburosídio A

8 2,7 3,6 2,7 3,0 98,7 90,0

30 1,4 1,0 3,0 1,8 98,7 96,0

50 0,6 1,1 1,9 1,2 99,0 97,0


250

7.2. Doseamento

O método validado foi adotado para quantificação dos quatro constituintes

majoritários, presentes em diferentes extratos etanólicos de A. cearensis.

O estudo químico da planta adulta foi realizado com as cascas do caule (extrato

etanólico) e com as sementes, devido ao emprego popular e comercial destas partes da planta.

Independente do método de extração adotado para a casca do caule, sohxlet ou maceração, a

ordem de concentração foi mantida: o amburosídio A foi o componente majoritário, seguido

por cumarina, ácido protocatecuico e ácido vanílico (Gráf. 1). A divergência residiu nos

maiores níveis de concentração encontrados para a extração feita em sohxlet. Como o

aumento de temperatura tende a favorecer a solubilização das substâncias, a extração num

aparelho sohxlet geralmente produz maiores rendimentos por processar-se a quente, em

detrimento da maceração que ocorre a frio. O extrato etanólico das sementes, gerado por

maceração, apresentou níveis detectáveis apenas de cumarina (23520 mg/100g ext. ou 1411

mg/100g planta), correspondendo ao maior teor achado entre todos os extratos analisados

(Tab. 31, p. 254).

900 720

2000

5280

320200

1340

2180

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Con

cent

raçã

o (m

g/10

0g E

xtra

to)

Soxhlet Maceração

Substâncias

Ác. protocatecuico

Ác. Vanílico

Cumarina

Amburosídio

Gráfico 1- Concentração dos quatro constituintes majoritários em extratos etanólicos das cascas do caule de A. cearensis, obtidos por maceração e soxhlet.

As análises quantitativas dos espécimens jovens de cumaru foram realizados com

extratos das plantas inteiras e extratos das partes aéreas e dos xilopódios (separadamente) de

2, 4, 7 e 9 meses de desenvolvimento.

Em extratos obtidos das plantas inteiras, foram possíveis apenas as determinações

dos teores de ácido vanílico e cumarina. Através do gráfico 2, observou-se um crescimento

linear nas concentrações de ácido vanílico e cumarina até o 7º mês, mês no qual ocorreu o Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith

251


252

ápice da presença destas substâncias (3440 e 4060 mg/100g de extrato, respectivamente).

Todavia no último mês (9º), a concentração decaiu acintosamente, atingindo os níveis mais

baixos determinados (1520 e 660 mg/100g ext.), respectivamente. Por outro lado, numa

análise feita em relação à planta, notou-se que a produção de ácido vanílico foi sempre

declinante ao longo do tempo (de 217 para 17 mg/100g de planta) e a de cumarina foi

praticamente estável nos sete meses iniciais (em torno de 140 mg/100g de planta),

apresentando uma queda abrupta no nono mês (7 mg/100g). O ácido protocatecuico e o

amburosídio foram detectados, porém não se encontravam em níveis quantificáveis, salvo no

nono mês, no qual este último teve sua concentração estimada em 400 mg/100g ext.

Gráfico 2- Concentrações de ácido vanílico e cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis (valores expressos em relação à massa de extrato e à biomassa).

Nos extratos das partes aéreas, o constituinte majoritário foi o ácido vanílico cuja

maior concentração foi medida no 7º mês (8520 mg/100g ext ou 452 mg/100g planta),

enquanto que, no xilopódio, a cumarina foi o principal componente (4º mês: 3760 mg/100g

ext. ou 256 mg/100g planta), excetuando o último mês, no qual o amburosídio foi o mais

abundante (680 mg/100g ext. ou 5 mg/100g planta). Quanto ao ácido protocatecuico, sua

presença só foi mensurada no extrato da parte aérea de espécimens de 4 meses (360 mg/100g

ext. ou 20 mg/100g planta).

A concentração de ácido vanílico na parte aérea foi sempre superior à encontrada no

xilopódio. Nos extratos, os teores máximos e mínimos foram encontrados, respectivamente,

no 7º (p. aérea: 8520 mg/100g ext. e xilopódio: 1380 mg/100g ext.) e 9º mês (p. aérea: 3460 e

xilopódio: 540 mg/100g ext). Entretanto, os platôs de produção ocorreram em períodos

distintos: na parte aérea (7º mês- 452 mg/100g planta) e no xilopódio (2º mês- 146 mg/100g

planta).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 2 4 6 8 10Idade (meses)

Con

cent

raçã

o (m

g/10

0g) Ác. vanílico

(ext.)

Ác. vanílico(planta)

Cumarina(ext.)

Cumarina(planta)

4780

780

6120

760

8520

1380

3460

540

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000C

once

ntra

ção

(mg/

100g

Ext

rato

)

2 4 7 9

Idade (meses)

Ácido Vanílico

P. aéreaXilopódio

354

146

337

52

452

2855

4

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Con

cent

raçã

o (m

g/10

0g P

lant

a)

2 4 7 9

Idade (meses)P. aéreaXilopódio


253

Gráfico 3- Concentração de ácido vanílico em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento.

A presença de cumarina foi registrada majoritariamente nos extratos da parte aérea,

em três dos quatro meses investigados, sendo o 7º mês o período de maiores rendimentos de

extração e produção (6060 mg/100g ext. ou 324 mg/100g planta). A exceção foi o 4º mês,

cujo extrato do xilopódio (3760 mg/100g ext. ou 256 mg/100g planta) apresentou um teor que

excedeu ao dobro da concentração aferida para a parte aérea (1660 mg/100g ext. ou 91

mg/100g planta). Curiosamente no primeiro mês analisado (2º), embora a proporção de

cumarina tenha sido maior no extrato da parte aérea (1540 mg/100g ext) do que no extrato

obtido do xilopódio (1320 mg/100g ext), este metabólito foi biossintetizado em maior escala

no xilopódio (247 mg/100g planta) do que na parte aérea (114 mg/100g planta).

Gráfico 4- Concentração de cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento.

Nas amostras investigadas, a ocorrência de amburosídio A foi detectada

exclusivamente numa das partes da planta, a cada mês: xilopódio (2, 7 e 9 meses de idade) e

114

247

91

256

324

5024 3

0

50

100

150

200

250

300

350

Conc

entra

ção

(mg/

100g

Pla

nta)

2 4 7 9


15401320

1660

3760

6060

2500

1500

420

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Con

cent

raçã

o (m

g/10

0g E

xtra

to)

2 4 7 9Idade (meses)

Cumarina

P. aéreaXilopódio


254

parte aérea (4 meses de idade), na qual foi verificada a sua menor concentração (260 mg/100g

ext.). No extrato de xilopódio de 9 meses de idade, foi medida a maior concentração de

amburosídio A (680 mg/100g ext.), entretanto o máximo de produção desta substância

ocorreu logo no 2º mês de cultivo (71 mg/100g planta).

Gráfico 5- Concentração de amburosídio A em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento.

Numa análise comparativa entre os extratos de plantas jovens e adultas, pôde-se

observar que o extrato de xilopódio de 9 meses de idade (680 mg/100g de ext. ou 5 mg/100g

de planta) foi a única amostra, obtida de espécimens cultivados, a conter o amburosídio como

principal constituinte, tal qual foi encontrado no extrato da casca do caule da planta silvestre

(maceração: 2180 mg/100g de ext. ou 11 mg/100g de planta). Ainda assim, numa proporção

cerca de duas a três vezes menor.

O xarope apresentou teores de cumarina (298 mg/100g de planta) e amburosídio A

(33 mg/100g de planta) semelhantes aos estimados para o extrato da parte aérea de 7 meses de

idade (324 e 33 mg/100g de planta), embora isento de ácido vanílico, o mais importante

constituinte desta amostra (452 mg/100g de planta). O xilopódio de 2 meses também exibiu

composição química parecida com a do xarope: 247 e 71 mg/100g de planta de cumarina e

amburosídio A, além de 146 mg/100g de planta de ácido vanílico.

A avaliação química dos extratos de A. cearensis, obtidos da planta adulta e de

espécimens jovens, revelou que qualitativamente estes materiais foram muito parecidos, no

entanto, os constituintes analisados apresentaram níveis de concentração muito distintos, em

razão do método de extração, da idade e da parte da planta investigadas. Além disso, a forma

de expressão dos resultados (mg/100g de extrato ou planta), fortemente influenciável pelos

0

380

260

0 0

300

0

680

0

100

200

300

400

500

600

700

Con

cent

raçã

o (m

g/10

0g E

xtra

to)

2 4 7 9

Idade (meses)

Amburosídio

P. aérea

Xilopódio

0

71

14

0 06

0 5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Conc

entr

ação

(mg/

100g

Pla

nta)

2 4 7 9


rendimentos de extração, demonstrou ser um parâmetro relevante na comparação entre as

concentrações estimadas.

Tabela 31- Concentração (mg/100g) dos quatro principais constituintes químicos detectados em diferentes extratos de A. cearensis, expressos em relação à massa de extrato e de material botânico.

Extrato Concentração (mg/100g)– CV (%) Ácido

protocatecuico Ácido

vanílico Cumarina Amburosídio Planta adulta

Silvestre Extrato Planta Extrato Planta Extrato Planta Extrato Planta

Casca do Caule

(Sohxlet)

900 (2,5)

54 720 (6,5)

43 2000 (1,5)

120 5280 (6,4)

317

Casca do Caule

(Maceração)

320 (6,3)

2 200 (5,6)

1 1340 (6,8)

7 2180 (5,5)

11

Xarope ND* ND - 298 (5,1)

- 33 (6,1)

Sementes ND ND 23520 (3,9)

1411 ND

Planta jovem Inteira

2 meses ND 1520 (1,3)

217 1020 (5,7)

146 ND

4 meses ND 2680 (13,4)

169 2000 (7,0)

126 ND

7 meses ND 3440 (4,3)

127 4060 (6,5)

150 ND

9 meses ND 1520 (6,1)

17 660 (1,8)

7 400 (5,7)

4

Parte aérea 2 meses ND 4780

(10,6) 354 1540

(3,0) 114 ND

4 meses 360 (3,3)

20 6120 (4,8)

337 1660 (2,0)

91 260 (8,7)

14

7 meses ND 8520 (1,0)

452 6060 (7,9)

324 ND

9 meses ND 3460 (6,3)

55 1500 (3,3)

24 ND

Xilopódio 2 meses ND 780

(5,3) 146 1320 (1,0) 247 380

(5,3) 71

4 meses ND 760 (7,5)

52 3760 (0,9) 256 ND

7 meses ND 1380 (2,9)

28 2500 (4,2) 50 300 (10,4)

6

9 meses ND 540 (9,8)

4 420 (10,8) 3 680 (9,4)

5

*ND- nível de concentração não-determinado.


255

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

2,67

72,

933

3,68

04,

090

4,32

14,

705

5,04

1

040 7,48

7

10,7

29

14,0

3614

,669

191

15,6

5016

,726 17

,

5,63

26,

157

6,44

47,

9,04

810

,216

11,2

9911

,700

11,8

9212

,582

13,1

5613

,733

17,5

4317

,794

18,6

8919

,426

19,9

3820

,306

20,7

2821

,582

22,3

3222

,777

23,5

3424

,900

25,8

5326

,171

27,8

8628

,607

29,0

5229

,741

31,0

61 31,5

7032

,440

33,2

8034

,596

Figura 144- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da casca do caule (ACCE)- sohxlet

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

2,65

290

09

4,31

206

89 6 3

7,07

97,

586 10

,775

708

14,0

3614

,683

196

577


256

2,3,

173,

636

11,

5,5,

666,

176,

54 17,

17,

20,3

43

22,7

6223

,527

27,8

43

29,7

1731

,040

31,5

54

33,2

9634

,231

34,5

94

Figura 145- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (9 meses)

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

2,65

33,

194

3,66

84,

286

4,62

34,

962

5,58

36,

116

6,60

3 7,00

77,

455

7,84

88,

442

10,7

8011

,709

12,1

24 13,3

6214

,031

14,3

5514

,854

16,3

2516

,573

17,1

9417

,563

18,0

1918

,634

d

f

hg

i

j

18,9

7919

,800

19,8

9020

,272

22,7

9123

,367

23,5

2623

,907

24,5

6824

,881

25,8

7426

,203

26,7

23

29,0

7029

,731

31,5

80

33,3

6934

,047

34,6

07

Figura 146- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (9 meses)

f b

h

dj

ga

a

b

d

f g

h

j

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

1,60

92,

663

2,88

83, 3,

185

644

4,30

04,

989

593

817,

022

7,46

9

10,6

89

14,0

2214

,672

14,8

28

435

187

17,5

6316

,17

,

5, 6,5 20,3

36

22,7

9123

,536

24,8

8325

,842

26,1

98

29,7

29

31,5

63

33,3

48


AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

2,68

72,

928

3,16

23,

714

4,32

24,

675

4,98

95,

620

6,12

26,

481

6,67 7, 7,

7,89

48,

478,

829,

049,

7310

,2

11,

12,1

12,7 13

,9 040

488

8 9 3 5 3610

,813

723

32 1436

714

,062

393

,902

77 321

563

17,2

1358

203

101 006


257

14,

1415

,7 16,

16, 17,

18,

18,7

19,

19,9

0420

,282

20,9

1621

,801

22,8

0923

,280

23,5

5423

,952

24,7

0024

,917

25,8

9826

,217

26,7

41

29,1

0029

,776

31,6

1232

,056

33,4

0234

,054

34,5

78


AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

1,08

31,

500

2,65

92,

875

3,56

94,

277

4,94

95,

594

6,7,

989

447

10,6

7722

866

573

326

714

14,8

7923

044

217

557

1

d

f

g

ij

11,

11,

12,

13,

,027

16,

16,

17,

17,

19,0

0619

,652

20,3

2721

,468

21,7

3322

,319

23,5

5524

,391

24,9

0025

,881

26,2

18

29,1

9029

,744

30,4

8631

,586

33,3

8234

,454


d a

b

f

g

h

ij

f

gh i

j

d

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

0,37

71,

185

2,66

82,

890

3,55

44,

322

5,09

05,

574

6,98

8 78,

427

9,02

09,

451,4

43

10,7

8069

210

2 3 13,3

37,0

3445 68

986

743

578

3 ,309

,549

17,1

84,5

5523


258

11,

12,

12,7

1 1414

,314

,14

,15

,15

, 16 16 1718

,018

,518

19,0

2719

,928

20,2

7620

,691

20,8

9621

,763

22,3

9922

,772

23,2

6323

,553

23,9

1424

,231

24,8

8025

,877

26,1

6926

,728

28,7

6729

,100

29,7

5930

,240

31,5

9632

,050

33,3

9734

,044

34,4

98


AU

0,00

0,02

0,04

0,06

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

2,63

62,

882

3,20

13,

600

3,68

34,

382

4,96

55,

605

6,44

77,

010

7,44

5

10,6

78

14,0

1914

,674

14,8

2716

,229

16,9

0417

,220

17,5

8718

,013

20,3

7121

,435

21,7

3822

,326

23,5

1624

,871

25,8

5526

,185

29,2

4129

,720

31,5

61

33,3

56


AU

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

2,61

63,

210

3,72

94,

302

4,96

65,

597

6, 6, 7,7,

8, 9,8226

966

000

4 453

431 6

10,7

5866

422

129

7 14,0

1314

,851

971

434

17,1

7753

938

d

f

gi

j

11,

12,

13,

15,

16, 17

,18

,6

20,3

4720

,887

21,4

1322

,335

22,7

7923

,488

24,8

6625

,843

26,1

8426

,704

28,6

6629

,696

30,5

2231

,537

33,2

8634

,566


d

f

gh

i

j

a bd

f

g hi j

Tabela 32- Relação das substâncias químicas identificadas, segundo seus tempos de retenção registrados em análises por HPLC, nos extratos de A. cearensis: planta adulta (casca do caule) e espécimens jovens (xilopódio e parte aérea).

Xilopódio (meses) Parte Aérea (meses) Substâncias

Identificadas

tR

(min.)

ACCE

2 4 7 9 2 4 7 9

a. Ác. (Z)-cumárico glicosilado

3,85 + + + +

b. Ác. 4-hidroxi-benzóico

4,99 + + + + +

c. Ác. (E)-cumárico glicosilado

6,02

d. Ác. protocatecuico 7,36 + + + + + + + +

e. Ác. o-cumárico 9,22

f. Ác. vanílico 10,87 + + + + + + + + +

g. Cumarina 13,98 + + + + + + + + +

h. Amburosídio A 14,65 + + + + + + +

i. Aiapina 14,85 + + + + + + +

j. Amburosídio B 17,17 + + + + + + + +

Análises comparativas dos cromatogramas de nove extratos de A. cearensis com

substâncias-padrão permitiram a identificação de onze constituintes químicos nestas amostras:

ácido 4-hidroxi-benzóico (Fig. 153, p. 259), ácido o-cumárico (Fig. 154, p. 259), ácido (Z)-

cumárico glicosilado (Fig. 155, p. 259), ácido (E)-cumárico glicosilado (Fig. 156, p. 260),

aiapina (Fig. 157, p. 260), cumarina (Fig. 158, p. 260), ácido vanílico (Fig. 159, p. 261), ,

amburosídio B (Fig. 160, p. 261), amburosídio A (Fig. 161, p. 261), ácido protocatecuico

(Fig. 162, p. 262) dispostos em ordem crescente de tempo de retenção (tR). O método de

identificação foi baseado no tempo de retenção e no espectro de ultravioleta extraído dos

picos.

Cumarina e ácido vanílico foram as únicas substâncias presentes em todos os extratos de

A. cearensis. O ácido protocatecuico foi encontrado em todos os extratos, exceto no extrato do

xilopódio de 4 meses de idade, enquanto que o amburosídio B só não foi detectado no

xilopódio de 4 meses. A aglicona e o glicosídio do ácido (E)-o-cumárico não foram

observados em nenhum dos extratos. Aiapina e os isômeros do ácido cumárico glicosilado

foram encontrados somente nas plantas jovens, além disso, o estereoisômero Z foi

identificado exclusivamente no xilopódio (Tab. 32).


259


260

Figura 153- Cromatograma de HPLC do ácido p-hidroxi-benzóico

Figura 154- Cromatograma de HPLC do ácido (E)-o-cumárico

Figura 155- Cromatograma de HPLC do ácido (Z)-o-cumárico glicosilado

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

3,85

AU

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

9,22

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

4,99


261

Figura 156- Cromatograma de HPLC do ácido (E)-o-cumárico glicosilado

Figura 157- Cromatograma de HPLC da aiapina

Figura 158- Cromatograma de HPLC da cumarina

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

13,98

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

14,85

AU

0,00

1,00

2,00

3,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

6,02


262

Figura 159- Cromatograma de HPLC do ácido vanílico

Figura 160- Cromatograma de HPLC do Amburosídio B

Figura 161- Cromatograma de HPLC do Amburosídio A

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

14,65

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

17,17

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

10,87


263

Figura 162- Cromatograma de HPLC do ácido protocatecuico

AU

0,00

1,00

2,00

3,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

7,36

8. BREVE ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DO ESTUDO

INTERDISCIPLINAR DE AMBURANA CEARENSIS

8.1. Avaliação da atividade farmacológica dos extratos etanólicos de espécimens jovens

Os extratos etanólicos da parte aérea (PA) e do xilopódio (X) de espécimens jovens

de A. cearensis, coletados aos 2, 4, 7 e 9 meses (m) de cultivo, foram avaliados em testes de

nocicepção (induzida por formalina) e edema de pata (induzida por carragenina), sendo seus

resultados comparados aos efeitos demonstrados pelo extrato etanólico da casca do caule da

planta silvestre adulta. Os extratos de xilopódio foram denominados EN-ACX e aqueles

provenientes da parte aérea foram designados EN-ACPa, onde N refere-se à idade da planta

(em meses de cultivo). A designação EN-ACPA+X corresponde ao extrato artificialmente

reconstituído. Esta pesquisa foi desenvolvida pela Profª Luzia Kalyne de Almeida Moreira

Leal (Departamento de Farmacologia e Fisiologia/UFC), como atividade do estudo integrado

para a validação química-farmacológica de A. cearensis.

Atividade antinociceptiva

Introduzido por Dubuisson e Dennis (DUBUISSON & DENNIS, 1977), o teste da

formalina permite a avaliação dos possíveis mecanismos modulatórios envolvidos numa dor

moderada e contínua, gerada pela lesão tecidual, sendo considerado como um dos modelos

mais válidos para dor clínica (TJOLSEN et al., 1992). A resposta nociceptiva para a formalina

ocorre de maneira bifásica: a 1ª fase (neurogênica) inicia-se imediatamente após a injeção de

formalina com duração de até 10 min., sendo causada predominantemente pela ativação de

nociceptores polinodais-C que liberam alguns neuropeptídios, incluindo glutamato e

substância P. Após um curto período de remissão, inicia-se a 2ª fase, que ocorre 15-30 min

após a injeção de formalina que persiste até 60 min. (TENG & ABBOTT, 1998), ocorrendo a

liberação de vários mediadores, como serotonina, histamina, bradicinina e prostaglandinas

(HUNSKAAR & HOLE, 1987); (TJOLSEN et al., 1992). Fármacos narcóticos que atuam a

nível central inibem as duas fases, mas fármacos que atuam perifericamente, como

antiinflamatórios não-esteroidais e dexametasona, inibem apenas a segunda fase da

nocicepção induzida pela formalina (SHIBATA et al., 1989).

Dentre os extratos etanólicos da parte aérea avaliados, apenas o obtido após 2 meses

de cultivo da planta, administrado por via oral (v.o.) na dose de 100mg/Kg, interferiu

significativamente na 1ª fase do teste, observado pela redução do tempo gasto pelo animal


264lambendo a pata (30,2 ± 5,2 seg.) em relação ao controle (49,4 ± 3,0 seg.), correspondendo a

uma inibição de 38,9%. Por outro lado, os extratos de xilopódio coletados aos 2, 4 e 9 m de

cultivo, nas doses de 100 e 200 mg/Kg (v.o.), causaram antinocicepção observada na 1ª fase

(2 m: 36, 6 ± 4,3 e 42,5 ± 3,5; 4 m: 21,9 ± 2,9 e 21,4 ± 2,8; 9 m: 21,4 ± 2,9 e 19,7 ± 2,9 seg.

respectivamente), correspondendo a uma inibição de 32 a 64%, comparado ao controle (54,2

± 3,1 seg.); enquanto que na 2ª fase resultados significativos foram observados apenas para o

E9-ACX na maior dose (16,5 ± 2,7 seg.), com uma inibição de 51,0% em relação ao controle

(33,7 ± 2,3 seg.)

Na avaliação dos extratos etanólicos produzidos a partir de toda a planta (PA+X) aos

4, 7 e 9 m de cultivo (200 mg/Kg, v.o.), observamos inibições significativas nas duas fases do

teste da formalina para os E7-ACPA+X (1ª fase: 20,8 ± 2,3; 2ª fase: 13,4 ± 1,93 seg.) e 9 m

(1ª fase:17,9 ± 1,3; 2ª fase: 10,8 ± 1,5 seg.) em relação ao controle (1ª fase: 40,2 ± 2,3; 2ª fase:

26,3 ± 3,1seg.). E4-ACPA+X inibiu significativamente apenas a 1ª fase do teste (21,5 ±

2,7seg.).

O extrato etanólico da casca do caule de A. cearensis (ACCE) silvestre, coletadas na

fase adulta da planta, nas doses de 100 e 200 mg/Kg, v.o., promoveu uma antinocicepção

observada pela redução do tempo gasto pelo animal lambendo a pata, tanto na 1ª fase (25,4 ±

3,9 e 22,8 ± 2,4 seg., respectivamente), correspondendo a uma inibição de 48 e 53%

respectivamente em relação ao controle (49,0 ± 3,0 seg.), quanto na 2ª fase (12,1 ± 21,8 e 6,5

± 1,1 seg., respectivamente), correspondendo a uma inibição dose-dependente de 47 e 71%

respectivamente em relação ao controle (22,8 ± 2,5 seg.).

Nos ensaios de avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos de A. cearensis, o

EEtOH da casca do caule da planta adulta (200 mg/Kg, v.o.) na 1ª fase do teste da formalina

foi eqüipotente em relação extratos compostos (PA+X) de 4, 7 e 9m. Por outro lado, na 2ª fase

do teste a mesma mostrou-se mais potente que os referidos extratos.

Dos extratos etanólicos da planta cultivada avaliados, apenas os extratos E9-ACX e

os extratos compostos (PA+X) de 4, 7 e 9 m foram capazes de inibir, à semelhança da planta

adulta, as duas fases do teste da formalina. Os demais, na dose investigada, interferiram

apenas a 1ª fase do teste (E2-ACPA e E4-PA+X). Dessa forma, os resultados sugerem que o

efeito antinociceptivo observado parece estar relacionado à atividade antiinflamatória dos

extratos, além de uma possível ação central a ser confirmada com estudos posteriores.


265

Atividade antiedematogênica

A resposta inflamatória aguda é caracterizada por um aumento na permeabilidade

vascular e infiltração celular levando à formação do edema, como resultado do

extravasamento de fluido, proteínas e acumulação de leucócitos no sítio inflamatório. O

modelo do edema de pata induzido por carragenina é largamente utilizado para determinar a

atividade antiinflamatória de novos fármacos e tem sido bem caracterizado, compreendendo

três fases distintas: a primeira fase envolve a liberação simultânea de histamina e serotonina,

nas concentrações em que cada amina exerce seu efeito máximo na permeabilidade vascular;

a segunda fase, por liberação de cininas como bradicinina, e a fase terminal por

prostaglandinas, presente no exsudato, 4h após a injeção de carragenina. Contudo a ação

desses mediadores parece ser dependente da presença do sistema complemento (DI ROSA et

al., 1971). Mais recentemente foi demonstrado que a ciclooxigenase-2 atinge sua expressão

máxima 1h após a injeção de carragenina. Outro mediador importante na inflamação aguda é

o óxido nítrico que em condições fisiopatológicas é produzido por três distintas isoformas de

óxido nítrico sintase (POSADAS et al., 2004).

Na avaliação da atividade antiedematogênica dos extratos ACPA investigados,

apenas o de 9 m (200 mg/Kg, v.o.) reduziu significativamente o edema de pata na 3ª h (79,8 ±

6,9 µL) e 4ª h (64,3 ± 8,4 µL) após a injeção de carragenina, correspondendo a uma inibição

de 37,4 e 41,3% respectivamente em relação ao controle (3ª h: 127,5 ± 5,3; 4ª h: 109,5 ±

4,5µL). Além disso, os grupos tratados com E-ACPA de 2 ou 7m, diferiram

significativamente em relação a E9-ACPA .

E2-ACX (200mg/Kg, v.o.) foi capaz de inibir o edema na 1ª h (48,0 ± 7,0µL) e 2ª h

(60,0 ± 7,9µL), apresentando uma inibição de 44,3 e 43,9% respectivamente em relação ao

controle (1ª h: 86,2 ± 12,7 e 2ª h: 107,0 ± 12,2µL). Enquanto, os demais extratos (4, 7 e 9 m)

na mesma dose não interferiram significativamente no edema, inclusive o tratamento com o

EEtOH de 2m diferiu significativamente em relação ao EEtOH 9 m.

Na dose de 200 mg/Kg, v.o., dentre os extratos compostos E-ACPA+X investigados

(4, 7 e 9 m e adulto), apenas o de 7 m foi capaz de inibir significativamente o edema na 3a h

após a injeção de carragenina, causando uma inibição de 34,3% em relação ao controle.

Porém, na dose de 400 mg/Kg, v.o., o extrato da planta adulta, silvestre, bem como

os obtidos pelo cultivo foram capazes de inibir significativamente o edema de carragenina em


266diferentes períodos de avaliação, com inibições de 25 a 64%. Os extratos E7-ACPA+X e E9-

ACPA+X foram eqüipotentes e apresentaram uma atividade antiedematogênica superior à da

planta adulta silvestre.

O estudo demonstrou o potencial antinociceptivo e antiedematogênico dos EEtOH

obtidos de A. cearensis cultivada, onde os extratos E7-ACPA+X e E9-ACPA+X

apresentaram-se pelo menos eqüipotentes em relação à planta adulta.

8.2. Avaliação da atividade farmacológica de substâncias isoladas de A. cearensis

Atividade Antiinflamatória

Em virtude do uso difundido de A. cearensis para o tratamento de doenças respiratórias

(gripe, resfriado, bronquite e asma) e as evidências farmacológicas de atividade

antiinflamatória mostradas pelo extrato hidroalcoólico de A. cearensis (LEAL et al., 2003), o

isocampferídio e o amburosídio A, isolados em nossos estudos, foram submetidos a diferentes

modelos de ensaios de inflamação, num estudo realizado pela Profa. Luzia Kalyne de

Almeida Moreira Leal.

As atividades antiedematogênicas do isocampferídio e do amburosídio A foram

observadas em modelos de edema de pata induzido por diversos agentes inflamatórios

(carragenina, dextrano, prostaglandina E2, histamina, serotonina), peritonite induzida por

carragenina e determinação das atividades das enzimas mieloperoxidase e elastase, incluindo

estudo histopatológico, avaliação morfométrica e avaliação da permeabilidade vascular de

ratos e camundongos. Os mecanismos de ação destas substâncias estão possivelmente

relacionados ao bloqueio da síntese, liberação e/ou ação de mediadores inflamatórios

(prostaglandina E2, histamina, e serotonina) e inibição parcial da degranulação de neutrófilos.

A ação antioxidante do amburosídio A foi evidenciada em modelos de hepatotoxicidade

induzida por CCl4, em fígado de ratos. A ação hepatoprotetora foi determinada através do

monitoramento das concentrações enzimáticas da catalase e enzimas transaminases, dos níveis

séricos de glutationa reduzida e substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico e análise

histológica do fígado, sugerindo que o amburosídio possui ação seqüestradora de radicais

livres e inibidora da peroxidação lipídica (LEAL et al., 2006a).

Atividade broncodilatadora

O isocampferídio apresentou efeito relaxante muscular em traquéias de cobaias, pré-

contraídas com carbacol ou KCl, independente da presença de epitélio. Por isso acredita-se


267

que este flavonóide seja capaz de mediar a ativação da via Óxido Nítrico Sintetase-Guanilato

Ciclase, promover a abertura de canais de K+ e interferir na liberação de neuropeptídios

(substância P e neurocinina A) (LEAL et al., 2006b).

As atividades antiinflamatória e broncodilatadora apresentadas pelo isocampferídio e

amburosídio A dão respaldo parcial ao uso tradicional da planta como alternativa terapêutica

para o tratamento de patologias respiratórias.

Atividade neuroprotetora

O amburosídio A teve sua ação neuroprotetora avaliada em modelos de neurotoxicidade

provocada pela neurotoxina 6-hidroxi-dopamina, em células mesencefálicas de ratos. Sua

ação neuroprotetora foi demonstrada por aferições dos níveis de óxido nítrico, nitrito e

substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico, os quais revelaram uma suposta inativação do

fator nuclear–kappaB (NF-κB) e inibição da peroxidação lipídica como prováveis

mecanismos. A atividade antioxidante exibida neste tipo de ensaio farmacológico sugere um

potencial terapêutico do amburosídio A contra doenças neurodegenerativas como o Mal de

Parkinson (LEAL et al., 2005).

Atividade Citotóxica

Em pesquisa desenvolvida pela Profa. Letícia Veras Costa-Lotufo (Departamento de

Farmacologia e Fisiologia/UFC) em busca de novos agentes citotóxicos, foram testados

isocampferídio, campferol, ácido protocatecuico e amburosídio A.

Todavia apenas os flavonóides, isocampferídio e o campferol, exibiram significativos

efeitos antiproliferativos contra ovos de ouriço-do-mar e cinco linhagens de células tumorais

(dois tipos de células leucêmicas humanas, células cancerosas de mama, cólon e pele) em

ensaios in vitro, sinalizando um potencial antineoplásico para estes compostos (COSTA-

LOTTUFO et al., 2003).


268


269

REFERÊNCIAS

COSTA-LOTUFO, L. V.; JIMENEZ, P. C.; WILKE, D. V.; LEAL, L. K. A. M.; CUNHA, G. M. A.; SILVEIRA, E. R.; CANUTO, K. M.; VIANA, G. S. B.; MORAES, M. E. A.; MORAES, M. O.; PESSOA, C.; Antiproliferative effects of several compounds isolated from Amburana cearensis A.C. Smith Z. Naturforsch., v. 58c, p. 675-680, 2003.

DI ROSA, M., GIROUD, J.P., WILLOUGHBY, D.A. Studies on the mediators of the acute inflammatory response induced in rats in different sites by carrageenan and turpentine. J. Pathol., v.104, p. 15-29, 1971.

DUBUISSON, D.; DENNIS, S. G. Formalin test - quantitative study of analgesic effects of morphine, meperidine, and brain-stem stimulation in rats and cats. Pain, v. 4, n. 2, p.161-174, 1977.

HUNSKAAR, S., FASMER, O. B., HOLE, K. Formalin test in mice a useful technique for evaluating mild analgesic. J. Neurosci. Methods., v. 14, p. 69-76, 1985.

HUNSKAAR, A.T., HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and non-inflammatory pain. Pain, v. 30, p.103-4, 1987.

LEAL, L. K. A. M. Contribuição para a validação do uso medicinal de Amburana cearensis (cumaru): estudos farmacológicos de princípios bioativos, isocampferídio e amburosídio A. 2006. 189 f. Tese (Doutorado em Farmacologia)- Departamento de Farmacologia e Fisiologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006.

LEAL, L. K. A. M.; COSTA, M.F.; PITOMBEIRA, M.; BARROSO, V. M.; SILVEIRA, E. R.; CANUTO, K. M.; VIANA, G. S. B. Mechanisms underlying the relaxation induced by isokaempferide from Amburana cearensis in the guinea-pig isolated trachea. Life Sciences, v. 79, p. 98-104, 2006.

LEAL, L. K. A. M; NECHIO, M.; SILVEIRA, E. R.; CANUTO, K. M.; FONTENELE, J. B.; RIBEIRO, R.A.; VIANA, G. S. B. Anti-inflammatory and smooth muscle relaxant activities of the hydroalcoholic extract and chemical constituents from Amburana cearensis A.C. Smith. Phytother. Res., v. 17, p.335-340, 2003.

LEAL, L. K. A. M.; NOBRE-JÚNIOR, H. V.; CUNHA, G. M. A.; MORAES, M. O., PESSOA, C.; OLIVEIRA, R. A.; SILVEIRA, E. R.; CANUTO, K. M.; VIANA, G. S. B.; Amburoside A, a glucoside from Amburana cearensis, protects mesencephalic cells against 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity. Neurosci. Lett., v. 388, p. 86-90, 2005.

POSADAS, I., BUCCI, M., CIRINO, G. Carrageenan-induced mouse paw oedema is biphasic, age-weight dependent and displays differential nitric oxide cyclooxygenase-2 expression. Brit. J. of Pharmacol., v. 142, p. 331-338, 2004.

SHIBATA, M., OHKUBO, T., TAKAHASHI H., INOKI, R. Modified formalin test:characteristic biphasic pain response. Pain, v.38, p.347-52, 1989.

TENG, C. J.; ABBOTT, F. V. The formalin test: a dose-response analysis at three developmental stages. Pain, v. 76, n. 3, p. 337-347, 1998

TJOLSEN, A., BERGE, O. G., HUNSKAAR, S., ROSLAND, J. H., HOLE, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain, v. 51, p. 5-17, 1992.

9. ATIVIDADE ALELOPÁTICA

9.1. Alelopatia

Alelopatia foi definida por Molish em 1937 como a circunstância em que

determinadas espécies de planta podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de outras

por síntese e liberação de substâncias químicas específicas (aleloquímicos) no ambiente

(ABENAVOLI et al., 2003). A principal rota biogenética produtora de aleloquímicos é a via

chiquimato, sendo ácidos fenólicos e cumarinas os mais importantes (CHON et al., 2003).

A cumarina é conhecida por ser um forte inibidor da germinação de sementes e

crescimento de raízes. É uma substância modulada pela luz capaz de reduzir a taxa de

respiração e fotossíntese, em plantas intactas, por inibir o sistema de transporte de elétrons.

Apresenta um efeito ambíguo (indução e inibição) sobre o crescimento dependendo da

espécie e da concentração (ABENAVOLI et al., 2003).

9.2. Atividade alelopática do extrato aquoso das sementes de A. cearensis

A capacidade alelopática do extrato aquoso das sementes de Amburana cearensis

(ACEAq) foi testada na inibição da germinação de Lactuca sativa (alface), pelo Prof. Antonio

Marcos Esmeraldo Bezerra (Departamento de Fitotecnia-UFC). No bioensaio, as sementes de

L. sativa foram semeadas sobre discos de papel de filtro, previamente umedecidos com

solução de ACEAq, e dispostos sobre placas de Petri, as quais foram mantidas num

germinador (20 °C), com luz continua, por 15 dias. Os procedimentos de contagens foram

efetuados no 4º e 7º dia. No 11º dia, foi realizada a substituição dos discos de papel de filtro, o

umedecimento dos mesmos com água destilada e a repicagem das sementes. Decorridos

quatro dias, realizou-se a avaliação das sementes repicadas, classificando-as em plântulas

normais, plântulas anormais e sementes não germinadas.

ACEAq mostrou atividade em todas as concentrações testadas, que variaram de 0,54

a 34,50 mg/mL. A inibição da germinação foi revertida nos tratamentos a baixas

concentrações (0,54; 1,08; 2,16 e 4,32mg/mL) quando procedeu-se a troca dos discos de papel

de filtro e a posterior repicagem das sementes, mas não para as outras (Fig. 163, p. 270).

Partição liquído-liquido do ACEAq com clorofórmio, seguida da extração com acetato de

etila, forneceu uma fração aquosa (isenta de cumarina) exercendo ainda efeito inibitório. Este

resultado sugere que a cumarina não é a única responsável pela ação alelopática. Análise por

RMN revelou a presença de cumarina livre, na porção apolar, e glicosídeos de cumarina e


270ácido (Z)- o-cumárico, na fração polar (BEZERRA, 2001).


271

Figura 163- Detalhe das plântulas normais (esquerda), anormais (centro) e sementes não germinadas (direita) observadas no bioensaio com extrato aquoso das sementes de cumaru.

A atividade alelopática demonstrada pelo extrato aquoso das sementes de A.

cearensis é uma prova científica do potencial bio-herbicida desta planta, a qual poderá ser

utilizada como uma arma química natural, de baixo custo e ecologicamente correta no

combate a ervas daninhas, possibilitando aumento na produtividade agrícola sem provocar

danos à saúde humana e ao meio-ambiente.

REFERÊNCIA

ABENAVOLI, M. R.; SORGONA, A.; SIDARI, M.; BADIANI, M.; FUGGI, A. Coumarin inhibits the growth of carrot (Daucus carota L. cv. Saint Valery) cells in suspension culture. J. Plant Physiol., v. 160, p. 227-237, 2003.

BEZERRA, A. M. E.; CANUTO, K. M.; SILVEIRA, E. R; FREITAS, J. B. S.; MEDEIROS-FILHO, S. Efeito do extrato aquoso das sementes de cumaru na germinação de alface. Hortic. Bras., v. 19, n. 2, p.243, 2001.

CHON, S-U; KIM, Y. M.; LEE, J. C. Herbicidal potential and quantification of causative allelochemicals from several Compositae weeds. Weed Res., v. 43, p. 444-450, 2003.

10. PARTE EXPERIMENTAL

10.1. ESTUDO QUÍMICO DOS CONSTITUINTES DE A. CEARENSIS

10.1.1. MATERIAL BOTÂNICO

As sementes de Amburana cearensis foram adquiridas no comércio de Fortaleza

pelo Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra, pesquisador responsável pelo cultivo de

mudas desta espécie.

As cascas do caule de A. cearensis selecionadas para este estudo foram coletadas,

em setembro de 2002, na fazenda São Vicente, no município de Quixeramobim-Ce, pela

Profª. Luzia Kalyne Almeida M. Leal (Departamento de Farmácia-UFC), pesquisadora

responsável pelos ensaios farmacológicos de extratos e substâncias isoladas desta planta.

A identificação botânica foi fornecida pelo Prof. Afrânio Gomes Fernandes,

pertencente ao Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará. As exsicatas

correspondentes à coleta encontram-se depositadas no Herbário Prisco Bezerra/UFC, com os

números de inscrição 837 e 847.

10.1.2. METODOLOGIA AGRONÔMICA

Cultivo de mudas de A. cearensis

Sementes foram semeadas, diretamente, em quatro canteiros de dimensões de 1,20 m

x 10,00 m cada, no Setor de Horticultura da UFC, os quais foram previamente adubados com

Bioadubo vitaemix® (2,8 kg m-2). Cada parcela compunha-se de seis fileiras regularmente

espaçadas de 20 cm, cuja densidade de semeadura foi de 50 sementes/fileira. Após o desbaste,

realizado 45 dias depois da semeadura, preservaram-se 20 plantas por parcela. Os tratamentos,

representados por oito épocas de colheita (60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 e 270 dias após a

semeadura), foram distribuídos aleatoriamente segundo um delineamento de blocos ao acaso

com quatro repetições. Os tratos culturais dispensados foram duas capinas manuais (45 e 70

dias) e regas por microaspersão, exceto nos dias chuvosos. As partes aéreas foram

manualmente separadas dos respectivos xilopódios.


272

10.1.3 Métodos cromatográficos

10.1.3.1. Cromatografia de adsorção

Nas cromatografias de adsorção foi empregada gel de sílica 60 da Merck ou da

Vetec (∅ µm 63-200). O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as

alíquotas das amostras e as quantidades de gel de sílica utilizadas. Para cromatografia de

camada delgada (CCD) utilizou-se cromatoplacas de gel de sílica 60 (∅ µm 2-25) sobre

poliéster T-6145 da Sigma Chemical CO (com indicador de fluorescência na faixa de 254

ηm). Os eluentes utilizados foram: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol puros, ou

combinados em proporções crescentes de polaridade.

A revelação das substâncias nas cromatoplacas analíticas foi obtida por exposição à

luz ultravioleta em dois comprimentos de onda (254 e 366nm) realizada em aparelho

Spectroline modelo ENF-240 C/F e/ou por aspersão com solução de vanilina (C8H8O3) e

ácido perclórico (HClO4) em etanol (C2H6O), seguido de aquecimento em estufa a 100 0C por

aproximadamente 5 minutos, ou ainda por exposição a vapores de iodo.

10.1.3.2. Cromatografia de exclusão

Os fracionamentos por cromatografia de exclusão foram efetuados em gel de

dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals, utilizando-se metanol puro ou

combinado com água ou clorofórmio como fase móvel.

10.1.3.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE≈ HPLC)

As soluções de calibração, os extratos e frações de Amburana cearensis foram

analisados num aparelho de HPLC, constituído de uma bomba binária Waters-1525 e um

detector DAD Waters-2996 a 254nm. As separações foram efetuadas em colunas XTerra®

RP-18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) e XTerra® RP-18 (10 x 250 mm, 10 µm), mantidas num forno

termostático a 35°C. As amostras foram eluídas com MeOH e solução aquosa de H3PO4, puro

ou tamponado com Et3N (pH=3,0), adotando-se fluxos de 1mL/min (coluna analítica) e 4,5

mL/min (coluna semi-preparativa).

Os solventes empregados apresentavam grau HPLC (MeOH-Tedia e H2O-Milli-Q) e


273

foram adequadamente filtrados através de membranas de nylon com poros de 0,45 µm

(Phenomenex) e desgaseificados por sonicação a vácuo durante 5 min. As amostras foram

dissolvidas nas fases móveis empregadas em cada análise e filtradas através de membranas de

teflon com poros de 0,45 µm (Waters).

10.1.3.4. Extração em Fase Sólida (EFS ≈ SPE)

As extrações em fase sólida de frações de A. cearensis, com fins de isolamento,

foram realizadas em cartuchos de fase reversa (C18) de 500 mg e 2g, fabricados pela Waters.

Na etapa de preparo das amostras injetadas no HPLC (clean-up), foram empregados cartuchos

de fase reversa de 100 mg, fabricados pela Varian. O uso dos cartuchos era precedido por

ativação do adsorvente com metanol, seguida de acondicionamento em água Mili-Q,

utilizando alíquotas equivalentes a três vezes o volume do cartucho.

10.1.4. Métodos espectroscópicos

10.1.4.1. Espectroscopia na região do infravermelho (IV)

Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em Espectrômetro Perkin

Elmer, modelo FT-IR Spectrum 1000 da central analítica do Departamento de Química

Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará (DQOI/UFC), utilizando pastilhas

de KBr para análise das amostras.

10.1.4.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Prótio (RMN 1H) e de

Carbono-13 (RMN 13C)

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Prótio (RMN 1H) e Ressonância

Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN 13C), uni e bidimensionais, foram obtidos em

espectrômetros Bruker, modelo Avance DPX-300 e/ou modelo Avance DRX-500,

pertencentes ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da

Universidade Federal do Ceará (CENAUREMN-UFC).

O espectrômetro Bruker Avance DRX-300, equipado com sonda de detecção inversa

de 5 mm e magneto de 7,046 T, foi operado nas freqüências de 300,13 e 75,47 MHz para

hidrogênio e carbono, respectivamente. Nos experimentos realizados no aparelho Bruker


274

Avance DRX-500, foram aplicadas freqüências de 500,13 MHz (1H) e 125,75 MHz (13C), sob

um campo magnético de 11,744 T. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: 1-

sonda dual de 5 mm com detecção direta (experimentos unidimensionais), 2- sonda

multinuclear de 5 mm com detecção inversa (experimentos bidimensionais).

As amostras foram dissolvidas em alíquotas de 0,6 mL de solvente deuterado:

clorofórmio (CDCl3), metanol (CD3OD), dimetilsulfóxido (DMSO-d6), água (D2O) ou

piridina (C5D5N), comercializados pelas companhias ACROS, Cambridge Isotope

Laboratories, Merck ou Aldrich.

Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e

referenciados, no caso dos espectros de prótio, pelos picos dos hidrogênios pertencentes às

moléculas residuais não-deuteradas dos solventes deuterados utilizados: clorofórmio (δ 7,27),

metanol (δ 3,31), DMSO (δ 2,50), piridina (δ 8,74; 7,58; 7,22), água (δ 4,80) e acetona

(δ.2,05) Nos espectros de carbono-13, os deslocamentos químicos foram referenciados pelos

picos centrais dos carbonos-13 dos solventes: clorofórmio (δ 77,23), metanol (δ 49,17),

DMSO (δ 39,51) piridina (δ 150,35; 135,91; 123,87) e acetona (δ 206,68 e 29,92).

As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram

indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), q

(quarteto), m (multipleto).

Nos experimentos unidimensionais de 1H e de 13C foram estabelecidos os seguintes

valores para os parâmetros de aquisição, respectivamente: larguras espectrais de 24 e 260

ppm, tempo de relaxação de 1 s e largura de pulso de 90o de 9,60 µs (0 dB) e 10,90 µs (-3 dB)

para 1H e 13C, respectivamente. Para todos os experimentos unidimensionais foram utilizados

65356 pontos para a aquisição e 32768 para o processamento, enquanto para os experimentos

bidimensionais foram utilizados 2048 x 256 pontos para a matriz de dados de aquisição e

2048 x 1024 pontos para o processamento. Predição linear para o processamento 2D,

utilizando 80 coeficientes, foi usada quando necessária. O número de transientes variou de 8,

para 1H, a 16384, para 13C, para os experimentos unidimensionais, e 2n (n ≥ 2) para

bidimensionais, dependendo do experimento e quantidade de amostra disponível.

Os microprogramas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H (zg), 13C-BB

(zgpg), 13C-DEPT135 (dept135), COSY (cosygp), NOESY (noesygpph), HSQC (hsqcgpph), 1H,13C-HMBC (hmbclpndqf).

A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com


275ângulos de nutação de 135°, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos CH2, e 90°, somente

CH, foi utilizada na determinação do padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN 13C,

descrito segundo a convenção: C (carbono não-hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2

(carbono metilênico ou metilidênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não-

hidrogenados foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.

Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY e NOESY) e

heteronuclear (HMQC, HSQC e HMBC), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500,

foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se

gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados

para os experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n ≥ 2.

10.1.4.3. Espectrometria de massa (EM)

Os espectros de massa de baixa resolução foram registrados num espectrômetro

Shimadzu, modelo QP 5000/DI-50, através de impacto eletrônico a 70 eV ((DQOI/UFC).

Os espectros de alta resolução dos amburosídios foram obtidos por ionização por

elétron-spray (EM-IES), enquanto que os espectros de biflavonóides foram produzidos por

impacto eletrônico (EM-IE). Os espectros por EM-IES foram registrados num espectrômetro

de quadrupolo com analisador de tempo-de-vôo (UltrOTOF-Q, Bruker Daltonics, Billerica,

USA), pertencente ao Laboratório de Espectrometria de Massas da USP-Ribeirão Preto, sendo

os scans aquiridos no modo positivo. Condições: voltagem capilar de 3400 V, temperatura e

fluxo do gás seco: 180 °C e 4 L/h. Nitrogênio foi utilizado como gás nebulizador e CF3CO2Na

foi empregado como padrão de calibração interna e externa. Os espectros de EM-IE foram

obtidos num aparelho VG Autospec Fisons Instruments (Micromass, Manchester),

pertencente à central analítica do Instituto de Química da UNICAMP.

10.1.5. Métodos físicos

10.1.5.1. Determinação do ponto de fusão (pf)

Os pontos de fusão, não corrigidos, foram determinados em equipamento da Mettler

Toledo, composto por uma placa aquecedora FP82HT e uma unidade de processamento FP90,

a uma taxa de aquecimento de 2 oC/min.


276

10.1.5.2 Determinação da rotação óptica (α)

As rotações ópticas foram determinadas em polarímetro Perkin-Elmer, modelo 341,

sendo as medidas realizadas a 589 ηm (20 oC).

10.1.6. Estudo Fitoquímico da casca do caule de A. cearensis

10.1.6.1. Obtenção do extrato etanólico da casca do caule (ACCE1)

4,0 Kg de cascas do caule de planta adulta silvestre, trituradas mecanicamente,

foram divididas em alíquotas de, aproximadamente, 200 g e submetidas à extração com etanol

em aparelho Sohxlet, gerando 192,5 g (R= 4,8 %, p/p) de um sólido viscoso marrom, após

destilação do solvente sob pressão reduzida. O extrato etanólico obtido foi denominado

ACCE1.

10.1.6.2. Partição líquido-líquido do extrato etanólico ACCE1

O extrato etanólico ACCE1 (192,5 g) foi suspenso em 350 mL de água e

particionado com acetato de etila (3 x 150 mL), fornecendo 101,8 g de fração aquosa

(ACCE1A), após liofilização. A fração acetato de etila, previamente tratada com Na2SO4

anidro, foi destilada a vácuo, rendendo 82,6 g de um sólido marrom viscoso Depois de seca, a

fração acetato de etila (82,6 g) foi solubilizada com 200 mL de metanol e desengordurada

através de partição com hexano (3 x 100 mL). As fases hexânica e metanólica foram

rotaevaporadas e secas, gerando, respectivamente, 16,6 g de um sólido verde (ACCE1AH) e

64,5 g de um sólido escuro (ACCE1AM).


277


278

Fluxograma 1- Partição líquido-líquido do extrato etanólico da casca do caule de A. cearensis.

Extrato etanólico ACCE (192,5 g)

Fração acetato de etila ACCEA (82,6 g)

Fração aquosa ACCEQ (101,8 g)

Fração metanólica ACCEAM (64,5 g)

Fração hexânica ACCEAH (16,6 g)

1. H2O 2. AcOEt

1. MeOH 2. Hexano

liofilização Na2SO4/Rotaevaporação

Rotaevaporação

10.1.6.3.Fracionamento de ACCEAM1

A fração ACCE1AM (64,5 g) foi adsorvida com 65,0 g de gel de sílica, pulverizada

em gral de porcelana e acondicionada sobre 48,7 g de gel de sílica numa coluna de vidro de

1000 mL. ACCE1AM foi fracionada por eluição com os seguintes solventes, obedecendo esta

ordem: CHCl3 (0,5 L), CHCl3/AcOEt (3,5 L), AcOEt (2,0 L) e MeOH (0,5 L). Após

evaporação dos solventes, foram obtidas as frações correspondentes a cada eluente, seguindo

a mesma seqüência: ACCE1AM/C (2,1 g), ACCE1AM/CA (22,7 g), ACCE1AM/A (25,3 g) e

ACCE1AM/M (12,3 g).

10.1.6.4.Cromatografia em sílica de ACCE1AM/CA

Numa coluna de 500 mL contendo 160,2 g de gel de sílica, acondicionou-se a fração

ACCE1AM/CA (22,7 g- sólido marrom), previamente adsorvida com 24,3 g de gel de sílica.

ACCE1AM/CA foi eluída com: CHCl3 (f1-6), CHCl3/AcOEt 10% (f7-18), CHCl3/AcOEt 20%

(f19-25), CHCl3/AcOEt 40% (f26-29), CHCl3/AcOEt 50% (f30-31), AcOEt (f32) e MeOH

(f33), coletando-se alíquotas de 75 mL. Através de análise por CCD, reuniram-se as frações

semelhantes: f3-7, f8-15, f16-19, f20-23, f24-31.

10.1.6.5. Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACCE1AM/CA(24-31)- Isolamento de

ACCE-1 (quercetina)

A fração ACCE1AM/CA(24-31) (4,0 g) foi dissolvida em 4 mL de MeOH e

cromatografada em 60,0 g de Sephadex LH-20 (∅int= 3,5 cm). Foram coletadas 34 frações de

10 mL, utilizando-se metanol como eluente. Monitoramento por cromatoplacas permitiu

reunir as frações idênticas: f2-8, f9-18 e f19-33. A cromatoplaca da fração 34 (40 mg) revelou

a presença de apenas uma mancha amarelada, sendo então submetida à análise

espectroscópica. Esta fração, um sólido amarelo, foi denominada ACCE-1 e identificada

como sendo o flavonol quercetina.

10.1.6.6. Isolamento de ACCE-2 ACCE- 3 e ACCE-4 (ácido protocatecuico, amburosídio

A e ácido vanílico)

Uma nova cromatografia em Sephadex LH-20 (60 g; ∅int= 3,5 cm) foi realizada para

fração ACCE1AM/CA(24-31)(2-8) (2,4 g), empregando-se condições idênticas às adotadas no

procedimento anterior. As 20 frações obtidas foram submetidas à análise por CCD, resultando

em 4 grupos de frações: f4-6, f8-13 e f14-15 e f16-20. Após secagem à temperatura ambiente,

foi possível visualizar a presença de cristais aciculares amarelados na fração f4-6 (186 mg),

chamada ACCE-2, e um sólido rosado na fração f8 -13 (954 mg), intitulada ACCE-3. A

fração f14-15 (103 mg), sólido marrom escuro, foi recristalizada em CHCl3/AcOEt 50%,

obtendo-se 47 mg de cristais amarelados, designados ACCE-4. Todas as frações puras foram

quimicamente caracterizadas através de comparação dos seus dados espectrais com os já

descritos na literatura, revelando as seguintes substâncias químicas: ácido protocatecuico

(ACCE-2), amburosídio A (ACCE-3) e ácido vanílico (ACCE-4).

10.1.6.7. Isolamento de ACCE-5 (Amburanina A)

Após dissolução em 3 mL de MeOH, a fração ACCE1AM/CA(24-31)(9-18) (1,5 g)

foi submetida à cromatografia em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), sendo eluída com

MeOH. 26 frações de 5 mL foram coletadas e reunidas, ao serem comparadas por CCD: f3-5,

f7-9 e f10-26.

A fração ACCE1AM/CA(24-31)(9-18)(10-26) (260 mg) foi cromatografada

novamente em Sephadex LH-20 (8 g- ∅int= 1,5 cm), obtendo-se 15 frações de 1mL. As

frações 6-12 apresentavam um sólido amarelo denominado ACCE-5 (61 mg) e identificado

como o biflavonóide amburanina A por técnicas espectroscópicas.


279


280

10.1.6.8. Isolamento de ACCE-6 (Amburanina B)

Cromatografia em Sephadex LH-20 (8 g- ∅int= 3,5 cm) de ACCE1AM/CA(24-

31)(19-33) (254 mg) rendeu um sólido amarelo nas frações 5 a 12, sendo então reunidas

depois comparadas através de CCD. MeOH foi utilizado na solubilização da amostra (1,5 mL)

e na eluição de 15 frações (alíquotas de 3mL).

A fração f5-12 (162 mg) foi purificada por HPLC, utilizando-se uma coluna de fase

reversa e uma fase móvel composta por H2O-MeOH. O gradiente de eluição variou de 60%

para 75% de MeOH em 10 min, empregando-se um fluxo de 4,5 mL/min. O cromatograma

(Fig. 164) exibiu dois picos a 284 nm, sendo o pico 2 (53 mg; tR= = 8,82 min), denominado

ACCE-6, estruturalmente caracterizado através de técnicas espectroscópicas como

amburanina B.

Figura 164- Cromatograma de HPLC da fração ACCE1AM/CA(24-31)(19-33)(5-12)

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

8,82


281

Fluxograma 2- Metodologia de Isolamento de 6 substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis.

10.1.6.9. Obtenção e partição de ACCE2

Em virtude da necessidade de maiores quantidades de substâncias de interesse

farmacológico (amburosídio A e isocampferídio), repetiu-se a mesma metodologia de

extração do item 10.1.6.1.. Foram obtidos 228 g do extrato etanólico denominado ACCE2 a

partir de 4,2 Kg de casca do caule (R= 5,4 %, p/p), adquiridas nos mesmos local e período de

coleta. O extrato ACCE2 foi particionado com H2O (350 mL)/AcOEt (3 x 150 mL) e

posteriormente a fase acetato de etila foi seca e submetida à partição MeOH (180

mL)/Hexano (3 x 120 mL), resultando em 81,8 g e 14,4 g das frações metanólica

(ACCE2AM) e hexânica da fração (ACCE2AH), respectivamente.

ACCE1AM

ACCE1AM/C ACCE1AM/CA ACCE1AM/A ACCE1AM/M

Sílica

F24-31

Sephadex

F2-8 F9-18 F19-33 F34

Sílica

Sephadex Sephadex Sephadex

F4-6 F8-13 F14-18

ACCE-2 Ac. protocatecuico

ACCE-1 Quercetina

ACCE-3 Amburosídio A

ACCE-4 Ác. vanílico

F10-26

F6-12

Sephadex

ACCE-5 Amburanina A

F5-12

Pico 2

HPLC

ACCE-6 Amburanina B

10.1.6.10. Fracionamento de ACCE2AM

A fração ACCE2AM foi adsorvida com 80 g de gel de sílica, sendo posteriormente

acondicionada sobre 30 g de gel de sílica numa coluna de 1000 mL, e cromatografada com:

CHCl3 (1,7 L), CHCl3/AcOEt (2,1 L), AcOEt (2,6 L) e MeOH (0,8 L), fornecendo as frações

ACCE2AM/C (12,7 g), ACCE2AM/CA (15,7 g), ACCE2AM/A (38,6 g) e ACCE2AM /M

(10,2 g), respectivamente.

10.1.6.11. Cromatografia em sílica de ACCE2AM/CA

Adsorvida com 20,6 g de gel de sílica, a fração ACCE2AM/CA (15,4 g) foi

cromatografada numa coluna de 500 mL, contendo 102,1 g de gel de sílica. Para eluição,

foram aplicadas as seguintes misturas de solventes: CHCl3/AcOEt 10% (f1-3), CHCl3/AcOEt

20% (f4-5), CHCl3/AcOEt 50% (f6-19), além dos solventes puros AcOEt (f20-22) e MeOH

(f23), sendo as frações recolhidas em porções de 75 mL. As frações f1-5, f6-12, f13-19 e f20-

22 foram juntas depois de comparadas por CCD.

10.1.6.12. Isolamento de ACCE-7 e ACCE-8 (protocatecuato de 6-cumarila e

isocampferídio)

A fração ACCE2AM/CA (6-12) (4,1 g- sólido marrom) foi três vezes submetida à

cromatografia em 60 g de Sephadex LH-20 (∅int= 3,5 cm), adotando-se MeOH como eluente

nas duas primeiras colunas cromatográficas e CHCl3/MeOH 50%, na última. Foram coletadas

33 e 30 porções de 10 mL na primeira e segunda tentativas de isolamento, respectivamente,

enquanto que, na terceira, recolheram-se 25 alíquotas de 5 mL. Em todas as colunas, as

amostras foram aplicadas em volumes de 5 mL. Ao final desta série de separações, sempre

monitoradas por CCD, chegou-se ao isolamento de 171,4 mg de ACCE-7, sólido amarelo

obtido na fração f4-6, e 7 mg de ACCE-8, sólido vermelho encontrado na fração f13. Ambos

tiveram suas estruturas elucidadas por métodos espectroscópicos como sendo o flavonóide

isocampferídio e a cumarina protocatecuato de 6-cumarila, respectivamente.

10.1.6.13. Isolamento de ACCE-9 (formononetina)

A fração ACCE2AM/CA(13-19) (2,9 g-sólido marrom) foi dissolvida em 4,6 mL de

CHCl3/MeOH 50 % e adicionada a uma coluna de Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm),

utilizando a mesma mistura de solventes como fase móvel. Foram recolhidos volumes de 5

mL, totalizando 30 frações. A fração 29 (8 mg) apresentava um sólido amarelo, o qual foi

tratado com MeOH e filtrado, restando um sólido branco (3 mg) chamado de ACCE-9. A


282


283

determinação estrutural de ACCE-9 como sendo o isoflavonóide formononetina foi obtida

somente por RMN.

Fluxograma 3- Metodologia de Isolamento de 3 outras substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis.

10.1.7. Estudo Fitoquímico das Sementes de A. cearensis

10.1.7.1. Obtenção dos extrato etanólico das sementes (ACS)- Isolamento de ACS-1

(cumarina)

1,5 Kg de sementes moídas de A. cearensis foram maceradas em 1,8 L de CHCl3

durante 24h. Após secagem do solvente, obteve-se um óleo amarelo (312 g) contendo um

precipitado branco (53,5 g) o qual foi separado por remoção do líquido sobrenadante. Uma

alíquota de 1,0 g do sólido branco foi tratada com 50 mL de água fervente, resultando no

aparecimento de uma fase oleosa, removida por filtração simples. Depois de resfriada, a

solução aquosa foi filtrada, gerando-se 240,5 mg de cristais brancos (ACS-1), identificados

por RMN como cumarina. A torta, resíduo da extração, foi extraída com etanol em aparelho

Sohxlet, fornecendo 144,0 g (R= 9,6 %, pext./psemente) de um sólido marrom, nomeado ACSE

depois de evaporação do solvente a vácuo.

ACCE1AM

ACCE1AM/C ACCE1AM/CA ACCE1AM/A ACCE1AM/M

Sílica

Sephadex

F6-12

F29

Sílica

Sephadex

F4-6 F13

ACCE-7 Isocampferídio

ACCE-9 Formononetina

ACCE-8 Protocatecuato de 6-

cumarila

F13-19


284

Fluxograma 4- Obtenção dos extratos hexânico e etanólico das sementes de A. cearensis. Isolamento de ACS-1.

Sementes de A. cearensis

Recristalização

Hexano

Etanol

ACS-1

ACSE

ACSH Torta

Torta Cumarina

10.1.7.2. Partição do extrato etanólico ACSE

Em 300 mL de uma mistura H2O-MeOH (2:1), o extrato ACSE (144,0 g) foi

solubilizado e particionado com clorofórmio (3 x 100 mL), sendo imediatamente submetido à

partição com AcOEt (3 x 100 mL). A fase hidrometanólica foi rotaevaporada, para remoção

do metanol, e posteriormente liofilizada, rendendo 109,7 g de um sólido marrom (ACSEHm).

As fases orgânicas, previamente tratadas com Na2SO4 anidro, foram concentradas e secas,

resultando em 24,8 g de fração clorofórmica (ACSEC) e 5,3 g de fração acetato de etila

(ACSEA).


285

Fluxograma 5- Partição do extrato etanólico das sementes de A. cearensis.

10.1.7.3.Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACSEA

A fração ACSEA (5,3 g), sólido marrom dissolvido em 5 mL de MeOH, foi

cromatografada em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), gerando 30 frações de 10 mL, por

eluição com MeOH. Depois de análise por CCD, reuniram-se as frações: f2-11, f12-15, f16-

18, f19-25 e f20-28. Em virtude da baixa resolução alcançada na separação das frações

iniciais, decidiu-se recromatografar a fração f2-11 (2,6 g), adotando-se as mesmas condições.

Foram coletadas 20 frações de 10 mL, sendo reunidas as seguintes subfrações: f2-11(4-5), f2-

11(6-10) e f2-11(11-18).

10.1.7.4. Isolamento de ACS-2 (galato de amburosila)

A fração ACSEA(16-18) (61,8 mg) foi solubilizada em 1 mL de H2O/MeOH 50% e

aplicada em um cartucho de SPE (500 mg), previamente ativado e equilibrado com a fase

móvel. O cartucho foi eluído com 6 mL de H2O/MeOH 50% e posteriormente com 6 mL de

MeOH, sendo coletadas alíquotas de 1 mL. A fração 3 (9,3 mg), um sólido marrom viscoso,

foi designada ACS-2 e submetida à análise espectroscópica, pela qual teve sua estrutura

elucidada como galato de 6”-amburosila (amburosídio C).

Extrato etanólico ACSE (144,0 g)

Fração acetato de etila ACSEA (5,3 g)

Fração hidrometanólica ACSEHm

Fração hidrometanólica ACSEHm (109,7 g)

Fração clorofórmica ACSEC (24,8 g)

1. H2O/MeOH (2:1) 2. CHCl3

1. AcOEt

Rotaevaporação/Liofilização

Na2SO4/Rotaevaporação

Na2SO4/Rotaevaporação

10.1.7.5. Cromatografia em sílica de ACSEA(2-11)(11-18)-Isolamento de ACS-3 e ACS-4

Adsorvida com 2,0 g de gel de sílica, A fração ACSEA(2-11)(11-18) (1,6 g) foi

depositada sobre 25,0 g deste mesmo adsorvente, numa coluna de 125 mL. A eluição da

coluna foi efetuada inicialmente com Hexano/AcOEt 20% (f1-7), seguida de Hexano/AcOEt

25% (f8-16), Hexano/AcOEt 30% (f17-19), Hexano/AcOEt 40% (f20-22), Hexano/AcOEt

50% (f23-25), Hexano/AcOEt 75% (f26-27), AcOEt (f28), e finalmente MeOH (f29),

recolhendo-se alíquotas de 50 mL. Cromatoplacas expostas a vapores de iodo permitiram

selecionar e agrupar as frações idênticas: f1-5, f6-7, f8-11, f13-17, f18-20, f21-23, f25-29.

Análise por CCD revelou que as frações f21-23 (119 mg, ACS-3) e f12 (16 mg, ACS-4) eram

quimicamente equivalentes às frações ACCE-3 (amburosídio A) e ACCE-4 (ácido vanílico),

respectivamente, isoladas das cascas do caule.

10.1.7.6. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-5 e ACS-6 (6-hidroxi-cumarina e

ácido (E)-o-cumárico)

Alíquotas de 200 µL de solução aquosa de H3PO4/MeOH 20% da fração ACSEA(2-

11)(11-18)(13-17) (37 mg) foram injetadas num aparelho de HPLC, provido de coluna de fase

reversa. A fase móvel, composta por H3PO4 (pH= 3,0)/MeOH, variou de 20 a 60% de MeOH

em 20 min, adotando-se um fluxo de 4,7 mL/min. Selecionando-se a detecção de UV para 310

nm, obteve-se um cromatograma (Fig. 165, p. 286) exibindo 3 picos cujos tempos de retenção

foram de 7,56 min (pico 1); 10,30 min (pico 2) e 11,24 min (pico 3). O primeiro pico (14,3

mg) foi reconhecido como sendo quimicamente idêntico a ACS-4 (ácido vanílico), após

análise por RMN 1H. Os picos 2 e 3, ambos sólidos brancos, passaram a ser referidos como

ACS-5 (5,0 mg) e ACS-6 (9,7 mg), sendo estruturalmente caracterizados por RMN, IV e EM

como 6-hidroxi-cumarina e ácido cumárico, respectivamente.


286

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00

10,30

7,56

11,24


287

Figura 165- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(13-17)

10.1.7.7. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-(7-12)

A fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20) (65,3 mg) foi analisada por HPLC numa

coluna de fase reversa, empregando-se uma mistura de composição variável de H3PO4 (pH=

3,0)/MeOH. A concentração de MeOH variou de 40 para 80% ao longo de 20 min de corrida,

mantendo-se um fluxo constante de 4,5 mL/min. As injeções foram realizadas através de

alíquotas de 200 µL de solução filtrada da amostra, dissolvida na fase móvel inicial. A 254

nm, foram detectados e coletados 5 picos (Fig. 166, p. 287): pico 1 (tR= 6,65 min, ACS-7),

pico 2 (tR= 9,36 min, ACS-8), pico 3 (tR= 11,06 min, ACS-9), pico 4 (tR= 12,50 min) e pico 5

(tR= 13,57 min, ACS-10). O pico 4 foi reinjetado e desdobrado em dois novos picos: pico 4.1.

(tR= 11,69 min, ACS-11) e pico 4.2 (tR= 13,54 min, ACS-12) (Fig. 167, p. 287). Este

conjunto de picos foi caracterizado como uma série de amburosídios denominados ACS- (7-

12) e identificados como sendo os amburosídios A, D-H.


288

Figura 166- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)

Figura 167- Cromatograma de HPLC do pico 4 da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)

AU

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00

13,54

11,69

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00

6,65

11,06

12,50 13,57

9,36


289

Fluxograma 6- Metodologia de isolamento das 9 substâncias obtidas do extrato etanólico das sementes de A .cearensis.

ACSEA

F2-11

F11-18

Sephadex

F13-17 F21-23

F16-18

F12

Sílica

Sephadex Cartucho C18

Pico 1 Pico 2 Pico 3

ACS-2 AmburosídioC

ACS-3-AmburosídioA

F18-20

Pico-1

HPLC

F3

Pico 2

ACS-4 Ac. Vanilico ACS-5

6--Hidroxi-cumarina

ACS-6 Ác. Cumárico

Pico 3 Pico 5

HPLC

ACS-7 AmburosídioA

ACS-8 AmburosídioD

ACS-9 Amburosídio E

ACS-10 AmburosídioF

Pico 4

Pico-4.1 Pico-4.2

ACS-11 AmburosídioG

ACS-12 AmburosídioH

ACS-4 Ac. Vanilico

10.1.8.Obtenção dos extratos etanólicos dos xilopódios e das partes aéreas de plantas

cultivadas (ACX e ACPA)

As partes aéreas e os xilopódios moídos de espécimens jovens de A. cearensis (2-9

meses de desenvolvimento), cultivados por semeadura direta, foram extraídos por maceração

com etanol durante 24 h. Os extratos foram obtidos em quadruplicata para fins estatísticos,

perfazendo um total de 64, os quais foram assim denominados: EN-ACX, para aqueles

oriundos do xilopódio, e EN-ACPa, para aqueles provenientes da parte aérea, sendo N

referente à idade da planta (em meses de cultivo). Ao final, os extratos de mesma época foram

reunidos por serem quimicamente idênticos, conforme análise realizada por RMN, resultando

em 16 amostras (Tab. 33, p. 290).

Os extratos E2, E4, E7 e E9 do xilopódio e da parte aérea foram selecionados para

serem submetidos a testes farmacológicos devido às diferenças observadas em seus perfis

químicos, segundo análise espectroscópica por RMN (Ressonância Magnética Nuclear). A

partir deste ponto, os estudos foram direcionados pelos resultados dos ensaios farmacológicos

cujas respostas mais significativas foram observadas para o extrato E7 e E9.

10.1.8.1. Partição do extrato etanólico E7-ACX

Uma alíquota de 30,7 g de extrato E7-ACX (sólido escuro), correspondente à metade

da massa de extrato obtida, foi particionada com H2O (200 mL)/AcOEt (3 x 120 mL). A fase

aquosa foi liofilizada, gerando 9,2 g de um sólido marrom denominado E7-ACXQ. Tratada

previamente com Na2SO4 anidro, a fase acetato de etila foi filtrada e seca, obtendo-se E7-

ACXA (20,8 g), um sólido escuro. A fração E7-ACXA foi dissolvida em 200 mL de MeOH e

misturada com 120 mL de CH2Cl2, contudo a separação de fases só foi observada após a

adição de 50 mL de H2O. A partição foi concluída com mais duas extrações com 120 mL de

CH2Cl2, resultando em 11,7 g de fração hidrometanólica (E7-ACXAM) e 7,0 g da fração

diclorometano (E7-ACXAD), após devido tratamento.


290

Tabela 33- Acompanhamento mensal das massas (g) e dos rendimentos (%) dos extratos etanólicos da parte aérea e do xilopódio de A. cearensis.

Extratos da parte aérea (canteiros) Mês

I (%) II (%) III (%) IV (%) Total

2 2,1 (7,0) 1,9 (8,0) 1,9 (7,1) 2,1 (7,6) 8,0

3 5,5 (8,0) 4,7 (8,5) 4,9 (8,8) 6,1 (12,9) 21,2

4 5,8 (4,5) 7,2 (7,0) 5,6 (4,4) 7,2 (6,0) 25,8

5 11,4 (3,4) 9,4 (3,6) 11,0 (3,8) 5,5 (1,6) 37,3

6 6,6 (2,8) 7,3 (2,9) 8,4 (2,9) 11,9 (5,6) 34,2

7 8,3 (4,0) 19,2 (5,8) 13,4 (4,0) 23,4 (7,4) 64,3

8 16,6 (5,6) 9,9 (2,90) 9,9 (6,7) 12,0 (3,7) 48,4

9 3,9 (0,8) 6,6 (1,6) 4,9 (1,1) 9,1 (2,8) 24,5

Extratos do xilopódio (canteiros) Mês

I (%) II (%) III (%) IV (%) Total

2 3,4 (16,0) 2,2 (21,4) 3,1 (19,6) 2,7 (17,9) 11,4 (19,4)

3 6,2 (7,3) 5,6 (10,2) 6,2 (9,7) 4,3 (11,8) 22,3 (43,5)

4 8,3 (4,5) 8,5 (8,4) 10,7 (6,6) 11,3 (7,6) 38,8 (64,6)

5 17,9 (10,0) 6,7 (2,4) 9,2 (3,9) 11,6 (6,2) 45,4 (82,7)

6 3,9 (0,7) 6,0 (1,0) 6,8 (1,1) 4,4 (0,8) 21,1 (55,3)

7 11,4 (1,8) 14,3 (1,6) 21,9 (1,9) 20,9 (2,5) 68,5 (132,8)

8 20,6 (1,9) 19,8 (1,7) 8,2 (1,3) 12,9 (1,1) 61,5 (109,9)

9 12,6 (1,2) 10,3 (0,6) 13,6 (0,7) 8,5 (0,6) 45,0 (69,5)


291


292

Fluxograma 7- Partição do extrato etanólico do xilopódio da planta jovem (7 meses) de A. cearensis.

Extrato etanólico E7-ACX (30,7 g)

Fração acetato de etila E7-ACXA (20,8 g)

Fração aquosa E7-ACXQ (9,2 g)

Fração hidrometanólica E7-ACXAM (11,7 g)

Fração diclorometano E7-ACXAD (7,0 g)

1. H2O (200 mL) 2. AcOEt (3 x 120 mL)

1. MeOH (200 mL) + H2O (50 mL) 2. CH2Cl2 (3 x 120 mL)

Liofilização/Rotaevaporação Na2SO4/Rotaevaporação

10.1.8.2. Fracionamento de ACXQ

A fração E7-ACXQ (9,2 g) foi dividida em duas porções eqüitativas e

cromatografada em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm) duas vezes, sob as mesmas

condições. A amostra foi dissolvida e eluída com H2O/MeOH 50%, obtendo-se 6 alíquotas de

30 mL em cada cromatografia. Em razão dos elevados teores de açúcares presentes nas

frações, as cromatografias foram monitoradas por RMN 1H. A fração f3 (3,9 g), resultante das

duas colunas, foi selecionada para novo fracionamento, em virtude da presença de sinais na

região de aromáticos no espectro de RMN 1H. Objetivando-se extrair os constituintes

heterosídicos, realizou-se uma partição H2O (25 mL)/n-butanol (3 x 15 mL) resultando numa

fração aquosa E7-ACXQ(3)Q (3,6 g) e outra butanólica E7-ACXQ(3)B (124 mg), sendo

ambas sólidos viscosos marrons.


293

10.1.8.3. Separação por HPLC de ACXQ/B- Isolamento de ACX-1 (ác. cumarínico

glicosilado)

Através de um loop de 200 µL, a fração ACXQ(3)B (124 mg) foi injetada sucessivas

vezes num aparelho de HPLC, equipado com coluna de fase reversa. A amostra foi eluída

com H3PO4 (pH= 3,0)/MeOH, empregando-se o gradiente de 20 para 50% de MeOH em 10

min de corrida. O cromatograma (Fig. 168), visualizado a 254 nm, mostrou a separação de 3

picos cujos tempos de retenção foram de 4,73 min (pico 1), 5,56 min (pico 2) e 7,87 min (pico

3). O pico 3 rendeu 12 mg de um sólido viscoso amarelo, denominado ACX-1, e

quimicamente caracterizado como ácido cumarínico glicosilado.

Figura 168- Cromatograma de HPLC da fração ACXQ(3)B

10.1.8.4. Tratamento cromatográfico de E7-ACXAM- Isolamento de ACX-2

(amburanina B)

A fração E7-ACXAM (11,7 g) foi adsorvida com 15,0 g de gel de sílica e eluída a

vácuo com CH2Cl2 (150 mL), seguido de CH2Cl2/AcOEt (450 mL), AcOEt (800 mL) e

MeOH (450 mL). Após evaporação dos solventes, foram obtidas as frações correspondentes a

cada eluente, obedecendo a ordem de eluição: E7-ACXAM/D (1,0 g), E7-ACXAM/DA(1,7

g), E7-ACXAM/A (1,5 g) e E7-ACXAM/M (7,0 g).

A fração E7-ACXAM/DA(1,7 g) foi submetida à cromatografia em Sephadex LH-

20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), após dissolução em 5 mL de MeOH. Foram geradas 15 frações de 10

mL utilizando-se MeOH como fase móvel. Monitoramento por CCD permitiu a reunião das

frações semelhantes: f3-4, f5-7, f9-13. A fração f8 (120 mg) foi solubilizada em 1,0 mL de

H2O/MeOH 20% e purificada através de um cartucho de SPE (500 mg). Foram coletadas

AU

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

4,737,87

5,56


294

frações de 3 mL, eluídas com H2O/MeOH 20% (f1-2), H2O/MeOH 50% (f3-4), MeOH (f5). A

subfração f8/5 (20,8 mg), sólido viscoso marrom denominado ACX-2, foi analisada por

técnicas espectrométricas, a partir das quais se chegou à estrutura da amburanina B.

Fluxograma 8- Metodologia de isolamento de duas substâncias isoladas do xilopódio das plantas jovens de A. cearensis (7 meses).

E7-ACX

E7-ACXQ

F3

Partição

E7-ACXA

Sephadex

Cartucho C18

Pico 3

ACX-2 Amburanina B

F8

ACX-1 Ác. cumarínico

glicosilado

HPLC

Partição

F-butanólica

Silica

E7-ACXAM

Partição

F5

E7-ACXAM/DA

Sephadex

10.1.8.5. Partição do extrato etanólico E7-ACPa

29,8 g do sólido verde-escuro E7-ACPa, aproximadamente metade da massa de

extrato obtida, foi submetida a sucessivas partições com H2O (200 mL)/AcOEt (3 x 120 mL),

e posteriormente com MeOH (200 mL) + H2O (50 mL)/ CH2Cl2 (3 x 120 mL), adotando-se

metodologia semelhante à aplicada para o extrato E7-ACX. As frações aquosa e acetato de

etila, oriundas da primeira partição, foram pesadas e denominadas E7-ACPaQ (10,5 g) e E7-

ACPaA (18,7 g), respectivamente. A segunda partição forneceu 5,2 g de fração metanólica

(E7-ACPaAM-sólido escuro) e 12,2 g de fração diclorometano (E7-ACPaAD-sólido verde).


295

Fluxograma 9- Partição do extrato etanólico da parte aérea da planta jovem (7 meses) de A. cearensis.

10.1.8.6. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD

A fração E7-ACPaAD (12,2 g) foi misturada com gel de sílica numa proporção 1:1 e

pulverizada em gral de porcelana, sendo acondicionada sobre 20 g de gel de sílica numa

coluna de 500 mL. Foram empregados os seguintes eluentes: hexano(f1- 100mL), hexano/

CH2Cl2 10% (f2- 300 mL), hexano/ CH2Cl2 25% (f3- 300 mL), hexano/ CH2Cl2 50% (f4- 700

mL), hexano/ CH2Cl2 75% (f5- 400 mL), CH2Cl2 (f6- 500 mL), CH2Cl2 /AcOEt 50% (f7- 500

mL), AcOEt (f8- 300 mL) e MeOH (f9- 200 mL). As frações f3 à f6 foram reunidas, após

comparação por CCD.

10.1.8.7. Cromatografia em Sephadex LH-20 de E7-ACPaAD(3-6) (1,8 g)- Isolamento de

ACPa-1 (ácido vanílico)

A fração E7-ACPaAD(3-6) (1,8 g), sólido verde-claro, foi dissolvida em 10 mL de

MeOH e submetida à cromatografia em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), resultando em

15 frações de 30 mL. A coluna, eluída com MeOH, foi monitorada por cromatoplaca,

possibilitando a reunião das frações f2-3, f4-6, f9-13. A fração f2-3 foi tratada com CH2Cl2 e

filtrada, resultando no isolamento de um sólido branco denominado ACPa-1 (258,8 mg), cujo

rf em CCD foi idêntico ao de ACCE-4, embora que com aspecto físico distinto. No entanto, a

Extrato etanólico E7-ACPa (29,8 g)

Fração acetato de etila E7-ACPaA (18,7 g)

Fração aquosa E7-ACPaQ (10,5 g)

Fração hidrometanólica E7-ACPaAM (5,2 g)

Fração diclorometano E7-ACPaAD (12,2 g)

1. H2O (200 mL) 2. AcOEt (3 x 120 mL)

1. MeOH (200 mL) + H2O (50 mL) 2. CH2Cl2 (3 x 120 mL)

Liofilização/Rotaevaporação Na2SO4/Rotaevaporação

concordância dos sinais dos espectros de RMN 1H das frações ACPA-1 e ACCE-4 permitiu

identificá-las como sendo o ácido vanílico.

10.1.8.8. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD(4-6)-Isolamento de ACPA-2-4

(cumarina, e aiapina

Numa coluna de 125 mL contendo 40,0 g de gel de sílica, a fração E7-ACPaAD(4-6)

(380 mg) foi adsorvida com 1,5 g de gel de sílica e eluída com: hexano/ CH2Cl2 80% (f1),

CH2Cl2 (f2-4), CH2Cl2 /AcOEt 10% (f5-7), CH2Cl2 /AcOEt 25% (f8-10), CH2Cl2 /AcOEt

40% (f11-12), CH2Cl2 /AcOEt 50% (f13-14), AcOEt 10% (f15), MeOH (f16). As frações

foram coletadas em alíquotas de 100mL e reunidas após análise por CCD.

A fração f1 (104 mg), cristais brancos chamados ACPa-2, foi quimicamente

identificada após co-eluição com a fração ACS-1 (cumarina) em cromatoplaca, na qual suas

manchas apareceram superpostas.

Aplicando-se a mesma técnica para a fração f10 (5,4 mg), tendo ACCE-7

(isocampferídio) como padrão de referência, descobriu-se que as frações eram quimicamente

idênticas. A fração f10, sólido amarelo, passou a ser chamada ACPa-3.

A cromatoplaca da fração f3-4 (62,5 mg) apresentou somente uma mancha (azul-

fluorescente) ao ser visualizada sob UV, sendo intitulada ACPa-4 (cristais incolores).

Análises espectroscópicas revelaram a estrutura da cumarina aiapina.

10.1.8.9. Isolamento de ACPa- 5 e ACPa-6 (ácido p-hidroxi benzóico e amburosídio B)

Dissolvida em 0,5 mL de H2O, a fração E7-ACPaAD(3-6)(9-13) (52,2 mg) foi

adicionada a um cartucho de SPE (500 mg), já ativado e equilibrado com a fase móvel. O

cartucho foi eluído com H2O (f1-2), H2O/MeOH 30% (f3-4) e MeOH (f5), recolhendo-se

alíquotas de 2 mL. As frações f1 (5 mg) e f4 (23 mg), sólidos marrons viscosos, apresentaram

apenas uma mancha na cromatoplaca, revelada por exposição a vapores de iodo. Ambas as

frações, denominadas ACPa-5 (f1) e ACPa-6 (f4), foram identificadas por comparação dos

seus dados espectrais com os já disponíveis na literatura, levando às proposições das

estruturas referentes ao ácido p-hidroxi benzóico e ao amburosídio B, respectivamente.

10.1.8.10. Fracionamento de E7-ACPaQ

Uma alíquota de 5,0 g da fração E7-ACPaQ (10,5 g), solubilizada em 12 mL de


296H2O/MeOH 50%, foi aplicada numa coluna de Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm) e eluída


297

com H2O/MeOH 50%, resultando na obtenção de 10 frações de 20 mL. Foram reunidas as

frações 1 a 4, totalizando 3,5 g de um material marrom viscoso, cujo espectro de RMN 1H

permitiu caracterizá-lo como sendo uma mistura de açúcares.

A fração f7 (137 mg) foi dissolvida em 1 mL de H2O e cromatografada num

cartucho de SPE (500 mg), utilizando-se como fase móvel H2O (f7/1), seguida de H2O/MeOH

20% (f7/2-3), H2O/MeOH 30% (f7/4-5) e H2O/MeOH 50% (f7/6). Colhidas em alíquotas de 3

mL, as frações da coluna foram monitoradas por CCD, através da qual verificou-se que a

fração f7/4 (30 mg) era quimicamente equivalente à fração ACPa-6 (amburosídio B). As

subfrações eluídas com H2O/MeOH 20%, f7/2 e f7/3, foram reunidas e purificadas por HPLC,

como descrito abaixo.

10.1.8.11. Purificação por HPLC- Isolamento de E7-ACPa-7 (ácido cumárico

glicosilado)

A fração E7-ACPaQ(7)(2-3) (65 mg) foi purificada num aparelho de HPLC,

injetando-se alíquotas de 200 µL de solução aquosa de H3PO4/MeOH 20%. A separação,

realizada numa coluna de fase reversa, foi efetuada com um gradiente H3PO4/MeOH,

variando de 30 para 50% em 10 min. Foram obtidos 2 picos (Fig. 169), detectados a 254 nm e

registrados com tempos de retenção de 7,20 min (pico 1) e 9,07 min (pico 2). O pico 1

forneceu 24 mg de um sólido branco, denominado ACPa-7 e identificado por métodos

espectrométricos como o ácido cumárico glicosilado.

Figura 169- Cromatograma de HPLC da fração E7-ACPaQ(7)(2-3)

ACPAQ(7)(2-3)- ác. E cumárico glicos

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00

9,07

7,20


298

Fluxograma 10- Metodologia de isolamento das 7 substâncias isoladas da parte aérea das plantas jovens de A. cearensis (7 meses).

E7-ACPa

E7-ACPaQ

F7

Partição

E7-ACPaA

Sephadex

Cartucho C18

Pico 1

F1

ACPa-6 Amburosídio B

HPLC

F2-3

E7-ACPaAD

Partição

F9-13 F2-3

Sephadex

F4

ACPa-7 Ác. Cumárico

glicosilado

Cartucho C18

F4-6

ACPa-1- Ác. Vanílico

F1 F4 F10F3-4

ACPa-2 Cumarina

ACPa-3 IsocampferídioACPa-4

Aiapina

ACPa-5 Ac. Hidroxi-

benzóico

ACPa-6 Amburosídio B

Sílica

10.2. Validação do método de quantificação de 4 substâncias presentes nos extratos de

Amburana cearensis

10.2.1. Preparo das Soluções

Preparação da solução-estoque

A solução-estoque foi preparada, em triplicata, pela dissolução de 5,0 mg de quatro

substâncias puras (ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio), isoladas das

cascas do caule de A. cearensis, em 10,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH=

3)/MeOH 20%, resultando numa concentração de 500 µg/mL. A solução-estoque foi filtrada

através de membranas de teflon.

Preparação das soluções padrões e soluções de controle de qualidade

A partir de cada solução-estoque, foram obtidas seis soluções padrões (60, 40, 20,

10, 5 e 1 µg/mL) e três soluções de controle de qualidade (50, 30 e 8 µg/mL), através de

diluições com volumes apropriados, retirados apenas da primeira solução.

Alíquotas de 2,0 mL das soluções obtidas foram tratadas por cartuchos de SPE (100

mg) e eluídas com porções de 2,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH

80%, mantendo-se as concentrações iniciais.

Preparação das amostras

Foram preparadas três soluções de 500 µg/mL de cada um dos seguintes extratos

etanólicos de A. cearensis: cascas do caule (ACCE); sementes (ACS); xilopódios de

espécimens com 2 (E2-ACX), 4 (E4-ACX), 7 (E7-ACX) e 9 (E9-ACX) meses de idade,

partes aéreas de espécimens com 2 (E2-ACPa), 4 (E4-ACPa), 7 (E7-ACPa) e 9 (E9-ACPa)

meses de idade, e misturas artificialmente reconstituídas dos xilopódios com as partes aéreas

de mesmas idades (E2-ACX+PA, E4-ACX+PA, E7-ACX+PA, E9-ACX+PA). Cada amostra

foi produzida através da dissolução de 5,0 mg de extrato em 10,0 mL de solução aquosa de

Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH 20%, totalizando 14 amostras, as quais foram posteriormente

filtradas através de membranas de teflon.

Todas as amostras, em volumes de 2,0 mL, foram aplicadas em cartuchos de SPE e

eluídas com alíquotas 2,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH 80%. Exceto

o extrato ACS, cujo volume aplicado foi de 500 µL, implicando numa concentração final

correspondente a 1/4 da solução original.


299

Três amostras de xarope de cumaru, fitoterápico produzido com as cascas do caule

de A. cearensis, foram preparadas pela aplicação de alíquotas de 400 µL do xarope num

cartucho de SPE (100 mg). Eluições com 10 mL de H2O, a fim de se remover a sacarose,

foram sucedidas por adições de volumes de 2,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH=

3)/MeOH 80%, resultando em amostras diluídas a 1/5 da concentração inicial.

10.2.2. Condições analíticas

As soluções padrões e de controle de qualidade e as amostras (extratos e xarope)

foram analisadas por HPLC (loop=20 µL, Fig. 170, p. 300), em triplicata. As separações

foram realizadas através de uma coluna de fase reversa (4,6 x 250 mm, 5 µm), utilizando-se

um fluxo de 1mL/min de um gradiente composto por Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH, variando

de 20% para 50% de MeOH em 15 min de corrida.

Curva de calibração

A curva de calibração foi construída a partir das áreas dos picos obtidas pela injeção

de soluções de padrões externos (ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e

amburosídio), nas concentrações de 1, 5, 10, 20, 40 e 60 µg/mL.

Recuperação

A recuperação, na etapa de preparação das amostras, foi avaliada através da injeção

das soluções de controle de qualidade, nas concentrações de 8, 30 e 50 µg/mL, em

quintuplicata. Os fatores de recuperação de cada substância foram fornecidos pelas razões

entre as áreas dos picos obtidas pelas soluções tratadas por cartucho de SPE e as as áreas dos

picos registradas pelas soluções não-tratadas.

Precisão

A precisão do método foi examinada por comparação das concentrações obtidas para

soluções de controle de qualidade em níveis baixos (8 µg/mL), médios (30 µg/mL) e altos (50

µg/mL), sendo a repetitividade determinada ao longo de um dia e durante três dias não-

consecutivos.

Exatidão

A exatidão do método foi mensurada através da comparação das concentrações

fornecidas pela curva de calibração, para cada substância, em relação às concentrações, já


300


301

conhecidas, das soluções de controle de qualidade (valores de referência), em três níveis

distintos(baixos- 8 µg/mL, médios- 30 µg/mL e altos- 50 µg/mL).

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Minutes1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00

A B

CD

Figura 170- Cromatograma dos quatro padrões (conc.= 60 µg/mL) utilizados na validação de amostras de A. cearensis: A- ácido protocatecuico, B- ácido vanílico, C- cumarina e D- amburosídio A.

11. CONCLUSÃO

A pesquisa química de A. cearensis resultou no isolamento de:

1- Cumarina aiapina, dos ácidos fenólicos: ác. vanílico, ác. p-hidroxi-benzóico, ácido

(E)-o-cumárico glicosilado, seu estereoisômero ácido (Z)-o-cumárico glicosilado e sua

aglicona livre ácido (E)-o-cumárico.

2- Protocatecuato de 6-cumarila, substância inédita na literatura, e 6-hidroxi-cumarina

representam uma relevante descoberta devido à rara ocorrência deste tipo de composto na

natureza. Acredita-se que plantas, capazes de sintetizarem cumarinas oxigenadas apenas na

posição 6, apresentam um intrigante caminho biogenético, alternativo à rota metabólica

comumente encontrada nos organismos vivos.

3- Amburosídio A e B, já relatados anteriormente, e derivados do amburosído A,

inéditos na literatura: ferulato de 6”-amburosila, protocatecuato de 6”-amburosila, galato de

6”-amburosila, acetato de 6”-amburosila, sinapato de 6”-amburosila e vanilato de 6”-

amburosila.

4- Por último, a prospecção química revelou uma abundante presença de flavonóides,

substâncias que possuem comprovadas atividades farmacológicas: o flavonol quercetina, a

isoflavona formononetina, e os biflavonóides amburanina A e B, registrados pela primeira vez

na literatura.

A metodologia desenvolvida nas análises por HPLC, devidamente validada, poderá

ser adotada, no futuro, no controle de qualidade de produtos que utilizam A. cearensis em

suas formulações, podendo ser aplicado para verificar a autenticidade da matéria-prima,

estabilidade ou para quantificação dos princípios ativos. Este tipo de análise visa garantir a

eficácia e segurança do produto ao usuário, além de funcionar como certificado de qualidade

para a empresa fabricante.

A atividade alelopática demonstrada pelo extrato aquoso das sementes de A.

cearensis é uma prova científica do potencial bio-herbicida desta planta, a qual poderá ser

utilizada como uma arma química natural, de baixo custo e ecologicamente correta no

combate à ervas daninhas, possibilitando aumento na produtividade agrícola sem provocar

danos à saúde humana e ao meio-ambiente.

Os notáveis avanços no conhecimento químico e farmacológico de A. cearensis são


302

frutos de árduos esforços imprimidos por uma equipe multidisciplinar na pesquisa científica


303

desta espécie, ao longo de mais de uma década. Paulatinamente, estas descobertas estão

contribuindo para agregar mais segurança e garantir eficácia ao fitoterápico de A. cearensis,

cuja aceitação pela população se torna cada vez mais crescente.

No entanto, diante da ameaça de extinção de A. cearensis pelo extrativismo predatório,

torna-se imprescindível a adoção de um modelo de exploração auto-sustentável para a

espécie, tal como proposto em nossos estudos, no qual a planta adulta silvestre seja

substituída por plantas jovens cultivadas, já que em testes farmacológicos pré-clínicos,

extratos de plantas jovens com 7 e 9 meses de cultivo apresentaram tanto efeitos

antiedematogênicos (edema de pata induzido por carragenina) como antinociceptivos

(nocicepção induzida por formalina) equivalentes aos do extrato da planta adulta. Isto

significa que, a partir de 7 meses de cultivo, plantas jovens de A. cearensis já exibem

atividades antiinflamatória e analgésica similares às da planta adulta silvestre. As evidências

encontradas neste estudo garantem ser farmacologicamente viável a substituição da planta

adulta por espécimens jovens.

Desta forma, a produção industrial do fitoterápico de A. cearensis seria economicamente

viável, pois a indústria disporia de uma fonte de matéria-prima renovável e obtenível a curto

prazo, além de se assegurar a preservação da espécie. Os espécimens preservados poderiam

fornecer sementes para o cultivo de novas mudas, as quais poderiam ser aproveitadas na

Agricultura, na produção de um bio-herbicida eficiente e inofensivo à saúde humana e ao

meio-ambiente.

A diversidade de aplicações de A. cearensis atesta a importância medicinal e econômica

desta planta cujo aproveitamento racional poderá, no futuro, render vultosas divisas e

empregos para o Estado do Ceará, através de investimento tecnológico.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS ... · LISTA DE SIGLAS ... 9.2. Atividade...

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