UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E RECURSOS NATURAIS

VALÉRIA MARIA ARAÚJO SILVA

FACILITAÇÃO PODE INCREMENTAR A CAPACIDADE DE ADAPTAÇÃO DE

ACTINOBACTÉRIAS E RIZÓBIOS “IN VITRO”

FORTALEZA

2016




FORTALEZA

2016

Dissertação submetida à Coordenação do

Programa de Pós-Graduação em Ecologia e

Recursos Naturais da Universidade Federal do

Ceará como requisito parcial para obtenção do

título de Mestre em Ecologia e Recursos

Naturais.

Orientadora: Profª. Drª. Suzana Claudia

Silveira Martins

Co-orientadora: Profª. Drª. Claudia Miranda

Martins

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências e Tecnologia

S578f Silva, Valéria Maria Araújo.

Facilitação pode incrementar a capacidade de adaptação de actinobactérias e

rizóbios “in vitro” / Valéria Maria Araújo Silva – 2016. 88 f.: il., color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências,

Departamento de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Recursos

Naturais, Fortaleza, 2016.

Área de Concentração: Ecologia Microbiana.

Orientação: Profa. Dra. Suzana Cláudia Silveira Martins.

Coorientação: Profa. Dra. Claudia Miranda Martins.

1. Solos. 2. Rizosfera. 3. Micro-organismos. I. Título.

CDD 577




Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em

Ecologia e Recursos Naturais, da Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do grau de Mestre em Ecologia e Recursos Naturais, Área de

concentração de Ecologia Microbiana.

Aprovada em 18/02/2016

BANCA EXAMINADORA

Profª. Drª. Suzana Cláudia Silveira Martins (Orientador) Universidade Federal do Ceará-UFC

Prof. Dr. Rogério Parentoni Martins Universidade Federal do Ceará

Profª. Drª Oscarina Viana de Sousa Universidade Federal do Ceará

A meus pais (Joaquim e Isamar), eternos educadores.

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo dom da vida e pela oportunidade de chegar até aqui.

Ao Governo do Estado do Ceará, através da SEDUC pela minha liberação das

atividades como docente para realização dessa tão sonhada formação acadêmica.

À UFC e ao PPGERN, pela oportunidade e zelo na formação de seus estudantes.

Agradeço as professoras: orientadora Drª. Suzana Cláudia Silveira Martins e a co-

orientadora Drª. Claudia Miranda Martins pela excelente orientação, auxílio,

paciência, dedicação, carinho, conhecimento, intervenção, apoio e exemplo de

profissionais comprometidas com a formação de seus orientandos. Muito obrigada.

Ao professor Dr. Rogério Parentoni Martins, pelas contribuições ecológicas.

As professoras Drª Oscarina Viana Sousa e Drª Regine Helena Silva dos Fernandes

Vieira, pelas excelentes contribuições na produção do projeto e execução da

pesquisa.

A minha família, pela presença e apoio em todos os momentos da minha vida.

A meus pais, pelo seu amor imensurável e dedicação na formação de suas filhas.

A minhas irmãs, meus anjos na terra, as quais amo infinitamente.

Aos meus tios, Antônio José e Raimunda, pelo apoio durante todo o mestrado.

A família LAMAB, Vínícius, Airlane, Karoline (Karol), Clarice, Fernando, Marcelo,

Mayara, Érika, Larissa (Lari), Andreia, Lucas, Ana Caroline, Juliani, Rhonyele,

Kássia, pessoas especiais que tive a honra de conviver e que muito me ajudaram

durante toda a pesquisa, auxiliando e ensinando. Muito obrigada a todos.

As minhas amigas em Jaguaruana, que me apoiaram durante os momentos críticos,

incentivando e possibilitando momentos de alegria.

Ao Grasiano, pelo apoio, carinho e motivação.

A todos que fizeram parte desse desafio.

RESUMO

O ambiente natural é marcado por uma intrincada rede de interações bióticas que

moldam a estrutura das comunidades ecológicas. A presença de interações

ecológicas positivas entre populações microbianas em solos de regiões semiáridas,

possui grande relevância na estruturação da microbiota do solo local. Neste

trabalho, cepas de actinobactérias e rizóbios oriundas de solo rizosférico do Parque

Nacional de Ubajara-CE, foram avaliadas quanto à capacidade de crescerem

através de mecanismos metabólicos cooperativos. Das 27 actinobactérias avaliadas,

22 apresentaram compatibilidade com rizóbios. As cepas UB-05, UB-07, UB-08, UB-

11 e UB-21, destacaram-se nos ensaios de facilitação para amilase e celulase. A

atividade metabólica de actinobactérias auxiliou o desenvolvimento das cepas de

rizóbios.

Palavras-chave: Interações metabólicas, valor adaptativo, semiárido, micro-

organismos.

ABSTRACT

The natural environment is marked by an intricate network of biotic interactions that

shape the structure of ecological communities. The presence of positive ecological

interactions between microbial populations in soils semiarid regions, has great

importance in structuring the local soil microbiota. In this work, actinomycetes strains

of rhizobia and coming from rhizosphere of Park National Ubajara-CE, were

evaluated for the ability to grow through cooperative metabolic mechanisms. Of the

27 evaluated actinomycetes, 22 showed compatibility with rhizobia. The strains UB-

05, UB-07, UB-08, UB-11 and UB-21 stood out in facilitating tests for amylase and

cellulase. The metabolic activity of actinomycetes helped the development of rhizobia

strains.

Keywords: Metabolic interactions, adaptive value, semiarid, microorganisms.

Sumário

1. Introdução ............................................................................................................... 9

2. Revisão bibliográfica ............................................................................................ 11

2.1 Solo ................................................................................................................. 11

2.2 Rizosfera ......................................................................................................... 13

2.3 Interações Positivas ........................................................................................ 15

2.4 Facilitação e Fitness microbiano: mecanismos de coexistência...................... 17

2.5 Actinobactérias ................................................................................................ 19

2.6 Rizóbios .......................................................................................................... 21

3. Material e Métodos ............................................................................................... 24

3.1 Declaração de Ética ........................................................................................ 24

3.2.1 Procedência das cepas de actinobactérias e rizóbios ............................... 24

3.3 Amostragem .................................................................................................... 25

3.4 Caracterização do Solo ................................................................................... 26

3.5 Rizóbios .......................................................................................................... 26

3.6 Actinobactérias ................................................................................................ 26

3.6.1 Isolamento ................................................................................................ 26

3.6.2 Caracterização cultural ............................................................................. 27

3.7 Caracterização enzimática .............................................................................. 28

3.7.1 Atividade celulolítica .................................................................................. 28

3.7.2 Atividade amilolítica .................................................................................. 29

3.7.3 Determinação do perfil enzimático ............................................................ 29

3.8 Análises estatísticas ........................................................................................ 29

3.9 Seleção de Isolados ........................................................................................ 30

3.10 Facilitação ..................................................................................................... 30

3.10.1 Amido ...................................................................................................... 30

3.10.2 Celulose .................................................................................................. 31

3.11 Seleção de actinobactérias compatíveis com as cepas de rizóbio ................ 31

3.11.1 Caracterização morfológica e micromorfológica das cepas de

actinobactérias compatíveis com rizóbios .......................................................... 31

3.11.2 Análise micromorfológica ........................................................................ 31

3.11.3 Caracterização Fisiológica ...................................................................... 32

4. Resultados ............................................................................................................ 33

4.1 Caracterização cultural .................................................................................... 33

4.2 Caracterização enzimática .............................................................................. 37

4.2.1 Atividade celulolítica .................................................................................. 37

4.2.2 Atividade Amilolítica .................................................................................. 40

4.2.3 Perfil Comparativo da Atividade Enzimática de Actinobactérias e Rizóbios

........................................................................................................................... 43

4.3 Uso de Compostos Metabolizados por Actinobactérias como Fonte de Carbono

para Bactérias Diazotróficas ................................................................................. 46

4.3.1 Teste de Facilitação .................................................................................. 47

4.4 Caracterização Morfológica e Micromorfológica.............................................. 50

4.5 Caracterização Fisiológica .............................................................................. 53

4.5.1 Tolerância a salinidade ............................................................................. 53

4.5.2 Crescimento em diferentes pHs ................................................................ 54

4.5.3 Tolerância a elevadas temperaturas ......................................................... 55

5. Discussão ............................................................................................................. 57

6. Conclusões ........................................................................................................... 69

7. Referências .......................................................................................................... 70

Considerações finais ................................................................................................ 87

Perspectivas Futuras ................................................................................................ 88

9

1. Introdução

O ambiente natural é caracterizado por uma intrincada rede de interações

bióticas que moldam a estrutura das comunidades ecológicas. Essas interações

podem ser positivas ou negativas (Faust; Raes, 2012). Durante muito tempo, os

ecologistas interessados em interações entre espécies direcionaram seus estudos

exclusivamente na competição e predação (Bronstein, 2009; Holmgren; Scheffer,

2010). No entanto, nas últimas décadas, a importância das interações positivas na

organização das comunidades tem sido amplamente reconhecida (Stachowicz,

2001; He; Bertness; Altieri, 2013; He; Bertness, 2014).

Num cenário de interações positivas, a facilitação, definida como um

mecanismo de melhoria de condições ambientais extremas e limitantes constitui um

possível mecanismo de coexistência, tendo em vista que a mesma pode modificar

as condições locais de um ambiente desfavorável, tornando-o propício para outros

seres vivos (Bronstein, 2009). No entanto, a maioria das pesquisas avaliam este tipo

de interação em grupos vegetais (Brooker et al., 2008), desconsiderando assim, a

possibilidade deste tipo de relação ecológica em outras escalas de vida, como a

microbiana.

O solo constitui palco de interações positivas, sobretudo, quanto à facilitação,

uma vez que abriga uma grande variedade de micro-organismos que desempenham

funções críticas no ecossistema e que estabelecem interações cooperativas

derivadas do seu metabolismo (Freilich et al., 2011; Aislabie; Deslippe, 2013). Neste

ambiente heterogêneo, a rizosfera representa um nicho ecológico exclusivo do solo,

apresentando alto teor de nutrientes e composto por numerosos e diversos

organismos microbianos (Adegboye; Babalola, 2012). Fazendo parte dessa distinta

microbiota rizosférica, encontram-se organismos de grande relevância econômica e

ecológica, como actinobactérias e rizóbios.

Actinobactérias representam um dos mais diversos grupos de bactérias

filamentosas, capazes de sobreviver em ambientes de condições e recursos

diferentes devido a sua diversidade metabólica (Suneetha; Karthick; Prathusha,

2011; Mansour; Abdel-Azeem; Abo-Deraz, 2015), já os rizóbios, são bactérias

diazotróficas importantes por sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico através

da simbiose estabelecida entre estes micro-organismos e raízes de plantas ou sua

10

estrutura caulinar (Sabino et al., 2012; Longatti; Marra; Moreira, 2013; Martins, C. et

al., 2015).

Os solos de regiões semiáridas, em geral, apresentam reduzida

disponibilidade de nutrientes e predominância de condições abióticas limitantes,

como intensa radiação solar, baixos índices pluviométricos e elevadas temperaturas

(Zanella, 2014). Essas condições extremas influenciam negativamente o

desenvolvimento das diferentes populações microbianas no referido habitat. No

entanto, actinobactérias e rizóbios constituem dois representativos grupos de

bactérias detectados nos solos destas regiões (Lima et al., 2014; Pinheiro et al.,

2014; Sousa et al., 2014; Silva et al., 2015), onde exercem importante papel

funcional para o equilíbrio ecológico do referido ecossistema.

Diante do exposto, e tendo em vista os raros estudos para compreensão das

interações entre esses dois importantes grupos microbianos em solos de regiões do

semiárido nordestino, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar in vitro, a

ocorrência de facilitação metabólica entre populações de actinobactérias e rizóbios

oriundos de uma região do semiárido do nordeste brasileiro, partindo-se da hipótese

que possíveis interações facilitadoras são importantes para a ampliação do fitness,

permitindo a coexistência estável entre esses organismos e contribuindo para

manutenção da diversidade microbiológica dos solos de regiões semiáridas.

Como objetivos específicos foram considerados: (1) isolar e caracterizar

culturalmente cepas de actinobactérias do solo rizosférico do Parque Nacional de

Ubajara (PNU); (2) determinar o Índice Enzimático (IE), celulolítico e amilolítico das

cepas de actinobactérias previamente caracterizadas e de cepas de rizóbios

originários da mesma região, pertencentes ao acervo microbiológico do Laboratório

de Microbiologia Ambiental (LAMAB); (3) investigar a capacidade co-metabólica

entre cepas de actinobactérias com IE mais significativo e de rizóbios deficientes nas

enzimas avaliadas e (4) selecionar e caracterizar sob os aspectos morfológicos e

fisiológicos as cepas de actinobactérias que apresentarem atividade cooperativa

com cepas de rizóbios.

11

2. Revisão bibliográfica

2.1 Solo

O solo é uma estrutura heterogênea e descontínua constituído de frações

orgânicas e inorgânicas formadas a partir de um complexo processo de forças

físicas, químicas e biológicas que interagem continuamente (Atlas; Bartha, 1997;

Nannipieri et al., 2003; Andreola; Fernandes, 2007). Essas interações permitem que

as partículas de rochas sejam quebradas e transformadas em argila, silte e outros

minerais, compondo um habitat natural bastante diversificado, contendo

comunidades biológicas de elevada complexidade (Siqueira et al., 1994; Barrios,

2007).

Considerado um sistema biológico dinâmico, complexo e essencial para o

funcionamento do ecossistema (Nannipieri et al., 2003; Araújo; Monteiro, 2007), o

solo representa um habitat favorável para inúmeras espécies de organismos

incluindo procariotos e eucariotos (Hinsinger et al., 2009). Esses organismos são

extremamente diversos e essenciais para manutenção da sustentabilidade de

ecossistemas naturais e manejados (Barrios, 2007). Sua população inclui

macrofauna, mesofauna, microfauna e microflora (Scow; Werner, 1998; Nannipieri et

al., 2003), sendo a população microbiana a mais abundante e diversa, chegando a

apresentar mais de 1016 procariotos por tonelada de solo (Curtis; Sloan, 2005; Nazir

et al., 2010; Previati et al., 2012)

Além de constituírem parte integral do solo, as populações microbianas

possuem funções fundamentais para manutenção da estrutura e funcionamento

deste ecossistema por disponibilização de nutrientes para as plantas, decomposição

da matéria orgânica e participação nos processos de ciclagem de nutrientes (Schow;

Werner, 1998; Barrios, 2007; Vinhal-Freitas et al., 2010; Brussaard, 2012; Verastegui

et al., 2014). Segundo Nannipieri et al. (2003) os micro-organismos, principalmente

bactérias e fungos, são os responsáveis por cerca de 80% a 90% dos processos

bióticos que ocorrem neste ambiente.

Cumpre destacar, que apesar da comunidade microbiana representar parcela

preponderante de organismos no solo, menos de 5% do seu espaço poroso é

ocupado por eles (Andreola; Fernandes, 2007), o que ressalta a importância das

condições ambientais nos diferentes micro-habitats. Dentre os fatores que podem

afetar a ecologia, a atividade e a dinâmica das populações microbianas no solo

destacam-se fatores físicos, químicos e biológicos como, fonte de carbono, energia,

12

nutrientes minerais, disponibilidade de água, temperatura, pressão, pH, relações

espaciais e genética dos micro-organismos, dentre outros (Nannipieri et al., 2003;

Gorlach-Lira; Coutinho, 2007; Hinsinger et al., 2009; Prashar; Kapoor; Sachdeva,

2014). Como os micro-organismos são sensíveis a essas variações, oferecendo

respostas rápidas a mudanças na sua estrutura, os mesmos constituem bons

indicadores da qualidade do solo (Araújo; Monteiro, 2007).

Estudos apontam que a qualidade do solo e sua funcionalidade estejam

diretamente relacionadas com a diversidade e abundancia microbiana (Araújo;

Monteiro, 2007; Chaer et al., 2009; Fierer et al., 2009; Previati et al., 2012). Para

O’Donnel et al. (2001), a biodiversidade é função da diversidade genética dos

organismos, sua estrutura, função e por último dos serviços ecossistêmicos por eles

desempenhados. Os mesmos autores salientam que o conhecimento da diversidade

microbiana deve estar associado à diversidade funcional no tempo e espaço, assim

como na influência dos fatores externos, como a gestão, mudanças no clima e no

uso do solo.

Embora estudos mostrem a importância da diversidade microbiana para o

funcionamento dos solos, pouco ainda se conhece sobre essa biodiversidade (Zhou

et al., 2002; Nannipieri et al., 2003; Barrios, 2007). É possível que as variações

ambientais, decorrentes de atividades naturais e antropogênicas, seja um dos

fatores determinantes para referida situação.

O semiárido brasileiro é uma região com ampla variedade de ambientes,

apresentando uma heterogeneidade na vegetação, clima e condições edáficas, com

plantas com adaptações, amplitudes térmicas elevadas e solos com pouca umidade

e oligotróficos (Kavamura, 2012). Essas condições são impostas em especial, pelas

variações pluviométricas baixas, geralmente abaixo de 800 mm anuais e

concentradas durante apenas três ou quatro meses consecutivos, associadas com

uma forte intensidade luminosa recebida pela região (Araújo, 2011; Pagano;

Zandavalli; Araújo, 2013). Essas condições são desfavoráveis para o crescimento

microbiano do solo, a diversidade e atividade microbiana (Gorlach-Lira; Coutinho,

2007).

Na maior parte da região semiárida do nordeste brasileiro os solos não

conseguem absorver a água totalmente devido a presença de um horizonte B

textural, argiloso, que impermeabiliza o solo (Araújo, 2011). Além disso, as elevadas

temperaturas e a evapotranspiração somadas com processos recorrentes de

13

degradação deste ambiente, cumulam em perdas biológicas importantes para

sustentabilidade e manutenção do ecossistema.

Araújo et al. (2014), realizando estudos em região semiárida do Piauí para

comparar a estrutura e diversidade da comunidade microbiana dos solos em uma

região degradada e outra de ambiente restaurado, verificaram que a diversidade foi

menor na área em processo de degradação, enquanto que na região restaurada os

índices de diversidade foram comparáveis a de ambientes de terra nativa.

Apesar dos avanços significativos nos processos de degradação,

desmatamento e contaminação dos solos na região semiárida do nordeste brasileiro

(Araújo, 2011), e da importância da diversidade estrutural e funcional da microbiota

do solo para manutenção do equilíbrio desse ambiente, constata-se que ainda são

raros os estudos sobre essas propriedades. Assim, faz-se pertinente o

desenvolvimento de pesquisas que avaliem esses parâmetros com o intuito de

compreender e auxiliar nas práticas de conservação deste importante ecossistema.

2.2 Rizosfera

O termo rizosfera foi definido por Hiltner em 1904 como a porção do solo que

recebe a influência direta das raízes e com características distintas que suporta

elevada diversidade microbiana (Cardoso; Nogueira, 2007; Prashar; Kappor;

Sachdeva, 2014; Haichar et al., 2014).

Além de representar uma zona ecológica única do solo (Prashar; Kappor;

Sachdeva, 2014), a rizosfera constitui um habitat mutável e dinâmico, uma vez que

sofre influência direta da estrutura vegetal e suas dimensões são determinadas pelo

tipo, composição e umidade do solo (Pereira, 2000; Moreira; Siqueira, 2006; Dantas

et al., 2009; Hinsinger et al., 2009). Essas características permitem que este

ecossistema seja altamente especializado e possibilite a sobrevivência de um

expressivo número de micro-organismos, principalmente bactérias e fungos (Dantas

et al., 2009).

Neste ambiente as raízes liberam secreções, também denominados de

exsudados que se classificam de acordo com suas propriedades químicas e o local

de origem (Nannipieri et al., 2007), que atuam no crescimento de bactérias e fungos

que colonizam a rizosfera (Cardoso; Nogueira, 2007). Os exsudados radiculares

podem ser de baixo ou de alto peso molecular, neles estão inclusos aminoácidos,

14

ácidos orgânicos, açúcares, vitaminas, peptídeos, enzimas, proteínas, dentre outros

(Nannipieri et al., 2007; Jesus, 2013; Haichar et al., 2014; Prashar; Kappor;

Sachdeva, 2014).

Esses exsudados tornam este ambiente altamente rico em nutrientes em

relação ao restante do solo, atuando também como mensageiros que se

comunicam, contribuindo para ocorrência de interações físicas e biológicas entre

raízes e organismos do solo (Walker et al., 2003; Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014),

as quais podem ser positivas ou negativas (Badri; Vivanco, 2009).

Pouco se conhece sobre a capacidade de dispersão dos micro-organismos

(Classen et al., 2015), principalmente em relação ao solo. No entanto, estima-se que

cerca de 4% a 10% da superfície radicular seja colonizada por eles (Moreira;

Siqueira, 2006), representando uma maior concentração na rizosfera do que em solo

não rizosférico (Cardoso; Nogueira, 2007).

Prashar; Kappor; Sachdeva (2014), afirmam que a rizosfera possui um grande

pool de micro-organismos do solo, sendo considerada como ponto chave para

colonização e atividade microbiana. Isso se deve principalmente à abundância de

nutrientes e a capacidade de utilização de diversos substratos por bactérias,

permitindo que maiores populações bacterianas possam ser encontradas na

rizosfera, em comparação com outros micro-organismos do solo.

A maior parte dos gêneros bacterianos encontrados na rizosfera incluem,

Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Rhizobia, Agrobacterium, Alacaligenes,

Azobacter, Mycobacterium, Flavobacter, Cellulomonas e Micrococcus, sendo

também um nicho favorável para alguns gêneros de actinobactérias como

Streptomyces e Nocardia (Dantas et al., 2009; Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014).

Ao mesmo tempo que a atividade microbiana na rizosfera altera os processos

e padrões da exsudação radicular, assim também, a rizodeposição influencia

fortemente tanto a estrutura como os aspectos funcionais das comunidades

microbianas na rizosfera (Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014), pois uma vez que este

processo aumenta o fluxo de carbono disponível, acaba favorecendo uma intensa

atividade metabólica das populações, influenciando direta e positivamente o tempo

de geração microbiano (Moreira; Siqueira, 2006).

De acordo com Pereira (2000), a comunidade reflete seu habitat, sendo

assim, a densidade da população microbiana na rizosfera aumenta até encontrar

limitações de natureza biótica ou abiótica (Hinsinger et al., 2009; Philippot et al.,

15

2013). Os exsudados secretados pelas raízes influenciam o crescimento de

bactérias e fungos. Dados sugerem um aumento de mais de 50 vezes da atividade

microbiana em solo rizosférico em relação ao não-rizosférico (Prashar; Kappor;

Sachdeva, 2014).

Dentro da diversidade microbiana no solo rizosférico, é possível destacar a

presença de organismos r-estrategistas, como bactérias que apresentam elevada

taxa de crescimento e o consumo de substratos simples, assim como, comunidades

bacterianas com baixa taxa de crescimento, porém com capacidade para degradar

substratos complexos, comportando-se como organismos k-estrategistas (Dantas et

al., 2009; Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014).

As características descritas nos parágrafos anteriores ressaltam a importância

ecológica da rizosfera, assim como, a necessidade de melhor compreensão sobre

os diversos fatores que regulam este ambiente altamente diverso e essencial para

manutenção de inúmeros processos biológicos.

2.3 Interações Positivas

Os seres vivos estabelecem vários tipos de interações bióticas que podem ser

classificadas como negativas ou positivas. As negativas produzem mecanismos que

podem limitar a densidade da população (Odum, 2012), já as positivas promovem a

sobrevivência das populações que interagem em um mesmo habitat (Atlas; Bartha,

1997). Ao contrário das interações negativas, que podem gerar extinções ou diminuir

a diversidade, as interações positivas podem manter a diversidade em ambientes

hostis, onde as espécies dependem umas das outras para persistir (He; Bertness;

Altieri, 2013).

Durante muito tempo os estudos ecológicos estavam interessados na

importância das interações negativas como elementos estruturadores das

comunidades, no entanto, pesquisas recentes demonstram que as interações

positivas possuem importância equivalente no processo de estruturação de

comunidades e também na diversidade, merecendo assim, a atenção dos ecólogos

(Bertness; Callaway, 1994; Bertness; Leonard, 1997; Filotas et al., 2010; Odum,

2012; He; Bertness, 2014).

As interações positivas podem ser consideradas como aquelas na qual pelo

menos uma das espécies envolvidas se beneficia sem causar danos a nenhum dos

16

participantes, afetando positivamente o crescimento ou reprodução de um ou mais

organismos (Bertness; Leonard, 1997; Stachowicz, 2001; Odum, 2012). Estas

relações incluem mutualismo facultativo ou obrigatório e facilitação, interações

tróficas e não-tróficas, bem como diretas e indiretas, além do comensalismo e da

protocooperação (Bertness; Leonard, 1997; Filotas et al., 2010; Odum, 2012).

Muitas interações positivas têm emergido como importantes na composição

das comunidades biológicas, uma vez que elas podem modificar o habitat alterando

as condições locais e oferecendo um ambiente mais favorável para outras espécies

(Stachowicz, 2001). Essas interações também contribuem para expansão da

distribuição de espécies, por meio da melhoria das condições resultantes de

estresses físicos e biológicos (Crotty; Bertness, 2015).

Estudos apontam que as interações positivas podem ocorrer quando um

organismo faz com que o ambiente local se torne mais favorável para outro, quer por

mecanismos diretos, como pela redução térmica, suplementação de água ou

nutrientes, ou através de simbioses nutricionais, ou indiretos, através da remoção de

concorrentes predadores (Bruno; Stachowicz; Bertness, 2003). Este tipo de contato

positivo se torna crucial para sobrevivência de muitos organismos em diversos

ambientes com níveis distintos de estresse abiótico (Travis; Brooker; Dytham, 2005).

Embora os estudos das interações positivas tenham apresentado avanços

significativos nos últimos anos, é possível constatar que em relação aos micro-

organismos estas análises ainda são incipientes, uma vez que pouco se conhece

sobre a dinâmica de interações que ocorre no universo microbiano.

Segundo Barberán; Casamayor; Fierer (2014), muitos dos conceitos que

conduzem a prática e a investigação dos estudos ecológicos foram desenvolvidos

sem considerar os micro-organismos, mesmo sendo estes os representantes da

maior diversidade filogenética e funcional da terra. Tendo em vista a

representatividade do mundo microbiano em diferentes escalas temporais, espaciais

e funcionais é relevante a realização de estudos que possam colaborar na

compreensão das relações estabelecidas entre micro-organismos e o ambiente

físico e biológico que o integra.

17

2.4 Facilitação e Fitness microbiano: mecanismos de coexistência

A facilitação tem sido definida como uma interação positiva na qual uma

espécie altera o ambiente e permite o crescimento, sobrevivência ou reprodução de

uma segunda espécie (Stachowicz, 2001; Bronstein, 2009). Esse tipo de relação tem

sido bastante documentada para comunidades vegetais (Bertness; Leonard, 1997;

Maestre et al., 2009; Hart; Marshall, 2013; He; Bertness; Altieri, 2013; He; Bertness,

2014).

De modo especial a facilitação tem sido observada em ambientes com

elevados níveis de estresses abióticos, nos quais a presença de espécies-chave que

possuem a capacidade de modificar as condições físicas locais permite a existência

de outras espécies na comunidade. Esse tipo de interação é, pois, fundamental para

manutenção desses ecossistemas (Stachowicz, 2001; Bruno; Stachowicz; Bertness,

2003; Maestre et al., 2009; He; Bertness; Altieri, 2013).

Tilman (2000), afirma que os processos que permitem que espécies interajam

e coexistam em um ecossistema influencia a produtividade, a dinâmica de nutrientes

e a estabilidade desse ecossistema, sendo, portanto, de grande relevância para os

processos fundamentais de composição e manutenção das atividades biológicas.

A presença dos micro-organismos em todas as partes da biosfera, inclusive

em ambientes com elevado nível de estresse, está associada à reconhecida

diversidade funcional desse grupo (Gudelj et al., 2010; Barberán; Casamayor; Fierer,

2014). Referida característica, contribui para o metabolismo dos mais diferentes e

complexos substratos, modifica as condições ambientais e permite a interação

metabólica entre outros organismos. Esses eventos, ampliam o nicho microbiano e

melhoram o valor adaptativo de outras espécies por mecanismos de coexistência

(Pande et al., 2014).

As interações metabólicas entre micro-organismos conhecidas como cross-

feeding (Gerlee; Lundh, 2010; Pande et al., 2014) se caracterizam pelo intercâmbio

recíproco de determinados metabólitos, que envolve a produção metabólica de uma

espécie a ser utilizada como fonte de energia por outra espécie (Turner; Souza;

Lenski, 1996; Schink, 2002; Bull; Harcombe, 2009; Pande et al., 2014).

De acordo com Gerlee; Lundh (2010) o mecanismo de cross-feeding amplia a

diversidade microbiana, uma vez que uma cepa degrada parcialmente o recurso

limitante em um metabólito secundário que é então usado por uma segunda cepa.

Este processo nas comunidades microbianas colabora para o mecanismo de

18

coexistência entre as espécies, ampliando o fitness bacteriano (Giacomini, 2007;

Porcher; Tenaillon; Godelle, 2001), uma vez que há registros de aumento da taxa de

crescimento de espécies participantes através desse tipo de interação (Goel et al.,

2012).

O principal mecanismo envolvido no cross-feeding que favorece a

coexistência é a produção e secreção de um recurso secundário, este, portanto,

fornece um segundo nicho ecológico, onde um genótipo com capacidade inferior

para crescer no recurso principal pode ser capaz de persistir se é melhor

concorrente para o recurso secundário (Ribeck; Lenski, 2015).

Um dos primeiros relatos sobre a utilização de substratos metabolizados por

cepas diferentes foram em experimentos usando mutantes de Escherichia coli.

Cepas deficientes na produção de triptofano foram capazes de crescer em co-cultura

de Salmonella typhi que conseguia produzir o referido metabólito (Fildes, 1956).

Outros estudos também usando genótipos de E. coli demonstraram interação

metabólica, mostrando crescimento significativo por cooperação entre as cepas

(Turner; Souza; Lenski, 1996; Wintermute; Silver, 2010).

Porcher; Tenaillon; Godelle (2001), afirmam que o metabolismo é o principal

componente do fitness, dessa forma a relação entre fitness bacteriano e

metabolismo com a coexistência das espécies no mesmo habitat se torna importante

para manutenção da diversidade. Segundo Wintermute; Silver (2010) as interações

metabólicas podem alterar radicalmente os fenótipos bioquímicos das estirpes

participantes, favorecendo dessa forma, a presença de processos adaptativos.

De acordo com Phelan et al. (2013), a coexistência de micro-organismos em

comunidades mistas estáveis pode ser atribuída a aspectos metabólicos, uma vez

que a nutrição é a maior força modeladora de comunidades microbianas.

Interações metabólicas cross-feeding constituem, pois, um poderoso

mecanismo ecológico que pode levar a coexistência estável de diferentes espécies

dentro de uma comunidade bacteriana, e assim, ajudar a manter a diversidade

genética através da relação entre fitness e atividade enzimática (Porcher; Tenaillon;

Godelle 2001; Pande et al., 2014).

De acordo com Goel et al. (2012) a modelagem metabólica em multi-espécies

é um campo emergente que visa quantificar as interações metabólicas e

compreender como o impacto da disponibilidade de determinado substrato pode

influenciar na dinâmica e abundância das espécies na comunidade. Essa

19

emergência é ainda mais perceptível na microbiologia, onde a complexidade das

interações contribui para os raros trabalhos disponíveis neste âmbito.

Embora os micro-organismos sejam produtores críticos em ambientes

terrestres áridos (Li et al., 2013), ainda são escassos os registros sobre a dinâmica

metabólica desses organismos, assim como sobre quais fatores podem estar

envolvidos na manutenção e organização ecológica dos mesmos no referido

ambiente. Assim, estudos para avaliar as ferramentas usadas pelos organismos na

manutenção da sua diversidade genética em ambientes áridos são de extrema

importância.

2.5 Actinobactérias

As actinobactérias são bactérias Gram-positivas com elevada concentração

de G + C (guanina, citosina), cerca de 55% no DNA, formam filamentos ramificados

ou hifas e esporos assexuais (Sharna; David, 2012; Ventura et al., 2007; Barreto et

al., 2008; Cwala; Igbinosa; Okon, 2011; Rao et al., 2012; Adegboye; Babalola, 2012;

Sharma, 2014). Assemelham-se estreitamente com fungos na sua morfologia geral,

sendo essa semelhança uma possível característica adaptativa do grupo ao mesmo

habitat (Sharma, 2014).

A maioria é de vida livre e estão distribuídos na natureza, podendo ser

encontrados em ambientes terrestre e aquático, mas de modo particular são

abundantes no solo (Semêdo et al., 2001; Adegboye; Babalola, 2012; Silva et al.,

2012; Velayudham; Murungan, 2012; Lima, 2013; Mansour; Abdel-Azeem; Abo-

Deraz, 2015), sendo também produtoras de compostos terpenóides como a

geosmina, responsáveis pelo odor característico de solo recém arado (Adegboye;

Babalola, 2012; Oliveira et al., 2014; Sharma, 2014).

Isolados a partir de diversos tipos de solos e localizações, como ambientes

áridos, florestas tropicais, pântanos, regiões de mangue, desertos e savanas

(Adegboye; Babalola, 2012; Mangamuri et al., 2012; Lima et al., 2014; Martins et al.,

2014; Silva et al., 2015), estudos apontam que actinobactérias são componentes

importantes da população microbiana na maioria dos solos e, em alguns solos são

mais numerosos do que outras bactérias (Jayasinghe; Parkinson, 2008).

De acordo com Arifuzzaman; Khatun; Raham (2010), o número e tipo de

actinobactérias em uma amostra de solo particular é fortemente influenciada pela

20

localização geográfica, temperatura do solo, pH, concentração de matéria orgânica,

aeração e teor de umidade. Para Ventura et al. (2007), essa característica é

responsável pela diversidade morfológica, fisiológica e metabólica desses micro-

organismos.

A variedade morfológica e as características biológicas do grupo, incluindo os

mecanismos reprodutivos, como a esporulação, constitui um aspecto vantajoso para

dispersão à longa distância, contribuindo para reprodução e distribuição em diversos

ambientes, inclusive habitats secos, tendo em vista a presença de esporos

resistentes a dessecação, como esporangiósporos e conidiósporos (Eisenlord; Zak;

Upchurch, 2012; Oliveira et al., 2014).

Actinobactérias são capazes de crescer em locais que apresentem condições

ambientais hostis e antropizados (Lima, 2013) como é o caso da região do semiárido

nordestino. Alguns estudos em regiões da Caatinga demonstraram predominância

de actinobactérias em relação a outros micro-organismos do solo, como fungos

(Kavamura, 2012; Martins, S. et al., 2014; Martins, C. et al., 2014), principalmente no

período de menor pluviosidade. A abundância de actinobactérias tende a ser menor

em solos úmidos e maior em solos oligotróficos (Fierer et al., 2007).

Entre as actinobactérias, o gênero Streptomyces é o mais comum no solo,

seguido dos gêneros Nocardia, Microsbispora, Micromonospora, Actinomyces,

Actinoplanes e Streptosporangium (Sêmedo et al., 2001; Adegboye; Babalola, 2012).

Embora o solo seja um habitat preferencial das actinobactérias, o filo também inclui

outros gêneros com estilos de vida diversos, dentre os quais é possível mencionar

agentes patogênicos (Mycobacterium spp.), comensais de plantas (Leifsonia spp.)

além de habitantes do trato gastrointestinal (Bifidobacterium spp.) (Ventura et al.,

2007).

Além de desempenharem papel vital na decomposição da matéria orgânica,

reabastecendo o solo de nutrientes (LeBlanc; Gonçalves; Mohn, 2008; Mabrouk;

Saleh, 2014), as actinobactérias representam um dos mais diversos grupos de

bactérias filamentosas capazes de sobreviver em um amplo número de nichos

ecológicos, graças ao seu reconhecido potencial bioativo (Mansour; Abdel-Azeem;

Abo-Deraz, 2015).

De acordo com Lam (2006), as actinobactérias são os procariotos

economicamente mais valiosos para a biotecnologia, isso se deve principalmente

pelo fato do grupo ser reconhecido pela produção de inúmeros compostos bioativos,

21

dentre os quais se destacam as substâncias com ação antibiótica, que representam

o principal foco de estudos do grupo (Mansour; Abdel-Azeem; Abo-Deraz, 2015).

Cerca de 80% das substâncias antibióticas produzidas por actinobactérias são

provenientes da atividade metabólica de espécies do gênero Streptomyces (Barreto

et al., 2008; Anzai et al., 2008; Arifuzzaman; Khatun; Rahman, 2010; Duraipandiyan

et al., 2010; Miyauchi, 2012).

Importantes ecologicamente na reciclagem e mineralização de nutrientes no

solo (Adegboye; Babalola, 2012), as actinobactérias produzem várias enzimas

extracelulares responsáveis pela degradação de moléculas complexas como

lignocelulose, celulose, proteínas, amido, quitina, húmus, dentre outras (Abdulla; El-

Shatoury, 2007; Minnoto et al., 2014; Sharma, 2014). Estas enzimas hidrolisam as

macromoléculas disponibilizando nutrientes para o solo e seus diversos organismos.

A heterogeneidade bioquímica, diversidade ecológica e capacidade

excepcional das actinobactérias para produção de metabólitos secundários

demonstram a importância de estudos ecológicos sobre suas populações

(Adegboye; Babalola, 2012; Previati et al., 2012). Embora existam poucos relatos

para o potencial enzimático do grupo, as actinobactérias constituem uma fonte

promissora de enzimas (Mansour; Abdel-Azeem; Abo-Deraz, 2015).

Uma vez que as actinobactérias estão presentes juntamente com outros

micro-organismos em vários habitats e conhecendo seu potencial para produção de

enzimas extracelulares capazes de hidrolisar substratos complexos no solo

(Abdelmahsen et al., 2015), se torna relevante compreender como os mecanismos

metabólicos deste grupo particular podem interagir positivamente no solo com outros

organismos, facilitando assim, a coexistência e manutenção da diversidade

microbiana neste ecossistema.

2.6 Rizóbios

As bactérias que possuem a enzima nitrogenase são capazes de realizar um

processo de grande importância ecológica que é a conversão do nitrogênio

atmosférico em formas disponíveis as plantas e as demais formas de vida do

planeta, essas bactérias são conhecidas como diazotróficas (Leite, 2011). Esses

micro-organismos podem viver no solo, associadas a espécies vegetais, tanto na

rizosfera quanto endofiticamente, bem como formar simbioses com leguminosas

(Sabino et al., 2012)

22

Os rizóbios são bactérias diazotróficas Gram-negativas, aeróbias e não

esporulantes que habitam o solo, em especial a região rizosférica, onde possuem a

habilidade de induzir a formação de nódulos nas raízes e também no caule de

plantas leguminosas, sendo responsáveis pelo processo de conversão do nitrogênio

atmosférico em formas utilizáveis pela planta (Zakhia; Lajudie, 2001; Goi; Souza,

2006; Freitas et al., 2007; Hoffmann, 2007; Vieira, 2007; Parmar; Dufresne, 2011;

Barbosa; 2013; Shankar; Sunutha, 2013; Singh; Ramteke; Shulka, 2013; Martins C.

et al., 2015).

A fixação de nitrogênio pelas bactérias diazotróficas é um processo natural

eficiente e de extrema relevância para o ambiente e também para a agricultura

(Zakhia; Lajudie, 2001; Fernades Júnior et al., 2012), uma vez que através dessa

interação (planta-rizóbio) o nitrogênio molecular passa a fazer parte dos processos

biológicos e a compor moléculas importantes dos organismos vivos, como as

proteínas.

Para Moreira et al. (2010) a incorporação de nitrogênio atmosférico pela

planta através da interação de rizóbios com as raízes, é um processo evoluído que

minimiza as perdas do nitrogênio fixado por interferência de fatores químicos, físicos

e biológicos que interagem na complexidade e dinâmica do sistema edáfico.

Além da capacidade saprofítica dos rizóbios, estes constituem um grupo de

micro-organismos bastante diverso fenotipicamente e com ampla distribuição pelo

mundo (Fernandes Júnior et al., 2012a; Barbosa, 2013). De acordo com Chagas

Júnior et al. (2009), a diversidade de rizóbios em ambiente natural se deve a rápida

reprodução, variações, mutações e aos processos naturais de transferência

genética. As características culturais, morfológicas e fisiológicas do grupo é uma

prova dessa diversidade (Barbosa, 2013), e também mostra a adaptabilidade

ecológica de diferentes cepas às condições ambientais predominantes no

ecossistema (Stroschein, 2007).

No entanto, mudanças na estrutura e característica do solo, podem provocar

impactos na diversidade da simbiose entre rizóbio e planta. Alterações no pH do

solo, assim como a presença de alumínio tóxico, podem ocasionar diminuição da

diversidade de rizóbios (Andrade; Murphy; Giller, 2002; Chagas Júnior; Oliveira;

Oliveira, 2012).

Entre os possíveis mecanismos adaptativos de sobrevivência dos rizóbios a

condições abióticas estressantes, destaca-se a produção de exopolissacarídeos

23

(Freitas et al., 2007). É possível que essas substâncias desempenhe um papel

relevante para a maior frequência de rizóbios reportada por Barbosa (2013) em

regiões de clima tropical e temperado, onde predominam temperaturas elevadas,

umidade e níveis distintos de salinidade, que poderiam limitar o crescimento

microbiano.

Parte significativa dos trabalhos desenvolvidos com rizóbios avalia a relação

simbionte do grupo com as leguminosas (Fernandes; Fernandes, 2000; Longatti;

Marra; Moreira, 2013; Sabino et al., 2012; Singh; Ramteke; Shulka, 2013), em geral,

objetivando a busca por inoculantes que possam viabilizar culturas de vegetais mais

eficientes na incorporação de nitrogênio e, portanto, com aumento na produção de

biomassa, suprindo assim, a cadeia produtiva de alimento.

Rizóbios também são reconhecidos por sua capacidade em produzir enzimas,

como a nitrogenase e a hidrogenase que auxiliam no processo de fixação de

nitrogênio (Oliveira et al., 2006; Kumari; Ram; Mallaiah, 2010). No entanto, estudos

como o de Kumari, Ram, Mallaiah (2010), registraram um elevado percentual de

cepas incapazes de sintetizar amilase e principalmente celulase. Tendo em vista a

disponibilidade dos substratos amido e celulose no solo, essa incapacidade pode ser

considerada uma condição limitante para o crescimento destes organismos, que

necessitam de outros mecanismos que possibilitem o uso dos citados substratos

como fonte de carbono e energia.

A dinâmica ecológica dos rizóbios vai além da simbiose mutualística na

fixação de nitrogênio. Aspectos como os tipos de relações entre estes micro-

organismos e os demais organismos que habitam a região rizosférica do solo, são

importantes para manutenção de sua diversidade e de suas funções ecológicas.

Assim, estudos que contribuam para compreensão dos mecanismos que envolvem

as interações ecológicas, distribuição e sobrevivência em diferentes habitats sob

diferentes condições bióticas e abióticas são de extrema relevância.

24

3. Material e Métodos

3.1 Declaração de Ética

Este projeto foi realizado com a autorização do Instituto Chico Mendes de

Conservação da Biodiversidade (ICMBio) número do processo 32890-3 e não

envolveu riscos ou espécies protegidas.

3.2 Área de estudos

3.2.1 Procedência das cepas de actinobactérias e rizóbios

As cepas de actinobactérias e de rizóbios avaliadas neste estudo foram

isoladas a partir de amostras de solo rizosférico do Parque Nacional de Ubajara

(PNU). Esta unidade de conservação federal de proteção integral localiza-se no

planalto da Ibiapaba, na região norte do Estado do Ceará a 320 km de Fortaleza,

limitando-se com o Estado do Piauí (ICMBio, 2016). A área do parque é de 6.288

hectares e abrange os municípios de Tianguá, Ubajara e Frecheirinha estando

compreendida entre a latitude 3º46’ S e longitude 40º 54’ W com altitudes que

variam de 800 a 1.100 m (Cunha; Araújo, 2014; ICMBio, 2016). A temperatura média

varia de 20 a 22ºC no planalto da Ibiapaba, ficando entorno de 24 a 26ºC nas

regiões de baixada. O parque apresenta duas variações climáticas anuais: no

primeiro semestre do ano, mais chuvoso e frio e o segundo semestre quase sem

chuvas e com temperaturas mais elevadas. A média pluviométrica fica em torno de

1.463,3 mm por ano (IBAMA, 2006).

Figura 3.1: Localização geográfica do Parque Nacional e Ubajara (PNU) no estado do Ceará, Brasil. Fonte: www.ipece.ce.gov.br

http://www.ipece.ce.gov.br/

25

3.3 Amostragem

Amostras de solo foram coletadas no segundo semestre de 2012, portanto, no

período seco. Na área experimental, de aproximadamente 400 m2, foram

selecionadas aleatoriamente 12 arbóreas/leguminosas da família Fabaceae (Tabela

3.1). Foram coletadas amostras de solo rizosférico de cada leguminosa na

profundidade de 0-20 cm. Cada amostra foi composta de três sub-amostras de 300

gramas cada, tomadas na projeção da copa ao redor da árvore utilizando-se uma

enxada de jardinagem (Lucena et al., 2013). Cada conjunto (três pontos/leguminosa)

constituiu uma amostra composta, que foram acondicionadas em sacos plásticos

etiquetados, conservados em caixas de isopor com gelo e encaminhados para o

Laboratório de Microbiologia Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da

Universidade Federal do Ceará (UFC).

Amostras Leguminosas

Nome científico Nome vulgar

1 Centrosema spp Centrosema

2 Crateagus monogyna Espinheiro branco

3 Acácia plephella Espinheiro preto

4 Stryphnodendron puclcherrimum Camunze

5 Hymenaea courbari Jatobá

6 Senna spectabilis Besouro

7 Inga spp Ingá

8 Caesalpinia spp Jucá

9 Bauhinia spp Mororó

10 Piptadenia stipulacea Jurema branca

11 Anadenanthera macrocarpa Angico

12 Mimosa caesalpiniifolia Sabiá

TABELA 3.1: Leguminosas da família Fabaceae selecionadas para coleta de

amostras de solo rizosférico do Parque Nacional de Ubajara, no Estado do Ceará.

26

3.4 Caracterização do Solo

O solo da área de amostragem foi avaliado segundo a classificação do

Sistema Brasileiro de Classificação de Solos (EMBRAPA, 2006), e foi descrito com o

seguinte perfil geral: cambissolo háplico Tb distrófico típico, característicos de

relevos fortemente ondulados ou montanhosos como é o caso da região da serra da

Ibiapaba, local onde se encontra o PNU. A presença de argila de baixa atividade e a

baixa fertilidade deste solo, associado a um relevo com declives acentuados,

pequena profundidade e a presença de pedras na massa do solo, tornam este tipo

de terreno pouco favorável para o desenvolvimento vegetal.

3.5 Rizóbios

As 26 cepas de rizóbios isoladas das amostras de solo rizosférico do PNU,

foram previamente autenticadas e caracterizadas fenotipicamente por Pinheiro et al.

(2014). Essas cepas foram denominadas (LAMAB-83, LAMAB-84, LAMAB-85,

LAMAB-86, LAMAB-87, LAMAB-89, LAMAB-90, LAMAB-91, LAMAB-92, LAMAB-93,

LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-96, LAMAB-97, LAMAB-98, LAMAB-99, LAMAB-

100, LAMAB-101, LAMAB-102, LAMAB-103, LAMAB-104, LAMAB-105, LAMAB-

107, LAMAB-108, LAMAB-109, LAMAB-110) e são mantidas em tubos inclinados

com meio “yeast manitol agar” (YMA) a 4°C no Laboratório de Microbiologia

Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do

Ceará, compondo coleção de bactérias diazotróficas oriundas do semiárido do

nordeste brasileiro.

3.6 Actinobactérias

3.6.1 Isolamento

Volumes de 100 µL de amostras do solo rizosférico previamente diluídas (10-

3, 10-4 e 10-5) foram inoculados pela técnica do spread-plate em placas contendo

Caseína Dextrose Ágar (CDA) com a seguinte composição por litro: K2HPO4 (0,5 g),

MgSO4.7H2O (0,2 g), glicose (10 g), caseína (0,2 g) e nistatina (0,05 mg) (Kuster;

Williams, 1964, Arifuzzaman; Khatun; Rahman, 2010). O meio foi distribuído em

placas de Petri estéreis e 100 µL das diluições 10-1 até 10-5 foram espalhados em

triplicatas sobre a superfície das placas com alça de Drigalski e foram incubadas a

27

28 ± 2 °C por 10 dias (Shaikh et al., 2013). Após incubação as colônias foram

purificadas por inoculação em estrias nos mesmos meios de cultura e condições de

cultivo do isolamento.

3.6.2 Caracterização cultural

A partir do crescimento no meio CDA foi feita uma avaliação das

características das colônias sendo selecionadas para a pesquisa as culturas com

características diversas, totalizando 27 cepas, que foram designadas com a sigla UB

seguida de sua respectiva numeração (UB01, UB02, UB03, UB04, UB05, UB07,

UB08, UB09, UB10, UB11, UB12, UB13, UB14, UB15, UB16, UB17, UB18, UB19,

UB20, UB21, UB22, UB23, UB24, UB25, UB26, UB27, UB28).

3.6.2.1 Coloração de Gram

A coloração de Gram foi realizada conforme Kern; Blewins (1999), para

verificar a pureza das culturas. Por meio de esfregaço, uma gota da cepa de cada

actinobactéria cultivada em caldo CDA foi depositada sobre uma lâmina e feito um

esfregaço com auxílio de alça. Após os esfregaços ficarem ao ar em uma superfície

plana, foram então passados três vezes pela chama.

Logo após esfriar, o esfregaço foi coberto durante um minuto com solução

fenicada de cristal violeta. Escorreu-se o corante e cobriu-se o esfregaço com

solução de lugol durante um minuto. Em seguida, lavou-se em água corrente e

descorou-se com álcool 95º GL. Por fim, foi adicionado ao esfregaço a solução de

fucsina básica por 30 segundos. As lâminas de Gram foram visualizadas em

microscópio óptico Zeiss Axioplan em aumento de 1000x.

3.6.2.2 Cor da massa aérea e micélio reverso

Cada cepa foi inoculada por estrias em placas de Petri, após purificação,

contendo o meio seletivo CDA para actinobactérias. Em seguida as placas foram

incubadas em estufa B.O.D a 28 ± 2 °C por 15 dias. Para descrição das

características culturais foram avaliadas as cores do micélio aéreo e reverso das

colônias conforme descrito por WINK (2012), baseada na carta de cores (RAL color

charts).

28

3.6.2.3 Pigmentos melanóides

A produção de pigmentos melanóides foi identificada conforme Shinobu

(1958), as colônias foram inoculadas em meio com a seguinte composição por litro:

15g de glicerol (11,9 mL), 0,5g de L-Tirosina, 0,5g de K2HPO4, 0,5g de MgSO4.H2O,

0,5g de NaCl, 0,01g de FeSO4.H2O, 1 mL de solução traços de sais (0,1g

FeSO4.7H2O, 0,1g MnCl2.4H2O, 0,1g ZnSO4.7H2O, 100 mL de água destilada), 15g

de ágar e pH 7,2-7,4. As placas foram incubadas por 5 a 7 dias em B.O.D. a 28°C.

Foram produzidos dois meios, um contendo tirosina e outro sem. A produção de

pigmentos melanóides foi evidenciada pelo escurecimento do meio contendo

tirosina. O escurecimento dos dois tipos de meio de cultivo pelas cepas consistiu em

evidencia de não produção de melanina.

3.6.2.4 Agrupamentos de dados culturais

Os resultados foram convertidos em uma matriz numérica. Esses dados foram

utilizados para construir uma matriz de similaridade utilizando o aplicativo

computacional PAST (Hammer; Harper; Ryan, 2001), que permite o agrupamento de

isolados semelhantes. Foi aplicado o algoritmo de média não ponderada (UPGMA),

a partir do coeficiente de Jaccard, e estes foram transformados em distância

Euclidiana, que é a distância entre dois pontos. Quanto maior este valor, maior será

a dissimilaridade. O resultado desse processo foi representado na forma de

dendrograma.

3.7 Caracterização enzimática

3.7.1 Atividade celulolítica

As cepas de actinobactérias e rizóbios foram inoculados na forma de spots e

em quadruplicata, no meio de cultivo conforme Couri; Farias (1995) com a seguinte

composição por litro: MgSO4 (0,5 g), KCl (0,5 g), NaNO3 (3,0 g), FeSO4.7H2O (0,01

g), K2HPO4 (1,0 g), ágar (15,0 g), carboximetilcelulose sal sódico (5,0 g) e pH 6,0. As

placas foram incubadas em câmara de crescimento B.O.D. a 28 ± 2ºC por 10 dias.

Após a incubação, foram adicionados 10 mL de solução de vermelho congo a 0,5%

em cada placa, deixando-se agir por 15 minutos a temperatura ambiente.

29

Posteriormente, o excesso da solução foi drenado e 10 mL de solução de NaCl (2M)

foram adicionados em cada placa, deixando-se agir por 30 minutos a temperatura

ambiente. Após a remoção do excesso de solução salina, foi feita a observação de

zonas de hidrólise em torno das colônias (Hankin; Anagnostakis, 1977).

3.7.2 Atividade amilolítica

A produção de amilase foi determinada segundo metodologia de Alariya et al.

(2013). As cepas de actinobactérias e rizóbios foram inoculadas na forma de spots e

em quadruplicata no meio de cultura ágar-amido com a seguinte composição por

litro: peptona (10,0 g), extrato de carne (3,0 g), NaCl (5,0 g), amido solúvel (2,0 g),

ágar (15,0 g) e pH 6,5. Posteriormente, as culturas foram incubadas em câmara de

crescimento B.O.D. a 28 ± 2ºC por 10 dias. Após o crescimento das colônias, foram

adicionados 10 mL de solução de lugol nas placas. A produção da enzima amilase

foi detectada pela descoloração do meio em torno da colônia, devido à hidrólise do

amido.

3.7.3 Determinação do perfil enzimático

As cepas de actinobactérias foram caracterizadas quanto à determinação do

índice enzimático (IE) de amilase e celulase utilizando-se a seguinte equação: IE=

Dh/Dc. Sendo Dh o diâmetro em mm do halo de hidrólise e Dc o diâmetro em mm da

colônia dos rizóbios e das actinobactérias (Hankin; Anagnostakis, 1975).

3.8 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando a versão GraphPad Prism

5,00 (GraphPad Software*, San Diego, CA). Cada ensaio enzimático ocorreu em

quadruplicada seguido de duas repetições. A análise de variância dos dados ocorreu

de acordo com o perfil dos resultados obtidos a partir das médias de cada conjunto

de dados. Para cada conjunto de dados do ensaio enzimático foi realizado o teste de

normalidade Shapiro-Wilk. Os dados que seguiram o padrão de distribuição normal

foram analisados através de uma ANOVA fator único, enquanto que os dados que

não seguiram uma distribuição normal foram avaliados pelo teste não paramétrico

30

Kruskal-Wallis. Ambos os testes foram utilizados para comparar as médias dos IE

dos grupos bacterianos.

3.9 Seleção de Isolados

As cepas de actinobactérias que apresentaram IE≥2,0 para amilase e

celulase, foram selecionadas para ensaio de facilitação com as cepas de rizóbios,

também avaliadas para as mesmas atividades, mas que não apresentaram as

referidas enzimas.

3.10 Facilitação

As cepas de rizóbios incapazes de degradar celulose e amido foram testadas

separadamente, quanto à capacidade de seu crescimento em meios contendo amido

e celulose como única fonte de carbono, inicialmente cultivados com cepas de

actinobactérias capazes de utilizar esses substratos.

3.10.1 Amido

As cepas de actinobactéria com IE≥2,0 foram inoculadas na forma de spots e

em quadruplicada no meio de cultura ágar-amido. Posteriormente, essas culturas

foram incubadas em câmara de crescimento tipo B.O.D., a 28 ± 2ºC por 10 dias.

Após os 10 dias de incubação das actinobactérias em meio de cultura ágar-amido,

um mililitro de culturas das cepas de rizóbios cultivadas previamente em meio de

cultura líquido YMA com a seguinte composição, manitol (10g), K2HPO4 (0,5g),

extrato de levedura (0,5g), MgSO4.7H2O (0,2g), NaCl (0,1g), adicionado de 1000 mL

de água destilada (Vicent, 1970), foram transferidos para microtubos com

capacidade de 1,5 mL. O material foi centrifugado (12.000 rpm por 10 minutos) e o

pellet obtido foi ressuspenso por agitação em vortex em 100 μL de água destilada

esterilizada. Este procedimento foi repetido por duas vezes para eliminação de

resíduos de meio de cultura. Logo após, sob fluxo laminar, gotículas de 3 μL do

volume final das culturas de rizóbios foram distribuídas em redor das colônias das

actinobactérias a 0,5 e 2,0 cm de distância de cada colônia. A distribuição das

gotículas foi feita em duplicata e a maior multiplicação das cepas de rizóbios nas

31

regiões mais próximas as colônias de actinobactérias, foi o parâmetro para

diagnosticar a ocorrência de interação metabólica positiva (Döbereiner; Baldani;

Baldani, 1995).

3.10.2 Celulose

Mesmo procedimento descrito no item 3.10.1 substituindo o substrato amido

pela carboximetilcelulose.

3.11 Seleção de actinobactérias compatíveis com as cepas de rizóbio

As cepas de actinobactérias que apresentaram resultado positivo nos testes

de facilitação para amido ou celulose com as cepas de rizóbios, foram selecionadas

para realização da caracterização fenotípica e fisiológica.

3.11.1 Caracterização morfológica e micromorfológica das cepas de

actinobactérias compatíveis com rizóbios

3.11.2 Análise micromorfológica

Para o microcultivo foram utilizadas placas de Petri esterilizadas, contendo

em seu interior uma lâmina e um pedaço de algodão umedecido, com água

destilada. Um cubo de aproximadamente 1 cm³ de meio de cultura CDA foi cortado e

colocado sobre uma lâmina contida no interior da placa. Cada isolado foi inoculado

nos lados do cubo, o qual foi coberto por uma lamínula estéril. Posteriormente, foi

colocado algodão umedecido na placa, que foi então fechada e incubada em estufa

B.O.D. por 7 a 14 dias, a 28ºC. Após esse período, a lamínula foi retirada e disposta

sobre outra lâmina limpa contendo uma gota de Lactofenol de Amann, em seguida

as bordas foram vedadas com esmalte incolor. As lâminas preparadas foram

observadas ao microscópio óptico Zeiss Axioplan em aumento de 40x (Kern;

Blewins, 1999). Características como: ramificação do micélio sobre o substrato,

estruturação do micélio aéreo, bem como a sua fragmentação ou produção de

esporos foram registradas e comparadas com as descritas por Holt; Krieg; Sneath

(2004). As cepas de actinobactérias foram classificadas a nível de gênero através da

32

comparação das características morfológicas, como tipos de hifas e esporos (Brito et

al., 2015).

3.11.3 Caracterização Fisiológica

3.11.3.1 Tolerância a salinidade

Diferentes concentrações de cloreto de sódio (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 35%)

foram adicionadas em meio 5339 com a seguinte composição para 1000 mL:

caseína peptonada (10,0 g), extrato de levedura (5,0 g), ágar (20,0 g) e pH 7,0

(Wink, 2012) para verificar a tolerância ao cloreto de sódio. As cepas de

actinobactérias foram inoculadas na forma de spots nas concentrações de NaCl

especificadas e incubadas em B.O.D. a 28 °C durante 7-15 dias. Cada ensaio foi

realizado em quadruplicada com duas repetições. A presença ou ausência de

crescimento foi registrada no sétimo dia em diante.

3.11.3.2 Capacidade para crescer em diferentes pHs

Para avaliar a capacidade de crescimento em diferentes pHs das 22

actinobactérias foi utilizado o meio de cultura YMD (Yeast Malt Dextrose) com a

seguinte composição para 1000 mL: extrato de levedura (4,0 g), extrato de malte

(10,0 g), dextrose (4,0 g), ágar (20,0 g). O pH foi ajustado para 5, 6, 7, 8, 9 e 10 e

foram preparadas triplicatas para cada cepa. Após a incubação a 28 ºC em B.O.D.

por 10-12 dias as leituras foram registradas para cada cepa em termos da presença

ou ausência de crescimento (Kishore, 2012).

3.11.3.3 Tolerância a elevadas temperaturas

Para avaliar a capacidade de crescimento nas temperaturas de 39°C, 41°C,

43ºC e 45°C, as 22 cepas de actinobactérias foram inoculadas na forma de spots em

placas de Petri contendo meio de cultura CDA. Em seguida foram incubadas em

B.O.D. nas respectivas temperaturas a serem testadas por 7 dias. Após esse

período foi observada a presença ou ausência de crescimento. Os ensaios foram

realizados em quadruplicada seguidos de duas repetições (Kishore, 2012).

33

4. Resultados

4.1 Caracterização cultural

Os aspectos morfológicos relacionados a cor da massa aérea dos micélios,

assim como a pigmentação do micélio reverso nas culturas de actinobactérias estão

apresentados na Tabela 4.1.

CEPAS COR DO MICÉLIO

AÉREO

COR DO MICÉLIO

REVERSO

UB-01 Branca (RAL 9003) Branca (RAL 9003)

UB-02 Cinza (RAL 7044) Cinza (RAL 7044)



UB-05 Laranja (RAL 2004) Laranja (RAL 2004)

UB-07 Creme (RAL 9001) Creme (RAL 9001)





UB-12 Verde oliva (RAL 6006) Verde (RAL 6007)


UB-14 Marrom (RAL 8019) Cinza (RAL 7035)


UB-16 Branca (RAL 9003) Amarelo (RAL 1018)

UB-17 Marrom (RAL 8028) Azul (RAL 5014)



UB-20 Marrom (RAL 8025) Marrom (RAL 8025)

UB-21 Preto (RAL 9011) Cinza (RAL 7004)


UB-23 Cinza (RAL 7047) Creme (RAL 9001)




UB-27 Cinza (RAL 7047) Marrom (RAL 8024)


Em todas as cepas avaliadas foi confirmado o caráter Gram-positivo,

característica típica desse grupo bacteriano (Goodfellow; Willians, 1983).

Em relação ao micélio aéreo observou-se que as cores predominantes foram

cinza, marrom e branco correspondendo a 25,93%, 25,93% e 22,22%,

respectivamente. Algumas cepas apresentaram micélio aéreo creme (14,92%),

laranja (3,70%), verde (3,70%) e preto (3,70%) (Figuras 4.1 e 4.2).

TABELA 4.1: Caracterização cromogênica dos micélios das cepas de

actinobactérias isoladas de amostras de solo rizosférico do Parque Nacional de

Ubajara, no Estado do Ceará, de acordo com carta de cores (RAL color charts).

34

Quanto a cor do micélio reverso, as cepas também apresentaram variedade,

sendo que o maior percentual (33,34%) apresentou a cor cinza, seguida das cores

branco e creme, ambas presentes em 18,52% das actinobactérias observadas.

Cores como azul (11,12%), marrom (7,4%), além de amarelo, laranja e verde,

ambas observadas em 3,7% dos isolados, também foram identificadas (Figura 4.3).

[]

[];[]

[]

[];

[] []

Cinza

Marrom

Branco

Creme

Verde

Laranja

Preto

A B C D

Figura 4.1: Percentual de actinobactérias isoladas do solo rizosférico do Parque

Nacional de Ubajara, no Ceará, quanto a cor do micélio aéreo. Fonte: acervo do

autor.

Figura 4.2: Características culturais do micélio aéreo de actinobactérias isoladas de

solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará (A) UB-

08, (B) UB-12, (C) UB-14, (D) UB-16. Fonte: acervo do autor.

C D

35

FALT

A produção de pigmentos melanóides foi registrada nas cepas (UB02, UB03,

UB07, UB08, UB09, UB10, UB12, UB13, UB14, UB17, UB18, UB19, UB21, UB22,

UB24, UB26, UB27, UB28) correspondendo a 64,2% das cepas (Figura 4.4).

33,34%

18,52%18,52%

11,12%

7,40%

3,70%

3,70% 3,70%

Cinza

Branco

Creme

Azul

Marrom

Amarelo

Laranja

Verde

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

(%)

Acti

no

bacté

rias

Actinobactérias

Produtoras

Não Produtoras

Figura 4.4: Percentual de cepas de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de

leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, produtoras e não

produtoras de pigmentos melanóides. Fonte: acervo do autor.

Figura 4.3: Percentual de cepas actinobactérias isoladas do solo rizosférico de

leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, quanto à cor do micélio

reverso. Fonte: acervo do autor.

36

A partir das características culturais apresentadas na Tabela 4.1 e da

produção de pigmentos melanóides, foram identificados 16 grupos de

actinobactérias (Figura 4.5).

As características culturais transformadas em uma matriz numérica

permitiram identificar grupos com maior similaridade e diversidade, nos quais se

destacaram os grupos 1 (UB-09; UB-13; UB-22; UB-28) e 2 (UB-24; UB-02; UB-03;

UB-08). Esses grupos mostraram cores semelhantes nas estruturas miceliais, além

de serem produtoras de pigmentos melanóides. A análise do dendrograma acima

mostra que dos 16 grupos formados, nove deles são constituídos por representantes

únicos, o que indica a diversidade cultural das cepas de actinobactérias oriundas do

solo rizosférico do PNU.

1

Figura 4.5: Dendrograma das características culturais das actinobactérias isoladas

de região rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará.

Fonte: acervo do autor.

37

4.2 Caracterização enzimática

4.2.1 Atividade celulolítica

Das 27 cepas de actinobactérias testadas quanto à capacidade de crescer em

meio suplementado com carboximetilcelulose, 18 cepas (66,6%) foram capazes de

crescer e gerar halo de hidrólise, como a cepa UB05 (Figura 4.6), enquanto que

nove cepas (33,4%) não apresentaram atividade celulolítica (UB-03; UB-04; UB-08;

UB-09; UB-15; UB-22; UB-23; UB-27; UB-28).

O índice enzimático correspondente a atividade celulolítica das cepas de

actinobactérias variou de 1,24 mm (UB-02) a 5,21 mm (UB-19) (Figura 4.7).

O teste de Kruskal-Wallis demonstrou diferença significativa (p<0,05) entre as

médias dos índices enzimáticos das cepas de actinobactérias com atividade

celulolítica, as cepas UB-11, UB-14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21 e UB-26,

destacaram-se com índices enzimáticos superiores a 3,0 mm e com variações

estatísticas significativas entre as demais cepas avaliadas (Figura 4.7).

Figura 4.6: Atividade celulolítica da cepa UB-05 isolada do solo rizosférico de

leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. A seta indica a presença de

halo de hidrólise ao redor da colônia. Fonte: acervo do autor.

38

O perfil de hidrólise enzimática da carboximetilcelulose permitiu classificar

11,1% das cepas de actinobactérias como fracamente produtoras (UB-01; UB-02;

UB-24), (1,0≤IE<1,5), 7,5% (UB-16; UB-20), moderadamente produtoras (1,5≤IE<2)

e 48,1% fortemente produtoras (IE≥2,0) (Figura 4.8).

O índice celulolítico das cepas de rizóbios variou de 1,66 mm a 1,78 mm

(LAMAB-84, LAMAB-91 e LAMAB-96) (Figura 4.9).

0

1

2

3

4

5

6

7

8IE

(Ø

h/Ø

c)

Actinobactérias

0

10

20

30

40

50

60

(%)

Ce

pa

s d

e

Ac

tin

ob

ac

téri

as

Nível de Produção de Celulase

Fortemente produtoras

Não produtoras

Fracamente produtoras

Moderadamente produtoras

Figura 4.7: Perfil da atividade celulolítica das cepas de actinobactérias isoladas do

solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte:

acervo do autor.

Figura: Perfil da atividade celulolítica de actinobactérias isoladas de região rizosférica do

Parque Nacional de Ubajara.

Figura 4.8: Classificação quanto à intensidade de produção de celulase das cepas

de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional

de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.

39

Quanto à atividade celulolítica das 26 cepas de rizóbios analisadas, verificou-

se que 23 (85,1%) não foram capazes de crescer em meio suplementado com

carboximetilcelulose, sendo classificadas como não produtoras de celulase.

Somente as cepas LAMAB-84, LAMAB-91 e LAMAB-96 (14,9%) demonstraram

atividade celulolítica, e foram classificadas como moderadamente produtoras

(1,5≤IE<2). Estes resultados demonstram a limitação das cepas de rizóbios na

degradação do substrato celulose (Figura 4.10).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

L83

L84

L85

L86

L87

L89

L90

L91

L92

L93

L94

L95

L96

L97

L98

L99

L10

0

L10

1

L10

2

L10

3

L10

4

L10

5

L10

7

L10

8

L10

9

L11

0

IE (

Øh

/Øc)

Rizóbios

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

(%)

Ce

pa

s d

e R

izó

bio

s

Nível de Produção de Celulase

Não produtoras


Figura 4.9: Perfil da atividade celulolítica de rizóbios isolados de região rizosférica

de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.

Figura 4.10: Classificação quanto à intensidade de produção de celulase das cepas

de rizóbios isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de

Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.

40

Assim como para as actinobactérias, o teste de Kruskal-Wallis evidenciou

diferença significativa (p<0,05) entre as médias dos índices enzimático das cepas de

rizóbios produtoras de celulase.

4.2.2 Atividade Amilolítica

Em relação à capacidade de degradação de compostos amilolíticos, as cepas

de actinobactérias e rizóbios avaliadas apresentaram bom desempenho na hidrólise

de amido, como visto na Figura 4.11 (A e B) para cepa de rizóbio LAMAB-101 e para

cepa de actinobactéria UB-04.

Das 27 cepas de actinobactérias analisadas, somente em quatro (15%), não

foi evidente atividade amilolítica. Entre as 23 cepas amilase positiva (85%), o índice

enzimático variou de 1,16 mm para UB-01 a 5,47 mm para UB-05 (Figura 4.12).

As cepas UB-04, UB-05, UB-08, UB-11, UB-14, UB-20, UB-23 e UB-24

apresentaram índice enzimático superior a 3,0. Estes resultados indicam o potencial

enzimático destas cepas para produção de amilase (Figura 4.12).

Figura 4.11: Atividade amilolítica de cepas de rizóbio LAMAB 101 (A) e de

actinobactéria UB-04 (B) isoladas do solo rizosférico de leguminosa do Parque

Nacional de Ubajara, no Ceará. As setas nas zonas claras ao redor da colônia são

indicativas de atividade hidrolítica. Fonte: acervo do autor.

A B

41

De acordo com os critérios utilizados para categorização das actinobactérias

em relação ao seu potencial enzimático para degradação do amido, observou-se

que das cepas testadas, cerca de 70,3% apresentaram IE≥2, sendo consideradas

como fortemente produtoras de amilase (UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07, UB-

08, UB-11, UB-12, UB-14, UB-15, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20, UB-21, UB-23, UB-

24, UB-26 e UB-27). As cepas UB-01, UB-09 e UB-13 (11%) foram classificadas

como fracamente produtoras, 1≤IE<1,5, enquanto a cepa UB-16 apresentou IE de

1,95 mm, sendo a única considerada como moderadamente produtora. As cepas

UB-10, UB-22, UB-25 e UB-28 não apresentaram atividade amilolítica (Figura 4.13).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

UB

-01

UB

-02

UB

-03

UB

-04

UB

-05

UB

-07

UB

-08

UB

-09

UB

-10

UB

-11

UB

-12

UB

-13

UB

-14

UB

-15

UB

-16

UB

-17

UB

-18

UB

-19

UB

-20

UB

-21

UB

-22

UB

-23

UB

-24

UB

-25

UB

-26

UB

-27

UB

-28

IE (

Øh

/Øc)

Actinobactérias

0

10

20

30

40

50

60

70

80

(%)

Ce

pa

s d

e

Ac

tin

ob

ac

téri

as

Nível de Produção de Amilase


Não produtoras

Fracamente produtoras


Figura 4.13: Classificação quanto à intensidade de produção de amilase das cepas

de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional


Figura 4.12: Perfil da atividade amilolítica de actinobactérias isoladas de região

rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte:

acervo do autor.

42

A análise de variância (ANOVA) das médias mostrou que houve diferença

significativa (p<0,05) entre as médias do índice enzimático das cepas de

actinobactérias amilase positiva. As cepas UB-04, UB-05, UB-08, UB-11, UB-14, UB-

20, UB-23 e UB-24, além de apresentarem índice enzimático superior a 3,0, também

exibiram diferenças estatísticas dentre os índices enzimáticos das demais cepas

avaliadas.

O índice enzimático para atividade amilolítica dos rizóbios variou de 1,71 mm

para a cepa LAMAB-90 a 4,98 mm para a LAMAB-101. Aproximadamente 17 (66%)

foram capazes de formar halo de hidrólise indicativa da presença de enzimas

amilolíticas. Dentre os rizóbios que apresentaram índices enzimáticos superiores a

3,0 mm, destacaram-se as cepas LAMAB-85, LAMAB-89, LAMAB-95 e LAMAB-101

(Figura 4.14).

Entre as cepas de rizóbios avaliadas, 30,8% foram classificadas como

fortemente produtoras (IE≥2), neste grupo estão as cepas LAMAB-83, LAMAB-85,

LAMAB-89, LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-97, LAMAB-101 e LAMAB-110. As

cepas LAMAB-87, LAMAB-90, LAMAB-92, LAMAB-102, LAMAB-103, LAMAB-104,

LAMAB-105, LAMAB-108 e LAMAB-109 foram consideradas moderadamente

produtoras, pois apresentaram 1,5≤IE<2. Nenhuma das cepas analisadas foi

0

1

2

3

4

5

6

IE (

Øh

/Øc)

Rizóbios

Figura 4.14: Perfil da atividade amilolítica de cepas de rizóbios isolados de região

rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo

do autor.

43

classificada como fracamente produtoras. No entanto, em nove cepas de rizóbios

(34,6%) não foi possível evidenciar atividade amilolítica (Figura 4.15).

O teste de Kruskal-Wallis apontou diferença significativa (p<0,05) entre as

médias dos índices enzimáticos das cepas de rizóbios produtoras de amilase, em

especial nas que apresentaram índice enzimático maior que 2,0 mm (LAMAB-83,

LAMAB-85, LAMAB-89, LAMAB-94, LAMAB-97 e LAMAB-101).

4.2.3 Perfil Comparativo da Atividade Enzimática de Actinobactérias e Rizóbios

A maior parte das cepas de actinobactérias (59,3%) demonstrou atividade

amilolítica e celulolítica, enquanto que apenas 7,4% não foram capazes de produzir

as enzimas avaliadas (Figura 4.16). Aproximadamente 25,9% das cepas apresentou

apenas atividade amilolítica, resultado que superou o percentual de cepas

produtoras apenas de celulase, que correspondeu a somente 7,4% das cepas.

0

5

10

15

20

25

30

35

40(%

) C

ep

as

de R

izó

bio

s

Nível de Produção de Amilase

Não produtoras



0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

(%)

Ac

tin

ob

ac

téri

as

Atividade Enzimática

Apenas amilase

Apenas celulase

Amilase e Celulase

Sem produção

Figura 4.15: Classificação quanto à intensidade de produção de amilase das cepas

de rizóbios isolados do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de


Figura 4.16: Percentual de actinobactérias com atividade celulolítica e amilolítica

isoladas de solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no

Ceará. Fonte: acervo do autor.

44

Atividade enzimática é um atributo importante na qualidade do solo. As cepas

UB-05, UB-07, UB-11, UB-12, UB-14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21 e UB-26,

destacaram-se com valores de IE celulolíticos e/ou amilolíticos superiores a 3,0.

Algumas cepas apresentaram a produção de apenas uma das enzimas testadas, no

entanto, mostraram ótimos resultados quanto ao IE, como foi verificado para UB-08

e UB-23 que mostraram IE para amilase de 5,41 e 4,74, respectivamente. Já as

cepas UB-10 e UB-25 foram produtoras apenas de celulose e apresentaram IE de

2,49 e 2,29, respectivamente. As cepas UB-17, UB-19, UB-21 e UB-26

apresentaram resultados significativos para ambos os IE, porém destacaram-se com

a presença de índices celulolíticos de 3,93, 5,21, 4,39 e 3,88, respectivamente

(Figura 4.17).

Os IEs amilolíticos e celulolíticos das cepas de actinobactérias foram

significativamente maiores que os das cepas de rizóbios.

0 1 2 3 4 5 6

UB-01

UB-02

UB-03

UB-04

UB-05

UB-07

UB-08

UB-09

UB-10

UB-11

UB-12

UB-13

UB-14

UB-15

UB-16

UB-17

UB-18

UB-19

UB-20

UB-21

UB-22

UB-23

UB-24

UB-25

UB-26

UB-27

UB-28

IE (Øh/Øc)

Acti

no

bacté

rias

Amilolítica

Celulolítica

Figura 4.17: Perfil comparativo de atividade celulolítica e amilolítica de cepas de

actinobactérias isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional


45

Enquanto 16 cepas de actinobactérias (57%) foram capazes de produzir tanto

amilase quanto celulase (Figura 4.16), nenhum dos rizóbios testados foi capaz de

produzir ambas as enzimas. O percentual de cepas de rizóbios não produtoras das

enzimas avaliadas foi de 23,2%. No entanto, 65,3% das cepas de rizóbios

apresentaram somente atividade amilolítica (Figura 4.18), já a atividade celulolítica

foi evidenciada em apenas três cepas, correspondente a 11,5% do total de rizóbios

testados (Figura 4.19).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

(%)

Riz

ób

ios

Atividade Enzimática

Apenas amilase

Apenas celulase

Sem produção

Figura 4.18: Percentual de rizóbios com atividade celulolítica e amilolítica

isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no

Ceará. Fonte: acervo do autor.

46

4.3 Uso de Compostos Metabolizados por Actinobactérias como Fonte de

Carbono para Bactérias Diazotróficas

O crescimento por cooperação metabólica foi evidenciado pela ocorrência da

multiplicação de cepas de rizóbios ao redor das colônias de actinobactérias

conforme observado na Figura 4.20 (A e B).

0 1 2 3 4 5 6

L83L84L85L86L87L89L90L91L92L93L94L95L96L97L98L99

L100L101L102L103L104L105L107L108L109L110

IE (Øh/Øc)

Riz

ób

ios

Amilolítica

Celulolítica

Figura 4.19: Perfil comparativo da atividade celulolítica e amilolítica de cepas de

rizóbios isolados do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de


Figura 4.20: (A) Teste facilitação celulase UB-11 e LAMAB-97. (B) Teste facilitação

amilase UB-04 e LAMAB-98. As setas indicam as regiões de multiplicação das

colônias de rizóbios. Fonte: acervo do autor.

47

4.3.1 Teste de Facilitação

4.3.1.1 Amilase

As cepas de rizóbios LAMAB-84, LAMAB-86, LAMAB-91, LAMAB-93, LAMAB-

96, LAMAB-98, LAMAB-99, LAMAB-100 e LAMAB-107 que não apresentaram

atividade amilolítica nos testes enzimáticos foram inoculadas separadamente com

as actinobactérias UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07, UB-08, UB-11, UB-14, UB-

15, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20, UB-21, UB-23, UB-24, UB-26 e UB-27 com IE≥2

para amilase.

Somente a cepa LAMAB-84 não apresentou crescimento com nenhuma das

cepas de actinobactérias usadas no teste de facilitação (Figura 4.21). As cepas

LAMAB-96 e LAMAB-98 se destacaram, apresentando crescimento com 63,15% das

cepas de actinobactérias, já a cepa LAMAB-91 obteve crescimento com apenas

duas cepas de actinobactérias (10,50%).

Dentre as actinobactérias que apresentaram melhor resultado quanto a

capacidade de auxiliar no crescimento de rizóbios deficientes na produção de

amilase, destacaram-se a UB-07 e UB-08, ambas apresentaram crescimento

conjunto com oito e sete cepas diferentes de rizóbios, respectivamente (Figura 4.22).

Estas cepas tiveram IE maiores do que dois, sendo que a UB-08 apresentou um dos

maiores IE, igual a 5,41.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

L-84 L-86 L-91 L-93 L-96 L-98 L-99 L-100 L-101

(%)

Ce

pa

s C

om

patí

ve

is

Rizóbios

Figura 4.21: Percentual de actinobactérias compatíveis com cepas de rizóbios em

teste de facilitação amilase. Fonte: acervo do autor.

48

As cepas UB-14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21, UB-23, UB-24, UB-26 e UB-

27, apresentaram crescimento conjunto com apenas duas ou uma cepa de rizóbio

testada (Figura 4.22). Apesar do IE das referidas cepas ter sido maior que 2,0 as

mesmas não se destacaram no teste de facilitação. Estes resultados também podem

estar relacionados a alguma dificuldade, por parte dos rizóbios, de assimilar os

compostos alterados por actinobactérias, uma vez que as referidas cepas foram

capazes de formar halo de hidrólise ao redor das colônias.

4.3.1.2 Celulase

As cepas de actinobactérias UB-05, UB-07, UB-10, UB-11, UB,12, UB-13, UB-

14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21, UB-25 e UB-26 que apresentaram IE≥2,0 foram

inoculadas em meio de cultivo contendo carboximetilcelulose como única fonte de

carbono. Após 10 dias foram inoculadas em mesma placa contendo as referidas

bactérias, as cepas de rizóbios (LAMAB-83, LAMAB-84, LAMAB-86, LAMAB-89,


LAMAB-99, LAMAB-100, LAMAB-101, LAMAB-102, LAMAB-103, LAMAB-104,

LAMAB-105, LAMAB-107, LAMAB-108, LAMAB-109 e LAMAB-110) que não

apresentaram atividade enzimática para o referido substrato.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Nº

de R

izó

bio

s C

om

patí

ve

is c

om

A

cti

no

bac

téri

as

Actinobactérias

L-107

L-100

L-99

L-98

L-96

L-93

L-91

L-86

L-84

Figura 4.22: Cepas de actinobactérias compatíveis com rizóbios em teste de

facilitação amilase. Fonte: acervo do autor.

49

Todos os rizóbios testados foram capazes de crescer com pelo menos uma

cepa de actinobactéria. A cepa LAMAB-87 se destacou por apresentar crescimento

com as 13 cepas de actinobactérias testadas (Figura 4.23). Alguns rizóbios

apresentaram baixo perfil de compatibilidade com actinobactérias, sendo capazes de

crescer com apenas duas a quatro das cepas testadas, neste grupo estão inclusos


LAMAB-99, LAMAB-100 e LAMAB-107.

Aproximadamente 48% dos rizóbios foram capazes de crescer com mais de

50% das actinobactérias testadas. Este resultado demonstra a eficácia destes

isolados na facilitação das cepas de rizóbios avaliadas quanto a assimilação de

compostos celulolíticos disponibilizados pelo metabolismo de actinobactérias.

Dentre as actinobactérias testadas no co-cultivo com rizóbios, foi possível

destacar a UB-05, UB-10, UB-11, UB-14, UB-17, UB-19, UB-21 e UB-25, sendo

capazes de permitir o crescimento de mais de 10 cepas de rizóbios deficientes na

capacidade de degradar a celulose (Figura 4.24). Ressaltando que as cepas UB-11,

UB-14, UB-17, UB-19 e UB-21, apresentaram IE>3.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

(%)

Ce

pa

s C

om

pa

tíve

is

Rizóbios

Figura 4.23: Percentual de actinobactérias compatíveis com cepas de rizóbios em

teste de facilitação celulase. Fonte: acervo do autor.

50

4.4 Caracterização Morfológica e Micromorfológica

As actinobactérias UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07, UB-08, UB-10, UB-

11, UB-12, UB-13, UB-14, UB-15, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20, UB-21, UB-23, UB-

24, UB-25, UB-26 e UB-27, apresentaram resultado positivo para facilitação in vitro

com pelo menos uma cepa de rizóbio e foram selecionadas para caracterização

morfológica e micromorfológica. Os resultados permitiram classificar as cepas de

actinobactérias dentro de gêneros de acordo com Willians; Sharpe; Holt (1989). Os

gêneros identificados foram Streptomyces, Terrabacter, Nocardia e Micromonospora

(Tabela 4.2 ) e (Figura 4.25).

0

2

4

6

8

10

12

14

L-8

3

L-8

5

L-8

6

L-8

7

L-8

9

L-9

0

L-9

2

L-9

3

L-9

4

L-9

5

L-9

7

L-9

8

L-9

9

L-1

00

L-1

01

L-1

02

L-1

03

L-1

04

L-1

05

L-1

07

L-1

08

L-1

09

L-1

10

Nº

de A

cti

no

bac

téri

as

Co

mp

atí

ve

is c

om

Riz

ób

ios

Rizóbios

UB-26

UB-25

UB-21

UB-19

UB-18

UB-17

UB-14

UB-13

UB-12

UB-11

UB-10

UB-07

UB-05

Figura 4.24: Cepas de actinobactérias compatíveis com cepas de rizóbios em teste

de facilitação celulase. Fonte: acervo do autor.

51

Cepa Morfologia Micromorfologia Provável Gênero Micélio Estruturas Microscópicas

UB-02 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato

Esporos em cadeias de espirais

Streptomyces

UB-03 Cocos soltos Ausência de micélio aéreo

Esporos únicos Micromonospora

UB-04 Cocos e bastonetes Aéreo e ramificação sob o substrato

Fragmentações em formas bacilares e esféricas

Terrabacter


Hifas ramificadas e onduladas

Streptomyces



Streptomyces



Streptomyces

UB-10 Formas bacilar e esférica. Presença de finos filamentos

Aéreo e ramificação sob o substrato


Terrabacter

UB-11 Forma filamentosa, presença de formas bacilares



Streptomyces

UB-12 Formas bacilar e esférica. Presença de finos filamentos


Cadeia de esporos Fragmentações em formas bacilares e esféricas.

Streptomyces

UB-13 Forma filamentosa, presença de formas bacilares



Terrabacter


Fragmentações em formas bacilares e esféricas.

Terrabacter



Streptomyces

UB-17 Presença de bacilos e cocobacilos

Apenas ramificação sob o substrato


Nocardia




Nocardia




Nocardia



Streptomyces

UB-21 Bastonetes Apenas ramificação sob o substrato

Hifas ramificadas e esporos circulares

Nocardia

UB-23 Cocobacilos. Emaranhado de finos filamentos



Streptomyces

UB-24 Cocobacilos. Emaranhado de finos filamentos



Terrabacter



Streptomyces



Streptomyces



Streptomyces

TABELA 4.2: Caracterização morfológica das cepas de actinobactérias isoladas do solo

rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará.

52

Dentre os quatro gêneros de actinobactérias identificados com base nas

características micromorfológicas, como o tipo de micélio e a estrutura das hifas, se

destacaram com maior predominância o gênero Streptomyces (54,55%), seguido

dos gêneros Terrabacter (22,72%), Nocardia (18,18%) e Micromonospora (4,55%)

(Figura 4.26).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

(%)

Ce

pa

s

Gêneros de Actinobactérias

Streptomyces

Terrabacter

Nocardia

Micromonospora

Figura 4.26: Percentual de gêneros das cepas de actinobactérias isoladas de

região rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará.


Figura 4.25: Caracterização morfológica e micromorfológica de actinobactérias

isoladas de solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara-CE. (A)

UB-05; (B) UB-08; (C) UB-12. Fonte: acervo do autor.

53

4.5 Caracterização Fisiológica

As actinobactérias compatíveis com os rizóbios na interação de faciltação

metabólica foram caracterizadas fisiologicamente. Os aspectos fisiológicos avaliados

foram a tolerância a salinidade, pH e temperaturas elevadas.

4.5.1 Tolerância a salinidade

Todas as cepas de actinobactérias cresceram na presença de 25% de NaCl e

19 cepas (86,4%) ainda cresceram a 35% de NaCl (Figura 4.27).

Vale ressaltar que com exceção das cepas UB-07, UB-17 e UB-21, as demais

apresentaram crescimento em todas as concentrações de NaCl (Figura 4.28).

Importante destacar que apenas a cepa UB-10 apresentou o mesmo tamanho das

colônias em todas as concentrações de NaCl, nas demais cepas o tamanho da

colônia diminuiu a proporção que ocorreu o aumento de NaCl, sugestivo de redução

celular (Figura 4.29).

75%

80%

85%

90%

95%

100%

0% 5 10 15 20 25 35

(%)

Ac

tin

ob

ac

téri

as

Concentração de NaCl(%)


leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, com crescimento em

diferentes concentrações de NaCl. Fonte: acervo do autor.

54

4.5.2 Crescimento em diferentes pHs

Em relação a capacidade de crescimento em diferentes potenciais

hidrogeniônicos, foi possível constatar que 95,5% das cepas de actinobactérias

apresentaram crescimento nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 e 91% no pH 9 (Figura 4.30).

Apenas as cepas UB-07, UB-18 e UB-26 não apresentaram crescimento em alguns

pHs, sendo observado que a actinobactéria UB-26 demonstrou desenvolvimento em

0

1

2

3

4

5

6

7

8N

º d

e C

on

cen

tra

çõ

es

de N

aC

l

Cepas de Actinobactérias

35%

25%

20%

15%

10%

5%

0%

Figura 4.28: Perfil de crescimento das cepas de actinobactérias do solo rizosférico

de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes

concentrações de NaCl. Fonte: acervo do autor.

Figura 4.29: Crescimento da cepa de actinobactéria UB-10 isolada do solo

rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes

concentrações de NaCl. Fonte: acervo do autor.

55

pHs extremos (pH 4 e 9), enquanto que, a UB-18 manifestou crescimento apenas

em pHs mais ácidos (pH 5 e 6) (Figura 4.31).

4.5.3 Tolerância a elevadas temperaturas

Quanto a capacidade para crescer sob elevadas temperaturas, foi possível

identificar que as actinobactérias testadas apresentaram na sua maioria bom

desenvolvimento, sendo que as temperaturas de 39°C e 41°C exibiram melhor

potencial para crescimento das referidas cepas, considerando um percentual de

86%

88%

90%

92%

94%

96%

98%

100%

pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9

(%)

Ac

tin

ob

ac

téri

as

pH

0

1

2

3

4

5

6

7

Nº

de p

Hs

Actinobactérias

pH 9

pH 8

pH 7

pH 6

pH 5

pH 4


leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, com crescimento em

diferentes pHs. Fonte: acervo do autor.


de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes pHs.


56

72,72% para ambas as temperaturas (Figura 4.32). Nas temperaturas de 43°C e

45°C foi possivel evidenciar crescimento de 59 e 50%, respectivamente.

As cepas UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07 e UB-12 não exibiram

desenvolvimento nas temperaturas testadas, enquanto as cepas UB-08, UB-10 e

UB-27 não demonstraram crescimento em temperaturas mais elevadas de 43°C e

45°C. As cepas UB-11, UB-13, UB-14, UB-15, UB-16, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20,

UB-23, UB-24 e UB-26 cresceram em todas as temperaturas avaliadas (Figura

4.33).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

39°C 41°C 43°C 45°C

(%)

Ac

tin

ob

ac

téri

as

Temperaturas

0

1

2

3

4

Nº

de T

em

pera

tura

s

Actinobactérias

45°

43°

41°

39°

Figura 4.32: Percentual das cepas de actinobactérias isoladas do solo rizosférico

de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, com crescimento em

diferentes temperaturas. Fonte: acervo do autor.


de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes

temperaturas. Fonte: acervo do autor.

57

5. Discussão

De acordo com Amal et al. (2011) e Amsaveni et al. (2015), assim como

ocorre com os fungos filamentosos, a produção de pigmentos retidos no micélio ou

dissolvidos no meio é uma característica primordial na identificação das

actinobactérias. Por esta razão, foi o primeiro parâmetro utilizado neste estudo para

caracterizar as colônias isoladas do solo rizosférico do PNU.

Silva (2013) ao estudar características macroscópicas de 36 cepas de

actinobactérias também isoladas do solo rizosférico de uma região do bioma

Caatinga, registrou a prevalência das cores cinza e branco, resultados semelhantes

aos apontados neste estudo. No entanto, as cepas de actinobactérias do presente

estudo apresentaram maior diversidade cromogênica, visto que, também foram

reportadas as cores marrom, creme, laranja, verde e preto. Silva et al. (2015),

analisando as características culturais de actinobactérias oriundas de uma região do

semiárido no Estado do Ceará (Perímetro Irrigado do Baixo Acaraú), reportaram as

mesmas cores predominantes deste estudo, além dos pigmentos amarelo, rosa,

verde e azul. Segundo Amal et al. (2011), a produção dos pigmentos, sofre

influência das condições ambientais, tais como: pH, temperatura e fonte de carbono

disponível, o que pode explicar a diversidade cromogênica registrada nas diferentes

áreas do semiárido.

Embora se tratando de outros ecossistemas e, portanto, condições ambientais

diferentes, Mabrouk; Salen (2014) também evidenciaram a predominância das cores

cinza e branco nos micélios de actinobactérias de quatro regiões do Egito, além de

pigmentos verde, amarelo e púrpura. Amsaveni et al. (2015) analisando as cores dos

micélios de 26 cepas de actinobactérias isoladas de solo de uma região da Índia

identificaram a predominância de cores branco, marrom e amarelo na massa

micelial, enquanto, Augustine et al. (2013) avaliando cepas de actinobactérias de

sedimentos marinhos, também reportaram o predomínio das cores branco e cinza na

massa de micélio das colônias.

Os parágrafos anteriores tornam evidente que mesmo em diferentes regiões,

as cores miceliais cinza e branco parecem ser uma característica dominante nas

actinobactérias. A quantidade de cepas com outras tonalidades variou entre os

ecossistemas estudados, possivelmente em função das diferenças ambientais nos

habitats avaliados.

58

Além de pigmentos carotenoides, as actinobactérias também podem sintetizar

e excretar pigmentos escuros de melanina ou melanóide (Bhasin; Cameotra; Modi,

2010; Mangamuri et al., 2012; Ahmed; Keyba; Moussa, 2014). Assim como outros

metabólitos secundários, essas susbtâncias não são indispensáveis à sobrevivência

da célula e, portanto, não são necessariamente produzidas. Embora a função

desses compostos e seus benefícios para a bactéria ainda não sejam plenamente

conhecidos (Cruz et al., 2015), estudos indicam uma associação entre os referidos

metabólitos com a resistência a fatores externos, como, por exemplo, a radiação

(Ahmed; Keyba; Moussa, 2014) e temperaturas extremas (Butler; Day, 1998). Dessa

forma, além de representar um aspecto cultural à identificação das actinobactérias,

os pigmentos melanóides se apresentam como potenciais mecanismos adaptativos

a condições ambientais estressantes (Zhu et al., 2007), o que de certa forma justifica

o percentual de cepas produtoras dos referidos pigmentos (64,2%) entre as cepas

de actinobactérias isoladas no presente estudo. De fato, esse percentual é bem

superior ao registrado por Janaki; Nayak; Ganeson (2014) que avaliando

actinobactérias oriundas de sedimento de mangue na Índia constataram que

somente 18% das culturas produziram pigmentos melanóides.

Importante destacar que as cepas de actinobactérias produtoras, tanto de

pigmentos carotenoides (azul, violeta, vermelho, rosa, amarelo, verde, cinza, creme),

como melanóides (polímeros de coloração marrom escura), contribuem para

sobrevivência dos mirco-organismos no solo (Sharma, 2014; Oliveira et al., 2014),

desempenhando importante papel ecológico no equilíbrio da comunidade

microbiana. Ainda sob o ponto de vista ecológico, alguns pigmentos apresentam

atividade antimicrobiana atuando direta e/ou indiretamente na promoção de

crescimento de plantas (Miyauchi, 2012).

Assim como observado neste estudo, Silva et al. (2015) ao avaliarem as

características culturais de actinobactérias isoladas de Acaraú, região semiárida do

Ceará, registraram 17 grupos, o que confirma a diversidade desse grupo microbiano

em regiões semiáridas. De acordo com Berry; Widder (2014), a estrutura da

comunidade de qualquer habitat é “imprimida” pelas interações entre espécies.

Dessa forma, a diversidade influencia a composição biológica do solo e se constitui

um caráter ecológico primordial para manutenção de todo e qualquer ecossistema.

Assim, o grau de diversidade cultural representado pelos 16 grupos cromogênicos

59

identificados no presente estudo, reforça a importância desse grupo de bactérias no

funcionamento e na sustentabilidade no solo rizosférico do PNU.

Além do potencial para produção de pigmentos naturais, as actinobactérias

possuem outras peculiaridades de grande interesse econômico e ecológico. Neste

sentido, a reconhecida capacidade de produção de metabólitos secundários, é

responsável por pesquisas em vários ecossistemas, como deserto, manguezais e

ambientes marinhos (Anzai et al., 2008; Mangamuri et al., 2012; Bull; Asenjo, 2013;

Priyadharsini; Dhanasekaren, 2015).

Dentre os metabólitos secundários produzidos por actinobactérias, de modo

particular para representantes do gênero Streptomyces, compostos bioativos com

ação antibiótica e a produção de enzimas extracelulares, são os mais pesquisados

(Lam, 2006; Ventura et al., 2007; Duraipandiyan et al., 2010; Priyadharsini;

Dhanasekaran, 2015).

As enzimas extracelulares sintetizadas pelas actinobactérias são capazes de

hidrolisar macromoléculas complexas, como proteínas, amido, quitina, húmus,

celulose, lignocelulose e xilana, além de compostos recalcitrantes presentes no solo

(Tuncer et al., 1999; Bhasin; Modi; 2013; Minnoto et al., 2014). Para Priyadharsini;

Dhanasekaran (2015), a produção dessas enzimas facilita a sobrevivência de

vegetais pela degradação de diversos substratos complexos no solo, além de

auxiliar no controle de fitopatógenos.

Entre os substratos disponíveis no solo, a celulose constitui cerca de metade

do peso seco da biomassa da Terra (Kumar; Bisht; Gusain, 2013), sendo o

polissacarídeo de maior ocorrência natural, representando o principal componente

dos vegetais (Bernades; Santos, 2006). É um carboidrato complexo de estrutura

cristalina, insolúvel em água e muito resistente a ação de enzimas e reagentes

químicos (Kumar; Bisht; Gusain, 2013).

Na presente pesquisa, a maioria das cepas de actinobactérias (66,6%)

demonstraram atividade enzimática para celulose, sendo que deste total, 70,3%,

apresentaram IEs superiores a 2,0. Estudos descritos por Abdulla; El-Shatoury,

(2007); Bhasin; Cameotra; Modi, (2010); Meignanalakshmi et al., (2013); Das;

Solanki; Khanna, (2014); Minnoto et al., (2014) apontam atividade celulolítica em

actinobactérias isoladas de amostras de solo de diferentes ambientes do Egito, da

Índia e do sul do Brasil. Um dos raros trabalhos sobre atividade celulolítica de

actinobactérias do semiárido nordestino, mais precisamente cepas isoladas de solos

60

da Bahia, foi realizado por Bispo (2010), que ao avaliar 80 cepas de actinobactérias,

reportou a presença de atividade celulolítica em 33% das mesmas. Segundo Sadhu;

Maiti (2013), estirpes bacterianas que produzem enzimas celulolíticas são

extremamente resistentes à estresses ambientais, constituindo assim, grupos de

extrema relevância para manutenção de outras espécies de seres vivos nestes

ambientes de condições relativamente hostis, reforçando a importância biológica e

ecológica desse grupo no semiárido brasileiro.

Embora os raros estudos sobre o potencial celulolítico de actinobactérias no

semiárido brasileiro reforcem a importância do presente estudo, dificulta a

comparação de resultados. Assim, a partir da literatura consultada, foram

selecionados alguns trabalhos com atividade celulolítica de actinobactérias

provenientes de outros ecossistemas. Minnotto et al. (2014) identificaram que 30%

das cepas de actinobactérias isoladas de amostras de solo da cidade de Pelotas,

Rio Grande do Sul no Brasil, foram capazes de degradar a carboximetilcelulose. O

percentual duas vezes maior de cepas celulolíticas do presente estudo (66,4%), é

sugestivo do efeito das condições estressantes no semiárido para produção da

enzima celulase por cepas de actinobactérias.

Jaradat et al. (2008) estudando 340 cepas de actinobactérias isoladas de

amostras de solo de uma região do Iraque, observaram que 94% dos isolados

apresentaram halos de degradação da celulose. No entanto, apenas três cepas

(1%), exibiram diâmetro na faixa de 20 mm e 25 mm, com a cepa J2 exibindo o

maior halo de inibição (22 mm). No presente estudo, 16 cepas (59%) mostraram

diâmetros de halo de inibição entre 20 mm a 32 mm, ressaltando que, a cepa UB-04,

que apresentou o maior halo de inibição (32 mm), não exibiu o maior IE. Esta

constatação ressalta o descrito por Silva et al. (2015a) de que somente a medida do

halo de inibição é insuficiente como medida da atividade enzimática.

As cepas de rizóbios utilizadas neste trabalho foram oriundas das mesmas

amostras de solo rizosférico de leguminosas do PNU, mas somente três (14,9%)

apresentaram atividade celulolítica, indicando a deficiência dessa enzima na

população de rizóbios da referida área. Esse grupo de bactéria desempenha a

importante função de fixar o nitrogênio atmosférico (N2), transformando-o em NH3,

que é utilizado pelas plantas. Segundo Robledo et al. (2008) o principal evento no

desenvolvimento da simbiose rizóbio-leguminosa é a degradação da parede celular

da planta para a passagem da bactéria. Portanto, nesse processo infeccioso,

61

enzimas capazes de degradar celulose são de fundamental importância. Oliveira et

al. (2006); Kumari; Ram; Mallaiah (2010) reportam que a excreção de enzimas

degradadoras da celulose no solo disponibiliza nutrientes para a comunidade

microbiana em geral e, em particular para os rizóbios deficientes dessa enzima.

Resultado semelhante ao do presente estudo foi reportado por Oliveira et al.

(2006a) que ao estudarem 67 cepas de rizóbios isoladas da Amazônia central

observaram atividade celulolítica em apenas seis cepas (9%). Estudos também

exibiram resultados pouco significativos para produção extracelular de celulose por

cepas de rizóbios isolados de solo da Índia (Singh; Kaur; Singh, 2008). Os dados

sugerem que este grupo presente na região rizosférica, é deficiente na degradação

desse substrato abundante no solo, não possuindo complexos enzimáticos capazes

de solubilizá-lo.

De acordo com Bernades; Santos (2006) em solos úmidos, os fungos são os

principais decompositores da celulose, ao passo que em solos de regiões

semiáridas, as bactérias predominam. Desse modo, a presença de grupos

bacterianos potencialmente decompositores de celulose em regiões de solos

semiáridos, como as actinobactérias, constitui ferramenta importante na reciclagem

de matéria orgânica, e, por conseguinte, na disponibilização de carbono para as

demais espécies. De fato, Martins et al. (2014) em estudo nessa mesma região do

PNU, registraram que a população de actinobactérias do solo foi significativamente

maior que a de fungos.

Além da celulose, outros carboidratos também apresentam grande relevância

para atividade microbiana no solo. O amido, principal reserva dos vegetais e sua

fonte principal de energia, é um carboidrato complexo e bastante comum no solo,

constituído por amilase e amilopectina, sendo decomposto por fungos e bactérias

(Mishra; Behera, 2008; Cuzzi et al., 2011; Alariya et al., 2013).

Estudos indicam a presença de atividade amilolítica por actinobactérias e

rizóbios (Oliveira et al., 2006a; Augustine et al., 2013; Jaralla et al., 2014). Mansour;

Abdel-Azeem; Abo-Deraz (2015) ao avaliarem a atividade amilolítica de 35 cepas de

actinobactérias de amostras de solo de Al-Aqsa Mosque em Jerusalém, Israel,

verificaram que todas as cepas apresentaram atividade amilolítica. Minotto et al.

(2014) ao observarem a atividade enzimática para amilase sob diferentes

temperaturas de 23 actinobactérias endofíticas obtidas de raízes de plantas de

tomate (Lycopersicon esculentum) em solo do Rio Grande do Sul, também

62

constataram atividade amilolítica em todas as cepas. Estudo desenvolvido na Índia,

por Singh; Kumar; Kapoor (2014) a partir de amostras de solo rizosférico de

morango, também apontaram significativa atividade amilolítica em cepas de

actinobactérias. No presente estudo, foi possível evidenciar a atividade amilolítica

em 85% das cepas analisadas, sendo que as actinobactérias UB-04, UB-05, UB-08,

UB-11, UB-14, UB-20, UB-23 e UB-24, apresentaram IEs superiores a 3,0, exibindo

expressivo potencial para produção dessa enzima.

A cepa UB-05 apresentou maior IE para amilase (5,45), demonstrando

crescimento em vários pHs (4, 5, 6, 7, 8 e 9) e em concentrações de NaCl de até

35%, porém não mostrou desenvolvimento em temperaturas mais elevadas (39°C a

45°C). Já as actinobactérias UB-11, UB-15, UB-20 e UB 23 apresentaram IEs

superiores a 2,5 e demonstraram desenvolvimento em todos os pHs testados (4, 5,

6, 7, 8 e 9), em concentrações salinas de até 35%, e em temperaturas de até 45°C.

Meena et al. (2013), estudando a atividade enzimática de 26 actinobactérias

isoladas de ambiente marinho, observaram atividade amilolítica de 23 isolados

(88%), sendo a cepa NIOT-VKKMA02 selecionada pelo maior IE de 4,3, e em testes

fisiológicos a mesma apresentou maior desenvolvimento em pH 8 e em

concentrações de NaCl de 5-15%.

Zenova; Manucharova; Zvyagintsev (2011) ressaltam que as actinobactérias

são capazes de colonizar ambientes extremos, caracterizados por pHs ácidos ou

acalinos, temperaturas baixas ou elevadas, salinos, com elevados índices de

radiação, baixos níveis de umidade e também com poucos nutrientes. Segundo

Shivlata; Satyanarayana, (2015), a diversidade fisiológica e a grande flexibilidade

metabólica de actinobactérias extremofílicas/termotolerantes, é que permite a

sobrevivência desse grupo bacteriano em ambientes hostis e com condições

desfavoráveis. De fato, as cepas de actinobactérias avaliadas neste estudo

confirmaram essa versatilidade fisiológica, exibindo padrões importantes de

resistência para ambientes áridos.

Quanto a atividade amilolítica dos rizóbios, Oliveira et al. (2006a) estudando a

produção de enzimas hidrolíticas extracelulares de rizóbios nativos da Amazônia

central, observaram que de 67 isolados, 19 (32,8%) apresentaram produção de

amilase, sendo que destes, 7 (36,8%) exibiram IE≥2,1. Outros estudos também

conduzidos por Oliveira et al. (2006), constataram que de 64 isolados, foi possível

evidenciar atividade amilolítica em 29,7% das cepas de rizóbios. Estes resultados se

63

assemelham ao atual estudo, tendo em vista que das 26 cepas, 8 (30,8%) tiveram

IE≥2. Já Fernandes Júnior et al. (2012a), verificaram que de 27 isolados de rizóbios

da rizosfera de Guandu (Cajanus cajan) no Rio de Janeiro, quatro mostraram

elevada atividade amilolítica, quatro apresentaram capacidade intermediária, e 19

exibiram baixa capacidade hidrolítica. Resultados semelhantes também foram

obtidos por Nunes et al. (2013), ao avaliarem a produção de amilase em 10 cepas

de rizóbios oriundas de amostras de solo da Bahia, obtiveram resultado positivo em

quatro cepas (40%).

O maior percentual amilolítico de cepas de actinobactérias e rizóbios em

comparação com o celulolítico, pode ser função da menor complexidade estrutural

do amido em relação à celulose, o que torna o referido substrato mais acessível para

os micro-organismos.

Manivasagan et al. (2010) observaram que de 29 cepas de actinobactérias

isoladas de solo de uma região da Índia, 10 (34,4%) exibiram atividade enzimática

amilolítica e celulolítica, com destaque para a cepa GK22 que teve máxima atividade

em pH 7, concentração de NaCl de 2% e em temperaturas de 45°C. No presente

trabalho, 10 cepas (38,4%) também exibiram múltipla atividade enzimática (amilase

e celulase), sendo que as actinobactérias UB-11, UB-14, UB-17 e UB-26,

apresentaram IE>2 e demonstraram desenvolvimento em diferentes pHs (4, 5, 6, 7,

8 e 9), em concentrações salinas de até 35% e em temperaturas de até 45°C. Esses

resultados indicam que o solo do PNU, se constitui um reservatório de cepas de

actinobactérias com potencial biotecnológico para a produção de enzimas, bem

como para recuperação de solos em áreas com condições ambientais extremas.

Minotto et al. (2014), trabalhando com actinobactérias endofíticas em solo de

uma região de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, constataram atividade enzimática

nas temperaturas de 25°C, 28°C e 30°C, sendo que a actinobactéria R(24),

destacou-se com IE>2 para amilase e celulase em todas as temperaturas testadas.

Comparando o efeito da temperatura limite desse estudo e da presente pesquisa,

constata-se o efeito da influência das condições ambientais, no caso a temperatura,

nas cepas isoladas do semiárido. Os dados do atual estudo reforçam a versatilidade

fisiológica desse grupo microbiano, sobretudo, em relação ao seu potencial

metabólico sobre condições abióticas estressantes.

A constatação de cepas de actinobactérias com capacidade de degradar

substratos amilolíticos e celulolíticos, como demonstrados neste estudo (59,3%),

64

configura-se como um indicativo da presença de enzimas hidrolíticas no solo do

PNU capazes de decompor moléculas complexas e altamente ricas em carbono. De

acordo com Gorlach-Lira; Coutinho (2007), a produção de enzimas hidrolíticas no

solo semiárido, caracterizados pela baixa disponibilidade de nutrientes, assim como

o efeito da própria rizosfera, pode contribuir significativamente para o crescimento e

sobrevivência de populações microbianas, influenciando assim, na estruturação da

microbiota local. Assim, a função da população microbiana nos solos, se torna

fundamental para recuperação de elementos essenciais, seja pela entrada de

matéria orgânica, ou pelo acúmulo dessa matéria no solo (Caldwell, 2005).

As actinobactérias vivem em colônias, juntamente com outros micro-

organismos em diversos ambientes. Assim, a interação entre este grupo com os

demais seres em mesmo habitat, pode ocorrer através de interações negativas,

como a competição e o antagonismo, ou por interações positivas, como a facilitação,

o mutualismo e o comensalismo. Segundo Tilman (2000), os processos que

permitem a interação entre espécies e sua coexistência influenciam não apenas a

produtividade e dinâmica de nutrientes, assim como também a estabilidade desse

ecossistema.

O presente estudo avaliou a interação metabólica cooperativa entre cepas de

actinobactérias produtoras de enzimas celulolíticas e amilolíticas com rizóbios não

produtores das referidas enzimas. Este procedimento visou observar a presença de

possíveis mecanismos metabólicos existentes em actinobactérias, que seriam

supostamente responsáveis por disponibilizar fontes de carbono para populações de

bactérias diazotróficas existentes em solo rizosférico, facilitando assim, a

sobrevivência de grupos bacterianos ineficientes na degradação de carboidratos

complexos, como o amido e a celulose, e, permitindo dessa forma, a coexistência

estável dessas populações microbianas em mesmo habitat. Os resultados

apresentados neste estudo sugerem crescimento das cepas de rizóbios em

substratos contendo os referidos carboidratos, metabolizados inicialmente por cepas

de actinobactérias. Em ambos os testes de facilitação, houve compatibilidade entre

rizóbios e actinobactérias, confirmando Tzamali et al. (2011), que afirmam que os

micro-organismos dependem de interações metabólicas para aumentar o suprimento

de nutrientes e para melhor explorar um determinado ambiente.

O tipo de interação avaliado no presente estudo tem sido reportado por Bull;

Harcombe, (2009); Tzamali et al., (2011); Pande et al., (2014); Ribeck; Lenski,

65

(2015), sendo denominado cross-feeding e identificada como uma troca de

nutrientes entre espécies de micro-organismos. Turner; Souza; Lenski (1996)

afirmam que este mecanismo é também responsável pela manutenção da

diversidade ecológica das bactérias.

Na presente pesquisa foi possível identificar crescimento de cepas de rizóbios

cultivadas com actinobactérias, sendo que alguns rizóbios apresentaram maior

compatibilidade (LAMAB-87, LAMAB-96 e LAMAB-98). Em estudos avaliando a

compatibilidade de nove cepas de actinobactérias com seis cepas de bactérias

diazotróficas, Jesus (2013) constatou que as estirpes diazotróficas VM10, Pal5,

RAM10 e HRCR54 oriundas do solo de Campos dos Goytacazes-RJ, apresentaram

maior número de interações positivas, destacando-se a RAM10 que foi compatível

com todas as cepas de actinobactérias testadas. Importante destacar que na

extensa revisão de literatura do presente trabalho, este foi o único trabalho a abordar

essa interação metabólica entre rizóbios e actinobactérias do solo. Martins et al.

(2016), avaliando in vivo mecanismos de facilitação para o crescimento de micro-

organismos sob diferentes níveis de fenol, constatou maior crescimento das

espécies consorciadas, do que quando cultivadas isoladamente, demonstrando que

a interação positiva entre as espécies aumentou o valor adaptativo (fitness) das

mesmas. Há poucos registros na literatura sobre o co-cultivo de actinobactérias com

outros micro-organismos (Abdelmohsen et al., 2015), principalmente avaliando-se

interações a nível ecológico quanto a mecanismos de facilitação. De acordo com

Pande et al. (2014), a maioria dos casos de co-cultura com interações cross-feeding

entre cepas mostra aumento do fitness Darwiniano. Para Gerlee; Lundh (2010), a

diversidade é facilitada através dessas interações metabólicas, uma vez que uma

estirpe degrada parcialmente um substrato que será utilizado como um recurso por

uma segunda estirpe. Assim, os resultados do atual estudo indicam que a

manutenção da diversidade microbiana do solo do PNU pode ser auxiliada por

interações cross-feeding que melhoram o fitness de comunidades bacterianas.

A maioria dos estudos registrados na literatura que avaliam interações

metabólicas cross-feeding entre micro-organismos se baseiam em cepas de

Escherichia coli, nos quais demonstram crescimento de comunidades de E. coli por

cooperação entre estirpes (Bull; Harcombe, 2009; Harcombe, 2010; Wintermute;

Silver, 2010; Tzamali et al., 2011). Phelan et al. (2013), afirmam que os micro-

organismos dedicam numerosos recursos para manter interações metabólicas, o

66

que demonstra a importância desses fatores metabólicos na sobrevivência de micro-

organismos individuais e no fitness da comunidade microbiana.

Embora o presente estudo não tenha quantificado o fitness (valor adaptativo)

das cepas de rizóbios que apresentaram crescimento no co-cultivo com

actinobactérias, foi possível observar que as actinobactérias que exibiram

crescimento com os rizóbios não apresentaram halo de inibição, o que aponta que

não houve reações antagônicas entre as cepas. Este fato corrobora os resultados

apresentados que indicam a existência de interações metabólicas de facilitação. De

acordo com Brostein (2009), a facilitação poderia ser definida como toda interação

positiva, em que pelo menos uma das espécies envolvidas é beneficiada, sendo

assim, a disponibilização de nutrientes limitantes por uma das partes constitui um

mecanismo de facilitação.

As actinobactérias que apresentaram maior número de interações positivas

para amilase (UB-07, UB-08) e celulase (UB-05, UB-10, UB-11, UB-14, UB-17, UB-

19, UB-21 e UB-25), exibiram na sua maioria crescimento em diversos pHs (4, 5, 6,

7, 8, 9), em várias concentrações salinas (5-35%), e em temperaturas elevadas

(39°C a 45°C). Esses dados corroboram com as observações feitas por Bertness;

Callaway (1994), que afirmam que as interações positivas aumentam à medida que

há aumento de estresses físicos. A presença das condições supostas neste estudo,

caracterizam as condições frequentemente encontradas em solos de região

semiárida. Segundo Goel et al. (2012), as restrições ambientais limitam a

distribuição dos micro-organismos, no entanto a presença de um comportamento

fisiológico adaptado a essas restrições, pode ser consequência de um processo

adaptivo que melhora seu fitness.

Os resultados dos testes fisiológicos das actinobactérias compatíveis nos

ensaios de facilitação demonstrou que as cepas apresentaram um perfil fisiológico

compatível com ambientes de condições estressantes, uma vez que a maioria

apresentou crescimento em vários pHs e salinidade extremas, e em temperaturas de

até 45°C, com exceção das cepas UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07 e UB-12 que

não exibiram crescimento nas temperaturas testadas. As variações ambientais são

onipresentes, assim, compreender como as mudanças no ambiente influenciam as

interações entre espécies é crucial para predizer a dinâmica de populações e

comunidades (Hart; Marshall, 2013).

67

O gênero Streptomyces constitui um dos mais expressivos representantes

das actinobactérias, em parte, isso se deve a sua abundância no solo, além de ser

responsável por cerca de 75% dos compostos bioativos com ação antibiótica

produzidos pelo metabolismo secundário de actinobactérias (Bhasin; Modi, 2013).

Neste estudo, o gênero Streptomyces foi o mais abundante (54,55%) dentre os

isolados de actinobactérias que apresentaram compatibilidade com as cepas de

rizóbios, sendo importante ressaltar que a mesma predominância foi observada

quanto produção de enzimas amilolíticas e celulolíticas. Abdulla; El-Shatoury (2007),

ao avaliarem a atividade celulolítica de 42 actinobactérias, também constataram

predominância do gênero Streptomyces (65%). Estudos com 512 actinobactérias

isoladas de diferentes regiões da Índia, também revelaram predominância do gênero

Streptomyces (65,23%), sendo que outros gêneros como Nocardia (4,49%) e

Micromonospora (0,97%), apresentaram menor representatividade (Kumar; Bisht;

Gusain, 2013). Esses dados se assemelham ao do presente trabalho, uma vez que

os mesmos gêneros tiveram apenas quatro e um representante, respectivamente.

Apesar da menor prevalência desses gêneros nos isolados do PNU, os mesmos

apresentam características relevantes como a capacidade de sobreviver em

ambientes hostis e a produção de enzimas hidrolíticas (Adegboye; Babalola, 2012).

Segundo Shivlata; Satyanarayana (2015), as actinobactérias podem ser

poliextremófilas e poliextremotolerantes, existindo em ambientes com duas ou mais

condições extremas. Nesse sentido, pesquisas tem revelado potencial de

crescimento para este grupo bacteriano em temperaturas elevadas (Kurapova et al.,

2012), em regiões salinas (Mohamed; Al-Saedi; Sadik, 2013), assim como em

regiões extremamente ácidas (Zenova; Manucharova; Zvyagintsev, 2011) ou

bastante alcalinas (Shivlata; Satyanarayana, 2015). Essa diversidade fisiológica

facilita a colonização de actinobactérias nos mais variados ambientes em distintas

zonas topográficas (Shivlata; Satyanarayana, 2015). Assim, a presença de

actinobactérias com ampla variedade fisiológica e com reconhecido potencial

metabólico, indica a relevância desse grupo microbiano na constituição da

comunidade microbiana dos solos da região do PNU.

Interações metabólicas constituem elo importante entre a manutenção da

diversidade microbiana e a disponibilidade de recursos, especialmente no solo,

ambiente de grande heterogeneidade ambiental. Dessa forma, a presença de

mecanismos metabólicos cooperativos entre cepas de micro-organismos, como

68

evidenciados no presente trabalho, demonstram a importância dessas interações

nos mecanismos de facilitação microbiana, contribuindo para manutenção de

comunidades, sobretudo em áreas com condições abióticas limitantes, como regiões

semiáridas.

69

6. Conclusões

Cepas de rizóbios do PNU foram compatíveis com cepas de actinobactérias,

sendo capazes de crescer em substratos celulolíticos e amilolíticos metabolizados

por actinobactérias. As cepas UB-07 e UB-08 se destacaram nos ensaios de

facilitação de amilase, enquanto que as cepas UB-05, UB-11 e UB-21, foram

expressivas nos ensaios de facilitação de celulase. A atividade metabólica de

actinobactérias auxiliou o desenvolvimento de cepas de rizóbios, apresentando

também potencial para resistência a fatores abióticos limitantes.

70

7. Referências

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Considerações finais

Neste trabalho o objetivo principal foi avaliar in vitro a interação metabólica de

actinobactérias como um mecanismo de facilitação para coexistência estável de

rizóbios em solo do semiárido do Nordeste brasileiro. A presente pesquisa foi

importante para ampliar o conhecimento sobre bactérias do semiárido, sobretudo

quanto aos aspectos ecológicos relacionados a sua distribuição, já que nessa região

os estudos sobre componentes microbianos são escassos, de modo particular para

cepas de actinobactérias.

88

Perspectivas Futuras

Após os estudos realizados, recomenda-se continuar com as pesquisas para

ampliar o conhecimento sobre essas bactérias, sobretudo, quanto a influência direta

de fatores abióticos na sua atividade metabólica e das possíveis interferências

dessas variações na capacidade de interação entre as espécies, assim como,

quantificar o fitness das espécies com base nas interações estabelecidas sob

influência de fatores estressantes.

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