UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS ... · instituto de ciÊncias biolÓgicas...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS AÇÃO IMUNOMODULADORA E LEISHMANICIDA DO EXTRATO AQUOSO PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata L. BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA Belém-Pará 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E
PARASITÁRIOS
AÇÃO IMUNOMODULADORA E LEISHMANICIDA DO EXTRATO AQUOSO
PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata L.
BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA
Belém-Pará
2015
BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA
AÇÃO IMUNOMODULADORA E LEISHMANICIDA DO EXTRATO
AQUOSO PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata L.
Belém-Pará
2015
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal do Pará como requisito
para obtenção do título de mestre em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profª. Drª. Edilene Oliveira da Silva
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BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA
AÇÃO IMUNOMODULADORA E LEISHMANICIDA DO EXTRATO AQUOSO
PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata L.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como
requisito para obtenção do título de mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Banca Examinadora:
Profª. Drª. Edilene Oliveira da Silva (Orientadora)
Laboratório de Parasitologia - Instituto de Ciências Biológicas - Universidade Federal do Pará
Prof. Dr. Adriano Penha Furtado
Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia - Instituto de Ciências Biológicas -
Universidade Federal do Pará
Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado
Laboratório de Malária, Serviço de Parasitologia - Instituto Evandro Chagas
Prof. Dr. Moysés dos Santos Miranda
Laboratório de Fecundação in vitro - Instituto de Ciências Biológicas - Universidade Federal
do Pará
Profª. Drª. Barbarella Matos Macchi (Suplente)
Laboratório de Neuroquímica Molecular e Celular - Instituto de Ciências Biológicas -
Universidade Federal do Pará
Belém, 23 de janeiro de 2015
2
3
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”
(José de Alencar)
4
A Deus pelo discernimento concedido e por sempre
iluminar os meu passos nessa longa jornada.
Aos meus familiares, pelo carinho, força e compreensão
dadas nos momentos mais difíceis,. OBRIGADO!
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AGRADECIMENTO
Primeiramente a Deus pelo dom da vida e discernimento concedido ao longo dessa
jornada.
A minha família, minha mãe Angelita, irmãs Ana Regina e Regiane, irmão Junior e
meus sobrinhos Yuri, Carol, Bianca, Beatriz, Gabriel e Rafael por todo incentivo, amor e
dedicação dados nos momentos tristes e felizes desta trajetória.
À minha orientadora Profª. Edilene Oliveira da Silva pela excelente orientação e
oportunidade concedida em participar desse grupo de pesquisa. Obrigado professora por todo
conhecimento repassado e pelo voto de confiança!
À Ana e o Luis pelas imensas, longas e demoradas montagens e discussões de
protocolos. As contribuições de vocês dois foram fundamentais e essenciais para a minha
formação e melhora na conduta técnica no grupo de pesquisa.
À Neide, a minha mais nova afilhada, obrigado por me ensinar a arte de se desesperar
por antecipação...rsrsrs, obrigado pelo companheirismo, pela ajuda em alguns experimentos,
pelas várias idéias oferecidas para complementar o meu trabalho, e também por toda força e
pelas bonitas palavras de conforto dadas em alguns momentos de tristezas e desânimo.
Obrigado também pelos convites em participar das feiras de ciências e palestras realizadas na
escola MAC, elas foram de imensa importância para o meu crescimento profissional.
À Paula, amiga desde o terceiro semestre do curso, parceira durante o mestrado,
experimentos e conselheira rsrs.., fico feliz em ter conhecido você e poder participar do
mesmo grupo de pesquisa. Obrigado pelo sua companhia, pelos vários momentos felizes e de
muitas loucuras que tive ao seu lado. Muito obrigado Paula pela sua amizade e de sempre
estar por perto quando mais precisei.
Ao Rodrigo, o “bandido Mor”, por todos os momentos de descontração, pelas
montagens de fotos no whatsapp, pelas piadas bandidas....Tudo isso contribuiu para
descontrair nos momentos estressantes.
À Carol, minha parceira de experimentos, obrigado pelo companheirismo na obtenção
das células da medula, por entender o desespero de separar células todas as segundas- feiras
as 7 horas da manhã rsrs....
À Raquel, a primeira pessoa com quem conversei no laboratório, e que posteriormente
veio a se tornar minha supervisora e auxiliadora nos experimentos. Muito obrigado Raquel
pelo companheirismo e paciência em ajudar nos “milhões” de experimento que eu queria
realizar ao mesmo tempo.
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À Amanda, pela imensa paciência de analisar minhas “poucas” amostras no citômetro,
pelas conversas e conselhos. Amanda aprendi a ser mais calmo e paciente com você rsrs.....
À Lienne e ao Jorge, obrigado pelos vários momentos de descontração que tivemos ao
longo desses dois anos.
Ao Davi, por todo auxílio desde antes do início do mestrado, ajudando na tradução dos
artigos para a seleção do mestrado. Obrigado por toda ajuda.
Aos recéns chegados ao lab, Evelen e Sandro que sempre alegravam o lab com toda
sua alegria e entusiamo.
Ao Profº. José Luiz do Nascimento, por permitir a utilização dos reagentes e
equipamentos do laboratório de neuroquímica.
À Profª. Gilmara Bastos, do laboratório de neuroinflamação, por preparar e ceder o
extrato aquoso utilizado no presente trabalho.
À Fernanda por todo suporte oferecido na preparação dos fixadores utilizados neste
trabalho e também por todos os conselhos e palavras amiga.
Ao Heyder, pelo auxílio no manuseio do microscópio eletrônico de transmissão e
análise do material processado.
Ao Profº. Chubert, pela ajuda no manuseio dos equipamentos do LBE.
Ao Dr. José Antonio Picanço Diniz do Instituto Evandro Chagas, por permitir a
utilização do microscópio óptico do laboratório de miscroscopia.
Aos professores Adriano Furtado, Ricardo Machado e Moyses Miranda, pelos
comentários e sugestões dados durante a defesa da dissertação.
À Mirna e ao Hosana, por toda ajuda durante esses dois anos de mestrado.
Ao programa de Pós-graduação em Biologia de Agentes infecciosos e Parasitário da
UFPA, por todo aprendizado nestes dois anos de curso.
À CAPES, ao CNPq e ao INCT de Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB), pelo
apoio financeiro, que auxiliou na execução deste trabalho.
E também, não posso deixar de agradecer aos meus amigos camundongos, pois sem as
suas células a realização deste trabalho seria impossibilitada.
E por fim, a todos que contribuíram de alguma forma para a concretização deste
trabalho.
7
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E FIGURAS .................................................................................. 11
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS .................................................................. 13
RESUMO ........................................................................................................................... 15
ABSTRACT ....................................................................................................................... 16
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 17
1.1 ASPECTOS GERAIS .................................................................................................... 17
1.2 O PROTOZOÁRIO Leishmania sp. ............................................................................... 18
1.2.1 Morfologia do protozoário Leishmania sp. ............................................................... 18
1.2.2 Ciclo de vida do protozoário Leishmania sp. ............................................................ 19
1.3 AS LEISHMANIOSES. ................................................................................................. 20
1.3.1 Formas clínicas das leishmanioses nas Américas ..................................................... 21
1.4 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA ...................................................... 21
1.4.1 Aspectos gerais e epidemiológicos ............................................................................. 21
1.4.2 Formas clínicas causadas pelo protozoário L. (L.) amazonensis .............................. 23
1.4.3 Leishmaniose Cutânea Localizada ........................................................................... 23
1.4.4 Leishmaniose Cutânea Difusa ................................................................................... 24
1.5 MODULAÇÃO DE CÉLULAS ALVO E NÃO ALVO PELO PROTOZOÁRIO
Leishmania sp ...................................................................................................................... 24
1.5.1 Medula óssea ............................................................................................................. 25
1.6 CÉLULAS DIFERENCIADAS ...................................................................................... 28
1.6.1 Linfócitos ................................................................................................................... 28
1.6.2 Granulócitos .............................................................................................................. 29
1.6.3 Monócitos................................................................................................................... 30
1.6.4 Células Dendríticas.................................................................................................... 32
1.6.4.1 Interação Leishmania sp. – Células Dendríticas ........................................................ 33
1.6.5 Macrófagos ................................................................................................................ 34
1.6.5.1 Processo de ativação dos macrófagos........................................................................ 35
1.7 INTERAÇÃO PARASITO – CÉLULA ALVO .............................................................. 37
1.8 TRATAMENTO DAS LEISHMANIOSES .................................................................... 38
1.8.1 Mecanismo de ação dos agentes leishmanicidas ....................................................... 39
1.9 GÊNERO Physalis ......................................................................................................... 41
1.10 OBJETIVOS ................................................................................................................ 44
1.10.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 44
8
1.10.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 44
2 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 45
2.1 FLUXOGRAMA ........................................................................................................... 45
2.2 PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DA PLANTA .................................................... 47
2.3 OBTENÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA ........................... 47
2.4 CULTIVO DO PARASITO .......................................................................................... 47
2.5 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA ............... 48
2.5.1 Método Thiazolyl Blue (MTT) .................................................................................. 48
2.5.2 Detecção do potencial da membrana mitocondrial (JC-1)....................................... 48
2.5.3 Detecção de apoptose e necrose em células da medula óssea tratadas com EAPa .. 49
2.6 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa .......................................................................................................................... 49
2.6.1 Microscopia Óptica ................................................................................................... 49
2.6.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA (MORFOMETRIA) ................................................... 50
2.6.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ...................................................... 50
2.7 DETECÇÃO DA PROTEÍNA LC3B ............................................................................. 51
2.8 DETECÇÃO DAS PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE POR CITOMETRIA DE FLUXO .. 52
2.9 RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa .......................................................................................................................... 52
2.9.1 Detecção da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelas células da
medula óssea tratadas com EAPa ..................................................................................... 52
2.9.1.1 Pelo método Nitroblue Tetrazolium (NBT) ............................................................... 52
2.9.1.2 Pelo Kit CellROX® .................................................................................................. 53
2.9.2 Dosagem da produção de óxido nítrico (NO) por células da medula óssea tratadas
com EAPa ........................................................................................................................... 53
2.9.3 Capacidade fagocítica de células da medula óssea tratadas com EAPa .................. 54
2.10 INTERAÇÃO PARASITO-CÉLULA HOSPEDEIRA ................................................. 54
2.10.1 Atividade leishmanicida .......................................................................................... 54
2.10.1 1 Ação de EAPa durante a fase inicial da interação com L. (L.) amazonensis ............. 54
2.10.1.2 Atividade antiamastigota ........................................................................................ 55
2.11 DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE MORTE CELULAR EM PROMASTIGOTAS
DE L. (L.) amazonensis TRATADAS COM EAPa ............................................................... 55
2.11.1 Detecção da produção de espécies reativas de oxigenio (ERO) em promastigotas
de L. (L.) amazonensis tratadas com EAPa ....................................................................... 55
9
2.11.2 Detecção de necrose e apoptose em promastigotas de L. (L.) amazonensis tratadas
com EAPa ........................................................................................................................... 56
2.11.3 Detecção do potencial da membrana mitocondrial das promastigotas de L. (L.)
amazonensis tratadas com EAPa ....................................................................................... 56
2.11.4 Detecção da proteína LC3b em promastigotas de L. (L.) amazonensis após
tratamento com EAPa........................................................................................................ 57
2.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 57
3 RESULTADOS ............................................................................................................... 58
3.1 VIABILIDADE CELULAR ........................................................................................... 58
3.1.1 Método triazolyl blue (MTT) .................................................................................... 58
3.1.2 Detecção do potencial da membrana mitocondrial (JC-1)....................................... 58
3.1.3 Detecção de apoptose e necrose em células da medula óssea tratadas com EAPa .. 58
3.2 ANÁLISE QUANTITATIVA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS CÉLULAS DA
MEDULA ÓSSEA TRATADAS COM EAPa ...................................................................... 60
3.2.1 Análise quantitativa das células cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas...................... 60
3.2.1.1 Linfócitos ................................................................................................................. 60
3.2.1.2 Polimorfonucleares ................................................................................................... 60
3.2.1.3 Mononucleares ......................................................................................................... 60
3.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DAS CÉLULAS CULTIVADAS
POR 96 HORAS .................................................................................................................. 62
3.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) ..................................... 63
3.5 DETECÇÃO DA PROTEÍNA LC3B ............................................................................. 65
3.6 DETECÇÃO DAS PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE POR CITOMETRIA DE FLUXO .. 66
3.6.1 Marcação com CD11b ............................................................................................... 66
3.6.2 Marcação com F4/80 ................................................................................................. 67
3.6.3 Marcação com CD11c ............................................................................................... 68
3.7 RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA TRATADAS COM
EAPa ................................................................................................................................... 69
3.7.1 Produção de ERO por células da medula óssea tratadas com EAPa ...................... 69
3.7.2 Dosagem da produção de NO por células da medula óssea tratadas com EAPa .... 69
3.7.3 Capacidade fagocítica de células da medula óssea tratadas com EAPa .................. 69
3.8 INTERAÇÃO PARASITO-CÉLULA HOSPEDEIRA ................................................... 71
3.8.1 Atividade leishmanicida ............................................................................................ 71
10
3.9 DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE MORTE CELULAR EM PROMASTIGOTAS DE
L. (L.) amazonensis TRATADAS COM EAPa ..................................................................... 75
4 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 78
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 87
6 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 88
7 PRODUÇÃO CIENTÍFICA ......................................................................................... 103
7.1 ARTIGO PUBLICADO ............................................................................................... 103
7.2 ARTIGO EM PREPARAÇÃO ..................................................................................... 103
8 PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS .............................................................................. 103
9 MISSÃO DE ESTUDOS ............................................................................................... 104
10 ANEXOS ..................................................................................................................... 105
11
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Figura 1: Formas evolutivas do protozoário Leishmania sp.. ............................................... 18
Figura 2: Ciclo de vida do protozoário Leishmania sp... ...................................................... 20
Figura 3: Notificações dos casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA) por unidade
federada. .............................................................................................................................. 22
Figura 4: Formas clínicas da leishmaniose tegumentar americana (LTA) ............................ 23
Figura 5: Interação do protozoário Leishmania com as células do sistema imune. ............... 25
Figura 6: Processo de diferenciação celular das células da medula óssea. ............................ 27
Figura 7: Processo de diferenciação de monócitos a partir de uma célula tronco
hematopoiética (CTH) .......................................................................................................... 31
Figura 8: a) Processo de diferenciação e maturação dos monócitos. b) As diferentes
denominações dos macrófagos nos vários tecidos do organismo............................................32
Figura 9: Produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) a partir de estimulo induzido por
Leishmania.. ........................................................................................................................ 36
Figura 10: a) Planta Physalis angulata. b) Fruto da planta Physalis angulata.. .................... 41
Figura 11: Fluxograma mostrando as atividades realizadas para avaliar a ação de EAPa sobre
as células da medula óssea de camundongos.. ...................................................................... 45
Figura 12: Fluxograma das atividades realizadas para avaliar a ação de EAPa sobre o
protozoário Leishmania (Leishmania) amazonenis.. ............................................................. 46
Figura 13: Análise da viabilidade celular. ........................................................................... 59
Figura 14: Contagem percentual do número de linfócitos, polimorfonucleares (PMN) e
mononucleares em culturas de células da medula óssea cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas. 61
Figura 15: Análise morfológica e morfométrica das células da medula óssea tratadas por 96
horas com EAPa................................................................................................................... 62
Figura 16: Análise ultraestrutural das células da medula óssea tratadas por 96 horas com
EAPa. .................................................................................................................................. 64
Figura 17: Detecção do processo de autofagia em células da medula óssea tratadas com
EAPa por 96 horas . ............................................................................................................. 65
Figura 18: Detecção do marcador de superfície CD11b em cultura de células da medula óssea
tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. ......................................... 66
Figura 19: Análise por citometria de fluxo do marcador de superfície F4/80 em cultura de
células da medula óssea tratadas com EAPa. ........................................................................ 67
Figura 20: Detecção da proteína de superfície CD11c em cultura de células da medula óssea
12
tratadas com EAPa por 96 horas.........................................................................................................68
Figura 21: Ação de EAPa sobre a resposta microbicida das células da medula óssea ........... 70
Figura 22: Efeito de EAPa sobre as formas intracelulares do protozoário L. (L.)
amazonensis.. ....................................................................................................................... 72
Figura 23: Efeito do tratamento com EAPa sobre as formas intracelulares do protozoário L.
(L.) amazonensis.. ................................................................................................................ 73
Figura 24: Efeito de EAPa sobre as formas amastigotas do protozoário L. (L.) amazonensis...
............................................................................................................................................ 74
Figura 25: Detecção da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) em promastigotas
de L. (L.) amazonensis tratadas ou não com a concentração de 100 μg/mL de EAPa............. 76
Figura 26: Detecção do mecanismo de ação de EAPa sobre as formas promastigotas de L.
(L.) amazonensis tratadas com EAPa. ................................................................................... 77
13
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
APC – Sigla inglesa para Célula apresentadora de antígenos
BSA – Sigla inglesa para Albumina do soro bovino
CD – Células dendríticas
CSDM – Células supressoras derivadas da linhagem mielóide
CDTIP – Célula dentrítica TIP
CDR3 – Sigla inglesa para 3 Regiões determinantes de complementariedade
CFU–GM – Unidade formadora de colônia grânulo-monocítica
CFU–M – Unidade formadora de colônia monocítica
CNA – Célula com núcleo em anel
CTH – Célula tronco hematopiética
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
EAPa – Extrato aquoso de Physalis angulata
ERO – espécies reativas de oxigênio
FEC – Fator estimulante de colônias
FS – Fosfatidilserina
GM-CSF – Sigla inglesa para fator estimulante de colônia granulócito/macrófago/monócito
GP63 – Glicoproteína de superfície de 63kDa
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
IgE –Imunoglobulina E
IL – Interleucina
INF-γ – Interferon –γ
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
NO – Óxido nítrico
LB – Linfócitos B
LCD – Leishmaniose cutânea difusa
LCDB – Leishmaniose Cutânea Disseminada Borderline
LCL – Leishmaniose cutânea localizada
LM – Leishmaniose mucocutânea
LPG – Lipofosfoglicano
LPS – Lipopolissacarídeo
LT – Linfócitos T
14
LTA – Leishmaniose tegumenta americana
LVA – Leishmaniose visceral americana
MA – Macrófagos ativados
M–CSF – Sigla inglesa para fator estimulante de colônia de macrófagos
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
mg/mL – Miligramas por mililitros
MHC – Sigla inglesa para Complexo principal de histocompatibilidade
MO – Monócitos
MR – Macrófagos residentes
MTT – Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatase hidrogenase
NH4Cl – Cloreto de amônio
NK – Natural killers
O2- – Ânion superóxido
OH- – Radical hidroxila
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS – Sigla inglesa para tampão fosfato salino
PCD – Precursor de células dendríticas
PMC – Progenitores Mielóide comum
PMo – Precursor de mononucleares
Pré-CD – Pré - células dendríticas
Sb+5
– Antimoniais pentavalentes
SBF – Soro bovino fetal
TCR – Sigla inglesa para receptor de célula T
TGF–β – Sigla inglesa para fator modulador de crescimento
TNF–α – Sigla inglesa para fator de necrose tumoral
15
RESUMO
As leishmanioses são doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania.
Esses protozoários multiplicam-se em células fagocíticas, principalmente macrófagos, que
desempenham importante função na defesa do organismo. Os macrófagos pertencem ao
sistema de fagócitos mononucleares, e são derivados dos precursores mielóides da medula
óssea. O tratamento mais efetivo para as leishmanioses ainda é a quimioterapia, além do custo
elevado, as drogas são tóxicas e requerem um longo período de tratamento. Atualmente,
alguns produtos naturais são considerados importantes fontes alternativas de novos agentes
leishmanicidas. Nesse contexto se destaca a planta Physalis angulata L., uma planta
amplamente utilizada na medicina popular. Desta forma, este estudo pretendeu avaliar a
propriedade imunomoduladora e ação leishmanicida do extrato aquoso obtido da raiz de
Physalis angulata (EAPa). Células da medula óssea foram obtidas por lavagem dos fêmures,
mantidas em cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 μg/mL. Foi observado por
microscopia óptica um aumento da área celular, aumento da habilidade de espraiamento
celular e do número de projeções citoplasmáticas. EAPa não promoveu a proliferação de
linfócitos e polimorfonucleares, no entanto promoveu o aumento do número de
mononucleares na cultura. Análise ultraestrutural por Microscopia Eletrônica de Transmissão
revelou que células tratadas com EAPa mostraram um numero elevado de projeções
citoplasmáticas e de vacúolos autofágicos. Além disso, um aumento da expressão de LC3b
em células tratadas foi detectado por citometria de fluxo, sugerindo um processo autofágico.
A detecção por citometria de fluxo das proteínas CD11b e F4/80 revelou que EAPa pode
estimular a diferenciação de células da medula óssea principalmente em macrófagos. EAPa
não diferencia células da medula óssea em células dendríticas, como avaliado por CD11c.
Análise da resposta microbicida das células tratadas com EAPa mostrou que apenas células
com pequeno volume citoplasmático apresentaram um aumento da produção de ânion
superóxido. Entretanto, EAPa não promoveu o aumento da produção de óxido nítrico e da
atividade fagocítica. Com relação a ação de EAPa sobre o protozoário Leishmania, foi
observado que o extrato apresentou uma atividade antiproliferativa sobre as formas
intracelulares de L. (L.) amazonensis. As células da medula óssea que foram tratadas com a
concentração de 100 μg/mL de EAPa por 96 horas antes da interação e 24 horas após a
internalização dos parasitos apresentaram uma redução do número de parasitos intracelulares
de 23,8%, e as células que foram tratadas durante 48 horas antes da interação e posteriormente
tratadas por 24 e 72 horas com 100 μg/mL de EAPa apresentaram uma redução de 22,7% e
96,5%, respectivamente. Entretanto, as células que receberam tratamento apenas antes da
interação apresentaram uma pequena redução de 4,2%. Foi observado um aumento da
produção de espécies reativas de oxigênio em promastigotas de L. (L.) amazonensis tratadas
com 100 μg/mL de EAPa nos períodos de 48 (47,67%) e 72 horas (81,42%) de tratamento,
quando comparado ao grupo controle. Análise por citometria de fluxo da marcação de
Anexina V mostrou que EAPa promoveu a morte por apoptose de promastigotas de L. (L.)
amazonensis. Não foi observada diferença na marcação para o Iodeto de Propídio e proteína
LC3b em promastigotas tratadas quando comparado ao controle. Além disso, nenhum efeito
citotóxico foi observado nas células tratadas com EAPa. Estes resultados demonstram que o
extrato aquoso obtido da raiz de Physalis angulata é capaz de induzir a diferenciação das
células da medula óssea em macrófagos, promover ativação dos macrófagos por meio da
produção de ânion superóxido, além de apresentar ação leishmanicida.
Palavras-chave: Proliferação e diferenciação celular, Medula óssea, Physalis angulata, L. (L.)
amazonensis.
16
ABSTRACT
Leishmaniasis are infectious diseases caused by protozoa of the genus Leishmania. This
parasite multiplies in the macrophage, which are the most important defense cells of the
human body against pathogens. Macrophages belong to mononuclerar phagocyte system, and
are derived from myeloid precursors in the bone marrow. The most effective treatment for
leishmaniasis is the chemotherapy and besides the high cost, these drugs are toxic and
require a long period of treatment. Nowadays, some herbal products are considered an
important alternative source of a new leishmanicidal agent, which includes the plant Physalis
angulata L., a plant widely used in popular medicine. Thus, this study aim to evaluate the
immunomodulatory properties and leishmanicidal action of the aqueous extract obtained from
Physalis angulata roots (AEPa). Bone marrow cells were obtained by flushing femurs, and
maintained in cultures treated with AEPa at a concentration of 100 µg/mL. It was observed by
optical microscopy an increase of cellular area, high spreading ability and number of
cytoplasmatic projections. Furthermore, AEPa did not promote the proliferation of
lymphocytes and polymorphonuclear leukocytes, however promotes increased the number of
mononuclear in the culture. Ultrastructural analysis by Transmission Electron Microscopy
demonstrated that treated cells showed an a high number of cytoplasmatic projections and
augmented autophagic vacuoles. Moreover, high LC3b expression on cells was detected by
flow cytometry, suggesting an autophagic process. Cell surface expression of F4/80 and
CD11b also indicated that AEPa may stimulate differentiation of bone marrow cells mainly
into macrophages. In addition, AEPa did not differentiate cells into dendritic cells, as assessed
by CD11c analysis. Analysis of the microbicidal response revealed that only cells with small
cytoplasm volume showed an increased production of superoxide anions in the group of cells
treated with AEPa. In addition, AEPa not promoted increases of nitric oxide production and
phagocytic activity. In the protozoan Leishmania were observed that AEPa presented
antiproliferative activity on intracellular forms of L. (L.) amazonensis. Bone marrow cells
treated with the concentration of 100 µg/mL by 96 hours before interaction and 24 hours after
internalization of the parasite showed a decrease in the number of intracellular parasites of
23,8%, and cells treated for 48 hours before interaction and subsequently treated by 24 and 72
hours with 100 µg/mL of AEPa showed a decrease of 22.7% and 96,5%, respectively.
However, cells treated before interaction showed a slight reduction of 4.2%. Was observed an
increased production of reactive oxygen species in promastigotes of Leishmania (L.)
amazonensis treated with 100 µg/mL of the AEPa in 48 (47,67%) and 72-hour (81,42%)
period compared to controls. Flow cytometric analysis of Annexin V marking showed that
AEPa promoting the death by apoptosis of L. (L.) amazonensis promastigotes. No difference
was observed in the markup for the Propidium Iodide and LC3b protein in promastigotes
treated when compared to untreated control. Furthermore, no cytotoxic effects were observed
in the cells treated with AEPa. These results demonstrate that aqueous extract obtained from
Physalis angulata roots promotes the differentiation of bone marrow cells into macrophages,
is able to activate macrophages through the production of superoxide anions and has
antileishmanial properties.
Key words: Cell proliferation and differentiation, Bone marrow, Physalis angulata, L. (L.)
amazonensis.
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS GERAIS
As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por diferentes espécies de
protozoários intracelulares obrigatórios do gênero Leishmania (Patel & Sethi, 2009). Este
parasito é unicelular, flagelado e apresenta uma única mitocôndria, onde fica localizado o seu
DNA mitocondrial (Castellano, 2005). A transmissão da doença ocorre por meio da picada de
insetos flebotomíneos, cerca de trinta espécies são capazes de transmitir a doença (WHO,
2010). Após o repasto sanguíneo do vetor, os parasitos invadem as células do sistema
fagocítico mononuclear, principalmente macrófagos e estabelecem a infecção (Sacks & Sher,
2002). Ao fagocitarem o protozoário Leishmania, ocorre a fusão fagolisossomal, onde são
liberadas hidrolases capazes de degradar o parasito. Outro importante mecanismo de defesa da
célula hospedeira é a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de óxido nítrico
(NO), que auxiliam os macrófagos na destruição do agente invasor (Das et al., 2001).
As leishmanioses apresentam duas formas clínicas diferenciadas: a forma visceral e a
tegumentar, podendo ainda apresentar um largo espectro de manifestações clínicas, as quais
estão diretamente relacionadas com as espécies envolvidas e tipo de resposta imune que o
hospedeiro poderá desencadear, podendo influenciar nos sintomas e na gravidade da doença
(David & Craft, 2009; De Oliveira et al., 2009).
O tratamento é realizado utilizando-se uma variedade de medicamentos. O principal
tratamento recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) ainda são os
antimoniais pentavalentes (Sb+5
), que podem ser administrados por via parenteral ou oral.
Entretanto, o tratamento com altas doses de Sb+5
têm tornado algumas espécies de Leishmania
resistentes, necessitando assim da utilização de outro arsenal terapêutico alternativo
(Ashutosh et al., 2007). Não havendo resposta satisfatória ou sendo detectada resistência aos
Sb+5
, as drogas de segunda escolha são as pentamidinas e a anfotericina B (ANF-B), que são
ainda mais tóxicas (Bailey & Lockwood, 2007; Pavli & Maltezou, 2010).
Na ausência de um tratamento eficaz, de baixo custo e de curta duração contra as
leishmanioses, se faz necessário o desenvolvimento de novos medicamentos que sejam
potencialmente menos tóxicos, de baixo custo e com ação sobre organelas ou estruturas
presentes somente no protozoário. Pesquisas utilizando bioprodutos tornam-se alternativas
atraentes, especialmente devido à grande biodiversidade da região Amazônica.
18
1.2 O PROTOZOÁRIO Leishmania sp.
1.2.1 Morfologia do protozoário Leishmania sp.
O protozoário Leishmania sp. é um parasito digenético que apresenta duas formas
evolutivas, a forma promastigota e amastigota. A forma promastigota flagelar (Figura 1a)
habita o tubo digestivo do vetor flebotomíneo e a forma amastigota (Figura 1b) o interior das
células monofagocíticas do sistema imunológico (Soong et al., 2012). Ambas as formas
evolutivas apresentam um DNA mitocondrial altamente condensado próximo ao corpúsculo
basal do flagelo. O DNA mitocondrial é denominado de kDNA, e a região onde se encontra é
denominada cinetoplasto, estrutura característica da ordem Kinetoplastida (Castellano, 2005;
De Souza, 2008). A forma promastigota deste protozoário é alongada, apresentando um
flagelo na porção anterior do corpo celular, um cinetoplasto anterior ao núcleo e um flagelo
livre, enquanto que, a amastigota apresenta um corpo celular com formato oval ou
arredondado e flagelo interiorizado (Castellano, 2005).
Figura 1
Figura 1: Formas evolutivas do protozoário Leishmania sp. Esquema tridimensional das
organelas da forma promastigota (a), observar a presença de um flagelo longo, cinetoplasto
próximo ao corpúsculo basal do flagelo, núcleo localizado posterior ao cinetoplasto e a
presença de organelas, dentre elas: Retículo endoplasmático, complexo de golgi,
acidocalcissomo, mitocôndria e glicossomo. Na figura b, observar a forma amastigota de
Leishmania sp., notar flagelo interiorizado, organelas que também são encontradas na forma
promastigotas e a presença do megassomo.
Fonte: Teixeira et al. (2013).
b a
19
1.2.2 Ciclo de vida do protozoário Leishmania sp.
O ciclo de vida do parasito Leishmania sp. tem início quando o flebotomíneo fêmea
(Ordem Díptera; Família Psychodidae; Subfamília Phlebotominae) realiza o repasto
sanguíneo em um hospedeiro vertebrado infectado com este parasito. O sangue contendo
macrófagos com as formas amastigotas passam pelo abdômen posterior do vetor, onde ocorre
a mudança das formas amastigotas para promastigotas procíclicas (Kamwavi, 2006). No
intestino do vetor, as formas promastigotas procíclicas transformam-se em promastigotas
metacíclicas, forma infectiva para os hospedeiros vertebrados, sendo esse processo
denominado de metaciclogênese. Durante a metaciclogênese, as formas promastigotas de
Leishmania sp. começam a sofrer várias alterações em seus constituintes de membrana, como
o alongamento na estrutura do lipofosfoglicano (LPG), principal fator de virulência deste
parasito (Castellano, 2005; Kaye & Scott, 2011).
Com o término da metaciclogênese, o vetor flebotomíneo realiza o repasto sanguíneo
no hospedeiro vertebrado inoculando as formas promastigotas metacíclicas, estabelecendo
assim o início de uma infecção. Após o repasto, as formas promastigotas infectantes são
lançadas na corrente sanguínea juntamente com a saliva do vetor, esta saliva apresenta um
importante papel imunomodulador, o qual irá contribuir para o sucesso da infecção e
sobrevivência do parasito. Com a presença das formas promastigotas no sangue, células do
sistema imune fagocítico, as células dendríticas (CD), polimorfonucleares (PMN) e
principalmente os macrófagos irão sofrer estímulo para assim migrarem para o local da
infecção. Ao entrar em contato com o protozoário, os macrófagos serão estimulados a realizar
fagocitose e, no interior do vacúolo parasitóforo, o protozoário Leishmania em sua forma
amastigota irá se multiplicar por divisão assexuada até provocar o rompimento da célula,
podendo assim infectar outros fagócitos ou novos vetores que estiverem próximos ao
hospedeiro vertebrado infectado (Figura 2) (Bailey & Lockwood, 2007; Sereno et al., 2007;
Kling & Körner, 2013).
20
1.3 AS LEISHMANIOSES
As leishmanioses são um conjunto de doenças de caráter infecioso e negligenciado,
porém não contagioso que acometem cerca de 12 milhões de pessoas por todo o mundo,
sendo emergente em 98 países tropicais e subtropicais, apresentando altas taxas de incidência
principalmente em países em desenvolvimento, como os da América latina (dentre eles: o
Figura 2: Ciclo de vida do protozoário Leishmania sp. Figura adaptada de Maurer et
al. (2009).
MФ – Macrófagos, CD – Células Dendríticas, PMN – Polimorfonuclear, MAST –
Mastócito.
Transmissão
do parasito Hospedeiro
Vertebrado
Transformação
intracelular em
amastigota
Vetor
Flebotomíneo
Infecção e replicação
em fagócitos
Reinfecção de
Flebotomíneos
Promastigota
metacíclica – Forma
infectiva
MФ CD
PMN
MAST
21
México, Brasil, Peru e Colômbia), alguns países da Ásia e da África, e mais recentemente na
Austrália, Timor Leste e na Tailândia (WHO, 2010; Kedzierski, 2011).
Nas Américas, são conhecidas cerca de onze diferentes espécies dermotrópicas
acometendo os humanos e oito espécies responsáveis pela manifestação da doença em
animais. No Brasil, foram descritas sete espécies, dentre as quais: L. (V.) braziliensis, L.(V.)
guyanensis e L.(L.) amazonensis são as principais causadoras de leishmaniose tegumentar no
Brasil e no novo mundo e a espécie L. (L.) infantum chagasi, causadora da leishamaniose
visceral (Goto & Lindoso, 2010; Brasil, 2013).
1.3.1 Formas clínicas das leishmanioses nas Américas
Nas Américas, as leishmanioses podem apresentar diferentes formas clínicas,
destacando-se entre elas a leishmaniose tegumentar americana (LTA) e a leishmaniose
visceral americana (LVA). A LTA é uma doença polimórfica que acomete a pele. São
conhecidas duas manifestações clínicas, a cutânea e a mucocutânea. A LVA apresenta
diversas manifestações clínicas, onde o indivíduo parasitado pode ser assintomático,
apresentar manifestações graves ou até mesmo obter a cura espontânea (Castellano, 2005;
David & Craft, 2009; De Oliveira et al., 2009).
1.4 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
1.4.1 Aspectos gerais e epidemiológicos
A LTA é uma doença de caráter antropozoonótico, sendo capaz de acometer tanto o
homem quanto animais silvestres e domésticos. A LTA está presente nas Américas, desde
antes da sua colonização, de acordo com dados obtidos de amostras de cerâmicas dos povos
pré-colombianos localizados em regiões que correspondem atualmente ao Peru e o México,
nos anos 400 a 900 d.C, mostrando mutilações nos lábios e narizes, lesões características da
leishmaniose conhecida hoje como mucocutânea (Basano & Camargo, 2004).
Atualmente, a forma tegumentar das leshmanioses representa um problema de saúde
pública, sendo endêmica em cerca de 98 países. A leishmaniose tegumentar é considerada
uma doença negligenciada, pois sua notificação só é obrigatória em 32 dos 98 países
endêmicos, contribuindo assim com a manutenção do quadro de desigualdade (Campos et al.,
2008; Clem, 2010; Kedzierski, 2011). O aumento do número de casos das leishmanioses não
22
se restringe aos países em desenvolvimento, já foi notificado um aumento do número de casos
de LTA nos Estados Unidos, um país não endêmico, decorrente da migração de pessoas
provenientes de países endêmicos e ação antrópica (Pavli & Maltezou, 2010).
O número de novos casos da LTA aumenta anualmente, onde cerca de 1,3 milhões de
novos casos são notificados nos países endêmicos (Clem, 2010, WHO, 2014). No Brasil, o
número de casos de LTA vem crescendo de forma alarmante, principalmente nos estados da
Bahia, Maranhão e Minas Gerais, além de apresentar também uma elevada taxa nos estados
do Pará e Mato Grosso (Figura 3). Este aumento está diretamente relacionado ao processo de
urbanização, construção de novas estradas e hidrelétricas, expondo o homem ao vetor no
ambiente urbano modificando assim o perfil do ciclo.
A LTA é considerada uma doença com sintomatologia polimórfica que acomete a pele
e as mucosas. Sendo assim, dependendo do espectro sintomatológico, a LTA pode apresentar-
se nas formas: cutânea localizada (LCL), mucocutânea (LM) e cutânea difusa (LCD). Na LCL
as manifestações clínicas podem variar de lesões que podem ser únicas, múltiplas, indolores e
ulceradas (Figura 4a e 4b); na forma LM, as mucosas são acometidas com lesões agressivas
Figura 3: Notificações dos casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA) por unidade
federada.
Fonte: Sinan/SVS-MS, 2011.
23
que afetam seriamente a nasofaringe (Figura 4c), e por fim a LCD, também conhecida como
forma anérgica da LTA, é a forma clínica mais grave da doença, causada pela espécie
Leishmania (Leishmania) amazonensis. As manifestações clínicas da LCD ocorrem em forma
de lesões nodulares não ulceradas, que recobrem grandes extensões da pele (Figura 4d e 4e)
(Basano & Camargo, 2004; Kedzierski, 2010; Mcgwire & Satoskar, 2014).
1.4.2 Formas clínicas causadas pelo protozoário L. (L.) amazonensis
O protozoário L. (L.) amazonensis é o agente etiológico causador de três manifestações
clínicas das leishmanioses: a LCL, LCD e a leishmaniose cutânea disseminada borderline
(LCDB). Apesar de ser causada pelo mesmo agente etiológico, cada forma clínica apresenta
aspectos clínicos, imunológicos e características diferencias nas lesões, sendo a LCD uma
forma bastante agravante da LTA e a LCL a mais frequente (Silveira et al., 2004; 2008).
1.4.3 Leishmaniose Cutânea Localizada
O paciente com LCL apresenta uma lesão ulcerada, única ou múltipla, podendo
ocorrer cura espontânea (Pires et al., 2012). As lesões de LCL causadas por L. (L.)
amazonensis são constituídas por macrófagos contendo inúmeras formas amastigotas no
interior do vacúolo parasitóforo, e apresenta infiltrado de plasmócitos. A resposta
a b
c d e Figura 4: Formas clínicas da leishmaniose tegumentar americana (LTA). a-b) Leishmaniose
cutânea localizada. c) Forma mucocutânea. d-e) Forma cutânea difusa.
Fonte: Brasil (2013).
24
imunológica observada na LCL é predominantemente do tipo TCD4+ Th1, que eleva a
produção de INF-γ que favorece a eliminação do parasito, resultando em cura. A expressão do
RNA para IL4 é observada nas lesões de LCL, sendo, portanto, uma importante citocina
relacionada com a inibição da resposta imune desencadeada contra o parasito, podendo
direcionar a resposta imunológica para o tipo Th2. Entretanto, alguns pacientes conseguem
manter o equilíbrio entre os dois tipos de resposta imunológica “Th1/Th2”, obtendo a cura
espontânea. No entanto, outros pacientes somente alcançam a cura através da utilização de
fármacos empregados no tratamento das leishmanioses (Silveira et al., 2004; 2008).
1.4.4 Leishmaniose Cutânea Difusa
A LCD é uma doença grave, na qual os pacientes apresentam uma supressão da
resposta imune, que permite a proliferação do parasito. Esta característica é notória em ratos
infectados com L. (L.) amazonensis, onde é possível observar por técnicas histopatológicas
das lesões a presença de macrófagos parasitados, com um único vacúolo parasitóforo
contendo várias formas amastigotas (Silveira, 2009; Soong et al., 2012).
A resposta imunológica observada na LCD é deficiente, visto que o protozoário L. (L.)
amazonensis consegue modular a resposta imunológica do hospedeiro favorecendo a
infecção. Desta forma, o parasito consegue influenciar a resposta de defesa desenvolvida
pelos linfócitos T CD4+ impedindo a produção de INF-γ, TNF-α, outras citocinas e
quimiocinas essenciais para promover a eliminação do parasito, desencadeando uma resposta
imune predominante do tipo T CD4+ Th2, sendo este o motivo das frequentes recaídas dos
pacientes, mesmo após tratamento (Soong et al., 2012; Kling & Körner, 2013).
O protozoário L. (L.) amazonensis consegue interferir na ativação dos linfócitos,
porém esses leucócitos ainda são capazes de realizar o recrutamento de células para o local da
infecção, principalmente macrófagos, onde a Leishmania consegue sobreviver e se multiplicar
dentro do vacúolo parasitóforo, impedindo a produção de ERO e NO (Maity et al., 2009;
Corrales et al., 2010; Freitas & Pinheiro, 2010).
1.5 MODULAÇÃO DE CÉLULAS ALVO E NÃO ALVO PELO PROTOZOÁRIO
Leishmania sp.
Após inoculação das formas promastigotas do protozoário Leishmania no organismo
do hospedeiro vertebrado pelo vetor, vários estímulos são iniciados induzindo a migração de
25
células que participam da defesa do organismo. Os PMN são as primeiras células a chegarem
ao local da infecção, contudo, outras células como macrófagos, CD e linfócitos também são
recrutadas, desencadeando uma resposta imunológica contra o parasito (Bogdan, 2012). Desta
forma, cada célula chega ao local da infecção em um estágio de maturação e ativação
diferenciado, porém todos os tipos celulares mencionados tem sua origem a partir de células
precursoras presentes na medula óssea (Geissmann et al., 2010).
A figura 5 mostra uma ilustração esquemática do processo de interação do protozoário
Leishmania com as células não alvo (PMN, mastócito, CD e Linfócitos) e com a célula alvo
(Macrófagos) (Castellano, 2005).
1.5.1 Medula óssea
A medula óssea é um tecido esponjoso localizada entre as trabéculas dos ossos longos,
sendo altamente irrigada por vários vasos sanguíneos, o que possibilita a locomoção dos
precursores rumo a circulação (Alberts et al., 2010; Abbas et al., 2012). O espaço existente
CD CD
Figura 5: Interação do protozoário Leishmania com as células do sistema imune. As células
não alvo e a célula alvo (Macrófagos) infectados com o protozoário Leishmania. Figura
adaptada de Maurer et al. (2009).
CD - Células dendríticas, PMN – Polimorfonucleares, Th1 – Linfócito auxiliar do tipo Th1,
Th2 – Linfócito auxiliar do tipo Th2, Tc1 – Linfócito T citotóxico, MФ – Macrófagos, B –
Linfócito B.
Morte
Sistema complemento
Aderência as CD
Infecção dos MФ
Recrutamento
Liberação das amastigotas
Infecção
de CD
Bloqueio
Ativação mediada – INF-γ
CD
26
entre as trabéculas é preenchido com células sanguíneas circulantes, fibroblastos estromais e
células gordurosas (Abbas et al., 2012). A medula óssea é dividida em três compartimentos de
sistemas celulares: compartimento hematopoiético, epitelial e estromal (Owen, 1985; Deans
& Moseley, 2000).
O sistema hematopoiético é composto pelos precursores das células sanguíneas que
tem a capacidade de locomover-se rumo à circulação sanguínea após terem passado pelo
processo de proliferação e diferenciação celular (Alberts et al., 2010; Abbas et al., 2012).
O compartimento estromal é composto por macrófagos, fibroblastos, adipócitos,
células endoteliais e reticulares. Alguns destes componentes, como macrófagos e fibroblastos
apresentam a capacidade de produzir várias citocinas hematopoiéticas, que juntamente com os
fatores estimulante de colônias (FEC) proporcionam um microambiente favorável para gerar
todas as células circulantes, processo este denominado de hematopoiese (Owen, 1985;
Zanichelli et al., 1995; Silveira, 2000; Abdelhay et al., 2009).
A hematopoiese (Figura 6) é um processo complexo, que envolve fatores de
crescimento e citocinas, resultando na geração das células sanguíneas. No período intrauterino
o principal local de realização da hematopoiese é o saco vitelínico e, com o avanço do
desenvolvimento embrionário outros órgãos também se tornam aptos a realizarem tal
processo. No período embrionário, o fígado e o baço já iniciam a fabricação das células
sanguíneas e no quarto mês deste período a medula óssea começa realizar a hematopoiese. Ao
longo do período intrauterino a produção das células sanguíneas vai diminuindo no fígado e
aumentando na medula óssea, sendo que após o nascimento e durante toda vida do individuo
este tecido torna-se principal local de geração de todas células sanguíneas circulantes
(Silveira, 2000).
O sistema hematopoiético comporta todos os tipos celulares que participam do
processo da hematopoiese e pode ser dividido em quatro compartimentos de acordo com o
grau de maturidade de cada tipo celular. No primeiro compartimento são encontradas as
células tronco hematopoiéticas (CTH), que compõe cerca de 0,01% da população total de
células da medula óssea. As CTH são multipotentes, ou seja, podem gerar diferentes tipos
celulares, apresentam a capacidade de promover auto-renovação, e podem gerar os
progenitores hematopoiéticos. Os progenitores estão localizados no segundo compartimento
do sistema hematopoiético e correspondem a 0,5% das células residentes da medula óssea. Os
progenitores são células multipotentes e em alguns casos monopotentes, e diferentemente das
CTH, não podem realizar o processo de auto-renovação. Dois tipos de progenitores são
27
encontrados no segundo compartimento, os progenitores mielóides e os progenitores linfóides
(Kondo et al., 1997; Bryder et al., 2006; Mayani et al., 2007).
Os progenitores mielóides comuns (PMC) são originados por um processo que ocorre
na medula óssea denominado de mielopoiese. Após completar seu estado de maturação, os
PMC são comprometidos com uma linhagem de células específicas, que está relacionado com
o início da expressão de vários genes dentre os quais destacam-se: PU.1, Hox, C/EBPa,
C/EBPb, C/EPBe, RUNX1 e SCL. O aumento de expressão de um determinado gene irá
estimular a diferenciação dos progenitores mielóides a um tipo celular específico. Os
progenitores mielóides vão dar origem aos PMN, eosinófilos, basófilos, monócitos, plaquetas
e eritrócitos, enquanto que os progenitores linfóides, originados através da linfopoiese, irão se
diferenciar em Linfócitos B (LB), Linfócitos T (LT) e células natural killeres (NK) (Travlos,
2006; Abdelhay et al., 2009; Nakajima, 2011).
O terceiro compartimento é composto pelos precursores das células sanguíneas, e
representam cerca de 90% da população total das células da medula óssea. No quarto
compartimento, são encontradas as células sanguíneas maduras, que se direcionam até a
circulação após ter completado o processo de maturação. Os PMN se direcionam a circulação
sanguínea totalmentes diferenciados, enquanto que, os monócitos, só completam o processo
de diferenciação quando invadem os tecidos, onde se diferenciam em macrófagos ou CD
(Mayani et al., 2007).
Figura 6: Processo de diferenciação celular das células da medula óssea. Figura adaptada da
Revista Scientific American- Edição especial ciência e saúde nª 3.
Fonte: Capozzoli, 2006.
28
1.6 CÉLULAS DIFERENCIADAS
As células sanguíneas maduras são constituídas pelos eritrócitos, eosinófilos,
basófilos, PMN, LT, LB e monócitos. Serão descritas apenas as células que participam da
defesa do organismo durante a infecção pelo parasito L. (L.) amazonensis.
1.6.1 Linfócitos
Os linfócitos são células sanguíneas formadas a partir dos precursores linfóides da
medula óssea, que além de se diferenciarem em LB e LT, também originam células NK. O
processo de maturação e diferenciação dos linfócitos envolve a presença de várias citocinas
que atuam sobre os progenitores comprometidos, estimulando sua diferenciação e maturação.
Durante este processo, várias citocinas estão envolvidas, como: IL-2, que participa da
maturação dos LB, LT e NK, a IL-4 e IL-6, que participam da proliferação e maturação dos
LB, LT e a IL-7, que estimula a proliferação dos LB (Roitt et al., 1999; Abbas et al., 2012)
Análise morfológica por microscopia óptica de campo claro mostra que LB e LT
apresentam pouco citoplasma, um núcleo grande com uma cromatina disposta em grumos.
Morfologicamente os LB e LT não podem ser diferenciados, porém técnicas de
imunofenotipagem utilizando marcadores de proteínas de superfície podem ser utilizados para
realizar essa diferenciação (Junqueira & Carneiro, 2008).
Os linfócitos são responsáveis por estabelecer uma diversidade de funções no
organismo, visto que os LB promovem a defesa imunológica por meio da produção de
anticorpos, enquanto que, os LT são capazes de reconhecer diferentes antígenos ou podem
agir diretamente sobre as células infectadas por um agente agressor (Junqueira & Carneiro
2008; Mesquita-Junior et al., 2010).
Os LT são morfológicamente idênticos, mas funcionalmente distintos, podendo ser
divididos em: LT auxiliar ou helper (LTh), LT supressor (LTs) e LT citotóxico (LTc). Todos
esses subtipos de LT apresentam uma caraterística em comum que é a presença dos receptores
TCR e CDR3 em sua superfície, entretanto, cada subtipo de LT desencadeia uma função
específica. Os LTh estão diretamente relacionados com a resposta imunológica desencadeada
contra patógenos intra e extracelulares e apresentam em sua superfície um receptor
denominado de CD4 (Nikolich-Zugich et al., 2004; Mesquita-Junior et al., 2010).
Os LTh podem desencadear dois tipos de resposta imunológica, a do tipo Th1 e a Th2.
A resposta do tipo Th1, ocorre quando os LTh são capazes de produzir citocinas, como INF-γ
29
e IL-12. Estas citocinas pró-inflamatórias promovem a ativação dos macrófagos, aumentando
a produção de NO e ERO, radicais importantes no processo de eliminação de patógenos
intracelulares. A secreção de IL-4 e IL-10 pelos LTh induzem outro tipo de resposta
imunológica, a resposta imunológica humoral do tipo Th2, estabelecida em processos
alérgicos e contra patógenos extracelulares (Nikolich-Zugich et al., 2004; Mesquita-Junior et
al., 2010; Streeck et al., 2013; Youngblood et al., 2013).
A ausência da ativação dos LT é essencial para o desenvolvimento e proliferação de
patógenos, fator este que resulta no estabelecimento de infecções diversas. O protozoário
Leishmania sp. é um exemplo de patógeno que consegue estabelecer a infecção através da
inativação dos LT. Durante a infecção, este parasito pode realizar um equilíbrio entre os tipos
de resposta imunológica, o “paradigma Th1/Th2”, neste caso, o paciente consegue alcançar a
cura espontânea ou terapêutica, porém a espécie L. (L.) amazonensis é capaz de induzir uma
resposta predominatemente do tipo Th2, dificultando uma possível cura terapêutica e sendo a
causa das constantes recaídas (Silveira et al., 2004).
A inativação da resposta do tipo Th1 impedindo que os macrófagos sejam ativados
está relacionada com a intença secreção de IL-10 induzida pelo parasito. A IL-10 está
diretamente ligada com a manuntenção da infecção, pois foi mostrado que camundongos IL-
10 -/- infectados com L. major conseguiram chegar à cura da doença sem o auxílio de
terapêutica (Kling & Körner, 2013).
A IL-10, IL-4 e outras citocinas Th2 conseguem silenciar a resposta microbicida dos
macrófagos, impedindo a geração de NO e ERO, permitindo a proliferação das formas
amastigotas no interior destes fagócitos, favorecendo assim a infecção e permitindo que esses
parasitos infectem outras células fagocíticas ou outros flebotomíneos (Maurer et al., 2009).
1.6.2 Granulócitos
Os granulócitos são um grupo de células sanguíneas que apresentam grande diferença
em relação a sua função e morfologia tendo origem a partir de uma unidade formadora de
colônia grânulo-monocítica (UFC-GM), e são classificados em três tipos celulares:
neutrófilos, eosinófilos e basófilos (Mayani et al., 2007). Os neutrófilos apresentam em seu
citoplasma um número variável de lóbulos (dois a cinco) unidos por ponte de
heterocromatina. Estas células são as primeiras a migrarem para o local da infecção,
realizando o processo de quimiotaxia. Os neutrófilos são fagócitos profissionais e apresentam
em seu citoplasma grânulos que podem ser específicos ou azurófilos, e apresentam enzimas
30
que degradam agentes patogênicos (Falcão & Calado, 2001; Dale et al., 2008; Cruvinel et al.,
2010).
Os neutrófilos tem uma curta vida na circulação sanguínea, que varia de 6 a 10 horas,
sendo que a maioria morre na circulação, não participando do processo de defesa do
organismo. A vida útil dos neutrófilos aumenta após a sua migração para o tecido, podendo
alcançar até dois dias, sendo que após este período entram em apoptose, para assim evitar
intensas reações inflamatórias. Os neutrófilos são capazes de eliminar microrganismos
invasores com sucesso pela fagocitose, utilizando enzimas proteolíticais e radicais tóxicos,
entretanto, estes fagócitos não conseguem desencadear a eliminação do protozoário
Leishmania sp., permitindo a sua permanência no interior do citoplasma da célula. Em
contrapartida, o protozoário consegue prolongar a vida útil destes fagócitos para 2-3 dias,
inibindo a via de caspase-3 de ativação da apoptose. Porém, após 2-3 dias os neutrófilos
começam a sofrer apoptose e expressar em sua superfície a fosfatidilserina (FS), e as
promastigotas do parasito emitem sinais quimiotáticos para estimular a migração de
macrófagos, que por sua vez ao localizarem as células apoptóticas realizam a fagocitose, e
assim, acabam se infectando com os parasitos Leishmania, que estavam no interior dos
neutrófilos (Castellano, 2005; Appelberg, 2007).
1.6.3 Monócitos
Os monócitos são células pertencentes ao sistema de fagócitos mononucleares e
constituem cerca de 3 a 8% dos leucócitos presentes no sangue. Apresentam núcleo em forma
de rim ou ferradura, citoplasma não volumoso, contendo finas granulações (Dickhout et al.,
2011).
Os monócitos constituem um grupo de células bem heterogêneas, sendo divididos em
subgrupos, levando em consideração seus marcadores de superfície CD14 e CD16. Assim, em
função da expressão destes marcadores, os monócitos se dividem em: clássicos,
intermediários e não clássicos. Existem trabalhos mostrando que os monócitos também são
caracterizados pela presença de outro marcador de superfície, o Ly-6C, que é encontrado
principalmente na superfície celular dos granulócitos (Geissmann et al., 2010). Os monócitos
que expressam em sua membrana o Ly-6C (monócitos inflamatórios GR1+) são recrutados
mais rapidamente para o local da infecção e sofrem o processo de diferenciação e ativação
celular (Figura 7). Esses monócitos diferenciados permanecem no local da inflamação por um
31
período mais longo que os neutrófilos, sendo eficazes na eliminação do agente agressor graças
ao aumento da fagocitose, o qual estimula a liberação de citocinas, a produção de ERO e NO
(Dale et al., 2008; Geissmann et al., 2010; Heitbrock et al., 2010; Saha & Geissmann., 2010).
Por outro lado, os monócitos que não expressam em sua superfície a proteína Ly-6C, não são
recrutados no início da infecção e não estão associados com o desenvolvimento do processo
inflamatório (Figura 7) (Heitbrock, 2007; Geissmann et al., 2010).
Os monócitos inflamatórios expressam em sua superfície uma maior quantidade da
proteína CD16 em relação à proteína CD14. Estes monócitos (CD14+CD16
++), chamados de
monócitos não clássicos, são essenciais no combate de patógenos intracelulares,
principalmente por serem capazes de secretar altas quantidades de citocinas pró-inflamatórias
e induzirem a migração de células de defesa para o local da infecção (Heitbrock, 2007).
Gonçalves et al. (2011) demonstraram a importância destas células no combate de parasitos
intracelulares. Neste estudo, foi observado que monócitos não clássicos conseguiam migrar
para o local da infecção e promover a eliminação do protozoário L. major através de uma
elevada produção de ERO. Em contrapartida, neutrófilos e macrófagos presentes no local da
infecção não foram capazes de eliminar o protozoário.
Figura 7: Processo de diferenciação de monócitos a partir de uma Célula tronco
hematopoiética (CTH), que origina o precursor linfoide (PL) e mielóide (PM), este último
poderá se direfenciar em monócitos. Os monócitos podem se diferenciar em macrófagos ou
células dendríticas. Os monócitos inflamatórios são capazes de migrar para o local da infecção,
promovendo a eliminação dos patógenos, e expressam em sua superfície a proteína Ly-6c.
Precursor de mononucleares (PMo), precursor de células dendríticas (PCD), pré-células
dendríticas (Pré-CD), macrófagos (MØ), células supressoras derivadas da linhagem mielóide
(CSDM) e CD que produzem mediadores inflamatórios (CDTIP).
Fonte: Figura adaptada de Geismann et al. (2010).
CD
tip
PMo
32
Os monócitos são células circulantes e indiferenciadas que só completam seu estado
de maturação quando chegam aos diferentes tecidos do organismo. Para que ocorra a
diferenciação e poder permanecer circulando na corrente sanguínea necessitam da presença de
um fator de crescimento, o Fator Estimulante de Colônia de Macrófagos (M-CSF) (Auffray et
al., 2009).
Após três dias circulando no sangue, os monócitos iniciam o processo de migração
para os diversos tipos de tecidos, para assim, se diferenciarem em macrófagos ou CD. Estes
macrófagos recebem denominações e funções diferenciadas dependendo do tipo de tecido que
se localizarão (Figura 8) (Mosser & Edwards, 2008; Randolph et al., 2008).
1.6.4 Células Dendríticas
As CD são fagócitos mononucleares e células apresentadoras de antígenos (APC),
pertencente ao sistema imune inato. Estas células tem a capacidade de promover a ativação
dos LT desencadeando assim o início da resposta imune (Steinman et al., 1975; Cella et al.,
1997; Geissmann et al., 2010).
As CD são originadas a partir dos precursores mielóides, e necessitam de citocinas
como a IL-4, TNF-α e do Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-
CSF) para assim sofrerem o processo de proliferação e maturação celular (Inaba et al., 1992;
Sato, 2010).
Figura 8: a) Processo de diferenciação e maturação dos monócitos, resultando na
diferenciação em macrófagos nos tecidos. b) As diferentes denominações dos macrófagos nos
vários tecidos do organismo. Figura adaptada de Mosser & Edwards (2008).
CTH – Célula tronco hematopoiética, UFC-GM - Unidade formadora de colônia grânulo-
monocítica, UFC-M - unidade formadora de colônia monocítica.
a
b
CTH UFC-GM UFC-M Monoblasto Pró-monócito
Medula óssea
33
As CD constituem um grupo de células heterogêneas que diferem nos tecidos em
diversos aspectos como localização, função e fenótipo dos marcadores de superfície
(Geissmann et al., 2010). As células precursoras, conhecidas como pré-células dencríticas,
são encontradas circulando pelos vasos linfáticos e sanguíneos, já as CD imaturas são
residentes em variados tipos de tecidos, apresentando nessas localidades atividade fagocítica,
função importante na destruição de patógenos. Nos tecidos, as CD ainda estão imaturas, não
sendo capazes de estimular as células T. Entretanto, durante a invasão do organismo por meio
de qualquer patógeno, as CD, sofrem o processo de maturação/ativação tornando-se capazes
de apresentar antígenos aos LT. As CD maduras são encontradas nos tecidos linfóides
secundários, onde produzem uma quantidade elevada de citocinas (Cella et al., 1997;
Banchereau & Steinman, 1998; Geissmann et al., 2010; Sato, 2010).
Diferentemente dos outros fagócitos mononucleares, as CD expressam diferentes
marcadores de superfície, podendo destacar o CD1a, CD11c, CD40, CD80, CD83, CD205, e
não apresentam em sua superfície celular o CD14, sendo um excelente marcador de exclusão
para este tipo celular (Reis, 2008).
1.6.4.1 Interação Leishmania sp. – Células Dendríticas
Trabalhos na literatura vêm mostrando que a infecção pelo protozoário Leishmania sp.
pode ser dividida em três fases: A primeira fase é caracterizada por uma invasão silenciosa
das formas promastigotas infectando os macrófagos, na segunda fase da infecção ocorre o
recrutamento das células do sistema inume inato para o local da infecção, e por fim, a terceira
fase culmina com o recrutamento das CD e células T, caracterizando a fase crônica da doença
(Von Stebut, 2007).
O recrutamento das CD pode ser induzido por vários fatores, como quimiocinas,
citocinas e mediadores químicos derivados dos mastócitos. As CD presentes no local da
infecção tendem a secretar grandes quantidades de IL-12, interleucina pró-inflamatória
responsável pelo recrutamento de LT CD4+ e CD8
+, ocasionando uma redução do tamanho da
lesão (Von Stebut, 2007; Liu & Uzonna, 2012).
Ao contrário dos macrófagos, as CD não utilizam o receptor de manose CR3 para
reconhecer o parasito e posteriormente realizar fagocitose, este tipo celular utiliza o receptor
FCC (RFCC). Existem evidências de que a utilização do RFCC seja o responsável por
permitir que as CD liberem IL-12 em resposta a infecção (Kautz-Neu et al., 2012).
34
As CD parasitadas com as formas amastigotas de Leishmania sp. ainda conseguem
aumentar a expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I, II e
cofatores, entretanto, nestas células é notada uma diminuição da expressão da molécula E-
caderina, fazendo com que as células soltem do epitélio e se direcionem aos linfonodos, para
assim apresentarem antígenos do parasito para as células do sistema imune (Castellano,
2005).
1.6.5 Macrófagos
Os macrófagos são células fagocíticas originadas a partir da migração dos monócitos
da corrente sanguínea para os diferentes tipos de tecidos do organismo. Durante e após o
processo de diferenciação celular, os macrófagos expressam proteínas em sua superfície,
sendo algumas exclusivas destas células, enquanto outras são expressas também em outros
tipos celulares. A proteína F4/80 é uma molécula expressa somente na superfície dos
macrófagos, sendo importante no processo de adesão, migração e sinalização celular (Gordon,
2003; Khazen et al., 2005). A proteína CD11b/MAC-1 é encontrada na superfície celular dos
LB, LT, das CD, dos granulócitos, macrófagos, e em grande quantidade nos monócitos.
Assim como a molécula F4/80 a proteína CD11b também está envolvida com o processo de
adesão celular e migração para o local da invasão de um agente agressor (Brom et al., 1995;
Mcknight & Gordon, 1998).
Várias mudanças são observadas durante o processo de diferenciação de monócitos em
macrófagos, tais como: alteração da expressão de proteínas de superfície, aumento do
tamanho celular, aumento do número de organelas e indução da autofagia (Zhang et al., 2012;
Huber et al., 2014). Autofagia é um processo essencial na diferenciação dos monócitos em
macrófagos. Existem relatos de que o bloqueio da via autofágica direciona os monócitos para
a morte celular programada, impedindo a sua maturação e diferenciação em macrófagos
(Zhang et al., 2012).
Duas características importantes são encontradas em uma célula autofágica, a presença
do autofagossoma e a marcação positiva para a proteína LC3 (Arroyo et al., 2014). A
proteína LC3 é uma subunidade da cadeia leve 3 das proteínas associadas a microtúbulos 1a e
2b, apresentando três isoformas (LC3A, B e C). Duas formas da proteína LC3 podem ser
encontradas, a forma citosólica (LC3-I) e a forma lipidada (LC3-II). Após a ativação do
processo autofágico a LC3-I é clivada e sofre um processo de lipidação com
fosfatidiletanolamina originando a LC3-II, posteriormente a este processo de clivagem a LC3-
35
II irá se associar a membrana do autofagossoma, podendo ser encontrada associada a essa
estrutura até o momento da fusão do autofagossoma com os lisossomos (Mei et al., 2013;
Arroyo et al., 2014; Mukhopadhyay et al., 2014).
A autofagia é um mecanismo importante para o estabelecimento da homeostase, pois
está relacionada com a renovação celular, apresentação de antígenos, eliminação de bactérias
intracelulares e proriferação/maturação de células como os monócitos, permitindo que estes
fagócitos completem seu processo de diferenciação em macrófagos, contribuindo assim para o
estabelecimento de uma resposta imune eficaz, pois os macrófagos após completarem seu
processo de ativação tornam-se capazes de proteger o organismo contra diferentes patógenos
intracelulares (Mizushima et al., 2008; Oh & Lee, 2012; Zhang et al., 2012; Mei et al., 2013).
1.6.5.1 Processo de ativação dos macrófagos
A ativação do macrófago pode ser classificada em tipo I (M1), tipo II (M2) e tipo III.
A M1 é induzida por citocinas pró-inflamatórias (INF-γ, IL-1, IL2, IL-6), que são
responsáveis por estimular a liberação de várias substâncias tóxicas, dentre elas o NO e as
ERO, ânions superóxidos (O2-), radicais hidroxila (OH
-), peróxido de hidrogênio (H2O2) (Das
et al., 2001; Finaud et al., 2006; Stempin & Cerban, 2007; Mosser & Edwards, 2008).
A formação de ERO está ligada a um complexo enzimático denominado nicotinamida
adenina dinucleotídeo reduzida (NADPH). Este processo decorre a partir de um estímulo
externo geralmente originado pela invasão de algum agente agressor. Após a invasão, o
complexo une as suas sete subunidades rapidamente, se ativando, e assim formando as ERO
(Figura 9) (El – Benna et al., 2005; Verreck et al., 2006).
O NO é outra substância tóxica liberada pelos macrófagos ativados. Este radical de
nitrogênio é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) que utiliza como substrato o
aminoácido L-arginina, originando o NO e L-citrulina (Figura 9) (Marletta, 1993). O NO é
um importante mediador inflamatório no combate de agentes agressores, dificultando a sua
proliferação (Rosseti, 2009).
A produção de NO pode ser induzida por estímulo do INF-γ, que após se ligar a
receptores específicos consegue realizar a ativação da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS). A iNOS também é ativada quando ocorrem infecções por diversos patógenos, quando
ativa consegue produzir grandes quantidades de NO, apresentando uma potente ação
microbicida (Winberg et al., 2007; Horta et al., 2012).
36
Macrófagos do tipo 1 produzem grande quantidade de O2- e NO, estes radicais juntos
podem formar o peróxinitrito (ONOO-), um radical livre bastante tóxico, apresentando uma
potente ação microbicida capaz de promover a morte de patógenos (Horta et al., 2012).
Existem relatos que o ONOO- consegue eliminar protozoários intracelulares com maior
eficiência do que as ERO e NO. Foi demonstrado que esse radical livre consegue promover o
aumento da temperatura e diminuição do pH dentro do vacúolo parasitóforo, desencadeando a
morte das formas amastigotas de Leishmania sp. (Van Assche et al., 2011).
Outro processo de ativação descrito é o alternativo ou M2, que está relacionado com a
imunossupressão, sendo desencadeado na presença de citocinas, como a IL-10, IL-13 e pelo
fator de transformação de crescimento β (TGF-β). Durante o processo M2 não é observada
uma elevação na produção de ERO e NO (Gordon, 2003; Mosser, 2003).
Por fim, a ativação do tipo III, é uma resposta imune anti-inflamatória, que resulta na
liberação de citocinas como IL-4 e IL-10, sintetizadas pelos LTh decorrente de um estímulo
Figura 9: Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) a partir de estimulo induzido
por Leishmania. O estresse oxidativo se inicia com a ativação da enzima nicotinamida adenina
dinucleotídeo reduzida (NADPH) e Óxido nítrico sintase induzida (iNOS). Essa ativação leva
ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e óxido nítrico (NO)
respectivamente, radicais fundamentais no processo de desenvolvimento do estresse oxidativo
e responsáveis por eliminação de patógenos intracelulares. Figura adaptada de Van Assche et
al. (2011).
L-arginina L-citrulina
LPS, INFy, IL-1..
Estresse oxidativo
LPS, INFy, TNFα....
Patógenos
37
dos macrófagos. Nesse processo é observada a liberação de TGF-β, citocina capaz de
promover uma regulação negativa sobre o INF-γ, impedindo liberação de ERO e NO (Verreck
et al., 2006).
1.7 INTERAÇÃO PARASITO – CÉLULA ALVO
Os macrófagos são células alvo do protozoário Leishmania sp, pois o parasito, na
forma amastigota consegue se multiplicar no interior do vacúolo parasitóforo (Shio et al.,
2012; Kling & Körner, 2013).
No momento do reconhecimento do parasito no organismo, os macrófagos sofrem
várias alterações morfológicas e funcionais tornando-se “células efetoras”, fagocitando o
parasito e gerando no vacúolo parasitóforo um ambiente hostil. Entretanto, mesmo
apresentando estas condições inóspitas tais como, pH ácido, elevada temperatura e a liberação
de substâncias tóxicas no fagolisossomo, o parasito consegue sobreviver na célula hospedeira
e, em um período que varia de 12-24h, as promastigotas metacíclicas começam a entrar em
autofagia, iniciando o processo de diferenciação em amastigota. As amastigostas se replicam
por divisão binária podendo posteriormente infectar outros macrófagos ou células do sistema
imune estabelecendo um processo infeccioso (Kiel, 2010; Van Assche et al., 2011).
A patogenia das leishmanioses pode ser variada dependendo do estado imunogenético
do indivíduo e da espécie de Leishmania causadora da infecção, resultando as diversas formas
clínicas observadas na LTA (Silveira et al., 2008).
Na LTA a resposta imunológica irá variar de acordo com a espécie causadora da
infecção. A L. (L.) amazonensis é responsável por desencadear formas clínicas com resposta
imune não reativa, permitindo o desenvolvimento do parasito no interior dos macrófagos. Em
contrapartida, a espécie L. (Viannia) braziliensis, causadora das formas clínicas LM, LCL e
LCDB, é responsável por induzir uma resposta imune reativa, ou seja, não inibi a resposta
microbicida dos macrófagos, promovendo assim uma hipersensibilidade celular. Uma outra
característica peculiar da infecção causada pela espécie L. (V.) braziliensis é a presença de
poucas amastigotas infectando os macrófagos e um grande infiltrado de linfócitos nas lesões
(Silveira et al., 2004; 2008; Carvalho et al., 2012).
O protozoário apresenta em sua superfície algumas moléculas essenciais para o
sucesso da infecção, como o LPG, FS e a glicoproteína de superfície de 63kDa (GP63). Suas
funções ainda não foram completamente elucidadas, mas já se sabe que o LPG durante o
processo de interação consegue impedir a ligação do sistema complemento ao parasito.
38
Existêm evidências de que o silenciamento da resposta do macrófago, assim como a não
ligação do sistema complemento ao parasito e a sobrevivência das formas amastigotas no
interior do fagolisossomo seja devido à presença da glicoproteína GP63 (Maurer et al., 2009;
Corrales et al., 2010)
É importante a investigação dos mecanismos utilizados pelo parasito para evadir a
resposte imune do hospedeiro, e também é muito importante entender melhor as funções
específicas das moléculas presentes em sua superfície, pois acredita-se que essas respostas
sejam o direcionamento para o desenvolvimento de uma vacina ou de medicamentos mais
eficazes (Corrales et al., 2010; Alavi-Naini et al., 2012; Horta et al., 2012).
1.8 TRATAMENTO DAS LEISHMANIOSES
A OMS recomenda a utilização dos Sb+5
como droga de primeira escolha para o
tratamento das leishmanioses. Dois tipos de Sb+5
podem ser empregados no tratamento desta
doença, porém apenas o Antimoniato de Meglumina, conhecido comercialmente como
Glucantime® é fabricado no Brasil. A dose utilizada no tratamento é de 20 mg/kg, podendo
ser administrado por via sistêmica, por via parenteral ou intravenosa, sendo possível também
realizar sua aplicação diretamente nas lesões (Mcgwire & Satoskar, 2014).
Os Sb+5
apresentam vários efeitos colaterais principalmente quando administrado por
via sistêmica, os pacientes medicados geralmente apresentam náuseas, vômito, diarreia, cólica
abdominal, erupções cutâneas, dentre outros sintomas. Os Sb+5
são contraindicados para
mulheres grávidas, devido à possibilidade do medicamento causar dano ao feto. Frente a essas
problemáticas e o surgimento de parasitos resistentes aos Sb+5
, se faz necessária à utilização
de drogas de secunda escolha, como a ANF-B e as pentamidinas (Frézard et al., 2009; Croft
& Olliaro, 2011).
A ANF-B apresenta uma boa resposta no tratamento da leishmaniose visceral (LV) na
India, sua taxa de cura é em torno de 90%, sendo administrada por apenas 15 dias na
concentração de 0,75 mg/kg. As taxas de recaídas são baixas, observadas na maioria das vezes
em pacientes HIV-positivos. Em contrapartida, a ANF-B apresenta uma grande desvantagem,
visto que o paciente precisa ficar hospitalizado para receber o medicamento e vários efeitos
adversos já foram notificados, porém é o medicamento de primeira escolha para gestantes,
pois não promove nenhum efeito adverso no feto (Pavli & Maltezou, 2010).
39
As pentamidinas são drogas de segunda escolha com ótima ação contra as espécies L.
panamensis e L. guyanensis, causadoras de leishmaniose no novo mundo. A dose utilizada no
tratamento é de 300 mg/kg, e sua aplicação é realizada apenas uma vez na semana. Assim,
como os outros agentes leishmanicidas, as pentamidinas apresentam uma série de
complicações para os pacientes, podendo causar problemas hepáticos, renais, hipo e
hiperglicemia (Bailey & Lockwood, 2007; Pavli & Maltezou, 2010).
Ainda existem fármacos que podem ser administrados por via oral, como a miltefosina
por exemplo. A miltefosina originalmente foi formulada para ser utilizada como anti-
neuplásico, porém vêm-se mostrando um fármaco bem promissor no tratamento das
leishmanioses, a duração do tratamento é de 28 dias e a dose utilizada pode variar de acordo
com a idade e peso do paciente (Mcgwire & Satoskar, 2014). Na Índia, pode ser utilizada em
associação com a paramomicina no tratamento da LV e apresenta uma potente ação sobre as
diferentes espécies causadoras de leishmaniose do novo mundo, não sendo, entretanto,
indicada para o tratamento de formas clínicas causadas pela espécie L. (V.) brazilienses, pois
não apresenta uma boa resposta frente a este parasito. A miltefosina é uma droga bastante
tolerável, manifestando poucos efeitos colaterais, entretanto é contra indicado para grávidas,
devido a sua ação teratogênica (Pavli & Maltezou, 2010; Tiuman et al., 2011; Mcgwire &
Satoskar, 2014).
Novas terapias, como tratamento tópico com formulações de pomadas e géis contendo
paramomicina e imidazóis antifúngicos, crioterapia, termoterapia, além do uso de
imunomoduladores associados a agentes leishmanicidas, nanofármacos, medicamento no
interior de lipossomas e a utilização de produtos naturais vêm se mostrando bastantes eficazes
na cicatrização das lesões na maioria dos pacientes, sendo assim, um tratamento bem rentável
para as leishmanioses, principalmente por não apresentarem efeitos adversos (Alavi-Naini et
al., 2012).
1.8.1 Mecanismo de ação dos agentes leishmanicidas
Os Sb+5
já são utilizados no tratamento das leishmanioses por muito tempo, sua
eficácia na eliminação do parasito é considerável, proporcionando a cura na maioria dos
pacientes, porém, ainda não se sabe ao certo como este medicamento consegue promover a
eliminação do parasito. Alguns estudos mostram que os Sb+5
são capazes de interferir no
metabolismo da glicose e ácido graxos das formas amastigotas de Leishmania, outros estudos
40
também mostram que esses fármacos são capazes de induzir a ativação da resposta
microbicida dos macrófagos (Alavi-Naini et al., 2012; Mcgwire & Satoskar, 2014).
Ainda existem dúvidas sobre a forma ativa dos antimoniais, se é a trivalente (Sb+3
) ou
a Sb+5
. Nos estudos iniciais com os antimoniais foi sugerido que a forma Sb+5
era um pró-
fármaco, sendo posteriormente no organismo do paciente convertida para a sua forma ativa, a
Sb+3
. Entretanto, outros estudos sugerem que esta conversão possa está relacionada com a
interação do fármaco com algumas moléculas do organismo (Frézard et al., 2009).
O mecanismo de ação das pentamidinas ainda não foi totalmente elucidado. Existem
relatos que mostram que sua ação é diretamente no protozoário, alterando o potencial de
membrana mitocondrial e desencadeando o desequilíbrio na quantidade de Ca+2
intracelular
(Fidalgo & Gille, 2011; Kappagoda et al., 2011). Em contrapartida, o mecanismo de ação da
ANF-B já é bem descrito, este antifúngico apresenta ação sobre as formas promastigotas e
amastigotas de Leishmania, interferindo na integridade dos ésteres de membrana do parasito,
o ergosterol (Chattopadhyay & Jafurulla, 2011).
Todos os medicamentos citados apresentam uma vantagem que é a afinidade por
estruturas específicas do protozoário, uma característica favorável, pois não causam danos
para as estruturas das células dos pacientes, entretanto, mesmo com todas essas vantagens
ainda apresentam vários efeitos adversos (Mcgwire & Satoskar, 2014).
Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação dos agentes leishmanicidas e vários efeitos
colaterais são notificados, e por estes motivos, o incetivo pela busca de novos medicamentos é
intenso, principalmente por drogas que em baixas doses sejam capazes de proporcionar a
morte do parasito, sem causar danos ao paciente e promover melhora do quadro clínico.
Produtos naturais, principalmente extraídos de plantas, estão se mostrando eficazes contra
agentes infecciosos e parasitários (Tiuman et al., 2011).
Estudos in vitro utilizando extratos de plantas têm mostrado que estes compostos
apresentam muitas características positivas para serem utilizados no tratamento das
leishmanioses. Os estudos ainda são iniciais, porém já são satisfatórios, suas ações são
variadas como: ativação dos macrófagos (Pereira et al., 2005), interferência no crescimento
do parasito (Luize et al., 2005; Laurella et al., 2012; Nogueira et al., 2013) bem como
alterações morfológicas em organelas importantes do patógeno (Delorenzi et al., 2001; Rosa
et al., 2003). Dentre esses extratos, se destaca a planta Physalis angulata L., uma planta
herbácea encontrada em vários países do mundo, e estudos in vitro e in vivo já demonstraram
sua potente ação leishmanicida tanto sobre as formas promastigotas e amastigotas de L. (L.)
amazonensis (Guimarães et al., 2009; Nogueira et al., 2013).
41
1.9 GÊNERO Physalis
O gênero Physalis pertence à família Solanaceae, e abrange cerca de 120 espécies, das
quais 70 podem ser encontradas apenas no México (Li et al., 2008), e as demais em regiões
tropicais da África, Ásia, América Central e do Sul (Agata et al., 2010). O gênero Physalis é o
mais desenvolvido da família Solanaceae, quando se evidencia o seu nível de oxidação
biogenética. No gênero Physalis, são encontradas substâncias polioxigenadas denominadas
vitaesteróides que possuem sua função lactônica em C-26, gerando assim oito grupos
estruturais distintos os quais são: Vitanolidos, vitanolidos modificados, vitafisalinas,
acnistinas, ixocarpalactonas, perulactonas e as fisalinas (Tomassini et al., 1999), sendo as
fisalinas e o vitanolidos os compostos mais abundantes (Ray & Gupta, 1994).
Plantas do gênero Physalis são conhecidas por seu valor etnofarmacológico e são
utilizadas na medicina tradicional por todo o mundo (Hawkes et al., 1991). Na região
Amazônica, pode-se destacar a planta Physalis angulata (Figura 10). A Physalis angulata é
uma planta herbácea comum e amplamente distribuída em regiões tropicais e subtropicais do
mundo, sendo na região Amazônica muito utilizada na medicina popular devido seus efeitos
diurético, antitérmico, analgésico, antinociceptivo, anti-inflamatório, para o tratamento de dor
de garganta e abdominal (Lin et al., 1992; Bastos et al., 2006; 2008).
Physalis angulata apresenta inúmeras funções, dentre as quais se incluem sua atuação
nas células de defesa que participam da resposta imune, como os linfócitos e macrófagos. Foi
mostrado por Bastos et al. (2008) a ação inibitória do extrato aquoso da raiz da planta
Physalis angulata (EAPa) sobre a proliferação dos linfócitos, especialmente as células T. Yu
Figura 10: a) Planta Physalis angulata. b) Fruto da planta Physalis angulata.
Fonte: Magalhães, 2005.
b a
42
et al. (2010) mostraram que a fisalina H, uma fisalina purificada de Physalis angulata
apresentou uma ação imunossupressora, impedindo a proliferação dos linfócitos T. Em
relação aos macrófagos, foi mostrado que as fisalinas B, F e G conseguem inibir a produção
de NO em macrófagos previamente estimulados com LPS e INF-y (Soares et al., 2003).
Lee et al. (2009) mostraram a capacidade de Physalis angulata em promover a morte
de células cancerígenas da mucosa oral em decorrência do aumento das ERO. Outro estudo
utilizando a fisalina F também mostrou sua capacidade de promover o aumento das ERO em
células de carcinoma renal humanas, induzindo a morte destas células por apoptose (Wu et
al., 2012).
Bastos et al. (2006) também relataram em seu trabalho a ação antinociceptiva de
Physalis angulata. O tratamento com EAPa promoveu uma redução na dor abdominal
induzida por ácido acético em ratos. Em outro estudo, Bastos et al. (2008) evidenciaram a
ação anti-inflamatória e imunomoduladora do extrato em ratos Wistar, em modelo de
inflamação de bolsa de ar. Neste mesmo estudo foi mostrado que essa substância consegue
inibir a via da enzima ciclooxigenase, não formando assim os derivados do ácido
araquidônico, dentre eles principalmente a prostaglandina E2, o extrato também foi capaz de
interferir na produção do NO e TGF-ß.
Na literatura são mostrados vários trabalhos evidenciando a capacidade de Physalis
angulata em interferir no processo de proliferação de alguns agentes infecciosos, dentre eles
podem ser destacados: Ação microbiana da fisalina B sobre a bactéria Staphylococcus aureus
(Silva et al., 2005), ação antimicobacteriana (Januário et al., 2002), antiplasmodial
(Lusakibanza et al., 2010; Ruiz et al., 2011; Sá et al., 2011) e ação tripanocida (Meira et al.,
2013).
Physalis angulata também apresenta ação leishmanicida, mostrada primeiramente por
Choudhary et al. (2006) onde foi observado que a fisalina H apresentou uma potente ação
sobre as formas promastigotas de L. major. Guimarães et al. (2009) mostraram também uma
potente ação leishmanicida das fisalinas B e F in vitro e in vivo sobre as formas amastigotas
do protozoário L. (L.) amazonensis e L. major. Recentemente, foi mostrada pela primeira vez
sua ação sobre as formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (Nogueira et al., 2013).
Resultados obtidos pelo nosso grupo (Laboratório de Parasitologia-ICB UFPA)
demonstraram ação de EAPa sobre o protozoário L. (L.) amazonensis e macrófagos
peritoneais. EAPa foi capaz de promover uma redução do número de promastigotas de L. (L.)
amazonensis ao longo do tempo de cultivo, e a redução no número de amastigotas no interior
do macrófago tratado. Por Microscopia Eletrônica de Transmissão foi observado que as
43
promastigotas tratadas apresentaram duplicação do cinetoplasto, a presença de múltiplas
vesículas na bolsa flagelar e estruturas apoptóticas, ainda foi possível observar por
microscopia óptica, parasitos com dois flagelos, indicando alteração no ciclo celular (Silva,
2013).
Os macrófagos peritoneais tratados com 100 µg/mL de EAPa apresentaram alterações
morfológicas como: aumento do padrão de espraiamento celular, desorganização do
citoesqueleto, aumento da vacuolização e de projeções citoplasmáticas, e foi observado uma
elevação da produção de O2-, indicando ativação celular (Silva, 2013). Assim, com base no
trabalho realizado por Silva (2013), da inexistência de trabalhos mostrando ação deste extrato
sobre as células que participam da resposta imunológica durante a infecção com o protozoário
Leishmania e o padrão de morte celular desencadeado para induzir a morte do parasito,
buscou-se determinar a ação de EAPa sobre as células da medula óssea e o padrão de morte
celular envolvido na morte deste protozoário.
44
1.10 OBJETIVOS:
1.10.1 Objetivo geral
Estudar o efeito imunomodulador do extrato aquoso da raiz da planta Physalis
angulata (EAPa) e sua ação sobre o protozoário Leishmania (Leishmania) amazonensis.
1.10.2 Objetivos específicos
1. Avaliar a viabilidade das células da medula óssea de camundongos após
tratamento in vitro com EAPa;
2. Analisar a morfologia das células da medula óssea tratadas in vitro com EAPa;
3. Avaliar o processo de autofagia nas células tratadas com EAPa;
4. Avaliar o processo de diferenciação celular pela detectação de marcadores de
superfície em células da medula óssea tratadas com EAPa;
5. Avaliar a resposta microbicida das células da medula óssea tratadas com EAPa;
6. Analisar a ação leishmanicida de EAPa sobre as células da medula óssea infectadas
com L. (L.) amazonensis;
7. Avaliar a produção de ERO em promastigotas de L. (L.) amazonensis tratadas com
EAPa.
8. Determinar o padrão de morte celular em promastigotas de L. (L.) amazonensis
tratadas com EAPa.
45
Figura 11: Fluxograma mostrando as atividades realizadas para avaliar a ação de EAPa
sobre as células da medula óssea de camundongos.
.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 FLUXOGRAMA
46
Figura 12: Fluxograma das atividades realizadas para avaliar a ação de EAPa sobre o
protozoário Leishmania (Leishmania) amazonenis.
.
47
2.2 PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DA PLANTA
O EAPa foi preparado e cedido pela Drª Gilmara Bastos do Laboratório de
Neuroinflamação do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará
(UFPA). O extrato foi preparado como descrito por Bastos et al. (2006). As raízes da planta
de Physalis angulata utilizadas para a preparação do EAPa foram coletadas no estado do
Pará. A exsicata (ref. 653) foi depositada no Herbário João Murca Pires do museu Emílio
Goeldi. As raízes (150g) foram lavadas em água corrente, e posteriormente foi realizada a
obtenção do extrato, diluindo as raízes em 700 mL de água Milli-Q. Com o término da
extração a solução resultante foi concentrada para 100 mL. O extrato foi liofilizado,
produzindo 2,712 g do extrato. O extrato liofilizado foi diluído em DMEM (Gibco®) ou
RPMI Medium 1640 (Gibco®) obtendo uma solução estoque de 1 mg/mL.
2.3 OBTENÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
Células da medula óssea foram obtidas a partir de fêmures de camundongos albinos
(Mus musculus) machos com 6-10 semanas de idade. Os animais foram mortos em câmara de
CO2 (Insight®), os fêmures dissecados no fluxo laminar e lavados com solução fosfato salina
(PBS) pH 7.2 estéril. Após a lavagem, os ossos foram mantidos em PBS pH 7.2 estéril à 4ºC.
Em seguida, as elipses dos fêmures foram retiradas com auxílio de pinça e tesoura
esterilizadas (Marim et al., 2010) e a medula removida com uma seringa contendo PBS pH
7.2. Posteriormente, as células foram homogeneizadas, diluídas em DMEM, contadas em
câmara de Neubauer, transferidas para garrafas (TPP) e/ou placas de cultura (TPP) de 12, 24
ou 96 poços contendo ou não lamínulas e incubadas em estufa a 37ºC contendo 5% de CO2.
Os animais foram sacrificados de acordo com as normas do Comitê de Ética (processo nº
BIO086-12 CEPAE/ICB/UFPA). Teste de viabilidade utilizando o corante azul de Tripan a
0,2% foi utilizado para determinar a porcentagem de células viáveis antes da etapa de
plaqueamento celular. Todos os resultados foram obtidos de três experimentos independentes
realizados em triplicata.
2.4 CULTIVO DO PARASITO
As formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis (MHOM/BR/26361) foram
obtidas em meio NNN provenientes do Programa de leishmanioses do Instituto Evandro
48
Chagas, e mantidas em meio RPMI 1640, suplementado com Soro Bovino Fetal (SBF) em
estufa B.O.D (Biological Oxygen Demand) à 27ºC.
2.5 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
2.5.1 Método Thiazolyl Blue (MTT)
O MTT (Sigma) é um sal tetrazolium solúvel em água que é convertido pelas
desidrogenases mitocondriais em cristais azuis de formazan, os quais são insolúveis em água.
Esses cristais por serem impermeáveis às membranas das células viáveis se acumulam no
interior dessas células, sendo posteriormente diluído em DMSO (Fotakis & Timbrell, 2006).
Células da medula óssea foram cultivadas como descrito no item 2.3 em placas de 96
poços e mantidas em cultura por 24, 48, 72 e 96 horas e tratadas com EAPa nas concentrações
de 25, 50 e 100 μg/mL.
Após o término do tratamento, o sobrenadante foi retirado e os poços lavados com
PBS pH 7.2. Logo após a lavagem, foi adicionado 0,5 mg/mL de MTT (Sigma) diluído em
PBS pH 7.2, sendo, posteriormente, incubados à 37ºC em estufa contendo 5% de CO2 por 3
horas. Após o término da incubação foi adicionado 200 μL DMSO em cada poço para
solubilização dos cristais de formazan e a placa foi incubada em agitação por 10 minutos.
Posteriormente, a solução resultante foi lida em leitor de microplacas ELx 800 (BIO-
RAD Model 450 Microplate Reader) a uma densidade óptica de 570 nm. Para o preparo do
controle negativo, as células foram incubadas com solução de 15% de formol em PBS pH 7.2.
Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados expressos em porcentagens.
2.5.2 Detecção do potencial da membrana mitocondrial (JC-1)
O JC-1 (Molecular Probes Invitrogen®) é um marcador fluorescente que mensura o
potencial da membrana mitocondrial (ΔΨ) das células. O ΔΨ é um importante parâmetro da
função mitocondrial utilizado como indicador de viabilidade celular.
O JC-1 possui vantagens sobre outros corantes fluorescentes, pois pode penetrar na
mitocôndria conforme variações no potencial de membrana. Este marcador possui duas
formas conhecidas. O “J- agregados” que coram células viáveis com fluorescência vermelha
intensa e a forma monomérica que se faz presente em células com baixo ΔΨ e apresenta
fluorescência verde.
49
Células da medula óssea foram cultivadas em placas de 12 poços e submetidas ao
tratamento por 96 hora com EAPa na concentração de 100 μg/mL. Após o tratamento, os
poços foram raspados, as células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e
ressuspendidas em solução de PBS pH 7.2. Uma nova centrifugação a 1500 rpm por 10
minutos foi realizada e as células foram incubadas por 30 minutos com 1 µM de JC-1 a 37°C.
Passando o tempo da incubação, as células foram centrifugadas e ressuspendidas em PBS pH
7.2. A análise foi feita utilizando um citômetro de fluxo BD FACSCantoII TM em
comprimento de onda de excitação de 490 e 546 nm, sendo que os monômeros de JC-1
emitem a 529 nm e os J-agregados a 590 nm. Os dados foram obtidos utilizando o software
WinMDI versão 2.9.
2.5.3 Detecção de apoptose e necrose em células da medula óssea tratadas com EAPa
Para a detecção do processo de apoptose e necrose das céluas da medula óssea tratadas
com EAPa foram utilizados os marcadores fluorescentes Anexina V-FITC (Molecular Probes
Invitrogen®) e Iodeto de Propídio (IP) (MP Biomedicals) respectivamente.
Células da medula óssea foram cultivadas em placas de 12 poços e submetidas ao
tratamento por 96 horas com EAPa na concentração de 100 μg/mL. Após o tratamento, estas
células foram centrifugadas, lavadas com PBS pH 7.2 e em seguida incubadas por 30 minutos
com 10 μL de Anexina V-FITC, diluída em tampão de ligação (10mM de Hepes pH 7.4,
150mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1mM de MgCl2 e 1,8mM de CaCl2) e posteriormente
incubadas com 5 μg/mL de IP (Sigma), obtido de um solução estoque de 1mg/mL, por 30
minutos. Por fim, as células foram novamente lavadas com PBS pH 7.2 e a leitura realizada
em citômetro de fluxo. Os dados foram obtidos utilizando o software WinMDI versão 2.9.
2.6 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa
2.6.1 Microscopia Óptica
Células da medula óssea foram cultivadas conforme descrito o item 2.3, e divididas
em três grupos (Grupo controle sem tratamento, grupo de células tratadas com 100 μg/mL de
EAPa e grupo de células tratadas com 100 nM de M-CSF-Sigma). A mesma concentração de
50
EAPa e M-CSF diluídos em DMEM e SBF foram adicionadas às culturas a cada 24 horas até
o término de cada ensaio. Após o término do tratamento (24, 48, 72 e 96 horas), as células
aderentes foram fixadas em solução contendo 3% de paraformaldeído em tampão PHEM 0,1
M, pH 7.2 por um período de 30 minutos a temperatura ambiente e, posteriormente coradas
com Giemsa.
A coloração foi feita com Giemsa, diluído a 25 % em tampão fosfato pH 8.0, durante
25 minutos à temperatura ambiente. Após esse período, duas lavagens com água destilada
foram realizadas e posteriormente as lamínulas foram incubadas em estufa a 37ºC, em um
processo de secagem, e por fim, foram montadas em lâminas de vidro, tendo Entellan® como
meio de montagem.
As lamínulas foram montadas com Entellan® e posteriormente foram contadas 200
células por lamínula em microscópio óptico Olympus BX41, sendo a captura das imagens
realizadas em microscópio Axiophot Zeiss com câmera digital Zeiss acoplada. Foram
analizados alguns tipos celulares como linfócitos, mononucleares e PMN, conforme descrito
por Cesar et al. (2008), apresentando algumas alterações.
2.6.2 Análise morfométrica (morfometria)
Com a finalidade de verificar se ocorreu aumento da área celular das células tratadas
com EAPa foi realizada a análise morfométrica. A morfometria é uma ferramenta
indispensável para analisar a ocorrência ou não do aumento da área celular, tendo em vista,
que a célula indiferenciada apresenta uma área citoplasmática inferior a da célula
diferenciada/madura (Sokol et al, 1987). Células da medula óssea foram obtidas conforme
descrito no item 2.3 e processadas para microscopia óptica como descrito no item 2.6.1.
Foram utilizadas 10 imagens obtidas de campos aleatórios, somando um total de 100 células.
A análise morfométrica foi realizada utilizando o programa image J, mensurando a área total
do citoplasma celular das células em estudo. Como controle negativo, foram utilizadas células
da medula sem tratamento, cultivadas por 96 horas e como controle positivo, células da
medula óssea foram tratadas com M-CSF na concentração de 100 nM por 96 horas.
2.6.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As células da medula óssea foram cultivadas em garrafas de cultura como descrito no
item 2.3 e tratadas por 96 horas com EAPa na concentração de 100 μg/mL. Posteriormente, as
51
células aderidas foram fixadas em uma solução contendo 2,5% de glutaraldeído, 4% de
paraformaldeído, 2,5% de sacarose, em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH7.2. As células
foram lavadas três vezes em tampão cacodilato 0.1 M e incubadas em solução com 1%
tetróxido de ósmio, ferrocianeto de potássio 0,8% por 1 hora.
As células foram lavadas três vezes em tampão cacodilato 0,1 M e desidratadas em
série crescente de acetona durante 10 minutos (50%, 70%, 90% e 2x em 100%), e mantidas
em temperatura ambiente. Após desidratação, as células foram lentamente impregnadas em
resina Epon (2:1, 1:1 e 1:2 - acetona 100%: Epon). Posteriormente, o material foi colocado
em Epon puro por 6 horas e depois polimerizado a 60ºC por 48 horas. Os blocos foram
cortados em ultramicrótomo (Leica EM UC6) e os cortes foram contrastados em acetato de
uranila 5% e citrato de chumbo e observados em Microscópio Eletrônico de Transmissão
LEO 906 E. Como controle negativo foram utilizadas células obtidas da medula óssea de
camundongos sem tratamento. Como controle positivo, células da medula óssea foram
tratadas com M-CSF na concentração de 100 nM por 96 horas.
2.7 DETECÇÃO DA PROTEÍNA LC3B
Com a finalidade de avaliar se EAPa estava induzindo o processo de autofagia na
células da medula óssea foi realizada a marcação da proteína LC3b por citometria de fluxo.
Células da medula óssea foram cultivadas como descrito no item 2.3 e tratadas por 96 horas
na concentração de 100 μg/mL de EAPa. Após o término do cultivo as células foram fixadas
por imersão em uma solução contendo 3 % de paraformaldeído em tampão PHEM 0,1 M, pH
7.2 por um período de 30 minutos a temperatura ambiente e, posteriormente, permeabilizados
com 0,1% de Triton X 100 durante 10 minutos. Posteriormente as células foram lavadas em
tampão PBS pH 8.0 e incubadas por 40 minutos em PBS contendo 50 mM NH4Cl.
Após novas lavagens, as células foram incubadas com anticorpo primário anti-LC3b
(Molecular Probes Invitrogen®) diluído na proporção de 1:1000 em PBS pH 8.0 por 1 hora.
Posteriormente as células foram incubadas com o anticorpo secundário goat anti-rabbit alexa
488 (Molecular Probes Invitrogen®) diluído na proporção 1:100 em PBS pH 8.0 durante 1
hora. A análise foi feita utilizando um citômetro de fluxo BD FACSCantoII TM em
comprimento de onda de excitação de 490 nm e os dados foram obtidos utilizando o software
WinMDI versão 2.9.
52
2.8 DETECÇÃO DAS PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE POR CITOMETRIA DE FLUXO
Para verificar qual tipo celular que EAPa está promovendo o processo de
diferenciação/maturação foi realizado a detecção de algumas proteínas de superfície. Assim,
células da medula óssea foram cultivadas em placas de 12 poços e submetidas ao tratamento
com EAPa na concentração de 100 μg/mL por 96 horas. Após o tratamento, estas células
foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e ressuspendidas em solução de PBS pH 8.0.
Em seguida, essas células foram centrifugadas novamente a 1500 rpm por 10 minutos e
incubadas com os anticorpos primários rat anti-mouse CD11b (marcador de
macrófagos/monócitos), rat anti-mouse CD11c (marcador de células dendríticas) e rat anti-
mouse F4/80 (marcador de macrófago) por 1 hora. Os anticorpos primários foram diluídos na
proporção 1:50 em PBS pH 8.0. Posteriormente, uma segunda incubação foi realizada com
anticorpo secundário PE-goat anti-rat IgG (Abcam®) diluídos na proporção 1:50 em PBS pH
8.0 por 1 hora, e por fim, uma nova centrifugação foi realizada e as células ressuspendidas em
PBS pH 8.0. As células foram analisadas em citômetro de fluxo BD FACSCantoII. Os dados
foram obtidos utilizando o software WinMDI versão 2.9.
2.9 RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa
2.9.1 Detecção da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelas células da
medula óssea tratadas com EAPa:
2.9.1.1 Pelo método Nitroblue Tetrazolium (NBT)
Células da medula foram cultivadas em placa de cultura de 24 poços como descrito no
item 2.3 e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. Após as 96 horas
de cultivo e tratamento com EAPa, as células foram lavadas com PBS pH 7.2 e incubadas em
meio contendo 1 mg/mL de NBT (Sigma), conforme descrito por Rodrigues et al. (2011),
com alterações. Como controle positivo foram usadas células da medula óssea tratadas com
M-CSF na concentração de 100 nM por 96 horas. Após incubação com NBT, as lamínulas
contendo as células foram lavadas com PBS, pH 7.2, e fixadas em paraformaldeído 3% por 30
minutos, as células foram desidratadas em acetona 100% e passadas em misturas crescentes
de acetona–xilol, até duas passagens finais em xilol puro e por fim foram montadas em
53
lâminas de vidro, tendo Entellan® como meio de montagem. Após a montagem, as células
foram analisadas e contadas em microscópio óptico Olympus BX41. Foram realizados dois
tipos diferentes de contagem, sendo a primeira para verificar o número de células marcadas
positivamente com NBT, sem levar em consideração as características morfológicas e a
segunda contagem, denominada contagem diferencial das células marcadas positivamente
com NBT. Para essa análise as células foram divididas em dois grupos: Grupo 1: Células com
pouco volume citoplasmáticos, aqui denominadas de células pequenas e grupo 2: células com
intenso volume citoplasmático, denominadas de células grandes.
2.9.1.2 Pelo kit CellROX®
Células da medula óssea foram cultivadas em placas de cultura de 12 poços como
descrito no item 2.3 e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. Após
esse período, as células foram lavadas com PBS pH 7.2 e incubadas com o marcador
fluorescente CellROX® Green (Molecular Probes Invitrogen) na concentração de 5 μM,
diluído em meio de cultura DMEM por 30 minutos a 37 ºC e em atmosfera de 5% de CO2,
conforme descrito por Hyo-Yang et al. (2012), com algumas modificações. Células tratadas
com M-CSF (concentração de 100 nM) por 96 horas foram utilizadas como controle positivo.
Após o tempo de incubação, as células foram lavadas com PBS, pH 7.2 e lidas em um
fluorímetro (VICTOR X Multilabel Plate Readers) em comprimento de onda de 490 nm.
Células não marcadas com CellROX® Green foram utilizadas como controle negativo.
2.9.2 Dosagem da produção de óxido nítrico (NO) por células da medula óssea tratadas
com EAPa
A dosagem da concentração de nitrito/nitrato em meio de cultura é uma forma indireta
de se determinar a concentração de NO produzido pelas células da medula óssea não tratadas
e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL durante 96 horas de cultivo. Este
procedimento foi realizado pelo método de Griess, no qual consiste em adicionar 50 µL do
reagente de Griess (sulfanilamida a 1% em ácido fosfórico a 5% e Naftilenodiamina a 0,1%
em água destilada) e 50 µL do sobrenadante das células tratadas e não tratadas. A leitura foi
feita em leitor de microplaca sobre uma densidade óptica de 570 nm e a concentração de
nitrito/nitrato foi expressa em µM de acordo com a curva padrão estabelecida.
54
2.9.3 Capacidade fagocítica de células da medula óssea tratadas com EAPa
Para observar o efeito de EAPa sobre a capacidade fagocítica das células da medula
óssea, as células foram cultivadas como descrito no item 2.3 e tratadas com EAPa na
concentração de 100 µg/mL por 96 horas. Em seguida, foi realizada a interação com a
Saccharomyces cerevisiae em uma proporção de (1:10) durante 2 horas a 37 ºC em atmosfera
de 5% de CO2. Após esse período, o sobrenadante foi desprezado e as células lavadas com
PBS, pH 7.2, por três vezes, para retirar as leveduras não internalizadas. Em seguida, as
células foram coradas com o corante Giemsa, como foi descrito no item 2.6.1. Foram
contadas 200 células por lamínula e o índice endocítico foi obtido calculando-se a
porcentagem de células que endocitaram e a média de levedura por células. As células foram
contadas em microscópio óptico Olympus BX41.
2.10 INTERAÇÃO PARASITO-CÉLULA HOSPEDEIRA
2.10.1 Atividade leishmanicida
2.10.1.1 Ação de EAPa durante a fase inicial da interação com L. (L.) amazonensis
Com o objetivo de avaliar a ação de EAPa durante a fase inicial da interação (24
horas) com o protozoário L. (L.) amazonensis, foi realizada a análise leishmanicida. As
células da medula óssea foram obtidas conforme descrito no item 2.3, e tratadas com EAPa na
concentração de 100 µg/mL por 48 e 96 horas, posteriormente os parasitos foram adicionados
aos poços de cultura na proporção 10 parasito para 1 célula, durante 3 horas à temperatura de
37 ºC em atmosfera de 5% de CO2. Após esse período, o sobrenadante foi desprezado e os
poços lavados com PBS, pH 7.2, por três vezes, para retirar os parasitos não internalizados.
As células infectadas foram posteriormente tratadas ou não por 24 horas com EAPa na
concentração de 100 μg/mL e incubadas em estufa de CO2 . Após esse período, as células
foram fixadas e coradas como foi descrito no item 2.6.1. As células foram contadas em
microscópio óptico Olympus BX41 e a captura das imagens realizada em um microscópio
Axiophot Zeiss com câmera digital Zeiss acoplada. Foram contadas 200 células por lamínula
e o índice de sobrevivência foi obtido calculando-se a porcentagem de células que
endocitaram e a média de parasitas por célula. Como controle negativo foram utilizadas
células da medula óssea infectadas sem tratamento e como controle positivo foram usadas
55
células da medula óssea infectadas com L.(L.) amazonensis e tratadas com ANF-B na
concentração de 0,5 µg/mL.
2.10.1.2 Atividade Antiamastigota
A partir do conhecimento de que o protozoário Leishmania leva em torno de 24-48
horas para se converter na forma amastigota em cultura in vitro, foi realizada a avaliação da
atividade antiamastigota de EAPa, incubando as células da medula óssea infectadas com L.
(L.) amazonensis por 72 horas com e sem EAPa. As células da medula óssea foram obtidas
como já foi descrito no item 2.3, e foram tratadas por 48 horas com EAPa na concentração de
100 µg/mL. Posteriormente os parasitos obtidos na fase estacionária de crescimento (sete
dias) foram colocados em contato com as células tratadas ou não na concentração de 106
células por poço, na proporção de 10 parasitos para cada célula, como descrito no item 2.10.1.
Após as lavagens, as células infectadas foram tratadas ou não por 72 horas com EAPa com a
concentração de 100 μg/mL. Após este período as células foram fixadas em paraformaldeído
4% em tampão PHEM 0,1 M por 30 minutos e posteriormente coradas. A coloração foi
realizada com o corante Giemsa, como descrito no item 2.6.1. As células foram contadas em
microscópio óptico e o índice de sobrevivência determinado como foi descrito no item 2.10.1.
O controle positivo foi composto por células da medula óssea infectadas com L. (L.)
amazonensis e tratadas com ANF-B na concentração de 0,5 µg/mL.
2.11 DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE MORTE CELULAR EM PROMASTIGOTAS
DE L. (L.) amazonensis TRATADAS COM EAPa
2.11.1 Detecção da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) em promastigotas
de L. (L.) amazonensis tratadas com EAPa
Promastigotas de L. (L.) amazonensis, na fase log, foram cultivadas em placas de 12
poços e tratadas ou não com EAPa na concentração de 100 μg/mL. Após 48 e 72 horas
alíquotas de cada poço foram retiradas para assim realizar a detecção de ERO utilizando o kit
CellROX® Green. Os parasitos foram lavados com PBS pH 7.2 e posteriormente incubados
com o marcador fluorescente CellROX® Green na concentração de 7.5 μM, diluído em meio
de cultura (RPMI). Após 45 minutos de incubação em estufa a 27 ºC as células foram lavadas
com PBS pH 7.2 e as soluções contendo as células marcadas foram transferidas para placas
56
multipoços de cor preta ou para tubos de citometria, para assim serem lidas em um
fluorímetro (VICTOR X Multilabel Plate Readers) em um comprimento de onda de 490 nm
ou em um citômetro de fluxo BD FACSCantoII. Como controle negativo foram utilizadas
células que não foram marcadas com CellROX® Green.
2.11.2 Detecção de necrose e apoptose em promastigotas de L. (L.) amazonensis tratadas
com EAPa
Para a detecção de necrose e apoptose do protozoário L. (L.) amazonensis tratados
com EAPa foram utilizados os marcadores fluorescentes IP (Sigma) e Anexina V-FITC
(Molecular Probes Invitrogen®), respectivamente.
Protozoários Leishmania foram cultivados como descrito no item 2.11.1. Após 72
horas de tratamento com 100 µg/mL de EAPa, as células foram centrifugadas e lavadas com
PBS pH 7.2. Posteriormente incubados por 30 minutos com 10 μL Anexina V-FITC, e em
seguida incubados com 5 μg/mL de IP, obtido de um solução estoque de 1mg/mL. Após a
incubação, as células foram novamente lavadas com PBS pH 7.2 e a leitura foi feita em
citômetro de fluxo BD FACSCantoII. Os dados foram analisados utilizando o software
WinMDI versão 2.9.
2.11.3 Detecção do potencial da membrana mitocondrial das promastigotas de L. (L.)
amazonensis tratadas com EAPa
Promastigotas de L. (L.) amazonensis, na fase log, foram cultivadas em placas de 12
poços e tratadas ou não com EAPa na concentração de 100 μg/mL por 72 horas. Após o
tratamento, estas células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e ressuspendidas em
solução de PBS pH 7.2. Em seguida, os parasitos foram centrifugados novamente a 1500 rpm
por 10 minutos e incubados por 30 minutos com 1 μM de JC-1 a 27°C. Posteriormente, foi
realizada uma nova centrifugação e as células ressuspendidas em PBS pH 7.2. A análise foi
feita utilizando um citômetro de fluxo BD FACSCantoII TM em comprimento de onda de
excitação de 488 nm, sendo que os monômeros de JC-1 emitem a 529 nm. Os dados foram
obtidos utilizando o software BD FACSDiva, analisando apenas a intensidade de
fluorescência verde.
57
2.11.4 Detecção da proteína LC3b em promastigotas de L. (L.) amazonensis após
tratamento com EAPa
Parasitos foram cultivados e tratados como descrito no item 2.11.1. Após 72 horas de
tratamento com EAPa na concentração de 100 µg/mL, os parasitos foram fixados por imersão
em uma solução contendo 3% de paraformaldeído em tampão PHEM 0,1 M, pH 7.2 por um
período de 30 minutos a temperatura ambiente e, posteriormente, permeabilizados com 0,1%
de Triton X 100 durante 15 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS pH
8.0 por 10 minutos e incubadas por 40 minutos em PBS pH 8.0 contendo 50 mM NH4Cl, para
assim realizar o bloqueio dos sítios inespecíficos.
Após o bloqueio, as células foram lavadas em PBS pH 8.0 e posteriormente incubadas
com o anticorpo primário anti-LC3b (Molecular Probes Invitrogen®) diluído 1:1000 em PBS
pH 8.0 durante 1 hora, seguido de 2 lavagens em PBS pH 8.0. Posteriormente as células
foram incubadas com o anticorpo secundário goat anti-rabbit alexa 488 (Molecular Probes
Invitrogen®) diluido na proporção de 1:100 em PBS pH 8.0 durante 1 hora. Após a
incubação as células foram lavadas e lidas em um citômetro de fluxo BD FACSCantoII.
Como controle negativo foi feita omissão do primeiro anticorpo.
2.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram analisados utilizando o GraphPad Prism 5. Os testes usados
foram a análise de variância, ANOVA seguido do teste Tukey e o Teste t de Student,
considerando significantes resultados com p < 0,05.
58
3 RESULTADOS
3.1 VIABILIDADE CELULAR
Com objetivo de verificar se EAPa apresenta ou não efeito citotóxico para as células
da medula óssea, foram realizados os seguintes testes de viabilidade: MTT, JC-1, IP e
Anexina-V.
3.1.1 Método triazolyl blue (MTT)
O método MTT detecta a viabilidade celular pela análise da atividade das
desidrogenases presentes nas mitocôndrias das células. No presente estudo não houve uma
diminuição significativa da viabilidade das células da medula óssea tratadas com EAPa nos
períodos de 24, 48, 72 e 96 horas quando comparados ao controle sem tratamento. Como
controle negativo, as células foram incubadas com solução de 15% de formol em PBS (Figura
13a).
3.1.2 Detecção do potencial da membrana mitocondrial (JC-1)
O ΔΨ foi analisado pelo método JC-1. Foi observado que as células tratadas com
EAPa na concentração de 100 μg/mL mantiveram-se viáveis mesmo após serem mantidas em
cultivo por 96 horas (Figura 13b2), semelhantes ao grupo controle sem tratamento (Figura
13b1), indicando assim que EAPa não possui efeito citotóxico para as células da medula
óssea.
3.1.3 Detecção de apoptose e necrose em células da medula óssea tratadas com EAPa
Para análise de morte celular foi utilizado o IP, que é um marcador capaz de ser retido
no interior das células necróticas e para análise da apoptose foi utilizado o marcador Anexina
V-FITC, que marca FS externalizada. Não foi observado aumento da porcentagem de células
mortas no grupo de células tratadas com EAPa (Figura 13c2), quando comparadas ao controle
sem tratamento (Figura13c1).
59
Figura 13: Análise da viabilidade celular.
a) Viabilidade celular pelo método MTT em células da medula óssea mantidas em cultivo e
tratadas com EAPa por 24, 48, 72 e 96 horas nas concentrações de 25, 50 e 100 µg/mL. A
viabilidade das células tratadas e não tratadas foi mostrada como absorvância, analisada a uma
densidade óptica (DO) de 570 nm. b) Análise do potencial da membrana mitocondrial (ΔΨ) das
células da medula óssea cultivadas e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96
horas. b1) Controle (CTL) sem tratamento. b2) Células da medula óssea tratadas com EAPa. c)
Detecção de apoptose e necrose nas células da medula óssea tratadas com EAPa por 96 horas.
c1) CTL sem tratamento. c2) Células da medula óssea tratadas com 100 µg/mL de EAPa. Para
análise estatística foram utilizados os testes: ANOVA seguido do teste Tukey para análise do
método MTT. T de Student para análise dos métodos JC1, Iodeto de propídio e Anexina. P <
0,05.
24 horas 48 horas
72 horas 96 horas
60
3.2 ANÁLISE QUANTITATIVA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS CÉLULAS DA
MEDULA ÓSSEA TRATADAS COM EAPa
3.2.1 Análise quantitativa das células cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas
As células da medula óssea foram cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas e analisadas por
microscopia óptica. Foram observados seis tipos celulares: os linfócitos, PMN, células com
núcleo em anel (CNA), monócitos (MO), macrófagos residentes (MR) e macrófagos ativados
(MA), para uma posterior análise quantitativa. Nesta análise, os MR, MA e MO foram
incluidos no grupo de mononucleares. Para este estudo as CNA não foram quantificadas.
3.2.1.1 Linfócitos
Foi possível observar que ocorreu uma diminuição significativa no número de
linfócitos no grupo tratado com M-CSF nos períodos de 48 (43%), 72 (53%) e 96 (77%) horas
quando comparados ao controle. Foi observada uma diminuição de 40% no número de
linfócitos durante o período de 96 horas no grupo EAPa quando comparado ao controle sem
tratamento (Figura 14a).
3.2.1.2 Polimorfonucleares
A análise quantitativa realizada por microscopia mostrou uma diminuição significativa
dos PMN no grupo M-CSF nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas quando comparado ao grupo
controle. Não houve diferença significativa entre o grupo controle e o grupo EAPa nos quatro
tempos de cultivo analisados (Figura 14b).
3.2.1.3 Mononucleares
Nos períodos de 24 (48%), 48 (15%), 72 (12%) e 96 (12%) horas foi possível observar
um aumento significativo de mononuclares no grupo M-CSF quando comparado ao grupo
controle, porém foi observado um aumento de 8% deste tipo celular no grupo EAPa no
período de 96 horas em comparação ao grupo controle, mostrando que EAPa esta estimulando
o processo de adesão deste tipo celular (Figura 14c).
61
Figura 14: Contagem percentual do número de linfócitos, polimorfonucleares (PMN) e
mononucleares em cultura de células da medula óssea cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas. a)
Contagem percentual do número de linfócitos. Inset, observar o linfócito, célula com núcleo
grande, com cromatina condensada e pouco citoplasma (seta). b) Contagem de PMN presentes
na cultura de células da medula óssea mantidas em cultivo por 24, 48, 72 e 96 horas. Inset,
Observar o PMN, células multilobuladas, apresentando em seu citoplasma dois ou mais núcleos
(seta). c) Contagem dos mononucleares cultivados por 24, 48, 72 e 96 horas. Inset 1, observar o
monócito, célula com pouco citoplasma e um núcleo em forma de rim ou ferradura. Inset 2,
observar o macrófago, célula que apresenta um núcleo redondo, central e citoplasma abundante.
Foi utilizado ANOVA seguido do teste Tukey. P < 0,05.
Linfócitos
Polimorfonucleares
Mononucleares
62
3.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DAS CÉLULAS CULTIVADAS
POR 96 HORAS
A análise morfológica das células aderidas revelou que as células tratadas com EAPa
(Figura 15b) no período de 96 horas apresentaram um maior padrão de espraiamento,
aumento da área citoplasmática e tamanho celular, quando comparadas ao controle sem
tratamento (Figura 15a), apresentando características similares as das células tratadas com o
M-CSF (Figura 15c). Foi observado nas células tratadas com M-CSF um processo de fusão
celular, formando células com morfologia similar a de células gigantes. A análise
morfométrica (Figura 15d) mostrou que as células tratadas com EAPa e com M-CSF
apresentaram um aumento da área celular quando comparadas ao controle, confirmando o que
foi verificado na análise morfológica das células aderentes.
a
Figura 11
Figura 15: Análise morfológica e morfométrica das células da medula óssea tratadas por 96
horas com EAPa. a) CTL sem tratamento, observar células com pouco espraiamento celular.
b) Grupo EAPa, observar o espraiamento celular, aumento da área citoplasmática e as células
com características de macrófagos ativados (seta). c) Células tratadas com M-CSF, observar a
presença de macrófagos ativados, observar que a maioria das células estão sofrendo o
processo de fusão celular (ponta da seta). Barra 10 μm. d) Análise morfométrica das células
tratadas com EAPa por 96 horas. Foi utilizado ANOVA seguido do teste Tukey. P < 0,05.
1
63
3.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET)
Para poder observar possíveis alterações ultraestruturais nas células tratadas com
EAPa foi realizada a MET. Foi possível observar que as células tratadas com EAPa
apresentaram alterações em suas organelas principalmente nas mitocôndrias (Figura 16c), que
apresentavam-se alongadas, características de células com intensa atividade metabólica. Foi
observado também nas células tratadas com EAPa a presença de vacúolos citoplasmáticos e
emissão de filopódios (Figura 16c e d), características essas também observadas nas células
tratadas com M-CSF (Figura 16b). Foi possível observar o aumento aparente de retículo
endoplasmático (RE) no citoplasma das células tratadas e núcleo com abundante eucromatina
(Figuras 16c e d). A presença de vacúolos autofágicos no citoplasma das células tratadas com
EAPa (Figura 17 a e b) e M-CSF eram bem evidentes, entretanto esses vacúolos também
foram observados no citoplasmas das células do grupo controle (Figura 16a), porém
aparentemente em menor número.
Figura 13
Figura 14
Figura 14
24 horas 48 horas 72 horas
64
Figura 16: Análise ultraestrutural das células da medula óssea tratadas por 96 horas com EAPa.
a) CTL sem tratamento. b) Células tratadas com M-CSF, observar a emissão de filopódios
(setas), a intensa vacuolização citoplasmática (asterisco) e a presença de vacúolos autofágios
(ponta da seta), características de células ativadas e diferenciadas. c e d) Células tratadas com
EAPa, observar a emissão de filopódios (setas), vacuolização citoplasmática (asterisco), o
aumento de RE, a presença de mitocôndrias alongadas, núcleos com eucromatina abundante e a
presença de vacúolos autofágios (ponta da seta). N: Núcleo, M: Mitocôndria, RE: Retículo
Endoplasmático. Barras 5 μm.
CTL M-CSF–100 nM
EAPa-100 µg/mL EAPa-100 µg/mL
65
3.5 DETECÇÃO DA PROTEÍNA LC3B
Para verificar se EAPa estava induzindo a autofagia foi realizada a marcação da
proteína LC3b por citometria de fluxo. Foi possível notar que EAPa promoveu a indução do
processo autofágico, sendo observado um aumento da intensidade de fluorescência e da
porcentagem de células marcadas positivamente para a proteína LC3b no grupo tratado com
EAPa quando comparado ao grupo controle sem tratamento. A marcação observada nas
células tratadas com EAPa foi similar a observada no grupo controle com inanição. Não foi
observado um aumento da intensidade de fluorescência no grupo M-CSF quando comparado
ao grupo controle sem tratamento (Figura 17 c-g).
Figura 17: Detecção do processo de autofagia em células da medula óssea tratadas com EAPa
por 96 horas. a-b) Análise ultraestrutural das células da medula óssea tratadas com EAPa.
Observar a presença de vacúolos autofágicos no citoplasma das células tratadas (seta). Barras
0,5 μm. c-g) Detecção da proteína LC3b por citometria de fluxo das células da medula óssea
tratadas com EAPa por 96 horas. c) CTL sem tratamento. d) Células tratadas com EAPa. e)
Células tratadas com M-CSF. f) Inanição. g) Intensidade de fluorescência das células da medula
óssea tratadas com EAPa e marcadas com LC3b. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste
tukey. P < 0,05.
b
EAPa - 100 µg/mL
66
3.6 DETECÇÃO DAS PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE POR CITOMETRIA DE FLUXO
3.6.1 Marcação com CD11b
Com a finalidade de verificar ação de EAPa sobre a proteína CD11b foi realizada a
análise por citometria de fluxo, no qual mostrou que as células tratadas com EAPa
apresentaram uma porcentagem de 10,60% para o marcador CD11b (Figura 18c), marcação
bem próxima da que foi observada no grupo de macrófagos peritoneais (Figura 18a) e do
grupo que foi estimulado com M-CSF (Figura 18d). Porém, a porcentagem observada no
grupo EAPa é equivalente ao dobro do que foi encontrado pelo grupo controle (Figura 18b).
A análise da intensidade de fluorescência mostrou que as células tratadas apresentaram uma
menor intensidade de fluorescência, quando comparadas ao grupo controle, porém a
intensidade de fluorescência observada no grupo de células tratadas com EAPa foi bem
próxima às das células do grupo M-CSF e macrófagos peritoneais (Figura 18e).
.
Figura 18: Detecção do marcador de superfície CD11b em cultura de células da medula óssea
tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. a) Controle positivo de
macrófagos peritoneais. b) CTL sem tratamento. c) Células da medula óssea tradadas com
EAPa. d) Células da medula óssea tratadas com M-CSF. e) Intensidade de fluorescência das
células da medula óssea marcadas com CD11b. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste
Tukey. P< 0,05.
67
3.6.2 Marcação com F4/80
Com a finalidade de verificar se EAPa induz a diferenciação dos monócitos em
macrófagos foi realizada a análise por citometria de fluxo marcando a proteína F4/80 (Figura
19). A marcação da proteína F4/80 mostrou que as células tratadas com EAPa (Figura 19c)
apresentaram uma porcentagem de 33,85%, valor bem próximo da marcação do grupo
estimulado com M-CSF (Figura 19d). A porcentagem observada no grupo EAPa é superior a
que foi encontrado pelo grupo controle (Figura 19b). A análise da intensidade de
fluorescência mostrou que as células tratadas com EAPa apresentaram uma marcação superior
a do controle, porém a marcação foi próxima as dos grupos M-CSF e macrófagos peritoneais
(Figura 19e).
Figura 19: Análise por citometria de fluxo do marcador de superfície F4/80 em cultura de
células da medula óssea tratadas com EAPa. a) Controle positivo de macrófagos peritoneais.
b) CTL sem tratamento. c) Células tratadas com EAPa. d) Células da medula óssea tratadas
com M-CSF. e) Intensidade de fluorescência das células da medula óssea marcadas com
F4/80. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste Tukey. P < 0,05.
b
d e
a
c
68
3.6.3 Marcação com CD11c
A análise por citometria de fluxo mostrou que as células tratadas com EAPa
apresentaram uma porcentagem de 7,12% para o marcador CD11c (Figura 20b), marcação
próxima das células do grupo controle (8,14%) e das células do grupo M-CSF (8,74%)
(Figura 20c). A intensidade de fluorescência revelou que não houve diferença significativa
entre as células tratadas com EAPa e as células do grupo controle (Figura 20d).
Figura 20: Detecção da proteína de superfície CD11c em cultura de células da medula óssea
tratadas com EAPa por 96 horas. a) CTL sem tratamento. b) Células da medula óssea tratadas
com EAPa. c) Células estimuladas com M-CSF. d) Intensidade de fluorescência das células da
medula óssea marcadas com CD11c. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste Tukey. P <
0,05.
69
3.7 RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA TRATADAS COM EAPa
3.7.1 Produção de ERO por células da medula óssea tratadas com EAPa
A detecção de ERO foi realizada através da reação citoquímica NBT e utilizando o kit
CellROX® Green. Através da marcação com o CellROX® Green (Figura 21a1) e pela reação
com NBT (Figura 21a2) não foi possível observar um aumento na produção destes radicais
em células da medula óssea tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL. Entretanto,
foi observada a produção de ERO apenas no grupo de células que foram tratadas com M-CSF.
A contagem diferencial utilizando as lamínulas marcadas com NBT discriminando célula com
intenso volume citoplasmático e células com pouco volume foi realizada para poder
determinar quais destes tipos celulares geravam O2-. Foi possível observar que a maioria das
células com pequeno volume citoplasmático no grupo tratado com EAPa estavam
positivamente marcadas com NBT e as células com grande volume citoplasmático
apresentavam pouca ou nenhuma marcação. No grupo controle foi observado o inverso, ou
seja, as células com maior volume citoplasmático apresentavam marcação positiva para o
NBT (figura 21a3).
3.7.2 Dosagem da produção de NO por células da medula óssea tratadas com EAPa
Com o objetivo de detectar a produção de NO em culturas de células da medula óssea
tratadas com EAPa foi realizado o método de Griess para análise de nitrito/nitrato. Não foi
possível observar a produção de NO em células cultivadas e tratadas com EAPa por 96 horas
quando comparadas com o controle sem tratamento e controle positivo estimulado com M-
CSF. Foi possível observar a redução da produção de NO no grupo de células tratadas com
EAPa e EAPa + M-CSF (Figura 21b).
3.7.3 Capacidade fagocítica de células da medula óssea tratadas com EAPa
A análise da atividade fagocítica foi realizada utilizando células da medula óssea
tratadas com 100 μg/mL de EAPa por 96 horas e submetidas à interação com Saccharomyces
cerevisiae. Não houve diferença significativa da atividade fagocítica entre as células tratadas
com EAPa e as células sem tratamento (Figura 21c).
Figura 12
Figura 13
a
c
70
Figura 21: Ação de EAPa sobre a resposta microbicida das células da medula óssea.
a) Detecção da produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) em células da medula óssea
tratadas com a concentração de 100 μg/mL de EAPa. a1) Detecção da produção de ERO pelo
kit CellROX®. a2) Análise da produção de radicais superóxidos (O2-)
através da reação
citoquímica do NBT. a3) Contagem diferencial das células marcadas positivamente com NBT,
as células foram divididas em dois grupos: Grupo 1: Células com pouco volume
citoplasmáticos, denominadas de células pequenas. Grupo 2: Células com intenso volume
citoplasmático, denominadas de células grandes. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste
Tukey. P < 0,05.
b) Gráfico da dosagem de óxido nítrico (NO) de células tratadas com a concentração de 100
μg/mL de EAPa. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste Tukey. P < 0,05.
c) Índice endocítico da interação de células da medula óssea tratadas com 100 µg/mL de EAPa
por 96 horas e infectadas com Saccharomyces cerevisiae. Como controle positivo foi utilizado
células da medula óssea tratadas com M-CSF. Foi utilizado ANOVA seguido pelo teste Tukey.
P < 0,05.
71
3.8 INTERAÇÃO PARASITO-CÉLULA HOSPEDEIRA
3.8.1 Atividade leishmanicida
Primeiramente foi realizada interação com L. (L.) amazonensis em células da medula
óssea tratadas ou não com a concentração de 100 μg/mL de EAPa por 96 horas. Após
tratamento, as células foram submetidas a interação com o parasito e posteriormente foram
tratadas ou não com EAPa na concentração de 100 μg/mL por 24 horas. Foi possível observar
uma redução significativa de 23,8% do número de parasitos intracelulares no grupo de células
que foram tratadas com EAPa antes e depois da interação em relação ao controle sem
tratamento, porém o grupo de células que foi tratado somente antes da interação apresentou
uma redução de apenas 4,2% em relação ao controle, mostrando que a redução dos parasitos
intracelulares foi mais intensa quando EAPa estava presente no meio de cultura. O controle
positivo de células tratadas com ANF-B apresentou uma redução de 91,7% (Figura 22).
Os resultados mostrados acima foram realizados com células cultivadas por 96 horas,
na qual a maioria das células aderentes são macrófagos, logo, o próximo passo foi avaliar
como o protozoário iria se comportar na presença de diversos tipos celulares: macrófagos,
linfócitos, PMN e monócitos. Após cultivo e tratamento por 48 horas, as células não tratadas e
tratadas com a concentração de 100 μg/mL de EAPa foram submetidas a interação com L. (L.)
amazonensis, e posteriormente, as células infectadas foram tratadas ou não com EAPa na
concentração de 100 μg/mL durante o período de 24 e 72 horas. Foi possível observar uma
redução significativa de 22,7% do número de parasitos intracelulares no grupo tratado com
EAPa por 24 horas quando comparado ao controle sem tratamento, durante este mesmo
período as células infectadas e tratadas com ANF-B apresentaram uma redução de 95,8% em
relação ao controle (Figura 23). No período de 72 horas de tratamento foi observado que
todos os parasitos intracelulares apresentaram caracteríticas de amastigotas, e neste período
foi possível notar uma intensa redução de amastigotas no grupo tratado com EAPa, essa
diminuição foi de 96,5% em relação ao controle (Figura 24).Vale destacar que no período de
24 horas de tratamento após interação foram encontrados PMN cheios de vacúolos vazios
(Figura 23b, seta fina), mostrando que EAPa também é capaz de eliminar o parasito
Leishmania do interior dos PMN.
72
Figura 22: Efeito de EAPa sobre as formas intracelulares do protozoário L. (L.) amazonensis.
Células obtidas da medula óssea de camundongos foram tratadas por 96 horas com a
concentração de 100 μg/mL de EAPa, posteriormente infectadas com as formas promastigotas
de L. (L.) amazonensis e por fim tratadas novamente ou não com EAPa por 24 horas. a) CTL
sem tratamento, observar parasitos no interior da célula (setas). b) Células tratadas com EAPa
antes e depois da interação, observar alguns vacúolos sem a presença do parasito (ponta da
seta). c) Controle positivo, células tratadas com anfotericina B (ANF-B), obsevar a presença de
células com vacúolos vazios, sem a presença do protozoário (Ponta da seta). Barra 20 μm. d)
Índice de sobrevivência dos parasitos intracelulares. T/A – Células tratadas apenas antes da
interação. T/D – Células tratadas antes e depois da interação. Foi utilizado ANOVA seguido
pelo teste Tukey. P < 0,05.
.
CTL EAPa – 100 µg/mL
ANF-B-0,5 µg/mL
73
Figura 22
CTL EAPa-100 µg/mL – T/D
ANF-B-0,5 µg/mL
CTL EAPa-100 µg/mL
ANF-B-0,5 µg/mL
Figura 23: Efeito do tratamento com EAPa sobre as formas intracelulares do protozoário L.
(L.) amazonensis. Células obtidas da medula óssea de camundongos foram tratadas por 48
horas com a concentração de 100 μg/mL de EAPa, posteriormente infectadas com as formas
promastigotas de Leishmania e por fim tratadas novamente ou não com EAPa por 24 horas.
a) CTL sem tratamento, observar parasitos no interior das células (setas). b) Células tratadas
com EAPa, observar alguns vacúolos sem a presença do parasito (ponta da seta), observar os
polimorfonucleares (PMN) com os vacúolos vazios (seta fina). c) Controle positivo, células
tratadas com ANF-B, obsevar a presença de células com vacúolos vazios, sem a presença do
protozoário (Ponta da seta). Barra 20 μm. d) índice de sobrevivência dos parasitos
intracelulares. Foi utilizado o teste ANOVA seguido do teste Tukey. P < 0,05.
74
Figura 24: Efeito de EAPa sobre as formas amastigotas do protozoário L. (L.) amazonensis.
Células obtidas da medula óssea de camundongos foram tratadas por 48 horas com a
concentração de 100 μg/mL de EAPa, posteriormente infectadas com as formas promastigotas
de Leishmania (L.) amazonensis e por fim tratadas novamente ou não com EAPa por 72 horas.
a) CTL sem tratamento, observar as formas amastigotas no interior das células (setas). b)
Células tratadas com EAPa, observar todos os vacúolos sem a presença do parasito (setas). c)
Controle positivo, células tratadas com anfotericina B (ANF-B), obsevar a presença de células
com vacúolos vazios, sem a presença do protozoário. Barra 20 μm. d) Índice de sobrevivência
das formas amastigotas. Foi utilizado ANOVA seguido do teste Tukey. (*) p < 0,05.
CTL EAPa-100 µg/mL
ANF-B-0,5 µg/mL
75
3.9 DETERMINAÇÃO DO PADRÃO DE MORTE CELULAR EM PROMASTIGOTAS DE
L. (L.) amazonensis TRATADAS COM EAPa
Para verificar a ação de EAPa sobre o protozoário L. (L.) amazonensis foram
realizados os seguintes testes: análise da produção de ERO, detecção de apoptose, necrose e
marcação da proteína LC3b. Foi possível observar uma elevada produção de ERO em
promastigotas de L. (L.) amazonensis a partir de 48 horas de tratamento com EAPa na
concentração de 100 µg/mL. É importante ressaltar que a produção de ERO se tornou mais
acentuada no período de 72 horas de tratamento (Figura 25a, b e c). A análise por citometria
de fluxo mostrou que ocorreu um aumento da porcentagem de células marcadas positivamente
para Anexina V (Figura 26a2 e b), mostrando que as promastigotas tratadas com EAPa estão
morrendo por apoptose. Não foi observada diferença na marcação com PI (necrose) (Figura
26a2 e c) e da marcação da proteína LC3b (autofagia) (Figura 26e) em promastigotas tratadas
com EAPa quando comparadas ao grupo controle sem tratamento. Análise da viabilidade pelo
método JC-1 revelou que esta ocorrendo uma alteração no potencial de membrana
mitocondrial das promastigotas de L. (L.) amazonensis tratadas, foi possível observar um
aumento da fluorescência verde nesse grupo quando comparado ao controle sem tratamento,
indicando uma redução na viabilidade das promastigotas, indicando o início do processo de
apoptose (Figura 26d).
76
a1 a2
b1 b2
c
CTL – 48 horas
CTL – 72 horas
EAPa-100 µg/mL-48 horas
EAPa-100 µg/mL-72 horas
Figura 25: Detecção da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) em promastigotas
de L. (L.) amazonensis tratadas ou não com a concentração de 100 μg/mL de EAPa.
Promastigotas de Leishmania foram marcadas com CellROX® green e lidas por citometria de
fluxo (Figuras a e b) e fluorimetria (Figura c). a1) CTL sem tratamento cultivado por 48 horas.
a2) Células tratadas com EAPa por 48 horas. b1) Parasitos sem tratamento cultivados por 72
horas. b2) Promastigotas tratadas com EAPa por 72 horas. c) Promastigotas tratadas ou não
com EAPa, cultivadas por 48 e 72 horas, marcadas com CellROX® green e lidas em um
fluorímetro. Foi utilizado ANOVA seguido do teste Tukey. (*) p < 0,05.
77
Figura 26: Detecção do mecanismo de ação de EAPa sobre as formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis tratadas com EAPa. a) Detecção de apoptose (Anexina V) e necrose (Iodeto de
propídio). a1) CTL sem tratamento cultivado por 72 horas. a2) Promastigotas tratadas com
EAPa por 72 horas. Intensidade de fluorescência de promastigotas de L. (L.) amazonensis
marcadas com Anexina V e Iodeto de propídio. b) Intensidade de fluorescência das células
marcadas com Anexina V. c) Intensidade de fluorescência das promastigotas marcadas com
Iodeto de propídio. d) Detecção do potencial de membrana mitocondrial das promastigotas
tratadas ou não com EAPa durante 72 horas. e) Detecção da proteína LC3b em promastigotas
de L. (L.) amazonensis tratadas com EAPa. Foi utilizado o teste t de Student. (*) p < 0,05.
.
d e
0,27%
78
4 DISCUSSÃO
Um grande número de produtos de origem natural estão sendo utilizados na medicina
popular devido os seus efeitos imunomodulatórios (Sato et al., 2005; Hamsa & kuttan, 2010;
De Oliveira et al., 2011; Ghonime et al., 2011). Um medicamento imunomodulador pode
atuar potencializando a resposta imune, sendo capaz de promover a ativação e maturação de
vários tipos celulares, estabelecendo uma resposta imune eficaz e manuntenção da
homeostase (Fischer et al., 2008). Medicamentos imunomoduladores vêm sendo bastante
aplicado na terapêutica de várias doenças, dentra elas as leishmanioses (Alavi-Naini et al.,
2012).
As leishmanioses são doenças negligenciadas, onde o tratamento disponível apresenta
custo elevado e diversos efeitos adversos. Além disso, várias espécies de Leishmania
conseguem silenciar a resposta microbicida gerada pelo macrófago, favorecendo a infecção
(Maity et al., 2009). Estudos recentes mostram que produtos naturais, extraídos de plantas,
apresentam ação imunomoduladora, promovendo maturação e ativação dos macrófagos e
assim eliminando o parasito Leishmania (Pereira et al., 2005; Guimarães et al., 2010; Ribeiro
et al., 2014). O extrato e fisalinas obtidos de Physalis angulata apresentam inúmeras
propriedades biológicas, incluindo ação leishmanicida (Choudhary et al., 2006; Guimarães et
al., 2009; Nogueira et al., 2013), entretanto, ainda não se conhece seus efeitos sobre as células
da medula óssea e qual via de morte celular que P. angulata ativa para promover a morte do
protozoário Leishmania.
Este estudo demonstrou pela primeira vez a ação imunomoduladora de EAPa sobre as
células da medula óssea de camundongos. Primeiramente foi realizada análise das células da
medula óssea por microscopia óptica, onde foi observada a presença de vários tipos celulares
como PMN, linfócitos e mononucleares. A análise percentual do número de linfócitos
mostrou que houve uma redução significativa deste tipo celular no grupo tratado com EAPa
no período de 96 horas quando comparado ao controle sem tratamento, mostrando que EAPa
não estimula a proliferação deste tipo celular. Bastos et al. (2008) mostraram que EAPa
apresentou um efeito inibitório sobre a proliferação de linfócitos, especialmente nas células T
em teste in vivo. Os resultados obtidos neste estudo também corroboram com aqueles
observados por Yu et al. (2010), os quais, demonstraram que a fisalina H, obtida de P.
angulata, apresentou uma atividade imunossupressora, impedindo assim a proliferação das
células T.
79
Em relação a quantificação dos PMN, foi observado que o extrato não estimula a
proliferação dos PMN. Diversos trabalhos na literatura mostram a ação de extratos de plantas
sobre os PMN (Braga et al., 2012; Liz et al., 2012; Suzuki et al., 2012), porém, relatam
apenas análise da viabilidade, resposta microbicida e ativação. Entretanto, este trabalho
mostra pela primeira vez a ação de um produto de origem natural sobre o processo de
proliferação celular dos PMN.
A análise quantitativa de mononucleares mostrou que houve um aumento deste tipo
celular no grupo de células tratadas com EAPa no período de 96 horas. A análise morfológica
e morfométrica mostraram que células tratadas com EAPa apresentaram um maior padrão de
espraiamento celular e maior volume citoplasmático. Além disso, análise ultraestrutural por
MET demonstrou que células da medula óssea tratadas durante 96 horas com 100 μg/mL de
EAPa apresentaram núcleo com eucromatina abundante, aumento de RE, presença de
mitocôndrias alongadas e projeções citoplasmáticas. Estes resultados corroboram com aqueles
obtidos por Abud et al. (2006) e Cesar et al. (2008). Estes autores estudando células da
medula óssea de camundongos tratadas com Canova® durante 96 horas observaram, maior
quantidade de células aderidas ao substrato, aumento do volume citoplasmático, espraiamento
celular, aumento do número de mitocôndrias, RE e núcleo com abundante eucromatina,
características típicas de células diferenciadas e ativadas.
Outra característica importante observada pela análise ultraestrutural foi a presença de
vacúolos autofágicos presentes no citoplasma das células tratadas com o extrato. Durante o
processo de diferenciação de monócitos em macrófagos várias alterações são observadas,
como aumento do tamanho celular, aumento do número de organelas, alteração da expressão
de proteínas de superfície e ativação de vias importantes como a autofagia, AKT e Caspase-8
(Jacquel et al., 2009; 2012; Zhang et al., 2012). A autofagia é um processo muito importante
durante a diferenciação celular, pois permite a proliferação dessas células e previne a morte
desses monócitos por apoptose (Zhang et al., 2012).
Este processo pode ser monitorado por meio da detecção da proteína LC3b. A análise
por citometria de fluxo revelou um aumento da marcação para a proteína LC3b no grupo de
células tratadas com EAPa e nas células submetidas ao processo de inanição quando
comparado ao grupo controle sem tratamento, sugerindo que EAPa esteja induzindo o
processo de autofagia durante a diferenciação dos monócitos em macrófagos. A ativação da
autofagia poderá ser induzida em diversas circunstâncias, incluindo a privação de nutrientes,
durante o combate de algumas bactérias intracelulares, através do estresse do RE e durante o
processo de maturação/proliferação celular (Mei et al., 2013; Mukhopadhyay et al., 2014). A
80
autofagia é um processo celular complexo, onde esse mecanismo poderá permitir que ocorra a
sobrevivência celular, ou promover morte não apoptótica (Mizushima et al., 2008; Zhang et
al., 2012). A análise ultraestrutural realizada por MET mostrou um aumento de RE no
citoplasma das células tratadas com EAPa no período de 96 horas, sugerindo assim que EAPa
esteja promovendo a ativação da autofagia através do estresse do RE e este mecanismo não é
danoso para as células, uma vez que não foi observada redução da viabilidade das células
tratadas. Desta forma, a autofagia induzida por EAPa favorece a sobrevivência celular,
permitindo a diferenciação dos monócitos em macrófagos.
A análise por microscopia óptica e eletrônica mostraram que a maioria das células
aderidas apresentavam morfologia típica de macrófagos, essas células apresentam algumas
características peculiares que permitem a sua identificação por técnicas de microscopia,
como: o espraiamento celular, forma do núcleo e vacuoalização citoplasmática. Porém, para
realizar uma análise mais precisa é necessário que sejam usados marcadores de superfície
específicos que são encontrados na membrana destes fagócitos. Os macrófagos apresentam
várias proteínas em sua superfície, dentre as quais se destacam a CD11b e F4/80. A proteína
CD11b é um integrina que pode ser encontrada na superfície dos neutrófilos, CD, linfócitos e
em macrófagos, porém a CD11b é expressa em grande quantidade na superfície dos
monócitos (Brom et al., 1995; Mcknight & Gordon, 1998), enquanto que a proteína F4/80, é
expressa somente na superfície dos macrófagos (Khazen et al., 2005).
No presente estudo a imunofenotipagem das células tratadas com EAPa foi realizada
utilizando os marcadores CD11b, F4/80 e CD11c. A análise por citometria revelou que as
células dos grupos EAPa, M-CSF e macrófagos peritoneais apresentaram uma maior
porcentagem de células marcadas positivamente para CD11b quando comparado ao grupo
controle. A marcação com F4/80 mostrou resultado similar ao da marcação com CD11b, onde
as células do grupo EAPa, M-CSF e macrófagos peritoneais apresentaram uma maior
porcentagem de células marcadas positivamente para F4/80 em relação ao controle.
A análise por intensidade de fluorescência da marcação de F4/80 mostrou que as
células do grupo EAPa, M-CSF e macrófagos peritoneais apresentaram um aumento da
intensidade de fluorescência quando comparado ao grupo controle, sugerindo que EAPa esteja
induzindo o processo de diferenciação de monócitos em macrófagos. Entretanto, foi
observado um aumento da intensidade de fluorescência de CD11b nas células do grupo
controle sem tratamento quando comparado aos grupos EAPa, M-CSF e de macrófagos
peritoneais. Estes resultados sugerem que existe uma população abundante de monócitos no
grupo controle.
81
O marcador CD11b também foi utilizado por Abud et al. (2006) e Cesar et al. (2008)
para caracterizar a população das células da medula óssea após tratamento com o
medicamento Canova®. Os autores observaram por microscopia de fluorescência que a
maioria das células aderidas e tratadas apresentavam morfologia típica de macrófago e
marcação positiva para o CD11b, inferindo assim, que esse medicamento induz a
diferenciação das células da medula óssea em monócitos/macrófagos, corroborando com os
resultados observados nesse trabalho.
Alguns estudos vêm utilizando produtos naturais com intuito de induzir o processo de
diferenciação celular. Inoue et al. (2014) mostraram que ninjin’yoeito, uma erva medicinal
utilizada no Japão, promoveu a diferenciação das células da medula óssea em macrófagos,
sendo observado por citometria de fluxo um aumento da porcentagem de células marcadas
positivamente com CD11b e F4/80. Nossos resultados também corroboram com os resultados
observados por De Oliveira et al. (2011), onde foi mostrado que M1 e M2, duas substâncias
altamente diluídas, apresentaram ação similar a de EAPa, pois estas substâncias também
estimularam o processo de maturação e diferenciação dos monócitos/macrófagos.
Os macrófagos são originados a partir da migração dos monócitos para os diferentes
tecidos, porém, os monócitos quando realizam a migração também podem se diferenciar em
CD, que também participam da resposta imunológica, atuando como uma APC (Geissmann et
al., 2010). As CD, são fagócitos que apresentam em sua superfície uma proteína denominada
de CD11c. Desta forma, para verificar se EAPa estimula o processo de diferenciação dos
monócitos em CD foi realizada a marcação dessa proteína por citometria de fluxo. A análise
mostrou que não houve aumento da marcação no grupo EAPa, mostrando que EAPa não
estimula o processo de diferenciação das células mononucleares da medula óssea em CD.
Cesar et al. (2008) observaram que o medicamento Canova® assim como EAPa estimula
apenas a diferenciação dos monócitos em macrófagos não promovendo diferenciação do
monócitos em CD.
A análise por citometria mostrou que EAPa estimula a diferenciação das células da
medula óssea em macrófagos, que são células importantes para a manuntenção de uma
resposta imune eficaz. Devido a isto, existe um crescente interesse de pesquisas direcionadas
para o estudo de bioprodutos capazes de promover ativação de macrófagos, induzindo o
aumento da atividade fagocítica e produção de ERO. Neste estudo foi mostrado que EAPa
promoveu a ativação das células medula óssea que estão passando pelo processo de
diferenciação celular através da produção de O2-. A contagem diferencial das células
marcadas positivamente com NBT mostrou que as células com pouco volume citoplasmático
82
do grupo EAPa apresentaram um aumento do número de células marcadas, mostrando que
EAPa promoveu o aumento da produção de O2- nesse tipo celular, entretanto, células tratadas
(100 μg/mL de EAPa) com maior volume citoplasmático apresentaram um número menor de
células marcadas para o NBT em relação ao controle sem tratamento.
A análise utilizando o marcador fluorescente CellROX® Green, para avaliar a
produção de todas as ERO, mostrou que não ocorreu aumento da produção das ERO no grupo
EAPa em relação ao grupo controle. Os ERO são importantes para a eliminação de patógenos
intracelulares, sinalização e crescimento celular, porém uma exacerbada produção destes
radicais pode promover uma série de danos celulares, induzindo apoptose (Dupré-Crochet et
al., 2013). Lee et al. (2006) e Madrigal-Matute et al. (2012) mostraram que o aumento da
produção de ERO é danoso para o organismo, promovendo morte celular. Além disso, estes
autores observaram que o silenciamento da produção de ERO promoveu aumento da
sobrevivência celular e inativação da via apoptótica.
No presente estudo, foi observado que EAPa promoveu uma regulação negativa na
produção de ERO, sendo observado uma produção destes radicais, especialmente O2-
nas
células com pequeno volume citoplasmático, ou seja, células que ainda estão passando pelo
processo de diferenciação celular. Entretanto, as células com maior volume citoplasmático,
consideradas células diferenciadas, apresentaram pouca ou nenhuma marcação positiva para o
NBT. Este resultado mostra que EAPa parece promover o silenciamento da produção de O2-
nas células diferenciadas prevenindo possíveis danos celulares. A marcação com CellROX
confirmou o que foi observado na citoquímica por NBT, sugerindo que EAPa promova uma
regulação negativa na produção de ERO em células diferenciadas, evitando assim ativação da
apoptose.
Em relação a produção de NO, EAPa apresentou uma ação inibitória da produção
destes radicais. Foi observada uma redução da produção de NO no grupo EAPa e nas células
estimuladas com M-CSF e tratadas com EAPa. Resultado similar foi observado por Soares et
al. (2003), que mostraram a inibição da produção de NO em macrófagos previamente
estimulados com LPS e INF-y e tratados com fisalinas B, F e G na concentração de 2 µg/mL.
O extrato da planta Physalis alkekengi também inibiu a produção de NO em macrófagos
tratados com concentrações de 50 e 100 µg/mL (Kang et al., 2011).
Assim como a análise da produção de ERO e NO, a fagocitose também é uma forma
de avaliar a ativação de macrófagos. Desta forma, neste trabalho foi mostrado pela primeira
vez que EAPa não induz o aumento na atividade fagocítica em células da medula óssea
tratadas por 96 horas. Em um estudo realizado por Garcia et al. (2002) foi observado que os
83
extratos vimang e mangiferin, assim como EAPa, também não foram capazes de aumentar a
atividade fagocítica nos macrófagos.
Resultados prévios obtidos pelo nosso grupo de pesquisa (Laboratório de
Parasitologia-UFPA) mostraram que EAPa na concentração de 100 µg/mL apresentou a
capacidade de ativar macrófagos peritoneais de murinos. Análises morfológicas evidenciaram
que macrófagos tratados apresentaram maior padrão de espraiamento celular, aumento do
volume citoplasmático e do número de projeções citoplasmáticas. EAPa não estimulou o
aumento da produção de NO e nem aumentou a atividade fagocítica dessas células, porém, o
ensaio citoquímico NBT revelou que EAPa na concentração de 100 μg/mL apresentou a
capacidade de promover o aumento de O2-, e esse resultado foi confirmado pela contagem das
células marcadas positivamente com NBT (Silva, 2013). Os resultados citados complementam
com os que foram observados neste trabalho, mostrando a capacidade de EAPa em ativar as
células mononucleares que estão passando pelo processo de diferenciação celular. Entretanto,
estudos adicionais serão necessários para verificar os mecanismos de ação envolvidos na
inibição de NO, ERO e atividade fagocítica em células diferenciadas e tratadas com EAPa.
Após observar que EAPa é capaz de induzir a diferenciação das células da medula
óssea em macrófagos, o próximo passo do estudo foi investigar ação de EAPa durante
interação com o protozoário L. (L.) amazonensis e macrófagos derivados da medula óssea. Os
macrófagos são células importantes para defesa do organismo, principalmente contra
patógenos intracelulares (Mosser & Edwards, 2008, Geissmann et al., 2010). Já foi
demonstrado pelo nosso grupo que EAPa foi capaz de eliminar formas amastigotas do
protozoário L. (L.) amazonensis em macrófagos peritoneais infectados e tratados por um
período de 72 horas.
A ação leishmanicida das substâncias purificadas (fisalinas) obtidas de P. angulata já
é conhecida (Guimarães et al., 2009; Meira et al., 2013; Nogueira et al., 2013). As fisalinas B
e F foram capazes de induzir a morte das formas amastigotas em modelo experimental in vitro
e in vivo (Guimarães et al., 2009). Entretanto, nenhum trabalho mostrou a ação do extrato
aquoso de P. angulata em macrófagos derivados da medula óssea infectados com o
protozoário Leishmania. Este estudo também teve como objetivo verificar se EAPa
apresentava capacidade de promover a morte do protozoário L. (L.) amazonensis no interior
das células da medula óssea tratadas por 48 e 96 horas.
Neste estudo, as células da medula óssea foram previamente tratadas com EAPa por
48 e 96 horas e posteriormente infectadas com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e
84
por fim tratadas com EAPa por 24 horas para avaliar a ação do extrato durante a fase inicial
da interação e 72 horas, para assim observar ação nas formas amastigotas.
EAPa apresentou ação antiproliferativa sobre as formas intracelulares de L. (L.)
amazonensis, apresentando uma redução do número destes parasitos após 24 e 72 horas de
tratamento. Diversos estudos utilizando extratos de plantas têm mostrado que essas
substâncias apresentam ação antripoliferativa sobre as formas intracelulares de diferentes
espécies de Leishmania, sem causar nenhum efeito citotóxico aos macrófagos (Luize et al.,
2005, Guimarães et al., 2009, Laurella et al., 2012, Nogueira et al., 2013).
Em outra análise, onde as células da medula óssea foram tratadas por 96 horas com
EAPa, porteriormente infectadas com L. (L.) amazonensis e por fim incubadas por 24 horas
sem a presença de EAPa, foi possível observar que as células tratadas apenas antes do
processo de interação apresentaram uma redução de 4,2% de parasitos intracelulares em
relação ao controle sem tratamento. Estes resultados mostram que EAPa apresenta uma ação
leishmanicida mais eficaz quando está presente no meio de cultura. Entretanto, é necessária a
realização de testes complementares para verificar se as células tratadas com EAPa
permanercem ativadas após a infecção com L. (L.) amazonensis e se as organelas das formas
intracelulares de L. (L.) amazonensis apresentam alguma alteração ultraestrutural.Guimarães
et al. (2009) também observaram a mesma característica quando utilizaram as substâncias
purificadas de P. angulata, entretanto os autores não conseguiram concluir se a ação
leishmanicida de P. angulata era através da ativação dos macrófagos, atuação direta sobre o
protozoário ou os dois mecanismos. Este estudo demonstrou pela primeira vez o mecanismo
de ação de EAPa sobre as formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, identificando a via de
morte celular que EAPa ativa para promover a morte do parasito.
A análise com o marcador CellROX® Green evidenciou um aumento da produção de
ERO em promastigotas tratadas com EAPa por 48 horas, e com maior intensidade durante 72
horas de tratamento. As ERO são produzidas principalmente na mitocôndria, e quando ocorre
um acúmulo destes radicais a integridade mitocondrial é comprometida, observando danos
nessa organela, principalmente no DNA mitocondrial, desestabilização do potencial de
membrana mitocondrial, ocorrendo assim ativação da apoptose (Lawen, 2003; Veal et al.,
2007). Os resultados apontam que EAPa esteja promovendo danos na mitocôndria do
parasito, pois foi observado em promastigotas tratadas com extrato um aumento da produção
de ERO e uma diminuição do potencial mitocondrial, indicativo de processo inicial de
apoptose.
85
Células apoptóticas apresentam características peculiares que as diferenciam das
células viáveis, como a fragmentação do DNA e a externalização da FS (Lawen, 2003). A
análise por citometria da marcação com Anexina-V, um marcador que se liga a FS
externalizada, revelou que as promastigotas tratadas com EAPa por 72 horas apresentaram um
aumento da porcentagem de células marcadas positivamente para Anexina-V quando
comparado ao grupo controle, confirmando o que foi observado na análise do método JC-1.
Diversos compostos apresentam a capacidade de promover a morte do protozoário
Leishmania através da ativação da apoptose. Estes trabalhos mostraram que as Leishmanias
apoptóticas apresentaram: danos na mitocôndria, diminuição do potencial de membrana
mitocondrial, aumento da produção de ERO e aumento da externalização da FS (Roy et al.,
2008; Britta et al., 2014; Chowdhury et al., 2014; Tiuman et al., 2014). A partir dos
resultados realizados com as promastigotas de L. (L.) amazonensis pode-se concluir que EAPa
induz a morte por apoptose nestes protozoários. EAPa parece apresentar seletividade pelo
parasito, pois não foi observado redução da viabilidade das células da medula óssea tratadas
com EAPa.
Compostos isolados e o extrato de P. angulata apresentam inúmeras funções
biológicas descritas na literatura (Januário et al., 2002; Bastos et al., 2006; 2008; Sá et al.,
2011; Nogueira et al., 2013), entretanto, as fisalinas isoladas apresentam ações biológicas que
não são observadas quando se utilizam todas as fisalinas em conjunto ou o extrato. Meira et
al. (2013), mostraram que os protozoários Trypanosoma cruzi tratados com fisalina B sofrem
morte por autofagia e necrose. Neste estudo foi observado que não ocorreu ativação da via
autofágica e de necrose em promastigotas de L. (L.) amazonensis tratadas com EAPa, e sim
morte celular programada.
Estudos mostram que extratos de plantas apresentam varias vantagens, como fácil
obtenção e baixo custo quando comparadas a substâncias purificadas (Rasoanaivo et al.,
2011). Além disso, extratos de plantas apresentam várias substâncias bioativas em sua
composição que podem atuar em sinergismo apresentando diversas funções biológicas
(Briskin, 2000; Gilbert & Alves, 2003). Baseado nisso, podemos sugerir que a capacidade de
EAPa em induzir o processo de diferenciação das células da medula óssea em macrófagos e
de promover a morte do protozoário Leishmania esteja associada com o sinergismo entre as
fisalinas D, E, F e G presentes no extrato (Dados não publicados).
EAPa parece, então, atuar como uma substância imunomoduladora, induzindo a
diferenciação dos macrófagos, favorecendo uma resposta imune mais eficaz e protetora contra
invasão de patógenos intracelulares. A partir dessa ação imunomoduladora, pode-se
86
considerar EAPa como uma substância em potencial para o tratamento da LCD, tendo em
vista, que nesta forma clínica da leishmaniose tegumentar o paciente apresenta o sistema
imunológico debilitado, dificultando o tratamento. Nossa hipótese é que EAPa seja capaz de
modular o sistema imunológico, dificultando possíveis recaídas observadas na LCD, e a sua
ação leishmanicida poderá promover a morte dos protozoários Leishmania presentes nas
lesões.
Este estudo mostrou pela primeira vez a ação de EAPa sobre as células da medula
óssea e o mecanismo de ação sobre as formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, podendo
sugerir que o extrato aquoso da raiz da planta Physalis angulata possa se tornar uma
substância promissora no desenvolvimento de um medicamento para as leishmanioses.
87
5 CONCLUSÃO
Os resultados apresentados e discutidos permitem concluir que o extrato aquoso da
raiz da planta Physalis angulata:
1. Não apresentou efeito citotóxico para as células da medula óssea tratadas durante 96 horas.
2. Interferiu no processo de proliferação, diferenciação e adesão dos linfócitos e
polimorfonucleares e promoveu um aumento do número de fagócitos mononucleares.
3. Induziu alterações morfológicas nas células da medula óssea, uma vez que foi observado
um aumento da área celular, aumento da habilidade de espraiamento celular e do número de
projeções citoplasmáticas.
4. Induziu a ativação da autofagia durante o processo de diferenciação celular.
5. Promoveu a diferenciação das células da medula óssea em macrófagos.
6. Induziu aumento da produção de radicais superóxidos em células em diferenciação, porém
não estimulou a produção de ERO, de NO e nem o aumento da atividade fagocítica em
células diferenciadas.
7. Apresentou ação leishmanicida sobre as formas intracelulares de L. (L.) amazonensis.
8. Induziu o aumento da produção de ERO e morte por apoptose em promastigotas de L. (L.)
amazonensis.
88
6 REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K., LIGTHMAN, A.H., PILLAI, S. Biologia Celular e Molecular. Rio de
Janeiro, Elsevier, 2012. 544p.
ABDELHAY, E.S.F.W., BRAGA, F.H.P., BINATO, R., BOUZAS, L.F.S. Hematopoietic
stem cells: expansion and perspectives for therapeutic use. Rev. Bras. Hematol.
Hemoter 31: 2-8, 2009.
ABUD, A.P.R., CESAR, B., CAVAZZANI, L.F.M., OLIVEIRA, C.C., GABARDO, J.,
BUCHI, D.F. Activation of bone marrow cells treated with Canova in vitro. Cell Biology
International 30 (10): 808-816, 2006.
AGATA, K., KUSIAK. J., STEPIÉN, B., BERGIER, K., KUŹNIAK, E. Bioaktywne
metabolity wtórne roślin z rodzaju Physalis. Postepy Hig. Med. Dosw. 64: 665-673,
2010.
ALAVI-NAINI, R., FAZAELI, A., O’DEMPSEY, T. Tropical treatment modalities for old
world cutaneous leishmaniasis: a review. Praque. Med. Rep. 113 (2): 105-118, 2012.
ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P.
Biologia Molecular da Célula. São Paulo, Artmed, 2010. 1287p.
APPELBERG, R. Neutrophils and intracellular pathogens: beyond phagocytosis and killing.
Thends Microbiol. 15 (2): 87-92, 2007.
ARROYO, D.S., GAVIGLIO, E.A., PERALTA RAMOS, J.M., BUSSI, C., RODRIGUEZ
GALAN, M.C., IRIBARREN, P. Autophagy in inflammation, infection,
neurodegeneration and cancer. Int. Immunopharmacol 18 (1): 55-65, 2014.
ASHUTOSH., SUNDAR, S., GOYAL, N. Molecular Mechanisms of Antimony Resistance In
Leishmania. J. Med. Microbiol 56 (2): 143-153, 2007.
AUFFRAY, C., SIEWEKE, M.H., GEISSMANN, F. Blood Monocytes: Development,
Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annu. Rev. Immunol. 27: 669-
692, 2009.
BAILEY, M.S., LOCKWOOD, D.N. Cutaneous Leihmaniasis. Clin. Dermatol. 25 (2): 203-
211, 2007.
BANCHEREAU, J., STEINMAN, R.N. Dendritic cell e the control of immunity. Nature 392
(6673): 245-252, 1998.
BASANO, S.A., CAMARGO, L.M.A. Leishmaniose tegumentar americana: histórico,
epidemiologia e perspectivas de controle. Rev. Bras. Epidemiol. 7 (3): 328-337, 2004.
BASTOS, G.N., SANTOS, A.R., FERREIRA, V.M., COSTA, A.M., BISPO, C.I.,
89
SILVEIRA, A.J., DO NASCIMENTO, J.L. Antinociceptive effect of the aqueous extract
obtained from roots of Physalis angulata L. on mice. J. Ethnopharmacol. 103 (2): 241-
245, 2006.
BASTOS, G.N.T., SILVEIRA, A.J.A., SALGADO, C.G., PICANÇO-DINIZ, D.L.W.,
NASCIMENTO, J.L.M. Physalis angulata extract exerts anti-inflammatory effects in
rats by inhibiting different pathways. J. Ethnopharmacol. 118 (2): 246–251, 2008.
BOGDAN, C. Leishmaniasis in rheumatology, haematology and oncology: epidemiological,
immunological and clinical aspects and caveats. Ann. Rheum. Dis. 71 (2): 60-66, 2012.
BRASIL. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. Série A.
Brasília: Fundação Nacional de Saúde - FUNASA, 180p., 2013.
BRAGA, P.C., MARABINI, L., WANG, Y.Y., LATTUADA, N., CALÒ, R., BERTELLI,
A., FALCHI, M., DAL SASSO, M., BIANCHI, T. Characterisation of the antioxidant
effects of Aesculus hippocastanum bark extract on the basis of radical scavenging
activity, the chemiluminescence of human neutrophil bursts and lipoperoxidation assay.
Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 3: 1-9, 2012.
BRISKIN, D.P. Medicinal plants and phytomedicines. Linking plant biochemistry and
physiology to human health. American Society Plant Physiol. 124 (2): 507-514, 2000.
BRITTA, E.A., SCARIOT, D.B., FALZIROLLI, H., UEDA-NAKAMURA, T., SILVA, C.C.,
DIAS, B.P.FILHO., BORSALI, R., NAKAMURA, C.V. Cell death and ultrastructural
alterations inLeishmania amazonensis caused by new compound 4-Nitrobenzaldehyde
thiosemicarbazone derived from S-limonene. BMC Microbiology 14:236, 2014.
BROM, J., KOLLER, M., SCHLUTER, B., MULLER-LANGE, P., ULRICH STEINAU, H.,
KONING, W. Expression of the adhesion molecule CD11b and polymerization of actin
by polymorphonuclear granulocytes of patients endangered by sepsis. Burns 21 (6): 427-
431, 1995.
BRYDER, D., ROSSI, D.J., WEISSMAN, I.L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic
tissue-specific stem cell. Am. J. Pathol. 169 (2): 338-346, 2006.
CAMPOS, M.B., DE CASTRO GOMES, C.M., DE SOUZA, A.A., LAINSON, R.,
CORBETT, C.E., SILVEIRA, F.T. In vitro infectivity of species of Leishmania
(Viannia) responsible for American Cutaneous Leishmaniasis. Parasitol. Res. 103 (4):
771-776, 2008.
CAPOZZOLI, U. Scientific American Brasil- Edição especial ciência e saúde nª 3, São
Paulo, Segmento. Disponível em: <http://www2.uol.com.br/sciam>. Acesso em
20/01/2014.
90
CARVALHO, A.K., SILVEIRA, F.T., PASSERO, L.F., GOMES, C.M., CORBETT, C.E.,
LAURENTI, M.D. Leishmania (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis promote
differential expression of dendritic cells and cellular immune response in murine model.
Parasite Immunology 34 (8-9): 395-403, 2012.
CASTELLANO, L.R.C. Resposta imune anti-Leishmania e mecanismos de evasão. VITAE
Academia Biomédica Digital: 1-19, 2005.
CELLA, M., SALLUSTO, F., LANZAVECCHIA, A. Origin, maturation and antigen
presenting function of dendritic cell. Curr. Opin. Immunol. 9 (1): 10-16, 1997.
CESAR, B., ABUD, A.P.R., OLIVEIRA, C.C., CARDOSO, F., GREMSKI, W., GABARDO,
J., BUCHI, D.F. Activation of mononuclear bone marrow cells treated in vitro with a
complex homeopathic medication. Micron 39 (4): 461–470, 2008.
CHATTOPADHYAY, A., JAFURULLA, M.D. A novel mechanism for an old drug:
Amphotericin B in the treatment of visceral leishmaniasis. Biochem. Biophys. Res.
Commum. 416 (1-2): 7-12, 2011.
CHOUDHARY, M.I., YOUSUF, S., SAMREEN., SHAH, S.A., AHMED, S., ATTA-UR-
RAHMAN. Biotransformation of physalin H and leishmanicidal activity of its
transformed products. Chem. Pharm. Bull. 54 (7): 927-930, 2006.
CHOWDHURY, S., MUKHERJEE, T., CHOWDHURY, S.R., SENGUPTA,
S., MUKHOPADHYAY, S., JAISANKAR, P., MAJUMDER, H.K. Disuccinyl betulin
triggers metacaspase-dependent endonuclease G-mediated cell death in unicellular
protozoan parasite Leishmania donovani. Antimicrob. Agents Chemother. 58 (4):
2186-2201, 2014
CLEM, A.A. current perspective on Leishmaniasis. J. Glob. Infect. Dis. 2 (2): 124-126,
2010.
CORRALES, R.M., SERENO, D., MATHIEU-DAUDÉ, F. Deciphering the Leishmania
exoproteome: what we know and what we can learn. FEMS Immunol. Med.
Microbiol. 58 (1): 27-38, 2010.
CROFT, S.L., OLLIARO, P. Leishmaniasis chemotherapy-challenges and opportunities.
Clinical Microbiology and Infection. 17 (10): 1478-1483, 2011.
CRUVINEL, W.M., MESQUITA-JINIOR, D., ARAÚJO, J.A.P., CATELAN, T.T.T., DE
SOUZA, A.W.S., SILVA, N.P., ANDRADE, L.E.C. Sistema Imunitário – Parte I
Fundamentos da imunidade inata com ênfase nos mecanismos moleculares e celulares da
resposta inflamatória. Rev. Bras. Reumatol 5: 434-461, 2010.
DALE, D.C., BOXER, L., LILES, W.C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chowdhury%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24468787
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mukherjee%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24468787
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jaisankar%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24468787
91
112 (4): 935-945, 2008.
DAS, M., MUKHERJEE, S.B., SHAHA, C. Hydrogen Peroxide apoptosis-like death in
Leishmania donovani promastigotes. Journal of Cell Science 114 (13): 2461-2469,
2001.
DAVID, C.V., CRAFT, N. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Dermatol. Ther. 22
(6): 491-502, 2009.
DEANS, R.L., MOSELEY, A.B. Mesenchimal stem cell: Biology and potencial clinical use.
Exp. Hematol. 28 (8): 875-884, 2000.
DELORENZI, J.C., ATTIAS, M., GATTAS, C.R., ANDRADE, M., REZENDE, C., CUNHA
PINTO, A., HENRIQUE, A.T., BOU-HABIB. D.C., SARAIVA, E.M. Antileishmanial
activity of na índole alkaloid from Peschiera australis. Antimicrob. Agents
Chemother. 45 (5): 1349–1354, 2001.
DE OLIVEIRA, C.I., NASCIMENTO, I.P., BARRAL, A., SOTO, M., BARRAL-NETTO,
M. Challenges and perspectives in vaccination against leishmaniasis. Parasitol. Int. 58
(4): 319-324, 2009.
DE OLIVEIRA, C.C., ABUD, A.P.R., DE OLIVEIRA, S.M., GUIMARÃES, F.S.F.,
ANDRADE, L.F., DI BERNARDI, R.P., COLLETO, E.L.O., KUCZERA, D., DA
LOZZO, E.J., GONÇALVES, J., TRINDADE, E.S., BUCHI, D.F. Developments on
drug discovery and on new therapeutics: highly diluted tinctures act as biological
response modifiers. BMC Complementary and Alternative Medicine, 11: 1-11, 2011.
DE SOUZA, W. An introduction to the structural organization of parasitic protozoa. Curr.
Pharm. Des. 14 (9): 822-838, 2008.
DICKHOUT, J.G., LHOTÁK, S., HILDITCH, B.A., BASSERI, S., COLGAN, S.M., LYNN,
E.G., CARLISLE, R.E., ZHOU, J., SOOD, S.K., INGRAM, A.J., AUSTIN, R. C.
Induction of the unfolded protein response after monocyte to macrophage differentiation
augments cell survival in early atherosclerotic lesions. FASEB Journal 25 (2): 576-589,
2011.
DUPRÉ-CROCHET, S., ERARD, M., NÜ, O. ROS production in phagocytes: why, when,
and where?. J. Leukoc. Biol. 94 (4): 657-670, 2013.
EL−BENNA, J., DANG, P.M., GOUGEROT−POCIDALO, M.A., ELBIM, C. Phagocyte
NADPH oxidase: a multicomponent enzyme essential for host defenses. Arch.
Immunol. Ther. Exp. 53 (3): 199–206, 2005.
FALCÃO, R.P., CALADO, R.T. Fundamentos e práticas. Produção, dinâmica e função
das células sanguíneas. São Paulo, Atheneu, 2001. 1090p.
92
FIDALGO, L.M., GILLE, L. Mitochondria and Trypanosomatids: Targets and Drugs.
Pharm. Res. 28 (11): 2758-2770, 2011.
FINAUD, J., LAC, G., FILAIRE, E. Oxidative Stress: Relationship with Exercise and
Training. Sports medicine 36 (4): 327-358, 2006.
FISCHER, S.O., HÜBNER, G.D., VARGAS, T.V. Imunomodulação pela própolis. Arq. Inst.
Biol. 75 (2): 247-253, 2008.
FOTAKIS, G., TIMBRELL, J.A. In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, vermelho
neutro, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium
chloride. Toxicol. Lett. 160: 171-77, 2006.
FREITAS, J.C.C., PINHEIRO, D.C.S.N. Aspectos celulares e moleculares da resposta
imunitária a Leishmania spp. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias 109: 11-20,
2010.
FRÉZARD, F., DEMICHELI, C., RIBEIRO, R.R. Pentavalent Antimonials: New
Perspectives for Old Drugs. Molecules 14 (7): 2317-2336, 2009.
GARCIA, D., DELGADO, R., UBEIRA, F.M., LEIRO, J. Modulation of rat macrophage
function by the Mangifera indica L. extracts Vimang and mangiferin. International
Immunopharmacology, 2 (6): 797–806, 2002.
GEISSMANN, F., MANZ, M.G., JUNG, S., SIEWEKE, M.H., MERAD, M., LEY, K.
Dendritic Cells Development of Monocytes, Macrophages, and Dendritic Cells. Science
327 (5966): 656-661, 2010.
GILBERT, B., ALVES, L.F. Synergy in plant medicines. Curr. Med. Chem. 10 (1): 13-20,
2003.
GHONIME, M., ELDOMANY, R., ABLELAZIZ, A., SOLIMAN, H. Evaluation of
immunomodulatory effect of three herbal plants growing in Egypt. Immunopharmacol
Immunotoxicol 33 (1): 141-145, 2011.
GONÇALVES, R., ZHANG, X., COHEN, H., DEBRABANT, A. MOSSER, D.M. Platelet
activation attracts a subpopulation of effector monocytes to sites of Leishmania major
infection. J. Exp. Med. 208 (6): 1253-1265, 2011.
GORDON, S. Alternative activation of macrophage. Nat. Rev. Immunol. 3 (1): 23-25, 2003.
GOTO, H., LINDOSO, J.A. Current diagnosis and treatment of cutaneous and
mucocutaneous leishmaniasis. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 8 (4): 419-433, 2010.
GUIMARÃES, E. T., LIMA, M.S., SANTOS, L.A., RIBEIRO, I.M., TOMASSINI, T.B.C.,
DOS SANTOS, R.R., DOS SANTOS, W.L.C. SOARES, M.P.B. Activity of physalins
purified from P. angulata in vitro and in vivo models of cutaneous leishmaniasis.
93
Journal of Antimicrobial Chemotherapy 64 (1): 84–87, 2009.
GUIMARÃES, L.R., RODRIGUES, A.P., MARINHO, P.S., MULLER, A.H., GUILHON,
G.M., SANTOS, L.S., DO NASCIMENTO, J.L., SILVA, E.O. Activity of
the julocrotine, a glutarimide alkaloid from croton Pullei var. glabrior, on Leishmania
(L.) amazonensis. Parasitol. Res. 107 (5): 1075-1080, 2010.
HAMSA, T.P., KUTTAN, G. Ipomoea obscura ameliorates cyclophosphamide-induced
toxicity by modulating the immune system and levels of proinflammatory cytokine and
gsh. Can. J. Physiol. Pharmacol. 88 (11): 1042-1053, 2010.
HAWKES, G.J., LESTER, R.N., NEE, M., ESTRADA, N. Solanaceae III: taxonomy
chemistry evolution. London, Royal Botanic Gardens, 1991. 492p.
HEITBROCK, L.Z. The CD14+ CD16
+ blood monocytes: their role in infection and
inflammation. Journal of Leukocyte Biology 81 (3): 584–592, 2007.
HEITBROCK, L.Z., ANCUTA, P., CROWE, S., DALOD, M., GRAU, V., HART, D.N.,
LEENEN, P.J.M., LIU Y.J., PHERSON, M.G., RANDOLPH, G.J., SCHERBERICH, J.,
SCHMITZ, J., SHORTMAN, K., SOZZANI, S., STROBL, H., ZEMBALA, M.,
AUSTYN, J.M., LUTZ, M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.
Blood 116 (16): 74-80, 2010.
HORTA, M.F., MENDES, B.P., ROMA, E.H., NORONHA, F.S.M., MACÊDO, J.P.,
OLIVEIRA, L.S., DUARTE, M.M., VIEIRA, L.Q. Reactive Oxygen Species and Nitric
Oxide in Cutaneous Leishmaniasis. Journal of Parasitology Research: 1-11, 2012.
HUBER, R., PIETSCH, D., GÜNTHER, J., WELZ, B., VOGT, N., BRAND, K. Regulation
of monocyte differentiation by specific signaling modules and associated transcription
factor networks. Cell Mol. Life Sci. 71 (1): 63-92, 2014.
HYO-YANG, A., KATHRYN, E., SMITH, F. Two-photon fluorescence microscopy imaging
of cellular oxidative stress using profluorescent nitroxides. Journal of the American
Chemical Society 134 (10): 4721-4730, 2012.
INOUE, T., KULKEAW, K., MUENNU, K., TANAKA, Y., NAKANISHI, Y., SUGIYAMA,
D.Herbal drug ninjin'yoeito accelerates myelopoiesis but not erythropoiesis in vitro.
Genes Cells 19 (5): 432-440, 2014.
INABA, K., INABA, M., ROMANI, N., AYA, H., DEGUCHI, M., IKEHARA, S.,
MURAMATSU, S., STEINMANL, R. Generation of large numbers of dendritic cells
from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-
stimulating factor. J. Exp. Med. 176 (6): 1693-1702, 1992.
JACQUEL, A., BENIKHLEF, N., PAGGETTI, J, LALAOUI, N., GUERY, L., DUFOUR,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rodrigues%20AP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20661748
94
E.K., CIUDAD, M., RACOEUR, C., MICHEAU, O., DELVA L., DROIN,
N., SOLARY, E. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in
phosphatidylinositol-3 kinase/akt are required for caspase activation in monocytes
undergoing differentiation into macrophages. Blood 114 (17): 3633-3641, 2009.
JACQUEL, A., BBA, S., BOYER, L., DUFIES, M., ROBERT, G., LEMICHEZ, P.G.E.,
LUCIANO, F., SOLARY, E., AUBERGER, P. Autophagy is required for CSF-1-induced
macrophagic differentiation and acquisition of phagocytic functions. Blood 119 (19):
4527-4531, 2012.
JANUÁRIO, A.H., FILHO, E.R., PIETRO, R.C., KASHIMA, S., SATO, D.N., FRANÇA,
S.C. Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae). Phytother
Res. Aug. 16 (5): 445-448, 2002.
JUNQUEIRA, L.C., CARNEIRO, J. Histologia Básica. Rio de Janeiro, Guanabara/Koogan,
2008. 507p.
KAMWAVI, S. Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: Friends or foes?. Trends
Parasit. 22 (9): 439-445, 2006.
KANG, H., KWON, S.R., CHOI, H.Y. Inhibitory effect of physalis alkekengi l. var franchetii
extract and its chloroform fraction on LPS or LPS/INF-γtimulatedinflamatory response in
peritoneal macrophages. J. Ethnopharmacol. 135 (1): 95-101, 2011.
KAPPAGODA, S., SINGH, U., BLACKBURN, B.G. Antiparasitic therapy. Mayo. Clin.
Proc. 86 (6): 561-583, 2011.
KAUTZ-NEU, K., SCHWONBERG, K., FISCHER, M.R., SCHERMANN, A.I., VON
STEBUT, E. Dendritic cells in Leishmania major infections: mechanisms of parasite
uptake, cell activation and evidence for physiological relevance. Med. Microbiol.
Immunol. 201 (4): 581-592, 2012.
KAYE, P., SCOTT, P. Leishmaniasis: complexity at the host-pathogen interface. Nature
Reviews Microbiology 9 (8), 604-15, 2011.
KEDZIERSKI, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are we today?. J. Glob. Infect Dis. 2 (2):
177-185, 2010.
KEDZIERSKI, L. Leishmaniasis. Human Vaccines 7 (11): 1204-1214, 2011.
KHAZEN, W., M’BIKA, J.P., TOMKIEWICZ, C., BENELLI, C., CHANY, C., ACHOUR,
A., FOREST, C. Expression of macrophage-selective markers in human and rodent
adipocytes. FEBS lette 579 (25): 5631-5634, 2005.
KIEL, J.A. Autophagy in unicellular eukaryote. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.
365 (1541): 819-830, 2010.
95
KLING, C.J., KÖRNER, H. Different regulatory mechanisms in protozoan parasitic
infections. International Journal for Parasitology 43 (6): 417-425, 2013.
KONDO, M., WEISSMAN, I.L., AKASHI, K. Identification of clonogenic common
lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 91 (5): 661-672, 1997.
LAURELLA, L.C., FRANK, F.M., SARQUIZ, A., ALONSO, M.R., GIBERTI, G.,
CAVALLARO, L., CATALÁN, C.A., CAZORLA, S.I., MALCHIODI, E., MARTINO,
V.S., SÜLSEM, V.P. In vitro evaluation of antiprotozoal and antiviral activities of
extracts from Argentinean Mikania species. ScientificWorldJournal: 2012.
LAWEN, A. Apoptosis—an introduction. Bioessays 25 (9): 888-896, 2003.
LEE, S., MOON, S.O., KIM, W., SUNG, M.J., KIM, D.H., KANG, K.P., JANG, Y.B., LEE,
J.E., JANG, K.Y., LEE, S.Y., PARK, S.K. Protective role of l-2-oxothiazolidine-4-
carboxylic acid in cisplatin-induced renal injury. Nephrol. Dial. Transplant. 21 (8):
2085-2095, 2006.
LEE, H.Z., LIU, W.Z., HSIEH,W.T., TANG, F.Y., CHUNG, J.G., LEUNG, W.C. Oxidative
stress involvement in Physalis angulata-induced apoptosis in human oral cancer cells.
Food and Chemical Toxicology 47 (3): 561–570, 2009.
LI, Y.Z., PAN Y.M., HUANG X.Y., WANG H. S. Withanolides from Physalis alkekengi var.
francheti. Helv. Chim. Acta 91 (12): 2284-2291, 2008.
LIN, Y.S., CHIANG, H.C., KAN, W.S., HONE, E., SHIH, S.J., WON, M.H.
Immunomodulatory activity of various fractions derived from Physalis angulata L.
extract. The American Journal of Chinese Medicine, 20 (3-4): 233–243, 1992.
LIU, D., UZONNA, J.E. The early interaction of Leishmania with macrophages and dendritic
cells and its influence on the host immune response. Front. Cell Infect. Microbiol. 2
(83): 1-8, 2012.
LIZ, R., HORST, H., PIZZOLATTI, M.G., FRODE, T.S., GIRARD, D. Activation of human
neutrophils by the anti-inflammatory mediator Esenbeckia leiocarpa leads to atypical
apoptosis. Mediators inflamm 20: 1-10, 2012.
LUIZE, P.S., TIUMAN, T.S., MORELHO, L.G., MAZA, P.K., UEDA-NAKAMURA, T.,
DIAS FILHO, B.P., CORTEZ, D.A.G., MELLO, J.C.P., NAKAMURA, C.V. Effects of
medicinal plant extracts on growth of Leishmania (L.) amazonensis and Trypanosoma
cruzi. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas 41 (1): 85–94, 2005.
LUSAKIBANZA, M., MESIA, G., TONA, G., KAREMERE, S., LUKUKA, A., TITS, M.,
ANGENOT, L., FRÉDÉRICH, M. In vitro and in vivo antimalarial and cytotoxic activity
of five plants used in congolese traditional medicine. Journal of Ethnopharmacology
96
129 (3): 398-402, 2010.
MAGALHÃES, H.I.F. Atividade antitumoral (In vitro e In vivo) das fisalinas isoladas de
Physalis angulata. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Fortaleza, Universidade
Federal do Ceará, 2005. 101p.
MAITY, P.C., BHATTACHARJEE, S., MAJUMDAR, S., SIL, A.K. Potentiation by cigarette
smoke of macrophage function against Leishmania donovani infection. Inflamm. Res.
58 (1): 22–29, 2009.
MARIM, F.M., SILVEIRA, T.N,, LIMA, S.D. JR., ZAMBONI, D.S. A method for
generation of bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone
marrow cells. PLoS One 5 (12): 152-63, 2010.
MARLETTA, M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J. Biol. Chem. 268 (17):
12231-12234, 1993.
MADRIGAL - MATUTE, J., FERNANDEZ - GARCIA, C.E., GOMEZ - GUERRERO,
C., LOPEZ - FRANCO, O., MUÑOZ - GARCIA, B., EGIDO, J., BLANCO - COLIO,
L.M., MARTIN - VENTURA, J.L. HSP90 inhibition by 17-DMAG attenuates oxidative
stress in experimental atherosclerosis. Cardiovasc. Res. 95 (1): 116-123, 2012.
MAURER, M., DONDJI, B., VON STEBUT. What determines the success or failure of
intracellular cutaneous parasites? Lessons learned from leishmaniasis. Med. Microbiol.
Immunol. 198 (3): 137–146, 2009.
MAYANI, H., FIGUEROSA, E.F., PELAYO, R., MONTESINOS, J.J., GUZMÁN, P.F.,
GONZÁLEZ, A.C. Hematopoyesis. Cancelorogia 2: 95-107, 2007.
MCGWIRE, B.S., SATOSKAR, A.R. Leishmaniasis: clinical syndromes and treatment. Q. J.
Med. 107 (1): 7-14, 2014.
MCKNIGHT, A.J., GORDON, S. The EGF-TM7 family: unusual structures at the leukocyte
surface. J. Leukoc. Biol. 63 (3): 271-280, 1998.
MEI, Y., THOMPSON, M.D., COHEN, R.A., TONG, X. Endoplasmic Reticulum Stress and
Related Pathological Processes. J. Pharmmacol. Biomed. Anal 15 (2): 1-16, 2013.
MEIRA, C.S., GUIMARÃES, E.T., BASTOS, T.M., MOREIRA, D.R.M., TOMASSINI,
T.C.B., RIBEIRO, I.M., SANTOS, R.R., SOARES, M.B.P. Physalins B and F, seco-
steroids isolated from Physalis angulata L., strongly inhibit proliferation, ultrastructure
and infectivity of Trypanosoma cruzi. Parasitology 140 (14): 1811-1821, 2013.
MESQUITA-JUNIOR, D., ARAÚJO, J.A.P., CATELAN, T.T.T., DE SOUZA, A.W.S.,
CRUVINEL, W.M., ANDRADE, L.E.C., SILVA, N.P. Sistema Imunitário – Parte II
Fundamentos da resposta imunológica mediada por linfócitos T e B. Rer. Bras.
97
Reumatol 50 (5): 552-580, 2010.
MIZUSHIMA, N., LEVINE, B., CUERVO, A.M., KLIONSKY, D.J. Autophagy fights
disease through cellular self-digestion. Nature 451 (7182): 1069-1075, 2008.
MOSSER, D.M. The many faces of macrophage activation. Journal of Leukocyte Biology
73 (2): 209-212, 2003.
MOSSER, D.M., EDWARDS, J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation.
Nat. Rev. Immunol. 8 (12): 958-969, 2008.
MUKHOPADHYAY, S., PANDA, P.K., SINHA, N., DAS, D.N., BHUTIA, S.K. Autophagy
and apoptosis: where do they meet?. Apoptosis 19 (4): 555-566, 2014.
NAKAJIMA, H. Role of transcription factors in differentiation and reprogramming of
hematopoietic cells. Keio. J. Med. 60 (2): 47-55, 2011.
NIKOLICH-ZUGICH, J., SLIFKA, M.K., MESSAOUDI, I. The many important facets of T-
cell repertoire diversity. Nature Review Immunology 4 (2): 123-132, 2004.
NOGUEIRA, R.C., ROCHA, V.P., NONATO, F.R., TOMASSINI, T.C., RIBEIRO, I.M.,
DOS SANTOS, R.R., SOARES, M.B. Genotoxicity and antileishmanial activity
evaluation of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Environ Toxicol.
Pharmacol. 36 (3): 1304-1311, 2013.
OH, J.E., LEE, H.K. Autophagy in innate Recognition of Pathogens and adaptive immunity.
Yonsei Medical Journal 53 (2): 241-247, 2012.
OWEN, M. Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system. New
York, Bone and mineral research, 1985. P. 1–25.
PATEL, S., SETHI, A. Imported tropical diseases. Dermatol. Ther. 22 (6): 538-549, 2009.
PAVLI. A., MALTEZOU, H.C. Leishmaniasis, an emerging infection in travelers. Int. J.
Infect Dis. 14 (12): 1032-1039, 2010.
PEREIRA,W.K., LONARDONI, M.V., GRESPAN, R., CAPARROZ-ASSEF, S.M.,
CUMAN, R.K., BERSANI-AMADO, C.A. Immunomodulatory effect of Canova
medication on experimental Leishmania amazonensis infection. Journal of Infection, 51
(2): 157–164, 2005.
PIRES, A.M.S., COSTA, C.G., GONÇALVES, E.G.R., ALVIM, A.C., NASCIMENTO,
F.R.F. Aspectos imunológicos e clínicos da Leishmaniose Tegumentar Americana: Uma
revisão. Revista de ciências da saúde 14 (1): 30-39, 2012.
RANDOLPH, G.J., JAKUBZICK, C., QU, C. Antigen Presentation by Monocytes and
Monocyte-derived Cells. Curr. Opin. Immunol. 20 (1): 52-60, 2008.
RASOANAIVO, P., WRIGHT, C.W., WILLCOX, M.L., GILBERT, B. Whole plant extracts
98
versus single compounds for the treatment of malaria: synergy and positive interactions.
Malar. J. 15:10, Suppl 1:S4, 2011.
RAY, B.A., GUPTA, M. In “Progress in the Chemistry of Organic Natural Products”,
Fortschr Chem. Org. Naturst. 63: 100-106, 1994.
REIS, E.S. Papel do sistema complemento no processo de diferenciação e maturação das
células dendríticas. Tese (Doutorado em Imunologia) - São Paulo, Universidade de São
Paulo, 2008. 135p.
RIBEIRO, T.G., CHÁVEZ-FUMAGALLI, M.A., VALADARES, D.G., FRANCA,
J.R., LAGE, P.S., DUARTE, M.C., ANDRADE, P.H., MARTINS, V.T., COSTA,
L.E., ARRUDA, A.L., FARACO, A.A., COELHO, E.A., CASTILHO, R.O.
Antileishmanial activity and cytotoxicity of brazilian plants. Exp. Parasitol. 143: 60-68,
2014.
RODRIGUES, A.P., CARVALHO, A.S., SANTOS, A.S., ALVES, C.N., DO
NASCIMENTO, J.L.. SILVA, E.O. Kojic acid, a secundary metabolite from
from Aspergillus sp., acts as An inducer of macrophage activation. Cell Biol. Int. 35 (4):
335-343, 2011.
ROITT, I., BROSTOFF, J., MALE, D. Imunologia. São Paulo, Malone, 1999. 423p.
ROSA, M.S.S., MENDONÇA-FILHO, R.R., BIZZO, H.R., RODRIGUES, I,A., SOARES,
R.M.,A., PADRÓN, T.S., LOPES, A.H.C.S. Antileishmanial activity of a Linalool-Rich
essential oil from Croton cajucara. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (6): 1895-1901,
2003.
ROSSETI, A.S. Bortedella pertussis: Participação da arginase. TGF-ß e TRL-4 no
controle da síntase de óxido nítrico em macrófagos derivados da medula óssea
murina. Dissertação (Mestrado em Interunidades em Biotecnologia) - São Paulo,
Universidade de São Paulo/Instituto Butantan, 2009. 51p.
ROY, A., GANGULY, A., BOSEDASGUPTA, S., DAS, B.B., PAL, C., JAISANKAR,
P., MAJUMDER, H.K. Mitochondria-dependent reactive oxygen species-mediated
programmed cell death induced by 3,3'-diindolylmethane through inhibition of F0F1-
ATP synthase in unicellular protozoan parasite Leishmania donovani. Mol. Pharmacol.
74 (5): 1292-1307, 2008.
RUIZ, L., MARCO, M., CABOS, M., CHOQUEVILCA, A.L.G., ROUMY, V. Plants used by
native Amazonian groups from the Nanay River (Peru) for the treatment of malaria.
Journal of Ethnopharmacology 133 (2): 917-921, 2011.
SÁ, M.S., MENEZES, M.N., KRETTLI, A.U., RIBEIRO, I.M., TOMASSINI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Valadares%20DG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24846006
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jaisankar%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18703668
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jaisankar%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18703668
99
T.C., RIBEIRO, R.S., AZEVEDO, W.F.JR., SOARES, M.B. Antimalarial activity of
physalins b, d, f, and g. J. Nat. Prod 74 (10): 2269-2272, 2011.
SACKS, D., SHER, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nature
Immunology 3 (11): 1041-1047, 2002.
SAHA, P., GEISSMANN, F. Toward a functional characterization of blood monocytes. News
and Commentary 89: 2-4: 2010.
SATO, D.Y.O., WL, R., OLIVEIRA, C.C., CATTANEO, R.I.I., MALVEZZI, M.,
GABARDO, J., BUCHI, D. F. Histopathological and immunophenotyping studies on
normal and sarcoma 180-bearing mice treated with a complex homeopathic medication.
A homeopatia, 94 (1): 26-32, 2005.
SATO, P.K. Estudos de células dendríticas derivadas de monócitos de pacientes com
paracoccidiodomicose: Expressão de moléculas de superfície e secreção de citocinas.
Dissertação (Mestrado em doenças Infecciosas e Parasitárias) - São Paulo, Universidade
de São Paulo, 2010. 110p.
SERENO, D., CORDEIRO DA SILVA, A., MATHIEU-DAUDE, F., OUAISSI, A. Advances
and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology
international 56 (1): 3-7, 2007.
SHIO, M.T., HASSANI, K., ISNARD, A., RALPH, B., CONTRERAS, I., GOMEZ, M.A.,
ABU-DAYYED, I., OLIVIER, M. Host Cell signaling and Leishmania mechanisms of
evasion. Journal of Tropical Medicine: 1-14, 2012.
SILVA, M.T., SIMAS, S.M., BATISTA, T.G., CARDARELLI, P., TOMASSINI, T.C.
Studies on antimicrobial activity, in vitro, of Physalis angulata L. (Solanaceae) fraction
and physalin B bringing out the importance of assay determination. Mem. Inst. Oswaldo
Cruz 100 (7): 779-782, 2005.
SILVA, R.R.P. Atividade leishmanicida do extrato da raiz de Physalis angulata e sua
ação na célula hospedeira. Dissertação (Mestrado em Neurociências e Biologia Celular)
– Belém, Universidade Federal do Pará, 2013. 90p.
SILVEIRA, A.P.A. Hematopoiese: Alguns aspectos. J. Bras. Nefrol: 5-6, 2000.
SILVEIRA, F.T., LAINSON, R., CORBETT, C.E.P. Clinical and Immunopathological
Spectrum of American Cutaneous Leishmaniasis with special reference to the disease in
Amazonian Brazil - A Review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 99 (3): 239-251, 2004.
SILVEIRA, F.T., MÜLLER, S.R., DE SOUZA, A.A.A., LAINSON, R., GOMES, C.M.C.,
LAURENTI, M.D., CORBETT, C.E.P. Revisão sobre a patogenia da Leishmaniose
Tegumentar Americana na Amazônia, com ênfase à doença causada por Leishmania (V.)
100
braziliensis e Leisshmania (L.) amazonensis. Revista Paraense de Medicina 22 (1): 9-
20, 2008.
SILVEIRA, F.T. Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD) na Amazônia, Brasil: Aspectos
clínicos e epidemiológicos. Gazeta Médica da Bahia 79 (3): 25-29, 2009.
SOARES, M.B., BELLINTANI, M.C., RIBEIRO, I.M., TOMASSINI, C.B., DOS SANTOS,
R.R. Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccharide-induced death by seco-
steroids purified from Physalis angulata L. European Journal of Pharmacology 459
(1): 107–112, 2003.
SOKOL, R.J., HUDSON, G., JAMES, N.T., FROST, I.J., WALES, J. Human macrophage
development: a morphometric study. J. Anat. 151: 27-35, 1987.
SOONG, L., HENARD, C.A., MELBY, P.C. Immunopathogenesis of non-healing American
cutaneous leishmaniasis and progressive visceral leishmaniasis. Semin. Immunopathol.
34 (6): 735–751, 2012.
STEINMAN, R.M., ADAMS, J.C., COHN, Z.A. Identification of a novel cell type in
peripheral lymphoid organs of mice. The jornal of experimental medicine 141: 805-
820, 1975.
STEMPIN, C.C., CERBAN, F.M. Macrofagos e induccion de arginase como mecanismo de
evasion de parasitos. Medicina 67: 737-746, 2007.
STREECK, H., D’SOUZA, M.P., LITTMAN, D.R., CROTTY, S. Harnessing CD4+ T cell
responses in HIV vaccine development. Nat. Med. 19 (2): 142-149, 2013.
SUZUKI, K., OHNO, S., SUZUKI, Y., OHNO. Y., OKUYAMA, R., ARUGA,
A., YAMAMOTO, M., ISHIHARA, K.O., NOZAKI, T., MIURA, S., YOSHIOKA,
H., MORI, Y. Effect of green tea extract on reactive oxygen species produced by
neutrophils from cancer patients. Anticancer. Res. 32 (6): 2369-2375, 2012.
SVS-MS. Secretaria de Vigilância Sanitária – Ministério da Saúde, Brasilia, 2011. Disponível
em: <http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-ministerio/principal/secretarias/svs>.
Acesso em 02/01/2015.
TEIXEIRA, D.E., BENCHIMOL, M., RODRIGUES, J.C.F., CREPALDI, P.H., PIMENTA,
P.F.P., SOUZA, W. Atlas didático: Ciclo de vida da Leishmania. Rio de Janeiro,
Fundação CECIERJ, Consórcio CEDERJ, 2013. 64P.
TIUMAN, T.S., SANTOS, A.O., UEDA-NAKAMURA, T., DIAS FILHO, B.P.,
NAKAMURA, C.V. Recent advances in leishmaniasis treatment. Int. J. Infect. Dis. 15
(8): 525-532, 2011.
TIUMAN, T.S., UEDA-NAKAMURA, T., ALONSO, A., NAKAMURA, C.V. Cell death in
101
amastigote forms of Leishmania amazonensis induced by parthenolide. BMC
Microbiology 14:152, 2014.
TOMASSINI, T.C.B., BARBI, N.S., RIBEIRO, I.M., XAVIER, D.C.D. Gênero Physalis-
Uma revisão sobre vitaesteróides. Química Nova 23 (1): 47-57, 1999.
TRAVLOS, G.S. Normal structure, function, and histology of the Bone Marrow. Toxicologic
Pathology 34 (5): 548–565, 2006.
VAN ASSCHE, T., DESCHACHT, M., DA LUZ, R.A., MAES, L., COS, P. Leishmania-
macrophage interactions: insights into the redox biology. Free Radical Biology &
Medicine 51 (2): 337-351, 2011.
VEAL, E.A., DAY, A.M., MORGAN, B.A. Hydrogen peroxide sensing and signaling.
Mol. Cell. 26 (1): 1-14, 2007.
VERRECK, F.A., DE BOER, T., LANGENBERG, D.M., VAN DE ZANDEN, L.,
OTTENHORF, T.H. Phenotypic and functional profiling of human proinflammatory
type-1 and anti-inflammatory type-2 macrophages in response to microbial antigens and
inf-gamma- and CD40l-mediated costimulation. J. Leukoc. Biol. 79 (2): 285-293, 2006.
VON STEBUT, E. Immunology of cutaneous leishmaniasis: the role of mast cells,
phagocytes and dendritic cells for protective immunity. Eur. J. Dermatol 17 (2): 115-
122, 2007.
W H O EXPERT COMMITTEE. Control of the leishmaniases.WHO technical report series;
no. 949. Report of a meeting of the WHO Expert Committeee on the Control of
Leishmaniases, Geneva 22-26 march 2010. Disponível em:
<http://www.who.int/leishmaniasis/resources/en/> .Acesso em: 10/03/2014.
W H O EXPERT COMMITTEE. Control of the leishmaniases.WHO technical report series;
nº. 375. Leishmaniases, January 2014. Disponível em: <
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/ >. Acesso em: 25/04/2014.
WINBERG, M. E., RASMUSSON, B., SUNDQVIST, T. Leishmania donovani: inhibition of
phagosomal maturation is rescued by nitric oxide in macrophages. Experimental
parasitology 2: 165-170, 2007.
WU, S.Y., LEU, Y.L., CHANG, Y.L., WU, T.S., KUO, P.C., LIAO, Y.R., TENG, C.M.,
PAN, S.L. Physalin F induces cell apoptosis in human renal carcinoma cells by targeting
NF-KappaB and generating reactive oxygen species. PLoS One 7 (7): 40727, 2012.
YOUNGBLOOD, B., HALE, J.S., AHMED, R. T-cell memory differentiation: Insights from
transcriptional signatures and epigenetics. Immunology 139 (3): 277-284, 2013.
YU, Y., SUN, L., MA, L., LI, J., HU, L., LIU, J. Investigation of the immunosuppressive
102
activity of physalin h on t lymphocytes. Int. Immunopharmacol. 10 (3): 290-297, 2010.
ZHANG, Y., MORGAN, M.J., CHEN, K., CHOKSI, S., LIU, Z.G. Induction of autophagy is
essential for monocyte-macrophage differentiation. Blood 119 (12): 2895-2905, 2012.
ZANICHELLI, M.A., FURRER, A.A., PEREIRA-FILHO, T.S., VAZ, F.A.C. Hematopoiesis,
growth factors and clinical application of erythropoietin in anemia of prematurity.
Review and essays 17 (2): 123-142, 1995.
103
7 PRODUÇÃO CIENTÍFICA
7.1 ARTIGO PUBLICADO:
Bruno José Martins da Silva, Ana Paula D. Rodrigues, Luis Henrique S. Farias, Amanda
Anastácia P. Hage, Jose Luiz M. Do Nascimento and Edilene O. Silva. Physalys angulata
induces in vitro differentiation of murine bone marrow cells into macrophages. BMC
Cell Biology. Aceito em 24/09/2014. Publicado em 03/10/2014 (Anexo 2).
7.2 ARTIGO EM PREPARAÇÃO
Bruno José Martins Da Silva, Ana Paula D. Rodrigues, Caroline Martins Almeida, Jose Luiz
M. Do Nascimento and Edilene O. Silva. Physalis angulata induces morphological and
physiological alterations during the process of differentiation of bone marrow cells into
macrophages.
8 PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS
IV Encontro Anual Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e
Bioimagem (INBEB) – 08-10 de maio de 2013
Trabalho apresentado (oral e pôster): Immunomodulatory effects of aqueous extract of root
plant Physalis angulata on cell obtained of bone marrow (Anexo 3).
XXIX Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology / XL Annual Meeting on
Basic Research in Chagas’ Disease – 30 de setembro a 2 de outubro de 2013
Trabalho apresentado (oral e pôster): Physalis angulata, an inducer of the production of
reactive oxygen species on Leishmania (L.) amazonensis promastigotes and its host cell.
(Anexo 4)
V Encontro Anual Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e
Bioimagem (INBEB) – 07-09 de maio de 2014
Trabalho apresentado (oral e pôster): Autophagic process on bone marrow cells induced by
Physalis angulata promotes the differentiation of monocytes into macrophages (Anexo 5).
104
18th International Microscopy Congress (IMC) – 07-12 de setembro de 2014
Trabalho apresentado (Oral e pôster): Differentiation in vitro of bone marrow cells into
macrophages induced by Physalis angulata (Anexo 6).
XXIX Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology / XL Annual Meeting on
Basic Research in Chagas Disease – 03 a 05 de novembro de 2014
Trabalho a ser apresentado (Oral e pôster): Selective effect of Physalis angulata on
Leishmania (Leishmania) amazonensis during interaction with murine bone marrow cells
(Anexo 7).
9 MISSÃO DE ESTUDOS
Missão de estudos realizado no Laboratório de Tecnologia em Bioquímica e
Microscopia da Universidade Estadual da Zona Oeste do Rio de Janeiro, no período de 15 de
julho a 26 de agosto de 2013, através do PROCAD NF/2009 e INCT-INBEB (Anexo V8).
105
10 ANEXOS
ANEXO 1: Comitê de ética
106
ANEXO 2: Publicação de artigo
107
Physalis angulata induces in vitro differentiation of murine bone marrow cells into macrophages
Bruno José Martins da Silva1,2
Email: [email protected]
Ana Paula D Rodrigues2,3
Email: [email protected]
Luis Henrique S Farias1,2
Email: [email protected]
Amanda Anastácia P Hage1,2
Email: [email protected]
Jose Luiz M Do Nascimento4
Email: [email protected]
Edilene O Silva1,2,*
Email: [email protected]
1 Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de
Parasitologia e Laboratório de Biologia Estrutural, Avenida Augusto Corrêa, 01,
Bairro Guamá, 660975-110 Belém, Pará, Brazil
2 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biologia Estrutural e Bioimagem,
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
3 Laboratório de Microscopia Eletrônica, Instituto Evandro Chagas, Secretaria de
Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, Belém, Pará, Brazil
4 Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de
Neuroquímica Molecular e Celular, Avenida Augusto Corrêa, 01, Bairro Guamá,
660975-110 Belém, Pará, Brazil
* Corresponding author. Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biologia
Estrutural e Bioimagem, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
Abstract
Background
The bone marrow is a hematopoietic tissue that, in the presence of cytokines and growth fac-
tors, generates all of the circulating blood cells. These cells are important for protecting the
organism against pathogens and for establishing an effective immune response. Previous stu-
dies have shown immunomodulatory effects of different products isolated from plant extracts.
This study aimed to evaluate the immunomodulatory properties of aqueous Physalis angulata
(AEPa) extract on the differentiation of bone marrow cells.
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
108
Results
Increased cellular area, higher spreading ability and several cytoplasmatic projections were
observed in the treated cells, using optical microscopy, suggesting cell differentiation. Fur-
thermore, AEPa did not promote the proliferation of lymphocytes and polymorphonuclear
leukocytes, however promotes increased the number of macrophages in the culture. The ul-
trastructural analysis by Transmission Electron Microscopy of treated cells showed spreading
ability, high number of cytoplasmatic projections and increase of autophagic vacuoles. More-
over, a high level of LC3b expression by treated cells was detected by flow cytometry, sug-
gesting an autophagic process. Cell surface expression of F4/80 and CD11b also indicated
that AEPa may stimulate differentiation of bone marrow cells mainly into macrophages. In
addition, AEPa did not differentiate cells into dendritic cells, as assessed by CD11c analysis.
Furthermore, no cytotoxic effects were observed in the cells treated with AEPa.
Conclusion
Results demonstrate that AEPa promotes the differentiation of bone marrow cells, particularly
into macrophages and may hold promise as an immunomodulating agent.
Keywords
Cell differentiation, bone marrow cells, Physalis angulata
Background
The hematopoietic tissue, bone marrow, is responsible for generating all circulating blood
cells [1]. Hematopoietic stem cells undergo the process of maturation and differentiation in
the presence of cytokines and growth factors present in the marrow microenvironment, giving
rise to myeloid and lymphoid progenitor cells [2,3]. These myeloid progenitors, when stimu-
lated, differentiate and give rise to blood cells, macrophages and dendritic cells (DCs), while
the lymphoid lineage differentiates into T and B lymphocytes, natural killers (NK) cells and
DCs [4,5].
The monocytes belong to the mononuclear phagocytic system and constitute about 3 to 8% of
circulating leukocytes in the blood [6,7]. After three days in the circulating blood, monocytes
begin the migration process to tissues where they differentiate into macrophages and DCs
[6,7]. During the differentiation of monocytes into macrophages, several cellular changes are
observed, such as increased cell size, increased number of organelles and the induction of the
autophagic process [8,9]. Autophagy is essential for monocyte-macrophage differentiation;
reports demonstrate that some monocytes cannot survive if the autophagy process is blocked
and, if they are to survive, the differentiation process becomes defective inhibiting differentia-
tion of cells into macrophages [9].
Macrophages express specific molecules on their surface, including the F4/80 and
CD11b/MAC-1 proteins, which are markers of the differentiation process and allow macro-
phages to differentiate into other cell types [10,11]. These molecules are also involved in the
process of cell adhesion and in the migration to sites of intracellular pathogen invasion [10].
Macrophages are important for maintaining an efficient innate immune response, having the
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
109
ability to migrate to the site of invasion, recognizing the aggressor, phagocytosing and elimi-
nating the pathogen [3,12].
In recent years, there has been a growing interest in the use of natural products to induce pro-
liferation and differentiation of bone marrow cells [13-16]. In this context, Physalis angulata
(Pa), which is a herbaceous plant, has been reported to possess several activities, among them,
diuretic, antipyretic, analgesic [17], antinociceptive, anti-inflammatory and immunomodula-
tory [18,19] properties. Phytochemical studies of P. angulata demonstrate that extracts from
this plant contains glucocorticoids, flavonoids, physalins (D, I, G, K, B, F, E), physagulins (E,
F and G), and withanolides [20,21]. It is possible that the immunomodulatory effects of this
plant may occur due to hematopoietic-supportive activities, through the activation of resident
macrophages, which undergo several morphological changes, such as an increase in spreading
and adhesion abilities, phagocytosis activity, ROS generation, antigen presentation and cyto-
kine production. Therefore, the aim of this study was to evaluate the modulatory activity of
AEPa on the cell differentiation process of monocyte-derived bone marrow cells in macro-
phages.
Methods
Preparation of the aqueous extract from roots of Physalis angulata (AEPa)
Roots of the Physalis angulata (Solanaceae) plant were collected in Pará state, Brazil. Roots
were cut to produce the aqueous extract. AEPa was prepared as described by Bastos et al.
[18]. The voucher specimen (no. 563) was deposited in the herbarium of the Emilio Goeldi
Museum (Belém, Pará, Brazil). One mg/mL of aqueous extract from the root of Physalis an-
gulata (AEPa) was dissolved in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) or RPMI
and used as the standard solution for assays.
Bone marrow cells isolation
Bone marrow cells (BMCs) were isolated from the femurs of male mice BALB/c (Mus mus-
culus) aged 6–12 weeks. The animals were sacrificed in a CO2 chamber (Insight ®) and the
femurs were dissected under laminar flow and washed with sterile phosphate buffered saline
(PBS). The epiphyses were then removed [22], and cells were homogenized and diluted in
DMEM containing 10% FBS, maintained in 12, 24 or 96-well plates at 37°C in a 5% CO2
atmosphere. The experiments and study were carried out in accordance with current Brazilian
animal protection laws (Lei Arouca number 11.794/08) in compliance with the National
Council for the Control of Animal Experimentation (CONCEA, Brazil). The protocol was
approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the Federal University of
Pará (CEPAE/ICB/UFPA - grant number 086–12).
Treatment of bone marrow cells
BMCs were cultured in the presence of 100 μg/mL of AEPa (1 mg/mL stock solution) for 24,
48, 72 and 96 hours. In some assays, BMCs were treated with 100 nM macrophage colony-
stimulating factor (M-CSF), as positive control for differentiation. M-CSF and AEPa were
added to the cultures every 24 hours until the end of each test, without replacing the culture
medium.
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
110
Cell viability tests
To assess the viability of the BMCs treated with AEPa, three tests were performed as descri-
bed below.
Method Thiazolyl Blue (MTT)
MTT is a soluble salt, which is converted by mitochondrial dehydrogenases into formazan
blue crystal. This assay is based on the mitochondrial-dependent reduction of 3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to formazan. The procedure
was performed according to Fotakis and Timbrell [23], with some modifications.
BMCs were cultured and treated with 25, 50 or 100 μg/mL AEPa for 24, 48, 72 and 96 hours.
Subsequently, cells were incubated with 0.5 mg/mL MTT diluted in PBS and incubated at
37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 3 hours. Two-hundred μL of DMSO
were added to each well to solubilize formazan crystals and the plate was incubated under
agitation for 10 minutes. The resulting solution was read in a microplate reader (BIO-RAD
Model 450 Microplate Reader) and absorbance was recorded at an optical density (OD) of
570 nm. As a negative control, cells were killed with a 15% solution of formaldehyde in PBS.
Detection of the mitochondrial membrane potential (JC-1)
JC-1 is a fluorescent dye that measures the mitochondrial membrane potential (ΔΨ) of cells.
The loss of this potential serves as an indicator of apoptosis, where this dye remains in its
monomeric form and emits a green fluorescence. Living cells form the “J-aggregates” which
emit a red fluorescence.
BMCs were treated with 100 μg/mL AEPA for 96 hours. Subsequently, cells were incubated
with JC-1 (1 μM) for 30 min at 37°C. After incubation, the cells were washed and resuspen-
ded in PBS. Fluorescence data were obtained using a flow cytometer (BD FACSCantoII TM)
at an excitation wavelength of 488 nm, where JC-1 monomers emit fluorescence at 529 nm
and J-aggregates emit at 590 nm. A total of 10.000 events were acquired for each sample and
the data were obtained by flow cytometer BD FACSCantoII. The data were analyzed using
WinMDI version 2.9 (Joseph Trotter) software. The gate was determined using unstained
BMCs controls (Additional file 1). The data were analyzed using WinMDI version 2.9 (Jose-
ph Trotter) software.
Detection of apoptosis and necrosis of BMCs treated with AEPa
For detection of apoptosis and necrosis of BMCs treated with AEPA, Annexin V-FITC (Invi-
trogen) and PI (Sigma) were used, respectively. BMCs were treated with 100 μg/mL AEPa
and cultured for 96 hours. After treatment, these cells were incubated for 30 minutes with 10
μg/mL Annexin V-FITC and then incubated with 25 μg/mL PI for 30 minutes. Finally, the
cells were washed with PBS and data obtained by flow cytometry. A total of 10.000 events
were acquired for each sample in the region that corresponded to the BMCs and the gates we-
re determined using unstained controls (Additional file 1).
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
111
Light microscopy (LM)
BMCs were cultured and treated for 24, 48, 72 and 96 hours before dividing into three groups,
control (non treated cells), treated with AEPa and M-CSF. Cells were fixed in a solution con-
taining 3% paraformaldehyde in PHEM buffer (5 mM magnesium chloride, 70 mM potassium
chloride, 10 mM EGTA, 20 mM HEPES, 60 mM PIPES), 0.1 M pH 7.2, stained with Giemsa
and covered with Entellan® (Merck). Two hundred cells were counted per coverslip. Diffe-
rentiated cell types such as lymphocytes, mononuclear phagocytes (monocytes and macro-
phages) and polymorphonuclear (PMN) were identified according to their morphological cha-
racteristics. Cells were counted and analyzed using an Olympus BX41 microscope.
Morphometric analysis
The cytoplasmic area of the control group and treated BMCs (100 μg/mL of AEPa for 96
hours) was analyzed using the program Image J (NHI) software and images were obtained by
light microscopy. This analysis was performed as described by Sokol et al. [24].
Transmission Electron Microscopy (TEM)
Control and treated BMCs were fixed with 2.5% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde in
0.1 M sodium cacodylate buffer, pH7.2. The cells were washed in the same buffer and incu-
bated in 1% osmium tetroxide and 0.8% potassium ferricyanide for 1 hour. The cells were
dehydrated in graded acetone (50%, 70%, 90% and 2× 100%) and embedded in Epon resin
(2:1, 1:1 and 1:2 - 100% acetone: Epon). Thin sections were contrasted with 5% uranyl aceta-
te and lead citrate and finally observed with a LEO 906 E Transmission Electron Microscope.
Detection of LC3b protein by flow cytometry
Treated and untreated BMCs were fixed with 3% paraformaldehyde and 0.1 M PHEM buffer,
pH 7.2, for 30 minutes. Subsequently, cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100, wa-
shed in PBS and incubated with 50 mM NH4Cl in PBS for 40 minutes.
The cells were incubated with polyclonal anti-LC3b antibody (Invitrogen Molecular Probes®)
diluted 1:1000 in PBS with 1% BSA for 1 hour, then washed in PBS and incubated with a
fluorescent secondary antibody (Alexa Fluor 488-labelled goat anti-rabbit IgG; Molecular
Probes Invitrogen®) diluted 1:100 in PBS for 30 minutes. Data were obtained by flow cyto-
metry (BD FACSCantoII) at an excitation wavelength of 488 nm. The results were analyzed
by WinMDI version 2.9 (Joseph Trotter). For induction of autophagy, BMCs were cultured
for 96 hours, washed with PBS and incubated for 3 hours with phosphate buffer, pH 7.2, at
37°C in 5% CO2 and used as a positive control for the autophagic process.
Detection of cell surface markers by flow cytometry
Treated and untreated BMCs were fixed with 3% paraformaldehyde and 0.1 M PHEM buffer,
pH 7.2, for 30 minutes. Cells were washed in PBS, pH 8.0, and incubated with 50 mM NH4Cl
in PBS for 40 minutes. Next, the cells were incubated for 1 hour with anti-CD11c monoclonal
antibody (DCs marker), anti-CD11b (Mac-1) and anti- F4/80 monoclonal antibody (mononu-
clear cells and macrophage markers, respectively), diluted 1:50 in PBS. Subsequently, cells
were incubated with fluorescent secondary antibody conjugated with PE-goat anti-rat IgG,
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
112
diluted 1:50 in PBS for 40 minutes. A positive control was treated with M-CSF (100 mM) and
also maintained in parallel. All experiments were performed at least three times with treated
and untreated cells. Data were obtained by flow cytometry (BD FACSCantoII) at an excitati-
on wavelength of 546 nm and analyzed by WinMDI version 2.9 (Joseph Trotter) software.
Statistical Analysis
All experiments were performed in triplicate and the results were analyzed by GraphPad
Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). The means and S.D. of at least three expe-
riments were determined. Analysis of variance (ANOVA) and Student’s t-test were used to
compare data. The Tukey test was applied when necessary. All p-values <0.05 were conside-
red as statistically significant.
Results
Effect of AEPa on BMCs cell viability
BMCs were treated with 25, 50 and 100 μg/mL AEPa for 24-96 h and cell viability analyzed
by the MTT assay (Figure 1a). Alternatively, BMCs were treated with 100 μg/mL for 96
hours and loaded with JC-1 (Figure 1b1 and 1b2) or stained with PI and Annexin-V (Figure
1c1 and 1c2). No cytotoxic effect of AEPa was observed in cells treated for 24, 48, 72 and 96
hours, when compared to the control group, as shown by the MTT assay. Labeling with JC-1
and PI and annexin-V demonstrated that treated cells remain viable following 96 hours of
culture.
Figure 1 Cellular viability of bone marrow cells (BMCs) treated with AEPa, as meas-
ured by MTT, JC-1, propidium iodide and annexin V assays. a) Cell viability was deter-
mined using the MTT assay. Treatment of BMCs maintained in culture after 24, 48, 72 and 96
hours with different concentrations of AEPa, (25, 50 and 100 μg/mL). Data are expressed as
mean ± SD of three independent experiments. ANOVA followed by Tukey test, p <0.05. b1-
b2) Determination of mitochondrial membrane potential (Δψm) by flow cytometry. Δψm de-
tected by JC-1 in untreated BMCs (b1) or treated cells with 100 μg/mL of AEPa after 96
hours (b2) (results from 10.000 events analyzed). c1 and c2) Determination of apoptosis
and/or necrosis analyzed by flow cytometry. c1) Untreated cells. c2) BMCs treated with 100
μg/mL AEPa and maintained in culture after 96 hours. The percentages of apoptotic and ne-
crotic cells are presented in the dot plots and are representative of one of three independent
experiments (results from 10.000 events analyzed).
Quantitative analysis of adherent cells
To evaluate the effect of AEPa on the BMCs, a quantitative analysis was performed and iden-
tified the following cell types, including lymphocytes, PMN and mononuclear phagocytes.
Lymphocytes
Lymphocytes were characterized as cells with a small cytoplasmic area and large nucleus.
From 96 hour of treatment, a reduction of 40% ± 8 in the number of lymphocytes was obser-
ved when compared with untreated cells (Figure 2a).
Da Silva et al., 2014
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Figure 2 Differential cell count in BMCs cultures after 24, 48, 72 and 96 hours. Cells
were treated with 100 μg/mL of AEPa, 100 nM of M-CSF and compared to the control group.
a) Lymphocytes. Inset, lymphocytes (arrow), cells with a small cytoplasmic area and large
nucleus. b) Polymorphonuclear. Inset, showing polymorphonuclear (arrow), cells with two or
more nuclei arranged in the cytoplasm. c) Mononuclear phagocytes. Inset 1, showing mono-
cyte, cell with a small cytoplasmic area and nucleus in a horseshoe shape and, inset 2 showing
macrophage, cell with a large nucleus and evident cytoplasm. The values are expressed as
means ± SD and compared with the control group. ANOVA, followed by Tukey test, p <0.05.
PMN cells
PMN cells have two or more nuclei arranged in the cytoplasm. No significant difference was
observed between the control group and the group treated with AEPa for 96 hours (Figure
2b).
Mononuclear cells
Mononuclear cells constitute monocytes (cells with a small cytoplasmic area and nucleus in a
horse-shoe shape) and macrophages (large nucleus and evident cytoplasm). significant increa-
se in cells with macrophage characteristics was observed in the cultures treated with AEPa
(8% ± 3) for 96 hours, when compared to the control group (Figure 2c).
AEPa induces morphological alterations and increases cellular area in BMCs
Control and BMCs treated with AEPa were analyzed by LM and TEM. Morphological altera-
tions were observed in 100 μg/mL AEPa-treated cells that were characteristic of activated
cells. An increase in cytoplasmic area, spreading ability and a high number of cytoplasmatic
projections were also observed (Figure 3b). Morphometric analysis showed an significant
increase in the area occupied by cytoplasm in cells treated with AEPa, when compared to the
control group (Figure 3d).
Figure 3 Cytological evaluation of BMCs using Giemsa stain. Treated cells were incubated
for 96 hours. a) Untreated cells. b) Cells treated with 100 μg/mL AEPa, note the increased
cell spreading, cytoplasmic volume and cells with characteristics of activated macrophages
(arrow). c) Cells treated with 100 nM of M-CSF. Cells after treatment with M-CSF presented
a significant spreading ability, increased cellular area and most of the cells are undergoing cell
fusion processes (head arrows). Scale bar 10 μm. d) Morphometric analysis showed increased
cell area for cells treated with AEPa or M-CSF, compared with control cells. Data are pre-
sented as means ± SD, p < 0.05.
To investigate possible ultrastructural changes in cells treated with AEPa, TEM was perfor-
med. BMCs treated with AEPa presented nuclei with abundant euchromatin, an apparently
increased number of endoplasmic reticuli (ER), numerous mitochondria, which are characte-
ristic of intense cell metabolism, and numerous cellular projections (Figure 4c and d). The
presence of cytoplasmic vacuoles and structures suggestive of autophagic vacuoles were ob-
served in the cytoplasm of AEPa-treated cells (Figure 5a and b).
Figure 4 Ultrastructural analysis of BMCs. Treated cells were incubated for 96 hours. a)
Untreated control. b) Cells treated with 100 nM M-CSF. c, d) Cells treated with 100 μg/mL of
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AEPa. Cells treated with M-CSF and AEPa presented filopodia (arrows), cytoplasmic vacu-
oles (*), mitochondria and abundant endoplasmic reticulae and presence of autophagic vacu-
oles (head arrows). Bars: 5 μm. N: Nucleus, M: Mitochondria, ER: Endoplasmic reticulum.
Figure 5 Detection of autophagic process in BMCs. Treated cells were incubated for 96
hours. a-b) Ultrastructural analysis of BMCs treated with AEPa. Cells treated with AEPa pre-
sented autophagic vacuoles in the cytoplasm (arrows). Bars: 0.5 μm. c) Untreated control. d)
Cells treated with 100 μg/mL AEPa. e) Cells treated with 100 nM M-CSF. f) Starvation. g)
Fluorescence intensity of BMCs stained with LC3b. ANOVA followed by Tukey test, p
<0.05.
Induction of autophagy in BMCs
To test whether AEPa induces autophagy in BMCs, cells were treated for 96 hours and the
expression of LC3b evaluated by flow cytometry. LC3b is a specific marker for autophagy in
mammalian cells; treated BMCs presented higher fluorescence intensity when compared to
the untreated control group. The staining of cells treated with AEPa was similar to that of the
control group after starvation and to that of the group of cells treated with M-CSF (Figures
5c-g).
Detection of cell surface markers by flow cytometry
To determine whether AEPa promotes the differentiation of BMCs into macrophages, the
expressions of the surface proteins F4/80, CD11b and CD11c were assessed on BMCs by
flow cytometry. An increased of expression of CD11b (Figure 6c) and F4/80 (Figure 6 h and
6j) and were observed on AEPa-treated cells. The same expression levels were observed in
the positive-control groups, consisting of peritoneal macrophages (Figure 6a for CD11b and
6f for F4/80) and BMCs stimulated with M-CSF (Figure 6d for CD11b and 6i for F4/80), in
comparison with untreated cells. Analysis of the fluorescence intensity showed that there was
a decreased staining of CD11b protein in AEPa-treated cells as also observed in the group
treated with M-CSF and peritoneal macrophages (Figure 6e). Furthermore, CD11c labeling
showed no significant difference in levels expression compared with untreated cells, AEPa
treated cells or M-CSF group (Additional file 2), showing that AEPa and M-CSF does not
stimulate the differentiation of BMCs into dendritic cells.
Figure 6 Expression of CD11b and F4/80 on BMCs. Treated cells were incubated for 96
hours. a-d) Detection of the CD11b surface marker by flow cytometry. e) Fluorescence inten-
sity of BMCs labeled with CD11b. f-i) Flow cytometric analysis of F4/80 surface marker. j)
Fluorescence intensity of BMCs stained with F4/80. ANOVA was followed by Tukey test,p
<0.05.
Discussion
A great number of herbal products have been used in folk medicine due to their immunomo-
dulatory actions [15,16,25,26]. Extracts and physalins obtained from P. angulata exhibit di-
verse biological properties, including, analgesic, anti-inflammatory and immunomodulatory
activities [18,19,27-29]. AEPa exhibits beneficial effects on carragenin-induced air pouch
inflammation through its immunomodulatory action [19]; however, the direct action of AEPa
on bone marrow remains unknown. Here, we demonstrate for the first time that AEPa has an
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
115
immunomodulatory effect on BMCs, differentiating cells into macrophages. Chemical analy-
ses from our group have found that aqueous extracts of the dried root of P. angulata contain
physalins D, E, F, and H (unpublished data). We hypothesize that the immunomodulatory
effects of AEPa may derive from the presence of these physalins.
The differentiation of monocytes into macrophages or DCs in culture is most commonly achi-
eved during 5 days, although a process of rapid differentiation within several hours can occur,
depending on the stimulus used [30]. These interesting effects indicate that bone marrow-
derived monocytes differentiate into macrophages; however, not all cell types respond in this
same manner during AEPa treatment.
A quantification experiment was performed to identify the presence of different cell types in
these cultures. Lymphocyte numbers were found to be significantly reduced in BMCs treated
with AEPa for 96 hours; as such, AEPa does not stimulate the adhesion and proliferation of
this cell type. Bastos et al. [19] showed that AEPa had an inhibitory effect on lymphocyte
proliferation, particularly on T cells. These results are in agreement with those observed by
Yu et al. [31], who demonstrated that physalin H obtained from P. angulata presents an im-
munosuppressive activity, thus preventing the proliferation of T cells.
BMCs treated with AEPa showed a significant increase of mononuclear cells when compared
to control. Morphological LM analysis showed that AEPa-treated cells had a higher spread
ability and morphometric analysis revealed that treated cells showed an increase in cellular
area. In addition, TEM demonstrated that BMCs, treated for 96 hours with 100 μg/mL AEPa,
presented nuclei with abundant euchromatin, augmented ER, elongated mitochondria and the
presence of numerous cellular projections. Several changes are observed during the process of
differentiation of monocytes into macrophages such as altered expression of surface proteins,
increased cell size, increased number of organelles and autophagic induction [8,9].
Another characteristic feature seen in AEPA- and M-CSF-treated BMCs was the presence of
autophagic vacuoles in the cytoplasm, which was not observed in untreated cells. Analysis by
flow cytometry revealed a significant increase in LC3b protein on treated cells, when compa-
red to the control group, indicating an autophagy process. Autophagy is very important during
the process of monocyte differentiation into macrophages, allowing the proliferation of these
cells and preventing death by apoptosis [9]. The autophagic activation mechanism can be in-
duced by various routes, one of which is by ER stress, and the response of the organism to
autophagy can be varied, allowing cell survival or leading to non-apoptotic death [32,33]. Our
results show that AEPa-treated cells presented autophagic characteristics and this mechanism
was not deleterious to the cells, since there was no reduction in cell viability. Thus, we may
suggest that autophagy favors cell survival, allowing the differentiation of monocytes into
macrophages.
Macrophages may elicit an altered pattern of surface markers, as compared to non-
differentiated cells. The surface proteins, CD11b and F4/80, are examples of molecules that
change after macrophage differentiation [34]. CD11b can be found on the surface of neutro-
phils, DCs, lymphocytes and macrophages, but is highly expressed on the monocyte surface
[10]. However, the F4/80 molecule is expressed only on the macrophage surface [11]. Flow
cytometry demonstrated a significant decrease in CD11b levels on AEPa-treated cells when
compared to the control group. Results indicate that monocytes were the most common cell
type in the untreated BMCs, because this group had a high staining for the CD11b protein. On
the other hand, cells found in the cultures treated with AEPa or M-CSF were mainly macro-
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BMC Cell Biology
116
phages as demonstrated by the decrease in CD11b protein expression. To confirm that macro-
phages were the major cell type in the culture population, expression of the macrophage-
specific protein, F4/80, was determined. There was a significant increase in surface F4/80 on
the AEPA-treated cells, where levels were similar to those observed in the positive control
(peritoneal macrophages) and the M-CSF-treated group. These results suggest that AEPa po-
tentiates the differentiation of monocytes into macrophages.
Another important immune cell type that is derived from the monocyte lineage is the DCs;
these are antigen-presenting cells (APCs) that play a major role in bridging of the innate and
adaptative immune responses. When monocytes migrate to tissues they can differentiate into
macrophages or DCs [3]. In this study, we have used the surface marker, CD11c, to determine
the presence of this cell type. No significant difference in the expression levels for CD11c on
AEPa-treated BMCs was observed. Thus, AEPa was not able to stimulate the differentiation
and maturation of bone marrow mononuclear cells in DCs. It is important to emphasize that
no cytotoxic effects were observed in the cells treated with AEPa. The search for new pro-
ducts, without cytotoxic effects on mammalian cells, is important for the development of a-
gents that can induce the differentiation and/or maturation of BMCs into macrophages. Since
these cells participate in the initiation of the innate immune response, such agents may be able
to promote the protection against several intracellular pathogens [12,26].
Conclusion
AEPa seems to act on different aspects of cellular differentiation, with potential to act as an
immunomodulatory agent, inducing the differentiation of BMCs into macrophages, which are
important cells in the defense against pathogens.
Abbreviations
BMCs, Bone marrow cells; DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; FBS, Fetal bovine
serum; AEPa, Aqueous extract from root of Physalis angulata; M-CSF, Macrophage colony-
stimulating factor; MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; PI,
Propidium iodide; LM, Light microscopy; TEM, Transmission electron microscopy; BSA,
Bovine serum albumine; DMSO, Dimethylsufoxide
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors’ contributions
BJMS performed all experiments and wrote the manuscript. LHSF and AAPH performed
flow cytometry analysis. APDR performed the LM and TEM analyzes. BJMS, APDR, EOS
and JLMN were involved in the discussion of results and manuscript editing. All authors read
and approved the final manuscript.
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
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Acknowledgments
This work was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecno-
lógico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
FAPESPA, PROPESP-UFPA and Instituto Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem-
INBEB (CNPq - grant number 573767/2008-4). The authors are grateful to Gilmara Bastos to
prepare and give the AEPa.
References
1. Travlos GS: Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol
Pathol 2006, 34(5):548–565.
2. Bryder D, Rossi DJ, Weissman IL: Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-
specific stem cell. Am J Pathol 2006, 169(2):338–346.
3. Geissmann F, Manz MG, Jung S, Sieweke MH, Merad M, Ley K: Development of mono-
cytes, macrophages, and dendritic cells. Science 2010, 327(5966):656–661.
4. Abdelhay ESFW, Braga FHP, Binato R, Bouzas LFS: Hematopoietic stem cells: expan-
sion and perspectives for therapeutic use. Rev Bras Hematol Hemoter 2009, 31(1):2–8.
5. Nakajima H: Role of transcription factors in differentiation and reprogramming of
hematopoietic cells. Keio J Med 2011, 60(2):47–55.
6. Trembicki KA, Qureshi MA, Dietert RR: Avian peritoneal exudate cells: a comparison
of stimulation protocols. Devel Comp Immunol 1984, 8(2):395–402.
7. Randolph GJ, Jakubzick C, Qu C: Antigen presentation by monocytes and monocyte-
derived cells. Curr Opin Immunol 2008, 20(1):52–60.
8. Huber R, Pietsch D, Günther J, Welz B, Vogt N, Brand K: Regulation of monocyte dif-
ferentiation by specific signaling modules and associated transcription factor networks.
Cell Mol Life Sci 2014, 71(1):63–92.
9. Zhang Y, Morgan MJ, Chen K, Choksi S, Liu ZG: Induction of autophagy is essential for
monocyte-macrophage differentiation. Blood 2012, 119(12):2895–2905.
10. Brom J, Köller M, Schlüter B, Müller-Lange P, Ulrich SH, König W: Expression of the
adhesion molecule CD11b and polymerization of actin by polymorphonuclear granulo-
cytes of patients endangered by sepsis. Burns 1995, 21(6):427–431.
11. Khazen W, M’bika JP, Tomkiewicz C, Benelli C, Chany C, Achour A, Forest C: Expres-
sion of macrophage-selective markers in human and rodent adipocytes. FEBS Lett 2005,
579(25):5631–5634.
12. Auffray C, Sieweke MH, Geissmann F: Blood monocytes: development, heterogeneity,
and relationship with dendritic cells. Annu Rev Immunol 2009, 27:669–692.
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
118
13. Jin M, Jeon HJ, Jung HJ, Kim B, Shin SS, Choi JJ, Lee JK, Kang CY, Kim S: Enhance-
ment of repopulation and hematopoiesis of bone marrow cells in irradiated mice by oral
administration of PG101, a water-soluble extract from Lentinus lepideus. Exp Biol Med
2003, 228(6):759–766.
14. Nworu CS, Esimone CO, Tenbush M, Nabi G, Proksch P, Uberla K, Temchuva VV: Ad-
juvant properties of AcF1, an immunostimulant fraction of Alchornea cordifolia extract.
Immunol Invest 2010, 39(2):132–158.
15. Hamsa TP, Kuttan G: Ipomoea obscura ameliorates cyclophosphamide-induced toxici-
ty by modulating the immune system and levels of proinflammatory cytokine and GSH. Can J Physiol Pharmacol 2010, 88(11):1042–1053.
16. Ghonime M, Eldomany R, Ablelaziz A, Soliman H: Evaluation of immunomodulatory
effect of three herbal plants growing in Egypt. Immunopharmacol Immunotoxicol 2011,
33(1):141–145.
17. Magalhães HI, Veras ML, Torres MR, Alves AP, Pessoa OD, Silveira ER, Costa-Lotufo
LV, De Moraes MO, Pessoa C: In-vitro and in-vivo antitumour activity of physalins B and
D from Physalis angulata. J Pharm Pharmacol 2006, 58(2):235–241.
18. Bastos GN, Santos AR, Ferreira VM, Costa AM, Bispo CI, Silveira AJ, Do Nascimento
JL: Antinociceptive effect of the aqueous extract obtained from roots of Physalis
angulata L. on mice. J Ethnopharmacol 2006, 103(2):241–245.
19. Bastos GN, Silveira AJ, Salgado CG, Picanço-Diniz DL, Nascimento JL: Physalis
angulata extract exerts anti-inflammatory effects in rats by inhibiting different path-
ways. J Ethnopharmacol 2008, 118(2):246–251.
20. Shingu K, Yahara S, Okabe H, Nohara T: Three new withanolides, physagulins E, F
and G from Physalis angulata L. Chem Pharmaceut Bull 1992, 40(9):2448–2451.
21. Ismail N, Alam M: A novel cytotoxic flavonoid glycoside from Physalis angulata. Fito-
terapia 2001, 72(6):676–679.
22. Marim FM, Tatiana-Silveira N, Lima SDJR, Zamboni DS: A method for generation of
bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone marrow cells. PLoS
One 2010, 5(12):152–163.
23. Fotakis G, Timbrell JA: In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, vermelho
neutro, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium
chloride. Toxicol Lett 2006, 160:171–177.
24. Sokol RJ, Hudson G, James NT, Frost IJ, Wales J: Human macrophage development: a
morphometric study. J Anat 1987, 151:27–35.
25. Sato DY, Wal R, De Oliveira CC, Cattaneo RI, Malvezzi M, Gabardo J, Buchi DF:
Histopathological and immunophenotyping studies on normal and sarcoma 180-bearing
mice treated with a complex homeopathic medication. A homeopatia 2005, 94(1):26–32.
Da Silva et al., 2014
BMC Cell Biology
119
26. De Oliveira CC, Abud AP, e Oliveira SM, Guimarães FS, Andrade LF, Di Bernardi RP,
Colleto EL, Kuczera D, Da Lozzo EJ, Gonçalves JP, Trindade ES, Buchi DF: Developments
on drug discovery and on new therapeutics: highly diluted tinctures act as biological
response modifiers. BMC Complement Altern Med 2011, 11(101):1–11.
27. Guimarães ET, Lima MS, Santos LA, Ribeiro IM, Tomassini TBC, dos Santos RR, dos
Santos WLC, Soares MPB: Activity of physalins purified from P. angulata in in vitro and
in vivo models of cutaneous leishmaniasis. J Antimicrob Chemother 2009, 64(1):84–87.
28. Guimarães ET, Lima MS, Santos LA, Ribeiro IM, Tomassini TB, Dos Santos RR, Dos
Santos WL, Soares MB: Effects of seco-steroids purified from Physalis angulata L.,
Solanaceae, on the viability of Leishmania sp. Braz J Pharmacogn 2010, 20(6):945–949.
29. Sá MS, Menezes MN, Krettli AU, Ribeiro IM, Tomassini TC, Ribeiro RS, Azevedo
WFJR, Soares MB: Antimalarial activity of Physalins B, D, F, and G. J Nat Prod 2011,
74(10):2269–2272.
30. Vordenbäumen S, Braukmann A, Altendorfer I, Bleck E, Jose J, Schneider M: Human
casein alpha s1 (CSN1S1) skews in vitro differentiation of monocytes towards macro-
phages. BMC Immunol 2013, 14(46):1–11.
31. Yu Y, Sun L, Ma L, Li J, Hu L, Liu J: Investigation of the immunosuppressive activity
of Physalin h on T lymphocytes. Int Immunopharmacol 2010, 10(3):290–297.
32. Mei Y, Thompson MD, Cohen RA, Tong X: Endoplasmic reticulum stress and related
pathological processes. J Pharmacol Biomed Anal 2013, 1(2):1–8.
33. Mukhopadhyay S, Panda PK, Sinha N, Das DN, Bhutia SK: Autophagy and apoptosis:
where do they meet? Apoptosis 2014, 19(4):555–566.
34. Smit E, Pretorius E, Anderson R, Oommen J, Potjo M: Differentiation of human mono-
cytes in vitro following exposure to canova in the absence of cytokines. Ultrastruct Pathol
2008, 32(4):147–152.
Additional files
Additional file 1 as TIFF
Additional file 1 Flow citometry of unstained BMCs controls elucidating gates for further
analysis of treated cells.
Additional file 2 as TIFF
Additional file 2 Detection of the CD11c surface marker by flow cytometry on BMCs. Treat-
ed cells were incubated for 96 hours. a) Untreated control. b) Cells treated with 100 μg/mL
AEPa. c) Cells treated with 100 nM M-CSF. d) Fluorescence intensity of BMCs labeled with
CD11c. ANOVA followed by Tukey test. p <0.05.
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Figura 1
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Figure 2
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Figure 3
Figure 4
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Figure 5
Figure 6
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ANEXO 3: Participação em eventos
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ANEXO 4: Participação em eventos
127
ANEXO 5: Participação em eventos
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ANEXO 6: Participação em eventos
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ANEXO 7: Participação em eventos
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Anexo 8: Missão de estudos
