SERVIO PBLICO FEDERAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR NCLEO DE MEDICINA TROPICAL

PROGRAMA DE PS- GRADUAO EM MEDICINA TROPICAL

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTGENOS CELULARES E SUA CORRELAO COM O GENTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECO PELO VRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Belm 2011

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTGENOS CELULARES E SUA CORRELAO

COM O GENTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECO PELO VRUS DA HEPATITE C (HCV)

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Doenas Tropicais, do Ncleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Par, como requisito para obteno do grau de mestre em Doenas Tropicais. Orientador: Prof. Dr. Juarez Antonio

Simes Quaresma

Belm 2011

Dados Internacionais de Catalogao-na-Publicao (CIP)

Souza, Ana Maria Almeida

Autoanticorpos contra antgenos celulares e sua correlao com o Gentipo viral em pacientes com infeco pelo vrus da Hepatite C (HCV) / Ana Maria Almeida Souza; orientador, Juarez Antnio Simes Quaresma. Belm, 2011.

72 f. Dissertao (Mestrado em Medicina Tropical) Universidade Federal do Par, Ncleo

de Medicina Tropical, Programa de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Belm, 2011. 1. Autoanticorpos 2. Hepatite C 3. Gentipo. Ttulo

CDU: 616.36-002

Catalogao na Fonte: Luciene Dias Cavalcante - CRB2/1076

ANA MARIA ALMEIDA SOUZA

AUTOANTICORPOS CONTRA ANTGENOS CELULARES E SUA CORRELAO COM O GENTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECO PELO VRUS DA

HEPATITE C (HCV)

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Doenas Tropicais, do Ncleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Par, como requisito para obteno do grau de mestre em Doenas Tropicais. rea: Clnica das Doenas Tropicais.

Aprovada em: _____/____/____

BANCA EXAMINADORA:

______________________________________ - Orientador Prof. Dr. Juarez Antonio Simes Quaresma Ncleo de Medicina Tropical UFPA ______________________________________ - Membro Profa. Dra. Clea Nazar Carneiro Bichara Centro de Cincias Biolgicas e da Sade UEPA ______________________________________ - Membro Prof. Dr. Lacy Cardoso de Brito Jnior Instituto Centro de Cincias Biolgicas UFPA ______________________________________ - Membro Prof. Dr. Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitrio do Par - CESUPA

A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTNCIA.

A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E

SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES: NUNCA D SUA RAZO A NINGUM, PROCURE

SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABEA ERGUIDA.

O ESTUDO A NICA HERANA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELA.

A MINHA ME SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR, COM DOM

DE SER ME, ESPOSA E PROFISSIONAL, SEM PERDER NUNCA SUA CALMA, TRANQILIDADE E BONDADE, PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A

RECORRIAM.

AO RIBAMAR, GRANDE AMOR DE MINHA VIDA, MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS, QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APIA NA REALIZAO DOS MEUS SONHOS.

AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO, RAFAEL E ANA CAROLINA, QUE SEMPRE ME

MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS, PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES.

AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA, (IN MEMORIAM), QUE SEMPRE ESTIVERAM

AO MEU LADO, AJUDANDO NA CRIAO DOS MEUS FILHOS, PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Juarez Antonio Simes Quaresma, meu orientador e incentivador, pelos ensinamentos e orientao para a concluso desta rdua tarefa. Ao meu cunhado Prof. Dr. Carlos Lenidas Silva Souza Sobrinho, que sempre me incentivou nessa caminhada. Aos amigos, Dra. Isabella e Dr. Alberto Amaral que muito me ajudaram, me apoiaram, e permitiram minhas ausncias no laboratrio, para a concluso desta jornada. Ao colega MS / MD David Bichara, que disponibilizou seu tempo para a realizao dos testes de FAN, de maior importncia para a execuo deste trabalho. A colega Profa. Dra. Cla Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuo deste trabalho. A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso, companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizao desta tarefa. A todos os amigos do laboratrio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada. A Profa. Dra. Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberao das amostras do material biolgica de sua soroteca, sem a qual esse trabalho seria impossvel de se realizar. Ao futuro colega de profisso doutorando Geraldo Duarte, pelas contribuies na concluso estatstica dos resultados encontrados. Ao Prof. Dr. Ismaelino Mauro Nunes Magno, que tem se empenhado me incentivando na concluso desta meta, meu anjo auxiliar. A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificao me fizeram v e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado. A Luciene Dias Cavalcante, bibliotecria do HOL pela ajuda imprescindvel na elaborao desta dissertao. A todos que, de forma direta ou indireta colaboraram para a realizao deste sonho.

CONFIE... AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA.

EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER! MOMENTOS FELIZES, LOUVE A DEUS.

MOMENTOS DIFCEIS, BUSQUE A DEUS. MOMENTOS SILENCIOSOS, ADORE A DEUS.

MOMENTOS DOLOROSOS, CONFIE EM DEUS. CADA MOMENTO, AGRADEA A DEUS

"ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE FCIL, MAS CRER QUE ELE EST NO COMANDO E TEM

UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER

PENA"

(DESCONHECIDO)

RESUMO

As inflamaes do fgado provocadas pelos vrus hepatotrpicos atingem milhes de

pessoas e representa significativo problema de sade pblica em todo o mundo.

Existem interaes entre viroses hepatotrpicas e o sistema imunolgico do hospedeiro

que podem influenciar na patogenicidade da agresso heptica. O objetivo deste

trabalho foi investigar a freqncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do vrus

da hepatite C, e sua correlao com os gentipos encontrados. Foram estudados 51

pacientes com diagnstico confirmado pelo PCR de infeco pelo vrus da hepatite C e

um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames sorolgico para doenas

infecto-contagiosas negativos. Os 51 pacientes portadores do vrus C apresentavam

idade mdia de 43 anos, +/- 11,3, em fase pr-tratamento, 34 (66,7%) eram do gnero

masculino e 17 (33,3%) do gnero feminino. Desses 13 (25,5%) apresentaram FAN

positivo, 45 (88,2%) eram gentipo tipo 1 e 11,8% gentipo tipo 3. Os pacientes que se

apresentaram com anticorpos detectveis no apresentavam nveis de AST, ALT,

AST/ALT, -GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-

anticorpos negativos. Desta forma, conclui-se que os anticorpos presentes na amostra

do estudo so independentes da evoluo da doena e do prognstico do paciente,

entretanto parece estar ligada ao gentipo tipo 1.

Palavras-chave: Hepatite C, Auto-anticorpos, Gentipo.

ABSTRACT

Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and

represents a significant public health problem worldwide. There are interactions between

hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of

liver injury. The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies

in patients with hepatitis C virus, and its correlation with the genotypes found. We

studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100

blood donors with all serological tests for infectious diseases negative. The 51 patients

with virus C had an average age of 43 years, + / - 11.3, in the pre-treatment, 34 (66.7%)

were male and 17 (33.3%) were female. Of these 13 (25.5%) were ANA positive, 45

(88.2%) were with genotype 1 and 11.8% with genotype 3. Patients who presented with

antibodies had no detectable levels of AST, ALT, AST / ALT, -GT and alkaline

phosphatase significantly different from those with negative antibody titers. Thus, we

conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease

progression and patient prognosis, though seems to be linked with genotype 1.

Keywords: Hepatitis C, Auto-antibodies, genotype.

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Padres de fluorescncia encontrados em maior freqncia e patologias relacionadas ........................................................................... 34

Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antgenos extrados do ncleo e relevncias clnicas mais freqentes ....................................................... 34

Quadro 3 Padres de FAN nuclear e relevncias clnicas mais freqentes ............. 35

Quadro 4 - Padres de FAN citoplasmticos e relevncias clnicas mais freqentes .. 36

Quadro 5 - Padres de FAN mistos e relevncias clnicas mais freqentes ............... 37

Quadro 6 - Padres de FAN nucleolares e relevncias clnicas mais freqentes ....... 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuio dos pacientes segundo as caractersticas demogrficas, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ................................................ 48

Tabela 2 - Distribuio dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmtico e genotipagem, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ...................................................................................................... 49

Tabela 3 Distribuio do FAN citoplasmtico de acordo com o gnero dos pacientes, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ............................... 49

Tabela 4 - Relao da genotipagem de acordo com o gnero dos pacientes, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ................................................ 50

Tabela 5 - Distribuio dos pacientes de acordo com o gentipo viral e faixa etria - janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par .............................................. 50

Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o gentipo viral e presena do FAN citoplasmtico, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par . .......................................................................................... 51

Tabela 7- Distribuio dos gentipos dos pacientes de acordo com os parmetros bioqumicos, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ........................... 51

Tabela 8 - Distribuio do FAN citoplasmtico dos pacientes de acordo com os parmetros bioqumicos, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ........ 52

Tabela 9 - Distribuio do FAN citoplasmtico segundo a presena ou ausncia de infeco por HCV, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ............. 52

Tabela 10 - Distribuio do FAN de acordo com o gentipo viral, janeiro 2009 a maio 2010, Belm Par ........................................................................ 53

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AAN Anticorpos antinucleares

aCL Anticorpos anticardiolipina

AIDS Sindrome da Imunodeficincia Adquirida

ALT Alanina aminotransferase

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutrfilos

Anti-CCP Antipeptdeo citrulinado cclico

Anti-2GPI Anticorpos anti-2 glicoprotena I

Cdna DNA complementar

CEP Comit em tica e Pesquisa

CHC Carcinoma hepatocelular

CIC Complexos imunes circulantes

DDTC Doenas difusas do tecido conjuntivo

DMTC Doena mista do tecido conjuntivo

E1 Protena do envoltrio

ENH Eritema Nodoso Hansnico

ESP Esclerose sistmica progressive

FAN Fator Anti-ncleo

FR Fator reumatide

HBV Vrus da hepatite B

HCV Vrus da Hepatite C

HEMOPA Fundao Centro de Hemoterapia e Hematologia do Par

HIV Vrus da imunodeficincia humana

HIV-1 Vrus da imunodeficincia humana1

IAH ndice de atividade histolgica

LE Lupus Eritematoso

LES Lpus eritematoso sistmico

MS Ministrio da Sade

mtDNA DNA mitrocondrial

NANBH Hepatite no-A no-B

NMT Ncleo de Medicina Tropical

OMS Organizao Mundial de Sade

PCR Reao de polimerase em cadeia

Rh Tipo sanguneo

RNA cido ribonuclico

RT-PCR Reao de polimerase em cadeia-em tempo real

SAF Sndrome antifosfolpide

SIDA Sndrome de Imunodeficincia Adquirida

SS Sndrome de Sjgren

UFPA Universidade Federal do Par

UV ultravioleta

VHA Vrus da Hepatite A

VHC Vrus da Hepatite C

VHC/HCV Hepatite C

VV Hansenase generalizada

SUMRIO 1 INTRODUO .......................................................................................................... 15 1.1 HEPATITE C (VHC/HCV) ....................................................................................... 15 1.1.1 Consideraes Gerais ....................................................................................... 15 1.1.2 Agente Etiolgico .............................................................................................. 16 1.1.3 Epidemiologia .................................................................................................... 17 1.1.4 Modo de Transmisso ....................................................................................... 18 1.1.5 Evoluo Clnica ................................................................................................ 19 1.1.6 Diagnstico ........................................................................................................ 23 1.2 DETERMINAO DO GENTIPO DO VHC ......................................................... 25

1.3 MANIFESTAES EXTRA-HEPTICAS DA INFECO PELO VHC .................. 26

1.4 A ASSOCIAO ENTRE DOENAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE .......... 27

1.5 FREQNCIA E IMPLICAES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS ................................................................................................... 31

1.6 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR FAN .................... 32 2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 39 2.1 ASPECTOS TICOS .............................................................................................. 39 3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 40

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 40

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................. 40 4 MATERIAL E MTODOS ......................................................................................... 41 4.1 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULAO DO ESTUDO) ........... 41 4.1.1 Pacientes com diagnstico laboratorial de Hepatite C .................................. 41 4.1.2 Grupo de no infectados .................................................................................. 41 4.2 MTODO ................................................................................................................ 42 4.2.1 Obteno do material biolgico ....................................................................... 42 4.2.2 Diagnstico sorolgico da hepatite C ............................................................. 42 4.2.3 Deteco dos cidos nuclicos do vrus da hepatite C por biologia

molecular .......................................................................................................... 43

4.2.4 Determinao do gentipo do vrus (genotipagem) ....................................... 45 4.2.5 Tcnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em clulas

HEp-2 ................................................................................................................ 46 4.3 ANLISE ESTATSTICA ........................................................................................ 47 5 RESULTADOS .......................................................................................................... 48 6 DISCUSSO ............................................................................................................. 54 7 CONCLUSES ......................................................................................................... 59 REFERNCIAS ............................................................................................................ 60 APNDICES ................................................................................................................ 67 ANEXOS ...................................................................................................................... 70

15

1 INTRODUO

1.1 HEPATITE C (VHC/HCV)

1.1.1 Consideraes Gerais

As hepatites virais so doenas causadas por diferentes agentes

etiolgicos, de distribuies universais, que tm em comum o hepatotropismo.

Possuem semelhanas do ponto de vista clnico-laboratorial, mas apresentam

importantes diferenas epidemiolgicas quanto sua evoluo (FERREIRA;

SILVEIRA, 2004). Desde a descrio e definio em 1989 (CHOO et al., 1989 apud

RIBEIRO et al. 2007), tornou-se evidente sua associao com uma grande

variedade de manifestaes extra-hepticas, desordens reumticas e auto-imunes

(ALMEIDA, 2010).

A infeco pelo VHC/HCV acarreta inflamao heptica e esteatose,

podendo evoluir para fibrose heptica e cirrose em indivduos cronicamente

infectados, estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

(RIBEIRO et al. 2007). Essas complicaes tardias ocorrem em um perodo, em

geral, superior a 20 anos aps o incio da infeco. A avaliao filogentica das

seqncias do VHC/HCV investigadas em vrias regies geogrficas sugere que

existam pelo menos seis gentipos principais, designados pelos nmeros de 1 a 6, e

pelo menos 30 subtipos, designados por letras minsculas. Nos Estados Unidos,

prevalecem os gentipos 1a (60%) e 1b (20%). Os tipos 5 e 6 so mais encontrados

no sudeste e sul da frica. O tipo 4 predominante na frica Central e no Oriente

Mdio. No Brasil, predominam os gentipos 1a e 1b (63%), e 3a (31,3%) (BASSIT et

al., 1999 apud RIBEIRO et al. 2007). As informaes sobre as causas que

determinam o curso evolutivo da doena so pouco conhecidas, apesar dos

progressos que h no campo do diagnstico da infeco pelo VHC/HCV. Uma

questo intrigante diz respeito relao gentipo versus replicao viral e graus de

leso histolgica. Assim, por exemplo, o gentipo 1 (1b) cursa com leses

histolgicas mais graves.

As ltimas dcadas foram de notveis conquistas no que se refere

preveno e ao controle das hepatites virais. Entre as doenas endmico-

epidmicas, que representam problemas importantes de sade pblica no Brasil,

16

salientam-se as Hepatites Virais, cujo comportamento epidemiolgico, no nosso pas

e no mundo, tem sofrido grandes mudanas nos ltimos anos.

Antes da seleo rigorosa dos doadores de sangue, em 1991, o

VHC/HCV era a maior causa de hepatite ps-transfusional. Atualmente permanece

como tal em casos espordicos (CONTE, 2000). Os grupos considerados de risco

so pessoas que receberam transfuso de sangue antes de 1992, usurios de

drogas injetveis, profissionais de sade que lidam com sangue, pacientes de

hemodilise e, com menor risco, pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE;

ONO-NITA, 2007).

A melhoria das condies de higiene e de saneamento das populaes, a

vacinao contra a Hepatite B (HBV) e as novas tcnicas moleculares de diagnstico

do vrus da Hepatite esto entre esses avanos importantes (BRASIL, 2008).

1.1.2 Agente Etiolgico

O VHC/HCV, um vrus cido ribonuclico (RNA) da famlia Flaviviridae,

representa a principal causa da previamente denominada hepatite no-A, no-B

(SANTOS, 2009). Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um

genoma NANBH, semelhante aos togaviridae ou flaviviridae, (SAADE, 2008) e

visualizado a imunoeletromicroscopia como partcula de 55 a 65 nm de dimetro,

com projees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae. Alm

disso, estas partculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais

do contedo protico do envelope do VHC. (HIRANUMA et al., 1994 apud CONTE,

2000).

O agente etiolgico do HCV no uma partcula homognea e apresenta

uma taxa alta de mutao, levando-o a uma heterogeneicidade genmica, cujo

resultado um grande nmero de gentipos (1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5, 6)

(AUGUSTO; LOBATO, 2003). No h evidncias de variantes no patognicas. O

gentipo 1b o que apresenta maior virulncia e pior resposta ao tratamento

(LAUER; WALKER, 2001 apud SOUZA, 2007). No Brasil, dados obtidos a partir de

casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o gentipo 1b

ocorre em cerca de 30% a 40% dos casos; o 1a em cerca de 20%; 1a e 1b em 20%;

o 3a em cerca de 28% (FOCACCIA, 2004).

17

1.1.3 Epidemiologia

De acordo com a Organizao Mundial de Sade (OMS) a HCV uma

questo de sade pblica e tambm a principal causa de transplante de fgado no

Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA, 2005). estimada uma

prevalncia em torno de 1,0% para a infeco pelo VHC na populao mundial

(KILLEMBERG, 2000). Nos Estados Unidos, cerca de 2,7 milhes de pessoas esto

infectadas pelo vrus (BRASIL, 2006).

De acordo com Ferreira e Silveira (2004), no Brasil o nmero de pacientes

infectados incerto, relacionado geralmente a alguns estados e municpios, e o

esclarecimento dos agentes causadores das hepatites, cuja identificao requer

tcnicas laboratoriais complexas de biologia molecular, realizado de maneira

insuficiente. Por outro lado, "a progressiva integrao entre as instncias gestoras

dos programas de vigilncia e controle das doenas com grupos de pesquisa e

desses com os servios" (FERREIRA; SILVEIRA, 2004, p. 473), e a disponibilidade

dos bancos de dados nacionais mais confiveis apontam para novos e melhores

caminhos. (BRASIL, 2005b).

A OMS alerta que o Pas deve se preparar para uma exploso da

epidemia a partir de 2011 (BRASIL, 2005b). Outra preocupao que as pessoas

que receberam sangue antes de 1992 tm mais chances de estarem infectadas; na

poca, o sangue destinado s transfuses no era analisado para deteco da HCV

porque o vrus no era conhecido e no havia exames especficos (BRASIL, 2005b).

A prevalncia da infeco nos doadores de sangue sadios varia de 0,01%-0,02% no

Reino Unido e no norte da Europa, 1%-1,5% no sul da Europa, 6,5% na frica

equatorial e de at 20% no Egito (CONTE, 2000).

De acordo com a OMS, a cada grupo de 50 pessoas no Brasil, uma tem

hepatite e de dez portadores, apenas um sabe (STRAUSS, 2001). So dois milhes

de infectados no Pas. Denominada epidemia silenciosa, calcula-se que 170 milhes

de indivduos no mundo estejam contaminados pelo vrus C, a forma mais grave da

doena Ainda de acordo com a OMS, o nmero de brasileiros vtimas da

enfermidade bem maior do que o estimado pelo Ministrio da Sade (TRINDADE,

2005).

18

Por ocasio da Conferncia Internacional de Consenso sobre HCV, em Paris

(LEUROPEAN ASSOCIATION, 1999), concluiu-se que a hepatite crnica por vrus

C um problema grave de sade pblica, sendo sua prevalncia mundial estimada

em 3% (de 0,1% a 5%, segundo os vrios pases) por tanto, havendo no mundo

todo, cerca de 150 milhes de portadores crnicos do VHC/HCV: 4 milhes nos EUA

e 5 milhes na Europa Ocidental. Na Europa Oriental a prevalncia maior ainda.

1.1.4 Modo de Transmisso

A HCV transmitida pelo sangue. No h comprovao de contgio por

meio de fluidos corporais como saliva, suor, lgrimas, smen ou leite materno.

Tambm deixa de ocorrer por meio de abraos, beijos, uso dos mesmos copos ou

roupas. Especialistas afirmam que a contaminao atravs de relaes sexuais

possvel, mas rara. Quando detectada de maneira precoce, a enfermidade tem

tratamento, inclusive gratuito, alm de cura (BRASIL, 2006).

Dentre os fatores de risco para transmisso outros alm da transfuso de

sangue, o uso de drogas ilcitas, o comportamento sexual de alto risco e variveis

socioeconmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar. No foi

observada associao entre o risco de infeco e as variveis demogrficas

designadas por gnero, idade e raa (ALTER, 2007). O risco de transmisso sexual

do VHC/HCV mnimo, A contaminao intrafamilial no-sexual considervel,

particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral

elevada (risco 1:10). (CONTE, 2000)

A prtica de tatuagem fornece dados conflitantes, sabendo-se que os

"lquidos" usados para "esterilizar" os instrumentos usados so ineficazes.

Karmochkine et al. (1998 apud CONTE, 2000) observaram que

aproximadamente 80% dos pacientes contraem o vrus atravs da toxicomania

intravenosa ou transfuses de sangue ou de derivados. Os restantes meios de

transmisso e de contgio so a hemodilise, os transplantes de rgos, picadas

acidentais profissionais e transmisso vertical me-criana. Em 20% a 40% dos

casos no se consegue determinar o modo de contaminao, A transmisso da

hepatite crnica por vrus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al., 1998 apud

CONTE, 2000).

19

As duas fontes de contaminao so a toxicomania endovenosa e a

administrao de produtos de origem sangnea. Esta ltima praticamente

eliminada, desde 1991, com a introduo dos testes ELISA 2, na seleo

aprimorada de doadores de sangue. (BRASIL, 2005a; KARMOCHKINE et al., 1998

apud CONTE, 2000).

A transmisso sexual rara, com menos de 3% em parceiros estveis e,

ocorre principalmente em pessoas com mltiplos parceiros e com prtica sexual de

risco (sem uso de preservativo) para os indivduos com parceiros mltiplos, o uso

de preservativos indicado (BRASIL, 2005a; KARMOCHKINE et al., 1998 apud

CONTE, 2000).

A gravidez no est contra-indicada nas mulheres infectadas pelo

VHC/HCV. A transmisso vertical me-criana rara (menor de 6%). O tipo de parto

(natural ou cesrea) no tem influncia. O aleitamento permitido. A transmisso

nosocomial prevenida eficazmente, de modo convencional. (KARMOCHKINE et

al., 1998 apud CONTE, 2000).

1.1.5 Evoluo Clnica

A infeco aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para

hepatite fulminante. Aproximadamente 85,0 % das pessoas infectadas agudamente

vo desenvolver uma viremia persistente, tornando-se, dessa forma, indivduos

infectados crnicos. Depresso, irritabilidade, dores no corpo, mal-estar, febre,

nuseas, e falta de apetite so alguns dos sintomas mais freqentes, embora a

maioria dos casos no apresente nenhum sintoma (ALTER, 2007).

A cirrose pouco observada em pessoas que apresentam nveis

persistentemente baixos das transaminases, mas a elevao destas no

representativa do grau de fibrose heptica. Dessa forma, a bipsia heptica

representa o melhor indicador do estgio de evoluo da doena, uma vez que

gradua os componentes inflamatrios e o estgio de fibrose (AGMON-LEVIN et al.,

2009; BLOCK; SCHIANO, 1999).

Alter et al. (1992) dizem que em 82% de 130 pacientes seguidos durante

muitos anos, aps surto agudo de hepatite no-A no-B, apresentam anti-VHC/HCV

ou VHC/HCV RNA, sendo que 62% deles desenvolveram hepatite crnica e

concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite

20

crnica, sendo que o VHC/HCV pode ser a maior causa de doena crnica de fgado

nos EUA e que na maioria dos pacientes a infeco pelo VHC/HCV parece persistir

por muitos anos, mesmo na ausncia de doena heptica ativa.

Almeida et al. (1999) determinaram a prevalncia da infeco em

doadores de sangue, assim como avaliaram o grau de comprometimento heptico

numa populao, de 37.335 doadores, durante o binio 93-94, em Porto Alegre - RS,

utilizando o teste anti-VHC ELISA 2. Selecionaram 60 deles para a biopsia heptica,

com agulha de Menghini, encontrando prevalncia de 1,74% com comprometimento

hepatico e 39 deles apresentavam cirrose heptica. Sendo a hepatopatia crnica de

graus variveis observadas em 80% deles, na sua grande maioria com leses leves

e mnimas. Foi observada forte associao entre elevao de alanina

aminotransferase (ALT) e a presena de hepatopatia crnica, embora a intensidade

desta elevao no se correlacione com a gravidade da leso histolgica.

J na experincia de Mutimer et al. (1995) cerca de 80% dos doadores

soro-positivos, analisados exaustivamente, inclusive com biopsia de fgado,

mostraram evidncias de alteraes histolgicas e ou virolgicas de infeco

persistente sem, no entanto, atingir graus mais avanados de hepatopatia crnica,

quase todos permanecendo na categoria moderada.

Nos pases industrializados, a HCV responsvel por 20% dos casos de

hepatite aguda, 70% dos casos de hepatite crnica, 40% dos casos de cirrose

descompensada, 60% dos carcinomas hepatocelulares e 30% dos transplantes

hepticos (LEUROPEAN ASSOCIATION, 1999).

Cerca de 40% do total de pacientes curam-se ou tm doena crnica de

natureza benigna. Os restantes 60% cursam com atividade aumentada de

aminotransferase, denotando evoluo crnica da doena. Dentre estes, a maioria

tem leses necro inflamatrias discretas e fibrose mnima ou ausente. O prognstico

em longo prazo mal conhecido, no entanto, provavelmente a maioria deles no vir

a falecer da doena heptica em curso. Cerca de 20% deles, depois de 10-20 anos

de evoluo, desenvolvero cirrose heptica, passvel de transplante. Assim, a

hepatite crnica por vrus C doena que ocasiona a morte de um pequeno nmero

de pacientes sem, no entanto, afetar a durao da vida mdia da maioria deles.

(CONTE, 2000; FERREIRA; SILVEIRA, 2004).

Aps infeco aguda, somente 10% dos pacientes desenvolve doena

clnica com ictercia. A infeco sub-clnica a regra e, assim, passa despercebida.

21

Cerca de 25% deles tm infeco crnica sintomtica, com aminotransferases

normais e leses inflamatrias histolgicas mnimas. (RESENDE et al., 2010).

A remisso espontnea acontece em cerca de 15% dos casos. Na grande

minoria dos casos, a progresso da doena aguda pode levar insuficincia

heptica aguda.

Observaes feitas pelo irlands Kenny-Walsh (1999), comprovam a

natureza e a evoluo clnica da afeco em causa. O autor acompanhou durante 17

anos, 376 mulheres que receberam injees de imunoglobulinas anti-D,

contaminadas com VHC, provenientes de doador nico num programa de

isoimunizao Rh. Destas, 81% apresentaram sintomatologia, mais freqentemente

fadiga (66%), ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 U/L) em 47% e igual ou maior de

100 U/L em 8%. A biopsia heptica mostrou inflamao em 98% delas, na maioria

das vezes, leves (41%) e moderadas (52%); fibrose presente em 51%, no entanto,

somente em sete pacientes (2%) houve sinais de cirrose provvel ou definitiva. Em

uma delas havia acentuado alcoolismo.

A hepatite crnica por vrus C doena de evoluo varivel. De maneira

geral, sua evoluo lenta, insidiosa e progressiva.

Os pacientes que no apresentam evidncias bioqumicas de leso

heptica podem constituir em subgrupo de casos "mais benignos", no curso natural

da doena. Muitos co-fatores tm papel importante no desenvolvimento da cirrose

nesses pacientes, como por exemplo, a idade no momento da infeco (os

contaminados de idade mais avanada tm evoluo mais rpida da doena,

enquanto que os mais jovens a tm mais lenta); o alcoolismo ( de consenso geral

que o abuso de lcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infeco com o

Vrus da Sndrome de Imunodeficincia Adquirida (SIDA) e da HVB.

A incidncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) de 1% a 4% nos

pacientes cirrticos, o que justifica plenamente o controle ecogrfico do fgado e a

dosagem srica de alfa-fetoprotena nesses pacientes, a cada 1-2 anos. Por outro

lado, nos pacientes com hepatite crnica por vrus C sem cirrose, o CHC muito

raro (LOPES, 2010).

Nos casos de cura, a atividade das transaminases cessa e os vrus no

so detectados (VHC RNA) no soro. Nos casos de cronificao, acontece o

contrrio, ou seja, as alteraes bioqumicas existem, com flutuaes, e os vrus so

detectveis, na grande maioria dos casos. Fazem exceo queles pacientes com

22

viremia baixa que, por isso mesmo, fogem aos limites dos mtodos de deteco viral

ou devido s flutuaes prprias desses nveis virmicos (HAYDON et al., 1998).

Nos pacientes anti-VHC positivos, com enzimas circulantes normais, a

falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa. No

entanto, Haydon et al. (1998) alteraram essa interpretao. Estes autores

demonstraram a presena de VHC RNA no fgado desses pacientes que eram

negativos no soro, independente das alteraes bioqumicas positivas ou negativas

do soro, ou seja, mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados.

Assim, os nveis de vrus intra-hepticos no so determinados pelos fatores

hospedeiro (idade, modo e durao da infeco) ou virais (VHC gentipos), pois,

mesmo as repetidamente Reao de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-

PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter vrus da HCV albergados no

fgado. Entretanto, existem limitaes metodolgicas que devem ser consideradas

nessa interpretao, como por exemplo, as limitaes do RIBA 3 e do RT-PCR.

Mais importante o seguimento dos pacientes ao longo do tempo. Assim,

Seef et al. (1992), em 568 pacientes de hepatite ps-transfusional e dois grupos

controles pareados que receberam transfuses sem desenvolver hepatite, aps 18

anos de seguimento, encontraram 3,3% de mortalidade no grupo 1 e 1,5% no grupo

controle, sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo

associado. Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doena crnica o faz

muito lentamente.

Existem ainda, no curso natural da doena, flutuaes intensas e muito

freqentes que dependem dos vrus e dos hospedeiros, a saber: nveis da viremia,

gentipos 1b, graus de diversidade gentica dos vrus, vias de transmisso (os

inoculados via transfuso apresentam leses hepatocelulares mais ativas)

(GORDON et al., 1993; GORDON; BAYATI; SILVERMAN, 1998), deficincias

imunes, alcoolismo e co-infeco com HBV e delta ou o Vrus da imunodeficincia

humana (HIV). (LOPES, 2010). Nestes ltimos casos, a co-infeco com mltiplos

vrus das hepatites est associada com mais graves leses histolgicas do fgado do

que nos casos de VHC isoladas.

Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantm

por longos perodos. Ou seja, como exemplos, a atividade da ALT persistentemente

normal, a variabilidade do RT-PCR, a deteco de VHC RNA pela tcnica Reao

de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa, devido inadequada

23

armazenagem das amostras, contaminao do soro com substncias que

interferem na leitura, entre outras causas de erro.

As informaes sobre as causas que determinam o curso evolutivo da

doena so pouco conhecidas, apesar dos progressos havidos no campo do

diagnstico da infeco pelo VHC. Uma questo intrigante diz respeito relao

genotipo versus replicao viral e graus de leso histolgica. Assim, por exemplo, o

genotipo 1 (1b) cursa com leses histolgicas mais graves, independentemente da

carga viral. Ainda mais, os VHC RNA negativos no soro, mesmo aps anos de

"cura", podem recair, pois neles persistem os vrus no fgado, em regime de

replicao muito baixa, indetectvel pelos mtodos atuais. Ao contrrio, os negativos

no soro e no fgado, tm demonstrado respostas boas e sustentadas, inclusive no

sentido de se fazer prognstico de cura real e verdadeira, infelizmente na grande

minoria dos casos.

1.1.6 Diagnstico

Quanto mais cedo o diagnstico, maiores as chances de detectar a

doena. Por isso importante que as pessoas faam o exame especfico porque s

esse exame que detecta a HCV. E as mulheres tm que ter uma ateno em

especial. Tempos atrs o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande matria

sobre a quantidade de mulheres que vm sendo infectadas com a HCV. Cuja causa

estava na esterelizao mal feita dos equipamentos das manicures. Uma soluo

prtica as mulheres terem seu prprio material pra fazer as unhas e no deixar

mais ningum utilizar (nem me, nem irm, etc). Bem, e quem tiver passado por

transfuso, dentistas, manicures, operaes, etc deve fazer o exame

(KARMOCHKINE et al., 1998 apud CONTE, 2000; KEER et al., 1997).

A HCV no como a Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (AIDS),

que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos

anos. Com a HCV, o paciente s tem chance de ficar bem se a doena for

diagnosticada e tratada antes dela se manifestar. Atualmente, o tratamento usa uma

associao de duas drogas o Interferon e a Ribavirina. As chances de cura, em

mdia, so de 50%.

Barbaro et al. (1999) verificaram que os pacientes VHC gentipos 1b,

freqentemente apresentavam alteraes ultraestruturais das mitocndrias com

24

depleo do mtDNA, podendo comprometer o processo de fosforilizao oxidativa.

Sendo assim, a produo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC gentipos

1b, poderia atuar de modo negativo na evoluo da doena heptica, aumentando o

efeito citopticos do VHC. Nesses pacientes, haveria, portanto, aumento de

hiperoxidao, com conseqente resistncia ao dos interferons e pior evoluo

da doena heptica. A ser confirmado este fato, novas estratgias teraputicas

podero vir a ser desenvolvidas no combate a essa doena.

Agnello et al. (1998) acreditam que a infeco persistente nessa doena

poderia ser devida baixa percentagem de replicao viral nos hepatcitos. Esses

autores usaram nova tcnica de hibridizao in situ para detectar VHC RNA, seis

vezes mais especfica do que a do RT-PCR. Concluem que a extenso da infeco

hepatoctica varia inversamente ao ndice de atividade histolgica (IAH), ou seja,

quando esta for mnima, aquela ser mxima. No entanto, nesses casos, a

concentrao de VHC nos hepatcitos ser muito baixa. Esses achados levam

hiptese de que a infeco persistente no fgado pode ser causada, ao menos em

parte, por essa mesma baixa replicao viral (AGMON-LEVIN et al., 2009.).

Dos fatos acima expostos, decorrem implicaes, tais como as respostas

CD8-CTL aos antgenos VHC, restritas aos complexos de histocompatibilidade

principais (MHC I), com inibio ou mesmo insuficiente produo de complexo

peptdeo VHC-MHC, inibio direta das clulas CTLK e a falta de resposta as

citoquininas, entre outras, dos vrios mecanismos de escape existentes. Dentro

desse contexto, o nvel de morte celular no seria alcanado e a leso hepatocelular

conseqente seria, portanto, mnima.

Outra implicao resultante consiste na induo de resposta imune

celular, T Helper mediadas, a partir de peptide vacinas contra o VHC. Estas novas

vacinas tm a capacidade de gerar linfcitos T citotxico os CTLs contra o VHC, em

camundongo imunizados com peptdeos CTL e clulas HT eptomes do core VHC.

Esses estudos recente, em animais de laboratrio, vm progredindo rapidamente,

esperando-se em breve, novos recursos no tratamento dessa doena (AGNELLO et

al., 1998).

25

1.2 DETERMINAO DO GENTIPO DO VHC

O VHC constitui-se em uma famlia heterognea de vrus, com no mnimo

seis gentipos e inmeros subtipos (BARBOSA; SILVA; MARTINS, 2005; BASSIT;

SANTOS; SILVA, 1999). Embora o mtodo de maior acurcia para a determinao

do gentipo do VHC seja a identificao completa da seqncia dos 9.500

nucleotdeos e a construo de uma rvore filogentica, esse mtodo s pode ser

utilizado em laboratrios de pesquisa (BARBOSA; SILVA; MARTINS, 2005), e no

em laboratrios clnicos. Assim, foram desenvolvidos mtodos para genotipagem

utilizando apenas as regies mais conservadas do genoma, como a protena do

envoltrio (E1), a protena core e a protena no estrutural NS5B. A seqncia dos

nucleotdeos dentro dessas regies relativamente conservadas gentipo-

especfico, e os isolados podem ser genotipados, independentemente da regio que

for utilizada para anlise (BARBOSA; SILVA; MARTINS, 2005; BASSIT; SANTOS;

SILVA, 1999). Para uso em laboratrios clnicos foram desenvolvidas basicamente

duas metodologias que se valem de tcnicas de biologia molecular (genotipagem)

ou citolgicas (serotipagem).

Os mtodos que adotam tcnica de biologia molecular para genotipagem,

utilizando pores do genoma, incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT;

SANTOS; SILVA, 1999), a tcnica de restriction fragment length polymorphism

(RFLP) (BARBOSA; SILVA; MARTINS, 2005; BASSIT; SANTOS; SILVA, 1999), a

hibridizao reversa (BASSIT; SANTOS; SILVA, 1999), (INNO-LiPA, Innogenetics,

Blgica; Gen. Eti DEIA HCV, Sorin Biomedica, Itlia) e o seqenciamento direto da

regio no-codificante 5' (TruGene, Visible Genetics, Canad). Suas principais

vantagens so a informao direta sobre seqncia dos nucleotdeos do genoma

viral, a alta sensibilidade, por se basearem na PCR, e a possibilidade de identificar o

subtipo viral (BARBOSA; SILVA; MARTINS, 2005).

Os mtodos para determinao do gentipo que utilizam serotipagem

baseiam-se na deteco de anticorpos gentipos-especficos contra eptopos do

VHC (por exemplo, protenas da regio do core) (BLOCK; SCHIANO, 1999). Os

testes comercializados utilizam diferentes tcnicas, ELISA competitivos ou

immunoblot (Murex-HC1-6, Murex Diagnostics Ltd, Reino Unido; RIBA HCV

Serotyping Assay, Chiron Diagnostics, Estados Unidos). As principais vantagens da

tcnica de serotipagem so o baixo custo e maior facilidade de realizao, em

26

comparao com os testes de biologia molecular (BLOCK; SCHIANO, 1999; De

LARANAGA et al., 2000).

A determinao do gentipo, anteriormente utilizada em pesquisas, mas

sem maior utilidade na prtica mdica, atualmente recomendada para uso clnico.

Como j mencionado, os pacientes infectados pelo gentipo 1 do VHC devem ser

tratados por 12 meses enquanto os demais, por 6 meses (BASSIT; SANTOS; SILVA,

1999).

A determinao do gentipo do VHC pode ser feita por PCR ou

serotipagem. A primeira tcnica mais sensvel e possibilita a identificao de

subtipos do VHC. Contudo, a segunda de mais fcil realizao e mais barata,

razo pela que importante que a tcnica seja aprimorada.

Oliveira et al. (1999) investigaram os padres de distribuio dos

gentipos do VHC, estudando 250 pacientes anti-VHC positivos, atravs da

deteco VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalncia de 72% para o VHC 1,

25,3% para o tipo 3, 2% para o 2 e 0,7% para o 4, semelhantes aos das vrias

regies mundiais.

1.3 MANIFESTAES EXTRA-HEPTICAS DA INFECO PELO VHC

As manifestaes extra-hepticas da infeco pelo VHC so as mais

variadas possveis. A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso,

variando desde quadros assintomticos at aqueles com evoluo grave, fatal ou

incapacitante, tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepncias

clnicas, sobretudo na imunomodulao. Dentre as infeces mais bem estudadas

destacam-se aquelas pelos Vrus da hepatite C, Vrus da imunodeficincia humana1

(HIV-1), pelo Herpes vrus humano 4 (vrus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium

leprae (ABBAS; LICHTMAN, 2005).

A agresso heptica por auto-imunidade um fenmeno reconhecido em

vrias doenas do fgado, inclusive nas de etiologia viral. Alm do agente agressor e

de sua interao com o sistema imunolgico do hospedeiro, fatores ambientais ou

hormonais esto aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade

heptica, como se supe acontecer na hepatite auto-imune em indivduos

geneticamente suscetveis. (CODES et al., 2002).

27

A leso hepatocelular relacionada infeco pelos vrus hepatotrpicos e

pelos herpes vrus (citomegalovrus e Epstein-Barr) secundria a uma resposta

auto-imune do hospedeiro. Estes vrus no parecem ser diretamente citopticos,

mas desencadeiam leso heptica atravs da resposta imune do hospedeiro contra

clulas hepticas infectadas (MALOY; POWRIE, 2001).

Existem estudos que focalizam alteraes imunolgicas em hepatites

virais, entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais, sem seguimento na

fase aguda da doena (BLOCK; SCHIANO, 1999; McFARLONE et al. 1990). Alm

disso, ainda no se estabeleceu uma associao entre as reaes auto-imunes

transitrias induzidas por viroses hepatotrpicas e agravamento do dano tecidual na

hepatite viral.

A infeco crnica est fortemente associada crioglobulinemia mista

essencial, glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutnea tardia. De

forma menos impressiva, encontra-se tambm associada lcera corneana de

Mooren, lquen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG, 2000; WENER et al., 1996).

A ocorrncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em

associao com a infeco crnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG, 2000;

CACOUB et al., 1999).

A associao entre a infeco crnica pelo VHC, a presena do fator

reumatide e do anticorpo antinuclear (FAN), o fenmeno de Raynaud e doenas

difusas do tecido conjuntivo (DDTC), como artrite reumatide, lpus eritematoso

sistmico, sndrome de Sjgren e vasculites sistmicas, relatada em alguns

trabalhos (CACOUB et al., 1999; LOVY; STARKEBAUM; UBEROI, 1996; STAUB,

1998; WENER et al., 1996).

1.4 A ASSOCIAO ENTRE DOENAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE

A associao entre doenas infecciosas e autoimunidade, apresentando-

se com manifestaes clnicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-

anticorpos, tem sido amplamente documentado. Infeces virais, bacterianas e

parasitrias podem estar envolvidas no desenvolvimento, recidivas e at mesmo na

preveno de doenas auto-imunes (KIVITY et al., 2009; PORDEUS et al., 2008).

Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a freqncia de FR, anticorpos

antipeptdeo citrulinado cclico (anti-CCP), AAN, anticorpos anti-citoplasma de

28

neutrfilos (ANCA), anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-2

glicoprotena I (anti-2GPI) em pacientes com hansenase. Existe estudo

demonstrando pacientes que apresentavam manifestaes articulares, comparados

aos que no apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indivduos

saudveis com idade e gnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que

residiam na mesma rea geogrfica. A maioria dos pacientes nos dois grupos (com

e sem envolvimento articular) apresentava hansenase generalizada. Entretanto

observaram uma baixa freqncia, que no foi significativamente diferente, de FR,

anti-CCP, AAN e ANCA em pacientes com hansenase (nos dois grupos) e normal

dos controles. Mas a prevalncia de anticorpos aCL e anti-2GPI estava

significativamente elevada nos pacientes com hansenase quando comparados com

o grupo controle, apesar de no haver associao significativa com o envolvimento

articular. O istopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM, (48.7%) dos

pacientes com hansenase apresentava pelo menos um anticorpo antifosfolpide.

Alm disso, os autores observaram uma associao entre a positividade para aCL e

as manifestaes clnicas, j que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam

doena Hansenase generalizada (VV) com mais freqncia (p= 0.002). No houve

associao entre a presena de anticorpos aCL ou anti-2GPI e episdios

reacionais; porm, entre os pacientes com esses episdios, aqueles com anticorpos

aCL apresentavam eritema nodoso hansnico (ENH) em 100% dos casos, enquanto

entre os pacientes negativos para aCL, 57% apresentavam ENH. Apesar de uma

alta taxa de concordncia para a presena de anticorpos aCL e anti-2GPI ter sido

observada, manifestaes tromboemblicas no foram observadas (RIBEIRO;

PROIETTI, 2004, 2005).

Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania

(leishmaniose visceral e leishmaniose cutnea) para a presena de anticorpos anti-

Leishmania, assim como FR, AAN, anti-DNA, anti-Sm, anti-RNP, anti-Ro, anti-La,

aCL e complemento (C3 e C4). Como esperado, os pacientes com leishmaniose

visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania. Ttulos significativamente elevados

de AANs, na maioria dos pacientes, o anti-DNA, foi detectado em poucos pacientes

com doena visceral, assim como ttulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG),

quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutnea. Nveis reduzidos

de complemento tambm so evidentes na doena visceral assim como nveis

significativamente reduzidos de C3. Outros estudos comparam e discutem os

29

resultados em relao crescente evidncia na literatura da presena de

autoanticorpos em ambas as doenas. Em geral, a prevalncia varivel de auto-

anticorpos relatada, assim como relatos prvios na literatura, podem estar

relacionados a diferenas metodolgicas, como o tipo de ensaio utilizado, a

definio dos pontos de corte, inativao dos soros pelo calor, seleo de pacientes

e variaes tnicas e geogrficas nos grupos de pacientes. Mas um dos resultados

consistentes foi a freqncia significativamente mais elevada de anticorpos

antifosfolpide, aCL e anti-2/GPI, em pacientes com hansenase enquanto

anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais freqncia nos pacientes com

leishmaniose visceral. A incidncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos

pacientes com leishmaniose visceral compatvel com outros estudos (OSSADRON

et al., 2006; SAKKAS et al., 2008; VOULGARI et al., 2004) e demonstra

semelhanas das manifestaes clnicas e laboratoriais entre a leishmaniose

visceral e o lpus eritematoso sistmico (LES). Alm disso, a reatividade cruzada

entre AAN e anticorpos anti-Leishmania j foi tambm relatada (GRANEL et al.,

2000).

Diversos grupos documentaram nveis elevados de anticorpos

antifosfolpide (aCL, anti-2GPI e anti-protrombina) em diversas doenas

infecciosas, como a sfilis, doenas virais (incluindo a hepatite C, Parvovrus B19 e

HIV), malria e hansenase, sem as manifestaes clnicas da sndrome

antifosfolpide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD; BLANK; SHOENFELD, 2002). Os

ttulos elevados geralmente so transitrios, diminuindo e desaparecendo aps a

resoluo da infeco (LOIZOU et al., 2003; ZANDMAN-GODDARD; BLANK;

SHOENFELD, 2002). Mas, em uma minoria dos pacientes, a associao entre

doenas infecciosas e anticorpos antifosfolpide pode levar a complicaes severas,

freqentemente fatais, ou seja, "SAF catastrfica" (ZANDMAN-GODDARD; BLANK;

SHOENFELD, 2002).

Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da

incidncia de anticorpos anti-2-GPI em pacientes com hansenase, associados aos

dados de outros grupos (De LARANAGA et al., 2000; FIALLO et al., 1998; HOJNIK

et al., 1994; LOIZOU et al., 2003), que tambm documentaram nveis elevados de

anticorpos anti-2GPI, lanam dvidas sobre a noo de que os anticorpos aCL

associados a infeces so independentes dos anticorpos anti-2GPI, e no

dependentes desses anticorpos, como nas doenas auto-imunes. Em conjunto,

30

esses resultados apiam a noo de que, na presena de infeces, anticorpos aCL

so heterogneos em relao sua dependncia da 2GPI (De LARANAGA et al.,

2000; FIALLO et al., 1998; HOJNIK et al., 1994; LOIZOU et al., 2003), e as infeces

podem desencadear a induo de anticorpos antifosfolpide "patognicos" em

indivduos predispostos (LOIZOU et al., 2003).

A produo de autoanticorpos na hansenase e leishmaniose pode ser

explicada por diversos mecanismos. Na forma mais generalizada dessas doenas

(hansenase VV e leishmaniose visceral), os pacientes apresentam

hipergamaglobulinemia difusa semelhante vista em outras infeces, como

Schistosoma mansoni, T. cruzi e Plasmodium. A induo de autoanticorpos pode ser

atribuda ativao policlonal e proliferao das clulas B, algumas com auto-

reatividade, pertencentes biblioteca de anticorpos naturais em indivduos normais

(ARGOV et al., 1989). Na leishmaniose, antgenos solveis derivados da L. major e

L. donovani so mitognicos e desencadeiam a produo de imunoglobulinas com

auto-reatividade (ARGOV et al., 1989). Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV

outro exemplo de ativao policlonal persistente levando a uma mistura de

autoanticorpos policlonais e monoclonais, os quais causam doenas auto-imunes

(AGMON-LEVIN et al., 2009).

Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infeces e

componentes do hospedeiro podem ser base da produo de autoanticorpos,

como no caso da febre reumtica, onde o componente M da membrana do

estreptococo apresenta homologia com peptdeos cardacos, cerebrais e sinoviais. A

associao da sndrome de Guillain-Barr com a infeco pelo Campylobacter

jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma

manifestao auto-imune. A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-

antgenos j foi demonstrada para o M. leprae (McADAM; MUDD; SHOENFELD,

1984) e M. tuberculosis (SHOENFELD et al., 1986), e a inibio de anticorpos anti-

Sm, anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apia a

homologia entre antgenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al., 1989).

A disseminao de eptopos, a emergncia de novos anticorpos ou a

resposta de clulas T a um novo eptopo (subdominante ou crptico) no mesmo

antgeno ou em outro antgeno foi demonstrada em modelos experimentais e na

doena humana, alguns autores demonstraram a disseminao molecular do

antgeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB, 1998), no LES, enquanto na febre

31

reumtica, o estado de autoimunidade crnica que afeta as vlvulas cardacas pode

resultar em uma resposta imunolgica contra o colgeno e laminina. (KIVITY et al.,

2009; PORDEUS et al., 2008). As infeces tambm podem desempenhar um papel

importante na induo da autoimunidade atravs da liberao de antgenos

seqestrados, aps leso tecidual, ou aumentando a exibio de eptopos crpticos,

no meio inflamatrio, apresentando, assim, novos antgenos ao sistema imunolgico.

(KIVITY et al., 2009; PORDEUS et al., 2008).

1.5 FREQNCIA E IMPLICAES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES

AGUDAS VIRAIS

O conceito de auto-imunidade induzida por vrus no exclusivo para

doenas hepticas. O vrus Coxsackie do grupo B responsvel por mais de um

tero dos casos clnicos de miocardite infecciosa e est implicado nas miocardites

auto-imunes, reagindo contra a miosina cardaca (GIST; BELL, 1974). Niwa et al.

(1984) encontraram elevao transitria de auto-anticorpos, incluindo fator

reumatide, fator antincleo, anticorpo anti-DNA (ttulos acima de 1:40) em doenas

virais comuns como: varicela, sarampo, influenza, caxumba, herpes zoster e

exantema sbito.

A patognia da infeco viral inclui pelo menos trs tipos de interaes

com o hospedeiro vertebrado; 1) o efeito do agente sobre as clulas; 2) a maneira

de disseminao do agente no organismo infectado; 3) a resposta imunolgica e a

sua influencia no processo infeccioso. Destacam-se dois tipos principais da

interao: a destruio celular e a resposta imunolgica (FIGUEIREDO, 1999;

CATALAN-SOARES; PROIETTI; CARNEIRO-PROIETTI, 2006). O vrus Coxsackie

do grupo B responsvel por mais de um tero dos casos clnicos de miocardite

infecciosa e est implicado nas miocardites auto-imunes, reagindo contra a miosina

cardaca (GERSHON; KONDO, 1971). Niwa et al. (1984) encontraram elevao

transitria de auto-anticorpos, incluindo fator reumatide, fator antincleo, anticorpo

anti-DNA (ttulos acima de 1:40) em doenas virais comuns como: varicela, sarampo,

influenza, caxumba, herpes zoster e exantema sbito.

32

1.6 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR FAN

De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2

(DELLAVANCE et al., 2003), os AAN so encontrados comumente em uma

variedade de doenas reumticas auto-imunes. So teis na investigao dessas

doenas, auxiliando no diagnstico de patologias como LES, esclerose sistmica

progressiva (ESP), doena mista do tecido conjuntivo (DMTC), sndrome de Sjgren

(SS), polimiosite e dermatomiosite.

Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populao

aparentemente sadia; essa freqncia maior em mulheres e aumenta com a idade.

Segundo a literatura, a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais

altos (13,3%) para ttulos baixos e mais baixos (3,3%) para ttulos mais elevados

(DELLAVANCE et al., 2003).

A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes

tcnicas; a imunofluorescncia indireta a mais utilizada, por sua sensibilidade,

reprodutibilidade e facilidade de execuo. A sensibilidade aumenta

significativamente quando se utiliza como substrato lminas com clulas Hep 2

(clulas de carcinoma de laringe humana), por causa da maior expresso de

antgenos na superfcie dessas clulas comparados aos expressos nas clulas de

fgado ou de rins de camundongos, que se utilizavam anteriormente.

Em geral, possvel detectar melhor a presena de AAN por associao

de trs anti-soros isotipos especficos (anti-IgG, anti-IgA e anti-IgM). A pesquisa

realizada por essa tcnica serve de triagem inicial para a presena de AAN.

normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN.

A realizao de outras metodologias, tais como as imunoenzimticas,

permite uma avaliao isolada dos diferentes auto-anticorpos, sugeridos pelos

padres de fluorescncia encontrados no FAN. A identificao desses AAN permite

um diagnstico mais preciso, e eles podem ser utilizados, em muitos casos, como

marcador para uma das diferentes doenas reumticas auto-imunes. Muitas dessas

patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnstico.

A presena de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser

devida a algumas situaes:

Doena auto-imune precoce ainda no expressa clinicamente;

33

distrbio imunolgico transitrio causado por doena no-imune,

tais como infeces, principalmente virais;

uso de medicamentos e neoplasias;

manifestao incompleta de uma sndrome, ou seja, o paciente

sintetiza o anticorpo, porm esse quadro no evolui para doena;

fenmeno auto-imune fisiolgico.

O resultado do FAN expresso em ttulo e padro, uma vez que ambos

os parmetros tm importncia para a avaliao do significado clnico do exame. O

ttulo do FAN corresponde maior diluio capaz de demonstrar fluorescncia

inequvoca e didaticamente, pode ser dividido em:

Baixo: menor 1/80;

Moderado: 1/160;

Moderadamente elevado: 1/320;

Alto: maior 1/640.

Nas pesquisas realizadas por imunofluorescncia indireta, os resultados

so expressos em ttulos, segundo as diluies empregadas. possvel trabalhar

utilizando-se como limite ttulos de 1/40, que permitem maior sensibilidade, ou de

1/80, que permitem maior especificidade, ou seja, um menor nmero de falso-

positivos.

Na prtica clnica, so considerados significativos ttulos superiores a

1/160. Os resultados com ttulos positivos so acompanhados pela descrio do

padro de fluorescncia encontrado, que serve como orientao da presena de um

antgeno especfico e, em alguns casos, como padro diagnstico. Em determinadas

situaes, em especial no LES em atividade, pode ocorrer observao de mais de

um padro de fluorescncia.

O padro do FAN, a seu turno, aponta uma probabilidade maior ou menor

de doena auto-imune e at mesmo sugere o antgeno nuclear envolvido e, por

conseqncia, a afeco com ele mais relacionada. Os padres homogneo,

centromrico e pontilhado grosso so os mais indicativos de processos de

autoimunidade, uma vez que se associam a diversas condies reumticas,

especialmente ao LES e esclerose sistmica, e tambm a enfermidades hepticas,

tais como a cirrose biliar primria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG, 2000).

34

J o pontilhado fino, o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear

tm maior significado quando encontrados em ttulos altos, uma vez que podem

estar presentes em ttulos baixos em indivduos hgidos. Por sua vez, o pontilhado

fino denso, mesmo quando elevado em pessoas assintomticas, s guarda relao

com alguma doena em cerca de 20% dos casos (DELLAVANCE et al., 2003).

O padro pontilhado pode tambm ser referido como padro salpicado.

Outros padres de fluorescncia podem ser encontrados em menor freqncia. Os

pontilhados citoplasmtico grossos ou reticulares, associados presena de

anticorpos antimitocndrias em pacientes com cirrose biliar primria; o

citoplasmtico homogneo, relacionado a protenas ribossmicas em pacientes com

LES; e o padro pontilhado fino citoplasmtico, que pode estar associado

presena de anticorpos anti-JO-1, anti-PCNA e protenas da membrana celular, em

pacientes com LES, outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-

imunes (DELLAVANCE et al., 2003).

Quadro 1 - Padres de fluorescncia encontrados em maior freqncia e patologias relacionadas

Padres de Fluorecncia Antgenos Patologias Relacionadas

Perifrico DNA de dupla hlice ou de hlice nica, histona e RNA LES

Homogneo DNA de dupla hlice ou de hlice nica, histona e RNA LES, AR, lupus induzido por drogas

Perifrico/homogneo DNA de dupla hlice ou de hlice nica, histona e RNA LES

Pontilhado grosso SM, RNP LES, DMTC

Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS, LES

Nucleolar Protenas Nucleolares ESP Centromrico Protenas de centrmeros Sndrome de CREST

Fonte: Dellavance et al., 2003. Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antgenos extrados do ncleo e relevncias clnicas mais freqentes Padres Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC, LES, ESP, AR e Polimiosite

SS-A (Ro) SS, LES, lupus neonatal e forma cutnea subaguda

SS-B (La) SS, LES, lpus neonatal e forma cutnea subaguda Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte: Dellavance et al., 2003.

35

Quadro 3 Padres de FAN nuclear e relevncias clnicas mais freqentes

Padres Nucleares Relevncia Clinica por Auto-Anticorpos

Nuclear Pontilhado Centromrico Anticorpo anti-centrmero: Esclerose Sistmica forma CREST; Cirrose Biliar Primria.

Nuclear homogneo Anticorpo anti-DNA nativo: Lupus Eritematoso Sistmico (LES). Anticorpo anti-Histoma: LES induzido por drogas: LES idioptico. Anticorpo anti-cromatina (DNA/Histona, Nucleossomo): Artrite Reumatide (AR); Artrite Idioptica Juvenil , importante associao com uvete na forma oligoarticular; Sndrome de Felty; Cirrose Billar Primria.

Nuclear tipo membrana nuclear contnua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins: Hepatites auto-imunes; Raramente associado a doenas reumticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear).

Nuclear pontilhado pleomrfico/PCNA Anticorpo contra ncleo de clulas em proliferao: LES

Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa: pode ser encontrado em indivduos saudveis, processos inflamatrios inespecficos, doenas reumticas auto-imunes, Cistite Intersticial, Dermatite Atpica, Psorase e Asma.

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-p80 coilina: no apresenta associao clnica definida.

Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos

Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95): Cirrose Biliar Primria; pode ocorrer em diversas outras condies clnicas.

Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm: LES. Anticorpo anti-RNP: critrio obrigatrio no diagnostico da doena mista do Tecido conjuntivo (DMTC); tambm ocorre no LES, Esclerose Sistmica (ES) e AR.

Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSA/Ro: Sndrome de Sjogren Primria (SS); LES; Lupus neonatal e Lupus Cutneo Subagudo. Anticorpo anti-SSB/La: Lupus neonatal; LES; SS. Anticorpo anti-Mi-2: Dermatomiosite, embora raramente ocorra na polimiosite do adulto.

Fonte: Dellavance et al., 2003.

36

Quadro 4 - Padres de FAN citoplasmticos e relevncias clnicas mais freqentes

Padres Citoplasmticos e Relacionados ao Aparelho Mittico Relevncia Clinica por Auto-Anticorpos

Citoplasmtico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina: Hepatite auto-imune, Cirrose. Anticorpo anti-miosine: Hepatite C, Hepatocarcionoma, Miastenia Gravis. Quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clinica definida.

Citoplasmtico Fibrilar Segmentar Anti actinina, anti--vinculina e anti-tropomiose: Miastenia Gravis, Doena de Crohn e Colite ulcerativa. Quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.

Citoplasmtico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi): raro no LES, SS e outras doenas auto-imunes sistmicas. Relato na Ataxia Cerebelar Idioptica, Degenerao Cerebelar, Paraneoplsica, infeces virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo vrus da imunodeficincia Humana (HIV). Quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clinica definida.

Citoplasmtico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1): anticorpo marcador de Polimiosite no adulto. Descrito raramente na Dermatomiosite.

Citoplasmtico Pontilhado com Pontos Isolados

Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina: no h associaes clinicas bem definida. Anticorpo anti-GWB:SS; tambm encontrado em diversas outras condies clnicas.

Citoplasmtico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitocndria: Cirrose Biliar Primria; Esclerose Sistmica. relativamente comum o encontro deste padro na ausncia de anticorpos anti-mitocndria.

Citoplasmtico Pontilhado Fino Denso Anti PL7/PL12: Raramente associado a Polimiosite. Anticorpo P-ribossomal: Este padro ocorre no LES se a associao com anti-proteina P ribossomal.

Citoplasmtico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina: Anti-queratina o anticorpo mais importante em doena heptica alcolica. Descritos em vrias doenas inflamatrias e infecciosas. Quando em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clinica definida.

Aparelho mittico Tipo Centrolo Anticorpo anti-enolase: em baixos ttulos no tem associao clnica definida. Em altos ttulos sugestivo de Esclerose Sistmica.

Aparelho mittico Tipo ponte Intercelular

Anticorpo anti Tubulina: Pode ser encontrado no LES e na DMTC. outros anticorpos ainda no bem definidos podem gerar o mesmo padro.

Aparelho mittico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5: diversas condies auto-imunes com baixa especificidade

Fonte: Dellavance et al., 2003.

37

Quadro 5 - Padres de FAN mistos e relevncias clnicas mais freqentes Padres Mistos Relevncia Clinica por Auto-anticorpos

Misto do tipo nucleolar homogneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafsica decorada em anel (cromossomos negativos)

Anticorpo anti-Ku: Superposio, Polimiose e Esclerose Sistmica. Podem ocorrer no LES e Esclerodermia.

Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafsica positiva.

Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70): ES forma difusa. Mais raramente pode ocorrer na Sndrome CREST e superposio Polimiosite/Esclerodermia.

Misto do tipo Citoplasmtico pontilhado fino denso e homogneo e nucleolar homogneo

Anticorpo anti rRNP: LES; freqentemente relacionado Psicose Lpica.

Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescncia do aparelho mittico

Anticorpo anti-NuMA1:SS; pode ocorrer tambm em outras condies auto-imunes ou inflamatrias crnicas.

Fonte: Dellavance. et al., 2003.

Quadro 6 - Padres de FAN nucleolares e relevncias clnicas mais freqentes Padres Nucleolares Relevncia Clinica por Auto-anticorpos

Nucleolar Aglomerado

Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP): Esclerose Sistmica (ES), especialmente com comprometimento visceral grave , entre eles a hipertenso pulmonar.

Nucleolar Pontilhado

Anticorpo anti-NOR-90: ES; tambm descrito em outras doenas do tecido conjuntivo, porm sem relevncia clinica definida. Anticorpos anti-RNA polimerase I: ES de forma difusa com tendncia para comprometimento visceral mais freqente e grave.

Nucleolar Homogneo

Anticorpo anti-PM/Scl: Sndrome de Superposio de Polimiosite com Esclerose Sistmica. Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistmica sem superposio clnica. Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padro.

Fonte: Dellavance et al., 2003.

De acordo com o 3 Consenso (DELLAVANCE et al., 2009), foram

comunicados dois novos padres de fluorescncia por participantes. Vrios outros

membros testemunharam j haver observado esses padres. O primeiro trata-se de

um padro nuclear pontilhado fino, aproximando-se da textura homognea, e com

placa metafsica corada da mesma forma. Sua associao clnica e identidade

imunolgica no esto definidas. Sua importncia deriva do fato de que pode ser

facilmente confundido com o padro pontilhado fino denso e com o padro

homogneo. O segundo trata-se de um padro citoplasmtico em forma de

pequenos bastes (rods) e crculos (rings) que, aparentemente, est associado

38

infeco pelo HCV. H estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a

finalidade de estabelecer sua identidade imunolgica.

Como ainda no esto definitivamente caracterizados, esses dois novos

padres foram considerados preliminares e o 3 Consenso recomendou que os

mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na prxima verso

do Consenso. (DELLAVANCE et al., 2009).

39

2 JUSTIFICATIVA

As inflamaes do fgado provocadas pelos vrus hepatotrpicos atingem

milhes de pessoas e representam significativos problemas de sade pblica em

todo o mundo. No Brasil, a Regio Norte responde por um significativo percentual

dos portadores de hepatite C. Dentre as manifestaes extra-hepticas da infeco

pelo vrus C, as doenas autoimunes tm significativo impacto na evoluo clnica

desses pacientes. A presena de anticorpo antincleo um marcador importante de

autoimunidade e, apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em

portadores de vrus C, tais estudos ainda no foram realizados na nossa regio,

sobretudo correlacionando-se com o gentipo do vrus responsvel pela infeco,

considerando que o gentipo um marcador de resposta ao tratamento ou

considerando que pacientes portadores do gentipo 1 no respondem

satisfatoriamente ao tratamento institudo pelo protocolo atual.

2.1 ASPECTOS TICOS

A pesquisa a ser realizada apresenta relevncia social e no perde o

sentido de sua destinao scio-humanitria (justia e equidade).

Este trabalho adequa-se aos princpios cientficos que o justificam e

apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como: FAN e o

gentipo viral em pacientes com infeco pelo vrus da hepatite C esto

relacionados.

Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluo 196/96-

CNS/MS (BRASIL, 1996), assegurando a confidenciabilidade e proteo da

identidade do sujeito da pesquisa, no momento da aferio dos dados e sua

posterior utilizao.

Por tratar-se de um estudo que far somente reviso de soroteca, os

participantes no sero submetidos a riscos de origem orgnica e/ou qumica.

40

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Estabelecer associao entre a presena de teste de FAN e o gentipo

viral em pacientes portadores de infeco pelo HCV.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

I. Identificar o padro de fluorescncia do FAN em pacientes com diagnstico

laboratorial de infeco pelo HCV; II. Distribuir a prevalncia de FAN e o Gentipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com o gnero e a idade;

III. Identificar a prevalncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e no

infectados;

IV. Distribuir a prevalncia de FAN e o Gentipo viral em pacientes infectados

pelo HCV de acordo com as alteraes bioqumicas.

41

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULAO DO ESTUDO)

Foi realizado um estudo transversal analtico no Servio do Ncleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Par (NMT/UFPA), utilizando-se

pacientes oriundos da Fundao Centro de Hemoterapia e Hematologia do Par

(HEMOPA) e Plano de Assistncia ao Servidor (PAS/IASEP) com coleta de material

biolgico para reconfirmao do diagnstico de hepatite C no perodo de janeiro de

2009 a maio de 2010.

4.1.1 Pacientes com diagnstico laboratorial de Hepatite C

A populao de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMT/UFPA

para reconfirmao diagnstica, tratamento clnico e acompanhamento ambulatorial

de ambos os gneros e independente da idade, sem excluso dos pacientes com a

presena de patologias associadas condio maior (motivadora da pesquisa),

oriundos da Fundao HEMOPA e PAS.

A amostra do grupo foi selecionada a partir da relao dos pronturios

catalogados no laboratrio de patologia do NMT/UFPA.

Os dados foram coletados atravs dos resultados dos exames realizados

no soro de cada paciente. O protocolo de coleta teve enfoque na identificao

individual do paciente, bem como a avaliao clnica dos resultados.

4.1.2 Grupo de no infectados

Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indivduos

doadores de sangue, com sorologias negativas para: HIV 1 e 2, HTLV 1 e 2, Sfilis,

Doenas de Chagas, Hepatite B e para Hepatite C, procedentes da fundao

HEMOPA.

42

4.2 MTODO

4.2.1 Obteno do material biolgico

Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifrico

dos 51 pacientes participantes da pesquisa. A amostra sangunea de cada paciente

foi centrifugada, o soro foi separado e colocado em frasco estril devidamente

identificado, armazenado e resfriado de 2 a 8C.

Foi realizada no Laboratrio de Patologia Clnica das Doenas Tropicais a

pesquisa sorolgica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimtico (ELISA)

e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados

atravs de tcnicas moleculares (RT-PCR), e com identificao do gentipo viral

(genotipagem).

Foi realizado no Laboratrio de Patologia Clnica Amaral Costa a pesquisa

de FAN dos 51 pacientes selecionados, utilizando as amostras existentes na

soroteca.

4.2.2 Diagnstico sorolgico da hepatite C

Foram empregados testes sorolgicos de ELISA (Ensaio

Imunoenzimtico) de 3 gerao, utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-

4, DiaSorin, Itlia) para deteco de anticorpos especficos anti-HCV no soro dos

pacientes.

As tiras (poos) necessrias para as reaes foram retiradas da geladeira

com antecedncia de uma hora e deixadas temperatura ambiente, e os reagentes

homogeneizados rapidamente no vrtex.

O primeiro poo da placa ficou o branco da reao, na sequncia da

microplaca de ELISA, foi dispensado 200 L do controle negativo em triplicata (trs

poos), 200 L do calibrador em duplicata (dois poos) e 200 L do controle positivo

em amostra nica (um poo).

Adicionou-se 200 L do Diluente de Amostra em todos os poos que

continham as amostras dos pacientes a serem dosadas, na placa de ELISA,

tomando cuidado para no contaminar os poos adjacentes.

43

Dispensou-se 50 L do Diluente do Reagente em todos os poos de

controles, calibradores e amostras; cobrimos com adesivo para evitar evaporao e

contaminao das amostras; e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37C.

Aps incubao, lavou-se cada poo da microplaca de 4 a 5 vezes com

300 L da Soluo de Lavagem diluda.

Pipetou-se 100 L de Conjugado Enzimtico, exceto no poo do branco, e

incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37C. Aps incubao, lavou-se

cada poo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 L da Soluo de Lavagem

diluda.

Pipetou-se 100 L de Cromgeno/Substrato em todos os poos.

Incubamos a microplaca, protegendo-a de luz intensa e direta, temperatura

ambiente (18-24C) por 15 min.

Pipetou-se 100 L de cido Sulfrico em todos os poos, para parar a

reao enzimtica e mediu-se a absorbncia da soluo obtida em leitor de ELISA

com filtro de 450 nM.

O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade

preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da

reao 0.100; controle negativo 0.050, controle positivo 1.000, e calibrador

1.100. Para as amostras testadas, os valores reagentes e no reagentes para

pesquisa de anticorpos anti-HCV so interpretados da seguinte maneira: no

reagentes com valores 0.9; reagentes com valores 1.1; e indeterminados entre

os valores 0.9 1.1.

4.2.3 Deteco dos cidos nuclicos do vrus da hepatite C por biologia molecular

Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extrao do

RNA viral presente no soro do paciente, utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA

kit, Quiagen, Alemanha), seguindo a tcnica adaptada no Laboratrio de Patologia

Clnica das Doenas Tropicais.

Pipetou-se 560 L de tampo AVL (lise) contendo RNA em tubo de

centrfuga de 1.5 ml identificado, adicionou-se 140 L da amostra e homogenizou-se

em vrtex por 15s; incubando a temperatura ambiente (15-25C) por 10 min. Aps

incubao, centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partculas dispersas.

44

Adicionou-se 560 L de etanol (96-100%) na amostra e homogenizou-se

no vrtex por 15s, centrifugando-se rapidamente para remover partculas dispersas.

Depois, cuidadosamente, transferiu-se 630 L para as colunas devidamente

identificadas, centrifugou-se a 14.000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo,

ficando s com a coluna para encaixar em outro tubo.

Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas, centrifugou-se a

14.000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo, ficando s com a coluna para

encaixar em outro tubo. Lavou-se com 500 L de tampo da lavagem (AW1) e

centrifugou-se por 1 min, mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo.

Lavou-se com 500 L de tampo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min,

mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo.

Identificados os tubos para RNA, colocou-se as colunas. Adicionou-se 60

L de tampo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min,

descartando a coluna e ficando com o tubo. Colocou-se em banho-maria por 10 min

a 65C, centrifugado rapidamente e colocado no gelo. As amostras extradas foram

congeladas e armazenadas em freezer a -20C.

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a tcnica de

RT-PCR qualitativa, com adaptaes feitas no Laboratrio de Patologia Clnica das

Doenas Tropicais, da seguinte maneira para o Mix de uma amostra: Tampo: 12

L; primer ou iniciador k10: 1L; primer ou iniciador k11: 1L; gua ultrapura livre de

DNAse e RNAse: 5 L; Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen): 1 L. O

primer k10 constitui-se da sequncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11

da sequncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC.

O volume do mix por amostra de 20 L e o volume da amostra (produto

da extrao) de 5 L, perfazendo um volume total por tubo de 25 L. As amostras

foram colocadas em termociclador e a reao realizada a 42C por 45 minutos,

temperatura inicial de desnaturao a 94C por 2 minutos, seguida de 35 ciclos, com

temperatura de desnaturao a 94C por 30 segundos, de anelamento a 54C por 30

segundos, de extenso a 72C por 45 segundos e temperatura de extenso final de

72C por 7 minutos, e um hold de 4C.

Para visualizao do produto dessa 1 PCR (RT-PCR), feito um gel de

agarose a 1% (1g de agarose para 100mL de tampo TEB 1X e 3 L de brometo de

etidium), que migrou na cuba de eletroforese com 100V, 500A por 60 minutos. Os

resultados foram visualizados atravs de luz ultravioleta (UV). Os pacientes

45

positivos, que apresentarem banda, devem continuar os procedimentos e os

negativos, que no apresentarem bandas devero ser liberados como

indetectveis por este mtodo.

A 2 PCR (RFLP) foi responsvel por fazer a amplificao do cDNA,

produto da 1 PCR. Para esta etapa, tambm com adaptaes feitas no Laboratrio

de Patologia Clnica das Doenas Tropicais, foram necessrios para o Mix de uma

amostra: Tampo 10X: 2,5 L; DNTP: 4 L; MgCl2: 1,5 L; primer ou iniciador k15: 1

L; primer ou iniciador k16: 1 L; gua ultrapura livre de DNAse e RNAse: 12,5 L;

Enzima Taq platinum (Invitrogen): 0,5 L. O primer k15 constitui-se da sequncia

ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequncia CAA GCA CCC TAT

CAG GCA GT.

O volume do mix por amostra foi de 23 L e o volume da amostra

(produto da 1 PCR) de 2 L, perfazendo um volume total por tubo de 25 L. As

amostras so colocadas em termociclador e a reao se realiza a temperatura inicial

de desnaturao a 94C por 4 minutos, seguida de 35 ciclos, com temperatura de

desnaturao a 94C por 30 segundos, de anelamento a 55C por 45 segundos, de

extenso a 72C por 1 minuto e temperatura de extenso final de 72C por 7

minutos, e um hold de 4C.

O produto da 2 PCR observado atravs de um gel de agarose a 1% (1g

de agarose para 100 mL de tampo TEB 1X e 3 L de brometo de etidium), que

migrou na cuba de eletroforese com 100V, 500A por 60 minutos. Os resultados

foram visualizados atravs de luz UV (ultravioleta). Os pacientes positivos, que

apresentaram banda (fragmento amplificado), se continuou os procedimentos e os

negativos, que no apresentaram bandas foram repetidos para o procedimento da

2 PCR.

4.2.4 Determinao do gentipo do vrus (genotipagem)

Os pacientes positivos para a 2 PCR foram submetidos genotipagem

do vrus atravs do mtodo de RFLP, utilizando um par de enzimas de restrio,

AVA II e RSA I. Essa tcnica tambm foi adaptada no Laboratrio de Patologia

Clnica das Doenas Tropicais.

46

Na determinao do gentipo, cada amostra utilizada duas vezes,

sendo uma reao para AVA II e uma para RSA I, portanto cada amostra teve dois

tubos correspondentes.

Para a preparao do mix de uma amostra para a enzima de restrio

AVA II (Promega), foram utilizados: Buffer C X 30: 2 L; gua ultrapura livre de

DNAse e RNAse: 12,5 L; AVA II: 0,5 L. Para o mix de uma amostra de RSA I

(Invitrogen), so necessrios: React 1 10X: 2 L; gua ultrapura libre de DNAse e

RNAse: 11 L; RSA I: 2 L.

O volume do mix por amostra foi de 15 L e o volume da amostra

(produto da 2 PCR) de 5 L, perfazendo um volume total por tubo de 20 L para

cada frasco correspondente a sua enzima de restrio. As amostras formo pares

de tubos AVA II e RSA I e so colocadas em banho-maria a 37C overnight para

digerir (cortar) os fragmentos.

Para visualizao do produto da digesto (RFLP) e verificao dos

gentipos, foi preparado um gel de agarose a 2% (2g de agarose para 100 mL de

tampo TEB 1X e 3 L de brometo de etidium), que migrou em cuba de eletroforese

com 100V, 500A por 60 minutos. Os resultados foram visualizados atravs de luz UV

(ultravioleta). Os pacientes positivos apresentam bandas (fragmentos) de

tamanhos diferentes. O nmero de bandas e sua disposio no gel formaram

padres de combinaes correspondentes a cada gentipo viral.

4.2.5 Tcnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em clulas HEp-2

A pesquisa de auto-anticorpo contra antgenos celulares foi realizada no

Laboratrio de Patologia Clnica Amaral Costa, pela tcnica de imunofluorescncia

indireta que os identifica atravs da ligao destes auto-anticorpos aos antgenos do

substrato, sendo esta ligao revelada pela adio de um soro com atividade Anti-

IgG conjugado fluorescena.

As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnstico

comercial Antinuclear Antibody HEp-2, da Hemagen Diagnostics.

Na primeira fase da reao, os soros diludos 1/40 colocados em contato

com o substrato durante 20 minutos, seguido de lavagem com soluo salina

tamponada por 10 minutos. Na segunda fase, aplicacou-se a substncia

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fluorescente, sendo o conjugado diludo 1/30, deixando-se por 10 minutos seguida

de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lmina com glicerina tamponada.

Em cada lmina foram utilizados controle positivo e controle negativo.

A leitura das lminas foi realizada em microscpio de imunofluorescncia,

marca Nikon, modelo Eclipse E-200.

Os critrios morfolgicos observados durante a leitura foram:

a) aspecto da matriz nuclear;

b) aspecto do nuclolo;

c) observao de todos os estgios de diviso nuclear;

d) aspecto do fuso mittico;

e) aspecto do citoplasma.

4.3 ANLISE ESTATSTICA

Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados, no qual

tambm foram confeccionadas tabelas e grficos para representao dos dados.

Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 5.0 para a gerao de

resultados estatsticos que comprovassem a associao de variveis pertinentes ao

estudo, considerando o intervalo de confiana (IC) 95% e nvel 5% (p-valor 0,05),

isto , u