UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁPRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período : Fevereiro de 2015 a Julho de 2015( ) PARCIAL(X) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Marcadores biológicos de infecção e progressão da hanseníase: sorologia e resposta linfocitária celular em pacientes de uma região hiperendêmica da Amazônia Brasileira

Nome do Orientador: Claudio Guedes Salgado

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Faculdade de Ciências Biológicas

Instituto: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Dermato-Imunologia (LDI)

Título do Plano de Trabalho: Detecção Molecular do Mycobacterium leprae em amostras de raspado intradérmico de casos e contatos de hanseníase

Nome do Bolsista: Oseias Souza da Silva Júnior

Tipo de Bolsa: PIBIC/CNPq

1

[1] INTRODUÇÃOA hanseníase é uma doença infectocontagiosa de evolução lenta (crônica) causada pelo

Mycobacterium leprae, Bacilo Álcool Ácido Resistente (BAAR), que infecta as células do

sistema fagocitário mononuclear, da pele e do sistema nervoso periférico, tais como

macrófagos e as células de Schwann (RAMBUKKANA, 2000; WEGNER, 2013), e acredita-se

que o contato prolongado com a fonte de infecção (o paciente não tratado) seja a forma mais

provável para o contágio/infecção (BRASIL, 2002; TRUMAN et al., 2011) e que as vias aéreas

superiores sejam a principal via de entrada e de eliminação do bacilo (PESSOLANI et al., 2003;

PONTES et al., 2008).

A doença pode se apresentar através de manchas hipocrômicas, indefinidamente

delimitadas ou lesões eritematosas infiltrativas, com alteração de sensibilidade, em quadros

mais graves observam-se lesões nodulares disseminadas, infiltração na face e nos pavilhões

auriculares (BRASIL, 2002; DUNCAN, 1993; SALGADO; BARRETO, 2012; SOUZA, 1997).

Também pode ocorrer o acometimento de nervos periféricos e da face, com alteração de

sensibilidade e/ou perda de força nas áreas inervadas pela fibra nervosa afetada devido a

desmielinização das células nervosas causada pelo bacilo (GARBINO et al., 2004;

WEINSTEIN, 2000). O tratamento da hanseníase com poliquimioterápicos (PQT) garante a

cura da doença, e casos de recidiva, nos quais ocorre a reinfecção do paciente, são raros em

hanseníase, cerca de 1,6 % ao ano (WHO, 2009).

A doença se manifesta em vários quadros clínicos, com dois polos (tuberculoide e

lepormatoso), três formas intermediárias (borderline-tuberculoide, borderline-borderline e

borderline-lepromatoso) e uma forma indeterminada de acordo com a classificação de Ridley &

Jopling (RIDLEY; JOPLING, 1966) que leva em consideração aspectos clínicos,

histopatológicos e imunológicos. A Organização Mundial da Saúde (OMS) utiliza a classificação

multibacilar (MB) e paucibacilar (PB), considerando a carga bacilar presente nos pacientes

(WHO, 1991; WHO, 2009) através da análise de biópsias e raspados intradérmicos de

baciloscopias.

A hanseníase é considerada pela OMS um problema de saúde pública em muitos países

(WHO, 1991). Em 2014 o continente americano contribuiu com cerca de 15% de novos casos

de hanseníase em todo o mundo nos primeiros quatro meses do ano. O Brasil registrou 31.044

casos novos de hanseníase, com cerca de 64,4% de casos MB e 19,4% de casos de recidiva.

O Estado do Pará tem contribuído substancialmente para o número de novos casos de

hanseníase todo ano, visto que é considerado hiperendêmico, e estudos epidemiológicos

2

demonstram que a incidência pode ser ainda mais elevada quando se realiza a busca ativa de

casos (BARRETO et al., 2011, 2012; WHO, 2014).

O diagnóstico precoce é fundamental para a quebra da cadeia de transmissão e o

controle da hanseníase, porém os métodos de diagnóstico histopatológicos e baciloscópicos

não são eficazes para a detecção em estados iniciais da doença devido ao número reduzido de

bactérias presentes no tecido dos pacientes (GELUK et, 2005). O diagnóstico molecular

utilizando primers de sequências espécies-específicas do M. leprae é uma das mais

promissoras formas de diagnóstico complementar da atualidade, devido à dificuldade de se

encontrar bacilos através do diagnóstico histopatológico e baciloscópico na fase inicial da

doença, sendo a técnica da PCR sensível para detectar bacilos em pequenas quantidades nos

tecidos (SANTOS et al, 2001). O estudo molecular de sequências repetitivas do M. leprae

também tem gerado dados importantes sobre a filogenia do agente e epidemiologia da doença,

possível graças ao desenvolvimento de técnicas moleculares como o multiplex PCR e ao

sequenciamento genômico. Cerca de 2% do genoma do bacilo é composto de ácido

desoxirribonucleico (DNA) repetitivo, destes as Repetições em Tandem de Número Variável

(VNTR) são as mais importantes nesses estudos (MONOT et al., 2005; SAKAMURI et al.,

2009; TAYLOR; TORRES et al, 2003; DONOGHUE, 2011; XING et al., 2009).

3

1[2] JUSTIFICATIVA

Apesar do Estado do Pará ser considerado um estado hiperendêmico, com mais de

mil casos novos notificados apenas no primeiro semestre de 2015 (SINAN), estudos

moleculares para compreender a distribuição da doença, a filogenia do agente e o

estabelecimento de técnicas de diagnóstico molecular para detecção precoce desta patologia

ainda são inexistentes na região norte do Brasil.

2[3] OBJETIVOS

a. GERAL

Caracterizar genotipicamente cepas de Mycobacterium leprae de pacientes

com hanseníase recidivante residentes no Estado do Pará e avaliar primers espécie-

específicos para o diagnóstico molecular.

b. ESPECÍFICOS

i. Utilizar o método de MLVA (Multiple-locus VNTR Analysis) e

sequenciamento genético para análise molecular de cepas obtidas

de pacientes

ii. Comparar a eficácia de primers dos genes RLEP e rpoT para o

diagnóstico molecular da hanseníase.

4

3[4] MATERIAIS E MÉTODOS:

a. AMOSTRAGEM

Para o estudo de genotipagem, foram coletadas 15 amostras de biópsias de pele de

casos de hanseníase diagnosticados com recidiva atendidos e diagnosticados na Unidade de

Referência Especializada em Dermatologia Sanitária “Dr. Marcello Candia”, localizada no

município de Marituba (PA). Para o diagnóstico molecular foram analisadas 39 amostras de

raspado intradérmico de casos índices e seus contatos precedentes do município do Acará

(PA). As biópsias foram coletadas da borda das lesões e os raspados intradérmicos de ambos

os lóbulos auriculares. As amostras foram estocadas em tubos de 2 mL contendo 1ml de

Etanol 70% e armazenadas em freezer -20°C.

b. OBTENÇÃO DO DNA TOTAL

Para obtenção de DNA Total de ambos os tipos de coleta (biopsia e raspado

intradérmico), foi utilizado o kit comercial Dneasy Blood and Tissue (Qiagen®), as amostras

foram processadas de acordo com as especificações do fabricante pelo protocolo de extração

e DNA tecidual.

c. MULTIPLE-LOCUS VNTR ANALYSIS (MLVA):

Para os ensaios de Multiplex PCR, iniciadores marcados com fluorescência

específicos para detectar 16 VNTR’s presentes em M. leprae foram agrupados em 4 conjuntos

(tabela 1). Para o PCR com um volume final de 25 µL, 2,0 µL de DNA de M. leprae foram

adicionados em 12,5 µL de Mix Multiplex PCR Kit (Qiagen®) contendo 2,5 U de DNA

polimerase HotStarTaq, 200 µM de cada desoxirribonucleosídeo trifosfato (dNTP), tampão e

0,2 µM de cada iniciador, de acordo com Fontes e colaboradores (FONTES et al., 2012). O

PCR ocorreu em termociclador (Veriti 96 Well Thermal Cycler, Applied Biosystems®) sob as

seguintes condições de amplificação: temperatura de desnaturação inicial de 95°C por 15

minutos, seguidos de 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 90 segundos e 72°C por 90

segundos, e por fim, 90 minutos a 72°C para extensão final (JENSEN et al., 2011).

5

Tabela 1. Sequências repetitivas pesquisadas.

Iniciador Sense Anti-senseAplicon

C1

AT17 TCTCCAACATGCTGCGACA GTACAGCGGCCTGATCGAA 181

CGT5 GCAGCGGTGTAACAGCATAGC TGTCTGCCTTGCGAAACGGTC 342

GTA9 AGCCTTAGTCGCGCAGATG TCCGCTGTCCGTCCGCTGA 307

AC8b GCCCACTTACCTCAACCAAC CCTATAACGGCACTCAGTCCA 390

C2

AC8a GTGTTACGCGGAACCAGGCA CCATCTGTTGGTACTACTGA 124

AT15 CAATATGCGGGTTGGCGCTTCTG CCGTCTGGCTCGATGGCTGGATTC 168

AC9 AGCGCCCGTTGTCGATAGA GACTGGATGTCGGCACCCC 236

21-3 GAATCTGACCTTTCGGAAATG CGATGCAGCTTCCTACGG 301

C3

TA18 CGTGCGTCGTGTGTAGGC GACGTGGCAACATCGAAGTT 230

6-7 GCCATCGTTGTCGGTTCATC CGGAGGAGGTGGGTACGGT 268

27-5 ATTGAGCAGATGGCCGGTC AGCAGTCGGCACGCCCTT 327

TTC GGACCTAAACCATCCCGTTT CTACAGGGGGCACTTAGCTC 170

C4

23-3 CCGAAGCCCTGGACGAAG GCCGTAAATCCGCTCCC 326

12-5 CTGGTCCACTTGCGGTACGAC GGAGAAGGAGGCCGAATACA 289

18-8 GCCCGTCTATCCGCATCAA GCAAAGATCAGCACGCCAAT 348

6-3 ATGCCGAACCGGACCTCGACGTTGA TCGTCTTCGAGGTCGTCGAGA 91

C1: Conjunto 1, C2: Conjunto 2, C3: Conjunto 3, C4: Conjunto 4.

Uma alíquota de 10 µL foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 2,5%, a 80V

por 60 minutos em TBE 1 X (Tris-borato e EDTA pH 8,0). A observação das bandas foi obtida

por marcação pelo CyberSafe e visualizou-se sob luz ultravioleta.

d. ANÁLISE DE FRAGMENTOS

Para determinação do número de cópias, 1,0 µL da solução do PCR diluída

foi misturado a 8,7 µL de formamida Hi-DiTM (Applied Biosystems®) e a 0,3 µL do padrão

de DNA LIZ-500 (Applied Biosystems®). Então, o material foi aquecido a 94°C por 3

minutos para a desnaturação, então foi submetido à eletroforese de capilar no

sequenciador automático ABI 3130 (Applied Biosystems®). Por fim, o comprimento dos

fragmentos gerados foi analisado através do software Peak Scanner versão 1.0 (Applied

Biosystems®).

6

e. PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DO PCR

Para a purificação dos produtos do PCR de VNTR’s, realizou-se PCR com o

volume final de 50 µL, contendo 2 µL de DNA, 0,5 µM de cada primer e 25 µL de

HotStarTaq Master Mix (Qiagen®), no qual continha tampão, 2,5 U de DNA polimerase

HotStarTaq e 200 µM dos dNTPs. A termociclagem foi composta de uma fase de

desnaturação inicial de 95°C por 15 minutos, 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C

por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos e 72°C por 10 minutos

de extensão final. Nos PCR’s positivos, os amplicons foram purificados utilizando o kit

QIAquink PCR Purification (Qiagen®) segundo as orientações do fabricante. Então, a fim

de estimar a quantidade de material a ser utilizado na reação de sequenciamento, uma

alíquota foi submetida à eletroforese em gel de agarose a 2%, 100V por 30-45 minutos.

f. SEQUENCIAMENTO

O material purificado foi diluído à concentração de 1-10ng/mL, então

adicionados os iniciadores na concentração de 3,2 pmol e 0,5µL do Big Dye Terminator

v 3.1 Cycle Sequencing kit, composto de dinucleotídeos livres (dNTPs) e marcados com

fluorescência (ddNTPs), tampão, cloreto de magnésio e Taq DNA Polimerase. As

condições da reação foram 30 ciclos de 96°C por 10 segundos, 50°C por 5 segundos e

60°C por 4 minutos para os VNTR’s. Para a precipitação, foram adicionados ao produto

da reação 30 µL de isopropanol 75%, então foram incubados por 15 minutos à

temperatura ambiente e depois centrifugados a 3000 rpm por 45 minutos a 20°C. O

pellet foi seco invertendo a placa em papel filtro e depois foram adicionados 50µL de

Etanol 75% e outra vez foi centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos a 20°C. Em seguida

o pellet foi seco e ressuspendido em 10µL de formamida Hi-DiTM (Applied Biosystems®),

foi então aquecido por três minutos a 95°C e imediatamente posto em gelo. As amostras

foram sequenciadas em sequenciador automático ABI 3730 (Applied Biosystems®) e a

leitura foi realizada através do software Molecular Evolutionary Genetics Analysis

(MEGA) versão 4.0.

g. QIAGEN MULTIPLEX PCR MASTER MIX

7

Foi utilizada a técnica de Multiplex PCR seguindo as orientações do

fabricante (Qiagen). Para o PCR com um volume final de 25µL, a concentração final de

cada reagente foi de 2,0µL de DNA de M. leprae, 12,5 µL de Multiplex PCR Master Mix

Kit (Qiagen), 0,2µM de cada iniciador e 11,7µM de água ultrapura. O PCR ocorreu em

termociclador sob as seguintes condições de amplificação: temperatura de desnaturação

inicial de 95°C por 15 minutos, seguindo para 94°C por 30 segundos, temperatura de

anelamento de 58°C, temperatura de extensão de 72°C por 30 segundos durante 37

ciclos, e por fim, 10 minutos a 72°C para extensão final. Uma alíquota de 10 µL foi

analisada por eletroforese em gel de agarose a 2%, a 80V por 20 minutos em TBE 0,5 X

(Tris-borato e EDTA pH 8,0). Então corou-se o produto com brometo de etídeo e

visualizou-se sob luz ultravioleta em um transiluminador.

h. ANÁLISE DE DADOS:

As amostras utilizadas no teste de diagnóstico molecular foram analisadas a partir

do software Graphpad6® para designar se havia diferença entre a positividade dos dois

genes na população estudada.

8

4[5] RESULTADOS:

Cepas de M. leprae de 15 pacientes com recidiva para hanseníase foram

genotipadas utilizando-se 16 VNTR’s A maioria dos pacientes apresentavam as formas

boderline (BT, BB ou BL), cerca de 53%, enquanto que 47% apresentavam a forma

lepromatosa (tabela 2).

Tabela 2 – Descrição dos casos de recidiva de hanseníase Idade

Gênero Localidade Forma Baciloscopia Tratamento2

* M Igarapé-Açú LL * ** F Igarapé-Açú LL * *35 M Belém BT IB= 0 PQT PB em 2002.

31 M Belém LL IB= 3,25

IM= 4% PQT MB em 1996.

26 F Belém BT IB= 0 PQT PB em 2003.

33 M Tomé-Açú LL IB= 0,5

IM= 0% PQT PB antes de 2003

35 M Belém LL IB= 2,25

IM= 30% PQT PB em 2005.

28 M Paragominas BT IB=0 PQT MB em 2003-2004.

36 M Ananindeua BL IB= 3,75

IM= 10% PQT MB em 2000-2001.

68 M Benevides BT IB= 0 PQT MB em 1986.

41 F Ananindeua BT IB= 0 PQT PB em 1988

59 M Ananindeua BB IB= 0 PQT MB em 2002.

* M Paragominas BB * *54 M Igarapé-açu LL IB=2,75

IM=0 PQT MB em 2008

19 F Igarapé-açu LL * PQT MB em 2013

1Baciloscopia realizada na fase 2, no momento da caracterização de recidiva.2Primeiro esquema de tratamento realizado pelo caso. *Dado não confirmado.

Residem na região metropolitana de Belém 53% dos casos (figura 2). 26%

residem na ex-colônia do Prata, situada em Igarapé-Açú, 13% no município de

9

Paragominas e um em Tomé-Açu (figura 1). O paciente 14 foi diagnosticado como tendo

uma cepa resistente a medicamentos (DA SILVA ROCHA et al., 2012). Cerca 45%

apresentaram Índice Bacilar (IB) positivo durante o diagnóstico de recidiva (tabela 2).

Este estudo não utilizou amostras de casos PB, segundo a classificação de Imunológica

de Ridley & Jopling (RIDLEY; JOPLING, 1966).

Figura 1 – Distribuição espacial dos casos de recidiva de hanseníase Região Metropolitana de Belém.

Distribuição: 1) Belém: A – Jurunas;B – Canudos; C – Tapanã; D – Tenoné.

2) Ananindeua: E – Aurá; G – Curuçambá;H – Distrito Industrial.

3) Benevides:

10

F – Nova Esperança.

Figura 2 – Distribuição espacial dos casos de recidiva de hanseníase na Região Metropolitana de Belém.

11

A tabela 3 apresenta o perfil genotípico de cada isolado em relação aos VNTRs com

uma hipotética amostra selvagem (WILD) com os alelos mais comuns. Os VNTRs 21.3, 12.5 e

TA10 foram os menos polimórficos, apresentando um alelo único em todos dos isolados,

enquanto que o loci TA18, apresentou o maior número de variações (8), seguida de AT15 (6) e

TTC21 (6). As cepas das amostras 4 e 11 foram os que apresentaram maior distância

filogenética entre os isolados, cerca de 6 alelos apresentavam padrões de repetições

encontradas apenas nestas cepas.

Tabela 3 – Genótipos de VNTRs de isolados de Mycobacterium leprae de pacientes de recidiva atendidos na URE “Dr.Marcelo Candia’’, Marituba-PA.

Amostras AT17 GGT5 GTA9 AC8b AC8a AT15 AC9 21.3 TTC21 TA18 6.7 27.5

23.3 12.5 18.8 TA10

1 13 4 10 7 9 16 8 2 12 18 6 5 2 4 3 3

2 13 5 10 7 11 18 9 2 9 25 6 5 2 4 3 3

3 12 4 9 7 9 17 8 2 13 25 6 5 2 4 3 3

4 15 4 10 6 8 14 8 2 16 17 7 6 1 4 7 3

5 12 4 9 7 9 18 8 2 12 18 6 ND 2 4 3 3

6 12 4 9 7 9 18 8 2 12 23 6 5 2 4 3 3

7 12 4 9 7 9 18 8 2 12 18 6 5 2 4 3 3

8 12 4 ND ND 9 18 8 2 12 16 ND ND ND 4 3 3

9 12 4 10 7 9 16 9 2 11 24 6 5 2 4 3 3

10 11 4 8 7 9 25 8 2 12 25 6 5 2 4 3 3

11 15 4 11 8 8 24 7 2 14 15 6 5 2 4 3 3

12 13 4 12 7 11 ND 9 2 10 ND 6 ND 2 ND ND 3

13 14 4 9 7 9 ND 8 2 13 25 ND 5 2 4 ND 3

14 14 4 10 7 9 17 9 2 11 25 6 4 2 4 3 ND

15 15 Z4 10 7 9 18 8 2 13 22 7 5 2 4 3 ND

WILD 12 4 10 7 9 18 8 2 12 ND 6 5 2 4 3 3

NA 5 2 5 3 3 6 3 1 6 8 2 3 2 1 2 1NA: Número de alelos.ND: Alelo não definido

Para o diagnóstico molecular, amostras de 39 casos e contatos foram testadas no

estudo, sendo que 15 (38,46%) foram positivos para RLEP, 12 (30,77%) para rpoT e 9

(23,08%) positivos para ambos os genes (tabela 4). Das amostras positivas para RLEP, 9 das

15 possuíam confirmação clínica (60%) e para rpoT, 5 das 12 (41,6%). Dos casos já

confirmados, 9 dos 11 foram positivos para RLEP (81%) e 5 para rpoT (45%)

12

5[6] DISCUSSÃO

Houve grande divergência genotípica entre as cepas, o que indicaria uma

considerável variabilidade de M. leprae na região, mesmo entre os isolados de pacientes

residentes na região metropolitana de Belém. Apenas os pacientes 5 e 7 provavelmente

desenvolveram a infecção pelo mesmo genótipo (tabela 4). Estes pacientes são residentes de

bairros periféricos relativamente próximos um do outro, da capital Belém, como observado na

figura 2. As amostras 5, 6 e 7 são as que mais se aproximam da cepa selvagem hipotética,

sendo que as três amostras foram identificas em pacientes PB.

Foram observadas também diferentes quantidades de cópias da cepa TN para

maioria dos alvos, ainda em alguns como a sequência no loci 21 o padrão diferente da cepa de

Tamil Nadu se repetiu em todos os isolados.

Tabela 4:

Amostras AT17 GGT5 GTA9 AC8b AC8a AT15 AC9 21.3 TTC21 TA18 6.7 27.5 23.3 12.5 18.8 TA1013 14 4 9 7 9 ND 8 2 13 25 ND 5 2 4 ND 3

3 12 4 9 7 9 17 8 2 13 25 6 5 2 4 3 3

15 15 4 10 7 9 18 8 2 13 22 7 5 2 4 3 ND

1 13 4 10 7 9 16 8 2 12 18 6 5 2 4 3 3

5 12 4 9 7 9 18 8 2 12 18 6 ND 2 4 3 3

7 12 4 9 7 9 18 8 2 12 18 6 5 2 4 3 3

6 12 4 9 7 9 18 8 2 12 23 6 5 2 4 3 3

WILD 12 4 10 7 9 18 8 2 12 ND 6 5 2 4 3 3

8 12 4 ND ND 9 18 8 2 12 16 ND ND ND 4 3 3

10 11 4 8 7 9 25 8 2 12 25 6 5 2 4 3 3

12 13 4 12 7 11 ND 9 2 10 ND 6 ND 2 ND ND 3

2 13 5 10 7 11 18 9 2 9 25 6 5 2 4 3 3

9 12 4 10 7 9 16 9 2 11 24 6 5 2 4 3 3

14 14 4 10 7 9 17 9 2 11 25 6 4 2 4 3 ND

11 15 4 11 8 8 24 7 2 14 15 6 5 2 4 3 3

4 15 4 10 6 8 14 8 2 16 17 7 6 1 4 7 3

Este estudo avaliou a técnica de MLVA, no qual esses resultados demonstram a

viabilidade em utilização da técnica, já que 60% tiveram seu genótipo completamente

caracterizado.

13

O par de primers para o gene RLEP detectou como positivo 100% dos novos casos,

60% dos casos índices e 21,43% dos contatos. Enquanto que o rpoT detectou 50% dos novos

casos, 40% dos casos índices e 17,39% dos contatos (tabela 5). A diferença entre os dois

genes foi significativa apenas no grupo dos casos novos segundo o testT de Student.

Tabela 5: Positividade das amostras estudadas.

Casos índices Contatos Novos casosN % N % N %

RLEP+ 3 60 6 21,43 6 100RLEP- 2 40 22 78,57 0 0Total 5 28 6rpoT+ 2 40 7 25 3 50rpoT- 3 60 21 75 3 50Total 5 28 6Duplo+ 2 50 4 17,39 3 100Duplo- 2 50 19 82,61 0 0Total 4 21 3

Nos casos índices, houve 40% de negatividade para o RLEP, o que pode ser

explicado porque ambos os casos negativos no PCR haviam sido entre os anos de 2008 e

2009 e os demais ainda encontravam-se em tratamento no momento da coleta, confirmando a

efetividade do esquema de PQT (poliquimioterapia) que induziu a negatividade dos dois casos

já tratados.

O RLEP apresentou maior positividade, comparado ao rpoT no diagnóstico dos

casos clínicos que foram anteriormente clinicamente confirmados. Excluindo os dois casos

índices tratados em 2008 e 2009, o RLEP obteve 100% de eficácia no diagnóstico enquanto

que o rpoT apenas 55%

14

Tabela 6 - Positividade em PCR entre contatos, segundo a forma clínica dos casos clinicamente diagnosticados.

Contatos PB MBN % N %

RLEP+ 7 25,93 2 66,67RLEP- 20 74,07 1 33,33Total 27 3

RPOT+ 7 25,93 1 33,33RPOT- 20 74,07 2 66,67Total 27 3DP 5 21,74 1 50,00DN 18 78,26 1 50,00

Total 23 2

Tanto para RLEP quanto para o rpoT, a positividade entre contatos de casos

confirmados de pacientes MB, e que posteriormente foram também diagnosticados como casos

novos, foi maior que a dos contatos de casos PB. Corroborando com o princípio de que o

contágio e o desenvolvimento da doença, está intimamente relacionado a exposição

continuada a carga bacilíferas maiores, observadas em pacientes multibacilares.

15

6[7] CONCLUSÃO

A genotipagem de cepas circulantes possibilitou montar um cluster de linhagens de

M. leprae circulantes no Estado do Pará, com pelo menos um caso de infecção de dois

pacientes localizados próximos pela mesma linhagem.

O diagnóstico molecular pela utilização do RLEP parece ser uma ferramenta de

diagnóstico complementar promissora e eficaz. Sua implantação em unidades laboratoriais e

unidades de referência seria possível por tratar-se de um PCR convencional.

16

7[8] REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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DIFICULDADES - Relacionar os principais fatores negativos que interferiram na execução do projeto.

PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.

DATA : ______/_________/________

_________________________________________ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________________ASSINATURA DO ALUNO

INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição.

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FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO :

1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?

2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho ?

3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?

4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?

5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório

6. Parecer Final: Aprovado ( ) Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações)Reprovado ( )

7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o

desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.Data : _____/____/_____.

________________________________________________Assinatura do(a) Avaliador(a)

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