UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

TIAGO DE MORAES LENZ

DESENVOLVIMENTO DE POLVOS OCTOPUS SPP. DURANTE A FASE

PLANCTÔNICA: SUBSÍDIOS PARA O CULTIVO

PONTAL DO PARANÁ

2015

TIAGO DE MORAES LENZ

DESENVOLVIMENTO DE POLVOS OCTOPUS SPP. DURANTE A FASE

PLANCTÔNICA: SUBSÍDIOS PARA O CULTIVO

Tese apresentada como requisito parcial para a

obtenção do grau de Doutor em Sistemas Costeiros

e Oceânicos. Curso de Pós-Graduação em Sistemas

Costeiros e Oceânicos, Centro de Estudos do Mar,

Setor de Ciências da Terra, Universidade Federal

do Paraná.

Orientador: Dra. Érica Alves González Vidal

Linha de pesquisa: Biologia e Ecologia dos Sistemas Costeiros e Oceânicos

PONTAL DO PARANÁ

2015

C u r s o d e P ó s -g r a d u a ç ã o em S i s t e m a s

C o s t e i r o s e O c e â n i c o sCentro de Estudos do Mar - Setor Ciências da Terra - UFPRAvn. Beira-mar, s/n° - Pontal do Sul - Pontal do Paraná - Paraná - Brasil Tel. (41) 3511*8644 - Fax (41) 3511*8648 - www.cem.ufpr.br - E-mail: pgsisco@ufpr.br

TERMO DE APROVAÇÃO

Tiago de Moraes Lenz

DESENVOLVIMENTO DE POLVOS OCTOPUS SP. DURANTE A FASE PLANCTÔNICA: SUBSÍDIOS PARA O CULTIVO

Tese aprovada como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor(a) em Sistemas Costeiros e Oceânicos, da Universidade Federal do Paraná, pela

Comissão formada pelos professores:

Dr. Ac^Cio Ribeira Gomes Tomás (Insituto de Pesca-SP)

Membro Examinador

Dr. TeoHòrÓVaske Júnior (UNESP)

Membro

DireafísTÍduardo Belz (UFPR/CEM)

Membro Examinador

J2 /

Dra. Terèzmha Absher (UFPR/CEM)

Membro Examinador

Dra. Érica Alves Gonzáles Vidai (UFPR/CEM)

Orientadora (afastada oficialmente)

Pontal do Paraná, 27/03/2015.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Dra. Érica Vidal que me deu a oportunidade de estudar o fantástico

mundo dos cefalópodes.

Aos corajosos companheiros do Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia

Marinha Experimental (LaCCef), Gustavo, Daphne, Nathália, Rita, Juliana, Paulo,

Fabrício e Marcelo.

Às Dra Cármen Évora, Aracelli Delgado e Maria Évora Rodriguez, além do Dr. Carlos

todos do Departamento de Farmácia da Universidade de La Laguna em Tenerife na

Espanha, pela paciência em transmitir os procedimentos técnicos e pela alegria no

convívio diário.

Ao Instituto Espanhol Oceanográfico de Canárias, em especial ao Dr. Eduardo

Almansa, Diego Lorenzo, Ullises, Diana Reis, Salvador Herrera, Beatriz Paramio,

Virgínia Martin, Catalina Raya, Luís Alberto e toda a equipe de apoio.

Ao professor Dr. Luís Fernando Fávaro e todos os amigos que fiz no Laboratório de

Reprodução de Peixes da Universidade Federal do Paraná. A Dra Gisela Westphal e Dr.

Antonio Ostrensky por ceder o laboratório de histologia.

Ao CAMAR através do Dr. Ubiratã e do companheiro Jorge que estiveram sempre

solícitos em ajudar na captação da água e outras pequenas necessidades emergenciais.

A todos os que se envolveram nas capturas de reprodutores de polvo, sem os quais este

trabalho não seria possível. Gustavo, Betão, Zé Hugo, Iroshi, Abraão, Tatiana, além dos

motoristas Agnaldo e Fumaça e dos seguranças Marcos, Cláudio, Adílson e Eduardo

que davam sempre uma força quando necessário.

Ao PGSisCO por compor a minha formação, trazendo conhecimentos da Oceanografia

que ampliaram a minha visão à outras perspectivas.

À CAPES pelo apoio na concessão da bolsa de Doutorado Sanduíche no Exterior e de

doutoramento viabilizando a realização deste trabalho.

À minha esposa que me acompanhou bravamente nesta longa jornada.

À minha mãe que é o alicerce do cidadão que sou hoje.

Ao privilégio de viver tudo que hei vivido.

RESUMO

Os polvos tem despertado crescente interesse para a aquicultura mundial devido à sua

boa adaptabilidade ao cativeiro, à aceitação de alimento congelado, altas taxas de

crescimento e de conversão alimentar, além de elevados preços de mercado. No entanto,

a baixa sobrevivência na fase paralarval é atualmente o principal gargalo para o

desenvolvimento do cultivo integral em nível comercial. Este estudo foi realizado nesta

fase crítica e buscou descrever aspectos gerais do desenvolvimento embrionário e das

paralarvas de uma espécie recém-descrita de polvo (Octopus insularis), avaliar o efeito

de variáveis ambientais (disponibilidade de alimento) sobre o conteúdo de vitelo e o

potencial de sobrevivência de paralarvas do polvo comum (Octopus vulgaris) após a

eclosão. Objetivou também, observar pela histologia as mudanças teciduais e

morfológicas no trato digestivo decorrentes da primeira alimentação e do

desenvolvimento planctônico, além de avaliar o crescimento e a sobrevivência de

paralarvas de O. vulgaris durante o inicio da fase planctônica, com a oferta de dieta

inerte encapsulada com quitosano e enriquecida com fluoesferas como marcadores de

ingestão. Este trabalho visa contribuir com informações que auxiliem no aprimoramento

do cultivo de polvos na fase planctônica.

Palavras-chave: Octopus, ovos, paralarvas, vitelo, quitosano, marcador de ingestão.

ABSTRACT

The octopus has aroused the interest for world aquaculture, due to its good adaptability

to captivity, the acceptance of frozen food, high growth rates and feed conversion, and

high market prices. However, the low survival is currently in phase paralarval main

bottleneck for the development of full-cultivation on a commercial level. This study was

conducted in this critical phase and sought to describe general aspects of embryonic

development and paralarvae of a newly described species of octopus (Octopus

insularis), and also evaluate the effect of environmental variables (food availability) on

the yolk contents and the potential paralarvae of survival of the common octopus

hatchling (Octopus vulgaris). Aimed also observe through the tissue histology and

morphologic changes in the digestive tract resulting from the first feeding and

planktonic development, and to evaluate the growth and O. vulgaris paralarvae survival

during early planktonic phase with the diet offer inert encapsulated with chitosan and

enriched with fluospheres as intake markers. The results of these findings will

contribute information for the efforts to improve the octopus cultivation in planktonic

phase.

Key words: Octopus, eggs, paralarvae, yolk, chitosan, intake marker.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 7

OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 12

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 12

HIPÓTESES.............................................................................................................. 13

LOCAL DE ESTUDO............................................................................................... 13

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 15

CAPÍTULO I - First description of the eggs and paralarvae of the tropical octopus

(Octopus insularis) under culture conditions ............................................................23

CAPÍTULO II - Mudanças teciduais no trato digestivo de Octopus vulgaris durante

a fase planctônica: influência do vitelo e da disponibilidade de alimento ...............51

CAPÍTULO III - Efeito da micro-encapsulação de dietas alimentares com

quitosano no crescimento e sobrevivência de paralarvas do polvo comum (Octopus

vulgaris) utilizando marcadores de ingestão ............................................................78

CONCLUSÕES .........................................................................................................98

7

INTRODUÇÃO GERAL

A pesca extrativista mundial se mantém estagnada em relação à sua produção e

mesmo o aumento no esforço de pesca aliado às inovações tecnológicas no setor, não

tem sido suficientes para aumentar a produção. A produção pesqueira mundial manteve-

se em torno de 150 milhões de ton/ano na última década, tendo a aquicultura importante

contribuição na produção. De acordo com dados da FAO (2014), a aquicultura tem

alcançado aproximadamente 43% do total de pescados produzidos no planeta, com 66

milhões de toneladas produzidos em 2012.

O Brasil, apesar de possuir grande potencial para a produção de pescados em

cativeiro, apresenta lento desenvolvimento, tendo sua produção estimada em 272 mil

toneladas (IBAMA, 2006). A aquicultura brasileira ainda se baseia em um pequeno

número de espécies, em sua maioria espécies exóticas. As ostras do Pacífico

Crassostrea gigas (Thundberg, 1795), os camarões-brancos Litopenaeus vannamei

(Boone, 1931) e as tilápias Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) são as principais

espécies cultivadas (CAMARGO & POUEY, 2005; BALDISSEROTTO, 2009).

O país possui uma enorme diversidade de organismos nativos com grande

potencial para a aquicultura, fato que, além de diversificar os produtos da aquicultura

nacional, podem contribuir para sua maior aceitabilidade em diversas regiões. Nesse

contexto, uma das principais tendências globais da aquicultura é a necessidade de

diversificação das espécies cultivadas, merecendo especial ênfase as espécies marinhas

de alto valor comercial e com mercado consolidado. Dentre os organismos com maior

potencial destacam-se os polvos, com elevado valor comercial e ampla aceitabilidade

nos mercados internacionais (GLOBEFISH, 2009).

Os polvos habitam diversos tipos de substrato, desde recifes de corais a

substratos rochosos e arenosos (GUERRA, 1981; LEITE & MATHER, 2008) em

profundidades de até 200m. São predadores visuais que se alimentam principalmente de

poliquetas, crustáceos, moluscos e peixes, podendo ainda ser observado o canibalismo

(GUERRA, 1978; GÍMENEZ & GARCÍA-GARCÍA, 2002; IBAÑEZ & KEYL, 2010).

Possuem a capacidade de mudar de cor e a textura da pele em perfeita sintonia com o

entorno, se camuflando dos predadores e auxiliando na estratégia de captura de presas.

Animal solitário e territorialista apresentam migrações estacionais principalmente

quando se aproxima a época de reprodução (SEIXAS, 2009). Seu ciclo de vida é

8

relativamente curto, sendo de um a dois anos no meio natural (MANGOLD &

BOLETZKY, 1973; HATANAKA, 1979; SMALE & BUCHAN, 1981; DOMAIN et al.

2000). Os machos apresentam maior longevidade do que as fêmeas, tendo em vista que

elas morrem logo após o período de incubação dos ovos (SEIXAS, 2009).

Dentre os moluscos cefalópodes mais bem estudados está o polvo comum

(Octopus vulgaris CUVIER, 1797), objeto de estudos no campo da neurobiologia,

fisiologia, bioquímica, e comportamento animal (YOUNG, 1971; WELLS, 1978;

BOYLE, 1983), que tem distribuição cosmopolita desde as zonas tropicais até águas

temperadas e no Brasil é encontrada em praticamente toda a costa (JEREB et al. 2014).

Apresentando características similares ao polvo comum, o Octopus insularis

(LEITE & HAIMOVICI, 2008), é uma espécie predominante em águas rasas e quentes

das ilhas tropicais oceânicas e ao longo da costa nordeste do Brasil (LEITE et al. 2010).

Espécie de porte médio é o principal alvo da pesca de cefalópodes em águas rasa

tropicais no nordeste do Brasil (LEITE et al. 2008), no entanto há poucos estudos sobre

a biologia e ecologia desta espécie (LEITE, 2007), já que anteriormente a espécie era

confundida com Octopus vulgaris. Apenas recentemente, através de diferenças

genéticas e morfológicas, houve a diferenciação da nova espécie (LEITE et al. 2008;

LEITE & MATHER, 2008).

Nas últimas décadas, os polvos tem despertado crescente interesse para a

aquicultura mundial, devido à sua boa adaptabilidade ao cativeiro, à aceitação de

alimento congelado, altas taxas de crescimento e de conversão alimentar e elevados

preços de mercado (GARCÍA-GARCÍA & AGUADO, 2002; IGLESIAS et al. 1999;

IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004). Vários estudos têm demonstrado que o

Octopus vulgaris pode chegar ao peso de comercialização (± 3 kg) a partir de um peso

médio inicial de 700 g em apenas 3 ou 4 meses (GARCÍA-GARCÍA & VALVERDE,

2004, GARCÍA-GARCÍA & CEREZO, 2006). As taxas de crescimento obtidas variam

de 0,5 a 1,0 kg por polvo ao mês e são realmente expressivas, uma vez que

pouquíssimas espécies cultiváveis atingem um crescimento semelhante.

Vários estudos têm avaliado a biologia e o ciclo de vida da espécie em cativeiro,

com o objetivo de aplicar estes conhecimentos no cultivo integral e comercial

(IMAMURA, 1990; HAMAZAKI et al. 1991; IGLESIAS et al. 1999; GARCÍA-

GARCÍA & VALVERDE, 2004; IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004;

IGLESIAS et al. 2007; DELGADO et al. 2011; VIDAL et al. 2014).

9

Segundo Vaz-Pires et al. (2004) para que o cultivo da espécie alcance o nível

industrial é necessário padronizar os métodos de larvicultura. A baixa sobrevivência

somada ao baixo crescimento na fase paralarval é atualmente o gargalo tecnológico para

se fechar o ciclo de vida do polvo comum (IGLESIAS et al. 1999; IGLESIAS et al.

2004).

Até o momento, pesquisas sobre a larvicultura de polvos tiveram como foco

principal a sobrevivência e o crescimento das paralarvas, além dos seus requerimentos

nutricionais (VILLANUEVA, 1994; 1995; NAVARRO & VILLANUEVA, 2000; 2003;

VILLANUEVA et al. 2002; IGLESIAS et al. 2002; 2004; VILLANUEVA &

BUSTAMANTE, 2006). Porém, pouca atenção foi destinada aos fatores que afetam o

desenvolvimento do embrião e as taxas de absorção do vitelo, ou seja, que determinam a

qualidade das paralarvas para a larvicultura.

Após a eclosão as paralarvas são planctônicas vivendo à deriva até o momento

do assentamento (NIXON, 1985; IGLESIAS et al. 2004; IGLESIAS et al. 2007). Nos

primeiros dias após a eclosão, as paralarvas combinam alimentação endógena (absorção

do vitelo) com exógena (captura de presas), para manutenção das suas altas taxas

metabólicas nesta fase da vida (VIDAL et al. 2002; 2005). A reserva vitelínica suporta

o metabolismo das paralarvas quando estas, todavia estão desenvolvendo suas

habilidades para capturar presas. No entanto, a energia contida no vitelo não dura por

longo período e as paralarvas devem rapidamente capturar alimento para manter seus

requerimentos metabólicos. Este fato pode explicar por que as paralarvas iniciam

alimentação exógena antes da completa depleção da reserva vitelínica (VIDAL et al.

2002; 2005).

Ao eclodirem as paralarvas podem ou não encontrar alimento em abundância,

fato que possivelmente irá afetar as taxas de crescimento. Diversos autores sugerem que

a transição entre a utilização do vitelo e a captura de presas ativas representa um

período crítico no ciclo de vida dos cefalópodes (BOLETZKY, 1987; VECCHIONE,

1987; IMAMURA, 1990; VIDAL & HAIMOVICI, 1998; IGLESIAS et al. 2000;

VIDAL et al. 2002; IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004). No entanto, não

há até o momento, estudos que descrevam as alterações progressivas que ocorrem em

nível de tecidos ou órgãos durante a absorção do vitelo na presença e na ausência de

alimento durante os primeiros dias de vida.

Outro momento delicado durante a larvicultura de polvo e a composição

nutricional do alimento ofertando durante a fase planctônica (VIDAL et al. 2014). A

10

artêmia por ser um crustáceo fácil de produzir e sua composição bioquímica poder ser

manipulada através de enriquecimento é o principal alimento ofertado na fase inicial de

vida de muitos organismos aquáticos cultivados (SEIXAS, 2009). Villanueva et al.

(2002) conclui que durante os primeiros dias de vida das paralarva a artêmia

enriquecida é um bom alimento, no entanto após os 14 dias, esta parece não suprir as

necessidades das paralarvas, resultados enfatizados por Seixas et al. (2010). A utilização

de zoeas de crustáceos como dieta complementar seria uma boa alternativa para oferecer

os nutrientes requeridos pelas paralarvas, já que foi utilizada com sucesso por Iglesias et

al. (1997), quando estes conseguiram fechar integralmente o cultivo de polvos em todos

os seus estágios de desenvolvimento. No entanto, há uma grande dificuldade em

conseguir produzir zoeas em quantidades suficientes e no momento preciso para suprir

as necessidades até o final da fase planctônica (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000;

IGLESIAS et al. 2007).

O uso de dietas artificiais com a composição nutricional específica para cada

estágio de vida é uma forma de substituir o uso de alimento vivo, abaixando

relativamente os custos de produção (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000). Algumas

tentativas de uso de dietas formuladas para paralarvas de polvo não obtiveram bons

resultados (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000; VILLANUEVA et al. 2002), pois

não apresentaram crescimento e sobrevivência diferenciados quando comparado a

paralarvas alimentadas com artêmia enriquecida. Segundo Villanueva et al. (2002),

esses resultados podem indicar desnutrição induzida pela formulação inadequada da

microdieta.

As paralarvas necessitam alimentos ricos em ácidos graxos polinsaturados

(PUFA), fosfolipídios e colesterol, assim como a presença lipídios neutros (NAVARRO

& VILLANUEVA, 2000). A relação proteína/lipídios na dieta parece ser mais

importante que a quantidade de ácidos graxos altamente insaturados (HUFA) para a

sobrevivência e crescimento da paralarvas (SEIXAS et al. 2010). No entanto, outros

aspectos devem ser considerados para o desenvolvimento de dietas artificiais, dentre

eles podemos destacar: a cor, forma tamanho, movimento na água, além do estímulo

olfativo (KOLKOVSKI, 2008). Os polvos são reconhecidamente predadores visuais

(VILLANUEVA & NORMAN, 2008), no entanto outros fatores químicos ainda pouco

conhecidos podem influenciar na seleção e ingestão de presas (VILLANUEVA, 1995).

Alguns trabalhos buscaram testar o uso de dietas artificiais com paralarvas de

cefalópodes (CASTRO et al. 1993; IGLESIAS et al. 2000; NAVARRO &

11

VILLANUEVA, 2000; VILLANUEVA et al. 2002; SEIXAS et al. 2010). Os autores

observaram a captura e ingestão das partículas, no entanto, quando avaliado o

crescimento e sobrevivência não se observou melhores índices quando comparadas às

alimentadas com presas vivas. A busca por formas de elaboração de partículas que

aumentem a ingestão da dieta e concomitantemente supram as necessidades nutricionais

das formas jovens são essenciais para tornar cultivo de polvos viável economicamente

(IGLESIAS et al. 2007).

Devido a sua composição natural, biocompatibilidade, não toxidade, habilidade

de adsorção e propriedade antimicrobiana o quitosano vem sendo utilizado para

encapsular ingredientes ativos na indústria farmacêutica (RAVI-KUMAR, 2000;

MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2005; KONG et al. 2010), alimentícia (DUTTA et

al. 2009), além de estudado o seu uso como coagulante no tratamento de efluentes

orgânicos (BOUGH, 1976; CHENG et al. 2005) e na formação de fibra sintética

(RINAUDO, 2006; PILLAI et al. 2009). Por ser um produto extraído da carapaça de

caranguejos e camarões (JOHNSON & PENISTON, 1982; RINAUDO, 2006; AL

SAGHEER et al. 2009), sendo o primeiro uma das principais fontes de alimentação dos

polvos em fase adulta, o quitosano pode ser um interessante aglutinante alimentar tanto

para polvos como também para peixes, tendo em vista que se pode manipular os

ingredientes encapsulados de acordo com a necessidade alimentar do organismo e seu

estágio de desenvolvimento.

Quando se testa uma dieta inerte com uma co-alimentação com presas vivas, há

a dificuldade de saber qual alimento foi realmente ingerido, já que muitas vezes pela

coloração do trato digestivo não é possível fazer uma distinção segura. O uso de

marcadores de ingestão é uma interessante ferramenta que pode ser utilizada para

avaliar a seleção e ingestão de partículas alimentares. O uso de microesferas

fluorescentes avançou principalmente no campo de administração de medicamentos,

terapia e investigação genética, marcação molecular e métodos de detecção óptica,

desencadeando um grande avanço nestas áreas do conhecimento (BORM et al. 2006). O

uso de microesferas permite avaliar a seleção e ingestão de presas através de

ferramentas relativamente simples, como o uso de microscópio de fluorescência ou um

espectrofotômetro de fluxo, método este que já foi testado em larvas de peixes marinhos

(HANSEN et al. 2009) e pode ser adaptado ao estudo de diferentes organismos

cultivados.

12

Neste contexto, o presente estudo abordou aspectos reprodutivos de uma nova

espécie nativa de polvo, como também aspectos relacionados à digestão na fase pós-

eclosão em uma espécie nativa de polvo já conhecida. Esta tese está formatada

conforme modelo exigido pelo Programa de Pós-Graduação em Sistemas Costeiros e

Oceânicos (PGSisCO) da Universidade Federal do Paraná, sendo apresentada na forma

de três artigos, antecedidos de uma Introdução Geral e procedidos das Conclusões

Finais. O primeiro artigo está em inglês e formatado nas normas da revista American

Mallacologial Bulletin, de acordo com as exigências do PGSisCO, que visa acelerar o

processo de publicação.

OBJETIVO GERAL

Este estudo tem como objetivo descrever aspectos gerais do desenvolvimento

embrionário e as paralarvas de uma espécie recém-descrita de polvo (Octopus

insularis). Também, avaliar o efeito de variáveis ambientais (disponibilidade de

alimento) sobre o vitelo e o potencial de sobrevivência de paralarvas do polvo comum

(Octopus vulgaris) e, ainda descrever mudanças teciduais e morfológicas no trato

digestivo decorrentes da primeira alimentação e durante a fase planctônica, além de

avaliar o crescimento e a sobrevivência de paralarvas de O. vulgaris durante o inicio da

fase planctônica, as quais foram alimentadas com dieta inerte elaborada com quitosano

e marcadas com microesferas fluorescentes.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

· Descrever o desenvolvimento embrionário, ovos e as paralarvas de Octopus

insularis através da manutenção de reprodutores em laboratório;

· Avaliar a influência da disponibilidade de alimento na fase pós-embrionária do

polvo comum em laboratório no que se refere às taxas de crescimento, potencial

de sobrevivência e às taxas de absorção do vitelo;

13

· Descrever ao longo da ontogenia as alterações celulares e teciduais na glândula

digestiva durante a transição alimentar endógena e exógena, para a alimentação

puramente exógena nas paralarvas de Octopus vulgaris;

· Comprovar a viabilidade do uso de fluoesferas como marcadores de ingestão em

paralarvas de polvo;

· Avaliar a influência da dieta inerte no crescimento e sobrevivência das

paralarvas de Octopus vulgaris durante o inicio da larvicultura.

HIPÓTESES

· Devido às espécies O. insularis e O. vulgaris possuírem similaridades

morfológicas, espera-se que ambas espécies tenham também modo de

desenvolvimento similar, produzam uma grande quantidade de ovos e

apresentem paralarvas planctônicas;

· Se a ausência de alimento influencia no consumo de vitelo, espera-se que a

quantidade de vitelo seja menor nas paralarvas em inanição;

· Se ao eclodir as paralarvas possuem a glândula digestiva funcional, então

espera-se encontrar os mesmos tipos celulares durante toda a sua cronologia

ontogenética;

· Se as paralarvas assimilam a dieta inerte, espera-se encontrar marcadores de

ingestão em seu trato digestivo;

· Se a dieta elaborada com quitosano é adequada para o a primeira alimentação

das paralarvas, espera-se que paralarvas alimentadas com esta dieta e artêmias

enriquecidas tenham maior crescimento e sobrevivência que aquelas alimentadas

somente com artêmia enriquecida.

LOCAL DE ESTUDO

Este estudo foi realizado no Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia

Marinha Experimental (LaCCef) do Centro de Estudos do Mar (CEM) na Universidade

14

Federal do Paraná, localizados no município de Pontal do Paraná no Estado do Paraná.

Os reprodutores de Octopus insularis foram capturados no município de Rio do Fogo no

Estado do Rio Grande do Norte e trazidos para o LaCCef por via aérea. Os reprodutores

de Octopus vulgaris foram capturados na desembocadura do Complexo Estuarino de

Paranaguá no litoral paranaense e no município de Bombinhas no Estado de Santa

Catarina através de mergulho livre e autônomo. O processamento histológico foi

realizado no Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes da Universidade

Federal do Paraná no município de Curitiba sob orientação do professor Dr. Luís

Fernando Fávaro. O experimento com dieta inerte micro-encapsulada com quitosano

para alimentação de paralarvas de Octopus vulgaris e suas análises, foram realizados no

Instituto Espanhol Oceanográfico (IEO) e no Departamento de Farmácia da

Universidade de La Laguna localizados em Tenerife, Ilhas Canárias, Espanha, orientado

pelo Dr. Eduardo Almansa.

15

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23

Capítulo I - FIRST DESCRIPTION OF THE EGGS AND PARALARVAE OF THE TROPICAL OCTOPUS (OCTOPUS INSULARIS) UNDER CULTURE

CONDITIONS*

DESCRIPTION OF EGGS AND PARALARVAE OF OCTOPUS INSULARIS

Tiago M. Lenz1, Nathalia H. Elias1, Tatiana S. Leite2, Erica A. G Vidal1*

1Centro de Estudos do Mar, Universidade Federal do Paraná, Pontal do Paraná, PR, Brazil.

tiagopesca@hotmail.com, naths.he@gmail.com, ericavidal2000@yahoo.com.br

2Dept. Oceanografia e Limnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN, Natal, Brazil. leite_ts@yahoo.com.br

Corresponding author EAG Vidal: ericavidal2000@yahoo.com.br

Keywords: cephalopod, chromatophore, embryonic development, fecundity, Octopus

*No prelo. American Malacological Bulletin, 2015.

24

ABSTRACT

Octopus insularis (Leite and Haimovici 2008) occurs in a wide region of the tropical

Atlantic, inhabiting shallow waters along the coast and oceanic islands of northeastern

Brazil, where it is considered the primary target of octopus fisheries. This species is

only recently described, and detailed information about its spawning, eggs, and

paralarvae is unknown. The objective of this study was to estimate the fecundity,

describe the eggs and paralarvae and the duration of embryonic development under

culture conditions. Broodstock (3 females and 1 male) were captured and transported to

the laboratory, where they were acclimated in a closed recirculation water system at

26°C and 32 salinity. Eggs were obtained from 2 spawning females; 30 eggs were

sampled 1 day after spawning and 1 day prior to the first hatching day, and their length

and diameter were measured. Embryonic development was monitored every three days

through the sample of 30 eggs. Fecundity was estimated. The duration of embryonic

development lasted from 30-38 days and fecundity was 85,000 eggs per female. The

length and width of the eggs on the first day after spawning were 2.13±0.06 mm and

0.82±0.04 mm, respectively, and were 2.29±0.06 mm and 0.92±0.03 mm, respectively,

one day before hatching. The newly hatched paralarvae exhibit 3 suckers per arm and a

mean mantle length of 1.682 ± 0.133 mm. The chromatophore pattern of paralarvae is

conspicuous, with a total of ~90-111 chromatophores. A total of 32-40 and 56-69

chromatophores were found on the dorsal and ventral view, respectively. These results

are of essential importance for identifying the eggs and paralarvae of Octopus insularis

and in broadening our knowledge of this species.

25

INTRODUCTION

Octopus insularis Leite and Haimovici 2008 is a medium-sized octopus and is

the principal commercial cephalopod species around the tropical oceanic islands of

Brazil and along the country’s northeastern coast. O. insularis shows distinct

morphological characteristics from its congener Octopus vulgaris Cuvier, 1797,

including short and stout arms, mantle, and head with large reddish-brown rough skin

(Leite et al. 2008). A recent study also described distinct reproductive features, such as

relatively smaller gonads, lower absolute and relative fecundity in the ovary, year round

production and release of spermatophores and group-synchronous ovulation (Lima et al.

2014). This species occurs throughout the year in shallow waters, where it is the focus

of artisanal fisheries (Lima et al. 2013.), and is usually found in rocky and reef habitats,

where it feeds primarily on crustaceans, bivalves, and gastropods and, less frequently,

on cephalopods and fish (Leite, Haimovic and Mather et al. 2009, Bouth et al. 2011).

Several studies have sought to understand aspects of the biology and ecology of

Octopus insularis by focusing primarily on adults and juveniles (Leite, Haimovic and

Mather 2009, Leite, Haimovic and Mather et al. 2009, Bouth et al. 2011, Lima et al.

2013). However, as it was not previously distinguished from O. vulgaris complex, only

recently described as a new species, there is virtually no information on the early life

stages of O. insularis.

Knowledge on early life stages is required for a better understanding of life

cycles, ecology and the sustainable management of stocks (Rodhouse et al. 1992,

Sweeney et al. 1992). Besides, information on the morphology and distribution of early

26

stages of cephalopods is of crucial importance for discriminating populations and

identifying species (Young 1989, Hochberg et al. 1992, Vidal et al. 2010).

Benthic, littoral octopuses species produce a small number of eggs, i.e., Octopus

joubini Robson, 1929 (<100 eggs) (Hanlon 1983), whereas others may produce several

hundred thousand eggs, e.g, O. vulgaris (100,000-500,000 eggs) (Mangold 1983,

Iglesias et al. 1997) and O. maorum Hutton, 1880 (>50,000 eggs) (Grubert and Wadley

2000). High fecundity species produce small eggs that hatch into planktonic paralarvae.

Lower fecundity species produce relatively few large eggs, resulting in more highly

developed benthic hatchlings that resemble the adult (Villanueva and Norman 2008). Ré

(1998) has suggested that fecundity depends on the weight of females, and Osborn

(1995) has stated that, on an absolute basis, larger females laid more festoons containing

a greater density of eggs. This author also suggested that the maintenance of females

under optimal laboratory conditions may increase the amount of energy available for

egg production and may ultimately increase fecundity.

The temperature is the principal factor controlled in laboratory conditions and

had direct influence in metabolism of the embryo and newly hatched. Embryonic

development in cephalopods is inversely related to water temperature (Mangold and

Boletzky 1973, Boletzky 1974). In fact, temperature is known to affect all metabolic

processes, such as respiration, excretion, yolk utilization, and consequently,

developmental time (Bouchaud 1991, Caverivièrie et al. 1999, Vidal et al. 2002).

Octopus paralarvae are delicate, have short arms with few suckers and limited

swimming ability (Villanueva and Norman 2008). Paralarvae have primarily been

described based on their chromatophore pattern, as the number and distribution of

chromatophores on the skin are species specific. Indeed, the chromatophore pattern is

27

conservative and can be used as a reliable taxonomic characteristic to identify paralarval

cephalopods (Young et al. 1989, Hochberg et al. 1992).

There is no available information on the embryonic and post-embryonic

development of Octopus insularis. Furthermore, maintenance under laboratory

conditions has not previously been accomplished but can potentially provide rich

information on embryonic development and morphological features of eggs and

hatchlings. This knowledge may help to examine such important features as

reproductive behavior in captivity, number of eggs laid, egg length, and embryonic

developmental times.

Due to the morphological similarity between O. insularis and O. vulgaris, we

aim to investigate the hypothesis that these species have a similar mode of development;

producing a large number of eggs and planktonic paralarvae. Therefore, the objectives

of this study describe, for the first time, the eggs, egg masses, fecundity, and newly

hatched paralarvae of O. insularis.

MATERIALS AND METHODS

Broodstock collection and maintenance

Broodstock (3 females and 1 male) were captured by scuba diving at a depth of

7-9 m along the coast of Rio Grande do Norte State (5°16 'S, 35°18' W) on 25 October

2011 and maintained for four days at the Technological Center of Aquaculture, at the

University of Rio Grande do Norte. After this previous acclimation, the animals were

air-freighted in their original seawater to the Laboratory of Cephalopod Culture and

Experimental Marine Ecology at the University of Paraná in southern Brazil. The

transportation time was approximately 10 h. Upon arrival, the octopuses were weighed

28

individually (male – 1,340 g; females – 1,630 g, 1,680 g and 1,810 g) and acclimatized

to a closed recirculation water system at 26±1°C and 32±1 salinity. The recirculation

system consisted of 3 culture tanks, 2 rectangular tanks (1.60 m length x 0.40 m height

x 0.30 m width – 192 L; 0.69 m length x 0.51 m height x 0.30 m width – 106 L) and 1

circular tank (superior edge diameter of 1.22 m, inferior opening diameter of 0.96 m,

height of 0.58 m – 300 L utilized), all connected to a biofilter (1.80 m length x 0.60 m

height x 0.30 m width – 325 L). The system was connected to a 13 W ultra-violet filter,

and two PVC shelters (30 cm length x 10 cm diameter) were offered per animal.

The broodstock diet consisted of live prey: blue crab (Callinectes sapidus,

Rathbun 1869), oyster (Crassostrea sp. Sacco, 1897), and mussels (Perna perna,

Linnaeus 1758). The shells and tissues not ingested were rapidly removed from the

tanks to ensure the maintenance of water quality. Broodstock were initially fed live

crabs only at night. After capturing the food, the octopuses brought it into the shelters

and then discarded only the remains. After 4 days, the octopuses became accustomed to

feeding by handlers during the day and were able to capture defrosted fish. The sardine,

Sardinella brasiliensis (Steindachner, 1879) was provided as food to the octopuses at a

ratio of one sardine per octopus per day; live crabs were offered at a ratio of one crab

octopus-1 day-1. Every day, the tanks were cleaned and siphoned to remove particulate

matter, food waste, and the excreta of the animals. Partial exchanges of water (20%

daily) were performed to reduce the nitrate levels and replenish the water removed by

cleaning. Measurements of physical and chemical parameters (salinity, temperature, pH,

and nitrogen compounds- nitrite, nitrate and ammonia) were performed daily.

Copulation, breeding, egg laying, fecundity, and embryonic development

29

Breeding was conducted in three tanks. With one male and three females as

breeding stock, it was necessary to rotate the male among the three tanks to ensure that

mating occurred with all the females. The male was observed to copulate with all the

female soon after it was place in the same tank.

During copulation male inserted the hectocotized arm (3rd right arm) inside the

mantle cavity of the female and copulation was observed to lasted around 20-30 min.

There were no fights between the octopuses, as there was plenty of food and shelter, but

the octopus were always positioned in front of their dens as if they were protecting their

shelters.

Twenty-six days after arrival at the laboratory, spawning was confirmed, when the

first clusters of eggs were observed on 21/11/2011. On November 28, another female

spawned and more eggs were seen in another tank. Spawning lasted for several days.

Fecundity was estimated by counting the total number of eggs in three clusters of

strings (the mean number of strings per cluster and mean number of eggs per cm of

string was obtained; the length of all strings was measured to estimate the total number

of eggs spawned per female).

Embryonic development was monitored using the eggs obtained from one of the

females. One day after spawning and one day prior to the first hatching day, 30 eggs

were sampled for image acquisition using a compound microscope attached to a high-

resolution, computer-based video system. The eggs were collected and immediately

photographed in a large Petri dish to ensure that they retained their natural

characteristics. Measurements were obtained using public domain NIH-Image software.

The eggs length and diameter were obtained by image analysis. The developmental

stages were based on the scale proposed by Naef (1928).

30

Description of morphology and chromatophore pattern of paralarvae

A total of 19 newly hatched live paralarvae were randomly sampled from the

rearing tanks, and placed on petri dishes for capture of dorsal, ventral, and side views

digital images with the same procedure used for the eggs. The morphological

description was based on the measurements of the following body dimensions: total

length (TL), mantle length (ML), mantle width (MW), length of the second pair of arms

(A2L), head width (HW), funnel length (FL) eye diameter (ED), and number of suckers

on the arms (Fig. 1) according to Roper and Voss (1983).

Figure 1

After image capture, the paralarvae were fixed in 70% alcohol. Schematic drawings

of the paralarvae were produced to describe the chromatophore pattern. A description of

the chromatophore pattern was performed based on the images taken in the dorsal view

(mantle, head, and arms), ventral view (mantle, funnel, head, and arms), and lateral

view (head, eyes, arms, and funnel) and followed anterior to posterior orientation of the

paralarvae body (Hochberg et al. 1992). For example, for funnel, the pattern 4+2+2

represents 4 chromatophores near the funnel aperture, 2 chromatophores in the median

region, and 2 more chromatophores in the posterior region (funnel base).

RESULTS

Broodstock behavior and spawning

Four days before laying eggs, the females stopped eating. The male fed normally

during this period and was removed from tanks holding brooding females. The egg

strings were attached to the posterior upper wall of the PVC shelter, and the females

31

remained in their dens cleaning, ventilating, and caring for the egg, dying a few days

after all the paralarvae have hatched.

Egg laying, fecundity, and embryonic development

The spawning process lasted approximately 7 days. Fecundity was estimated at

85,000 eggs per female and was most likely 30 % underestimated, as a few egg strings

were lost in the first days after spawning. The length and width of the eggs on the first

day after spawning were 2.13±0.06 mm and 0.82±0.04 mm, respectively, and 2.29±0.06

mm and 0.92±0.03 mm, respectively, one day before hatching.

TABLE 1

The eggs had a prolate ellipsoid-shaped chorion, which was devoid of other

capsules, and a short chorion stalk that was enlarged at the free end (Fig. 2a). Egg

strings of variable size were attached by the oviducal gland to the den wall by female.

The female attached the egg strings to a central axis (Fig. 2b), and was surrounded by

secretions from oviducal glands at the moment of laying, forming strings of a variable

number of eggs. In complete clutch, 108 strings were counted, and the presence of 790

eggs was estimated per string (Table 1). Embryonic development lasted from 30-38

days.

FIGURE 2

Based on the embryonic development stages defined by Naef (1928), cell

division occurred shortly after fecundation; however, the blastodisc was only clearly

visible beginning on the 7th day (stages I-III), resulting in an increase in cell number

(morula). The blastoderm spread by marginal cell division over the uncleaved yolk mass

at this stage, covering 10- 20% of the embryo length between days 7 and 10 (stages IV

and V). The organogenesis followed, which is characterized by the production of organs

32

formed during gastrulation. Prior to early organogenesis, the first inversion of the

embryo was observed on day 19 of embryonic development; however, not all embryos

went through the first inversion (Fig. 3a). Advanced organogenesis was observed on

day 22 corresponded to a (Stages XIII and XIV) and a mean ML of 568 µm (SD±132,

n= 30). Also, eight buds, corresponding to the eight arms, with suckers rudiments of

were observed on the embryo. The eyes pigmented (orange) and the mantle initially

developed to partially cover the gills of the embryo.

On the 25th day of development, the arms were more developed, showing the

three suckers fully formed. Functional chromatophores were distributed on the mantle,

ventral arms, head, and funnel. The mantle was larger in size (mean= 871 µm±260,

n=25) than on the 22nd day. The eyes were larger and more heavily pigmented, but still

reddish in color (stage XV).

An increase in the size of the mantle (mean=1224 µm±131, n=30), funnel, and

arms in relation to the total size of the embryo was observed on the 29th day of

development. Chromatophores were found on the arms, mantle, funnel, and head, and

the eyes were larger and more pigmented showing a brownish retina (XVI and XVII).

The advanced developmental stages (stage XIX) before (Fig. 3b) and after (Fig.

3c) the second inversion of the embryo occurred on day 30-31, indicating the end of

organogenesis. The eyes exhibited a darkish- brown retina and a conspicuous lens, the

ink sac was fully formed, and the mantle and funnel were well developed. No

significant morphological modifications were observed from day 31 to day 38, with

exception of the outer yolk sac that was substantially reduced, accompanied by an

increase in the volume of the inner yolk sac.

FIGURE 3

33

Description of paralarvae and their chromatophore pattern

The mean total length and mantle length of newly-hatched paralarvae was 2.34 ±

0.16 mm and 1.68 ± 0.13 mm, respectively. The funnel (0.49 ± 0.05 mm) was well

developed, occupying almost the entire length of the head in the ventral region. The

arms were short with three well defined suckers of approximately the same diameter.

The eyes had a diameter of 0.31 ± 0.04 mm, with the right and left always identical

(Table 2).

TABLE II

A skin membrane densely surrounded by Kölliker organs covered the head, and

mantle, although it was more prominent on the surface of the mantle. The

chromatophore pattern of paralarvae was described considering the dorsal, ventral and

lateral views as follows. When variability was observed among individuals, the most

frequent number and pattern of chromatophores was listed.

Dorsal view: Mantle: Three to four tegumental chromatophores are distributed at the

mantle edge and another four in the posterior region (Fig. 4a). The number of

extrategumental chromatophores on the central mantle covering the visceral mass was

between six and 11. These chromatophores exhibited an oval shape but were arranged in

the form similar to a "flower" (that is one in the middle and the other eight distributed

around this central chromatophore). Head: A dense arrangement of eight tegumental

chromatophores was present: two between the eyes, four in corresponding middle

position and two other at the central posterior region near the edge of the mantle. The

lateral sides bore one pair of extrategumental chromatophore. Eyes: one chromatophore

over the anterior portion of each eye (Fig. 4a).

FIGURE 4

34

Ventral view: Mantle: Densely covered with tegumental chromatophores; an average of

40 chromatophores (Fig. 4b; Table 3) were distributed into nine rows. The first three

rows were arranged horizontally, while the next six rows were distributed in a spiral

form. Head: two extra large extrategumental chromatophores were always observed and

when expanded, occupied almost the entire surface of the head below the eyes; another

tegumental chromatophore was present between the eyes. Funnel: always contained

eight chromatophores distributed in a standardized manner, four of which were near the

orifice of the funnel (above), two in the middle, and two more at toward the base of the

funnel. Arms: a single row with four to five chromatophores.

Side view: Next to the eyes 2-4 chromatophores were always observed; four on the

funnel and in the mantle, four extrategumental on the viscera and several tegumental

distributed on the mantle.

The chromatophore pattern of O. insularis is very distinctive, with a total of

~90-111 chromatophores. In the dorsal view, from 17 to 25 chromatophores were found

on the mantle (8-11 under the viscera), 9-12 on the head, and 3-4 in a single row on the

arms. In the ventral view, 42-50 chromatophores were found on the mantle, 2-3 large

chromatophores on the head, 4-5 on the arms, 8 on the funnel, and 2-4 around the eyes.

TABLE III

DISCUSSION

Newly laid eggs are immature, and formative cytoplasm is concentrated in a

small spot but increases in size at a later developmental stage, providing ample space

for the mantle sac after the second inversion (Boletzky and Fioroni 1990).

35

Octopus insularis produces small eggs and planktonic paralarvae in accordance

to our hypothesis. The estimated number of 85,000 eggs for female, with a mean total

weight of 1680 g, is comparable to the data found by Lima et al. (2014) who reported

that the number of oocytes in O. insularis ovaries ranged between 68,502 – 120,166,

with average of 93,820. This number is much lower than the fecundity estimated for O.

vulgaris, at 100,000–500,000 eggs per female (Mangold 1983). However, fecundity

seems to be dependent on the weight and size of females at the advanced maturity stage

(Mangold 1983, Ré 1998, Boyle and Rodhouse 2005). Indeed, O. insularis is a smaller

species than O. vulgaris with a shorter life cycle at the tropical environment; thus, it is

expected that the fecundity of O. insularis would be lower. Besides, although the latter

has a gonadal development similar to O. vulgaris, it has relatively smaller gonads, lower

absolute and relative fecundity and year around production and release of

spermatophores (Lima et al. 2014). Furthemore, it was also suggested by these authors

that these reproductive characteristics of O. insularis are related to more predictable

conditions at the tropical environment. Interestingly, this species has recently been also

found at a subtropical estuary in southern Brazil (EAG Vidal, unpublish data), where

environmental conditions are quite variable. Thus, further studies are necessary to

assess the fecundity of O. insularis of different weights from different locations of its

distributional range.

On the first day after spawning the length and width of the eggs of O. insularis

were 2.13±0.06 mm and 0.82±0.04 mm, respectively; thus, being slightly larger than the

eggs of O. vulgaris, which measure 1.8-2.0 mm in length and 1.0 mm in width (Nixon

1985, Mangold 1986, Boletzky and Fioroni 1990). The slightly larger size of the eggs of

O. insularis might indicate longer embryonic developmental time. The duration of the

embryonic development in O. insularis was 30-38 days at 26±1°C. However, the course

36

of development was not identical, with different embryonic stages being observed even

in the same egg string. Caveriviere et al. (1999) found that embryonic developmental

time in O. vulgaris was 15-42 days at an average temperature of 27°C and 29-49 days at

approximately 22-23 °C. On previous experiments, with O. vulgaris females of similar

weight as the O. insularis female of the present study, we have verified an embryonic

developmental time of 20-32 days at an average temperature of 26 °C (unpublished

data).

Embryonic developmental times in cephalopods show an inverse relationship

with temperature (Boletzky 1987), thus higher temperatures will reduce the time to

hatchling. Temperature directly affects almost every aspect of the early life history of

marine larvae, including the hatching time, yolk utilization rate and efficiency, and size

and weight at first feeding (Pechenik 1987, Pechenik 1990, Boidron-Metarion 1995;

Vidal et al. 2002). These physiological responses are due to the domineering effects of

temperature on metabolism. However, the combined effects of temperature and salinity

seem to be also important and deserve further investigation (Vidal and Boletzky 2014).

The embryonic stages observed in O. insularis closely resembled those of O.

vulgaris described by Naef 1928. The first reversal of the embryo inside the chorion

was observed at approximately stage VIII of Naef´s scale and the second inversion at

stage XIX. The first inversion is combined with a regular rotation around the axis of the

egg case (Orelli and Mangold 1961, Boletzky 1971), whereas the second inversion

brings the advanced embryo into a position corresponding to that prior to the first

inversion by a unique dorsal folding movement, to provide ample space for the mantle

after the second inversion prior to hatching (Boletzky and Fioroni 1990).

Octopus insularis hatchlings are planktonic, a characteristics of octopus species

with small oocytes and relatively high fecundity (Hochberg et al. 1992). However, O.

37

insularis hatchlings are slightly smaller than those of O. vulgaris, whose hatchlings

have a TL = ~3.0 mm and an ML=~2.0 mm (Boletzky 1987, Villanueva 1995, Nixon

and Mangold 1996, Villanueva et al. 1996, Vidal et al. 2010). Both species display 3

suckers distributed a single row along the arms, although the arms are shorter in O.

insularis (~0.58 mm) than in O. vulgaris (~0.7 to 1.0 mm) (Villanueva et al. 1996,

Vidal et al. 2010). Adult O. insularis shows negative allometric growth of the arm

length and positive allometric growth of the arm width with mantle length for a size

range of 32-120 mm mantle length (Leite 2007). These characteristics result in

individuals with short and thick arms in comparison to O. vulgaris (Voight 1991), a

difference that facilitates the discrimination of larger specimens of the two species

(Leite et al. 2008). The hatchlings of O. insularis showed a similar pattern to adults,

with the arms length comprising ~ 30% of the TL, in comparison with O. vulgaris

which occupied ~ 45% of the TL (Vidal et al. 2010).

This study showed that the chromatophore pattern of O. insularis paralarvae is quite

conspicuous. A comparison with the chromatophore pattern of O. vulgaris paralarvae

described by Vidal et al. (2010), shows that the principal differences between the two

paralarvae occur in the dorsal mantle and in the ventral view. The dorsal mantle of O.

vulgaris has 8-11 chromatophores, 6 of which are visceral, whereas O. insularis shows

an average of 17 chromatophores, with 7-11 visceral. In ventral view, O. vulgaris shows

an average of 23 chromatophores distributed in horizontal rows, whereas O. insularis

shows an average of 40 chromatophores divided into 9 rows of which the first 3 are

arranged horizontally and the others are distributed in a spiral form. On the funnel, O.

vulgaris exhibits 4 chromatophores with a 2 +2 distribution; in contrast, O. insularis

always shows 8 chromatophores in standard 4 +2 +2 distribution. In total, O. vulgaris

shows 56-77 chromatophores, whereas O. insularis shows 84-112. Interestingly, the

38

color pattern of O. insularis adults is also much darker than that of O. vulgaris (Leite

and Mather 2008), suggesting that the former species bears more chromatophores than

the latter.

On the other hand, when compared to the other warm-water species, O. insularis

still exhibits fewer chromatophores than O. burryi (Voss, 1950) endemic to the Gulf of

Mexico, for example, which displays approximately 205 chromatophores in total

(Forsythe and Hanlon 1985). Similarly, O. maorum, native to New Zealand, shows

approximately 220 (Batham 1957). Typically, older or brown chromatophores are found

in such regions as the mantle (ventral and dorsal), mainly covering the viscera, head

(dorsal), arms, and funnel. Conversely, younger or reddish chromatophores are found on

the soft tissue of the head that coats the entire ventral and small dorsal region, whereas

yellows chromatophores are generally small, appear in smaller quantities, and are

observed only along the dorsal edge of the mantle. During the planktonic phase, the

color changes are less pronounced, culminating with a small variety of chromatophores

and a color pattern that is less complex when compared to newly settle benthic juveniles

(Villanueva 1995, Vidal et al. 2010).

Octopus insularis was recently described as a new species in northeastern Brazil

(Leite et al. 2008) and discriminated from the O. vulgaris complex. The present study

provided fundamental information on the early life stages of O. insularis that will be

essential to identifying paralarvae from plankton samples and achieve a better

understanding of the ecology and distribution of the species. Accordingly, much of the

information on the population dynamics of both species is confusing due to the

occurrence of both species. Thus, more observations of the paralarvae, juveniles, and

adults of O. insularis should be conducted in both natural and controlled environments.

Octopus insularis should receive more focused attention, particularly because it is the

39

main target of fisheries in the northeastern Brazil and may have aquaculture potential

due to its relatively high fecundity, easy adaptation to captivity conditions at high

temperatures, good acceptability of frozen food, and high market price.

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45

Figures Legend

Figure 1. Schematic illustration showing the body dimensions measured in Octopus insularis

paralarvae. Abbreviations: a2l, length of the second pair of arms; ed, eye diameter; fl, funnel

length; hw, head width; ml, mantle length; mw, mantle width; tl, total length

46

Figure 2. Octopus insularis. (a) Eggs and (b) eggs strings in initial embryonic

development.

47

Figure 3. Octopus insularis embryos at different developmental stages. (a) Initial

developmental stages before (down) and after (upper) the first inversion of the embryo;

(b) advanced developmental stages before the second inversion; (c) after the second

inversion of the embryo and (d) newly-hatched paralarvae.

48

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) 2+

3+4

2 3-

4 Y

21

(8

VS)

24

-25

38-4

0 4-

5 (1

row

) 2+

1 2

35-3

8 4+

2+2

55-5

9 93

-99

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4+4

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2 3-

4 Y

22

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VS)

25

-26

40-4

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5 (1

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1 2

33-3

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55-5

8 95

-101

6 3

(1 r

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3+4

2 3-

4 Y

19

(9

VS)

22

-23

39-4

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ow)

2+1

2 39

-41

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2 59

-61

98-1

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7 3

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5 2

3-4

Y

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11 V

S)

22-2

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-39

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5 88

-94

8 3

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4 4

3-4

Y

13 (

8 V

S)

16-1

7 33

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) 2+

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3

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5 2

3-4

Y

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7 V

S)

16-1

7 32

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1 -

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10

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ow)

2+1+

4+4

2 3-

4 Y

19

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VS)

22

-23

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9 5

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ow)

2+1

- 34

-38

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2 53

-57

89-9

6

11

3 (1

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2+3+

5 2

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Y

15 (

9 V

S)

18-1

9 34

-36

6 (1

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) 2+

1 -

44-4

7 4+

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64-6

7 98

-103

12

3 (1

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) 2+

4+4

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- 3-

4 Y

14

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VS)

17

-18

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ow)

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- 44

-47

4+2+

2 63

-66

93-9

8

13

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4 Y

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VS)

18

-19

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-101

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4+4

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S)

12-1

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-32

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- 50

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2 68

-72

98-1

04

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12 V

S)

23-2

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2 41

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2 61

-65

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19

(12

VS)

22

-23

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1 4

(1 r

ow)

2+1

- 34

-37

4+2+

2 50

-53

90-9

4

51

Capítulo II - Mudanças teciduais no trato digestivo de Octopus vulgaris durante a

fase planctônica: influência do vitelo e da disponibilidade de alimento

Tiago M. Lenz1, José Iglesias3, Luís F. Fávaro2, Érica A. G. Vidal1

1Centro de Estudos do Mar, Universidade Federal do Paraná, Pontal do Paraná, PR, Brasil.

2Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil.

3Instituto Espanhol Oceanográfico, Vigo, Espanha.

Resumo: Durante os primeiros dias de vida, os cefalópodes combinam a alimentação

endógena (absorção do vitelo) com a exógena (captura de presas) a fim de sustentar suas

altas taxas metabólicas. A transição alimentar é considerada um período crítico nas

fases iniciais de vida dos polvos, onde ocorrem altas taxas de mortalidade. Este trabalho

objetivou estimar as taxas de absorção de vitelo e sobrevivência em paralarvas de

Octopus vulgaris alimentadas e em inanição logo após a eclosão, além de examinar

através de análise histológica a cronologia ontogenética da glândula digestiva desde a

eclosão, na presença e ausência de alimento, bem como durante fase planctônica.

Reprodutores (2♀ : 1♂) foram capturados e transportados para o laboratório, mantendo-

os em um sistema de recirculação de água fechado a 26 ± 2 ° C e salinidade 33 ± 2. A

partir da desova as paralarvas foram distribuídas em dois tratamentos, um denominado

alimentado, mantido com náuplius de artêmia e outro denominado inanição, mantidos

sem alimento, cada um com três réplicas. Diariamente 15 paralarvas de cada tratamento

foram amostradas para estimar as medidas do volume do vitelo, comprimento total,

comprimento do manto, comprimento do braço e peso seco. Para a análise histológica,

foram selecionadas amostras diárias de 15 paralarvas de cada tratamento, e a fim de

contemplar as diferentes etapas do desenvolvimento planctônico, paralarvas com idade

de 15, 22, 31, 41 e 45 dias foram analisadas. Observou-se que a transição alimentar

ocorre principalmente durante os 3 primeiros dias, sendo que o consumo do vitelo

ocorre nos 2 primeiros dias após a eclosão à temperatura 26 °C. O ciclo citológico na

glândula digestiva esteve relacionado ao ato de se alimentar sendo independente da

idade.

Palavras-chave: paralarva, vitelo, glândula digestiva, Octopus.

52

INTRODUÇÃO

Os polvos da família Octopodidae apresentam duas estratégias reprodutivas bem

definidas. A primeira se caracteriza pela produção de relativamente poucos ovos

grandes que ao eclodirem, darão origem a indivíduos morfologicamente similares aos

adultos e de hábito de vida bentônico (VILLANUEVA, 1995; AVILA-POEDA et al.

2009; VILLANUEVA & NORMAN, 2008). A outra estratégia se caracteriza pela

produção de grande quantidade de ovos pequenos, que ao eclodirem dão origem a

indivíduos igualmente pequenos e de hábito planctônico, denominados paralarvas, as

quais passam por alterações morfológicas antes de se tornarem bentônicas (NIXON &

MANGOLD, 1996; VILLANUEVA & NORMAN, 2008).

Durante os primeiros dias de vida, os cefalópodes combinam a alimentação

endógena (absorção do vitelo) com a exógena (captura de presas) a fim de sustentar suas

altas taxas metabólicas (IMAMURA, 1990; BOLETZKY, 1989; 2003; VIDAL et al.

2002; 2005). A taxa de absorção de vitelo é exponencial e dependente da temperatura,

portanto, as paralarvas devem rapidamente aprender a capturar alimento para não

morrerem de inanição. Por esta razão, a transição alimentar endógena para exógena é

considerado um período crítico nas fases iniciais de vida dos cefalópodes, onde ocorrem

altas taxas de mortalidade (BOLETZKY, 1975; VIDAL et al. 2002; 2005).

Alterações celulares e teciduais ocorrem durante a absorção do saco vitelínico

interno e provavelmente esteja relacionado a modificações na glândula digestiva,

principal órgão responsável pelo processo de digestão. Dentro do processo de digestão

podemos destacar a importância da glândula digestiva na síntese e secreção das enzimas

digestivas, na reabsorção e metabolismo de nutrientes, no armazenamento de reservas e

na secreção de metabólitos (BOUCAUD-CAMOU & BOUCHER-RONDONI, 1983;

BUNDELMANN et al. 1997). No entanto, pouco se sabe sobre a relação entre a

glândula digestiva e a reserva vitelínica na fase final de absorção de seus nutrientes e

secreção de metabólitos. Boletzky (1975) enfatiza que o mecanismo básico de absorção

do vitelo em decápodes e octópodes não diferem, o saco vitelínico interno está em

contato com uma grande veia (sinus) sanguínea na qual libera ao sistema circulatório os

nutrientes provenientes do vitelo.

Boletzky (1975; 1989) também sugere que as paralarvas de polvo podem

capturar presas ativamente imediatamente após a eclosão, pois o seu trato digestivo já é

53

capaz de digeri-las. No entanto, Iglesias et al. (2006) observaram que paralarvas recém

eclodidas de Octopus vulgaris efetuavam poucos ataques à presas e sugeriu que as

mesmas não estariam fisiologicamente aptas para iniciar a alimentação exógena. Um

resultado similar foi encontrado por Vidal et al. (2002) que mostraram que o percentual

de paralarvas de lulas com o trato digestivo cheio, aumenta nos primeiros dias após a

eclosão, concomitantemente com a redução das reservas vitelínicas. Em seu estudo

sobre alimentação e digestão de juvenis recém eclodidos de Sepia officinalis, Boucaud-

Camou et al. (1985) analisou a glândula digestiva, por ser este o único órgão a não estar

totalmente desenvolvido no momento da eclosão e estar diretamente relacionada aos

processos de digestão e absorção de nutrientes. Estes estudos ilustram que ainda pouco

se conhece sobre as modificações que ocorrem na glândula digestiva durante a fase de

absorção do vitelo e também quais são as alterações esperadas caso o animal não

encontre alimento disponível neste momento crucial de sua vida. Vidal et al. (2002;

2005) observaram que em lulas Doryteuthis opalescens, as taxas de utilização do vitelo

diferiram em paralarvas alimentadas e em inanição, sugerindo que as taxas de absorção

de vitelo poderiam estar relacionadas ao processo de digestão de alimento.

Nixon & Mangold (1996) sugerem que as adaptações na morfologia das

paralarvas de polvo durante a fase planctônica são fruto do desenvolvimento do sistema

nervoso e poderiam afetar a formação de órgãos. Estas adaptações preparariam as

paralarvas para em um curto intervalo de tempo realizar uma drástica mudança

comportamental para sobreviver no bentos. Moguel et al (2010) comentam que após a

eclosão, o Octopus maya possui capacidade digestiva limitada, no entanto aos 45 dias a

glândula digestiva mostra amadurecimento através do espessamento da lâmina basal e

evidenciação das células digestivas e vacúolos. No entanto, os autores sugerem que o

processo de alimentação parece ter maior influencia na composição da glândula

digestiva, pois a estimula a secretar grandes quantidades de enzimas.

Estudos experimentais comparativos sobre as alterações teciduais da glândula

digestiva durante a fase planctônica podem aportar importantes conhecimentos sobre a

cronologia ontogenética deste importante órgão, responsável pelos processos de

absorção e excreção. Neste contexto os objetivos deste trabalho são: 1) estimar as taxas

de absorção de vitelo e sobrevivência em paralarvas de Octopus vulgaris alimentadas e

em inanição 2) examinar através de análise histológica a cronologia ontogenética da

glândula digestiva desde a eclosão, na presença e ausência de alimento, bem como

durante fase planctônica.

54

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta e manutenção dos reprodutores

Reprodutores foram coletados na natureza através de mergulho livre com uso de

solução hipersalina na desembocadura da Baía de Paranaguá no município de Pontal do

Paraná (25°32ɂ822ʺS; 48°23ɂ283ʺO) durante os meses de setembro e outubro de 2012.

Os polvos capturados foram acondicionados em recipiente de 50 L com suprimento de

ar e transportados ao Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia Marinha

Experimental e (LaCCef) distante 20 Km do ponto de coleta. Os polvos foram

previamente aclimatados e mantidos em um sistema fechado de recirculação de água

para abrigar os reprodutores. O sistema foi constituído por um filtro biológico com

dimensões de 1,80 x 0,60 x 0,30 m e um volume aproximado de 325 L, interligado a 3

tanques circulares de fibra, dois com dimensões de 1,00 m de diâmetro na borda

superior, 0,73 m de diâmetro na borda inferior e altura de 0,60 m, com volume útil de

250 L; outro com 1,20 m de diâmetro na borda superior, 0,88m na borda inferior e

altura de 0,69 m com um volume útil de 400 L, sendo o volume total do sistema de

1225 L.

Os reprodutores foram dispostos (2♀ : 1♂) em tanques contendo abrigos

confeccionados com tubos de PVC de 100 mm de diâmetro e 34 cm de comprimento os

quais serviram de refúgio e local para a deposição dos ovos. Medições diárias dos

parâmetros físico-químicos foram realizadas. A temperatura foi de 26 ± 2 °C e

salinidade 33 ± 2, medidas com o uso termômetro de mercúrio e de refratômetro Atago,

respectivamente. O pH foi de 8,4 ± 1 medido com peagametro digital de bolso e o

fotoperíodo foi o natural. Os compostos nitrogenados (nitrito, nitrato e amônio), foram

monitorados com auxílio de kit colorimétrico SERA, sendo feitas, quando necessária,

trocas parciais de água para manter os níveis de compostos nitrogenados dentro dos

limites aceitáveis. Diariamente os tanques eram limpos e sifonados para retirada de

partículas em suspensão, restos de alimentos e excretas do animal. Os reprodutores

foram alimentados diariamente com uma dieta composta por crustáceos (50%), peixes

(30%) e moluscos (20%) vivos e/ou congelados, até o momento da desova.

Uma fêmea de 1,5 kg desovou entre 30/10/2012 e 04/11/2012 no abrigo de PVC.

O desenvolvimento embrionário durou entre 20 e 31 dias (19/11 a 01/12/2012) à

55

temperatura 26 ± 2 ° C e salinidade 33 ± 2. Durante todo o período de incubação dos

ovos a qualidade de água foi mantida em níveis adequados de acordo com IGLESIAS et

al. (2004).

Protocolo experimental

O protocolo experimental consistiu em dois tratamentos denominados

‘alimentado’ e ‘inanição’, cada um com três réplicas. Cada réplica consistiu em

recipientes de vidro de 2 L, com volume útil de 1,5 L. Cada réplica possuía uma aeração

central disposta dentro de uma estrutura cilíndrica de PVC vazada, esta recoberta por

uma tela de 500µm, estrutura responsável pelo suprimento de oxigênio, além de criar

um leve fluxo de água dentro dos recipientes.

No tratamento alimentado, o alimento vivo foi oferecido para as paralarvas. No

tratamento inanição as paralarvas foram mantidas na ausência de alimento. O alimento

vivo oferecido as paralarvas do tratamento alimentado, consistiu de náuplios artêmia

recém eclodidos oferecidos na densidade de 15 artêmias paralarva-1. Esta densidade foi

mantida durante todo o experimento.

Para se obter paralarvas da mesma idade, todas do tanque de eclosão eram

transferidas para outros tanques no final da tarde, assim todas as paralarvas utilizadas no

experimento eclodiram durante a noite seguinte. O número inicial de paralarvas foi de

50 indivíduos por réplica. O dia de eclosão foi considerado como Dia 0, pois menos de

24 horas havia se passado após a eclosão. O dia seguinte de amostragem foi considerado

o Dia 1 e assim sucessivamente.

Diariamente 30% do volume de água de cada réplica eram renovados utilizando-

se água na mesma salinidade e temperatura. A mortalidade foi determinada diariamente

pela contagem dos indivíduos mortos em cada réplica e a sobrevivência estimada de

acordo com o número de indivíduos presentes no início do experimento. Para o

tratamento inanição foi registrado quantos dias as paralarvas sobreviveram apenas com

a energia contida em sua reserva vitelínica e este, foi considerado o potencial de

sobrevivência das paralarvas às condições submetidas.

Paralarvas de diferentes idades obtidas através de cultivo

56

Para complementar a análise histológica na fase planctônica, paralarvas com

idades de 15, 22, 31, 41 e 45 dias foram obtidas através de cultivo realizado no Instituto

Espanhol de Oceanografia (IEO) em Vigo, Espanha, entre 15 de março e 19 de abril de

2010. Estas foram cultivadas em tanques circulares pretos, de 85 cm de diâmetro e

volume de 500 L. A densidade de paralarvas foi de 10 indivíduos L-1 (5000 paralarvas

por tanque), a temperatura média foi mantida entre 21 – 22 ºC, a salinidade entre 33 –

34 e uma iluminação contínua de 800 – 1000 lux foram fornecidas a cada tanque através

de duas lâmpadas fluorescentes de 36 W. A dieta consistiu em artêmias (1,5-2 mm)

alimentadas com Isochrysis galbana e posteriormente enriquecidas por 24h com

Nannochloropsis sp.. As paralarvas foram coletadas ao acaso nos tanques de cultivo e

fixadas em formol 4-6 % neutralizado e enviadas por correio ao Centro de Estudos do

Mar, da Universidade Federal do Paraná, Brasil.

Obtenção e análise dos dados

Diariamente 30 paralarvas foram amostradas, totalizando 15

paralarvas/dia/tratamento. As paralarvas foram anestesiadas em cloreto de magnésio

segundo Moltschaniwskyj et al. (2007) e feita a captura de imagens ventrais, utilizado-

se um microscópio Olympus com uma das oculares de 8x de aumento substituída por

câmera fotográfica Nikon (SMZ-10A). O comprimento total, o comprimento do manto e

o comprimento do 4º par de braços foram medidos utilizando-se o software de imagem

de domínio público NIH- Image.

Para estimar o volume da glândula digestiva e de vitelo das paralarvas, as

imagens capturadas foram analisadas através de um software de imagem Photoshop

7.0.1®. Para tal, a forma de uma elipse foi sobrepostas à forma da glândula digestiva e

outra à forma do saco vitelínico das paralarvas recém eclodidas. A seguinte fórmula foi

usada:

Elipsóide rotacional: V(1,2) = 4πAB2

. 3

Onde V1 é o volume da glândula digestiva (mm3), V2 o volume do vitelo (mm3), A e B

são, respectivamente, a metade do comprimento e a metade da largura da glândula

digestiva e do saco vitelínico, respectivamente. O volume real de vitelo foi obtido pela

57

subtração do volume da glândula digestiva do volume do saco vitelínico. Sendo a

estimativa do valor real do volume de vitelo (VR) dado pela seguinte fórmula:

VR= V2-V1

Os volumes estimados de vitelo foram convertidos em peso quando multiplicado

pela densidade de 1,036 mg.mm-3 (O`DOR et al. 1986; VIDAL et al. 2002).

Figura 1: O. vulgaris. Paralarva recém eclodida em vista ventral mostrando as medidas

de dimensão do corpo, área da glândula digestiva e do vitelo. O saco vitelínico e a

glândula digestiva são indicados pela forma geométrica (elipsóide) utilizada para

calcular o volume do vitelo.

Após o registro fotográfico, as mesmas foram pesadas para obtenção do peso

seco de acordo com a metodologia proposta por Vidal et al. (2002), registrando-se o

peso seco inicial no Dia 0 (n=30) e o peso seco final no Dia 4 (n=9/tratamento).

Para verificar diferenças estatísticas entre as médias de comprimento do manto,

comprimento total, uma Análise de Variância de dois fatores com nível de significância

de 5% foi utilizada. Para comparar as médias de peso inicial e final entre tratamentos foi

usado o Teste t-student (p<0,05). As análises estatísticas foram realizadas com o uso do

pacote estatístico R.

Com

primento total

Com

prim

ento

do

man

to

Com

prim

ento

do

4° p

ar d

e br

aços

Saco vitelínico

Glândula digestiva

58

Caracterização histológica

Para a análise histológica, foram selecionadas amostras diárias de 15 paralarvas

de cada tratamento (alimentado e inanição), sendo 3 paralarvas de cada réplica, nos 4

primeiros dias após a eclosão. Para complementar a amostragem, paralarvas alimentadas

com idade de 15, 22, 31, 41 e 45 dias foram cedidas pelo Instituto Oceanográfico

Espanhol de Vigo, a fim de analisar diferentes etapas do desenvolvimento planctônico.

Para garantir que as paralarvas amostradas no tratamento alimentado tivessem

capturado presas, e assim iniciado a alimentação exógena, as amostras obtidas no

primeiro dia após eclosão foram selecionadas da seguinte forma: a) paralarvas

amostradas antes de ser oferecido (n=5); b) paralarvas amostradas no momento da

primeira alimentação (n=5), realizada 5 minutos após a ingestão; c) paralarvas

amostradas após a 1º, 2º e 3º hora após terem capturado a primeira presa (n=2 para cada

hora). Para estas amostragens as paralarvas foram selecionadas imediatamente após a

oferta de presas. Para tal, seguiu-se o seguinte procedimento, quando uma paralarva era

observada capturando uma presa, a mesma era cuidadosamente retirada do tanque de

cultivo em um recipiente de vidro, onde a mesma podia ser observada separadamente

até a completa ingestão da presa. No tratamento alimentado as amostragens seguiram

até o dia 8, momento em que se observou grande taxa de mortalidade. Para o tratamento

em inanição as amostragens seguiram até o quarto dia.

As amostras foram fixadas em solução Alfac (85 partes de álcool etílico 80%, 10

partes de formaldeído 40% e cinco partes de ácido acético glacial) e decorridas

aproximadamente 30 h de fixação, os exemplares foram transferidos para etanol a 70%.

O processamento histológico seguiu a rotina clássica de desidratação em série alcoólica

crescente, diafanização em xilol, impregnação/emblocamento em parafina, obtenção de

cortes com cerca de 5 μm através de microtomia, hidratação progressiva, coloração por

Hematoxilina de Harris e Eosina (HE), desidratação e montagem sob lamínula. A

glândula digestiva foi eleita alvo das análises devido a sua importância nos processos de

digestão e absorção de nutrientes.

59

RESULTADOS

Variáveis morfométricas

O experimento foi conduzido até o 5º dia após a eclosão (Dia 4), momento em

que a mortalidade do tratamento de paralarvas em inanição ultrapassou 80%. Os dados

morfométricos se encontram sintetizados na Tabela 1.

Tabela 1: Octopus vulgaris. Características morfométricas das paralarvas durante os

primeiros dias após a eclosão.

Dia 0 Dia 2 Dia 4

Inanição Alimentadas Inanição Alimentadas

Sobrevivência (%) 100 81 (77-89) 95(91-100) 16 (7-22) 67 (57-77)

Comprimento total

(mm)

2,79±0.08 2,83±0.12 2,99±0.15 2,90±0,36* 3,36±0,22

Comprimento do

manto (mm)

1,90 ± 0,06 1,86±0,11 2,05±0,11 2,05±0,28* 2,29±0,15

Comprimento do 4°

par de braços (mm)

0,88±0,04 0,97±0,05 0,93±0,06 0,85±0,10* 1,07±0,10

Peso seco (mg) 0,15±0.04 - - 0,14±0,08 0,17±0,05

Peso do vitelo (mg) 0,054±0,009 0,005±0,002* 0,01±0,003 0 0

*Diferença significativa para p<0,05

A média de sobrevivência para as réplicas do tratamento alimentado no Dia 4 foi

de 67%. Para os indivíduos mantidos em inanição a sobrevivência foi de 16% ao final

do Dia 4, o que decretou o final do experimento.

O comprimento médio total no Dia 4 foi de 3,36 mm ± 0,22 e 2,90 mm ± 0,36

para paralarvas alimentadas e em inanição, respectivamente (t= 3,87 gl=23; p<0,05)

apresentando diferença significativa entre os tratamentos.

O comprimento médio do manto no Dia 4 foi de 2,29 mm ± 0,15 e 2,05 mm ±

0,28 para paralarvas alimentadas e em inanição. Observou-se uma leve diminuição no

comprimento do manto após o primeiro de vida após a eclosão, seguida de uma

tendência de valores maiores para paralarvas alimentadas, observando-se diferença

significativa entre os tratamentos (t= 2,69; gl=23; p<0,05) (tabela 1).

60

O comprimento médio do 4° par de braços foi de 0,70 mm ± 0,03 para ambos os

tratamentos no Dia 0 e no Dia 4 foi de 1,07 mm ± 0,10 e 0,85 mm ± 0,13 para

paralarvas alimentadas e em inanição (t= 5,20; gl=23; p<0,05), apresentando diferença

significativa entre os tratamentos.

O peso seco médio em paralarvas de ambos os tratamentos não mostraram

diferenças significativas (p>0,05), com média inicial de 0,15 mg ± 0,04 para o Dia 0 e

de 0,14± 0,08 mg e 0,17± 0,05 mg no dia 4 para os tratamentos inanição e alimentados,

respectivamente.

Figura 2: O. vulgaris. A) Comprimento total, B) comprimento do manto de paralarvas

alimentadas e em inanição. A idade expressa os dias após a eclosão e os valores são a

média de 63-68 paralarvas ± DP. Maioria das paralarvas em inanição morreu no Dia 4.

y = 2.72e0.05x

R² = 0.93

y = 2.77e0.02x

R² = 0.43

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 1 2 3 4

Co

mp

rim

en

to t

ota

l (m

m)

Idade (dias)

Alimentadas

Inanição

A

y = 1.85e0.05x

R² = 0.91

y = 1.82e0.03x

R² = 0.53

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 1 2 3 4

Co

mp

rim

en

to d

o m

an

to (

mm

)

Idade (dias)

Alimentadas

Inanição

B

61

Absorção de vitelo

O maior percentual de vitelo foi absorvido entre os dias 0 e 2 em ambos os

tratamentos (Figura 3). Diferenças significativas nos valores estimados de vitelo entre

os tratamentos foram observados nos dias 1, 2 e 3 entre os tratamentos (p<0,05) e não

houve diferenças no dia 4 (p>0,05). As taxas de utilização de vitelo diárias expressas

pelo declive da função exponencial entre o peso do vitelo e a idade foram de 88% para o

grupo alimentado e 100% para o grupo em inanição. Isso significa que a cada 24 h, 88%

da reserva vitelínica foram utilizadas pelas paralarvas alimentadas e praticamente 100%

pelas paralarvas em inanição, assim, no segundo dia após a eclosão, a taxa de utilização

do vitelo restante foi de novamente 88% para paralarvas alimentadas e praticamente

100% para as paralarvas em inanição e assim sucessivamente até o Dia 4, onde toda a

reserva vitelínica havia sido consumida.

As paralarvas do tratamento em inanição utilizaram o vitelo a maiores taxas que

as paralarvas do tratamento alimentado. Apesar da maioria das paralarvas não

apresentarem mais vitelo no 4º dia após a eclosão, em alguns indivíduos ainda era

possível observar resquícios do saco vitelínico, no entanto não apresentou diferença

significativa entre os tratamentos.

Em termos de peso do vitelo tem-se que 0,019 mg de vitelo foram consumidos

pelas paralarvas alimentadas e 0,033 mg pelas paralarvas em inanição ao fim das

primeiras 24 h. No dia 3 somente havia 0,004 mg e 0,0015 mg de vitelo remanescente

nas paralarvas alimentadas e em inanição, respectivamente. No dia 4, a maioria das

paralarvas já não apresentava mais vitelo, no entanto ainda era possível observar

resquícios do saco vitelínico em alguns indivíduos.

62

Figura 3: O. vulgaris. Taxa de utilização de vitelo (mg), em paralarvas alimentadas e em

inanição nos primeiros dias pós eclosão. A idade expressa os dias após a eclosão e os

valores são a média de 16-38 paralarvas. Para as paralarvas em inanição uma taxa de

mortalidade de 86% foi registrada no Dia 4.

Caracterização histológica:

Paralarvas recém eclodidas alimentadas e em inanição

Em paralarvas recém eclodidas verificou-se que a glândula digestiva é envolta

por tecido conjuntivo que por seu caráter acidófilo possui coloração rosada. Este a

separa do saco vitelínico interno, da glândula salivar posterior, do saco de tinta e dos

outros órgãos presentes na cavidade do manto. A glândula digestiva possui formato

globular e é composta por ácinos tubulares onde se pode observar a presença de dois

tipos celulares principais, a) células de digestão e b) vacúolos digestivos. É possível

também visualizar uma secreção enzimática preenchendo a luz do lúmen da glândula

digestiva (Figura 4 e 5).

y = 0.06e-0.88x

R² = 0.98

y = 0.05e-1.07x

R² = 0.98

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0 1 2 3 4 5

Pe

so d

o v

ite

lo (

mg

)

Idade (dias)

Alimentadas

Inanição

63

Figura 4: O. vulgaris. A) Paralarva recém-eclodida (Dia 0); B) Glândula digestiva e

saco vitelínico interno; C) Detalhe da glândula digestiva. m: manto, br: braços, v:

ventosa, cm: cavidade do manto, e: estatólitos, gd: glândula digestiva, svi: saco

vitelínico interno, f: funil, b: bico, mc: massa cerebral; tc: tecido conjuntivo; svi: saco

vitelínico interno; gsp: glândula salivar posterior; se: secreção enzimática e st: saco de

tinta.

64

Figura 5: O. vulgaris. Tipos celulares identificados na glândula digestiva das paralarvas.

lb: lâmina basal; cd: células digestivas, vd: vacúolos de digestão; se: secreção

enzimática.

Após a eclosão, quando ainda há a presença do saco vitelínico interno, as

paralarvas apresentam a glândula digestiva repleta de vacúolos digestivos e uma

quantidade menor de células de digestão, as quais estão localizadas principalmente

sobre a lâmina basal (Figura 4 e 5). As células de digestão são granulares e amorfas e

possuem um tamanho médio de 4,4 µm. Os vacúolos de digestão têm forma esférica

variando a trapezoidal e seu tamanho pode variar de 9 a 19 µm dentro de um mesmo

indivíduo.

As paralarvas fixadas logo após a primeira alimentação, isto é, logo após

haverem ingerido a primeira presa, não mostraram diferença na composição da glândula

digestiva e proporção celular quando comparadas com paralarvas recém-eclodidas

mantidas somente com suas reservas vitelínicas e sem alimento (Figura 6).

65

Figura 6: O. vulgaris. Paralarva de recém eclodida fixada logo após capturar e ingerir a

1°presa, preenchida pelos vacúolos de digestão (vd), com a presença das células de

digestão (cd), glândula salivar posterior (gsp) e do saco de tinta (st).

No segundo dia após a eclosão a absorção das reservas vitelínicas é quase

completa, havendo forte diminuição na quantidade de vacúolos digestivos,

principalmente nas paralarvas mantidas em inanição. No terceiro dia em diante as

paralarvas em inanição mostraram células de digestão, no entanto pouquíssimos

vacúolos, sugerindo que ao não haver alimento há a extinção quase que total dos

vacúolos abundando as células digestivas sobre a lâmina basal (Figura 7).

Nas paralarvas alimentadas foi registrada a maior presença de vacúolos até o 8°

dia (Figura 8), no entanto não em todos os exemplares, sugerindo que mesmo com a

presença de alimento, alguns indivíduos estavam sofrendo de inanição.

A maior presença de um ou outro tipo célula parece estar relacionada ao

processo de alimentação, já que há variação na abundância de tipos celulares em

indivíduos da mesma idade. As células de digestão parecem ser produzidas através da

lâmina basal que na presença de alimento abunda de vacúolos de digestão que secretam

enzimas na luz do lúmen dos túbulos digestivos.

66

Figura 7: O. vulgaris. Detalhe da glândula digestiva: A) paralarva em inanição (Dia 3) e

B) paralarva alimentada (Dia 3). cd: células digestivas; vd: vacúolos digestivos; lb:

lâmina basal; l: lúmen; se: secreção enzimática.

A glândula digestiva não mostrou diferença na estrutura citológica entre

paralarvas alimentadas e não alimentadas, porém apresentou diferenças na proporção de

células digestivas e ou vacúolos digestivos (Figura 7 e 8). Cabe resaltar que após a total

67

absorção do saco vitelínico interno as paralarvas em inanição apresentaram maior

quantidade de células de digestão e poucos vacúolos digestivos, os quais foram mais

abundantes em paralarvas alimentadas. No entanto, em paralarvas alimentadas também

foi observado grande quantidade de células digestivas e menor quantidade de vacúolos

de excreção, sugerindo que a abundância de vacúolos digestivos esteja associada à

ingestão de alimento. Portanto, é possível que a maior ou menor quantidade de vacúolos

digestivos tenha uma produção cíclica dentro do processo de digestão e excreção. Outro

aspecto observado foi que as paralarvas em inanição apresentaram o lúmen quase

sempre vazio, diferente das paralarvas alimentadas que podiam apresentar o túbulo do

lúmen preenchido de secreções enzimáticas ou vazio em alguns momentos.

Figura 8: O. vulgaris. A) paralarva em inanição (Dia 5) e B) paralarva alimentada (Dia

8). cd: células digestivas; vc: vacúolos digestivos; st: saco de tinta; m: manto; cm:

cavidade do manto; c: ceco e tc: tecido conjuntivo.

Características da glândula digestiva de paralarvas durante o desenvolvimento

planctônico

Durante o desenvolvimento planctônico a glândula digestiva é o órgão que

ocupa a maior proporção da cavidade do manto em todas as idades. Através da análise

histológica não se observou a formação ou diferenciação de novos tecidos e tampouco

diferentes tipos de células na glândula digestivas durante a fase planctônica. Os mesmos

tipos de células observados em paralarvas recém eclodidas foram encontrados em

paralarvas de diferentes idades ao longo do desenvolvimento planctônico (Figura 9).

68

Não houve mudanças na composição estrutural interna da glândula digestiva,

sendo que a lâmina basal, as células digestivas e vacúolos de digestão possuíam

tamanho similar em paralarvas mais velhas quando comparados com as paralarvas

recém eclodidas, notando-se somente o alargamento da luz do lúmen em paralarvas

maiores.

Figura 9: O. vulgaris. Vista em detalhe da glândula digestiva das paralarvas de O.

vulgaris com A) 22; B) 35dias; C) 41 dias e D) 45 dias após a eclosão. vd: vacúolos

digestivos; cd: células digestivas; lb: lâmina basal; se: secreção enzimática; gsp:

glândula salivar posterior; st: saco de tinta e tc: tecido conjuntivo.

No decorrer do desenvolvimento pode ser observada uma alternância nos tipos

de célula, podendo haver a presença massiva de vacúolos de digestão ou abundancia de

células digestivas, sugerindo que a composição celular da glândula digestiva está

associada ao ato de se alimentar e não com a idade do animal. Em amostras da mesma

idade observou-se tanto paralarvas com presença massiva de vacúolos de digestão,

como também paralarvas com abundancia de células digestivas (Figura 10), reforçando

69

a hipótese de haver um ciclo citológico na glândula digestiva, este independente da

idade.

Figura 10: O. vulgaris. Paralarvas com 31 dias após a eclosão); A) detalhe da glândula

com maior presença de vacúolos de digestão e B) detalhe da glândula digestiva com

maior presença de células de digestão. vd: vacúolos digestivos; cd: células digestivas;

lb: lâmina basal; l: lúmen e st: saco de tinta.

DISCUSSÃO

Os resultados demonstraram que há uma leve diminuição do comprimento do

manto e comprimento total logo após o primeiro dia de vida, fato que ocorreu em ambos

os tratamentos. Deste modo, a reserva vitelínica que nesse momento ocupa grande parte

da cavidade do manto é utilizada para manter o metabolismo basal e a atividade das

paralarvas. A reserva vitelínica foi praticamente toda consumida, em ambos os

tratamentos, nos dois primeiros dias após a eclosão. Após a eclosão, o saco vitelínico

interno ocupa um grande volume na cavidade do manto e pode haver uma compactação

dos órgãos e tecidos, esse fato poderia explicar o porquê da diminuição dos

comprimentos de manto para ambos os tratamentos no primeiro dia. Boletzky (1974)

comenta que durante o desenvolvimento pós-embrionário dos cefalópodes ocorrem

mudanças significantes na proporção corporal. A energia disponibilizada pelo saco

vitelínico consumido parece refletir no leve crescimento do manto, observado em ambos

os tratamentos no Dia 3. Resultados semelhantes foram registrados por outros autores

(BOUCHER-RODONI et al. 1987; VIDAL et al. 2002; MOGUEL et al. 2010) para

cefalópodes. Após as primeiras 48 horas há a recuperação do animal em tamanho em

70

ambos os tratamentos. No entanto, no Dia 4 a energia disponibilizada pelo alimento

oferecido, parece haver contribuído para que as paralarvas alimentadas apresentassem

maior crescimento do que as paralarvas em inanição.

A transição alimentar endógena para exógena acarreta altas taxas de mortalidade

(VECHIONE, 1987; BOLETZKY, 1989; VIDAL et al. 2002; VIDAL & BOLETZKY,

2014), atribuída principalmente à inabilidade das paralarvas em capturar presas na

quantidade e qualidade suficiente para manterem os seus altos requerimentos

metabólicos (VIDAL et al. 2002).

Apesar da maioria das paralarvas não apresentarem mais vitelo no 3º dia pós-

eclosão, em alguns indivíduos alimentados ainda era possível observar visualmente

resquícios do saco vitelínico. Observou-se que em paralarvas em inanição houve uma

tendência de consumo do vitelo mais rápido, fato este que pode ter sido influenciado

pela possível ingestão de presa pelas paralarvas alimentadas, fazendo com que estas

aproveitem parte dos nutrientes da presa mantendo por algum tempo mais a sua reserva

vitelínica. Observamos diferença significativa entre o volume e peso de vitelo durante

primeiras 72 h após a eclosão, com as paralarvas em inanição mostrando uma tendência

ao consumo mais rápido do vitelo. VIDAL et al. (2002) também observou que o

consumo de vitelo foi maior em paralarvas de lulas mantidas em inanição, sugerindo

que a ingestão de alimento poderia influenciar a taxa de absorção de vitelo.

Um aspecto que é evidente no desenvolvimento inicial das paralarvas é a

variabilidade morfométrica individual que ocorre entre paralarvas de mesma idade de

eclosão e provenientes da mesma fêmea. Há uma tendência ao aumento da variabilidade

dos dados morfométricos mensuradas no decorrer dos dias, sendo que as paralarvas em

geral apresentaram maior desvio padrão das variáveis morfométricas nos últimos dias

de experimento. O desenvolvimento desigual é observado em diversos organismos

aquáticos cultivados, assim como também em cefalópodes (FORSYTHE & HANLON,

1988; VILLANUEVA, 1995; MOGUEL et al. 2010) durante todo o ciclo de vida. Esta

variabilidade pode estar relacionada a fatores não completamente conhecidos como a

disposição do ovo nos cachos em relação à disponibilidade de oxigênio e nutrientes,

influencia genética, nutrição inicial da paralarva, dominância, dentre outros (IGLESIAS

et al. 2007).

A glândula digestiva foi escolhida como alvo do presente estudo, pois segundo

Boucau-Camoud et al. (1985) é o único órgão digestivo a não estar totalmente

desenvolvido após a eclosão. No entanto, Boletzky (1989) comenta que a paralarva

71

recém eclodida é um cefalópode completo em miniatura, com o tubo digestivo

completamente formado e a boca já aberta e com uma reserva em seu saco vitelínico

interno que vai sendo absorvida em paralelo com a digestão de presas capturadas

ativamente. Estas sugestões foram confirmadas no presente estudo, onde foi possível

observar a presença dos órgãos relacionados à digestão já nas paralarvas recém

eclodidas e também durante o desenvolvimento planctônico.

Foi possível observar também as transformações que ocorrem na glândula

digestiva após a captura e ingestão de presas quando o processo de absorção de vitelo

ainda estava em andamento. Ao eclodir observou- se em ambos os tratamentos a

presença do saco vitelínico interno, este separado da glândula digestiva por uma lâmina

de tecido conjuntivo, estrutura também observada em outros cefalópodes por outros

autores (BOLETZKY, 1975; VILLANUEVA & NORMAN, 2008; MOGUEL et al.

2010). A glândula digestiva apresentou no seu interior, células comuns a todas as idades

e tratamentos. As células digestivas podem apresentar-se de duas formas: como células

de digestão e os vacúolos de excreção (BOUCHER-RODONI, 1982), aqui chamadas de

vacúolos de digestão. O que se diferencia entre as paralarvas em inanição e alimentadas

é a maior presença de vacúolos digestivos nas últimas. Por outro lado, paralarvas em

inanição apresentam uma grande quantidade de células de digestão. A morfologia do

órgão não se diferenciou entre os tratamentos sendo formado por lâmina basal que

parece ser a base de produção das células de digestão. Estudos realizados com o polvo

O. maya até os 45 dias após a eclosão mostram o espessamento da lâmina basal, como

também o aumento da quantidade de vacúolos digestivos no decorrer do

desenvolvimento (MOGUEL et al. 2010).

No presente estudo, as paralarvas com até 3 dias de idade mostram a presença de

vacúolos digestivos, sugerindo que os mesmos podem estar relacionados a assimilação e

digestão da reserva vitelínica. Alguns autores relacionaram a baixa quantidade de

vacúolos digestivos na fase pós-eclosão ao fato da glândula digestiva ainda não estar

suficiente madura ou totalmente formada e provavelmente com sua capacidade digestiva

limitada (BOUCAUD-CAMOU & YIM, 1980; VECCHIONE & HAND, 1989;

MOGUEL et al. 2010). No entanto, no presente estudo observou-se a presença de

vacúolos digestivos logo após a eclosão, como também durante todo o desenvolvimento

planctônico, demonstrando que as paralarvas de O. vulgaris já possui uma capacidade

digestiva funcional e ativa, no que diz respeito aos processos de absorção e excreção de

nutrientes e metabólitos, respectivamente.

72

Nossos resultados mostraram também que paralarvas mantidas em inanição

apresentaram ampla luz do lúmen com ausência de secreção enzimática e baixa

presença de vacúolos de digestão. Vecchione & Hand (1989) comentam que animais

submetidos à inanição ou má alimentação, a glândula digestiva possui ampla luz e finas

paredes nos seus túbulos. Este fato foi observado tanto nas paralarvas mantidas em

inanição, como em parte das paralarvas alimentadas que possivelmente, mesmo com a

presença de alimento, estavam sofrendo de inanição.

Nesta fase ocorre uma alta mortalidade e mesmo quando se oferece alimento

para as paralarvas (tratamento alimentado), boa parte delas não inicia a alimentação por

não conseguir capturar presas. A inabilidade das paralarvas na captura do alimento

aliada à necessidade constante de energia para manter o seu alto metabolismo, faz com

que boa parte das paralarvas morra de inanição quando suas reservas de vitelo se

esgotam.

Em paralarvas da mesma idade se observou indivíduos com a maior presença de

células digestivas e outros com a maior presença de vacúolos de digestão, reforçando a

hipótese de haver um ciclo citológico na glândula digestiva, o qual parece ser

independente da idade. Uma alternância natural no tipo de células digestivas pode estar

associada ao processo digestivo e não propriamente com o desenvolvimento da

paralarva.

A fase planctônica dos polvos pode durar entre 30 e 70 dias, dependendo da

temperatura (VILLANUEVA, 1995; NIXON & MANGOLD, 1996; MOXICA et al.

2002; IGLESIAS et al. 2004). Após este período ocorre o assentamento e os pequenos

polvos assumem o hábito bentônico (NIXON & MANGOLD, 1996; VILLANUEVA &

NORMAN, 2008). Este é considerado o segundo momento mais crítico dentro do ciclo

de vida dos polvos devido à drástica mudança de comportamento que acarreta em altas

taxas de mortalidade (VILLANUEVA, 1995; IGLESIAS et al. 2007; VIDAL et al.

2014). Nixon & Mangold (1996) sugerem que as alterações que ocorrem nos órgãos e

na morfologia dos animais durante a fase planctônica são consequência das mudanças

comportamentais dos animais, os quais precisam se adaptar às diferentes presas que irão

encontrar ao assumir o habito bentônico. A presença das células e vacúolos digestivos

está relacionada à síntese enzimática e à excreção de metabólitos (BOUCAUD-

CAMOU et al. 1976; BOUCAUD-CAMOU & BOUCHER-RODONI, 1983). O

processo de alimentação e inanição influencia diretamente no processo de excreção de

amônia (BOUCHER-RODONI & MANGOLD, 1985) sendo assim, o momento de

73

alimentação terá influência direta sobre os tipos de células encontradas na glândula

digestiva, sendo que antes da ingestão se observa uma grande quantidade de células

digestivas e após a ingestão um aumento na quantidade de vacúolos de digestão. As

diferentes formas celulares parecem ser estágios funcionais de um único tipo de célula,

as células digestivas (YIM & BOUCAUD-CAMOU, 1980; BOUCHER-RODONI,

1981). As células digestivas maduras são caracterizadas pelas células digestivas e pela

frequente ocorrência das células dos “Brown bodies”, estes grande massa contendo

cristais, frequentemente incluído no vacúolo (BOUCAUD-CAMOU & BOUCHER-

RODONI, 1983).

No decorrer do desenvolvimento planctônico não se observou diferença no

tamanho das células e tampouco no tamanho dos vacúolos digestivos quando

comparado às paralarvas recém eclodidas. Segundo Boucaud-Camou & Boucher-

Rodoni (1983) o bolo alimentar é liberado para o intestino, entrando em contato com a

glândula digestiva, ocorrendo a fase de absorção. Neste momento os vacúolos

digestivos que portam a secreção enzimática, aumentam em número, com flutuações

devidas principalmente, ao estímulo para liberação da enzima digestiva (BOUCHER-

RODONI & MANGOLD, 1977) causado pela alimentação. Estas enzimas podem ser

produzidas pela fragmentação dos vacúolos e em seguida sofrer exocitose (YIM &

BOUCAUD-CAMOU, 1980).

A nutrição das paralarvas é apontada como uma das maiores responsáveis pela

alta mortalidade neste período (VAZ-PIRES et al. 2004; IGLESIAS et al. 2007). A

nutrição inadequada ou carência de nutrientes pode afetar a composição celular da

glândula digestiva e a composição da dieta pode influenciar na quantidade de células

específicas na glândula digestiva, fato observado nas paralarvas mantidas em inanição.

Neste estudo pudemos observar que a transição alimentar ocorre principalmente

durante os 3 primeiros dias, sendo que o consumo do vitelo ocorre principalmente nos 2

primeiros dias após a eclosão, de acordo com a temperatura em que as paralarvas foram

expostas (24 °C). O ciclo citológico na glândula digestiva esteve relacionado ao ato de

se alimentar parecendo ser independente da idade.

74

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78

Capítulo III - Efeito de dieta alimentar micro-encapsulada com quitosano no

crescimento e sobrevivência de paralarvas do polvo comum (Octopus vulgaris)

utilizando marcadores de ingestão

Resumo: O cultivo do polvo comum Octopus vulgaris (Cuvier, 1797) é promissor, no

entanto, esbarra na inexistência de formas jovens devido à alta mortalidade que ocorre

na fase inicial de vida. A formulação de dietas inertes para paralarvas e a busca por

formas mais eficientes de elaboração de micro partículas tem sido um desafio para

diminuir a mortalidade após a eclosão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da

microdieta encapsulada com polímero natural (quitosano) no crescimento e

sobrevivência das paralarvas de polvo, assim como avaliar a viabilidade do uso das

fluoesferas como marcadores de ingestão. A partir da desova, dois experimentos

similares foram realizados distribuindo as paralarvas em dois tratamentos: o ‘controle’,

mantidos somente com náuplius de artêmia enriquecido e o ‘dieta’, mantidos com

náuplius de artêmia enriquecido co-alimentados com dieta inerte microencapsulada com

quitosano e enriquecida com fluoesferas, havendo três réplicas por tratamento. Nos dias

0, 10 e 15 foram amostrados 15 paralarvas de cada tratamento para estimar o

comprimento ventral do manto e o peso seco e ao final do experimento estimar a razão

de crescimento, a prevalência de ingestão e a sobrevivência. A dieta foi ingerida por

15% das paralarvas, com as fluoesferas mostrando-se uma ferramenta viável como

marcadores de ingestão em cefalópodes. A dieta inerte encapsulada com quitosano não

mostrou eficiência para promover maior crescimento e sobrêvivencia das paralarvas nas

condições aqui apresentadas, não mostrando diferença significativa entre os

tratamentos. As propriedades físicas das partículas se mostraram inadequadas para esta

espécie, sendo necessário aprimorar sua composição e aceitabilidade, adequando sua

flutuabilidade ao comportamento alimentar das paralarvas.

Palavras-chave: paralarva, dieta artificial, quitosano, Octopus.

79

INTRODUÇÃO

O grande interesse no cultivo do polvo comum Octopus vulgaris (Cuvier, 1797)

é justificado devido às características biológicas da espécie; ampla distribuição

geográfica, boa adaptação ao cativeiro, alta fecundidade, aceitação de alimento

congelado, altas taxas de crescimento e elevado valor de mercado (GARCÍA-GRACÍA

& AGUADO, 2002; IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004). No entanto, o

cultivo integral do polvo em nível comercial é uma realidade ainda não alcançada,

devido principalmente à inexistência na suplementação de formas jovens (VIDAL et al.

2014).

Segundo a revisão de Iglesias et al. (2007) o principal problema para o

desenvolvimento integral do cultivo de polvos é a elevada mortalidade observada

durante o cultivo das paralarvas. Grande esforço tem sido realizado para solucionar este

entrave (IMAMURA, 1990; HAMAZAKI et al. 1991; VILLANUEVA, 1995;

IGLESIAS et al. 2000; MOXICA et al. 2002; OKAMURA, 2005; CARRASCO et al.

2006; IZQUIERDO et al. 2008, SEIXAS et al. 2010) havendo um consenso entre os

pesquisadores que a solução está fundamentada nos aspectos nutricionais das presas

nesta fase do desenvolvimento (IGLESIAS et al. 2007).

Até o presente momento foi possível fechar o ciclo de cultivo de polvos em

laboratório uma única vez (IGLESIAS et al. 2004). Este estudo demonstrou a

viabilidade do uso de zoeas e Artemia adultas enriquecidas durante a fase planctônica.

Alguns grupos de pesquisadores conseguiram juvenis bentônicos em laboratório

(IMAMURA, 1990; HAMAZAKI et al. 1991), porém não tem sido possível repetir o

fato fundamentando-se na metodologia descrita por eles. Outros autores também

conseguiram juvenis bentônicos com a utilização de diferentes presas como zoeas de

diferentes crustáceos decápodos e Artemia enriquecida com microalgas complementada

com zoeas do caranguejo Maja brachydactyla (VILLANUEVA, 1994; 1995;

CARRASCO et al. 2003; IGLESIAS et al. 2004).

O uso de Artemia é importante para o cultivo larvário de polvo, pois é um

crustáceo fácil de produzir, os náuplius e metanáuplios se desenvolvem bastante rápido

(24-72 h) e é possível variar a sua composição bioquímica por meio de enriquecimento

(SEIXAS, 2009). Durante os primeiros dias de vida da paralarva, a artêmia enriquecida

costuma ser um bom alimento para sustentar suas altas taxas metabólicas, no entanto

80

depois dos primeiros 14 dias, seu conteúdo nutricional parece não mais suprir as

necessidades das paralarvas (VILLANUEVA et al. 2002). Neste momento, a utilização

de zoeas de crustáceos como dieta complementar seria a melhor alternativa para

oferecer os nutrientes requeridos pelas paralarvas (IGLESIAS et al. 2007). Porém, a

dificuldade de controlar as quantidades assim como os momentos exatos para a

obtenção das zoeas, faz que esta prática seja muito custosa e incerta (NAVARRO &

VILLANUEVA, 2000).

Uma forma de substituir o alimento vivo seria a formulação de dietas artificiais.

As dietas balanceadas direcionadas aos requerimentos nutricionais das paralarvas são

imprescindíveis para alcançar o sucesso em escala comercial, baixando os custos de

produção e fornecendo os nutrientes basais e de crescimento. Em larvas de peixes, as

dietas são uma realidade para várias espécies (HOLT, 1993; CAHU et al. 1998;

SOUTHGATE & PARTRIDE, 1998; TAKEUCHI, 2001). Para paralarvas de polvo

algumas tentativas de subministração de dietas formuladas não tiveram muito sucesso

(VILLANUEVA et al. 2002; NAVARRO & VILLANUEVA, 2000), pois mesmo as

micro dietas sendo ativamente atacadas e ingeridas pelas paralarvas não resultaram em

crescimento e sobrevivência satisfatória. Segundo Villanueva et al. (2002), isso pode

ser resultado da adaptação enzimática para um substrato nutricional específico ou

indicar desnutrição induzida pela formulação inadequada da micro dieta.

Navarro e Villanueva (2000) destacam que paralarvas nas fases iniciais de vida

necessitam alimentos ricos em ácidos graxos polinsaturados (PUFA), fosfolipídeos e

colesterol, além de lipídeos neutros. Seixas et al. (2010) demonstrou no seu trabalho

que a relação proteína/lipídeos na dieta é mais importante que a quantidade de ácidos

graxos altamente insaturados (HUFA) para a sobrevivência e crescimento. Estas

informações são imprescindíveis para a formulação de dietas inerte que possam suprir

as necessidades nutricionais das paralarvas. No entanto, alguns outros aspectos internos

e externos devem ser considerados, pois podem afetar a eficiência da utilização da

partícula alimentar inerte em larvas marinhas. A busca, identificação e ingestão são

influenciadas por fatores físicos e químicos como a cor, forma, tamanho, movimento e

estimulo olfativo a nível celular (KOLKOVSKI, 2008). As paralarvas de polvo são

predadores visuais, mas certamente os estímulos táteis e químicos influenciam na caça,

seleção e ingestão da presa (VILLANUEVA & NORMAN, 2008). Desta forma, estes

aspectos devem ser considerados na elaboração da dieta, buscando alguma forma de

qualificar e quantificar a seleção e ingestão do alimento oferecido.

81

O uso de microesferas fluorescente pode ser uma ferramenta interessante que

poderia ajudar a avaliar a seleção e ingestão de presas de paralarvas de polvo por meio

da sua visualização através de microscópio de fluorescência ou em espectrofotômetro de

fluxo. Até o momento, esta técnica nunca havia sido utilizada com cefalópodes, porém

já foi testado com sucesso em larvas de peixes marinhos e segundo Hansen et al. (2008)

pode ser adaptadas a diferentes áreas da nutrição larval, seleção e ingestão de presas.

Outro desafio na formulação de dietas inertes para paralarvas de polvo é a busca

por formas mais eficientes de elaboração de micro cápsulas. Partículas alimentares

foram testadas usando o processo de gelificação-coacervação por Villanueva et al.

(2002), com a produção de partículas ovaladas com tamanho em torno de 1.3-2.0mm.

Os autores observaram a captura e ingestão da dieta, mas quando comparado às

paralarvas alimentadas somente com Artemia enriquecida, não houve diferencia

significativa no crescimento.

O quitosano é um polissacarídeo natural derivado da quitina, que possui como

fonte principal carapaças de camarões, lagostas e caranguejos (JOHNSON &

PENISTON, 1982). Recentemente é usado para encapsular componentes ativos devido

a não ser tóxico, ser biodegradável, biocompatível e atuar como indutor do sistema

imune. Sua composição natural pode ser testada como encapsulador da dieta a ser

testada por meio da formação de grãos de quitosano.

Neste contexto, este estudo tem como objetivos: 1) Avaliar o efeito da

microdieta encapsulada com polímero natural (quitosano) no crescimento e

sobrevivência de paralarvas de polvo comum (Octopus vulgaris), assim como 2) avaliar

a viabilidade do uso das fluoesferas como marcadores de ingestão para paralarvas de

polvo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Formação e distribuição do tamanho das partículas alimentares

O alimento inerte oferecido às paralarvas consistiu de uma dieta produzida

através do método de gelificação iônica (DELGADO, 2009), o qual entrecruza o gel de

quitosano aos ingredientes, formando as partículas alimentares. A composição da dieta

foi de 0,47 g de carne de lula liofilizada (Doryteuthis opalescens), 0,47 g de carne de

caranguejo liofilizado (Portunus validus), 11,2 mg de microalga liofilizada

82

(Nannochloropsisis sp.), 16,1 mg de ácido ascórbico em pó e 12000 fluoesferas

(FluoSpheres®Molecular Probes®Polystyrene Micrrospheres, 10 µm, blue fluorescent

(365/415)), estes entrecruzados em 2% de gel de quitosano (ALDRICH®), produzindo

um grama de dieta inerte.

A distribuição do tamanho da dieta foi amostrada a partir de um total de 90

partículas. Estas foram confeccionadas e congeladas, posteriormente foram liofilizadas,

e mantidas em refrigeração para posterior análise em microscópio de luz (LEICA

DM4000B) com câmera digital acoplada (LEICA DFC300 FX). Através das fotografias

e com uso de software de imagens (Leica Q-win V3 Pro-image Analysis System), o

diâmetro das partículas foi medido antes e depois do processo de liofilização.

Taxa de incorporação das fluoesferas na dieta

Para avaliar a quantidade de fluoesferas incorporadas na dieta inerte, o

recipiente comercial foi agitado em vórtex por 10 segundos e então coletadas 3 amostras

de 2 µL. Após a produção das partículas alimentares foram coletadas da solução de

entre cruzamento 3 amostras de 1 mL sob agitação magnética (IKA-WERK®) a 500

rpm. A taxa de incorporação foi a diferencia entre a quantidade total de fluoesferas

adicionada à dieta menos a quantidade residual de fluoesferas na solução de entre

cruzamento. As amostras foram divididas em alíquotas e quantificadas em câmara de

contagem de Neubauer.

Teste de flutuabilidade das partículas

Um total de 90 partículas foi distribuído em dez recipientes de 50 ml contendo

água salgada na salinidade de 35. Após 48 h registraram-se a quantidade de partículas

que se mantiveram flutuando e quantas afundaram.

Octopus vulgaris reprodutores e ovos

Os reprodutores de Octopus vulgaris foram capturados individualmente por

pescadores artesanais profissionais na costa de Tenerife (Ilhas Canárias, Espanha).

Indivíduos com peso médio de 1309±503 g, foram mantidos em tanques circulares de

fibra de 1000 L com fluxo contínuo de água do mar, sob fotoperíodo natural (12 luz: 12

83

escuridão), temperatura da água de 23±2°C e salinidade de 36,8±0,14. A temperatura foi

medida com um Tinytag Plus 2 (TGP-4020; Gemini Data Loggers Ltd.) e a salinidade

com um refratômetro S/Mill-E (ATAGO). Três polvos com peso médio similar foram

colocados em cada tanque (2♀ : 1♂), os quais continham dois potes por polvo como

abrigo para evitar competição. Os indivíduos foram alimentados ad libitum com lulas

congeladas (Doryteuthis opalescens). Semanalmente foi verificada se havia a presença

de ovos e ao constata-los, a fêmea era mantida sozinha através da retirada dos outros

polvos.

Protocolo experimental

Foram realizados dois experimentos utilizando duas desovas de diferentes

fêmeas. No primeiro experimento as paralarvas recém eclodidas tiveram média de

1,56±0,05 mm de comprimento ventral do manto (CVM) e 0,21±0,02 mg de peso seco.

No segundo experimento as paralarvas recém eclodidas tiveram média de 2,03±0,07 de

CVM e peso seco médio de 0,22±0,02 mg. Para ambos os experimentos utilizou-se uma

densidade de 1 paralarvas/L em 6 tanques de fibra cilíndricos cônicos de 100 L (52 cm

de diâmetro e 56 cm de altura) com fluxo de água do mar entrando através de um anel

circular posicionado na borda superior. A vazão de renovação de água foi 504%/dia,

acionada das 18 h às 8 h da manhã. Os tanques foram mantidos em intensidade

luminosa de 500-700 lux (provido por uma lâmpada incandescente de 21 W) e um

fotoperíodo de 12L:12E (luz das 8:00 a.m. a 8:00 p.m.). Antes de povoar os tanques

com as paralarvas foram inseridos 16000 copépodes (Tisbe sp.) em todas as réplicas.

Diariamente, no período da manhã, microalgas Nannochloropsis sp. eram

adicionadas aos tanques na densidade de 1milhão de células/mL e 500 mil células/mL,

respectivamente para o primeiro e o segundo experimento. A média da temperatura da

água foi de 24,28±0,30°C e 21,4±0,39°C para ambos os experimento, respectivamente;

e a salinidade foi de 36,8±0,14. Semanalmente os compostos nitrogenados foram

medidos, amônia ionizada (NH4+) e nitritos (NO2

-) com uso do kit teste para aquário

TETRA. O pH foi medido diariamente com um pHmetro Hanna-HI-98107 que

mostraram valores de 7,9-8,0.

Dois diferentes grupos de paralarvas baseados nas diferentes dietas foram

estabelecidos: a) o controle, o qual consistiu na adição de 10 náuplius de artêmias/ml

enriquecidos com 106 células de T-Iso/ml/dia; e b) dieta artificial, o qual consistiu na

84

co-alimentação de 0,25 gramas de dieta de quitosano com fluoesfera/dia e 10 náuplius

de artêmias/ml enriquecidos com 106 células de T-Iso/ml/dia. Ambos os tratamentos

foram realizados em triplicata e os experimentos tiveram duração de 15 dias. A

sifonagem dos tanques ocorreu diariamente e somente no primeiro experimento, sempre

antes da primeira alimentação.

Quinze paralarvas foram amostradas no início e ao final do experimento, cinco

indivíduos de cada tanque. As amostras foram utilizadas para calcular: (i) peso seco

(DW; mg); (ii) comprimento ventral do manto (VML; mm); (iii) razão de crescimento

instantâneo (IGR;%DW t-1) = (LnW2 - LnW1) t-1.100, onde W1 e W2 são o peso seco

inicial e final, respectivamente, Ln o logaritmo natural e t o número de dias do

experimento. A razão de sobrevivência (SR; %) foi determinada como (100Nf)Ni-1, onde

Nf e Ni são, respectivamente, o número final e inicial de paralarvas nos tanques de cada

tratamento.

As paralarvas amostradas foram anestesiadas com Cl2Mg6H2O 0.4 M (Panreac-

Química SA), de acordo com a metodologia descrita por Messenger et al. (1985). Após

mediu-se o comprimento médio do manto, através das imagens registradas por uma lupa

estereoscópica acoplada a uma câmera fotográfica (59 x de magnificação, SMZ-10A;

Nikon), e o peso seco foi determinado pela secagem das amostras ao fim de 24 h a 110

°C.

A coleta das paralarvas ocorreu nos dias 0, 7 e 15, totalizando 90 paralarvas (45

paralarvas/tratamento ou 5 paralarvas/tratamento/amostras). Estas foram fotografadas

para a avaliação do crescimento e a taxa de ingestão da dieta. Para avaliar a ingestão

utilizou-se um microscópico (AZ100; Nikon) acoplado a uma epifluorescência em

diferentes aumentos (50-400x). As marcas de fluorescência foram observadas através de

luz de epi-fluorescência usando filtros de excitação UV-2A (330-380 nm) e V-2A (380-

420 nm). Ao final dos 15 dias de experimento avaliou-se o incremento em peso seco e a

sobrevivência.

Para verificar diferenças estatísticas entre as médias de comprimento do manto,

peso seco e sobrevivência nos diferentes tratamentos e experimentos, uma Análise de

Variância de dois fatores com nível de significância de 5%. As análises estatísticas

foram realizadas com o uso do pacote estatístico R.

85

RESULTADOS

O tamanho das partículas e incorporação de fluoesferas

A concentração de gel de quitosano de 2 % apresentou viscosidade adequada

para passar no goteador, sendo utilizado na proporção de ingredientes e quitosano de

80:20. Após diferentes testes, esta foi a proporção que possibilitou a maior incorporação

de nutrientes em relação à menor quantidade de gel de quitosano adicionado.

O tamanho das partículas alimentares variou de 1,45 mm a 2,33 mm, com média

de 1,83± 0,17 mm e a taxa de incorporação de fluoesferas à dieta foi de 88 %. A

incorporação foi resultado da subtração da concentração inicial de fluoesfera

adicionadas à dieta (1940 ± 260 células para cada 0,3 g de dieta liofilizada), da

concentração final media resultante não incorporada que foi de 232 fluoesfera (Figura

1).

Figura 1: A) Partículas de dieta encapsulada com quitosano; B) fluoesferas de 10 µm

incorporadas às partículas alimentares.

Peso seco, crescimento, IGS e sobrevivência das paralarvas nos diferentes

tratamentos

Experimentos 1

O peso seco médio das paralarvas ao eclodir foi de 0,21± 0,02 mg e ao final do

experimento no dia 15, foi de 0,41± 0,02 mg e 0,42± 0,03 mg para os tratamentos dieta

86

e controle, respectivamente. Não houve diferença significativa entre os tratamentos

(p=0,86).

O comprimento ventral do manto foi de 1,56± 0,05 no momento da eclosão e de

2,48± 0,07 mm e 2,51± 0,10 mm ao final do experimento para os tratamentos dieta e

controle, respectivamente (Figura 2). Não houve diferença significativa entre os

tratamentos (p=0,56).

Figura 2: O. vulgaris. Comprimento do manto de paralarvas dos tratamentos dieta e

controle. A idade expressa os dias após a eclosão e os valores são a média de 80

paralarvas ± DP.

A razão de crescimento instantâneo foi de 4,45±0,28 % e 4,55±0,68 % para os

tratamentos dieta e controle, respectivamente. A razão de sobrevivência foi de

2,91±1,29 % e 4,27±2,14 % para os tratamentos dieta e controle, respectivamente.

Tabela 1: Octopus vulgaris. Características morfométricas das paralarvas para o

experimento 1.

Experimento 1 Dia 0 Dia 7 Dia 15

Dieta Controle Dieta Controle

Sobrevivência (%) 100 - - 2,91±1,29 4,22±2,14

Comprimento do

manto (mm)

1,56 ± 0,05 2,17±0,01 2,22±0,04 2,48±0,07 2,51±0,10

Peso seco (mg) 0,21±0,02 - - 0,41±0,02 0,42±0,03

IGS (%) - - - 4,45±0,28 4,55±0,68

y = 1.62e0.030x

R² = 0.92

y = 1.63e0.031x

R² = 0.90

1.40

1.60

1.80

2.00

2.20

2.40

2.60

2.80

0 5 10 15

Co

mp

rim

en

to d

o m

an

to (

mm

)

Idade (dias)

dieta

controle

Exponencial (dieta)

Exponencial

(controle)

87

Experimento 2

O peso seco médio das paralarvas ao eclodir foi de 0,22± 0,02 mg e ao final do

experimento no dia 15, foi de 0,32± 0,04 mg e 0,34± 0,05 mg para os tratamentos dieta

e controle, respectivamente (Figura 3). Não houve diferença significativa entre os

tratamentos (p=0,79).

O comprimento ventral do manto foi de 2,03± 0,07 no momento da eclosão e de

2,30± 0,02 mm e 2,21± 0,33 mm ao final do experimento para os tratamentos dieta e

controle, respectivamente (Figura 4). Não houve diferença significativa entre os

tratamentos (p=0,08).

Figura 3: O. vulgaris. Peso seco das paralarvas dos tratamentos dieta e controle. A idade

expressa os dias após a eclosão e os valores são a média de 180 paralarvas ± DP.

y = 0.23e0.0239x

R² = 0.76

y = 0.23e0.0293x

R² = 0.83

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0 5 10 15

Pe

so s

eco

(m

g)

Idade (dias)

dieta

controle

88

Figura 4: O. vulgaris. Crescimento do manto das paralarvas dos tratamentos dieta e

controle. A idade expressa os dias após a eclosão e os valores são a média de 180

paralarvas ± DP.

A razão de crescimento instantâneo foi de 4,16±0,76 % e 4,16±1,24 % para os

tratamentos dieta e controle, respectivamente. A razão de sobrevivência foi de 4,79% e

6,15 % para os tratamentos dieta e controle, respectivamente.

Tabela 2: Octopus vulgaris. Características morfométricas das paralarvas durante o

segundo experimento.

Experimento 2 Dia 0 Dia 5 Dia 10 Dia 15

Dieta Controle Dieta Controle Dieta Controle

Sobrevivência (%) 100 - - - - 4,79±5,83 6,15±3,12

Comprimento do manto

(mm)

2,03±0,07 2,05±0,05 2,13±0,09 2,11±0,02 2,15±0,02 2,l3±0,05 2,21±0,03

Peso seco (mg) 0,22±0,02 0,29±0,04 0,29±0,14 0,32±0,04 0,34±0,04 0,32±0,01 0,34±0,03

IGS (%) - 5,26±0,94 5,26±2,44 3,50±1,30 4,13±1,30 4,16±0,76 4,16±1,24

Prevalência de ingestão

Um total de 41 paralarvas foi amostrado para analise de ingestão da dieta através

da presença de fluoesfera no trato digestivo. Observou-se o ataque às partículas e o seu

manuseio pelas paralarvas, bem como a presença de fluoesferas no trato digestivo em

y = 1.99e0.0082x

R² = 0.85

y = 2.05e0.0054x

R² = 0.93

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0 5 10 15

Co

mp

rim

en

to d

o m

an

to (

mm

)

Idade (dias)

dieta

controle

Exponencial (dieta)

Exponencial

(controle)

89

15% das paralarvas amostradas (Figura 5), encontradas principalmente no esôfago,

estômago e intestino.

Figura 5: O. vulgaris. Fluoesfera ingerida por paralarva submetida ao tratamento com a

dieta alimentar inerte encapsulada com quitosano.

DISCUSSÃO

O presente estudo testou pela primeira vez em cefalópodes o uso de microdieta

de quitosano e a incorporação de fluoesferas como marcadores de ingestão. A dieta foi

ingerida por 15% das paralarvas, mostrando que apesar da proporção ser baixa, houve a

ingestão. As fluoesferas se mostraram uma ferramenta útil como marcadores de ingestão

nas paralarvas de polvo, constatando sua aplicabilidade em experimentações que

busquem avaliar a seleção e ingestão de presas. Estudos com larvas e juvenis de

bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) mostraram a viabilidade do uso de fluoesferas

como marcador indireto para estimar a digestibilidade de proteínas (HANSEN et al.

2008) como também para avaliar a seleção e quantificação de ingestão (MUSCATO et

al. 2009; KOLKOVSKY et al. 2009)

Neste estudo, pode-se observar que a técnica de micro encapsulação produz

partículas com alta estabilidade em água salgada e baixa desintegração, mantendo a

flutuabilidade por períodos maiores que 24 h. As partículas ao flutuarem se mantém

abaixo da película formada pela tensão superficial da água durante longo período,

estando assim maior tempo à disposição para serem consumidas. No entanto, estudos

em laboratório com dietas inertes para paralarvas de polvos mostraram que o ataque

90

acontecia principalmente, quando a partícula afundava na coluna d’água (NAVARRO

& VILLANUEVA, 2000). No presente estudo foi possível visualizar ataques às

partículas da dieta, porém como as mesmas se mantinham em suspensão na camada

mais superficial da coluna de água, isso possivelmente dificultou o acesso às partículas

para a maioria das paralarvas, explicando em parte a baixa taxa de ingestão observada.

Cabe enfatizar que a dieta de quitosano, devido a sua baixa desintegração,

mostrou-se favorável para a manutenção de uma boa qualidade da água nos tanques de

cultivo. No entanto, Yúfera et al. (2003) comentam que por diminuir a lixiviação dos

componentes solúveis em água, a micro encapsulação pode diminuir a atração das

larvas pelas partículas alimentares. Métodos de micro encapsulação até o momento não

obtiveram bons resultados no crescimento de larvas marinhas (YÚFERA et al. 2003),

devido principalmente à inabilidade das larvas em digerir e assimilar as partículas,

como também à alta proporção de elementos não essenciais utilizados para formar a

cápsula (YÚFERA et al. 2003). Neste estudo a proporção de quitosano foi 20 % do total

do conteúdo da dieta, sendo que menores proporções de quitosano dificultavam a

formação das partículas aumentando o seu tamanho, devido à diminuição da fluidez.

O quitosano é um polímero de composição natural, biocompatibilidade, não

toxidade, habilidade de adsorção e propriedade antimicrobiana que já é utilizado na

indústria farmacêutica (RAVI, 2000; MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2005; KONG

et al. 2010) e alimentícia (DUTTA et al. 2009), podendo ter um grande potencial para o

uso na aquicultura. Estudos que comprovem a assimilação e digestibilidade da dieta de

quitosano em diferentes espécies marinhas são necessários para comprovar sua eficácia

no crescimento, como também investigar a sua possível aplicabilidade na administração

de medicamentos via oral para o tratamento contra enfermidades. Assim como em

paralarvas de polvo, em testes realizados usando alevinos de truta arco íris de

aproximadamente 15 cm, observou-se a ingestão completa da dieta de quitosano

oferecida (observação pessoal), podendo esta técnica ser viável em peixes, fato este que

abriria um campo interessante de pesquisa no desenvolvimento de dietas alimentares e

suplementação de fármacos com o quitosano.

As partículas produzidas tiveram tamanho médio de 1,83 mm, com a menor

medindo 1,4 mm e a maior medindo 2,3 mm. Após a eclosão as paralarvas tem

preferência por partículas alimentares em torno de 1,4 mm (IGLESIAS et al. 2006),

limite estes inferiores ao tamanho médio das partículas da dieta de quitosano. Este fato

91

pode ter dificultado a captura das partículas da dieta de quitosano, e consequentemente,

resultado nas baixas taxas de ingestão da dieta observadas.

A sobrevivência observada ao final de ambos os experimentos esteve abaixo do

encontrados por outros autores que também utilizaram dieta inerte em co-alimentação

com artêmia, ou somente artêmia (IGLESIAS et al. 2000; VILLANUEVA et al. 2002;

SEIXAS et al. 2010). A baixa sobrevivência observada em ambos os tratamentos

seguramente influenciou na ingestão das partículas da dieta, mas não pode ser atribuída

à presença da mesma, tendo em vista que o tratamento controle também apresentou

baixos valores de sobrevivência ao encontrado por outros autores, não havendo

diferença significativa entre os tratamentos. A contaminação bacteriana através do

alimento vivo, fezes e resíduos orgânicos podem ter sido a maior causa da alta

mortalidade, tendo em vista que os valores de qualidade de água e oxigênio dissolvido

estiveram de acordo ao sugerido por Iglesias et al. (2007).

O peso seco inicial das paralarvas no Dia 0, ou seja, logo após a eclosão, foi de

0,2 mg, valores inferior aos registrados por Iglesias et al. (2000) de 0,46mg, Villanueva

et al. (2002) de 0,27mg e 0,34 mg, Seixas et al. (2010) de 0,32 mg e por Moxica et al

(2002) 0,36 mg. O peso seco das paralarvas neste estudo aos 15 dias de cultivo foi

também inferior aos registrados em outros estudos (IGLESIAS et al. 2000;

VILLANUEVA et al. 2002; SEIXAS et al. 2010), sugerindo que as condições do

cultivo foram influenciadas por algum fator que afetou o desenvolvimento e a

sobrevivência das paralarvas, no entanto a qualidade da desova parece ter afetado a

qualidade das paralarvas, e consequentemente, ter influenciado os valores obtidos neste

trabalho. Os maiores valores de peso seco após 15 dias de cultivo foram obtidos no

experimento 1, os quais variaram de 0,41±0,02 mg a 0,42±0,03 mg. Estes valores

ficaram abaixo aos valores encontrados após 15 dias de cultivo por Seixas et al. (2010)

que variou de 0,43-0,50 mg, por Villanueva et al. (2002) que ao utilizar somente

náuplius de artêmia obteve 0,40-0,88 mg e ao utilizar artêmia co-alimentada com dieta

inerte obteve 0,78-0,84 mg e por Iglesias et al. (2000) que utilizando náuplius e

metanáuplius obteve peso seco de 0.75 mg.

No presente estudo o CVM das paralarvas ao eclodir foi de 1,56± 0,05 e 2,03±

0,07 para o primeiro e segundo experimento, respectivamente. Estes valores foram

inferiores no primeiro experimento e similares no segundo experimento aos valores

encontrados por Seixas et al. (2010), porém superiores ao registrado por Iglesias et al.

(2000). Ao final de 15 dias de cultivo, os valores do comprimento do manto foram

92

similares quando comparados aos resultados de Seixas et al. (2010) que observaram

valores médios variando de 2,24 a 2,34 mm.

Neste estudo, esperava-se que devido ao CVM após 15 dias de cultivo ser

similar ao encontrado por Seixas et al. (2010), o peso seco das paralarvas também fosse

similar, o que não aconteceu. Este fato sugere que a relação CVM e peso seco foram

influenciados por fatores nutricionais ou até a possível inanição das paralarvas que

afetou ambos os tratamentos. Mesmo as paralarvas apresentando crescimento no CVM,

este não se refletiu no ganho de peso afetando negativamente a razão de crescimento

como também a sobrevivência em comparação aos resultados de outros autores

(VILLANUEVA et al. 2002; SEIXAS et al. 2010).

A dieta inerte encapsulada com quitosano não se mostrou eficiente para

promover crescimento e sobrêvivencia das paralarvas de polvo nas condições aqui

apresentadas. Este fato foi devido principalmente às suas propriedades físicas

inadequadas para esta espécie, sendo necessário aprimorar a composição das partículas,

assim como sua aceitabilidade, adequando sua densidade, e consequentemente sua

flutuabilidade ao comportamento alimentar das paralarvas. O quitosano parece ser um

interessante aglutinante alimentar para dietas inertes para peixes, tendo em vista que se

podem manipular os ingredientes encapsulados de acordo com a necessidade alimentar

do organismo, de acordo com seu estágio de desenvolvimento. Assim, pesquisas que

objetivem investigar a aceitabilidade e digestibilidade de dietas micro encapsuladas com

quitosano em diferentes espécies cultivadas, como também a sua interação com

fármacos, se fazem necessárias para avaliar o seu potencial uso na aquicultura, tanto

para a alimentação de espécies aquáticas como para a administração de tratamentos

profiláticos através da encapsulação de ingredientes ativos.

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98

CONCLUSÕES

Os resultados encontrados no primeiro capítulo deste trabalho levaram à

aceitação da hipótese de trabalho na qual devido à similaridade morfológica entre a

espécie recém-descrita de polvo O. insularis e a espécie amplamente conhecida e

estudada O. vulgaris, esperava-se que a primeira assim como a segunda espécie

produzissem uma grande quantidade de ovos e paralarvas planctônicas.

O padrão de distribuição de cromatóforos diferenciado entre as paralarvas de

ambas as espécies de polvo permitirá que estudos realizados no plâncton já possam

identificar corretamente a espécie de paralarva de polvo capturada, possibilitando a

identificação correta das áreas de desova de cada espécie.

Trabalhos futuros visando estabelecer técnicas apropriadas de larvicultura,

identificar presas adequadas para a fase planctônica, assim como avaliar o desempenho

de juvenis de O. insularis na engorda precisam ser realizados para avaliar o real

potencial da espécie para a aquicultura.

Os resultados encontrados no segundo capítulo levaram à aceitação da hipótese

de trabalho, na qual se esperava um consumo mais rápido do vitelo em paralarvas

mantidas em inanição. A outra hipótese também foi aceita, pois se verificou que a

glândula digestiva é funcional desde o momento da eclosão, apresentando todos os tipos

celulares. O ciclo citológico na glândula digestiva esteve relacionado ao ato de se

alimentar independente da idade.

A nutrição das paralarvas é apontada como ponto chave para aumentar os

índices de sobrevivência durante a fase planctônica. O ato de ingerir a presa determina

a quantidade de células específicas na glândula digestiva, no entanto a presença de um

determinado tipo de célula não garante que a paralarva está bem nutrida. Pesquisas que

busquem determinar quais presas (nutrientes) aumentam realmente a sobrevivência em

cada fase do desenvolvimento planctônico segue sendo determinante para tornar a

larvicultura de polvos economicamente viável.

No capítulo três, pudemos observar a ingestão da dieta através da presença de

fluoesferas no trato digestivo das paralarvas, aceitando as hipóteses de trabalho. No

entanto, a dieta inerte encapsulada com quitosano não melhorou o crescimento e

tampouco a sobrevivência das paralarvas, sendo rejeitada a outra hipótese, aceitando a

hipótese nula.

99

Os resultados mostraram a viabilidade da técnica para a aquicultura, no entanto

há a necessidade de ampliar as pesquisas visando melhorar a aceitabilidade e entender a

digestibilidade das partículas micro encapsuladas com quitosano. Pesquisas em

diferentes espécies cultivadas, como também a sua interação com fármacos, se fazem

necessárias para avaliar o seu potencial uso na aquicultura, tanto para a alimentação de

espécies aquáticas como para a administração de tratamentos profiláticos através da

encapsulação de ingredientes ativos.

Esperamos que os resultados, sugestões e ideias apresentadas nesta tese, possam

contribuir para pesquisas futuras no que diz respeito à larvicultura de polvos. Assim

outras pesquisas, em cada capítulo aqui apresentado, se fazem necessárias para ampliar

o conhecimento no que diz respeito ao cultivo do O. insularis, assim como também para

entender as transformações que ocorrem na fase plactônica dos polvos, buscando

desenvolver dietas que possam melhorar os baixos índices de sobrevivência atualmente

observados.