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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

ELLANE SABRYNA SENA RIBEIRO

ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR DE

SUCO DE CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495

NATAL/RN

2019

2




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial a obtenção do título de Mestre em Nutrição.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Canindé Sousa Junior

NATAL/RN

2019

4




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Nutrição.

Aprovada em 13 de dezembro de 2019.

Profa. Dra. Karine Cavalcanti Maurício de Sena Evangelista

Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Francisco Canindé Sousa Júnior


Orientador

Profa. Dra. Juliana Kelly da Silva Maia


Membro Interno

Profa. Dra. Ester Ribeiro de Andrade

Universidade Federal de Pernambuco – UFPE

Membro Externo

5

Aos meus maiores incentivadores, Walmir e

Cristhina, José Lúcio e Dalva....

6

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu Deus, porque Dele, por Ele e para Ele são todas as coisas.

Aos meus amados pais, Walmir e Cristhina, por todo amor, suporte, paciência,

presença e dedicação a mim em todos os aspectos da vida.

Aos meus avós, José Lúcio e Dalva, que carinhosamente estão sempre me

incentivando, apoiando e acreditando nos meus sonhos.

A todos meus familiares queridos, os de perto e os de longe, que estão sempre

torcendo pelo meu sucesso.

A todos os meus amigos, que também se fazem presente na minha caminhada. Em

especial à minhas amigas Mariana e Ingrid e colegas de turma Ruty, Thatyane,

Josiane que dividiram muitas emoções, palavras positivas e de conforto durante

essa trajetória.

De maneira especial, agradeço a minha amiga Grazielly Louise, que acompanhou de

maneira mais próxima minha jornada e me ajudou em vários momentos com seus

sábios conselhos, reflexões e exemplo de fé.

Ao meu orientador, Prof. Francisco pela orientação brilhante, pelo respeito e

cordialidade. Por me dar autonomia para fazer minha pesquisa e desenvolver meus

conhecimentos, mas ainda assim, estar sempre presente para me ensinar e auxiliar.

A Profª. Karla Suzanne, pela disponibilidade e orientação nessa reta final.

Agradeço aos meus colegas mestrandos, Wendell, Pedro Ivo e Anderson e também

as alunas de iniciação científica, Lívia, Thereza, Wilma Fabiana, Carla e Leonan por

suas significativas contribuições no meu trabalho.

Agradeço também o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior - Brasil (CAPES) que viabilizou essa produção científica através do

auxílio financeiro (Código de Financiamento 001)

E a todos, que de alguma forma participaram e fizeram parte dessa trajetória.

7

“O Senhor é o Deus Eterno, ele criou o mundo inteiro. Ele

não se cansa, não fica fatigado; ninguém pode medir a

sua sabedoria. Aos cansados ele dá novas forças e enche

de energia os fracos. Até os jovens se cansam, e os

moços tropeçam e caem; mas os que confiam no Senhor

recebem sempre novas forças. Voam nas alturas como

águias, correm e não perdem as forças, andam e não se

cansam.” (Isaías 40: 29-31)

8

RESUMO

Probióticos são definidos como micro-organismos viáveis que exibem efeitos

benéficos para a saúde do hospedeiro quando ingeridos em quantidades

adequadas. Em virtude dos benefícios da ingestão regular de culturas probióticas e

que as fontes alimentares destes componentes funcionais ainda estarem limitadas a

produtos lácteos, é de fundamental importância que novas bebidas probióticas

sejam desenvolvidas. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo elaborar

e caracterizar uma bebida de cajá fermentada com Lactobacillus acidophilus NRRL

B-4495. Inicialmente, as condições de pH e temperatura foram otimizadas utilizando

um delineamento composto central 22. Em seguida determinou-se o tempo de

fermentação necessário para a máxima viabilidade. Durante a fermentação, os

parâmetros físico-químicos e as atividades antioxidantes foram determinados. Além

disso, a atividade antimicrobiana, e a estabilidade microbiológica em

armazenamento refrigerado e em condições gastrointestinais simuladas foi

investigada. Por fim, o suco obtido foi submetido a análise sensorial utilizando

provadores não treinados. As condições ideais para a produção de suco probiótico

foram pH inicial 6,4 e o tempo de 16 h de fermentação. A concentração de fenólicos

totais foi de 123,20 (7,36) EAG/mL em 16 h, com atividade antioxidante de 3,28

(0,02) µmol TE/mL e 3,56 (0,02) µmol TE/mL, para o sequestro dos radicais DPPH e

ABTS, respectivamente. A formulação obtida apresentou boa estabilidade

microbiológica quando armazenada por 28 dias sob refrigeração (4 oC), com

viabilidade de 8,7 Log UFC/mL. Além disso, para o suco recém fermentado não

houve alteração significativa na viabilidade probiótica após a exposição ao estresse

gástrico-intestinal simulado in vitro. Já para o suco após 28 dias de refrigeração, foi

observada uma pequena redução das células viáveis na fase entérica. A partir da

análise sensorial, foi visto que bebida probiótica de cajá não foi bem aceita, no

entanto, a análise Just about Right (JAR) permitiu identificar os atributos específicos

que necessitam ser melhorados no ponto de vista dos provadores, para que assim

seja possível aumentar a aceitação do produto. Assim, este estudo mostrou grande

potencial para elaboração de uma nova bebida probiótica a base de suco de cajá,

sendo uma excelente alternativa aos tradicionais produtos lácteos.

Palavras-chave: Probióticos, Lactobacillus acidophilus, alimentos funcionais, bebida

probiótica não láctea, Spondias mombin L., análise sensorial.

9

ABSTRACT

Probiotics are defined as viable microorganisms that exhibit beneficial effects

on host health when ingested in adequate amounts. Because of the benefits of

regular intake of probiotic beverages and that food sources of these functional

components are still limited to dairy products, it is of fundamental importance that

new probiotic beverages will are studied. In this context, the present study aimed to

elaborate and characterize a yellow mombin juice fermented with Lactobacillus

acidophilus NRRL B-4495. Initially, the pH and temperature conditions were

optimized using a central composite design 22. Then, the fermentation time required

for maximum viability was determined. During fermentation, physicochemical

parameters and antioxidant activities were determined. Also, antimicrobial activity,

microbiological stability in refrigerated storage and simulated gastrointestinal

conditions were investigated. Finally, the juice obtained was submitted to sensory

analysis using untrained tasters. The ideal conditions for probiotic juice production

were the initial pH of 6.4 at 16 h of fermentation. The total phenolic concentration

was 123.20 (7.36) GAE/mL at 16 h, with antioxidant activity of 3.28 (0.02) µmol

TE/mL and 3.56 (0.02) µmol TE/mL for the sequestration of DPPH and ABTS

radicals, respectively. The formulation obtained presented good microbiological

stability when stored for 28 days under refrigeration (4 ºC), with the viability of 8.7

Log CFU/mL. Moreover, for freshly fermented juice, there was no significant change

in probiotic viability after exposure to simulated gastric-intestinal stress in vitro. For

juice after 28 days of storage, a small reduction of viable cells in the enteric phase

was observed. From the sensory analysis, it was seen that yellow mombin probiotic

beverage was not well accepted. However, the Just about Right (JAR) analysis

allowed us to identify the specific attributes that need to be improved from the tasters'

point of view, improve product acceptance. Thus, this study showed great potential

for creating a new probiotic beverage based on yellow mombin juice, is an excellent

alternative to traditional dairy products.

Key words: Probiotics, Lactobacillus acidophilus, Functional foods, Non-dairy

probiotic drink, Spondias mombin L., Sensory analysis.

10

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 14

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 14

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 14

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 15

3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS PROBIÓTICOS ....................................................... 15

3.2 EFEITOS BENÉFICOS DOS PROBIÓTICOS ..................................................... 17

3.3 SUCO DE FRUTAS COMO VEÍCULO DE CULTURAS PROBIÓTICAS ............ 18

3.4 CAJÁ (Spondias mombin L.) ............................................................................... 21

4 METODOLOGIA .................................................................................................... 22

4.1 ELABORAÇÃO DO SUCO DE CAJÁ .................................................................. 22

4.2 OBTENÇÃO DO SUCO DE CAJÁ PROBIÓTICO ............................................... 22

4.2.1 MICRO-ORGANISMO ...................................................................................... 22

4.2.2 ATIVAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO............................................................. 22

4.2.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE

FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ........... 23

4.2.4. AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO .............................................. 23

4.3 AVALIAÇÃO DE VIABILIDADE, CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E

FUNCIONAIS DO SUCO PROBIÓTICO ................................................................... 24

4.3.1 VIABILIDADE ................................................................................................... 24

4.3.2 pH ..................................................................................................................... 24

4.3.3 ACIDEZ TITULÁVEL ........................................................................................ 24

4.3.4 SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS ......................................................................... 24

4.3.5 PROTEÍNAS TOTAIS ....................................................................................... 25

4.3.6 FENÓLICOS TOTAIS ....................................................................................... 25

4.3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ....................................... 25

4.3.7.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL DPPH .......... 25

4.3.7.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL ABTS ........... 26

4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ...................................... 26

4.5 ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DA BEBIDA FERMENTADA POR ATÉ 28

DIAS .......................................................................................................................... 27

4.6 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 EM

CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS ................................................. 27

11

4.7 AVALIAÇÃO DA ACEITAÇÃO DO PRODUTO ................................................... 28

4.7.1 ASPECTOS ÉTICOS........................................................................................ 28

4.7.2 PREPARO DAS AMOSTRAS .......................................................................... 28

4.7.4 RECRUTAMENTO ........................................................................................... 29

4.7.5 TESTES AFETIVOS ......................................................................................... 30

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 31

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 32

5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE

FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ........... 32

5.2 AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO .................................................. 37

5.3 DETERMINAÇÃO DE COMPONENTES FENÓLICOS TOTAIS E ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE ........................................................................................................ 42

5.4 AVALIAÇÃO DA COR ......................................................................................... 45

5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ...................................... 47


DIAS .......................................................................................................................... 49


CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS ................................................. 52

5.7 ANÁLISE SENSORIAL ........................................................................................ 54

5.7.2 PERFIL DOS PROVADORES .......................................................................... 54

5.7.3 TESTE DE ACEITAÇÃO GLOBAL ................................................................... 55

5.7.4 “JUST ABOUT RIGHT” (JAR) .......................................................................... 57

5.7.4 TESTE DE INTENÇÃO DE COMPRA .............................................................. 65

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 67

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 68

ANEXOS ................................................................................................................... 79

APÊNDICES ............................................................................................................. 82

12

1 INTRODUÇÃO

Atualmente o consumidor está mais consciente sobre o papel da alimentação

na longevidade, bem-estar e prevenção de doenças crônicas não transmissíveis1.

Nesse contexto, tem sido observado mudanças no estilo de vida e hábitos

alimentares de parcela significativa da população, elevando a procura por alimentos

mais nutritivos, saudáveis e que auxiliem na prevenção de doenças, com amplos

benefícios para a saúde, como os alimentos funcionais2.

Um tipo de alimento funcional que domina o mercado são os probióticos,

definidos como micro-organismos viáveis que exibem efeitos benéficos para a saúde

do hospedeiro quando ingeridos em quantidades adequadas3.

Em 2016, o mercado global de probióticos movimentou cerca de 40 bilhões de

euros, com iogurtes e outros produtos lácteos correspondendo a 90% do total de

vendas. Além disso, até 2021 espera-se um crescimento de 38% neste mercado4.

Os principais efeitos benéficos à saúde atribuídos ao consumo regular de

probióticos são redução da intolerância à lactose, diminuição dos níveis de

colesterol, estimulação do sistema imunológico, alívio da constipação, aumento da

absorção de minerais, efeitos antimutagênico, anticarcinogênico e anti-hipertensivo5.

Ademais, uma das funções mais importantes ligadas ao consumo de probióticos,

está na sua ação contra micro-organismos patogênicos6.

Bebidas fermentadas por maioria têm sido desenvolvidas em produtos

lácteos, no entanto, a partir do crescimento das tendências veganas, bem como dos

casos de intolerância/alergia ao leite e a preferência por dietas hipocolesterolêmicas,

têm aumentado a necessidade de inovação e desenvolvimento de novos produtos

probióticos, utilizando diferente fontes e matérias primas na obtenção de produtos

com alto valor nutricional6. Portanto, estudos com a inoculação de micro-organismos

probióticos em suco de frutas e vegetais são promissores e vêm ganhando espaço

como opção para o desenvolvimento de novos produtos probióticos7.

Suco de frutas são consumidos regularmente, o que torna uma maneira

atrativa de fornecer os probióticos. Além disso, são ricos em nutrientes e contém

concentração de açúcares adequada para estimular o crescimento destes micro-

organismos benéficos8.

O cajá (Spondias mombin L.), uma fruta pertencente à família Anacardiaceae

é comumente encontrada nas regiões Norte e Nordeste do Brasil9. Na região

amazônica, o fruto da cajazeira é conhecido como Taperebá10. O cajá é um alimento

13

que possui elevado valor nutricional e funcional, em virtude de seus baixos teores

energéticos e da presença de fibras, aliados a consideráveis valores de vitamina C e

de provitamina A, expressa em seus teores de carotenoides totais. Além disso, o

cajá apresenta polpa bastante ácida e um índice de maturação relativamente

baixo11.

Assim, considerando os benefícios da ingestão diária de culturas probióticas e

que esse tipo de alimento ainda é restrito à produtos lácteos, é imprescindível que

novas bebidas probióticas sejam desenvolvidas, com o intuito de ampliar o mercado

deste produto, além de oferecer opções aos indivíduos que não podem ou não

apreciam o consumo de produtos lácteos. Neste contexto, o presente trabalho se

propõe a elaborar e caracterizar uma bebida probiótica de suco de cajá fermentado

com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.

14

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Elaborar e caracterizar uma bebida probiótica de suco de cajá fermentado com

Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Analisar as condições de pH, temperatura e tempo de fermentação para o

desenvolvimento e manutenção da viabilidade de L. acidophilus em suco de

cajá;

Analisar o pH, acidez titulável, sólidos solúveis totais e concentração de

proteínas totais no suco durante a fermentação;

Determinar as propriedades antioxidantes do suco de cajá fermentado e não

fermentado;

Analisar os parâmetros de cor do suco de cajá antes e após fermentação;

Investigar a atividade antimicrobiana do suco de cajá fermentado;

Avaliar a viabilidade probiótica da bebida fermentada, armazenada por 28

dias sob refrigeração;

Investigar a viabilidade do probiótico em condições gastrointestinais

simuladas;

Verificar os atributos sensoriais e a intenção de compra do suco de cajá

probiótico.

15

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS PROBIÓTICOS

A ampla divulgação dos meios de comunicação acerca da alimentação e

seu impacto na saúde, tem trazido para sociedade a preocupação com a

alimentação saudável, tornando o consumidor mais exigente em relação à

qualidade nutricional dos produtos alimentícios, e, consequentemente,

impulsiona a criação e lançamento exponencial de novos produtos no

mercado12.

Os trabalhos no ramo da alimentação funcional têm merecido destaque

em consequência da mudança do estado de saúde da população. À medida que

os custos dos cuidados de saúde e a expectativa média de vida aumentam, o

público tem procurado maneiras de se tornar mais saudável e desenvolver

melhor qualidade de vida13.

Sendo assim, a procura por alimentos que promovem a saúde além da

nutrição básica, tem sido crescente, sendo esses denominados “alimentos

funcionais”, termo que abrange uma ampla gama de produtos, sendo exemplos

típicos desse ramo os produtos probióticos e os alimentos adicionados de

oligossacarídeos (prebióticos)14.

A Resolução no 18, 30 de Abril de 1999 que regula às alegações de

propriedades funcionais e/ou de saúde de alimentos e ingredientes utilizados

para consumo humano, define que para a alegação de propriedades funcionais

de um alimento, é exigido que esse alimento ou ingrediente além de possuir

funções nutricionais básicas, quando se tratar de nutriente, deve também

necessariamente produzir efeitos metabólicos e ou fisiológicos e ou efeitos

benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica15.

A popularização dos benefícios de probióticos tem feito com que haja o

crescimento no consumo, e, consequentemente na sua produção. Os micro-

organismos mais comumente utilizados na fermentação de produtos próbioticos

pertencem aos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus16. O consumo de

alimentos funcionais contendo microrganismos probióticos tem efeitos

associados na prevenção de doenças e à promoção da saúde17

Para que os probióticos exerçam seu efeito funcional necessitam ser

ingeridos diariamente, pois a composição da microbiota intestinal está

16

constantemente sendo modificada pelos substratos presentes, micro-organismos

veiculados nos alimentos, estresse e outros fatores18.

Segundo a Resolução no 241, 26 de julho de 2018 que dispõe sobre os

requisitos para comprovação da segurança e dos benefícios à saúde dos probióticos

para uso em alimentos, o termo probiótico é definido como micro-organismo viável

que, quando administrado em quantidades adequadas, confere um benefício à

saúde do indivíduo19.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estabelece a quantidade mínima

viável no momento do consumo de 106 a 107 unidades formadoras de colônia (UFC)

por mL20. Ademais, a legislação brasileira determina que bebidas lácteas

fermentadas apresentem uma contagem total de bactérias viáveis no produto final de

mínimo 106 UFC/g, durante todo o prazo de validade21.

Assim, um dos grandes desafios da indústria de alimentos na produção de

probióticos é garantir sua viabilidade e funcionalidade durante todas as etapas de

processamento e armazenamento1.

Existem diversos fatores que afetam nessa viabilidade. Como nos produtos

fermentados, durante seu processo fermentativo são formados vários metabólitos,

incluindo ácido lático, ácido acético, bacteriocinas, pode ocorrer favorecimento à

diminuição do pH do produto e consequentemente estes metabólitos podem afetar a

estabilidade das bactérias probióticas, alterando suas propriedades funcionais e

sensoriais22.

Além disso, a matriz alimentar utilizada como veículo dos micro-organismos

probióticos pode influenciar o seu crescimento, viabilidade, sobrevivência, tolerância

à ácido e sais biliares, e sua funcionalidade6.

Nesse sentido para o desenvolvimento de novos alimentos funcionais

probióticos, uma investigação cuidadosa da interação de diferentes linhagens

probióticas e componentes alimentares deve ser considerada, visando obter

sucesso no produto, uma vez que a interação micro-organismo com a matriz

alimentar deve auxiliar na resistência do probiótico durante a passagem pelo trato

gastrointestinal23.Apesar de já existir a produção de bebidas fermentadas em

matrizes não lácteas, como em chás, vale ressaltar que essas bebidas não tem

padronização pela legislação.

As cepas probióticas mais comumente utilizadas em matrizes alimentares

pertencem aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium. Espécies de Lactobacillus

17

das quais foram isoladas cepas probióticas incluem L. acidophilus. L. johnsonii, L.

casei, L. rhamnosus, L. gasseri e L. reuteri. As estirpes de Bifidobacterium incluem

B. bifidum, B. longum e B. infantis24.

Bactérias do gênero Lactobacillus sp. são produtoras de ácido láctico e

pertencem a um grupo de micro-organismos gram-positivos, que ao longo dos anos

têm sido bem utilizados na fermentação de alimentos22.

Lactobacillus são bactérias comumente encontradas no trato gastrointestinal,

bem como são encontrados na cavidade oral e vaginal de humanos 25. Esses micro-

organismos são capazes de produzir substâncias antimicrobianas, como

bacteriocinas, ácido láctico e peróxido de hidrogênio, que são fatores responsáveis

por controlar o crescimento de bactérias potencialmente patogênicas26.

L. acidophilus é classificado como uma bactéria homofermentativa que

converte hexoses exclusivamente em ácido lático27. Além de produtos lácteos, essa

espécie vem mostrando resultados positivos sendo inoculada em produtos vegetais,

como é o caso de sucos de frutas28.

3.2 EFEITOS BENÉFICOS DOS PROBIÓTICOS

Os probióticos desempenham efeitos benéficos no trato digestivo, mantendo o

equilíbrio da microbiota intestinal e impedindo que micro-organismos potencialmente

prejudiciais nelas presentes exerçam seus efeitos negativos29.

Ou seja, quando ingeridos em quantidades adequadas, são capazes de

modular a microbiota intestinal, neutralizando possíveis disfunções e

desempenhando atividade antagônica a micro-organismos patogênicos7.

Além disso, aspectos fisiológicos como o desenvolvimento da imunidade inata

e adaptativa, relativa à susceptibilidade a infecções, tolerância imunológica,

biodisponibilidade de nutrientes e função de barreira intestinal podem ser modulados

pela microbiota intestinal30. Devido a capacidade dos Lactobacillus produzirem ácido

láctico e ácido acético para diminuir o pH no trato gastrointestinal e competir por

nutrientes ou sítios de adesão epitelial com patógenos, são capazes de para inibir o

crescimento destes31.

Assim, diversos autores têm reportado os efeitos benéficos de culturas

probióticas sobre a saúde do hospedeiro, como na prevenção de colite ulcerativa,

síndrome do intestino irritável, doença de Crohn, artrite reumatoide, infecções

18

(diarréia infecciosa, Helicobacter pylori, infecções de pele e vaginais), na redução do

colesterol, síntese de vitaminas, e atividade antimutagênica29,27,32.

Probióticos também apresentam efeitos na saúde em um amplo espectro de

condições como síndrome do intestino irritável (SII), diarreia por viajantes, cárie

dentária, úlceras causadas por Helicobacter pylori, encefalopatia hepática,

enterocolite necrosante neonatal (NEC), para prevenção do câncer de cólon33,34,35.

Em pesquisa, foi observado possível benefício de um probiótico no tratamento

da Doença Inflamatória Intestinal (DII)37. Em outro estudo, realizado com gestantes,

foi visto que suplemento nutricional com probióticos administrado durante o final da

gestação e início da lactação foi bem tolerado e seguro, trazendo benefícios para a

mãe e o bebê38.

Foi observado também que a utilização de probióticos, de diferentes cepas de

Lactobacillus sp. estão associadas à diminuição do número de contagens de S.

mutans na placa dentária39. Além disso, uma pesquisa utilizando micro-organismos

probióticos na prevenção e tratamentos de saúde sugeriu que a utilização de L.

acidophilus YT1 poderia auxiliar no alívio dos sintomas da menopausa, como

aumento da sensibilidade à dor, depressão, gordura corporal e perda óssea em

mulheres na menopausa, sugerindo o desenvolvimento de um alimento funcional e

probiótico para mulheres idosas37.

É conhecida também, a relação do uso de probióticos com a redução

significativa dos níveis de colesterol total e de LDL-c em adultos

hipercolesterolêmicos, e consequentemente reduz os fatores de risco para o

desenvolvimento de doenças cardiovasculares18.

3.3 SUCO DE FRUTAS COMO VEÍCULO DE CULTURAS PROBIÓTICAS

Os probióticos estão disponíveis comercialmente em diferentes tipos de

produtos como alimentos, suplementos alimentares e medicamentos. No entanto,

estes produtos alimentares que contém culturas probióticas disponíveis

comercialmente são quase exclusivamente derivados lácteos6.

Por este motivo, com o surgimento de novas tendências alimentares e o

aumento da adesão ao veganismo e outros comportamentos alimentares que optam

por não consumir leite e derivados, bem como o crescimento de pessoas

19

intolerantes à lactose e com alergia às proteínas do leite, há a necessidade de

produtos probióticos alternativos que atendam a necessidade desse público61.

Apesar da fermentação láctica estar muito mais frequentemente associada ao

leite e a subprodutos lácteos, como o soro de leite, ela também pode ser obtida a

partir de outros substratos, como as polpas de frutas, desde que possuam açúcares

fermentáveis em suas composições. O uso de frutas apresenta ainda um diferencial,

quanto a incorporação de aromas e nutrientes específicos, resultando em produtos

com características próprias e isentos de lactose, que podem ser bem aceitos pelo

consumidor40.

Sendo assim, os sucos de frutas podem constituir um meio alternativo para

veículos de bactérias probióticas devido à presença de carboidratos fermentescíveis

e consumidos de maneira regular por uma grande parcela da população, além do

aspecto nutricional de sua composição rica em minerais, vitaminas, fibras dietéticas

e vários componentes fitoquímicos41,28.

Muitas frutas e polpas têm sido utilizadas como matrizes para fermentação

lática. Em um estudo onde foi realizada a fermentação no suco de abacaxi, com

resultados adequados que mostram atividade probiótica, sugerindo assim, que o

suco da fruta é um substrato adequado para incorporação de probióticos8.

Sobre os micro-organismos, um estudo sugere atividade antimicrobiana de L.

plantarum LS5 fermentado em suco de limão doce contra Salmonella typhimurium e

Escherichia coli O157:H732.

Em pesquisa, utilizando suco de caju como substrato para fermentação láctica

por Lactobacillus casei a 30 °C; de acordo com os pesquisadores, a adição de

açúcar ao suco favoreceu a contagem de células viáveis e ao se estocar os sucos

fermentados a 4 °C foi observado que L. casei é capaz de continuar a produzir ácido

lático por 42 dias, e, consequentemente, reduzir o pH dos sucos mesmo em baixas

temperaturas42.

Outro fator observado, a polpa de Juçara (Euterpe edulis) como substrato

para o crescimento de culturas probióticas, Guergoletto et al.43 observam uma

elevação na concentração de compostos fenólicos totais e nas propriedades

antioxidantes.

Pesquisadores otimizaram a fermentação do suco de melão por L. casei

NRRL B-442, onde foi observado boa viabilidade celular (108 UFC/mL) alcançada no

20

final da fermentação. Este nível foi mantido durante 42 dias de armazenamento sob

refrigeração44.

Outro resultado positivo na contagem de células viáveis e também na

estabilidade positiva até 42 dias sob armazenamento refrigerado, com maior

viabilidade de L. casei no suco de caju adoçado. Foi observado também que a

fermentação proporcionou um bom efeito conservante na atividade antioxidante e no

teor de ácido ascórbico do suco de caju quando comparado ao suco não

fermentado, conferindo assim benefícios nutricionais, sendo assim uma bebida

funcional41.

Hashemi et al.32 utilizaram L. plantarum na inoculação do suco de limão doce

e observaram uma viabilidade de 8,52 (0,34) Log UFC/mL, enquanto após 28 dias

de armazenamento a 4 ºC, eles foram reduzidos para 7,14 (0,21) Log UFC/mL,

demonstrando uma diminuição aceitável. Deste trabalho foi possível observar

também que a fermentação no suco de limão doce poderia melhorar as propriedades

químicas como atividade antioxidante, bem como propriedades antibacterianas,

sendo assim o suco fermentado pode ser usado como alimento funcional não-lácteo.

Em pesquisa analisando as condições de fermentação em uma bebida

probiótica de cupuaçu, também foi observada a viabilidade da inoculação do micro-

organismo L. casei na bebida. Inoculou-se 7,00 Log UFC/mL e após 24 h de

fermentação microbiana, contagens superiores a 8,00 Log UFC/mL foram

observados. Podendo-se concluir que o cupuaçu é uma boa matriz para a produção

de bebidas probióticas6.

A fermentação lática no suco de melão, também se mostrou positiva e viável,

com crescimento intenso nas primeiras horas de fermentação, com fase exponencial

de crescimento de 8 h para L. casei44.

Outro estudo que testou diferentes matrizes, mostrou que polpas de manga e

de goiaba em composição ou não com o soro de leite mostraram boa potencialidade

como substratos para a fermentação láctica de uma cultura mista de L. casei, L.

bulgaricus e S. termophillus a 37 oC40.

Assim, diferentes matrizes vegetais têm apresentado resultados satisfatórios

para fermentação lática, com fornecimento eficaz para a viabilidade de diferentes

micro-organismos.

21

3.4 CAJÁ (Spondias mombin L.)

O consumo de frutas e vegetais está associado à diminuição do risco de

doenças cardíacas e câncer. Os antioxidantes presentes nos frutos atuam inativando

espécies reativas de oxigênio envolvidas na iniciação ou progressão dessas

doenças11.

O cajá é o fruto da cajazeira, árvore frutífera que faz parte da família

Anacardiaceae e com nome científico de Spondias mombin L., é extremamente

aromático e rico em carotenoides, que dão à sua polpa, além de uma intensa

coloração amarela, um apelo funcional significativo45.

Além da alta concentração de carotenóides, o cajá possui elevado teor de

componentes fenólicos e vitamina C, que dão a polpa uma notável atividade

antioxidante. Além de suas características marcantes de sabor, a fruta é uma boa

fonte de pró-vitamina A. Possui também um alto teor de taninos que afere à polpa do

cajá como um antioxidante natural46.

O cajá tem sido usado nas mais diferentes preparações, como sucos, picolés,

sorvetes, geleias e iogurtes. Seus produtos têm sido amplamente apreciados no

mercado, além da popularização de suas qualidades nutricionais, seu sabor exótico,

agridoce também é um atrativo47.

Avaliando as polpas de cajá no seu aspecto funcional, sugerem resultados

positivos para atividade antioxidante, bem como, quantidades significativas de

fenólicos totais, minerais (ênfase em cobre e potássio) e carotenoides48.

Considerando a importância dos alimentos funcionais para a saúde humana,

os benefícios da ingestão diária de culturas probióticas e que as fontes alimentares

de probióticos ainda estarem restritas a produtos lácteos, é importante que novas

bebidas probióticas sejam desenvolvidas, com o intuito de ampliar o mercado deste

produto, além de oferecer opções aos indivíduos que não podem ou não apreciam o

consumo de produtos lácteos. Diante do exposto, devido a suas excelentes

características nutricionais e bioativas, o suco de cajá poderia ser um veículo de

micro-organismos probióticos, favorecendo o seu crescimento, viabilidade,

sobrevivência e propriedades funcionais.

22

4 METODOLOGIA

4.1 ELABORAÇÃO DO SUCO DE CAJÁ

O cajá (Spondias mombin L.) foi adquirido em estabelecimentos comerciais

da cidade de Natal-RN durante o período de agosto de 2018 a outubro de 2019. As

frutas foram selecionadas, higienizadas com uma solução de hipoclorito de sódio a

1% por 15 minutos, em seguida, lavadas com água corrente, trituradas em

processador e prensadas. Após a extração, o suco foi filtrado, em seguida foi medido

o valor de sólidos solúveis totais sendo estabelecido padrão de 8,0 ºBrix pela adição

de água destilada, e posteriormente a isso, foi submetido ao processo de

pasteurização (80 ºC por 5 minutos) e armazenado a -20 °C até a fermentação. O

projeto foi cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do

Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) sob número AB1B7B2, em

11/10/2018.

4.2 OBTENÇÃO DO SUCO DE CAJÁ PROBIÓTICO

4.2.1 MICRO-ORGANISMO

A linhagem de Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 utilizada neste projeto

para elaboração do suco probiótico foi obtida da coleção de culturas do

Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (U.S. Departament of Agriculture,

ARS Culture Collection- NRRL, Peoria, Illinois). A cepa foi armazenada a -20 °C em

microtubos contendo caldo MRS (Man, Rogosa e Sharpe) e glicerol a 50% (m/v),

segundo a metodologia de Pereira et al.6

4.2.2 ATIVAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO

Para ativação do microrganismo, 8 mL da cultura estoque em glicerol 50%, na

qual se encontra a cepa de L. acidophilus NRRL B-4495, foram transferidos

assepticamente para Erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL do caldo MRS e 10

mL de tampão fosfato 200 mM pH 6,5. Esse cultivo inicial foi realizado em estufa

estática a uma temperatura de 37 °C por 12 h, para se atingir a concentração de

células na ordem de 109 UFC/mL, equivalente a 0,600 de absorbância a 590 nm na

23

escala de McFarland baseado em Fonteles et al44. Esta suspensão foi utilizada como

inóculo do processo de fermentação.

4.2.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE

FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

A otimização das condições de pH inicial e temperatura de fermentação do

suco de cajá por L. acidophilus NRRL B-4495 foi realizada através de um

delineamento composto central rotacional (DCCR) 22 com 4 pontos axiais e

quadruplicata no ponto central, totalizando 12 ensaios. O ajuste do pH inicial dos

sucos foi realizado pela adição de bicarbonato de sódio 4 M. Em seguida, o volume

de 5 mL da linhagem ativada em caldo MRS foi transferido assepticamente para

frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do suco com diferentes

condições de pH. Os frascos foram incubados em estufa estática por 24 h em

diferentes temperaturas para avaliação da contagem de células viáveis. As

condições de pH inicial e temperatura foram definidas com base no trabalho de

Pereira et al.6. Os fatores e os níveis utilizados estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Fatores e níveis utilizados no delineamento composto central rotacional

(DCCR) 22 para otimização das condições de pH e temperatura de fermentação do

suco de cajá por L. acidophilus NRRL B-4495

Fatores Níveis

-1,41 -1 0 +1 +1,41

Temperatura (°C) 20,1 23,0 30,0 37,0 39,9

pH 3,38 4,00 5,50 7,00 7,62

4.2.4. AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO

Após determinação das condições de pH e temperatura ótimos na Seção

4.2.3, foi determinado o tempo de fermentação que favoreça a maior viabilidade

celular. Por tanto, o volume de 5 mL da linhagem L. acidophilus em caldo MRS foi

transferido assepticamente para frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL

do suco. Os frascos foram incubados na estufa estática por até 24 h, com retirada de

amostras a cada 2 h para contagem de células viáveis. O restante da amostra foi

24

submetida a centrifugação a 2500 rpm por 15 minutos. No sobrenadante foram

analisados pH, acidez titulável, sólidos solúveis totais, proteínas totais, compostos

fenólicos e atividade antioxidante.

4.3 AVALIAÇÃO DE VIABILIDADE, CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E

FUNCIONAIS DO SUCO PROBIÓTICO

4.3.1 VIABILIDADE

A viabilidade de L. acidophilus no suco de cajá fermentado foi avaliada

conforme metodologia previamente descrita por Pereira et al.6. Para cada amostra,

foram realizadas diluições decimais seriadas em água peptonada a 0,3% nas ordens

de 10-1 a 10-9. Em seguida, 100 μL das diluições 10-4 a 10-9 foram semeadas por

“spread plate” em placas contendo ágar MRS com espalhamento utilizando-se alça

de Drigalski. As placas foram incubadas a 37 °C por 72 h em estufa bacteriológica, e

em seguida, foi realizada a contagem das colônias de Lactobacillus sp., e a

viabilidade expressa em logaritmo de Unidades Formadoras de Colônias por mL

(Log UFC/mL).

4.3.2 pH

O acompanhamento do potencial Hidrogeniônico (pH) foi realizado ao longo

de todo o cultivo utilizando-se um potenciômetro de bancada49.

4.3.3 ACIDEZ TITULÁVEL

Em um Erlenmeyer, 5 mL do suco diluído 1:10 em água destilada foi titulado

com uma solução de NaOH 0,01 M utilizando fenolftaleína como indicador49. A

acidez total foi expressa em g de ácido cítrico por 100 mL de suco.

4.3.4 SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS

A medição da quantidade de açúcares de uma solução é fornecida através

dos sólidos solúveis totais - SST (°Brix). Três a quatro gotas do sobrenadante do

suco fermentado foram levadas ao refratômetro de Abbe para medição dos SST49.

25

4.3.5 PROTEÍNAS TOTAIS

Para determinação da concentração de proteínas totais presentes no suco,

100 μL de cada amostra foi misturada com 3,0 mL do reagente Bradford. Os tubos

foram agitados suavemente em agitador de tubos tipo vórtex e, em seguida,

incubados durante 5 minutos.

Logo após, foi realizada a leitura em espectrofotômetro a 595 nm, contra um

branco, no qual a amostra foi substituída por água destilada50. A curva de calibração

foi realizada através de diluições de uma solução de albumina de soro bovino (BSA),

utilizando-se uma faixa de concentração de 0,1 a 1,0 g/L.

4.3.6 FENÓLICOS TOTAIS

Os compostos fenólicos totais nos sucos foram analisados através do método

Folin-Ciocalteau de acordo com Fujita et al.51 adaptado. Em tubos de ensaio foram

adicionados sequencialmente 1 mL de Folin-Ciocalteau 50% (v/v), 400 μL de

carbonato de sódio 7,5% (p/v) e 400 μL da amostra. Após 30 minutos protegidos da

luz, as amostras tiveram suas absorbâncias medidas em espectrofotômetro a 750

nm contra um branco, no qual a amostra foi substituída por água destilada. Uma

curva padrão foi construída com ácido gálico na faixa de concentração de 10 a 200

mg/mL e a concentração dos componentes fenólicos totais expressa em

microgramas de equivalente de ácido gálico por mililitro de amostra (µg EAG/mL).

4.3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

4.3.7.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL DPPH

A capacidade de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi

avaliada conforme Nóbrega et al.52 com adaptações, utilizando microplacas com 96

poços. Em resumo, 200 µL de uma solução de DPPH 0,1 mM em solução de etanol

50% foram adicionados a 40 µL de cada amostra. A mistura foi incubada por 25

minutos em câmara escura e a leitura realizada a 517 nm em leitor de microplacas.

Uma curva padrão foi construída com concentrações de trolox (ácido 2-carboxílico-6-

hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano) variando de 10 a 200 µM e os resultados

expressos em µmolar de trolox equivalente por mililitro de amostra (µmolar TE/mL).

26

4.3.7.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELA CAPTURA DO RADICAL ABTS

Para a determinação da atividade antioxidante pelo método do radical 2,2′-

azinobis (3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfônico) (ABTS), foi utilizada a metodologia

descrita por Rufino et al.53 com adaptações, utilizando microplacas com 96 poços.

Uma alíquota de 20 µL do suco diluído em etanol e água destilada foi adicionada à

microplaca. Em seguida, 280 µL do radical ABTS foram adicionados e a microplaca

permaneceu em repouso por 6 minutos em câmara escura e a leitura realizada a

734 nm. Uma curva padrão foi construída com concentrações de trolox, variando de

0 a 800 µM, e os resultados foram expressos em µmolar de trolox equivalente por

mililitro de amostra (µmolar TE/mL).

4.3.8 ANÁLISE DA COR

A análise de cor foi realizada por meio de espectrofotometria de reflectância,

utilizando-se um analisador de cor modelo ACR 1023 (Instrutherm). As amostras

foram colocadas em recipientes de vidro, dentro de uma câmara branca com

iluminação apropriada, para realização da leitura. Os parâmetros foram obtidos no

sistema RGB (vermelho, verde e azul) e convertidos para o espaço de cor CIE Lab,

utilizando o programa OpenRGB, e expressos em coordenadas de cor (L*, a* e b*).

4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A atividade antimicrobiana foi avaliada utilizando o método de microdiluição

em caldo conforme metodologia previamente padronizada pelo Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI) com adaptações54. O sobrenadante da cultura

(sem células) do suco de cajá fermentado por 16 h foi obtido por centrifugação (2500

rpm por 15 minutos). A filtração do sobrenadante foi realizada usando uma

membrana de 0,22 µm para remover as células residuais.

Foram utilizadas linhagens de Staphylococcus aureus ATCC 29213,

Enterococcus faecalis ATCC 4028, Escherichia coli ATCC 25922 e Klebsiella

pneumonie ATCC 10031. As linhagens foram semeadas em meio caldo "Brain Heart

Infusion” (BHI), e incubadas a 37 °C por 24 h. Após a incubação, obteve-se uma

turbidez equivalente a 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1 x 108

UFC/mL), que foi diluída 10 vezes, resultando em uma suspensão com

27

aproximadamente 107 UFC/mL. Aos poços da microplaca foram adicionados 100 µL

de caldo BHI, 100 µL do sobrenadante do suco (sem células) e por fim, 5 µL da

suspensão microbiana.

Poços contendo apenas caldo BHI na ausência da suspensão de micro-

organismo foram utilizados para o controle de esterilidade, e os poços com a

suspensão de micro-organismo na ausência do suco foram usados como controle

positivo de crescimento. A microplaca foi incubada por 24 h, sob agitação de 200

rpm, a 37 °C. A leitura da absorbância foi realizada no comprimento de onda 492 nm

em um leitor de microplacas. A partir da leitura espectrofotométrica foi determinada a

porcentagem de inibição do crescimento microbiano, de acordo com a equação

abaixo55:

% Inibição do crescimento microbiano = [1- (Ac/A0)] x 100

Em que: Ac representa a média das absorbâncias do suco testado já

subtraída do valor da absorbância obtida para o suco sem a adição do inóculo, e, A0

a média das absorbâncias do controle de crescimento microbiano (sem o suco).


DIAS

O suco de cajá fermentado obtido sob condições otimizadas foi armazenado

em tubos estéreis, fechados e armazenados em refrigerador a 4 ºC. A viabilidade de

L. acidophilus, foi determinada antes do armazenamento e em intervalos de 7 dias,

durante o período de 28 dias, de acordo com metodologia previamente descrita na

Seção 4.3.1.


CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS

A avaliação da sobrevivência de L. acidophilus NRRL B-4495 em condições

gastrointestinais simuladas foi realizada antes e após 28 dias de armazenamento do

suco sob refrigeração, conforme metodologia previamente descrita por Brinques et

al.56 e Farias et al.57, com adaptações.

28

Para isso, as células de L. acidophilus foram recolhidas do suco de cajá após

centrifugação a 3600 rpm por 15 minutos, e ressuspendidas em solução salina

(0,85% p/v) contendo 3 g/L de pepsina após ajuste de pH para 2,0, pela adição de

HCl 5 M (condições gástricas simuladas-CGS). As amostras foram incubadas a 37

ºC e 70 rpm de agitação, retirando alíquotas de 1 mL nos tempos 0, 60 e 120

minutos.

Passados os 120 minutos correspondentes à etapa gástrica, os tubos foram

centrifugados (3600 rpm por 15 minutos) e os sobrenadantes descartados. Em

seguida, o pellet foi ressuspendido em fluido intestinal simulado (Condições

intestinais simuladas -CIS), obtido pela adição de 1 g/L de pancreatina e 10 g/L de

sais biliares em solução salina (0,85% p/v) após ajuste do pH para 8,0 com solução

de NaOH 2,0 M. As amostras foram incubadas a 37 ºC e 70 rpm de agitação,

retirando-se alíquotas de 1 mL nos tempos 180 e 240 minutos. Por fim, a viabilidade

de L. acidophilus nas CGS e CIS foi avaliada conforme descrito na Seção 4.3.1.

4.7 AVALIAÇÃO DA ACEITAÇÃO DO PRODUTO

4.7.1 ASPECTOS ÉTICOS

O presente projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética do Hospital

Universitário Onofre Lopes (HUOL) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN) para julgamento, de acordo com a Resolução CNS/MS 466/12 (BRASIL,

2012), aprovado conforme o N° 07811118.9.0000.5292 do Certificado de

Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) (ANEXO A). O suco de cajá

fermentado com L. acidophilus foi submetido a testes afetivos, sendo esses

realizados no Laboratório de Análise Sensorial do Departamento de Nutrição da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cabines individuais e sob

condições de luminosidade específicas.

4.7.2 PREPARO DAS AMOSTRAS

O suco de cajá foi produzido de acordo com as seções 4.1 e 4.2 desta

metodologia com algumas adaptações. Após obtenção do crescimento microbiano

conforme seção 4.2.2, o conteúdo foi transferido para tubos de centrífuga estéreis e

centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos, para separação da biomassa. Em seguida,

29

o meio de cultura sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com

solução de NaCl 0,9%, e novamente centrifugadas por três ciclos. Por fim, o pellet

celular de cada tubo foi resuspenso em 50 mL de solução NaCl 0,9% e essa

suspensão foi utilizada como inóculo para fermentação do suco de cajá, preparado

utilizando água mineral e com pH ajustado para 6,4 com bicarbonato de sódio grau

alimentício. Antes do consumo dos provadores, as amostras foram submetidas a

análises microbiológicas, não sendo detectada a presença de coliformes a 45º C e

nem Salmonella sp. Sendo assim, as 3 formulações de suco estavam de acordo com

os padrões legais vigentes no Regulamento Técnico sobre o padrão microbiológico

para alimentos, estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA)97

As amostras das três formulações de suco submetidas aos testes sensoriais

apresentam diferentes características, sendo F1 a formulação padrão de suco de

cajá, F2 o suco fermentado de cajá, e F3 o suco fermentado e adoçada com 10% de

estévia em pó (Tabela 2). Desse modo, foram codificadas com algarismos de três

dígitos aleatórios, acondicionadas em copos de plásticos descartáveis. Os

provadores receberam as três amostras, com o volume de 20 mL cada, de forma

monádica (uma de cada vez) e sequencial (uma após a outra), de forma aleatória,

acompanhadas de um copo com água mineral.

Tabela 2: Composição das formulações de suco de cajá utilizadas na análise

sensorial.

Formulação Composição

F1 Suco de cajá padrão (não fermentado)

F2 Suco de cajá fermentado com L. acidophilus por 16 h

F3 Suco de cajá fermentado com L. acidophilus por 16 h e

adoçado com 10% de estévia em pó

4.7.4 RECRUTAMENTO

O recrutamento ocorreu por meio do preenchimento do questionário

(APÊNDICE A), sendo obtidas informações sobre afinidade com os produtos, dados

30

sócios demográficos e condições de saúde dos indivíduos. Assim, foram

selecionados os indivíduos que consumiam habitualmente suco de cajá, não

apresentaram informações sobre intolerância, alergias ou aversão aos ingredientes

presentes na formulação, maiores de 18 anos e que concordaram em participar da

pesquisa assinando o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE

(APÊNDICE B), onde consta o objetivo da pesquisa bem como os procedimentos

metodológicos, riscos e benefícios. Foram recrutadas 95 voluntários, dos quais

apenas 88, entre funcionários, professores e acadêmicos que frequentam o

Departamento de Nutrição e o Restaurante Universitário (DNUT) da UFRN, estavam

aptas para participarem da análise.

4.7.5 TESTES AFETIVOS

Utilizou-se o Teste de Aceitação Global para avaliar as três formulações de

suco de cajá, empregando a escala hedônica estruturada de nove pontos, variando

de “gostei muitíssimo” a “desgostei muitíssimo” 58 descritos na ficha utilizada para o

teste (APÊNDICE C).

A partir dos dados coletados, determinou-se o índice de aceitabilidade (IA)

para cada formulação. Para o cálculo do índice, dividiu-se a nota média obtida no

produto pela nota máxima dada, multiplicando essa razão por 100. Foi considerando

como 100% a maior nota alcançada por cada amostra analisada, tomando como

critério de decisão para classificação de boa aceitação o IA igual ou superior a

70%96.

Também foi utilizado o teste escala do ideal “Just About Right” (JAR), método

pelo qual é quantificado a presença de determinados atributos, e/ou intensidades.

Assim, os atributos escolhidos para avaliação foram acidez, sabor doce,

viscosidade e cor, identificando-se a preferência dos consumidores por meio de um

padrão de 5 (cinco) pontos na escala, em que os provadores decidiram para acidez

se o suco sabor doce estava “muito mais ácido do que gosto”, “muito menos ácido

do que eu gosto” ou “ideal, do jeito que eu gosto” (parâmetro ideal), e para o sabor

doce “muito mais intenso do que gosto”, “muito menos intenso do que eu gosto” ou

“ideal, do jeito que eu gosto” (parâmetro ideal), para avaliação da viscosidade a

escala variou de “muito menos viscoso do que eu gosto” a “ muito mais viscoso do

31

que eu gosto” ou “ideal, do jeito que eu gosto” e para avaliar o atributo “muito menos

claro do que eu gosto” a “muito mais escuro do que gosto” ou “ideal, do jeito que eu

gosto”, conforme descrito nas fichas utilizada para o teste (APÊNDICE C).

Ainda, avaliou-se a intenção de compra do produto pelos julgadores, por meio

de uma escala de 5 pontos, descrita no APÊNDICE C, a fim de avaliar sua aceitação

no mercado 59

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados da caracterização do suco foram expressos como média

aritmética (desvio-padrão). Para a análise estatística foi realizada a Análise de

Variância (ANOVA) com pos-teste de Tukey, considerando o grau de confiança de

95% (p<0,05) como resultado significativo, utilizando o software Statistica 8.0

(StatSoft Inc., Tulsa, EUA).

Todos os experimentos do delineamento composto central rotacional foram

realizados aleatoriamente e os dados foram tratados com o auxílio do software

Statistica. A significância estatística da equação do modelo de segunda ordem foi

determinada pelo teste F (ANOVA).

Para a estatística da análise sensorial, o teste de Shapiro-Wilk foi aplicado

para testar a normalidade dos dados. Para avaliar se houve diferença na aceitação

global entre as formulações do suco foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis com teste

Dunn para comparações Múltiplas e correção de Bonferroni. A análise de

componentes principais foi usada para criar o mapa de p preferência interno. Para

avaliar os dados JAR foi executada a análise de penalidade. Todas as análises

foram realizadas com o nível de significância de 5% (p<0,05) e utilizando o software

XLStat (Addinsoft, Paris, França). Para as outras análises (Perfil dos provadores,

teste de aceitação global e Intenção de compra) foi utilizado o Microsoft Office Excel

2016 para gerar médias, desvio- padrão e percentuais.

32

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE pH INICIAL E TEMPERATURA DE

FERMENTAÇÃO DO SUCO USANDO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Os efeitos da temperatura e pH inicial do suco de cajá sobre a resposta da

viabilidade celular de L. acidophilus, foi avaliada após 24 h de fermentação

empregando o delineamento composto central rotacional (DCCR) 22. Conforme a

condição experimental adotada, a resposta viabilidade variou de 5,06 a 8,02 Log

UFC/mL (Tabela 3).

Tabela 3: Matriz do DCCR 22 para otimização das condições de temperatura e pH

inicial de fermentação do suco de cajá utilizando L. acidophilus.

aResultado expresso em média (DP)

bPonto central

Pode-se observar que mesmo com diferentes valores de temperatura de pH

sendo testados, a contagem de células viáveis, por maioria se manteve-se alta,

Ensaio Temperatura (ºC)

pH Viabilidadea

(Log UFC/mL)

1 23,0 (-1) 4,00 (-1) 6,01 (0,17)

2 37,0 (+1) 4,00 (-1) 6,10 (0,26)

3 23,0 (-1) 7,00 (+1) 6,65 (0,05)

4 37,0 (+1) 7,00 (+1) 6,84 (0,11)

5 20,1 (-1,41) 5,50 (0) 6,11 (0,07)

6 39,9 (+1,41) 5,50 (0) 6,19 (0,07)

7 30,0 (0) 3,38 (-1,41) 5,06 (0,02)

8 30,0 (0) 7,62 (+1,41) 7,18 (0,00)

9b 30,0 (0) 5,50 (0) 8,02 (0,03)

10b 30,0 (0) 5,50 (0) 6,79 (0,00)

11b 30,0 (0) 5,50 (0) 6,98 (0,03)

12b 30,0 (0) 5,50 (0) 6,93 (0,05)

33

sugerindo assim a robustez desse micro-organismo No que diz respeito à resposta

viabilidade, no diagrama de Pareto (Figura 1) é possível observar que apenas a

variável pH (termo linear - L) apresentou significância estatística (p > 0,05). Os

resultados mostraram, ainda, que a viabilidade foi afetada pelo fator pH de maneira

positiva, ou seja, um incremento nesta variável (nível -1 para nível +1) conduziu a

um incremento na resposta. Assim, foi possível observar que valores de pH abaixo

de 5,0, foram aqueles que apresentaram menor viabilidade celular.

,092453

,2861543

-2,32807

-2,41124

3,159769

p=0,05

Ef eito estimado (Valor absoluto)

1Lby 2L

(1)Temp(L)

Temp(Q)

pH(Q)

(2)pH(L)

Figura 1: Diagrama de Pareto para avaliação do efeito estimado das variáveis pH e

temperatura sobre a resposta a resposta viabilidade celular de L. acidophilus em

suco de cajá.

A partir dos coeficientes de regressão ajustados, obtidos pelo software

Statistica 7.0, foi construído o modelo estatístico que correlaciona a viabilidade

celular de L. acidophilus (Log UFC/mL) com os fatores temperatura e pH inicial,

conforme observado na Equação 2:

Viabilidade (Log UFC/mL) = 7,18 + 0,10X1 - 0,90X12 + 1,09 X2- 0,93 X2

2 + 0,04 X1

X2

Em que, X1 é a temperatura e X2 o pH inicial do suco.

34

Observando o gráfico de superfície de resposta (Figura 2) podemos observar

que o ponto crítico, de maior viabilidade celular, no presente estudo foi no pH de 6,4.

Como resultado, definiu-se que o pH do suco cajá seria ajustado para 6,4 em todas

as etapas seguintes do trabalho.

Figura 2: Gráfico de superfície de resposta para viabilidade celular de L. acidophilus

(Log UFC/mL) fermentado em suco de cajá por 24 h em função das variáveis

temperatura e pH.

Os resultados encontrados neste trabalho estão de acordo com os dados

previamente descritos na literatura, que mostram o pH como uma variável

fundamental para crescimento e manutenção bactérias do gênero Lactobacillus. De

maneira geral, é descrito na literatura que as bactérias do gênero Lactobacillus com

crescimento favorecido em condições relativamente ácidas, com valores de pH

variando entre 5,5 a 6,5, devido à produção de ácido láctico como principal

metabólito60,61.

35

Similarmente aos resultados encontrados no presente trabalho, Santos Filho

et al.7 produziram um suco probiótico a partir de suco de cacau fermentado por L.

casei NRRL-442, obtendo máxima viabilidade no pH de 6,2 e na temperatura de 33

°C. Além disso, em suco de caju, também observou-se que o maior crescimento e

viabilidade de L. casei NRRL-442 ocorreu em pH 6,442. Outra pesquisa, realizada

com L. rhamnosus ATCC 7469 fermentado em suco de maracujá da caatinga

descreveu o pH inicial de 6,0 como ideal para o crescimento28.

Como a análise estatística revelou que a variável temperatura não influenciou

a resposta viabilidade de L. acidophilus em suco de cajá, para utilização na etapa

seguinte definiu-se a temperatura de 30 °C (ponto central), baseado em estudos

encontrados na literatura61. O resultado encontrado no presente trabalho, diverge do

relatado por Pereira et al.6, que ao avaliar os efeitos da temperatura e pH sobre a

viabilidade L. casei NRRL-442 em suco de cupuaçu, observam efeito significativo

apenas para variável temperatura. Tais diferenças de resultados podem ser

justificadas pelas diferenças de composição dos sucos avaliados.

Trabalhos anteriores avaliando a fermentação de L. casei em sucos de lichia

e abacaxi descreveram a temperatura de 30 °C como mais favorável para o

crescimento de probióticos62,63. Ademais, foi relatado que o crescimento e

funcionalidade de bactérias do ácido láctico é favorecido nas temperaturas de 30 a

37 °C6.

De acordo com a análise de variância – ANOVA (Tabela 4), o valor de F

calculado (6,45) para o modelo que expressa a viabilidade foi maior que o valor de

F1,10 tabelado (4,96) para 95,0% de confiança. Assim o modelo pode ser

considerado estatisticamente significativo.

A avaliação do modelo também foi realizada através da observação do gráfico

dos valores preditos versus valores observados, que é mostrado na Figura 3.

Salienta-se que o modelo foi considerado satisfatório, uma vez que os valores

observados experimentalmente aproximaram-se dos valores preditos pelo modelo.

36

Tabela 4: Análise de variância (ANOVA) para variável pH.

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática Valor de F

Regressão 2,3851 1 2,3851 6,63

Resíduo 3,6921 10 0,3692

Total 6,0772 11

F tabelado (95%) F1,10= 4,96

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5

Valores observados

5,2

5,4

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

Valo

res p

reditos

Figura 3: Valores observados versus valores preditos para a resposta viabilidade

celular de L. acidophilus em suco de cajá.

37

5.2 AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO

Após determinação das condições de pH e temperatura ótimos para

viabilidade celular de L. acidophilus em suco de cajá, o tempo de fermentação foi

analisado através de contagem das células viáveis por 24 h (Figura 4).

Figura 4: Perfil de viabilidade celular de L. acidophilus (Log UFC/mL) e sólidos

solúveis totais (°Brix) em suco de cajá fermentado por 24 h.

De acordo com a Figura 4, pode-se observar que após a inoculação houve

uma fase de adaptação (fase lag) no suco de cajá. Após 12 h de fermentação, o

micro-organismo apresentou crescimento exponencial, atingindo maior viabilidade às

16 h, com 12,9 (0,4) Log UFC/mL, motivo pelo qual elegeu-se este tempo como ideal

para produção do suco de cajá probiótico.

É importante destacar que os resultados apresentados na Figura 4

comprovam que L. acidophilus foi capaz de fermentar o suco de cajá com viabilidade

satisfatória assim como preconiza a legislação para leites fermentados de 6 Log

UFC/mL21, utilizando os nutrientes naturalmente presentes na bebida, sem

necessidade de adição de sacarose ou qualquer outro nutriente. Estes resultados

são interessantes no ponto de vista econômico e de segurança do produto, pois isto

38

não aumentará o custo nem os pontos de controle de contaminação, uma vez que

se trata de um produto probiótico.

Outros pesquisadores relatam que o tipo de substrato exerce influência direta

sobre os parâmetros de crescimento e viabilidade de probióticos. No estudo

utilizando o suco de cupuaçu como matriz, o tempo de 8 h de fermentação foi

suficiente para a linhagem L. casei NRRL-442 atingir sua viabilidade máxima, com

valores superiores a 9,0 Log UFC/mL6.

Por outro lado, em um estudo, com a linhagem L. plantarum, fermentado no

suco de maça, observou-se que foram necessárias 24 h para atingir a viabilidade

máxima de 8,5 Log UFC/mL64. Outrossim, foram necessárias 24 h de fermentação

para atingir a maior contagem de células viáveis em um estudo utilizando uma

mistura de frutas como veículo de probióticos65. Estes resultados, divergiram do

presente estudo, sugerindo assim que a matriz utilizada foi mais eficiente, já que

apenas 16 h de fermentação, foi suficiente para obter maior viabilidade celular.

Na avaliação da fermentação láctica no suco de melão por L. casei NRRL-442

foi observado crescimento celular intenso nas primeiras horas de fermentação. A

fase exponencial de crescimento foi de 8 horas, no entanto, foi visto que o

crescimento continuou até 20 h de fermentação, e, após este período foi observado

um declínio na viabilidade das células no meio de fermentação44.

Vale destacar que o resultado desta pesquisa obteve maior contagem de

células viáveis (12,9 Log UFC/mL) contrastando com o que é visto na literatura, até

o presente momento, que apesar de obterem viabilidade máxima em menor tempo

de fermentação, não atingiram valores de viabilidade tão altos como nessa pesquisa,

evidenciando a robustez do micro-organismo, bem como, possível êxito na

adaptação na matriz.

A Figura 4 mostra também o perfil de sólidos solúveis totais - SST (°Brix) em

suco de cajá durante as 24 h de fermentação. Pode-se observar que os açúcares

naturalmente presentes no suco de cajá, foram parcialmente consumidos durante a

fermentação, já que o mesmo não foi adicionado de sacarose, caracterizando o

metabolismo das bactérias do ácido lático que utilizam açúcares para a produção de

ácido lático. Ao longo da fermentação, a concentração de sólidos solúveis caiu de

8,55 (0,05) para 7,85 (0,05) °Brix em 16 h. Observa-se que no intervalo de maior

crescimento do micro-organismo (entre 12 e 16 h de fermentação) houve uma queda

mais pronunciada dos SST. No entanto, após 18 h de fermentação, a utilização

39

desses açúcares por L. acidophilus diminui, o que pode ser justificado pelo menor

crescimento do micro-organismo nas últimas horas de fermentação.

Em um estudo realizado com iogurte de extrato hidrossolúvel de soja

fermentado, foi observado que o maior consumo de sólidos solúveis totais coincidiu

com o tempo de crescimento celular mais intenso66, se assemelhando, assim, com o

observado no presente estudo.

Nesta pesquisa, ao longo das 24 h de fermentação, não foi observado

variação expressiva nos valores de pH, que oscilou entre 6,63 e 6,95 durante o

processo, o que se diferencia de outros estudos que relatam forte diminuição do pH

ao longo da fermentação76,67. Isso pode ser explicado pela necessidade de ajuste de

pH do suco de cajá, que é naturalmente ácido (1,99), e foi alterado com a adição de

bicarbonato de sódio, até atingir o pH ideal de 6,4, definido no planejamento

experimental. Assim, pode ter sido gerado um efeito tamponante, hipótese que

explicaria essa capacidade de resistir a mudanças de pH, sendo assim, esse fator

pode ter contribuído positivamente na viabilidade, já que se observa que a redução

do pH ao longo da fermentação é fator que influencia na redução dos micro-

organismos.

Em divergência com o atual estudo, em uma pesquisa utilizando o suco de

melão fermentado por L. casei foi relatado um perfil de pH decrescente em 24 h de

processo com o pH caindo de 6,0 para 3,544. Já em outro estudo realizado com

marmelo e maçã, observaram reduções no pH, por exemplo, de 6,6 para 4,8 após

16 h de fermentação68.

Apenas um trabalho, utilizando a polpa de pitaia fermentada com

L. casei, S. thermophilus e L. bulgaricus, mostrou resultados que se assemelham

com o presente estudo, no qual o pH também não variou ao longo das 24 h de

fermentação, neste caso devido a uma dificuldade de adaptação dos micro-

organismos40. Outra exceção quanto a baixa variação de pH, que se assemelha ao

presente estudo foi observado em um estudo utilizando a carambola, no qual o pH

se manteve entre 6,0 e 6,8 ao longo das 24 h de fermentação, nesse caso os

autores desse estudo sugerem uma dificuldade adaptativa da cultura lática aos

substratos da matriz40, que não foi o caso do presente estudo, visto que a linhagem

de L. acidophilus NRRL B-4495 obteve excelente viabilidade no suco de cajá

40

A Figura 5 mostra o perfil de acidez titulável (g ácido cítrico/100 mL) em suco

de cajá fermentado por L. acidophilus. Embora o pH não tenha sofrido variação

expressiva ao longo da fermentação, foi possível observar uma variação nos valores

de acidez titulável ao longo das 24 h. Inicialmente é visto que os valores de acidez

mais baixos são observados na fase de adaptação, ou seja, nas horas iniciais, e os

valores mais elevados entre a 14 e 16 h, onde ocorreu a maior crescimento celular.

Figura 5: Perfil de proteínas totais (mg/mL) e acidez titulável (g ácido cítrico/100 mL)

em suco de cajá fermentado por L. acidophilus.

Sabe-se que a acidez pode reduzir significativamente a viabilidade das

células microbianas, portanto torna-se essencial o seu monitoramento para garantir

os efeitos desejados sobre viabilidade. É relatado que L. acidophilus tolera acidez na

faixa de 0,3% a 1,9%69.

O resultado encontrado no presente estudo difere do estudo feito com frutas

tropicais, no qual foi observado que a acidez titulável tinha um perfil crescente a

partir de 24 h refletindo o maior crescimento microbiano40. O perfil crescente dessa

pesquisa foi a partir de 10 h, atingindo maior acidez titulável em 16 h. Após essa

hora há queda brusca dos valores de acidez atingindo os menores valores de acidez

até o final da fermentação.

41

De maneira análoga ao observado no presente trabalho, um estudo realizado

com iogurte de extrato hidrossolúvel de soja, fermentado por BAL mostrou que o

maior de valor de acidez titulável foi obtido no período de maior viabilidade celular66.

Neste estudo, a concentração de proteínas totais também foi avaliada durante

as 24 h de fermentação, como ilustrado na Figura 5. O suco não inoculado

apresentou uma concentração de proteínas totais de 0,19 (0,01) mg/mL. Durante a

fermentação, esta concentração variou pouco, com valores oscilando entre 0,20

(0,01) e 0,13 (0,01) mg/mL. Quando comparados à concentração de proteínas totais

com a viabilidade celular, pode-se notar que no período de maior crescimento

microbiano (16 h), foi observado menor concentração de proteínas, o que pode

sugerir maior metabolização das proteínas por parte do micro-organismo.

É de crucial importância analisar que, apesar da baixa concentração de

proteínas totais encontrada no suco, Sameh et al.70 descrevem que as espécies do

gênero Spondias são ricas em aminoácidos livres, como glicina, cisteína, serina,

alanina e leucina. A presença destes aminoácidos livres no suco de cajá representa

uma vantagem adicional, e também, poderia justificar a boa adaptação de L.

acidophilus na matriz estudada.

42

5.3 DETERMINAÇÃO DE COMPONENTES FENÓLICOS TOTAIS E ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE

A atividade antioxidante e a concentração de componentes fenólicos totais

foram inicialmente determinadas no suco não fermentado (SNF), como mostra a

Tabela 5.

Tabela 5: Concentração de componentes fenólicos totais e atividade antioxidante no

suco não fermentado.

Parâmetro Média (DP)

Fenólicos totais (µg EAG/mL) 609,3 (8,8)

DPPH (µmol TE/mL) 3,28 (0,02)

ABTS (µmol TE/mL) 3,56 (0,25)

Em seguida, avaliou-se a concentração de fenólicos totais e a atividade

antioxidante durante as 24 h de fermentação, e os resultados estão apresentados na

Figura 6.

Ao longo da fermentação foi observado que a atividade antioxidante, avaliada

através dos testes capacidade de sequestro dos radicais DPPH e ABTS, apresentou

variações, com atividades máximas de 0,38 (0,01) µmol TE/mL e 2,87 (0,13) µmol

TE/mL, respectivamente. A maior concentração de fenólicos de 123,20 (7,36) µg

EAG/mL ocorreu em 14 h de fermentação.

43

Figura 6: Concentração de componentes fenólicos totais e atividade antioxidante

(DPPH e ABTS) durante 24 h de fermentação do suco de cajá por L. acidophilus.

Antioxidantes são compostos capazes de retardar a velocidade da oxidação

através de um ou mais mecanismos impedindo a formação de radicais livres e

complexação de metais. A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se

principalmente às suas propriedades de oxido-redução desempenhando um papel

significativo na absorção e neutralização de radicais livres, podendo atuar, ainda,

como quelante de metais ou ainda na decomposição de peróxidos71.

No suco não fermentado (SNF), a concentração de fenólicos foi de 609,3 (8,8)

µg EAG/mL (Tabela 4), ou seja, valor quase cinco vezes superior aos valores

encontrados no suco fermentado (SF). Esse fato pode ser explicado devido aos

efeitos de processamento sofridos pelo suco antes e durante a fermentação. Sabe-

se que o teor de polifenóis no produto final depende da concentração e da atividade

do teor dos seus substratos, os ácidos fenólicos, além do pH, da temperatura e da

concentração de oxigênio dissolvido no suco72.

44

Sugere-se que o ajuste do pH do suco de cajá realizado antes da

fermentação seja responsável pela modificação do metabolismo de compostos

fenólicos, bem como sua disposição para a quantificação73. Em consequência do

teor de compostos fenólicos mais elevados no SNF, a atividade antioxidante da

amostra sem ajuste de pH também foi maior. Foi observada atividade antioxidante

(SNF) pelo sequestro do radical DPPH de 3,28 (0,02) µmol TE/mL e pelo radical

ABTS de 3,56 (0,25) µmol TE/mL (Tabela 4).

De maneira análoga ao encontrado no presente estudo, Hashemi et al.32

descreveram uma redução significativa na concentração de fenólicos totais em suco

de limão doce fermentado com L. plantarum LS5, o que foi atribuído ao metabolismo

destes componentes pelo micro-organismo.

Por outro lado, alguns estudos relatam o aumento de compostos fenólicos

totais ao longo da fermentação74,75,76. Esse fato pode estar relacionado à capacidade

das bactérias ácido-láticas converterem os compostos bioativos presentes no suco

em seus metabólitos, que resultam na produção de novos compostos fenólicos.

Um estudo mostrou em análise similar, após 24 h de fermentação, a cultura

bacteriana entra na fase de morte e, portanto, o aumento de fenóis totais é

insignificante75, resultado que difere do presente estudo, no qual percebeu-se a

morte celular, bem como a diminuição dos compostos fenólicos e atividade

antioxidante após a 16a hora de fermentação.

Outro estudo também mostra o aumento do sequestro do radical DPPH ao

longo da fermentação com linhagens de Lactobacillus sp., ou seja, confirma a

capacidade de atividade antioxidante em matrizes de origem vegetal35. Como foi

visto também que o teor total de polifenóis do suco de manga aumentou durante a

fermentação com o L. plantarum76.

Em outro trabalho, analisando estabilidade, foi observado que após 30 dias a

atividade antioxidante, bem como a concentração de fenólicos diminuíram. Podendo

ser essa diminuição a consequência do armazenamento dos frutos e suas perdas

naturais de armazenamento, bem como a presença de oxigênio, resultando na

oxidação de compostos fenólicos, e também pela baixa atividade das bactérias

probióticas em temperaturas refrigeradas77.

45

Em um estudo feito com duas matrizes diferentes, com frutas vermelhas e

verdes, foi visto um efeito positivo da fermentação de bactérias do ácido lático,

também do gênero Lactobacillus sp., na atividade antioxidante. Foi observado que

os compostos polifenólicos foram preservados nas amostras fermentadas65.

Assim, pode-se observar no presente estudo que, apesar do SF apresentar

uma diminuição do teor de fenólicos totais bem como a capacidade antioxidante, o

diferencial da bebida é associar as características antioxidantes do suco à presença

do micro-organismo probiótico.

5.4 AVALIAÇÃO DA COR

A cor é uma característica que compõe a qualidade sensorial de produtos

alimentícios no mercado, sendo de grande importância na aceitação do produto.

Assim, as alterações de cor nas formulações são ilustradas na Figura 7.

Figura 7: Representação fotográfica das três formulações analisadas, F1, F2 e F3,

respectivamente.

As amostras foram avaliadas em relação às coordenadas de cor, e os

resultados são apresentados na Tabela 6.

46

Tabela 6. Coordenadas de cor obtidas para as três formulações de suco de cajá

utilizadas na análise sensorial.

Formulação Coordenadas de cor

L* a* b*

F1 21,983 (0,010)a 13,648 (0,053)a 22,645 (0,472)a

F2 13,720 (0,213)b 5,172 (0,904)b 10,662 (0,713)b

F3 11,780 (0,465)c 6,635 (0,818)b 10,470 (0,825)b

abcLetras diferentes na mesma coluna indicam que há diferença estatística entre as

médias a 95% de confiança pelo teste de Tukey (p<0,05).

Quanto ao parâmetro luminosidade (L*), percebe-se que os valores

diminuíram após a fermentação, tornando o suco mais escuro. Destaca-se que o

suco fermentado e adoçado apresentou menor valor de L*. Neste sentido, a

diferença significativa observada para L* entre os sucos fermentado pode ser

justificada pela presença do adoçante estévia a 10%, que possivelmente contribuiu

para redução da luminosidade na amostra adoçada.

Além disso, as coordenadas a* e b* diferiram significativamente entre os

sucos controle (F1) e os fermentados (F2 e F3), confirmando que a fermentação de

L. acidophilus no suco de cajá interferiu nestes parâmetros de cor.

Ao avaliar as coordenadas de cor do suco de abacaxi com juçara fermentado

por L. rhamnosus GG, Campos et al.73, não observaram interferência na

luminosidade em relação ao suco controle (não fermentado), no entanto, a adição do

probiótico foi capaz de alterar significativamente as coordenadas de cor a* e b*.

Ademais, de maneira análoga ao observado em nosso estudo, Costa et al.79

relataram que a adição de L. paracasei promoveu escurecimento em suco de

laranja, com consequente perda da cor amarela, comprometendo a aceitabilidade do

produto pelos consumidores.

47

5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

O sobrenadante suco de cajá fermentado por L. acidophilus por 16 h foi

submetido a ensaios in vitro para avaliação de seus efeitos inibitórios sobre o

crescimento de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e

Klebsiella pneumoniae, bactérias oportunistas de relevância clínica por acometer

pacientes pós-cirúrgicos e imunocomprometidos. A Tabela 7 descreve o percentual

de inibição do crescimento microbiano obtido para o sobrenadante do suco de cajá

fermentado com L. acidophilus.

Tabela 7: Atividade antimicrobiana do sobrenadante do suco de cajá fermentado por

L. acidophilus durante 16 h.

Micro-organismo Inibição do crescimento (%)ª

Staphylococcus aureus 44,5 (12,4)

Enterococcus faecalis NDb

Escherichia coli 35,0 (3,3)

Klebsiella pneumoniae 16,1 (0,9)

aResultado expresso em média (DP)

bNão detectado

Estudos anteriores relatam a atividade antimicrobiana de uma variedade de

probióticos contra micro-organismos patogênicos80,81. É importante destacar, ainda,

que o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos têm motivado a pesquisa

de novas alternativas antimicrobianas, das quais os probióticos ganharam um forte

interesse. Neste sentido, o consumo de alimentos contendo Lactobacillus spp. e

Bifidobacterium spp. poderia auxiliar no combate de infecções microbianas e

melhorar a saúde humana82.

Os resultados encontrados no presente estudo, mostram que houve inibição

de crescimento dos micro-organismos Staphylococcus aureus (44,5%) e Escherichia

coli (35,0%), e menor inibição para Klebsiella pneumoniae (16,1%). Uma justificativa

para atividade encontrada é a produção compostos como bacteriocinas, ácido lático

e peróxido de hidrogênio por L. acidophilus83.

48

Abdelhamid et al.81, avaliaram a inibição do crescimento de 6 linhagens de E.

coli por diferentes probióticos, incluindo L. acidophilus, que foi capaz de inibir 56,9%

do crescimento. Nesse mesmo estudo, foram utilizados outros probióticos, como B.

longum, B. bifidum, L. helveticus e L. rhamnosus, sendo observado que a inibição do

crescimento variando de 48,62% a 57,94%.

No estudo de Hashemi et al.32 que utilizou o suco de limão para fermentação

de L. plantarum, foi observado um aumento da atividade antibacteriana durante a

fermentação, mostrando assim, que as propriedades antibacterianas foram

aceitáveis contra E. coli, e também contra S. typhimurium.

Koohestani et al.83, também demonstraram a atividade antimicrobiana de L.

acidophilus LA5 e L. casei 431 contra S. aureus. Foi avaliada pelo método da

difusão em ágar por poço, e os resultados encontrados mostram que diâmetros das

zonas de inibição de L. acidophilus foram de 50,26 mm e os de L. casei de 37,06

mm, ou seja, o L. acidophilus apresentou uma atividade antimicrobiana satisfatória

para este micro-organismo.

De maneira similar aos resultados obtidos no atual estudo, Tejero-Sariñena et

al.80 descreveram uma atividade antimicrobiana significativa de L. acidophilus

NCIMB 30184 contra E. coli e S. aureus. E, também, para E. fecalis, divergindo do

resultado encontrado no presente estudo, visto que não foi detectado atividade

antimicrobiana para este micro-organismo.

Em contrapartida, Mogna et al.84, em um estudo in vitro, avaliando a inibição

da K. pneumoniae por L. delbrueckii, observou que houve inibição do micro-

organismo, diferentemente do que foi encontrado no atual estudo, onde para K.

pneumoniae houve inibição leve. É sugerido que o maior efeito inibitório de L.

delbrueckii pode ser atribuído a uma característica específica dessa linhagem, que é

uma produção elevada de bacteriocinas.

Em outro estudo, testando a atividade antimicrobiana de diferentes linhagens

de Lactobacillus sp. e antibióticos padrão contra micro-organismos uropatogênicos,

Shim et al.85 demonstraram que os probióticos possuíam maior zona de inibição

quando comparados a alguns antibióticos, confirmando, assim, a sua eficiência

antimicrobiana.

49

Portanto, os achados desta pesquisa revelam resultados positivos quanto a

inibição do crescimento de micro-organismos patogênicos em diferentes proporções,

corroborando com que é descrito na literatura sobre a capacidade antimicrobiana de

micro-organismos probióticos.


DIAS

Um dos grandes desafios no desenvolvimento de bebidas vegetais probióticas

é fazer com que o micro-organismo mantenha a sua viabilidade e funcionalidade

durante toda a vida de prateleira do produto. Neste estudo, a estabilidade

microbiológica do suco de cajá fermentado com L. acidophilus, armazenado sob

refrigeração (4 °C) foi avaliada por 28 dias. Os resultados são apresentados na

Figura 8.

Figura 8: Estabilidade microbiológica da bebida fermentada durante armazenamento

por 28 dias. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre as médias

a 95% de confiança (p<0,05).

50

Os resultados mostraram que a contagem de células viáveis no suco de cajá

caiu de 12,0 (0,1) Log UFC/mL no dia 0 para 9,3 (0,2) Log UFC/mL no dia 7, com o

tempo de armazenamento influenciando significativamente a viabilidade de L.

acidophilus nos primeiros 7 dias (p<0,05). Logo em seguida, a viabilidade se

manteve estável nos dias 14, 21 e 28, com uma contagem de 8,7 (0,7) Log UFC/mL

no final do período.

É importante destacar que contagem permaneceu acima de 6,0 Log UFC/mL

durante todo o período de armazenamento, o que corresponde a uma quantidade

superior a 106 UFC/mL, o valor mínimo exigido pela legislação para leites

fermentados86. Esse valor foi usado como referência para o suco produzido neste

trabalho, em virtude da inexistência de parâmetros específicos para sucos

fermentados.

A fruta escolhida para elaboração de sucos fermentados apresenta forte

influencia na viabilidade inicial e final de estoque do produto. Em pesquisa, com

metodologia similar, avaliando estabilidade por 28 dias no suco de jujuba (Ziziphus

jujuba Mill.) fermentado com L. rhamnosus GG e L. plantarum, inicialmente foi

observado um ligeiro aumento da contagem de células viáveis para 9,2 Log UFC/mL

e após 28 dias houve uma diminuição para 8,4 Log UFC/mL87.

Alguns autores sugerem que essa diminuição na contagem celular, pode estar

ligada às condições desfavoráveis de pH e alto grau de acidez durante a

estocagem87. No entanto, no presente trabalho esse efeito foi minimizado, uma vez

que o pH oscilou entre 6,63 e 6,95 durante toda a fermentação.

Por outro lado, a baixa temperatura empregada inicialmente na refrigeração,

poderia ser um fator de estresse para a célula microbiana, constituindo-se num fator

limitante da manutenção da viabilidade do micro-organismo. Entretanto, após esse

estresse inicial pode-se observar que a temperatura promoveu a manutenção da

viabilidade da bebida probiótica na temperatura de 4 ºC.

Em uma pesquisa, a estabilidade de nove linhagens do gênero Lactobacillus

em uma bebida de fruta com pH de 4,2 estocada a 4 ºC foi avaliada por até 80 dias,

com L. plantarum demonstrando a melhor viabilidade após período de

armazenamento refrigerado e L. acidophilus com a menor viabilidade ao final dos 80

dias88. Após a avaliação da estabilidade de uma bebida derivada do leite e em um

suco de cenoura, por 20 dias, foi observado que as linhagens de L. acidophilus e L.

51

plantarum não perderam viabilidade significativa durante este período em ambas as

matrizes89.

Igualmente, no suco de caju fermentado por L. casei NRRL-442, foi

observado que no início do armazenamento, houve uma alta concentração de

células viáveis de 8,63 (0,04) Log UFC/mL até ao 28º dia de armazenamento a 4 °C.

A partir do 35° dia, houve uma ligeira redução da contagem de células viáveis para

8,53 (0,05) Log UFC/mL. Apesar dessa redução na viabilidade no final do período de

armazenamento, a contagem de células viáveis de L. casei foi sempre superior a

8,00 Log UFC/mL, o que é um bom valor para produtos fermentados contendo

probióticos41.

Em um estudo utilizando o cacau como matriz para a fermentação de

bactérias do ácido lático, e avaliando sua estabilidade refrigerada a 4 oC por 42 dias,

foi observado que viabilidade do suco probiótico com adição de sacarose aumentou

de 8,76 (0,05) Log UFC/mL, no início da armazenagem para 8,99 (0,02) Log

UFC/mL, no dia 21. E então, a partir do dia 28, ocorreu redução da viabilidade para

7,52 (0,01) Log UFC/mL até 42 dias90.

52


CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS

Outro requisito imprescindível para um alimento probiótico é que a estirpe

seja capaz de sobreviver às condições do trato grastrointestinal (TGI), tolerando pH

ácido, ação de enzimas digestivas e sais biliares73. Para avaliar a sobrevivência do

micro-organismo em condições gastrointestinais simuladas bem como sua

adequação a matriz, a viabilidade de L. acidophilus foi analisada in vitro utilizando o

suco recém-fermentado e após 28 dias de armazenamento sob refrigeração.

Figura 9: Viabilidade celular L. acidophilus NRRL B-4495 em condições

gastrointestinais simuladas no armazenados sob refrigeração no suco recém-

fermentado e no suco após 28 dias de armazenamento. Letras iguais indicam que

não há diferença estatística entre as médias a 95% de confiança (p<0,05).

A sobrevivência de L. acidophilus no suco submetido às condições

gastrointestinais simuladas é mostrada na Figura 9. O ensaio in vitro foi analisado

para as fases gástrica I (60 minutos), gástrica II (120 minutos), entérica I (180

minutos) e entérica II (240 minutos).

53

Ao avaliar o comportamento do probiótico nas diferentes fases, verificou-se

que para o suco recém-fermentado, a viabilidade da cultura probiótica antes da

exposição ao estresse gástrico não diferiu (p<0,05) da viabilidade da fases gástricas

e intestinais. No entanto, o suco refrigerado pelo período de 28 dias apresentou

contagens de células viáveis para as fases entéricas I e II, significativamente

menores (p<0,05), caindo de 11,78 Log UFC/mL (0,03) no tempo 0 para 11,58 Log

UFC/mL (0,0) e 11,55 Log UFC/mL (0,05) respectivamente (Figura 8).

Apesar da redução estatisticamente significativa do probiótico refrigerado nas

condições intestinais simulada para a bebida armazenada por 28 dias, é importante

destacar que a contagem de células viáveis ainda permaneceu acima de 6,00 Log

UFC/mL, para fornecer os efeitos benéficos, segundo preconiza a legislação para

leites fermentados e estudos da área86.

Os resultados encontrados corroboram com a afirmação de que a matriz

carreadora exerce ação sobre a estirpe probiótica durante a passagem pelo trato

gastrointestinal. Desta forma, a fermentação realizada em suco de cajá pode ter

possibilitado uma adaptação do microrganismo à matriz carreadora, o que também

pode ter favorecido a manutenção da contagem de células viáveis, mesmo em

condições adversas.

Em um estudo, onde também foi avaliado a sobrevivência de espécies de

Lactobacillus em condições gastrointestinais simuladas, foi observado um resultado

positivo. As bactérias probióticas investigadas exibiram uma viabilidade muito boa

contra ambas as tensões: 0,3% de pepsina e 0,6% de sais biliares. Apenas uma

perda de 0,01 Log UFC/mL foi detectada após o tratamento com 0,3% de pepsina

por 135 minutos77.

Outros estudos com metodologia similar, utilizando linhagens diferentes de

Lactobacillus spp. também descrevem a resistência de bactérias probióticas aos

estresses gástricos, mantendo-se viável em contagens satisfatórias em todo trânsito

gastrointestinal88,91.

Em pesquisa realizada por Ortakci et al.92, também com a espécie L.

acidophilus, foi observada diminuição da viabilidade celular após 30 minutos de

exposição do micro-organismo às condições gastrointestinais simuladas, com a

diminuição numérica de 109 para 106.

Diante disto, conclui-se que os achados no presente estudo demonstram que

a viabilidade do probiótico foi satisfatória sob condições simuladas de digestão,

54

indicando o potencial do produto em atingir o lúmen intestinal e exercer benefícios a

saúde do hospedeiro.

5.7 ANÁLISE SENSORIAL

5.7.2 PERFIL DOS PROVADORES

De acordo com a seleção de provadores, obedecendo os critérios de inclusão,

obteve-se uma amostra de 88 provadores, sendo majoritariamente do sexo feminino,

com 72 voluntários (81,81%) e apenas 16 (18,18%) do sexo masculino, com idades

entre variando de 18 a 46 anos.

Na variável escolaridade, foi observado que a maioria, possuía ensino

superior incompleto (68,18%) e ensino superior completo (19,31%). Além disso,

11,36% e possuíam ensino médio completo e 1,13% ensino fundamental completo.

Os provadores foram questionados em relação à presença de dores no

momento da análise e também sobre alergias e intolerâncias alimentares, referentes

aos ingredientes presentes nas amostras e todos negaram a presença desses

fatores.

Em relação a quanto os provadores gostam de suco de cajá, bebidas

fermentadas e suas devidas frequências de consumo, foi visto que a maioria 87,95%

marcou a opção “gosto muito”, 25% “gosto moderadamente” e 6,81% “gosto

ligeiramente” de suco de cajá. A minoria escolheu indiferença “nem gosto e nem

desgosto” (4,54%) e apenas 2,27%, 2,27% e 1,13% escolheram “desgosto

moderadamente”, “desgosto ligeiramente” e “desgosto muito”, respectivamente,

referente a intensidade de quando gostam de suco de cajá.

Os resultados sobre o quanto os provadores gostam de bebida fermentada

foram os seguintes: 29,54% elegeram a opção “gosto muito”, 23,86% “gosto

ligeiramente”, 23,86% “gosto moderadamente”, 11,36% “nem gosto nem desgosto”,

6,81% “desgosto ligeiramente”, 2,27% “desgosto moderadamente”, e 2,27%

“desgosto muito”. E ainda sobre as bebidas fermentadas, foi perguntado aos

provadores quanto a frequência de consumo desse tipo de bebida, podendo

observar que 36,36% alegaram consumo “mensal”, 18,18% “nunca”, 15,90%

55

“quinzenalmente”, 15,90% “1 vez por semana”, 11,36% “2-3 vezes por semana” e

2,27% “diariamente”.

5.7.3 TESTE DE ACEITAÇÃO GLOBAL

A Tabela 8 apresenta o índice de aceitação das três formulações, sendo F1 a

formulação do suco de cajá (não fermentado), F2 a formulação do suco de cajá

fermentado e F3 a formulação do suco de cajá fermentado e adoçado com estévia.

Tabela 8: Média, mediana e índice de aceitação (%) de cada formulação analisada.

Parâmetro F1 F2 F3

Média de aceitação 5,78 (1,97) 2,19 (1,40) 3,74 (2,25)

Mediana 6ª 2c 3b

Índice de aceitação (%) 64,77 36,55 41,54

abcLetras diferentes na mesma linha mostram que as medianas das formulações

diferiram entre si pelo teste de Kruskal-Wallis com teste Dunn e correção de

Bonferroni (p<0,05).

Os dados de aceitação global não apresentaram distribuição normal. Assim,

foi realizado o teste de Kruskal-Wallis com teste Dunn para comparações Múltiplas e

correção de Bonferroni. Pode-se observar que as três formulações diferiram

estatisticamente entre si (p<0,0001) e que todas elas tiveram índice de aceitação

baixo (<70%)96. Em relação a isso, a formulação 1 (padrão), referente ao suco de

cajá não fermentado, teve maior índice de aceitação (64,77%).

Em contrapartida, a formulação F2, referente a amostra fermentada obteve o

pior IA de 36,55%, seguida da F3 com 41,54%. Essas aceitações mais baixas das

formulações fermentadas, podem estar ligadas ao ajuste de pH do suco para o valor

ideal da fermentação (6,4) pela adição de bicarbonato de sódio, causando

mudanças na cor (fica mais escura), viscosidade (mais viscoso) e no sabor.

Outrossim, é importante destacar que o crescimento da cultura probiótica pode gerar

metabólitos que contribuem de forma negativa para os aspectos organolépticos do

produto.

Apesar de ser uma amostra fermentada nas mesmas condições que a F2, a

F3 possuiu um IA maior. Por ser a amostra adoçada (estévia), pode-se concluir que

56

o sabor doce nessa formulação agradou mais os provadores, em comparação com a

formulação fermentada sem acréscimo de adoçante.

Assim como no presente estudo, Pereira et al.41, realizaram análise sensorial

de suco de probiótico, com uma formulação adoçada com um maior teor de

sacarose e outra formulação com um teor mais baixo do mesmo adoçante. Foi visto

que a aceitação geral foi maior da formulação mais doce. Podendo estar relacionado

à preferência e o alto consumo dos brasileiros por produtos doces93.

Para avaliar as respostas individuais de cada provador e não apenas a média

do grupo, foi realizado um teste de avaliação do componente principal, um tipo de

análise de variável multivariada, usando uma matriz com dimensões de 3 amostras x

88 consumidores para a avaliação da aceitação global. Sendo assim, os dados

foram ajustados e o resultado do teste de aceitação foi apresentado através de um

mapa de Biplot (mapas vetoriais de preferência interna), como mostrado na Figura 9.

Figura 10: Mapa de preferência interna da aceitação global de cada provador pela

avaliação do componente principal.

Os mapas apresentam os consumidores, representados pelos vetores e as

amostras são dispersas entre eles. De acordo com Reis et al. 95 para que a

avaliação do componente principal seja eficiente, é desejável que os dois primeiros

F1

F2

F3

P1

P3

P4

P6

P8

P9

P10

P11

P12

P13P14P15

P17

P19

P20

P21P22

P23

P24

P25

P27

P28

P29P30

P31

P32

P33

P34

P35

P36

P37

P38

P39

P40

P41

P42

P43

P44P46P47

P48

P49

P50

P51

P52

P53P54P55P56

P57

P58

P59

P60P61

P62

P63

P64

P65

P66

P67P68

P69

P70

P71 P72

P73

P74

P75

P76

P77

P78

P79

P80

P81

P82

P83

P85

P86

P87

P88

P89

P90

P91

P92P93

P95P96

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

PC

2 (

21

,96

%)

PC1 (78,04 %)

Biplot (eixos F1 e F2: 100,00 %)

57

componentes acumulem uma porcentagem de variação >70%, como observado no

mapa gerado acima, onde PC1 é 78,04%.

Pode-se perceber maior densidade de vetor direcionado ao quadrante

referente a formulação F1, confirmando assim a maior aceitação dos provadores por

essa amostra. E ainda, é observado que apenas um provador preferiu a formulação

F2, confirmando também o seu resultado de menor aceitação.

5.7.4 “JUST ABOUT RIGHT” (JAR)

O teste “Just About Right” (JAR) foi realizado para avaliar a intensidade da

influência dos atributos acidez, sabor doce, viscosidade e cor, na aceitação de cada

formulação testada (F1, F2, F3), como mostra a Figura 10.

Figura 11: Intensidade da influência dos atributos acidez, sabor doce, viscosidade e

cor na aceitação da formulação 1, 2 e 3.

É observado que entre as formulações, a F1 foi a amostra qual os provadores

elegeram como ideal a metade dos atributos avaliados, viscosidade e cor. Já em

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

F3 COR

F3 VISCOSIDADE

F3 SABOR DOCE

F3 ACIDEZ

F2 COR

F2 VISCOSIDADE

F2 SABOR DOCE

F2 ACIDEZ

F1 COR

F1 VISCOSIDADE

F1 SABOR DOCE

F1 ACIDEZ

35,22

9,09

12,5

68,18

11,36

7,95

81,81

65,9

5,68

6,81

65,9

1,13

2,27

43,18

15,9

26,13

26,13

11,36

10,22

13,63

89,77

73,86

30,68

36,36

62,5

47,72

71,59

5,68

62,5

80,68

7,95

20,45

4,54

19,31

3,4

62,5

menos que o ideal JAR mais que o ideal

58

relação aos atributos sabor doce e acidez, os resultados mostram que a maioria

escolheu os extremos da escala para classificar a intensidade desses atributos,

sendo acidez escolhida por eles como “mais que o ideal” (62,5%) e sabor doce,

“menos que o ideal” (65,9%).

Em contrapartida, na F2, podemos observar que a acidez e o sabor doce são

classificados na escala “menos que o ideal” (65,9% e 81,81%, respectivamente) e os

atributos viscosidade e cor estão na escala “mais que o ideal” (80,68 e 62,5%,

respectivamente) mostrando assim, que os avaliadores consideraram todos os

atributos dessa formulação não satisfatórios.

Na F3, é visto também que todos os atributos são considerados fora do ideal.

Sendo o atributo acidez definido como “menos que o ideal” (68,18%), assim como na

formulação anterior, o sabor doce classificado como ”mais que o ideal” (71,59%) , ou

seja, a maioria dos provadores consideraram a amostra mais doce do que

gostariam. E ainda definiram viscosidade e cor “mais que o ideal” (47,72% e 67,5%,

respectivamente). Ou seja, é observado também, uma insatisfação a todos os

atributos dessa formulação.

A fermentação foi responsável por alterar alguns aspectos sensoriais

importantes, principalmente a cor e viscosidade, que nas amostras fermentadas

ficaram bem diferentes do padrão de suco, afetando diretamente na aceitação do

provador.

Para confirmar a influência dos atributos na aceitação do provador de cada

formulação foi feito o teste de penalidade quando mais que 20% dos provadores

escolheram um extremo para avaliar aquele atributo. Sendo assim, foi gerado

resultados específicos para F1, F2 e F3.

A Tabela 9 mostra as penalidades da formulação 1 (padrão), é importante

ressaltar que os atributos cor e viscosidade para a maioria dos provadores foram

atributos definidos como ideal.

59

Tabela 9: Tabela de teste de penalidade da formulação 1.

Variável Nível % Efeitos

na média p-valor

Penalidades

p-valor

Menos ácido

1,14% 4,125

ACIDEZ JAR 36,36% 2,107 < 0,0001

Mais ácido

62,50% 2,070 < 0,0001

Menos intenso

65,91% 2,289 < 0,0001

SABOR DOCE

JAR 30,68% 2,395 < 0,0001

Mais

intenso 3,41% 4,444

Menos viscoso

6,82% 1,864

VISCOSIDADE

JAR 73,86% 0,944 0,048

Mais

viscoso 19,32% 0,619

Muito clara

5,68% 0,048

COR JAR 89,77% 0,626 0,370

Mais

escura 4,55% 1,348

Em contrapartida, atributo acidez foi avaliado como mais ácido do que o ideal

(62,50%), tendo assim, um efeito elevado na média (2,070), evidenciando assim que

a acidez elevada da formulação 1, foi um atributo que influenciou significativamente

(< 0,0001) na aceitação dessa amostra.

Também é observado um maior efeito da média (2,289) e consequentemente

maior efeito na aceitação dessa formulação, quando avaliado o atributo sabor doce

que foi classificado por 65,91% dos provadores num nível de intensidade menor do

que eles gostariam (“menos intenso”). Para os níveis “menos ácido” da acidez e

“mais intenso” do sabor doce não foi possível calcular o teste devido ao percentual

de provador inferior a 20%.

Sabendo disso, conclui-se acerca da formulação 1, que apesar de todos os

atributos terem significância estatística, apenas os atributos acidez e sabor doce

influenciaram a aceitação pelos provadores (Figura 12).

60

Sendo assim, é necessário melhorar os atributos que os provadores

consideraram importantes para a aceitação dessa formulação. Podendo ser testado

o aumento da diluição dessa amostra e ainda, adicionar adoçante, como estratégia

de tentar diminuir a acidez e evidenciar um sabor mais doce.

Figura 12: Efeitos na média (%) dos atributos penalizados na F1, sendo o eixo

horizontal o percentual de provadores e eixo vertical referente a queda média.

Os resultados adquiridos através do teste de penalidade referente a

formulação 2 estão descritos na Tabela 10. Podemos observar a significância

estatística dos atributos, e que a maioria dos provadores avaliaram a amostra nos

níveis de menor e maior intensidade e em consequência disso, longe do ideal (JAR).

Analisando o efeito da média, podemos concluir que um alto percentual de

provadores que penalizaram significativamente a formulação quando consideraram

que a amostra estava menos ácida (acidez) (p = 0,014) e mais viscosa (viscosidade)

(p = 0,046) que o ideal. Em consequência disso, pode-se concluir que esses

atributos foram os que influenciaram na aceitação da formulação 2, já que mesmo o

ACIDEZ

ACIDEZSABOR DOCE

SABOR DOCE

VISCOSIDADE

VISCOSIDADE

COR

COR

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 10 20 30 40 50 60 70

Efe

ito

s n

a m

éd

ia

%

Efeitos na média vs %

Demasiadamente pouco

61

sabor doce pouco intenso e a cor muito escura sendo atributos que sofreram

penalidades, estes não foram significativos (Figura 13).

Tabela 10: Teste de penalidade referente a formulação 2 em valores de percentual

(%), efeitos na média e penalidades (p-valor).


na média

p-valor Penalida

des p-valor

Menos ácido 65,91% 1,236 0,014

ACIDEZ JAR 13,64% 1,127 0,009

Mais ácido 20,45% 0,778 0,277

Menos intenso 81,82% 0,319 0,531

SABOR DOCE

JAR 10,23% 0,404 0,417

Mais intenso 7,95% 1,270

Menos viscoso 6,82% -0,091 VISCOSIDA

DE JAR

12,50% 0,818 0,071

Mais viscoso 80,68% 0,895 0,046

Muito clara 4,55% 0,848

COR JAR 26,14% 0,209 0,542

Mais escura 69,32% 0,167 0,634

62



ACIDEZ

ACIDEZ

SABOR DOCE

SABOR DOCE

VISCOSIDADE

VISCOSIDADECOR

COR

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Efe

ito

s n

a m

éd

ia

%



63

Sobre o Teste de penalidade realizados na formulação 3, os resultados estão

descritos na Tabela 11.

Tabela 11: Teste de penalidade referente a formulação 3 em valores de percentual

(%), efeitos na média e penalidades (p-valor).


na média

p-valor

Penalidades

p-valor

Menos ácido 68,18% 2,515

< 0,0001

ACIDEZ JAR 26,14% 2,473

< 0,0001

Mais ácido 5,68% 1,965

Menos intenso 12,50% 2,136

SABOR DOCE

JAR 15,91% 3,284

< 0,0001

Mais intenso 71,59% 3,484

< 0,0001

Menos viscoso 9,09% 1,184 VISCOSIDA

DE JAR

43,18% 1,664 0,000

Mais viscoso 47,73% 1,756 0,000

Muito clara 2,27% -0,597

COR JAR 35,23% 1,798 0,000

Mais escura 62,50% 1,885 0,000

No que se refere aos resultados encontrados dessa formulação, observa-se

uma particularidade comparado as outras formulações, que todos os atributos foram

significativos na aceitação global assim como, todos os atributos foram penalizados

significativamente (Figura 14) quando consideraram que a formulação estava menos

ácida (p< 0,0001) que o ideal, com o sabor doce mais intenso (p< 0,0001), mais

viscosa (p<0,001) e mais escura (p<0,001), por este motivo, conclui-se um alto

percentual de provadores e um alto efeito na média, consequentemente uma

influência direta de todos os atributos na aceitação dessa formulação, devendo

assim ser melhorados.

O sabor doce elevado nessa amostra é de fácil resolução, visto que é só

ajustar a proporção de adoçante utilizado (10% de estévia para cada 100mL). Os

64

outros atributos, alguns ajustes no preparo como a maior diluição do suco e ainda

alinhar-se com os conhecimentos da tecnologia dos alimentos para propor

melhorias.



Em relação a alteração de aspectos sensoriais importantes após a

fermentação, como cor, acidez e viscosidade, pode-se aplicar algumas medidas

para melhoria das formulações testadas, sendo umas delas, analisar e caracterizar

outros tempos de fermentação anteriores, para saber se com menos tempo de

fermentação há menores alterações sensoriais de cor e viscosidade, principalmente,

testar maior diluição da polpa do cajá e consequentemente, da amostra, analisar

juntamente com a tecnologia dos alimentos outras possibilidades para o ajuste do

pH que exerça menor influência na acidez do produto, e ainda, estabelecer

estratégias necessária para a melhoria das formulações no aspecto sensorial,

visando assim, melhor aceitação dos provadores sem prejudicar as características

tecnológicas e funcionais do produto que foram padronizadas e analisadas no

presente trabalho.

ACIDEZ

ACIDEZSABOR DOCE

SABOR DOCE

VISCOSIDADE

VISCOSIDADE

COR

COR

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Efe

ito

s n

a m

éd

ia

%



65

5.7.4 TESTE DE INTENÇÃO DE COMPRA

Os resultados obtidos para a intenção de compra durante o período sensorial

das amostras de suco de cajá fermentado estão representados na Figura 15.

Figura 15: Gráfico de intenção de compras das três formulações expressos em

percentual (%) no eixo vertical e escala hedônica variando de 1 a 5 no eixo

horizontal.

A partir dos resultados encontrados no presente estudo, percebe-se referente

a formulação F1 que os percentuais variaram de 30% a 15%, para “possivelmente

compraria” e “certamente compraria”, respectivamente. Apenas 8% dos provadores

afirmaram que “certamente não compraria” e 22% “possivelmente não compraria”. E

ainda, 8% dos provadores foram indiferentes a esta formulação (“talvez comprasse,

talvez não”). Sendo assim, pode-se perceber que a formulação 1 teve maior

interesse dos provadores para uma possível aquisição do produto.

Já em relação a intenção de compra da formulação F2, é evidenciado que

essa amostra possui o menor interesse na aquisição pelos provadores, visto que

66% decidiu que “certamente não compraria” e 23% “possivelmente não compraria”,

8% “talvez comprasse, talvez não”. E nenhum dos provadores marcou a

possibilidade de compra dessa formulação e apenas 3 escolheram a opção

8

2226

30

15

66

23

8

03

41

2419

15

1

0

10

20

30

40

50

60

70

Certamente nãocompraria

Possivelmente nãocompraria

Talvez comprasse,talvez não

Possivelmentecompraria

Certamente compraria

F1 F2 F3

66

“certamente compraria”. Concluindo-se assim, que a maioria não tem interesse de

comprar na amostra.

Os resultados referentes a F3, nos mostram baixa intenção de compra assim

como na F2. Assim, 41% dos provadores alegaram que “certamente não compraria”

esta formulação e ainda, 24% “possivelmente não compraria”. Na escala de

indiferença, 19% marcaram “talvez comprasse, talvez não”. Além disso, 15%

afirmaram que “possivelmente compraria" e apenas 1% dos provadores “certamente

compraria”.

Mesmo a formulação 1 tendo melhor interesse e maior possibilidade de

compra pelo provador quando comparado com as outras formulações, não teve um

bom percentual de pessoas que com certeza (“certamente”) comprariam o produto,

(apenas 15%). Segundo Ferreira et al.94, para um produto a ser considerado aceito

pelos consumidores como sua aprovação índice deve ser de 50% ou melhor,

levando em consideração as porcentagens obtidas para as pontuações 4

(provavelmente compraria) e 5 (certamente compraria).

Os resultados de intenção de compras refletem a aceitação das formulações.

Ou seja, a formulação que melhor foi aceita, teve maior intenção de compras pelos

provadores (F1). E as formulações com menores aceitação (F2 e F3), também

tiveram menor interesse de compra pelo consumidor. Ainda assim, esse teste de

intenção de compra, reforça a necessidade de aprimorar e melhorar as

características das amostras como já visto anteriormente, para que seja possível

aumentar o interesse dos consumidores para aquisição do novo produto probiótico

desenvolvido.

Por fim, outro aspecto de fundamental importância é quando ingredientes

funcionais, como os probióticos, sejam adicionados à alimentos, os consumidores

estejam cientes dos seus benefícios a saúde, percebendo o diferencial do produto

em relação ao convencional. Destaca-se que esse é um dos aspectos mais

importantes para a aceitação dos alimentos funcionais. Assim, a indústria de

alimentos deve comunicar os efeitos benéficos à saúde aos consumidores de forma

clara e compreensível.

67

6 CONCLUSÃO

A partir dos resultados encontrados nesta pesquisa, podemos afirmar que o

suco de cajá é uma matriz viável para o crescimento do Lactobacillus acidophilus em

quantidades suficientes para oferecer efeitos positivos a saúde, como é preconizado

pela legislação. Conclui-se também boa estabilidade e viabilidade ao longo de 28

dias de armazenamento sob refrigeração, bem como boa resistência do probiótico

ao estresse gastrointestinal. Podemos observar ainda boa concentração de

compostos fenólicos, sugerindo atividade antioxidante satisfatória quando

comparados a outros estudos, conferindo assim, aspecto funcional à bebida

probiótica. Em relação a análise sensorial, apesar da aceitação não ter sido

satisfatória, foi estabelecida as características que não agradaram aos provadores

nas formulações testadas, sendo assim, possível estabelecer os critérios que

necessitam de melhorias para tornar as formulações ideal ao gosto dos

consumidores, baseado em suas contribuições. Assim, este estudo mostrou grande

potencial para criação de uma nova bebida probiótica a base de suco de cajá, sendo

uma excelente alternativa aos tradicionais produtos lácteos.

68

REFERÊNCIAS

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79

ANEXOS

ANEXO A

82

APÊNDICES

APÊNDICE A

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

Projeto de pesquisa “ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR

DE SUCO DE CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.”

PERFIL DOS PROVADORES

Nome:____________________________________Idade:_________Sexo:__________ 1. Escolaridade:

Fundamental completo ( )

Médio completo ( )

Superior incompleto ( )

Superior completo ( )

2. Apresenta dor de cabeça ou alguma outra dor que atrapalhe no momento da

análise?

Sim ( ) Não ( )

3. Possui alergia ao cajá, estévia ou frutose? Sim ( ) Não ( )

4. Possui intolerância a algum dos componentes acima? Sim ( ) Não ( )

5. Quanto gosta ou desgosta de suco de cajá?

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

Desgosto

muito

Desgosto

moderadamente

Desgosto

ligeiramente

Nem

gosto

nem

desgosto

Gosto

ligeiramente

Gosto

moderadamente

Gosto

muito

6. Quanto gosta ou desgosta de bebida fermentada?

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

Desgosto

muito

Desgosto

moderadamente

Desgosto

ligeiramente

Nem

gosto

nem

desgosto

Gosto

ligeiramente

Gosto

moderadamente

Gosto

muito

7. Qual a sua frequência de consumo de bebidas fermentadas?

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

Diariamente 2 a 3 x por

semana

1 x por

semana

Quinzenalmente Mensalmente Nunca

83

APÊNDICE B

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA

TCLE para maiores de idade

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Esclarecimentos

Este é um convite para participar da Pesquisa “Elaboração e caracterização de bebida probiótica a partir de suco de cajá fermentado com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495”, que tem como pesquisador responsável o professor Francisco Canindé de Sousa Junior.

Esta pesquisa pretende verificar a viabilidade do uso do suco de cajá como veículo de probióticos, que são micro-organismos vivos cuja ingestão regular pode trazer inúmeros benefícios à saúde. O motivo que nos leva a fazer este estudo é contribui para aumentar a disponibilidade de novos produtos probióticos e valorizar um espécie vegetal rica em nossa região.

Caso decida participar da análise sensorial dos sucos desenvolvidos com a adição de probióticos, primeiramente, voce responderá um questionário de recrutamento em que, entre outras informações sobre seus hábitos alimentares, deverá relatar se apresenta alergia ou intolerância a qualquer ingrediente contido nos produtos. Em caso positivo, voce não deverá participar da análise sensorial. No caso de participar da análise sensorial, voce receberá uma amostra de suco para avaliação dos atributos sensoriais dos produtos. Os sucos serão submetidos a análises microbiológicas objetivando garantir a segurança e minimizar os riscos de infecção alimentar, cuja elaboração será controlada por meio da adoção das boas práticas de manipulação, conforme legislação vigente.

Na presença de sintoma(s) após o consumo dos sucos, o provador deverá entrar em contato com o pesquisador responsável para que este avalie e se responsabilize pelo tratamento de saúde, se necessário. E ainda, se o provador necessitar de atendimento de urgencia/emergencia decorrente do teste sensorial com o produto proposto, o pesquisador responsável o levará ao atendimento médico mais próximo.

Durante todo o período da pesquisa voce poderá sanar suas dúvidas ligando para o professor Dr. Francisco Caninde de Sousa Junior no Departamento de Farmácia da UFRN, localizado na Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Faria, s/n, Petrópolis, Natal-RN, ou pelo telefone 3342-9821, ou e-mail: [email protected]

Sua decisão em participar da análise sensorial é voluntária. Durante a realização da pesquisa, voce pode desistir de participar da mesma a qualquer momento. O risco envolvido com a participação na pesquisa é a eventualidade de surgir(em) sintoma(s) em decorrencia da prova do suco. Os riscos relatados serão minimizados pela garantia da qualidade do produto. Só participarão da análise sensorial os usuários que não apresentarem alergia ou intolerância a qualquer componente da formulação da bebida.

Os dados que voce irá fornecer serão confidenciais e divulgados apenas em congressos ou publicações científicas, não havendo exposição de qualquer informação que possa lhe identificar. Esses dados serão guardados pelo pesquisador responsável por essa pesquisa em local seguro e por um período de 5 anos.

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Se a participação nessa pesquisa lhe gerar algum custo, este será assumido pelo pesquisador e devidamente reembolsado. Se voce sofrer qualquer dano comprovadamente decorrente deste projeto, será também indenizado.

O benefício da pesquisa para os participantes e a sociedade em geral será a possível inserção de novos produtos probióticos no mercado, que contribuirão para diversificar as opções de bebidas probióticas disponíveis.

Qualquer dúvida a respeito da ética dessa pesquisa poderá ser questionada ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) no endereço Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis, Natal/RN ou pelo telefone (84) 3342-5003. E-mail: [email protected]

Este documento foi impresso em duas vias. Uma ficará com você e a outra com o

pesquisador responsável, professor Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior

Consentimento Livre e Esclarecido

Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados serão coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que ela trará para mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da pesquisa “Elaboração e caracterização de bebida probiótica a partir de suco de cajá fermentado com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495”, e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em congressos e/ou publicações científicas, desde que nenhum dado possa me identificar.

Natal, ____/____/______.

_____________________________________

Assinatura do participante da pesquisa

Declaração do pesquisador responsável

Como pesquisador responsável pelo estudo, “Elaboração e caracterização de bebida probiótica a partir de suco de cajá fermentado com Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495” declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos metodologicamente, e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante desse estudo, assim como manter sigilo e confidencialidade sobre a identidade do mesmo.

Declaro ainda estar ciente que, na inobservância do compromisso ora assumido, estarei infringindo as normas e diretrizes propostas pela Resolução do Conselho Nacional de Saúde (CNS/MS) 466 de 2012, que regulamenta as pesquisas envolvendo seres humanos.

Natal, ____/____/______

_______________________________________________

Francisco Canindé de Sousa Junior

mailto:[email protected]

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APÊNDICE C

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO Projeto de pesquisa “ELABORAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA PROBIÓTICA A PARTIR DE SUCO DE

CAJÁ FERMENTADO COM Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495.” Data:___ /___ /___ Idade: ___________ Sexo: ________________

Você receberá 3 amostras codificadas de suco de cajá, uma de cada vez. Entre uma amostra e outra, beba um pouco de água para limpar língua, palato e bochechas.

CÓDIGO DA AMOSTRA: _______________________________

TESTE DE ACEITAÇÃO GLOBAL – Do suco de cajá probiótico Por favor, avalie as amostras cuidadosamente e identifique, de acordo com a escala abaixo o quanto você gostou ou

desgostou. Marque a posição da escala que melhor reflete o seu julgamento:

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

Desgostei muitíssimo

Desgostei muito

Desgostei regularmente

Desgostei ligeiramente

Indiferente Gostei ligeiramente

Gostei regularmente

Gostei muito

Gostei muitíssimo

ESCALA DO IDEAL – Avaliação de atributos do suco de cajá probiótico

Agora, por favor, marque com um X sua opinião sobre as seguintes características do suco: Acidez

( ) Muito menos ácido

do que eu gosto

( ) Menos ácido do que

eu gosto

( ) Está ideal, do jeito

que eu gosto

( ) Mais ácido do que eu

gosto

( ) Muito mais ácido do que eu gosto

Sabor doce

( ) Muito menos

intenso do que eu gosto

( ) Menos intenso do que

eu gosto


que eu gosto

( ) Mais intenso do que

eu gosto

( ) Muito mais intenso

do que eu gosto

Viscosidade

( ) Muito menos

viscoso do que eu gosto

( ) Menos viscoso do que

eu gosto


que eu gosto

( ) Mais viscoso do que

eu gosto

( ) Muito mais viscoso

do que eu gosto

Cor

( ) Muito mais clara do que eu gosto

( ) Mais clara do que eu

gosto


que eu gosto

( ) Mais escuro do que

eu gosto

( ) Muito mais escuro do que eu gosto

TESTE DE ATITUDE – Intenção de Compra do suco de cajá probiótico Se os produtos que você provou estivessem disponíveis no mercado, você o compraria?

( ) Certamente compraria

( ) Possivelmente compraria

( ) Talvez comprasse

talvez não

( ) Possivelmente

não compraria

( ) Certamente não

compraria

Sugestões e comentários: ______________________________________________________________________________________

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