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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

MARIA LUIZA DINIZ DE SOUSA LOPES

IMUNOEXPRESSÃO DE GALECTINAS EM QUEILITES ACTÍNICAS E SUA

RELAÇÃO COM CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E GRADAÇÃO HISTOLÓGICA

Natal/RN

2014

Maria Luiza Diniz de Sousa Lopes

IMUNOEXPRESSÃO DE GALECTINAS EM QUEILITES ACTÍNICAS E SUA

RELAÇÃO COM CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E GRADAÇÃO HISTOLÓGICA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral.

Orientadora: Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira

Natal/RN

2014

Dedicatória

Com muito amor, dedico este trabalho...

Aos meus pais e alicerces do meu caráter, Ivanilce e Walter.

Ao meu marido, Fred, maior fonte de inspiração em tudo que faço.

Vocês foram força que precisei para prosseguir nessa jornada.

Mas renova-se a esperança.

Nova aurora a cada dia.

E há que se cuidar do broto,

Pra que a vida nos dê flor e fruto.

(Milton Nascimento e Wagner Tis)

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

A Deus, que em seu amor infinito, me concedeu o discernimento necessário para

alcançar essa vitória, sem deixar-me esmaecer diante dos obstáculos.

Aos meus pais, Ivanilce e Walter, meus primeiros professores da vida. Obrigada por

priorizarem a minha educação e por não medirem esforços, nem distâncias para estarem ao

meu lado durante o meu aprendizado. Vocês sempre foram minha maior torcida, incansáveis,

me incentivando para que eu buscasse novos desafios. Obrigada por serem tão

compreensivos com minhas escolhas. A vocês, o meu reconhecimento e reciprocidade por

todo o amor à mim dedicado.

Ao meu esposo Fred, por nosso amor descomplicado. Obrigada pela paciência,

carinho e principalmente, pelo exemplo de dedicação. Sua paixão pela pesquisa e ensino é

admirável e despertou em mim a força necessária para ir à luta. Você foi meu porto seguro

nos dias difíceis e vibrou comigo diante de cada pequena conquista. Obrigada por me

compreender em minhas limitações e por me ensinar a enfrentar os problemas com leveza.

Obrigada, meu amor, por sonhar, planejar e viver intensamente comigo.

À minha orientadora, Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira. Quero

primeiramente expressar minha admiração por seu entusiasmo e competência na docência e

pesquisa, características que ficaram claras desde que fui sua aluna de graduação na

imunologia. A sua orientação foi para mim, aprendizado e exemplo diário da profissional que

almejo um dia me tornar. Muito obrigada pela atenção, disponibilidade, compreensão e

confiança em situações de grande responsabilidade. A senhora abriu muitas portas para

mim, que foram essenciais para o meu crescimento científico e pessoal. Guardo

carinhosamente comigo seus ensinamentos, a cumplicidade e amizade durante o nosso

convívio diário e espero fortalecer esses laços nos próximos anos!

À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN,

Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, a quem tanto admiro pela dedicação e amor à profissão.

Obrigada pelos ensinamentos, oportunidades e também pelas correções sugeridas no exame

de Qualificação desta pesquisa.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN,

com quem tive a alegria de conviver e aprender durante esses dois anos. Ao Prof. Dr. Leão

Pereira Pinto, por sua integridade e dedicação à profissão tão inspiradores para seus

alunos. À Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas, pelo exemplo de competência e

profissionalismo que levarei para minha vida. À Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, pela

simpatia e incentivo. À Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, por sempre nos

estimular a ir além no nosso aprendizado, tenho muito respeito por sua sabedoria. Ao Prof.

Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa, por sempre incentivar seus alunos à buscar seus ideais.

Ao Prof. Dr. Manuel Antonio Gordón-Núñez, pela gentileza com que sempre me tratou, sua

dedicação e humildade são admiráveis. À Profa. Dra. Ana Myriam Costa de Medeiros e

Profa. Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, pelos ótimos momentos de aprendizado e

descontração na clínica de Estomatologia. Em especial, agradeço à Profa. Dra. Lélia Maria

Guedes Queiroz, a quem muito admiro por sua simplicidade e serenidade com que transmite

seus ensinamentos, obrigada pela ajuda no decorrer desta pesquisa e pelas correções

sugeridas no exame de Qualificação.

Ao Prof. Dr. Kenio Costa Lima, pelos ensinamentos nas disciplinas de bioestatística,

que foram fundamentais para a realização da análise estatística desta pesquisa.

À Profa. Dra. Iris do Céu Clara Costa, por ter me dado a chance de descobrir quão

maravilhosa é a pesquisa científica. Obrigada pelos ensinamentos e amizade.

Ao meu irmão de coração e de turma de mestrado, Luiz, pela amizade e

companheirismo. Sem você, eu não teria escolhido a Patologia Oral. Dividir mais uma

caminhada com você tornou o dia-a-dia mais fácil e divertido, o que me faz refletir sobre

quão entediante será minha vida nos próximos anos sem você para discutir comigo. Obrigada

por sempre acreditar no meu potencial, mesmo quando eu mesma não acreditava.

Aos demais amigos da turma de mestrado, Andréia, minha amiga fofa de todas as

horas, agradeço por toda a ajuda, carinho, companheirismo, sinceridade e força, você é

muito especial para mim; Luciana querida, positiva e que sempre sabe o que quer, obrigada

pela ajuda e amizade; Marcelo, pela tranquilidade e simplicidade que o tornam tão especial,

obrigada pelo apoio através de palavras e abraços; Thais, a gatinha mais meiga e

batalhadora, conte sempre comigo mesmo que nossos caminhos agora não sejam mais os

mesmos; minha amiga linda Thâmara, tão querida por todos nós, obrigada por todas as

risadas e dificuldades divididas! Você sempre acreditou e torceu por mim! Os próximos anos

sem você por perto serão menos engraçados e mais difíceis, mas sei que vou levar a sua

amizade por toda a minha vida! Tiago, exemplo de paixão pela vida, sempre disposto a

ajudar, agradeço pelos momentos de descontração e por me ensinar que não precisamos

pensar igual para nos sermos amigos; Viviane, pela sinceridade, humildade, amabilidade e

força de vontade, sou sua fã, obrigada pelos momentos em que me ajudou de prontidão!

Alice, pela positividade que ficou marcada no pouco tempo que cursou conosco. Levarei

sempre comigo união e amizade da nossa turma. Desejo felicidade e sucesso a todos!

Aos doutorandos, Ana Luiza, pelo bom humor constante; Bárbara, por ser tão fofa,

amável e paciente comigo; Clarissa, por sua gentileza e exemplo de dedicação; Melka, por

seu jeito único, generoso e alto astral de ser; Natália, por transmitir serenidade à todos ao

seu redor; Roseane, pelas risadas e cortadas carinhosas; Jadson, pela amizade e parceria

nos trabalhos científicos; Stefânia, Emeline e Keila, pela paciência e gentileza ao dividir

suas experiências; Adriana, Cynthia, Edilmar, Emília, Endrigo, Fernanda, Jamile, Maiara,

Nazareno, Rodrigo, Vilson e aos já doutores Joabe, Felipe e Fernando pelos momentos de

aprendizado e descontração que compartilhamos. Agradeço especialmente à doutoranda

Denise, que foi minha companheira em muitos momentos científicos, conversas literárias e

musicais, mas também nas horas de angústia e desabafo. Obrigada, minha amiga, por estar

sempre com um sorriso no rosto e por ser tão paciente e doce em todos os muitos momentos

em que recorri à sua ajuda.

Aos funcionários Gracinha, Hévio, Idel, Lourdinha, Patrícia, Ricardo e Sandrinha.

Muito obrigada pela disponibilidade, auxílio e convívio harmonioso.

Aos familiares e amigos que estão sempre ao meu lado. Em especial, à minha avó

Francisca e tia Vânia, por tantas preces e torcida ao longo deste curso; aos meus cunhados

Maximiliano, Alexandre, Cecília, Letícia, Antônio Fernando, Estela, Nadja e Claudio, ao

meu sogro Antônio e Fabiana, que me apoiaram mesmo à distância; à minha amiga

Lucyana Ramalho, por ser a irmã que não tive; à amiga querida Georgia Souza, por ter sido

a primeira a me encorajar nos caminhos científicos; ao Mano Cris, Dani e vó Chiquita que

literalmente viveram comigo em muitos momentos durante esses dois anos, obrigada pela

paciência, apoio e amizade.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo

apoio financeiro que possibilitou a realização deste curso.

A felicidade aparece para aqueles que choram.

Para aqueles que se machucam.

Para aqueles que buscam e tentam sempre.

E para aqueles que reconhecem a importância das pessoas que passam por suas vidas.

(Clarice Lispector)

Resumo

RESUMO

A queilite actínica (QA) é uma lesão inflamatória crônica potencialmente maligna que

em algumas situações pode se transformar em carcinoma de células escamosas (CCE) de lábio

inferior. Os mecanismos moleculares envolvidos neste processo ainda não são completamente

esclarecidos. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a imunoexpressão das galectinas -1, -3, -7 e

-9 e relacionar este aspecto com as características clínicas (sexo, idade e aspecto clínico) e

gradação histológica pelo sistema binário (baixo ou alto risco de transformação maligna) em

65 casos de QA. A imunomarcação de cada caso foi avaliada de forma semiquantitativa, na

qual foram atribuídos os escores: 0 (0% de células positivas), escore 1 (1 a 30% de células

positivas), escore 2 (31 a 60% de células positivas) e escore 3 (mais de 60% das células

positivas). A imunoexpressão também foi analisada quanto à localização nos compartimentos

celulares e nos estratos epiteliais. A análise estatística foi realizada através dos testes de

Mann-Whitney, Qui-quadrado de Pearson e Exato de Fisher com nível de significância

estabelecido em 5%. Dos 65 casos de QA, 76,9% eram do sexo masculino, 80% tinham idade

superior a 40 anos, 70,8% eram da raça branca e 61,5% foram histologicamente gradadas

como QAs de baixo risco. A expressão imunoistoquímica das galectinas foi variável na

amostra e de forma geral não exibiu relação com os parâmetros clínicos. A expressão da

galectina-1 foi observada em 98,5% dos casos, principalmente no citoplasma em todas as

camadas epiteliais e foi elevada em 60% dos casos (escore 3), independente da gradação

histológica (p>0,05). A expressão de galectina-3 foi observada em todos os casos, sendo

maior nas QAs de alto risco que no grupo de baixo risco (p<0,05), com predominância de

marcação no citoplasma e núcleo nas QAs de baixo risco (67,5%) e de marcação apenas no

citoplasma nos casos de alto risco (60%) (p<0,05). A galectina-7 foi positiva em todos os

casos, majoritariamente na região suprabasal do epitélio (95,4%), porém sem diferenças

significativas no escores de expressão entre os grupos histológicos (p>0,05). Com relação à

galectina-9, 89,2% dos casos foram positivos, com redução na mediana dos escores de

expressão com o aumento do grau histológico (p<0,001), sendo essa expressão predominante

no núcleo e citoplasma. Com base nestes resultados, sugere-se que as galectinas analisadas

nesta pesquisa podem estar envolvidas no desenvolvimento e progressão das queilites

actínicas.

Palavras-chave: Queilite. Galectinas. Imunoistoquímica. Neoplasias labiais.

Abstract

ABSTRACT

Actinic cheilitis (AC) is a potentially malignant chronic inflammatory lesion that in

some situations can turn into squamous cell carcinoma (SCC) of the lower lip. The molecular

mechanisms involved in this process are not yet fully understood. The objective of this

research was to evaluate the immunoexpression of galectins-1, -3, -7 and -9 and to relate this

with clinical characteristics (sex, age and clinical aspect) and histological grading by the

binary system (low or high risk of malignant transformation) in 65 cases of AC.

Immunostaining of each case was semiquantitatively evaluated through scores assignment:

score 0 (0% of positive cells) score 1 (1 to 30% of positive cells), score 2 (31 to 60% of

positive cells) and score 3 (more than 60% of positive cells). The immunoreactivity was also

evaluated regarding the location on cellular compartments and on the epithelial layer.

Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney, Pearson's Chi Square, and

Fisher's exact tests with significance level set at 5%. Of the 65 AC cases, 76.9% were male,

80% were older than 40 years, 70.8% were white and 61.5% were histologically graded as

low risk ACs. The immunoexpression of galectins in the sample was variable and in general

showed no relationship with clinical parameters. Expression of galectin-1 was observed in

98.5 % of cases, mainly in the cell cytoplasm of all epithelial layers and was elevated in 60%

of cases (score 3), regardless of the histological grade (p>0.05). The galectin-3 expression

was observed in all cases, being higher in high risk ACs than in the low risk group (p<0.05),

showing a predominant expression in the cytoplasm and nucleus of low risk ACs (67.5%),

and in the only in the cytoplasm of high risk cases (60%) (p< 0.05). Galectin-7 was positive in

all cases, mostly in the suprabasal region of the epithelium (95.4%), but no significant

differences in the expression scores of histological groups (p>0.05). With respect to galectin-

9, 89.2% of cases were positive showing decrease in median of scores as there was increase in

histological grade (p<0.001), with predominant expression in the nucleus and cytoplasm.

Based on these results, it is suggested that galectins analyzed in this study may be involved in

the development and progression of actinic cheilitis.

Key-words: Cheilitis. Galectins. Immunohistochemistry. Lip neoplasms.

Lista de Ilustrações

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Quadro 1. Critérios arquiteturais e citológicos preconizados pela OMS

(BARNES et al., 2005) para o diagnóstico de displasia epitelial ........ 33

Quadro 2. Critérios preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005) para a

classificar o grau de displasia epitelial oral ......................................... 34

Quadro 3. Especificações dos anticorpos utilizados na pesquisa. Natal-RN,

2014 ...................................................................................................... 57

Quadro 4. Variáveis dependentes elencadas para os testes estatísticos ................ 58

Quadro 5. Variáveis independentes elencadas para os testes estatísticos ............. 59

Gráfico 1. Box-plot relativo aos escores de expressão da galectina-1 de acordo

com a gradação histológica das queilites actínicas. Natal, RN-2014... 64







Figura 1. Representação das galectinas com seus DRCs e suas interações com

glicoproteínas e glicolipídios ............................................................... 37

Figura 2. Localização das galectinas nos compartimentos celulares ou no

espaço extracelular ............................................................................... 38

Figura 3. Queilite actínica de baixo risco exibindo pleomorfismo nuclear e

celular e hipercromatismo limitados à camada basal do epitélio (HE;

Barra = 100 µm) ................................................................................... 76

Figura 4. Queilite actínica de alto risco exibindo intenso pleomorfismo nuclear

e celular, aumento da relação núcleo/citoplasma e nucléolos

proeminentes em mais de dois terços do epitélio (HE; Barra = 100

µm) ....................................................................................................... 76

Figura 5. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática da

galetina-1 (escore 3) localizada em todos as camadas do epitélio em

queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 100 µm) .............. 77

Figura 6. Fotomicrografia ilustrando imunoexpressão citoplasmática da

galetina-1 (escore 3) localizada em todas as camadas epiteliais de um

fragmento de queilite actínica de alto risco (STUHRP; Barra = 100

µm) ....................................................................................................... 77

Figura 7. Fotomicrografia ilustrando imunoexpressão nuclear e citoplasmática

da galetina-3 (escore 2) localizada em todas as camadas epiteliais de

fragmento de queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 100

µm) ....................................................................................................... 78

Figura 8. Fotomicrografia ilustrando imunoexpressão citoplasmática da

galetina-3 (escore 3) localizada em todas as camadas epiteliais de

fragmento de queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 200

µm) ....................................................................................................... 78

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática

(asterisco) e membranar (seta) da galetina-7 (escore 2) localizada em

região suprabasal do epitélio em queilite actínica de baixo risco

(STUHRP; Barra = 100 µm) ................................................................ 79

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática e

nuclear da galetina-7 (escore 2) localizada em região suprabasal do

epitélio em queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra=200

µm) ....................................................................................................... 79

Figura 11. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática e

nuclear da galetina-9 (escore 3) localizada em todas as camadas do

epitélio em queilite actínica de baixo risco (Envision; Barra=100

µm) ....................................................................................................... 80

Figura 12. Fotomicrografia demonstrando escassa imunoexpressão

citoplasmática da galectina-9 (escore 1) no epitélio de queilite

actínica de alto risco (Envision; Barra = 100 µm) ............................... 80

Lista de Tabelas

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Perfil da amostra. Natal, RN-2014 ....................................................... 61

Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos quanto ao sexo, idade e

aspecto clínico de acordo com a gradação histológica das queilites

actínicas. Natal – RN, 2014................................................................... 62

Tabela 3. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,

estatística U e significância estatística para os escores de expressão

da galectina-1 nas diferentes categorias correspondentes às

características clínicas das queilites actínicas. Natal, RN-2014............ 63



da galectina-1 nos grupos histológicos das queilites actínicas. Natal,

RN-2014 ............................................................................................... 64

Tabela 5. Distribuição absoluta e relativa da localização da marcação da

galectina-1 no epitélio de acordo com a gradação histológica das

queilites actínicas. Natal – RN, 2014 ................................................... 65


galectina-1 na célula de acordo com a gradação histológica das





características das queilites actínicas. Natal, RN-2014......................... 66



da galectina-3 nos grupos histológicos das queilites actínicas. Natal,

RN-2014................................................................................................ 67













da proteína galectina-7 nos grupos histológicos das queilites

actínicas. Natal, RN-2014...................................................................... 70










da proteína galectina-9 nos grupos histológicos das queilites

actínicas. Natal, RN-2014...................................................................... 72







Lista de Abreviaturas e Siglas

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AKT: Serina/treonina quinase. Bcl-2: Fator anti-apoptótico mitocondrial. CCE(s): Carcinoma(s) de células escamosas CD43 Do inglês cluster of differentiation 43, traduzido como grupamento

de diferenciação 43. CD45: Do inglês cluster of differentiation 45, traduzido como grupamento

de diferenciação 45. CD7: Do inglês cluster of differentiation 7, traduzido como grupamento de

diferenciação 7. CD95: Do inglês cluster of differentiation 95, traduzido como grupamento

de diferenciação 95. CEP: Comitê de Ética em Pesquisa. CNS: Conselho Nacional de Saúde. DAB: Diaminobenzidina. DLD-1: Linhagem celular in vitro de adenocarcinoma colorretal. DRC(s): Domínio(s) de reconhecimento de carboidratos ERK: Quinase regulada por sinal extracelular. Gal-9FL/Gal-9L: Galectina-9 de longo tamanho. Gal-9M/Gal 9∆5: Galectina-9 de médio tamanho. Gal-9S/Gal-9∆5/6: Galectina-9 de curto tamanho. HE: Hematoxilina/Eosina. IFN-γ: Interferon gama. IL: Interleucina. JNK: Proteína quinase c-Jun N-terminal. Ki-67: Refere-se ao antígeno celular Ki-67. MAPK: Do inglês mitogen activated kinase, traduzido como proteína quinase

mitogênica. MDM2: Do inglês murine doble minute 2, refere-se à proteína MDM2. MMP(s): Do inglês matrix metalloproteinasis, traduzido como

metaloproteinase(s) de matriz. mRNA: Do inglês messenger ribonucleic acid, traduzido como ácido

ribonucleico mensageiro. OMS: Organização Mundial de Saúde P21: Do inglês cyclin-dependent kinase inhibitor 1, refere-se à proteína

p21. P27: Do inglês cyclin-dependent kinase inhibitor 1B, refere-se à proteína

p27. P53: Do inglês protein 53, refere-se ao gene P53 ou à proteína p53. P63 ou TP63: Do inglês tumor protein 63, refere-se à proteína p63. QA(s): Queilite(s) actínica(s).

Ras/Raf: Proteínas que regulam a divisão, crescimento e o ciclo celular. Tim-3: Do inglês T-cell immunoglobulin and mucin domain, traduzido como

domínio de mucina e imunoglobulina em células T. Treg(s): Célula(s) T regulatória(s). UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte. UV(s): Ultravioleta(s) UVB: Ultravioleta tipo B VEGF: Do inglês vascular endothelial growth factor, traduzido como fator

de crescimento endotelial vascular. VEGFR-2: Do inglês vascular endothelial growth fator-receptor 2, traduzido

como receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular.

Sumário

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 26

2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 29

2.1 QUEILITE ACTÍNICA ....................................................................................... 29

2.2 GALECTINAS .................................................................................................... 36

2.2.1 Galectina-1 ......................................................................................................... 39

2.2.2 Galectina-3 ......................................................................................................... 42

2.2.3 Galectina-7 ......................................................................................................... 45

2.2.4 Galectina-9 ......................................................................................................... 48

3 OBJETIVOS ...................................................................................................... 52

3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................... 52

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 52

4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 54

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ............................................................................. 54

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ................................................................. 54

4.3 POPULAÇÃO ..................................................................................................... 54

4.4 AMOSTRA .......................................................................................................... 54

4.4.1 Critérios de inclusão .......................................................................................... 54

4.4.2 Critérios de exclusão ......................................................................................... 55

4.5 ESTUDO CLÍNICO ............................................................................................ 55

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO ............................................................................... 55

4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO .................................................................... 56

4.7.1 Método imunoistoquímico ................................................................................ 56

4.7.2 Análise do perfil imunoistoquímico ................................................................. 57

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 58

4.8.1 Variáveis ............................................................................................................. 58

5 RESULTADOS .................................................................................................. 61

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................. 61

5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS ........................................................ 63

5.2.1 Galectina-1 ......................................................................................................... 63

5.2.2 Galectina-3 ......................................................................................................... 66

5.2.3 Galectina-7 ......................................................................................................... 69

5.2.4 Galectina-9 ......................................................................................................... 71

6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 82

7 CONCLUSÕES .................................................................................................. 93

REFERÊNCIAS ................................................................................................. 95

APÊNDICE A .................................................................................................... 104

APÊNDICE B .................................................................................................... 105

ANEXO A ........................................................................................................... 107

Introdução

26

1 INTRODUÇÃO

A exposição excessiva e/ou crônica ao sol pode trazer consequências graves, incluindo

danos celulares irreversíveis e o surgimento de lesões cuja etiologia é relacionada com a

radiação ultravioleta (UV) do sol. Uma dessas lesões é a queilite actínica (QA), que constitui

uma condição inflamatória potencialmente maligna, que acomete os lábios, que tem sido

indicada como um fator de risco para o carcinoma de células escamosas (CCE)

(MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS, 2004; JADOTTE;

SCHWARTZ, 2012a; LUCENA et al., 2012).

A QA é mais frequente em indivíduos de meia-idade ou idosos do gênero masculino,

com cor da pele clara e com ocupações que requerem muita exposição ao sol

(MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS, 2004; PIÑERA-MARQUES et

al., 2010; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a). A apresentação clínica mais comum da QA é o

lábio com área escamosa pálida e seca com espessura variada e eritema associado, porém em

fases mais avançadas da lesão, ulcerações e erosões crônicas podem surgir (KAUGARS et al.,

2009). Do ponto de vista histopatológico, seus achados mais presentes são hiperceratose,

displasia epitelial que varia de leve a severa, degeneração basofílica das fibras colágenas ou

elastose solar, inflamação em graus variados e vasodilatação (CAVALCANTE; ANBINDER;

CARVALHO, 2008).

Embora a avaliação microscópica da QA seja essencial para estimar o comportamento

biológico, tratamento e acompanhamento dessas lesões, o conhecimento dos mecanismos

moleculares envolvidos no desenvolvimento pode auxiliar na compreensão da progressão

dessas lesões para CCE de lábio inferior. Neste sentido, também se torna importante

investigar as mudanças nos componentes proteicos das células sujeitas ao dano da radiação

solar.

O uso de marcadores imunoistoquímicos se insere nesse contexto visando analisar

alterações em determinadas proteínas, tais como as galectinas, que são lectinas

multifuncionais, que atuam em diferentes processos biológicos como adesão celular,

regulação do crescimento celular, desenvolvimento embrionário, inflamação, angiogênese,

modulação de apoptose e controle do ciclo celular (HASAN et al., 2007).

Em virtude dessa variedade de funções exercidas pelas galectinas, vários autores têm

explorado associação dessas proteínas com neoplasias malignas de diferentes localizações

anatômicas (KIM et al., 2011; KOBAYASHI et al., 2011; BARROW et al., 2011; WANG et

27

al., 2012; ITO; RALPH, 2012; ZHANG et al., 2012; BIRON-PAIN et al., 2013; ZHANG et

al., 2013; ZHU et al., 2013) incluindo câncer oral (ZHONG et al., 2010; WU et al., 2009;

ALVES, 2011; FÍK et al., 2012; ZHANG et al., 2013).

O envolvimento das galectinas na tumorigênese, especialmente em cavidade oral, tem

sido demonstrado em escassos estudos (DING et al., 2009; CARVALHO et al., 2012), o que

impulsiona investigações, até então inexistentes, sobre a expressão destas proteínas em QAs.

Além disso, a literatura aponta que algumas dessas galectinas sofrem influência da radiação

UV, fator essencial na etiologia das queilites actínicas (BERNERD; SARANSIN;

MAGNALDO, 1999; KUWABARA et al., 2002; PRIETO et al., 2006; GENDRONNEAU et

al., 2008; VILLENEUVE et al., 2011).

Diante do exposto, com ênfase na forte relação da progressão de QAs com o

desenvolvimento de CCE de lábio, esta pesquisa se propõe a avaliar a imunoexpressão das

galectinas -1, -3, -7 e -9 em QAs, assim como verificar se essa expressão está associada com

aspectos clínicos e progressão morfológica dessas lesões. Com os resultados obtidos,

pretende-se contribuir no entendimento do papel destas proteínas multifuncionais no

comportamento biológico desta desordem potencialmente maligna.

28

Revisão da Literatura

29

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 QUEILITE ACTÍNICA

A QA, também chamada de queilose solar, é uma condição potencialmente maligna

inflamatória que acomete os lábios, cuja etiologia foi associada com a exposição solar pela

primeira vez por Ayres (1923). Esse autor analisou cinco casos de pacientes que exerciam

atividades ao ar livre em uma região quente da Califórnia e descreveu os principais aspectos

clínicos das lesões, destacando que a melhor forma de prevenção seria a proteção contra a luz

solar. A exposição crônica ao componente UV do sol, especialmente a radiação UV do tipo B

(UVB) (280–315 nm), permanece como a principal causa da QA e do CCE de lábio inferior

(FREITAS et al., 2011; SOUZA et al., 2011).

Sabe-se que quanto mais espessa é a epiderme e quanto maior a quantidade de

melanina, melhor é a capacidade que a pele apresenta de absorver a radiação UV sem

danificar as células epiteliais. Entretanto, em comparação com a pele, que reflete de 5% a

10% e absorve 70% da radiação UV, o lábio apresenta uma proteção menor devido ao epitélio

ser mais delgado, possuir menos melanina e ter menos secreções advindas de glândulas

sebáceas e sudoríparas (JADOTTE, SCHWARTZ, 2012a; VIEIRA et al., 2012).

A associação da QA com a radiação UV explica a predileção que essa lesão apresenta

por indivíduos com ocupações profissionais que exigem exposição solar crônica e excessiva,

principalmente agricultores e pescadores (MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI;

KAYAVIS, 2004; PIÑERA-MARQUES et al., 2010; LUCENA et al., 2012), acometendo

principalmente o lábio inferior de homens com mais de 40 anos exibindo cor da pele clara

(SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010; SARMENTO et al., in press).

A predileção por indivíduos de meia-idade, provavelmente ocorre porque os danos da

radiação solar são acumulados ao longo da vida (VIEIRA et al., 2012), enquanto o maior

acometimento do sexo masculino se deve ao fato destes exercerem atividades com exposição

solar por períodos mais longos e se aposentarem mais tarde quando comparado a mulheres, ou

ainda pelas mulheres usarem mais vestuários ou cosméticos que atuem como fatores

protetores (MARTINS-FILHO; DA SILVA; PIVA, 2011).

Em países tropicais ou próximos à linha do equador, a exposição à luz solar pode

causar mais danos (CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008). Martins-Filho, Da

Silva e Piva (2011) fizeram uma estimativa da prevalência de QA em agricultores do semi-

30

árido do Nordeste brasileiro. Nos seus resultados, encontraram que a prevalência de QA foi de

16,7%, com uma associação significante da doença com o gênero masculino, pessoas de pele

clara, idade acima de 50 anos e tempo de exposição diária a radiação solar maior que oito

horas, concluindo que os agricultores dessa área semi-árida têm um risco maior de

desenvolver câncer labial.

Um estudo recente com 1.539 trabalhadores rurais canavieiros com exposição solar

crônica e um grupo controle de 150 indivíduos sem exposição solar crônica, mostrou uma

maior prevalência em indivíduos que estiveram expostos ao sol por mais de 10 anos, em

caucasianos e homens (MIRANDA et al., 2012). Lucena et. al. (2012) realizaram um estudo

com 362 indivíduos que trabalhavam em praias urbanas de uma cidade do Nordeste brasileiro

e verificaram que a prevalência de QA foi de 15,5%. Dos indivíduos que participaram deste

estudo, a maioria era do sexo masculino, com cerca de 40 anos de idade ou mais velho e com

pele clara. Além disso, mais de 80% destes trabalhavam expostos ao sol, sendo que 57,9%

trabalhavam mais de 6 horas por dia e 54,4% trabalhavam há mais de 8 anos. Curiosamente,

89,5% eram adeptos de algum método de proteção solar, fosse este o uso de protetor solar,

protetor labial ou uso de chapéu ou boné. Além dessas estratégias para proteção, também é

relatado na literatura o uso de um pano para cobrir a face em combinação com o chapéu de

abas largas principalmente por mulheres que são agricultoras (MARTINS-FILHO; DA

SILVA; PIVA, 2011).

Além da radiação UV, localização geográfica (latitude), ocupação profissional

evolvendo exposição solar e falta de uso de protetor solar, outros fatores de risco têm sido

associados com a QA, como a predisposição genética (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a). O

risco oferecido por fatores como o tabagismo e alcoolismo foi analisado por Junqueira et al.

(2011) em 202 agricultores de uma cidade do Sudeste brasileiro. Em seus resultados

encontraram que a QA foi presente em 39,6% dos pacientes e que somente o consumo de

álcool representou um fator de risco, enquanto o tabagismo não foi um fator de risco para QA

na amostra estudada. Contudo, Markopoulos, Albanidou-Farmaki e Kayavis. (2004) sugerem

que o hábito de fumar cigarro pode ter um papel na ocorrência preferencial da QA no lado

direito do lábio inferior, devido aos tabagistas segurarem o cigarro do lado direito do lábio.

Clinicamente, a QA pode se manifestar isoladamente, ou como lesões multifocais

(JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a), bem como se apresentar na sua forma aguda ou crônica

(VIEIRA et al., 2012; LUCENA et al., 2012). A sua forma aguda ocorre com maior

frequência em indivíduos jovens, geralmente no verão, quando a exposição à luz solar é mais

intensa, apresentando-se como uma lesão eritematosa, com vesículas, bolhas, descamação e

31

mesmo ulceração (SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010). Na fase aguda, a lesão tende a

regredir com a interrupção da ação do agente etiológico (LUCENA et al., 2012). A forma

crônica da QA persiste durante todas as estações do ano e acomete preferencialmente

indivíduos com mais de 40 anos.

A QA crônica geralmente é assintomática caracterizada por exibir atrofia da borda

labial, apagamento da margem entre vermelhão do lábio e porção cutânea labial (NEVILLE et

al., 2009), áreas de ressecamento, discreta aparência rachada (HUBER, 2010), geralmente

com apenas uma alteração de cor (FONTES et al., 2009). Com a progressão da lesão, surgem

características que sugerem dano no tecido subjacente, como fissuras, além de áreas

escamosas, que podem assumir maior espessura principalmente na região mais próxima da

mucosa interna do lábio inferior (NEVILLE et al., 2009; HUBER, 2010). Nesta fase, a lesão

também pode se apresentar hiperplásica, onde geralmente a superfície é irregular com áreas

ulceradas. Nas lesões que apresentam ulceração, a aparência é de uma zona central de erosão,

circundada por uma área tecidual leucoplásica ou eritroplásica (FONTES et al., 2009).

A presença de áreas de ulcerações ou erosões crônicas, nodularidade, atrofia,

sangramento, borda do vermelhão do lábio indistinta, endurecimento, crostas, descamação,

leucoplasia ou eritroplasia principalmente persistente por longos períodos de tempo com

dificuldade em curar, sugere a progressão para CCE de lábio (MARKOPOULOS;

ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS, 2004; MENTA SIMONSEN NICO; RIVITTI;

LOURENÇO, 2007; SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010; WOOD et al., 2011;

JADOTTE; SCHWARTZ., 2012a; VIEIRA et al., 2012). Além do CCE de lábio, o

diagnóstico diferencial clínico da QA também inclui queimaduras solares, líquen plano, lúpus

eritematoso, queilite glandular, queilite angular, queilite granulomatosa (JADOTTE;

SCHWARTZ, 2012b).

Nos casos analisados pelo estudo de Markopoulos, Albanidou-Farmaki e Kayavis

(2004), a QA de forma geral apresentava-se clinicamente sob três aspectos: lesões brancas

não ulceradas (29,2%), erosões ou úlceras nos lábios (47,7%) e coexistência de erosão e

úlcera com lesões brancas (23,1%). Em 11 casos (16,9%) houve presença de CCE, sendo 9

destes detectados no exame inicial e 2 com transformação maligna posterior ao exame inicial.

Cavalcante, Anbinder e Carvalho (2008), ao analisarem 38 casos de pacientes com

diagnóstico clínico de QA, verificaram como principais manifestações clínicas: atrofia,

ressecamento, lesões escamosas, edema, eritema, ulceração, perda da demarcação entre o

vermelhão do lábio e a pele, dobras acentuadas ao longo do vermelhão do lábio, manchas ou

placas brancas, crostas. Além disso, no estudo citado todos os pacientes apresentaram lesões

32

multifocais como relatado também em outras pesquisas (MARTINS-FILHO; DA SILVA;

PIVA, 2011). Entretanto, no estudo de Kaugars et al. (1999) que avaliou o número de lesões

de QA em 99 pacientes, verificou-se uma predominância da manifestação clínica isolada da

QA (81,8% dos casos), enquanto apenas 18,20% apresentaram mais de uma lesão.

Atrofia e eritema foram os principais achados clínicos nos 40 agricultores com QA

examinados na pesquisa de Martins-Filho, Da Silva e Piva (2011). Esses autores relataram

que em muitos casos (mais de 50%), o lábio se apresentava com um aspecto mosqueado

devido à presença concomitante de eritema com placas brancas. Poucos casos demonstravam

ulceração e quase 30% dos pacientes relatavam uma sensação de queimação labial.

Warnakulasuriya et al. (2008) enfatizaram que devido à grande variedade de

apresentação clínica das desordens potencialmente malignas, o cirurgião-dentista deve

realizar uma biópsia para obter um diagnóstico histopatológico. Escolher a área ideal para

uma biópsia incisional torna-se difícil para o cirurgião devido à variedade de alterações

clínicas que normalmente se mostram difusas ao longo do vermelhão do lábio (MENTA

SIMONSEN NICO; RIVITTI; LOURENÇO, 2007). Essa dificuldade também está

relacionada com o fato do aspecto clínico da QA nem sempre estar correlacionado com os

achados histológicos, visto que áreas que parecem clinicamente normais ou que são mais

homogêneas podem apresentar alterações histológicas significantes (KAUGARS et al., 1999;

MENTA SIMONSEN NICO; RIVITTI; LOURENÇO, 2007; PIÑERA-MARQUES et al.,

2010; HUBER, 2010; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a).

Os aspectos histopatológicos da QA variam desde hiperceratose, variados graus de

displasias epiteliais até carcinoma in situ do lábio. Portanto, atipias em células epiteliais

relacionadas com displasia epitelial são frequentes, como demonstrado no estudo de Xavier et

al. (2009) cujos 40 casos de QA analisados apresentaram pelo menos 3 alterações relativas à

displasia epitelial. É importante ressaltar que tais alterações displásicas podem estar presentes

em diferentes localizações do lábio em diferentes fases do seu processo de evolução

(JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a). O epitélio também pode demonstrar microscopicamente

hiperplasia, acantose ou atrofia.

No interior do tecido conjuntivo, os achados histopatológicos mais frequentes

compreendem infiltrado inflamatório de intensidade variada, vasodilatação e elastose solar,

sendo esta última uma característica proeminente em tecidos que sofreram danos pela

radiação ultravioleta (MENTA SIMONSEN NICO; RIVITTI; LOURENÇO, 2007;

CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008; FREITAS et al, 2011; VIEIRA et al.,

2012; ROJAS et al., 2012).

33

Kaugars et al. (1999) avaliaram as variáveis histopatológicas e clínicas de 152 casos

de QA para determinar se essas variáveis foram significativamente associadas com o grau de

alteração epitelial e concluíram que a acantose, alteração basofílica do tecido conjuntivo,

inflamação no tecido conjuntivo, inflamação perivascular e espessura da camada córnea

tiveram significante associação positiva com a severidade da alteração epitelial e concluíram

ainda que nenhuma das variáveis clínicas foi associada com o grau de alteração epitelial.

A pesquisa de Piñera-Marques et al. (2010), examinou microscopicamente 16 casos

diagnosticados clinicamente como QA, dentre os quais 7 casos revelaram displasia moderada

à severa, 5 casos mostraram displasia leve e 4 casos já tinham adquirido fenótipo maligno (2

carcinomas in situ e 2 CCE superficialmente invasivos). O fenótipo maligno também estava

estabelecido em 2 das 20 biópsias de QAs analisadas por Martins-Filho, Da Silva e Piva

(2011), reforçando a importância de um exame clínico criterioso, considerando que casos com

diagnóstico clínico de QAs podem exibir diagnóstico histopatológico de carcinoma de células

escamosas.

A severidade da displasia epitelial está diretamente relacionada com a progressão para

malignidade (WARNAKULASURIYA et al., 2008). Destarte, o estabelecimento do grau de

severidade em displasias epiteliais se faz necessário para estabelecer um tratamento e

prognóstico apropriado.

Embora a interpretação histopatológica da displasia ainda seja considerada um campo

subjetivo, em 2005 a Organização Mundial da Saúde (OMS), usando como base determinados

critérios morfológicos (Quadro 1), classifica a displasia epitelial em leve, moderada e severa

(Quadro 2) (BARNES et al., 2005).

Quadro 1. Critérios arquiteturais e citológicos preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005) para o diagnóstico de displasia epitelial.

CRITÉRIOS PARA DIAGNÓSTICO DE DISPLASIA EPITELIAL

Alterações arquiteturais Alterações celulares

Estratificação epitelial irregular; Hiperplasia da camada basal; Projeções epiteliais em gota;

Número aumentado de figuras de mitose; Mitoses superficiais;

Disceratose (ceratinização prematura das células);

Pérolas de ceratina.

Anisonucleose (tamanho anormal do núcleo); Pleomorfismo (forma anormal) nuclear;

Anisocitose (tamanho anormal da célula); Pleomorfismo (forma anormal) celular;

Aumento da proporção núcleo-citoplasma; Mitoses atípicas;

Hipercromatismo nuclear; Aumento do número e/ou tamanho dos

nucléolos.

34

Quadro 2. Critérios preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005) para a classificar o grau de displasia epitelial oral.

GRAU DE DISPLASIA EPITELIAL

CRITÉRIOS

LEVE Alterações na arquitetura epitelial limitada ao terço inferior do epitélio e poucas atipias citológicas.

MODERADA Alterações na arquitetura epitelial estendem-se até o terço médio do epitélio e atipias citológicas em quantidade moderada.

SEVERA Alterações na arquitetura epitelial observadas em mais de dois terços do epitélio associadas com quantidade considerada de atipias celular e nuclear.

Embora a classificação da displasia epitelial pelo sistema da OMS seja

satisfatoriamente utilizada em várias pesquisas, tem sido observada uma variabilidade

considerável na interpretação inter e intraexaminadores (WARNAKULASURIYA et al.,

2008). Essa variabilidade é especialmente relatada na gradação das displasias epiteliais

moderadas, cuja conduta clínica normalmente envolve apenas o acompanhamento da lesão.

Kujan et al. (2006) relataram que grande parte das displasias epiteliais moderadas tem um

potencial significativo de transformação maligna.

Em busca de atenuar essas discordâncias, tem-se sugerido a redução das categorias na

gradação das displasias epiteliais para um sistema com apenas duas categorias: baixo risco e

alto risco de transformação maligna. Em uma oficina coordenada pela OMS no Reino Unido

para tratar questões relacionadas com as desordens potencialmente malignas, foi proposta a

união dos casos diagnosticados segundo critérios morfológicos preconizados pela OMS

(BARNES et al., 2005) gradados como sem displasia/com displasia questionável/displasia

leve, em um grupo denominado de baixo risco; e em outro grupo, seriam agrupados os casos

com displasia epitelial moderada/severa, sendo denominado de alto risco de transformação

maligna (WARNAKULASURIYA et al., 2008). Assim, o sistema binário de gradação das

displasias epiteliais orais foi inicialmente publicado e testado por Kujan et al. (2006), seguido

por outros estudos (LIU et al., 2010; CARVALHO et al., 2012; CALDEIRA et al., 2012;

NANKVELL et al., 2013).

Nankvell et al. (2013) compararam a reprodutibilidade e valor prognóstico entre o

sistema binário proposto por Kujan et al. (2006) e o sistema da OMS (BARNES et al., 2005)

em 141 casos de displasias epiteliais orais. Esses autores verificaram uma similaridade no

valor prognóstico dos dois sistemas, porém encontraram uma reprodutibilidade maior no

sistema binário.

35

Liu et al. (2010) analisaram 138 pacientes com desordens potencialmente malignas

orais com displasia epitelial, acompanhando estes casos por cerca de 5 anos. Nesse período,

26,8% dos casos se transformaram em câncer oral, sendo os casos diagnosticados com

displasias epiteliais de alto risco associados com risco 2,78 vezes maior de transformação,

quando comparados aos casos de baixo risco, refletindo uma boa aplicabilidade deste sistema

quanto à predição de transformação maligna.

Várias alterações relacionadas com a QA podem ser irreversíveis, mas mesmo assim

os pacientes devem ser orientados a utilizar protetor solar labial e mudar os hábitos de

exposição solar para prevenir maiores danos. É importante acompanhar periodicamente o

paciente com QA e realizar biópsias incisionais naquelas lesões com aspecto clínico mais

severo, visando prevenir sua transformação maligna. Em casos com quadro microscópico

grave, com transformação maligna clara, métodos terapêuticos como a excisão cirúrgica

(vermelhectomia), criocirurgia e cirurgia a laser podem ser adotados (SHAH; DOHERTY;

ROSEN, 2010).

Em síntese, Jadotte e Schwartz (2012b) destacaram que a escolha da terapia deve levar

em consideração o diagnóstico histológico, a experiência do dentista, o aspecto estético de

acordo o desejo do paciente e os possíveis efeitos colaterais, enquanto Shah, Doherty e Rosen

(2010) relatam que independente da terapia escolhida, o ideal é que o tratamento da QA seja

eficaz para garantir que não haja o desenvolvimento de CCE de lábio.

Em geral, pode demorar mais de duas décadas de exposição solar crônica para que a

QA sofra transformação maligna, entretanto em alguns pacientes a progressão pode ser mais

rápida (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a). Devido a essa evolução lenta e também pelo fato

dos primeiros sinais clínicos serem sutis, muitos pacientes associam a QA em seu estágio

inicial com o processo de envelhecimento e negligenciam a lesão até que ela se transforme em

CCE de lábio (KAUGARS et al., 2009; CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008).

A taxa de transformação maligna da QA varia de 10% a 30% (PIÑERA-MARQUES

et al., 2010), portanto devem ser adotadas medidas preventivas, principalmente devido ao

CCE de lábio ser o mais comum (SCULLY; BAGAN, 2009). A carcinogênese é iniciada

quando as células normais sofrem transformação neoplásica, resultado cumulativo da

desregulação de mecanismos de crescimento-regulação celular. Um determinado número de

proteínas pode estar envolvido nesse processo, incluindo as galectinas (LIU; RABINOVICH,

2005).

36

2.2 GALECTINAS

As galectinas constituem uma família de lectinas, formalmente denominadas de

lectinas tipo-S, que estão expressas em diversos tecidos humanos, bem como em vários outros

organismos como outros mamíferos, esponjas, fungos, nematoides, insetos e vírus (DI

LELLA et al., 2011; LARSEN et al., 2011). Dentre suas principais características, estão

inclusas a sua afinidade por β-galactosídeos e a presença de pelo menos um domínio de

reconhecimento de carboidrato (DRC) composto por uma sequência de aproximadamente 130

aminoácidos longos (HASAN et al., 2007; BARROW; RHODES; YU, 2011; BOSCHER;

DENNIS; NABI, 2011). Até hoje, 15 galectinas foram identificadas em mamíferos, as quais

são numeradas de acordo com a ordem cronológica de suas descobertas (DI LELLA et al.,

2011; BARROW; RHODES; YU, 2011; BOSCHER; DENNIS; NABI, 2011).

De acordo com suas diferenças arquiteturais, as galectinas são classificadas em três

subtipos: prototípicas, quimera e tandem-repetido (VASTA, 2012). As galectinas prototípicas

(-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 e -15) contém apenas 1 DRC em sua sequência polipeptídica

(BRAEUER; KAMYIA; BAR-ELI, 2011). O único componente do grupo quimera é a

galectina-3 que exibe estrutura única, sendo constituída por um domínio N-terminal não-

lectina (com cerca de 120 aminoácidos constituídos por repetições em série de sequências

curtas ricas em prolina e glicina) ligado ao DRC (LARSEN et al., 2011). As galectinas do tipo

tandem-repetido (-4, -6, -8, -9 e -12) contém 2 DRCs em uma única cadeia polipeptídica, estes

frequentemente diferem um do outro e são conectados por um link (YANG; RABINOVICH;

LIU, 2008; BARROW et al., 2011; BOSCHER; DENNIS; NABI, 2011).

As galectinas exibem diferentes preferências ao se ligarem aos carboidratos, podendo

ser bivalentes ou multivalentes (BARROW; RHODES; YU, 2011). Certas galectinas com um

DRC são capazes de homodimerização, enquanto a galectina-3 pode formar pentâmeros ao se

ligar com carboidratos multivalentes em um processo que envolve a auto-associação da região

N-terminal não-lectina (LARSEN et al., 2011). Aquelas com dois DRCs, são pelo menos

proteínas bivalentes. Assim, as galectinas são capazes de formar matrizes ordenadas feitas de

lectina e glicoconjugados multivalentes, denominados complexos lattices (BOSCHER;

DENNIS; NABI, 2011). A Figura 1 ilustra a estrutura das galectinas e a formação de lattices.

37

Figura 1. Representação das galectinas com seus DRCs e suas interações com glicoproteínas e glicolipídios. (a) Galectinas Prototípicas -1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 e -15 com um DRC são capazes de homodimerização para formarem lattices de superfície celular. (b) A galectina-3 do subtipo quimera contém um DRC e um domínio N-terminal não-lectina responsável pela oligomerização (até pentâmeros) formando lattices geometricamente diferentes daqueles formados pelos outros subtipos de galectinas (c) Semelhante às galectinas prototípicas, as galectinas do tipo tandem-repetido (-4, -6, -8, -9 e -12) possuem dois DRCs podem formar um complexo lattice.

Fonte: Adaptado de Boscher, Dennis e Nabi (2011).

As galectinas podem estar expressas intracelularmente ou serem secretadas, por vias

pouco esclarecidas, para o meio extracelular (Figura 2). Intracelularmente, essas proteínas

podem estar presentes no núcleo ou no citoplasma, interagindo com outras proteínas na

modulação da sinalização de vários processos celulares importantes como ligação com um

precursor de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) e regulação do crescimento celular.

Quando em meio extracelular, essas galectinas podem se ligar a moléculas de superfície

celular ou presentes na matriz extracelular, onde participam de processos de diferenciação,

proliferação, apoptose e progressão do ciclo celular ou ainda participar da interação

intercelular ou entre célula e matriz extracelular (LIU; RABINOVICH, 2005; COMPAGNO

et al., 2013).

38

Figura 2. Localização das galectinas nos compartimentos celulares ou no espaço extracelular. As galectinas são sintetizadas no citosol e podem ser translocadas para o interior do núcleo ou secretadas para o espaço extracelular, onde se ligam a glicanos presentes na matriz extracelular ou na superfície das células.

Fonte: Adaptado de Vasta (2012).

Além de exercerem funções em processos fisiológicos, a expressão alterada das

galectinas em células tumorais ou associadas ao estroma tumoral tem fornecido evidências

que essas proteínas realizam papéis importantes na tumorigênese e progressão tumoral,

incluindo assim influência na angiogênese (HSIEH et al., 2008; THIJSSEN et al., 2010),

apoptose (BROWN et al., 2012), diferenciação (LIANG et al., 2008; ZHONG et al., 2010;

ALVES et al., 2011), metástase (CHIANG et al., 2008; WU et al., 2009; FÍK et al., 2013) e

imunidade tumoral (RUBINSTEIN et al., 2004; ITO; RALPH, 2012).

2.2.1 Galectina-1

A primeira proteína descoberta na família das galectinas foi a galectina-1, que

constitui uma proteína homodimérica não covalente de 14kDa, com sítio ligante a β-

galactosida e reconhece, preferencialmente, complexos tipo glicanos (ITO et al., 2012).

Quando sua localização é intracelular, encontra-se predominantemente em sua forma de

monômero através da qual interage com outras proteínas localizadas no núcleo e no

39

citoplasma; em contraste, a galectina-1 extracelular geralmente forma dímeros que interagem

com glicoproteínas de superfície celular (CEDENO-LAURENT; DIMITROFF, 2012).

A galectina-1 é considerada funcionalmente polivalente já que participa de diversas

atividades biológicas e de desenvolvimento tecidual. Existem numerosas evidências de que a

galectina-1 esteja envolvida em vários processos relacionados ao câncer como

imunossupressão, angiogênese, metástase e hipóxia (ITO et al., 2012). Nesse contexto, a

expressão alterada da galectina-1 tem sido demonstrada em tecidos malignos e com potencial

de transformação maligna de diversas localizações anatômicas (KOHRENHAGEN et al.,

2006; SAUSSEZ et al., 2008; KOHRENHAGEN et al., 2010; ITO; RALPH, 2012) incluindo

em cavidade oral (LE et al., 2005; CHIANG et al., 2008; SAUSSEZ et al., 2008; HSIEH et al,

2008; DING et al., 2009; WU et al., 2009; ZHONG et al., 2010; ALVES et al., 2011;

CARVALHO et al., 2012).

A função imunossupressora da galectina-1 foi amplamente pesquisada. Evidências

mostram que a galectina-1 pode induzir a apoptose de células T por várias vias de sinalização

dependentes da sua interação com os ligantes específicos presentes na superfície celular. De

fato, a galectina-1 liga-se a várias moléculas que podem atuar como receptores na superfície

das células T, incluindo CD7, CD43, CD45 e CD95 (BARROW; RHODES; YU, 2011). Além

disso, a galectina-1 pode causar supressão de células T através da sua influência na produção

de citocinas, dentre elas o interferon-gama (IFN-γ; citocina de assinatura da resposta Th1) e

interleucina 17 (IL-17; citocina relacionada com a resposta do tipo Th17) (YANG;

RABINOVICH; LIU, 2008).

Recentemente, Mobergslien e Sioud (2011) verificaram, em seus experimentos in

vitro, que células dendríticas maduras e imaturas que não expressavam os genes da galectina-

1 aumentavam as respostas de células T+ alogênicas, com consequente aumento na produção

de IFN-γ por estas últimas. A alta expressão da galectina-1 também tem sido associada com a

promoção de um microambiente favorável à resposta inflamatória mediada por células Th2,

com níveis elevados de interleucinas -4, -13 e -10 e ainda com o aumento do número de

células T regulatórias (Tregs), fatores estes que prejudicam respostas imunes anti-tumorais

eficazes (CEDENO-LAURENT; DIMITROFF, 2012).

A contribuição da galectina-1 para o privilégio imunológico dos tumores tem sido alvo

de vários estudos. Através de estratégias in vitro e in vivo, Rubinstein et al. (2004)

demonstraram que a inibição da atividade imunossupressora da galectina-1 em tecidos

cancerosos resultou em aumento da imunidade tumoral mediada por células T, incluindo

também o aumento da sobrevida de células Th1 e subsequente produção de IFN-γ.

40

Enfatizando essa função imunossupressora da galectina-1, Le et al. (2005) mostraram que a

expressão da galectina-1 foi inversamente correlacionada com a quantidade de células T em

CCEs de cabeça e pescoço. Recentemente, Ito e Ralph (2012) demonstraram em experimentos

in vitro que a inibição da galectina-1 está associada com a supressão de metástase em modelos

murinos de metástases pulmonares de câncer de mama e cólon. Essa supressão ocorreu devido

à proteção de células T efetoras e à inibição da adesão de células malignas.

A maioria dos estudos relata que níveis aumentados da galectina-1 em células

tumorais ou no estroma associado ao tumor podem ser considerados como uma indicação da

progressão de tumores malignos, como também de transformação maligna. Chiang et al.

(2008) avaliaram a expressão da galectina-1 em espécimes bem diferenciados de CCE orais,

comparando-as com espécimes de pacientes saudáveis e observaram que a superexpressão da

galectina-1 no front invasivo dos tumores foi associada com um pior prognóstico. Esses

autores enfatizaram que nos casos com metástase, a expressão ocorreu apenas no front

invasivo, sugerindo a participação dessa proteína na metástase de CCE oral.

No que se refere ao processo de metástase, a galectina-1 tem sido associada com

algumas etapas, como na adesão das células malignas à matriz extracelular, na formação de

complexos formados por células malignas associadas a plaquetas (ITO et al., 2012) ou ainda

na modulação de metaloproteinases de matriz (MMPs), proteínas relacionadas com a

degradação da matriz extracelular, processo ativo na invasão tumoral.

Experimentos in vitro demonstraram a associação do aumento na expressão da

galectina-1 com a promoção da invasão tumoral em CCEs orais, através da regulação positiva

da produção e atividade das MMP-2 e MMP-9, como também através da reorganização do

citoesqueleto (WU et al., 2009).

Em seus experimentos in vitro com modelo de carcinogênese de CCE oral, Zhong et

al. (2010) realizaram uma análise proteômica que revelou uma superexpressão da galectina-1

na linhagem celular analisada, sendo este dado confirmado tanto pela análise Western Blot

nessa e em outra linhagem de células malignas, como também em amostras de pacientes com

CCEs orais primários. Além disso, esses autores encontraram que a galectina-1 foi

negativamente correlacionada com a diferenciação patológica do tumor, de forma que uma

maior expressão dessa proteína poderia indicar um grau mais pobre de diferenciação

patológica.

No que se refere à tumorigênese, Kohrenhagen et al. (2006) avaliaram a expressão da

galectina-1 em neoplasias benignas e malignas cervicais e observaram que o aumento da

expressão desta proteína, principalmente em células estromais próximas às células

41

neoplásicas, foi positivamente correlacionada com o aumento da gravidade do grau

histológico, sugerindo que galectina-1 está envolvida com a iniciação e progressão de

neoplasias cervicais. Este mesmo grupo de autores, pouco tempo depois, verificou resultados

semelhantes ao constatar uma correlação positiva entre o aumento na expressão da galectina-1

(principalmente em células associadas ao estroma) e a progressão de neoplasias vulvares

(KORENHAGEN et al. 2010).

A participação da galectina-1 na tumorigênese em região de cabeça e pescoço foi

investigada por Saussez et al. (2008) que demonstraram um aumento na imunoexpressão da

galectina-1 em CCE de laringe e hipolaringe, quando comparada ao epitélio normal e

displasias epiteliais de baixo e alto grau destas regiões. Esses autores também verificaram que

a progressão de displasias de alto grau para carcinomas foi correlacionada com uma mudança

na localização dessa proteína do citoplasma para o núcleo.

Com relação à carcinogênese oral, Ding et al. (2009) mostraram que os maiores níveis

desta proteína estavam presentes nos CCEs orais e ainda que esta proteína encontrava-se

superexpressa na camada espinhosa de leucoplasias orais, quando comparada a mucosa oral

normal. Este resultado se repetiu com quantificação de mRNA para galectina-1 realizada

nesta mesma pesquisa.

Analisando a expressão da galectina-1 em displasias epiteliais orais, Carvalho et al.

(2012) verificaram que esta proteína está mais expressa quando o epitélio está alterado,

estando sua marcação restrita ao tecido epitelial e que a intensidade dessa marcação aumenta

de acordo com o aumento do grau da displasia, sugerindo o envolvimento dessa proteína tanto

no processo de transformação de fenótipo normal para displásico, quanto na progressão de

displasias de baixo risco para displasias de alto risco.

Um dos papéis da galectina-1 na transformação neoplásica seria a ligação desta com a

proteína oncogênica H-Ras, promovendo a sua fixação na membrana plasmática. O complexo

galectina-1-H-Ras representa uma das etapas essenciais na transformação neoplásica (YANG;

RABINOVICH; LIU, 2008). Além disso, em condições de hipóxia, altos níveis de galectina-1

têm sido observados (LE et al., 2005; ZHAO et al., 2010), fornecendo um microambiente que

favorece a angiogênese, bem como tumorigênese (BRAEUER et al., 2012; ITO et al., 2012).

A superexpressão da galectina-1 em células endoteliais associadas ao tumor em CCEs

orais foi verificada por Hsieh et al. (2008). Esse estudo mostrou que a galectina-1 interage

com a neuropilina-1, co-receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) presente

na superfície das células endoteliais e essa interação estimulou a fosforilação do receptor 2 do

VEGF (VEGFR-2), ativando a via de sinalização da MAPK (proteína quinase mitogênica) e

42

resultou no aumento da proliferação e adesão das células endoteliais. Nessa perspectiva,

estudos in vitro realizados por Thijssen et al. (2010) mostraram que em ratos knockout

[galectina-1(-/-)] ocorre redução da angiogênese em vários modelos tumorais. Esses autores

mostraram evidências de que a galectina-1 secretada por células tumorais pode atuar como um

fator pró-angiogênico ao ser absorvida por células endoteliais associadas ao tumor, ativando a

cascata Ras/Raf/ERK que resulta na estimulação de migração e proliferação de células

endoteliais.

2.2.2 Galectina-3

A galectina-3 é o único membro do grupo quimera de galectinas e é amplamente

expressa em vários tipos celulares, incluindo células inflamatórias e epiteliais (LARSEN et

al., 2011). O DRC da galectina-3 consiste em aproximadamente 140 resíduos de aminoácidos

e quando comparado ao de outras galectinas, mostra uma sequência de aminoácidos (Asp-

Trp-Gli-Arg), que se assemelha à do fator anti-apoptótico mitocondrial Bcl-2 (CEDENO-

LAURENT; DIMITROFF, 2012).

Estudos recentes têm demonstrado a participação da galectina-3 em diferentes

fenômenos biológicos relacionadas com o câncer (FERRAZZO et al., 2009; ALVES et al.,

2011; BROWN et al., 2012; ZHANG et al., 2013), tais quais adesão celular, proliferação,

diferenciação e angiogênese (PRIETO et al., 2006). Entretanto, sua função (principalmente

como proteína pró ou anti-apoptótica) e expressão parecem depender do tipo celular e tecido

tumoral envolvido (BROWN et al., 2012).

O compartimento celular no qual a galectina-3 está localizada também influencia na

sua função (DE FARIA et al., 2010). Predominantemente, a galectina-3 se localiza no

citoplasma, no entanto ela pode migrar para o núcleo ou ser secretada para o meio extracelular

(BROWN et al., 2012). Quando localizada no citoplasma, essa galectina tem um importante

papel em sua atividade anti-apoptótica, contudo tem sido relatado um efeito oposto quando

sua localização é nuclear (HONJO et al., 2000).

Honjo et al. (2000) observaram que a expressão da galectina-3 no citoplasma

aumentou durante a progressão do câncer de língua, enquanto que a expressão nuclear

diminuiu consideravelmente, sendo este fato associado à sobrevida diminuída destes

pacientes. O estudo de Alves et al. (2011) com CCEs de língua também avaliou a

imunoexpressão da galectina-3, mostrando um decréscimo da expressão nuclear e aumento da

43

expressão citoplasmática desta proteína correlacionado com o aumento do grau de

diferenciação histológica. Esses autores sugerem que a galectina-3 exerce uma função anti-

tumoral quando presente no compartimento nuclear e favorece a progressão do tumor, quando

expressa no citoplasma.

A pesquisa de Prieto et al. (2006) sugeriu uma forte associação da expressão

citoplasmática e nuclear da galectina-3 com a radiação UV em lesões de áreas expostas ao sol.

Esses autores demonstraram que melanomas sobre áreas expostas cronica e intermitentemente

ao sol exibiam intensa expressão citoplasmática da galectina-3, quando comparados com

melanomas acrais, que não expressaram a proteína. Além disso, a expressão nuclear da

galectina-3 foi restrita aos melanomas cronicamente expostos ao sol, sugerindo que esta

translocação nuclear está associada com lesões induzida por radiação UV crônica. Os

resultados desse estudo mostraram que os melanócitos expostos à radiação UV acumularam

galectina-3 com a progressão do tumor, particularmente no núcleo.

Saegusa et al. (2008) descreveram, através de experimentos in vitro e in vivo, que a

galectina-3 desempenha uma função de proteção contra apoptose em ceratinócitos expostos à

radiação UVB. Esses autores relataram que após exposição de ceratinócitos à radiação UVB

ocorre um aumento transitório na expressão do gene da galectina-3. Em seus resultados, os

ceratinócitos de camundongos galectina-3-/- foram significantemente mais sensíveis a

estímulos apoptóticos induzidos por radiação UVB que ceratinócitos do tipo selvagem.

Adicionalmente, neste estudo a deficiência de galectina-3 foi associada com o aumento da

ativação das vias de sinalização JNK e ERK (reguladoras da apoptose), bem como uma

diminuição da ativação de AKT (proteína anti-apoptótica).

Embora não haja estudos que abordem a relação entre radiação UV e galectina-3 em

lesões orais, existem algumas pesquisas com essa galectina na tumorigênese oral, uma vez

que evidências sugerem que sua expressão seja necessária para o início da transformação

maligna. Algumas de suas funções têm sido associadas com esse processo de tumorigênese,

como sua interação com o oncogene K-RAS e regulação do ciclo celular (YANG;

RABINOVICH, 2008).

A atividade da galectina-3 como reguladora do ciclo celular, se dá principalmente pela

sua ligação com a proteína β-catenina em diferentes tipos de câncer, dentre os quais o de

cabeça e pescoço (FERRAZZO et al., 2009; ZHANG et al., 2013). A expressão alterada da β-

catenina já foi associada com a progressão de diferentes tipos de câncer, inclusive com a

progressão de QA para CCE de lábio (SCHUSSEL; SANTOS PINTO; MARTINS, 2011).

Quando a β-catenina se acumula no citoplasma, ela migra para o núcleo e se liga à galectina-

44

3, estimulando a proliferação celular através da ativação de Ciclina D1 (alvo final da via de

sinalização Wnt) (FERRAZZO et al., 2009). Além da indução da Ciclina D1, outros

reguladores do ciclo celular são afetados pela galectina-3, como a regulação negativa da

Ciclina E e Ciclina A, e a regulação positiva de inibidores do ciclo celular como p21 e p27

(YOSHII et al., 2002).

Para estudar a expressão da galectina-3 na tumorigênese oral, De Faria et al. (2011)

investigaram a expressão desse marcador em um modelo de carcinogênese de língua. Esses

autores observaram que a mudança no padrão de superexpressão do núcleo para o citoplasma

pode ser associado com a progressão do estado displásico para o neoplásico.

Com conclusões similares, Carvalho et al. (2012) analisaram a expressão

imunoistoquímica da galectina-3 em displasias epiteliais orais e mucosa oral normal. Seus

resultados mostraram uma predominância de marcação na membrana celular nos casos de

mucosa oral, fato esse que os autores explicam pela função que a galectina-3 desempenha no

mecanismo de adesão celular; enquanto nos casos de displasias, a marcação ocorreu

principalmente no núcleo/citoplasma, seguida pelo citoplasma apenas, colaborando com a

hipótese de que o aumento da expressão citoplasmática dessa proteína está associado com sua

atividade anti-apoptótica e consequentemente com a progressão das lesões estudadas.

A expressão da galectina-3 na tumorigênese também foi alvo de estudos em outras

localizações anatômicas, muitas vezes mostrando resultados conflitantes. Araújo-Filho et al.

(2006) avaliaram a expressão da galectina-3 em tecidos normais, benignos e malignos de

próstata, verificando que houve uma maior expressão dessa proteína nos espécimes de tecidos

normais quando comparados à contraparte maligna. Em concordância com esses achados, Lee

et al. (2006) verificaram que a diminuição da expressão da galectina-3 foi correlacionada com

a progressão de lesões potencialmente malignas cervicais para o carcinoma cervical, no qual

se observou ausência de marcação. Em contraste, Hittelet et al. (2002) concluíram em seu

estudo compreendendo tecido normal, displásico e maligno de cólon, que a expressão da

galectina-3 aumentou consideravelmente com a progressão da malignidade tecidual.

Brown et al. (2012) investigaram a expressão da galectina-3 em uma série de lesões

melanocíticas e verificaram um aumento na expressão desta proteína em melanomas

primários delgados, quando comparados ao nevo benigno; entretanto, uma diminuição

progressiva dessa expressão entre os melanomas primários delgados e melanomas mais

espessos ou melanomas metastáticos. Em seus resultados, encontraram ainda que essa

diminuição na expressão da galectina-3 está associada a um aumento no risco de

disseminação metastática e pior prognóstico em pacientes com melanomas primários. Esses

45

autores sugerem que em melanomas delgados os altos níveis dessa proteína podem contribuir

para a resistência a apoptose, que é uma característica chave de células melanocíticas

malignas e que durante a progressão dos melanomas mais espessos, MMPs são liberadas pelas

células e poderiam usar a galectina-3 como um substrato.

A clivagem da galectina-3 por MMP-2 e MMP-9 foi demonstrada por experimentos in

vivo em uma linhagem de células de câncer de mama, sendo esse fenômeno descrito como um

processo ativo na progressão deste tipo de tumor (NANGIA-MAKKER et al., 2007) e

adicionalmente, a clivagem desta proteína por estas MMPS foi associada com a angiogênese

nesta mesma linhagem celular (NANGIA-MAKKER et al., 2010). Experimentos de

Melnikova e Bar-Eli (2008) silenciaram o gene a galectina-3 em linhagens de melanomas

detectaram que esse processo reduzia a secreção de MMP-2 ativa e desta forma reduzia

significativamente a capacidade invasiva destas células. Além disso, recentemente a

galectina-3 acelerou a mobilidade de células gástricas cancerosas através da regulação

positiva de um outro membro da família de MMPS, a MMP-1 (KIM et al., 2011), conclusão

semelhante à do estudo de Wang et al., (2012), no qual a superexpressão de galectina-3 em

células de melanoma promoveu migração e invasão das células tumorais in vitro, além de

estar associada com metástase em pacientes com melanoma, através de sua ação indireta na

supraregulação da MMP-1.

2.2.3 Galectina-7

A expressão da galectina-7 em condições de normalidade ocorre, preferencialmente,

nos epitélios estratificados tais quais os presentes na epiderme, córnea, esôfago, epitélio

anorretal e de cavidade oral (GENDRONNEAU et al., 2008). Sua contribuição para diferentes

eventos associados à diferenciação e desenvolvimento de epitélios pluriestratificados é bem

estabelecida, assim como sua associação com a migração das células epiteliais, o que

desempenha um papel crucial na reepitelização de feridas da córnea e da epiderme

(SAUSSEZ; KISS, 2006).

Além de ser um fator de diferenciação celular, a função pró-apoptótica da galectina-7

tem sido demonstrada por vários estudos desde sua identificação, por Polyak et al. (1997),

como um dos genes cuja expressão é induzida nos passos iniciais da apoptose mediada por

p53 em células malignas DLD-1 de cólon humano (BIRON-PAIN et al., 2013). O gene P53

tem como uma das suas maiores funções o controle da apoptose e da homeostase, e sua

46

expressão é modulada pela radiação UVB proveniente do sol, que induz a apoptose em

ceratinócitos epidérmicos.

De fato, em 1999, Bernerd, Saransin e Magnaldo encontraram que a proteína e o

mRNA da galectina-7 são rapidamente induzidos em ceratinócitos expostos à radiação UVB.

Assim, esta superexpressão estimularia o descolamento dos ceratinócitos apoptóticos na

camada basal da epiderme, contribuindo para a sua eliminação subsequente após atravessar as

camadas suprabasais. Estes autores concluíram, de forma geral, que a secreção da galectina-7

em ceratinócitos suprabasais pode afetar adesão intercelular e participar na sua eliminação

rápida. Adicionalmente, um estudo in vitro mostrou que a expressão da galectina-7 ectópica

atuou regulando positivamente a ativação da via JNK e liberação de citocromo C (mediador

apoptótico), aumentando assim a susceptibilidade de células tumorais à apoptose após

exposição a vários agentes genotóxicos, dentre eles a radiação ultravioleta (KUWABARA et

al., 2002).

Gendronneau et al. (2008), através de experimentos in vitro, forneceram evidências

que a galectina-7 é essencial na manutenção da homeostase da epiderme em resposta a

radiação UVB, por meio da modulação da apoptose e proliferação de ceratinócitos, como

também participando no processo de migração deste tipo celular. Recentemente, Villeneuve et

al. (2011) em seus estudos in vitro, descreveram a galectina-7 como uma proteína capaz de se

ligar ao Bcl-2. Esses autores demonstraram que uma fração da galectina-7 é constitutivamente

localizada nas mitocôndrias, de maneira parcialmente dependente de Bcl-2 e que após

estímulos apoptóticos (radiação UV), ocorre superexpressão da galectina-7, induzindo um

aumento na liberação de proteínas apoptóticas mitocondriais. Adicionalmente, o estresse

apoptótico estimula o recrutamento da galectina-7 para as mitocôndrias sem que haja ruptura

dos complexos Bcl-2/Galectina-7. Estes resultados em conjunto, sugerem que alterações na

expressão da galectina-7 estão associadas com desordens epidérmicas com etiologia

relacionada à radiação ultravioleta.

A expressão da galectina-7 em carcinomas epiteliais de diferentes localizações tem

demonstrado resultados conflitantes (UEDA; KUWABARA; LIU, 2004; DEMERS et al.,

2005; SAUSSEZ et al., 2006; ZHU et al., 2010; BIRON-PAIN et al., 2013; ZHU et al., 2013).

Assim, um papel dual tem sido atribuído à esta proteína, semelhante à galectina-3, atuando

como fator positivo ou negativo no desenvolvimento tumoral (SAUSSEZ; KISS, 2006).

Com relação ao câncer oral, Chen et al. (2004) demonstraram, por meio de análises

proteômicas, que a galectina-7 é superexpressa em CCE oral, quando comparada ao epitélio

oral normal. A avaliação imunoistoquímica da galectina-7 em CCEs de língua realizada por

47

Alves et al. (2011) demonstrou a superexpressão dessa proteína em 73,8% dos casos, sendo

esta significantemente correlacionada com o grau histológico de malignidade. Contudo, não

foi observada correlação entre a expressão desta molécula com metástase e estágio clínico,

sugerindo que esta proteína não estaria associada com o desenvolvimento de metástase em

linfonodos cervicais de CCEs de língua.

Devido à forte associação entre esse processo e distúrbios de apoptose, alguns estudos

vêm investigando o envolvimento da galectina-7 no estabelecimento do fenótipo maligno.

Além disso, um estudo destacou que a mesma possui atividade pré-maligna relacionada à sua

capacidade de induzir a expressão de MMP-9 in vitro, gerando um efeito positivo no

desenvolvimento de linfomas (DEMERS et al., 2005).

Saussez et al. (2008) verificaram que a presença de galectina-7 foi associada com a

progressão neoplásica em CCE de hipofaringe e laringe. Esse estudo demonstrou uma

superexpressão imunoistoquímica da galectina-7 em displasias epiteliais de baixo grau,

quando comparadas ao epitélio normal e em carcinomas, quando comparados à displasias de

alto grau. O aumento gradual da galectina-7 nos casos de displasias foi concomitante à

mudança de marcação citoplasmática para nuclear.

Altos níveis de galectina-7 no compartimento intracelular foram associados com a

carcinogênese oral na pesquisa de Carvalho et al. (2012). Esses autores verificaram que sua

expressão foi predominante no compartimento intracelular em casos de displasia epitelial oral,

principalmente naquelas classificadas como de alto-risco de transformação maligna, enquanto

nas amostras de mucosa oral normal a expressão foi principalmente membranar e no terço

superior e médio do epitélio, corroborando sua função em processos fisiológicos do epitélio.

Os resultados deste estudo sugerem que a galectina-7 poderia atuar tanto na progressão de

células de mucosa oral normal para células epiteliais displásicas, bem como na progressão de

displasias epiteliais orais de baixo risco para as de alto risco de transformação maligna.

2.2.4 Galectina-9

A galectina-9 faz parte do grupo de galectinas tandem-repetido e consiste em dois

DRCs homólogos (N-terminal, 148 aminoácidos; C-terminal, 149 aminoácidos) conectados

através de um peptídeo ligante. A expressão da galectina-9 é regulada por algumas citocinas,

como o IFN-γ, sugerindo diferentes funções desta proteína em condições fisiológicas e

patológicas (HIRASHIMA et al., 2004).

48

O splicing pós-transcricional da galectina-9 tem sido relatado como um dos fatores

que afetam a sua função. Nesse sentido, de acordo com o tamanho do peptídeo de ligação

entre os dois DRCs, têm sido relatadas três isoformas desta proteína, sendo denominadas de

galectina-9 de longo (Gal-9FL ou Gal-9L), médio (Gal-9M ou Gal-9∆5) e curto tamanho

(Gal-9S ou Gal-9∆5/6). As variantes determinadas pelo splicing provavelmente possuem

especificidades ou afinidades diferentes para os glicoconjugados. Ademais, o splicing também

parece influenciar na localização celular da galectina-9, que tem sido descrita como uma

proteína extracelular, ou intracelular, seja no núcleo ou no citoplasma (HEUSSCHEN;

GRIFFIOEN; THIJSSEN, 2013). Mesmo com a sugestão de diferentes funções para cada

isoforma da galectina-9, a maioria dos estudos ainda não considera esse fator em suas

metodologias.

De forma geral a galectina-9 desempenha papel chave na resposta imune e reações

alérgicas, mas também atua na interação adesiva de vários tipos celulares e atividade pró-

apoptótica nos timócitos e linfócitos T citotóxicos ativados (KASAMATSU et al., 2005). Em

determinadas situações, a galectina-9 também pode induzir uma rápida morte celular nas

células Th1 de maneira dependente da Tim-3, podendo atuar como um regulador negativo das

respostas Th1 e Th17 com redução paralela de células Tregs (OOMIZU et al., 2012).

Semelhante a outros tipos de galectinas, as funções exercidas pela galectina-9 têm sido

associada a vários processos na progressão tumoral, sendo encontrada, na maioria dos

estudos, uma expressão ausente, baixa ou reduzida nas células neoplásicas quando

comparadas aos tecidos normais. Na biologia tumoral sua expressão tem sido associada com

apoptose, controle do ciclo celular, imunidade tumoral, angiogênese, adesão celular, migração

e metástase (HEUSSCHEN; GRIFFIOEN; THIJSSEN, 2013).

Até então, sua função na adesão de células tumorais e metástase é a mais estudada.

Kageshita et al. (2002) observaram que uma linhagem de células de melanomas que

expressaram galectina-9 foi capaz de formar colônias, enquanto outras linhagens celulares que

não expressaram essa galectina, não formaram colônias. Neste estudo também foi observada

correlação inversa entre a expressão de galectina-9 e a progressão da doença, sendo associada

com uma baixa frequência de metástase, sugerindo que essa proteína está relacionada com um

aumento significante do tempo de sobrevida.

A pesquisa de Irie et al. (2005) demonstrou que uma linhagem de adenocarcinoma de

mama com altos níveis de galectina-9 foi capaz de formar agregados celulares, enquanto

células malignas com baixos níveis dessa lectina não conseguiram. A adesão célula-matriz

extracelular mostrou-se reduzida em células com altos níveis de galectina-9. Além disso, esse

49

estudo analisou a expressão imunoistoquímica da referida proteína em 84 pacientes portadores

de câncer de mama, onde dezenove dos 21 casos com metástase exibiam baixa expressão da

galectina-9, bem como a taxa de sobrevida livre de doença cumulativa para pacientes

galectina-9-positivos foi mais favorável do que aquela para o grupo galectina-9-negativo.

Adicionalmente, nesta amostra, a expressão dessa proteína foi inversamente correlacionada

com o grau histopatológico dos tumores.

Zhang et al. (2012) verificaram em seus experimentos in vitro, que a perda da

expressão de galectina-9 em células de carcinoma hepatocelular promoveu supressão da

agregação celular, além de estimular o potencial adesivo e invasivo destas células à matriz

extracelular. Adicionalmente, esses autores analisaram a expressão imunoistoquímica da

galectina-9 em 200 espécimes de carcinoma hepatocelular e verificaram que a diminuição da

expressão desta molécula foi significantemente correlacionada com a gradação histológica,

metástase linfonodal e intra-hepática e invasão vascular. Ainda observaram que o tempo de

sobrevida foi maior em pacientes que expressaram galectina-9 que nos casos negativos. A

conclusão deste estudo sugere que a galectina-9 seja um novo fator prognóstico com potencial

anti-metastático.

Esse provável aumento do potencial maligno em tecidos tumorais com baixos níveis

de galectina-9, conduziu Liang et al. (2008) a analisarem a imunoexpressão dessa proteína em

epitélio cervical normal, neoplasia cervical intraepitelial e CCE cervical, usando como

controle a expressão da E-caderina. Estes autores encontraram expressão citoplasmática

marcante para as duas proteínas em tecidos normais, enquanto nas neoplasia cervical

intraepiteliais e CCEs esta expressão foi significantemente reduzida. No que se refere às

neoplasias intraepiteliais, aquelas com alto grau histológico mostraram uma expressão

significantemente reduzida, quando comparadas às de baixo grau, sugerindo a participação da

galectina-9 na transformação maligna cervical. Em adição, a expressão da galectina-9 nos

CCEs foi inversamente correlacionada com o grau de diferenciação, sugerindo que a

expressão reduzida dessa galectina poderia ser utilizada como biomarcador de diferenciação

em carcinomas cervicais.

Com relação ao câncer oral, Kasamatsu et al. (2005) avaliaram a expressão da

galectina-9 em linhagens celulares de carcinoma oral através de PCR em tempo real e

Western blot e observaram que tanto o mRNA quanto a proteína Galectina-9 exibiram baixa

expressão nas linhagens de células malignas em comparação com ceratinócitos normais.

Um estudo recente analisou o perfil da imunoexpressão da galectina-9 em carcinomas

de células escamosas de cabeça e pescoço. A mesma estava expressa na maioria das amostras

50

de epitélio normal, enquanto não foi detectada marcação nos casos de CCE de cabeça e

pescoço, sugerindo que devido a essa perda de expressão no processo de displasia do tecido

até a transformação maligna, essa proteína pode representar um potencial marcador de

normalidade no epitélio de células escamosas (FÍK et al., 2012).

Não existem, até o presente momento, estudos que investiguem a expressão da

galectina-9 em lesões orais potencialmente malignas, especialmente QAs. Portanto,

considerando o potencial anti-tumoral sugerido para esta proteína, assim como seu papel

como marcador de diferenciação em CCEs de diferentes localizações anatômicas,

investigações sobre essa molécula na tumorigênese oral se fazem importantes para a

implementação de novas estratégias terapêuticas contra o câncer nesta localização.

51

Objetivos

52

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a expressão imunoistoquímica das galectinas -1, -3, -7 e -9 em 65 casos de

QAs, bem como relacionar essa expressão com as características clínicas e gradação

histológica.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Aplicar os critérios estabelecidos pela OMS (BARNES et al., 2005) para diagnóstico das

displasias epiteliais nas QAs e posteriormente classificar os casos em QAs de baixo e alto

risco segundo metodologia sugerida por Kujan et al. (2006) e adaptada por Caldeira et al.

(2012).

• Verificar se há associação entre as características clínicas e a gradação histológica das

QAs estudadas.

• Verificar se há diferenças nos escores de imunoexpressão das galectinas -1, -3, -7 e -9

entre as características clínicas das queilites actínicas;

• Avaliar se há diferenças nos escores de imunoexpressão das galectinas -1, -3, -7 e -9 entre

os grupos histológicos das queilites actínicas;

• Verificar se há associação entre a localização da marcação imunoistoquímica das

galectinas -1, -3, -7 e -9 na célula e a gradação histológica das queilites actínicas;

• Verificar se há associação entre as camadas epiteliais com marcação positiva para as

galectinas -1, -3, -7 e -9 e a gradação histológica das queilites actínicas;

54

Material e Métodos

54

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Antes da realização da pesquisa, este projeto foi submetido à análise do seu conteúdo

pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN), de acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS).

Conforme parecer nº 317/2012 (ANEXO A), seu protocolo foi aprovado.

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

A presente pesquisa consistiu em um estudo descritivo, semiquantitativo e

retrospectivo com análise comparativa das características clínico-morfológicas e a expressão

imunoistoquímica das galectinas -1, -3, -7 e -9 em uma série de casos de queilites actínicas.

4.3 POPULAÇÃO

Para a realização dessa pesquisa, foram utilizados todos os casos de queilites actínicas

arquivados no serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da Faculdade

de Odontologia da UFRN no período de 1996 a 2013.

4.4 AMOSTRA

A seleção da amostra foi intencional e compreendeu 65 casos de QAs que incluíram

casos com e sem displasias epiteliais.

4.4.1 Critérios de inclusão

Espécimes de QAs localizadas em lábio inferior diagnosticadas histopatologicamente

como hiperceratose, elastose solar, displasias epiteliais orais;

55

Casos cujos blocos em parafina apresentaram quantidade suficiente de material para

realização do estudo imunoistoquímico.

4.4.2 Critérios de exclusão

Casos com diagnóstico clínico de QA e histopatológico de carcinoma in situ ou CCE

de lábio inferior;

4.5 ESTUDO CLÍNICO

A partir de fichas clínicas de requisições de biópsias arquivadas no Laboratório de

Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da UFRN, foram obtidas informações

clínicas referentes ao sexo, idade, raça e profissão, assim como dados relacionados aos

aspectos clínicos das QAs. Posteriormente, estes dados foram transcritos para uma ficha

específica elaborada para o estudo (APÊNDICE A).

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO

Para o estudo morfológico, do material incluído em parafina foram obtidos cortes

histológicos de 5µm de espessura que foram corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina

(HE). Posteriormente, esses cortes foram examinados à microscopia de luz para análise da

gradação de displasia epitelial. A princípio, os espécimes de QA analisados conforme os

critérios morfológicos arquiteturais e citológicos preconizados pela OMS para diagnóstico das

displasias epiteliais e de acordo com a presença e frequência dessas alterações, os casos que

apresentaram displasia epitelial foram classificados em displasia leve, moderada ou severa

(BARNES et al. 2005). Em seguida, para a classificação dos casos pelo sistema binário de

gradação inicialmente proposto por Kujan et al. (2006), foi aplicada a metodologia realizada

por Caldeira et al. (2012), na qual os espécimes sem displasia e com displasias leves foram

categorizadas como QAs de baixo risco e os casos com displasias moderadas e severas foram

56

categorizados como QAs de alto risco de transformação maligna. Estes dados foram

transcritos para uma ficha específica elaborada para o estudo (APÊNDICE A).

4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO

4.7.1 Método imunoistoquímico

Os espécimes foram fixados em formol a 10% e incluídos em parafina.

Posteriormente, foram submetidos a cortes histológicos de 3µm de espessura, que foram

estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e desengorduradas, preparadas com

adesivo à base de Organosilano (3-aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St

Louis, MO, USA). Foram utilizados anticorpos primários anti-galectina-1, anti-galectina-3,

anti-galectina-7 e anti-galectina-9 conforme especificações constantes no Quadro 3. Após a

recuperação antigênica, a peroxidase endógena tecidual foi bloqueada com solução de 0,3%

de peróxido de hidrogênio 10 volumes, na proporção 1:1. Na técnica imunoistoquímica foi

empregado sistema estreptoavidina-biotina (STUHRP, Starr Trek Universal HRP

DetectionTM, Biocare Medical, CA, USA), utilizando os anticorpos primários anti-galectina-1,

anti-galectina-3, anti-galectina-7 e o sistema Envision® (Dako Co., Carpinteria, CA, USA)

utilizando o anticorpo primário anti-galectina-9. A reação foi desenvolvida com

diaminobenzidina (DAB) como cromógeno. Os espécimes foram contracorados com

hematoxilina de Mayer e montados em resina Erv-mount (Easy Path®). O controle negativo

foi obtido pela substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino (BSA –

Bovine Serum Albumin) a 1% em solução tampão. Como controle positivo foram utilizados

espécimes de carcinomas de células escamosas orais sabidamente positivos para as galectinas

-1, -3 e -7 e espécimes de mucosa labial sem displasia epitelial para a galectina-9.

57

Quadro 3. Especificações dos anticorpos utilizados na pesquisa. Natal-RN, 2014.

*Novocastra Laboratories LTDA; ** Abcam Inc., Cambridge, MA, USA.

4.7.2 Análise do perfil imunoistoquímico

Após o processamento dos cortes histológicos, foi analisada a imunomarcação das

galectinas -1, -3, -7 e -9 em cada espécime, através da microscopia de luz (Olympus CH30,

Olympus Japan Co., Tokyo, Japão), sob o aumento de 40x e 100x. As células epiteliais que

exibiram coloração acastanhada na membrana plasmática ou em meio intracelular foram

consideradas positivas. Inicialmente, foi feita a análise com relação à camada do tecido

epitelial que exibiu positividade (camada basal, suprabasal ou todas as camadas), segundo

metodologia proposta por Caldeira et al. (2012). Em seguida, a localização da galectina na

célula também foi avaliada e classificada em marcação membranar, citoplasmática e nuclear,

conforme preconizado por Carvalho et al. (2012). Por fim, a extensão do tecido epitelial

imunomarcado foi analisada conforme metodologia adaptada de Ding et al. (2009). Foram

atribuídos escores para cada caso, que receberam escore 0 quando exibiam 0% das células

positivas; escore 1 quando apresentaram 1 a 30% de células imunopositivas; escore 2 quando

havia de 31 a 60% de células marcadas e escore 3 quando mais de 60% das células foram

positivas.

A avaliação foi realizada independentemente por dois examinadores previamente

calibrados e que desconheciam o diagnóstico histológico dos casos. Os dados coletados foram

devidamente anotados em fichas previamente elaboradas para a presente pesquisa

(APÊNDICE B).

Especificidade e Clone Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação

Galectina-1 (25C1) Novocastra* 1:50 Citrato pH 6,0,

Microondas 2x5’ Overnight

Galectina-3 (9CA) Novocastra* 1:100 Citrato pH 6,0,

Microondas 2x5’ Overnight

Galectina-7 (5F12) Novocastra* 1:100 Sem Tratamento 120 minutos

Galectina-9 (ab69630) Abcam** 1:250 Tris/EDTA

pH 9,0 em Pascal 121 ºC 120 minutos

58

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Após a coleta dos dados, os mesmos foram digitados em planilha eletrônica Excel

(Microsoft Office 2013® para Windows) e posteriormente exportados para o programa

estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 20.0, no qual foi à

princípio foi realizada a análise descritiva dos dados e em seguida os testes estatísticos

descritos abaixo.

A análise da associação entre as variáveis qualitativas sexo, idade dicotomizada (<40

anos e ≥40 anos) e aspecto clínico dicotomizado (leucoplásico e eritroplásico/

eritroleucoplásico) com a gradação histológica (baixo risco e alto risco) das QAs, utilizou-se o

teste Qui-quadrado de Pearson.

Para avaliar a existência de diferenças significativas entre os escores de expressão das

galectinas nos grupos das variáveis sexo, idade dicotomizada, aspecto clínico dicotomizado e

gradação histológica das QAs, foi realizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.

Para verificar a associação da localização das galectinas na camada epitelial e na

célula com a gradação histológica dos espécimes, utilizou-se o teste Qui-quadrado de Pearson

e quando não foi possível utilizá-lo, foi realizado o Teste Exato de Fisher.

Adicionalmente, com o objetivo de avaliar a variabilidade de concordância entre os

observadores foi calculado o coeficiente ponderado de Kappa que denotou uma boa

concordância (Kappa=0,733). Para todos os testes realizados foi adotado um nível de

significância de 5%.

4.8.1 Variáveis

Quadro 4. Variáveis dependentes elencadas para os testes estatísticos. Variável Classificação Categoria/Escalada de medida

Imunomarcação das células epiteliais para galectina-1

Qualitativa ordinal Extensão do tecido epitelial positivo (escores)







59

Quadro 5. Variáveis independentes elencadas para os testes estatísticos. Variável Classificação Categorias

Localização da marcação na célula

Qualitativa nominal mutualmente exclusiva

Categorizada a depender da galectina em questão.

Localização da marcação na camada epitelial

Qualitativa nominal mutualmente exclusiva

Categorizada a depender da galectina em questão.

Sexo Qualitativa nominal mutuamente exclusiva

1. Masculino 2. Feminino

Idade Qualitativa nominal mutualmente exclusiva

1. <40 anos 2. ≥ 40anos

Aspecto clínico Qualitativa nominal mutuamente exclusiva

1. Leucoplásica 2. Eritroplásica/ Eritroleucoplásica

Gradação das QAs Qualitativa ordinal 1.Baixo Risco 2.Alto Risco

60

Resultados

61

5 RESULTADOS

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

O perfil clínico e morfológico dos 65 casos de QAs analisados nesta pesquisa

encontram-se detalhados na Tabela 1.

Tabela 1. Perfil da amostra. Natal, RN-2014. VARIÁVEIS n % SEXO Masculino 50 76,9 Feminino 15 23,1 IDADE ≥ 40 anos 52 80,0 < 40 anos 13 20,0 RAÇA Branca 46 70,8 Parda 9 13,8 Negra 2 3,1 Não informada 8 12,3 ATIVIDADES PROFISSIONAIS Com exposição solar 37 56,9 Sem exposição solar 20 30,8 Não informado 8 12,3 ASPECTO CLÍNICO Leucoplásico 42 64,6 Eritroplásico 5 7,7 Eritroleucoplásico 13 20,0 Outro 4 6,2 Não informado 1 1,5 GRADAÇÃO HISTOLÓGICA Baixo risco 40 61,5 Alto risco 25 38,5 TOTAL 65 100

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN.

A amostra foi composta principalmente por indivíduos do sexo masculino (76,9%),

com idade superior a 40 anos (80,0%) e de raça branca (70,8%). A média de idade, em anos,

com respectivo desvio-padrão foi de 52,54+15,55. Houve predominância de indivíduos que

62

exerciam atividades ocupacionais relacionadas à exposição solar como agricultores (17),

trabalhadores de construção civil (7), motoristas (5), vendedores ambulantes (2), militares (2),

pescadores (2), ferroviário (1) e salva-vidas (1). Dos indivíduos com atividades que não

exigiam exposição solar a maioria era de aposentados (7), mas havia também 3 professores, 2

donas de casa, 2 diretoras de escola, 1 autônoma, 1 empregada doméstica, 1 agente

penitenciário, 1 estudante, 1 funcionário público e 1 veterinário. No que se refere ao aspecto

clínico das lesões, houve predominância do leucoplásico. Com relação à análise morfológica,

40 casos de QA de baixo risco (Figura 3) e 25 casos de alto risco (Figura 4) (Tabela 1).

As variáveis, sexo, idade e aspecto clínico foram testadas quanto a associação com a

gradação histológica das QAs (Tabela 2).

Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos quanto ao sexo, idade e aspecto clínico de acordo com a gradação histológica das queilites actínicas. Natal – RN, 2014.

Variável

Gradação Queilite Actínica

Baixo Risco n (%)

Alto Risco n (%)

TOTAL n (%)

p(1)

Sexo Masculino 30 (60,0) 20 (40,0) 50 (100)

0,642 Feminino 10 (66,7) 5 (33,3) 15 (100)

TOTAL 40 (61,5) 25 (38,5) 65 (100)

Idade ≥ 40 anos 33 (63,5) 19 (36,5) 52 (100)

0,524 < 40 anos 7 (53,8) 6 (46,20) 13 (100)

TOTAL 40 (61,5) 25 (38,5) 65 (100)

Aspecto clínico

Leucoplásico 29 (69,0) 13 (31,0) 42 (100) 0,315 Eritroplásico/

Eritroleucoplásico 10 (55,6) 8 (44,4) 18 (100)

TOTAL* 39 (65,0) 21 (35,0) 60 (100) Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (*): 4 casos não apresentavam algum dos aspectos clínicos categorizados e em 1 caso esta informação não estava disponível. (1): Teste Qui-quadrado de Pearson.

Não houve significância estatística na associação entre as características clínicas com a

gradação histológica das QAs. Tanto os pacientes do sexo masculino, quanto do sexo

feminino apresentaram, em sua maioria, QAs de baixo risco de transformação maligna. Das

25 QAs de alto risco, apenas 5 casos eram do sexo feminino. A maioria dos pacientes mais

velhos (≥ 40 anos) apresentou QAs de baixo risco. O grupo de pacientes mais jovens

63

(<40anos) exibiu uma discreta predominância de QAs de baixo risco. Com relação ao aspecto

clínico das lesões, a maioria dos casos com aparência leucoplásica correspondiam a QAs de

baixo risco.

5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS

5.2.1 Galectina-1

A expressão da galectina-1 foi observada no epitélio de 64 (98,5%) dos 65 casos

analisados. Adicionalmente, observou-se imunorreatividade desta proteína em células

endoteliais, fibroblastos e células musculares no interior do tecido conjuntivo.

Os dados referentes aos escores de imunoexpressão dos casos de QAs com relação às

variáveis, sexo, idade e aspecto clínico encontram-se descritos na Tabela 3.

Tabela 3. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para os escores de expressão da galectina-1 nas diferentes categorias correspondentes às características clínicas das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

Variável n Mediana Q25-Q75 Média dos

postos U p(1)

Sexo Masculino Feminino

50 3 2-3 33,34 358,00 0,76215 3 2-3 31,87

Idade ≥ 40 anos < 40 anos

52 3 2-3 34,07 282,50 0,29713 2 2-3 28,73

Aspecto clínico+

Leucoplásico 42 3 2-3 31,67 329,00 0,361Eritroplásico/

Eritroleucoplásico 18 2,5 2-3 27,78

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): 4 casos não apresentavam algum dos aspectos clínicos categorizados e em 1 caso esta informação não estava disponível. (1): Teste Mann-Whitney.

A partir da análise da Tabela 3, verifica-se que as medianas dos escores de expressão

da galectina-1 foram iguais no sexo masculino e feminino. Com relação à idade dos

indivíduos, aqueles mais velhos apresentaram mediana maior que aqueles mais novos. Os

casos com aspecto clínico leucoplásico revelaram mediana maior que os casos de aspecto

64

eritroplásico/eritroleucoplásico. No entanto, não se observou significância estatística nestas

diferenças (p>0,05).

A Tabela 4 e o Gráfico 1 demonstram os resultados dos escores de imunoexpressão da

galectina-1 nas diferentes gradações histológicas das lesões.

Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para os escores de expressão da galectina-1 nos grupos histológicos das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

Grupos n Mediana Q25-Q75 Média dos postos U p(1) Baixo Risco 40 3 2-3 34,05 458,00 0,516 Alto Risco 25 3 2-3 31,32

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (1): Teste Mann-Whitney.

Gráfico 1. Box-plot relativo aos escores de expressão da galectina-1 de acordo com a gradação histológica das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

A maioria dos casos de QAs (60%) apresentou escore 3 de expressão da galectina-1.

Dos casos de QAs de baixo risco, constatou-se que 26 (65,0%) exibiram escore 3 (Figura 5), 8

(20,0%) com escore 2, 5 (12,5%) apresentaram escore 1 e em apenas 1 caso (2,5%) houve

ausência de marcação (escore 0). Todos os casos de QAs de alto risco evidenciaram marcação

65

para esta proteína, com predominância de escore 3 (n=13; 52,0%) (Figura 6), enquanto 10

casos (40,0%) revelaram escore 2 e em 2 (8,0%) dos casos se observou escore 1. No que se

refere aos escores de marcação para galectina-1, não foram verificadas diferenças estatísticas

significativas entre os grupos histológicos (p=0,516) (Tabela 4).

A distribuição da localização da galectina-1 nas camadas epiteliais de acordo com a

gradação histológica das QAs encontra-se na Tabela 5.

Tabela 5. Distribuição absoluta e relativa da localização da marcação da galectina-1 no epitélio de acordo com a gradação histológica das queilites actínicas. Natal – RN, 2014.

Gradação histológica

Localização da galectina-1 no epitélio

Total n (%)

p(1) Todas as camadas n (%)

Suprabasal n (%)

Baixo Risco 35 (89,7) 4 (10,3) 39 (100,0) 0,092 Alto Risco 18 (72,0) 7 (28,0) 25 (100,0) TOTAL+ 53 (82,8) 11 (17,2) 64 (100,0)

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): Em 1 caso a marcação foi negativa. (1): Teste Exato de Fisher.

A maioria das QAs de baixo risco (89,7) e de alto risco (72%) demonstrou marcação

para galectina-1 em todas as camadas epiteliais, embora esta associação não tenha exibido

significância estatística (p=0,092) (Tabela 5).

A Tabela 6 demonstra os resultados referentes as localizações da galectina-1 na célula

distribuídas nos grupos histológicos das QAs.

Tabela 6. Distribuição absoluta e relativa da localização da marcação da galectina-1 na célula de acordo com a gradação histológica das queilites actínicas. Natal – RN, 2014.


Localização da galectina-1 na célula Total n (%)

p(1) Citoplasma n (%)

Citoplasma/Núcleo n (%)

Baixo Risco 22 (56,4) 17 (43,6) 9 (36,0)

39 (100,0) 0,546 Alto Risco 16 (64,0) 25 (100,0) TOTAL+ 38 (59,4) 26 (40,6) 64 (100,0)

FONTE: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): Em 1 caso a marcação foi negativa. (1): Teste Qui-quadrado de Pearson.

66

A partir da análise da Tabela 6, verifica-se que não houve associação significativa com

relação à localização da marcação da galectina-1 na célula nas diferentes gradações

histológicas das QAs (p=0,546). A marcação citoplasmática foi predominante tanto nos casos

de QA de baixo risco (n=22; 56,4%), quanto nas de alto risco (n=16; 64%). Os demais casos

positivos mostraram uma combinação de marcação citoplasmática e nuclear.

5.2.2 Galectina-3

A imunoexpressão da galectina-3 foi observada no epitélio de todas as 65 QAs

analisadas nesta pesquisa. Em adição, em alguns casos também foi observada positividade em

células endoteliais e fibroblastos na lâmina própria.

A Tabela 7 dispõe os dados referentes aos escores de imunoexpressão para galectina-3

com relação às variáveis, sexo, idade e aspecto clínico.

Tabela 7. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para os escores de expressão da galectina-3 nas diferentes categorias correspondentes às características das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

Variável n Mediana Q25-Q75 Média dos

postos U p(1)


50 2 2-3 33,90 330,00 0,45415 2 1-3 30,00


52 2 1-3 34,06 283,00 0,33513 2 2-2 28,77

Aspecto clínico+

Leucoplásico 42 2 1-3 28,36 468,00 0,121Eritroplásico/

Eritroleucoplásico 18 3 2-3 35,50

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): 4 casos não apresentavam algum dos aspectos clínicos categorizados e em 1 caso esta informação não estava disponível. (1): Teste Mann-Whitney.

Verificou-se que as medianas dos escores de expressão da galectina-3 foram as

mesmas em casos do sexo masculino e feminino, bem como em pacientes mais jovens e mais

velhos. Já no tocante ao aspecto clínico, a mediana para os casos com aspecto clínico

leucoplásico foi menor que para os casos de aspecto eritroplásico/eritroleucoplásico.

Entretanto, não se observou significância estatística nesta diferença (p>0,05) (Tabela 7).

67

A Tabela 8 e o Gráfico 2 demonstram os resultados dos escores de expressão da

galectina-3 nos diferentes grupos histológicos.

Tabela 8. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para os escores de expressão da galectina-3 nos grupos histológicos das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

Grupos n Mediana Q25-Q75 Média dos postos U p(1) Baixo Risco 40 2 1-3 28,52 679,00 0,010* Alto Risco 25 3 2-3 40,16

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (*): Diferença significante a 5,0%. (1): Teste Mann-Whitney.


Após avaliar os escores para a galectina-3, foram observadas diferenças estatísticas

significativas entre os grupos histológicos (p=0,010) (Tabela 8 e Gráfico 2). Das QAs de

baixo risco, a maioria apresentou escore 2 (n=14; 35,0%) (Figura 7) e escore 1 (n=14; 35,0%),

enquanto 12 casos (30,0%) mostraram escore 3. As QAs de alto risco mostraram uma

68

predominância de escore 3 (n=14; 56,0%) (Figura 8) (Figura 2), enquanto 9 (36,0%)

apresentaram escore 2 e somente 2 (8,0%) exibiram escore 1.

A localização da galectina-3 nas camadas epiteliais foi associada com a gradação

histológica das QAs. Os resultados encontram-se na Tabela 9.



Localização da galectina-3 no epitélio Total n (%)


Suprabasal n (%)

Baixo Risco 25 (62,5) 15 (37,5) 40 (100,0) 0,403Alto Risco 13 (52,0) 12 (48,0)

27 (41,5) 25 (100,0)

TOTAL 38 (58,5) 65 (100,0) Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (1): Teste Qui-quadrado de Pearson.

Evidenciou-se predominância de imunoexpressão para galectina-3 em todas as

camadas epiteliais. Dos casos de QA de baixo risco, a maioria (n=25; 62,5%) exibiu marcação

em todos os estratos epiteliais e em 15 casos (37,5%) a marcação foi restrita à camada

suprabasal. No casos de QAs com alto risco, essa diferença foi mais discreta, visto que 13

casos (10,8%) exibiram marcação em todas as camadas e 12 casos (48,0%) apresentaram

positividade apenas na região suprabasal. Não houve diferença estatisticamente significativa

entre os grupos em relação à localização epitelial da marcação da galectina-3 (p=0,446).

Os resultados referentes à localização da galectina-3 na célula com relação aos grupos

histológicos das QAs podem ser observados na Tabela 10.




p(1) Citoplasma

n(%) Citoplasma/Núcleo

n (%) Baixo Risco 13 (32,5) 27 (67,5)

10 (40,0) 40 (100,0) 0,029*

Alto Risco 15 (60,0) 25 (100,0) TOTAL 28 (43,1) 37 (56,9) 65 (100,0)

FONTE: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (*): Diferença significante a 5,0%. (1): Teste Qui-quadrado de Pearson.

69

A análise da localização da marcação da galectina-3 na célula revelou que as QAs de

baixo risco exibiram marcação positiva mais frequente no núcleo e citoplasma (n=27; 67,5%),

enquanto a maioria dos casos gradados como de alto risco (n=15; 60,0%) demonstrou

marcação predominante no compartimento citoplasmático. Este resultado apresentou

significância estatística (p=0,029) (Tabela 10). Adicionalmente, 10 dos casos de QAs com

marcação citoplasmática exibiram marcação focal na membrana plasmática.

5.2.3 Galectina-7

Os 65 casos de QAs analisados nesta pesquisa demonstraram marcação positiva para

galectina-7.

Na Tabela 11 podem ser observados os resultados referentes aos escores de

imunoexpressão para galectina-7 com relação às variáveis, sexo, idade e aspecto clínico.


Variável N MedianaQ25-Q75

Média dos postos

U p(1)


50 3 2-3 32,64 393,00 0,753 15 3 2-3 34,20


52 3 2-3 35,42 212,00 0,020* 13 2 1-3 23,31

Aspecto clínico+

Leucoplásico 42 3 2-3 30,90 361,00 0,757 Eritroplásico/


Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): 4 casos não apresentavam algum dos aspectos clínicos categorizados e em 1 caso esta informação não estava disponível. (*): Diferença significante a 5,0%. (1): Teste Mann-Whitney.

A análise da Tabela 11 evidencia que as medianas dos escores de expressão da

galectina-7 foram as mesmas em casos do sexo masculino e feminino, assim como nos casos

com aspecto clínico leucoplásico e eritroplásico/eritroleucoplásico (p>0,05). Após comparar a

mediana dos escores de imunoexpressão da galectina-7 com a idade dicotomizada dos

70

pacientes, verificou-se uma mediana maior no grupo de pacientes mais velhos que no grupo

mais novo, sendo esta diferença estatisticamente significativa (p=0,020).

A Tabela 12 e o Gráfico 3 demonstram os resultados dos escores de imunoexpressão

da galectina-7 nas diferentes gradações histológicas das lesões.

Tabela 12. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para os escores de expressão da proteína galectina-7 nos grupos histológicos das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

Grupos N Mediana Q25-Q75 Média dos postos U p(1) Baixo Risco 40 3 2-3 34,29 448,50 0,436 Alto Risco 25 2 2-3 30,94

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (1): Teste Mann-Whitney.


A avaliação dos escores de imunoexpressão da galectina-7 nas gradações histológicas

das QAs, revelou que para os casos de baixo risco a mediana foi 3, enquanto para as QAs de

alto risco, a mediana foi 2 (Gráfico 3). Contudo, o após o teste Mann-Whitney, não foi

observada diferença estatisticamente significativa (p=0,436) (Tabela 12). Dos casos de QA de

71

baixo risco, 24 (60,0%) exibiram escore 3, 11 (27,5%) apresentaram escore 2 (Figura 9) e 5

(12,5%) escore 1. Das QAs de alto risco, 12 casos (48,0%) apresentaram escore 3, 10 (40,0%)

revelaram escore 2 (Figura 10), e apenas 3 (12,0%), escore 1.

A análise da localização da galectina-7 nas camadas epiteliais demonstrou que quase a

totalidade dos casos (n=62; 95,4%) exibiu marcação apenas na região suprabasal, enquanto

apenas 3 casos (4,6%) mostraram marcação em todas as camadas epiteliais. Trinta e oito

(95,0%) das QA de baixo risco e 24 das de alto risco (96,0%) demonstraram marcação na

suprabasal. O teste Exato de Fisher revelou não existir associação estatisticamente

significativa entre os grupos histológicos e a localização epitelial da marcação desta proteína

(p=1,000).

Na Tabela 13 podem ser observados os resultados da localização da galectina-7 na

célula de acordo com a gradação histológica das queilites actínicas.




p(1) Citoplasma/Núcleo

n (%) Citoplasma/Membrana

n (%) Baixo Risco 27 (67,5) 13 (32,5)

10 (40,0) 40 (100,0) 0,538

Alto Risco 15 (60,0) 25 (100,0) TOTAL 42 (64,6) 23 (35,4) 65 (100,0)

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (1): Teste Qui-quadrado de Pearson.

Todos os casos de QA estudados exibiram positividade no compartimento

citoplasmático. Ambos os grupos histológicos de QAs demonstraram um predominância de

marcação positiva no citoplasma e núcleo, quando comparados ao outro padrão encontrado

(marcação citoplasmática e membranar). No entanto, não foi verificada associação

estatisticamente significativa entre a localização da marcação da galectina-7 na célula e os

grupos histológicos de QAs (p=0,538) (Tabela 13).

5.2.4 Galectina-9

A avaliação da imunoexpressão da galectina-9 revelou marcação positiva no epitélio

de 58 (89,2%) dos 65 casos analisados. A expressão desta proteína também foi evidenciada

em algumas células inflamatórias presentes no tecido conjuntivo.

72

A Tabela 14 apresenta os dados referentes aos escores de imunoexpressão para

galectina-9 nas variáveis, sexo, idade e aspecto clínico das queilites actínicas.


Variável N Mediana Q25-Q75 Média dos

postos U p(1)


50 2 1-3 30,93 478,50 0,092 15 3 2-3 39,90


52 2 1-3 35,41 212,50 0,031*

13 1 0,5-2,5 23,35

Aspecto clínico+

Leucoplásico 42 2 1-3 33,07 270,00 0,068 Eritroplásico/


Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): 4 casos não apresentavam algum dos aspectos clínicos categorizados e em 1 caso esta informação não estava disponível. (*): Diferença significante a 5,0%. (1): Teste Mann-Whitney.

A expressão da galectina-9 foi maior nos casos de sexo feminino. Com relação à idade

dos indivíduos, aqueles mais velhos (idade ≥ 40 anos) apresentaram mediana maior que

aqueles mais novos. Os casos com aspecto clínico leucoplásico revelaram mediana maior que

os casos de aspecto eritroplásico/eritroleucoplásico. No entanto, apenas a diferença dos

escores de imunoexpressão da galectina-9 nos grupos de idades diferentes revelou

significância estatística (p=0,031).

A Tabela 15 e o Gráfico 4 demonstram os resultados dos escores de imunoexpressão

da galectina-9 nas diferentes gradações histológicas das lesões.

Tabela 15. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para os escores de expressão da proteína galectina-9 nos grupos histológicos das queilites actínicas. Natal, RN-2014.

Grupos n Mediana Q25-Q75 Média dos postos U p(1) Baixo Risco 40 3 2-3 40,76 189,50 <0.001* Alto Risco 25 1 0-2 20,58

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (*): Diferença significante a 5,0%. (1): Teste Mann-Whitney.

73


A mediana dos escores de expressão da galectina-9 nas QAs de baixo risco foi maior

(escore 3) que nas QAs de alto risco (escore 1) (Gráfico 4). Dos casos de QA de baixo risco,

21 (52,5%) demonstraram escore 3 (Figura 11), 11 (27,5%) revelaram escore 2 e 8 (20,0%),

escore 1. Já nos casos de alto risco, observou-se que a maioria (n=9; 36,0%) exibiu escore 1

(Figura 12), enquanto 7 casos (28,0%) demonstraram escore 0 (ausência de marcação), 7

(28,0%) apresentaram escore 2 e apenas 2 casos (8,0%), escore 3. Observou-se diferença

estatística altamente significativa ao avaliar os escores de imunoexpressão da galectina-9

entre os grupos histológicos (p<0,001) (Tabela 15).

Na Tabela 16 estão os resultados referentes à localização da galectina-9 nas camadas

do epitélio de acordo com a gradação histológica das queilites actínicas.

74



Localização da galectina-9 no epitélio

Total n (%)


Suprabasal n (%)

Baixo Risco 26 (65,0) 14 (35,0) 40 (100,0) 0,141Alto Risco 8 (44,4) 10 (55,6)

24 (41,4) 18 (100,0)

TOTAL+ 34 (58,6) 58 (100,0) Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): 7 casos apresentaram ausência de marcação imunoistoquímica para galectina-9. (1): Teste Qui-quadrado de Pearson.

Como pode ser observado na Tabela 16, a análise da localização da galectina-9 nas

camadas epiteliais demonstrou que a maioria dos casos (n=34; 58,6%) exibiu marcação em

todos os estratos epiteliais. Dos casos de QAs de baixo risco, 26 (65,0%) apresentaram

marcação em todas as camadas. Em contraste, houve uma discreta predominância (n=10,

55,6%) de marcação restrita à região suprabasal nos casos com displasia de alto risco. Porém,

estas associações não foram estatisticamente significativas (p=0,162).

Na Tabela 17 podem ser observados os resultados da distribuição relativa e absoluta

da localização da galectina-9 na célula de acordo com os grupos histológicos das queilites

actínicas.




p(1) Citoplasma/Núcleon (%)

Citoplasma n (%)

Membrana n (%)

Baixo Risco 25 (62,5) 10 (25,0) 5 (12,5) 40 (100,0) 0,405 Alto Risco 13 (72,2) 5 (27,8) 0 (0,0) 18 (100,0) TOTAL+ 38 (65,5) 15 (25,9) 5 (8,6) 58 (100,0)

Fonte: Laboratório de histopatologia da disciplina de Patologia Oral – UFRN. (+): 7 casos apresentaram ausência de marcação imunoistoquímica para galectina-9. (1): Teste Exato de Fisher

Foram observados três padrões de marcação para a galectina-9 na célula: marcação no

citoplasma e núcleo, apenas no citoplasma ou apenas na membrana plasmática. A marcação

no citoplasma e núcleo foi predominante nos dois grupos histológicos de QAs, seguida da

marcação apenas no citoplasma. Somente 5 casos (12,5%) do grupo de QAs de baixo risco

75

exibiu marcação restrita à membrana plasmática, enquanto nenhum caso de alto risco mostrou

esse padrão de marcação. Contudo, o teste Exato de Fisher revelou não existir associação

estatisticamente significativa entre o padrão de marcação da galectina-9 na célula e os grupos

histológicos das QAs (p=0,405) (Tabela 17).

76

Figura 3. Queilite actínica de baixo risco exibindo pleomorfismo nuclear e celular e hipercromatismo limitados à camada basal do epitélio (HE; Barra = 100 µm).

Figura 4. Queilite actínica de alto risco exibindo intenso pleomorfismo nuclear e celular, aumento da relação núcleo/citoplasma e nucléolos proeminentes em mais de dois terços do epitélio (HE; Barra = 100 µm).

77

Figura 5. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática da galectina-1 (escore 3) localizada em todos as camadas do epitélio em queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 100 µm).

Figura 6. Fotomicrografia ilustrando imunoexpressão citoplasmática da galectina-1 (escore 3) localizada em todas as camadas epiteliais de um fragmento de queilite actínica de alto risco (STUHRP; Barra = 100 µm).

78

Figura 7. Fotomicrografia ilustrando imunoexpressão nuclear e citoplasmática da galectina-3 (escore 2) localizada em todas as camadas epiteliais de fragmento de queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 100 µm).

Figura 8. Fotomicrografia ilustrando imunoexpressão citoplasmática da galectina-3 (escore 3) localizada em todas as camadas epiteliais de fragmento de queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 200 µm).

79

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática (asterisco) e membranar (seta) da galectina-7 (escore 2) localizada em região suprabasal do epitélio em queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 100 µm).

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática e nuclear da galectina-7 (escore 2) localizada em região suprabasal do epitélio em queilite actínica de baixo risco (STUHRP; Barra = 200 µm).

*

80

Figura 11. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática e nuclear da galectina-9 (escore 3) localizada em todas as camadas do epitélio em queilite actínica de baixo risco (Envision; Barra = 100 µm).

Figura 12. Fotomicrografia demonstrando escassa imunoexpressão citoplasmática da galectina-9 (escore 1) no epitélio de queilite actínica de alto risco (Envision; Barra = 100 µm).

Discussão

82

6 DISCUSSÃO

A QA é uma lesão potencialmente maligna que acomete os lábios, resultante da

exposição crônica à radiação solar, especialmente os raios UVB, cujas taxas de transformação

maligna em CCE de lábio varia de 10% a 30% (XAVIER et al., 2009; PIÑERA-MARQUES

et al., 2010; LUCENA et al., 2012). Em geral, os estudos revelam que os indivíduos que

desenvolvem QA são, em sua maioria, do sexo masculino, com cor de pele clara e idade

acima de 40 anos (KAUGARS et al., 1999; MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI;

KAYAVIS, 2004; CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008; PIÑERA-

MARQUES et al., 2010; MARTINS-FILHO; DA SILVA; PIVA, 2011; LUCENA et al.,

2012; SARMENTO et al., in press). Os dados epidemiológicos da amostra da presente

pesquisa corroboram com os dados da literatura revisada, fortalecendo o perfil, já bem

estabelecido, dos pacientes mais acometidos pela queilite actínica.

Dos indivíduos que compunham a amostra desta pesquisa, a maioria (56,9%) realizava

atividades ocupacionais com exposição solar crônica, à semelhança da amostra de outros

estudos (MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS, 2004; FREITAS et al.,

2008; SARMENTO et al., in press). De fato, atividades profissionais que exigem exposição

solar têm sido descritas como o principal fator de risco para as QAs (SARMENTO et al., in

press). A prevalência da QA em estudos sem distinção de atividades ocupacionais seja de

0,2% a 0,45% (KAUGARS et al., 1999; CORSO et al., 2006), enquanto nos estudos que

envolvem apenas indivíduos com atividades relacionadas com exposição solar crônica essas

taxas variam de 15,5% a 39,6% (JUNQUEIRA et al., 2011; LUCENA et al., 2012).

Do ponto de vista clínico, a QA comumente se apresenta uma placa leucoplásica e/ou

eritroplásica, geralmente assintomática, com áreas ressecadas e descamadas, afetando

principalmente o vermelhão de lábio inferior (HUBER, 2010; JADOTTE; SCHWARTZ,

2012a; VIEIRA et al., 2012). Martins-Filho, Da Silva e Piva (2011) enfatizaram que

alterações na cor dos lábios é um sinal marcante da QA em trabalhadores expostos

cronicamente ao sol. Alguns estudos demonstram uma predominância das formas

eritroplásicas e/ou eritroleucoplásicas em queilites actínicas (MARKOPOULOS;

ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS, 2004; CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO,

2008). Contudo, na presente pesquisa a maioria das QAs exibiu aspecto leucoplásico, como

observado também no estudo de Sarmento et al. (in press). Além disso estes autores

encontraram em sua amostra que a maioria das lesões leucoplásicas representavam casos de

83

QAs sem displasia epitelial ou com displasias leves, fato também observado nas QAs

analisadas na presente pesquisa.

Dentre as características histopatológicas das QAs, a displasia epitelial é a mais

importante (LIU et al., 2010). E embora haja limitações, atualmente o prognóstico e a

estimativa do potencial de transformação das lesões potencialmente malignas na rotina clínica

ainda depende da gradação da displasia epitelial destas lesões (WARNAKULASURIYA et

al., 2008; NANKVELL et al., 2013).

O sistema de gradação histológica de desordens potencialmente malignas criado pela

OMS (BARNES et al., 2005) é amplamente utilizado, porém têm surgido algumas críticas

com relação à reprodutibilidade e subjetividade desse sistema (BRENNAN et al., 2007;

WARNAKULASURIYA et al., 2008; LIU et al., 2010). Assim, Kujan et al. (2006) utilizaram

pela primeira vez um sistema binário para gradação histológica de displasias epiteliais orais,

simplificando e reduzindo as categorias para apenas duas: lesões de baixo risco e de alto risco

de transformação maligna.

O sistema binário foi testado por outras pesquisas (LIU et al., 2011; NANKVELL et

al., 2013) e tem sido adotado satisfatoriamente por estudos recentes com desordens

potencialmente malignas como em Caldeira et al. (2012) e Carvalho et al. (2012). Nessa

perspectiva, a utilização do sistema binário para gradação histológica de QAs é promissora,

sendo portanto o sistema de escolha para o estudo morfológico do presente estudo. A amostra

de QAs desta pesquisa consistiu principalmente em casos de baixo risco de transformação

maligna, correspondendo portanto há casos sem displasia ou com displasia leve. Esse achado

corrobora com as pesquisas de Kaugars et al. (1999), Freitas et al. (2008) e Sarmento et al. (in

press), onde a maioria das QAs estudadas exibiam displasia epitelial leve. Muito embora,

QAs com displasias epiteliais mais severas foram mais frequentes na pesquisa de Cavalcante,

Anbinder e Carvalho (2008) e Souza et al. (2011). Segundo Sarmento et al. (in press) estas

diferenças podem apenas refletir a variação do tempo de diagnóstico das lesões.

Geralmente não há relação entre o grau de severidade histológica de QAs e as

características clínicas das lesões (NICO; RIVITTI; LOURENÇO, 2007; CAVALCANTE,

ANBINDER; CARVALHO, 2008; PIÑERA-MARQUES et al., 2010; HUBER, 2010;

JADOTTE; SCHWARTZ, 2012). Em concordância, nos resultados da presente pesquisa não

foram observadas associações entre as variáveis clínicas (sexo, idade dicotomizada em 40

anos e aspecto clínico dicotomizado) e os grupos histológicos das queilites actínicas.

Cavalcante, Anbinder e Carvalho (2008) atribuem a dificuldade de correlacionar os achados

clínicos com os aspectos histológicos ao fato da QA apresentar-se muitas vezes como uma

84

lesão multifocal, tanto clínica quanto microscopicamente. Assim, em algumas situações, o

fragmento enviado para exame anatomopatológico pode não ser representativo do real grau de

severidade morfológica da lesão.

Embora a gradação histológica da QA seja amplamente utilizada para estimar o

comportamento biológico dessas lesões, auxiliando na conduta clínica dos casos, também é

importante investigar as alterações moleculares que ocorrem no epitélio displásico,

especialmente aquelas de alguma forma relacionadas com a radiação ultravioleta. A partir da

identificação das alterações em nível molecular que estão envolvidas na carcinogênese, o

potencial de transformação maligna poderia ser estabelecido com maior precisão através do

uso de biomarcadores.

Nas vias moleculares da QA, a desregulação de algumas proteínas já foi verificada,

como da p53, MDM2, p63, Bcl-2, Ki-67, hMLH1 e hMSH2 (MARTINEZ et al., 2005;

FREITAS et al., 2008; XAVIER et al., 2009; SOUZA et al., 2011; SARMENTO et al., 2013).

Avanços nesse campo de pesquisa tornam-se necessários no entendimento dos mecanismos

envolvidos na progressão do epitélio displásico da QA até o estabelecimento do fenótipo

maligno.

Nesse contexto, esta pesquisa busca auxiliar a atual conjuntura de conhecimentos

sobre os fenômenos envolvidos na progressão da QA, através da investigação do padrão de

imunoexpressão das galectinas -1, -3, -7 e -9 em 65 casos de QA, visto que as galectinas são

proteínas multifuncionais previamente relacionadas com a transformação maligna em

diferentes tecidos humanos (SAUSSEZ et al., 2008; DING et al., 2009; CARVALHO et al.,

2012), inclusive em melanomas cutâneos que possuem etiologia relacionada à exposição UV,

semelhante às queilites actínicas (PRIETO et al., 2006; BROWN et al., 2012). Braeuer et al.

(2012) enfatizam que a desregulação de membros da família das galectinas têm sido

consistentemente associadas com a progressão de melanomas.

De forma geral, a imunoexpressão das galectinas avaliadas no presente estudo não foi

significativamente relacionada com o aspecto clínico das QAs, reforçando as pesquisas

clínico-morfológicas que não encontram associação entre aspecto clínico destas lesões e sua

severidade morfológica, que de fato é o principal fator a ser considerado quanto ao potencial

de transformação maligna. Mesmo diante destas evidências, alguns autores sugerem que em

pacientes portadores de QA, áreas vermelhas ou ulceradas sejam a escolha para a realização

de biópsias (SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010; JADOTTE; SCHWARTZ, 2012b).

No que diz respeito à galectina-1, esta proteína contribui para diferentes processos

fisiológicos e patológicos, tais quais inflamação e fenômenos da biologia tumoral, incluindo

85

transformação maligna, regulação do ciclo celular, apoptose, adesão e migração celular

(ZHONG et al., 2010). Na presente amostra, a galectina-1 estava expressa em 64 casos

(98,5%), predominantemente distribuída por todas as camadas do epitélio. Não foram

observadas diferenças significativas nos escores de expressão entre as QAs de baixo risco e de

alto risco, sendo o escore 3 (mais de 60% das células epiteliais positivas) predominante em

ambos os grupos (p>0,05).

Alguns estudos mostram que níveis aumentados de galectina-1 estão presentes em

CCEs de cabeça e pescoço (SAUSSEZ et al., 2008) e em displasias epiteliais orais

(CARVALHO et al., 2012), quando estas entidades patológicas são comparadas à mucosa oral

normal. Na pesquisa de Zhong et al. (2010), a expressão da galectina-1 foi negativamente

correlacionada com a diferenciação tumoral em linhagens de CCE oral, pois a alta expressão

da mesma foi evidenciada em tumores pouco diferenciados. Entretanto, na amostra analisada

por Alves et al. (2011) evidenciou-se que nos 87,7% dos CCEs de língua que exibiram

imunomarcação para galectina-1, a forte expressão desta proteína foi significativamente

associada com tumores em estágios precoces e casos sem metástases, independente do grau

histológico de malignidade. Nesse sentido, acreditamos que a expressão elevada nas QAs que

constituíram nossa amostra possa estar relacionada com alterações precoces nos ceratinócitos,

provavelmente devido à radiação UV, em um processo que pode um conduzir à imortalidade

destas células e contribuir para a carcinogênese.

Em todas as QAs imunopositivas para a galectina-1, a expressão nos ceratinócitos foi

restrita aos compartimentos intracelulares. Tanto as QAs de baixo risco quanto as de alto risco

exibiram uma predominância de marcação apenas citoplasmática, seguida de marcação no

citoplasma e núcleo (p>0,05). Achados similares foram verificados nas amostras de mucosa

oral normal, leucoplasias e CCEs orais do estudo de Ding et al. (2009), nas quais a marcação

da galectina-1 também foi predominante no citoplasma. Saussez et al. (2008), ao compararem

a imunoexpressão da galectina-1 entre displasias epiteliais de alto risco e carcinomas de

hipofaringe, encontraram uma mudança no padrão de marcação nuclear para citoplasmática,

respectivamente. Assim, pode-se sugerir que o acúmulo intracelular, especialmente no

citoplasma, de galectina-1 em células epiteliais alteradas está relacionado com fenômenos

envolvidos na tumorigênese. Um desses fenômenos é a estabilização do oncogene H-RAS. A

expressão de galectina-1 tem sido descrita como essencial para a ancoragem membranar de

Ras, que é um processo sabidamente relacionado com os mecanismos de transformação

maligna (LIU; PATTERSON; WANG, 2002; RABINOVICH, 2005; YANG; RABINOVICH;

LIU, 2008).

86

Embora a análise realizada nesta pesquisa tenha sido restrita ao epitélio, na maioria

dos casos estudados observou-se células positivas para a galectina-1 no tecido conjuntivo,

principalmente fibroblastos e células endoteliais. Alguns estudos relatam a presença desta

galectina em fibroblastos próximos à ninhos de CCEs orais (CHIANG et al., 2008) e em

fibroblastos na matriz extracelular de tecidos cutâneos (CHEN et al., 2012). Segundo

Goldring et al. (2002) a expressão da galectina-1 em fibroblastos in vitro está relacionada com

a diferenciação destes em miofibroblastos. Já a expressão desta galectina em células

endoteliais associadas à tumores tem sido descrita em pesquisas como as de Hsieh et al.

(2008) e Thijssen et al. (2010), que demonstram que a presença da galectina-1 favorece a

angiogênese tumoral, especialmente estimulando a proliferação das células endoteliais.

Assim, podemos sugerir que a presença de fibroblastos e células endoteliais positivas em

nossa amostra possa estar envolvida com a diferenciação de fibroblastos e angiogênese nas

QAs, respectivamente.

No que concerne à galectina-3, Yang e Rabinovich (2008) destacam seu papel tanto

em fenômenos fisiológicos como respostas inflamatórias, como também em mecanismos

patológicos como a tumorigênese, através da regulação do ciclo celular e interação com o

oncogene K-RAS. Os resultados dos experimentos in vivo de Song et al. (2012) reforçam essa

última afirmação, pois revelaram que a galectina-3 participou na progressão do câncer

pancreático especialmente através da ligação com Ras e ativação de vias de sinalização Ras.

Enquanto Ferrazzo et al. (2009) mostraram evidências de que a galectina-3 participa da

ativação da ciclina-D1 que ocorre na progressão de neoplasias malignas de glândulas

salivares, portanto regulando o ciclo celular.

Imunorreatividade para galectina-3 foi verificada em todas as QAs desta pesquisa,

sendo constatado um aumento significativo nos escores de expressão dessa galectina com o

aumento do grau histológico das lesões (p<0,05). Nossos resultados podem ser comparados

aos obtidos na pesquisa de Mourad-Zeidan et al. (2008) em pacientes com melanomas

cutâneos, que mostrou que o aumento nos níveis desta proteína foi relacionado com o

estabelecimento do fenótipo maligno, já que quando comparados aos nevos cutâneos, os

melanomas originados de áreas expostas ao sol exibiram marcação mais forte. Além disso,

neste mesmo estudo foi constatado que a galectina-3 uma relação positiva com o potencial

metastático de linhagens celulares de melanomas cutâneos humanos. Os experimentos

realizados por Melnikova e Bar-Eli (2008) também demonstraram que a esta galectina

estimulou a invasão celular de melanomas cutâneos ao contribuir para o aumento da

degradação de proteínas da matriz extracelular. Com base neste estudo, nós sugerimos que

87

esse mecanismo possa ser um dos envolvidos na evolução das QAs de alto risco, para CCEs

de lábio inferior.

Ainda com relação à imunoexpressão da galectina-3, na presente análise foi

identificado que a maioria das QAs exibiu marcação em todos os estratos epiteliais,

especialmente nos casos de baixo risco de transformação maligna. Conforme Larsen et al.

(2011), esta proteína é abundante no citoplasma de epitélios ceratinizados, principalmente em

camadas suprabasais, sendo colocalizada com proteínas dos desmossomos e associada com a

diferenciação e maturação dos ceratinócitos. De fato, em carcinomas de células basais e em

CCEs cutâneos, a expressão de galectina-3 é mais intensa nas regiões centrais dos ninhos

tumorais, áreas que contém células mais diferenciadas. Nestes tumores é evidenciado que a

imunorreatividade citoplasmática é maior que a nuclear e nos CCEs foi observada uma

correlação positiva entre a intensidade da marcação citoplasmática e o tamanho tumoral,

sugerindo que a presença desta proteína no citoplasma de células malignas pode contribuir

para o crescimento destas neoplasias (KAPUCUOGLU et al., 2009).

Nessa mesma perspectiva, Hossaka et al. (2013) relataram que os níveis de expressão

nuclear de galectina-3 diminuem durante a progressão do o estado normal para o canceroso,

enquanto expressão citoplasmática aumenta. Na amostra analisada nesta pesquisa, observou-

se associação significativa do padrão de marcação no citoplasma e núcleo com as QAs de

baixo risco e dos casos de alto risco com a marcação apenas no citoplasma (p<0,05). Nossos

resultados são consistentes com a literatura, visto que o aumento da expressão citoplasmática

da galectina-3 já foi observado na iniciação e progressão neoplásica em cólon (HITTLET et

al., 2003), na progressão de mucosa oral normal para displasias epiteliais (CARVALHO et al.,

2012) e na progressão do CCE de língua (HONJO et al., 2000; ALVES et al., 2011). Todos

estes autores relatam que o aumento na expressão citoplasmática desta proteína está

relacionado com uma maior atividade anti-apoptótica da mesma.

Esse efeito anti-apoptótico nos ceratinócitos pode ser aumentado pela radiação UV

como demonstrado nos experimentos de Saegusa et al. (2008). Paralelamente, reforçando esta

sugestão, o estudo de Prieto et al. (2006) demonstrou uma intensa expressão citoplasmática

nos melanomas cutâneos expostos crônica ou intermitentemente ao sol, enquanto essa

expressão foi negativa em melanomas acrais. Com base nesses aspectos, pode-se sugerir que a

localização citoplasmática da galectina-3 está relacionada com a progressão das QAs,

provavelmente através do aumento da atividade anti-apoptótica desta proteína em um efeito

potencializado pela exposição crônica à radiação ultravioleta.

88

Adicionalmente, alguns dos nossos espécimes revelaram expressão focal da galectina-

3 em células do tecido conjuntivo, principalmente em células endoteliais, semelhante aos

achados de Than et al. (2008) em neoplasias malignas de tireóide. De acordo com Nangia-

Makker et al. (2000), a galectina-3 secretada para meio extracelular pode se ligar à receptores

celulares de células endoteliais, induzindo a migração e morfogênese destas em um processo

que culmina na angiogênese. Um recente experimento in vitro realizado por D’Haene et al.

(2013) constatou que a galectina-3 extracelular pode induzir angiogênese através da ativação

da via de sinalização VEGFR2 em um efeito potencializado pela galectina-1. Embora estes

estudos forneçam evidências fortes da relação entre galectina-3 e angiogênese, seria

precipitado tecer qualquer hipótese sobre a marcação endotelial demonstrada em nosso

estudo, visto que esta só foi verificada em algumas queilites actínicas, além desta análise não

ser foco de nossa pesquisa.

A galectina-7 exibe um alto grau de especificidade tecidual, sendo descrita como uma

proteína expressa predominantemente no epitélio escamoso (CHEN et al., 2012). De fato,

todas as QAs da presente análise revelaram uma marcação desta proteína exclusiva no epitélio

pavimentoso estratificado. No entanto, não houve diferenças significativas ao analisar os

escores de imunoexpressão da galectina-7 entre os grupos de QAs de baixo e alto risco

(p>0,05), sendo verificados acentuados níveis de expressão na maioria dos casos,

independente do grau histológico. Segundo os experimentos de Bernerd, Saransin e Magnaldo

(1999), em ceratinócitos expostos à radiação UV ocorre um aumento nos níveis de galectina-

7, em geral atuando como fator regulador positivo da morte celular programada. Enquanto um

estudo in vitro com linfomas mostrou que a expressão desta proteína tem um efeito positivo

no desenvolvimento tumoral através da supra-regulação do gene da MMP-9, em um processo

que favorece progressão e invasão tumoral (DEMERS et al., 2005).

De fato, a galectina-7 pode modular o desenvolvimento tumoral positiva ou

negativamente a depender do tecido envolvido e da sua localização na célula ou no espaço

extracelular envolvido (SAUSSEZ; KISS, 2006). No câncer cervical por exemplo, esta

proteína exibe função anti-tumoral (ZHU et al., 2013), em contraste, sua função pró-tumoral

têm sido relatada em linfoma (DEMERS et al., 2005), CCE de língua (CHEN et al., 2004;

ALVES et al., 2011), CCE de hipofaringe (SAUSSEZ et al., 2008).

A marcação da galectina-7 foi quase exclusiva na região suprabasal do epitélio (n=62;

95,4%). Este resultado pode ser explicado pelo fato desta proteína ser detectada em áreas de

interação célula-célula, particularmente nos estratos superiores do epitélio humano

(MADSEN et al., 1995). Além disso, esta proteína tem sido associada com a regulação da

89

apoptose e migração de ceratinócitos (KUWABARA et al., 2002; GENDRONNEAU et al.,

2008). Bernerd, Saransin e Magnaldo (1999) demonstraram que uma elevada expressão da

galectina-7 induziu o descolamento dos ceratinócitos apoptóticos na camada basal de tecidos

epiteliais irradiados por UV, fato que potencializa a transposição das camadas suprabasais por

estas células para posterior eliminação. Este efeito pró-apoptótico exercido pela galectina-7

ocorre de forma co-dependente de p53, já que esta galectina é induzida nas fases iniciais da

apoptose mediada por p53 (POLYAK et al., 1997). Diante dos estudos discutidos, sugere-se

que a elevada expressão desta galectina na camada suprabasal do epitélio da nossa amostra

está relacionada com etiopatogenia das QAs, visto que a exposição à radiação UV é o

principal fator envolvido nesse processo.

No tocante à localização da galectina-7 nos ceratinócitos, os resultados da nossa

pesquisa não mostraram associações significativas com os grupos histológicos (p>0,05).

Constatou-se uma predominância de marcação no citoplasma e núcleo tanto nas QAs de baixo

risco quanto nas de alto risco. Adicionalmente, a maioria dos casos que exibiram marcação na

membrana plasmática correspondiam a QAs de baixo risco. Segundo Carvalho et al. 2012, a

presença desta proteína na membrana plasmática estaria relacionada com a sua importância

em fenômenos fisiológicos, como por exemplo adesão célula-célula. Com relação à

localização intracelular, nossos dados corroboram os resultados de alguns estudos que

demonstram a associação desta localização com a tumorigênese e progressão do câncer oral

(SAUSSEZ et al., 2008; ALVES et al., 2011; CARVALHO et al., 2012).

Por outro lado, a localização intracelular, especialmente a nuclear estaria relacionada

com a regulação da apoptose celular por essa proteína. Kuwabara et al. (2002) demonstraram

que a galectina-7 pode induzir a apoptose em diversos tipos celulares, sendo esse efeito

apoptótico induzido principalmente no núcleo. Além disso, esses autores observaram que em

uma linhagem de células malignas imortais, esse efeito na regulação da morte celular

aumentava após a exposição das células à radiação ultravioleta. Assim, são necessários mais

estudos para revelar se a localização intracelular da galectina-7 em QAs, como observada de

forma predominante no nosso estudo provavelmente devido à radiação UV, estaria

relacionada com a carcinogênese ou com vias moleculares da apoptose.

Assim como as galectinas previamente discutidas, a galectina-9 têm sido associada a

complexos processos na iniciação e progressão tumoral como imunidade tumoral, adesão

celular, migração e metástase (HIRASHIMA et al., 2004; HEUSSCHEN; GRIFFIOEN;

THIJSSEN, 2013). A alteração de um tecido em estado fisiológico normal para um tecido

tumoral tem sido associada com a perda dessa proteína. Essa perda também tem sido

90

relacionada com a aquisição de resistência à apoptose e a perda da integridade do tecido

tumoral, facilitando o processo de metástase (HEUSSCHEN; GRIFFIOEN; THIJSSEN,

2013). Estes aspectos somados à escassez de pesquisas com esta proteína, justificaram a

investigação da expressão da mesma em nossa amostra.

Nossos resultados demonstraram que a galectina-9 esteve presente em 58 (89,2%) das

65 QAs analisadas, diferença altamente significativa entre os escores de expressão desta

proteína entre os grupos histológicos das QAs, de forma que houve uma redução na expressão

da galectina-9 com o aumento do grau histológico (p<0,001). A literatura demonstra que a

imunoexpressão da galectina-9 já foi inversamente correlacionada com o grau histopatológico

em neoplasias malignas de mama (IRIE et al., 2005), neoplasias cervicais (LIANG et al.,

2009) e de fígado (ZHANG et al., 2012). Em pacientes com melanomas cutâneos in situ a

expressão desta galectina no tecido tumoral foi mínima, quando comparada à pacientes

portadores de nevos melanocíticos (KAGESHITA et al., 2002). No trabalho de Fík et al.

(2012), a galectina-9 esteve expressa na maioria das amostras de epitélio oral normal, porém

em todos os espécimes de CCE de cabeça e pescoço foi observada ausência de marcação.

Baseados na consonância dos nossos resultados com os dos estudos mencionados, podemos

sugerir que a perda de expressão de galectina-9 está relacionada com a progressão das

queilites actínicas.

Em face a alguns estudos que têm demonstrado evidências da participação da

galectina-9 na agregação celular e inibição do potencial adesivo e invasivo de células

tumorais à matriz extracelular (KAGESHITA et al., 2002; IRIE et al., 2005; ZHANG et al.,

2012), nós acreditamos que a perda desta proteína verificada em nosso estudo pode estar

relacionada com eventos de transição epitélio-mesenquimal envolvidos na carcinogênese de

lábio inferior.

A maioria das QAs de baixo risco (65%) exibiu marcação da galectina-9 em todas as

camadas epiteliais, enquanto nos casos de alto risco a expressão foi mais frequente apenas da

suprabasal do epitélio (55,6%) (p>0,05), diferente dos casos de mucosa oral normal

analisados por Fík et al. (2012), nos quais a expressão desta galectina limitou-se à camada

basal do epitélio. No entanto, amostras neoplasias cervicais intraepiteliais e epitélio cervical

normal analisados por Liang et al. (2008), sua marcação esteve distribuída em todas as

camadas do epitélio, similar aos nossos achados em QAs de baixo risco.

Na nossa pesquisa, não foram observadas associações significativas entre a localização

da galectina-9 na célula e os grupos histológicos das QAs (p>0,05), sendo a maioria dos casos

positivos no citoplasma e núcleo (65,5%), seguida de marcação apenas no citoplasma

91

(25,9%), independente do grau histológico das QAs. A presença desta proteína no citoplasma

já foi evidenciada em tecidos com potencial de malignização e malignos (IRIE et al., 2005;

LIANG et al., 2009) e no núcleo de melanomas, especialmente os metastáticos (KAGESHITA

et al., 2002). No presente trabalho também foi observada marcação membranar limitada a 5

casos (12,5%) de QAs de baixo risco. A expressão membranar desta proteína foi previamente

verificada em tecidos de mucosa oral normal (FÍK et al., 2012). Segundo Kageshita et al.

(2002), a presença da galectina-9 na superfície celular seria importante para a adesão e

apoptose celular em melanomas. Com base nestes estudos, podemos sugerir que a

participação da galectina-9 na adesão celular justifique sua presença na membrana plasmática

das QAs de baixo risco analisadas, enquanto com relação à predominante marcação

citoplasmática e nuclear encontrada, podemos sugerir, que esteja relacionada com o

desenvolvimento da lesão.

Um achado adicional interessante na nossa pesquisa foi a imunorreatividade da

galectina-9 em células inflamatórias no tecido conjuntivo fibroso em várias QAs analisadas.

Dados semelhantes foram relatados por Fík et al. (2012), que verificaram algumas células

positivas para esta proteína apenas no estroma de CCEs orais, sendo estas co-localizadas com

células positivas para CD45, um marcador de leucócitos, sugerindo que se tratassem de

células inflamatórias. De acordo com Oomizu et al. (2012), além de ser expressa em células

epiteliais, esta galectina também pode estar presente em células endoteliais e em diversas

células do sistema imune como linfócitos T, linfócitos B, macrófagos e mastócitos. Embora

nossos dados não sejam suficientes para inferir conclusões sobre este aspecto, estudos vem

demonstrando que esta proteína pode induzir in vitro a maturação de células dendríticas (DAI

et al., 2005), a ativação de genes de citocinas inflamatórias em linhagens de monócitos

(MATSUURA et al., 2009) e apoptose em células Th1 de forma dependente de Tim-3

(OOMIZU et al., 2012).

As múltiplas funções exercidas pelas galectinas na biologia da iniciação e progressão

de tumores malignos, bem como sua desregulação em desordens relacionadas à irradiação por

UV fomentaram a realização desta pesquisa. Os nossos resultados revelam pela primeira vez o

padrão de imunoexpressão das galectinas-1, -3, -7 e -9 em queilites actínicas e sugerem que a

estas proteínas podem ser relacionadas com eventos biomoleculares envolvidos na patogênese

e progressão destas lesões.

60

Conclusões

93

7 CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:

1. Os dados clínicos e morfológicos da amostra analisada reforçaram o perfil do

indivíduo portador de QA, já bem estabelecido na literatura.

2. O sexo, a idade e o aspecto clínico das QAs não influenciaram na gradação

histológica dos casos estudados.

3. De forma geral, as características clínicas (sexo, idade e aspecto clínico) não

exerceram influência na imunoexpressão das galectinas -1, -3, -7 e -9 nas queilites actínicas.

4. A expressão elevada das galectinas -1 e -7 na amostra estudada, bem como o

aumento na expressão da galectina-3 e redução de galectina-9, quando comparadas QAs de

baixo risco às de alto risco, sugerem que estas proteínas podem estar relacionadas com a

progressão e etiopatogênese das queilites actínicas.

5. Com o aumento do grau histológico das QAs, houve mudança no padrão de

expressão citoplasmática/nuclear para apenas citoplasmática da galectina-3, sugerindo que o

acúmulo citoplasmático desta está relacionado com a progressão da QA, provavelmente por

seu efeito anti-apoptótico neste compartimento, potencializado pela radiação UV.

6. Alterações no padrão de expressão das galectinas analisadas na presente amostra,

sugerem que essas proteínas multifuncionais participam nos processos moleculares

envolvidos no desenvolvimento e progressão das queilites actínicas.

60

Referências

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Apêndices

104

APÊNDICE A

Ficha para coleta de dados clínicos e morfológicos

Nº Registro da Pesquisa:____________ Nº de Registro do Laboratório:____________

Sexo: ( ) Masculino ( ) Feminino

Idade:_____

Raça: ( ) Branca ( ) Parda ( ) Negra ( ) Outra:_______________ ( ) Não relatado

Profissão: __________________

Aspecto clínico: ( ) Leucoplásica ( ) Eritroplásica ( ) Eritroleucoplásica ( )

Outro:_______________________ ( ) Não relatado

Gradação histológica: ( ) QA de baixo risco ( ) QA de alto risco

105

APÊNDICE B

Ficha para coleta de dados imunoistoquímicos

Galectina _____

Nº DO CASO

ESCORE DE IMUNOMARCAÇÃO

LOCALIZAÇÃO CELULAR CAMADA EPITELIAL

IMUNOMARCADA

0 1 2 3 MEMBRANA PLASMÁTICA

CITOPLASMA NÚCLEO BASAL SUPRABASAL

Anexos

107

ANEXO A

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE … · Com muito amor, dedico este...

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