UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

KAROLINE RACHEL TEODOSIO DE MELO

POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARROM Dictyopteris justii COMO AGENTES ANTIOXIDANTES E

INIBIDORES DA FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO.

NATAL

2013

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KAROLINE RACHEL TEODOSIO DE MELO

POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARROM Dictyopteris justii COMO AGENTES ANTIOXIDANTES E

INIBIDORES DA FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO.

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

NATAL 2013

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UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Catalogação da Publicação na Fonte

Melo, Karoline Rachel Teodósio de.

Polissacarídeos sulfatados da alga marrom Dictyopteris justii como agentes

antioxidantes e inibidores da formação de cristais de oxalato de cálcio / Karoline

Rachel Teodósio de Melo. – Natal, RN, 2013.

79 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.

1. Fucanas - Dissertação. 2. Glucanas - Dissertação. 3. Urolitíase - Dissertação.

4. Polissacarídeos bioativos - Dissertação. 5. Bioquímica - Dissertação. I. Rocha,

Hugo Alexandre de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV.

Título.

RN/UF/BCZM CDU 582

3

KAROLINE RACHEL TEODOSIO DE MELO

4

DEDICATÓRIA

Dedico esta obra: A minha mãe que me deu todo o apoio logístico, incentivo pra

continuar caminhando nos estudos e ser uma pessoa melhor ao longo da minha vida, além de ser o meu exemplo de caráter, generosidade e

amor. Eu te amo mãe. A minha querida avó Dorinha (em memória), por ter sido uma grande

e batalhadora mulher, que lutou pela vida até o fim.

5

DEDICATÓRIA

Dedico esta obra: A meu orientador e amigo Dr. Hugo Rocha, por ter sido meu

exemplo na vida acadêmica e quem abraçou essa pesquisa junto comigo, me auxiliando e incentivando nessa caminhada. Vou levar

seus ensinamentos ao longo da minha vida.

6

AGRADECIMENTOS

A Deus por está sempre presente, pela sua misericórdia e pelas graças

alcançadas.

A minha mãe pelo incentivo, pelos ensinamentos e acima de tudo pelo amor a

mim dedicado durante toda minha vida. Eu te amo muito!

À toda família BIOPOL, Leandro (viu, que eu coloquei você no topo dessa

vez?) Ivan, Valquíria, Kaline, Ana Karina, Letícia, Pablo (Pablito!), Sara, Raniere,

Cíntia, Susana, Marília, Almino, Monique, Danielle, especialmente a Jailma (um dos

meus maiores exemplos! Te adoro!), Dayane (amigona e mãezona de Helena e

Heitor), Mariana (minha gêmula querida), Rafael (um grande amigo e uma pessoa

com um coração maior que ele), Ruth (minha pi..favorita), Gabriel, Moacir Arthur,

Fernando, Daniel ex-biopol, Joana (fofa). Os ICs novos, Larisse, Mariane, Ajax, Fred

e Everton, e os antigos Rony, Max, Vinicius. A todos pela amizade, pelo apoio nos

momentos difíceis e pelas contribuições diretas no desenvolvimento deste trabalho.

Dentre esses citados gostaria de agradecer mais especialmente a Jailma, por

esta sempre ao meu lado em todos os momentos. A Mariana por ser minha amiga

para todas as conversas, a Ruth, e a Rafa por terem se tornado meus grandes

amigos e a Moacir que foi um grande colaborador desse trabalho e Gabriel, por

serem meus amigos desde a graduação, principalmente Gabriel que é meu parceiro

da vida, cuja amizade será eterna.

Também gostaria de agradecer aos agregados, Fernanda Ginani e Luciana,

as pi...que são amizades inesperadas e que eu adoro dar risada com elas. e a Ana

Catarina que me ajudou e aconselhou em vários momentos.

Aos meus colegas de mestrado, Iara (querida!), Rômulo, Ingrid, Henrique,

Érika, Luiza, Cris, Keith, Márcia, Lívia, Gabriel, Moacir, e principalmente Vanessa e

Isabel, que se tornaram minhas amigas pra sempre e que eu adoro dar bolo pra sair

(heheh).

A Samir por me estender a mão nos momentos em que eu mais precisei e

está sempre me incentivando quando bate as incertezas.

Aos meus amigos pelos muitos momentos felizes e pela cumplicidade nas

horas mais difíceis. Em especial a Marília (minha querida maluca e companheira pra

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todas as horas), Miguel, Lara, Bruna, Anthony, Gabizinha, Caio, Anaugusta, Edbar e

minhas amigas de infância Luiza e Cinthia. Amo muito vocês.

A Chico pela amizade, compreensão e por ter me incentivado a nunca

desistir dos meus sonhos.

Aos demais amigos pela certeza de poder contar com cada um, em particular,

em muitos momentos da vida e pela alegria que me proporcionam.

A banca de qualificação (Professores Carlos Eduardo, Vanessa e Gerlane)

pelas contribuições sugeridas que enriqueceram muito o trabalho apresentado.

A banca avaliadora desse trabalho, Leandro e Valquíria, pois sei que a

contribuição de cada um será muito válida e enriquecedora.

Aos demais colegas, funcionários e professores do Departamento de

Bioquímica pela atenção, respeito e receptividade.

A CAPES e CNPq, pelo financiamento que permitiu a conclusão deste

trabalho.

Por fim, e de forma especial, ao meu professor e orientador Dr. Hugo

Alexandre que me recebeu de braços abertos no laboratório, me acompanhou

quando dei meus primeiros passos no mundo científico, me enveredou pelo caminho

do conhecimento e me ajudou a compreender muitas coisas que, com certeza, vou

levar pra vida inteira.

A todos vocês o meu sincero agradecimento.

8

Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as

grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.

Charles Chaplin

9

RESUMO

Os cristais de Oxalato de Cálcio são os principais componentes dos cálculos urinários e estes estão intimamente relacionados com o estresse oxidativo na condição fisiopatológica da urolitíase. Por causa disso, estudos recentes tem buscado componentes antioxidantes que também sejam capazes de inibir a formação desses cristais. Diante disso, esse trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de alga marrons Dictyopteris justii e seu efeito sobre a cristalização do oxalato de cálcio in vitro. Assim, no presente estudo, quatro frações ricas em polissacarídeos sulfatados(DJ-0.3v, DJ-0.4v, DJ-0.5v, e DJ-1.2v) foram obtidas por proteólise seguida de precipitação sequencial com acetona a partir da espécie Dictyopteris justii. As análises químicas e o FT-IR mostraram que D. justii sintetiza populações de polissacarídeos sulfatados diferentes. A primeira, que se encontra em DJ-0.3v, é rica em glicose, xilose e ácido glucurônico e apresenta traços de fucose; a segunda (DJ-0.4v), que tem como diferencial grandes quantidades de fucose; as duas populações que se encontram em DJ-0.5v e DJ-1.2v, que apresentam apenas glucose e traços de fucose, mas se diferenciam entre si pela quantidade de íons sulfato. Todos os polissacarídeos sulfatados extraídos apresentaram atividade antioxidante para CAT, Poder Redutor e Quelação de Cobre. No entanto, a fração DJ-0.4v foi a que apresentou melhor atividade antioxidante como também foi o que teve melhor capacidade de inibir a cristalização de oxalato de cálcio. Destaca-se também a fração DJ-0.5v, que foi o segundo composto mais potente inibidor da formação de cristais de oxalato, como também foi o composto que estabilizou os cristais dihidratados de oxalato (forma menos agressiva) impedindo-os de se transformarem em cristais monohidratados (forma mais agressiva). Os dados obtidos nos levam a propor que estes polissacarídeos são agentes promissores para serem utilizados posteriormente no tratamento da urolitíase.

PALAVRAS CHAVE: fucana; glucana; urolitíase, polissacarídeos bioativos.

10

ABSTRACT

Oxalate crystals and other types of crystals are the cause of urolithiasis, and these are related to oxidative stress. The search for new compounds with antioxidant qualities and inhibitors of these crystal formations is therefore necessary. In this study, we extracted four fractions rich in sulfated polysaccharides, which were called DJ-0.3v, DJ-0.4v, DJ-0.5v and DJ-1.2v, from the marine alga Dictyopteris justii. The presence of sulfated polysaccharides was confirmed by chemical analysis and FT-IR. All the sulfated polysaccharides presented antioxidant activity under different conditions in some of the in vitro tests and inhibited the formation of calcium oxalate crystals. DJ-0.4v was the polysaccharide that showed the best antioxidant activity and was one of the best inhibitors of the crystallization of calcium oxalate. DJ-0.5v was the second most potent inhibitor of the formation of oxalate crystals, as it stabilized dehydrated oxalate crystals (less aggressive form), preventing them from transforming into monohydrate crystals (more aggressive form). The obtained data lead us to propose that these sulfated polysaccharides are promising agents for use in the treatment of urolithiasis. Keywords: fucan; glucan; urolithiasis; bioactive polysaccharides

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Patogênese dos cálculos de oxalato de cálcio nos rins........................ 30

FIGURA 2 Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura de Cristais de

Oxalato de Cálcio...................................................................................................

31

FIGURA 3 Modelo hipotético da representação da deposição/internalização do

cristal de oxalato de cálcio nas células renais por endocitose e processo

intracelular por oxalúria durante condições hiperoxalúricas...................................

33

FIGURA 4 Resposta bioquímica da produção de ROS durante o processo

inflamatório frente aos cristais de oxalato..............................................................

35

FIGURA 5 Geração de hiperoxalúria induzida por Espécies Reativas de

Oxigênio e seus efeitos sobre vários aspectos da formação de cristais, retenção

e desenvolvimento do cálculo dentro dos rins. ......................................................

36

FIGURA 6 Alga Dictyopteris justii........................................................................... 38

FIGURA 7 Obtenção das frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos

da alga marrom Dictyopteris justii. ........................................................................

41

FIGURA 8 Capacidade antioxidante total de polissacarídeos sulfatados

extraídos da alga marinha marrom D.justii. ..........................................................

51

FIGURA 9. Poder redutor dos polissacarídeos sulfatados de D. justii. Os dados

estão expressos como médias ± desvio padrão. ..................................................

52

FIGURA 10. Atividadade quelante de Cobre dos polissacarídeos sulfatados da

alga marrom D. justii...............................................................................................

55

FIGURA 11. Atividade inibitória dos polissacarídeos sulfatados da alga marrom

D. justii sobre a cristalização de sais de oxalato de cálcio. ...................................

56

FIGURA 12. Cristais observados sob microscópio invertido (60 ×), formado na

solução metastável de CaOx na ausência (A) e na presença de (B) de citrato

trissódico (1 mM) (C) DJ-0.3V (0,1 mg / ml). (D) DJ-0.4V (0,1 mg / mL) (E) DJ-

0.5v (0,1 mg / mL) (F) DJ-1.2v (0,1 mg / mL).........................................................

57

12

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Algumas atividades farmacológicas das fucanas.............................. 19

TABELA 2: Algumas espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio de

interesse biológico................................................................................................

22

TABELA 3. Análise química e relação molar do teor de açúcar e sulfato das

frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom

Dictyopteris justii..................................................................................................

48

TABELA 4. Principiais assinalamentos encontrados nos espectros de

Infravermelho dos polissacarídeos sulfatados da alga D. justii............................

49

TABELA 5: Sequestro de radicais superóxido e hidroxila pelas frações

polissacarídicas. ..................................................................................................

53

TABELA 6: Atividade de Quelação Férrica.......................................................... 54

TABELA 7. Características dos potenciais Zeta de cristais com tratamento de

polissacarídeos sulfatados de algas marrons D. justii à temperatura de 25 ° C..

59

13

LISTA DE SIGLAS

AC GLU Ácido glucurônico

CaCl2 Cloreto de Cálcio

CAT Catalase/Capacidade Antioxidante Total

COD Oxalato de Cálcio Dihidratado

COM Oxalato de Cálcio Monohidratado

COT Oxalato de Cálcio Trihidratado

DPPH Di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium

EAA Equivalente de Ácido Ascórbico

FUC Fucose

GLI GlIcose

GPx Glutationa Peroxidase

GSH Glutationa Reduzida

JNK c-Jum N-terminal cinase

MAPK Proteína Cinase Ativada por Mitógeno

Na2C2O4 Acetato de Sódio

OPN Osteopontina

Ox Oxalato

PKC Proteína Quinase C

PS Polissacarídeos Sulfatados

RNS Espécies Reativas de Nitrogênio

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

Sulf Sulfato

XIL Xilose

14

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 16

1.1 Glucanas: aspectos gerais................................................................ 16

1.2 Fucanas: considerações gerais....................................................... 17

1.2.1 ATIVIDADES ENVOLVENDO O POTENCIAL FARMACOLÓGICO

DAS FUCANAS....................................................................................

18

1.2.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FUCANAS....................................... 20

1.2.2.1 RADICAIS LIVRES E ANTIOXIDANTES.............................................. 20

1.2.2.2 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES DE FUCANAS.................................. 24

1.3 Fucanas e cálculos renais.............................................................................. 27

1.3.1 UROLITÌASE.......................................................................................................... 27

1.3.2 FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO E ESTRESSE OXIDATIVO. ....................................................................

29

1.3.3 ANTIOXIDANTES PROTETORES RENAIS......................................... 36

2 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 38

2.1 Materiais............................................................................................. 38

2.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO....................................................................... 38

2.1.2 OUTROS MATERIAIS.......................................................................... 38

2.1.3 APARELHOS........................................................................................ 39

2.2 Métodos.............................................................................................. 40

2.2.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA............................................................ 41

2.2.1.1 Dosagem de açúcares totais................................................................ 41

2.2.1.2 Dosagem de proteínas......................................................................... 42

2.2.1.3 Compostos fenólicos totais................................................................... 42

2.2.1.4 Determinação da composição monossacarídica.................................. 42

2.2.1.5 Espectroscopia de Infravermelho ....................................................... 42

2.2.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO.............................................. 43

2.2.2.1 Capacidade antioxidante total.............................................................. 43

2.2.2.2 Poder redutor........................................................................................ 43

2.2.2.3 Sequestro do radical superóxido (O2-•)................................................ 43

2.2.2.4 Sequestro do radical hidroxila (OH.) .................................................... 44

15

2.2.2.5 Quelação de Ferro................................................................................ 44

2.2.2.6 Quelação de cobre............................................................................... 45

2.2.3 ENSAIO DE CRISTALIZAÇÃO DO OXALATO DE CÁLCIO............... 45

2.2.4 ANÁLISE DA MORFOLOGIA DOS CRISTAIS POR IMAGEM MICROSCÓPICA.................................................................................

46

2.2.5 MEDIDA DE POTENCIAL ZETA (ζ) .................................................... 46

2.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................... 47

3 RESULTADOS..................................................................................... 48

3.1 Análises químicas das frações obtidas........................................... 48

3.2 Atividade Antioxidante....................................................................... 50

3.2.1 CAT (CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL) ................................... 50

3.2.2 PODER REDUTOR.............................................................................................. 51

3.2.3 SEQUESTRO DOS RADICAIS HIDROXILA E SUPEROXIDO............ 52

3.2.4 QUELAÇÃO FÉRRICA......................................................................... 53

3.2.5 QUELAÇÃO DE COBRE...................................................................... 54

3.3 Ensaio de Inibição da cristalização de sais de oxalato de cálcio in vitro..................................................................................................

55

3.4 Efeito dos polissacarídeos sulfatados sobre a Morfologia dos Cristais.................................................................................................

56

3.5 Determinação do potencial Zeta (ζ) ................................................. 58

4 DISCUSSÃO........................................................................................ 60

5 CONCLUSÕES.................................................................................... 70

REFERÊNCIAS.................................................................................... 71

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 Glucanas: Aspectos gerais

As glucanas são um grupo heterogêneo de polímeros de glicose, os quais são

constituintes da parede celular de cereais, fungos e algas (RIOUX, TURGEON E

BEAULIEU, 2010).

As glucanas de cereais são encontradas principalmente na forma β, as quais

estão contidas no endosperma de sementes. A literatura mostra que essas glucanas

diminuem a taxa de colesterol plasmático e atenuam a resposta glicêmica e

insulínica pós-prandial (FUJIMYA, et al 1998). Já as glucanas de fungos são

polissacarídeos com função estrutural na parede celular do micélio, das frutificações

do fungo, ou ainda podem ser exopolissacarídeos. Esses polímeros chamam

atenção por possuir atividades biológicas como anti-inflamatória e antitumoral

(KAWAGISHI et al., 1990).

Em se tratando de algas, as glucanas podem estar presentes como reserva

energética ou ainda ser um importante componente estrutural. Nas algas marrons,

as mais conhecidas são denominadas de laminarinas, as quais contém esse nome

por serem estudadas primeiramente nas algas do gênero Laminaria sp (NOVAK E

VETVICKA, 2008.)

As laminarinas são polissacarídeos pequenos que contém cerca de 5 KDa e tem

uma estrutura química que consiste, principalmente, de uma forma linear β-(1 → 3)-

glucana ligada aleatoriamente a algumas cadeias β-(1 → 6) laterais. Embora sua

estrutura seja importante, o que mais chama atenção para essas glucanas diz respeito

às suas atividades biológicas, sendo as mais bem estudadas a atividade de modulação

da resposta inflamatória, atividade antitumoral, antiapoptótica, antiviral e antibacteriana

(RIOUX, TURGEON E BEAULIEU, 2010).

Curiosamente, muitas atividades biológicas de polissacarídeos de algas marrons

estão relacionados a grupos polares em sua estrutura, principalmente de sulfato. No

entanto, ainda não foi relatada na literatura, até esse trabalho, a presença de

polissacarídeos sulfatados de algas marrons.

Contudo, a introdução desses grupos de maneira artificial já foi relatado na

literatura. Além de modificar a estrutura do polímero, esses grupos podem modular

suas atividades biológicas, intensificando ou adicionando atividade aos

polissacarídeos. Como por exemplo, a adição de grupos sulfato promove diferenças em

17

uma variedade de atividades dos polissacarídeos, como a geração das atividades

anticoagulante ( JOUAULT, et al 2001) e antitrombótica ( MOURÃO et al., 2001); e a

intensificação das atividades antiinflamatória e antitumoral (NOVAK E VETVICKA,

2008.)

1.2 Fucanas: considerações gerais

Fucana é uma denominação utilizada para polissacarídeos sulfatados,

lineares ou não, que tem como característica estrutural mais marcante a presença

de L-fucose sulfatada (ROCHA et al., 2001). As fucanas são observadas em algas

marrons (Phaeophyceae) (BERTEAU e MULLOY, 2003) e em equinodermos

(ouriços e pepinos do mar) (POMIN, 2012). Apesar desta definição simples só há

duas exceções de polissacarídeos que apresentam L-fucose sulfatada em sua

composição que não foram denominados de fucanas: o condroitim fucosilado,

sintetizado principalmente por ascídias (MELO-FILHO et al., 2010) e a rosacelose,

um polissacarídeo sulfatado constituído de glicose e fucose e extraído da esponja do

mar Mixylla rosacea (CIMINO, et al.,2001 ).

Nas algas, as fucanas estão localizadas na matriz mucilagenosa e devido ao

seu caráter altamente higroscópico, acredita-se que protejam a alga da desidratação

quando essa é submetida a longos períodos de exposição ao sol durante as marés

baixas. A natureza mucilagenosa destes compostos, também parece contribuir para

tornar a alga flexível o bastante para crescer em ambiente líquido e rígida o

suficiente para permanecer estendida, e assim, melhor captar a luz e os nutrientes

existentes (PERCIVAL & MACDOWELL, 1967).

Nos ouriços, são encontradas fazendo parte da constituição do gel que cobre

os óvulos e estão relacionadas com a ativação da reação acrossômica durante o

processo de fecundação (ALVES et al.,1997). As análises têm indicado que são

espécie-específicas, impedindo assim, um intercruzamento das várias espécies de

ouriços (VILELA-SILVA et al., 2002). Há poucos relatos sobre fucanas em pepinos

do mar, contudo são descritas como participantes da constituição do tecido muscular

do animal (RIBEIRO et al., 1994).

As fucanas de algas são divididas em dois grandes grupos: homofucanas e

heterofucanas (ROCHA et al., 2012). Segundo a IUPAC as homofucanas, apesar do

nome, podem ser constituídas de até 10% de outros monossacarídeos que não a L-

18

fucose. São mais comuns em algas do gênero Fucus, Laminaria (CUMASHI et al., 2006)

e Sacharina (CROCI et al.,2011). Porém, em comparação com as heterofucanas, as

homofucanas são bem mais raras. Já as heterofucanas são encontradas em todos os

gêneros de algas marrons e em vários casos a quantidade de outros monossacarídeos

chega superar a de fucose (KLOAREG e QUATRANO, 1988).

Estudos com as fucanas de algas têm demonstrado que suas estruturas

variam de espécie para espécie e às vezes, em diferentes partes da mesma planta

(FARIAS, 1992; DIETRICH et al., 1995). Contudo, esse aspecto pode ser visto como

um aspecto positivo e não um problema, se a situação for analisada por outro ponto

de vista, ou seja, cada fucana pode apresentar uma conformação estrutural única, e,

portanto, possuir atividades farmacológicas diferentes e/ou mais potentes do que

outras fucanas ou outros compostos já descritos. Então, a caracterização de uma

nova fucana traz sempre novas perspectivas de descoberta de um novo fármaco ou

de um novo composto a ser utilizado por diversas indústrias, como: química,

farmacêutica ou alimentícia (ROCHA, 1998).

1.2.1 ATIVIDADES ENVOLVENDO O POTENCIAL FARMACOLÓGICO DAS

FUCANAS

As fucanas têm sido avaliadas com relação as suas possíveis atividades

farmacológicas através de diversos modelos experimentais. A tabela 1 mostra algumas

das atividades farmacológicas atribuídas às fucanas.

Tabela 1. Algumas atividades envolvendo o potencial farmacológico das fucanas

Atividade

Alga Referências

Angiogênica Fucus vesiculosus, Sargassum stenophyllum

DIAS et al., 2005, MATSUBARA et al., 2005

Anticomplemento

Laminaria cichorioide,

Laminaria japônica*, Fucus evanescens Ascophyllum

nodosum

BLONDIN et al., 1994, ZVYAGINTSEVA et al.,2000, BOISSON-VIDAL et al., 2007

19

Antiadesiva

A. nodosum, Laminaria

brasiliensis, Spatoglossum schröederi, Sargassum

stenophyllum

LIU et al., 2000, ROCHA et al., 2001

Anticoagulante

Lessonia vadosa, Dictyota

menstruallis, Laminaria cichorioides, Padyna

gymnospora, Dictyopeteris delicatulla, Dictyopeteris

justii

ALBUQUERQUE et al., 2004, SILVA et al., 2005, MAGALHAES

et al.,. 2011, MELO et al.,. 2011

Antiinflamatória

Lobophora variegata, Sargassum hemiphyllum, F.

vesiculosus, Sargassum vulgare

HWANG et al., 2011, PAIVA et al., 2011, PARK et al., 2011, DORE, et

al., 2013

Antiadipogênica

F. vesiculosus

YOKOTA et al., 2009

Antioxidante L. japonica, Sargassum

palidum, Undaria pinnatifida

JIAO et al., 2011

Antiproliferativa

A. nodosum, Laminaria setchellii, Macrocystis

integrifolia, Nereocystis leutkeana, Ecklonia cava,

S. schröederi

ELLOUALI et al., 1993; ATHUKORALA et al.,

2006; YUAN & WALSH, 2006; ALMEIDA-LIMA et al., 2010;

Nobre et al.,, 2013

Antitrombótico A. nodosum, S. schröederi

ROCHA et al., 2005, BARROSO et

al.,2008, JIAO et al., 2011)

Fibrinolítica

E. kurome, F. vesiculosus

DOCTOR et al., 1995; NISHINO et

al., 2000

Hepato-protetora

F. vesiculosus, C. okamuramus

NAKAZATO et al., 2010, HONG et

al., 2011

Antiviral S. horneri, C. indica

HOSHINO et al., 1998; MANDAL et al., 2007; HAYASHI, 2008; JIAO et

al., 2011.

* Laminaria japonica é atualmente denominada de Saccharina japonica Adaptado de COSTA, 2012

Descreve-se abaixo, com maiores detalhes, atividades farmacológicas

descritas para fucanas que estão correlacionadas com os resultados obtidos nessa

dissertação.

20

1.2.2 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES DE FUCANAS

1.2.2.1 Radicais Livres e Antioxidantes

O desenvolvimento do estudo de doenças crônicas e sua prevenção

colocaram em evidência termos como radicais livres e antioxidantes. O nascimento

da bioquímica dos radicais livres tem relação direta com os eventos da Segunda

Guerra Mundial (1939-1945), especificamente com as bombas atômicas de 1945,

em Hiroshima e Nagasaki, as quais levaram a morte milhares de pessoas, e os

sobreviventes encurtaram sua vida útil. Em 1954, Gershman e Gilbert especularam

que os efeitos letais da radiação ionizante poderiam ser atribuídos à formação de

espécies reativas de oxigênio (ROS). Desde então, os radicais livres como ROS e

espécies reativas de nitrogênio (RNS) ganharam notoriedade. (GILBERT et al.,,

1981).

O termo Radical Livre designa átomos ou moléculas que contêm um ou mais

elétrons desemparelhados (COSTA, 2008; WICKENS, 2001), conferindo-lhe, dessa

forma, alta reatividade. Os radicais podem ter carga positiva, negativa ou neutra.

Eles são formados como intermediários necessários em uma variedade de reações

bioquímicas normais, mas quando gerada em excesso ou não devidamente

controlada, os radicais podem causar estragos em uma ampla gama de

macromoléculas. Uma característica proeminente de radicais é que eles têm muito

alta reatividade química, o que explica não só as suas atividades biológicas normais,

mas como causam danos nas células (CUZZOCREA et al., 2001).

Existem muitos tipos de radicais, mas aqueles de maior preocupação em

sistemas biológicos são os derivados do oxigênio e conhecidos coletivamente como

espécies reativas de oxigênio (HALLIWELL, 1992). O oxigênio tem dois elétrons

desemparelhados em orbitais separados em sua camada externa. Esta estrutura

eletrônica faz com que o oxigênio seja especialmente suscetível à formação de

radicais. No organismo, essas espécies químicas em excesso podem reagir com

moléculas importantes, e por isso são capazes de inibir ou modificar sua função

dessas moléculas e, consequentemente, provocar inúmeras desordens fisiológicas

(CUZZOCREA et al., 2001). Por exemplo, ao reagir com o DNA os radicais livres

podem modificar as bases púricas e pirimídicas que o compõem, gerando mutações

21

ou inativando genes importantes. Já com proteínas, as espécies reativas são

capazes de oxidar grupos sulfidrilas (-SH) a pontes dissulfeto (S-S), alterando a

conformação e consequentemente a função das proteínas. Ou ainda, pode haver a

oxidação de ácidos graxos poliinsaturados de membranas celulares, proporcionando

mudanças estruturais e funcionais de tais lipídios (VALKO et al., 2006).

Por causa dessa alta reatividade, inúmeras condições relacionadas ao

envelhecimento e a doenças têm sido atribuídas à ação dos radicais livres. Doenças

neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal de Alzheimer e esclerose

amiotrófica lateral (BARNHAM; MASTERS; BUSH, 2004), diabetes tipo 2,

aterosclerose (KANETO et al., 2010) e câncer (VALKO et al., 2006) são exemplos de

condições derivadas diretamente ou indiretamente da ação destas espécies reativas.

É importante ressaltar que os radicais livres não tem apenas malefícios. Se

produzidos de uma forma bem regulada, os ROS e RNS têm importante função nos

sistemas biológicos. Por exemplo, o NO, que é uma espécie reativa de oxigênio,

quando produzido pelas células endoteliais é essencial para a regulação do

relaxamento e proliferação de células musculares lisas vasculares, a adesão dos

leucócitos, a agregação de plaquetas, a angiogênese, a trombose, o tónus vascular,

e a hemodinâmica. Além disso, o NO produzido por neurônios serve como um

neurotransmissor. Já aquele gerado por macrófagos ativados é um importante

mediador da resposta imune (FANG, et al.,. 2002).

Outros processos que os radicais livres participam são: Desintoxicação de

xenobióticos pelo citocromo P450 (enzimas de oxidação) e apoptose de células

estéreis ou com defeito; (DEVASAGAYAM, et al., 2006). Na tabela 2 estão contidas

as principais espécies reativas de oxigênio e nitrogênio de interesse biológico.

TABELA 2: Algumas espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio de interesse

biológico

Espécies reativas

Símbolo T de ½

vida (em seg)

Reatividade / Observações

Especies reativas de oxigênio

Superóxido O2.- 10-6 s

Considerado um ROS primário; É capaz

de gerar derivados reativos por

interação direta com outras moléculas

22

ou através de processos catalisados

por enzimas ou metais (VALKO et al.,.

2006). Produzido na mitocôndria ou em

desordens cardiovasculares.

Radical

Hidroxila OH• 10-9 s

É o mais reativo dos radicais, que o

torna extremamente danoso. A sua

principal fonte de produção in vivo se

deve a reação de metais de transição

com o íon superóxido pela reação de

Fenton. Este radical é extremamente

danoso a moléculas de DNA (VALKO et

al.,. 2006).

Peróxido de

Hidrogênio H2O2 estável

Apesar de não ser um radical livre, é

um metabólito do oxigênio

extremamente deletério, porque

participa de reações de Fenton e

Haber-Weiss que produzem o OH•. É

capaz de atravessar camadas lipídicas,

pode reagir com a membrana

eritrocitária e com proteínas ligadas ao

Fe++ (FERREIRA; MATSUBARA,

1997).

Peroxil ROO• segundos

Possuem os maiores potenciais de

redução dentre os ROS, e este

potencial varia de acordo com seu

grupo R. O mais simples dos radicais

peroxil é o radical peroxil (HOO•), que é

o ácido conjugado do íon superóxido

(O2•−) (VALKO et al., 2006).

Especies reativas de nitrogênio

Óxido nítrico

NO• segundos

Neurotransmissor e regulador de

pressão arterial. Durante a reação

imune, pode produzir potentes

oxidantes (DEVASAGAYAM, et al.,

2006).

Peroxinitrito ONOO- 10-3 s

Formado a partir do NO. e superóxido.

Altamente reativo capaz de provocar a

fragmentação do DNA e a peroxidação

lipídica (JOMOVA et al., 2010)

Adaptado de DEVASAGAYAM, et al., 2006

23

O conjunto das substâncias que neutralizam os efeitos biológicos danosos

dos ROS/RNS é chamado de antioxidantes. Esses podem ser enzimáticos e não-

enzimáticos. Segundo Valko (2006), um antioxidante ideal deve ser capaz de

sequestrar radicais livres, quelar metais de transição, interagir com outros

antioxidantes, e ser absorvido, além de trabalhar tanto em soluções aquosas como

em domínios de membrana celular. No entanto, as substâncias até então

descobertas que atuam como antioxidantes possuem apenas uma ou algumas

dessas características (VALKO et al., 2007).

Em eucariotos, os antioxidantes enzimáticos mais eficientes compreendem a

superóxido desmutase, a catalase e a glutationa peroxidase. A superóxido

dismutase (SOD) catalisa a dismutação do superóxido formando H2O2 e O2. A

catalase e a glutationa dismutase removem o peróxido de hidrogênio

(DEVASAGAYAM, et al., 2006). Os não enzimáticos compreendem o ácido

ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol (vitamina E), carotenóides, antioxidantes tióis

(glutationa, tioredoxina e ácido lipóico), melatonina, dentre outros (VALKO et al.,

2007; FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

Apesar de o organismo humano possuir um potente sistema antioxidante e de

reparo, não é possível combater todos os danos oxidativos. Desse modo, o

organismo faz uso de antioxidantes exógenos fornecidos pela alimentação (SIMIC,

1988).

Existem também os antioxidantes sintéticos, sendo os mais conhecidos o

butil-hidroxitolueno (BHT) e o butil-hidroxianisol (BHA), comumente usados como

conservantes de alimentos (VERHAGEN, et al., 1990). Entretanto, o uso de tais

compostos tem sido relacionado a riscos de saúde como danos no fígado e

possibilidade de promover a carcinogênese, resultando em normas rígidas sobre o

seu uso em alimentos (MCCATHY, et al., 2001).

Desse modo, os estudos com fontes alternativas naturais de antioxidantes

estão tomando espaço no meio científico. Nesse contexto, a pesquisa com

polissacarídeos sulfatados de algas vem ganhando grande destaque (SHAO et al.,

2013).

24

1.2.2.2 Atividades Antioxidantes de Fucanas

As algas marinhas vivem num ambiente de constante estresse salino e

hidrolítico, além de estarem expostas a radiação ultravioleta e altas concentrações

de oxigênio, fatores que levam a formação de radicais livres e outros oxidantes. No

entanto, não se observa danos oxidativos severos nessas algas, nem mesmo

quando estocadas durante grandes períodos, indicando que possuem mecanismos

protetores mediados por enzimas e/ou compostos antioxidantes não-enzimáticos

(AGUILERA et al., 2002; ROCHA et al., 2007).

Dentre os compostos antioxidantes não-enzimáticos algais, destacam-se os

polissacarídeos sulfatados (PS). Os PS extraídos de algas marrons são de longe os

mais estudados, apresentando um potencial antioxidante mediado principalmente

através da capacidade de sequestro de radicais livres, com destaque para a inibição

de radicais hidroxila e superóxido bem como quelação de íons metais (ZHANG et al.,

2003b, HEO et al., 2005, WANG et al., 2008, MAGALHÃES et al., 2011).

Dentre os PS antioxidantes extraídos de espécies de algas marrons, o

fucoidan da alga marrom Laminaria japonica é o PS mais amplamente avaliado. Os

estudos mais sistemáticos com esta molécula iniciaram em 2001, quando Xue et al.,.

(2001) analisaram fucoidans de L. japonica como agentes antioxidantes, usando

para tal o modelo de peroxidação lipídica (teste de TBA) para quantificar a oxidação

de lipoproteínas de baixa densidade (LDL); os polissacarídeos testados foram

fortemente ativos na proteção da oxidação de LDL induzida por AAPH (dicloreto de

2,2’-azobis (2-amidinopropano)), mas não para aquela induzida por Cu2+.

Posteriormente, fucoidans de baixa massa molecular, desta mesma alga, obtidos por

hidrólise ácida demonstram ter a capacidade de seqüestrar os radicais hidroxila e

superóxido (Zhao et al.,. 2006).

Com intuito de obter mais informações sobre a atividade antioxidante de

fucoidan de L. japonica Zhao e colaboradores (2007) obtiveram, a partir do extrato

bruto de polissacarídeos sulfatados da L. japonica, várias frações de fucoidan por

cromatografia de gel filtração (F-A, F-B), por cromatografia de gel filtração seguida

por hidrólise ácida (F-A1, F-A2, F-B1, F-B2) e por processo de degradação de

radical (LM1, LM2). Estes autores verificaram que o fucoidan de baixa massa

molecular (F-A2) apresentou uma potente ação sequestradora de radicais hidroxila e

superóxido, superior até que a dos fucoidans de alto massa molecular F-A e F-B.

25

Além disso, os autores verificaram que os fucoidans de baixo peso molecular mais

sulfatados apresentaram menor atividade antioxidante do que aqueles menos

sulfatados. Segundo os autores, esses dados indicaram que a presença de muitos

grupos sulfato no fucoidans de baixa massa molecular devem promover um

impedimento esterico que bloqueia a reação do polissacarídeo com os radical de

oxigênio. Estes autores, também observaram que a presença de mais de 5% de

ácido glucurônico na composição do polissacarídeo abole sua atividade

sequestradora de radical superóxido.

Outro trabalho publicado também em 2008 demonstrou que fucoidans de L.

japonica obtidos por fracionamento em cromatografia de troca iônica também

apresentavam uma alta atividade antioxidante pelo mecanismo de sequestro dos

radicais superóxido e hidroxila e moderada habilidade de quelação férrica (WANG et

al., 2008). Posteriormente, este grupo também mostrou que esses fucoidans

também tinham atividade antioxidante quando avaliado pelos testes de sequestro do

DPPH e poder redutor (WANG et al., 2010). Viu-se também que fucoidans de L.

japonica modificados pela adição de grupamentos funcionais mostraram excelente

atividade antioxidante, principalmente, os benzoilados (WANG et al., 2009).

Mais recentemente outros gêneros de algas marrons passaram a ser

avaliados como fontes de polissacarídeos sulfatados antioxidantes e um dos

gêneros que mais vem sendo estudado neste sentido é o Sargassum.

Um dos primeiros trabalhos mais relevantes foi publicado em 2007. Neste foi

demonstrado que uma heterofucana de S. fulvellum apresentava excelente atividade

antioxidante pelo teste de DPPH, e atividade sequestradora de peróxido de

hidrogênio, no entanto, apresentou baixa atividade sequestradora para os radicais

hidroxila e superóxido (Kim et al.,, 2010). No ano seguinte, foi demonstrado que

heteropolissacarídeos sulfatados, com diferentes conteúdos de ácido urônico e

distintas massas moleculares foram extraídos de S. fusiforme, estes polissacarídeos,

diferente das fucanas de S. fulvellum, apresentaram atividade sequestradora de

radicais hidroxila e superóxido, sendo o polissacarídeo com maior conteúdo de ácido

urônico e menor massa molecular o que apresentou a mais potente atividade

antioxidante (ZHOU et al., 2008). PS extraídos de S. pallidum também foram

avaliados pelo teste de DPPH, porém, diferente dos polissacarídeos citados até aqui,

os PS de S. pallidum apresentaram uma baixa atividade antioxidante (Ye et al.,

2008).

26

Posteriormente foi demonstrado que heterofucanas de S. filipendula (COSTA

et al., 2011) e S. vulgare (DORE et al., 2013) apresentavam baixa atividade

sequestradora de radicais hidroxila e superóxido. Apesar dos poucos dados, parece

haver um consenso de que este não é o principal mecanismo de ação antioxidante

das fucanas de algas do gênero Sargassum. Por outro lado, verificou-se que uma

heterofucana de S. filipendula apresentou forte atividade no teste do poder redutor

que foi semelhante à encontrada para a vitamina C (COSTA et al., 2011). Como

também se verificou que uma heterofucana de S. vulgare apresentava boa atividade

antioxidante no teste de DPPH (DORE et al., 2013). Ou seja, os dados estão

indicando até o momento que a as fucanas do gênero Sargassum tem como

mecanismo de ação antioxidante principal o fato de atuarem como agentes

redutores.

Fucanas da alga marrom Fucus vesiculosus são obtidas facilmente, pois são

vendidas comercialmente. Portanto, elas foram uma das primeiras fucanas

analisadas como agentes antioxidantes. Já no ano de 2002 demonstrou-se que a

fucana desta alga apresentava alto poder antioxidante avaliado pelo método FRAP

(RUPÉREZ; AHRAZEM; LEAL, 2002). Posteriormente, verificou-se que ela também

apresentava atividade sequestradora dos radicais superóxido e hidroxila (SOUZA et

al., 2007). Estes dados mostram que o mecanismo de ação da fucana de F.

vesiculosus é bem mais complexo do que das fucanas de Sargassum. Contudo, esta

conclusão deve ser vista com ressalvas, pois vários trabalhos mostram que a fucana

obtida comercialmente de F. vesiculosus é na verdade uma mistura de diferentes

fucanas e que a proporção entre elas varia de acordo com o lote.

Amostras ricas em diferentes polissacarídeos extraídos da mesma alga

também foram avaliadas por outros autores. Como por exemplo, Ananthi e

colaboradores (2010) mostraram que amostras ricas em heterofucanas extraídas da

alga Turbinaria ornata possuíam atividade antioxidante nos testes de sequestro de

DPPH, sequestro de óxido nítrico e inibição da peroxidação lipídica (ANANTHI et al.,

2010). Quando amostras ricas em heterofucanas de outras 5 espécies de algas da

ordem Dictyotales foram avaliadas por Costa et al.,. 2010: Dictyota cervicornis,

Dictyota menstrualis, Dictyota mertensii, Dictyopteris delicatula e Spatoglossum

schöederi, observou-se que apenas aquelas oriundas de D. menstrualis e D.

mertensii tiveram a capacidade de sequestrar os radicais hidroxilas, no entanto, esta

atividade foi baixa, tendo os PS a capacidade de sequestrar menos de 8,7% dos

27

radicais formados. Já para o ensaio de sequestro do radical superóxido todas

apresentaram atividade, exceto o de S. schröederi. Para os demais ensaios testados

(poder redutor, capacidade antioxidante total e quelação férrica) as cinco algas

apresentaram atividade de moderada a alta (COSTA et al.,, 2010).

Fucanas purificadas de algas da ordem Dictyotales também já foram

avaliadas como antioxidantes. Heterofucanas de Padina gymnospora apresentaram

atividade antioxidante no ensaio de sequestro do radical hidroxila e uma fucana

extraída da alga Lobophora variegata, denominada F1, apresentou atividade

seqüestrando radicais hidroxila e superóxido e mostrando excelente atividade

redutora (SOUZA et al., 2007, PAIVA et al., 2011). Mais recentemente, cinco

heterofucanas isoladas da alga Canistrocarpus cervicornis apresentaram atividade

antioxidante através dos seguintes mecanismos: Sequestro de radicais superóxido e

hidroxila, capacidade redutora e principalmente capacidade quelante de íons ferro

(CAMARA et al., 2011).

1.3. Fucanas e cálculos renais

1.3.1 UROLITÌASE

A litíase urinária ou urolitíase é uma condição fisiopatológica oriunda da

formação de cálculos renais. Estes cálculos são estruturas sólidas, resultantes da

aglomeração de cristais, compostos por cristais inorgânicos e orgânicos, os quais

podem estar amalgamados por proteínas. Tais cálculos derivam de uma alteração

metabólica crônica do organismo provocando uma excreção aumentada de

substâncias pela urina, como cálcio, oxalato, fosfato e/ou diminuição de excreção de

substâncias inibidoras da cristalização, como o citrato (MOE, 2006).

Evidências paleontológicas mostram que a presença de cálculos renais

acompanha a história da humanidade. De fato, os cálculos em bexiga foram

descobertos em múmias do Egito que remota 7.000 anos atrás (EKNOYAN, 2004).

Além disso, existem registros em papiros feitos por babilônicos e egípcios, a 4.800

anos a.C, de dietas para o tratamento de doenças do trato urinário, incluindo os

cálculos (LOPES E HOPPE, 2010).

28

Segundo Eknoyan (2004), a remoção dos cálculos e alivio da dor foi um dos

tratamentos mais antigos registrados na história. Muitas civilizações antigas,

incluindo egípcios, babilônios, gregos e romanos estudaram procedimentos, até

mesmo cirúrgicos para a retirada do cálculo. As pesquisas só não avançaram

durante a Idade Média, onde somente era oficialmente aceita cirurgia realizada por

cirurgião-barbeiro ou pelo próprio clero. Já no Renascimento, outras metodologias

começaram a ser pesquisadas, inclusive pra elaboração de medicamentos. Contudo,

os estudos metabólicos só começaram a ser elaborados no século XX, com a

descoberta do raio-X, o qual foi possível realizar análises química de pedras, base

para o manejo clínico da litíase urinária.

Atualmente, muitas técnicas e pesquisas têm sido desenvolvidas a fim de

eliminar e ou prevenir os cálculos renais. No contexto do tratamento clínico, a atitude

imediata perante uma crise renal provocada pelos cálculos ainda é a analgesia.

Desse modo, os AINES e as prostaglandinas (PGs) potenciam e modulam os

mecanismos locais e centrais da dor (GOMES, et al., 2002).

Após a analgesia, o procedimento posterior dependerá do tamanho e localização

do cálculo formado. O tratamento tradicional é a eliminação do cálculo

espontaneamente, porém bloqueadores de canais de cálcio (nifedipina) podem ser

utilizados, pois seus efeitos miorrelaxantes parecem aumentar a taxa de eliminação

espontânea dos cálculos. Outro tratamento utilizado é a quemólise para a dissolução

do cálculo de ácido úrico. Porém o bombardeamento por laser e procedimentos

cirúrgicos são ainda a forma de tratamento mais utilizado para cálculos de tamanhos

maiores ou com riscos críticos de obstrução (KNOLL e PEARLE, 2013), mesmo

sendo o método mais invasivo.

Graças aos estudos dos componentes químicos dos cálculos, foi possível

entender o processo de sua formação. Alguns trabalhos recentes mostram que

cálculos calcários, principalmente formados por oxalato de cálcio, são os mais

frequentes na urolitíase, representando mais de 80% dos cálculos encontrados.

Aqueles constituídos de ácido úrico representam cerca de 5-10%, seguido pelos

constituídos de cistina, estruvita, e cálculos de urato ácido de amônio. A formação de

diversos tipos de cálculos altamente incomuns está associado com a presença de

xantina, 8-diidroxiadenina, matriz protéica e fármacos, por exemplo, indinavir e

triantereno. Além disso, cálculos de origem mista não são raros e podem mostrar

uma fisiopatologia subjacente bastante diferente do cálculo formado por um único

29

componente, o que também pode modificar drasticamente o tratamento (MOE,

2006).

Nesse contexto, vários fatores podem estar relacionados a urolitíase sendo os

principais: a herança genética, o sedentarismo, clima e/ou exposição a temperaturas

elevadas, hábitos alimentares, entre outros (SELVAM, 2002). A literatura mostra

ainda que há um risco de cerca de 10 a 15% de desenvolvimento de cálculos em

países desenvolvidos e cerca de 25% nos que estão em desenvolvimento. Além

disso, a probabilidade de recorrência é de 50% entre 5 a 10 anos e 75% em 20 anos

(LOPES E HOPPE, 2010).

1.3.2 FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO E ESTRESSE

OXIDATIVO.

Em se tratando dos cálculos de oxalato de cálcio, os quais são os mais

comumente desenvolvidos em pacientes litisíacos, além dos fatores citados acima,

também estão comumente relacionados a formação destes cálculos: o distúrbio

metabólico, especialmente a hipercalciúria idiopática e a hiperoxalúria (MOE,2006),

que são fatores essenciais para o processo de supersaturação urinária.

O processo de formação do cálculo de oxalato de cálcio é resultado de um

processo físico-químico correspondente a três fases: nucleação, crescimento e

agregação dos cristais. A primeira condição para a formação de um cristal é a

supersaturação urinária, a qual consiste no estado no qual alguns sais se encontram

dissolvidos na urina em concentrações muito maiores que as plasmáticas (KNOLL,

2010). Os íons, quando em concentrações elevadas em uma solução, tendem a se

agrupar, através de suas cargas, formando pequenos cristais. Tal processo,

denominado de nucleação, dependendo da composição da urina, pode ser

homogêneo ou heterogêneo (RUSSEL, 1972). O processo homogêneo acontece

quando o cristal formado serve de substrato para a deposição de outros nanocristais

semelhantes. Já o heterogêneo, como é mostrado na figura 1, é resultado da

deposição dos cristais sobre um substrato, o qual pode ser constituído por

macromoléculas, ou outro cristal quimicamente diferente (GRASES et al.,, 1998). Os

cristais, por sua vez, se atraem e passam a formar agregados que,

progressivamente, crescem até a formação de uma fase sólida (COE, FAVUS,

30

1997). Esse cristal em fase sólida, pode se ligar a proteínas e outras substâncias

presentes na urina, originando-se, por sua vez, os cálculos.

Figura 1. Patogênese dos cálculos de oxalato de cálcio nos rins. Três categorias de fatores (genética, metabólica e alimentar), em conjunto ou isoladamente para levar a formação do cálculo. O processo de nucleação heterogênea provavelmente precisa de um ninho iniciando no epitélio (I), que constitui o substrato para a cristalização e para o crescimento (II). Fonte: MOE, 2006.

Segundo os estudos de YU et al., (2010), cristais de oxalato de cálcio

desenvolvem-se em três diferentes formas: mono-hidratadas (COM) (Figura 2.A), di-

hidratadas (COD) (FIGURA 2.B) e tri-hidratadas (COT) (FIGURA 2.C). Os cristais de

COM apresentam uma geometria de prisma tetragonal alongada, com superfície

externa irregular, uma estrutura densa e elevada dureza. Os cálculos de COM

consistem basicamente de um núcleo onde os cristais se depositam de modo

concêntrico, e uma camada intermediária estriada radialmente (DAGANELLO, 1991).

O COD são cristais de oxalato de cálcio de geometria piramidal tetragonal que se

apresentam termodinamicamente instáveis. Em contato com líquido gradualmente

eles se transformam na forma mais estável, o COM (GRASES, 1998). A forma COM

é encontrada em grandes quantidades nos cálculos renais, enquanto COD é mais

I

II

31

raro. Já o COT possui uma grande instabilidade termodinâmica, sendo raramente

encontrado nos cálculos.

A B

C

Figura 2: Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura de Cristais de Oxalato de Cálcio. (A) Mono-hidratado; (B) Di-hidratado; (C) Tri-hidratado

Fonte: GRASES et al.,, 1989

O tipo de cristal formado é um passo decisivo no processo da urolitíase, uma

vez que sua forma é determinante para a ligação ao epitélio renal e posterior

formação do cálculo. Desse modo, a forma mono-hidratada (COM) por ter a

morfologia termodinâmica mais estável dentre os três tipos é consequentemente

aquela que mais se ligar ao epitélio renal. Um fato importante relacionado a essa

preferência é a carga de superfície, já que os cristais COM aderem à superfície da

célula em sítios aniónicos específicos, os quais se encaixam perfeitamente a sua

forma tetragonal alongada. Além disso, propriedade adesiva, ligação eletrostática e

interações específicas são também outros fatores mediadores importantes para

adesão desse cristal (FONG-NGERN, et al.,2011)

A ligação ao epitélio acontece preferencialmente nos lugares onde o epitélio

renal está com as suas camadas protetoras (glicosaminoglicanos- GAG) danificadas

ou destruídas. Esse dano está intimamente relacionado ao estresse oxidativo celular

e formação de radicais livres (SELVAN, 2002).

32

As primeiras observações do processo de formação dos cálculos de CaOx

datam de 1930, quando Randall descreveu lesões em formato de placas no epitélio

renal, as quais estavam invariavelmente presentes em pacientes com cálculos de

CaOx. Posteriormente, comprovou-se que essas placas eram provenientes da

peroxidação lipídica decorrente do estresse oxidativo gerado durante a cristalização

na membrana basal das alças de Henle. Esta foi à primeira comprovação da relação

entre o estresse oxidativo e a formação de cálculos renais (MOE et al, 2002).

Estudos com ratos que foram induzidos a formarem cálculos renais de CaOx

com uso de deferentes agentes mostraram que há uma diminuição plasmática das

atividades das enzimas antioxidantes superoxido dismutase (SOD), catalase,

glutationa peroxidase (GPx), glucose-6-fosfato desidrogenase, glutationa-S-

transferase, bem como diminuição dos níveis plasmáticos dos sequestradores de

radicais livres: vitamina E, vitamina C, proteína tiol e glutationa reduzida (GSH). Foi

demonstrado que também havia um aumento plasmático de moléculas marcadoras

de peroxidação lipídica (SELVAN,2002). Alterações semelhantes foram observadas

em pessoas portadoras de cálculo de CaOx, o que mostra uma correlação positiva

entre a diminuição das defesas antioxidantes, a presença do oxalato/CaOx e a

formação de cristais de CaOx (BACKMAN, et al., 1984; ANBAZHAGAN, et al., 1999).

Normalmente pessoas possuem na urina várias moléculas que controlam a

nucleação, crescimento ou agregação dos cristais oxalato de cálcio, como citrato,

magnésio, pirofosfato, glicosaminoglicanos, nefrocalcina e diferentes glicoproteínas.

Uma diminuição na produção dessas moléculas ou uma síntese defeituosa pode

permitir a formação de cálculos. A partir daí o oxalato/oxalato de cálcio/ e cristais tipo

COM desempenham um papel importantíssimo na patogênese da urolitíase,

provocando inclusive a diminuição das defesas antioxidantes citadas acima. Apesar

de não se compreender totalmente como o oxalato/oxalato de cálcio/ e cristais tipo

COM promovem o stress oxidativo na urolitíase, foi proposto uma linha geral de

eventos que levam a formação dos danos renais provocados pelos oxalato/oxalato

de cálcio/ e cristais tipo COM, como pode ser visto na figura 3 (SELVAN,2002).

Os cristais formados se precipitam sobre a superfície celular ligam-se

rapidamente à superfície de células epiteliais e são internalizados. O tipo de cristal é

bastante importante durante esse processo, uma vez que, os monohidratados são

prontamente reconhecidos e endocitados, ao passo que o dihidratado se liga

fracamente a superfície celular e não é endocitado. No citoplasma celular proteínas

33

ligantes de oxalato/CaOx induzem a peroxidação a produção de peróxido de

hidrogênio e do ion superoxido, que por sua vez promovem a peroxidação lipídica.

Esta peroxidação lipídica dessatibiliza a membrana celular, levando ao aparecimento

de regiões pobres em várias moléculas, como glicosaminoglicanos, e

conseuqentemente levando a exposição de substância moléculas aniônicas, como

fosfatidil serina (BIGELOW et al., 1997) e fosfolipídeos (KHAN et al., 1988). Estas

regiões servem de local para a deposição de novos cristais e formação do cálculo

renal. Este cálculo é então endocitado. Não se sabe ainda se forma-se cálculos no

interior celular. Dentro da célula, o cálculo pode promover ativaçao de vários genes,

como cmyc, EGR-1, Nur-77, PAI-1, PDGF–A (HAMMES, et al 1995), levar a morte

celulr (KHAN 2012) e desencadear um processo inflamatorio (SELVAN,2002).

Figura 3: Modelo hipotético da representação da deposição/internalização do cristal de oxalato de cálcio nas células renais por endocitose e processo intracelular por oxalúria durante condições hiperoxalúricas Fonte: SELVAN,2002

A resposta bioquímica que envolve a produção de ROS durante o processo

inflamatório decorrente da alta concentração de cristais de oxalato é bastante

complexa. Primeiramente, a deposição desses cristais parecem estar associados a

34

ao aumento dos hormônios renina e angiotensina II, os quais estão envolvidos no

equilíbrio hemodinâmico do organismo (KHAN,2012).

Ainda segundo Khan (2012), de uma maneira que ainda não foi totalmente

esclarecida, os cristais são capazes de ativar a enzima NADPH oxidase não-

fagocítica, a qual está presente nos macrófagos e ativa ROS por meio de uma via

dependente de PKC. O complexo NADPH-oxidase é formada por um citocromo b

(559), um heterodímero associado a membrana composta de duas subunidades

(NoX2 e p22 (phox)), e quatro proteínas citosólicas (p47 (phox), p67 (phox), Rac, e

p40 (phox). Após estimulação, os componentes citosólicos p47 phox é fosforilado e

translocado juntamente com o componente Rac 1 para a membrana, ativando a via

da MAPK/JUNK. O acionamento dessa via faz com que vários fatores

transcripcionais e de crescimento, incluídos NF-ĸB, AP-1 e TGF-β sejam ativados.

Mediadores secundários também começam a ser gerados como isoprenos,

fosfolipase A2 e prostaglandinas. A produção de quimioatratores, tais como MCP-1 e

a cristalização do modulador OPN é aumentada. Macrófagos infiltram-se no

interstício renal em torno de depósitos de cristais. Daí então, a ativação da NADPH

oxidase fagocíticas resulta na produção de ROS adicional. A partir daí desenvolvem-

se inflamação, fibrose, deposição de colágeno e mineralização, levando a um

crescimento dos depósitos de cristais intersticiais (figura 4).

35

Figura 4: Resposta bioquímica da produção de ROS durante o processo inflamatório frente aos cristais de oxalato Fonte: Khan, 2012

Além disso, lesões apoptóticas e necróticas também se fazem presentes em

decorência desse processo. Estudos prévios afirmam que aonde há essas lesões

urotéliais pode predispor a cristalização de novo e retenção de cristais nos rins.

Estudos in vitro já demonstraram que os lipídeos de membrana, assim como

produtos de degradação celular são excelentes nucleadores para o processo de

cristalização. A figura 5 resume como ocorre o processo de formação do cálculo de

oxalato de cálcio (KHAN,2005).

36

Figura 5. Geração de hiperoxalúria induzida por Espécies Reativas de Oxigênio e seus efeitos sobre vários aspectos da formação de cristais, retenção e desenvolvimento do cálculo dentro dos rins. Fonte: Khan, 2005.

1.3.3 ANTIOXIDANTES PROTETORES RENAIS

O tratamento dos cálculos renais por meio de antioxidantes ainda é pouco

observado na clínica. No entanto, vários antioxidantes específicos são mostrados na

literatura impedindo o desenvolvimento do estresse oxidativo induzido por oxalúria

(KHAN, 2013). O pré-tratamento com a vitamina E (alfa-tocoferol) diminui a

deposição de cristais de oxalato de cálcio (SELVAN, 2002). O tratamento com

metionina ou glutationa monoéster, reduziu também os depósitos de cristais renais

CaOx nos rins dos ratos hiperoxalúricos . A redução ou eliminação total da

deposição de cristais foi associada a restauração das defesas antioxidantes dos rins

por atividades crescentes de enzimas SOD , catalase , glutationa- peroxidase (GPx )

Geração de ROS

Hiperoxaluria

Formação da Pedra Células inflamatórias

no interstício

Retenção do Cristal Mov. do Cristal no

interstício

Fixação/Endocitose do

Cristal

Crescimento/Agregação

do Cristal Nucleação deCaOx

Apoptose/Ne

crose

Modulação da

Cristalização

Proliferação

Celular Quimioatractantes

Ves. Memb. Exposição do Cristal

aos sítios de fixação

37

e /ou removedores de radicais livres , glutationa reduzida (GSH ), ácido ascórbico e

vitamina E (KHAN,2005) .

Recentemente, os polissacarídeos sulfatados de algas também começaram a

ser testados como antioxidantes protetores das injúrias renais. Estudos in vitro,

demonstraram que polissacarídeos da Laminaria Japonica além de diminuir o

tamanho dos cristais COM também estabilizaram o tipo COD, os quais não podem

se ligar a membrana (OUYANG, 2011). Outro polissacarídeo que mostrou ser

eficiente no processo da inibição da cristalização foi da alga marrom Sargassum

Graminifolia (ZHANG, 2012).

Estudos in vivo com suplementação exógena de polissacarídeos sulfatados

para ratos hyperoxalúricos de Fucus vesiculosus foram eficazes na redução do

estresse oxidativo, aumentando a atividade das enzimas antioxidantes como SOD,

CAT, GPX , e limitar a peroxidação lipídica . Além disso, os polissacarídeos

sulfatados foram capazes de evitar a retenção de cristal, por evitar o dano da

membrana induzida por os cristais de oxalato de cálcio (VEENA et al.,. 2007).

No litoral do Nordeste brasileiro são encontradas várias espécies de algas

marrons, porém nenhum polissacarídeo sulfatado dessas algas teve a sua

capacidade de inibição de formação de cristais avaliadas.

Desse modo, esse trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antioxidante

de polissacarídeos sulfatados de alga marrons Dictyopteris justii e seu efeito sobre a

cristalização do oxalato de cálcio in vitro.

Para obtenção do objetivo proposto, pretende-se:

Obter frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga marinha

Dictyopteris justii

Caracterizar quimicamente os polissacarídeos sulfatados extraídos;

Avaliar as atividades antioxidantes inerentes aos polissacarídeos

Avaliar a capacidade do polissacarídeo em inibir a cristalização do oxalato de

cálcio in vitro.

Avaliar a capacidade do polissacarídeo em interferir na morfologia dos cristais

formados

Analisar a capacidade do polissacarídeo em modificar o potencial zeta do

cristal de oxalato de cálcio.

38

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Materiais

2.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO

FILO: Ochrophyta

CLASSE: Phaeophyceae

ORDEM: Dictyotales

FAMILIA: Dictyotaceae

GÊNERO: Dictyopteris

ESPÉCIE: Dictyopteris justii (V.Lamouroux)

A alga Dictyopteris justii (J.V.Lamouroux) foi coletada na praia de Maracajaú,

município de Maxaranguape (RN, Brasil), distante 64 Km do norte da capital Natal. A

praia é relativamente rasa, de fundo arenoso, em muitos pontos cobertos por algas

calcárias e protegida do embate das ondas pelos arrecifes. Esta praia possui uma

vasta diversidade de algas com um grande número de espécies de Chlorophyceae,

Rhodophyceae e Phaeophyceae.

2.1.2 OUTROS MATERIAIS

Acetato de sódio trihidratado (3 H2O) da VETEC

Ácido acético

Ácido ascórbico, albumina, glicose, nitroblue tetrazolium (NBT), ferrozina, cloreto

de cálcio, oxalato de sódio, cloreto de sódio, acetato de sódio, citrato trisódicom

violeta de pirocatecol, sulfato de cobre II pentahidratado e riboflavina da Sigma-

Aldrich Brasil(São Paulo, SP, Brasil);

Ácido Gálico da CAQ Casa de Química Ind. E Com. (Diadema, SP, Brasil);

Figura 6: Alga Dictyopteris justii Fonte: http://biogeodb.stri.si.edu. Acesso: 13/12/2013

39

Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomasie brilliant blue R 250,

fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, hidróxido de sódio,

peróxido de hidrogênio e sulfato de ferro heptahidratado da CRQ (Diadema, SP,

Brasil);

Fenol e molibdato de amônio da Reagen Quimibrás Industrias Químicas (Rio de

Janeiro, RJ, Brasil);

Reagente de Bradford da Bio-Rad (NY, EUA);

Reagente Folin-Ciocalteau e Cloreto de Ferro da Merck;

Todos os demais materiais e reagentes foram obtidos da melhor forma possível.

2.1.3 APARELHOS

Agitador orbital modelo 255-B da FANEM Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

Banhos e estufas de temperatura controlável da FANEM Ltda (São Paulo, SP,

Brasil);

Centrífuga refrigerada CR21 da Hitachi Koki Co. Ltda. (Tóquio, Japão);

Espectrofotômetro digital DR5000 UV/VIS da Hach Company® (Loveland,

Colorado, EUA)

Medidor de pH PHTEK, modelo Meter PHS 3B (Tóquio, Japão);

Balança analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);

Microscópio NIKON CFI60, Spectrum – Spectrum Bioengenharia médica

hospitalar LTDA.

Analisador de Potencial Zeta (Zetaplus®), da Instrutécnica (Campinas, SP,

Brasil)

40

2.2 Métodos

A alga Dictyopteris justii (J.V.Lamouroux) foi coletada na praia de Maracajaú,

município de Maxaranguape (RN, Brasil). A extração de polissacarídeos sulfatados

foi adaptada da metodologia descrita por Rocha e colaboradores (2005). A alga

após a coleta foi limpa com água corrente e seca em estufa aerada a 45° C.

Posteriormente foi triturada e submetida a um processo de despigmentação e

delipidação. Após nova secagem sob temperatura ambiente, foram adicionados dois

volumes de NaCl 0,25 M à massa resultante, o pH foi ajustado para 8,0 com NaOH e

adicionou-se Prozima (proteaze alcalina) a mistura para digestão proteolítica. Após

18 h de incubação a 60° C, a mistura foi filtrada e centrifugada (10.000 x g, 10 min.,

4o C) e o sobrenadante foi fracionado por precipitação com acetona. Assim,

inicialmente, 0,3 volumes de acetona (4 °C) foram adicionadas à solução sob

agitação suave e mantida a 4° C por 12 h. A seguir, o precipitado foi separado da

solução por centrifugação (10.000 x g, 10 min., 4º C), secado e armazenado para as

análises posteriores. Ao sobrenadante obtido nessa etapa, adicionou-se mais

solvente até se ter a turvação do material. Esse procedimento foi repetido com

volumes crescentes de acetona até não se conseguir mais a turvação do

sobrenadante. A figura 7 resume-se de maneira esquemática a forma de obtenção

das amostras.

41

Figura 7: Obtenção das frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom

Dictyopteris justii.

2.2.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA

2.2.1.1 Dosagem de açúcares totais

Para verificação da quantidade de açucares nas frações, foi realizada o

método fenol/ácido sulfúrico, utilizando a glicose como padrão e leitura à 490 nm,

como descrito por Dubois et al (1956).

42

2.2.1.2 Dosagem de proteínas

A quantificação de proteína de cada extrato foi determinada com o reagente

de Bradford de acordo com as instruções do fabricante. Como padrão de leitura, foi

utilizada a albumina. A leitura foi realizada a 595nm.

2.2.1.3 Compostos fenólicos totais

Os compostos foram quantitativamente avaliados pelo método colorimétrico

de Folin-Ciocalteau e as leituras realizadas a 765nm. O ácido gálico foi utilizado

como padrão de leitura (COSTA, et al., 2010) resultado foi expresso em equivalentes

de ácido gálico, que é definido como a razão mg de ácido gálico/g de amostra.

2.2.1.4 Determinação da composição monossacarídica

As frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom D.

justii foram hidrolisados com 2 M de HCl por 2 horas a temperatura de 100 °C. Após

hidrólise, foram secos à pressão reduzida, na presença de pastilhas de NaOH, esta

etapa foi repetida três vezes. Por fim, o hidrolisado foi ressuspenso e 10 L de cada

solução foi aplicada em papel Whatman n ° 01 para realização da cromatografia em

papel (acetato de etila, piridina, água – na proporção 8:2:1). Os monossacarídeos

foram visualizados após redução de uma solução de nitrato de prata.

2.2.1.5 Espectroscopia de Infravermelho

As frações ricas em polissacarídeos sulfatados (5 mg) foram misturadas

cuidadosamente, com brometo de potássio seco. Os espectros de infravermelho

entre 500 e 4000 cm-1 foram realizados com uma pastilha de KBr e o polissacarídeo.

43

Em seguida, foram medidos em um Thermo-Nicolet Nexus 470 pesetas

espectrômetro de FT-IR. Trinta e duas varreduras em uma resolução de 4 cm-1

foram calculados e referenciada contra o ar.

2.2.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO

2.2.2.1 Capacidade antioxidante total

O ensaio é baseado na redução do Mo+6 a Mo+5 pela amostra teste, com

formação final de um complexo esverdeado fosfato/molibdênio +5 em pH ácido. As

amostras foram adicionadas em uma solução reagente (28 mM de fosfato de sódio,

0,6 M de ácido sulfúrico, 4 mM de molibdato de amônia). A solução foi mantida a 100

°C por 90 minutos e depois resfriada. A leitura foi feita a 695 nM (PRIETO; PINEDA;

AGUILAR. 1999). Como padrão de leitura, o foi utilizado o ácido ascórbico. O

resultado foi expresso em equivalentes de ácido ascórbico (mg de ácido ascórbico/g

de amostra).

2.2.2.2 Poder redutor

O poder redutor foi quantificado de acordo com metodologia descrita por

Athukorala; Kim; Jeon (2006) e Wang et al. (2008). 4 mL das amostras teste em

diferentes concentrações (0,10-1,00mg/mL) foram misturadas em tampão fosfato

(0,2M, pH 6,6) e ferricianeto de potássio (1%) e incubados por 20 min a 50 °C. A

reação foi interrompida pela adição de TCA (ácido tricloroacético) a 10%.

Posteriormente, foi adicionado água destilada e cloreto de ferro (0,1%). As amostras

foram lidas a 700 nm.

44

2.2.2.3 Sequestro do radical superóxido (O2-•)

Este método baseia-se na capacidade da amostra teste (frações

polissacarídicas) em inibir a redução fotoquímica do nitroblue tetrazolium (NBT) em

um sistema riboflavina-luz-NBT (CÂMARA et al, 2011). 3 mL da solução reagente

contendo: tampão fosfato (50 mM, pH 7,8), metionina (13 mM), riboflavina (2 μM),

EDTA (100 μM), NBT (75 μM) e 1 mL de solução contendo as frações

polissacrídicas em diferentes concentrações (10-2000 µg/mL), foram incubadas sob

iluminação com lâmpada fluorescente por 10 min. A produção do azul de formazan

foi monitorada pelo aumento da absorbância a 560 nm.

2.2.2.4 Sequestro do radical hidroxila (OH.)

O ensaio de sequestro do radical hidroxila foi baseado na reação de Fenton

(Fe2 + + H2O2 → Fe3+ + OH-+ OH.). Estes resultados foram expressos como taxa de

inibição. Os radicais hidroxila foram gerados utilizando 3 mL de tampão de fosfato de

sódio (150 mM, pH 7.4), que continha 10 mM de FeSO4 · 7H2O, 10 mM de EDTA, 2

mM de salicilato de sódio, 30% de H2O2 (200 mL) e concentrações diferentes das

frações. No controle, tampão fosfato de sódio substituiu o H2O2. As soluções foram

incubadas a 37° C durante 1 h, e a presença do radical hidroxila foi detectada

através da monitomento da absorvância a 510 nm. O ácido gálico foi utilizado como

controle positivo.

2.2.2.5 Quelação de Ferro

A capacidade de quelar ferro das frações foi investigada utilizando a seguinte

metodologia: SP em diferentes concentrações foram adicionados a uma mistura de

reação que continha FeCl2 (0.05 mL, 2 mM) e ferrozina (0.2 mL, 5 mM). A mistura foi

agitada e incubada durante 10 min à temperatura ambiente e a absorbância da

45

mistura foi medida a 562 nm contra um branco. O EDTA foi utilizado como controlo

positivo.

2.2.2.6 Quelação de cobre

A habilidade de quelar o íon cobre das frações foi determinada pelo método

descrito por Anton (1960). O violeta de pirocatecol, reagente utilizado neste ensaio,

tem a capacidade de se associar com alguns cátions como alumínio, cobre, bismuto

e tório e assim formar complexos coloridos. Na presença de agentes quelantes esta

associação não é formada, resultando na diminuição da intensidade da cor obtida.

Tal diminuição permite estimar a atividade quelante do íon de cobre. O teste foi

realizado em microplaca de 96 poços que conteve uma mistura de reação contendo

diferentes concentrações das amostras (0,1 – 2,00 mg/mL), Violeta de Pirocatecol (4

mM) e Sulfato de Cobre II pentahidratado (5 H2O) (50 µg/mL). Todos os poços foram

homogeneizados com um auxílio de uma micropipeta e a absorbância da solução foi

medida a 632 nm. A habilidade, das amostras, em quelar o íon cobre foi calculada

usando a equação abaixo:

Absorbância do branco – Absorbância da amostra

Absorbância do branco x 100

2.2.3 ENSAIO DE CRISTALIZAÇÃO DO OXALATO DE CÁLCIO

O efeito das frações ricas em polissacarídeos sulfatados na cristalização de

oxalato de cálcio foi medido espectrofotometricamente durante 30 min a 620 nm,

conforme descreve Zhang et al, (2012). Esse ensaio é baseado na quantificação por

densidade óptica de soluções metaestáveis de Ca2+ e Ox. Utilizando uma mistura de

cloreto de cálcio (8 mmol/L) e oxalato de sódio (1 mmol/L), 200 mmol/L de cloreto

de sódio e 10 mmol/L de acetato de sódio. As concentrações de compostos

presentes nesta mistura estão perto das concentrações fisiológicas urinárias. A

solução de CaCl2 (1.0 mL) foi agitada constantemente a 37° C tanto na ausência

46

quanto na presença de diferentes concentrações dos polissacarídeos sulfatados ou

o do citrato sódico como controle positivo. Após a obtenção de uma linha de base

estável, a cristalização foi induzida pela adição de solução de Na2C2O4 (1.0 mL) para

atingir concentrações finais de 4 mmol/L de cálcio e de 0.5 mmol/L de oxalato. A

partir de uma análise de regressão linear foi possível mensurar o percentual de

inibição da cristalização. A percentagem foi calculada a partir das taxas de

nucleação e de agregação, como se segue: [1- (SNA/SNC)] *100 para o percentual

de nucleação, sendo SNA a inclinação da curva de absorbância da solução de sais

na presença das amostras e SNC a inclinação do controle; [1- (SAA/SAC)] *100 para

o percentual de agregação, sendo SAA a inclinação da curva de absorbância da

solução de sais na presença das amostras e SAC a inclinação da absorbância do

controle.

2.2.4 ANÁLISE DA MORFOLOGIA DOS CRISTAIS POR IMAGEM

MICROSCÓPICA

Os cristais foram induzidos a se formarem na presença ou ausência dos

polissacarídeos sulfatados ou citrato de sódio (1 mM). Após trinta minutos, as

soluções foram centrifugadas (5000 x g) e sobrenadante foi descartado. Os cristais

foram então suspendidos em 0.5 mL de água e uma alíquota de 0.1 mL foi posta

numa lâmina histológica e levada a um microscópio. A morfologia dos cristais foi

analisada em dez campos selecionados aleatoriamente em ampliação de 60×. As

imagens foram capturadas a partir de diferentes campos. Foram realizados três

experimentos distintos.

2.2.5 MEDIDA DE POTENCIAL ZETA (ζ)

Os cristais foram induzidos a se formarem na presença ou ausência dos

polissacarídeos sulfatados ou citrato de sódio (1 mM). Após trinta minutos, as

soluções foram centrifugadas (5000 x g). O concentrado de cristais foi então

47

suspendido com 1,5 mL de água e o potencial zeta das amostras ζ foi obtido com o

uso analisador Zeta Plus®.

2.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todos os dados dos experimentos realizados foram expressos como média ±

desvio padrão (n=3). Para testar diferenças entre os frações, foi utilizado o teste de

análise paramétrica de análise de variância (ANOVA). O teste de Student–Newman–

Keuls (Nível de significância de p<0,05) foi aplicado para se comprovar algumas

similaridades encontradas pela ANOVA

48

3 RESULTADOS

3.1 Análises químicas das frações obtidas

O pó desidratado da alga D. justii foi ressuspenso na presença de enzimas

proteolíticas, que degradaram as proteínas contaminantes e permitiram a maior

solubilização dos polissacarídeos sulfatados. Posteriormente, os polissacarídeos

solúveis foram separados em quatro frações com o uso da precipitação diferencial

com acetona, como descrito em métodos. As frações foram então denominadas de

DJ-0.3v; DJ-0.4v; DJ-0.5v; DJ-1.2v e submetidas às análises, cujos resultados são

descritos abaixo.

Na Tabela 3 têm-se o resumo dos dados obtidos a partir das análises

químicas, pode-se observar que ocorre a presença de açúcares em todas as

frações. Porém, esta presença não ocorre de forma similar, já que o teor de açúcar

variou de acordo com a fração analisada (59,6 a 80,4 %). Com relação ao teor de

sulfato das frações, verificou-se que ele variou entre 3,9% a 7,5%, sendo o maior

valor percentual encontrado na fração DJ-0.4v. Já em relação à contaminação por

compostos fenólicos e proteínas, ambas foram consideradas baixas, variando de 0,5

% a 5% e 0,0% a 1,6 %, respectivamente.

TABELA 3. Análise química e relação molar do teor de açúcar e sulfato das frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom Dictyopteris justii

Frações Açucares

Totais (%)

Sulfato (%)

Proteínas (%)

Comp.

Fenólicos (%)

Razão Molar1

Gli1

Xil1

Ac, Glu1

Fuc1 Sulf.1

DJ-0,3v 67.5 ± 0.8 3,9 ± 0,4

1,6 ± 0,05 4,4 ± 0,2

1,0 0,8 1,2 0,3 0,9

DJ-0,4v 59.6 ± 1.3 7,5 ± 1,8

0,9 ± 0,04 5,0 ± 0,1

1,0 1,7 1,4 1,2 2,1

DJ-0,5v 75.8 ± 0.1 4,3 ± 0,6

0,1 ± 0,02 2,0 ± 0,2

1,0 0,0 0,0 0,2 1,0

DJ-1,2v 80.4 ± 0.2 6,8 ± 0,2

n,d 0,5 ± 0,0

1,0 0,0 0,0 0,1 1,5

1 Razão Molar utilizando a glicose como parâmetro. n.d= Não detectado; Gli - Glucose, Xil - Xilose,

Fuc – Fucose e Ac. Glu. – Acido Glucurônico

49

Uma análise geral dos dados apresentados na tabela acima leva a afirmação

de que a alga D. justii sintetiza populações de polissacarídeos sulfatados diferentes.

A primeira que se encontra em DJ-0.3v é rica em glicose, xilose e ácido glucurônico

e apresenta traços de fucose; a segunda (DJ-0.4v), que tem como diferencial

grandes quantidades de fucose; as duas populações que se encontram em DJ-0.5v

e DJ-1.2v apresentam apenas glucose e traços de fucose, mas se diferenciam entre

si pela quantidade de íons sulfato.

A fim de verificar as características estruturais dos polissacarídeos sulfatados

DJ-0,3v e DJ-0,4v e das glucanas sulfatadas DJ-0,5v e DJ-1.2, as amostras foram

submetidas a espectroscopia de infravermelho e os resultados estão expressos na

Tabela 4.

TABELA 4. Principiais assinalamentos encontrados nos espectros de Infravermelho dos polissacarídeos sulfatados da alga D. justii

Frações Polissacarídicas

Infravermelho (KBr) (cm-1)

DJ-0.3v 3303, 2924, 1605, 1231, 1159, 1024, 813 DJ-0.4v 3337, 2920, 1603, 1230, 1162, 1031, 811 DJ-0.5v 3316, 2924, 1625, 1244, 1155, 1033, 889 DJ-1.2v 3324, 2921, 1630, 1244, 1158, 1025, 994, 887

Os sinais na região de 3324-3303 cm-1 e 2920-2930 cm-1 comprovam a

existência de polissacarídeos, pois eles indicam a presença dos grupos OH e C-H,

respectivamente, que são encontrados em todos os polissacarídeos. O sinal em na

região em torno de 1605 cm-1 indica a presença das carboxilas dos ácidos

glucurônicos e só foi encontrado em DJ-0.3v e DJ-0.4v. Como este sinal se encontra

largo em sua base (dados não mostrados), pode-se propor que este está sobreposto

com sinais das hidroxilas da água que está solvatando as moléculas de

polissacarídeos. Os sinais das hidroxilas da camada de solvatação da água nos

espectros das frações DJ-0.5v e DJ-1.2v foram identificados nas regiões de 1630-

1625 cm-1. A vibração assimétrica da ligação glicosídica C-O-C foi refenciada à

banda 1150 cm-1, este sinal indicou a presença de aneis piranosídicos em todos os

carboidratos em estudo. Os sinais em torno de 1232-1256 cm-1 indicam vibração

assimétrica S = O e os sinais em torno 1150 e 1025-1033 cm-1 indicam vibração

associada a C-OSO, confirmando a presença de polissacarídeos sulfatados em

todas as frações. Os sinais observados em 813 (DJ-0.3v) e 811 (DJ-0.4v) indicam a

50

presença de sulfato predominante na posição 6 dos resíduos de açucares das

fucanas. Já os sinais em 889 e 887 nas frações DJ-0.5v e DJ-1.2v indicam a

presença de sulfato na posição 6 de resíduos de glicose na configuração β.

3.2 Atividade Antioxidante

A atividade antioxidante das frações ricas em polissacarídeos sulfatados foi

avaliada em seis diferentes ensaios: Capacidade antioxidante total (CAT), poder

redutor, sequestro de radicais hidroxila, sequestro de radicais superóxido, quelação

férrica e quelação cúprica.

3.2.1 CAT (CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL)

No ensaio de Capacidade Antioxidante Total (expresso como equivalentes de

ácido ascórbico), todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados tiveram

atividade antioxidante. As frações DJ-0.5v e DJ-1.2v apresentaram a menor

atividade antioxidante sendo os valores determinados de CAT para elas de 29,6 e

32,8 mg/g de equivalentes de ácido ascórbico (EAA), respectivamente. Por outro

lado, o valor de CAT obtido com a fração DJ-0.3v foi mais pronunciado e

correspondeu a 44,3mg/g. A fração cujo valor de CAT foi significativamente maior

(p< 0,05) foi a DJ-0.4v, que foi igual a 82,9 mg/g de EAA, conforme pode ser

observado na figura 8.

51

FIGURA 8. Capacidade antioxidante total de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marinha marrom D.justii. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Cada valor é a média ± DP de três determinações:

a, b, c Letras diferentes indicam uma diferença significativa

(p <0,05) entre os polissacáridos sulfatados.

3.2.2 PODER REDUTOR

O teste de poder redutor é expresso como atividade redutora equivalente,

calculado a partir da razão da atividade redutora encontrada para os compostos e

aquela encontrada para o ácido ascórbico na concentração de 0,2 mg/mL. Os

valores obtidos com DJ-0.3v e DJ-0.4v foram maiores do que aqueles obtidos com

as frações DJ-0.5v e DJ-1.2v. Outro fato a ser comentado é que as frações DJ-0.3v

e DJ-0.4v exibiram um efeito dose dependente, porém ao se comparar a atividade

de DJ-0.3v com a da fração DJ-0.4v, se observa que DJ-0.3v possui uma potencia

menor como agente redutor, este fato foi observado em todas as concentrações

avaliadas, ficando bem evidente na maior concentração avaliada (1.0 mg/mL), pois

nesta concentração DJ-0.4v apresentou o dobro do poder redutor verificado com

DJ-0.3v (Figura 9).

52

Figura 9. Poder redutor dos polissacarídeos sulfatados de D. justii. Os dados estão expressos como médias ± desvio padrão. A redução de potência está expressa como percentagem da atividade mostrada por 0,2 mg / mL de ácido ascórbico.

a, b, c, d, letras diferentes indicam uma

diferença significativa entre as concentrações de polissacarídeos sulfatados de frações das algas (p <0,05).

1,2,3,4 números diferentes indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração

de diferentes polissacarídeos sulfatados.

3.2.3 SEQUESTRO DOS RADICAIS HIDROXILA E SUPEROXIDO

No teste de sequestro de radicais hidroxila, todas as frações obtidas da alga

marrom D. justii não apresentaram atividade detectável. Com relação ao sequestro

do ion superoxico, apenas a fração DJ-F0.4v apresentou atividade sequestradora

de íon superoxido (27,4 a 29.4% para 0,25 mg/ml e 0,5 mg/mL respectivamente),

conforme pode ser observado na tabela 5.

53

Tabela 5: Sequestro de radicais superóxido e hidroxila pelas frações polissacarídicas. Valores expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b,c,d,e Letras indicam diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações do mesmo extrato/padrão.

Frações Concentração (mg/mL)

Sequestro do radical hidroxila (%)

Sequestro do radical superóxido (%)

DJ-0.3v 0,05 0,0 0,0

0,1 0,0 0,0

0,25 0,0 0,0

0,5 0,0 0,0

DJ-0.4v 0,05 0,0 0,0

0,1 0,0 0,0

0,25 0,0 29,4 ± 3,2a

0,5 0,0 27,6 ± 4,3a

DJ-0.5v 0,05 0,0 0,0

0,1 0,0 0,0

0,25 0,0 0,0

0,5 0,0 0,0

DJ-1.2v 0,05 0,0 0,00

0,1 0,0 0,00

0,25 0,0 0,00

0,5 0,0 0,00

Ácido Gálico

0,05 24,6 ± 1,7 a 57,73 ± 0,59a

0,1 38,9 ± 3,0b 66,34± 1,83b

0,25 74,1 ± 2,4c 78,50 ± 0,06c

0,5 81,2 ± 1,7d 86,35 ± 2,06d

3.2.4 QUELAÇÃO FÉRRICA

As frações polissacarídicas foram avaliadas quanto à capacidade de quelar

íons ferro (tabela 6). Observa-se que neste ensaio apenas as frações DJ-0.3v e DJ-

0.4v mostraram-se capazes de quelar ferro significativamente, entretanto esta

atividade foi apenas moderada chegando a 23,7% e 27,6 % respectivamente. Em

contrapartida, as frações DJ-0.5v r DJ-1.2v não apresentaram atividade de quelação

férrica.

54

Tabela 6: Atividade de Quelação Férrica. Valores expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b Letras indicam diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações do mesmo extrato/padrão.

Frações Concentração (mg/mL)

Quelação Férrica (%)

DJ-0.3V

0,1 0,0

0,5 0,0

1,0 17,0±2,2a

2,0 23,7±1,8b

DJ-0.4v

0,1 0,5 1,0 2,0

0,00 0,00

19,9 ± 3,4a

27,6 ± 1,1b

DJ-0.5v

0,1 0,5 1,0 2,0

0,00 0,00 0,00 0,00

DJ-1.2v

0,1 0,5 1,0 2,0

0,00 0,00 0,00 0,00

EDTA

0,1 0,5 1,0 2,0

19,7 ± 0,5 55,7 ± 0,3 87,6 ± 0,3 96,8 ± 0,7

3.2.5 QUELAÇÃO DE COBRE

O efeito quelante, sobre íons de cobre exibido por diferentes concentrações

das frações obtidas de D. justii está exposto na figura 10. Observa-se, com base nos

55

dados apresentados que todos os polissacarídeos tiveram atividade quelante de

cobre e em todos os casos o efeito foi dose dependente. Vale salientar, que mais

uma vez as frações DJ-0.3v e DJ-0.4v foram mais potentes do que DJ-0.5v e DJ-

1.2v. Porém, desta vez DJ-0.3v foi mais potente que DJ-0.4v, pois chegou ao platô

de sua atividade numa concentração menor que DJ-0.4v.

Figura 10. Atividadade quelante de Cobre dos polissacarídeos sulfatados da alga marrom D. justii. Os valores representam a média ± desvio padrão de três determinações:

a, b, c, d, e diferentes

letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre cada uma das concentrações do mesmo polissacarídeo sulfatado.

1,2,3 números diferentes indicam diferença significativa (p <0,05) entre a

mesma concentração de diferentes polissacarídeos sulfatados.

3.3 Ensaio de Inibição da cristalização de sais de oxalato de cálcio in vitro

A partir de uma mistura de sais que simula a urina supersaturada, verificou-se o

efeito inibitório dos polissacarídeos sulfatos antioxidantes de D. justii na cristalização

de oxalato de cálcio (CaOx), com base nos cálculos de regressão linear, conforme

descrito em métodos.

Na figura 11 é possível observar que a fração DJ-0.3v não foi capaz de inibir a

nucleação. A DJ-1.2v teve baixa atividade, com apenas 12,4% de inibição. Os

melhores resultados foram aqueles observados para os polissacarídeos DJ-0.5v e

DJ-0.4v, cuja capacidade de nucleação foi de 73,33% e 84,07% respectivamente,

efeito semelhante ao observado com o citrato de sódio (1 mM). Com relação à

agregação dos cristais, os valores de inibição da agregação encontrados na

presença dos polissacarídeos variou entre 86 a 80%. Apenas os valores obtidos com

DJ-0.4v foram estatisticamente diferentes dos demais polissacarídeos (86%), sendo

56

ainda maior que o citrato de sódio, cuja capacidade de inibição da agregação foi de

84%.

Figura 11. Atividade inibitória dos polissacarídeos sulfatados da alga marrom D. justii sobre a cristalização de sais de oxalato de cálcio. a, b, c, d, x,y Letras diferentes indicam diferença significativa (p <0,05) entre 0,25 mM de citrato de sódio e de polissacarídeos diferentes.

3.4 Efeito dos polissacarídeos sulfatados sobre a Morfologia dos Cristais

Na figura 12A pode-se observar os cristais formados nas condições controle.

Nessas condições são formados os três tipos de cristais de CaOx como indicado na

legenda da figura 12. A observação das lâminas de microscopia em dez campos

diferentes mostraram que 68.5% são do tipo COM, 13.2% do tipo COD e 18.3% são

do tipo COT.

Os cristais formados na presença do citrato de sódio e dos polissacarídeos

são menores (figura 12) do que aqueles encontrados no controle. Em concordância

com o que foi observado no ensaio de agregação, já que todas as amostras

inibiram a agregação de forma significativamente semelhante exceto a fração DJ-

0,5v, a qual foi significativamente maior.

Na figura 12B, observam-se os cristais formados na presença de citrato de

sódio. Foi detectado apenas cristais tipo COM nos dez campos observados, além

57

disso, esses cristais assumem um formato com arestas mais arredondadas do que

os COM observados no controle. Na presença de DJ-0.3v e DJ-0.4v os cristais

encontrados nos 10 campos observados também foram do tipo COM, mas são

ainda menores (figura 12G) e assumem uma forma ainda mais arredondada do que

aqueles observados na presença do citrato (figura 12C e 12D). Notou-se que os

cristais na presença do polissacarídeo DJ-1.2v assumiram duas formas bem

diferentes, uma mais arredondada e menor do tipo COM e outra maior que é do tipo

COD. Além disso, observa-se que 82.6% dos cristais formados na presença DJ-1.2v

são do tipo COM e 17.4% são do tipo COD nos 10 campos observados. Já na

presença do polissacarídeo DJ-0.5v, 87.5% dos cristais encontrados são do tipo

COD e 12.5% são do tipo COM. Vale salientar, que na presença destas duas

frações a geometria dos cristais tipo COD não está bem desenvolvida.

Por fim, também pode ser observado na figura 12 que os cristais na presença

dos todos os polissacarídeos ficam menores, o que já era esperado, pois os

polissacarídeos inibem sua agregação.

58

Figura 12. Cristais observados sob microscópio invertido (60 ×), formado na solução

metastável de CaOx na ausência (A) e na presença de (B) de citrato trissódico (1 mM) (C) DJ-

0.3V (0,1 mg / ml). (D) DJ-0.4V (0,1 mg / mL) (E) DJ-0.5v (0,1 mg / mL) (F) DJ-1.2v (0,1 mg / mL).

indica a forma COM; indica a forma COD e indica a forma COT; (G)

Tamanho médio dos cristais formados. a, b, c,

Letras Diferentes indicam Diferença significativa (p <0,05)

Entre o Controle, o Citrato de Sódio 0,1 uM e os Diferentes polissacarídeos.

3.5 Determinação do potencial Zeta (ζ)

O potencial zeta das amostras foi determinado no intuito de verificar as

59

alterações referentes à carga relacionada a possível mudança na estrutura dos

cristais. Os resultados estão expostos na Tabela 4. Nessa tabela também se

encontra ζ dos cristais formados a partir de soluções em condições semelhantes

aos ensaios de inibição de cristais de oxalato de cálcio. O valor médio do ζ dos

cristais de CaOx sem tratamento foi +8.39 ± 1.79 mV. Este caráter positivo da

superfície do cristal pode ser correlacionado com a presença principalmente dos

íons de Ca2+ presentes na estrutura do cristal.

Todos os polissacarídeos sulfatados diminuíram o potencial zeta dos cristais

de CaOX. Na presença de DJ-0.5v o ζ foi +4,98 ± 1.01 mV, este polissacarídeo foi o

que menos diminuiu o ζ dos cristais. Os polissacarídeos sulfatados DJ-0.3v e DJ-

1.2v diminuíram o valor do ζ dos cristais de maneira semelhante 4,5 ± 1,77 e 4.19 ±

0.9 mV respectivamente. A fucana DJ-0.4v foi o polissacarídeo sulfatado que mais

diminuiu o ζ dos cristais de CaOX, no caso foi determinado um valor de 2.0 ± 0.45

mV.

Tabela 7. Características dos potenciais Zeta de cristais com tratamento de polissacarídeos sulfatados de algas marrons D. justii à temperatura de 25 ° C. a, b, c, d Letras diferentes indicam diferença significativa (p <0,05) de Potencial Zeta entre CaOx e CaOx tratado com cada fração.

Amostras Zeta Potencial (mV)

CaOx + 8.39 ± 1.79a

CaOx + Citrato de Sódio + 3.10 ± 1.11b

CaOx + DJ-0.3v + 4.5 ± 1.77c

CaOx+ DJ-0.4v + 2.00 ± 0.45d

CaOx + DJ-0.5v + 4.98 ± 1.01c

CaOx + DJ-1.2v + 4.19 ± 0.9e

60

4 DISCUSSÃO

O ambiente marinho oferece incontáveis fontes de compostos que possuem

benefícios para saúde humana como, ácidos graxos, minerais, vitaminas e peptídeos

bioativos (NGO, 2012). Dentre os organismos marinhos, as algas despertam um

interesse especial por ser uma boa fonte de diversos componentes com potencial

biotecnológico (KIM, WIJESEKARA 2010). Quando se pensa em atividades como a

indústria de alimentos, cosméticos e de medicamentos, um dos compostos algais

que se destacam são os polissacarídeos sulfatados (REN, 1997).

O grupo em que se insere esta dissertação há mais de uma década vem

extraindo, purificando e caracterizando estruturalmente polissacarídeos sulfatados

de algas marinhas (ROCHA et al., 2001; ROCHA et al., 2005; BARROSO et al.,

2008; ALMEIDA-LIMA et al., 2010, CAMARA et al., 2011; COSTA et al., 2012).

Embora muitos trabalhos de prospecção em busca de polissacarídeos bioativos já

foram realizados (COSTA et al 2010), muitas algas ainda não tiveram seus

polissacarídeos sulfatados avaliados em diversos aspectos.

A escolha pela extração de polissacarídeos sulfatados da alga D. justii se deu

pela sua inedicidade, como também por ser uma alga de fácil obtenção e que ainda

não possui valor comercial.

Nesse contexto, para se verificar a presença de polissacarídeos sulfatados na

Dictyopteris justii, essa alga passou por um tratamento inicial como descrito em

materiais e métodos, e, após a proteólise, obteve-se extratos ricos em

polissacarídeos que foram submetidos à precipitação com o acréscimo de vários

volumes de acetona. Este passo não só teve o objetivo de separar diferentes

polissacarídeos, mas permitiu também a separação dos polissacarídeos sulfatados de

contaminantes como: proteínas e ácidos nucléicos (DIETRICH, 1995). Desse modo,

obteve-se quatro frações que foram denominadas de DJ-0.3v, DJ-0.4v, DJ-0.5v e

DJ-1.2v.

Com relação à caracterização química das frações polissacarídicas (Tabela

3), foi observado um alto teor de açúcares totais em todas as frações. As frações DJ-

0.5v, DJ-0.3v, e DJ-0.4v apresentaram valores correspondentes a 75,8%, 67,5%,

59,6% respectivamente. A fração com a maior taxa percentual foi a DJ-1.2v,

correspondente a 80,4% de açúcares. Estes valores podem ser considerados altos

se comparados com os valores obtidos com frações de algas como Spatoglossum

61

schröederi (ROCHA et al. 2005a) e Canistrocarpus cervicornis (CAMARA et al.,

2011) que não foram superiores a 50 % e mostra que o teor de açúcar varia de

acordo com a espécie de alga estudada.

Já o teor de sulfato das frações apresentou uma variação de 3,9% a 7,5%,

sendo o maior valor percentual, o da fração DJ-0.4v. Quando se compara os valores

de teor de sulfato verificados em frações polissacarídicas da D. justii com aqueles

descritos para frações de outra alga, desse mesmo gênero, encontrada no litoral do

Rio Grande do Norte, Dictyopteris delicatula, percebe-se que os valores descritos

nesse trabalho são mais baixos, pois essa alga apresentou teores que variam de 14

a 19% (MAGALHÃES et al. 2011). Com isso, pode-se inferir que a quantidade de

sulfato e teor de açúcares totais das algas pode variar independente das

características do mesmo gênero.

A contaminação protéica foi baixa nas frações DJ-0,3v, DJ-0,4v, DJ-0,5v e

não detectada para DJ-1,2v (Tabela 3). Tal resultado pode ser considerado baixo se

comparado com outros autores como Hussein et al. (1980) que encontraram em

fucanas de Padina pavonia um elevado teor de proteínas (67%). Já Dietrich et al.

(1995) obtiveram para Padina gymnospora valores compreendidos entre 1,6 - 7,5%.

Mas recentemente, Silva et al.., 2005, utilizando a mesma metodologia de extração

usada neste trabalho, obtiveram frações com níveis de contaminação variando entre

0,6 e 5,8% (SILVA et al., 2005). Esses dados indicam que o uso de proteases como

passo inicial durante o processo de extração dos polissacarídeos é essencial para a

obtenção de baixos níveis de contaminantes protéicos.

Quanto à composição monossacarídica mostrada também na tabela 3, é

possível observar que os polissacarídeos sulfatados das frações obtidas da D. justii

são polímeros heterogêneos. A partir dos dados, pode-se concluir que a glucose e a

fucose são os monossacarídeos presentes em todas as frações, mas a quantidade

desses açúcares é diferente em cada polímero, deixando claro que, os valores

percentuais destes açúcares podem variar de acordo com o polissacarídeo extraído.

Além disso, pode-se verificar claramente que a alga D. justii sintetiza populações de

polissacarídeos sulfatados diferentes.

Assim, pode-se inferir então que a alga D. justii sintetiza duas fucanas,

encontradas em DJ-0,3v e DJ-0,4v, que, pela presença de fucose e sulfato, podem

ser denominadas de fucanas heterogêneas ou heterofucanas. Surpreendentemente,

observou-se a presença de altas concentrações de glucose além de sulfato, nas

62

frações DJ-0.5v DJ-1.2v, o que indica a presença de glucanas sulfatadas. Glucose

não é muito comum na composição de heterofucanas, mas já foi detectada fazendo

parte da constituição de fucanas de algumas algas como D. Cervicornis (CAMARA,

2011). Padina pavonia, Sargassum stenophyllum, Chorda filum (MORYA et al,

2012). Contudo, não foram encontrados artigos que mostrem algas marrons

sintetizando glucanas sulfatadas, portanto, este é o primeiro relato da presença

destes polissacarídeos em algas marrons.

Com relação aos resultados obtidos pela microscopia de infravermelho (tabela

4) foi possível obter algumas características estruturais das frações DJ-0,3v e DJ-

0,4v, DJ-0,5v e DJ-1.2.

Os resultados mostram que todas as frações possuem polissacarídeos

ligados a sulfato em sua composição. Foi observado também diferenças sutis em

relação a posição do sulfato nessas frações, uma vez que os sinais observados em

torno de 813 indicam a presença de sulfato predominante na posição 6 dos resíduos

de açucares das fucanas das frações DJ-0.3v e DJ-0.4 (COSTA et al 2012) e os

sinais em torno de 889 indicam a presença de sulfato na posição 6 de resíduos de

glicose na configuração β (WANG et al 2005).

Levando em consideração a caracterização química das frações, as quais

comprovaram a existência de polissacarídeos sulfatados, avaliou-se então suas

atividades antioxidantes.

O processo de formação de espécies reativas ocorre através de uma reação em

cadeia envolvendo três fases (iniciação, propagação e terminação), em que os

antioxidantes atuam através de vários mecanismos que bloqueia uma ou mais

destas etapas. Assim, utilizou-se métodos diferentes para avaliar o efeito dos

polissacarídeos sulfatados de D. justii nos diferentes estágios de iniciação

(capacidade antioxidante total e poder redutor), de propagação (quelação de cobre e

de ferro) e de terminação (sequestro do radical superóxido e de hidroxila), contudo,

não houve correlação entre eles.

Assim, a primeira atividade antioxidante realizada foi o teste de capacidade

antioxidante total (CAT), cuja finalidade é avaliar a habilidade de uma amostra de

doar elétrons, neutralizando, dessa forma, os radicais livres.

Todas as amostras apresentaram atividade neste teste, como demonstrado

na figura 8. Além disso, vale salientar que todas elas apresentaram resultados

melhores do que aqueles encontrados para polissacarídeos sulfatados de outras

63

algas marrons. Como os da alga C. cervicornis (CAMARA et al 2012). As fucanas de

C. cervicornis apresentaram valores de CAT que variaram entre 20,9 e 39,4 mg/g de

EAA.

Outro ensaio realizado foi a atividade de poder redutor, que também avalia a

capacidade de uma amostra de doar elétrons, porém por mecanismos diferentes do

ensaio de capacidade antioxidante total (LUE, et al., 2010). O resultado desse

ensaio é expresso em atividade redutora equivalente ao ácido ascórbico na

concentração de 0,2 mg/mL. Os dados obtidos com o teste do poder redutor

apresentam um perfil semelhante ao perfil daqueles que foram observados no teste

do TAC, ou seja, DJ-0.3v e DJ-0.4v foram mais potentes do que DJ-0.5v e DJ-1.2v.

Os valores obtidos com DJ-0.4v são próximos daqueles obtidos com uma fucana

extraída de outra alga do gênero Dictyopteris, no caso a D. delicatula, essa fucana,

denominada de F1.3v, apresentou uma atividade de 53,2% de atividade da vitamina

C (MAGALHAES, et al, 2011).

O efeito redutor dos compostos, inclusive polissacarídeos sulfatados, parece

funcionar como inibidor de reações em cadeia de radicais livres através da doação

de elétrons, uma vez que a esta atividade é mediada por reações redox (KAEFFER,

1999). Zhang e colaboradores (2010) relatam que a densidade de cargas negativa

em uma fucana é importante para que ele seja um bom doador de elétrons e, por

conseguinte apresente um bom poder redutor. Isto também é valido para glucanas,

como mostrou Telles e colaboradores (2011). Esses autores promoveram a

sulfatação de uma glucana e verificaram que esta a inserção dos grupos sulfato

aumentou a poder redutor da glucana. Contudo, os dados da literatura levam a

observação de que só a densidade de cargas negativas não é suficiente para

justificar um maior poder redutor de um polissacarídeo, o padrão de distribuição

dessas cargas na molécula aparece também como um fator importante para que

polissacarídeo apresente poder redutor. O que justificaria o fato de DJ-0.4v

apresentar poder redutor semelhante ao da fucana F1.3v da alga D. delicatula

(MAGALHAES et al., 2011), apesar de DJ-0.4v ser menos sulfatada que a fucana

F1.3v. Espera-se que com a purificação dos polissacarídeos sulfatados encontrados

nas frações obtidas de D. justii relações entre estrutura e atividade dessas moléculas

possam ser realizadas e que se possa assim predizer as melhores condições

estruturais de polissacarídeos sulfatados para que eles sejam bons doadores de

elétrons.

64

Outros testes antioxidantes avaliados foram sequestro dos radicais hidroxilas

e ânios superóxidos. Nenhuma fração da alga D. justii apresentou atividade

sequestradora de hidroxila e apenas DJ-F0.4v (0.5 mg/mL) apresentou atividade

sequestradora de íon superoxido (29.4%). A ausência ou a presença de baixa

atividade no ensaio de eliminação de radicais hidroxila e superóxido é comum em

polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marrons (COSTA, et al 2010). Isto

mostra que a eliminação de radicais hidroxila provavelmente não é o principal

mecanismo antioxidante desses polissacarídeos.

Foram avaliadas ainda a habilidade das frações em quelar ferro e cobre. O

efeito quelante é muito importante, uma vez que ele inibe a interação entre os metais

e os lipídeos através da formação de complexos metálicos insolúveis com íons

ferrosos. Além disso, é uma maneira eficaz de eliminar a geração de radicais

hidroxila, uma vez que impede o ferro de interagir com H2O2, impedindo então a

decomposição de H2O2, e formação de um radical livre mais danoso (VALCO et al

2006). Das frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídas da D. justii, apenas

DJ-0.3v e DJ-0.4v mostraram-se capazes de quelar ferro, entretanto esta atividade

foi apenas moderada chegando a 23,7% e 27,6 % respectivamente (tabela 6). Em

contrapartida, as frações DJ-0.5v e DJ-1.2v não apresentaram atividade de quelação

férrica, mesmo tendo sulfato em sua composição. Alguns autores correlacionam a

capacidade de quelação férrica do polissacarídeo à presença de sulfato nos

polímeros. De fato, há exemplos de polissacarídeos sem atividade quelante de ferro

que, quando sulfatados artificialmente, passam a apresentar essa atividade (YANG

et al 2005, WANG, et al 2010). No entanto, estudos realizados por Telles e

colaboradores (2011) mostraram que a sulfatação das glucanas melhorou a

atividade antioxidante em diversos ensaios, todavia, a glucana sulfatada não teve

atividade quelante de ferro significativamente diferente da glucana não-sulfatada,

corroborando, dessa forma com a hipótese aqui apresentada, de que não é só a

presença de sulfato que fornece a atividade quelante, e também antioxidante, a um

polissacarídeo, mas a forma como estes grupos sulfatos estão distribuídos na

molécula.

Já a capacidade quelante de cobre foi bastante significativa para todas as

frações em diferentes concentrações (figura 10). A quelação de íons Cu2+ pode ser

crucial para a prevenção da produção de espécies reativas que danificam as

biomoléculas-alvo, uma vez que quando ocorre um desequilíbrio metálico provocado

65

pelo o aumento da concentração de cobre tem-se um aumento na produção de

espécies reativas do oxigênio devido em grande parte a reações de Fenton

(MCCORD, 1985) e de Haber-Weiss (SVINGEN, 1979).

Ao se observar os dados da figura 10, pode-se inferir que mais uma vez DJ-

0.3v E DJ-0.4v foram mais potentes do que as frações ricas em glicose DJ-0.5v e

DJ-1.2v. Estudos com fucanas da alga Undaria pinnatifida (MAK et al., 2013)

mostraram que elas também tinham capacidade de quelar cobre e aquelas com

maior teor de sulfato apresentavam maior atividade, assim como as fucanas de D.

justii. No entanto, não foi possível identificar outros trabalhos que avaliaram o efeito

de outras espécies como quelantes de cobre. Portanto, não há ainda dados

suficientes para se fazer maiores observações desses polissacarídeos para essa

atividade.

As atividades antioxidantes aqui apresentadas pelos polissacarídeos

sulfatados da alga Dictyopteris justii foram bastante significativas, uma vez que

auxilia no tratamento/prevenção de diversas doenças sendo uma delas a urolitíase.

Além disso, alguns trabalhos tem demonstrado que além da capacidade

antioxidante, os polissacarídeos sulfatados poderiam proteger o tecido renal da

agressão provocada pelo oxalato de cálcio, inibindo diretamente a formação de

cristais de oxalato (OUYANG, 2010).

Com base nisso, procurou-se também verificar se as frações ricas em

polissacarídeos sulfatados da D. justii eram capazes de inibir a formação de cristais

de oxalato de cálcio. Desse modo, a partir de uma mistura de sais que simula a urina

supersaturada, foi verificado o efeito inibitório dos polissacarídeos sulfatos

antioxidantes de D. justii na cristalização de oxalato de cálcio (CaOx), com base nos

cálculos de regressão linear, conforme descrito em métodos. Vale salientar, que esta

técnica não é capaz de avaliar o processo de nucleação e crescimento

separadamente. Porém, ela é amplamente utilizada pelos artigos encontrados sobre

este tema (OUYANG, 2010, ZHANG et al 2012).

DJ-0.3v não inibiu a nucleação dos cristais e DJ-1.2v teve baixa atividade

inibitória. Os melhores resultados foram aqueles observados com os polissacarídeos

DJ-0.5v e DJ-0.4v. Com relação a agregação, todas as frações apresentaram

valores de inibição comparáveis ao controle positivo.

Já foi demonstrado que a nucleação/crescimento e agregação dos cristais de

oxalato pode ser inibida pela presença de poliânions como proteínas e carboidratos

66

devido primariamente a presença das cargas negativas nessas moléculas, já que

essas moléculas interagem com cálcio e diminuem a supersaturação do sistema

(HES, 1995), o que justifica os dados encontrados com DJ-0.5v e DJ-0.4v. Contudo,

DJ-0.3v não afetou a nucleação e DJ-1.2v teve um efeito muito reduzido, apesar de

serem poliânions. Um estudo com diferentes glicosaminoglicanos (polissacarídeos

sulfatados de animais) mostrou que cada um deles inibe a nucleação por um

mecanismo diferente daquele utilizada pelo outro glicosaminoglicano e foi proposto

que a inibição da nucleação por polissacarídeos sulfatados não é unicamente um

efeito de cargas, mas também de como estas cargas estão distribuídas na molécula

(ESCOBAR et al., 2007). Isto explicaria o efeito de DJ-0.3v e DJ-1.2v.

Outros fatores que também podem afetar a nucleação/crescimento são a

topologia do cristal e a interação entre o poliânion e as faces do cristal. Os cristais

apresentam faces diferentes, uma rica em Ca2+ e outra rica em oxalato e o

polissacarídeo para ser um bom inibidor de nucleação/crescimento deve ser capaz

de interagir com a face rica em Ca2+, e para tal a conformação que o polissacarídeo

assume é um fator importante (GROHE, 2011). Por isso, sugere-se que DJ-1.2v

assume uma conformação que não permite uma boa interação dele com a face Ca2+

dos cristais nascentes, deixando-o pouco efetivo como inibidor da nucleação.

Os resultados encontrados com os polissacarídeos sulfatados de D. justii

levaram a observação de que alguns polissacarídeos desta alga possuem uma

capacidade semelhante a do citrato de sódio em inibir fortemente a formação de

cristais de oxalato. Além disso, os valores aqui obtidos são melhores do que os

descritos para os polissacarídeos sulfatados da alga marrom Sargassum

graminifolium (ZHANG et al, 2012), neste caso, os valores de inibição de nucleação

e agregação obtidos com os polissacarídeos de S. graminifolium não foram

superiores a 70% e 77%, respectivamente. Mediante esses dados, buscou-se então,

verificar se existem possíveis alterações na morfologia dos cristais formados após

tratamento com as frações ricas em polissacarídeos sulfatados.

Ao se observar a figura 12, é possível perceber claramente uma modificação

na estrutura dos cristais de CaOx tratados com as frações da alga D. justii. Estes

cristais ficaram menores, o que era esperado, já que os polissacarídeos inibem o

crescimento. Além disso, a mudança na morfologia dos cristais em decorrência dos

polissacarídeos é bastante visível. A geometria mais arredondada dos cristais COM

indica que eles estão mais amorfos, o que é provocado pela ruptura da rede

67

cristalina devido à presença dos polissacarídeos que se associaram ao cristal. Tal

geometria tem menor área de superfície, quando comparado com os cristais COM

com arestas e pontas (grupo controle), o que facilita a eliminação desses cristais

para fora do corpo na urina (ESCOBAR, et al 2007).

Escobar e colaboradores (2010) trabalhando com polímero carregado

negativamente [poly(ethyleneglycol)-block-poly(methacrylic acid) copolymer],

também conhecido como PEG-b-PMAA, mostraram que ele induz a formação de

cristais COD em detrimento dos cristais COM. Os autores sugerem que PEG-b-

PMAA por ser hidrofílico estabiliza os cristais COD, impedindo que eles se

transformem em COM. As duas frações ricas em glucose DJ-1.2v e principalmente

de DJ-0.5v são mais facilmente solúveis em água (dado não mostrado) do que DJ-

0.3v e DJ-0,4v. Estes dados nós levam a propor que essas frações, assim como

PEG-bPMAA, estabilizam os cristais COD e impedem que ele se transforme em

COM.

A forma COD, apesar de ser instável, é muito comum na urina de pacientes

saudáveis, o que indica que a urina naturalmente possui moléculas que estabilizam

a forma COD, impedindo sua transformação na forma geométrica COM (YAO, et al

2012). Esse caráter também foi observado nas frações ricas em glucose,

especialmente na DJ-0.5v. Tal estabilização tem um eficaz efeito protetor contra

urolitíase já que os cristais COM tem uma maior capacidade de ligação às células do

túbulo renal.

A fim de verificar as alterações referentes a carga relacionada a possível

mudança na estrutura dos cristais após o tratamento com os polissacarídeos

sulfatados, foi realizado, então, o potencial zeta das amostras.

O potencial zeta (ζ) é uma medida da carga total da superfície de partículas

(inclusive moléculas) em relação as cargas da suspensão líquida na qual ele se

encontra. No caso de moléculas, como polissacarídeos, o ζ reflete também o quanto

a conformação que a molécula assume pode “expor” ou “esconder” as cargas da

molécula. Assim, moléculas que apresentam cargas diferentes, podem apresentar

um ζ semelhante em uma solução e diferente em outro tipo de solução.

Na Tabela 6 também se encontra ζ dos cristais formados a partir de soluções

em condições semelhantes aos ensaios de inibição de cristais de oxalato de cálcio.

O valor médio do ζ dos cristais de CaOx sem tratamento foi +8.39 ± 1.79 mV. Este

caráter positivo da superfície do cristal pode ser correlacionado com a presença

68

principalmente dos íons de Ca2+ presentes na estrutura do cristal. Todos os

polissacarídeos sulfatados diminuíram o potencial zeta dos cristais de CaOx. Na

presença das frações ricas em glucose DJ-0.5v o ζ foi +4,98 ± 1.01 mV, este

polissacarídeo foi o que menos diminuiu o ζ dos cristais. Este fato ocorreu devido ao

DJ-0.5v ser, dentre os quatro polissacarídeos estudados, o menos carregado

negativamente (Tabela 3). Os polissacarídeos sulfatados DJ-0.3v e DJ-1.2v

diminuíram o valor do ζ dos cristais de maneira semelhante 4,5 ± 1,77 e 4.19 ± 0.9

mV respectivamente. Isso pode está relacionado ao fato de que a carga líquida

dessas frações serem semelhantes (Tabela 3), assim como o potencial zeta dessas

frações. A fucana DJ-0.4v foi o polissacarídeo sulfatado que mais diminuiu o ζ dos

cristais de CaOx, no caso foi determinado um valor de 2.0 ± 0.45 mV. Este efeito

provavelmente se deu devido ao maior valor da carga líquida negativa de DJ-0.4v

em comparação com os outros açucares.

Os resultados obtidos com esse trabalho demonstram que as frações ricas em

polissacarídeos sulfatados da alga marrom D. justii, tem uma alta capacidade de

diminuir a cristalização do oxalato de cálcio, como também atuam como

antioxidantes em diferentes ensaios in vitro. Embora os métodos antioxidantes

avaliados não tenham obtido correlação com os ensaios de inibição de cristalização

do CaOx, essas duas atividades atuando em conjunto apontam para uma

promissora frente de tratamento da urolitíase, uma vez que, já foi descrito que as

espécies reativas são capazes de causar injúrias renais, provocadas principalmente

por peroxidação lipídica.

69

5 CONCLUSÕES

A alga marrom Dictyopteris justii sintetiza quatro frações ricas em

polissacarídeos sulfatados DJ-0.3v, DJ-0.4v, DJ-0.5v e DJ1.2v.

A análise da composição monossacarídica dessa alga indicou que essa alga

sintetiza um complexo sistema de polissacarídeos sulfatados. Na fração DJ-

0.3v, glucofucoxyloglucuronana; na fração DJ-0.4v, uma hetrofucana; e nas

frações DJ-0.5v e DJ-1.2v uma glucana sulfatada.

Todas as frações apresentaram atividade antioxidante, com destaque para a

fração DJ-0.4v, que foi a mais potente em todos os ensaios, principalmente

em CAT, poder redutor e Quelação de Cobre; Como também foi a que teve

melhor capacidade de inibir a cristalização de oxalato de cálcio.

Destaca-se também a fração DJ-0.5v, que além de inibir também foi capaz de

estabilizar os cristais COD, impedindo-os de se transformarem em cristais

COM. Estes polissacarídeos são, portanto, agentes promissores para a

possível utilização para tratamento da urolitíase.

70

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