UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CURSO DE ... · Síndrome de Guillain-Barré - TCC. 2....
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA Washington Candeia de Araújo ANÁLISE DE ENRIQUECIMENTO DE GENES OBTIDOS POR RNA-SEQ DE INFECTADOS POR VÍRUS ZIKA E CHIKUNGUNYA: UMA ABORDAGEM ACERCA DA ASSINATURA BIOLÓGICA NO HOSPEDEIRO Natal – RN 2019
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
Washington Candeia de Araújo
ANÁLISE DE ENRIQUECIMENTO DE GENES OBTIDOS POR RNA-SEQ DE
INFECTADOS POR VÍRUS ZIKA E CHIKUNGUNYA: UMA ABORDAGEM
ACERCA DA ASSINATURA BIOLÓGICA NO HOSPEDEIRO
Natal – RN
2019
Washington Candeia de Araújo
ANÁLISE DE ENRIQUECIMENTO DE GENES OBTIDOS POR RNA-SEQ DE
INFECTADOS POR VÍRUS ZIKA E CHIKUNGUNYA: UMA ABORDAGEM
ACERCA DA ASSINATURA BIOLÓGICA NO HOSPEDEIRO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso
de Graduação em Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como requisito parcial para
obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Jorge Estefano S. de Souza
Natal – RN
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Araujo, Washington Candeia de.
Análise de enriquecimento de genes obtidos por RNA-seq de
infectados por vírus Zika e Chikungunya: uma abordagem acerca da
assinatura biológica no hospedeiro / Washington Candeia de Araujo. - 2019.
50f.: il.
Trabalho de Conclusão de Curso - TCC (Graduação) -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências
da Saúde, Departamento de Farmácia. Natal, RN, 2019. Orientador: Jorge Estefano Santana de Souza.
1. Síndrome de Guillain-Barré - TCC. 2. Sequenciamento de Nova
Geração - TCC. 3. Transcriptoma - TCC. I. Souza, Jorge Estefano
Santana de. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.833-002
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
Washington Candeia de Araújo
ANÁLISE DE ENRIQUECIMENTO DE GENES OBTIDOS POR RNA-SEQ DE
INFECTADOS POR VÍRUS ZIKA E CHIKUNGUNYA: UMA ABORDAGEM
ACERCA DA ASSINATURA BIOLÓGICA NO HOSPEDEIRO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso
de Graduação em Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como requisito parcial para
obtenção do título de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Jorge Estefano S. de Souza
__________________________________________________________________________
Presidente: Prof. Dr. Jorge Estefano Santana de Souza
_________________________________________________________________________
Membro: Prof. Dr. Leonardo Capistrano Ferreira
__________________________________________________________________________
Membro: Prof. Dr. Carlos Eduardo Maia Gomes
Natal – RN
2019
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, à FAPERN/CAPES por fornecer bolsa de estudos que permitiu minha
pesquisa e permanência na UFRN.
Agradeço à Professora Selma Jeronimo por permitir minha pesquisa no Laboratório de
Imunogenética do Instituto de Medicina Tropical – IMT, na UFRN. Além disso, por ter
fornecido as amostras dos pacientes com febre zika e chikungunya, além de todo o meio
material para o desenvolvimento desta pesquisa.
Meu agradecimento ao Professor Jorge Estefano por suas orientações e todo o suporte
intelectual, através de seu conhecimento em bioinformática, sendo essencial ao bom
desenvolvimento desta pesquisa.
Ao colega de trabalho Diego por compartilhar códigos R para DESeq2, além de ajudar-me na
pesquisa, sendo imprescindível no desenvolvimento das análises computacionais e
estatísticas.
Agradeço a todos os funcionários e servidores do Instituto de Medicina Tropical, Centro de
Biociências e Faculdade de Farmácia.
RESUMO
Atualmente, diversas ferramentas computacionais têm sido utilizadas em análises biomédicas
de dados genômicos provenientes de doenças complexas e infecciosas, com vistas ao
incremento em velocidade e performance computacional, além de acurácia analítica, com
vistas à resolutividade clínica. Neste sentido, os recentes surtos de infecção por vírus Zika
(ZIKV) eleveram a importância do reconhecimento desta síndrome como um agudo caso de
saúde pública, tendo seu estudo importância primordial para este fim. Desta forma, foram
utilizados dados de infectados por ZIKV durante surto de 2015; Síndrome de Guillain-Barré,
cujo processo inflamatório em nervos periféricos pode ser originado por infecções virais,
incluindo ZIKV. Análises valeram-se de dados advindos de sequenciamento de alta
performance (High Throughput Sequencing), em que transcriptômica utilizando NGS (RNA-
seq) foram utilizados em indivíduos recuperados de infecção por ZIKV, aqueles que
desenvolveram síndrome de Guillain-Barré devido à infecção por ZIKV, além de infectados
por vírus chikungunya (CHIKV). Com vistas a identificar assinaturas biológicas em vias,
genes e processos biológicos, além de diferenciar fenótipos do hospedeiro sob influência
destas diferentes infecções, utilizou-se metodologia de enriquecimento funcional de genes
conhecida por Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Os resultados indicam que vias de
desenvolvimento (morfogênese do olho, movimento ciliar), vias ligadas à inflamação e
sistema imune inato, além de vias de transmissão sináptica, estão sobrerreguladas
(upregulated) recuperados de GBS. O mesmo é indicado para recuperados por ZIKV, 400
dias após infecção. Em relação à doentes GBS é possível observar vias de ciclo celular e
neurogênese como sobrerreguladas, com mitofagia e maturação neuronal em nível menor
(downregulated), indicando que os recuperados de GBS tendem a recuperar as funções
normais diminuindo a expressão de genes destas vias. Em relação à CHIKV, vias ligas à
regulação do sistema imune inato (principalmente ligados ao reconhecimento de RNA viral),
ciclo celular, respostas de defesa do hospedeiro etc estão sobrerreguldas. Já aquelas vias
ligadas à vias biossintéticas, produção de ribossomos, e sinalização celular durante processos
inflamatórios estão com nível de expressão mais baixo (downregulated), indicando processos
celulares que levam à normalidade e correção de processos modifição durante a infecção por
estes vírus.
Palavras-chave: síndrome de Guillain-Barré, sequenciamento de nova geração, transcriptoma.
ABSTRACT
Currently, several computational tools have been used in biomedical analysis of genomic data
from complex and infectious diseases, aiming at increasing computational speed and
performance, as well as analytical accuracy, aiming at clinical resolution. In this regard,
recent outbreaks of Zika virus infection (ZIKV) have highlighted the importance of
recognizing this syndrome as an acute public health case, and its study is of primary
importance for this purpose. Thus, ZIKV-infected data were used during the 2015 outbreak;
Guillain-Barre syndrome, whose inflammatory process in peripheral nerves may be caused by
viral infections, including ZIKV. Analyzes were based on data from High Throughput
Sequencing, in which transcriptomics using NGS (RNA-seq) were used in individuals
recovered from ZIKV infection, those who developed Guillain-Barré syndrome due to
infection with ZIKV, besides being infected by chikungunya virus (CHIKV). In order to
identify biological signatures in pathways, genes and biological processes, in addition to
differentiating host phenotypes under the influence of these different infections, the Gene Set
Enrichment Analysis (GSEA) functional gene enrichment methodology was used. The results
indicate that developmental pathways (eye morphogenesis, ciliary movement), inflammation-
related pathways and innate immune system, as well as synaptic transmission pathways, are
upregulated recovered from GBS. The same is indicated for recovered by ZIKV, 400 days
after infection. In GBS patients, cell cycle pathways and neurogenesis can be observed as
overregulated, with mitophagy and downregulated neuronal maturation, indicating that GBS
recovered individuals tend to recover normal functions by decreasing gene expression in these
pathways. Regarding CHIKV, pathways linked to innate immune system regulation (mainly
linked to viral RNA recognition), cell cycle, host defense responses etc are overregulated.
Those pathways linked to biosynthetic pathways, ribosome production, and cellular signaling
during inflammatory processes are downregulated, indicating cellular processes that lead to
normality and correction of modification processes during infection by these viruses.
Keyword: Guillain-Barré syndrome, Next Generation Sequencing, transcriptomics.
LISTA DE SIGLAS
C2 C2 collection: Curated gene sets of MSigDB
C5 GO Gene sets of MSigDB
CHIKV vírus chikungunya
DE Diferencialmente expressos
GBS Guillain-Barré syndrome
GSEA Gene Set Enrichment Analysis
H H collection: Hallmark gene sets of MSigDB
HTS High Throughput Sequencing
MSigDB Molecular Signatures Database
NE Nordeste
NES Normalized Enrichment Score
NGS Next Generation Sequencing
OMS Organização Mundial de Saúde
PCR Polymerase Chain Reaction
SE Sudeste
SGB síndrome de Guillain-Barré
WHO World Health Organization
ZIKV vírus Zika
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 7
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 9
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 9
3 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................... 10
3.1 Vírus Zika e Emergência de Pandemia nas Américas e Brasil ..................................................... 10
3.1.1 Vírus Zika, Síndrome de Guillain-Barré e Microcefalia ............................................................. 11
3.2 Vírus Chikungunya e Sua Reemergência na Ásia e Américas ...................................................... 12
3.4 RNA-seq: Análise Transcriptômica de Alto Rendimento (HTS) ................................................... 14
3.3 GSEA - Gene Set Enrichment Analysis ......................................................................................... 15
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 17
4.1 Obtenção de Amostras de RNA e Preparação para Sequenciamento ...................................... 17
4.2 Extração de RNA viral .................................................................................................................. 19
4.3 qRT-PCR para CHIKV .................................................................................................................... 19
4.4 Extração de RNA Total e Sequenciamento .................................................................................. 20
4.5 Mapeamento de reads ................................................................................................................ 20
4.6 Mapeamento e Montagem de Genoma CHIKV........................................................................... 20
4.7 GSEA - Gene Set Enrichment Analysis ......................................................................................... 21
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 22
6 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 42
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 43
7
1 INTRODUÇÃO
Em meados desta década presenciou-se novas epidemias virais principalmente na Ásia e
Américas, iniciando com a reemergêngia de febre desencadeada por alfavírus chikungunya
(CHIKV) (DEEBA et al., 2016; STAPLES et al., 2009; WONG AND CHU, 2018),
culminando com a infecção por flavivírus Zika (ZIKV). Este último evidenciou-se como um
caso epidemiológico excepcional principalmente em países pertencentes àquele último
continente, desencadeando uma pandemia que trouxe consigo manifestações severas, tais
quais síndrome de Guillain-Barré em adultos e microcefalia em neonatos (FANTINATO et
al., 2016; MALTA et al., 2017; PLOURDE AND BLOCH, 2016; VARGAS et al., 2016)
Ambos são arbovírus endêmicos de áreas tropicais, tais quais África e Ásia,
responsáveis por surtos de doenças humanas nas mesmas, mas, principalmente nas novas
áreas cujas barreiras imunitárias a estes vírus são pouco desenvolvidas (YACTAYO et al.,
2016). Portanto, esses vírus encontraram ambientes ecológicos ideais, cujos hospedeiros
forneciam pouca ou nenhuma capacidade de ameaça, infectando até 70% de pessoas em áreas
afetadas (GÉRARDIN et al., 2008).
Neste sentido, diversos estudos têm sido realizados acerca destes vírus, incluindo
principalmente aspectos moleculares, genéticos e imunológicos, com vistas ao conhecimento
de genômica viral, configuração ultraestrutural, fenótipos do hospedeiro e desenvolvimento
de fármacos e vacinas (ABDELNABI et al., 2015; BAILEY et al., 2018; BARROWS et al.,
2019; CUNHA et al., 2017; GODEC et al., 2016; PARDY AND RICHER 2019; PROW et
al., 2019).
Não obstante o interesse geral e o desenvolvimento de tantas pesquisas, a colonização
destes vírus em seu hospedeiro resulta em diversos tipos de respostas - imunológicas,
bioquímicas -, as quais desencadeiam fenótipos sutis, cuja caracterização pode auxiliar no
conhecimento ampliado destas patologias.
Portanto, estas análises de enriquecimento aqui apresentadas surgem para auxiliar a
difícil interpretação de resultados de expressão gênica diferencial obtidos por dados de análise
transcriptômica de alto rendimento (High Throughput Sequencing, HTS) – feitos em
sequenciadores de nova geração, next generation sequencing (NGS) –, denominada na
literatura atual sob o termo RNA-seq, em termos de fenótipos, ou seja, processos biológicos,
8
vias etc. Neste caso, buscar associações com o fenótipo de doenças, como as aqui
representadas, originadas de vírus zika (incluindo a síndrome de Guillain-Barré) e
chikungunya.
9
2 OBJETIVOS
Análise funcional (enriquecimento) acerca de genes obtidos por RNA-seq de infectados por
vírus zika e chikungunya com vistas à busca por assinaturas biológicas no hospedeiro.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Busca por assinaturas biológicas em vias, genes e processos biológicos.
2. Diferenciar fenótipos do hospedeiro.
10
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Vírus Zika e Emergência de Pandemia nas Américas e Brasil
O vírus Zika é um flavivírus (senso positivo), arbovíros da Família Flaviviridae,
estruturalmente caracterizado por vírions envelopados e icosaédricos, isolado inicialmente a
partir de macacos rhesus em uma floresta de Uganda chamada Zika em 1947 (PLOURDE
AND BLOCH, 2016; WHITE et al., 2016), sendo identificado em hospedeiros incidentais
humanos em 1952 (PROENCA-MODENA et al., 2018).
Inicialmente caracterizado por sintomas clínicos leves, principalmente quando
comparados a outros arbovírus (MUSSO et al., 2019), apenas em meados desta década seu
efeito sobre a saúde coletiva pôde ser reconhecido, trazendo consigo características clínicas
sobre o hospedeiro humano, as quais, naquela época eram desconhecidos, tal qual sua
transmissão por via sexual (YARRINGTON et al., 2019), associação com a síndrome de
Guillain-Barré e casos de microcefalia em neonatos, casos os quais, relatados primeiramente
na região NE do Brasil (FANTINATO et al., 2016; MALTA et al., 2017; VARGAS et al.,
2016; WHO, 2015).
O histórico epidemiológico indicava surtos restritos à Ilhas do Pacífico, tais quais Yap
Island, Guam e Micronésia em 2007 (DUFFY et al., 2009; HADDOW et al., 2012). Após
isso, novos casos foram relatados, especificamente na Polinésia Francesa em 2013 e 2014
(CAO-LOMEAU et al., 2014; MUSSO et al., 2018). Somente em 2015 fez-se primeiro relato
deste vírus no Brasil - confirmada através de Nota Informativa n°6 (MS, 2015) - e
subsequentemente em países caribenhos da América Central e do Sul (GUIMARÃES et al.,
2019; PROENCA-MODENA et al., 2018), além de África em 2015. A partir deste ponto,
ZIKV fora considerada uma pandemia.
Embora análises moleculares anteriores tenham indicado que ZIKV tenha sido
introduzido nas Américas através de uma linhagem Asiática (FARIA et al., 2016; HADDOW
et al., 2012), não houve um consenso neste período acerca de sua origem espaço-termporal
específica.
No entanto, Faria et al. (2017) estabeleceram origem e histórico da epidemia de ZIKV
baseando-se em análises de genomas de 54 ZIKV, advindos principalmente de amostras
brasileiras, comparando-as através de análises de filogeografia com aquelas do Caribe e
11
outros países da América Central e Ásia (Polinésia Francesa). Esses pesquisadores
demonstraram, ao associar seus resultados moleculares aos àqueles epidemiológicos e
ecológicos disponíveis, que o ZIKV fora introduzido no país em 2014, cuja origem recaía em
uma linhagem asiática (nomeada PreAm-ZIKV, originária do sudoeste da Ásia e do Pacífico).
Logo, a introdução de ZIKV se deu através de ancestral comum a todos aqueles vírus
ZIKV nas Américas, consistindo em fundador único, cuja convergência levava
especificamente ao mês de janeiro de 2014. A partir deste momento, uma linhagem americana
de ZIKV ficou estabelecida (am-ZIKV), sendo subsequentemente disseminada a partir de
fevereiro do mesmo ano, irradiando-se em várias outras linhagens (CB1 e CB2, caribenhas;
SA1 e SA2, sul-americanas). Neste sentido, sua distribuição geográfica e temporal corrobora
com histórico meteorológico de precipitação de chuvas, responsável por elevação em número
de indivíduos na população do vetor, o Aedes aegypti, fornecendo evidência de convergência
entre estes diversos fatores ao incremento na epidemia de febre Zika observada neste período.
Por fim, inferiu-se que a linhagem americana do ZIKV (am-ZIKV) fora importante na
distribuição de ZIKV até a América Central, Caribe e outras localidades na América do Sul,
bem como, em seu movimento em direção ao sudeste (SE) do Brasil.
No entanto, a epidemia de ZIKV levaria um ano até evidenciar-se como um surto de
febre zika no continente Americano, e ser reconhecida com uma pandemia, a qual traria
consigo um conjunto de manifestações ainda não caracterizadas anteriormente,
principalmente aquelas relacionadas a desordens neurológicas observadas em adultos e
crianças.
3.1.1 Vírus Zika, Síndrome de Guillain-Barré e Microcefalia
A partir do reconhecimento da presença deste vírus em território brasileiro, notabilizou-se um
período de elevação anormal em casos de desordens de origem neurológica, especificamente
síndrome de Guillain-Barré (SGB) em adultos e microcefalia em neonatos (PROENCA-
MODENA et al., 2018), embora manifestações de SGB tenham sido descritas no surto de
ZIKV na Polinésia Francesa (CAO-LORMEAU et al., 2016).
É o termo é usado especificamente para definir pacientes com um neuropatia paralítica
aguda de progressão rápida, causada por distúrbio autoimune, embora englobe um conjunto
de neuropatias agudas, desencadeada após infecções, cirurgias etc. Caracteriza-se por ataque à
bainha de mielina que envolve os nervos periféricos (polineuropatia desmielinizante), do
12
axônio. Os sintomas são fraqueza e sensação de formigamento - principalmente nas pernas -
com diminuição de reflexos ou sua ausência, agravando-se com uma manifestação
generalizada severa com falha respiratória (20 - 30% dos casos) (WILLISON et al., 2016).
Embora mais reconhecida em casos de pacientes infectados por microrganismos, tais quais
Campylobacter jejuni, citomegalovírus, Haemophilus influenzae, vírus Epstein-Barr e HIV
(ESTRIDGE AND ISKANDER, 2015), atualmente inclui-se nesta lista infecção por ZIKV. A
emergência desta epidemia coincidente com uma elevação subsequente em casos de SGB
levou ao monitoramento mais acurado, resultando em reconhecimento por parte da OMS de
associação de febre zika com esta síndrome, declarando-a como Public Health Emergency of
International Concern (PHEIC), uma “emergência de saúde pública de interesse
internacional” em tradução livre (SAMARASEKERA AND TRIUNFOL, 2016).
Por sua vez, em 2015 a Organização Mundial de Saúde (OMS) reconheceu ZIKV
como associada aos casos de microcefalia e desordens neurológicas relacionadas, em bebês
cujas mães apresentaram febre zika durante a gravidez (WHO, 2017). Portanto, os casos de
defeitos congênitos resultantes de ZIKV durante a gravidez também começaram a ser
monitorados com maior acurácia. Até janeiro de 2018 foram detectados mais de 3700 casos
de defeitos congênitos por este vírus nas Américas (MUSSO et al., 2019; WALDORF et al.,
2018). Embora o surto tenha encerrado, ainda é possível detectar casos de síndrome de ZIKV
congênitca caracterizada por efeitos teratogênicos, tais quais malformação muscoloesquelética
e manifestações neurológicas (microcefalia e outras desordens neurológicas) em neonatos
(GUIMARÃES et al., 2019).
Atualmente, o Brasil conta com a Rede Nacional de Especialistas em Zika
(RENEZIKA), uma rede multiprofissional criado através do Ministério da Saúde, cujo
objetivo é prover pesquisas com vistas à vigilância, prevenção e controle, além de suporte
científico; incremento em análises epidemiológicas; contribuir no desenvolvimento de
orientação e cuidado (GUIMARÃES et al., 2018).
3.2 Vírus Chikungunya e Sua Reemergência na Ásia e Américas
O vírus chikungunya é um alfavírus da Família Togaviridae, gênero Alphavirus, envelopado,
cujo genoma consiste em uma fita de RNA linear (senso positiva) (DEEBA et al., 2016).
Assim como ZIKV, é um arbovírus cujo vetor principal é o Aedes albopictus e A. aegyptis
(ABDELNABI et al., 2015).
13
Este vírus causa febre aguda, artralgia severa, e rash (COUDERC AND LECUIT,
2015; LO PRESTI et al., 2016), tendo seu nome originado-se de uma palavra Makonde
(grupo étnico da Tanzânia, e significaria “aquele que se dobra”, postura vista naqueles
infectados, devido à artrose e à dor extrema gerada (DEEBA et al., 2016).
Este vírus foi detectado repetidas vezes no mundo todo, desde 2004, em surtos
esporádicos em localidades do Oceano Índico, países da África e alguns países do continente
Americano (WEAVER AND FORRESTER, 2015). Em 2004, por exemplo, reemergiu no
Quênia e se espalhou por outras localidades do continente Africano, levando à milhares de
casos ao redor do Oceano Índico (STAPLES et al., 2009). Em 2005, CHIKV foi responsável
por epidemia nas ilhas Comoros, costa leste da região norte de Moçambique, além de Índia,
Sri Lanka e muitos países do sudeste da Ásia (MORRISON, 2014).
Não obstante ser responsável por surtos esporádicos e casos de reemergência, esse
vírus emerge nas Américas no final de 2013 (ver YACTAYO et al., 2016), levando a um
incremento de gastos públicos devido ao aumento na procura aos sistemas de saúde pública,
principalmente devido aos sintomas incapacitantes de artrose (STAPLES et al., 2009). Sua
expansão durante esse período levou, inclusive, ao confundimento inicial dos sintomas
causados por ZIKV, no qual o diagnóstico desta última doença recaía sobre febre
chikungunya, o que explica em parte, a demora na resolução de diagnóstico de ZIKV (ver
WHITE et al., 2016).
No Brasil, as primeiras transmissões autóctones detectadas deste vírus foram descritas
em 13 de setembro de 2014, na região Norte do país, causadas por um linhagem asiática.
Alguns dias depois, outros casos foram detectados na região NE (NUNES et al., 2015).
Dentre estes casos, destaca-se uma população do
NE, residente no Estado de Sergipe, cujo acompanhamento de pacientes sintomáticos através
de exames sorológicos revelou a distribuição do CHIKV sob o genótipo ECSA (East-Central-
South-Africa) (CUNHA et al., 2017).
Para maiores esclarecimentos sobre o histórico de CHIKV, ver STAPLES et al.
(2009), YACTAYO et al. (2009), WEAVER AND FORRESTER (2015), MORRISON
(2014), COUDERC AND LECUIT (2015), DEEBA et al. (2016).
14
3.4 RNA-seq: Análise Transcriptômica de Alto Rendimento (HTS)
RNA-seq é uma metodologia de sequenciamento de alta performance (high throughput
sequencing, HTS), em que uma biblioteca de cDNAs é construída a partir de fragmentos de
mRNA retirados de amostras biológicas, caracterizando o transcriptoma daquela célula ou
tecido (GRIFFITH et al., 2015; WANG et al., 2009). Atualmente seu uso está bem difundido
em diversas áreas, especialmente no que diz respeito a interação entre o agente responsável
por determinada enfermidade e seu hospedeiro (ver WESTERMANN et al., 2012;
WESTERMANN et al., 2016).
Muito tem contribuído para a ampla distribuição que essa metodologia tem obtido em
diversas áreas das ciências biológicas e biomédicas, principalmente o desenvolvimento de
sequenciadores cada vez mais avançados, chamados na literatura por Next Generation
Sequencing (NGS), os quais possuem a capacidade de ler a informação genética das
diferentes bibliotecas de cDNA em paralelo e de forma maciça, liberando tais leituras (reads)
de forma acurada e eficiente (KHATOON et al., 2014; NOWROUSIAN, 2010; WEBER et
al., 2007).
Desta forma, esta tecnologia de sequenciamento e análise transcriptômica possui
vantagens sobre aquelas ainda muito utilizadas, como os microarrays (microarranjos) e ESTs
(Expressed Sequence Tags), dentre as quais a alta qualidade de leitura dos transcritos (reads),
redução de replicatas técnicas em experimentos e uma quantificação rápida e acurada
(AGARWAL et al., 2008).
No entanto, é preciso destacar uma qualidade específica inerente à metodologia de
RNA-seq, a identificação de novas isoformas, splicing alternativo, que possam existir, logo,
variação genética nas amostras sequenciadas além de quantificação de expressão das mesmas
(ROBERTS et al., 2011; TRAPNELL et al., 2010).
Portanto, esta metodologia está amadurecida, com ferramentas computacionais e
estatísticas bem estabelecidas (GARBER et al., 2010; PERTEA et al., 2016; TRAPNELL et
al., 2013), além de um custo menor a cada ano (COSTA-SILVA et al., 2017), fornecendo
quantidades maciças de informação genética de alta qualidade (MARTIN et al., 2013; WANG
et al., 2009).
15
3.3 GSEA - Gene Set Enrichment Analysis
Uma abordagem para interpretar perfis de expressão gênica baseada em anotações
funcionais de genes diferencialmente expressos (por exemplo, advindos do DESeq2). É útil
para buscar por respostas, por exemplo, se os genes diferencialmente expressos obtidos na
análise de DESeq2 estão associados à certos processos biológicos (GO), vias (KEGG,
Immunological MsigDB) ou funções moleculares.
Além disso, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (Subramanian et al., 2005) –
também chamada de enriquecimento funcional – é uma abordagem, um método para
identificar classes de genes que estão sobre representados em um grande conjunto de genes, e
estão associados a assinaturas biológicas, processos particulares e fenótipos.
O que a metodologia GSEA, desenvovida por Subramanian et al. (2005), faz é agregar
a estatística per gene através genes inseridos em um conjunto (set), portanto tornando possível
detectar situações onde todos os genes em um conjunto pré-definido se modifica em uma
forma sutil mas coordenada. Por ser provável que muitas diferenças fenotípicas relevantes
sejam manifestadas por alerações pequenas, mas consistentes, em um conjunto de genes.
Dentre estes bancos de dados de anotações, destacam-se aqueles os quais utilizam
termos de ontologia, ou seja, Gene Ontology (GO). Este último o faz de acordo com um
dicionário de termos de anotação. Logo, a lista de genes diferencialmente expressos (DE)
obtidos através de metodologia de RNA-seq são comparados à tais bancos de dados de
termos. Os termos GO contabilizados como positivos com maior frequência naquela lista de
genes DE são chamados de sobrerrepresentados (over-representing) ou enriquecidos
(enriched). Daí a nomenclatura deste tipo de análise, tal qual GSEA.
Um desses bancos de dados de anotações de termos, vias biológicas, é o Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Apesar de ser menor que GO, este é um banco
de dados curado de vias moleculares e assinaturas biológicas de doenças. Desta forma,
constitui uma outra importante ferramenta de análises para a abordagem GSEA.
GSEA testa para enriquecimento de alguns grupos S entre genes de background N. Os
genes são classificados de acordo com seus fenótipos. Dado um conjunto de genes S definidos
a priori (por exemplo, genes compartilhando uma mesma categoria), o objetivo de GSEA é
determinar se os membros de S estão distribuídos aleatoriamente através de uma lista de
genes ranqueados (L) ou primariamente encontrados no topo ou no fim da mesma.
16
Cálculo do Enrichment Score (ES), ou seja, o escore de enriquecimento. Este ES
representa o grau no qual um conjunto S está sobre-representado (over-represented) no topo
ou no final de uma lista ranqueada (L), incrementando a soma estatística quando se encontra
um gene em S e diminuindo quando não há sua presença. A magnitude do incremento
depende da estatística do gene (correlação do gene com o fenótipo). O ES é o máximo desvio
de zero encontrado em uma passagem aleatória; corresponde a uma estatística weighted
Kolmogorov-Smirnov-like (SUBRAMANIAN et al., 2005).
17
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Obtenção de Amostras de RNA e Preparação para Sequenciamento
Amostras de sangue total foram obtidas de 35 doadores 400 dias após o início dos sintomas.
Essas amostras foram armazenadas em TempusTM Blood RNA Tubes (Invitrogen TM) para
extração subsequente.
Estas amostras foram obtidas com vistas à realização de transcriptômica utilizando
dados HTS (RNA-seq) destes indivíduos, no Instituto de Medicina Tropical (IMT) da UFRN.
Os resultados de análise de RNA-seq estão, atualmente, submetidos em PLoS Pathogens.
Portanto, neste trabalho, somente foram utilizadas as tabelas de genes DE obtidos por
DESeq2 desenvolvida para linguagem R (Bioconductor) (LOVE; HUBER; ANDERS, 2014),
as quais serviram de entrada para análise GSEA de enriquecimento funcional dos genes. Para
gerar cada tabela, contrastes específicos foram feitos (Tabela 1). O grupo nomeado de
Controles foi utilizado como parâmetro de controle para análise de genes DE.
Os doadores foram classificados segundo seguinte nomenclatura:
1. CHIKV – afetados por febre chikungunya (n=4); recuperados da doença (n=6);
2. ZIKV – indivíduos que foram afetados por vírus Zika (n=4). Doadores de mostras
após 400 dias do início dos sintomas (i.e., recuperados da febre zika).
3. GBS – indivíduos que desenvolveram a síndrome de Guillain-Barré. Classificados em
GBS doentes (n=6), i.e., cujas amostras de sangue total foram retiradas no momento
em que os indivíduos ainda estavam com GBS; GBS recuperados (n=9), i.e.,
recuperados da doença.
4. Controles – doadores brasileiros que não entraram em contato com ambos os vírus,
uma vez que residiam fora do país durante o surto das respectivas doenças (n = 6).
18
Figura 1. Resumo da metodologia de análise utilizada neste trabalho.
1) Arquivos .fastq foram obtidos a partir do sequenciamento, contendo os dados do RNA-seq. 2)
HISAT2 foi utilizado para mapeamento das reads. 3) Arquivos .bam (alinhamento) obtidos a partir do
mapeamento foram utilizados para quantificação de genes expressos em cada amostra através da
função featureCounts (Subread package), gerando uma tabela de contagem de genes. 4) Esta tabela
obtida com uso de featureCounts foi utilizada para análise de DE de genes por DESeq2 (R,
Bioconductor). DESeq2 produz tabelas de genes diferencialmente expressos para cada contraste
utilizado (ver Tabela 1). Nenhum cutoff quanto aos genes DE foi feito durante uso de DESeq2 para
produção das tabelas DE. 5) Os dados brutos de genes DE contidos nas tabelas geradas por DESeq2
foram usados como entrada para análise GSEA , cuja execução se deu utilizando o pacote fgsea da
linguagem R. A abordagem GSEA utiliza algoritmo que elencará os genes DE e os associará às vias
MSigDB aqui utilizadas.
Tabela 1 – Contrastes realizados para obtenção de tabelas de genes DE utilizando DESeq2.
Contraste Análise de genes DE por DESeq2
1 GBS (recuperados) Vs ZIKV
2 GBS (doentes) Vs ZIKV
3 GBS (doentes) Vs GBS (recuperados)
4 CHIKV (doentes) Vs CHIKV (recuperados)
19
4.2 Extração de RNA viral
Para a extração do RNA viral das amostras de sangue, foi utilizado o QIAamp Viral
RNA Mini Kit (QIAGEN) seguindo o protocolo sugerido pela fabricante. Utilizando uma
cabine de segurança biológica foi adicionado em cada microtubo de 1,5 mL, 560 µL do
tampão AVL, 5,6 µL do RNA transportador e 140 µL do material biológico retirado do
freezer -70 oC. Os microtubos foram agitados em vortex e incubados em temperatura
ambiente por 10 minutos. Após a adição de 560 µL de etanol 96 – 100%, os microtubos foram
novamente agitados no vortex. Em seguida, 630 µL da solução do tubo foi posta na
minicoluna QIAamp e centrifugada a 8000 rpm por 1 minuto. As colunas foram então
transferidas para novos tubos coletores e repetiu-se o processo de adição de solução e
centrifugação. A coluna foi transferida para um novo tubo de 2 mL, onde foi adicionado 500
µL do tampão AW1 seguido de uma noca centrifugação à 8000 rpm durante 1 minuto. A
coluna foi transferida para um novo tubo de 2 mL onde foi adicionado 500 µL e submetida
novamente a centrifugação à 14000 rpm durante 3 minutos. As colunas foram novamente
transferidas para um microtubo de 1,5 mL onde foi adicionado 60 µL de tampão AVE seguido
de uma incubação à temperatura ambiente e subsequente centrifugação à 8000 rpm por 1
minuto. Por fim, os microtubos contendo o RNA extraído foram estocados em um congelador
com temperatura de -20 oC.
4.3 qRT-PCR para CHIKV
A qRT-PCR foi realizada como descrito por LANCIOTTI e colaboradores (2007),
utilizando o kit TaqMan FAST Virus 1 Step Master Mix (Applied Biosystems, Bleiswijk,
Noruega). Para a realização da qRT-PCR foram utilizados 0,4 µL de cada um dos iniciadores
para CHIKV (Tabela 2) na concentração de 500 nM; 0,4 µL da sonda à 100 nM; 11,3 µL de
ddH2O; acrescido de 5 µL do RNA da amostra. Para os ciclos no termociclador, foi
selecionada uma programação de 95 oC durante 3 minutos para a Ativação da enzima e
desnaturação do RNA, seguido de 60 oC durante 30 minutos para o processo de anelamento
dos iniciadores e extensão da cadeia; durante 40 ciclos.
20
Tabela 2: Informação da sequência de iniciadores utilizados para o ensaio de
qRT-PCR.
Iniciador Posição no genoma* Sequência
Primer CHIKV 6856F 6856–6879 TCACTCCCTGTTGGACTTGATAGA
Primer CHIKV 6981R 6981–6956 TTGACGAACAGAGTTAGGAACATACC
Sonda CHIKV 6919P 6919–6941 AGGTACGCGCTTCAAGTTCGGCG
*Tendo como base a sequência para a cepa NC_004162 (NCBI ID).
4.4 Extração de RNA Total e Sequenciamento
A amostra de sangue foi armazenada em tubos TempusTM Blood RNA Tube
(InvitrogenTM) e mantida congelada até o processamento. A extração do RNA foi realizada
utilizando o Kit TempusTM Spin RNA Isolation Kit, de acordo com o protocolo proposto
pelo fabricante. A qualidade do RNA foi checada utilizando o espectrômetro NanoDrop
(NanoDrop Technologies), Agilent Bioanalyzer (RNA Nano Chip, Agilent) e também pelo
Qubit 2.0/3.0 fluorimétro. As bibliotecas de RNA isolados foram sequenciadas utilizando a
plataforma Illumina HiSeq 4000 (Illumina Inc.).
4.5 Mapeamento de reads
A reads sequenciadas e armazenadas nos arquivos .fastq foram submetidas a uma
etapa de mapeamento ao genoma humano, por meio do programa HISAT2 (KIM;
LANGMEAD; SALZBERG, 2015) e utilizando o genoma humano (build 38 patch 7) obtido
no repositório do Ensembl (ZERBINO et al., 2018). Para o mapeamento, o HISAT2 foi
configurado para rodar com paired-end reads e com os parâmetros padrões. Para identificar a
quantidade de reads mapeadas em cada uma das regiões gênicas foi utilizado o programa
FeatureCounts v1.5.2 (LIAO; SMYTH; SHI, 2014), habilitando a contagem das reads
mapeadas em múltiplos locais, resultando na tabela de contagens para cada uma das
bibliotecas.
4.6 Mapeamento e Montagem de Genoma CHIKV
As reads não mapeadas ao genoma humano passaram por um novo processo de
mapeamento, dessa vez pelo software BWA (LI; DURBIN, 2009), utilizando o genoma de
CHIKV como referência (NC_004162.2). As reads de todas as replicatas técnicas foram
concatenadas em um único arquivo respectivo a sua biblioteca, e o BWA foi executado no
21
modo single end. O Samtools foi utilizado para a checagem das bibliotecas que apresentaram
reads para CHIKV. Uma vez que houve a identificação das bibliotecas com reads para
CHIKV, as que se apresentaram positivas foram submetidas ao processo de montagem de
novo guiada por genoma de referencia utilizando o Trinity v2.8.5 (HAAS et al., 2013). Nessa
abordagem, após a primeira etapa, o Trinity utiliza as reads mapeadas ao genoma de CHIKV e
desempenha uma montagem de novo especificamente sobre elas. O método permite uma
melhor detecção de variações estruturais contidas no organismo sequenciado.
4.7 GSEA - Gene Set Enrichment Analysis
Neste trabalho utilizou-se a metodologia de análise de enriquecimento de genes GSEA
(Gene Set Enrichment Analysis) através do Molecular Signatures Database (Subramanian et
al., 2005). Este banco de dados possui uma coleção de conjuntos de genes dividos por
categorias. Os genes neste banco de dados representam assinaturas biológicas, processos
particulares e fenótipos.
Para as análises, foram selecionadas três coleções de anotações de genes:
H – Hallmark gene sets, são assinaturas coerentemente expressas de estados biológicos e
processos bem definidos. Estes dados são gerados no MsigDB através de uma metodologia
computacional baseada na identificação e sobreposição entre conjuntos de genes em outras
coleções deste banco de dados, além de retenção de genes que exibem expressão
coordenadada (LIBERZON et al., 2015).
C2 – Curated gene sets, os quais podem ser de vias canônicas ou perturbações químicas e
genéticas. Optou-se por seleção de vias canônicas (anotações KEGG).
C5 – GO gene sets, especificamente sob a categoria Biological Process (BP).
Além disso, os contrastes utilizados nas análises de DE utilizando DESeq2 foram:
Como dito anteriormente, as tabelas de genes DE gerados através destes contrastes
serviram de entrada para análises GSEA utilizando o pacote fgsea (SERGUSHICHEV,
2016)(R, Bioconductor) (ver Figura 1 e Tabela 1).
Os códigos utilizados em DESeq2 e fgsea estão disponibilizados no GitHub
(https://github.com/washingtoncandeia/DESeq_IMT/).
22
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram feitas análises de expressão gênica global, cujos dados foram obtidos a partir de
sequenciamento de amostras de RNA retiradas dos indivíduos. As amostras que foram
enviadas para o sequenciamento (RNA-seq) consistiam em sujeitos que apresentaram a
Síndrome de Guillain-Barré (n = 15), além daqueles infectados por vírus Zika (n = 4), e
CHIKV (n=10), além de controles externos (n = 6). As reads obtidas a partir do
sequenciamento foram utilizadas para contabilização de genes (DE), utilizando para este fim o
pacote DESeq2 (R, Bioconductor) (Love et al., 2014). A tabela de contagem resultante foi
utilizada para obter contrastes estatísticos entre as condições:
Com vistas a resgatar informações acerca dos tipos de processos biológicos nos quais
os genes, obtidos nas contagens por DESeq2, estariam envolvidos, utilizou-se o algorítmo
GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) (Subramanian et al., 2005; Mootha et al., 2003),
implementado no pacote de linguagem R, fgsea (Sergushichev, 2016). O banco de dados
utilizado para a análise GSEA é o MsigDB (Molecular Signatures Data Base) (Liberzon et al.,
2011; Liberzon et al., 2015), cujos conjuntos de genes nas suas coleções são usados para
comparação com a lista de genes obtida durante análise de expressão diferencial usando
DESeq2 (Figura 2).
Figura 2. Metodologia de uso de GSEA. Os dados expressão diferencial gerados por DESeq2 são
utilizados como entrada no software fgsea (R, Bioconductor). O conjunto de genes do banco de dados
MSigDB é inserido na análise, sendo utilizado para comparação. Esse conjunto de genes está contido
em uma das três coleções (H, C2 e C5).
23
Figura 3. Principal Componet Analysis (PCAs) de contrastes utilizados neste trabalho. A –
GBS (recuperados) x ZIKV; B – GBS (doentes) x ZIKV; C – GBS (doentes) x GBS
(recuperados); D – CHIKV (doentes) x CHIKV (recuperados).
Análises de expressão diferencial realizadas com intuito de fornecer lista de genes DE
(DESeq2) foram realizadas. Os contrastes aqui designados forneceram tais tabelas de genes
DE para entrada em fgsea. Método estatístico Principal Component Analysis (PCA) foi
aplicado a cada um dos constrastes com vistas a observar a dispersão dos dados de forma a
realçar semelhanças ou diferenças entre os indivíduos (Figura 3). Em A, como se tratam de
dois grupos muito próximos, uma vez que ambos recuperaram-se de GBS e ZIKV
respectivamente, os grupos são pouco definidos. Alguns grupos ficam evidentes, como em B-
GBS (doentes) x ZIKV; e D-CHIKV (doentes) x CHIKV (recuperados), principalmente
quando se observa que os controles (CTL) também se agrupam em um grupo próprio. Isso
evidencia que tais grupos estão bem definidos quanto aos seus fenótipos moleculares
(DRAWNEL et al., 2017).
A
B
C D
24
Os dados iniciais de GSEA são aqueles correspondentes à coleção Hallmark, cujos
conjuntos de genes representam estados e processos biológicos bem definidos, obtida por
sobreposição de conjuntos de genes de outras coleções MSigDB. Sendo assim, é possível
observar que o contraste 1 (GBS (recuperados) Vs ZIKV) possuem genes upregulados (padj <
0.05; NES > 0) correspondentes à vias no conjunto de genes cujo Normalized Enrichment
Score (NES, Escore Enriquecido Normalizado) indica que o esse conjunto gênico
representado nesta Halmmark será representado no topo da lista de genes DE inseridos
durante a análise (Figura 4).
Na lista Halmmark deste contraste 1 (Figura 3) vê-se genes conjunto gênico desta
coleção correspondente à Mitotic Spindle (Hallmark_Mitotic_Spindle), caracterizando-se com
em estado upregulado (NES >0). BULLERDIEK et al. (2016) levantam hipótese de efeito
teratogênico gerado por ZIKV (microcefalia e desenvolvimento do olho, como
corioretinopatia bilateral), cujo interação com hospedeiro pode afetar a correta formação do
fuso mitótico (mitotic spindle).
É possível observar na figura 3, diversas vias imunes, inflamatórias e de sinalização
celular downreguladas (NES<0, mais abaixo na lista), isto é, os genes mais expressos são
aqueles relativos a outra condição neste contraste (ZIKV, i.e., pessoas que foram infectadas
por vírus Zika). Isso se deve, possivelmente, ao estágio em que os indivíduos neste contraste
se encontram, isto é, em processo de remissão de GBS. Ambos, ZIKV e GBS recuperados,
estão há cerca de 400 dias do início da infecção, ou seja, em estado recuperado. Pportanto,
tais vias gênicas apresentam expressão diferencial no sentido de recuperar processos celulares
e crescimento de tecidos (ver Quadros 1 e 5). Sendo assim, as vias downreguladas equivalem
àquelas que diminuem sua atividade conforme a ameaça ao hospedeiro é debelada. Dentre as
vias downreguladas observadas na Figura 3, destaca-se Interferon Gamma Response
(HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE). Isso indica que há uma diminuição
de atividade celular (Th1 CD4+ e T CD8+) do sistema imune, o que está de acordo co o fato
de que a infecção (processos e mecanismos relativos ao hospedeiro contra o vírus) está
debelada (ABBAS et al., 2015). Além disso, SERMAN AND GACK (2019) observaram que
ZIKV possui mecanismos moleculares que o ajudam a evadir-se da resposta a IFN-I.
25
Figura 4. Hallmark. Contraste 1, GBS (recuperados) Vs ZIKV. A partir do banco de dados MsigDB,
utilizando a coleção de genes hallmark, obtidas na análise de enriquecimento de conjunto de genes
(GSEA) para o contraste GBS entre pacientes que desenvolveram GBS após infecção, mas
recuperaram-se após certo tempo versus recuperados de ZIKV. Estes genes representam estados ou
processos biológicos bem definidos, cujos conjuntos de genes foram gerados por uma metodologia
computacional baseada na identificação de sobreposições entre conjuntos de genes em outras coleções
MSigDB e na retenção de genes que exibem expressão coordenada. Logo, representam conjuntos de
genes que estão agindo de forma coordenada e têm relação na assinatura biológica ou processos
(halmarks, segundo MsigDB). Em azul, aqueles cujos padj < 0.05. Vias cujo NES < 0 indicam
processos downregulados. NES > 0, processos uprregulados.
26
Portanto, esse mecanismo pode não ser tão efetivo contra essa infecção viral,
permitindo ao vírus circular nos organismos dos indivíduos recuperados da febre zika durante
este longo tempo. Desta forma, isso poderia explicar – em parte – o porquê de, mesmo após
cerca de um ano de recuperação de febre zika, estes indivíduos apresentarem algumas vias
diferencialmente expressas em relação à ação viral.
Em comparação com estes resultados, pode-se observar aqueles relativos ao contraste
2 (GBS doentes Vs ZIKV). Neste, é possível observar que vias gênicas no topo (NES>0) – ou
seja, uprreguladas –, estão relacionados às vias de sinalização celular, e algumas vias de
resposta imunológica (Figura 5). Porém, observam-se outras vias relativas ao sistema imune
também downreguladas. Isso se deve provavelmente ao estado de remissão de GBS além de
febre zika, acarretando na manutenção de algumas vias de defesa (inflamatórias e do sistema
imune inato), possivelmente devido a circulação de vírus no organismo mesmo durante esta
fase de remissão. Ao observar os quadros 2 (C2, canonical pathways, KEGG) e 6 (C5, GO
biological process), é possível observar que muitas vias enriquecidas para genes uprregulados
estão relacionadas à processos celulares, crescimento de tecidos, diferenciação neuronal; já
para aquelas relativas a genes downregulados, encontram-se biogênese de ribossomos,
ubiquitinação de proteínas, iniciação da tradução viral (ver quadro 6). Estas observações
corroboram com um fenótipo de recuperação e reconstrução tecidual, porém, ainda em estado
de defesa contra o hospedeiro viral através de estado inflamatório em menor intensidade.
BARROWS et al. (2019) afirmam que há milhares de fatores celulares do hospedeiro
requeridos para sustentar a infecção por flavivírus (tais quais vírus dengue, febre amarela e
ZIKV), e com vistas a testar alguns desses fatores, estudaram fatores do hospedeiro
requeridos para infecção eficientes por estes flavivírus, os quais eram proteínas componentes
do complexo proteico da membrana do retículo endoplasmático humano (EMC, endoplasmic
reticulum membrane protein complex), as quais possuem papéis na biogênese de proteínas e
metabolismo de lipídeos. Os autores demonstraram que infecções de vírus dengue, febre
amarela e ZIKV eram inibidas naquelas células cujos ECMs estavam ausentes.
27
Figura 5. Hallmark. Contraste 2, GBS (doentes) Vs ZIKV. A partir do banco de dados MsigDB,
utilizando a coleção de genes hallmark, obtidas na análise de enriquecimento de conjunto de genes
(GSEA) para o contraste GBS entre pacientes que desenvolveram GBS após infecção, com coleta de
amostra ainda durante manifestação de GBS (doentes) versus recuperados de vírus zika (ZIKV). Estes
genes representam estados ou processos biológicos bem definidos, cujos conjuntos de genes foram
gerados por uma metodologia computacional baseada na identificação de sobreposições entre
conjuntos de genes em outras coleções MSigDB e na retenção de genes que exibem expressão
coordenada. Logo, representam conjuntos de genes que estão agindo de forma coordenada e têm
relação na assinatura biológica ou processos (halmarks, segundo MsigDB). Em azul, aqueles cujos
padj < 0.05. Vias cujo NES < 0 indicam processos downregulados. NES > 0, processos uprregulados.
28
Isso indica que estes vírus requerem tais fatores do hospedeiro para seu
desenvolvimento. Além disso, estes autores descobriram um importante papel exercido por
EMC na infecção por ZIKV: este complexo é requerido para acumulação de proteínas virais
nas linhagens celulares que abrigam um replicon de ZIKV, indicando a participação de ECM
na biogênese proteica de ZIKV. São vias gênicas deste tipo que estão diferencialmente
expressas no contraste 2, principalmente downreguladas (indicando expressão diferenciada na
condição ZIKV e não em GBS doentes.
No entanto, ao se comparar as fases GBS doentes e GBS recuperados (Figura 6) é
possível observar um fenótipo diferente em relação àqueles anteriores de GBS recuperados e
ZIKV. Aqui, é possível observar que as vias que abrigam genes mais diferencialmente
expressos, em sentido de maior expressão (uprregulados), são aquelas relacionadas ao sistema
imune inato (hallmark_interferon_alpha_response, hallmark_interferon_gamma_response),
complemento (hallmark_complement) e inflamação (hallmark_TNFa_singnaling_via_NFĸB).
Por sua vez, a única via apresentada como downregulada na figura 6 é aquela relacionada a
TGF-β, relacionada a efeitos de controle de proliferação celular e reparo tecidual (ABBAS et
al., 2015) . Além disso, é possível observar diversas vias de sinalização celular, transdução de
sinais (Quadro 3), além de processos biológicos de neurogênese (go_neurogenesis), resposta
do hospedeiro (GO_defense_response), processos do sistema nervoso
(GO_nervous_system_process), todos uprregulados. (Quadro 7).
29
Figura 6. Hallmark. Contraste 3, GBS (doentes) x GBS (recuperados). A partir do banco de dados
MsigDB, utilizando a coleção de genes hallmark, obtidas na análise de enriquecimento de conjunto de
genes (GSEA) para o contraste GBS entre pacientes que desenvolveram GBS após infecção versus
amostras de GBS recuperados da doença. Estes genes representam estados ou processos biológicos
bem definidos, cujos conjuntos de genes foram gerados por uma metodologia computacional baseada
na identificação de sobreposições entre conjuntos de genes em outras coleções MSigDB e na retenção
de genes que exibem expressão coordenada. Logo, representam conjuntos de genes que estão agindo
de forma coordenada e têm relação na assinatura biológica ou processos (halmarks, segundo MsigDB).
Em azul, aqueles cujos padj < 0.05. Vias cujo NES < 0 indicam processos downregulados. NES > 0,
processos uprregulados.
30
Porém, a partir daqui, baseando-se nos três primeiros contrastes realizados envolvendo
ZIKV, GBS recuperados e GBS doentes, é possível observar que há diferentes fenótipos
observáveis.
1. Contraste 1 (GBS rec x ZIKV) – menor inflamação; homeostase.
2. Conraste 2 (GBS doentes x ZIKV) – inflamação intermediária;
3. Contraste 3 (GBS doentes x GBS rec) – inflamação elevada;
Tais fenótipos são condizentes com as observações de cada uma destas doenças, na
literatura (para revisão, consultar (AAGAARD et al., 2017; ADAMS WALDORF et al.,
2018; ANAYA et al., 2016; BAILEY et al., 2018; BARROWS et al., 2019; BERRY et al.,
2019; BORDONI et al., 2019; CHIEN et al., 2019; DE PAULA GUIMARÃES et al., 2019;
DEVHARE et al., 2017; ESTRIDGE; ISKANDER, 2015; KURSCHEIDT et al., 2019;
MANESS et al., 2019; MUSSO et al., 2018; MUSSO; KO; BAUD, 2019; VAN DUIJL-
RICHTER et al., 2015; WEILG et al., 2018; WHITE et al., 2016; WILDER-SMITH et al.,
2019; YARRINGTON et al., 2019; YI; PIMENTEL; PACHTER, 2017; YUN; LEE, 2017).
31
Figura 7. Hallmark. Contraste 4, CHIKV (doentes) x CHIKV (recuperados). A partir do banco de
dados MsigDB, utilizando a coleção de genes hallmark, obtidas na análise de enriquecimento de
conjunto de genes (GSEA) para o contraste CHIKV entre pacientes detectados com CHIKV (fase
aguda da doença) versus recuperados de CHIKV (amostras retiradas ~ 400 dias após febre
chikungunya). Estes genes representam estados ou processos biológicos bem definidos, cujos
conjuntos de genes foram gerados por uma metodologia computacional baseada na identificação de
sobreposições entre conjuntos de genes em outras coleções MSigDB e na retenção de genes que
exibem expressão coordenada. Logo, representam conjuntos de genes que estão agindo de forma
coordenada e têm relação na assinatura biológica ou processos (halmarks, segundo MsigDB). Em
azul, aqueles cujos padj < 0.05. Vias cujo NES < 0 indicam processos downregulados. NES > 0,
processos uprregulados.
32
Quadro 1. Contraste 1, GBS (recuperados) Vs ZIKV, categoria MSigDB C2 (canonical
pathways, KEGG). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e downrregulados (30,
valores NES negativos).
33
Quadro 2. Contraste 2, GBS (doentes) Vs ZIKV, categoria MSigDB C2 (canonical pathways,
KEGG). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e downrregulados (30, valores
NES negativos).
34
Quadro 3. Contraste 3, GBS (doentes) Vs GBS (recuperados), categoria MSigDB C2
(canonical pathways, KEGG). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e
downrregulados (30, valores NES negativos).
35
Quadro 4. Contraste 4, CHIKV (doentes) Vs CHIKV (recuperados), categoria MSigDB C2
(canonical pathways, KEGG). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e
downrregulados (30, valores NES negativos).
36
Quadro 5. Contraste 1, GBS (recuperados) Vs ZIKV, categoria MSigDB C5 (GO biological
process). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e downrregulados (30, valores
NES negativos).
37
Quadro 6. Contraste 2, GBS (doentes) Vs ZIKV, categoria MSigDB C5 (GO biological
process). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e downrregulados (30, valores
NES negativos).
38
Quadro 7. Contraste 3, GBS (doentes) Vs GBS (recuperados), categoria MSigDB C5 (GO
biological process). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e downrregulados (30,
valores NES negativos).
39
Quadro 8. Contraste 4, CHIKV (doentes) Vs CHIKV (recuperados), categoria MSigDB C5
(GO biological process). Listas de genes uprregulados (30, valores NES positivos) e
downrregulados (30, valores NES negativos).
40
A – CONTRASTE 1, UP (C2, KEGG). B – CONTRASTE 2, UP (C2, KEGG)
C – CONTRASTE 3, UP (C2, KEGG) D – CONTRASTE 4, DOWN (C2, KEGG)
Figura 8. Principais vias GO KEGG (MSigDB, C2) obtidas na análise de enriquecimento de conjunto
de genes (GSEA) para o contraste entre pacientes que desenvolveram GBS após infecção
(recuperados) versus ZIKV. A) indica a via na qual os genes upregulados para GBS (recuperados)
versus ZIKV apresentam-se em declínio ao se obserar os dois pacientes que desenvolveram GBS após
ZIKV. B) GBS (doentes) Vs ZIKV e C) GBS (doentes) Vs GBS (recuperados); e D) CHIKV (doentes)
Vs CHIKV (recuperados). Nota-se que a via KEGG AXON GUIDANCE está uprregulada em GBS
doentes (B); levemente uprregulda em GBS (recuperados) (A) e GBS (doentes) Vs GBS (recuperados).
A mesma via não está consistente em D (CHIKV doentes X CHIKV recuperados).
O envolvimento neurológico pôde ser captado em algumas via, a exemplo daquela
observada na Figura 8. Isso indica que, possivelmente, o vírus continua a influenciar
processos biológicos nos hospedeiros após nove meses passados do início da infecção para
aqueles indivíduos afetados por ZIKV, os quais desenvolveram GBS, enquanto estas vias de
desenvolvimento neuronal iniciam seu declínio, possivelmente em direção à normalidade,
após a recuperação de GBS. Como comparação, é possível observar que a mesma via não está
consistente para CHIKV, o que corrobora com o fato de que este alfavírus não possui relatos
consistentes de casos onde ocorra envolvimento neuronal, embora alguns autores discutam
41
que mesmo CHIKV possa levar a consequências neuronais (SCHWARTZ AND ALBERT,
2010).
Estes fenótipos observados através destas vias são corroborados na literatura, uma vez
que é sabido que o ZIKV possui envolvimento neuronal (ANAYA et al., 2016; MIER-Y-
TERAN-ROMERO et al., 2018; WALDORF et al., 2018; WHITE et al., 2016).
Os resultados obtidos indicam que as principais vias obtidas a partir de termos de
Gene Ontology (GO) de processos biológicos (GO, Biological Process) estão envolvidas
principalmente no desenvolvimento, sistema imune, estruturas celulares, no que diz respeito
as análises entre GBS (doentes) versus ZIKV (recuperados) (ver Quadros 5 - 8).
Os resultados tanto de vias KEGG quanto GO (Biological Process) indicam que genes
de desenvolvimento, tais quais Sonic Hedgehog e Wnt, possuem maior nível de expressão
(upregulated) durante GBS (recuperados), como visto no quadro 1, representando contraste 1,
GBS (recuperados) Vs ZIKV. A expressão de genes nestas vias pode estar se elevando (como
é o caso de Sonic Hedgehog), devido a estes genes se caracterizarem como essenciais para
desenvolvimento, i.e., construção e reconstrução (DORUS et al., 2006). Nesta fase de
arrefecimento da doença estes genes possuem nível de expressão detectado como elevado em
relação a controles possivelmente devido à menor atividade de outros genes ativos durante a
fase de doença. É possível ver no quadro 2 (GBS doentes Vs ZIKV) que a mesma via para
Sonic Hedgehog não se possui expressão tão elevada, possivelmente diminuindo conforme a
evolução para cura da síndrome e arrefecimento da febre zika.
42
6 CONCLUSÃO
1. Através de abordagem GSEA fenótipos puderam ser diferenciados.
2. Contraste 1 (GBS rec x ZIKV) – menor inflamação; homeostase.
3. Conraste 2 (GBS doentes x ZIKV) – inflamação intermediária;
4. Contraste 3 (GBS doentes x GBS rec) – inflamação elevada;
5. Contraste 4 (CHIKV doentes x CHIKV recuperados:
6. O uso de enriquecimento de genes é eficaz em fornecer insights acerca de
características fenotípicas destas infecções (ZIKV, CHIKV), além de GBS.
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