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Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas Curso de Mestrado Wógenes Nunes de Oliveira Avaliação da atividade citotóxica in vitro do óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) frente ao câncer de pele Natal – RN 2019
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Curso de Mestrado
Wógenes Nunes de Oliveira
Avaliação da atividade citotóxica in vitro do óleo de rã-touro (Rana
catesbeiana Shaw) frente ao câncer de pele
Natal – RN
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Curso de Mestrado
Wógenes Nunes de Oliveira
Avaliação da atividade citotóxica in vitro do óleo de rã-touro (Rana
catesbeiana Shaw) frente ao câncer de pele
Dissertação apresentada à Coordenação
do Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas como requisito
para a obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
Co-Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
Natal – RN
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas – SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Oliveira, Wógenes Nunes.
Avaliação da atividade citotóxica in vitro do óleo de rã-touro
(Rana catesbeiana Shaw) frente ao câncer de pele / Wógenes Nunes de Oliveira. - 2019.
51f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2019.
Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. Coorientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
1. Câncer de pele - Dissertação. 2. Melanoma - Dissertação. 3.
Óleo de rã-touro - Dissertação. I. Egito, Eryvaldo Sócrates
Tabosa do. II. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. III. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 615.015:616-006
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474
DEDICATÓRIA
Ao meu avô Domício Costa e aos meus pais
Washington Luiz e Eliana Rosa.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus e aos meus Guias que estiveram ao meu lado durante
toda a caminhada, agradeço por toda força, paciência e energias positivas.
Aos meus pais Eliana e Washington por todo amor, cuidado e atenção. Por
compreenderem meus sonhos e sempre me apoiarem.
Às minhas irmãs Poliana e Gabriela por me estimularem a seguir em frente e
por todos os momentos de conversas e risadas compartilhadas.
Ao meu supervisor e amigo Lucas Machado por estar sempre ao meu lado, por
todos os conselhos, paciência e ensinamentos. Foi uma caminhada bem difícil
e desgastante, sua ajuda e apoio em todos os momentos foram essenciais
para que eu chegasse até aqui. Você é um ser humano maravilhoso. Obrigado.
Aos amigos Aretha Maria, Alan Victor, Nadyellen Valle, Matheus Lacerda,
Jhonny Lucas, Guilherme Alves e Augusto Silva pelo apoio e paciência. Alguns
de perto e outros bem longe, mas todos vocês sempre estiveram ao meu lado
me apoiando.
À toda equipe do Laboratório de Sistemas Dispersos pelo apoio, especialmente
a Henrique Marcelino.
Aos amigos que conheci na Sala de Cultura de Células: Ana Katarina, Wladimir
Sabino, Jefferson Barbosa e Janine França. Obrigado por todos os momentos
de felicidade e energias positivas compartilhadas.
Ao meu orientador Prof. Dr. E. Sócrates T. do Egito por todo conhecimento,
orientação e por tornar possível a realização desse trabalho.
Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Hugo Alexandre por todo apoio, disponibilidade
e suporte oferecido durante a realização desse trabalho.
EPÍGRAFE
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo
não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis."
(José de Alencar)
RESUMO
O óleo de rã-touro (OR) é um óleo animal obtido a partir do reaproveitamento
biotecnológico do tecido adiposo do anfíbio Rana catesbeiana Shaw e que
apresenta biocompatibilidade frente à fibroblastos murino (3T3) e toxicidade em
células de melanoma murino (B16F10). Baseado nisso e na atual necessidade
de novas alternativas de tratamento contra o melanoma, esse trabalho teve
como objetivo avaliar a potencial atividade citotóxica in vitro do OR in natura
frente à linhagem celular de melanoma humano A2058. Assim, foram
realizados os ensaios de avaliação da atividade mitocondrial (MTT), ciclo
celular e morte celular para avaliar o atividade citotóxica do OR, enquanto que
o potencial apoptótico foi investigado por meio da avaliação de alterações na
morfologia celular, pelo potencial de membrana mitocondrial e avaliação da
indução de estresse oxidativo. Os resultados obtidos demonstram que o OR
(100 µg/mL) após 72 horas foi capaz de reduzir a atividade mitocondrial em 40
± 9 % no ensaio de MTT. Adicionalmente, no ensaio de morte celular foi
verificado que a citotoxicidade do OR está relacionada à indução de apoptose
sem interferências no ciclo celular. Além disso, foi verificado que o processo
apoptótico pode ter sido estimulado pela capacidade que o OR apresentou em
induzir o estresse oxidativo, visto que foi capaz de aumentar em 51 ± 13 % os
níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio, gerando, desta forma,
uma redução do potencial da membrana mitocondrial (35 ± 5 %). Finalmente,
os resultados obtidos nos permitiram elucidar, pela primeira vez, uma das vias
de citotoxicidade do OR, a qual está relacionada a indução de estresse
oxidativo intracelular associado a danos mitocondriais, resultando, assim, na
indução da apoptose. Assim, estes resultados evidenciam potencial citotóxico
do OR e permitem sugerir que este óleo pode vir a ser utilizado como matéria-
prima bioativa no desenvolvimento de novas alternativas de tratamento contra
o câncer de pele.
Palavras chaves: Câncer de Pele; Melanoma; Óleo de rã-touro; Rana
catesbeiana Shaw.
ABSTRACT
Bullfrog oil, an animal oil extracted from the adipose tissue of Rana catesbeiana
Shaw, showed promising cytotoxic activity against melanoma cells and,
therefore, potential to become a pharmaceutical active compound. However,
there is a lack of information regarding the pathways involved its
pharmacological activity. Thus, the aim of this study was to investigate and
elucidate the cytotoxic effect of this oil against human melanoma cells (A2058).
The cytotoxic potential was evaluated by the MTT assay, the cell cycle analysis
and the cell death assay. In addition, the apoptotic potential was investigated by
(i) the DNA fragmentation using propidium iodide (PI) staining analysis, (ii) the
evaluation of mitochondrial membrane potential and (iii) the determination of
intracellular reactive oxygen species (ROS) level. The results showed that the
bullfrog oil was able to promote a time-dependent cytotoxic effect, decreasing
cell viability in 38 % after 72 hours of treatment without affecting the cell cycle.
Additionally, the bullfrog oil induced the apoptosis in A2058 cells, increasing up
to 50 ± 13 % the intracellular ROS level, maintaining the DNA integrity and
promoting an approximate decrease of 35 ± 5 % in the mitochondrial membrane
potential. It can be concluded that the in vitro cytotoxic effect of the bullfrog oil in
human melanoma cells is mediated by oxidative stress that induces
mitochondrial dysfunction, triggering the apoptosis. These unprecedented
results highlight the pharmacological potential of bullfrog oil and provide
important information to support studies on the development of new
pharmaceutical products for complementary and alternative treatments for
melanoma.
Keywords: bullfrog oil; apoptosis; cytotoxicity; melanoma; natural products.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema representativo do processo de divisão celular
demonstrando suas diferentes etapas.
Figura 2 – Representação fotográfica do anfíbio Rana catesbeiana Shaw (rã-
touro)
Figura 3 – Avaliação da atividade mitocondrial das células A2058 após
tratamento com o óleo de rã-touro (OR) à 1, 10 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72
horas.
Figura 4 – Avaliação da morte celular das células A2058 após 24 e 72 horas. A
(controle – 24 horas), B (células tratadas com 100 µg/mL de óleo de rã-touro
por 24 horas), C (controle – 72 horas), D (células tratadas com 100 µg/mL do
óleo de rã-touro por 72 horas).
Figura 5 – Determinação das características morfológicas das células A2058
coradas com IP após 72 horas. A (controle), B (células tratadas com 100 µg/mL
de óleo de rã-touro). Setas brancas (núcleo celular).
Figura 6 – Níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio nas células
A2058 coradas com DCFH-DA após 72 horas. OR (células tratadas com 100
µg/mL de óleo de rã-touro).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição Química do Óleo de Rã-Touro
Tabela 2 – Avaliação da distribuição das células A2058 no ciclo celular após
tratamento das células com óleo de rã-touro na concentração de 100 µg/mL.
OR (óleo de rã-touro).
Tabela 3 – Determinação do potencial da membrana mitocondrial das células
A2058 tratadas por 72 horas com 100 µg/mL do óleo de rã-touro (OR).
*Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle.
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
% Porcentagem
® Registrado
°C Graus Celsius
µg/mL Micrograma por mililitro
µL Microlitro
µS/cm Microsiemes por centímetro
ATCC American Type Culture Colection
CCB Carcinoma de Células Basais
CCE Carcinoma de Células Escamosas
CDKn Proteína Ciclina dependente de Quinase
CO2 Gás Carbônico
CPNM Câncer de Pele do Tipo Não Melanoma
DCFH-DA Dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato
DLS Espalhamento de Luz Dinâmico
DMEM Dulbecoco’s Modified Eagle Medium
DMSO Dimetilsufóxido
DNA Ácido Desoxiribonucleico
DP Desvio Padrão
G1 Gap 1
G2 Gap 2
MEC Matriz Extracelular
mg/mL Miligrama por Mililitro
mL Mililitro
nm Nanômetro
OR Óleo de Rã-Touro
PI Iodeto de Propídeo
pRb Proteína Retino Blastoma
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
rpm Rotações por Minuto
SFB Soro Fetal Bovino
UVB Radiação Ultravioleta do Tipo B
v/v Volume por volume
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO .................................................................................................. 14
2.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ......................................................................... 17
2.1 Homeostasia e Oncogênese ....................................................................... 17
2.2 Câncer de Pele ........................................................................................... 20
2.3 Tratamento de Câncer de Pele ................................................................... 22
2.4 Óleo de Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw) ............................................. 24
3.OBJETIVOS ...................................................................................................... 27
3.1. Objetivo Geral ............................................................................................ 27
3.2. Objetivos Específicos................................................................................. 27
4.MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 28
4.1 Materiais ..................................................................................................... 28
4.2 Condições de cultivo celular e plaqueamento ............................................. 28
4.3 Tratamento das células e análises em citômetro de fluxo ......................... 28
4.4 Ensaio colorimétrico MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de
tetrazolina) ........................................................................................................ 29
4.5 Análise do ciclo celular ............................................................................... 30
4.6 Análise de morte celular ............................................................................. 30
4.7 Avaliação da morfologia celular por microscopia de fluorescência ............. 31
4.8 Avaliação do potencial da membrana mitocondrial ..................................... 31
4.9 Avaliação de estresse oxidativo intracelular ............................................... 32
4.10 Análise estatística ..................................................................................... 32
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 33
5.1 Avaliação da Viabilidade Celular ................................................................ 33
5.2 Avaliação da ação citotóxica do óleo de rã-touro ....................................... 35
5.3 Avaliação do potencial apoptótico do óleo de rã-touro ............................... 39
6.CONCLUSÃO .................................................................................................... 46
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 47
14
1.INTRODUÇÃO
Em virtude do aumento da expectativa de vida do homem, assim como a
frequente exposição a agentes cancerígenos, tem-se observado, de acordo com
os dados da Organização Mundial de Saúde, um aumento na incidência de
câncer, de modo que são diagnosticados cerca de 14 milhões de novos casos
anualmente (Mcguire, 2016), havendo expectativa para um aumento de 70% nos
próximos 20 anos (Ferlay et al., 2015). Nesse cenário, o câncer de pele tem
representado 20% destes novos casos (Azoury e Lange, 2014), sendo
diagnosticado em 30% da população brasileira (INCA - Instituto Nacional do
Câncer, 2018) e mais frequente entre indivíduos com 50 a 70 anos de idade
(Zuluaga-Sepúlveda et al., 2016), seja pela elevada exposição aos fatores de
risco, tais como a radiação ultravioleta, à que os mesmos se expuseram em sua
juventude, visto que as campanhas de utilização de protetores solares tem se
tornado mais frequentes apenas na última década, ou mesmo pela perda da
eficiência protetora da pele em decorrência da idade (Azoury e Lange, 2014).
Diante da sua elevada incidência, é de fundamental importância o
delineamento de estratégias terapêuticas que sejam efetivas contra o câncer de
pele. Assim, o tratamento atualmente disponível para esse tipo de câncer, quando
diagnosticado precocemente, é bastante efetivo e envolve cuidados médicos e de
enfermagem, procedimentos cirúrgicos (Zuluaga-Sepúlveda et al., 2016),
imunoterapia, terapia gênica e medicamentos de uso interno (Michielin e Hoeller,
2015), os quais atuam promovendo danos às células cancerígenas, mas que, em
decorrência da sua distribuição, também podem causar danos às células sadias
do organismo, além de uma série de efeitos adversos que comprometem a
qualidade de vida do paciente (Macdonald et al., 2015). Dessa forma, a cada dia
buscam-se novos fármacos ou agentes anticancerígenos ou citotóxicos que
apresentem efeitos adversos menos agressivos, contribuindo para uma melhoria
na adesão ao tratamento e na qualidade de vida do paciente.
Neste contexto, destacam-se os produtos naturais como uma das principais
fontes de compostos bioativos com atividade antitumoral/citotóxica relatada
(Bhalla et al., 2013), dentre os quais é possível citar o óleo de rã-touro (Rana
catesbeiana Shaw), um óleo de origem animal obtido a partir do reaproveitamento
15
biotecnológico do tecido adiposo deste anfíbio (Amaral-Machado et al., 2016).
Esse óleo pode ser obtido por diferentes processos de extração, como a extração
à quente, na qual o tecido adiposo é exposto a elevadas temperaturas (70 – 80
○C), ou extração por solventes orgânicos, a qual utiliza o n-hexano para a
obtenção do óleo de rã-touro (Amaral-Machado et al., 2016; Rutckeviski et al.,
2017). Embora ambos os processos apresentem rendimento semelhante (60 –
70%), a extração à quente permite a obtenção do óleo de rã-touro com maior
qualidade, em virtude de um baixo índice de peróxido, elevada quantidade de
ácidos graxos insaturados, assim como previne a contaminação por solventes
orgânicos (Amaral-Machado et al., 2016).
Além disso, estudos que avaliaram a composição química do óleo de rã-
touro evidenciaram a presença de diversos ácidos graxos saturados e
insaturados, como o ácido eicosapentaenoico, ácido araquidônico, ácido oleico,
ácido linoleico e ácido palmítico; compostos aos quais são atribuídas diversas
atividades terapêuticas, principalmente a anti-inflamatória e cicatrizante (Alencar
et al., 2015). Assim, em virtude de sua composição química, o óleo de rã-touro
vem sendo utilizado pela medicina popular devido sua atividade cicatrizante (Silva
et al., 2004), antibiofilme (Alencar et al., 2015) e antifúngica (Moreira-Oliveira et
al., 2018).
Adicionalmente, estudos avaliaram o potencial antimicrobiano do óleo de
rã-touro e relataram sua atividade antifúngica em diferentes espécies de Cândida
spp., assim como a atividade antibacteriana em Pseudomonas aeruginosa, cepa
bacteriana responsável por infecções hospitalares (Alencar et al., 2015; Moreira-
Oliveira et al., 2018). Mais recentemente, estudos relataram a potencial atividade
citotóxica do óleo de rã-touro contra o câncer de pele, uma vez que nos estudos
realizados por Amaral-Machado e Colaboradores (2016) assim como por Bonatto
e Colaboradores (2015) foi verificado a capacidade do óleo de rã-touro em
diminuir a viabilidade de células de melanoma murino (B16F10), sendo essa
atividade atribuída a presença do composto esteroide ethyl iso-allocholate,
identificado no estudo de caracterização química deste óleo (Amaral-Machado et
al., 2016). No entanto, mesmo com tais potenciais atividades biológicas, ainda
não se tem relatos científicos e estudos aprofundados sobre a real atividade
citotóxica do óleo de rã-touro frente ao câncer de pele.
16
Sendo assim, baseado na atual necessidade de alternativas terapêuticas
capazes de contribuir com o avanço terapêutico do câncer de pele, de maneira
efetiva e com reduzidos efeitos adversos, assim como nos relatos da provável
atividade citotóxica do óleo de rã-touro em células de melanoma, este trabalho
tem como objetivo avaliar, por meio de estudos in vitro em linhagem celular de
melanoma humano A2058, o potencial citotóxico do óleo de rã-touro frente ao
câncer de pele.
17
2.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Homeostasia e Oncogênese
Homeostasia é o termo criado por Walter Bradford Canon em 1926 e
amplamente utilizado para descrever o modo como as células se organizam em
tecidos e órgãos e os processos biológicos que regulam sua integridade a nível
estrutural e funcional, promovendo o equilíbrio fisiológico ao organismo humano
(Davies, 2016), e que envolve um amplo conjunto de relações entre as células de
um mesmo ou diferentes tecidos e também relações das células com a matriz
extracelular (Mechkarska et al.) (Humphrey et al., 2014). Sabe-se que a MEC é
constituída principalmente por proteínas (colágeno e elastina) e açúcares
(glicosaminoglicanos), os quais são responsáveis por promover o suporte
estrutural para as células, definir as características relacionadas ao tamanho e
dimensão de tecidos e órgãos, assim como controlar o comportamento celular de
forma individual e coletiva (Cox e Erler, 2011).
Adicionalmente, os fibroblastos presentes na MEC também contribuem
para a manutenção da homeostase, visto que são as células responsáveis pela
deposição e remodelamento da MEC, capazes de se diferenciarem em
miofibroblastos e que, através da síntese do fator de crescimento β, estimulam a
síntese da MEC (Humphrey et al., 2014). Além disso, os fibroblastos também
auxiliam no controle do processo de crescimento celular ao secretarem citocinas e
mediadores solúveis que atuam nas células como fatores de crescimento,
estimulando o processo de mitose que resulta na multiplicação celular
(Mavrogonatou et al., 2017).
Tal processo é regulado por inúmeras proteínas (mitógenos) que, através
de diferentes vias de sinalização, ativam o ciclo celular e levam as células a
iniciarem o processo de divisão (Humeau et al., 2017). Sabe-se que o ciclo celular
é um processo complexo que envolve a duplicação do material genético celular e
a segregação desse DNA em duas novas células, sendo dividido em 4 etapas
(Gap 1, S, Gap 2 e M) e regulado, principalmente, pelas proteínas quinases e
ciclinas dependentes de quinase (CDK), que coordenam as atividades
18
metabólicas celulares e guiam as células pelas diferentes fases do ciclo celular
(Humeau et al., 2017).
Figura 1 – Esquema representativo do ciclo de divisão celular demonstrando suas diferentes
etapas. (Fonte: Alberts, 2012).
A fase inicial do clico celular é a Gap 1 (G1), ativada por diferentes
mitógenos e regulada pelas proteínas CDK4 e CDK6 que estimulam a transcrição
da proteína do gene retinoblastoma (pRb), a qual induz a transcrição de inúmeras
outras proteínas e enzimas envolvidas na duplicação do material genético,
estimulando assim uma intensa síntese proteica, principal característica desta
etapa (Salazar-Roa e Malumbres, 2017). Nessa fase, a célula mantém seu
material genético diplóide e a intensa síntese proteica que, juntamente com a
regulação da proteína CDK2, permite que a célula continue sua divisão e inicie a
fase S (Humeau et al., 2017), caracterizada pelo início da duplicação do material
genético. Na fase S, a célula diminui a síntese de proteínas e ocorre uma intensa
atividade voltada para a duplicação do material genético, fazendo com que a
célula aumente o seu conteúdo de DNA (Humeau et al., 2017; Salazar-Roa e
Malumbres, 2017).
A progressão do ciclo celular da fase S para a fase G2 é mediada pelo
complexo proteico ciclina A – ciclina B – CDK1, que quando ativado, estimula a
fosforilação de diferentes componentes celulares resultando na condensação dos
19
cromossomos, maturação e separação dos centrôm EROs com formação do fuso
mitótico, assim como desestruturação do envelope nuclear (Salazar-Roa e
Malumbres, 2017). Nessa fase a célula já apresenta o material genético
totalmente duplicado e se encontra apta para iniciar o processo de mitose (fase
M), o qual irá resultar na formação de duas novas células (Humeau et al., 2017).
A mitose, por sua vez, é um processo complexo que, de forma geral, compreende
a descondensação dos cromossomos, desaparecimento do fuso mitótico,
estruturação do envelope nuclear e reorganização do material genético,
resultando assim na formação de novas células (Salazar-Roa e Malumbres,
2017).
Dessa forma, é perceptível a complexidade do processo de divisão celular
diante das diversas alterações metabólicas que ocorrem na célula assim como
diante das inúmeras proteínas envolvidas nesse processo, mas que quando
regulado corretamente resulta no crescimento adequado e ordenado dos diversos
órgãos e tecidos, contribuindo assim para a manutenção da homeostase no
organismo.
Por outro lado, em casos específicos, pode ocorrer um aumento na
incidência de mutações no material genético celular que, por sua vez, interferem
na homeostase do organismo, promovendo, desta forma, o surgimento de células
anormais que secretam fatores de crescimento de forma exacerbada, estimulando
a divisão celular descontrolada e liberando mediadores solúveis que interferem na
composição e dinâmica da MEC, gerando uma elevada capacidade de
diferenciação e migração para outros tecidos e, assim, adquirindo um
comportamento característico de células tumorais (Ramos, E. K. et al., 2017).
Essas mutações envolvem reações específicas como a metilação das
bases do DNA ou mesmo modificações nas proteínas histonas que promovem
alterações, principalmente, nos oncogenes e nos genes supressores de tumor,
levando à intensa proliferação e desregulação do ciclo celular (López-Lázaro,
2018), respectivamente, resultando, assim, em um crescimento anormal e
desordenado do tecido, processo conhecido como hiperplasia tecidual (Weinberg,
1996).
Adicionalmente, além da hiperplasia tecidual é observado um aumento na
síntese de colágeno, o que promove alterações morfofisiológicas na MEC,
20
resultando em fibrose do tecido, além de alterações no formato e orientação das
células, sendo possível observar um aumento no número de nucléolos e
hipercromatismo nuclear (Tlsty, 2001; Cox e Erler, 2011). O conjunto dessas
alterações em nível celular e tecidual resulta, então, na formação de uma massa
tumoral, caracterizada por um aumento significativo no número de células que
apresentam comportamento autônomo e que não respondem aos mecanismos de
regulação hemostática do organismo (López-Lázaro, 2018).
Além disso, as células tumorais também são capazes de promover a
angiogênese através da liberação de proteínas, ou seja, formação de novos vasos
sanguíneos ao redor da massa tumoral (Weinberg, 1996), os quais irão
proporcionar o aumento do aporte de nutrientes e oxigênio necessários para a
excessiva replicação celular da massa tumoral, além de atuar como uma via de
migração, permitindo que a célula tumoral chegue até a corrente sanguínea,
atingindo novos tecidos, nos quais uma nova massa tumoral irá se formar,
processo conhecido como metástase (Tlsty e Coussens, 2006).
Assim, é perceptível que as ocorrências de mutações nos oncogenes e nos
genes supressores de tumor implica desde o surgimento de uma célula com o
comportamento anormal e capacidade de proliferação excessiva até a formação
de uma massa tumoral com potencial capacidade metastática, constituindo assim
o principal fator responsável pelo processo de oncogênese, isto é, pelo início do
que se conhece como câncer.
2.2 Câncer de Pele
O câncer de pele é uma das neoplasias humanas mais comuns em todo
mundo, com taxas de incidência e mortalidade crescentes em um ritmo alarmante
(Akhtar e Khan, 2016), visto que anualmente são diagnosticados mais de 200.000
novos casos no mundo inteiro, havendo um destaque para os países que estão
localizados próximos da linha do equador (Azoury e Lange, 2014), como é o caso
do Havaí, o qual apresenta 422 casos de câncer de pele para cada 100.000
habitantes, e do Brasil, onde câncer de pele é responsável por 33,2% de todos os
casos de câncer diagnosticados (Rezende et al., 2009). Devido as suas posições
geográficas, estes países estão expostos a uma forte incidência de radiação
21
ultravioleta, principalmente os raios UVB, um dos principais fatores de risco
associados ao desenvolvimento dessa neoplasia, causando alterações genéticas
ao promoverem o estresse oxidativo devido à formação de radicais reativos de
oxigênio e dím EROs de piridina que atuam sobre as bases do DNA (Gilchrest et
al., 1999; Gandhi e Kampp, 2015)
Sabe-se que a pele é um órgão heterogêneo e complexo que desempenha
funções fundamentais no organismo, tais como proteção, termorregulação,
absorção e excreção (Tosi et al., 2010; Brohem et al., 2011). Histologicamente, a
mesma é dividida em camadas que desempenham funções específicas: o estrato
córneo, formado por queratinócitos com função de proteção (Akhtar e Khan,
2016); a epiderme, formada principalmente por queratinócitos, melanócitos e
células do sistema imune, com importante papel em quadros infecciosos (Candi et
al., 2005; Cevc e Vierl, 2010); a derme que é formada por fibras de colágeno,
fibroblastos, células dentríticas e histiócitos, além de vasos sanguíneos, linfáticos
e terminações nervosas, sendo a principal responsável pela sustentação da pele
e também pela nutrição da epiderme; e finalmente a hipoderme, onde se localiza
o tecido adiposo (Lai-Cheong e Mcgrath, 2009).
Com base na divisão histológica da pele, o câncer de pele é classificado
conforme a camada e/ou célula acometida pela neoplasia. Os principais tipos de
câncer de pele diagnosticados mundialmente são: carcinoma de células basais
(CCB), carcinoma de células escamosas (CCE) e melanoma (Akhtar e Khan,
2016).
O CCB e CCE são classificados como câncer de pele do tipo não-
melanoma (CPNM), sendo este primeiro o de maior incidência na população
mundial, responsável por 75% dos casos de CPNM, enquanto que o CCE
representa 20% dos casos diagnosticados (Azoury e Lange, 2014; Akhtar e Khan,
2016). Os CPNM se localizam nas regiões do corpo como pescoço, cabeça,
palmas e mãos e se desenvolvem principalmente devido à exposição direta e
crônica à luz solar assim como a presença de feridas e queimaduras graves, no
entanto, podem ser removidos cirurgicamente e apresentam taxa de
sobrevivência superior a 99%, quando diagnosticados em seus estágios iniciais
(Akhtar e Khan, 2016).
22
Por outro lado, o câncer de pele do tipo melanoma surge como o câncer de
pele mais agressivo, sendo responsável por 75% das mortes relacionadas às
neoplasias cutâneas (Akhtar e Khan, 2016). O melanoma apresenta-se,
inicialmente, como manchas na pele e pode estar presente nos olhos, em
mucosas e em qualquer lugar da superfície do corpo, o que torna seu diagnóstico
bastante difícil (Gandhi e Kampp, 2015). Desta forma, é indicada a avaliação da
assimetria, borda, cor e evolução do tamanho da mancha da pele como
observação inicial e, posteriormente, exames histopatológicos para o correto
diagnóstico e classificação desse tipo de câncer (Gandhi e Kampp, 2015).
Assim, tendo em vista a elevada incidência do câncer de pele na população
mundial e os elevados índices de mortalidade atribuídos ao melanoma, é evidente
a necessidade não apenas de métodos diagnósticos eficazes que permitam a
identificação desse tipo de câncer em seu estágio inicial, mas também de
tratamentos efetivos, capazes de reduzir ou mesmo eliminar as células
cancerígenas e manter a qualidade de vida dos pacientes.
2.3 Tratamento de Câncer de Pele
O tratamento do câncer de pele é norteado pelas características desse tipo
de câncer, pela localização do tumor, grau de progressão, margens e dimensões
da massa tumoral (Simões et al., 2015; Akhtar e Khan, 2016). Além disso, diante
da crescente incidência de neoplasias cutâneas, é observada a necessidade da
disponibilidade de um amplo e efetivo arsenal terapêutico para o tratamento do
câncer de pele, que seja capaz de promover a total eliminação das células
cancerígenas, preservar as funções normais do organismo e manter o bem estar
do paciente (Gandhi e Kampp, 2015; Simões et al., 2015).
Dentre as possíveis formas de tratamento do câncer de pele, o padrão ouro
é a incisão cirúrgica, a qual consiste na remoção por completo da massa tumoral
através de métodos invasivos (Simões et al., 2015). No entanto, nos casos em
que o paciente apresenta lesões múltiplas ou de grande extensão em áreas
sensíveis, o método cirúrgico se torna inviável (Gracia-Cazana et al., 2016), de
modo que as alternativas terapêuticas atualmente disponíveis incluem a
23
radioterapia, terapia fotodinâmica, imunoterapia e a quimioterapia (Azoury e
Lange, 2014; Simões et al., 2015; Akhtar e Khan, 2016).
A radioterapia e a terapia fotodinâmica são indicadas principalmente para o
tratamento do CPNM (Akhtar e Khan, 2016). A primeira é utilizada principalmente
em pacientes idosos e apresenta uma elevada taxa de cura, permitindo um
melhor controle para tratar lesões extensas e com bordas irregulares (Simões et
al., 2015), evitando, assim, efeitos indesejáveis no tecido sadio. Já a terapia
fotodinâmica, se baseia na ativação óptica de um agente fotossensível capaz de
transformar o oxigênio tecidual local em radicais, os quais eliminam as células
tumorais (Amini et al., 2010; Clarke, 2012). O tratamento ocorre através da
aplicação de um creme com um agente fotossensível, tal como o metil-
aminolevulinato, sobre a lesão cutânea seguida de exposição a uma fonte intensa
de luz (Simões et al., 2015).
Adicionalmente, a imunoterapia e a quimioterapia surgem como outras
opções para o tratamento do câncer de pele, apresentando uma elevada taxa de
resposta e efetividade, além de permitirem a administração de agentes de ação
sistêmica de forma não invasiva que podem ser combinados com outros tipos de
terapia (Gracia-Cazana et al., 2016). Os principais imunoterápicos e
medicamentos de ação sistêmica utilizados no tratamento do câncer de pele são
a Dacarbazina, Carboplatina, Paclitaxel e Temozolamida (Simões et al., 2015),
que agem inibindo a divisão celular ou mesmo interferindo na síntese do DNA e
de seus precursores (Weingart et al., 2008), causando, assim, a morte das células
cancerígenas. Outras classes de medicamentos também utilizados são os
inibidores da proteína B-RAF (Vemurafenibe) e os anticorpos monoclonais anti
CTLA-4 (Ipilimumabe) (Simões et al., 2015).
Além do tratamento de forma sistêmica, alguns fármacos estão disponíveis
em apresentações semissólidas, como emulsões, e viabilizam o tratamento tópico
do câncer de pele. Os principais são o 5-Fluoruracil e o Imiquimod (Akhtar e
Khan, 2016). Mesmo com uma elevada efetividade e taxa de cura, os tratamentos
atualmente disponíveis não atuam especificamente nas células tumorais, afetando
também as células saudáveis do organismo, apresentando, portanto, uma
elevada toxicidade, promovendo fortes reações inflamatórias, erupções cutâneas,
queda de cabelo, cicatrizes desagradáveis, alterações hematológicas e
24
gastrointestinais, comprometendo, desta forma, a adesão ao tratamento e a
qualidade de vida do paciente (Azoury e Lange, 2014; Simões et al., 2015; Akhtar
e Khan, 2016; Gracia-Cazana et al., 2016).
Nesse cenário, diversos estudos utilizando fontes naturais têm sido
realizados, seja para a elucidação da atividade de agentes antitumorais contra o
câncer de pele, para aprimoramento da atividade farmacológica desses agentes,
ou mesmo para a redução da toxicidade de substâncias utilizadas na clínica
médica (Paiva et al., 1998; Paiva et al., 2004; Alencar et al., 2015), contribuindo
assim para o incremento do arsenal terapêutico contra o câncer de pele, de forma
a preservar a qualidade de vida do paciente e facilitar sua adesão ao tratamento.
Assim, dentre os recentes produtos naturais com provável efetividade e
biocompatibilidade no tratamento do câncer de pele têm-se o óleo de rã-touro, um
óleo de origem animal amplamente utilizado na medicina popular e que em
estudos recentes demonstrou uma potencial atividade antineoplásica contra o
câncer de pele (Amaral-Machado et al., 2016).
2.4 Óleo de Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw)
O óleo de rã-touro é um óleo de origem animal extraído do tecido adiposo
do anfíbio Rana catesbeiana Shaw, o qual é material de descarte das indústrias
alimentícias que realizam o beneficiamento da carne de rã-touro (Mendez et al.,
1998; Silva et al., 2004). Este anfíbio é nativo da América do Norte e chegou ao
Brasil por volta de 1930 pela indústria alimentícia, em virtude do clima tropical, o
qual favorece o desenvolvimento deste anfíbio e consequentemente o
enriquecimento do poder nutritivo da carne do mesmo (Longo, 1987).
Figura 2 – Representação fotográfica do anfíbio Rana catesbeiana Shaw (rã-touro) (Fonte: Lima,
S. L. 1997).
25
O óleo de rã-touro tem sido amplamente utilizado pela medicina popular
para o tratamento de distúrbios imunológicos e doenças inflamatórias, em virtude
de suas características de biocompatibilidade, biodegradabilidade e baixa
toxicidade (Rutckeviski et al., 2017). Além disso, estudos que avaliaram sua
composição química (Tabela 1), identificaram ácidos graxos saturados e
insaturados, dentre os quais se encontram os poli-insaturados de cadeia longa
como o ácido eicosapentaenoico e o ácido docosahexaenoico (Al-Adham et al.),
além dos ácidos graxos oleico, linolênico, esteárico, mirístico e palmítico (Amaral-
Machado et al., 2016), os quais permitem sugerir uma potencial atividade anti-
inflamatória, anti-edematogênica e antimicrobiana (Alencar et al., 2015).
Adicionalmente, Amaral-Machado e colaboradores (2016) identificaram a
presença do composto ethyl iso-allocholate na composição química do óleo de rã-
touro, um composto que, segundo a literatura, é um derivado da bile da Rana
catesbeiana Shaw e possui provável atividade diurética, antibacteriana,
antiasmática e antitumoral (Sarada et al., 2011; Saravanan et al., 2014),
permitindo a este autor sugerir que o achado da atividade antineoplásica se deve
à presença do mesmo na composição química do óleo.
Tabela 1 – Composição Química do Óleo de Rã-Touro (Amaral-Machado et al., 2016)
Ácido Graxo Concentração (%)
Mirístico 1,4
Araquidônico 8,4
Palmítico 10,3
Eicosapentaenoico 17,6
Oleico 29,9
Esteárico 2,5
Docosahexaenoico 0,8
Colesterol 9,5
Ethyl Isso-allocholate 3,5
Total 83,9
Não Identificado 16,1
Por outro lado, Amaral-Machado e colaboradores (2016) assim como
Bonatto e colaboradores (2015), sugeriram a atividade antineoplásica do óleo de
26
rã-touro baseados somente no ensaio de MTT, no qual foi verificado que o óleo in
natura foi capaz de diminuir a viabilidade de uma linhagem celular de melanoma
murino B16F10 (Bonatto, C. C. et al., 2015; Amaral-Machado et al., 2016).
Dessa forma, diante da composição química do óleo de rã-touro assim
como dos recentes relatos de sua provável ação citotóxica contra células do
câncer de pele, é evidente a necessidade de uma avaliação mais aprofundada a
fim de investigar a real atividade citotóxica do óleo de rã-touro frente a linhagens
celulares de câncer de pele.
27
3.OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Investigar a atividade citotóxica do óleo de rã-touro (Rana catesbeiana
Shaw) in natura por meio de estudos in vitro em linhagem celular característica do
câncer de pele humano (A2058).
3.2. Objetivos Específicos
- Avaliar a capacidade do óleo de rã-touro em interferir na atividade
mitocondrial através do ensaio de MTT;
- Analisar a possível interferência do óleo de rã-touro no ciclo de divisão
celular através de citometria de fluxo com o corante Iodeto de Propídio;
- Avaliar o processo de morte celular pelo qual o óleo de rã-touro atua sobre
as células de melanoma humano A2058 por meio da citometria de fluxo
com Iodeto de Propídio e Anexina V-FITC;
- Investigar o potencial apoptótico do óleo de rã-touro por meio de análise
morfológica das células A2058, avaliação do potencial da membrana
mitocondrial e determinação dos níveis intracelulares de espécies reativas
de oxigênio.
28
4.MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
O tecido adiposo utilizado para extrair o óleo de rã-touro foi doado pela
empresa Asmarana Produtos Naturais (Natal, RN, Brasil). Triton-X, reagente de
MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina), RNase, Iodeto de
Propídio, Anexina-V-FITC, Dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato (DCFH-DA) e
Rodamina 123 foram comprados na Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, MO, EUA).
Etanol, dimetilsufóxido (DMSO) e Metanol PA foram adquiridos da empresa Synth
(Diadema, SP, Brasil).
O meio Dulbecoco’s Modified Eagle Medium (DMEM) e o soro fetal bovino
(SFB) foram adquiridos da Cultilab (Campinas, SP, Brasil). A linhagem celular
A2058 da American Type Culture Colection (ATCC) utilizada nesse estudo foi
doada pelo Laboratório de Imunologia de Tumores da Universidade de São Paulo
(USP, São Paulo, Brasil).
4.2 Condições de cultivo celular e plaqueamento
Para a realização dos experimentos in vitro, as células foram mantidas em
meio DMEM suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB) em estufa a 37
°C e atmosfera de 5 % de CO2. Em seguida, as células foram plaqueadas de
acordo com as condições (tipo de placa e densidade) específicas de cada ensaio
e ficaram por 24 horas em estufa a 37 °C para que aderissem às placas. Após
isso, foi realizado o carenciamento por mais 24 horas, período em que as células
ficaram em contato com o meio DMEM sem a suplementação com o SFB.
4.3 Tratamento das células e análises em citômetro de fluxo
Para o tratamento das células, foi feita uma solução mãe a 2 mg/mL do OR
em solução aquosa de DMSO 1%, a qual foi diluída em meio DMEM
suplementado com 10 % de soro fetal bovino para se obter as concentrações
desejadas de óleo. Além disso, nos ensaios de citometria de fluxo, após o
29
tratamento das células com as amostras, a suspensão de células não aderentes
foi removida e reservada em tubo cônico de 15 mL, e as células aderentes na
placa foram lavadas com tampão fosfato pH 7,4 gelado, tratadas com 500 µL de
tripsina por 5 minutos, 1 mL de DMEM suplementado com 10% de SFB e então
transferidas para o mesmo tubo cônico. Em seguida, as suspensões de células
foram centrifugadas a 2500 rpm por 6 minutos a 4 °C e lavadas duas vezes com
tampão fosfato pH 7,4 gelado. Por fim, as células foram tratadas conforme
procedimento específico de cada ensaio.
4.4 Ensaio colorimétrico MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)
O ensaio foi realizado utilizando-se de da linhagem de melanoma humano
A2058 (melanoma derivado de células epiteliais humanas com elevada
capacidade invasiva) (Shields et al., 2007; Haguet et al., 2017) cultivada conforme
descrito no item 4.2.
O ensaio foi realizado em triplicata e três diferentes concentrações de óleo
de rã-touro (OR) in natura (1 µg/mL, 10 µg/mL e 100 µg/mL) foram avaliadas.
Poços isentos de amostra foram utilizados como controle negativo de toxicidade e
poços contendo a solução de DMSO 1% (v/v) na proporção da maior diluição
utilizada foram testadas para avaliar o potencial de toxicidade do diluente.
Sendo assim, as células foram incubadas em placas de 96 poços na
densidade celular de 5 x 104 células/placa conforme descrito no item 4.2. Após o
carenciamento, as células foram incubadas com concentrações do óleo
supracitadas em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal
bovino pelo período de 24, 48 e 72 horas. Posteriormente, 100 µL de reagente de
MTT na concentração de 1 mg/mL foi adicionado em cada poço para avaliar a
viabilidade celular. Após 4 horas de incubação, os cristais de formazan foram
dissolvidos em 100 µL de etanol e sua absorbância medida em leitor de ELISA
Multiskan Ascent Microplate Reader (Thermo Labsystems, Franklin, MA, EUA) no
comprimento de onda de 570 nm. Por fim, a viabilidade celular foi determinada
através do valor relativo da absorbância entre o controle negativo (células não
tratadas) e as células tratadas com o óleo de rã-touro.
30
4.5 Análise do ciclo celular
A distribuição das células A2058 no ciclo celular foi avaliada utilizando o
corante iodeto de propídio (Vartholomatos et al., 2015). As células foram
incubadas em placas de 6 poços (2 x 105 células/poço) conforme descrito no item
4.2 e após o carenciamento, as células foram incubadas por 24 horas com o OR
na concentração de 100 µg/mL.
Posteriormente, as células foram tratadas conforme o procedimento
descrito no item 4.3 e então fixadas em etanol a 70% por 45 minutos e novamente
centrifugadas e lavadas com tampão fosfato pH 7,4. A seguir, o pellet de células
foi incubado a 37 °C por 1 hora com 90 µL de Triton-X 0,01% (v/v) e 10 µL de
solução de RNase (4 mg/mL). Finalmente, foi adicionado 5 µL de solução de IP (5
mg/mL) e 200 µL de tampão fosfato pH 7,4 gelado e, com o auxílio de um
citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, New Jersey, USA) a
fluorescência emitida do IP foi mensurada. O ensaio foi realizado em duplicata.
4.6 Análise de morte celular
A morte celular da linhagem A2058 foi avaliada utilizando os corantes
anexina-V-FITC e IP (Vermes et al., 1995; Vartholomatos et al., 2015). As células
foram incubadas em placas de 6 poços (2 x 105 células/poço) conforme descrito
no item 4.2. Após o carenciamento, as células foram incubadas por 24 e 72 horas
com o OR na concentração de 100 µg/mL.
Posteriormente, as células foram tratadas conforme o item 4.3 e o pellet de
células foi ressuspendido em 50 µL de tampão de ligação para a anexina-V-FITC
e então 5 µL desta última e 1 µL de IP foram adicionados, conforme o
procedimento sugerido pelo fabricante do kit (Invitrogen, Catalogo número
V13242). As células ficaram protegidas da luz sob temperatura ambiente (25 ± 2
°C) por 20 minutos e foram então analisadas em citômetro de fluxo FACSCalibur
(Becton Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em duplicata.
31
4.7 Avaliação da morfologia celular por microscopia de fluorescência
Para avaliar possíveis alterações morfológicas no DNA nuclear, as células
A2058 foram incubadas em placas de 24 poços (4 x 105 células/poço) conforme
descrito no item 4.2 e após o carenciamento, foram incubadas por 72 horas com o
OR na concentração de 100 µg/mL. Células não tratadas foram utilizadas como
controle negativo de toxicidade.
Após a incubação, as células foram lavadas com tampão fosfato pH 7,4
gelado e fixadas com metanol PA durante 20 minutos e então tratadas com
solução de Triton - X 0,1% por 15 minutos. Em seguida, foram novamente lavadas
com tampão fosfato pH 7,4 gelado e foram adicionados 5 µL de solução de iodeto
de propídio (5 µg/mL). Por fim, a morfologia celular foi observada em microscópio
fluorescente confocal (Nikon Eclypse Ti-E) (Hezel et al., 2012).
4.8 Avaliação do potencial da membrana mitocondrial
A fim de avaliar o efeito apoptótico do OR sobre as células A2058, foi
avaliado o potencial da membrana mitocondrial. Para isso, as células A2058
foram incubadas em placas de 6 poços (2 x 105 células/poço) conforme descrito
no item 4.2 e após o carenciamento, as células foram incubadas por 72 horas
com o OR na concentração de 100 µg/mL. Células não tratadas foram utilizadas
como controle negativo de toxicidade.
Após 72 horas, a suspensão de células foi tratada conforme procedimento
descrito no item 4.3, e então o pallet de células foi ressuspendido em 500 µL de
tampão fosfato pH 7,4 e tratado com 0,5 µL de solução etanólica de Rodamina
123 na concentração de 5 mg/mL por 15 minutos. Finalmente, a suspensão de
células foi novamente centrifugada nas condições descritas no item 4.3,
ressuspendidas em 200 µL de tampão fosfato pH 7,4 e analisadas em citômetro
de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em
duplicata.
32
4.9 Avaliação de estresse oxidativo intracelular
A fim de avaliar os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs)
intracelular, as células A2058 foram incubadas em placas de 6 poços (2 x 105
células/poço) conforme procedimento descrito no item 4.2. Após o carenciamento,
as células foram incubadas por 72 horas com o OR na concentração de 100
µg/mL. Células não tratadas foram utilizadas como controle negativo de
toxicidade.
Após 72 horas, as células foram incubadas por mais 2 horas com solução
de DCFH-DA 10 µM em DMEM suplementado com 1 % de soro fetal bovino em
estufa à 37 °C e atmosfera de 5% de CO2 (Tu et al., 2008). Em seguida, as células
foram tratadas conforme o item 4.3 e então o pellet de células foi ressuspendido
em 200 µL de tampão fosfato pH 7,4 e analisados em citômetro de fluxo
FACSCalibur (Becton Dickinson, USA).
4.10 Análise estatística
Os dados obtidos nos ensaios de citometria de fluxo foram analisados no
software FlowJo X10.0.07 (Tree Star, Inc. Ashland, OR, USA). Todos os
resultados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados pelo
software Origin® 8, Pro 8.E, OriginLab ou pelo FlowJo X10.0.07 (Tree Star, Inc.
Ashland, OR, USA). A significância estatística entre os grupos foi determinada
pela análise de variância seguida pelo teste de Turkey’s por comparação múltipla,
e análise entre dois grupos foi realizada segundo o teste T de Student, e o valor
de p < 0,05 foi considerado significativo.
33
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação da Viabilidade Celular
A citotoxicidade do OR foi avaliada pelo ensaio de MTT, uma técnica
amplamente utilizada para determinar biocompatibilidade ou citotoxicidade de
sistemas e fármacos por meio da determinação da atividade mitocondrial das
células (Stepanenko e Dmitrenko, 2015). Este ensaio baseia-se da redução do sal
de MTT, por reações enzimáticas nas mitocôndrias, levando à síntese dos cristais
de formazan, substância com coloração fortemente roxa. Assim, em virtude da
sua coloração, é possível relacionar a atividade mitocondrial de acordo com a
concentração dos cristais de formazan através de sua absorbância avaliada por
técnica espectrofotométrica (Mosmann, 1983).
Os resultados da Figura 3 mostram a capacidade das células A2058 em
reduzir o sal de MTT quando tratadas com diferentes concentrações do OR por
24, 48 e 72 horas, na qual é possível observar uma ação tempo dependente para
as concentrações de 1 e 10 µg/mL. Além disso, é possível observar que o OR
interferiu na capacidade da célula em reduzir o sal de MTT, reduzindo essa
capacidade em 7 % após 24 horas e em 35 % em 72 horas, na concentração de 1
µg/mL. Já na concentração de 10 µg/mL observou-se uma redução de 17 % após
24 horas e de 38 % após 72 horas, enquanto que na concentração de 100 µg/mL
foi observado uma redução na atividade mitocondrial próxima a 40 % em todos os
tempos testados, resultado que sugere uma atividade citotóxica do OR frente às
células características de melanoma humano A2058. Estes dados corroboram
com os resultados apresentados na literatura, nos quais o OR foi capaz de
interferir na atividade das enzimas mitocondriais, reduzindo a viabilidade da
linhagem B16F10 (melanoma murino) em 20% após 72 horas na concentração de
100 µg/mL (Amaral-Machado et al., 2016).
34
Figura 3 – Avaliação da atividade mitocondrial das células A2058 após tratamento com o óleo de
rã-touro (OR) à 1, 10 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas.
Adicionalmente, esse resultado também pode ser atribuído à composição
química do OR, a qual apresenta ácidos graxos saturados e insaturados que
podem vir a causar efeito citotóxico em células de melanoma murino, conforme
estudos já relatados na literatura (Sousa-Andrade et al., 2005; Gelzo et al., 2014;
Amaral-Machado et al., 2016), e também devido a presença do composto Ethyl
iso-allocholate, o qual possui atividade antitumoral relatada na literatura (Amaral-
Machado et al., 2016).
Além disso, estudos recentes da literatura também avaliaram a possível
citotoxicidade do OR frente às células não-tumorais, como uma linhagem de
fibroblastos (3T3) e eritrócitos humanos, e demonstraram por meio de ensaios in
vitro que esse óleo animal não promoveu danos às essas linhagens, permitindo
sugerir assim, que a atividade citotóxica do OR pode estar relacionada com
características específicas de células tumorais (Amaral-Machado et al., 2016;
35
Oliveira et al., 2018). Dessa forma, os dados de citotoxicidade obtidos, juntamente
com os dados de biocompatibilidade já descritos na literatura, reforçam a hipótese
de que o OR apresenta atividade citotóxica frente à linhagem celular característica
do câncer de pele do tipo melanoma, tanto humano quanto murino (Amaral-
Machado et al., 2016), evidenciando assim, o potencial citotóxico desse óleo
animal.
5.2 Avaliação da ação citotóxica do óleo de rã-touro
Diante da atividade citotóxica demonstrada pelo OR frente à linhagem
celular A2058 no ensaio de MTT, optou-se por avaliar mais detalhadamente qual
seria a provável via de atuação pela qual este óleo promove a inibição da
viabilidade destas células cancerígenas. Desta forma, tendo em vista que os
compostos naturais que desempenham atividade antitumoral atuam
principalmente interferindo na divisão celular, promovendo a morte celular por vias
de apoptose, necrose, ou mesmo promovendo danos oxidativo no material
genético (Bhalla et al., 2013), investigou-se primeiramente a possível interferência
deste óleo na divisão celular da linhagem A2058.
Desta forma, avaliou-se a população das células de melanoma humano
A2058 nas diferentes fases do ciclo celular por análise de citometria de fluxo
utilizando o iodeto de propídio (Ramos, Erika K et al.), um corante fluorescente
que se liga ao material genético das células e permite identificar a população de
células em cada fase do ciclo celular de acordo com as características específicas
do DNA. Isto se deve ao fato de que na fase G1 não são verificadas alterações no
DNA celular devido à intensa síntese proteica que ocorre nessa fase, no entanto,
o processo de duplicação que se inicia na fase S, aumenta a quantidade de
material genético celular, de modo que na fase G2/M o DNA se encontra
totalmente duplicado, sendo assim, a partir dessas alterações relacionadas à
duplicação do material genético, o IP emite níveis de fluorescência diretamente
proporcional à quantidade do material genético, permitindo identificar a população
de células em cada fase do ciclo celular (Vartholomatos et al., 2015; Salazar-Roa
e Malumbres, 2017).
36
A Tabela 2 demonstra distribuição das células A2058, as quais foram
tratadas por 24 horas com 100 µg/mL do OR, nas diferentes fases do ciclo celular,
onde é possível observar que não houve interferência no ciclo de divisão celular,
uma vez que não houve diferença estatisticamente significativa (p > 0,05) entre a
distribuição das células tratadas e das células não tratadas (controle).
Tabela 2 – Avaliação da distribuição das células A2058 no ciclo celular após tratamento das
células com óleo de rã-touro na concentração de 100 µg/mL. OR (óleo de rã-touro).
Fase do ciclo celular
Distribuição das células (%)
Controle OR
G1 61,2 ± 3,3
63,3 ± 2,1
S 30,6 ± 4,9
28,6 ± 1,1
G2/M 4,9 ± 1,9
4,6 ± 1,6
Esses resultados, quando comparados a estudos que avaliaram a ação de
outros produtos naturais no ciclo de divisão celular, mostra notória discordância,
uma vez a interferência na divisão celular é um dos mecanismos mais comuns
pelo qual ocorre a atividade citotóxica de produtos naturais (Chinembiri et al.,
2014). Por outro lado, também são relatados diversas outras vias pelas quais
produtos naturais podem vir a desenvolver um efeito citotóxico, como a indução
de morte celular (necrose ou apoptose), interferência no metabolismo ou mesmo
indução de danos ao material genético celular. Sendo assim, torna-se necessário
avaliar a atividade citotóxica do OR por ensaios que permitam avaliar outras vias
de citotoxicidade.
Dessa forma, diante dos resultados obtidos na análise do ciclo celular,
avaliou-se a capacidade do OR em induzir a morte celular pelas vias de apoptose
ou necrose. Logo, a avaliação da morte celular ocorreu através da análise por
citometria de fluxo, de células A2058 tratadas com o OR por 24 e 72 horas na
concentração de 100 µg/mL, utilizando os corantes anexina-V-FTIC e IP.
37
Durante os processos de morte celular, seja por apoptose ou necrose, é
possível observar modificações específicas na expressão de proteínas e
organização do material genético que permite identificar qual processo de morte
está ocorrendo (Vermes et al., 1995). Assim, uma das principais características do
processo de apoptose é a exposição do fosfolipídio fosfatidilserina na superfície
da membrana citoplasmática. Esse lipídeo, em condições homeostáticas, se
encontra ancorado na membrana citoplasmática voltado para o citoplasma da
célula, no entanto, durante o processo de apoptose ocorre uma translocação e a
fosfatidilserina passa a ser exposta na superfície da membrana celular voltada
para o meio extracelular (Fadok et al., 1992). Assim, devido ao fato de que a
anexina-V-FITC possui a propriedade de se ligar a fosfolipídios por uma via
dependente de Ca+2 e emitir fluorescência, a mesma liga-se a este fosfolipídio,
permitindo assim a identificação de células no estágio inicial de apoptose (Fadok
et al., 1992; Vermes et al., 1995).
Adicionalmente, outra via comum de morte celular é a necrose, processo
caracterizado pela perda da integridade da membrana plasmática com liberação
dos constituintes celulares para o meio extracelular, bem como a clivagem de
cromatina por enzimas endonucleases, as quais levam à fragmentação do
material genético e formação de subunidades de oligonucleotídeos (Nicoletti et al.,
1991). Baseado nisto e devido à capacidade que o IP possui de se ligar a essas
subunidades de oligonucleotídeos e emitir fluorescência, o mesmo é utilizado para
identificar as células afetadas pela necrose (Laake et al., 1999).
Sendo assim, de acordo com a intensidade da fluorescência emitida pela
Anexina-V-FITC e IP é possível identificar os diferentes processos da morte
celular, ou seja, células que sofreram o processo de necrose vão apresentar
fluorescência positiva apenas para o IP (IP+, ANX-, localizado no quadrante 1 -
Q1), células em processo de apoptose tardia apresentarão fluorescência positiva
para ambos os corantes (IP+, ANX+, localizado no quadrante 2 - Q2), células no
estágio inicial de apoptose demonstrarão fluorescência positiva apenas para a
anexina-V-FTIC (IP-, ANX+, localizado no quadrante 3 - Q3) e células normais ou
que ainda se encontram em atividade vital irão apresentar fluorescência negativa
para ambos corantes (IP- e ANX- , localizado no quadrante 4 - Q4) (Bernardes-
Oliveira et al., 2016).
38
A Figura 4 apresenta os resultados obtidos nos ensaios supracitados após
24 e 72 horas de tratamento, no qual, após 24 horas de tratamento, é possível
observar a predominância da viabilidade celular (95,5 ± 0,01 %) das células não
tratadas (controle negativo), em virtude da negatividade de fluorescência para
ambos os corantes utilizados (Figura 4A). No entanto, nas células que foram
expostas ao tratamento com OR (100 µg/mL) por 24 horas (Figura 4B) foi
observado um aumento significativo (p < 0,05) de +6,95 ± 1,44 % na população
de células em apoptose inicial, sem que houvesse alterações significativas na
população de células necróticas e em apoptose tardia, sugerindo que o OR pode
vir a induzir apoptose nas células de melanoma após 24 horas de contato.
Figura 4 – Avaliação da morte celular das células A2058 após 24 e 72 horas. A (controle – 24
horas), B (células tratadas com 100 µg/mL de óleo de rã-touro por 24 horas), C (controle – 72
hora, D (células tratadas com 100 µg/mL do óleo de rã-touro por 72 horas).
Adicionalmente, após 72 horas de tratamento com o OR (Figura 4D) foi
verificado um aumento significativo na população de células A2058 que
39
apresentaram fluorescência positiva tanto para o IP quanto para a Anexina-V-
FITC, indicando que o OR é capaz de induzir a morte celular por apoptose tardia.
Na Figura 4C pode-se observar que o controle negativo apresentou uma
população de células majoritariamente viáveis (58,5 ± 0,01 %) e uma pequena
população indicando a ocorrência de apoptose tardia (20,10 ± 0,03 %). No
entanto, as células tratadas com 100 µg/mL do OR (Figura 4D) apresentaram um
aumento de +41,15 ± 2,59 % de células em apoptose tardia quando comparado
ao controle, sugerindo que o OR é capaz de induzir a morte celular por apoptose
tardia.
Sabe-se que a atividade antineoplásica do OR é atribuída a presença do
composto ethyl iso-allocholate em sua composição química (Amaral-Machado et
al., 2016). No entanto, estudos da literatura relatam que a presença de ácidos
graxos insaturados e saturados (linoleico, linolênico, araquidônico,
eicosapentaenoico e decosapentaenoico) em óleos naturais podem estar
relacionados a efeitos apoptóticos, uma vez que esses compostos, mesmo que
por vias não totalmente elucidadas, são capazes de induzir apoptose em diversas
linhagens de células tumorais (Arita et al., 2001; Bonatto, S. J. R. et al., 2015); o
que nos permite sugerir que o efeito apoptótico do óleo de rã-touro pode vir a ser
atribuído a sua composição química.
Sendo assim, estes resultados tornam evidente a relevância científica do
óleo de rã-touro, uma vez que demonstra que um óleo de origem animal, obtido a
partir de um processo de reaproveitamento biotecnológico, pode vir a induzir o
processo de apoptose em uma linhagem humana de câncer de pele.
5.3 Avaliação do potencial apoptótico do óleo de rã-touro
Dada a obtenção de dados que permitiram sugerir que o OR é capaz de
promover/induzir a apoptose tardia das células A2058, foi investigado o potencial
efeito apoptótico desse óleo com o objetivo de elucidar sua ação sobre as células
A2058. A apoptose, também denominada de morte celular programada, é
caracterizada por diversas alterações metabólicas e morfológicas (Redza-
Dutordoir, M. e Averill-Bates, D. A., 2016), podendo ser iniciada ou pela via
extrínseca, onde há ativação de receptores na membrana plasmática e ativação
40
das proteínas caspases responsáveis pelo processo de apoptose, ou pela via
intrínseca, também denominada via da mitocôndria, onde ocorre a alteração no
potencial de membrana das mitocôndrias com produção excessiva de espécies
reativas de oxigênio (EROS) e liberação do Citocromo C para o citoplasma,
induzindo a apoptose pelas proteínas caspases (Ouyang et al., 2012; Redza-
Dutordoir, M. e Averill-Bates, D. A., 2016), podendo apresentar modificações
morfológicas como condensação de cromatina, fragmentação do DNA, danos a
membrana plasmática e formação de corpo apoptótico, além de alterações
metabólicas relacionadas a atividade de proteínas e organelas citoplasmáticas
(Redza-Dutordoir, M. e Averill-Bates, D. A. , 2016).
Baseado nisso, foi investigado o potencial apoptótico do OR através da
análise morfológica das células A2058 por microscopia de fluorescência,
avaliação do potencial da membrana mitocondrial e dos níveis intracelulares de
EROS. Inicialmente, as células foram analisadas por microscopia de fluorescência
utilizando IP como agente de marcação, corante que, conforme discutido
anteriormente, se liga aos ácidos nucleicos do DNA nuclear e permite avaliar a
integridade do material genético assim como identificar a fragmentação do DNA,
uma das possíveis características do processo de apoptose (Kim et al., 2013). A
Figura 5A apresenta células A2058 não tratadas, na qual é possível observar a
organização do material genético nuclear de forma íntegra e fusiforme,
característico das células A2058 (Simões et al., 2015).
41
Figura 5 – Determinação das características morfológicas das células A2058 coradas com IP após
72 horas. A (controle), B (células tratadas com 100 µg/mL de óleo de rã-touro). Setas brancas
(núcleo celular).
Similarmente, após 72 horas de tratamento com OR na concentração de
100 µg/mL (Figura 5B) não foi possível identificar fragmentação do material
genético nuclear, uma vez que os núcleos das células A2058 permaneceram
organizados de forma fusiforme e com DNA íntegro, tais como os da amostra
controle.
Esse dado nos permite sugerir que o OR, embora seja capaz de induzir o
processo de apoptose tardia nas células de melanoma humano A2058, não foi
capaz de induzir a fragmentação do material genético, indicando, desta forma,
que provavelmente a indução da apoptose possa ocorrer por outras vias de
ativação, visto que estudos que relatam a ocorrência de danos no DNA durante o
processo de apoptose em virtude da ativação de genes relacionados com a
expressão de enzimas endonucleases, as quais são responsáveis por promover a
fragmentação do material genético, ressaltam que mesmo que estes danos ao
material genético sejam uma característica comum da apoptose, esse fato não é
essencial para a ocorrência da apoptose (Allen et al., 1997). Assim, como já
abordado anteriormente, a apoptose, por ser um processo complexo, pode ser
iniciado por diferentes vias de ativação, envolvendo diversas modificações
42
morfológicas e bioquímicas, sendo assim, mesmo não promovendo danos ao
DNA, o OR podem vir a induzir a apoptose por vias que não envolvam
fragmentação do material genético (Allen et al., 1997; Ouyang et al., 2012).
Dessa forma, foi avaliada a capacidade do OR em interferir no metabolismo
celular a partir da avaliação do potencial da membrana mitocondrial, visto que a
mitocôndria é uma organela que apresenta uma dupla membrana plasmática e
possui função essencial para o metabolismo celular, uma vez que é responsável
pela síntese de ATP (Martinou e Youle, 2011). Nesse processo, a energia química
de nutrientes como carboidratos, glicose e ácidos graxos é convertida em um
gradiente eletroquímico pela cadeia transportadora de elétrons, composta por
uma série de complexos proteicos localizados na membrana interna da
mitocôndria, a qual permite a conversão de adenosina difosfato (ADP) em ATP, a
principal molécula energética do metabolismo celular (Burke, 2017). Por outro
lado, essa organela também está envolvida na via de ativação intrínseca da
apoptose, um processo caracterizado por alterações nas funções e no
metabolismo mitocondrial, assim como pela liberação de proteínas para o citosol,
como o citocromo C, o qual induz a ativação de proteínas caspases, promovendo
uma cascata de sinalização intracelular dependente de caspase, induzindo desta
forma, a apoptose (Martinou e Youle, 2011; Burke, 2017).
Baseado nisso, e em resultados anteriores que demonstraram uma
citotoxicidade do OR em diminuir a atividade mitocondrial, como observado no
ensaio de MTT, além de sua capacidade em induzir a apoptose, foi avaliado o
potencial da membrana mitocondrial com o objetivo de elucidar o efeito apoptótico
do OR.
A Tabela 3 demonstra que o tratamento das células A2058 com o OR foi
capaz de promover uma diminuição significativa (p < 0,05) no potencial da
membrana mitocondrial, sugerindo que esse óleo é capaz de promover danos
mitocondriais que podem estar relacionados com seu efeito apoptótico, uma vez
que o potencial da membrana mitocondrial pode ser definido como um potencial
elétrico resultante das reações de oxi-redução relacionadas com a síntese de ATP
e que regula as funções normais da mitocôndria, assim, valores elevados indicam
uma intensa síntese de ATP associada com uma produção mitocondrial excessiva
de EROS, enquanto que valores baixos do potencial de membrana mitocondrial
43
estão associados a danos que interferem no metabolismo mitocondrial e,
consequentemente, comprometem o metabolismo celular (Zorova et al.). Dessa
forma, como o OR promoveu uma diminuição no potencial da membrana
mitocondrial, esse resultado nos permite sugerir um provável dano mitocondrial
que pode vir a interferir no metabolismo celular.
Tabela 3 – Determinação do potencial da membrana mitocondrial das células A2058 tratadas por
72 horas com 100 µg/mL do óleo de rã-touro (OR). *Diferença estatisticamente significativa em
relação ao controle.
Potencial da Membrana Mitocondrial (%)
Controle 100 ± 3
OR 65 ± 5*
Nesse contexto, dentre os diversos efeitos que possam levar à essa
alteração, é possível citar a interferência do OR nos níveis intracelulares de
EROs, uma vez que essas moléculas podem ser produzidas pela mitocôndria ou
mesmo agir sobre essa organela, induzindo danos oxidativo à proteínas e
lipídeos, o que pode comprometer a síntese de ATP (Redza-Dutordoir, M. e
Averill-Bates, D. A. , 2016) e o metabolismo mitocondrial. Em baixos níveis, as
EROS são consideradas moléculas essenciais para funções fisiológicas vitais,
uma vez que participam da regulação do ciclo celular e de processos como a
diferenciação, proliferação e migração celular (Redza-Dutordoir, M. e Averill-
Bates, D. A. , 2016).
Por outro lado, uma produção excessiva de EROs pode induzir o estresse
oxidativo, o qual é caracterizado por danos oxidativo e diversos efeitos deletérios
às estruturas celulares como lipídeos, proteínas, membranas e até mesmo
organelas citoplasmáticas, como a mitocôndria (Halliwell, 2011; Redza-Dutordoir,
M. e Averill-Bates, D. A. , 2016). Assim, para investigar o efeito do OR no
metabolismo mitocondrial, visto que esse óleo foi capaz de interferir no potencial
de membrana mitocondrial, foi investigada a capacidade do OR em interferir na
produção de EROs nas células A2058 utilizando o corante fluorescente DCFH-
DA, o qual, ao ser internalizado pelas células, é rapidamente convertido pelas
44
enzimas esterases em um derivado polar (DCFH), e oxidado pelas EROs,
emitindo, desta forma, fluorescência capaz de ser identificada por citometria de
fluxo (Chen et al., 2013). Dessa forma, na Figura 6 é possível observar os
diferentes espectros de fluorescência emitidos pelas células controle e pelas
células que foram tratadas por 72 horas com o OR na concentração de 100
µg/mL.
Figura 6 – Níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio nas células A2058 coradas com
DCFH-DA após 72 horas. OR (células tratadas com 100 µg/mL de óleo de rã-touro).
As células tratadas com o OR, quando comparadas ao controle,
demonstraram um espectro com um ligeiro desvio à direita, indicando um maior
nível de fluorescência, a qual está diretamente relacionada com a quantidade de
EROs intracelular, indicando, desta forma, que o OR foi capaz de aumentar a
produção de EROs. Adicionalmente, baseado na área do espectro obtido, foi
calculado a intensidade da fluorescência emitida pelo DCFH-DA e verificado que
45
o OR foi capaz de aumentar em 51% os níveis de EROs, dado que corrobora com
os resultados obtidos na avaliação do potencial de membrana mitocondrial, uma
vez que uma elevação nos níveis intracelulares de EROs está diretamente
associada com danos mitocondriais e com a redução do potencial da membrana
mitocondrial. Além disso, esses dados nos permitem elucidar o efeito apoptótico
do óleo de rã-touro sobre as células de melanoma A2058, uma vez que o
aumento na produção de EROs, o que caracteriza o estresse oxidativo,
juntamente com danos mitocondriais que comprometem o metabolismo celular
podem induzir o processo de apoptose pela via intrínseca (Sinha et al., 2013;
Redza-Dutordoir, M. e Averill-Bates, D. A. , 2016).
Dessa forma, os resultados obtidos permitem afirmar que o óleo de rã-touro
é capaz de promover um efeito citotóxico nas células de melanoma humano
A2058 e induzir o processo de morte celular por apoptose tardia através do
aumento intracelular de EROs assim como devido a interferência no potencial de
membrana mitocondrial. Tais resultados nos permitiram elucidar, pela primeira
vez, o efeito citotóxico do óleo de rã-touro frente à linhagem celular A2058,
evidenciando o potencial uso desses produto natural no desenvolvimento de
novas estratégias terapêuticas para o tratamento de câncer de pele.
46
6.CONCLUSÃO
Os resultados demonstraram que óleo de rã-touro, um óleo de origem
animal composto por ácidos graxos saturados e insaturados, foi capaz de
promover um efeito citotóxico tempo-dependente em células de melanoma
humano A2058, diminuindo a atividade mitocondrial, como demonstrado no
ensaio de MTT. Adicionalmente, o óleo de rã-touro não interferiu no ciclo celular
da linhagem A2058, mas foi capaz de induzir a morte celular por meio de
apoptose tardia, sem provocar a fragmentação do material genético celular. No
entanto, seu efeito apoptótico foi atribuído à alterações no metabolismo
mitocondrial devido a capacidade do óleo de rã-touro em induzir um estresse
oxidativo intracelular ao estimular a produção de EROs, fatores que favorecem a
indução da apoptose.
Desta forma, tendo em vista os resultados obtidos, foi possível, pela
primeira vez, elucidar a via de toxicidade pelo qual o óleo de rã-touro atua sobre
as células de melanoma humano, dados que nos permitem sugerir o uso desse
óleo de origem animal como matéria-prima farmacêutica capaz de auxiliar no
desenvolvimento de pesquisas relacionadas com o tratamento alternativo de
melanoma.
47
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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