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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS AVALIAÇÃO DE EFEITOS TOXICOLÓGICOS E COMPORTAMENTAIS DE PANAX GINSENG C A MEYER EM RATOS ANA LAURA DE SOUZA ALMEIDA MATOS NATAL-RN 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DE EFEITOS TOXICOLÓGICOS E
COMPORTAMENTAIS DE PANAX GINSENG C A MEYER EM
RATOS
ANA LAURA DE SOUZA ALMEIDA MATOS
NATAL-RN
2013
ii
ANA LAURA DE SOUZA ALMEIDA MATOS
AVALIAÇÃO DE EFEITOS TOXICOLÓGICOS E
COMPORTAMENTAIS DE PANAX GINSENG EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da UFRN, como pré-requisito para defesa
de Mestrado.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Aline Schwarz.
NATAL/RN
2013
Matos, Ana Laura de Souza Almeida. Avaliação de efeitos toxicológicos e comportamentais de ginsengpanax em ratos / Ana Laura de Souza Almeida Matos. - Natal, 2013. 58f: il.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Aline Schwarz. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação emCiências Farmacêuticas da UFRN, como pré-requisito para defesa deMestrado.
1. Panax ginseng C.A. Meyer (Araliaceae) -Dissertação. 2. Glicina -Dissertação. 3. Ketamina - Dissertação. 4. Toxicidade - Dissertação. 5.Comportamento / Ratos - Dissertação. I. Schwarz, Aline. II. Título.
RN/UF/BSA01 CDU 582.794.2
Catalogação da Publicação na FonteUniversidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
iii
PÁGINA RESERVADA PARA A FOLHA DE APROVAÇÃO
(BANCA EXAMINADORA)
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, sem Ele nada disso seria possível.
Agradeço à minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Aline Schwarz. Aline, obrigada pela
paciência, por acreditar em mim e me empurrar para frente sempre que as dificuldades
começavam a surgir. Perturbei bastante sua paz com minhas dúvidas, inquietudes e
descontentamentos. Você me ensinou o que é pesquisa e como buscar o sucesso através
do estudo árduo e da disciplina. Obrigada por me tornar a pessoa crítica que sou hoje e
por ouvir alguns desabafos durantes nossas longas horas de reunião.
Agradeço aos meus pais, Ana Maria e Harrisson, por me permitirem morar em
uma cidade diferente, trabalhando o dobro para me manter em pé, firme e forte para
completar este trabalho. Mãe essa dissertação eu dedico a você.
As minhas irmãs, Christiane e Adriana, pelo apoio ao longo do mestrado e por
me ouvirem mesmo quando o assunto era tão chato para vocês.
Agradeço a minha avó, Maria da Conceição, por sua vozinha sempre boa e
disposta a me escutar. Por poder desabafar meu choro quando o coração apertava e eu
queria desistir.
À minha madrinha, Gracinha, por considerar lindo este trabalho e demonstrar
tanto orgulho de mim.
Agradeço aos alunos de graduação que se dispuseram a me ajudar com todo o
carinho e dedicação que foram essenciais para esta minha vitória: Kayo, Felipe, Cássio,
Milena, Iris, obrigada por todo o conhecimento compartilhado e adquirido!
Agradeço a todos que de forma indireta passaram na minha vida nesse momento
de estudo e dedicação.
Por fim, agradeço a UFRN por me proporcionar um ambiente adequado para
realização e conclusão do primeiro de muitos trabalhos da minha vida.
v
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE QUADRO:
Quadro01: Materiais utilizados para a execução do presente estudo ................. 13
LISTA DE FIGURAS:
Figura 01: Panax ginseng na natureza ..................................................................... 1
Figura 02: Panax ginseng – raiz ............................................................................... 2
Figura 03: Estrutura química dos ginsenosídeos do grupo panaxadiol .................... 4
Figura 04: Estrutura química dos ginsenosídeos do grupo panaxatriol ................... 4
Figura 05: Estrutura química dos ginsenosídeos do grupo ácido oleanólico ........... 4
Figura 06: Receptor NMDA ..................................................................................... 7
Figura 07: Estrutura química do glutamato .............................................................. 8
Figura 08: Estrutura química do aminoácido Glicina .............................................. 9
Figura 09: Estrutura química da ketamina ............................................................... 11
Figura 10: Campo aberto .......................................................................................... 16
Figura 11: Labirinto em cruz elevado ...................................................................... 17
Figura 12: Corte histológico (10x) de baço de ratos do grupo branco (A),
ratos tratados com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C),
300mg/kg. Não houve alterações morfológicas significativas no tecido 25
Figura 13: Corte histológico (40x) de cérebro de ratos do grupo branco (A),
ratos tratados com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C),
300mg/kg. Não houve alterações morfológicas significativas no tecido 26
Figura 14: Corte histológico (10x) de coração de ratos do grupo branco (A),
ratos tratados com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C),
300mg/kg. Não houve alterações morfológicas significativas no tecido 27
Figura 15: Corte histológico (10x) de fígado de ratos do grupo branco (A),
ratos tratados com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C),
300mg/kg. Não houve alterações morfológicas significativas no tecido . 28
Figura 16: Corte histológico (10x) de rim de ratos do grupo branco (A),
ratos tratados com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C),
300mg/kg. Não houve alterações morfológicas significativas no tecido . 29
Figura 17: Corte histológico (10x) de testículo de ratos do grupo branco (A),
ratos tratados com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C),
300mg/kg. Não houve alterações morfológicas significativas no tecido 30
LISTA DE TABELAS:
Tabela 01: Ingestão hídrica (mL) e consumo de ração (g) de ratos tratados ou não
(grupo ketamina, glicina e branco) durante 30 dias com diferentes
doses de P. ginseng. São apresentados as médias e os respectivos erros
padrão (n=12/grupo) ............................................................................... 19
vi
Tabela 02: Ganho de peso corporal (g) de ratos tratados ou não (grupo ketamina,
glicina e branco) durante 30 dias com diferentes doses de P. ginseng.
São apresentados as médias e os respectivos erros padrão (n=12/grupo) 19
Tabela 03: Atividade geral no campo aberto de ratos tratados ou não (grupo
ketamina, glicina e branco) durante 30 dias com diferentes doses de
P. ginseng. São apresentados as médias e os respectivos erros padrão
(n=12/grupo) ........................................................................................... 21
Tabela 04: Comportamento de ratos tratados ou não (grupo ketamina, glicina e
branco) no labirinto em cruz elevado durante 30 dias com diferentes
doses de P. ginseng. São apresentados as médias e os respectivos
erros padrão (n=12/grupo) ...................................................................... 23
Tabela 05: Parâmetros bioquímicos mensurados no soro de ratos tratados ou não
(grupo ketamina, glicina e branco) no labirinto em cruz elevado durante
30 dias com diferentes doses de P. ginseng. São apresentados as médias
e os respectivos erros padrão (n=12/grupo) ............................................ 24
Tabela 06: Razão peso órgão/peso corporal de ratos tratados ou não (grupo
ketamina, glicina e branco) no labirinto em cruz elevado durante 30 dias
com diferentes doses de P. ginseng. São apresentados as médias (x104) e
os respectivos erros padrão (x104) (n=12/grupo).................................... 24
vii
LISTA DE SIGLAS
ALT Alanina-aminotransferase
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agênica Nacional de Vigilância Sanitária
AST Enzimas Aspartato-aminotransferase
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
DEF Defecação
EBA Entradas nos Braços Abertos
EBF Entradas nos Braços Fechados
GOT Transaminase Glutâmico-oxalacética
GPT Transaminase glutâmico-pirúvica
IMO Duração de imobilidade
LCR Líquido cefalorraquidiano
LE Frequência de levantar
LO Frequência de locomoção
NMDA N-metil-D-aspartato
OMS Organização Mundial da Saúde
SNC Sistema Nervoso Central
TBA Permanência nos Braços Abertos
TBF Permanência Nos Braços Fechados
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
viii
RESUMO
Panax ginseng C.A. Meyer (Araliaceae) é uma planta herbácea muito usada na China,
Coréia do Sul, Japão e outros países da Ásia no tratamento de várias doenças micro
circulatórias, vasculares cerebrais, entre outras. Possui mais de 30 ginsenosídeos, que
inibem o receptor NMDA, provocando diferentes efeitos farmacológicos e
comportamentais. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade geral, no campo
aberto, e a ansiedade, no labirinto em cruz elevado, de ratos tratados com P. ginseng.
Ratos tratados com ketamina (antagonista do receptor NMDA) e com glicina (co-
agonista do receptor NMDA), foram também empregados para melhor entendimento do
mecanismo de ação desse fitoterápico. Foram utilizados 66 ratos machos adultos,
divididos em seis grupos: um controle positivo (n=12), tratado durante 30 dias com
água por gavagem, que recebeu glicina (500mg/kg; v.o.) nos dias 7, 14, 21 e 28 de
tratamento, uma hora antes da avaliação comportamental; um controle negativo (n=12),
tratado durante 30 dias com água por gavagem, que recebeu ketamina (5mg/kg; i.p.) nos
dias 7, 14, 21 e 28 de tratamento, uma hora antes da avaliação comportamental; três
grupos experimentais (n=12), que receberam 100, 200 ou 300 mg/kg de P. ginseng, por
gavagem, durante 30 dias e um grupo branco (n=6) tratado exclusivamente com água,
sendo também administrado 1mL de água por gavagem uma hora antes da avaliação
comportamental. O comportamento animal nesses grupos também foi analisado nos dias
7, 14, 21 e 28 de tratamento. No dia 30 de tratamento os animais foram anestesiados
para coleta de sangue e retirada de órgãos diversos, que tiveram seus pesos anotados e
porções foram coletadas para estudo histopatológico. Não foram observadas alterações
no peso e ganho de peso corporal entre os diversos grupos nem nas razões peso
órgão/peso corporal calculadas. Nos animais tratados com P. ginseng, ketamina e
glicina o consumo de água e de ração e as concentrações séricas de AST revelaram estar
aumentadas em comparação com grupo branco. Entretanto, os animais tratados com as
três doses de P. ginseng, ketamina e glicina apresentaram níveis reduzidos de creatinina
e ureia quando comparados com o grupo branco. Não foram observadas alterações no
parâmetro ALT. O estudo histopatológico revelou ausência de alterações na morfologia
celular nos diversos tecidos analisados. Não foram encontradas alterações
comportamentais no labirinto em cruz elevado e poucas alterações foram observadas
nos animais tratados com P. ginseng, glicina e ketamina quando comparados com o
grupo branco, no campo aberto. Esses dados sugerem que as doses de P. ginseng
empregadas não foram capazes de provocar toxicidade geral em ratos tratados por 30
dias e revela também que o comportamento geral dos ratos tratados com P. ginseng foi
pouco diferente daquele observado nos animais tratados com glicina e ketamina. Por
fim, o estudo no labirinto em cruz elevado mostrou que o extrato de P. ginseng não
apresentou ação ansiogênica nem ansiolítica nas condições experimentais adotadas.
Palavras-chaves: Panax ginseng C. A. Meyer. Glicina. Ketamina. Toxicidade.
Comportamento. Ratos.
ix
ABSTRACT
Panax ginseng CA Meyer (Araliaceae) is a herbaceous plant widely used in China,
South Korea, Japan and other Asian countries for the treatment of various diseases
micro circulatory, cerebrovascular, among others, representing one of the drugs used by
older man. It has over 30 biologically active ginsenosides with different
pharmacological and behavioral effects and inhibitory effect on the NMDA receptor.
The amino acid glycine is a co-agonist of the NMDA receptor, activating this receptor.
At the cellular level, ketamine is widely known to be NMDA receptor antagonist. The
aim of this study was to evaluate the general activity in the open field, and anxiety in
elevated plus maze, mice treated with P. ginseng compared with the action of ketamine
and glycine, to better understand the action of this herbal medicine at the NMDA
receptor. We used 66 adult male rats were divided into six groups: a positive control,
treated for 30 days with water by gavage, who received glycine (500mg/kg; po) on days
7, 14, 21 and 28 of treatment, one hour before of behavioral assessment, a negative
control was treated for 30 days with water by gavage received ketamine (5mg/kg, ip) on
days 7, 14, 21 and 28 of treatment, one hour prior to behavioral evaluation, three
experimental groups, receiving 100, 200 or 300 mg / kg P. ginseng by gavage for 30
days and one group treated solely with white water, and is also administered 1 ml of
water by gavage one hour prior to behavioral evaluation. Animal behavior in these three
groups was also examined on days 7, 14, 21 and 28 of treatment. On day 30 of
treatment, the animals were anesthetized with thiopental (70mg/kg) for blood collection
and after euthanasia, withdrawal of various organs. There were no changes in weight
and body weight gain and weight reasons in organ / body weight. However the
consumption of water and food values showed a significant increase. Serum levels of
AST was increased in a dose-dependently in the animals treated with doses of P.
ginseng, glycine and ketamine as compared to the blank group. Unlike creatinine levels
proved to be decreased in all treated groups when compared with white. However, the
level of urea in these groups was reduced and no changes were observed in the ALT
parameter. Histopathological examination revealed no changes in cell morphology in
different tissues. There were no behavioral changes in the elevated plus maze and few
changes were observed in the open field, animals treated with P. ginseng, glycine and
ketamine when compared to white. These data suggest that the doses of P. ginseng
employed were unable to induce general toxicity in rats treated for 30 days and also
shows that the general behavior of mice treated with P. ginseng was slightly different
from that observed in animals treated with ketamine and glycine. Finally, the study on
the elevated plus maze showed that the extract of P. ginseng showed no anxiolytic or
anxiogenic action.
Keywords: Panax ginseng CA. Meyer. Glycine. Ketamine. Toxicity. Behavior.
NMDA. Rats.
x
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ................................................................. v
LISTA DE SIGLAS ............................................................................... vii
RESUMO ............................................................................................... viii
ABSTRACT ........................................................................................... ix
1 INTRODUÇÃO ........................................................................... 1
1.1 GINSENOSÍDEOS ........................................................................................ 3
1.2 RECEPTOR NMDA ...................................................................................... 6
1.3 GLUTAMATO .............................................................................................. 7
1.4 GLICINA ....................................................................................................... 8
1.5 KETAMINA .................................................................................................. 10
2 OBJETIVOS ................................................................................ 12
2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 12
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 12
3 MATERIAIS ................................................................................ 13
4 PROCEDIMENTOS ................................................................... 14
4.1 MATERIAL VEGETAL ............................................................................... 14
4.2 ANIMAIS ...................................................................................................... 14
4.3 TRATAMENTO ............................................................................................ 14
4.4 ESTUDO COMPORTAMENTAL ................................................................ 15
4.4.1 Medida da atividade geral no campo aberto ............................................. 15
4.4.2 Medida da ansiedade no labirinto em cruz elevado ................................. 16
4.5 ANÁLISE BIOQUÍMICA ............................................................................. 17
4.6 ESTUDO HISTOPATOLÓGICO ................................................................. 18
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 18
5 RESULTADOS ............................................................................ 19
6 DISCUSSÃO ................................................................................ 31
7 CONCLUSÃO ............................................................................. 37
REFERÊNCIAS .......................................................................... 38
ANEXOS ...................................................................................... 47
1
1 INTRODUÇÃO
Panax ginseng é uma erva tônica e, segundo Wang et al. (2010), quando tomado
regularmente resulta em efeitos cumulativos. Possui longa história de uso na China,
Coréia do Sul, Japão e outros países da Ásia. É empregado no tratamento de várias
doenças micro circulatórias, vasculares cerebrais, entre outras, representando um dos
medicamentos mais antigos utilizados pelo homem (GU et al., 2009).
É um arbusto, de 30-70 cm de altura, com folhas palmatiformes, geralmente em
número de cinco, com caules redondos. As folhas pequenas possuem pecíolos largos de
forma lanceolada. Os frutos, vermelho-claros, possuem 01 cm de diâmetro, contendo de
1-2 sementes brancas (Figura 1). A raiz principal e o grande número de raízes
secundárias (Figura 2) atingem cerca de 20-30 cm de profundidade e possuem diâmetro
de 20 mm e de 5-10 mm, respectivamente (CHINA, 1987).
Figura 01: Panax ginseng na natureza.
Fonte: Gois (2010).
2
Figura 2: Panax ginseng – raiz.
Fonte: Bwye (2009).
Panax ginseng (também referida como ginseng chinês ou coreano) e Panax
quinquefolius (ginseng canadense ou ginseng americano) são as duas espécies,
conhecidas simplesmente como ginseng, mais usadas na medicina popular (CHAN;
PECKHAM e MALARKEY, 2011). Ambas pertencem à família Araliaceae. Em sua
composição são encontrados polissacarídeos, óleos essenciais e polipeptídeos, além de
seu principal constituinte ativo, as saponinas triterpênicas, também conhecidas como
ginsenosídeos (DALEY, 2007).
A palavra Panax é derivada do grego “Panakos”, que significa “um cura tudo”,
uma fonte de longevidade, bem como também se refere à força física e resistência. O
uso de ervas tradicionais chinesas para fins medicinais e para alimentação vem se
tornando cada vez mais popular nos países ocidentais, aumentando as vendas de P.
ginseng na América do Norte e Europa, bem como em outras partes do mundo (WEE;
PARK; CHUNG, 2011).
Historicamente, P. ginseng é utilizado para melhorar o estado de estresse e
cansaço devido às suas propriedades adaptogênicas, além de atuar como tônico cerebral
melhorando a concentração e a capacidade de memorização. Com isso, parece estar
3
associado a uma melhora do bem-estar e a um aumento da habilidade em lidar com os
fatores estressores (ambientais, fisiológicos e emocionais) (BAHRKE et al., 2000).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) já reconhece a atividade profilática e
restauradora de P. ginseng como comprovada cientificamente (AURICCHIO et al.,
2007). Inúmeros outros efeitos, incluindo modulação do eixo hipotálamo-hipófise-
adrenal (KIM et al.,2003), ações neuroprotetoras (RAUSCH et al., 2006; KIM; NAH;
RHIM, 2008.) ações antiinflamatória (PARK et al., 2004), anti-oxidante (LI et al.,
2010), anti-cancerígena (SHIN et al., 2004), além da melhoria das funções psicológicas
(TODE et al., 1999), imunológicas (SONG et al., 2010) e outras associadas ao diabetes
(ARUSHANIAN, 2009) e doença de Parkinson (VAN KAMPEN et al., 2003), foram
relatados (WANG et al., 2010).
De acordo com Wang et al.(2010), os ingredientes ativos de P. ginseng contêm
mais de 15% de polissacarídeos solúveis em água e são considerados os componentes
ativos mais importantes. O polissacarídeo solúvel em água possui uma porção neutra
(uma mistura de glucanos e arabinogalactanos simples, ou seja, arabinose e galactose) e
uma porção ácida (arabinogalactano, tamnogalacturonano tipo I e homogalacturonano).
1.1 GINSENOSÍDEOS
De acordo com Wee; Park e Chung (2011), os ginsenosídeos (saponinas
triterpênicas) são os principais componentes bioativos de P. ginseng. São classificados
em três grupos com base na estrutura química de suas agliconas: panaxadiol (Figura 3),
panaxatriol (Figura 4) e o grupo do ácido oleanólico (Figura 5). Investigações
mostraram que dependendo do grupo pertencente, os ginsenosídeos exercem
marcadamente diferentes efeitos farmacológicos e comportamentais (KENNEDY;
SCHOLEY, 2002; PARK, RHEE, LEE, 2005; LEE et al., 2006; LEE et al., 2010; LIU
et al., 2010).
4
Figura 3: Estrutura química dos ginsenosídeos do grupo panaxadiol.
Fonte: Disponível em: <http://www.epharmacognosy.com/2012/04/ginseng-panax-
ginseng-ca-mey-or-aralia.html>.
Figura 4: Estrutura química dos ginsenosídeos do grupo panaxatriol.
Fonte: Disponível em: <http://www.epharmacognosy.com/2012/04/ginseng-panax-
ginseng-ca-mey-or-aralia.html>.
Figura 5: Estrutura química dos ginsenosídeos do grupo ácido oleanólico.
Fonte: Disponível em: <http://www.epharmacognosy.com/2012/04/ginseng-panax-
ginseng-ca-mey-or-aralia.html>.
5
A qualidade e a composição de ginsenosídeos em P. ginseng são influenciadas
por diversos fatores como a espécie, idade, parte da planta, método de cultivo, época de
colheita e método de conservação (LEUNG; WONG, 2010).
Estudos evidenciaram que os ginsenosídeos aumentam a capacidade do músculo
esquelético em oxidar ácidos graxos, ampliando o fornecimento de energia durante o
exercício prolongado e inibem a lipoperoxidação, impedindo, assim, a formação de
radicais livres (AURICCHIO et al., 2007). Apesar dessas evidências, a maioria dos
estudos clínicos, ao investigar a ação de P. ginseng no desempenho físico, não
demonstraram efeito algum, como observado em um estudo realizado com 19 mulheres
adultas fazendo uso de um extrato de P. ginseng (200 mg/dia). Nesse estudo, nenhuma
mudança no desempenho físico, resposta metabólica ou nos níveis de oxigênio
consumido foram verificadas nas voluntárias (KIEFER; PANTUSO, 2003).
Em contra partida, para testar a ação de P. ginseng, Grandhi et al. (1994),
compararam os resultados de ratos suplementados com 100mg da raiz seca/kg/dia
durante 30 dias, com os resultados de ratos que receberam uma solução placebo em um
teste de endurance em natação. O tempo de natação dos ratos suplementados com P.
ginseng foi quatro vezes maior que o tempo gasto pelo grupo placebo. Os ratos
suplementados também apresentaram aumento na atividade anabólica. Em outro estudo,
Ramachandran et al. (1990) demonstraram que uma dose única de 50mg/kg da raiz de
P. ginseng aumentou o tempo de resistência à baixas temperaturas e diminuiu o tempo
de recuperação, após cinco dias de exposição de ratos ao frio intenso.
Investigações postularam que o extrato de P. ginseng afeta o eixo hipotálamo-
hipófise-adrenal e o sistema imune, o que poderia explicar muitos dos efeitos
documentados. Estudos em modelos animais e in vitro indicam que P. ginseng aumenta a
fagocitose ao interferir na atividade das células natural killer e na produção de interferon
γ, além de provocar vasodilatação e afetar atividades hipoglicemiantes (KIEFER;
PANTUSO, 2003). De acordo com Song et al. (2010), em um estudo com 227 voluntários
saudáveis demonstrou que a administração diária de 100mg de extrato de P. ginseng,
durante 12 semanas, reforçou a eficácia da vacina polivalente contra a influenza. Os
pacientes que receberam P. ginseng apresentaram reduzida incidência da gripe e
resfriados, títulos mais altos de anticorpos e maior atividade das células natural Killer.
P. ginseng também se mostrou eficaz na disfunção erétil: 45 pacientes fazendo uso
de 900 mg de P. ginseng, três vezes ao dia, durante 16 semanas, com intervalo de duas
semanas na oitava semana, obtiveram melhora na função erétil, no desejo sexual e maior
6
satisfação nas relações sexuais (HONG et al., 2002). Entretanto, o uso de P. ginseng
combinado com outras ervas medicinais ou vitaminas e as limitações de alguns estudos,
como: má qualidade da metodologia, estudos centrados em indivíduos saudáveis, pequena
quantidade da amostra, variação de doses, etc., dificultam conclusões precisas quanto a
alguns efeitos clínicos desta erva (KIEFER, PANTUSO, 2003).
De acordo com Kim e Rhim (2004), estudos mostraram que esta bem
conhecida erva oriental possui um efeito inibitório sobre o receptor N-metil-D-
aspartato (NMDA). Alguns experimentos têm demonstrado que P. ginseng provoca
efeitos benéficos no Sistema Nervoso Central (SNC) como melhora na aquisição de
aprendizado e na consolidação de memória (KIM et al., 2002) e, também, diminuição
da morte neuronal associada a processos isquêmicos e à toxicidade provocada por
glutamato ( LI et al., 2007). Em estudo realizado observou-se que saponinas totais de
P. ginseng, foram capazes de inibir a ação do glutamato mediada por receptores
NMDA (PASSOS et al., 2009).
1.2 RECEPTOR NMDA
Os receptores NMDA são descritos em quase todos os neurônios. Desde os
períodos iniciais do desenvolvimento neuronal, desempenham papel importante na
regulação da função sináptica no Sistema Nervoso Central. No hipocampo, os
receptores NMDA possuem ações crucias nas funções fisiológicas, tais como a
aprendizagem e a memória. Em condições anormais, a superestimulação dos receptores
NMDA irá causar excitotoxicidade (SHIN et al., 2012).
Os receptores NMDA são constituídos por quatro domínios transmembrana
(Figura 6) parecidos com outros canais iônicos regulados por ligante, um domínio
extracelular N-terminal e um intracelular C-terminal que, conectados, formam um canal
iônico permeável a íons cálcio, sódio e potássio. Estes receptores podem sofrer um
bloqueio dependente de voltagem realizado por íons magnésio. Os receptores NMDA
atuam nos neurônios pós-sinápticos excitatórios após o bloqueio voltagem-dependente
exercido pelo magnésio. A despolarização da membrana é crucial para que haja a
abertura deste canal (PEREIRA, 2006).
7
Figura 6: Receptor NMDA
Fonte: Adaptado de Winson (2001).
A ativação do receptor NMDA induz a potencialização a longo prazo (LTP), que
é um modelo para a memória. Com a liberação do neurotransmissor glutamato (quadro à
esquerda) um canal associado a um receptor não-NMDA (N-metil-D-aspartato) se abre,
permitindo o influxo de sódio, que vai despolarizar o neurônio. Enquanto estiver
despolarizada (quadro central), se houver uma nova liberação de glutamato, o receptor
NMDA irá então abrir um segundo canal, permitindo então o influxo de cálcio
provocando uma LTP. A LTP é resultado do aumento da entrada de sódio através do
canal associado a um receptor não-NMDA (quadro à direita) e consequente aumento da
despolarização da célula.
1.3 GLUTAMATO
O glutamato (C5H9NO4) (Figura 7) é o principal neurotransmissor excitatório do
SNC. Seu excesso no meio extracelular promove ativação constante de receptores,
principalmente do subtipo NMDA, que desencadeia um processo de neurotoxicidade
que ocorre durante os períodos de hipoglicemia e isquemia (CASERVAN, 2008). O
mesmo autor explica que o receptor é constituído de subunidades heteroméricas e de
canais iônicos, classificados em NR1, NR2 e NR3. As diferentes combinações de
subunidades irão determinar especificidades na capacidade funcional de cada receptor,
como a sua afinidade pelo glutamato e o limiar para abertura do canal iônico. Os
receptores NMDA controlam a condutância de Na+, K
+ e, em especial do Ca
2+, através
8
da membrana neuronal. A atividade dos receptores NMDA é regulada por fatores que
determinam a abertura do canal iônico e a entrada de Ca2+
(BRESSAN & PILOWSKY,
2003). Receptores de glutamato têm um papel essencial na sinaptogênese e
sobrevivência neuronal, mas eles também são importantes na morte celular induzida por
excitotoxicidade (BHUTTA, 2007).
Figura 7: Estrutura química do glutamato.
Fonte: Disponível em: <http://www.acidoglutamico.com/>.
1.4 GLICINA
A glicina (C2H5NO2) (Figura 8) é um aminoácido com estrutura molecular
simples e apresenta amplos efeitos biológicos. Foi utilizada por muitos anos como
aminoácido controle por acreditar-se que tinha efeito inerte como agente biológico. No
entanto comprovou-se, em experimentos com animais, que a glicina atua como
moduladora na cascata inflamatória sistêmica, promove algum benefício em micro
circulação e aumenta a contagem de monócitos na anastomose intestinal (FIGUEIREDO
et al., 2009).
No entanto, as variações na absorção intestinal de glicina são extensas e
variáveis, sendo este fato demonstrado em estudos farmacocinéticos. Assim, o
metabolismo deste aminoacido também varia entre os indivíduos. As variações da
glicina no SNC são desconhecidas, uma vez que atualmente não é possível medir, de
forma não invasiva, a glicina sináptica. No entanto, os neurônios e células gliais, que
são elementos estruturais de sinapses, não só acumulam glicina, mas também a liberam.
Assim, ambos os tipos de células regulam a glicina sináptica que pode desempenhar um
papel na resposta terapêutica (KAUFMAN et al.,2009). A glicina exerce papel vital na
neurotransmissão inibitória e excitatória através das vias do receptor da glicina
estriquinina-dependente e do receptor NMDA, respectivamente (JOHNSON; ASCHER,
9
1987; D’SOUZA et al. 1995, KAWAI et al., 2011). Os níveis extracelulares de glicina
no cérebro são estritamente reguladas pelos transportadores da glicina GlyT1 e GlyT2,
que dependem de sódio e cloreto para exercerem sua função (BETZ et al 2006;
ZAFRA; GIMENEZ, 2008).
A glicina extracelular é reciclada por recaptação; metabolizada à carbono,
dióxido de carbono e amônia pelas enzimas de clivagem da glicina na células gliais; ou
ainda convertida em L-serina pela serina-hidroxi-metiltransferase (SHMT) também em
células da glia (VERLEYSDONK et al. 1999; FAGUNDES et al. 2001). L-serina é
convertido em piruvato e usado como uma fonte de energia no ciclo do ácido
tricarboxílico (XUE et al. 1999). Elevadas doses de glicina (40 a 90 g/dia) têm efeitos
benéficos sobre os sintomas negativos da esquizofrenia em seres humanos (TSAI et al.
1998, 2004; HERESCO-LEVY et al. 1999). Estudos indicaram que a ingestão de
glicina antes de dormir melhora significativamente a qualidade do sono entre as pessoas
com tendências de insônia (INAGAWA et al 2006; YAMADERA et al. 2007). Além
disso, administrada por via oral, a glicina atravessa a barreira hemato-encefálica e se
acumula no líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores e humanos. Administrada por
via oral, a glicina pode afetar a função cerebral. No entanto, a evidência é inconclusiva
e, portanto, as características farmacocinéticas e os mecanismos da captação de glicina
no cérebro ainda não estão totalmente esclarecidos (KAWAI et al., 2011).
Os compostos glutamato e glicina, considerados respectivamente, agonista e co-
agonista do receptor NMDA, não competem pela mesma subunidade, ou seja, se ligam
a sítios distintos desse mesmo receptor. O glutamato liga-se especificamente na
subunidade NR2, enquanto o sítio de ligação da glicina se encontra na subunidade NR1.
Ambos, quando ligados ao receptor NMDA, modulam positivamente a sua atividade
(MADRY et al., 2008).
Figura 8: Estrutura química do aminoácido Glicina.
Fonte: < http://pt.wikipedia.org/wiki/Glicina>. Acesso em: 10 set. 2012.
1.5 KETAMINA
10
A ketamina (2(2’-clorofenil)-2-(metilamino)ciclohexanona) (Figura 9), é um
agente anestésico de uso clínico restrito. É rapidamente absorvida por via oral,
intramuscular ou intravenosa. É metabolizada no fígado por enzimas do citocromo P450,
mais especificamente pelas isoformas da família CYP2B (YANAGIHARA et al., 2001).
Após N-desmetilação, é originado o principal metabólito ativo, a norketamina. Também
são originados os álcoois 4- e 6-hidroxiketamina, não ativos farmacologicamente
(WOOLF; ADAMS, 1987). Esses metabólitos são excretados principalmente através da
urina (91%). Apenas 3% da ketamina absorvida é excretada pelas fezes (CHANG et al.,
1970). A dose terapêutica de ketamina produz um estado de anestesia dissociativa (LEE;
ATKINSON, 1976). Clinicamente, o papel da ketamina em anestesia pediátrica está bem
estabelecido. No entanto, estudos recentes comprovaram que a ketamina pode provocar
neurodegeneração apoptótica generalizada, dose-dependente, no cérebro de ratos
imaturos. Como consequência, os possíveis efeitos tóxicos da ketamina no cérebro
imaturo estão sendo amplamente explorados (ZOU et al., 2009). A segurança de uma
perfusão pré-anestésica de ketamina é baseada no cuidado da seleção da dose para evitar
efeitos indesejáveis. Em ratos, a segurança do procedimento é garantida pelo uso de uma
dose abaixo daquela normalmente usada na prática clínica (NEWCOMER et al., 1999).
Foi levantada a hipótese de que o sistema nervoso em desenvolvimento pode ser
mais susceptível a alguns compostos neurotóxicos do que o cérebro maduro. Durante o
desenvolvimento no rato, a janela de vulnerabilidade aos efeitos tóxicos de ketamina é
restrita ao breve período de sinaptogênese, também conhecido como o surto de
crescimento do cérebro, que ocorre imediatamente após neurônios diferenciados
migrarem para seus destinos finais. Postula-se que, em roedores, a supressão da
atividade neuronal excessiva da ketamina durante o surto de crescimento do cérebro
aciona os neurônios para cometer "suicídio" via apoptose (ZOU et al., 2009).
Em estudos anteriores foi relatado que o tratamento de ratos machos adultos com
ketamina pode produzir uma reação tóxica reversível em certos neurônios
cerebrocorticais (NEWCOMER et al., 1999). A nível celular, a ketamina é amplamente
conhecida por ser antagonista do receptor NMDA, apesar de interagir também com
outros neurotransmissores, como a dopamina (KEGELES et al., 2000; IRIFUNE,
SHIMIZU, NOMOTO, 1991; NISHIMURA e SATO, 1999; YAMAMOTO et al.,
1997), serotonina e noradrenalina (TSO et al., 2004), ações essas cada vez mais
reconhecidas (BHUTTA, 2007). Antagonistas de NMDA, como fenciclidina e
11
nemantina, são usados na terapêutica para prevenir desordens neurológicas (GARCIA et
al., 2009). Entretanto, tratamentos em ratos adultos com antagonistas de NMDA não
competitivos (ketamina, tiletamina, MK-801), causam efeitos neurotóxicos consistindo
em mudanças morfológicas em neurônios do córtex cerebral (OLNEY et al., 1991).
Figura 9: Estrutura química da ketamina.
Fonte: <http://cetamina-ffup.blogspot.com.br/2009/05/
aspectos-estruturais.html>. Acesso em 10 set. 2012.
O presente estudo pretendeu investigar a toxicidade e comparar o
comportamento de ratos tratados com P. ginseng, glicina ou ketamina, para melhor
entendimento da ação desse fitoterápico. Por exercer ação semelhante à de P. ginseng
no receptor NMDA, a ketamina foi utilizada no presente estudo como controle negativo
e, por atuar como agonista do receptor NMDA, a glicina foi empregada como controle
positivo.
12
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos toxicológicos e
comportamentais de P. ginseng em ratos por comparação com os resultados obtidos de
ratos sob o efeito de glicina e ketamina e de ratos não tratados com nenhuma substância
química (grupo branco).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliação da toxicidade geral de P. ginseng através da mensuração diária do
peso corporal, do consumo de ração e ingestão hídrica dos animais.
Cálculo do ganho de peso dos animais e das razões pesos de órgãos/peso
corporal após o término do tratamento.
Realização do estudo histopatológico de tecidos diversos;
Avaliação da hepatotoxicidade através do cálculo da razão peso do
fígado/peso corporal, da mensuração dos níveis séricos das enzimas aspartato
aminotranseferase e alanina aminotransferase e do estudo histopatológico de porções
teciduais do fígado dos animais tratados com P. ginseng;
Avaliação da nefrotoxicidade através do cálculo da razão peso renal/peso
corporal, da mensuração dos níveis séricos de creatinina e uréia e do estudo
histopatológico de porções teciduais do rim dos animais tratados com P. ginseng;
Avaliação da atividade geral dos animais no campo aberto;
Avaliação, no labirinto em cruz elevado, da ação ansiogênica ou ansiolítica de
P. ginseng.
13
3 MATERIAIS
Os materiais empregados no estudo estão descritos no Quadro 01 abaixo.
Quadro 01: Materiais utilizados para a execução do presente estudo.
EQUIPAMENTOS MODELO
- Balança de precisão BEL Engineering
- Balança analítica OHAUS
- Balança eletrônica Toledo
- Campo aberto
- Destilador de água Milli-Q (Millipore)
- Estufa de ar circulante Hydrosan,
- Estufa de ar circulante Nova Ética
- Labirinto em cruz elevado modificado
- Sistema de análise bioquímica, BAYER
- M203
- C305-S;
- 9094
- HY 480 SA;
- 420/D;
- RA-50.
REAGENTES
- Água destilada;
- Etanol a 96º GL, Isofar;
- ALT/GPT liquiform
- AST/GOT liquiform
- Creatinina
- Ureia
- Solução água e álcool a 5%;
- Solução água e formalina a 10%;
- Solução salina 0,9%.
- LABTEST
- LABTEST
- LABTEST
- LABTEST
FÁRMACOS FABRICANTE
- Glicina, ácido aminoacético.
- Tiopental sódico
- Ketamina
- Extrato seco de P. ginseng
- SYNTH Lote: 139815
- Tiopentax® 1 g, (Cristália);
- Ketamin-S(+)® solução injetável 10mL (Cristália);
- (QUIMER)
VIDRARIAS
- Balão de rotaevaporador (1000 mL);
- Bastão de vidro;
- Béquer (50 mL, 100 mL, 200 mL);
- Erlenmeyer (50 mL, 100 mL);
- Proveta 500 mL;
- Tubos de ensaio.
MATERIAIS DIVERSOS
- Agulhas 24 x 7 mm para seringa; - Bisturi nº 04 de INOX, Prata instrumentos
cirúrgicos;
- Caneta retroprojetor;
- Crachás de identificação
- Cronômetros;
- Espátula;
- Fita crepe;
- Flanela;
- Gaze;
- Lâminas de bisturi nº 22, Freebac;
- Lâminas de bisturi nº 23, Solidor;
- Lâminas de vidro;
- Luvas de Látex, SUPERMAX média;
- Microtúbulos (Ependorff®).
- Papel alumínio
- Papel filme
- Pera de borracha;
- Pinça anatômica para dissecação, ABC
instrumentos cirúrgicos;
- Pipetas de vidro graduadas
- Pipetas semi-automáticas (100-200 mcL e 1000
mcL) GILSON;
- Pote coletor de urina estéril cap 80ml - Seringas descartáveis de 1 mL, 3 mL, 5 mL e 10 mL;
- Softwares Graphpad Instat 3.0 e Graphpad Prisma 5.0;
- Sonda uretral nº 08 em silicone, EMBRAMED; - Tesoura cirúrgica reta, ABC instrumentos cirúrgicos.
14
4 PROCEDIMENTOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
O extrato seco de P. ginseng foi obtido em uma farmácia de manipulação da
cidade do Natal-RN (Fabricante QUIMER, lote do fabricante 001/E, lote interno
033980). Especificações técnicas: pó fino, bege claro, solúvel em água e insolúvel em
etanol, com pH 4 contendo 3% de ginsenosídeos totais. O extrato foi diluído em água
destilada resultando em uma solução mãe de 30mg/ml.
4.2 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar adultos, pesando inicialmente cerca de 210g, de
mesma linhagem, obtidos do biotério do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Os animais foram alojados, em gaiolas de
polipropileno, com tampa de metal medindo 40 x 50 x 20 cm, por um período não
inferior a cinco dias antes de serem colocados nas diferentes situações experimentais.
Os animais foram mantidos em sala com temperatura ambiente aproximadamente
constante (23 a 26º C), num ciclo de 12 horas de claro/escuro, sendo a luz acesa às 06h.
Água e ração foram oferecidas ad libitum durante todo o procedimento experimental.
Os experimentos foram conduzidos de forma a minimizar o sofrimento dos animais
e limitar o número de espécimes necessários às investigações, de acordo com o Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996). O protocolo
foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (007/2011).
4.3 TRATAMENTO
Foram empregados ratos Wistar adultos, 66 machos, separados em seis grupos
contendo 12 animais nos cinco grupos de tratamento e 6 animais no grupo branco.
Foram três os grupos experimentais tratados com P. ginseng nas doses de 100, 200 e
300 mg/kg/dia durante 30 dias; um grupo controle positivo tratado apenas com água
(1mL) por gavagem, durante 30 dias, mas que recebeu glicina (500 mg/kg) por via oral
uma hora antes dos testes comportamentais, nos dia 7, 14, 21 e 28 do tratamento; um
15
grupo controle negativo tratado apenas com água (1mL) por gavagem, durante 30 dias,
mas que recebeu ketamina (5 mg/kg) por via intraperitoneal uma hora antes dos testes
comportamentais, nos dia 7, 14, 21 e 28 do tratamento; e um grupo branco tratado
apenas com água durante 30 dias mas que recebeu por via oral 1mL de água, uma hora
antes dos testes comportamentais, nos dia 7, 14, 21 e 28 do tratamento.
A dose de 100 mg/kg de P. ginseng foi anteriormente empregada por Grandhi et
al (1994) ao estudarem a ação antidepressiva dessa espécie empregando o protocolo da
natação forçada. A glicina é um aminoácido de estrutura molecular simples, cuja dose
recomendada pode variar entre 50 mg e 500 mg de aminoácido por quilograma de peso
corporal ao dia de acordo com Hall (1998) e Costa (2003). Neste experimento optou-se
pela dose de 500 mg/kg de peso corporal por ter sido a dose usada em um estudo
anterior (COSTA, 2003). A dose de ketamina (5 mg/kg) foi adotada considerando
estudos prévios realizados (Hunt et al., 2006; Garcia et al., 2008, 2009). A
administração foi única, pela via intraperitoneal, 60 min antes da realização dos testes.
Diariamente durante todo o tratamento foi mensurado o peso corporal dos
animais, bem como a ingestão hídrica e consumo de ração dos mesmos. Os animais
tiveram o comportamento geral avaliado no campo-aberto seguido de avaliação no
labirinto em cruz elevado nos dias 07, 14, 21 e 28 de tratamento.
4.4 ESTUDO COMPORTAMENTAL
4.4.1 Medida da atividade geral no campo aberto
A atividade geral foi realizada por observação direta dos animais no campo
aberto por um período de 5 minutos, sempre entre as 13 e 18 horas.
O campo aberto utilizado para o estudo do comportamento dos animais adultos
foi construído segundo modelo descrito por Broadhurst (1960), que consiste de uma
arena circular de madeira, com 95 cm de diâmetro e 29 cm de altura, pintada de branco.
O fundo desta arena é dividido em 25 áreas aproximadamente iguais por meio de três
círculos concêntricos e 16 segmentos de reta convenientemente distribuídos (Figura 10).
Cada rato foi colocado individualmente no centro do campo aberto e observado
seu comportamento por 5 minutos, através dos parâmetros:
16
Frequência de locomoção (LO): uma unidade de medida corresponde à
presença das quatro patas dentro do espaço delimitado pelas quatro linhas que compõem
uma subdivisão do chão da arena.
Frequência de levantar (LE): uma unidade de medida corresponde ao
movimento do animal apoiar-se apenas nas patas posteriores, com a cabeça dirigida para
cima e com o corpo perpendicular em relação ao chão da arena, tocando ou não as
paredes laterais com as patas anteriores.
Duração de imobilidade (IMO): total ausência de movimentos do animal com
as quatro patas no piso do campo aberto; registra-se a duração desse parâmetro em
segundos.
Defecação (DEF): ao final dos cinco minutos conta-se o número de bolos
fecais.
O registro das frequências dos parâmetros de locomoção e levantar foram feitos
por intermédio de contador manual. Para a medida da duração de imobilidade
empregou-se um cronômetro. Entre as observações de cada animal, a arena foi limpa
com solução de álcool etílico 5%.
Figura 10: Campo aberto.
Fonte: Arquivo pessoal Ana Laura Souza (2012).
4.4.2 Medida da ansiedade no labirinto em cruz elevado
Foi realizada através da observação direta dos animais no labirinto, por um
período de 5 minutos, logo após a observação destes no campo aberto.
17
O labirinto em cruz elevado é constituído de dois braços abertos opostos,
medindo 50 x 10 cm e dois braços fechados, também opostos, medindo 50 x 10 x 40
cm, dispostos em um ângulo de 90º. O piso do labirinto é de madeira, pintado de cinza e
distante 50 cm do chão (Figura 11).
O rato foi colocado, individualmente, no centro do labirinto, com a cabeça
voltada em direção a um dos braços abertos e, durante 5 minutos, foram observados os
parâmetros: número de entradas nos braços abertos; número de entradas nos braços
fechados; tempo de permanência nos braços abertos, tempo de permanência nos braços
fechados e tempo de permanência no centro do labirinto.
O registro do número de entradas nos braços abertos e fechados foi feito por
intermédio de contador manual. Para o tempo de permanência nos braços empregou-se
o cronômetro (segundos). Entre as observações de cada animal, a arena foi limpa com
solução de álcool 5%. Com os dados obtidos, calculou-se a porcentagem de entradas e o
tempo de permanência nos braços abertos e fechados.
Figura 11: Labirinto em cruz elevado.
Fonte: Arquivo pessoal Ana Laura Souza (2012).
4.5 ANÁLISE BIOQUÍMICA
No dia 30 de tratamento os animais foram anestesiados com tiopental (80 mg/kg;
i.p.) para a coleta de sangue, que foi realizada por punção cardíaca ou punção na veia
hepática. Após centrifugação o soro foi empregado para as dosagens das enzimas
hepáticas ALT e AST, e para as dosagens de creatinina e de uréia. As razões AST/ALT
em seguida foram calculadas.
18
4.6 ESTUDO HISTOPATOLÓGICO
Após a coleta de sangue, os animais anestesiados foram submetidos à eutanásia
por deslocamento cervical. Em seguida, baço, cérebro, coração, fígado, testículos e rim
foram coletados, examinados macroscopicamente, mensurados seus pesos e calculada a
razão peso órgão/peso corporal. Porções teciduais foram fixadas em formol 10%,
encaminhadas para a Professora Cláudia Nunes Oliveira do Departamento de Patologia
da UFRN, para a confecção e interpretação de lâminas histológicas.
Os fragmentos de fígado e rim removidos foram fixados por imersão em formol
tamponado a 10%. Durante o processamento do tecido este foi submetido à
desidratação. Em seguida foi realizada diafanização em xilol e impregnação pela
parafina. A inclusão foi realizada em blocos de parafina. Os cortes histológicos foram
preparados por microtomia, a 4 µm, e corados pela técnica de rotina da Hematoxilina
Eosina (HE).
A análise histopatológica dos fragmentos de tecidos foi realizada pela
observação de diversos parâmetros. Para fígado: alteração arquitetural, apoptose,
necrose, degeneração hidrópica, esteatose, colestase, proliferação ductular, fibrose,
respiração inflamatória, presença de corpúsculo de Mallory. Para rim: congestão,
resposta inflamatória, tumefação tubular, perda da polaridade, desprendimento, necrose,
apoptose, tubulorrex, cilindros e outros aspectos. Para baço: avaliação de edema,
infiltração leucocitária nas polpas branca (zonas B e T) e vermelha. Para testículos:
espermatogênese, células de Leydig, fibrose/hialinização. Para cérebro: inflamação,
necrose/reação glial, edema. Para coração: inflamação, necrose coagulativa,
fibrose/hialinização.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A homocedasticidade dos dados foi avaliada pelo teste de Bartlett. Em seguida,
os dados obtidos de cada grupo experimental foram comparados com o grupo controle,
através da Análise de Variância (ANOVA), seguido pelo post-hoc teste de Tukey-
Kramer, quando necessário. Para todos os dados foi considerado o nível de significância
de 5%. Foi empregado o software estatístico GRAPHPAD INSTAT 5.1.
19
5 RESULTADOS
A análise estatística revelou que as três doses de P. ginseng provocaram
elevados consumos de água e de ração (p<0,01), quando os dados foram comparados
com aqueles provenientes do grupo branco. As médias e respectivos erros do desvio
estão apresentados na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Ingestão hídrica (mL) e consumo de ração (g) de ratos tratados ou não (grupo
ketamina, glicina e branco) durante 30 dias com diferentes doses de P. ginseng. São
apresentados as médias e os respectivos erros padrão (n=12/grupo).
Intervalo
de dias
P.ginseng
100mg/kg
P.ginseng
200mg/kg
P.ginseng
300mg/kg Branco (n=6) F
Água
01-15 306,43 ± 3,14* 281,71 ± 3,88* 290,43 ± 3,63* 185,00 ± 8,30 53,67
Água
16-29 300,29 ± 1,90* 275,43 ± 6,51* 291,14 ± 7,25* 184,57 ± 6,26 34,93
Ração
01-15 183,00 ± 8,07* 179,00 ± 5,57* 172,00 ± 3,75* 94,71 ± 2,53 23,20
Ração
16-29 182,57 ± 7,14* 174,71 ± 3,83* 180,29 ± 4,55* 95,14 ± 3,10 21,13
ANOVA: Tukey (*p<0,01)
Os animais tratados com as diferentes doses de P. ginseng não apresentaram
alterações no ganho de peso corporal total, calculado considerando todo o período de
tratamento (dia 01-29) quando comparados com o grupo branco, Conforme
demonstrado na Tabela 2.
Tabela 2: Ganho de peso corporal (g) de ratos tratados ou não (grupo ketamina, glicina e
branco) durante 30 dias com diferentes doses de P. ginseng. São apresentados as médias
e os respectivos erros padrão (n=12/grupo).
Intervalo
de dias
Ketamina
5mg/kg
Glicina
500mg/kg
P.ginseng
100mg/kg
P.ginseng
200mg;kg
P.ginseng
300mg;kg
Branco
(n=6) F
01-09 1,75 ±
4,07*
12,33 ±
3,46
9,17 ±
1,96
12,58 ±
2,73
17,08 ±
3,11
16,50 ±
2,51 3,120
11-19 10,83 ±
1,67
6,08 ±
1,28
10,83 ±
2,29
8,17 ±
1,76
9,92 ±
2,27
10,00 ±
1,00
21-29 2,25 ±
2,06**
5,17 ±
0,66
7,67 ±
1,26
5,75 ±
1,44
11,08 ±
1,97
9,50 ±
0,72 4,164
01-29 20,92 ±
5,37
26,92 ±
4,86
30,92 ±
4,48
31,33 ±
6,25
43,83 ±
7,09
39,50 ±
1,18 2,134
ANOVA: Tukey (*p<0,05; **p<0,01)
20
Nos parâmetros locomoção e levantar, observados no campo aberto, não foram
observadas diferenças entre os grupos tratados com as três doses de P. ginseng, glicina e
ketamina. Entretanto, os dois parâmetros mostraram estarem reduzidos nos testes
realizados nos dias 14, 21 e 28 de tratamento em todos os grupos quando comparado
com o grupo branco, conforme observado na Tabela 3.
Não foram encontradas alterações no número de bolos fecais nos diferentes
grupos analisados. O tempo de imobilidade mensurado no dia sete de tratamento foi
diferente apenas para o grupo tratado com 200mg/kg de P. ginseng quando comparado
como grupo branco e glicina. No dia 14 de tratamento, os grupos glicina e P.ginseng
(100 e 200 mg/kg) apresentaram maior imobilidade em relação ao grupo branco e
apresentou menor imobilidade em relação ao grupo glicina. Nos dias 21 e 28 todos os
grupos tratados com P. ginseng, glicina e ketamina apresentaram maior tempo de
imobilidade em comparação ao grupo branco. Esses dados estão apresentados na Tabela
3 a seguir.
21
Tabela 03: Atividade geral no campo aberto de ratos tratados ou não (grupo ketamina,
glicina e branco) durante 30 dias com diferentes doses de P. ginseng. São apresentados
as médias e os respectivos erros padrão (n=12/grupo).
Dia Ketamina
5mg/kg
Glicina
500mg/kg
P. ginseng
100mg/kg
P. ginseng
200mg/kg
P. ginseng
300mg/kg
Branco
(n=6)
F
Locomoção
7º 69,83 ±
5,96
67,50 ± 8,73 71,92 ±
6,28
59,42 ±
4,11
80,42 ±
8,77
83,17 ±
12,22
14º 53,17 ±
4,35*
49,00 ±
3,13**
52,50 ±
5,90*
45,50 ±
4,31**
71,83 ±
6,20
81,33 ±
8,92
5,877
21º 7,67 ±
1,14**
6,58 ±
1,05***
10,25 ±
2,31*
9,50 ±
2,15*
10,58 ±
1,47*
19,33 ±
2,35
4,232
28º 83,83 ±
7,82 a
59,42 ± 4,62 63,00 ±
3,89
61,17 ±
3,63a
74,42 ±
4,81
76,00 ±
5,44
3,590
Levantar
7º 14,42 ±
2,05
13,83 ± 1,71 21,00 ±
3,66
14,25 ±
3,08
19,67 ±
2,66
20,17 ±
3,77
14º 10,67 ±
1,37**
9,42 ±
1,30***
11,58 ±
1,13**
13,25 ±
1,77*
18,42 ±
3,53
26,67 ±
5,08
5,735
21º 7,67 ±
1,14***
6,58 ±
1,05***
10,25 ±
2,31**
9,50 ±
2,15**
10,58 ±
1,47**
23,50 ±
3,13
7,070
28º 11,00 ±
2,46**
8,67 ±
1,12***
9,67 ±
1,09***
7,50 ±
1,16***
9,33 ±
1,97***
23,17 ±
4,50
5,633
Imobilidade
7º 82,92 ±
11,30
108,58 ±
12,94
135,17 ±
14,02
154,00 ±
19,19** a
114,75 ±
11,82
66,17 ±
12,86
4,404
14º 69,25 ±
11,84 aaa
152,17 ±
13,18***
144,75 ±
15,49**
139,33 ±
16,11 **
101,67 ±
9,59
56,00 ±
6,99
8,175
21º 148,58 ±
16,18*
147,92 ±
17,61*
150,25 ±
13,50*
163,00 ±
13,74*
140,75 ±
8,92*
76,00 ±
12,92
2,835
28º 157,08 ±
15,56**
154,92 ±
17,37**
187,67 ±
16,74**
179,67 ±
12,84**
139,08 ±
14,48**
74,50 ±
9,72
4,625
Bolos Fecais
7º 1,25 ±
0,54a
3,75 ± 0,54 3,58 ± 0,56 2,08 ± 0,45 2,67 ± 0,80 3,00 ± 0,68 2,614
14º 1,83 ± 0,62 2,25 ± 0,48 1,83 ± 0,36 2,33 ± 0,47 1,50 ± 0,29 2,00 ± 0,36
21º 1,75 ± 0,54 2,33 ± 0,48 1,92 ± 0,64 1,58 ± 0,26 2,58 ± 0,67 2,67 ± 0,33
28º 2,83 ± 0,72 2,17 ± 0,72 3,50 ± 0,73 2,50 ± 0,62 2,00 ± 0,67 3,00 ± 0,58
ANOVA-Tukey. Tratamentos x branco (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001)
Tratamentos x glicina (aaa
p<0,001; ap<0,05)
Diversos parâmetros foram analisados no teste comportamental no labirinto em
cruz elevado. A análise estatística empregada (ANOVA) revelou ausência de alterações
no parâmetro número de entradas nos braços abertos (EBA). Apenas no dia sete de
análise esse parâmetro mostrou-se elevado nos animais tratados com a maior dose de P.
ginseng em relação ao grupo branco. Não foram observadas alterações no parâmetro
número de entradas nos braços fechados (EBF). Apenas nos dias 21 e 28 de tratamento
foi observado que o grupo ketamina realizou maior número de entradas nos braços
22
fechados do labirinto em relação ao grupo glicina. Não foram constatadas alterações no
parâmetro tempo de permanência nos braços abertos (TBA), em todos os dias de
análise, para todos os grupos. Também não foram observadas alterações no tempo de
permanência nos braços fechados (TBF) do labirinto. Exceto no dia 28 de tratamento,
dia em que o grupo ketamina apresentou maior TBF em relação ao grupo branco. O
tempo de permanência no centro do labirinto não foi diferente entre os grupos. Esses
resultados estão apresentados na Tabela 4.
Os parâmetros bioquímicos não foram diferentes entre os grupos tratados com as
três doses de P. ginseng, glicina e ketamina. Entretanto,
Foram observadas diferenças significantes em alguns parâmetros bioquímicos
entre os grupos tratados com as três doses de P. ginseng e o grupo branco. Os níveis
séricos de AST foram elevados para todos os grupos em relação ao grupo branco.
Entretanto, a razão ALT/AST foi conservada. Os níveis séricos de creatinina dos grupos
P. ginseng (100 e 200 mg/kg) foi diminuído em relação ao grupo branco. Os níveis
séricos de ureia foram reduzidos nos grupos tratados com P. ginseng em relação ao
grupo branco conforme se pode observar na Tabela 5.
23
Tabela 04: Comportamento de ratos tratados ou não (grupo ketamina, glicina e branco)
no labirinto em cruz elevado durante 30 dias com diferentes doses de P. ginseng. São
apresentados as médias e os respectivos erros padrão (n=12/grupo).
Dia Ketamina
5mg/kg
Glicina
500mg/kg
P.ginseng
100mg
P.ginseng
200mg
P.ginseng
300mg
Branco
(n=6) P F
Número de entradas nos braços abertos
7º 0,42 ±
0,15
0,58 ±
0,19
0,75 ±
0,33
0,58 ±
0,19
1,42 ±
0,40*
0,00 ±
0,00 2,605 0,0338
14º 0,50 ±
0,19
1,17 ±
0,40
0,58 ±
0,34
0,25 ±
0,18
0,67 ±
0,43
0,17 ±
0,17 0,3627
21º 0,50 ±
0,26
0,08 ±
0,08
0,50 ±
0,34
0,67 ±
0,22
0,58 ±
0,19
0,17 ±
0,17 0,4619
28º 0,33 ±
0,14
0,08 ±
0,08
0,67 ±
0,22
0,50 ±
0,15
0,25 ±
0,13
0,17 ±
0,17 0,0996
Número de entradas nos braços fechados
7º 4,33 ±
0,77
2,67 ±
0,82
2,42 ±
0,42
1,67 ±
0,35
3,25 ±
0,76
1,67 ±
0,33 2,330
14º 4,83 ±
0,89
3,75 ±
0,87
2,83 ±
0,72
1,83 ±
0,40
4,17 ±
0,88
1,83 ±
0,31 2,441
21º 5,42 ±
1,07*
3,33 ±
0,65
3,00 ±
0,70
2,33 ±
0,58
3,83 ±
0,95
1,33 ±
0,21 2,533 0,0381
28º 5,33 ±
0,69**aa
2,67 ±
0,57
3,50 ±
0,66
3,08 ±
0,86
3,17 ±
0,44
1,33 ±
0,21 3,301 0,0107
Tempo de permanência (s) nos braços abertos
7º 2,75 ±
1,07
1,92 ±
0,66
2,25 ±
0,90
1,58 ±
0,57
3,58 ±
1,05
0,00 ±
0,00 0,2167
14º 1,25 ±
0,54
3,08 ±
1,04
1,25 ±
0,75
0,67 ±
0,51
2,08 ±
1,43
0,33 ±
0,33 0,3666
21º 1,50 ±
0,86
0,25 ±
0,25
1,17 ±
0,66
2,00 ±
0,77
1,50 ±
0,50
0,50 ±
0,50 0,4216
28º 1,50 ±
0,73
0,25 ±
0,25
2,08 ±
0,74
1,67 ±
0,53
0,92 ±
0,51
0,33 ±
0,33 0,1878
Tempo de permanência (s) nos braços fechados
7º 286,25 ±
1,69
288,83 ±
1,46
290,58 ±
1,45
289,58 ±
1,27
289,67 ±
1,57
292,33 ±
1,91 0,2199
14º 290,25 ±
1,03
289,33 ±
1,44
293,50 ±
1,45
292,42 ±
1,03
290,33 ±
1,75
295,50 ±
1,06 2,316 0,0545
21º 292,00 ±
1,85
294,00 ±
0,85
290,83 ±
1,41
292,17 ±
1,15
291,75 ±
1,08
295,17 ±
1,25 0,3462
28º 289,08 ±
1,90*
294,00 ±
1,16
290,42 ±
1,23
291,17 ±
1,34
290,50 ±
1,03
296,00 ±
1,65 2,688 0,0294
Tempo de permanência (s) no centro
7º 11,00 ±
1,40
9,25 ±
1,23
7,17 ±
0,83
8,83 ±
1,17
6,75 ±
0,81
7,67 ±
1,91 0,1111
14º 8,50 ±
0,89
7,58 ±
0,88
5,25 ±
1,02
6,92 ±
0,87
7,58 ±
0,67
4,50 ±
1,06 0,0554
21º 6,50 ±
1,26
5,75 ±
0,81
8,00 ±
1,37
5,83 ±
0,62
6,75 ±
0,90
4,33 ±
0,88 0,3700
28º 15,67 ±
5,23
7,67 ±
2,28
9,92 ±
2,00
17,75 ±
6,34
10,67 ±
1,87
3,67 ±
1,33 0,2300
ANOVA-Tukey. Tratamentos x branco (*p<0,05; **p<0,01); Tratamentos x glicina (aa
p<0,01).
24
Tabela 5: Parâmetros bioquímicos mensurados no soro de ratos tratados ou não (grupo
ketamina, glicina e branco) no labirinto em cruz elevado durante 30 dias com diferentes
doses de P. ginseng. São apresentados as médias e os respectivos erros padrão
(n=12/grupo).
Parâmetro Ketamina
5mg/kg
Glicina
500mg/kg
P. ginseng
100mg/kg
P. ginseng
200mg/kg
P. ginseng
300mg/kg
Branco
(n=6) F
ALT (U/L) 44,17 ±
1,81
56,73 ±
4,00
56,58 ±
4,13
52,00 ±
4,33
54,45 ±
4,96
47,33 ±
1,52
AST (U/L)
105,17 ±
11,35*
149,18 ±
13,71**
116,58 ±
6,53 *
151,83 ±
12,48**
136,64 ±
14,35**
96,50 ±
2,04 3,527
AST/ALT 0,43 ±
0,03
0,40 ±
0,03
0,49 ±
0,03
0,36 ±
0,04*
0,41 ±
0,03
0,49 ±
0,02 2,255
Creatinina
(mg/dL)
0,54 ±
0,03**
0,67 ±
0,04**
0,77 ±
0,04*
0,73 ±
0,06*
0,88 ±
0,10
0,89 ±
0,02 4,594
Ureia
(mg/dL)
58,92 ±
3,96
52,09 ±
5,10
45,33 ±
1,03*
43,58 ±
2,37*
42,73 ±
1,38**
50,17 ±
3,97 3,985
ANOVA-Tukey. Tratamentos x branco (*p<0,05; **p<0,01).
A razão peso órgão/peso corporal apresentou diferenças entre os grupos
tratados com as três doses de P. ginseng e o grupo branco para todos os órgãos
analisados, exceto cérebro e testículos, conforme se pode observar na Tabela 6.
Tabela 6: Razão peso órgão/peso corporal de ratos tratados ou não (grupo ketamina,
glicina e branco) no labirinto em cruz elevado durante 30 dias com diferentes doses de
P. ginseng. São apresentados as médias (x104) e os respectivos erros padrão (x10
4)
(n=12/grupo).
ANOVA-Tukey. Tratamentos x branco (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001)
Tratamentos x ketamina (aa
p<0,01; aaa
p<0,001)
O estudo histopatológico revelou que cinco animais (41,7%) tratados com
glicina, dois animais (16,7%) tratados com 200mg/kg de P. ginseng, seis animais
Orgãos Ketamina
5mg/kg
Glicina
500mg/kg
P.ginseng
100mg/kg
P.ginseng
200mg/kg
P.ginseng
300mg/kg
Branco
(n=6) F
Baço 20,00 ±
1,74
19,17 ±
0,83*
20,00 ±
0,64
19,17 ±
0,83*
20,00 ±
0,64
25,00 ±
2,24 2,70
Cérebro 43,33 ±
2,25
47,50 ±
2,79
40,83 ±
2,29
43,33 ±
1,88
45,00 ±
1,51
40,00 ±
0,10
Coração 34,17 ±
2,88
34,17 ±
1,49
32,50 ±
1,31*
30,83 ±
0,83**
30,83 ±
1,49**
41,67 ±
1,67 3,42
Fígado 317,5 ±
3,10*
321,7 ±
7,77*
323,3 ±
6,99*
338,3 ±
10,93
327,5 ±
8,89*
410,0 ±
10,33 2,94
Rim 35,83 ±
1,93 **
19,17 ±
0,83***
35,00 ±
1,95 **
32,50 ±
1,31 ***
20,00 ±
6,39 ***
46,67 ±
4,94 29,72
Testículo 52,50 ±
2,50
45,00 ±
2,30
38,33 ±
2,07
43,33 ±
1,42
39,17 ±
3,13
50,00 ±
3,651 5,22
25
tratados com 300mg/kg de P. ginseng (50%) apresentaram resposta inflamatória no
fígado, ilustrado pelo extravasamento leucocitário provavelmente explicado pelo uso
prolongado do fitoterápico. Todos os animais tratados com as três doses de P. ginseng
apresentaram congestão no tecido renal. Não foram encontradas alterações no baço,
testículos ou coração. Foi observado edema discreto no cérebro dos animais de todos os
grupos. Entretanto, a morfologia celular dos diversos tecidos foi mantida após o
tratamento dos animais com as diferentes doses de P. ginseng, conforme ilustrado nas
Figuras 12 a 17.
Figura 12 – Corte histológico (10x) de baço de ratos do grupo branco (A), ratos tratados com P.
ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C), 300mg/kg (D). Não houve alterações morfológicas
significativas no tecido
26
Figura 13: Corte histológico (40x) de cérebro de rato do grupo branco (A), ratos tratados com P.
ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C), 300mg/kg (D). Não houve alterações morfológicas
significativas no tecido
27
Figura 14: Corte histológico (10x) de coração baço de ratos do grupo branco (A), ratos tratados
com P. ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C), 300mg/kg (D). Não houve alterações morfológicas
significativas no tecido
28
Figura 15: Corte histológico (10x) de fígado de ratos do grupo branco (A), ratos tratados com P.
ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C), 300mg/kg (D). Não houve alterações morfológicas
significativas no tecido. A seta na foto D indica extravasamento leucocitário.
29
Figura 16: Corte histológico (10x) de rim de ratos do grupo branco (A), ratos tratados com P.
ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C), 300mg/kg (D). Não houve alterações morfológicas
significativas no tecido. As setas indicam edema nos túbulos dos néfrons.
30
Figura 17: Corte histológico (10x) de testículo de ratos do grupo branco (A), ratos tratados com P.
ginseng – 100mg/kg (B), 200mg/kg (C), 300mg/kg (D). Não houve alterações morfológicas
significativas no tecido.
31
6 DISCUSSÃO
Panax ginseng exerce vários efeitos no organismo, incluindo ação antitumoral,
propriedades antioxidantes e hipoglicemiantes. É um medicamento fitoterápico
padronizado e legislado pela Agênica Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Fitoterápicos são medicamentos provenientes de plantas medicinais. Eles são obtidos
empregando-se exclusivamente derivados de droga vegetal (extrato, tintura, óleo, cera,
exsudato, suco e outros). O presente estudo investigou a toxicidade e alterações no
comportamento de ratos tratados com um extrato seco padronizado de P. ginseng e
comparou os dados obtidos com aqueles provenientes de ratos tratados com glicina e
ketamina, para melhor entendimento da ação desse fitoterápico.
A avaliação da toxicidade geral de P. ginseng foi investigada nos ratos através
da observação e acompanhamento do peso corporal, consumo de ração e ingestão
hídrica, cálculo do ganho de peso corporal e das razões peso órgão/peso corporal para
fígado, rim, baço, testículos, cérebro e coração, dosagens dos parâmetros bioquímicos
AST, ALT, ureia e creatinina em soro e do estudo histopatológico dos órgãos acima
citados. Um estudo realizado com ratos demonstrou que doses de P. ginseng, variando
de 43 a 86 mg/kg, administradas a ratos por 10 dias, não foram capazes de alterar o
consumo de ração dos animais (CICERO et al., 2000). Entretanto, nosso estudo revelou
maior consumo de ração, resultante muito provavelmente do tratamento mais
prolongado (30 dias) com doses mais elevadas de P. ginseng. Em relação ao ganho de
peso total, de acordo com a Tabela 02, os resultados obtidos não foram significativos
entre os grupos tratados quando comparado ao grupo branco, ao contrário dos dados
obtidos por Karu, Reifen e Kerem (2007). Esses autores demonstraram que a
suplementação dietética com saponinas de P. ginseng inibe aumento no peso corporal
de camundongos machos. Vale salientar que os ratos tratados com P. ginseng no atual
estudo apresentaram maior consumo de ração, porém não apresentaram alterações no
ganho de peso corporal. Esses resultados em conjunto, de certa forma corroboram com
aqueles obtidos por Karu, Reifen e Kerem (2007).
A atividade geral, também chamada de atividade motora ou espontânea, mensura
a capacidade do animal de se movimentar numa área desconhecida independente de
estímulos ambientais. No experimento realizado no campo aberto, fatores ambientais
(aparelho, intensidade de luz) e fatores biológicos (idade, sexo, horário), foram
32
padronizados para uma correta determinação da atividade geral, conforme sugerido por
Reiter e Mc-Phail (1982).
Um estudo realizado com ratos tratados com 43 e 86 mg/kg de P. ginseng durante
10 dias revelou maior atividade espontânea nos animais no campo aberto (CICERO;
BANDIERI; ARLETTI, 2000). Esses dados não corroboram com os resultados
observados no atual estudo, onde os grupos tratados com as diferentes doses de P. ginseng
e os grupos controles não apresentaram diferenças significativas. Entretanto quando
comparados ao grupo branco, houve uma atividade espontânea reduzida. É provável que a
exposição prolongada (acima de 20 dias) ao extrato padronizado de P. ginseng possa ter
provocado alterações fisiológicas, como por exemplo, aumento da ação de enzimas
metabolizadoras, alterando a farmacocinética dos ginsenosídeos no organismo e
diminuindo a sua meia vida de ação (CICERO; BANDIERI; ARLETTI, 2000).
Antagonistas dos receptores NMDA, como a ketamina, por exemplo, podem
afetar vários aspectos da emocionalidade incluindo medo, ansiedade e depressão, bem
como prejudicar, de certa forma, a aprendizagem e memória. Estruturas do cérebro no
lobo temporal medial, tais como o hipocampo e a amígdala, estão interligadas entre a
cognição e a emoção e são os sítios prováveis em que antagonistas dos receptores
NMDA podem exercer seus efeitos sobre a emocionalidade (BARKUS et al., 2010). A
defecação é um parâmetro empregado para avaliar a emocionalidade do animal, todavia
pouco explica alterações na atividade geral. Em nosso estudo mensuramos o número de
bolos fecais com o objetivo de auxiliar na investigação do possível efeito ansiogênico
decorrente do tratamento com P. ginseng. Não foram evidenciadas alterações nesse
parâmetro em todos os grupos tratados em comparação com o grupo branco, conforme
demonstrado na Tabela 03.
No sétimo dia de tratamento, apenas os animais tratados com a dose de
200mg/kg de P. ginseng apresentaram maior imobilidade no campo aberto quando
comparados os grupos branco, glicina e ketamina. Já no dia 14 de tratamento, os grupos
glicina e P. ginseng (100 e 200mg/kg) tiveram maior imobilidade quando comparados
ao grupo branco. Nesse mesmo dia, o grupo ketamina apresentou reduzido tempo de
imobilidade em comparação ao grupo glicina. Nos demais dias de tratamento (21 e 28)
todos os grupos tratados apresentaram maior tempo de imobilidade em comparação ao
grupo branco. Como já dito anteriormente, é provável que a exposição prolongada
(acima de 20 dias) ao extrato padronizado de P. ginseng possa ter provocado alterações
fisiológicas, como por exemplo, aumento da ação de enzimas metabolizadoras,
33
alterando a farmacocinética dos ginsenosídeos no organismo e diminuindo a sua meia
vida de ação (CICERO; BANDIERI; ARLETTI, 2000). Por esse motivo, o
comportamento de freezing (elevada imobilidade) foi observado em todo o
experimento. É provável que as diferentes doses de P. ginseng tenham sido suficientes
para promover o aumento da imobilidade, tanto pela via glutamatérgica quanto por
outras vias de neurotransmissores que possam estar envolvidos (BARKUS et al., 2010).
O parâmetro levantar, ainda mensurado no campo aberto, indica exploração do
animal. Esse parâmetro não foi diferente entre os grupos tratados com as três doses de
P. ginseng, ketamina e glicina. Todavia, a exploração apresentou-se diminuída nos
diversos grupos quando comparados ao grupo branco. Mais uma vez, é provável que a
cinética dos ginsenosídeos presentes no extrato tenha sido alterada ao longo do
experimento (CICERO; BANDIERI; ARLETTI, 2000).
O labirinto em cruz elevado é um modelo de triagem, bem estabelecido, para testar
a ação ansiogênica ou ansiolítica de fármacos (FILE; HYDE, 1978). É sabido que P.
ginseng induz efeitos sedativos em doses mais elevadas e efeito ansiolítico em doses mais
baixas (LIU et al., 2011). Uma dose baixa de extrato seco de P. ginseng (100 mg/kg) não
aumentou a porcentagem de entradas nos braços abertos ou o tempo gasto em braços
abertos, indicando não ocorrência de efeito ansiolítico (LIU et al., 2011). Os dados obtidos
no atual estudo, referente ao comportamento no labirinto em cruz elevado, corroboram os
do estudo acima. Os ratos tratados com 100, 200 e 300 mg/kg de P. ginseng durante 30 dias
não apresentaram alterações nos diversos parâmetros estudados, em comparação com o
grupo controle positivo (tratado com glicina), com o grupo controle negativo (tratado com
ketamina) e com o grupo branco, conforme observado na Tabela 04. Diante do exposto, é
sugerido que P. ginseng, nas doses empregadas em ratos, não é capaz de exercer ação
ansiolítica nem ansiogênica. Entretanto, estudos têm demonstrado que doses de P. ginseng,
variando entre 20 a 100 mg/kg provocaram ação ansiolítica, em ratos e camundongos no
campo aberto e no labirinto em cruz elevado, quando comparado com diazepam
(BHATTACHARYA; MITRA, 1991; PARK et al., 2005).
De acordo com Engin et al. (2009), a ketamina, antagonista não-competitivo do
receptor NMDA, ao contrário do previsto, produziu efeitos ansiogênicos em ratos. Esse
anestésico diminuiu o tempo gasto nos braços abertos do labirinto elevado e a interação
social desses animais. A ação ansiogênica da ketamina também foi evidenciada em ratos no
labirinto em cruz elevado, após tratamento por via oral durante 35 dias (SILVESTRE et al.,
2002), mas não após cinco semanas de testes, onde os animais receberam a ketamina (30
34
mg/kg; i.p), diariamente (BECKER et al., 2003). Curiosamente, em doses tão baixas como
0,1 mg/kg (i. v.), a ketamina reduz a ansiedade em voluntários humanos saudáveis
(KRYSTAL et al., 1994), de acordo com o perfil ansiolítico exibido por outros fármacos
antagonistas competitivos e não competitivos do receptor NMDA. Em nosso estudo, a
ketamina não foi capaz de provocar alterações nos diversos parâmetros analisados no
labirinto em cruz elevado. Assim como o P. ginseng e a glicina, a ketamina não
demonstrou, no atual estudo, efeito ansiogênico nem ansiolítico.
As enzimas aspartato-aminotransferase (AST) ou transaminase glutâmico-
oxalacética (GOT) e alanina-aminotransferase (ALT) ou transaminase glutâmico-pirúvica
(GPT), catalisam a transferência reversível dos grupos amino de um aminoácido para o 2-
oxoglutarato, formando cetoácido e ácido glutâmico. As reações catalisadas pelas
aminotransferases exercem papéis centrais tanto na síntese como na degradação de
aminoácidos. As aminotransferases estão amplamente distribuídas nos tecidos. As
atividades mais elevadas de AST encontram-se no miocárdio, no fígado e no músculo
esquelético, com pequenas quantidades nos rins, no pâncreas, no baço, no cérebro, nos
pulmões e nos eritrócitos (MOTTA, 2009). As dosagens séricas das enzimas hepáticas AST
e ALT são mensuradas para investigar e monitorar doenças hepáticas, sendo empregadas
para complementar dados de peso corporal e estudo histopatológico. Os níveis séricos de
ALT, enzima citoplasmática, estão elevados quando ocorrem alterações na permeabilidade
dos hepatócitos. A AST é mitocondrial, não sendo liberada tão rapidamente quanto a ALT
na corrente sanguínea. É sabido que a ALT é indicador mais sensível de hepatotoxicicidade
do que a AST, pois enquanto a primeira é essencialmente hepática, a segunda também pode
ser encontrada em altas concentrações em outros órgãos como coração, rins e pulmões
(MOTTA, 2006). Nível sérico elevado de AST (alanina aminotransferase) tem sido
proposto como um indicador de que o álcool tem induzido danos nos órgãos. Assim,
quando a proporção AST/ALT é maior que dois, é considerado como altamente sugestiva
de que o álcool é a causa da lesão do fígado do paciente. No entanto, quando a relação é
inferior a um, sugere esteatohepatite não alcoólica. Muitos pacientes que, sem dúvida,
consomem grandes quantidades de álcool e na verdade são dependentes de álcool e
apresentam elevados níveis séricos de aminotransferases não mostram uma relação
AST/ALT elevada. Isto sugere que fatores adicionais modulam a razão AST/ALT. Um
destes fatores pode ser a gravidade da doença do fígado (NYBLOM et al., 2004). Conforme
demonstrado na Tabela 05, não foram observadas alterações no parâmetro ALT. Entretanto,
os níveis séricos de AST foram elevados em todos os grupos tratados quando comparados
35
ao grupo branco. Contudo, a análise estatística revelou a preservação na razão AST/ALT
em todos os grupos experimentais.
Os aminoácidos provenientes do catabolismo protéico são desaminados com a
produção de amônia. Como esse composto potencialmente tóxico, é convertido em uréia
(NH2- CO- NH2) no fígado, associado ao CO2. A uréia constitui a maior parte do
nitrogênio não protéico no sangue. Após a síntese exclusivamente hepática, a uréia é
transportada pelo plasma até os rins, onde é filtrada pelos glomérulos. A uréia é
excretada na urina, embora 40% a 70% seja absorvida por difusão passiva pelos túbulos.
A concentração de uréia no plasma é afetada pela função renal, pelo conteúdo protéico
da dieta e pela amplitude do catabolismo protéico, pelo estado de hidratação do paciente
e pela presença de sangramento intestinal (MOTTA, 2009). A creatinina é produzida
como resultado da desidratação não enzimática da creatina muscular. A creatina, por sua
vez, é sintetizada no fígado, nos rins e no pâncreas por duas reações mediadas
enzimaticamente. Na primeira, a transamidação da arginina e da glicina forma ácido
guanidinoacético. Na segunda, ocorre com a doação de metila pela S-adenosilmetionina.
Em presença de teores marcadamente elevados de creatinina no plasma, parte da mesma
é também excretada pelos túbulos renais. A quantidade de creatinina excretada
diariamente é proporcional à massa muscular e não é afetada por dieta (exceto em caso
de excesso de proteínas), idade, sexo ou exercício e corresponde a 2% das reservas
corpóreas da creatina-fosfato. A creatinina é o principal indicador de função renal.
Entretanto, a mensuração do nível sérico de uréia é importante por tornar possível a
distinção entre várias causas da insuficiência renal, permitindo estabelecer um
diagnóstico (MOTTA, 2006). Em nosso trabalho, ocorreu redução dos níveis séricos de
uréia nos animais que receberam ketamina, glicina e P. ginseng, nas doses de 100 e 200
mg/kg, em relação ao grupo branco; e dos níveis séricos de creatinina nos animais
tratados com as diferentes doses de P. ginseng em relação ao grupo branco.
As doses de P. ginseng administradas em ratos durante 30 dias parece não serem
capazes de provocar nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. A presença de congestão no rim de
todos os animais dos grupos tratados com P. ginseng pode ser consequência dos
procedimentos adotados na coleta e fixação desse tecido em formol 10%. Já a resposta
inflamatória, constatada pela infiltração leucocitária em amostras de fígado e rim de alguns
animais, sugere que as doses de P. ginseng empregadas não foram capazes de provocar
toxicidade, mas que doses superiores ou tratamento mais prolongado, talvez possam causar
efeitos tóxicos. Ainda, as razões peso fígado/peso corporal e peso rim/peso corporal,
36
calculadas para cada animal, também sugerem, conforme demonstrado na Tabela 06,
ausência de nefrotoxicidade e hepatotoxicidade.
Diante do exposto, os dados aqui apresentados sugerem que o tratamento de ratos
durante 30 dias com as diferentes doses de P. ginseng não foi capaz de provocar
toxicidade nem alterações comportamentais no campo aberto e no labirinto em cruz
elevado, quando esse extrato padronizado foi comparado com grupo branco. Algumas
alterações foram encontradas em relação ao grupo branco. Entretanto, acredita-se que o
uso desse extrato enquanto medicamento mostra-se bastante seguro, corroborando estudos
anteriormente realizados. Sendo amplamente utilizado na medicina popular,
principalmente como um tônico geral para manter a resistência do organismo a fatores
adversos e homeostase, inclusive melhorando a função física e sexual e a vitalidade geral,
P. ginseng e seus ginsenosidios parecem ser benéficos para a imunidade e na prevenção
do câncer e diabetes. Embora um único ginsenosídeo mostre ser benéfico sobre alguns
efeitos ou condições, resta determinar se um único componente ou misturas de
componentes derivados de P. ginseng pode maximizar o benefício através de diversas
doenças e condições. Portanto, maiores pesquisas sobre a relação estrutura-atividade entre
os constituintes de P. ginseng, agindo individualmente ou em uma mistura sinérgica, são
necessárias para prever e garantir a eficácia fisiológica e farmacológica. Além disso,
muitos passos devem ser tomados para uniformizar o uso da raiz de P. ginseng e, assim,
isolar ginsenosídeos específicos (WEE; PARK; CHUNG, 2011).
A padronização formulada de P. ginseng e o isolamento do extrato de
ginsenosidio são claramente necessárias na obtenção de resultados confiáveis por testes
desenvolvidos em animais e em humanos. Finalmente, em larga escala, estudos clínicos
controlados são necessários para validar os resultados em termos de sua aplicabilidade
para os seres humanos para estender essas experiências relatadas que foram realizados
em modelos animais (WEE; PARK; CHUNG, 2011).
37
7 CONCLUSÃO
O tratamento de ratos durante 30 dias com as diferentes doses de P.
ginseng, ketamina ou glicina não causaram toxicidade geral. O consumo de ração e
a ingestão hídrica apresentaram aumento significativo provavelmente pelo
tratamento prolongado com as doses mais elevadas de P. ginseng, entretanto não foi
observado aumento do ganho de peso corporal. Hepatotoxicidade e nefrotoxicidade
não foram evidenciados com os dados obtidos.
A atividade geral, mensurada no campo aberto, dos animais tratados com
as diferentes doses de P. ginseng, glicina e/ou ketamina foi elevada quando
comparados aos animais do grupo branco. A imobilidade dos animais tratados com
a dose intermediária do extrato foi maior que a de todos os grupos tratados e o
grupo branco em todo o período de avaliação. O comportamento dos animais dos
diversos grupos analisados não foi diferente no labirinto em cruz elevado.
Sugere-se que P. ginseng não exerce ação ansiogênica ou ansiolítica, quando
comparado com o grupo tratado com glicina, ketamina e o grupo branco. Conclui-se
então que P. ginseng não é capaz de provocar toxicidade nas doses empregadas no
presente estudo.
38
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