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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

Equipe de Virologia UFRGS & IPVDF

www.ufrgs.br/labvir

Diagnóstico de

infecções virais

• Duas formas

Buscar o vírus

Métodos diretos

Buscar a resposta do organismo

Métodos indiretos

Diagnóstico de infecções virais

• Métodos diretos: utilizados na detecção do

vírus, antígenos ou genomas virais:

Microscopia eletrônica

Isolamento viral

Detecção imunológica (IPX ou IF)

Hemaglutinação (HA)

ELISA direto

PCR, RT-PCR, Real-time PCR

Sequenciamento

Buscar o vírus

• Permite a visualização de partículas

víricas viáveis e também inviáveis

• Aplicável virtualmente a todos os vírus

• Identificação definitiva do agente

• Desvantagens:

Caro

Baixa sensibilidade

Mão de obra especializada

Microscopia eletrônica

Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Megavirus

Megavirus chilensis

http://en.wikipedia.org/wiki/Megavirus

• Identificação pela produção do efeito

citopático (ECP) característico

• Exige vírus viável

• Boa sensibilidade

• Não aplicável a muitos vírus

• Disponibilidade de linhagens celulares

Isolamento em cultivo celular

• Os vírus são espécie-específicos, mas alguns

conseguem se multiplicar em células da

espécie homóloga

• BVDV: céls de bovinos, ovinos, suínos,

carnívoros e primatas

• PRRSV: céls MARC-145 (céls de primata)

• EHV: céls VERO (primata) e RK-13 (coelho)

• Influenza: MDCK (canina)

• BoHV: MDBK, CRIB, VERO, etc

Qual célula utilizar

• É o dano que o vírus causa à célula

lise

arredondamento

vacuolização

formação de sincícios

inclusões

picnose

apoptose

Efeito citopático (ECP)

Adenovírus em células 293A

Fonte: Knak et al., in prep

Efeito citopático (ECP)

• Obtenção do vírus viável permite a sua

caracterização e estudos posteriores

Detecção de antígenos ou ácidos nucleicos

Neutralização com soro imune específico

• Desvantagens: caro, demorado, risco de

contaminações

Isolamento viral

• Inoculação em animais

Ex.: em camundongos lactentes para

o diagnóstico conclusivo da raiva

• Inoculação em ovos embrionados

Tecidos, suabes

Visando o isolamento viral

Outras formas de detecção

direta do vírus


direta do vírus


direta do vírus

• Lesões: 2 a 7 dias PI

morte embrionária, nanismo, enrolamento

embrionário e hemorragias cutâneas

• Observação da capacidade do vírus de

aglutinar hemácias

• Vantagens: rápida, boa sensibilidade e

especificidade e de fácil execução

• Desvantagens: aplicável a um grupo

restrito de vírus

Necessidade de espécies doadoras de

hemácias (cobaias, coelhos ou galinha)


• Alguns vírus possuem estruturas capazes de se ligar a

receptores específicos de hemácias de determinadas espécies

e produzir o fenômeno da HEMAGLUTINAÇÃO

Essas estruturas são as

hemaglutininas (glicoproteínas

de superfície dos virions)


• Alguns vírus com capacidade hemaglutinante

– Influenza

– Parainfluenza

– Adenovírus bovino, equino, canino

– Parvovírus

– Doença de Newcastle

– Bronquite infecciosa das galinhas


• Mecanismo /

Princípio


Rede de hemácias que não se acumulam no fundo do poço

Hemácias acumuladas

no fundo do poço

• Interpretação – Reação positiva: presença de vírus

– Reação negativa: ausência de vírus

– Reação negativa: ausência de vírus


1º PBS


2º Vírus


3º Diluição do vírus

25μl


4º Hemácias a 1%


• Utiliza anticorpos específicos

• Método mais utilizado para detecção e

identificação viral

• Diferentes amostras: secreções, tecidos

ou céls de cultivo inoculadas

• IPX, Imunofluorescência, ELISA

Detecção de antígenos virais

• Vantagens: alta sensibilidade e

especificidade

• Rapidez, baixo custo e facilidade de

execução

• Kits comerciais ampliaram e popularizaram

o uso

Detecção de antígenos virais

• É uma técnica de detecção de antígeno (Ag)

utilizada no diagnóstico de infecções víricas

• Baseia-se na reação de anticorpos (Ac)

específicos com o antígeno presente no

material suspeito

Imunocitoquímica: monocamadas celulares

Imunoistoquímica: diretamente em tecidos

Imunoperoxidase (IPX)

- IPX indireta é mais sensível Ampliação do sinal!

IPX

Resultado positivo

Resultado negativo

IPX

• Tb é uma técnica baseada na reação

antígeno-anticorpo

• Proteínas virais são detectadas por Ac

conjugados com marcador fluorescente

• Rápida, fácil, apresenta boa sensibilidade

e especificidade

• Detecta tb vírus inviável

Imunofluorescência

• Disponível em kits

• Desvantagens:

Podem ocorrer reações inespecíficas

Reagentes para alguns vírus podem

não ser disponíveis

• Aplicação: imunofluorescência direta para

o diagnóstico do vírus da raiva

Imunofluorescência

• Diagnóstico da raiva

• Amostras de cérebro suspeitas

• Impressão tecidual em lâminas (imprint)

• Anticorpo marcado com FITC sobre

material infectado

• Visualização em microscópio de

fluorescência

Imunofluorescência direta

Imunofluorescência direta

Fonte: http://www.utmb.edu/virusimages/

Cérebro de raposa positivo para o vírus da raiva (CDC, 1958)

• Baseia-se na identificação de anticorpos e/ou

antígenos, por anticorpos marcados com uma

enzima, de maneira que esta enzima age sobre

um substrato e a reação faz com que o

cromógeno mude de cor

Tipos de ELISA:

indireto, direto, competitivo

ELISA

• Anticorpos imobilizados em placas de

poliestireno detectam o vírus presente na

amostra

• Rápida, sensível, específica,

automatizável, disponível em kits,

Desvantagens: kits comerciais são caros

e podem apresentar falhas na detecção

(falsos-negativos)

ELISA direto

• Também denominado sanduiche

• Utilizado para detecção de antígenos

• Anticorpo primário específico ao antígeno é

adsorvido no poço da microplaca

• Adiciona-se o antígeno

• O segundo anticorpo específico ao antígeno é

marcado com uma enzima é adicionado

ELISA direto

• PCR, Nested PCR, multiplex PCR

• RT-PCR

• Real-time PCR

• Sequenciamento

• Alia alta sensibilidade e especificidade

• Aplicável a todos os vírus

• Rápida e automatizável

Detecção de ácidos nucleicos

PCR

Nested PCR

Multiplex

RT-PCR


• PCR

Primers específicos para o vírus

Padronização visando alta

sensibilidade

Novo ciclo de amplificação via uma

nested PCR: aumenta sensibilidade e

especificidade


Produto da 1ª PCR

570 pb

BoHV-1 BoHV-5

161 pb 236 pb

Nested PCR

• Detecção da amplificação associada a

cada ciclo durante a PCR

• Quantificação do DNA ou RNA viral

(cDNA)

• Ciclos ultra-rápidos (30 min a 2 horas)

• Nenhuma análise no final da reação de

PCR

Real time PCR

Fonte: www.i-med.ac.at/.../genotyping_unit/index.html

Real time PCR

Fonte: www.id.yamagata-u.ac.jp/CLRE/clre_e/CLRE-ev3.htm / www.genomic.com.br/images/no_noise.gif

Sequenciamento Equipamento: ABI 3500xl

Análise do cromatograma

5’TATGGAGAAGGAAGAGCCCGATACGCTCGCACCACGAGCTTCACGTGACGCTCCGGG

GACGCCAAAAGTGCCCGCGATGCCCGGTGTGACCCCGGAGCCATCAGGAAACGCCTC

GGAGCCCGCCGACCCGGCGGAGCTCCGGGCGGACTTGCGGGGTCTAAAAGGCTCCA

GCGACGATCCTAATTTCTACGTGTGCCCCCCTCCCACCGGTGCGACCGTGGTGCGGCT

CGAGGAGCCGCGCCCGTGCCCGGAGTTGCCCAAGGGGCTCAACTTCACCGAGGGCAT

CGCCGTAACTTTCAAGGAGAACCTCGCGCCGTACAAGTTTAAGGCCACTATGTACTACAA

GGCCGTGACTGTCGCTAGCGTGTGGTCCGGGTACTCGTATAACCAGTTTATGAATATCTT

TGAGGACCGTGCCCCTATACCGTTCGAGGAAATCGTCGACCGGATACACGGCCGGGGT

ATGTGTTTGTCCACGGCAAAGTACGTCAGGAACAACCTTGAGACCACCGCATTCCATAAT

GATGCCGACGAACATGAGATGAAGCTGGTGCCCGCCGAGTCCGCCCCTGGGTTGCATC

GCGGATGGCACACCACGCGGCTAAAAA3’

• Sequência > Blast > Identificação do vírus

Sequenciamento

Sequenciamento

• Quando ocorre contato com o vírus

• Detecção de anticorpos

• Métodos indiretos:

Soro-neutralização

Inibição da hemaglutinação (HI)

Imunofluorescência indireta

ELISA indireto

Buscar a resposta do organismo

• Técnicas de detecção de anticorpos são tb

denominados testes sorológicos

• Importância na epidemiologia: prevalência

e distribuição de infecções virais

• Resultados dos exames sorológicos

devem ser interpretados de acordo com a

biologia e epidemiologia do agente e da

resposta imunológica do hospedeiro

Detecção de anticorpos antivirais

Inibição da Hemaglutinação

• Anticorpos antivirais impedem a atividade

hemaglutinante do vírus

• Rápida, sensível, especifica, custo baixo

• Somente aplicável a vírus

hemaglutinantes

• Requer animais doadores de hemácias

• Não automatizável

Detecção de anticorpos capazes

de inibir a atividade aglutinante

de alguns vírus


Resultado positivo

PRESENÇA DE ANTICORPOS

Resultado negativo

AUSÊNCIA DE ANTICORPOS


• Anticorpos presentes no soro previnem a

replicação viral e a produção de ECP nas células

• Vantagens: sensível, especifica, qualitativa e

quantitativa

Soroneutralização

Anticorpos anti-BoHV

Foto: Fabrício Campos Foto: http://images.google.com.br

• Obj.: avaliar o título de anticorpos neutralizantes

• Determinar nível de imunidade de uma população

• Determinar poder imunogênico de vacinas

• Desvantagens: exige cultivo celular, toxicidade do

soro

Detecta somente anticorpos neutralizantes

Somente vírus que replicam em cultivo

Soroneutralização

• Vírus “desafio” previamente conhecido e quantificado

• Teste realizado em microplacas de 96 cavidades

• Incubação das diluições crescentes do soro-teste com

uma quantidade constante de vírus (100 DICC50)

• 1h a 24h de incubação (OIE: 24hs)

• Adição das células de cultivo

• Soro-vírus-célula (37°C; 5% de CO2 ; 48 a 96h).

Soroneutralização

100 DICC50

7° dil. 1° dil. 2° dil. 3° dil. 4° dil. 5° dil. 6°dil.

100

DICC50

Vírus Estoque:

Título = 106

105 104 103 102 101 100 10-1

DICC50 = Doses infectantes em 50% do cultivo celular

900 ul

100 ul

MEM

Vírus

900 ul

100 ul

900 ul

100 ul

900 ul

100 ul

900 ul

100 ul

900 ul

100 ul

900 ul

100 ul

10

DICC50

1

DICC50

0,1

DICC50

Calculo de dose infectante

+ -

soro teste

vírus suspeito

células

24 horas

Soroneutralização

Leitura: 48-96h

VÍRUS CITOPÁTICO

+ -

Presença de Ac –

neutralização viral –

ausência de efeito

citopático

Ausência de Ac –

vírus livre –

presença de efeito

citopático

Soroneutralização

Leitura: 48-96h

VÍRUS NÃO CITOPÁTICO

+ -

Presença de Ac –

neutralização viral –

ausência de efeito

citopático

Ausência de Ac –

vírus livre –

presença de efeito

citopático

Soroneutralização

VÍRUS NÃO

CITOPÁTICO IPX

Soroneutralização

Soroneutralização

• Anticorpos presentes no soro se ligam a

antígenos imobilizados e são detectados

por anticorpos marcados com FITC

• Vantagens: rápida e simples

• Desvantagens: risco de reações

inespecíficas

Reagentes para alguns vírus podem não ser

disponíveis



Fonte: www.virologyj.com - Figure

Imunofluoresncencia indireta feita com soro de galinha

em células Vero infectadas com virus West Nile

• Utilizado para detecção de anticorpos

• Antígeno fica aderido aos poços da microplaca

• Adiciona-se o soro

• Em seguida um anticorpo marcado com uma

enzima que reage com o substrato fazendo

com que o cromógeno mude de cor

ELISA INDIRETO

• Detecta exposição, mas não quando ela

ocorreu

• Considerar a cinética de replicação dos

vírus para escolher o teste diagnóstico

• Sugestão de leitura: Capitulo 11:

Diagnóstico Laboratorial das Infecções

Víricas do livro Virologia Veterinária;

Flores, 2007.

Limitações da sorologia

Cinética da replicação viral

Fonte: Flores, 2007

Grato pela atenção!

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