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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

USO DO GLICEROL NO CULTIVO MIXOTRÓFICO DE MICROALGAS MARINHAS: IMPACTO NO CRESCIMENTO CELULAR E NO CONTEÚDO LIPÍDICO

MICHELE PUTTI PALUDO

Prof. Dr. Carlos André Veiga Burkert Orientador

RIO GRANDE, RS 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS


Química de Alimentos Michele Putti Paludo

Prof. Dr. Carlos André Veiga Burkert Orientador

RIO GRANDE, RS 2012

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos.

Dedico este trabalho aos meus pais Lourdes e Isidoro que sempre apoiaram e incentivaram meu crescimento profissional.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida, benção e proteção.

Aos meus pais, Lourdes e Isidoro, pelo apoio, amor incondicional e pela compreensão

nos inúmeros momentos em que estive ausente.

A minha irmã Isa, pelo amor, alegria e apoio de sempre.

Ao Prof. Dr. Carlos André Veiga Burkert, pela orientação, amizade, estímulo e,

sobretudo pela confiança e pelas oportunidades.

A Elisane, que além da amizade, foi uma grande professora dentro do laboratório

ensinando-me enfrentar os diferentes obstáculos, contribuindo na consolidação deste

trabalho.

Aos iniciantes científicos Bruno e Sabrina, pela grande contribuição, apoio,

compromisso e especialmente pela amizade. Também ao Charlon, pela sua

disponibilidade.

Aos colegas de laboratório Bruno, Eliane, Francisco, Franciela, pelos momentos de

descontração.

A Dai, exemplo de fé, guerreira de verdade, amiga, parceira, pessoa que quero

sempre manter ao meu lado.

As minhas queridas amigas Lidi, Grê, Rê, Jô, Deh, Adri, Vanessa e Lígia que sempre

estiveram presentes me apoiando.

A Kah e a Cher, pelas conversas, risadas e amizade verdadeira.

A Aline, pela amizade e pelo auxílio na correção do resumo.

A CAPES pela concessão da bolsa de mestrado. Ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos e a FURG pela oportunidade. Ao LABIOMAR, pela aquisição das microalgas.

A EMA, pelo fornecimento da água marinha, em especial ao doutorando André Braga,

pela atenção e disponibilidade.

Aos colegas do LEB, que ajudaram com seus conhecimentos sobre o cultivo de

microalgas.

Aos professores do curso de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos

pelos valiosos ensinamentos adquiridos.

Aos professores Helen Treichel, Susana Kalil e Márcio Mazutti por participarem da

defesa desta dissertação, colaborando com ideias enriquecedoras.

Só existem dois dias no ano que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o

outro se chama amanhã, portanto hoje é o dia certo para amar, acreditar, fazer e

principalmente viver.”

Dalai Lama

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS.................................................................................................... ix

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................... x

RESUMO..................................................................................................................... xii

ABSTRACT.................................................................................................................. xiii

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 1

2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 3

2.1 Objetivo geral...................................................................................................... 3

2.2 Objetivos específicos.......................................................................................... 3

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 4

3.1 Microalgas.......................................................................................................... 4

3.2 Tipos de cultivo................................................................................................... 8

3.3 Principais nutrientes no cultivo de microalgas.................................................... 11

3.3.1 Carbono......................................................................................................... 11

3.3.2 Nitrogênio...................................................................................................... 12

3.3.3 Fósforo..................................................................................................... 12

3.3.4 Silício............................................................................................................. 12

3.4 Fatores externos que influenciam no cultivo de microalgas............................... 13

3.4.1 Luminosidade................................................................................................ 13

3.4.2 Temperatura.................................................................................................. 13

3.4.3 pH.................................................................................................................. 14

3.4.4 Agitação e aeração........................................................................................ 14

3.5 Biodiesel............................................................................................................. 14

3.6 Glicerol................................................................................................................ 16

3.7 Cultivo mixotrófico de microalgas....................................................................... 18

3.8 Glicerol como substrato em processos biotecnológicos..................................... 19

3.9 Conteúdo lipídico das microalgas....................................................................... 20

3.10 Considerações finais........................................................................................ 22

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................... ................................................... 24

4.1 Microalgas.......................................................................................................... 24

4.2 Meio de cultivo.................................................................................................... 24

4.2.1 Meio Conway (Walne, 1966)........................................................................ 24

4.2.2 Água marinha............................................................................................... 26

4.2.3 Fonte de carbono........................................................................................... 27

4.3 Cultivo nos fotobiorreatores................................................................................ 27

4.3.1 Inóculo........................................................................................................... 27

4.3.2 Condições de cultivo...................................................................................... 27

4.4 Avaliação do crescimento microalgal................................................................. 28

4.5 Determinação de pH........................................................................................... 30

4.6 Determinação da concentração de glicerol........................................................ 30

4.7 Determinação de lipídeos totais......................................................................... 31

4.8 Análise estatística dos resultados...................................................................... 33

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ 34

5.1 Crescimento celular das microalgas................................................................... 34

5.1.1 Chaetoceros calcitrans................................................................................... 34

5. 1.2 Chaetoceros gracilis...................................................................................... 36

5.1.3 Dunaliella tertiolecta....................................................................................... 38

5.1.4 Isochrysis galbana.......................................................................................... 39

5.1.5 Nannochloropsis oculata................................................................................ 41

5.1.6 Phaeodactylum tricornutum............................................................................ 44

5.1.7 Pyramimonas virginica.................................................................................... 46

5.1.8 Skeletonema costatum................................................................................... 48

5.1.9 Tetraselmis chuii............................................................................................. 49

5.1.10 Tetraselmis suecica...................................................................................... 51

5.2 Conteúdo lipídico das microalgas........................................................................ 53

6 CONCLUSÃO........................................................................................................... 58

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS....................................................... 59

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 60

APÊNDICE A............................................................................................................... 69

APÊNDICE B............................................................................................................... 74

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Comparação das características dos cultivos microalgais.........................

10

Tabela 2 - Conteúdo lipídico das microalgas...............................................................

22

Tabela 3 - Solução principal.......................................................................................

24

Tabela 4 - Solução de traços de metais.....................................................................

25

Tabela 5 - Solução de vitaminas................................................................................. 25

Tabela 6 - Solução de silicato...................................................................................... 25

Tabela 7 - Divisão das microalgas utilizadas nos experimentos................................. 26 Tabela 8 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga C. calcitrans e análise estatística dos dados...................................................................................................

34

Tabela 9 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga C. gracilis e análise estatística dos dados...................................................................................................

36

Tabela 10 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga D. tertiolecta e análise estatística dos dados...................................................................................................

38

Tabela 11 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga I. galbana e análise estatística dos dados...................................................................................................

41

Tabela 12 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica da microalga N. oculata e análise estatística dos dados....................................................................................................................

43

Tabela 13 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga P. tricornutum e análise estatística dos dados.......................................................................................

44

Tabela 14 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga P. virginica e análise estatística dos dados...................................................................................................

46

Tabela 15 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga S. costatum e análise estatística dos dados...................................................................................................

48

Tabela 16 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga T. chuii e análise

51

estatística dos dados................................................................................................... Tabela 17 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga T. suecica e análise estatística dos dados...................................................................................................

53

Tabela 18 - Parâmetros do crescimento celular dos cultivos autotrófico e mixotrófico das dez espécies de microalgas avaliadas...............................................

56

Tabela 19 - Conteúdo lipídico das dez espécies de microalgas estudadas nos cultivos autotrófico e mixotrófico..................................................................................

57

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fotos ilustrativas das microalgas utilizadas no estudo...............................

8

Figura 2 - Reação de transesterificação para a produção de biodiesel......................

15

Figura 3 - Principais aplicações industriais de utilização do glicerol..........................

16

Figura 4 - Esquema do glicerol em relação a sua utilização em biorrefinarias...........

17

Figura 5 - Repique das culturas microalgais...............................................................

27

Figura 6 - Estufa de fotoperíodo e distribuição do fotobiorreatores em seu interior...

28

Figura 7 - Fluxograma para a determinação da concentração de biomassa dos cultivos microalgais......................................................................................................

29

Figura 8 - Kit colorimétrico – enzimático para a determinação do consumo de glicerol........................................................................................................................

30

Figura 9 - Fluxograma de preparo da biomassa microalgal para a determinação de lipídeos totais..........................................................................................................

31

Figura 10 - Formação do sistema trifásico obtido na extração de lipídeos totais........

35

Figura 11 - Chaetoceros calcitrans: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico....

35

Figura 12 - Chaetoceros gracilis: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.........

37

Figura 13 - Dunaliella tertiolecta: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.........

39

Figura 14 - Isochrysis galbana: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico...........

40

Figura 15 - Nannochloropsis oculata: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico..

42

Figura 16 - Phaeodactylum tricornutum: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico....................................................................................................................

45

Figura 17 - Pyramimonas virginica: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.....

47

Figura 18 - Skeletonema costatum: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.....

49

Figura 19 - Tetraselmis chuii: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.............

50

Figura 20 - Tetraselmis suecica: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.........

52

Figura 21 - Conteúdo lipídico das dez microalgas utilizadas no estudo...................... 54


RESUMO A crescente produção de biodiesel tem gerado um excedente de glicerol, principal coproduto do processo de obtenção. Uma alternativa que vem sendo estudada para resolver este problema é a sua utilização em processos biotecnológicos como fonte de carbono em cultivos microbianos, de forma a agregar valor à cadeia produtiva do biodiesel, contribuindo para seu desenvolvimento sustentável. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de diferentes espécies de microalgas marinhas em assimilar o glicerol como fonte de carbono e verificar o efeito sobre parâmetros do crescimento celular e conteúdo lipídico. Nos experimentos foram utilizadas as microalgas Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros gracilis, Dunaliella tertiolecta, Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricornutum, Pyramimonas virginica, Skeletonema costatum, Tetraselmis chuii e Tetraselmis suecica. Os experimentos foram realizados em triplicata, em fotobiorreatores do tipo Erlenmeyer de 1 L, contendo meio Conway com salinidade 28, acrescido ou não de glicerol (0,05 M), mantidos a 24°C, 3000 Lx de irradiância e dispostos em estufa com fotoperíodo. Os resultados foram tratados estatisticamente utilizando o software Statistica 7.0. A partir dos resultados obtidos observou-se que as microalgas C. calcitrans, P. tricornutum e S. costatum apresentaram os maiores incrementos de biomassa máxima (1,44; 2,94 e 1,28 vezes) e conteúdo lipídico (2,30; 1,61 e 12,19 vezes) com o cultivo mixotrófico, tendo-se observado também ganhos de produtividade. D. tertiolecta e T. suecica se destacaram pelo incremento no acúmulo de lipídios (1,54 e 2,39 vezes, respectivamente), com o cultivo mixotrófico, enquanto que N. oculata e T. chuii foram as microalgas em que o cultivo mixotrófico teve impacto negativo mais pronunciado, afetando a produção de biomassa e lipídeos. Assim, a utilização de glicerol em processos biotecnológicos, como no cultivo de microalgas, pode ser uma alternativa tecnológica para o aproveitamento e valorização do glicerol oriundo da produção do biodiesel. Palavras-chave: Crescimento celular; Glicerol; Lipídeos; Microalgas, Cultivo

Mixotrófico.

USE OF GLYCEROL IN MIXOTROPHIC GROWTH OF THE MARINE MICROALGAE:

IMPACT ON GROWTH RATE AND LIPID CONTENT

ABSTRACT

The growing production of biodiesel has generated an excess of glycerol, the main byproduct of the production process. An alternative that has been studied to solve this problem is to use it in biotechnological processes as carbon source in microbial cultures in order to add value to the production chain of biodiesel, contributing to its sustainable development. In this context, the present study aimed to evaluate the ability of different species of marine microalgae in assimilating the glycerol as carbon source and to verify the effect on parameters of cell growth and lipid content. In the experiments, the microalgae used were: Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros gracilis, Dunaliella tertiolecta, Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricornutum, Pyramimonas virginica, Skeletonema costatum, Tetraselmis chuii and Tetraselmis suecica. The experiments were performed in triplicate in photobioreactors type 1 L Erlenmeyer flask, containing medium Conway with salinity 28, with or without glycerol (0,05 M) maintained at 24°C, iluminance of 3000 Lx and disposed in photoperiod. The results were statistically analyzed by using the software Statistica 7.0. From the results obtained it was observed that the microalgae C. calcitrans, P. tricornutum and S. costatum showed higher maximum biomass increments (1.44, 2.94 and 1.28 times) and lipid content (2.30, 1.61 and 12.19 times) with mixotrophic cultivation, it also has been observed well productivity gains. D. tertiolecta and T. suecica have highlighted by the increase in lipid accumulation (1.54 and 2.39 times, respectively), with the mixotrophic cultivation, while N. oculata and T. chuii were the microalgae that the mixotrophic cultivation had more pronounced negative impact, affecting the production of biomass and lipids. Thus, the use of glycerol in biotechnological processes, such as the cultivation of microalgae, can be a technology alternative to the use and recovery of the glycerol derived from biodiesel production. Keywords: Cell growth; Glycerol; Lipid; Microalgae; Mixotrophic cultivation.

1

1 INTRODUÇÃO

Com o aumento do preço dos combustíveis fósseis e dos problemas

ambientais ocasionados pelos mesmos, as indústrias produtoras de biodiesel têm

crescido rapidamente nos últimos anos (EITHER, 2010). O biodiesel compreende um

produto obtido da reação de transesterificação entre triacilglicerois e álcoois (metanol,

etanol), em presença de catalisadores alcalinos. O glicerol é o coproduto mais

abundante da reação, resultando, geralmente, em 10 kg de glicerol bruto a cada 100

kg de biodiesel produzido (CHI et al., 2007).

O glicerol obtido da produção do biodiesel apresenta uma grande

quantidade de impurezas, metanol e outras substâncias como cálcio, magnésio e

fósforo. A presença de tais compostos restringe o seu emprego para fins farmacêutico,

químico e na indústria de cosméticos, em função dos dispendiosos custos para a sua

purificação (AMARAL et al., 2009). Desta forma, a fim de evitar futuros problemas

derivados do acúmulo de glicerol e tornar a produção de biodiesel economicamente

viável, torna-se necessário alternativas para o uso do glicerol bruto gerado, abrindo um

novo leque para pesquisas (CHAVEZ, 2008).

Alguns dos principais usos do glicerol estão associados à produção de

biossurfactantes (MORITA et al., 2007), ácidos orgânicos (PAPANIKOLAOU et al.,

2002), conversão termo - química de glicerol em propileno glicol (DASARI et al., 2005),

entre outros. Contudo, o aprofundamento de pesquisas na área biotecnológica,

especialmente no que se refere ao emprego do glicerol em cultivos de bactérias e

leveduras (AMARAL et al., 2009) e no cultivo de microalgas (CERÓN GARCÍA et al.,

2005; LIANG; SARKANY; CUI, 2009), vem ganhando destaque.

Por outro lado, o cultivo de microalgas resulta em uma produção

consolidada de biomassa, rica em ácidos graxos poli-insaturados, como ácido

eicosapentaenoico (EPA) e ácido docosaexaenoico (DHA), capazes de prevenir

doenças cardiovasculares, câncer, diabetes, doenças inflamatórias, ente outras

(DERNER et al., 2006). Estes micro-organismos ainda têm sido utilizados na

alimentação humana como fontes de suplemento alimentar de alto valor nutricional, na

produção de pigmentos, principalmente carotenoides, no tratamento de águas

residuais, como fonte de biocombustíveis (OHSE et al., 2009) e no sequestro e

assimilação do dióxido de carbono (MORAIS; COSTA, 2008b).

As microalgas, ainda, realizam a fotossíntese como metabolismo principal

para a obtenção de carbono orgânico através do carbono inorgânico contido no CO2,

2

utilizando a energia solar e liberando oxigênio na atmosfera (BROWN; ZEILER, 1993).

O emprego de outras fontes de carbono como substrato orgânico constitui uma

alternativa viável para o crescimento de microalgas, uma vez que o cultivo mixotrófico

utiliza compostos orgânicos, luz e CO2 simultaneamente. Além disso, este tipo de

cultivo proporciona um aumento da concentração de biomassa, da taxa de

crescimento, da produção de clorofilas, carotenoides e ácidos graxos, aparentemente

associado ao efeito sinérgico da luz e do substrato orgânico (CERÓN GARCÍA et al.,

2005; BRENNAN; OWENDE, 2010).

Diversos estudos têm proposto fontes alternativas de substratos orgânicos

para o cultivo mixotrófico de microalgas, tais como melaço (ANDRADE; COSTA,

2007), manipueira (BORGUETTI, 2009), glicose (MULITERNO et al., 2005; DERNER,

2006), frutose, lactose e manose (CERÓN GARCÍA et al., 2006), entre outras. Por

outro lado, o uso do glicerol ainda é pouco explorado, sendo necessária a investigação

da capacidade de diferentes espécies de microalgas em assimilá-lo e os impactos

decorrentes de sua utilização em cultivos mixotróficos.

3

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar o crescimento de dez espécies de microalgas marinhas em cultivo

autotrófico e mixotrófico, utilizando o glicerol como fonte de carbono, a fim de

selecionar espécies com potencial para bioconversão do glicerol em bioprodutos de

maior valor comercial, de forma a agregar valor à cadeia produtiva do biodiesel,

contribuindo para seu desenvolvimento sustentável.

2.2 Objetivos específicos

Avaliar o cultivo mixotrófico (glicerol 0,05 M) das microalgas marinhas

Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros gracilis, Dunaliella tertiolecta, Isochrysis

galbana, Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricornutum, Pyramimonas

virginica, Skeletonema costatum, Tetraselmis chuii e Tetraselmis suecica,

comparando ao cultivo autotrófico, verificando os efeitos sobre parâmetros do

crescimento celular, como concentração de biomassa máxima, produtividade e

velocidade específica máxima de crescimento.

Comparar o conteúdo de lipídeos totais das biomassas obtidas em cultivo

autotrófico e mixotrófico (glicerol 0,05 M).

4

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Microalgas

As microalgas compreendem um grupo heterogêneo de organismos que

engloba todos os micro-organismos fotossintetizantes, sejam eucarióticos ou

procarióticos (cianobactérias). São geralmente unicelulares, coloridos devido à

presença de pigmentos fotossintéticos e vivem em ambientes aquáticos (OLAIZOLA,

2003; TOMASELLI; GIOVANNETTI; TORZILLO, 1993).

A importância das microalgas na natureza refere-se, principalmente, à

elevada participação no balanço global da fotossíntese, contribuindo com grande

parcela da produção primária do planeta. No mar, mais de 90% da fotossíntese é

realizada pelas diversas microalgas que constituem o fitoplâncton. As microalgas são

os principais produtores primários marinhos, portanto são fundamentais para a

estruturação de quase todos os ecossistemas costeiros e oceânicos (LOURENÇO,

2006).

O número exato de espécies microalgais ainda é desconhecido.

Atualmente são encontradas citações relatando que podem existir entre 200.000 até

alguns milhões de representantes deste grupo. Tal diversidade também se reflete na

composição bioquímica e, desta forma, as microalgas são fonte de uma quantidade

ilimitada de produtos. Cabe ressaltar que algumas espécies sintetizam compostos que

podem ser altamente tóxicos para outras espécies de organismos, inclusive para o

homem. Estes compostos também têm sido explorados comercialmente, constituindo

o tema de inúmeras pesquisas (DERNER et al., 2006).

O cultivo de microalgas pode ser realizado em sistemas abertos ou

fechados com iluminação natural ou artificial. Os cultivos em sistemas abertos

compreendem tanques naturais ou artificiais e representam o processo clássico de

produção de microalgas. Já os sistemas fechados e semifechados apresentam

algumas vantagens com relação ao sistema aberto como: menor perda de CO2, menor

risco de contaminação, manutenção da temperatura e condições de cultivo

reprodutíveis. São indicados quando a intenção é a obtenção de produtos com alto

valor agregado (KARAM; SOCCOL, 2007).

As microalgas vêm sendo utilizadas na alimentação de animais aquáticos;

como fonte de proteínas na forma de suplementação alimentar; como fonte de

pigmentos (ficocianinas, astaxantinas e β-caroteno); tratamento de águas residuais;

5

como adubo orgânico; e, atualmente, vêm sendo indicadas como uma possível

matéria-prima para biocombustíveis, devido ao alto teor de lipídeos que algumas

espécies apresentam e ao perfil de ácidos graxos (OHSE et al., 2009).

Desta forma, em função da alta produtividade, do rápido crescimento e do

grande número de substâncias por elas produzidas, tem aumentado o interesse de

pesquisadores por estes micro-organismos, fomentando, assim, diversos estudos e

divulgação em importantes publicações.

A seguir são descritas e ilustradas na Fig. 1 as microalgas utilizadas no

presente estudo.

Chaetoceros calcitrans e Chaetoceros gracilis

As espécies C. calcitrans e C. gracilis são microalgas marinhas

unicelulares amplamente empregadas na alimentação de larvas de crustáceos

marinhos e moluscos bivalves (SHEI et al., 2008), além de serem utilizadas no cultivo

de camarão, a fim de aumentar os níveis de vitamina dos mesmos (HEMAISWARYA

et al., 2011). Quando cultivada em meio líquido e com agitação, apresenta células

individuais, não formando cadeias (DERNER, 2006). Poucos estudos em relação ao

cultivo mixotrófico de Chaetoceros sp. são mencionados na literatura, destacando-se

trabalhos realizados por Derner (2006), o qual avaliou o efeito de diferentes fontes de

carbono no crescimento de C. muelleri, e por Moreira (2007), que pesquisou o

crescimento da microalga em meios contendo extrato de esterco de gado (EEG) e

extrato de esterco de minhoca (EEM).

Dunaliella tertiolecta

A microalga exibe um cultivo simples, sendo capaz de tolerar altas

concentrações salinas, o que pode ser útil para o cultivo em larga escala (CHEN et al.,

2011b). Outra importante característica da espécie esta associada à sua produção de

carotenoides, em especial de α e β – caroteno (TAFRESHI; SHARIATI, 2009).

Alguns estudos relatando a utilização de D. tertiolecta são encontrados na

literatura. Belle (2007) sugeriu o emprego da microalga no tratamento de águas

residuais salinas contendo elevada concentração de nitrogênio amoniacal. Tafreshi e

Shariati (2009) reportaram o emprego de D. tertiolecta como bioindicador, informando

sobre o nível de eutrofização dos corpos d’água.

6

Em estudo realizado por Campos, Barbarino e Lourenço (2010), avaliando

o cultivo autotrófico e a composição química da microalga D. tertiolecta, verificou-se o

potencial da mesma para produzir carotenoides e ácido α – linoleico.

Ischrysis galbana

I. galbana apresenta substancial interesse na aquicultura, sendo utilizada

na alimentação de moluscos, camarões, ostras, mariscos, mexilhões, peixes e

crustáceos em estágios iniciais de crescimento (OHSE et al., 2008; HEMAISWARYA

et al., 2011). A microalga ainda destaca-se pelo seu conteúdo lipídico, em função da

presença de ácidos graxos poli-insaturados, em especial o ácido docosaexaenoico

(DHA) (HEMAISWARYA et al., 2011). Trabalhos avaliando o crescimento da microalga

em meios contendo fontes de carbono orgânico não são descritos na literatura,

sobressaindo-se estudos em relação ao seu cultivo autotrófico (OHSE et al., 2009;

SÁNCHEZ; MARTÍNEZ; ESPINOLA, 2000).

Nannochloropsis oculata

As espécies deste gênero são bastante utilizadas na aquicultura em

decorrência da facilidade de cultivo, do tamanho pequeno e da velocidade de

crescimento acentuada (LOURENÇO, 2006). O elevado conteúdo de lipídeos é uma

característica importante da microalga, correspondendo a cerca de 31 - 68% (HARUN

et al., 2010), destacando-se pela produção do ácido eicosapentaenoico (EPA). Esta

espécie ainda é conhecida por suas fontes de pigmentos como clorofila a, zeaxantina,

cantaxantina e astaxantina (MEINERZ, 2007). Estudos avaliando o crescimento

mixotrófico da espécie Nannochloropsis sp. em meios contendo glicose, acetato de

sódio e silagem de pescado estão descritos na literatura (HU; GAO, 2003; SÁNCHEZ;

JUSCAMAITA; VARGAS, 2008; XU et al, 2004).

Ainda, a capacidade de N. oculata na participação de mecanismos de

desenvolvimento limpo (MDL), como produção de biocombustíveis, vem sendo

investigada (BORGES et al., 2007).

7

Phaeodactylum tricornutum

A microalga é conhecida pelo seu alto valor nutricional, em função da

presença de ácidos graxos poli-insaturados, especialmente do ácido

eicosapentaenoico, e por apresentar facilidade no cultivo (LOURENÇO, 2006). O seu

cultivo é realizado, principalmente, sob condições fotoautotróficas, resultando em uma

taxa de crescimento e concentração de biomassa relativamente baixas. Contudo, o

cultivo em condições mixotróficas poderia produzir uma maior concentração de

biomassa (CERÓN GARCÍA et al., 2005)

Diferentemente das demais microalgas avaliadas, diversos estudos

abordam o cultivo mixotrófico de P. tricornutum, inclusive em glicerol. As principais

fontes de carbono utilizadas foram: glicerol (CERÓN GARCÍA et al., 2005), acetato,

glicose (LIU et al., 2009), frutose, manose (CERÓN GARCÍA et al., 2006), entre outras.

Pyramimonas virginica

A microalga P. virginica ainda é pouco estudada, sendo utilizada na

alimentação de organismos aquáticos em substituição a clorofícea Tetraselmis sp.

(HELM; BOURNE, 2006). Não existem estudos relatando seu cultivo em condições

autotróficas, heterotróficas e mixotróficas.

Skeletonema costatum

A microalga S. costatum é um importante constituinte do fitoplâncton

marinho em função de sua ocorrência em grandes quantidades. Por apresentarem

rápido crescimento são amplamente utilizadas para alimentação de larvas de

crustáceos e moluscos bivalves, e também em estudos de auto-ecologia (BERTOLLI,

FERNADES, 2008). A influência da temperatura, salinidade e nutrientes dissolvidos no

cultivo desta microalga foi estudada por Meinerz (2007).

Tetraselmis chuii e Tetraselmis suecica

As espécies T. chuii e T. suecica são microalgas unicelulares flageladas.

Habitam ambientes marinhos, exibem altas taxas de crescimento e são usadas em

cultivos como alimento para larvas de moluscos bivalves. Sob condições de cultivo

8

mixotrófico, podem alcançar densidade celular considerável (OHSE et al., 2008). Os

principais ácidos graxos obtidos pela microalga T. suecica são o ácido palmítico e o

ácido oleico (GO et al., 2012). Trabalhos avaliando seu crescimento são escassos.

Figura 1 – Fotos ilustrativas das microalgas utilizadas no estudo. (a) Chaetoceros calcitrans (Disponível em: http://www.starcentral.mbl.edu; acesso em: 20 jan. 2012); (b) Chaetoceros gracilis (Disponível em: http://www.seahorse.com; acesso em: 20 jan. 2012); c) Dunaliella tertiolecta (Disponível em: http://www.marinebiology.edu; acesso em: 20 jan. 2012); (d) Isochrysis galbana (Disponível em: http://www.ina.tmsoc.org; acesso em: 20 jan. 2012); (e) Nannochloropsis oculata (Disponível em: http://www.algaedepot.com; acesso em: 20 jan. 2012); (f) Phaeodactylum tricornutum (foto do autor); (g) Pyramimonas virginica (Disponível em: http://www.eol.org; acesso

em: 20 jan. 2012); (h) Skeletonema costatum (Disponível em: http://www.paper.li; acesso em: 20 jan. 2012); (i) Tetraselmis chuii (Disponível em: http://www. algaedepot.com; acesso em: 20 jan. 2012); (j) Tetraselmis suecica (Disponível em: http://www. ifremer.fr; acesso em: 20 jan. 2012).

3.2 Tipos de cultivo

As características de crescimento e a composição das microalgas

dependem significativamente das condições de cultivo. O cultivo de microalgas pode

(a) (b) (c) (d)

(e) (f) (g) (h)

(i) (j)

http://www.starcentral.mbl.edu/

http://www.seahorse.com/

http://www.marinebiology.edu/

http://www.algaedepot.com/

9

ser autotrófico (fotoautotrófico), heterotrófico e mixotrófico. A diferença entre cada um

dos cultivos esta fundamentada na fonte de carbono empregada e na utilização ou não

de energia luminosa (CHEN et al., 2011a).

Nos cultivos autotróficos, há o emprego de luz como exclusiva fonte de

energia, para a fixação do CO2 e liberação de O2. Neste tipo de cultivo, problemas com

contaminação são menores quando comparado com as demais condições de cultivo.

Nos cultivos heterotróficos, não há utilização de luz, mas há o emprego de

compostos orgânicos como fonte de carbono para biossínteses e energia. As

principais fontes de carbono orgânico assimiladas por algumas espécies de microalgas

são: glicose, acetato, glicerol, frutose, lactose, galactose e manose. Desta forma, por

este tipo de cultivo utilizar fontes de carbono provenientes de açúcares,

frequentemente problemas de contaminação são observados (CHEN et al., 2011a).

Neste tipo de cultivo ainda ocorre um aumento da concentração de biomassa e da

produtividade. Apesar disso, poucos processos industriais utilizam-no, o que

provavelmente esteja associado ao número limitado de espécies de microalgas

heterotróficas disponíveis; maior contaminação por bactérias; inibição do crescimento

em substratos com baixas concentrações de compostos orgânicos; incapacidade de

produzir alguns produtos induzidos pela presença de luz, como pigmentos (CERÓN

GARCÍA et al., 2000).

Em relação ao cultivo mixotrófico, este utiliza, simultaneamente, uma fonte

luminosa e um substrato orgânico como fonte de carbono (DERNER, 2006). Este tipo

de cultivo representa uma excelente alternativa para produção de biomassa, quando

comparado ao cultivo autotrófico. As taxas de crescimento e o aumento da

concentração de biomassa aparentemente estão associados ao efeito sinérgico da luz

e do substrato orgânico. Também é importante ressaltar que os cultivos mixotróficos

apresentam elevada produção de clorofilas, carotenoides e ácidos graxos, quando

comparados aos cultivos autotróficos. Além disso, substratos como o glicerol são

capazes de estimular a produção destes metabólitos (CERÓN GARCÍA et al., 2005).

Neste tipo de cultivo, ainda, ocorre uma menor perda de biomassa durante a fase

escura, decorrência da adição do substrato orgânico ao meio de cultivo (BRENNAN;

OWENDE, 2010). A Tabela 1 apresenta uma comparação entre os cultivos

microalgais.

10

Tabela 1 - Comparação das características dos cultivos microalgais.

Fonte: CHEN et al. (2011a).

Condições de

cultivo

Fonte de

energia

Fonte de

carbono

Densidade

celular

Reator

(scale-up)

Custo Conclusões com o

aumento da escala

Autotrófico

(Fotoautotrófico)

Luz Inorgânico Baixa Lagoas abertas

ou

fotobiorreatores

Baixo Baixa densidade celular

Heterotrófico Compostos

orgânicos

Compostos

orgânicos

Alta Biorreator

convencional

Médio Contaminação

Alto custo dos substratos

Mixotrófico Luz e

compostos

orgânicos

Inorgânico e

orgânico

Média Fotobiorreatores

fechados

Alto Contaminação

Alto custo de

equipamentos

Alto custo dos substratos

11

3.3 Principais nutrientes no cultivo de microalgas

Um dos fundamentos essenciais para o cultivo de microalgas é o que se

refere ao conhecimento dos nutrientes necessários ao seu desenvolvimento. Desta

forma, com o objetivo de minimizar os custos de produção da biomassa microalgal

e/ou seus bioprodutos, muitos estudos estão sendo realizados utilizando fontes

alternativas de nutrientes como glicose, melaço (ANDRADE; COSTA, 2008), glicerol

(CERÓN GARCÍA et al., 2005) e manipueira (BORGHETTI, 2009).

A seguir está descrito alguns dos principais macronutrientes requeridos

para o crescimento das microalgas.

3.3.1 Carbono

O carbono é considerado o macroelemento mais importante nos cultivos,

uma vez que constitui cerca de 50% da biomassa, podendo atuar como fator limitante

no crescimento microalgal (DERNER, 2006). Sua elevada demanda decorre do fato de

que o carbono constitui o componente mais importante de todas as substâncias

sintetizadas pelas células (LOURENÇO, 2006).

O carbono inorgânico pode estar na forma de dióxido de carbono (CO2),

ácido carbônico (H2CO3), bicarbonato (HCO3-) ou carbonato (CO2

-) e suas proporções

dependem do pH. Quanto mais ácido, maior a proporção de CO2 livre, enquanto que

com a elevação do pH as proporções de bicarbonato e carbonato aumentam no meio

(DERNER, 2006).

A fonte de carbono mais utilizada pelas microalgas é o dióxido de carbono

(CO2), provavelmente por ter uma rápida difusão da água para o interior das células.

O dióxido de carbono contribui no crescimento fotossintético e autotrófico das

microalgas, tanto que em alguns cultivos se faz necessário à adição de CO2

(BORGHETTI, 2009), o qual pode ser proveniente do ar atmosférico injetado na forma

de bolhas ou através de cilindros pressurizados contendo este gás (DERNER, 2006).

Assim, o emprego de fontes de carbono alternativas, como o glicerol,

utilizadas nos cultivos mixotróficos, surge como uma solução na redução dos custos

dos meios de cultivo. Além do glicerol, outras fontes de carbono orgânico também têm

sido empregadas no cultivo de diferentes microalgas, destacando-se: melaço

(ANDRADE; COSTA, 2007), manipueira (BORGUETTI, 2009), glicose (MULITERNO

et al., 2005; DERNER, 2006), frutose, lactose e manose (CERÓN GARCÍA et al.,

2006).

12

3.3.2 Nitrogênio

O nitrogênio é um dos principais macroelementos para o desenvolvimento

microalgal, constituindo as proteínas, ácidos nucleicos e pigmentos fotossintetizantes.

Desta forma, quando o suprimento de nitrogênio é abundante, verifica-se a tendência

do aumento nas concentrações de proteínas e clorofila nas células. Contrariamente,

quando as concentrações de nitrogênio são baixas, verifica-se uma diminuição

marcante da taxa de divisão celular, além da redução das concentrações de proteínas

e clorofila. Assim, o nitrogênio é um dos elementos limitantes ao desenvolvimento de

produtores primários fotossintetizantes no mar (LOURENÇO, 2006).

O nitrogênio pode ser assimilado através de várias fontes, como: nitrogênio

molecular (N2), amônio (NH4+), nitrato (NO3

-), nitrito (NO2-), ureia, aminoácidos, purinas

e pirimidinas (LOURENCO, 2006). Em cultivos artificiais, os sais de nitrato, de amônio

e de ureia são as fontes mais empregadas.

3.3.3 Fósforo

O fósforo é um nutriente essencial para o crescimento de microalgas, uma

vez que participa de todos os processos que envolvem trocas energéticas nas células,

síntese de ácidos nucléicos e reações associadas à divisão celular. Assim, ao lado do

nitrogênio, o fósforo também é considerado um dos principais fatores limitantes no

desenvolvimento microalgal (LOURENÇO, 2006).

Em cultivos, o fósforo tende a ser adicionado aos meios de cultivo em altas

concentrações, como fosfatos (NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.12H2O, K2HPO4) ou como

pentóxido de fósforo (P2O5). Em alguns meios, o fosfato é adicionado como

glicerofosfato de sódio, que é menos susceptível à precipitação em presença de

metais traços (LOURENÇO, 2006).

3.3.4 Silício

Apenas as microalgas pertencentes à classe das diatomáceas e

silicoflagelados necessitam de silício em altas concentrações, pois este é um

componente estrutural fundamental de revestimento externo. Em situações de

limitação, verifica-se uma diminuição da espessura da parede celular dessas

microalgas (LOURENCO, 2006).

Nos meios de cultivo, o silício geralmente é adicionado na forma de sais de

silicato de sódio hidratado (LOURENCO, 2006).

13

3.4 Fatores externos que influenciam o cultivo de microalgas

Tanto no ambiente natural quanto nos cultivos, o crescimento de uma

população de microalgas é resultado da interação entre fatores biológicos, químicos e

físicos. Os fatores biológicos estão relacionados às próprias taxas metabólicas da

espécie cultivada, bem como a possível influência de organismos contaminantes.

Quanto aos fatores físico-químicos que afetam o crescimento das microalgas, são

principalmente reportados estudos sobre luminosidade, temperatura, pH, salinidade e

disponibilidade de nutrientes (OHSE et al., 2008).

3.4.1 Luminosidade

Os cultivos microalgais podem ser iluminados artificialmente por lâmpadas

fluorescentes, luz natural ou uma combinação de diferentes fontes de luz (CHEN et al.,

2011a). A intensidade e duração dos feixes luminosos são importantes fatores

ambientais no crescimento microalgal. Níveis extremos de luminosidade no cultivo de

microalgas podem conduzir a dois processos desfavoráveis, a fotoinibição e a

fotolimitação (BEZERRA, 2006).

A fotoinibição ocorre quando o fluxo de fótons absorvido pelos cloroplastos

é tão alto que a concentração de elétrons de alta energia na célula é excessiva para

ser consumida pelo Ciclo de Clavin. Esses elétrons de alta energia reagem com a

água, formando peróxido de hidrogênio, tóxico às células (BEZERRA, 2006).

Já a fotolimitação ou sombreamento ocorre devido ao aumento da

concentração de biomassa, diminuindo a profundidade de penetração da luz no

cultivo. Desta forma, os micro-organismos localizados na superfície são altamente

iluminados, e os localizados em profundidades maiores não recebem energia luminosa

suficiente para garantir uma boa condição fotossintética (BEZERRA, 2006).

Ainda é válido destacar que quando se usa estufa fotoperíodo, cerca de

25% da biomassa produzida durante o dia pode ser perdida durante a noite devido à

respiração. O teor desta perda depende do nível da luz sob o qual a biomassa está

crescendo e da temperatura, principalmente à noite (MOLINA GRIMA et al., 1999).

.

3.4.2 Temperatura

Segundo Lourenço (2006), a temperatura é um dos fatores que mais

afetam a taxa metabólica dos organismos, interferindo principalmente na velocidade

das reações bioquímicas e na composição celular. De maneira geral, a maioria das

14

microalgas apresenta crescimento em temperaturas que variam de 15-25ºC (KARAM;

SOCCOL, 2007).

A atividade fotossintética diminui com a queda na temperatura, sendo que

acima de 35°C a concentração de proteínas e especificamente de pigmentos

fotossintéticos proteicos decresce e ocorre um aumento nas concentrações de

carboidratos e lipídeos (TOMASELLI; GIOVANNETTI; TORZILLO, 1993).

3.4.3 pH

O pH do meio é um dos fatores mais importantes no cultivo de microalgas,

determinando a solubilidade do dióxido de carbono e minerais, influenciando, assim,

no metabolismo das microalgas. O pH ainda depende de fatores como: composição e

capacidade tamponante do meio, quantidade de dióxido de carbono dissolvido,

temperatura e atividade metabólica das células (KARAM; SOCCOL, 2007).

Os valores de pH podem variar em decorrência de diversas proporções de

gás carbônico, carbonato e bicarbonato dissolvido no meio de cultivo (BEZERRA,

2006).

3.4.4 Agitação e aeração

A agitação nas culturas microalgais está relacionada a alguns fatores que

influenciam no crescimento celular. A agitação deve impedir a formação de

aglomerados celulares, garantindo incidência luminosa suficiente às células (MOLINA

GRIMA et al., 1996), permitir a captação de CO2 da atmosfera, a liberação de O2 do

interior do meio líquido e diminuir os gradientes gasosos e de nutrientes no meio

(JIMÉNEZ et al, 2003).

Já a aeração é um fator muito importante para a homogeneização dos

nutrientes e para evitar a sedimentação das microalgas. Em cultivos de grande escala

é recomendada a injeção de CO2, contribuindo no processo de fotossíntese

(BORGHETTI, 2009). A injeção de ar proporciona uma difusão efetiva dos nutrientes,

um aporte parcial de CO2 inorgânico, uma estabilidade do pH, a manutenção das

algas em suspensão e a uniformidade do cultivo (COLLA; RUIZ; COSTA, 2002).

3.5 Biodiesel

O biodiesel pode ser definido como um mono-alquil éster de ácidos graxos

derivado de fontes renováveis, como óleos vegetais e gorduras animais, obtido através

15

de um processo de transesterificação, no qual ocorre a transformação de

triacilglicerois em moléculas menores de ésteres de ácidos graxos (FERRARI;

OLIVEIRA; SCABIO, 2005; KHAN; HUSSAIN; BANERJEE, 2009). A Fig. 2 indica a

reação de transesterificação para a obtenção do biodiesel.

Figura 2 - Reação de transesterificação para a produção de biodiesel. Fonte: Geris et al. 2007.

Desta forma, o biodiesel vem ganhando grande destaque por compreender

um combustível não tóxico, biodegradável e renovável (MANDAL; MALLICK, 2009),

podendo ser obtido de óleos vegetais como soja, milho, amendoim, algodão, babaçu e

palma (SANTOS; PINTO, 2009). Além disso, auxilia na conservação do meio

ambiente, mediante a redução dos gases responsáveis pelo aquecimento global, e

contribui para o desenvolvimento social devido à geração de empregos. No Brasil, a

produção e comercialização de biodiesel possuem importantes vantagens devido à

grande disponibilidade de matéria-prima para sua produção e ao crescimento contínuo

da indústria de óleos vegetais e etanol (RIVALDI et al., 2008).

Segundo dados da APROBIO (Associação dos Produtores de Biodiesel do

Brasil) poderá ocorrer no ano de 2012 o aumento do percentual de mistura do

biodiesel ao diesel passando de 5% para 7%, para 10% em 2014 e para 20% em

2020. O incremento representaria uma produção adicional da ordem de 1 bilhão de

litros, o que, acrescido à oferta atual, somaria 3,5 bilhões de litros já em 2012. Ainda é

válido ressaltar que o Rio Grande do Sul deverá ultrapassar neste ano os 600 milhões

de litros produzidos em 2011, o que representará 25% da produção nacional,

passando a ser o maior produtor nacional.

Assim, a fim de consolidar a produção de biodiesel e evitar futuros

problemas derivados do acúmulo de glicerol, torna-se necessária à busca de

alternativas eficientes para o uso do glicerol bruto gerado no processo.

16

3.6 Glicerol

Glicerol é o nome comum do composto orgânico 1,2,3-propanotriol,

descoberto por Carl W. Scheele em 1779, pelo aquecimento de uma mistura de óxido

de chumbo com azeite de oliva. Os seus sinônimos são glicerina, trihidroxipropano,

glicilálcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano. Na natureza, o glicerol existe sob formas

combinadas com ácidos graxos, em animais e em vegetais como soja, mamona,

babaçu, girassol, palma, algodão, coco e dendê. O glicerol também é um composto

considerado fundamental dentro do sistema metabólico de micro-organismos, onde

atua como precursor de numerosos compostos e como regulador de vários

mecanismos bioquímicos intracelulares (RIVALDI et al., 2008).

Em função da combinação de suas propriedades físico-químicas, o glicerol

é uma substância com grande variedade de aplicações, podendo ser utilizado em

indústria de cosméticos, farmacêutica, detergentes, na fabricação de resinas e aditivos

e na indústria de alimentos (RIVALDI et al., 2008). A Fig. 3 mostra uma distribuição

percentual de aplicações mais usuais do glicerol.

Figura 3 - Principais aplicações industriais do glicerol. Fonte: MACHADO; BRITO; OLIVEIRA (2009); PAGLIARO et al.(2007).

Outras relevantes aplicações do glicerol são: produção de biossurfactantes

(ROSA et al., 2010); ácidos orgânicos, especialmente ácido cítrico (PAPANIKOLAOU

et al., 2002); produção de 1,3-propanodiol, importante produto para a indústria tintas,

resinas de poliéster, lubrificantes, anti-congelante até a produção de cosméticos

(RIVALDI et al., 2008); obtenção de ácidos graxos poli-insaturados de microalgas

(ETHIER, 2010). Assim, com foco nas inúmeras aplicações deste coproduto a Fig. 4

17

apresenta o glicerol no futuro de biorrefinarias, em que os materiais e a energia serão

produzidos a partir de matérias–primas renováveis.

Figura 4 - Esquema do glicerol em relação à sua utilização em biorrefinarias. Fonte: Adaptado de PAGLIARO et al. (2007).

O glicerol bruto obtido da produção do biodiesel é composto

aproximadamente por 50-60% de glicerol (KOLESÁROVÁ et al, 2011), além de uma

grande quantidade de impurezas como metanol, sabões, traços de sódio, cálcio,

potássio, entre outros (ETHIER, 2010). Essas impurezas dependem da natureza da

oleaginosa e do tipo de catálise empregada na preparação do biodiesel (FERRARI;

OLIVEIRA; SCABIO, 2005). A presença de tais compostos acaba limitando o emprego

do glicerol bruto para fins farmacêutico, químico e indústria de cosméticos, em função

dos altos custos para a sua purificação (AMARAL et al., 2009). É válido ressaltar que o

glicerol bruto contém cerca de 24-37,7% de carbono, podendo estes valores variar em

função da fonte utilizada na obtenção do biodiesel (KOLESÁROVÁ et al, 2011).

O valor do glicerol bruto obtido da produção de biodiesel encontra-se entre

0,2 a 0,4 R$/kg. Este baixo valor é atribuído ao conteúdo de aproximadamente 30%

(p/p) de impurezas e ao grande volume deste coproduto gerado pelas indústrias

(RIVALDI et al., 2008).

Como já dito anteriormente, o glicerol é o principal coproduto gerado na

produção de biodiesel, sendo que aproximadamente 10% do volume total de biodiesel

produzido correspondem ao glicerol. No Brasil, a maioria das plantas industriais de

biodiesel não valorizam efetivamente o glicerol (RIVALDI et al., 2008).

Como é possivel observar há um excedente de glicerol, sem um emprego

efetivo para o mesmo. Desta forma, a conversão microbiana de glicerol por processos

biotecnológicos em produtos de maior valor agregado, como biomassa e moléculas

Biomassa (Óleo

vegetal)

Fotossíntese

Biodiesel

Glicerol

CO2/H20

Energia

Conversão

Catalítica

Química

Farmacêutica

Biocombustíveis

Conversão

Catalítica

Polímeros

18

bioativas, é uma alternativa relevante para a maior valorização da produção de

biodiesel (RIVALDI et al., 2008).

3.7 Cultivo mixotrófico de microalgas

Alguns estudos têm utilizado fontes alternativas de substratos orgânicos

para o cultivo mixotrófico de microalgas como: glicerol (CERÓN GARCÍA et al., 2000;

CHI et al., 2007; LIANG et al., 2010), melaço (ANDRADE; COSTA, 2007), manipueira

(BORGUETTI, 2009), glicose (MULITERNO et al., 2005), entre outras.

Muliterno et al. (2005) estudaram o cultivo mixotrófico da microalga

Spirulina platensis por meio da adição de uma fonte orgânica de carbono (glicose) em

modo batelada alimentada. As concentrações de glicose nos meios variaram de 0,5 a

1,0 g L-1. A maior concentração de biomassa obtida foi de 5,38 g L-1 com a adição de

0,5 g L-1 de glicose ao meio de cultivo.

Andrade e Costa (2007) estudaram a influência da iluminância e da

concentração de melaço no crescimento da microalga Spirulina platensis em cultivo

mixotrófico. As concentrações de melaço nos meios foram de 0,25; 0,50; e 0,75 g L-1.

A presença de melaço influenciou favoravelmente as máximas concentrações

celulares, sendo alcançado 2,94 g L-1 com 0,75 g L-1 de melaço e 3500 Lx.

Borghetti (2009) avaliou o crescimento da microalga Chlorella minutissima

em meio de cultivo contendo diferentes concentrações de manipueira, obtendo maior

produção de biomassa nos meios que apresentavam 5% de manipueira, 75% do meio

MBM e 20% de inóculo. A concentração de biomassa máxima obtida foi de 2,79 g L-1.

Yu, Jia e Dai (2009) estudaram o crescimento de Nostoc flagelliforme em

cultivo autotrófico, heterotrófico e mixotrófico, e obtiveram biomassa máxima de 0,335

g L-1, 0,731 g L-1 e 1,670 g L-1, em 7 dias de experimento, respectivamente. Como

pode ser observado, a adição de glicose (2,52 g L-1) nos cultivos heterotrófico e

mixotrófico contribuiu favoravelmente para o crescimento da cianobactéria.

O crescimento da microalga Botryococcus braunii em diferentes fontes de

carbono foi estudado por Tanoi, Kawachi e Watanab (2011). Nos experimentos eles

observaram que com concentrações maiores que 10 mM de glicose e manose houve

um maior crescimento da microalga, correspondendo a cerca de três vezes mais que

no cultivo autotrófico.

19

3.8 Glicerol como substrato em processos biotecnológicos

O glicerol é considerado uma fonte de carbono altamente reduzida e

assimilável, especialmente, por bactérias e leveduras sob condições aeróbicas e

anaeróbicas, para a obtenção de energia metabólica, como regulador do potencial

redox e para a reciclagem de fosfato inorgânico dentro da célula (RIVALDI et al.,

2008).

O glicerol tem sido utilizado como fonte de carbono em diversos processos

biotecnológicos, como na produção de biomassa e proteínas intracelulares e

extracelulares por Pichia ssp.; produção de α-amilase por Yarrowia lipolytica (AMARAL

et al., 2009); e carotenoides por Sporobolomyces pararoseus (MANOWATTANA et al.

2012). Também pode ser empregado na produção de ácido cítrico por Yarrowia

lipolytica (IMANDI et al., 2007; KUMARI, BABU; RAO, 2008) e lipídios por Rhodotorula

glutinis (CHEIRSILP; KITCHA; TORPEE, 2012)

Ao contrário do grande número de pesquisas tratando da utilização de

glicerol como fonte de carbono por leveduras e bactérias, sua utilização no cultivo de

microalgas ainda é restrito.

Cerón García et al. (2000) avaliaram o crescimento mixotrófico e o perfil de

ácidos graxos da microalga marinha P. tricornutum em diferentes concentrações de

glicerol (0 - 0,1 M). A concentração ótima de glicerol foi de 0,1 M, com biomassa

máxima de 2,4 g L-1. A concentração de biomassa obtida foi cerca de 74% maior que a

do cultivo autotrófico.

Pooksawang et al. (2009) estudaram o cultivo da microalga

Schizochytrium limacinum usando glicerol obtido da indústria de biodiesel para a

produção do ácido docosaexaenoico (DHA). Observaram que aumentando a

concentração inicial do glicerol bruto do meio ocorreu aumento da produção de

biomassa. A concentração máxima de biomassa foi 9 g L-1 obtida em 5 dias na

concentração de 50 g L-1 de glicerol. O aumento da concentração de glicerol acima de

50 g L-1 resultou no decréscimo do crescimento algal. Já Chi et al. (2007) observaram

que a concentração ótima de glicerol para a produção de DHA foi em torno de 100 g L-

1.

Estudo do crescimento de Chlorella vulgaris em meio contendo glicerol foi

realizado por Liang, Sarkany e Cui (2009), no qual se obteve 722 mg L-1 de biomassa

e produtividade de 102 mg L-1 dia-1.

Liang et al. (2010) avaliaram o crescimento da microalga marinha

Schizochytirum limacinum SR21 e a produção de lipídeos a partir de glicerol bruto

proveniente de gordura animal e de óleo utilizado para frituras em restaurantes.

20

Observaram que altas concentrações de glicerol afetavam negativamente o

crescimento da microalga. A concentração ótima de glicerol obtida foi de 35 g L-1,

resultando em 2,29 g L-1 de biomassa e 73,3% de lipídeos.

Heredia-Arroyo, Wei e Hu (2010) estudaram o acúmulo de lipídeos de

Chlorella protothecoides sob condições heterotróficas e mixotróficas. No cultivo

mixotrófico utilizou-se uma mistura com diferentes proporções de glicose e glicerol. O

meio de cultivo que continha 40% de glicose e 60% de glicerol foi o que alcançou

maior concentração de biomassa, correspondendo a 2,94 g L-1 e produtividade de 0,98

g L-1 dia-1.

O’Grady e Morgan (2011) avaliaram o cultivo heterotrófico de Chlorella

protothecoides em glicerol, glicose e em uma mistura de glicose e glicerol (9:1), e

alcançaram velocidades específicas de crescimento de 0,100 h-1, 0,096 h-1 e 0,096 h-1,

respectivamente.

Isleten-Hosoglu, Gultepe e Elibol (2012) pesquisaram a otimização das

fontes de carbono e nitrogênio no cultivo heterotrófico de Chlorella saccharophila

visando à produção de biomassa e lipídeos. No estudo os pesquisadores utilizaram

glicose, glicerol e acetato de sódio e obtiveram a maior concentração de biomassa no

meio contendo glicose, correspondendo a 0,344 g L-1, seguida de glicerol (0,248 g L-1)

e acetato de sódio (0,092 g L-1). Enquanto que o meio contendo peptona, como fonte

de carbono, foi o que apresentou maior produção de biomassa (0,480 g L-1).

3.9 Conteúdo lipídico das microalgas

Os lipídeos são importantes constituintes das microalgas, compondo cerca

de 5 a 75% da biomassa seca (SOARES, 2010). Fatores como intensidade luminosa,

temperatura e nutrientes presentes no meio de cultivo podem influenciar na síntese de

tais compostos (RADMANN; COSTA, 2008).

É importante destacar que sob condições mixotróficas, algumas microalgas

aumentam sua taxa de crescimento, além de produzirem uma maior concentração de

ácidos graxos (CERÓN GARCÍA et al., 2000). Isso pode ser explicado pelo fato de que

o uso de fontes suplementares de carbono minimiza as consequências do auto-

sombreamento causado pela elevada densidade celular. Com a baixa disponibilidade

de luz em cultivos densos, a assimilação do carbono inorgânico pelas microalgas fica

prejudicada. Se a alga consegue assimilar mais carbono, aumenta sua produção de

carboidratos, proteínas e lipídeos (DERNER, 2006).

Todavia, o acúmulo de lipídeos pelas microalgas está intimamente ligado à

limitação da disponibilidade de nitrogênio. Isso é explicado pelo fato de que a falta de

21

nitrogênio direciona o metabolismo microalgal, antes voltado à multiplicação celular,

para a produção de componentes de reserva, como os ácidos graxos saturados, a fim

de preparar a célula para um período de privação (ALONSO et al, 2000).

Os ácidos graxos nas microalgas correspondem à maior fração lipídica e,

em algumas espécies, os poli-insaturados representam entre 25 e 60% dos lipídeos

totais. Comparadas aos vegetais superiores, as microalgas apresentam maior

eficiência fotossintética e podem ser cultivadas em meio salino simples (RADMANN;

COSTA, 2008). Os principais ácidos graxos poli-insaturados produzidos pelas

microalgas são o ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosaenoico (DHA) e o α-

linoleico, além de sintetizar ácidos graxos saturados, matéria-prima para a produção

de biocombustíveis, em especial de biodiesel (KHAN; HUSSAIN; BANERJEE, 2009).

As principais aplicações dos ácidos graxos estão associadas ao enriquecimento de

rações para peixes, produção de biodiesel e fonte de ácidos graxos essenciais na

dieta humana (MORAIS; COSTA, 2008a).

Alguns autores reportam um aumento da biomassa seca e aumento da

produção de lipídeos pela microalga Phaeodactylum tricornutum utilizando fontes de

carbono como extrato de centeio, trigo ou batata (FÁBREGAS et al., 1997), glicose e

glicerol (CERÓN GARCÍA et al., 2000). Cerón García e colaboradores (2000)

adicionaram glicerol ao meio durante o cultivo dessa microalga e obtiveram uma maior

produção de biomassa e um percentual de lipídeos cerca de três vezes maior do que

no cultivo autotrófico.

Xu et al. (2004), também avaliaram o perfil de ácidos graxos da microalga

Nannochloropsis oculata e obtiveram uma maior produção de ácido eicosapentaenoico

no meio contendo glicose e uma solução de nitrato, alcançando a concentração de 56

mg L-1.

Estudo avaliando o crescimento e a composição química de Chaetoceros

muelleri revelou que o meio suplementado com glicose resultou no maior conteúdo de

ácido eicosapentaenoico (EPA), enquanto que o meio contendo dióxido de carbono e

acetato produziu uma maior quantidade do ácido docosaenoico (DHA) (DERNER,

2006).

A Tabela 2 apresenta o conteúdo lipídico de algumas microalgas em

cultivo autotrófico, segundo dados obtidos na literatura.

A maior parte das metodologias destinadas à extração de lipídeos totais

são adaptações dos métodos desenvolvidos por Bligh e Dyer (1959) e Folch, Less e

Stanley (1957). Estas metodologias baseiam-se na utilização de uma mistura

monofásica de clorofórmio, metanol e água (SOARES, 2010).

22

Tabela 2 - Conteúdo lipídico das microalgas.

Microalgas Conteúdo lipídico (%)* Referência

Chaetoceros calcitrans 15 – 39,8 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Chaetoceros gracilis 20 – 45 ANANADHIPADMANABHAN; RENITA; STANLEY (2010) apud

ARAUJO et al. (2011) (referente a Chaetoceros sp.)

Dunaliella tertiolecta 16,7 - 71,0 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Isochrysis galbana 7,0 - 40,0 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Nannochloropsis oculata 22,7 - 29,7 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Phaeodactylum

tricornutum

18,0 - 57,0 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Skeletonema costatum 13,5 - 51,3 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Tetraselmis chuii 12,6 – 14,7 VARFOMEEV; WASSERMAN

(2011)**

Tetraselmis suecica 15 - 23,0 KHAN; HUSSAIN; BANERJEE (2009)

Spirulina platensis 4 -16,6 MATA; MARTINS; CAETANO (2010)

Schizochytrium sp. 50 - 77 DENG; LI; FEI (2009)

* Percentual em biomassa seca. ** Referente a Tetraselmis sp.

3.10 Considerações finais

Assim, tendo como base a revisão bibliográfica, observa-se que o glicerol

apresenta potencial para ser utilizado como uma fonte de carbono no cultivo de

microalgas, contribuindo na obtenção de biomassa e produtos de alto valor agregado.

Cabe ressaltar, que dentre as dez espécies de microalgas abordadas neste estudo,

apenas para Phaeodactylum tricornutum há trabalhos relatando o cultivo mixotrófico

23

utilizando glicerol, como fonte de carbono, evidenciando, assim, a importância da

pesquisa. Além disso, estudos relacionando o conteúdo lipídico ao cultivo mixotrófico

também são escassos na literatura.

24

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Microalgas

Nos experimentos foram utilizadas as microalgas marinhas Chaetoceros

calcitrans, Chaetoceros gracilis, Dunaliella tertiolecta, Isochrysis galbana,

Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricornutum, Pyramimonas virginica,

Skeletonema costatum, Tetraselmis chuii e Tetraselmis suecica. As microalgas foram

cedidas pelo Laboratório de Biologia Marinha e Biomonitoramento da UFBa

(LABIOMAR – Universidade Federal da Bahia).

4.2 Meio de cultivo

4.2.1 Meio Conway (Walne, 1966)

As microalgas foram cultivadas em meio Conway (Walne, 1966), utilizando

água marinha natural. O meio é formado por quatro soluções denominadas como:

solução principal (Tabela 3), solução de traços de metais (Tabela 4), solução de

vitaminas (Tabela 5) e solução de silicato (Tabela 6), conforme fornecido pelo

LABIOMAR.

Tabela 3 - Solução principal.

Componente Quantidade (g L-1)

C10H14O8Na2.2H2O 45

H3BO3 33,6

NaNO3 100

MnCl2.4H2O 0,36

FeCl3.6H2O 1,3

NaH2PO4.2H2O 20

Modo de preparo: Diluir os componentes em 1 L de água destilada, esterilizando-a a 121°C por 15 min. Fonte: WALNE (1966).

25

Tabela 4 - Solução de traços de metais.


ZnCl2 0,21

CoCl2.6H2O 0,2

(NH4)6Mo7O24.4H2O 0,09

CuSO4.5H2O 0,2

Modo de preparo: Diluir os componentes em 10 mL de água destilada. Retirar 1 mL da solução e acrescentar à solução principal estéril. Descartar o restante da solução. Fonte: WALNE (1966).

Tabela 5 - Solução de vitaminas.


Vitamina B12 0,005

Vitamina B1 0,1

Modo de preparo: Diluir as vitaminas em 100 mL de água destilada estéril. Todo procedimento deve ser realizado em câmera asséptica. Fonte: WALNE (1966).

Tabela 6 - Solução de silicato.


Na2OSiO2.nH2O 4

Modo de preparo: Diluir o silicato em 100 mL de água destilada e esterilizar a 121°C por 15 min. Fonte: WALNE (1966).

É importante destacar que de acordo com a divisão pertencente da

microalga, quantidades diferentes das soluções foram adicionadas ao meio de cultivo.

Desta forma, para clorofíceas, primnesiofícea e eustigmatofícea adicionou-se 1 mL de

solução principal e 0,1 mL de solução de vitaminas, para cada litro de água marinha. E

para as bacillariofíceas (diatomáceas), 2 mL de solução principal, 2 mL de solução de

silicato e 0,1 mL de solução de vitaminas. A Tabela 7 apresenta a divisão das

microalgas utilizadas nos experimentos.

As soluções prontas foram adicionadas à água marinha previamente tratada e

estéril.

26

Tabela 7 - Divisão das microalgas marinhas utilizadas nos experimentos.

Divisão Microalga

Clorofícea Dunaliella tertiolecta

Tetraselmis chuii

Tetraselmis suecica


Bacilariofícea (diatomácea) Chaetoceros calcitrans

Chaetoceros gracilis



Primnesiofícea Isochrysis galbana

Eustigmatofícea Nannochloropsis oculata

Fonte: LOURENÇO (2006).

4.2.2 Água marinha

A água marinha foi coletada na Estação Marinha de Aquicultura (EMA –

FURG), localizada no Balneário Cassino (Rio Grande/RS). Antes de ser adicionada ao

meio de cultivo, a água foi filtrada e sua salinidade ajustada em 28. O ajuste da

salinidade foi realizado utilizando o instrumento denominado de Multiparâmetro (YSI

556 MPS, Estados Unidos) e consistia nas seguintes etapas:

- Medir a salinidade da água marinha natural.

- Dividir a salinidade desejada, neste caso 28, pela salinidade da água marinha

coletada.

- Multiplicar o valor encontrado pela quantidade, em litros, que se deseja obter.

- Subtrair o valor encontrado pela quantidade, em litros, que se deseja obter.

- Correlacionar os resultados obtidos nas operações de multiplicação e subtração. A

partir da diferença obtida adicionar a quantidade de água destilada requerida para que

a salinidade 28 seja alcançada (LABIOMAR).

Após o ajuste da salinidade, a água marinha foi esterilizada a 121°C por 15

min, estando, assim, pronta para ser utilizada no cultivo das microalgas.

27

4.2.3 Fonte de carbono adicional

Como fonte de carbono nos cultivos mixotróficos utilizou-se glicerol P.A.

(Labsynth, Brasil), o qual foi adicionado ao meio na concentração de 0,05 M. O glicerol

foi esterilizado separadamente em autoclave a 121°C por 15 min.

4.3 Cultivo nos fotobiorreatores

4.3.1 Inóculo

O volume de inóculo adicionado correspondeu a 10% do volume de meio

estéril (SOARES, 2010). Desta forma, para alcançar o volume de inóculo necessário

nos experimentos foram realizados repiques com volume crescente, isto é, 1:10, 3:30,

7:70, 16:160, 25:250, 40:400, 45:450, 60:600 e 80:800 mL (suspensão de

microalga:meio Conway). Os repiques foram realizados a cada 15 dias. A Fig. 5

apresenta os repiques dispostos na estufa fotoperíodo e aerados por bombas de

aquário, contendo filtros de lã de vidro estéreis.

Figura 5 - Repique das culturas microalgais.

4.3.2 Condições de cultivo

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Engenharia de

Bioprocessos, da Universidade Federal do Rio Grande.

Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores do tipo Erlenmeyer de 1 L

previamente esterilizados a 121°C por 15 min e dispostos em estufa de fotoperíodo

(Fig. 6). O volume utilizado dos fotobiorreatores foi de 900 mL. As culturas foram

28

mantidas sob aeração constante, com um fluxo de ar atmosférico de 242 mL min.-1, e

fotoperíodo integral, proporcionado por lâmpadas fluorescentes do tipo luz do dia, com

irradiância de 3000 Lx. (MOLINA GRIMA et al., 1999). A temperatura foi mantida em

24 ± 1°C.

Figura 6 - Estufa de fotoperíodo e distribuição dos fotobiorreatores em seu interior.

4.4 Avaliação do crescimento microalgal

A avaliação do crescimento nos cultivo autotrófico e mixotrófico foi feita a

partir da determinação da concentração de biomassa máxima (Xmax, g L-1),

produtividade (P, g L-1 dia-1) e velocidade específica máxima de crescimento (µmax, dia-

1).

A cada 24 h coletaram-se amostras assepticamente, seguindo-se etapas

de centrifugação e lavagem, conforme esquematizado na Fig. 7.

A concentração de biomassa máxima (Xmax, em g L-1) compreende o valor

máximo de concentração obtido no experimento. Para sua determinação, a biomassa

ressuspendida (Fig. 7) foi submetida à medida da absorvância a 680 nm em

espectrofotômetro (Biospectro SP-220). Entretanto, para a diatomácea Phaeodactylum

tricornutum utilizou-se o comprimento de onda de 625 nm (CERÓN GARCÍA et al.,

2000). A leitura do branco foi feita com água destilada.

Para cada uma das microalgas foi construída uma curva padrão de

absorvância versus biomassa (g L-1), obtendo-se uma equação para determinação da

concentração de biomassa a partir dos valores de absorvância obtidos para as

amostras (APÊNDICE A).

29

Figura 7 - Fluxograma para a determinação da concentração de biomassa dos cultivos

microalgais.

A produtividade (P, em g L-1 dia-1) corresponde à quantidade de biomassa

produzida em um intervalo de tempo, sendo determinada pela Equação 1

(SCHMIDELL et al., 2001):

( )

Onde:

Xmax = Concentração de biomassa máxima (g L-1)

X0 = Concentração de biomassa inicial (g L-1)

t = Tempo para atingir Xmax (dia)

A velocidade específica máxima de crescimento (μmax, dia-1) foi obtida na

fase exponencial, correspondendo ao coeficiente angular da curva ln (X) versus tempo

(SCHMIDELL et al., 2001).

10 mL de amostra

Centrifugação – 1431xg/15min

min.

SOBRENADANTE

BIOMASSA

pH

Glicerol

Lavagem (H2O dest.)

Centrifugação – 1431xg/15 min

Descarte sobrenadante

Biomassa

Ressuspensão

Leitura em espectrofotômetro

Concentração de biomassa

(1)

30

4.5 Determinação do pH

O pH foi acompanhado diariamente utilizando-se potenciômetro digital

(MARTE – MB 10, Brasil).

4.6 Determinação da concentração de glicerol

A concentração de glicerol foi acompanhada utilizando um kit enzimático-

colorimétrico para triacilglicerois (Labtest, Brasil). Amostras do sobrenadante (0,03 mL)

foram adicionadas a 3 mL do reagente e mantidas a 37°C por 10 min. A absorvância

foi medida a 505 nm, usando glicerol como padrão (ROSA et al., 2010). Uma curva

padrão de absorvância versus concentração de glicerol (g L-1) foi construída a fim de

determinar a concentração do substrato contido no meio de cultivo (APÊNDICE B). A

Fig. 8 ilustra o método descrito, no qual o tubo com coloração amarela corresponde à

amostra em ausência de glicerol (branco), enquanto que o tubo com coloração rósea,

a amostra contendo glicerol.

Figura 8 - Kit colorimétrico-enzimático para a determinação da concentração de

glicerol.

O método baseia-se em reações enzimáticas, nas quais o glicerol ao reagir

com a glicerolquinase forma glicerol-3-fosfato. Este é oxidado a dihidroxicetona e

peróxido de hidrogênio na presença de glicerolfosfato oxidase. Em seguida, ocorre

uma reação de acoplamento entre o peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e 4-

clorofenol, catalisada pela peroxidase, produzindo uma quinoneimina, permitindo,

assim, quantificar a concentração de glicerol presente nas amostras. A seguir estão

apresentadas as reações descritas.

31

Glicerol + ATP Glicerol-3-Fosfato + ADP

Glicerol-3-Fosfato + O2 Dihidroxiacetona + H2O2

2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + 4-Clorofenol Quinoneimina + 4 H2O

4.7 Determinação de lipídeos totais

Ao término do cultivo autotrófico e mixotrófico separou-se o sobrenadante

da biomassa, para que a determinação de lipídeos totais fosse realizada na biomassa.

Inicialmente, a biomassa foi centrifugada, lavada e seca, conforme descrito na Fig. 9.

Figura 9 - Fluxograma de preparo da biomassa microalgal para a determinação de

lipídeos totais.

Assim, com a biomassa seca foi feito a determinação de lipídeos totais a

partir do método de Bligh e Dyer (1959), utilizando as quantidades sugeridas por

Manirakiza, Covaci e Schepens (2001).


min.

Sobrenadante Biomassa

Descarta Lavagem (H2O dest.)


BIOMASSA

Secagem 50°C/peso constante

Raspagem

Determinação de lipídeos totais

Glicerolquinase

Glicerolfosfato Oxidase

Peroxidase

32

Pesou-se 300 a 500 mg da biomassa microalgal em um tubo de centrifuga

com tampa e adicionou-se 5 mL de HCl 2 M, misturando-os. Realizou-se digestão da

amostra em banho-maria a 80°C durante 1 h. A seguir, resfriou-se o tubo em água

corrente até a temperatura ambiente. Centrifugou-se a amostra a 1436xg por 10 min e

observou-se a separação da biomassa do ácido, permanecendo a mesma no fundo do

tubo. Retirou-se o líquido utilizando pipeta de Pasteur, descartando-o.

À biomassa remanescente no tubo, acrescentou-se 4 mL de metanol,

agitando-a uniformemente. Adicionou-se 2 mL de clorofórmio, agitando o tubo em

vórtex por 2 min. A seguir mais 2 mL de clorofórmio foram adicionados e misturados

por 2 min. Logo, acrescentou-se 3,6 mL de água destilada e agitou-se por mais 2 min.

Centrifugou-se a 1436xg por 10 min. Após a centrifugação um sistema trifásico foi

obtido, composto por uma fase inferior líquida (clorofórmio), um sólido interfacial

(biomassa) e uma fase líquida superior (metanol e água). Retirou-se a fase inferior

(clorofórmio) utilizando-se uma seringa (Fig. 10). Assim, obteve-se um primeiro

extrato, o qual foi transferido para outro tubo de centrífuga.

Realizou-se uma re-extração a fim de potencializar a extração dos lipídeos

totais da biomassa. Adicionou-se 4 mL da solução 10% metanol:clorofórmio à

biomassa que estava contida no tubo de centrífuga, agitando a mistura no vórtex.

Centrifugou-se a 1436xg por 10 min. Um segundo extrato foi obtido, juntando-o ao

primeiro extrato.

Transferiu-se o extrato (lipídeo dissolvido em clorofórmio) para um balão,

previamente seco e pesado. Evaporou-se o excesso de solvente em evaporador

rotatório a 75°C e 40 rpm. Ao fim, secou-se o balão em estufa a 105°C por 8 h,

obtendo-se o percentual de lipídeos totais presente em cada uma das biomassas

avaliadas. A Equação 2 foi utilizada para o cálculo do conteúdo lipídico das biomassas

do cultivo autotrófico e mixotrófico.

( )

Onde:

Pf = peso do balão + lipídio (g)

Pi = peso do balão (g)

Pb = peso da biomassa (g)

(2)

33

Figura 10 - Formação do sistema trifásico obtido na extração de lipídeos totais pelo

método de Bligh e Dyer.

4.8 Análise estatística dos resultados

Os experimentos do cultivo autotrófico e mixotrófico foram realizados em

triplicata, sendo os resultados submetidos à análise de variância (ANOVA), utilizando-

se o software Statistica 7.0 (StatSoft Inc., Estados Unidos) a fim de verificar diferenças

significativas em relação à presença ou ausência de glicerol no meio, a 95% de

confiança (p≤0,05).

Os resultados da extração dos lipídeos totais foram avaliados pelo Teste t-

Student a 95% de confiança.

Metanol e água

Biomassa

Clorofórmio

34

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Crescimento celular das microalgas

5.1.1 Chaetoceros calcitrans

Na Fig. 11 estão apresentadas as curvas de crescimento, pH (cultivos

autotrófico e mixotrófico) e concentração de glicerol (cultivo mixotrófico) da microalga

C. calcitrans.

De acordo com a Fig. 11, C. calcitrans apresentou maior crescimento no

cultivo mixotrófico. A concentração celular máxima obtida foi de 0,63 ± 0,03 g L-1,

alcançada no 8° dia de experimento, enquanto que no cultivo autotrófico foi de 0,44 ±

0,02 g L-1, obtida no 10° dia de cultivo. Quanto ao consumo de glicerol, a microalga C.

calcitrans assimilou 48,7% do glicerol adicionado ao meio de cultivo Conway.

A Tabela 8 exibe uma comparação entre o cultivo autotrófico e mixotrófico,

em relação aos parâmetros cinéticos, para esta microalga.

Tabela 8 - Média ± desvio padrão para concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga C. calcitrans e análise estatística dos dados.

Xmax – Concentração de biomassa máxima; P – Produtividade; μmax - Velocidade específica máxima de crescimento. * Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas a 95% de confiança (p<0,05).

Desta forma, os cultivos diferiram significativamente, sendo que no cultivo

mixotrófico a biomassa de C. calcitrans foi cerca de 31% maior que no cultivo

autotrófico. Como observado, o glicerol contribuiu positivamente no crescimento da

microalga, além de reduzir o tempo de cultivo, levando a um incremento na

produtividade. Segundo Morais et al. (2009) a adição de uma fonte de carbono ao

meio permite uma maior produção de biomassa, já que há maior disponibilidade de

carbono.

Parâmetros Cultivo autotrófico Cultivo mixotrófico

Xmax (g L-1) 0,44 ± 0,02b 0,63 ± 0,03a P (g L-1 dia -1) 0,047 ± 0,003b 0,076 ± 0,005a µmax (dia-1) 0,51 ± 0,01b 0,88 ± 0,04ª

35

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Bio

massa (

g L

-1)

8,0

8,2

8,4

8,6

8,8

9,0

9,2

9,4

9,6

9,8

10,0

10,2

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Bio

massa (

g L

-1)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 11 - Chaetoceros calcitrans: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()

Biomassa (g L-1); (▪) pH; () Glicerol (g L-1).

Um aspecto relevante de se observar no cultivo autotrófico é em relação

ao pH do meio, o qual oscilou entre 8,1 a 10,0. Segundo Shiraiwa, Goyal e Tolbert

(1993) as elevações no pH podem ocorrer em função do metabolismo autotrófico,

onde o íon bicarbonato do meio se desidrata formando CO2 para a fotossíntese e OH-.

Enquanto que quedas no pH ocorrem devido à liberação respiratória de CO2. Por outro

(a)

(b)

36

lado, comportamento similar não foi observado no cultivo mixotrófico, com variação

pouco expressiva no pH.

Raghavan, Haridevi e Gopinathan (2008) avaliaram o crescimento de C.

calcitrans em diferentes níveis de dióxido de carbono, e observaram uma maior taxa

de crescimento no meio contendo maior concentração de CO2. Segundo os mesmos

autores, a adição de dióxido de carbono pode ampliar a fase exponencial,

contribuindo, desta forma, no crescimento da microalga.

Derner (2006), que estudou o efeito de fontes de carbono no crescimento e

na composição bioquímica da microalga C. muelleri, também observou um maior

crescimento no meio contendo dióxido de carbono, obtendo 0,79 g L-1 de biomassa

máxima.

5.1.2 Chaetoceros gracilis

A Fig. 12 apresenta as curvas de acompanhamento do cultivo autotrófico e

mixotrófico da microalga C. gracilis.

De acordo com a Fig. 12, o crescimento da microalga C. gracilis foi maior

no cultivo mixotrófico, alcançando a biomassa máxima de 0,35 ± 0,02 g L-1, no 8º dia

de cultivo. Em contrapartida, a biomassa máxima do cultivo autotrófico foi de 0,28 ±

0,02 g L-1, obtida no 10º dia. A microalga, ainda, consumiu 66,4% do glicerol

adicionado ao meio.

A Tabela 9 exibe uma comparação entre o cultivo autotrófico e mixotrófico,

em relação aos parâmetros cinéticos.

Tabela 9 - Média ± desvio padrão para concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga C. gracilis e análise estatística dos dados.

Xmax – Concentração de biomassa máxima; P – Produtividade; μmax - Velocidade específica máxima de crescimento. * Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas a 95% de confiança (p<0,05).

Assim, com os resultados obtidos no cultivo mixotrófico da diatomácea C.

gracilis, pode-se afirmar que as espécies deste gênero estudadas são capazes de

assimilar o glicerol, contribuindo para a obtenção de biomassa. O crescimento da

microalga no cultivo mixotrófico foi 18,2% maior, quando comparado ao autotrófico.

Moreira (2007) pesquisou o crescimento de Chaetoceros muelleri em

diferentes meios de cultivo, observando que o meio contendo extrato de esterco de


Xmax (g L-1) 0,28 ± 0,02b 0,35 ± 0,02ª P (g L-1 dia -1) 0,025 ± 0,001b 0,043 ± 0,003a µmax (dia-1) 0,28 ± 0,01b 0,43 ± 0,02a

37

minhoca resultou em uma maior concentração celular, quando comparado ao meio

padrão F/2 Guillard (1975).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Bio

ma

ssa

(g

L-1

)

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Bio

massa (

g L

-1)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 12 - Chaetoceros gracilis: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


Pesquisa realizada por Banerjee e colaboradores (2011) avaliou o

crescimento e a composição bioquímica de C. gracilis e Nannochloropsis oculata sob

condições controladas e não controladas em cultivo autotrófico. A biomassa máxima

(a)

(b)

38

obtida pra C. gracilis foi de 2,2 g L-1, em condições controladas e de 2,5 g L-1 para não

controladas. Observa-se, portanto que este resultado é cerca de 10 vezes superior ao

obtido nos cultivos autotrófico e mixotrófico do presente trabalho.

5.1.3 Dunaliella tertiolecta

A Fig. 13 apresenta as curvas de acompanhamento obtidas nos cultivos

autotrófico e mixotrófico da microalga D. tertiolecta.

A clorofícea D. tertiolecta apresentou maior crescimento no cultivo

mixotrófico, alcançando biomassa máxima de 0,29 ± 0,01 g L-1, em 10 dias de cultivo,

enquanto que no cultivo autotrófico foi de 0,25 ± 0,04 g L-1, obtida no 12° dia. O

consumo de glicerol correspondeu a 18,2%. A Tabela 10 mostra uma comparação

entre o cultivo autotrófico e mixotrófico, em relação aos parâmetros cinéticos.

Tabela 10 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga D. tertiolecta e análise estatística dos dados.

Xmax - Concentração de biomassa máxima; P – Produtividade; μmax - Velocidade específica máxima de crescimento * Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas a 95% de confiança (p<0,05).

De acordo com a Tabela 10, observou-se que houve diferença significativa

entre o cultivo autotrófico e o mixotrófico, com respeito aos parâmetros avaliados,

demonstrando, assim, que o glicerol influenciou positivamente no crescimento celular

da microalga D. tertiolecta.

Almeida e Jorqueira (2010) avaliaram o cultivo mixotrófico da microalga

Dunaliella salina, utilizando melaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono e

obtiveram melhores resultados em relação à produtividade, velocidade específica

máxima de crescimento e densidade celular máxima, quando comparado ao cultivo

autotrófico. A densidade celular máxima obtida no cultivo mixotrófico correspondeu a

6,45 x 105 células mL-1, enquanto que no cultivo autotrófico foi de 5,56 x 105 células

mL-1.


Xmax (g L-1) 0,25 ± 0,04b 0,29 ± 0,01ª P (g L-1 dia -1) 0,021 ± 0,002b 0,028 ± 0,001ª µmax (dia-1) 0,50 ± 0,01b 0,56 ± 0,01ª

39

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tempo (dias)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Bio

massa (

g L

-1)

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tempo (dias)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Bio

massa (

g L

-1)

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 13 – Dunaliella tertiolecta: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


5.1.4 Isochrysis galbana

Na figura a seguir são mostradas as curvas obtidas para I. galbana nos

cultivos autotrófico e mixotrófico.

(a)

(a)

(b)

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Bio

ma

ssa

(g

L-1

)

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

8,2

8,4

8,6

8,8

9,0

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Bio

massa (

g L

-1)

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 14 – Isochrysis galbana: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


Como observado na Fig. 14, I. galbana demonstrou o mesmo crescimento

nos dois cultivos, isto é, as biomassas máximas nos cultivos autotrófico e mixotrófico

foram de 1,02 ± 0,02 g L-1, no 8º dia, e 1,04 ± 0,05 g L-1, no 6º dia, respectivamente. A

Tabela 11 apresenta uma relação dos parâmetros cinéticos dos cultivos avaliados.

(a)

(b)

41

Tabela 11 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga I. galbana e análise estatística dos dados.


I. galbana assimilou 31,7% do glicerol adicionado ao meio de cultivo. No

entanto, este consumo não se refletiu em aumento da concentração de biomassa,

observando-se, entretanto, um acréscimo na produtividade da microalga.

Pesquisas reportando o cultivo mixotrófico de I. galbana não são descritos

na literatura, sobressaindo-se alguns trabalhos de cultivo autotrófico. Ohse et al.

(2009) estudaram a produção de biomassa em meio F/2 Guillard (1975) de diversas

espécies de microalgas marinhas, e obtiveram para I. galbana concentração de

biomassa máxima de 0,730 g L-1 e produtividade de 0,15 g L-1 dia-1, resultado inferior

ao observado no presente trabalho para biomassa máxima no cultivo autotrófico.

Em outro trabalho realizado por Ohse et al. (2008), no qual foi avaliado o

crescimento de microalgas em sistema autotrófico estacionário, a microalga I. galbana

apresentou valores intermediários de biomassa máxima (2,49x104 células mL-1),

quando comparada com as demais microalgas utilizadas no estudo.

Sánchez, Martínez e Espinola (2000), que avaliaram a produção de

biomassa e a composição química de I. galbana em cultivo autotrófico utilizando cinco

meios de cultivo, obtiveram produtividade de 2,25 g L-1 h-1 e biomassa máxima de 0,24

g L-1, no meio Ukeles. Isso pode indicar que a maior fonte de matéria para a conversão

em biomassa da microalga foi o CO2 atmosférico utilizado no experimento (ARANTES

et al., 2010).

5.1.5 Nannochloropsis oculata

A Fig. 15 apresenta as curvas de crescimento do cultivo autotrófico e

mixotrófico da eustigmatofícea N. oculata.


Xmax (g L-1) 1,02 ± 0,02a 1,04 ± 0,05a P (g L-1 dia -1) 0,128 ± 0,001b 0,164 ± 0,008a µmax (dia-1) 0,33 ± 0,02a 0,28 ± 0,01b

42

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Bio

massa (

g L

-1)

7,6

7,8

8,0

8,2

8,4

8,6

8,8

9,0

9,2

9,4

9,6

9,8

10,0

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Bio

massa (

g.L

-1)

2

4

6

8

10

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 15 – Nannochloropsis oculata: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


Como visto na Fig. 15 o crescimento da N. oculata no cultivo autotrófico foi

superior ao mixotrófico. A biomassa máxima atingida no cultivo autotrófico foi de 0,61

± 0,01 g L-1, no 11º dia de experimento, enquanto que no cultivo mixotrófico

correspondeu a 0,36 ± 0,03 g L-1, obtida no 10º dia. No entanto, N. oculata assimilou

(a)

)

(a)

(b)

)

(a)

43

24,4% do glicerol adicionado ao meio. A Tabela 12 compara o cultivo autotrófico e

mixotrófico em relação aos seus parâmetros cinéticos.

Tabela 12 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga N. oculata e análise estatística dos dados.


Desta forma, nota-se que os cultivos apresentaram diferenças

significativas entre si, sendo que a presença do glicerol levou à redução nos

parâmetros do crescimento celular, produtividade e velocidade específica máxima,

quando comparado ao cultivo autotrófico.

Sánchez, Juscamaita e Vargas (2008) estudaram o crescimento

mixotrófico de N. oculata em três distintos meios: meio Guillard (T1), água marinha

enriquecida com a solução de Yashima (T2) e silagem de pescado filtrada (T3). Eles

obtiveram um maior crescimento no meio contendo a solução de Yashima, seguido da

silagem de pescado. O maior crescimento da N. oculata no meio T2 pode estar

associado ao melhor equilíbrio nitrogênio:fósforo (N:P).

Hu e Gao (2003) avaliaram o crescimento e a composição dos ácidos

graxos de Nannochloropsis sp., e observaram uma maior concentração celular no

meio enriquecido com acetato de sódio 2 mM, alcançando 0,50 g L-1 de biomassa

máxima. Em relação à sua composição, a adição de acetato de sódio diminuiu a

quantidade de ácidos graxos totais e do ácido eicosapentaenoico (EPA).

Xu et al. (2004) também estudaram o crescimento mixotrófico de

Nannochloropsis sp. e observaram um maior crescimento no meio com glicose,

obtendo biomassa máxima 0,51 g L-1, sendo este resultado 1,4 vezes maior que no

cultivo autotrófico, que foi de 0,36 g L-1. Observou-se que a adição do acetato de sódio

e glicose contribuiu no crescimento da microalga, resultando em valores superiores

aos obtidos pelo glicerol.

Estudo avaliando o crescimento autotrófico de N. oculata e de outras

espécies de microalgas marinhas foi realizado por Ohse et al. (2008). N. oculata foi a

que apresentou maior valor de densidade celular máxima (5,54x104 células mL-1), em

um maior tempo (7 dias) e com uma menor velocidade específica de crescimento (0,88

dia-1) que as demais espécies estudadas.


Xmax (g L-1) 0,61 ± 0,01ª 0,36 ± 0,03b P (g L-1 dia -1) 0,053 ± 0,002ª 0,033 ± 0,003b µmax (dia-1) 0,62 ± 0,005a 0,47 ± 0,001b

44

5.1.6 Phaeodactylum tricornutum

A Fig. 16 apresenta as curvas de acompanhamento dos cultivos autotrófico

e mixotrófico da diatomácea P. tricornutum.

De acordo com as curvas de crescimento, é possível notar que a microalga

P. tricornutum apresentou um crescimento significativo no cultivo mixotrófico,

alcançando concentração de biomassa máxima de 2,82 ± 0,13 g L-1, no 6º dia de

experimento. Em contrapartida, a biomassa máxima do cultivo autotrófico foi de 0,96 ±

0,06 g L-1, obtida no 11º dia. O consumo de glicerol pela diatomácea correspondeu a

44,6%. A Tabela 13 traz uma comparação do cultivo autotrófico e mixotrófico de P.

tricornutum em relação aos seus parâmetros cinéticos.

Tabela 13 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga P. tricornutum e análise estatística dos dados.

Xmax - Concentração de biomassa máxima; P – Produtividade; μmax - Velocidade específica máxima de crescimento. * Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas a 95% de confiança (p<0,05).

Em relação à biomassa, o cultivo mixotrófico de P. tricornutum resultou em

um incremento de cerca de 66% em relação ao autotrófico. Também se observou

aumento significativo na produtividade e velocidade específica máxima de

crescimento, sendo 5 e 3 vezes maiores que no cultivo autotrófico, respectivamente.

O crescimento da microalga P. tricornutum utilizando glicerol, acetato e

glicose foi avaliado por Liu et al. (2009). No estudo, eles obtiveram biomassa de 0,71 g

L-1 no meio contendo glicerol, 0,59 g L-1 para acetato e de 0,55 g L-1 para glicose.


Xmax (g L-1) 0,96 ± 0,06b 2,82 ± 0,13a P (g L-1 dia -1) 0,100 ± 0,001b 0,540 ± 0,03a µmax (dia-1) 0,22 ± 0,01b 0,67 ± 0,03a

45

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Bio

massa (

g L

-1)

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Bio

massa (

g L

-1)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 16 - Phaeodactylum tricornutum: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico.

() Biomassa (g L-1); (▪) pH; () Glicerol (g L-1).

No estudo de Cerón García et al. (2005) a diatomácea P. tricornutum foi

cultivada em acetato, amido, ácido lático, glicose e glicerol, em diferentes

concentrações. Em geral o crescimento foi estimulado na presença de todos os

substratos orgânicos, exceto em acetato. A maior concentração de biomassa foi obtida

no meio suplementado com glicerol 0,1 M, atingindo-se 2,4 g L-1.

(a)

)

(a)

(b)

)

(a)

46

Em outro trabalho desenvolvido por Cerón García et al. (2006) avaliou-se o

crescimento desta microalga em glicerol, frutose, lactose, glicose e manose. A

concentração de biomassa máxima foi alcançada no cultivo contendo glicerol 0,1 M,

correspondendo a 7,04 g L-1 e produtividade de 21,30 mg L-1 h-1, seguido de frutose

com 3,5 g L-1 e 15,80 mg L-1 h-1, respectivamente.

Morais et al. (2009), que também cultivaram P. tricornutum adicionando

0,15 M de glicerol ao meio, alcançaram concentração celular máxima de 1,3 g L-1,

enquanto que no cultivo autotrófico foi de 0,88 g L-1.

Pesquisa realizada por Fábregas e colaboradores (1997) avaliando o

cultivo mixotrófico de P. tricornutum em meio contendo frações solúveis de centeio,

trigo e batata, revelou um maior crescimento da diatomácea no meio composto por

batata crua. A produtividade máxima obtida neste meio foi de 4,1x109 células L-1 dia-1,

sendo 2,4 vezes maior que a resultante do cultivo autotrófico (1,3x109 células L-1 dia-1).

Ohse et al. (2009) realizaram cultivo autotrófico da microalga P.

tricornutum e de outras espécies de microalgas marinhas utilizando meio F/2 Guillard

(1975), atingindo 0,62 g L-1 de biomassa máxima. Como é possível notar, a

concentração de biomassa foi inferior à obtida no cultivo autotrófico do presente

trabalho.

5.1.7 Pyramimonas virginica

A Fig. 17 apresenta os cultivos autotrófico e mixotrófico da clorofícea P.

virginica.

Como é observado na Fig. 17, o cultivo mixotrófico favoreceu o

crescimento da microalga P. virginica. A concentração de biomassa máxima foi de

0,55 ± 0,05 g L-1, alcançada em 6 dias de cultivo. Enquanto que no cultivo autotrófico

foi de 0,42 ± 0,05 g L-1, no 10º dia de experimento. A clorofícea ainda foi capaz de

assimilar 21,1% do glicerol adicionado ao meio de cultivo. A Tabela 14 apresenta uma

comparação dos parâmetros cinéticos do cultivo autotrófico e mixotrófico.

Tabela 14 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga P. virginica e análise estatística dos dados.



Xmax (g L-1) 0,42 ± 0,05b 0,55 ± 0,05a P (g L-1 dia -1) 0,044 ± 0,005b 0,092 ± 0,01a µmax. (dia-1) 0,22 ± 0,01b 0,67 ± 0,03a

47

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Bio

massa (

g L

-1)

7,8

8,0

8,2

8,4

8,6

8,8

9,0

9,2

9,4

9,6

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Bio

massa (

g L

-1)

3

4

5

6

7

8

9

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 17 - Pyramimonas virginica: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


De acordo com a Tabela 14, observou-se que houve diferença significativa

entre o cultivo autotrófico e o mixotrófico, com respeito aos parâmetros avaliados,

demonstrando, assim, que o glicerol influenciou positivamente no crescimento celular

da microalga P. virginica. A biomassa máxima obtida no cultivo mixotrófico foi 22,7%

maior que no autotrófico. Além da maior concentração de biomassa, observou-se um

aumento significativo na produtividade e velocidade específica máxima de

(a)

)

(a)

(b)

)

(a)

48

crescimento, alcançando valores 2 e 3 vezes maiores que no cultivo autotrófico,

respectivamente.

Cabe ressaltar que na literatura não estão relatados qualquer trabalho

reportando o cultivo autotrófico, mixotrófico e heterotrófico da microalga P. virginica.

5.1.8 Skeletonema costatum

A Fig. 18 apresenta as curvas de crescimento do cultivo autotrófico e

mixotrófico da microalga S. costatum.

A microalga S. costatum obteve maior crescimento celular no cultivo

mixotrófico, como visto na Fig. 18. A biomassa máxima foi de 0,65 ± 0,02 g L-1,

enquanto que no cultivo autotrófico foi de 0,51 ± 0,02 g L-1, ambas obtidas no 6º dia de

experimento. A S. costatum assimilou 45,8% do glicerol acrescido ao meio de cultivo.

A Tabela 15 apresenta uma comparação do cultivo autotrófico e mixotrófico em

relação aos seus parâmetros cinéticos.

Tabela 15 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga S. costatum e análise estatística dos dados.


Desta forma, observa-se que os parâmetros cinéticos dos cultivos

estudados possuem diferenças significativas, revelando que a presença de glicerol

contribuiu no crescimento da diatomácea, obtendo-se biomassa numa proporção cerca

de 21,8% maior, quando comparado ao cultivo autotrófico. Além da biomassa,

observou-se aumento na produtividade e velocidade específica máxima de

crescimento.


Xmax (g L-1) 0,51 ± 0,02b 0,65 ± 0,02a P (g L-1 dia -1) 0,085 ± 0,004b 0,109 ± 0,004a µmax. (dia-1) 0,49 ± 0,04b 0,53 ± 0,02a

49

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Bio

massa (

g L

-1)

7,8

8,0

8,2

8,4

8,6

8,8

9,0

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Bio

massa (

g L

-1)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 18 - Skeletonema costatum: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


5.1.9 Tetraselmis chuii

A seguir estão apresentadas as curvas obtidas para T. chuii em cultivo

autotrófico e mixotrófico.

(a)

)

(a)

(b)

)

(a)

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Bio

massa (

g L

-1)

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Bio

massa (

g L

-1)

2

3

4

5

6

7

8

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 19 – Tetraselmis chuii: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


Conforme visualizado na Fig. 19, a microalga T. chuii obteve maior

crescimento no cultivo autotrófico, alcançando a biomassa máxima de 0,71 ± 0,04 g L-

1, no 13° dia, enquanto que no cultivo mixotrófico atingiu-se 0,51 ± 0,01 g L-1 em 12

dias de cultivo. Assim, o crescimento da microalga no cultivo autotrófico foi 28,4%

maior que no cultivo mixotrófico. E o consumo de glicerol pela T. chuii foi de 21,8%. A

(a)

)

(a)

(b)

)

(a)

51

Tabela traz uma comparação dos parâmetros cinéticos do cultivo autotrófico e

mixotrófico de T. chuii.

Tabela 16 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga T. chuii e análise estatística dos dados.


Observa-se que os parâmetros de crescimento da clorofícea apresentaram

diferenças significativas, indicando que a presença de glicerol não contribuiu

positivamente no crescimento da microalga estudada, ocorrendo uma redução na

biomassa máxima e produtividade da microalga. Fato semelhante foi observado no

crescimento de Nannochloropsis oculata, a qual apresentou diminuição dos mesmos

parâmetros descritos.

Klein e Gonzalez (1993) estudaram o crescimento de T. chuii em diferentes

meio de cultivo - água de matadouro, vinhoto e caldo de peixe – e observaram maior

concentração de biomassa no meio contendo caldo de peixe na concentração de 5

ppm.

Ohse et al.(2009) estudaram o cultivo autotrófico de diferentes espécies de

microalgas visando à produção de biomassa, e obtiveram 0,61 g L-1 e 0,11 g L-1 dia-1

de biomassa máxima e produtividade para T. chuii, respectivamente. Nota-se que a

biomassa máxima foi inferior à obtida no presente trabalho.

5.1.10 Tetraselmis suecica

Os cultivos autotrófico e mixotrófico da microalga T. suecica estão

apresentados na Fig. 20.

O crescimento da microalga T. suecica nos cultivos autotrófico e

mixotrófico não apresentou diferença, alcançando concentração de biomassa máxima

de 0,43 ± 0,02 g L-1, no 9° dia, e de 0,41 ± 0,02 g L-1, no 6° dia de cultivo,

respectivamente. A microalga foi capaz de assimilar 24,8% do glicerol presente no

meio. A Tabela 17 faz uma comparação dos parâmetros cinéticos do cultivo autotrófico

e mixotrófico.


Xmax (g L-1) 0,71 ± 0,04a 0,51 ± 0,01b P (g L-1 dia -1) 0,051 ± 0,003ª 0,036 ± 0,006b µmax. (dia-1) 0,30 ± 0,02a 0,29 ± 0,02a

52

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

Bio

ma

ssa

(g

L-1

)

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

8,2

8,4

8,6

8,8

9,0

9,2

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Bio

massa (

g L

-1)

3

4

5

6

7

8

9

pH

Glic

ero

l (g L

-1)

Figura 20 – Tetraselmis suecica: (a) Cultivo autotrófico; (b) Cultivo mixotrófico. ()


(a)

)

(a)

(b)

)

(a)

53

Tabela 17 - Média ± desvio padrão para a concentração de biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima da microalga T. suecica e análise estatística dos dados.


Apesar do crescimento da microalga T. suecica não possuir diferença

significativa ao comparar cultivo autotrófico e mixotrófico, observa-se que os valores

de produtividade no cultivo mixotrófico foram superiores ao autotrófico, o que está

associado ao menor tempo para obtenção da concentração de biomassa máxima.

Comparando-se os resultados obtidos com outros trabalhos descritos na

literatura, observa-se que os valores do cultivo autotrófico foram semelhantes. Ohse et

al. (2009) obtiveram 0,41 g L-1 e produtividade de 0,08 g L-1 dia-1 no cultivo autotrófico

de T. suecica.

5.2 Conteúdo lipídico das micralgas

Na Figura 21 estão apresentados os resultados de lipídeos totais dos

cultivos autotrófico e mixotrófico das microalgas estudadas, utilizando o método Bligh

e Dyer (1959).

Como pode ser observado, o cultivo mixotrófico contribuiu no aumento do

conteúdo lipídico das microalgas C. calcitrans, D. tertiolecta, P. tricornutum, S.

costatum e T. suecica, observando-se diferença estatisticamente significativa (p<0,05)

em relação ao cultivo autotrófico.

Este fato possivelmente esteja associado à adição da fonte de carbono ao

meio de cultivo, pois segundo Cerón García e colaboradores (2000), sob condições

mixotróficas, algumas microalgas podem aumentar sua taxa de crescimento, além de

produzirem uma maior concentração de ácidos graxos.


Xmax (g L-1) 0,43 ± 0,02ª 0,41 ± 0,02a P (g L-1 dia -1) 0,043 ± 0,002b 0,06 ± 0,001a µmax. (dia-1) 0,30 ± 0,03b 0,38 ± 0,01a

54

C. ca

lcitra

ns

C. g

racilis

D. te

rtio

lecta

I. g

alb

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a

N. o

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lata

P. tr

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P. vir

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S. co

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tum

T. ch

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T. su

ecic

a

0

10

20

30

40

50

60

Lip

íde

os to

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(%

)

b

a

a a

b

a

aa

a

b

b

a

a

b

b

a

a

b

b

a

Figura 21 - Conteúdo lipídico das dez espécies de microalgas utilizadas no estudo.

( ) Autotrófico ( ) Mixotrófico * Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas a 95% de confiança (p<0,05).

Trabalho realizado por Chen e colaboradores (2011a), avaliando o efeito

dos nutrientes no crescimento e no acúmulo de lipídios por D. tertiolecta, revelou que a

limitação de nitrogênio, ferro e cobalto resulta em um maior acúmulo de lipídios pela

microalga.

Por outro lado, diferenças significativas (p<0,05) também foram

observadas no cultivo mixotrófico de N. oculata, P. virginica e T. chuii, nas quais o

conteúdo lipídico diminuiu. As microalgas C. gracilis e I. galbana foram as únicas que

não apresentaram diferença significativa no conteúdo lipídico entre os cultivos


Considerando micro-organismos oleaginosos aqueles com conteúdo

lipídico superior a 20%, pode-se observar que no cultivo autotrófico destacaram-se as

microalgas N. oculata (39,17%), P. virginica (26,27%), I. galbana (24,60%) e D.

tertiolecta (22,70%), enquanto que no cultivo mixotrófico destacaram-se as microalgas

S. costatum (55,20%). C. calcitrans (44,30%), D. tertiolecta (34,91%), T. suecica

(21,12%) e P. tricornutum (21,07%). I. galbana e N. oculata, apesar de acumularem

lipídios no cultivo mixotrófico (respectivamente, 26,91 e 23,04%), demonstraram

desempenho insatisfatório no cultivo mixotrófico, comparado ao autotrófico.

Os valores obtidos são promissores quando comparados aos descritos na

literatura. No trabalho de Gouveia e Oliveira (2009) o conteúdo lipídico obtido para as

55

microalgas N. oculata e D. tertiolecta correspondeu a 28,7% e 16,7%,

respectivamente. Assim, os resultados do presente estudo são superiores, com

destaque para o cultivo mixotrófico de D. tertiolecta.

Em pesquisa realizada por Araujo et al. (2011), foi estudada a influência da

salinidade 25 e 35 no rendimento de óleo pelas microalgas, sendo que o conteúdo

lipídico da microalga C. gracilis foi de 15,5% e de 60,28%, respectivamente, similar,

portanto ao observado no presente trabalho para o cultivo autotrófico.

No trabalho de Lee et al. (2011) que pesquisaram o conteúdo lipídico de

microalgas marinhas a fim de utilizá-las na produção de biodiesel, a diatomácea P.

tricornutum foi a que apresentou maior quantidade de lipídios, correspondendo a

25,31%, seguida das microalgas I. galbana (23,15%) e T. suecica (7,55%). Observa-se

que os resultados descritos na literatura são similares aos obtidos no cultivo

autotrófico para as microalgas I. galbana (24,6%) e T. suecica (8,84%).

Pesquisa realizada por Araujo e colaboradores (2011), avaliando o

conteúdo lipídico de diferentes espécies de microalgas em meio F/2 Guillard (1975)

com salinidade 25, obteve os seguintes resultados: 8,0% para Tetraselmis sp, 22,75%

para N. oculata, 6,5% para Isochrysis sp., 23,50% para T. chuii e 12,0% para

Dunaliella sp. De modo geral, os valores apresentados no trabalho são inferiores aos

obtidos nos cultivos autotrófico e mixotrófico do presente estudo.

Wang e Wang (2012) caracterizaram os lipídios das microalgas

Nannochloropsis sp. e Schizochytrium limacinum para produção de biocombustíveis e

obtiveram 50,1% para S. limacinum e 22,7% para Nannochloropsis sp. Nota-se que o

conteúdo lipídico da microalga N. oculata no cultivo autotrófico (39,17%) do presente

estudo foi superior ao resultado descrito na literatura (22,7%).

As Tabelas 18 e 19 apresentam uma compilação dos dados obtidos para

os cultivos autotrófico e mixotrófico. Assim, de acordo com os resultados obtidos pode-

se afirmar que o glicerol atuou de maneira distinta no crescimento celular e no

conteúdo lipídico das microalgas avaliadas, havendo impacto positivo mais relevante

para as microalgas C. calcitrans, P. tricornutum e S. costatum, para as quais se

observou incrementos na biomassa máxima (1,44, 2,94 e 1,28 vezes,

respectivamente) e no conteúdo lipídico (2,30, 1,61 e 12,19 vezes, respectivamente),

apresentando também ganhos de produtividade, demonstrando a potencialidade do

uso do glicerol como fonte de carbono adicional no cultivo destas microalgas.

56

Tabela 18 - Parâmetros do crescimento celular dos cultivos autotrófico e mixotrófico das dez espécies de microalgas avaliadas.

Microalgas Cultivo autotrófico Cultivo mixotrófico

Xmax (g L-1) P (g L-1 dia -1) µmax (dia -1) Xmax (g L-1) P (g L-1 dia -1) µmax (dia -1)

C. calcitrans 0,44 ± 0,02b 0,047 ± 0,003b 0,51 ± 0,01b 0,63 ± 0,03ª 0,076 ± 0,005ª 0,88 ± 0,04ª

C. gracilis 0,28 ± 0,02b 0,025 ± 0,001b 0,28 ± 0,01b 0,35 ± 0,02ª 0,043 ± 0,003ª 0,43 ± 0,02ª

D. tertiolecta 0,25 ± 0,04b 0,021 ± 0,002b 0,50 ± 0,01b 0,29 ± 0,01ª 0,028 ± 0,001ª 0,56 ± 0,01ª

I. galbana 1,02 ± 0,02ª 0,128 ± 0,001b 0,33 ± 0,02ª 1,04 ± 0,05ª 0,164 ± 0,008ª 0,28 ± 0,01b

N. oculata 0,61 ± 0,01ª 0,053 ± 0,002ª 0,62 ± 0,005ª 0,36 ± 0,03b 0,033 ± 0,003b 0,47 ± 0,001b

P. tricornutum 0,96 ± 0,06b 0,100 ± 0,001b 0,22 ± 0,01b 2,82 ± 0,13ª 0,540 ± 0,03ª 0,67 ± 0,03ª

P. virginica 0,42 ± 0,05b 0,044 ± 0,005b 0,22 ± 0,01b 0,55±0,05ª 0,092 ± 0,01ª 0,67 ± 0,03ª

S. costatum 0,51 ± 0,02b 0,085 ± 0,004b 0,49 ± 0,04b 0,65 ± 0,02ª 0,109 ± 0,004ª 0,53 ± 0,02a

T. chuii 0,71 ± 0,04ª 0,051 ± 0,003ª 0,30 ± 0,02ª 0,51 ± 0,01b 0,036 ± 0,006b 0,29 ± 0,02ª

T. suecica 0,43 ± 0,02ª 0,043 ± 0,002b 0,30 ± 0,03b 0,41 ± 0,02a 0,06 ± 0,001a 0,38 ± 0,01ª

Xmax - Concentração de biomassa máxima; P – Produtividade; μmax - Velocidade específica máxima de crescimento. * Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas para um mesmo parâmetro, a 95% de confiança (p<0,05).

57

Tabela 19 - Conteúdo lipídico das dez espécies de microalgas estudadas nos cultivos


Microalgas Cultivo autotrófico Cultivo mixotrófico

C. calcitrans 19,30b 44,30a

C. gracilis 14,61a 15,27a

D. tertiolecta 22,70b 34,91a

I. galbana 24,60a 26,91a

N. oculata 39,17a 23,04b

P. tricornutum 13,05b 21,07a

P. virginica 26,27a 15,14b

S. costatum 4,53b 55,2a

T. chuii

15,58a 11,96b

T. suecica 8,84b 21,12a

* Percentual em base seca.

* Letras minúsculas iguais representam que não há diferenças significativas entre colunas a 95% de confiança (p<0,05).

58

6 CONCLUSÃO

Dez microalgas marinhas foram cultivadas em meio Conway (cultivo

autotrófico) e meio Conway acrescido de glicerol (0,05 M). A análise estatística dos

parâmetros relativos ao crescimento celular (biomassa máxima, produtividade,

velocidade específica máxima de crescimento), bem como do conteúdo lipídico,

revelou que as microalgas C. calcitrans, P. tricornutum e S. costatum demonstraram

os maiores incrementos de biomassa máxima (1,44, 2,94 e 1,28 vezes) e conteúdo

lipídico (2,30, 1,61 e 12,19 vezes) com o cultivo mixotrófico, apresentando também

ganhos de produtividade.

Além destas, D. tertiolecta e T. suecica também se destacaram pelo

incremento no acúmulo de lipídios (1,54 e 2,39 vezes, respectivamente) com o cultivo

mixotrófico, apesar da pouca influência sobre a biomassa, enquanto que com C.

gracilis foi observado um acréscimo importante somente na biomassa (1,25 vezes).

Por outro lado, N. oculata e T. chuii foram as microalgas em que o cultivo

mixotrófico com glicerol 0,05 M teve o impacto negativo mais pronunciado, afetando

ambos biomassa e conteúdo lipídico, enquanto que com I. galbana não houve

influência sobre a biomassa e conteúdo lipídico. Já P. virginica, apesar do incremento

na biomassa (1,31 vezes) houve redução expressiva no conteúdo lipídico.

Desta forma, principalmente as microalgas C. calcitrans, P. tricornutum e

S. costatum apresentam um grande potencial para a produção de biomassa e lipídios,

podendo constituir uma alternativa tecnológica importante para o aproveitamento e

valorização do glicerol oriundo da produção do biodiesel.

59

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Estudar o cultivo de microalgas em diferentes faixas de concentração de

glicerol PA.

Estudar a cinética de crescimento de microalgas de água doce utilizando

glicerol como fonte de carbono.

A partir das microalgas que apresentaram melhor crescimento em glicerol

PA, iniciar cultivos mixotróficos empregando o glicerol bruto proveniente da indústria

do biodiesel.

Otimizar a produção das microalgas que apresentarem melhores respostas

em relação à produção de biomassa e conteúdo lipídico em glicerol bruto.

Ampliar o volume dos cultivos para escala piloto.

Avaliar a composição bioquímica das microalgas que apresentarem melhor

crescimento em glicerol bruto, incluindo a determinação do perfil de ácidos graxos.

Avaliar o efeito da suplementação dos meios de cultivo com fontes

nitrogenadas.

60

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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.APÊNDICE A - Curvas padrão das microalgas utilizadas no estudo.

Chaetoceros calcitrans

Figura 1A – Curva padrão da microalga Chaetoceros calcitrans.


Figura 2A – Curva padrão da microalga Chaetoceros gracilis.

y = 0,396x - 0,0048 R² = 0,9989

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância

Chaetoceros calcitrans

y = 0,3346x + 0,0256 R² = 0,9925

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância


70


Figura 3A – Curva padrão da microalga Dunaliella tertiolecta.

Isochrysis galbana

Figura 4A – Curva padrão da microalga Isochrysis galbana.

y = 0,2527x + 0,0031 R² = 0,9989

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80

Bio

mas

sa (

g L-

1)

Absorbância


y = 2,2511x - 0,0019 R² = 0,9992

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância

Isochrysis galbana

71


Figura 5A – Curva padrão da microalga Nannochlopsis oculata.


Figura 6A – Curva padrão da microalga Phaeodactylum tricornutum.

y = 0,4196x - 0,0161 R² = 0,9971

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância


y = 1,3158x + 0,0158 R² = 0,993

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância


72


Figura 7A – Curva padrão da microalga Pyramimonas virginica.


Figura 8A – Curva padrão da microalga Skeletonema costatum.

y = 0,645x + 0,0018 R² = 0,9971

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância


y = 1,9009x - 0,0011 R² = 0,9949

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância


73

Tetraselmis chuii

Figura 9A – Curva padrão da microalga Tetraselmis chuii.

Tetraselmis suecica

Figura 10A – Curva padrão da microalga Tetraselmis suecica.

y = 0,7351x + 0,0034 R² = 0,9989

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância

Tetraselmis chuii

y = 0,5196x - 0,0025 R² = 0,9989

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60

Bio

mas

sa (

g L-1

)

Absorvância

Tetraselmis suecica

74

APÊNDICE B - Curva padrão de glicerol.

Figura 1B – Curva padrão do glicerol.

y = 0,7534x + 0,044 R² = 0,9837

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Co

nce

ntr

ação

(g

L-1)

Absorvância

Glicerol

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