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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

PALOMA CLEMENTINO DA CRUZ LUBARINO

AVALIAÇÃO FENOTÍPICA E BIOQUÍMICA DE Citrullus lanatus L.

PARASITADAS POR Meloidogyne enterolobii

PETROLINA

2015

PALOMA CLEMENTINO DA CRUZ LUBARINO

AVALIAÇÃO FENOTÍPICA E BIOQUÍMICA DE Citrullus lanatus L.

PARASITADAS POR Meloidogyne enterolobii

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido, para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais Orientador: Prof. Dr. Leonardo Sousa Cavalcanti Co-orientador: Dr. Pedro Martins Ribeiro Junior

PETROLINA

2015

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF

Bibliotecário(a): Maria Betânia de Santana da Silva – CRB4-1747.

Lubarino, Paloma Clementino da Cruz

L926a Avaliação fenotípica e bioquímica de Citrullus lanatus L. parasitadas por Meloidogyne enterolobii / Paloma Clementino da Cruz Lubarino. -- Petrolina, 2015.

xvi; 89 f.: il. 29 cm. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do

Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina- PE, 2015.

Orientador: Prof. Dr. Leonardo Sousa Cavalcanti.

1. Nematoide das galhas. 2. Citrullus lanatus.

3. Mecanismos de defesa. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 581.19

A Deus, aos meus pais Antonio José Lubarino e

Maria Oneide Clementino da Cruz Lubarino, ao meu

irmão Radamés Clementino da Cruz Lubarino, ao

meu filho Iago Clementino Lubarino Nogueira, ao meu

namorado Manicio Antonio Antas Souza que

acreditaram em mim e me apoiaram em todos os

momentos.

Dedico

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por me manter perseverante em meus propósitos.

Agradeço à Nossa Senhora, por me cobrir com seu manto protetor, fortalecendo- me

mesmo nas dificuldades.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Leonardo Sousa Cavalcanti, a quem agradeço pela

atenção e pela oportunidade de ser sua orientada.

Ao meu co-orientador, Dr. Pedro Martins Ribeiro Júnior por todas as contribuições

científicas, pela paciência e técnicas ensinadas.

A minha supervisora da Embrapa, Dr.ª Rita de Cássia Souza Dias, a quem agradeço

pela oportunidade de desenvolvermos os trabalhos de melhoramento, fase

fundamental para seguir com as demais etapas deste trabalho.

Ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido, aos

professores por me ajudarem como agrônoma, a aprimorar o conhecimento químico

tão relevante para minha formação, a Nancy Freire Cavalcante, pessoa-chave no

colegiado da pós-graduação, que radia simpatia e carisma.

A Embrapa Semiárido pelo suporte para o desenvolvimento deste trabalho, como

casa de vegetação, as sementes dos genótipos do programa de melhoramento de

melancia visando resistência a M. enterolobii, os laboratórios e outros.

As colegas de turma, Amanda Leite Guimarães, Ana Paula de Oliveira, Deize Raquel

dos Reis Cruz, Eriane Dantas Bezerra, Fernanda Granja da Silva Oliveira, Georgia

Sueley Bezerra, Jackeline Ferreira Gomes, Kíscyla Oliveira de Andrade, Naiane

Darklei dos Santos Silva e Sandra Kelle Souza Macedo pelo apoio, momentos de

estudo e amizade.

A Antonio José Lubarino e Maria Oneide Clementino da Cruz Lubarino, meus pais,

por todo amor incondicional e valores ensinados. Por me lembrarem sempre que

Deus está acima de tudo, que Ele é nosso conforto, nossa diretriz e por mais que

existam dificuldades, elas existem para serem superadas.

A Radamés Clementino da Cruz Lubarino, meu irmão, sinônimo de determinação, a

quem agradeço por sempre me ejetar força, coragem, a ele devo a ousadia em

buscar sempre crescer mais e mais.

A Iago Clementino Lubarino Nogueira, meu amado filho, por quem tenho amor maior

e infinito. Esteve presente nas minhas outras formações (Biologia e Agronomia) e,

hoje, mamãe dedica mais um título a você.

A Manicio Antonio Antas de Souza, meu noivo, amigo e parceiro que esteve presente

em algumas etapas deste trabalho, até irrigar as plantinhas, ele irrigou comigo nos

finais de semana. Obrigada, por me transmitir carinho, amor e afetividade, o

sentimento é recíproco.

A todos, o meu “Muito obrigada”!

“Cada sonho que você deixa para trás, é um pedaço

do seu futuro que deixa de existir”.

(Steve Jobs)

RESUMO

O trabalho objetivou selecionar plantas da população de melancia forrageira acesso

BGCIA 240, oriunda do Banco Ativo de Germoplasma de Cucurbitáceas da Embrapa

Semiárido resistentes a Meloidogyne enterolobii, comparar os métodos não

destrutivos com os métodos tradicionais destrutivos; e estudar mecanismos

bioquímicos envolvidos nessa resistência. Para a seleção de plantas resistentes,

foram realizadas avaliações aos 30 dias após a inoculação (DAI) pelos métodos não

destrutivos: desenvolvimento global da parte aérea (DGPA) e de galhas (DGG)

classificando-as com grau de resistência (R), média resistência (MR) e

suscetibilidade (S). Após a seleção, as plantas foram transplantadas para vasos de

30 L e avaliadas aos 90 DAI pelos métodos não destrutivos e destrutivos

(desenvolvimento global do sistema radicular (DGSR), de galhas (DGG) e fator de

reprodução (FR). Para o estudo de mecanismos bioquímicos envolvidos na defesa

da melancia ao nematoide foi utilizada um acesso resistente selecionado neste

trabalho comparado com um acesso de melancia BGCIA 875 suscetível a esse

nematoide. Os acessos foram inoculados e avaliados quanto ao número de galhas

(NG), número de ovos por planta (NO), comprimento (CR) e massa fresca de raiz

(MFR) aos 7, 14, 21, 28 e 35 DAI. Avaliou-se também os teores de clorofila e

atividade de enzimas relacionadas à defesa. Pelo método não destrutivo foi

selecionado 46 % de plantas R. A avaliação não destrutiva baseada no DGPA e

DGG das plantas do acesso BGCIA 240 apresentou correlação positiva na

classificação precoce da reação de resistência a M. enterolobii com o FR. Com

relação a reação ao patógeno, o acesso resistente apresentou menor NG e NO, e

aos 14 DAI, apresentou maior atividade das enzimas guaiacol peroxidase, ascorbato

peroxidase, polifenoloxidases e fenilalanina amônia-liase. O uso dos métodos não

destrutivos e o estudo de respostas de defesa na melancia podem auxiliar na

seleção de genótipos visando à resistência a M. enterolobii.

Palavras-chave: nematoide das galhas, Citrullus lanatus, mecanismos de defesa.

ABSTRACT

The study aimed to select plants a population of forage watermelon access BGCIA

240, resistant to Meloidogyne enterolobii from the Cucurbitaceae Germplasm Active

Bank of Embrapa Semi-Arid, methods avoid destructive traditional methods, were

comparad in this, as well as study biochemical mechanisms involved in this

resistance. For the selection of resistant plants an assessments was carried out up

to 30 days after inoculation (DAI) by means of non-destructive approaches evaluating

global development of shoots (DGPA) and galls (DGG) classifying them with degree

of resistance (R), average resistance (MR) and susceptible (S). After selection, these

plants were transplanted and evaluated at 90 DAI by non-destructive and destructive

(overall development of the root system (DGSR), galls (DGG) and reproduction factor

(FR) approaches. For the study of biochemical mechanisms involved in the defense

of watermelon against nematode infection, resistant plants were selected and

compared to a watermelon access BGCIA 875 (susceptible to this nematode). The

plants were inoculated and evaluated as the number of galls (NG), number of eggs

per plant (NO), length (CR) and fresh pasta from root (MFR) at 7, 14, 21, 28 and 35

DAI. The chlorophyll content and enzymes activity related to defense, were also

assessed. The non-destructive method analyses selected 46% of plants as non

susceptible, based on DGPA and DGG analyses. Plant access BGCIA 240 showed a

positive correlation in the early classification of the M. enterolobii resistance reaction

to the FR. Regarding the reaction to pathogen resistant access showed less NG and

NO, and 14 DAI, higher activity of enzymes guaiacol peroxidase, ascorbate

peroxidase, polyphenol and phenylalanine ammonia lyase. The use of non-

destructive methods and study biochemical of defense responses in watermelon can

help in the early selection of forage watermelon genotypes for resistance to M.

enterolobii.

Key words: root-knot nematodes, Citrullus lanatus, defense mechanism.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Espécie vegetal Citrullus lanatus (A), frutos da melancia forrageira (C.

lanatus var. citroides) (B) e da melancia comercial (C. lanatus var. lanatus) (C).......24

Figura 2. Raízes com galhas (A) e parte aérea de Citrullus lanatus var. lanatus

infectada (B) por Meloidogyne enterolobii..................................................................25

Figura 3. Ciclo de vida do nematoide das galhas, Meloidogyne spp. A terceira fase

juvenil (J3) não está ilustrada na figura. J2 corresponde à segunda fase juvenil e J4

à quarta fase (Fonte: PERRY & MOENS, 2006)........................................................26

Figura 4. Etapas da lavagem de raízes inoculadas do acesso BGCIA 240, para

avaliação aos 30 dias após inoculação. Retirada da planta (A), lavagem e retirada do

excesso de solo nas raízes (B)..................................................................................41

Figura 5. Aspecto geral das plantas em vasos de 30 litros de solo para obtenção de

descendência em condições de telado......................................................................42

Figura 6. Classes do sistema radiculares do acesso BGCIA 240, colhido e avaliado.

Resistente (A), média resistência (B) e suscetível (C) em função do desenvolvimento

global da parte aérea (DGPA) e de galhas (DGG).....................................................47

Figura 7. Número de galhas (A) e número de ovos (B) por planta de dois genótipos

de melancia do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas da Embrapa

Semiárido, acesso BGCIA 240 (resistente) e acesso BGCIA 875 (suscetível)

inoculadas com Meloidogyne enterolobii, avaliadas em diferentes épocas de coleta. *

Significativo a 5% de probabilidade e ns= não significativo pelo teste T....................55

Figura 8. Proteínas solúveis totais (A), atividades das enzimas guaiacol peroxidase

(POX) (B), polifenoloxidase (PPO) (C), ascorbato peroxidase (APX) (D), catalase

(CAT) (E) e fenilalanina amônia liase (PAL) (F) de dois genótipos de melancia do

Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido,

acessos BGCIA 240 e BGCIA 875 inoculadas com Meloidogyne enterolobii, e seus

controles, avaliadas em diferentes épocas de coleta. Barras representam erro

padrão da média.........................................................................................................59

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Caracterização física e química do solo autoclavado utilizado nos

experimentos. Embrapa Semiárido, Petrolina-PE, 2015............................................40

Tabela 2. Avaliação preliminar dos graus de resistência e suscetibilidade em

melancia forrageira acesso BGCIA 240, inoculadas com Meloidogyne enterolobii aos

30 dias após inoculação (DAI) e dados de amplitude do fator de reprodução (FR).

Petrolina, Embrapa Semiárido, 2015..........................................................................47

Tabela 3. Dados de amplitude do acesso BGCIA 240 inoculadas com Meloidogyne

enterolobii avaliadas quanto ao número de ovos/mL de solução do sistema radicular.

Petrolina, Embrapa Semiárido, 2015..........................................................................48

Tabela 4. Valores dos coeficientes de correlação para a associação entre as

variáveis desenvolvimento global de galhas (DGG) e da parte aérea (DGPA) de

planta do acesso BGCIA 240 aos 30 dias após a inoculação. Petrolina, Embrapa

Semiárido, 2015.........................................................................................................49


variáveis desenvolvimento global do sistema radicular (DGSR), de galhas (DGG),

fator de reprodução (FR) e desenvolvimento global da parte aérea (DGPA) de

plantas do acesso BGCIA 240 aos 90 dias após a inoculação. Petrolina, Embrapa

Semiárido, 2015.........................................................................................................52

Tabela 6. Comprimento de raiz, massa fresca de raiz, clorofila a e clorofila b de dois

genótipos de melancia do Banco Ativo de Germoplasma de Cucurbitáceas da

Embrapa Semiárido, acessos BGCIA 240 e BGCIA 875 inoculadas e não inoculadas

com Meloidogyne enterolobii em diferentes épocas de avaliação.............................55

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APX Ascorbato peroxidase

BAG Banco Ativo de Germoplasma

CAT Catalase

CCP Citocromo c peroxidase

CF Comprimento da primeira folha verdadeira

CPA Comprimento da parte aérea

CSR Comprimento do sistema radicular

cv. Cultivar

DAI Dias após a inoculação

DF Diâmetro da primeira folha verdadeira

DGG Desenvolvimento global de galhas

DGPA Desenvolvimento global da parte aérea

DGSR Desenvolvimento global do sistema radicular

DH Diâmetro do hipocótilo

DMSO Dimetilsulfóxido

EAO's Espécies ativas de oxigênio

EC Enzyme commission

f. sp. forma specialis

FC Final do ciclo

FR Fator de reprodução

H2O2 Peróxido de hidrogênio

HR Resposta de hipersensibilidade

IFC Índice Falker de Clorofila

J2 Juvenil de segundo estágio

J3 Juvenil sedentário

J4 Juvenil no início da fase reprodutiva

Lip Lignina peroxidase

MDA Monodehidroascorbato

MFSR Massa fresca do sistema radicular

MnP Peroxidase dependente de manganês

MR Média resistência

NO Número de ovos

O2- Oxigênio molecular

OH- Radical hidroxila

PAL Fenilalanina amônia liase

PFOs Polifenoloxidases

POX Guaiacol peroxidase

PPO Polifenoloxidase

PR-proteínas Proteínas relacionadas à patogênese

R Resistente

S Suscetível

SAR Resistência sistêmica adquirida

VSR Volume do sistema radicular

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................18

2. OBJETIVOS...........................................................................................................21

2.1. Objetivo Geral......................................................................................................21

2.2. Objetivos Específicos..........................................................................................21

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.............................................................................22

3.1. Botânica de Citrullus lanatus L.............................................................................22

3.2. Nematoides das galhas da melancia...................................................................24

3.3. Recursos genéticos: fontes de resistência de Citrullus lanatus var. citroides.....28

3.4. Melhoramento genético de Citrullus lanatus L. visando resistência à

nematoides.................................................................................................................29

3.5. Mecanismos de defesa de plantas à nematoides................................................30

3.5.1. Espécies ativas de oxigênio e enzimas antioxidantes.....................................31

3.5.1.1. Peroxidases...................................................................................................32

3.5.1.2. Ascorbato Peroxidase...................................................................................33

3.5.1.3. Catalase........................................................................................................34

3.5.2. Polifenoloxidase...............................................................................................35

3.5.3. Fenilalanina amônia-liase.................................................................................36

3.6. Proteínas relacionadas à patogênese.................................................................37

3.7. Clorofila...............................................................................................................38

4. PARTE EXPERIMENTAL.......................................................................................40

4.1. Material vegetal e cultivo das plantas..................................................................40

4.2. Preparo do inóculo e inoculação.........................................................................40

4.3. Seleção de plantas resistentes à M. enterolobii na população do acesso BGCIA

240..............................................................................................................................41

4.4. Avaliação dos métodos não destrutivos com os métodos tradicionais

destrutivos..................................................................................................................42

4.5. Reação de genótipos de melancia de mesa e forrageira ao patógeno...............43

4.6. Análises de clorofila e enzimáticas......................................................................43

4.7. Delineamento experimental e análise estatística................................................44

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................46

5.1. Seleção de plantas resistentes à M. enterolobii na população do acesso BGCIA

240..............................................................................................................................46

5.2. Correlação dos métodos não destrutivos com os métodos tradicionais

destrutivos..................................................................................................................49

5.3. Reação de genótipos de melancia de mesa e forrageira ao patógeno...............53

5.4. Respostas bioquímicas de defesa.......................................................................56

6. CONCLUSÕES......................................................................................................60

REFERÊNCIAS..........................................................................................................61

APÊNDICE.................................................................................................................72

LUBARINO, P. C. da C. Avaliação fenotípica e bioquímica de Citrullus lanatus L.

parasitadas por Meloidogyne enterolobii 18

1. INTRODUÇÃO

A melancia forrageira (Citrullus lanatus (Thumb.) Matsum & Nakai var.

citroides (L. H. Bailey) Mansf.) pertence à família Cucurbitaceae, e seu fruto

apresenta casca resistente a impactos e à deterioração, polpa branca

geralmente consistente com baixo teor de sacarose (OLIVEIRA et al., 2000).

Muitas vezes são conservadas por mais de um ano sem perder suas qualidades

nutricionais, sob sol escaldante nas áreas secas do Nordeste brasileiro e sem

necessidade de práticas sofisticadas de armazenamento. A espécie forrageira é

um dos recursos alimentares à criação pecuária da região. Em um hectare, a

depender da quantidade e da distribuição das chuvas, pode chegar a produzir de

25 a 30 toneladas (OLIVEIRA et al., 2000; ARAÚJO et al., 2013).

Alguns estudos também descrevem a importância da espécie C. lanatus

var citroides como porta-enxerto (GAMA et al., 2010; 2013). Na maioria das

vezes, genótipos desta espécie possuem sistema radicular mais vigoroso que o

da planta enxertada, sendo utilizado como alternativa a curto prazo para o

manejo de plantas em solos com problemas de patógenos, salinidade ou mesmo

oscilações de temperatura (RIZZO et al., 2004).

A longo prazo, a melancia forrageira, assim como outras Cucurbitáceas tem

sido utilizada em programas de melhoramento genético visando identificação de

fontes de resistência aos patógenos do solo. Entre estes, o nematoide de galhas

(Meloidogyne spp.) estão entre os patógenos mais comuns que limitam a

qualidade e a produção das Cucurbitáceas. As espécies desse gênero de maior

ocorrência no Brasil são M. incognita (Kofoid & White) Chitwood, M. javanica

(Treub) Chitwood e M. arenaria (Neal) (PEREIRA et al., 2009). Contudo, no

Submédio do Vale do São Francisco a espécie M. enterolobii (sin. M.

mayaguensis) vem, nos últimos anos, causando prejuízos aos produtores de

Cucurbitáceas e de outras culturas (TERAO et al., 2010). O controle desses

nematoides na melancia é difícil devido a ampla gama de plantas hospedeiras e

não existem nematicidas registrados no Brasil para o seu controle (AGROFIT,

2015). Ademais, os nematicidas químicos apresentam alta toxidez ao homem e

ao ambiente e tem alto custo aos produtores. Assim, para o controle destes



fitopatógenos, a resistência genética tem sido adotada como alternativa mais

econômica para o produtor e mais sustentável para o ambiente (LIMA et al.,

2005).

Neste contexto, experimentos mostraram que acessos de Cucurbitáceas

como a bucha (Luffa cylindrica (L.) Roem.), abóbora Goianinha (Cucurbita

moschata Duchesne), abóbora Mini Paulista (Cucurbita moschata Duchesne),

melão Redondo Amarelo (Cucumis melo L. var. inodorus Naud) e melancia

Charleston Gray (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai var. lanatus) foram

resistentes a M. incognita (FRANCO et al., 2008). Em outros trabalhos, Castro et

al. (2011) e Damaceno (2012), relataram a melancia forrageira (Citrullus lanatus

var. citroides) como fonte de resistência contra M. enterolobii, com uso potencial

tanto como porta-enxerto, quanto para cruzamentos com melancia de mesa

(Citrullus lanatus (Thumb.) Matsum & Nakai). Apesar destes relatos, existem

poucos trabalhos apresentando estudos de mecanismos bioquímicos

relacionados à defesa dessas acessos resistentes quando inoculadas com

nematoides do gênero Meloidogyne.

Ao reconhecer o patógeno, em plantas resistentes ocorre o aumento dos

níveis de defesa pela ativação de genes que codificam diversos compostos

como enzimas antioxidantes, proteínas relacionadas à patogênese e enzimas

precursoras de fitoalexinas como a fenilalanina amônia-liase (PAL) (KOVÁCIK et

al, 2007).

Estudos da associação da expressão destes compostos de defesa e de

genótipos resistentes a nematoides em outras olerícolas foram realizados. Na

família das Solanáceas, o tomate e batata tem mostrado associação da enzima

PAL como um fator de resistência a patógenos. Brueske (1980) e Kalaiarasan

(2009) observaram em raízes de tomate resistentes e inoculadas com M.

incognita menor número de galhas por planta e um aumento significativo na

atividade da PAL às 108 horas após a inoculação, superiores à testemunha

suscetível que apresentaram menor atividade dessa enzima. Em raízes de

batatas resistentes e inoculadas com o nematoide Globodera rostochiensis

foram observadas maiores atividades da PAL do que em raízes de plantas

suscetíveis (GIEBEL, 1973).



De acordo com um levantamento bibliográfico, ainda não foi encontrado

estudo fitoquímico de genótipos de melancia relacionados com a resistentes a

nematoide de galhas.

Diante do exposto, o trabalho tem como objetivos selecionar dentro de

uma população de Citrullus lanatus var. citroides plantas com graus de

resistência a Meloidogyne enterolobii, correlacionando e validando os métodos

de avaliação não destrutivos com os métodos tradicionais destrutivos. Assim

como, avaliar enzimas relacionadas à defesa de plantas à patógenos e clorofilas

em genótipos de melancia forrageira resistente comparando com genótipo de

melancia de mesa suscetível a M. enterolobii.



2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Os objetivos gerais deste trabalho foi selecionar plantas de melancia

forrageira com resistência ao nematoide das galhas Meloidogyne enterolobii;

comparar os métodos não destrutivos com os métodos tradicionais destrutivos e

estudar os aspectos bioquímicos relacionados à defesa da planta a esse

patógeno.

2.2. Específicos

Selecionar dentro de uma população de Citrullus lanatus var. citroides

plantas com grau de resistência a M. enterolobii;

Validar métodos não destrutivos na avaliação de resistência a M. enterolobii,

correlacionando-os com os métodos tradicionais destrutivos;

Verificar a resposta de reação dos genótipos de C. lanatus var. lanatus e C.

lanatus var. citroides a M. enterolobii;

Avaliar as enzimas relacionadas à defesa de plantas à patógenos, guaiacol

peroxidase, polifenoloxidase, catalase, ascorbato peroxidase e fenilalanina

amônia-liase e clorofilas em genótipo de melancia forrageira resistente

comparado com genótipo de melancia de mesa suscetível a M. enterolobii;

Contribuir para o estudo fitoquímico de genótipos de melancia relacionados

com a resistencia a nematoide de galhas.



3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Botânica de Citrullus lanatus L.

Plantas da família Cucurbitaceae estão amplamente distribuídas pelo

mundo todo. Em regiões da América do Norte, América do Sul, Norte da Ásia,

Sul da Europa, Ásia Tropical e Temperada, ocupa lugar de destaque entre as

hortaliças mais cultivadas (SATURNINO et al., 1982).

A família Cucurbitaceae é constituída por plantas caracterizadas como

ervas anuais ou perenes, subarbustos escandentes ou prostrados. Podem

apresentar gavinhas, que quando presentes são simples ou ramificadas sendo

originadas de modificações dos ramos, ao passo que as folhas são alternas,

simples ou lobadas. As flores são perfeitas ou unissexuadas, com plantas

monoicas, dioicas ou ainda andromonoicas, isoladas ou ordenadas em racemos,

espigas, fascículos ou panículas. A flor feminina apresenta hipâncio geralmente

alongado, ovário ínfero, tricarpelar, unilocular ou dividido em falsos lóculos pela

intrusão de placentas parietais. As flores masculinas contem cinco estames livres

entre si com ou sem estaminódios. O número de estames e a sua disposição,

constituem caráter de valor na sistemática das cucurbitáceas (BARROSO,

1978).

Essa família está classificada dentro da divisão Magnoliophyta, classe

Magnoliopsida, subclasse Rosidae, ordem Cucurbitales (BARROSO, 2001).

Embora não seja a maior família da ordem Cucurbitales, as Cucurbitáceas se

destacam por possuir cerca de 120 gêneros e 820 espécies, dentre as quais

encontra-se espécies de alta relevância econômica, de frutos comestíveis e

amplamente conhecidos, como os jerimuns (Cucurbita spp.), pepino, melão

(Cucumis spp.), e a melancia (Citrullus spp.) (NUEZ et al., 2000).

Esta última pertence ao gênero Citrullus que possui quatro espécies, sendo

três consideradas espécies de melancias selvagens anuais, C. colocynthis (L.)

Schrad, C. ecirrhosus Cogn e C. rehmmi Winter (MEEUSE, 1962) e a C. lanatus

Mansf. (melancia) encontrada em território brasileiro, a qual é consumida como

fruta fresca (ROMÃO, 1995; JOBST et al., 1998).



Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai é uma espécie originária das

regiões quentes da África Tropical e aparentemente os primeiros cultivos

ocorreram a mais de 5000 anos nessa região (WHITAKER; DAVIS, 1962). Hoje,

seu cultivo, tanto quanto seu consumo está difundido nos países de clima quente

em regiões tropicais.

A espécie, ainda apresenta duas variedades botânicas, a melancia

cultivada para consumo humano, Citrullus lanatus var. lanatus e para

alimentação animal, Citrullus lanatus var. citroides (WHITAKER; DAVIS, 1962;

MOHR, 1986). No entanto, existem entre estas duas variedades, características

botânicas e morfológicas que as diferenciam, como por exemplo, o sistema

radicular, que é mais extenso nas variedades citroides justamente por se

tratarem de genótipos adaptados às condições de sequeiro.

Em geral, as folhas dessa espécie apresentam um tamanho médio, são

recortadas, triangulares, lobadas, alternas e de nervura palmeada. Quanto ao

florescimento, as plantas são monoicas, isto é, possuem flores masculinas e

femininas separadas na mesma planta, contudo, algumas populações são

andromonoicas, com flores hermafroditas e masculinas na mesma planta

(SOUZA, 2008). As flores femininas se diferenciam das flores masculinas pela

presença de um ovário súpero, bem visível (CASTELLANE; CORTEZ, 1995).

As flores ocorrem isoladamente, raramente agrupadas, axilares, opostas às

gavinhas, de cálice estrelado, esverdeado e corola dividida em cinco lóbulos, de

coloração amarela ou branca (CASTELLANE; CORTEZ, 1995).

Os frutos são indeiscentes, constituídos por uma baga, de paredes

externas duras e internas carnosas. Quando maduro, a coloração externa varia

de verde cana a verde escuro para as ambas variedades, a interna (parte

comestível) na var. lanatus é geralmente vermelha e macia. Já, a variedade

citroides apresenta a polpa branca e dura (LUBARINO et al., 2012) (Figura 1).

Segundo Nuez et al. (1998), o formato do fruto pode variar entre alongado,

elíptico, deprimido, ovalado e redondo para as ambas variedades.



Figura 1. Espécie vegetal Citrullus lanatus (A), frutos da melancia forrageira (C.

lanatus var. citroides) (B) e da melancia comercial (C. lanatus var. lanatus) (C).

3.2. Nematoides das galhas da melancia

Os nematoides do gênero Meloidogyne, também conhecidos por

nematoides das galhas, estão entre os nematoides mais destrutivos que

infectam as cucurbitáceas (POFU et al., 2011). Esse gênero contém mais de 80

espécies e estão distribuídos em todo o mundo parasitando quase todas as

espécies de plantas superiores (PERRY; MOENS, 2006). As espécies do gênero

Meloidogyne mais importantes em cultivos de cucurbitáceas no Brasil são M.

incognita (Kofoid & White) Chitwood, M. javanica (Treub) Chitwood e M. arenaria

(Neal) Chitwood e são as espécies de maior ocorrência no mundo e no Brasil

(PEREIRA et al., 2009). Outro nematoide desse gênero que vem trazendo

prejuízos aos produtores de cucurbitáceas no Submédio Vale do São Francisco

é o M. enterolobii Yang & Eisenback, 1983 (sin. M. mayaguensis).

O primeiro relato no Brasil de M. enterolobii ocorreu em goiabeira

plantadas em perímetros irrigados de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA),

representando ameaça potencial para os produtores de culturas suscetíveis no



Semiárido brasileiro (CARNEIRO et al., 2001). Nessa região foi relatado um

intenso ataque desse nematoide no cultivo da goiabeira que tomou maiores

proporções com o surgimento de novos plantios, muitos dos quais em áreas

anteriormente utilizadas com culturas suscetíveis como bananeira, tomateiro,

cebola e cucurbitáceas. A disseminação desse nematoide também foi favorecida

pelo uso comunitário de tratores e implementos contaminados com solo

infestado (MARANHÃO et al., 2001).

Pelo comprometimento do sistema radicular, os sintomas reflexos na parte

aérea das plantas ocasionados por patógenos desse gênero podem ser

confundidos com outros problemas como escassez de água ou déficit nutricional,

como amarelecimento e redução do crescimento das plantas.

O sítio de alimentação nematoides do gênero Meloidogyne no hospedeiro

é responsável pelo sucesso do parasitismo. O estabelecimento do sítio se dá

pela formação de três a cinco células gigantes multinucleadas, que funcionam

como drenos de nutrientes do cilindro vascular para o nematoide. As células

gigantes formadoras de galhas são geradas a partir de células vegetais

diferenciadas, situadas na porção anterior ao nematoide, induzidas pela

modificação do ciclo celular, balanço hormonal, sinalização celular, expressão

gênica e, consequentemente, a fisiologia da raiz (WILLIAMSON; GLEASON,

2003; BIRD et al., 2003). As galhas formadas ocasionam a ramificação anormal

das raízes, clorose e amarelecimento das folhas, porte aéreo irregular ou

reduzido, podendo ainda apresentar folhas finas, escassas e murchas (COYNE

et al., 2007; MICHEREF et al., 2005) (Figura 2).

Figura 2. Raízes com galhas (A) e parte aérea (B) de Citrullus lanatus var.

lanatus infectada por Meloidogyne enterolobii.



As espécies de Meloidogyne são consideradas endoparasitas sedentários

e, seu ciclo de vida varia de 28 a 35 dias, dependendo da espécie hospedeira e

das condições ambientais, como a temperatura, tornando-se mais longo em

temperaturas mais baixas ou mais altas (AGRIOS, 2005).

Seguindo a embriogênese desse nematoide, a primeira muda, juvenil (J1)

ocorre dentro do ovo dando origem ao juvenil de segundo estágio (J2) (Figura

3). Quando J2 deixa as massas de ovos, eles infectam as raízes do hospedeiro

e migram pelo cilindro vascular, via força mecânica do estilete e degradação

enzimática da parede celular e lamela média, para formação do sítio de

alimentação (PERRY; MOENS, 2006; GHEYSEN; FENOLL, 2002).

Figura 3. Ciclo de vida do nematoide das galhas, Meloidogyne spp. A terceira

fase juvenil (J3) não está ilustrada na figura. J2 corresponde à segunda fase

juvenil e J4 à quarta fase (Fonte: PERRY & MOENS, 2006).



A natureza dos estímulos produzidos pelas raízes e percebidos por J2

não é clara, mas sabe-se que raízes de plantas suscetíveis são mais atraentes.

Muitos compostos orgânicos e inorgânicos excretados pelas raízes formam

gradientes da superfície da raiz no solo e podem influenciar os nematoides tanto

na atração como na repelência (PERRY; MOENS, 2006).

Nos estádios J3 e J4, os nematoides já se encontram no interior das

raízes, sendo sedentários e obesos. Após o estádio J4, ocorre à completa

formação do aparelho reprodutor, o que caracteriza o estádio adulto. Cada

fêmea pode produzir massas com aproximadamente 500 a 2.000 ovos

(TIHOHOD, 1993). Destes, apenas 5% sobrevivem para reproduzirem-se em

gerações seguidas, e terão em apenas quatro gerações, respectivamente: 25,

625, 15.625 e 390.625 adultos (CASTAGNONE-SERENO, 2002; TAYLOR;

SASSER, 1978). Em condições favoráveis, o ciclo de vida completo dos

nematoides das galhas ocorre em três a quatro semanas. Contudo, qualquer

espécie reduz ou paralisa por completo as suas atividades vitais em

temperaturas superiores a 40 °C ou inferiores a 5 °C (FERRAZ, 2001).

Nematoides do gênero Meloidogyne, por serem parasitas obrigatórios,

necessitam de plantas suscetíveis para a sua sobrevivência, que podem ser

plantas daninhas. Muitos ovos são mantidos viáveis em massas de ovos,

assegurando rápido crescimento da população quando plantas hospedeiras são

cultivadas (LIMA et al., 1995).

O controle desse nematoide é difícil devido a gama de hospedeiras

alternativas e não existem nematicidas registrados no Brasil para o controle

desse patógeno em melancia (AGROFIT, 2015). Além disso, os nematicidas tem

alto custo, apresentam período residual longo e alta toxidez ao homem e

ambiente. Para amenizar esse problema, a utilização de cultivares resistentes

para controlar este patógeno é a estratégia mais econômica e eficaz para o

produtor, impedindo ou dificultando o estabelecimento do patógeno na área de

cultivo (LIMA et al., 2005).



3.3. Recursos genéticos: fontes de resistência de Citrullus lanatus var.

citroides

Dentre os estados no Nordeste brasileiro, o Rio Grande do Norte é

considerado como centro secundário de diversidade da melancia forrageira na

agricultura tradicional, uma vez que são encontradas populações adaptadas à

região, e em alguns casos são encontrados tipos superiores que se

desenvolvem quase que totalmente sem agroquímicos (QUEIRÓZ, 1993;

QUEIRÓZ et al., 2004).

Diversos fatores ameaçam a perda desta diversidade genética, como a

substituição de genótipos tradicionais por melhorados e o êxodo rural

(QUEIRÓZ, 1993). Deste modo, foi realizada no final da década de 80

expedições no Nordeste brasileiro sendo coletadas várias amostras de sementes

da agricultura tradicional da região (QUEIRÓZ, 1993). Posteriormente, foram

realizadas etapas como multiplicação dessas sementes, caracterização,

avaliação e conservação, etapas que caracterizam um Banco Ativo de

Germoplasma (BAG) (GIACOMETTI, 1988).

Estes bancos são importantes fontes de variedades crioulas com

resistência que podem ser utilizadas em programas de melhoramento que visem

a resistência das plantas às doenças (BORÉM; MIRANDA, 2009).

Grande parte das cultivares e dos híbridos de melancia disponíveis no

mercado brasileiro não foram desenvolvidas para as condições climáticas do

Brasil, o que contribui para sua suscetibilidade aos principais estresses bióticos

do Semiárido nordestino.

Alguns estudos tem relatado fontes de resistência da melancia ao M.

enterolobii (THIES; LEVI, 2007). Pontes (2009) encontrou resistência a este

patógeno em acesso introduzido dos Estados Unidos, PI 244019, C. lanatus var.

citroides. Em outro trabalho, Castro et al. (2011), ao estudarem a reação de

genótipos de melancia a nematoides verificaram que acessos do BAG de

Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido, BGCIA 240, BGCIA 229 e BGCIA TEMP

23, apresentaram os menores números de ovos, promovendo a maior inibição

na reprodução desses nematoides, sendo classificados como muitos resistentes.



Damaceno (2012) verificou que há variabilidade para resistência de

alguns acessos, destacando a acesso BGCIA 240. Costa Filho (2012), ao avaliar

20 acessos de melancia coletados no estado do Rio Grande do Norte quanto à

reação ao M. enterolobii, verificou-se que dois destes acessos apresentaram

como fonte potencial de resistência.

3.4. Melhoramento genético de Citrullus lanatus L. visando resistência à

nematoides

Genes de resistência de plantas a nematoides podem estar presentes em

diversas espécies de culturas cultivadas e parentes selvagens. Sua identificação

e incorporação em cultivares comerciais são fatores importantes para um

programa de melhoramento visando a resistência às doenças (ABREU, 2005;

THURAU et al., 2010).

Esta resistência pode ser monogênica ou poligênica e sofrer influência da

variação de fatores ambientais, como a temperatura principalmente em zonas

tropicais. Neste contexto, foi identificado na cultura do tomate, o gene Mi-1, que

confere resistência contra nematoides das galhas, porém em temperaturas do

solo acima de 28 ºC, este gene é inativado (PERRY; MOENS, 2006).

Em geral, os nematoides provocam danos nas plantas resistentes e

suscetíveis, no entanto, há variação na intensidade dos danos. Na maior parte

dos casos, a resistência e a tolerância a nematoides são características

independentes em plantas. Isso significa que um está relacionado com o

controle da multiplicação do patógeno e outro com danos às plantas,

respectivamente (PERRY; MOENS, 2006).

Sabe-se que existem poucos genótipos de melancia disponíveis aos

produtores no mercado brasileiro. Entretanto, esses genótipos não foram

desenvolvidos para as condições brasileiras e sim de outros países como Japão

e Estados Unidos (COSTA; PINTO, 1977). Isto implica que o cultivo dessas

variedades e híbridos gera gastos com defensivos, uma vez que quando

cultivadas em condições ambientais para as quais não foram desenvolvidas, as



variedades tornam-se suscetíveis ao ataque de pragas e doenças (SILVEIRA et

al., 2005).

Para isso, é necessário reunir um maior número de informações

importantes sobre o germoplasma selecionado (LORENCETTI et al., 2005;

SOUZA et al., 2004).

No início de um programa de melhoramento genético visando à

incorporação de resistência a fitopatógenos, é necessário conhecer a reação de

acessos da cultura estudada frente a estes agentes para a seleção de fontes de

resistência (WILCKEN et al., 2005). Sendo assim, para que haja sucesso em um

programa de melhoramento genético é fundamental a escolha de potenciais

genitores. Isso permitirá que se obtenham híbridos e, posteriormente,

populações segregantes promissoras.

3.5. Mecanismos de defesa de plantas à nematoides

As plantas são constantemente atacadas por pragas e por patógenos

causando sérios prejuízos aos produtores. Dentre estes patógenos, os

nematoides se destacam e podem parasitar milhares de espécies de plantas.

Entretanto, tem sido relatadas significativas exceções nesse processo de

parasitismo. Assim, com o processo evolutivo, essas plantas desenvolveram

diversos mecanismos de defesa (AGRIOS, 2005) que podem prevenir a atração,

penetração, migração, formação do sítio de alimentação, nutrição, reprodução

ou sobrevivência dos nematoides, podendo ser classificadas em plantas

antagonistas, armadilhas, não hospedeiras ou resistentes (FRAGOSO et al.,

2007).

Nas plantas, os mecanismos de defesa podem ser estruturais e

bioquímicos, ambos podendo ser pré-existentes ou constitutivos (passivos), ou

seja, quando sua expressão independe da presença do patógeno (HUANG,

1985). Nesta categoria, incluem-se os efeitos repelentes e/ou nematicida de

determinadas substâncias químicas presentes na parte aérea ou no exsudato

radicular de algumas plantas. Segundo Rodríguez-Kábana et al. (1994), algumas

plantas contem na parte aérea, compostos nematicidas pré-formados, como



alcalóides, ácidos graxos, isotiocianatos, glicosídeos acianogênicos, terpenóides

e compostos fenólicos que apresentam toxidez aos nematoides e também

podem ser utilizadas como adubo verde. Em plantas do gênero Tagetes spp. é

produzida a substância química α-tertienil no exsudato radicular, a qual

apresenta efeito nematicida (MARAHATTA et al., 2012).

Algumas plantas também apresentam mecanismos estruturais e

bioquímicos pós-formados (induzidos) que são ativados ou aumentam o nível de

compostos pré-existentes após a infecção pelo patógeno (MICHEREFF et al.,

2005). Por exemplo, em plantas resistentes, após o reconhecimento do

patógeno, há o aumento dos níveis de defesa da planta pela ativação de genes

que codificam diversos compostos em resposta a fatores externos bióticos e/ou

abióticos (MICHEREFF et al., 2005). Estas respostas de defesa bioquímicas

podem estar associadas às espécies reativas de oxigênio (EAO´s), proteínas

relacionadas à patogênese e fitoalexinas, dentre outros (AGRIOS, 2005).

3.5.1. Espécies ativas de oxigênio e enzimas antioxidantes

Após o reconhecimento do patógeno pela planta, a primeira resposta de

defesa ativada é a explosão oxidativa ou produção de EAO´s (ex: H2O2, O2- e

OH-) (RESENDE et al., 2003). As EAO’s ocorrem normalmente na célula vegetal,

mas quando estas se acumulam podem se tornar tóxicas à própria célula da

planta. A resposta hipersensitiva é um mecanismo bioquímico pós-formado de

defesa, caracterizado pela morte de células do hospedeiro próximas aos

patógenos biotróficos, o que resulta na interrupção da infecção e na

consequente resistência da planta à doença pelo acúmulo de EAO´s. A indução

da resposta de hipersensibilidade tem sido associada à interação molecular

específica entre uma proteína de avirulência do patógeno, que sinaliza sua

presença para a planta com uma proteína de resistência, que faz a ligação de

reconhecimento proteína-proteína e desencadeia a resposta hipersensitiva

(BAKER et al., 1997; PARKER et al., 2000), conhecida como hipótese de

resistência gene-a-gene.



No entanto, para evitar um maior dano nos tecidos do hospedeiro, além

do ponto de infecção dos patógenos, as plantas possuem um conjunto de

enzimas antioxidantes, tais como guaiacol peroxidase, ascorbato peroxidase,

superóxido dismutase e catalase, que impedem a ação tóxica das EAOs

protegendo as células da planta (RESENDE; SALGADO; CHAVES, 2003).

3.5.1.1. Peroxidases

As peroxidases são glicoproteínas antioxidantes, que catalisam a

oxidação do substrato concomitantemente à redução do peróxido de hidrogênio

(CHOI et al., 2007). Elas estão presentes em fungos, bactérias, plantas e

animais (HIRAGA et al., 2001). Nas plantas, as peroxidases são subdivididas em

três classes. A classe I é representada por enzimas intracelulares, como a

citocromo c peroxidase; vale salientar que, cada enzima recebe uma abreviação

do nome e classificação numérica baseado nas reações químicas que catalisam,

assim o código EC (Enzyme commission) e abreviação da enzima acima

descrita é E.C 1.11.1.5, CCP, repectivamente; e a ascorbato peroxidase (E.C

1.11.1.11, APX). A classe II é composta por enzimas extracelulares, como a

lignina peroxidase (E.C 1.11.1.14, LiP) e peroxidase dependente de manganês

(E.C 1.11.1.13, MnP). A classe III é formada por peroxidases (E.C 1.11.17, POX),

que são secretadas no apoplasto ou acumuladas no vacúolo, apresentam uma

ampla variedade de substratos e são responsáveis pela maioria das reações de

oxirredução estimuladas pelas variações ambientais, ferimentos ou reações

infecciosas (HIRAGA et al., 2001).

Na reação da atividade do guaiacol peroxidase (1), o guaiacol reage com

o peróxido de hidrogênio na presença da peroxidase formando o tetraguaiacol

(HIRAGA et al., 2001). Nesta reação, o peróxido de hidrogênio é reduzido e o

guaiacol, oxidado, atua como doador de prótons.

Peroxidase

4 Guaiacol + 4 H2O

2 Tetraguaiacol (alaranjado) + 8 H

2O (1)



Em um estudo sobre interação de nematoide das galhas com plantas de

tomate resistentes e infectadas pelo fungo Fusarium oxysporum f.sp.

Lycopersici, foi mostrado que a atividade específica de POX aumentou em

plantas inoculadas com o fungo até o quinto dia após a infecção. Enquanto nas

plantas inoculadas com nematoides, a atividade da enzima aumentou apenas

até ao segundo dia e, em seguida, diminuiu. Atividade da enzima POX foi

significativamente menor nos tratamentos (nematoide + fungos), em comparação

com as plantas de controle inoculados com o fungo. Foi observado também, que

em todas as fases biológicas do nematoide há uma supressão da atividade de

peroxidase em raízes de tomateiro, mas esta é acentuada na formação de

adultos do que nas outras fases da vida do nematoide, incluindo formação de

células gigantes, postura de ovos e penetração (SAHEBANI et al., 2008).

3.5.1.2. Ascorbato Peroxidase

A enzima ascorbato peroxidase (E.C 1.11.1.11, APX) engloba uma família

de isoenzimas importantes no sistema de detoxificação de espécies reativas de

oxigênio nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio

(H2O2) em água (GUZZO; HARAKAVA, 2007).

Esta enzima constitui parte do ciclo conhecido como ascorbato/glutationa.

Esta via faz uso de antioxidantes não enzimáticos doadores de elétrons como o

ascorbato e a glutationa. Estes oxidantes são responsáveis pela remoção de

metabólitos de peróxido onde a enzima catalase não consegue alcançar, como

por exemplo, no cloroplasto (POLLE, 2001).

Na reação (2), observa-se que o H2O2 pode ser reduzido e removido pela

APX através do ascorbato como redutor, formando o radical

monodehidroascorbato (MDA) (YOSHIMURA et al., 2000).

APX + H2O

2Composto I + H

2O

Composto I + Ascorbato Composto II + MDA (2)

Composto II + Ascorbato APX + MDA. + H2O



Após o reconhecimento da planta ao patógeno, ocorre a sinalização de

respostas de defesa, onde o H2O2 age como um sinalizador. A partir desse

momento, sucede-se explosão oxidativa e indução de genes de proteção celular

nas células vizinhas restringindo o desenvolvimento da lesão em função da

resposta de hipersensibilidade (HR), que é, então, acompanhada pelo

desenvolvimento de uma resistência sistêmica adquirida (SAR) (RESENDE et

al., 2003).

Em raízes de soja inoculadas com nematoides das galhas (Meloidogyne

javanica e Meloidogyne incognita) foi expresso, após 12 horas da inoculação, um

aumento desta enzima nas plantas inoculadas com o patógeno quando

comparadas com plantas controles não inoculadas (SANTANA, 2012). Logo, a

APX está envolvida nos mecanismos de defesa vegetal contra os danos

provocados pelo estresse oxidativo.

3.5.1.3. Catalase

As catalases (E.C 1.11.1.6, CAT) são metaloproteína constituídas por

quatro grupos heme que convertem H2O2 em H2O e O2 (3), sendo encontradas

em organismos aeróbicos (SCANDALIOS, 2005). Nas células vegetais, estão

presentes nos peroxissomos, glioxissomas, mitocôndrias e dispersos no citosol

(RESENDE et al., 2003). Esta enzima decompõe peróxido de hidrogênio a um

ritmo extremamente rápido, correspondente uma atividade de centro catalítico de

cerca de 107 min-1, apresentando baixa constante de Michaelis (Km) que é a

concentração de substrato necessária para obter a metade da velocidade

máxima.

Catalase

H2O

2 H

2O + O

2(3)

A CAT está relacionada com a expressão de genes em plantas, com o

aumento da resistência das mesmas durante estresses abióticos e estresse

biótico. Para este último, foi observada a atividade dessa enzima em diferentes

interações planta-patógeno. Em plantas de tomate inoculadas com Meloidogyne



spp. houve maior atividade de CAT, 50 dias após a inoculação, em relação às

plantas não inoculadas (MOLINARI; MIACOLA, 1997). E ao estudar sobre

resistência sistêmica adquirida, foi relatada que a infecção de plantas de algodão

pelo nematoide Rotylenchulus reniformis aumenta a atividade da catalase tanto

nas cultivares suscetível (B2RF), quanto nas resistentes (LONREN – 1), o

mesmo não ocorre com o controle, o qual foi isento do estresse causado pelo

patógeno (ARYAL et al, 2011).

3.5.2. Polifenoloxidase

As polifenoloxidases (E.C 1.10.3.1, PFOs) são enzimas que reagem (4)

junto com a agente oxidante O2, inserindo um átomo de oxigênio em um grupo

hidroxila existente nos compostos fenólicos, seguida pela oxidação do o-difenol

na quinona correspondente (MAYER et al., 2006).

O2

+ Catecol (o-difenol) o-quinona + H2O

2(4)

Desta forma, o papel fisiológico da polifenoloxidase (PPO) em plantas tem

sido relacionado à resistência ao ataque de insetos e microorganismos. Ao

passo que, o dano causado por esse ataque rompe as células dos cloroplastos,

e a enzima que se encontrava latente, torna-se ativa quando liberada na

membrana dos tilacóides e assim ocorre a reação de oxidação, que tem como

resultado a produção de quinonas, compostos que são bastante reativos

(YORUK; MARSHALL, 2003). Além disso, as quinonas são mais tóxicas a

microrganismos do que os fenóis em sua forma original (AGRIOS, 2005).

Não se conhece nenhum trabalho que relacione a PPO em melancia

como forma de defesa a nematoides. No entanto, alguns estudos tem mostrado,

para plântulas de soja e inoculadas com J2 de M. javanica, um aumento na

atividade da PPO após 72 h da inoculação na variedade Hartwig (resistente) em

comparação com raízes de plantas não infectadas e com raízes de Cristalina

(suscetível). No caso da soja inoculada com J2 de Heterodera glycines, houve



aumento na atividade de PPO na variedade resistente às 48 h após a

inoculação. Acredita-se que a atividade provocada por H. glycines foi detectada

mais precocemente pela forma de infecção e estabelecimento na raiz, uma vez

que este nematoide provoca mais lesões no tecido da raiz que M. javanica

(SHIMIZU, 2004).

3.5.3. Fenilalanina amônia-liase

A fenilalanina amônia-liase (E.C 4.3.1.5, PAL) é uma enzima chave do

metabolismo vegetal estando envolvida na biossíntesse dos fenilpropanoides,

com participação de fenilalanina catalisando a reação de conversão de L-

fenilalanina em amônia e ácido trans-cinâmico, além de ser o ponto de

ramificação entre o metabolismo primário (via do ácido chiquímico) e secundário

(HERRMANN; WEAVER, 1999).

A PAL é uma enzima tetramérica composta por quatro subunidades

diferentes e está presente nas plantas, localizada no citoplasma das células,

mas também pode estar associada a estruturas membranosas (DIXON; PAIVA,

1995). O papel da PAL como um fator de resistência de plantas a patógenos é

bem conhecido, assim como o papel desta em plantas infectadas com

nematoides das galhas. Muitos estudos a este respeito foram descritos em

algumas plantas da família da Fabaceae e Solanaceae, o mesmo não é

compreendido entre as Cucubitáceas.

Janegitz (2012), ao estudar a indução de compostos de defesa pela

aplicação de cis-jasmone e danos causados por M. javanica em genótipos de

soja resistente e suscetível, observou que a pulverização foliar com cis-jasmone

induziu sistemicamente a atividade da PAL, após 120h da aplicação. Já, a

pulverização foliar com cis-jasmone e inoculação aumentaram a atividade da

PAL, 72h após a inoculação. Estes resultados sugerem que a indução de forma

sistêmica, nas raízes de soja, por cis-jasmone assim como em resposta ao

parasita, podem estar relacionados à resistência da soja à M. javanica. Em

avaliação de genótipos de tomate resistentes e suscetíveis a M. incógnita,



observou-se que os genótipos resistentes possuíam atividade de PAL superior

quando comparado a genótipos suscetíveis (KALAIARASAN, 2009).

Diversos trabalhos demonstraram a indução de fitoalexinas por plantas

em defesa ao ataque de nematoides do gênero Meloidogyne. Em raízes de

plantas de soja resistente e inoculada com M. javanica foi observada a produção

da fitoalexina coumestrol, induzidas pela via do ácido jasmônico (JANEGITZ et

al., 2012). Outra substância química conhecida pelo seu papel na defesa das

plantas e encontradas na soja é a fitoalexina gliceolina, que pode ser produzida

em resposta ao ataque por M. incognita (KAPLAN et al., 1980).

Na família das Solanáceas, o tomate e a batata tem mostrado associação

da atividade da enzima PAL como um fator de resistência a patógenos (CAMM;

TOWERS, 1973; BRUESKE, 1980; KALAIARASAN, 2009). Nesse sentido, foi

observado em raízes de tomate resistentes e inoculadas com M. incognita menor

número de galhas por planta e um aumento significativo na atividade da PAL às

108 horas após a inoculação, superiores às plantas suscetíveis inoculadas com

este nematoide (BRUESKE, 1980, KALAIARASAN, 2009). Em raízes de batatas

resistentes e inoculadas com o nematoide dos cistos, Globodera rostochiensis,

foram encontradas maiores atividades da PAL e tirosina amônia-liase (TAL) do

que em raízes de plantas suscetíveis (GIEBEL, 1973).

Plantas resistentes expostas às proteínas dos patógenos ativam seus

mecanismos de defesa, tais como a enzima PAL e a atividade das enzimas

antioxidantes, catalase e peroxidase (RYAN; JAGENDORF, 1995; MARIUTTO et

al., 2011; TRIPATHI, 2006).

3.6. Proteínas relacionadas à patogênese

As PR-proteínas são proteínas localizadas intra e extracelularmente que

se acumulam em tecidos vegetais ou em cultura de células após o tratamento

com eliciadores ou sob ataque de patógenos. Estas proteínas apresentam

algumas características físico-químicas e imunológicas comuns que permitiram

que elas fossem classificadas em 17 famílias, variando de PR-1 até PR-17.

Destas, as mais estudadas são as peroxidases, quitinases e β-1,3-glucanases



(VAN LOON et al., 2006). A PR- 9 é um tipo específico de peroxidase que atua

no reforço da parede celular da planta, catalisando a lignificação e aumentando a

resistência contra vários patógenos (PASSARDI et al., 2004).

Assim, as PR-Proteínas podem estar presentes na planta em baixos

níveis, e seus níveis são aumentados quando as plantas são submetidas a

condições de estresses. Nessa condição, os genes correspondentes são

ativados, vindo a ser detectadas nos tecidos vegetais após injúrias de origem

biótica (pragas e doenças) e/ou abiótica (salinidade, seca, baixas/altas

temperaturas, etc) (BERNARDS et al., 1999; MARTINS-MIRANDA, 2002).

Muitas PR-Proteínas possuem atividades antifúngica, antibacteriana in

vitro e antinematicida como, por exemplo, quitinases, glucanases e proteínas

que se ligam à quitina. Pesquisas avaliando cultivares resistentes de algodão e

café infectadas com M. incognita e M. paranaensis, respectivamente,

identificaram proteínas relacionadas com a patogenicidade como quitinase e

quinona redutase (FRANCO et al., 2010). O reconhecimento da presença dos

nematoides resulta em mudanças conformacionais das proteínas que sinalizam

a resposta de defesa. No entanto, não se sabe ao certo se as proteínas que

reconhecem a presença do patógeno o fazem por meio do reconhecimento

direto do produto de uma molécula do nematoide ou pelas mudanças na célula

hospedeira mediada pelos genes do patógeno (BELKHADIR et al., 2004).

3.7. Clorofila

A clorofila está diretamente relacionada com a atividade fotossintética nas

plantas (TAIZ & ZEIGER, 2006). Assim, a sua quantificação é relevante no

estudo de fatores externos que interferem na qualidade e na quantidade da

clorofila no tecido foliar (LARCHER, 1986).

Diversas formas podem ser trabalhadas para se obter dados de clorofila

nas folhas, estas podem ser diretas (método destrutivo ou clássico) ou indiretas

(método não destrutivo). Alguns estudos tem mostrado a correlação positiva

entre os dois métodos. De tal forma, Rigon et al. (2012) conduziram um

experimento para estabelecer a relação entre os pigmentos fotossintéticos



extraídos em dimetilsulfóxido (DMSO) e as leituras obtidas no clorofilômetro

portátil ClorofiLOG® 1030. As leituras foram realizadas em discos foliares com

diferentes tonalidades de verde, sendo feita, nesses mesmos discos, a

determinação da clorofila pelo método clássico. Os resultados indicaram que o

clorofilômetro portátil ClorofiLOG® 1030, associado a modelos matemáticos,

permitiu estimar a concentração dos pigmentos fotossintéticos, exceto a clorofila

b, com alta precisão, com economia de tempo e com reagentes normalmente

utilizados nos procedimentos convencionais.

Alguns estudos demonstram a importância da relação da clorofila com as

doenças de plantas. Na avaliação de cultivares de soja quanto à resistência

parcial à P. pachyrhizi e o teor de clorofila com o auxílio de um clorofilômetro,

Polizel et. al. (2011) observaram que o teor de clorofila apresentou uma relação

inversamente proporcional à severidade da ferrugem asiática. Em outro trabalho,

Lubarino (2012) ao realizar avaliações aos 60 dias após a inoculação com M.

enterolobii em genótipos de melancia do BAG de Cucurbitacéas da Embrapa

Semiárido observou que os índices de clorofila a e b foram menores nas plantas

inoculadas quando comparadas com seus controles não inoculados. Este estudo

mostrou que embora existam genótipos com maior ou menor presença de galhas

nas raízes, nas duas situações há uma diminuição da clorofila presente na folha.



4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Material vegetal e cultivo das plantas

Os experimentos foram realizados na casa de vegetação da Embrapa

Semiárido, entre os meses de junho a agosto, de 2013 e 2014. No primeiro

experimento foi utilizada uma população de plantas do acesso BGCIA 240 de

melancia forrageira (C. lanatus var. citroides) proveniente do Banco Ativo de

Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido previamente

selecionada pelo programa de melhoramento visando resistência a patógenos

de solo desta Unidade. No segundo experimento foram utilizadas as plantas do

acesso BGCIA 240 classificadas no experimento anterior como resistente a M.

enterolobii, mais as plantas de um acesso BGCIA 875 de melancia de mesa (C.

lanatus var. lanatus), suscetível ao patógeno. Para a produção das mudas, as

sementes foram plantadas em copos descartáveis de polipropileno (uma

semente por copo) contendo 500 mL de solo autoclavado, cujos resultados das

análises química e física realizadas estão apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1. Caracterização física e química do solo autoclavado utilizado nos

experimentos. Embrapa Semiárido, Petrolina-PE, 2015.

Análise Física do Solo

Porosidade Total Areia Silte Argila

(%) g kg-1

47,5 759,9 177,6 62,6

Análise Química do Solo

M.O PO4 ++ K + Ca2+ Mg2+ Na+ Al+ H pH CE

g kg-1 mg dm-3 --------------cmolcdm-3 ------------- mS cm -1

- 5 0,1 0,04 1,6 1,1 1 6,2 0,54

4.2. Preparo do inóculo e inoculação

Para a produção e manutenção do inóculo, foram coletadas fêmeas de

uma população de M. enterolobii de raízes de goiabeira (Psidium guajava L. cv.

Paluma) no município de Petrolina, PE, que foram previamente identificadas

utilizando-se o padrão de isoenzimas (CARNEIRO et al., 2001) e multiplicado em



mudas de tomateiro cv. Santa Clara. Para o preparo do inóculo, os ovos foram

extraídos das plantas de tomateiro infectadas de acordo com a metodologia

proposta por Hussey e Barker (1973). A inoculação foi realizada 12 dias após a

germinação das sementes, quando surgi a primeira folha expandida, com

suspensão de 500 ovos de M. enterolobii por planta, utilizando-se 1 mL da

suspensão, sendo depositados 500 µL de cada lado do colo das plantas.

4.3. Seleção de plantas resistentes a M. enterolobii na população do acesso

BGCIA 240

Afim de se visualizar os sintomas iniciais da infecção causado pelo M.

enterolobii em plantas de melancia, foi realizado aos 30 dias após a inoculação,

lavagem das raízes (Figura 4) e avaliações individuais nas plantas pelos

métodos não destrutivos, como tais variáveis:

Figura 4. Etapas da lavagem de raízes inoculadas da Acesso BGCIA 240, para

avaliação aos 30 dias após inoculação. Retirada da planta (A), lavagem e

retirada do excesso de solo nas raízes (B).

A) Desenvolvimento global da parte aérea (DGPA): comprimento da parte

aérea (CPA), diâmetro do hipocótilo (DH), comprimento (CF) e diâmetro da

primeira folha verdadeira (DF).

B) Grau de resistência da planta estimado a partir do desenvolvimento global

de galhas (DGG), obtido através de uma escala de nota, a qual variou de 0 a 5,

em função do número de galhas onde 0 = ausência de galhas a 1 = 1 a 2 galhas

(Resistente, R); 2 = 3 a 10 galhas a 3 = 11 a 30 (Média Resistência, MR); e 4 =



31 a 100 galhas a 5 = mais de 100 galhas (Suscetível, S), adaptada conforme

proposta de Taylor & Sasser (1998).

4.4. Avaliação dos métodos não destrutivos com os métodos tradicionais

destrutivos

Após a seleção nas avaliações anteriores baseado no DGPA e DGG, as

plantas classificadas preliminarmente como R, MR e S, foram transplantadas

para vasos de 30 litros de solo, submetidas ao manejo recomendado para

melancia (DIAS et al., 2010). Afim de se observar o máximo da infecção causada

pelo M. enterolobii nas plantas inoculadas do acesso BGCIA 240, foram

realizadas avaliações ao final do ciclo (FC), aos 90 DAI (Figura 5).

Figura 5. Aspecto geral das plantas em vasos de 30 litros de solo para obtenção

de descendência em condições de telado.

As avaliações foram feitas pelos métodos não destrutivos, como tais

variáveis:

A) Desenvolvimento global da parte aérea (DGPA): (exceto CF e DF, e

adicionou-se os dados de clorofilas A e B, na região apical, mediana e basal da

planta a partir do clorofilômetro marca ClorofiLOG® modelo CFL 1030).

B) Desenvolvimento global de galhas (DGG): conforme Taylor & Sasser

(1998).



E pelos métodos destrutivos, que são as avaliações do sistema radicular

realizadas após eliminação da parte aérea baseadas no:

A) Desenvolvimento global do sistema radicular (DGSR): comprimento do

sistema radicular (CSR), massa fresca do sistema radicular (MFSR) e volume do

sistema radicular (VSR).

B) Fator de reprodução (FR): através do número de ovos (NO) é definido a

razão entre a população final (que foi recuperada no sistema radicular) e a inicial

(utilizada na inoculação). Plantas com FR < 1 são consideradas resistentes,

enquanto que aquelas com FR ≥ 1 são consideradas suscetíveis (MOURA;

REGIS, 1987).

4.5. Reação de genótipos de melancia de mesa e forrageira ao patógeno

Para a avaliação da reação dos genótipos de melancia de mesa suscetível

(BGCIA 875) e de forrageira resistente (BGCIA 240) ao nematoide, foram

realizadas avaliações aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a inoculação, do número

de galhas (NG) e número de ovos por planta (NO) (COOLEN; D’HERDE, 1972).

Além disso, avaliou-se também o comprimento do sistema radicular (CSR) e

massa fresca do sistema radicular (MFSR). Para a realização das análises, as

raízes das plantas foram retiradas dos recipientes e lavadas com água.

4.6. Análises de clorofila e enzimáticas

Para a avaliação das clorofilas e enzimática, foi instalado outro

experimento paralelo ao do item 4.5.

Antes das coletas das raízes, foram realizadas as avaliações das clorofilas

a e b (IFC - Índice Falker de Clorofila) das folhas utilizando-se o clorofilômetro

marca ClorofiLOG® modelo CFL 1030. Para tanto, foram realizadas três leituras

com o clorofilômetro, sempre na primeira folha completamente expandida (do

topo do dossel para a base) aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a inoculação (DAI).

Para as análises enzimáticas, foram realizadas coletas nos mesmos

tempos citados anteriormente, onde as raízes dos genótipos foram lavadas



cuidadosamente com água corrente. Posteriormente, as amostras radiculares

foram envolvidas em papel alumínio, identificadas, mergulhadas em nitrogênio

líquido e armazenadas em freezer (-80 °C) até o momento das análises. Para a

obtenção do extrato protéico, tecidos radiculares foram triturados em nitrogênio

líquido, com almofariz e pistilo, até a obtenção de um pó fino. Em seguida, foi

adicionado tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,0 (3 mL de tampão por

grama de material triturado) e homogeneizou-se com o pistilo por 2 min. Após

esse processo, a suspensão foi centrifugada a 12.000 g por 15minutos (4 oC) e o

sobrenadante foi utilizado como fonte enzimática.

As proteínas solúveis totais contidas nos extratos foram quantificadas com

base no ensaio de Bradford (1976) utilizando-se uma curva padrão de albumina

sérica bovina (BSA).

A atividade do guaiacol peroxidase (POX) foi determinada pelo aumento na

absorbância a 470 nm durante 2 min em um meio de reação contendo fosfato de

potássio 100 mM (pH 7,0), guaiacol 50 Mm e H2O2 150 mM (URBANEK et al.,

1991).

A atividade da catalase (CAT) foi estimada pelo decréscimo na


potássio 100 mM (pH 7,0) e H2O2 250 mM (AZEVEDO et al.,1998).

A atividade do ascorbato peroxidase (APX) foi medida pelo decréscimo na


potássio 100 mM (pH 7,0), ácido ascórbico 10 Mm e H2O2 2 mM (NAKANO;

ASADA, 1981).

A atividade de polifenoloxidase (PPO) foi estimada pelo aumento na


potássio 100 mM (pH 6,5) e pirogalol 100 mM (GAUILLARD et al., 1993). A

reação ocorreu pela transformação do pirogalol (fenol) em quinona.

A atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) foi ensaiada através

da reação entre 90 μL de tampão 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 μL de 40 mM de

fenilalanina e 50 μL do extrato enzimático (MORI et al.,2002).



4.7. Delineamento experimental e análise estatística

No experimento de seleção de plantas resistentes e validação dos

métodos de avaliação não destrutivo foi utilizado uma população de 37 plantas.

O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, onde cada planta

correspondeu a uma unidade experimental. O estudo da correlação entre as

variáveis estudadas foi baseado no método do coeficiente de correlação de

Pearson, através do software GENES (CRUZ, 2006).

No experimento de reação dos genótipos ao patógeno e análises

enzimáticas e de clorofila, o delineamento utilizado foi o inteiramente

casualizado, com três repetições e parcela experimental composta por três

plantas. Os dados foram submetidos à análise de variância utilizando-se o

programa Sisvar (FERREIRA, 2006). As médias do número de galhas e número

de ovos por planta foram comparadas pelo teste T a 5% de probabilidade. As

médias do comprimento, massa fresca de raiz e clorofilas a e b foram

comparadas pelo teste de Tukey 5% de probabilidade. Para melhor visualização

dos resultados das análises enzimáticas ao longo do tempo, plotou-se a curva

de progresso da atividade das enzimas com os respectivos erros padrões.



5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Seleção de plantas resistentes a M. enterolobii na população do acesso

BGCIA 240

Na Tabela 2, é observada uma semelhança nos resultados referentes à

resistência das plantas com relação à avaliação preliminar do grau de resistência

das plantas e o fator de reprodução (FR) de M. enterolobii. Assim, verificou-se

que das 37 plantas do acesso BGCIA 240 que germinaram, 17 foram

classificadas preliminarmente como R, correspondendo a 46 %, 32 % do

estande foram MR e 22 % das plantas foram classificadas como S. Segundo

Oliveira et al. (2000), a melancia forrageira apresenta um período de dormência

fisiológica, de aproximadamente dois meses e atingem o máximo de germinação

entre 90 e 100 dias após a colheita, explicando assim a dificuldade em se obter

um maior estande de plantas de melancia forrageira para as avaliações, já que a

qualidade de germinação varia entre os genótipos de C. lanatus var. citroides.

Segundo Almeida et al. (2011) e Coyne et al. (2007) à medida que as

galhas se formam, há uma menor disponibilidade de nutrientes para a planta,

interferindo no desenvolvimento da parte aérea. No presente trabalho, o alto

percentual de acerto (78,33 %) na caracterização precoce da reação ao

nematoide (R, MR e S) (Figura 6), no qual se considerou o DGPA e DGG está de

acordo com o reportado pelos citados autores.

Por meio dos dados de amplitude do fator de reprodução (FR), verificou-

se uma variação de 0,04 – 1,62 para plantas R (Tabela 2), correspondendo a

94,12 % das plantas avaliadas preliminarmente como R, enquanto que se

observou a amplitude de 0,05 – 2,78 para as plantas MR, e de 0,23 – 2,03 para

as S. Isto indica uma porcentagem de acerto (%), validada pelo FR < 1, de 91,66

% das plantas MR. Enquanto isso, a porcentagem de acerto correspondente as

planta avaliadas como S, foi de 87,5 %. Este resultado, provavelmente, foi

influenciado pelo menor número de plantas classificadas como S (8 plantas),

ocasionando uma margem de erro maior. Contudo, a média de porcentagem de

acerto foi de 91,09 %, indicando a efetividade dos parâmetros considerados na



avaliação preliminar como ferramenta alternativa e não destrutiva na

discriminação precoce do grau de resistência de genótipos a M. enterolobii.

Tabela 2. Avaliação preliminar dos graus de resistência e suscetibilidade em

melancia forrageira acesso BGCIA 240, inoculadas com Meloidogyne enterolobii

aos 30 dias após inoculação (DAI) e dados de amplitude do fator de reprodução

(FR), avaliado aos 90 DAI. Petrolina, Embrapa Semiárido, 2015.

Grau de resistência

Época de avaliação Amplitude do Fator de

reprodução (FR) * Média FR

30 DAI Mínima Máxima

Resistente 17 0,04 1,62 0,62 Média resistência 12 0,05 2,78 0,87 Suscetível 8 0,23 2,03 1,24

Total 37

Média 0,11 2,14 0,91 *. FR < 1: Plantas resistentes são consideradas aquelas com número de ovos menor que 500 por sistema radicular e FR ≥ 1: Plantas suscetíveis são as plantas que apresentaram número de ovos maior e igual que 500 por sistema radicular.

Figura 6. Classes do sistema radiculares do acesso BGCIA 240, colhido e

avaliado. Resistente (A), média resistência (B) e suscetível (C) em função do

desenvolvimento global da parte aérea (DGPA) e de galhas (DGG).



De acordo com dados de amplitude do acesso BGCIA 240 (Tabela 3)

observou-se que a avaliação preliminar para plantas designadas como

resistentes (R), média resistência (MR) e suscetíves (S) apresentaram médias

do número de ovos/mL dentro do resultado esperado, < 500 ovos encontrados

para plantas classificadas como R e MR, bem como > 500 ovos para plantas S.

De acordo com os dados de amplitude, o número de ovos/mL variou de 20 a 808

para plantas R (observando-se que das 17 plantas avaliadas como R, somente

uma planta apresentou o número de ovos > 500). Este dado corresponde ao

encontrado por Castro et al. (2011), estudando a reação de genótipos de

melancia a M. enterolobii, verificaram que o acesso BGCIA 240 teve o menor

número de ovos (NO) em relação aos demais genótipos estudados, com apenas

45 ovos por sistema radicular. Estas progênies promoveram a maior inibição na

reprodução dos nematoides sendo classificados como muito resistente. Para

plantas avaliadas como S, somente uma, das oito plantas classificadas

inicialmente, apresentou NO < 500. Portanto, a avaliação preliminar baseada no

desenvolvimento global da parte aérea e de galhas, mostrou-se confiável, tendo

em vista à necessidade de seleção de caraterísticas não destrutivas,

possibilitando assim, o transplantio de mudas inoculadas com M. enterolobii com

potencial para seguir nos trabalhos de melhoramento de melancia visando

resistência ao referido patógeno do solo.

Tabela 3. Dados de amplitude do acesso BGCIA 240 inoculadas com

Meloidogyne enterolobii avaliadas quanto ao número de ovos/mL de solução do

sistema radicular. Petrolina, Embrapa Semiárido, 2015.

Avaliação Preliminar Amplitude número de ovos

Média Mínima Máxima

Resistente 20 808* 310

Média resistência 25 1391 436

Suscetível 113 1017** 622

*. Somente uma planta apresentou valor acima de 500 ovos. **. Somente uma planta apresentou valor abaixo de 500 ovos.



5.2. Correlação dos métodos não destrutivos com os métodos tradicionais

destrutivos

Em relação às correlações entre os caracteres, observou-se que das 30

combinações possíveis entre os quatro caracteres e os três grupos de plantas

classificadas quanto a diferentes graus de resistência (R, MR e S) foram

altamente significativas 11 combinações e três significativas a 5 % (Tabela 4).

Ao analisar o desenvolvimento global da parte aérea (CPA, DH, CF e DF)

das plantas R verificou-se que não houve correlações destas variáveis com o

desenvolvimento global de galhas (DGG), devido a variável constante. No

entanto, foi observado nas plantas S uma correlação negativa do compriemento

de folha (CF) e o DGG de -0,97.

Ao avaliar as demais correlações de desenvolvimento global da parte

aérea (DGPA) das plantas R, observou-se correlações significativamente

positiva entre elas.


variáveis desenvolvimento global de galhas (DGG) e da parte aérea (DGPA) de

planta do acesso BGCIA 240 aos 30 dias após a inoculação. Petrolina, Embrapa

Semiárido, 2015.

CPA DH CF DF

R 1,00**b 1,00**b 1,00**b 1,00**b

DGG MR 0,85 ns 0,35 ns -0,31 ns -0,03 ns

S -0,82 ns b -0,93 ns b -0,97* b -0,91 ns b

R 1,00** 1,00** 1,00** CPA MR 0,26 ns -0,41 ns -0,74 ns

S 0,65 ns 0,66 ns 0,57 ns

R 1,00** 1,00** DH MR -0,94 ns -0,94 ns

S 0,98* 0,99**

R 1,00** CF MR 0,93 ns

S 0,98* *. A correlação é significativa no nível 0,05 (2 extremidades) **. A correlação é significativa no nível 0,01 (2 extremidades) b. Não é possível calcular porque pelo menos uma das variáveis é constante. DGPA: comprimento da parte aérea (CPA), diâmetro do hipocótilo (DH), comprimento (CF) e diâmetro da primeira folha verdadeira (DF).



Em relação às correlações existentes na Tabela 5, observou-se que das

234 combinações possíveis entre as treze caracteres e seus graus de

resistência (R, MR e S), 27 combinações foram altamente significativas e

significativas a 5 %.

Ao analisar o coeficiente de galhas de plantas R com o desenvolvimento

global do sistema radicular (CSR, MFSR e VSR), observou-se correlações

significativamente positivas. Nas plantas resistentes, é preservada a estrutura

morfológica do sistema radicular e uma baixa população de M. enterolobii, no

entanto, este patógeno determina a retenção de água e nutrientes nas galhas

implicando em um maior volume e massa fresca da raiz.

Ao analisar o coeficiente de galhas de plantas suscetíveis, verificou-se

uma correlação significativamente positiva com o fator de reprodução (FR). Este

resultado afirma a idéia de que quanto mais galhas houver no sistema radicular

de plantas suscetíveis, maior será seu fator de reprodução. Esta característica

confirma a credibilidade dos dados aqui apresentados de acordo com as

encontradas na literatura (TAYLOR; SASSER, 1978). Ademais, serão

necessárias avaliações futuras para uma boa caracterização de outros

parâmetros envolvidos no desenvolvimento do sistema radicular, tais como

ramificação (secundária, terciária etc.), que provavelmente indiquem a

capacidade de regeneração do sistema radicular frente à destruição feita pelo

nematoide das galhas.

No entanto, ao correlacionar galhas com o desenvolvimento global da

parte aérea (CPA, DH, CAA e CBA) das plantas avaliadas, observou-se

correlações significativamente positivas, onde esperava-se que houvesse

correlação negativa. A única correlação significativamente negativa desse

caracter foi para o coeficiente de CAB (-0,95) de plantas R. Provavelmente,

como as plantas R tem um maior DGPA, há maior demanda por nutrientes que

as plantas S. Como no presente ensaio, houve apenas uma adubação de

plantio, alguns nutrientes como nitrogênio das folhas mais velhas podem ter sido

carreadas para as folhas mais jovens. Assim, é sugerido para os demais

experimentos, empregar a adubação de cobertura das plantas.



Quanto ao FR de plantas R, observou-se correlação significativamente

positiva com MFSR (0,97) e com VSR (0,96). Po outro lado, Damaceno (2012)

ao avaliar alguns genótipos do BAG de Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido,

observou essa mesma correlação entre massa fresca das raízes e fator de

reprodução, porém em plantas suscetíveis e inoculadas com M. enterolobii.

E para o DGPA, foi constatado correlação positiva com CPA de plantas

suscetíveis (0,96) e correlação negativa com CBA de plantas de média

resistência (-0,99).

Os dados acima relatados mostram que é possível realizar uma seleção

precoce de plantas com potencial de resistência a M. enterolobii, através de

variáveis que inicialmente mensurem o desenvolvimento global da parte aérea e

de galhas, e, posteriormente confirmem com o FR da população selecionada.

Entretanto, a busca de marcadores bioquímicos e/ou moleculares devem ser

estudadas.

LUBARINO, P. C. da C. Avaliação fenotípica e bioquímica de Citrullus lanatus L. parasitadas por Meloidogyne enterolobii 52

Tabela 5. Valores dos coeficientes de correlação para a associação entre as variáveis desenvolvimento global do sistema radicular (DGSR), de galhas (DGG), fator de reprodução (FR) e desenvolvimento global da parte aérea (DGPA) de plantas do acesso BGCIA 240 aos 90 dias após a inoculação. Petrolina, Embrapa Semiárido, 2015. MFSR VSR DGG FR CPA DH CAA CBA CAM CBM CAB CBB

R 0,98* 0,99* 0,99* 0,91 ns 0,99** 0,97** 0,99* 0,83* 0,71 ns 0,56 ns -0,99* -0,98* CSR MR -0,52 ns -0,61 ns -0,44 ns 0,31 ns -0,42 ns -0,41 ns -0,56 ns -0,44 ns -0,69 ns -0,56 ns -0,34 ns -0,35 ns

S -0,72 ns -0,97* 0,83 ns 0,75 ns 0,91 ns 0,71 ns 0,17 ns 0,88 ns 0,83 ns 0,67 ns 0,98* 0,77 ns

R 0,99** 0,99** 0,97** 0,99** 0,96* 0,99* 0,86 ns 0,62 ns 0,43 ns -0,94 ns -0,92 ns

MFSR MR 0,99** 0,63 ns 0,57 ns 0,45 ns 0,58 ns -0,19 ns -0,49 ns -0,25 ns -0,41 ns 0,08 ns 0,58 ns

S 0,87 ns -0,21 ns -0,08 ns -0,36 ns -1,00** 0,57 ns -0,29 ns -0,98* -1,00** -0,85 ns -1,00**

R 0,99** 0,96* 1,0** 0,97* 1,0** 0,88 ns 0,61 ns 0,43 ns -0,95 ns -0,93 ns

VSR MR 0,64 ns 0,48 ns 0,47 ns 0,59 ns -0,10 ns -0,39 ns -0,14 ns -0,30 ns 0,12 ns 0,10 ns

S -0,66 ns -0,56 ns -0,77 ns -0,87 ns 0,10 ns -0,72 ns -0,95 ns -0,84 ns -1,00** -0,91 ns

R 0,94 ns 0,99** 0,99* 1,00** 0,90 ns 0,58 ns 0,42 ns -0,95* -0,94 ns

DGG MR -0,06 ns 0,97* 1,00** 0,45 ns 0,04 ns -0,10 ns -0,16 ns -0,61 ns -0,62 ns

S 0,99** 0,99* 0,20 ns 0,68 ns 1,00** 0,38 ns 0,15 ns 0,70 ns 0,29 ns

R 0,95 ns 0,88 ns 0,93 ns 0,80 ns 0,52 ns 0,31 ns -0,84 ns -0,81 ns

FR MR -0,26 ns -0,10 ns -0,91 ns -0,99* -0,79 ns -0,87 ns 0,18 ns 0,15 ns

S 0,96* 0,07 ns 0,77 ns 0,98* 0,26 ns 0,02 ns 0,59 ns 0,16 ns

R 0,97* 0,99** 0,85 ns 0,65 ns 0,48 ns -0,96* -0,95 ns

CPA MR 0,98* 0,61 ns 0,23 ns 0,20 ns -0,07 ns -0,69 ns -0,69 ns

S 0,35 ns 0,56 ns 1,00** 0,52 ns 0,30 ns 0,80 ns 0,43 ns

R 0,99* 0,94 ns 0,53 ns 0,38 ns -0,94 ns -0,93 ns

DH MR 0,48 ns 0,07 ns -0,10 ns -0,14 ns -0,66 ns -0,66 ns

S -0,58 ns 0,28 ns 0,98* 1,0** 0,84 ns 1,0**

R 0,90 ns 0,59 ns 0,43 ns -0,96* -0,95 CAA MR 0,91 ns 0,73 ns 0,76 ns -0,32 ns -0,29 ns

S 0,62 ns -0,41 ns -0,62 ns -0,49 ns -0,50 ns

R 0,20 ns 0,04 ns -0,77 ns -0,75 ns

CBA MR 0,88 ns 0,93 ns -0,05 ns -0,02 ns

S 0,46 ns 0,23 ns 0,75 ns 0,36 ns

R 0,97* -0,78 ns -0,79 ns

CAM MR 0,98* 0,40 ns 0,43 ns

S 0,97* 0,93 ns 0,99**

R -0,66 ns -0,69 ns

CBM MR 0,31 ns 0,34 ns

S 0,81 ns 0,99**

CAB R 1,00** MR 1,00** S 0,89 ns

*. A correlação é significativa no nível 0,05 (2 extremidades); **. A correlação é significativa no nível 0,01 (2 extremidades); DGSR: comprimento do sistema radicular (CSR), massa fresca do sistema radicular (PSR) e volume do sistema radicular (VSR); DGPA: comprimento da parte aérea (CPA), diâmetro do hipocótilo (DH), clorofilas A e B, na região apical (CAA e CBA), mediana (CAM e CBM) e basal (CAB e CBB).



5.3. Reação de genótipos de melancia a Meloidogyne enterolobii

Plantas do acesso de melancia forrageira BGCIA 240, considerada

resistente, e do acesso melancia de mesa BGCIA 875, considerada suscetível,

apresentaram ao longo das avaliações número de galhas por planta

semelhantes estatisticamente (Figura 7A). Entretanto, aos 35 dias após a

inoculação com M. enterolobii, plantas do acesso suscetível apresentou 87,5%

mais galhas que a acesso resistente. Segundo Taylor e Sasser (1978) uma

planta que apresenta índice de galhas entre 31 a 100, é considerada altamente

suscetível.

Dos 7 aos 28 dias após a inoculação, não se observou efeito dos acessos

para o número de ovos por planta. Aos 35 dias após a inoculação, plantas

suscetíveis apresentaram maior número de ovos por planta do que plantas do

acesso resistente, diferindo estatisticamente. Observou-se nas plantas

suscetíveis 8,08 vezes mais ovos que nas plantas resistentes (Figura 7B). O

maior número de ovos observados no acesso BGCIA 875 indica seu estado de

suscetibilidade. Por outro lado, mesmo havendo formação de galhas em raízes

do acesso BGCIA 240, observou-se uma baixa produção de ovos de M.

enterolobii. Embora as plantas resistentes sejam invadidas pelos nematoides, o

parasitismo não é bem sucedido devido a mecanismos de resistência das

plantas (TRUDGIL; BLOK, 2001). Assim, plantas resistentes podem reconhecer

substâncias liberadas pelo patógeno e desencadear respostas de defesa contra

o invasor (FRAGOSO et al., 2007).

Para comprimento de raiz, observou-se que a inoculação não afetou o

crescimento da mesma, não havendo diferenças significativas em cada acesso

de melancia inoculada e não inoculada. Em média, o acesso de melancia

forrageira apresentou maior comprimento do que a melancia de mesa (Tabela 6).

O comprimento da raiz pode estar relacionado com estratégias de sobrevivência

desenvolvida pelas variedades de melancias forrageiras. A melancia forrageira

adaptou-se bem às condições semiáridas, assim como a estresse hídrico,

nutricional ou ataque de patógenos do solo (QUEIRÓZ, 1993; ROMÃO, 1995).



Com isso, supõem-se que a medida que as galhas foram se desenvolvendo, as

raízes secundárias ficaram impedidas de absorver nutrientes induzindo o

alongamento axial da raiz. O mesmo não foi observado para o acesso BGCIA

875, talvez por se tratar de uma variedade comercial suscetível. Na avaliação da

massa fresca de raiz, foi observado comportamento semelhante ao do

comprimento de raiz. Não foi observado efeito significativo da inoculação na

massa fresca das raízes em cada acesso de melancia (Tabela 6). Este resultado

provavelmente está associado com a formação das galhas nas raízes das

plantas inoculadas aumentando inicialmente a massa nas plantas inoculadas.

Em média, a massa fresca foi maior no acesso de melancia forrageira.

Afim de compreender o mecanismo de infecção de M. javanica em plantas

de soja, Fragoso et al. (2007) demonstraram que a superexpressão do gene de

corismato mutase I do fitonematoide altera a via do xiquimato por causa da

degradação do corismato citoplasmático, que resulta num fenótipo de redução

ou aborto das radícolas laterais, provavelmente como consequência da redução

dos níveis de auxinas nos plastídios. Assim, no presente trabalho foi observado

para a acesso BGCIA 240 uma recuperação do sistema radicular aos 28 e 35

DAI e para o acesso BGCIA 875 uma contínua queda dos valores de massa

fresca de raiz.

Os dados de clorofila a e b para as épocas estudadas não diferiram

estatisticamente entre as plantas inoculadas e não inoculadas, nem entre os

genótipos (Tabela 6). Provavelmente, esse fato ocorreu devido ao pouco tempo

após a inoculação. Os sintomas reflexos na parte aérea da planta pela presença

do nematoide na raiz aparecem num estágio mais avançado da infecção e na

fase de produção, caracterizando um maior dreno de nutrientes para os frutos.

Por sua vez, Lubarino (2012) ao estudar a relação do teor de clorofila com a

ação do M. enterolobii em plantas inoculadas de melancia, observou, aos 60

dias após a inoculação, um menor teor de clorofila em plantas inoculadas com

relação as não inoculadas. Em geral, o índice médio de clorofila a foi maior que

o de clorofila b, que ocorre devido a uma maior proporção do fotossistema I que

é mais rico em clorofila a, em condições normais de luminosidade,



(CRITCHELEY, 1999) e menor clorofila b, uma vez que, esta tem uma maior

proporção em ambientes sombreados (SOUZA et al., 2011).

ns ns ns

ns

ns

0

10

20

30

40

50

7 14 21 28 35

N°

de

gal

has

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nta

Dias após inoculação

BGCIA240R+ BGCIA 875+

A

ns ns ns ns

*

0

100

200

300

400

7 14 21 28 35

N°

de

ovos/

pla

nta


BGCIA240 BGCIA 875

B

Figura 7. Número de galhas (A) e número de ovos (B) por planta de dois

genótipos de melancia do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de

Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido, acessos BGCIA 240 (resistente) e BGCIA

875 (suscetível) inoculadas com Meloidogyne enterolobii, avaliadas em

diferentes épocas de coleta. * Significativo a 5% de probabilidade e ns= não

significativo pelo teste T.



Tabela 6. Comprimento de raiz, massa fresca de raiz, clorofila a e clorofila b de dois genótipos de melancia do Banco Ativo de Germoplasma de Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido, acessos BGCIA 240 e BGCIA 875 inoculadas e não inoculadas com Meloidogyne enterolobii em diferentes épocas de avaliação.

Acessos

Comprimento de raiz (cm)


7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 16,25 a 12,90 a 14,30 ab 21,75 a 21,17 a BGCIA 240 17,00 a 15,50 a 16,17 a 13,40 b 9,33 a BGCIA 875+ 10,25 b 10,50 a 10,50 b 9,83 b 12,25 a BGCIA 875 10,73 b 10,87 a 10,83 b 11,80 b 11,75 a

Massa fresca de raiz (g)

7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 2,66 a 1,78 a 1,46 ab 1,61 a 1,73 a BGCIA 240 2,54 ab 1,85 a 2,22 a 1,24 a 1,14 a BGCIA 875+ 0,61 b 0,63 a 0,63 b 0,29 b 0,60 a BGCIA 875 0,99 ab 0,69 a 1,00 ab 0,35 b 1,11 a

Clorofila a (IFC)

7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 24,90 a 32,07 a 31,80 a 28,03 a 24,57 b BGCIA 240 26,00 a 33,90 a 34,47 a 27,73 a 28,93 ab BGCIA 875+ 24,10 a 28,90 a 31,80 a 28,40 a 28,57 ab BGCIA 875 26,33 a 30,40 a 36,17 a 30,03 a 30,63 a

Clorofila b (IFC)

7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 9,33 a 14,67 a 15,37 a 14,90 a 10,83 a BGCIA 240 12,90 a 15,07 a 16,83 a 13,33 a 11,07 a BGCIA 875+ 12,33 a 11,87 a 12,67 a 12,10 a 9,27 a BGCIA 875 12,53 a 13,27 a 18,73 a 13,40 a 11,97 a += genótipos inoculados; IFC= Índice Falker de Clorofila. Médias com mesma letra nas colunas não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey (P < 0,05).

5.4. Respostas bioquímicas de defesa

As proteínas presentes na planta podem estar envolvidas no processo de

defesa bioquímica contra os danos causados pelo patógeno (BERNARDS et al.,

1999). Além disso, espécies vegetais sensíveis ao nematoide das galhas podem

apresentar a quantidade ou qualidade das proteínas alteradas. Não foi

observado efeito da inoculação com o M. enterolobii nos teores de proteínas

solúveis totais nos dois acessos estudados nos tempos avaliados, exceto aos 35

dias após a inoculação que o genótipo suscetível (BGCIA 875) inoculado



apresentou menor teor de proteínas que os não inoculados, época de maior

formação de galhas e número de ovos observado neste genótipo (Figura 8- A).

Para a guaiacol peroxidase, foi observado que não ocorreram diferenças

na atividade desta enzima em plantas resistentes e suscetíveis infectadas e não

infectadas com o M. enterolobii até os 14 dias após a inoculação (Figura 8-B). A

acesso com maior nível de resistência (BGCIA 240) inoculada com o nematoide

apresentou maior atividade dessa enzima, especialmente nos tempos de 21 e 28

dias após a inoculação, enquanto que a não inoculada apresentou atividade

semelhante à do acesso suscetível BGCIA 875 inoculada e não inoculada. No

presente estudo, foi observado nas plantas resistentes aumento da atividade da

enzima guaiacol peroxidase somente aos 21 DAI, o que significa dizer que

nesse momento há uma interação de reconhecimento planta-patógeno,

desencadeando a resposta de defesa da planta contra os danos causados pelo

nematoide.

A atividade da polifenoloxidase foi maior nas plantas do acesso resistente,

tanto para plantas inoculadas como para não inoculadas somente aos 14 dias

após a inoculação (Figura 8-C). Não há relatos que correlacionem o aumento da

atividade de polifenoloxidase com a defesa das plantas de melancia aos

nematoides. Entretanto, para outras culturas como a soja estudos tem mostrado

que plântulas de soja de variedade resistente e inoculadas com J2 de M.

javanica está associada a um aumento na atividade da PPO 72 horas após a

inoculação (SHIMIZU, 2004).

A atividade da ascorbato peroxidase foi maior nas plantas do acesso

resistente (BGCIA 240), tanto inoculada como não inoculada com M. enterolobii,

até os 21 dias após a inoculação, superiores à acesso suscetível (Figura 8-D).

Não foi observado diferença nas atividades da catalase entre os acessos

suscetíveis (BGCIA 875) e resistentes de melancia (Figura 8-E).

O resultado de não haver diferença entre plantas inoculadas e não

inoculadas do BGCIA 240 para a atividade da PPO até 14 DAI e APX, indica o

possível uso destas enzimas como marcadores de seleção de genótipos, pois

diferentes quantidades são observadas entre os dois acessos, BGCIA 240 e

BGCIA 875.



Para a atividade da fenilalanina amônia-liase, aos 14 dias após a

inoculação, foi observado aumento significativo nas raízes de plantas do acesso

BGCIA 240, inoculadas, em relação às plantas do acesso suscetível, BGCIA

875, também inoculadas (Figura 8-F). Este aumento de atividade provavelmente

reflete o aumento da utilização de compostos fenólicos em raízes resistentes. A

partir desse momento houve queda na atividade dessa enzima para as plantas

do acesso BGCIA 240 inoculadas e não inoculadas. Kalaiarasan (2009) ao

avaliar genótipos de tomate resistentes e suscetíveis a M. incognita quanto aos

danos provocados pelo patógeno observou por avaliação bioquímica, que os

genótipos resistentes possuíam maior atividade de fenilalanina amônia-liase que

os genótipos suscetíveis.

Estes resultados mostram o potencial do uso de enzimas na seleção por

tempo de infecção, uma vez que, que o acesso resistente apresentou

precocemente maior atividade da enzima PAL.

Os resultados deste trabalho possibilitam um maior conhecimento dos

mecanismos de defesa envolvidos na resistência da melancia ao nematoide M.

enterolobii. Entre as respostas bioquímicas na defesa das plantas contra

patógenos, as peroxidases, catalases, polifenoloxidases e fenilalanina amônia-

liases tem recebido destaque em diversos estudos (KALAIARASAN, 2009) pois

estes compostos podem atuar na mitigação dos danos causados pelo patógeno,

ou impedir o avanço do mesmo nos tecidos do hospedeiro (RESENDE et al.,

2003). Estas enzimas podem atuar de forma diferente em diferentes relações

planta-nematoide e, neste trabalho, observou-se que o aumento na atividade das

enzimas peroxidases, polifenoloxidase e fenilalanina amônia-liase indica um

efeito de resposta da planta após o reconhecimento do patógeno.



0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

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7 14 21 28 35

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L-1

)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

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4

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PP

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m

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-1)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

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0

10000

20000

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7 14 21 28 35

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mM

m

in-1

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)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

B

0

40

80

120

160

200

7 14 21 28 35

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mM

m

in-1

mg

P-1

)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

D

0,00

0,50

1,00

1,50

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3,50

4,00

7 14 21 28 35

CA

T (

mM

m

in-1

mg P

-1)


BGCIA240R+ BGCIA240R

BGCIA875+ BGCIA875

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0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

7 14 21 28 35

PA

L (m

M

min

-1 m

g P

-1)



BGCIA875+ BGCIA875

F

Figura 8. Proteínas solúveis totais (A), atividades das enzimas guaiacol peroxidase (POX) (B), polifenoloxidase (PPO) (C), ascorbato peroxidase (APX) (D), catalase (CAT)(E) e fenilalanina amônia liase (PAL) (F) de dois genótipos de melancia do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido, acessos BGCIA 240 e BGCIA 875 inoculadas com Meloidogyne enterolobii, e seus controles, avaliadas em diferentes épocas de coleta. Barras representam erro padrão da média



6. CONCLUSÕES

A avaliação baseada nos métodos não destrutivos permitiu selecionar

plantas resistentes dentro da população do acesso BGCIA 240, num percentual

de 46%.

Os parâmetros utilizados, desenvolvimento global da parte aérea e

número de galhas, apresentaram correlação positiva com o FR e um elevado

percentual de acerto na classificação precoce e não destrutiva do grau de

resistência de genótipos de melancia a Meloidogyne enterolobii.

Os métodos não destrutivos utilizados foram validados pelos métodos

tradicionais destrutivos indicando ser uma ferramenta alternativa não destrutiva

importante para os futuros trabalhos de melhoramento genético de plantas

resistentes à Meloidogyne spp.

Com relação a reação ao patógeno, o acesso BGCIA 240 resistente

apresentou menor número de galhas e de ovos, aos 14 dias após inoculação.

Este estudo demonstrou, que a presença do patógeno induziu, no acesso

resistente inoculada com M. enterolobii, maior valor de comprimento de raiz aos

28 DAI e menor massa fresca de raiz aos 21 DAI.

O acesso BGCIA 240 resistente apresentou maior atividade das enzimas

guaiacol peroxidase, ascorbato peroxidase, polifenoloxidases e fenilalanina

amônia-liase.

As enzimas POX, APX, PPO e PAL indicaram ser compostos potenciais

para serem utilizados como marcadores bioquímicos de resistência a M.

enterolobii em melancia.

O uso da atividade de enzima, também se mostrou promissora como

marcadores na seleção por tempo de infecção, uma vez que, o acesso resistente

apresentou precocemente maior atividade da enzima PAL, e na seleção de

genótipos, uma vez que, não houve diferença entre plantas inoculadas e não

inoculadas dentro do acesso, e sim entre os acessos.

Este trabalho também trouxe dados inéditos na literatura científica, com

os primeiros relatos de estudos fitoquímicos em raízes de Citrullus lanatus L.



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72

APÊNDICE

Artigo submetido à:

Revista: Química Nova

Título: Respostas bioquímicas associadas à defesa em melancia contra

Meloidogyne enterolobii

Autores: Paloma C. da C Lubarino, Leonardo Sousa Cavalcanti, Pedro M.

Ribeiro Junior e Rita de Cássia S. Dias

73

RESPOSTAS BIOQUÍMICAS ASSOCIADAS À DEFESA EM MELANCIA

CONTRA MELOIDOGYNE ENTEROLOBII

Paloma C. da C Lubarinoa,*, Leonardo Sousa Cavalcantia, Pedro M. Ribeiro Juniorb

e Rita de Cássia S. Diasb

aUniversidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco,

Brasil

bEmbrapa Semiárido, BR 428, Km 152, Zona Rural, 56302-970, Petrolina, Pernambuco,

Brasil

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

( ) Manuscrito com material suplementar

(X) Manuscrito sem material suplementar

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

*e-mail: [email protected]

BIOCHEMICAL RESPONSES ASSOCIATED WITH DEFENSE IN

WATERMELON AGAINST MELOIDOGYNE ENTEROLOBII

Este estudo objetivou investigar a reação de linhas de melancia resistente (BGCIA 240) e

suscetível (BGCIA 875) ao Meloidogyne enterolobii, assim como avaliar atividade de

enzimas relacionadas à defesa e os teores de clorofilas nessas plantas. As linhas foram

inoculadas com o nematoide e avaliadas quanto ao número de galhas (NG) e número de

ovos por planta (NO), comprimento (CR) e massa fresca de raiz (MFR), os teores de

clorofila e à atividade de enzimas relacionadas à defesa, guaiacol peroxidase (POX),

polifenoloxidases (PPO), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e fenilalanina

amônia-liase (PAL). Para as análises, foram coletadas amostras de raízes aos 7, 14, 21, 28

e 35 dias após a inoculação (DAI). A presença do nematoide induziu na linha resistente

maior valor CR aos 28 DAI e menor MFR aos 21 DAI. A linha suscetível também

apresentou menor MFR, porém maior formação de galhas e maior NO. Aos 14 DAI,

houve maior atividade de POX, APX, PPO e PAL na linha resistente inoculada. Estes

resultados sugerem que uma combinação destas respostas de defesa na melancia podem

mailto:[email protected]

74

contribuir para a seleção de genótipos em programas de melhoramento visando

resistência da melancia contra M. enterolobii.

Keywords: nematoide das galhas, Citrullus spp., mecanismos de defesa.

This study aimed to investigate the reaction of resistant (BGCIA 240) and susceptible

(BGCIA 875) watermelon lines to Meloidogyne enterolobii, and to evaluate the activity

of enzymes related to the defense and the content of chlorophyll. The lines were

inoculated with the pathogen and evaluated for reaction by the number of galls (NG) and

number of eggs per plant (NO), length (CR) and fresh weight of roots (MFR) and

analyzed for chlorophyll content and activity of defense-related enzymes, guaiacol

peroxidase (POX), polyphenol oxidases (PPO), ascorbate peroxidase (APX), catalase

(CAT) and phenylalanine ammonia lyase (PAL). For analysis, samples were collected

from roots 7, 14, 21, 28 and 35 days after inoculation (DAI). The pathogen induced in the

resistant line highest value CR at 28 DAI and lower MFR at 21 DAI. The susceptible line

also showed less MFR, but most galling and increased NO. At 14 days, a higher enzyme

activity in the resistant line inoculated for POX, APX, PPO and PAL. These results

suggest that a combination of these defense responses in watermelon can help in the

selection of genotypes in breeding programs for watermelon resistance against M.

enterolobii attack.

Keywords: root-knot nematodes, Citrullus spp., defense mechanism.

75

INTRODUÇÃO

Os nematóides de galhas (Meloidogyne spp.) estão entre os patógenos mais comuns

que limitam a qualidade e a produção das Cucurbitáceas As espécies desse gênero de

maior ocorrência no Brasil são M. incognita (Kofoid & White) Chitwood, M. javanica

(Treub) Chitwood e M. arenaria (Neal) (PEREIRA et al., 2010) Contudo, no Submédio

do Vale do São Francisco a espécie M. enterolobii (sin. M. mayaguensis) vêm, nos

últimos anos, causando prejuízos aos produtores de cucurbitáceas e de outras culturas

(TERAO et al., 2010) O controle desses nematoides nas cucurbitáceas é difícil devido a

ampla gama de hospedeiras e não existem nematicidas registrados no Brasil para o seu

controle (AGROFIT, 2015). Ademais, os nematicidas químicos apresentam alta toxidez

ao homem e ao ambiente e tem alto custo aos produtores. Nesse contexto, outras

estratégias devem ser adotadas no controle destes fitopatógenos na cultura da melancia,

como a resistência genética que é a forma de controle mais econômica para o produtor e

mais sustentável para o ambiente (LIMA et al., 2005)

Alguns estudos vêm sendo realizados visando à identificação de linhas de

melancia e outras cucurbitáceas com resistência a Meloidogyne spp. Experimentos

mostraram que linhas de Cucurbitáceas como a bucha, abóbora Goianinha, abóbora Mini

Paulista, melão Redondo Amarelo e melancia Charleston Gray foram classificadas como

resistentes a M. Incognita (FRANCO et al., 2008) Melancias forrageiras (Citrullus

lanatus var. citroides) tem sido relatadas como fonte de resistência contra M. Enterolobii

(DAMACENO, 2012; CASTRO et al., 2011) e podem ser utilizadas tanto como porta-

enxerto quanto fontes de genes de resistencia para cruzamentos com melancia de mesa

(Citrullus lanatus (Thumb.) Matsum & Nakai). Apesar destes relatos, existem poucos

trabalhos apresentando estudos de mecanismos bioquímicos relacionados à defesa dessas

linhas resistentes quando inoculadas com nematoides do gênero Meloidogyne.

Ao reconhecer o patógeno, em plantas resistentes ocorre o aumento dos níveis de

defesa pela ativação de genes que codificam diversos compostos de defesa como a

explosão oxidativa, enzimas antioxidantes, proteínas relacionadas à patogênese e enzimas

precursoras de fitoalexinas como a fenilalanina amônia-liase (PAL) (KOVÁCIK et al,

2007).

76

Estudos da associação da expressão destes compostos de defesa e de genótipos

resistentes a nematois em outras olerícolas foram realizados. Na família das Solanáceas, o

tomate e batata tem mostrado associação da enzima PAL como um fator de resistência a

patógenos (CAM; TOWRES, 1973; BRUESKE, 1980; KALAIARASAN, 2009). Em

outro estudo foi observado em raízes de tomate resistentes e inoculadas com M. incognita

menor número de galhas por planta e um aumento significativo na atividade da PAL às

108 horas após a inoculação, superiores à testemunha suscetível que apresentaram menor

atividade de dessa enzima (BRUESKE, 1980; KALAIARASAN, 2009). Em raízes de

batatas resistentes e inoculadas com o nematóide Globodera rostochiensis foram

observadas maiores atividades da PAL do que em raízes de plantas suscetíveis (GIEBEL,

1973).

Diante do exposto, este estudo objetivou investigar a reação de uma linha de

melancia forrageira resistente e uma linha de melancia de mesa suscetível ao M.

enterolobii. Objetivou também avaliar a atividade de enzimas relacionadas à defesa e os

teores de clorofilas nesses genótipos inoculados com M. enterolobii.

PARTE EXPERIMENTAL

Material vegetal

Os experimentos foram realizados na Embrapa Semiárido com genótipos de

melancia provenientes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas dessa

Unidade, sendo uma Linha BGCIA240 de melancia forrageira (C. lanatus var. citroides)

resistente a M. enterolobii e uma Linha BGCIA875 de melancia de mesa (C. lanatus var.

lanatus), suscetível ao patógeno. Para a produção das mudas, as sementes foram

plantadas em copos descartáveis de polipropileno (uma semente por copo) contendo 500

mL de solo autoclavado.

Preparo do inóculo e inoculação

Para a produção e manutenção do inóculo, foram coletadas fêmeas de uma

população de M. enterolobii de raízes de goiabeira (Psidium guajava L. cultivar. Paluma)

77

no município de Petrolina, PE, que foram previamente identificadas utilizando-se o

padrão de isoenzima (CARNEIRO; ALMEIDA, 2001). O inóculo foi multiplicado em

mudas de tomateiro Santa Clara. Para o preparo do inóculo, os ovos foram extraídos das

raízes das plantas de tomateiro infectadas de acordo com a metodologia proposta por

Hussey e Barker (HUSSEY; BARKER, 1973). A inoculação foi realizada 12 dias após a

germinação das mudas, com suspensão de 500 ovos de M. enterolobii por planta,

utilizando-se 1 mL da suspensão distribuídos no vaso ao redor do colo das plantas.

Reação dos genótipos de melancia de mesa e forrageira ao Meloidogyne enterolobii

Para a avaliação da reação dos genótipos de melancia ao nematoide, foram

realizadas avaliações aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a inoculação do número de galhas

(NG) e número de ovos por planta (NO) (COOLEN; D’HERDE, 1972). Além disso,

avaliou-se também o comprimento de raiz (CR)e massa fresca de raiz (MFR). Para a

realização das análises, as raízes das plantas foram retiradas dos recipientes lavadas com

água.

Análises de clorofila e enzimáticas

Para a avaliação das clorofilas e enzimática, foi realizado outro experimento nas

mesmas condições do experimento anterior.

Antes das coletas das raízes, foram realizadas as avaliações das clorofilas a e b

(IFC - Índice Falker de Clorofila) das folhas utilizando-se o clorofilômetro marca

ClorofiLOG® modelo CFL 1030. Para tanto, foram realizadas três leituras com o

clorofilômetro, sempre na primeira folha completamente expandida (do topo do dossel

para a base) aos 14, 21, 28 e 35 dias após a inoculação (DAI).

Para as análises enzimáticas, foram realizadas coletas nos mesmos tempos citados

anteriormente, onde as raízes dos genótipos foram lavadas cuidadosamente com água

corrente. Posteriormente, as amostras radiculares foram envolvidas em papel alumínio,

identificadas, mergulhadas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer (-80 °C) até o

momento das análises. Para a obtenção do extrato protéico, tecidos radiculares foram

triturados em nitrogênio líquido, com almofariz e pistilo, até a obtenção de um pó fino.

78

Em seguida, foi adicionado tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,0 (3 mL de tampão

por grama de material triturado) e homogeneizou-se com o pistilo por 2 min. Após esse

processo, a suspensão foi centrifugada a 12.000 g por 15minutos (4 oC) e o sobrenadante

foi utilizado como fonte enzimática.

As proteínas solúveis totais contidas nos extratos foram quantificadas com base no

ensaio de Bradford (1976) utilizando-se uma curva padrão de albumina sérica bovina

(BSA).

A atividade do guaiacol peroxidase (POX) foi determinada pelo aumento na

absorbância a 470 nm durante 2 min em um meio de reação contendo fosfato de potássio

100 mM (pH 7,0), guaiacol 50 Mm e H2O2 150 mM (URBANEK et al., 1991).

A atividade da catalase (CAT) foi estimada pelo decréscimo na absorbância a 240

nm durante 3 min em um meio de reação contendo fosfato de potássio 100 mM (pH 7,0)

e H2O2 250 mM (AZEVEDO et al.,1998).

A atividade do ascorbato peroxidase (APX) foi medida pelo decréscimo na

absorbância a 290 nm durante 3 min em um meio de reação contendo fosfato de potássio

100 mM (pH 7,0), ácido ascórbico 10 Mm e H2O2 2 mM (NAKANO; ASADA, 1981).

A atividade de polifenoloxidase (PPO) foi estimada pelo aumento na absorbância

a 420 nm durante 3 min em um meio de reação contendo fosfato de potássio 100 mM (pH

6,5) e pirogalol 100 mM (GAUILLARD et al., 1993). A reação ocorreu pela

transformação do pirogalol (fenol) em quinona.

A atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) foi ensaiada através da

reação entre 90 μL de tampão 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 μL de 40 mM de

fenilalanina e 50 μL do extrato enzimático (MORI et al.,2002).

Delineamento experimental e análise estatística

Os delineamentos experimentais utilizados nos experimentos foram o inteiramente

casualizado, com três repetições e parcela experimental composta por três plantas. Os

dados foram submetidos à análise de variância utilizando-se o programa Sisvar

(FERREIRA, 2006). As médias do número de galhas e número de ovos por planta e fator

foram comparadas pelo teste T a 5% de probabilidade. As médias do comprimento, massa

fresca de raiz e clorofilas a e b foram comparadas pelo teste de Tukey 5% de

79

probabilidade. Para melhor visualização dos resultados das análises enzimáticas ao longo

do tempo, plotou-se a curva de progresso da atividade das enzimas com os respectivos

erros padrões.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Reação de genótipos de melancia a Meloidogyne enterolobii

Plantas da linha de melancia forrageira BGCIA 240, considerada resistente, e da

linha melancia de mesa BGCIA 875, considerada suscetível, apresentaram ao longo das

avaliações número de galhas por planta semelhantes estatisticamente (Figura 1A).

Entretanto, aos 35 dias após a inoculação com M. enterolobii, a linha suscetível

apresentou 87,5% mais galhas que a linha suscetível. Segundo Taylor e Sasser (1978)

uma planta que apresenta índice de galhas entre 31 a 100, é considerada altamente

suscetível.

Dos 7 aos 21 dias após a inoculação, não observou-se efeito das linhas para o

número de ovos por planta. Aos 35 dias após a inoculação, plantas suscetíveis

apresentaram maior número de ovos por planta do que plantas da linha resistente,

diferindo estatisticamente. Observou-se nas plantas suscetíveis 8,08 vezes mais ovos que

nas plantas resistentes (Figura 1B). O maior número de ovos observados na linha BGCIA

875 indica seu estado de suscetibilidade. Por outro lado, mesmo havendo formação de

galhas em raízes da linha BGCIA 240, observou-se uma baixa produção de ovos de M.

enterolobii. Embora as plantas resistentes sejam invadidas pelos nematóides, o

parasitismo não é bem sucedido devido a mecanismos de resistência das plantas

(TRUDGIL; BLOK, 2001). Assim, plantas resistentes podem reconhecer substâncias

liberadas pelo patógeno e desencadear respostas de defesa contra o invasor (FRAGOSO

et al., 2007).

Para comprimento de raiz observa-se que a inoculação não afetou o crescimento

da mesma, não havendo diferenças significativas em cada linha de melancia inoculada e

não inoculada. Em média, a linha de melancia forrageira apresentou maior comprimento

do que a melancia de mesa (Tabela 1). O comprimento da raiz pode estar relacionado

com estratégias de sobrevivência desenvolvida pelas variedades de melancias forrageiras.

80

A melancia forrageira adaptou-se bem às condições semiáridas, assim como a estresse

hídrico, nutricional ou ataque de patógenos do solo (QUEIROZ, 1993; ROMÃO, 1995).

Com isso, supõem-se que a medida que as galhas foram se desenvolvendo, as raízes

secundárias ficaram impedidas de absorver nutrientes induzindo o alongamento axial da

raiz. O mesmo não foi observado para a linha BGCIA 875, talvez por se tratar de uma

variedade comercial suscetível. Na avaliação da massa fresca de raiz, foi observado

comportamento semelhante ao do comprimento de raiz. Não foi observado efeito

significativo da inoculação na massa fresca das raízes em cada linha de melancia (Tabela

1). Este resultado provavelmente está associado com a formação das galhas nas raízes das

plantas inoculadas aumentando a massa nas plantas inoculadas. Em média, a massa fresca

foi maior na linha de melancia forrageira

Afim de compreende o mecanismo de infecção de M. javanica em plantas de soja,

foi demonstrado que a superexpressão do gene de corismato mutase I do fitonematoide

altera a via xiquimato por causa da degradação do corismato citoplasmático, que resulta

num fenótipo de redução ou aborto das radícolas laterais, provavelmente como

conseqüência da redução dos níveis de auxinas nos plastídios (FRAGOSO et al., 2007).

Assim observou-se para a linha BGCIA 240 uma recuperação do sistema radicular aos 28

e 35 DIA e para a linha BGCIA 875 uma contínua queda dos valores de massa fresca de

raiz.

Os dados de clorofila a e b para as épocas estudadas não diferiram

estatisticamente entre as plantas inoculadas e não inoculadas, nem entre os genótipos

(Tabela 1). Provavelmente, esse fato ocorreu devido ao pouco tempo após a inoculação.

Os sintomas reflexos na parte aérea da planta pela presença do nematoide na raiz

aparecem num estágio mais avançado da infecção e na fase de produção, caracterizando

um maior dreno de nutrientes para os frutos. Por sua vez, Lubarino (2012) ao estudar a

relação do teor de clorofila com a ação do M. enterolobii em plantas inoculadas de

melancia observou aos 60 dias após a inoculação um menor teor de clorofila em plantas

inoculadas com relação as não inoculadas. Em geral, o índice médio de clorofila a foi

maior que o de clorofila b, que ocorre devido a uma maior proporção do fotossistema I

que é mais rico em clorofila a, em condições normais de luminosidade, (CRIRCHELEY,

1999) e menor clorofila b, uma vez que, esta tem uma maior proporção em ambientes

sombreados (SOUZA et al., 2011).

81

ns ns ns

ns

ns

0

10

20

30

40

50

7 14 21 28 35

N°

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nta


BGCIA240R+ BGCIA 875+

A

ns ns ns ns

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0

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200

300

400

7 14 21 28 35

N°

de

ov

os/

pla

nta


BGCIA240 BGCIA 875

B

Figura 1. Número de galhas (A) e número de ovos (B) por planta de dois genótipos de

melancia do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas da Embrapa

Semiárido, Linha BGCIA 240 (resistente) e Linha BGCIA 875(suscetível) inoculadas com

Meloidogyne enterolobii, avaliadas em diferentes épocas de coleta. * Significativo a 5%

de probabilidade e ns= não significativo pelo teste T.

Tabela 1. Comprimento de raiz, massa fresca de raiz, clorofila a e clorofila b de dois

genótipos de melancia do Banco Ativo de Germoplasma de Cucurbitáceas da Embrapa

Semiárido, Linha BGCIA 240 e Linha BGCIA 875 inoculadas e não inoculadas com

Meloidogyne enterolobii em diferentes épocas de avaliação.

Linhas

Comprimento de raiz (cm)


7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 16,25 a 12,90 a 14,30 ab 21,75 a 21,17 a

BGCIA 240 17,00 a 15,50 a 16,17 a 13,40 b 9,33 a

BGCIA 875+ 10,25 b 10,50 a 10,50 b 9,83 b 12,25 a

BGCIA 875 10,73 b 10,87 a 10,83 b 11,80 b 11,75 a

Massa fresca de raiz (g)

7 14 21 28 35

82

BGCIA 240+ 2,66 a 1,78 a 1,46 ab 1,61 a 1,73 a

BGCIA 240 2,54 ab 1,85 a 2,22 a 1,24 a 1,14 a

BGCIA 875+ 0,61 b 0,63 a 0,63 b 0,29 b 0,60 a

BGCIA 875 0,99 ab 0,69 a 1,00 ab 0,35 b 1,11 a

Clorofila a (IFC)

7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 24,90 a 32,07 a 31,80 a 28,03 a 24,57 b

BGCIA 240 26,00 a 33,90 a 34,47 a 27,73 a 28,93 ab

BGCIA 875+ 24,10 a 28,90 a 31,80 a 28,40 a 28,57 ab

BGCIA 875 26,33 a 30,40 a 36,17 a 30,03 a 30,63 a

Clorofila b (IFC)

7 14 21 28 35

BGCIA 240+ 9,33 a 14,67 a 15,37 a 14,90 a 10,83 a

BGCIA 240 12,90 a 15,07 a 16,83 a 13,33 a 11,07 a

BGCIA 875+ 12,33 a 11,87 a 12,67 a 12,10 a 9,27 a

BGCIA 875 12,53 a 13,27 a 18,73 a 13,40 a 11,97 a

+= genótipos inoculados; IFC= Índice Falker de Clorofila. Médias com mesma letra nas

colunas não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey (P < 0,05 ).

Respostas bioquímicas de defesa

As proteínas presentes na planta podem estar envolvidas no processo de defesa

bioquímica contra os danos causados pelo patógeno (BERNARDS et al., 1999). Além

disso, espécies vegetais sensíveis ao nematoide das galhas podem apresentar a quantidade

ou qualidade das proteínas alteradas. Não foi obeservado efeito da inoculação com o M.

enterolobii nos teores de proteínas solúveis totais nas duas linhas estudadas nos tempos

avaliados, exceto aos 35 dias após a inoculação que o genótipo suscetível (BGCIA 875)

inoculado apresentou menor teor de proteínas que os não inoculado, época de maior

formação de galhas e número de ovos observado neste genótipo (Figura 1- A).

Para a guaiacol peroxidase, foi observado que não ocorreram diferenças na

atividade desta enzima em plantas resistentes e suscetíveis infectadas e não infectadas

com o M. enterolobii até os 14 dias após a inoculação (Figura 1-B). A linha com maior

nível de resistência (BGCIA 240) inoculada com o nematoide apresentou maior atividade

dessa enzima, especialmente nos tempos de 21 e 28 dias após a inoculação, enquanto que

a não inoculada apresentou atividade semelhante à da linha suscetível BGCIA875

inoculada e não inoculada. No presente estudo, foi observado nas plantas resistentes

aumento da atividade da enzima guaiacol peroxidase somente aos 21 DAI, o que significa

83

dizer que nesse momento há uma interação de reconhecimento planta-patógeno,

desencadeando a resposta de defesa da planta contra os danos causados pelo nematóide.

A atividade da polifenoloxidase foi maior nas plantas da linha resistente, tanto

para plantas inoculadas como para não inoculadas somente aos 14 dias após a inoculação

(Figura 1C). Não há relatos que correlacionem o aumento da atividade de

polifenoloxidases com a defesa DAE plantas de melacia aos nematoides. Entretanto, para

outras culturas como a soja estudos têm mostrado que plântulas de soja de variedade

resistente e inoculadas com J2 de M. javanica está associada a um aumento na atividade

da PPO 72 horas após a inoculação (SHIMIZU, 2004).

A atividade da ascorbato peroxidase foi maior nas plantas da linha resistente

(BGCIA 240), tanto inoculada como não inoculada com M. enterolobii, até os 21 dias

após a inoculação, superiores à linha suscetível (Figura 1D). Não foi observado diferença

nas atividades da catalase entre as linhas suscetíveis (BGCIA 875) e resistentes de

melancia.

Para a atividade da fenilalanina amônia-liase , aos 14 dias após a inoculação, foi

observado aumento significativo nas raízes de plantas da linha BGCIA 240, inoculadas,

em relação às plantas da linha suscetível, BGCIA 875, também inoculadas (Figura 2F).

Este aumento de atividade provavelmente reflete o aumento da utilização de compostos

fenólicos em raízes resistentes. A partir desse momento houve queda na atividade dessa

enzima para as plantas da linha BGCIA 240 inoculadas e não inoculadas. Kalaiarasan

(2009) ao avaliar genótipos de tomate resistentes e suscetíveis a M. incognita quanto aos

danos provocados pelo patógeno observou por avaliação bioquímica que os genótipos

resistentes possuíam maior atividade de fenilalanina amônia-liase que os genótipos

suscetíveis.

Os resultados deste trabalho possibilitam um maior conhecimento dos

mecanismos de defesa envolvidos na resistência da melancia ao nematoide M.

enterolobii. Entre as respostas bioquímicas na defesa das plantas contra patógenos, as

peroxidases, catalase, polifenoloxidase e fenilalanina amônia-liase têm recebido destaque

em diversos estudos (KALAIARASAN, 2009) pois estes compostos podem atuar na

mitigação dos danos causados pelo patógeno, ou impedir o avanço do mesmo nos tecidos

do hospedeiro (RESENDE et al., 2003). Estas enzimas podem atuar de forma diferente

em diferentes relações planta-nematóide e, neste trabalho, observou-se que o aumento na

84

atividade das enzimas peroxidases, polifenoloxidase e fenilalanina amônia-liase indica

um efeito de resposta da planta após o reconhecimento do patógeno.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

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0,80

7 14 21 28 35

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L-1

)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

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4

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7 14 21 28 35

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m

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-1)


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BGCIA875+ BGCIA875

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7 14 21 28 35

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mM

m

in-1

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P-1

)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

B

0

40

80

120

160

200

7 14 21 28 35

AP

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mM

m

in-1

mg

P-1

)


BGCIA240+ BGCIA240

BGCIA875+ BGCIA875

D

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

7 14 21 28 35

CA

T (

mM

m

in-1

mg P

-1)



BGCIA875+ BGCIA875

E

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

7 14 21 28 35

PA

L (m

M m

in-1

mg P

-1)



BGCIA875+ BGCIA875

F

85

Figura 2. Proteínas solúveis totais (A), atividades das enzimas guaiacol peroxidase

(POX) (B), polifenoloxidase (PPO) (C), ascorbato peroxidase (APX) (D), catalase

(CAT)(E) e fenilalanina amônia liase (PAL) (F) de dois genótipos de melancia do Banco

Ativo de Germoplasma (BAG) de Cucurbitáceas da Embrapa Semiárido, Linha BGCIA

240 e Linha BGCIA 875 inoculadas com Meloidogyne enterolobii, e seus controles,

avaliadas em diferentes épocas de coleta. Barras representam erro padrão da média

CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou, em alguns casos, que a presença do patógeno induziu na

linha resistente inoculada com M. enterolobii, maior valor de comprimento de raiz aos 28

DAI e menor massa fresca de raiz aos 21 DAI. A massa fresca também foi menor para a

linha suscetível inoculada, apresentando-se mais acentuado, por estar associado com a

formação das galhas nessas raízes.

Nas análises bioquímicas a maior concentração de compostos de defesa na linha

resistente inoculada foi aos 14 DAI. As enzimas relacionadas a defesa da melancia a M.

enterolobii nesse trabalho foi a POX, APX, PPO e PAL. Desta forma nota-se que estes

compostos são potenciais para serem utilizados como marcadores bioquímicos de

resistência a M. enterolobii em melancia.

AGRADECIMENTOS

À Embrapa Semiárido pela utilização das instalações (casa de vegetação e

laboratórios) e ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido da

Universidade Federal do Vale do São Francisco pelo suporte financeiro.

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