UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE LEIDYANNE … · A massa de tecido adiposo aumenta durante a meia...

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE NOVA FRIBURGO

CURSO DE GRADUÇÃO EM BIOMEDICINA

LEIDYANNE FERREIRA GONÇALVES

ESTUDO HISTOPATOLÓGICO DO TECIDO ADIPOSO BRANCO E

MARROM DE CAMUNDONGOS C57Bl/6 FÊMEAS NO

ENVELHECIMENTO

NOVA FRIBURGO

2015

i




ENVELHECIMENTO

ORIENTADORA:

PROFa. DRª. CAROLINE FERNANDES DOS SANTOS BOTTINO

Nova Friburgo, RJ

2015

Monografia apresentada à Universidade

Federal Fluminense/Campus Universitário

de Nova Friburgo, como Trabalho de

Conclusão do Curso de graduação em

Biomedicina.

G635e Gonçalves, Leidyanne Ferreira

Estudo histopatológico do tecido adiposo branco e marrom de

camundongos C57BI/6 fêmeas no envelhecimento. / Leidyanne Ferreira

Gonçalves; Profᵃ. Drᵃ. Caroline Fernandes dos Santos Bottino, orientadora. --

Nova Friburgo, RJ: [s.n.], 2017.

46f. : il.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) –

Universidade Federal Fluminense, Instituto de Saúde de Nova Friburgo,

2017.

1. Histologia. 2. Tecido adiposo. 3. Envelhecimento. I. Bottino, Caroline

Fernandes dos Santos, Orientadora. II. Título.

CDD M574.824

ii




ENVELHECIMENTO

Aprovado em: 21/12/ 2015

Banca Examinadora

_____________________________________ Profa. Dra. Caroline Fernandes dos Santos Bottino

Universidade Federal Fluminense - Campus Universitário de Nova Friburgo

_____________________________________ Profa. Dra. Elan Cardozo Paes de Almeida

Universidade Federal Fluminense - Campus Universitário de Nova Friburgo

_____________________________________ Profa. Dra. Bianca Martins Gregório

Universidade do Estado do Rio de Janeiro - Campus Maracanã

Nova Friburgo

2015

Monografia apresentada à Universidade

Federal Fluminense/Campus Universitário

de Nova Friburgo, como Trabalho de

Conclusão do Curso de graduação em

Biomedicina.

iii

A todos meus amigos, professores e familiares que estiveram ao meu

lado durante esses anos e me apoiaram.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente ao Senhor por ter me dado a oportunidade de tentar

me tornar a cada dia uma pessoa melhor, agradeço aos meus professores

por toda a instrução e sabedoria que foram passadas, aos meus amigos e

familiares por sempre me darem força nos momentos mais difíceis.

v

RESUMO

A massa de tecido adiposo aumenta durante a meia idade em humanos e declina em idosos, havendo redistribuição do depósito subcutâneo para o intra-abdominal. Os estudos sugerem que a deterioração do metabolismo do tecido adiposo branco (TAB) e marrom (TAM) com a idade contribua com a deterioração do metabolismo energético. O objetivo do presente estudo é avaliar as mudanças histopatológicas dos diferentes depósitos de gordura (branco [visceral e subcutâneo] e marrom) ao longo do envelhecimento em camundongos C57Bl/6 fêmeas e correlacionar estes achados com o perfil glicídico e lipídico. Os animais foram divididos em quatro grupos de acordo com a idade: 3, 6, 9 e 12 meses de idade. Antes da eutanásia foi avaliada a ingestão alimentar, massa corporal e a glicemia após jejum de 6 horas. Na eutanásia, os animais foram anestesiados e o sangue coletado para dosagem de triglicerídeo, colesterol total, HDL e insulina séricos. O TAB visceral e subcutâneo e o TAM foram coletados e pesados. Após processamento histológico, foi mensurado o diâmetro dos adipócitos (TAB e TAM), a densidade de gotículas lipídicas no TAM e o tamanho dessas gotículas por morfometria. A massa corporal teve aumento a partir dos 9 meses de idade, mesmo com a ingestão alimentar igual entre os grupos (3,7±0,1g/dia). Todos os depósitos de gordura aumentaram com a idade, mas mesmo com o ganho de adiposidade subcutânea (GI), a relação gordura subcutânea/visceral diminui progressivamente com a idade. Não houve diferença no peso da GM entre os grupos, porém a relação GM/gordura branca diminui progressivamente já a partir dos 6 meses de idade. Na quantificação morfológica, houve aumento do diâmetro dos adipócitos na GG, GI e GR. Em relação a GM, o grupo F3 apresentou 22,8% do tecido ocupado por gotículas lipídicas, e houve aumento dessa porcentagem em F6, F9 e F12, comparados ao grupo F3, assim como em F12 comparado a F6. Esta célula apresentou hipertrofia com a idade nos grupos F6, F9 e F12. Visto que há uma mudança fenotípica dos adipócitos de diferentes depósitos ao longo da vida, faz-se importante o estudo deste fenômeno e sua correlação com o metabolismo glicídico e lipídico. Esse entendimento auxiliará no desenvolvimento de novos medicamentos que tenham como objetivo o combate à obesidade e as doenças metabólicas.

Palavras chave: Tecido adiposo branco, tecido adiposo marrom, envelhecimento, fêmeas.

vi

ABSTRACT

The adipose tissue mass increases during the middle age in humans and declines in the elderly, when fat is redistributed from subcutaneous to intra-abdominal depots. Recent studies suggest that the deterioration in white (WAT) and brown (BAT) adipose tissue metabolism with age impairs energy metabolism. This study aimed to evaluate the histopathological changes of different fat depots (white [visceral and subcutaneous] and brown) during aging in C57Bl/6 female mice and to correlate these changes with glucose and lipid profile. Animals were allocated into four groups according to age: three, six, nine and 12 months old. Prior to euthanasia, we measured food intake, body weight and 6-hour fast glucose. At euthanasia, animals were anesthetized and blood was withdrawn to determine serum triglyceride, total cholesterol, HDL cholesterol and insulin. Visceral and subcutaneous WAT, and the subscapular BAT were harvested and weighed. After histological processing, we assessed adipocyte diameter (WAT and BAT), and lipid droplet area and size (BAT) by means of morphometry. Body weight had increased from 9 months of age, even with the same food intake between the groups (3.7 ± 0.1g / day). All deposits of fat increased with age, but even with subcutaneous fat gain (GI) the subcutaneous / visceral fat ratio decreases progressively with age. There was no difference in GM weight between the groups, but GM / white fat ratio decreases progressively from 6 months of age. In the morphological quantification, there was increase in diameter of adipocytes in GG, GI and GR. For GM, F3 group presented 22.8% of tissue occupied by lipid droplets, and this percentage was increased F6, F9 and F12, as compared to the group F3, and F12 compared to F6. This cell presented hypertrophy with aging in groups F6, F9 and F12. Since adipocytes from different depots exhibit phenotypic plasticity throughout life, it is important to study this phenomenon and to correlate it with glucose and lipid metabolism. This knowledge will guide the development of new drugs that aim to fight obesity and metabolic disorders.

Keywords: white adipose tissue, brown adipose tissue, aging, female.

vii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................... 1

2 REVISÂO DE LITERATURA............................................................2

2.1 TECIDO ADIPOSO ................................................................. .....2

2.1.1 Tecido adiposo branco...............................................................4

2.1.2 Tecido adiposo marrom..............................................................5

2.2 ENVELHECIMENTO.....................................................................7

2.3 METABOLISMO E HORMÔNIOS SEXUAIS.................................8

2.4 MODELO ANIMAL.......................................................................10

3 OBJETIVOS....................................................................................11

3.1 OBJETIVOS GERAIS...................................................................11

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................11

4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................. .........12

4.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS.......................................................12

4.2 CITOLOGIA VAGINAL.................................................................12

4.3 TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA À GLICOSE ........................... 14

4.4 BIOQUÍMICA SANGUÍNEA ....................................................... 14

4.5 EXTRAÇÃO DO TRIGLICERÍDEO HEPÁTICO ......................... 15

4.6 MORFOMETRIA E ESTEREOLOGIA ........................................ 15

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................... ..18

5 RESULTADOS ............................................................................. 19

viii

5.1 MASSA CORPORAL ................................................................. 19

5.2 INGESTÃO ALIMENTAR ........................................................... 20

5.3 ÚTERO E OVÁRIO .................................................................... 21

5.4 GLICEMIA DE JEJUM ............................................................... 22

5.5 LIPIDOGRAMA............................................................................23

5.6 FÍGADO ..................................................................................... 24

5.7 MASSA DE TECIDO ADIPOSO...................................................25

5.8 REMODELAMENTO DO TECIDO ADIPOSO BRANCO GENITAL

...........................................................................................................27

5.9 REMODELAMENTO DO TECIDO ADIPOSO BRANCO INGUINAL

...........................................................................................................28

5.10 REMODELAMENTO DO TECIDO ADIPOSO BRANCO

RETROPERITONEAL ......................................................................29

5.11 QUANTIFICAÇÃO DA GORDURA MARROM .........................30

5.12 INSULINA..................................................................................32

5.13 TESTE DE TOLERÂNCIA ORAL À GLICOSE..........................33

5.14 HOMA-IR e HOMA-B.................................................................34

6 DISCUSSÃO ............................................................................... .35

7 CONCLUSÕES ............................................................................ 39

8 REFERÊNCIAS ............................................................................ 40

ANEXO A – Aprovação CEUA ....................................................... 46

1

1 INTRODUÇÃO

O envelhecimento traz uma série de alterações no organismo, dentre elas

podemos observar a obesidade e o descontrole metabólico que vem ocorrendo cada

vez em maior número na população mundial. Um dos principais fatores envolvidos

no desenvolvimento dessas modificações fisiológicas é o tecido adiposo.

O tecido adiposo desempenha um papel fundamental no controle da

homeostase energética, com o passar dos anos vários estudos relataram a

importância crescente de uma maior investigação das características e

singularidades desse tecido, com isso vários aspectos importantes foram elucidados,

porém ainda há muito a ser descoberto.

Durante o envelhecimento são observadas várias alterações tanto na

morfologia desse tecido quanto na redistribuição entre os seus diferentes depósitos,

que podem ser correlacionadas com as alterações fisiológicas presentes durante

esse período. Os hormônios sexuais também têm grande influência no

envelhecimento e nas variações observadas no tecido adiposo.

Com isso, é importante um estudo mais aprofundado da relação existente

entre todos esses fatores, sendo muito comum a utilização de camundongos

C57BL/6, por serem excelentes modelos para o estudo da obesidade e do diabetes.

2

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 TECIDO ADIPOSO

Durante muitos anos o tecido adiposo foi considerado apenas como um

importante órgão de armazenamento de energia, porém a identificação da leptina,

um hormônio secretado pelos adipócitos que tem efeito sobre o sistema nervoso e a

função endócrina, levou o tecido adiposo a ser visto também como um órgão

multifuncional, que produz e secreta peptídeos e proteínas bioativas denominadas

adipocitocinas ou adipocinas (Fonseca-Alaniz et al., 2007; Guimarães et al., 2007).

O tecido adiposo tem um papel essencial na sobrevivência de mamíferos, já

que consegue armazenar o excesso de calorias produzido na forma de lipídeos até

que se tornem necessários para o suprimento de energia, também proporcionam

isolamento térmico e proteção mecânica. Essas duas primeiras funções, de

estocagem e isolamento têm grande importância na regulação do metabolismo

energético. Os adipócitos que constituem o tecido adiposo têm a capacidade de

armazenar lipídeos sem que isso comprometa a integridade funcional das células.

Eles têm as enzimas necessárias para sintetizar os ácidos graxos (lipogênese) e

estocá-los em períodos de grande oferta de energia ou mobilizá-los quando há a

falta dela (lipólise). Essa capacidade de lipogênese ou lipólise pode variar de acordo

com a localização do tecido adiposo, sendo ele subcutâneo ou visceral, a secreção

das adipocinas também pode sofrer essa variação (Guimarães et al., 2007).

Vários sistemas como o sistema nervoso central, digestório e endócrino,

estão envolvidos na regulação dessa homeostase. O sistema nervoso central

participa desses dois processos (lipólise e lipogênese) tanto de forma direta quanto

indireta, levando por exemplo à busca pelo alimento ou a recusa do mesmo,

enquanto os sistemas digestório e endócrino realizam essa regulação através de

nutrientes e hormônios levando em consideração as necessidades do momento

(Fonseca-Alaniz et al., 2007). A capacidade de armazenamento é descrita em

alguns estudos como virtualmente ilimitada o que inicialmente é uma vantagem

adaptativa a curto prazo, já que permite a estocagem de grande quantidade de

energia, mas a longo prazo pode levar a uma disfunção metabólica (Costa e Duarte,

3

2006). Na prática sabe-se que os adipócitos não têm uma capacidade ilimitada de

armazenamento de triglicerídeos, quando seu crescimento atinge o grau máximo

eles se tornam mais lipolíticos podendo desencadear um aumento da concentração

de ácidos graxos livres no plasma e danificar a função de alguns órgãos pela

lipotoxicidade, assim que esse crescimento exacerbado ocorre, novas células são

lentamente recrutadas, porém essas células possuem uma capacidade de

armazenamento consideravelmente menor (Queiroz et al., 2009). Aproximadamente

um décimo do total de células adiposas é renovado a cada ano, seja pela

adipogênese que já está em curso ou pela morte de alguns adipócitos (Arner et al.,

2010).

O tecido adiposo está disperso por todo o organismo formando depósitos

que não possuem conexão física entre si, onde podem ser encontrados vários tipos

celulares, como macrófagos, fibroblastos, pré-adipócitos e adipócitos, além de uma

matriz de tecido conjuntivo (fibras colágenas e reticulares), fibras nervosas, estroma

vascular e nódulos linfáticos (Fonseca-Alaniz et al., 2007). Sua atividade secretória é

regulada tanto por mecanismos humorais quanto hormonais. As adipocinas

secretadas desempenham um papel importante não só na homeostase energética

como também na resposta imunológica, sensibilidade à insulina e doença vascular

(Costa e Duarte, 2006). Dentre essas adipocinas podemos citar: fator de necrose

tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) relacionadas ao sistema imunológico,

angiotensinogênio que influencia na regulação da pressão arterial e adiponectina,

resistina, visfatina e leptina que estão envolvidas na homeostase glicêmica

(Fonseca-Alaniz et al., 2007). A hipertrofia e/ou hiperplasia dos adipócitos leva a

alterações na secreção dessas adipocinas que podem influenciar no processo de

desenvolvimento da obesidade e suas complicações (Guimarães et al., 2007).

O tecido adiposo branco (TAB) e o tecido adiposo marrom (TAM) são

fundamentais no controle da massa corporal, pelo menos em pequenos mamíferos.

Enquanto o TAM é importante no gasto energético uma vez que ele é o principal

mediador da termogênese adaptativa, o tecido adiposo branco é importante no

armazenamento de energia, assim como na geração de sinais que informam o

encéfalo sobre o status da reserva energética corporal (p.ex., leptina) (Seydoux e

Girardier, 1978; Rothwell, 1989).

Estruturas chamadas “crown-like-stuctures” (CLS) foram identificadas em

grande número tanto em humanos quanto roedores no tecido adiposo em obesos,

4

são formadas por adipócitos mortos rodeados por macrófagos, na região visceral

esses CLS são encontrados em maior número que no tecido adiposo subcutâneo, o

número dessas estruturas diminui consideravelmente quando há grande perda de

peso, porém um estudo mais aprofundado é necessário para a avaliação do

envolvimento dessas estruturas com a obesidade e função dos adipócitos (Lee, Wu

e Fried, 2010).

2.1.1 Tecido Adiposo Branco

O tecido adiposo branco é formado por uma única e grande gotícula lipídica, o

citoplasma, núcleo e demais organelas ficam localizadas na periferia celular. Seu

volume é variável, de acordo com a quantidade de lipídeos armazenados, podendo

ser algumas centenas ou milhares de vezes maior que hemácias e células do

sistema imune. O tecido adiposo branco possui distribuição por todo o organismo

envolvendo ou se infiltrando em quase toda a região subcutânea, órgãos e

grupamentos musculares, oferecendo assim proteção mecânica e sendo essencial

na preservação da temperatura corporal.

Um fato curioso é que, inicialmente os adipócitos jovens apresentam

múltiplas gotículas lipídicas, que são características do adipócito marrom, porém

com o amadurecimento elas se unem para formar a tão representativa única gotícula

do adipócito branco (Fonseca-Alaniz et al., 2007). Para acomodar as grandes

variações na disponibilidade de nutrientes, o TAB (tecido adiposo branco) é capaz

de alterar de forma rápida e significativa o seu tamanho, em especial o tecido

adiposo subcutâneo (TASC), que não está submetido às limitações anatômicas ao

crescimento como ocorre com o tecido adiposo visceral (TAV). O crescimento do

TAB ocorre devido a alterações no tamanho e número das células adiposas, as

quais variam em magnitude entre os diferentes depósitos de gordura.

5

2.1.2 Tecido Adiposo Marrom

O tecido adiposo marrom é essencial para a sobrevivência de pequenos

mamíferos em ambientes frios, já que é ele o responsável pela termogênese

adaptativa através da produção de calor (Harms e Seale, 2013).

Comparado ao TAB, o TAM (tecido adiposo marrom) é mais vascularizado,

possui uma densa inervação adrenérgica e uma grande quantidade de mitocôndrias

e pequenas gotículas lipídicas. Até recentemente, acreditava-se que o TAM

desaparecia rapidamente após o nascimento, quando ele é essencial para que a

temperatura corporal seja mantida, já que a necessidade de ativação desses

adipócitos diminui depois de alguns meses de vida, e que ele desempenhava um

papel mínimo na fisiologia do adulto (Lean, 1989; Ravussin e Galgani, 2011).

Entretanto, o TAM foi consistentemente identificado em humanos adultos, os

adipócitos marrons estão localizados em dois tipos de depósito, depósito discreto ou

difuso. Os depósitos discretos se encontram na região cervical-supraclavicular (mais

comum), perirenal, adrenal, paravertebral e grandes vasos como a aorta e seus

principais ramos (aa. carótida, aa. subclávia, aa. intercostais e aa. renais), onde

provavelmente estão presentes para gerar calor e manter a temperatura central do

corpo. Já os depósitos difusos estão embebidos no próprio TAB e no músculo

esquelético (Nedergaard, Bengtsson e Cannon, 2007; Cypess et al., 2009; Ravussin

e Galgani, 2011).

O adipócito marrom tem formato poligonal e é formado por várias pequenas

gotículas lipídicas. Os adipócitos são menores do que os adipócitos brancos

(diâmetro médio de 60-100 μm), tendo em média 30-40 μm de diâmetro, e possuem

numerosas mitocôndrias onde se localiza a proteína desacopladora-1 (UCP-1 ou

termogenina) que leva a dissipação da energia em forma de calor. A coloração mais

escurecida do tecido ocorre pela alta concentração de citocromo oxidase dessas

mitocôndrias, a qual pode ser considerada um marcador desse tecido, assim como a

UCP-1. Alguns genes também são altamente expressos nessas células como, por

exemplo, o receptor β3 adrenérgico, citocromo C e o coativador 1 alfa do PPARγ

(PGC1-α), que estão relacionados a produção de calor, principal função do tecido

adiposo marrom (Fonseca-Alaniz et al., 2007; Ravussin e Galgani, 2011).

6

O gene PGC1-α tem um grande papel no desenvolvimento do tecido adiposo

marrom, reforçando a biogênese mitocondrial e a sinalização oxidativa metabólica. A

expressão ectópica desse gene nos adipócitos brancos tanto em humanos quanto

em ratos induziu genes mitocondriais e termogênicos incluindo UCP1 (Puigserver et

al., 1998; Tiraby et al., 2003).

Recentemente também foi descoberto um fator de transcrição que atua

diretamente na diferenciação desses adipócitos, o PRDM16 que é um potente

coativador da atividade transcricional do PGC1α e β, assim como do PPARα e γ.

Além disso, esse fator também suprime alguns genes específicos presentes no

tecido adiposo branco como a resistina e o angiotensinogênio (Seale et al., 2007;

Kajimura et al., 2008; Seale et al., 2008).

Em camundongos, e muito provavelmente em humanos também, ocorrem 2

tipos de população de adipócitos marrons, o clássico que se localiza na região

interescapular e profunda do pescoço e o segundo tipo, adipócitos que expressam

UCP-1 que podem ser encontrados interpostos no tecido adiposo branco e músculo

esquelético, esses adipócitos tem sido chamados de bege ou “brite” ("brite

adipocyte", junção dos termos em inglês "BRown adipocyte" e "whITE adipocyte").,

mesmo que ainda não se saiba qual o tipo é mais prevalente em humanos adultos, o

envelhecimento afeta negativamente a formação de ambos os tipos (Graja e Schulz,

2015). Sua presença está associada à proteção contra a obesidade induzida por

dieta e doenças metabólicas (Seale et al., 2011). Os adipócitos brite possuem

morfologia e bioquímica semelhantes ao adipócito marrom, incluindo a presença de

múltiplas gotículas lipídicas e a expressão da proteína desacopladora 1 (UCP-1),

porém eles não são originados da linhagem celular Myf-5, como ocorre normalmente

no desenvolvimento do TAM estimulado pela proteína PRDM16 (Seale et al., 2008).

Entre os genes compartilhados pelos adipócitos brite e adipócitos marrons clássicos

pode-se citar o PGC1-α e o CIDEA. Por outro lado, há genes que são expressos

predominantes dos adipócitos brite e não nos adipócitos marrons clássicos, como o

FGF21, CITED1 e HOX9a (Sharp et al., 2012).

O processo de termogênese desse tecido é ativado principalmente pela

noradrenalina que é secretada em resposta ao frio, ≤ 23ºC para humanos e ≤ 30ºC

para camundongos (Ravussin e Galgani, 2011), estimulado pelo sistema nervoso

simpático, sua atividade é maior em fêmeas, possivelmente hormônios sexuais

estão envolvidos na regulação, assim como a idade (Pfannenberg et al., 2010).

7

2.2 ENVELHECIMENTO

A massa de tecido adiposo aumenta durante a meia idade em humanos e

declina em idosos. A gordura é redistribuída entre os diferentes depósitos de

gordura, especialmente durante e após a meia idade, quando esta se redistribui do

depósito subcutâneo para o intra-abdominal (Visser et al., 2003; Raguso et al.,

2006). Como consequência, por exemplo, a circunferência abdominal aumenta

aproximadamente 4,0 centímetros a cada 9 anos nas mulheres (Hughes et al., 2004;

Koutsari et al., 2009). Em idades mais avançadas, a gordura é redistribuída para fora

dos depósitos de gordura (esteatose) e se acumula, por exemplo, na medula óssea,

músculo esquelético e fígado. Estas alterações estão associadas com o diabetes

tipo 2, hipertensão arterial, câncer, disfunção cognitiva e aterosclerose, podendo

levar ao infarto do miocárdio e acidente vascular encefálico (Guo et al., 1999; Lutz,

Sanderson e Scherbov, 2008).

Com o envelhecimento, há um declínio na atividade do TAM e esse

fenômeno está relacionado a diminuição da quantidade de depósitos pelo corpo (Au-

Yong et al., 2009). No idoso, o TAM passa a ser interposto por TAB no pescoço e

porção superior do tórax (Cypess et al., 2009). O autor Zingaretti (Zingaretti et al.,

2009) hipotetiza que em uma determinada idade os humanos passariam de um

fenótipo caracterizado por eutrofia e adipócitos brancos pequenos para um fenótipo

caracterizado por obesidade crescente, adipócitos brancos grandes e ausência de

adipócitos marrons. Entretanto os mecanismos biológicos que regulam a

manutenção ou o declínio da massa de TAM no envelhecimento são desconhecidos

no momento. Esta (re)descoberta do TAM tem incitado o interesse científico no

estudo do papel dele na regulação da massa corporal e das desordens metabólicas

que acometem os humanos, principalmente no que concerne à obesidade e doenças

associadas, assim como as doenças crônicas associadas ao envelhecimento (Lidell

e Enerback, 2010; Mattson, 2010).

Existe uma renovação das células adiposas ao longo da vida. Os pré-

adipócitos (células progenitoras dos adipócitos) são abundantes e estão intimamente

relacionados aos macrófagos. Eles se desdiferenciam em idades mais avançadas,

replicam em menor taxa, possuem menor capacidade adipogênica, maior

susceptibilidade a lipotoxicidade e adquirem um perfil pró-inflamatório e senescente

8

que favorece o remodelamento do TAB (Karagiannides et al., 2001; Guo et al., 2007;

Schipper et al., 2008). Outras células progenitoras mesenquimais também podem

adquirir um perfil pró-inflamatório e um fenótipo semelhante ao do adipócito com a

idade (Tchkonia et al., 2010). Também há aumento de macrófagos no TASC com a

idade em camundongos. Seu número já é grande em idades precoces no TAV intra-

abdominal, porém diferente do TASC esse número não se altera muito com a idade

(Jerschow e Al, 2007). O envelhecimento também está relacionado com o aumento

da hipóxia e dos níveis teciduais de espécies reativas de oxigênio no TAV de

camundongos C57Bl/6, onde o TAV apresentaria menor alteração na expressão de

genes envolvidos na regulação redox quando comparado ao TASC (Zhang et al.,

2011).

Enquanto os mecanismos que correlacionam a obesidade ao diabetes estão

começando a serem elucidados (Weisberg et al., 2003; Xu et al., 2003), o link entre

o envelhecimento e o diabetes tipo 2 continua obscuro. Um declínio na tolerância à

glicose como parte do envelhecimento humano foi primeiro notado em 1921

(Spence, 1921) e a redução da sensibilidade à insulina é agora reconhecida como a

causa primária da falência dependente da idade do metabolismo da glicose

(Silverstone et al., 1957; Defronzo, 1979). Um dos marcos do envelhecimento é a

perda da sensibilidade à insulina no TASC (Borkan et al., 1983), e acredita-se que

este declínio dependente da idade esteja relacionado a uma alteração na replicação

e diferenciação dos pré-adipócitos (Karagiannides et al., 2001; Miard et al., 2009).

Uma vez que a adipogênese reduzida e a deposição ectópica de lipídios estão

intimamente relacionados com a resistência à insulina (Muoio e Newgard, 2008), a

deterioração da função do tecido adiposo com a idade provavelmente contribui com

a deterioração do metabolismo da glicose. Assim, os mecanismos por trás da

disfunção do tecido adiposo durante o envelhecimento merecem investigação.

2.3 METABOLISMO E HORMÔNIOS SEXUAIS

As mulheres possuem um maior percentual de gordura corporal (Womersley,

1977; Jackson et al., 2002), apresentando uma quantidade menor de tecido adiposo

9

branco visceral e uma maior deposição de tecido adiposo subcutâneo, enquanto

homens acumulam mais gordura visceral (Schreiner et al., 1996; Després et al.,

2000; Demerath et al., 2007; Macotela et al., 2009; Camhi et al., 2011). A

distribuição da gordura corporal é um fator importante para a saúde metabólica, por

exemplo, uma menor quantidade de tecido subcutâneo é favorável, enquanto uma

grande quantidade de tecido adiposo visceral é desfavorável, podendo auxiliar nas

alterações da homeostase de lipídeos e da glicose.

Mesmo tendo um percentual de gordura corporal mais baixo, a maior

prevalência de diabetes do tipo 2 e de resistência à insulina ocorre nos homens, o

que pode ser explicado pela maior sensibilidade à insulina na mulher, que tem

também maior resistência a uma dieta hiperlipídica (high fat) (Macotela et al., 2009;

Varlamov, Bethea e Roberts, 2014).

O mecanismo responsável pelas diferenças sexuais na sensibilidade à

insulina ainda não é totalmente compreendido. Um estudo demonstrou que não há

diferença na secreção de insulina entre machos e fêmeas jovens (Basu et al., 2006),

mas outro já indicou que as fêmeas tem uma secreção maior de insulina de primeira

fase do que os machos (Flanagan et al., 2006).

A castração aumenta a resposta à insulina no tecido adiposo branco em

machos e a ovariectomia diminui essa resposta em fêmeas, as diferenças

relacionadas ao sexo em relação a sensibilidade a insulina e o desenvolvimento e

função do tecido adiposo podem ser atribuídas em parte ao estrogênio e a

testosterona, a diminuição do estrogênio e o aumento dos níveis de testosterona que

ocorrem na menopausa podem ser associados a perda de tecido adiposo

subcutâneo e ganho de gordura visceral, assim como aumento da resistência à

insulina (Macotela et al., 2009). Da mesma forma, foi visto que o uso de

contraceptivos orais está associado a redução da sensibilidade à insulina e baixo

nível de estrogênio, sugerindo que esse hormônio pode ser um fator protetor contra

a resistência à insulina. O estrogênio também pode suprimir a síntese de

triglicerídeos, reduzindo a lipogênese no fígado e aumentando a lipólise nos

adipócitos (Varlamov, Bethea e Roberts, 2014).

10

2.4 MODELO ANIMAL

O camundongo é amplamente utilizado como modelo experimental

principalmente por ser pequeno, muito prolífero, ter período de gestação curto, ser

de fácil domesticação e manutenção, além de ser capaz de mimetizar diversas

condições patológicas humanas (Chorilli e Al, 2007).

A linhagem de camundongos C57Bl/6 é a mais amplamente utilizada e foi a

primeira a ter o seu genoma sequenciado. Eles são altamente suscetíveis a

obesidade induzida por dieta, diabetes tipo 2 e aterosclerose, mimetizando o que é

visto em humanos e servindo assim como um bom modelo para o estudo destas

doenças (Fernandes-Santos et al., 2009; Fraulob et al., 2010). Mesmo sem um

estímulo externo (p.ex., dieta hiperlipídica), o camundongo C57Bl/6 apresenta

deterioração do metabolismo de carboidratos e lipídios com a idade, assim como da

função pancreática. Tanto em machos como em fêmeas, há aumento da glicemia de

jejum, triglicerídeos e colesterol total (Zhou e Hansson, 2004; Fernández et al.,

2010). O envelhecimento também resulta em hipertrofia das ilhotas pancreáticas e

aumento da secreção de insulina pelo pâncreas (Leiter et al., 1988), com redução da

expressão do transportador da glicose tipo 2 (GLUT-2) e aumento da expressão da

glicoquinase (Perfetti et al., 1996).

11

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

A hipótese deste trabalho é a de que a deterioração do metabolismo com o

envelhecimento está correlacionada a alterações morfológicas do tecido adiposo.

Assim, o objetivo é avaliar se o envelhecimento influencia o remodelamento

morfológico do tecido adiposo branco (visceral e subcutâneo) e marrom de

camundongos e correlacionar estes dados com o perfil glicídico e lipídico.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar se o envelhecimento influencia o remodelamento morfológico do

tecido adiposo branco (visceral e subcutâneo);

• Avaliar o efeito do envelhecimento no tecido adiposo marrom;

• Correlacionar os achados morfológicos com os achados do perfil glicídico e

lipídico.

12

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS

Os protocolos de manuseio e experimentação foram aprovados pelo Comitê

de Ética em experimentação animal da Universidade Federal Fluminense (CEUA:

Projeto nº 446/2014). A investigação respeitou os preceitos do “Guia para o uso e

cuidado de animais de laboratório” (Publicação do NIH Nº 85-23, revisada em 1996,

USA). Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas com 3, 6, 9 e 12 meses de

idade, obtidos do Biotério próprio da Universidade Federal Fluminense. Eles foram

alocados nos seguintes grupos de estudo:

▪ F3 – fêmeas eutanasiadas aos 3 meses de idade (n=15/grupo)




Os animais foram alimentados com dieta própria para roedores (Nuvilab) e

tiveram a massa corporal e a ingestão alimentar aferidos antes da eutanásia. Água e

ração foram ofertadas ad libitum durante todo o experimento.

4.2 CITOLOGIA VAGINAL

Na semana anterior a eutanásia, foi realizado o exame de citologia vaginal

durante 5 dias, para observar se as fêmeas estavam ciclando ou não. Para isso, foi

utilizada uma pipeta de Pauster contendo aproximadamente 100 µl de água

destilada que foi posicionada na abertura do canal vaginal, gentilmente aperta-se o

bulbo da pipeta para que a água entre em contato com a abertura e então o bulbo

deve ser solto para que o líquido volte para a pipeta. Esse procedimento foi

realizado de 4 a 5 vezes. O líquido obtido foi desprezado em uma lâmina que

quando seca foi corada com cristal violeta (1 minuto) e lavada em água destilada (1

13

minuto). Após todo esse processo as lâminas ficaram prontas para análise, que foi

baseada na figura a seguir, retirada do mesmo estudo onde o protocolo acima foi

baseado (Mclean et al., 2012)

Adicionalmente, o útero e o ovário foram coletados para que juntamente com

a citologia vaginal pudessem indicar se os animais estavam na menopausa ou se

ainda estavam ciclando.

Figura 1 – Análise de Citologia Vaginal; A. Células epiteliais nucleadas; B. Células epiteliais

escamosas cornificadas; C. Leucócitos; D. Proestro; E. Estro; F. Metaestro; G Diestro; Cabeças de

seta preta em E, F e G apontam células epiteliais escamosas cornificadas representativas; setas

pretas em C, F e G indicam leucócitos; setas brancas em D e G sinalizam células epiteliais nucleadas

(Adaptado de Mclean 2012).

14

4.3 TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA À GLICOSE

Para análise de um possível desenvolvimento de resistência à insulina, o

teste oral de tolerância à glicose (TOTG) foi realizado. Glicose a 50% diluída em

salina estéril (0,9% NaCl) foi administrada através de gavagem orogástrica após

jejum de 6 horas (dose de 1g/kg de massa corporal). Sangue foi coletado através de

uma incisão na ponta da cauda do animal para dosagem da glicose plasmática antes

da gavagem e após 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos. A área sob a curva (ASC) foi

calculada usando a regra do trapézio para analisar a intolerância à glicose

(Fernandes-Santos et al., 2009).

4.4 BIOQUÍMICA SANGUÍNEA

Antes da eutanásia, os animais foram submetidos a jejum de 6 horas. A

glicemia sanguínea foi avaliada através de uma gota de sangue coletada por uma

pequena incisão na ponta da cauda do animal (glicosímetro One Touch Ultra,

Johnson& Johnson, SP, Brasil).

No momento da eutanásia, os animais foram anestesiados com ketamina

(100,0 mg/kg) e xilasina (10,0 mg/kg) intraperitoneal. Uma incisão foi realizada no

tórax e o coração foi exposto para que o sangue fosse coletado em seringa

previamente heparinizada diretamente do átrio direito. Após a centrifugação e

separação do plasma, foi feita a dosagem dos lipídios séricos (triglicerídeos,

colesterol total e HDL, ensaio colorimétrico, Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brasil). A

insulina de jejum também foi verificada através de ensaio de Elisa (Cat#EZRMI-13K,

Millipore).

Os valores de glicemia e insulinemia de jejum foram utilizados para o cálculo

do índice de resistência à insulina HOMA-IR (homeostasis model assessment index)

e para a análise da função das células beta pelo índice HOMA-B, segundo as

equações: HOMA-IR = (insulina de jejum x glicemia de jejum)/ 22,5 e; HOMA-B = (20

x insulina de jejum)/(glicemia de jejum - 3,5)%, sendo a unidade da insulina mU/mL e

da glicose mmol/L (Matthews et al., 1985).

15

4.5 EXTRAÇÃO DO TRIGLICERÍDEO HEPÁTICO

Para a extração do triglicerídeo foi pesado aproximadamente 50 mg de

tecido hepático de cada animal. O fígado foi lisado em 1,0 ml de álcool isopropílico e

o lisado hepático foi centrifugado a 4ºC por 10 minutos a 5.500 rpm. Parte do

sobrenadante foi reservada em um novo microtubo (~400 µL) e 2,0 µL foram

utilizados em ensaio colorimétrico para detecção do triglicerídeo (Bioclin, Belo

Horizonte, MG, Brasil).

4.6 MORFOMETRIA E ESTEREOLOGIA

Após a punção cardíaca, o tecido adiposo branco visceral (gordura genital e

retroperitoneal), subcutâneo (gordura inguinal) e o tecido adiposo marrom

subescapular foram coletados, pesados em balança de precisão e então imersos em

formalina de Millonig (4% peso/volume em 0,1M tampão fosfato pH 7,2) por 48 horas

(Carson, Martin e Lynn, 1973). Fragmentos de cada tecido foram submetidos ao

processamento histológico de rotina, embebidos em parafina, seccionados a 3,0 μm

de espessura e corados com hematoxilina e eosina.

No tecido adiposo branco, imagens digitais foram obtidas de campos

aleatórios para a mensuração do diâmetro do adipócito (Mandarim-De-Lacerda,

Fernandes-Santos e Aguila, 2010) através de microscópio Diagtech acoplado a uma

videocâmera DCM510. A análise morfométrica foi realizada utilizando-se o software

Image-Pro® Plus versão 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, USA). Pelo menos

50 adipócitos tiveram o seu maior e menor diâmetro mensurados por animal (Fig. 2).

A relação entre a massa de gordura visceral e subcutânea foi calculada como:

TASC:TAV = [gordura inguinal (g)]/ [gordura epididimal (g) + gordura retroperitoneal

(g)] (Fernandes-Santos et al., 2009).

16

Figura 2 - Mensuração do maior e do menor diâmetro de adipócitos pelo software Image-Pro® Plus 4.5.

O tecido adiposo marrom subescapular foi seccionado a 3,0 μm de

espessura e corado em hematoxilina e eosina. Uma vez que a célula adiposa

marrom é multilocular, imagens digitais foram obtidas para a quantificação que foi

feita em três abordagens diferentes:

▪ Porcentagem de gotículas lipídicas presentes no tecido, feita através

da análise por segmentação de imagem e posterior uso de

histograma, foram analisadas 8 imagens por animal;

▪ Foi mensurado o diâmetro das vesículas, sendo analisada a

circunferência das gotículas presentes dentro de um adipócito de

cada lâmina, sendo 8 lâminas usadas por animal;

▪ E por fim, o tamanho do adipócito marrom, foi medida a circunferência

de dois adipócitos por lâmina, num total de 8 lâminas por animal.

17

Foi calculada também a relação entre a gordura marrom e a gordura branca

da seguinte forma [gordura marrom (g)]/ [gordura genital (g)] + [gordura

retroperitoneal (g)] + [gordura inguinal (g)].

B

Figura 3 – A. Mensuração da porcentagem de gotículas lipídicas por histograma; B. Mensuração das vesículas lipídicas dentro do adipócito.

A

18

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram testados para distribuição normal e homocedasticidade das

variâncias e então analisados por one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (dados

paramétricos) ou por ANOVA não paramétrico de Kruskal-Wallis com pós-teste de

Dunn (dados referentes a um mesmo gênero). Um P<0,05 foi considerado

estatisticamente significativo (GraphPad Prism versão 6).

A B

19

5. RESULTADOS

5.1 MASSA CORPORAL

A massa corporal das fêmeas foi aferida antes da eutanásia e é possível

observar que não houve um aumento significativo do peso entre as idades de 3 e 6

meses, mas foi visto aumento em relação aos animais de 9 meses quando

comparados aos de 3 e 6 meses, assim como também houve uma diferença entre

os de 3, 6 e 9 meses para os animais de 12 meses (Fig 4).

Figura 4 – Massa corporal (g) de camundongos fêmeas com 3 (n=10), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12

(n=8) meses de idade. Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses;

[b] 6 meses e; [c] 9 meses.

20

5.2 INGESTÃO ALIMENTAR

A ração dada aos grupos foi medida diariamente e verificou-se não haver

diferença estatística na ingestão alimentar. Isto mostra que o ganho de peso ao

longo do experimento nas idades de 9 e 12 meses não se deve a maior ingestão

alimentar por esses grupos.

Figura 5 – Ingestão Alimentar (grama/camundongo/dia) dos grupos de 3 (n=4), 6 (n=6), 9

(n=8) e 12 (n=4) meses de idade. Dados expressos em média±EPM.

21

5.3 ÚTERO E OVÁRIO

O útero e o ovário também foram coletados e pesados durante a eutanásia e

foi visto que não há nenhuma diferença estatística entre o peso desses órgãos com

o envelhecimento. Juntamente com o esfregaço vaginal que mostrou que as fêmeas

estavam ciclando, esses dados indicam que as fêmeas não entraram na

menopausa, sugerindo que as alterações observadas não ocorreram por esse

evento.

Figura 6 – A. Peso do útero (g) em camundongos fêmeas com 3 (n=5), 6 (n=6), 9 (n=6) e

12 (n=5) meses. Dados expressos em média±EPM; B. Peso do ovário (g) em camundongos fêmeas

com3 (n=5), 6 (n=6), 9 (n=6) e 12 (n=5) meses. Dados expressos em média±EPM.

B A

A B

22

5.4 GLICEMIA DE JEJUM

A glicemia foi aferida após 6 horas de jejum. Pode ser observado que não

houve variação significativa da glicemia até os 9 meses de idade, porém os animais

de 12 meses de idade apresentaram uma queda significativa desse parâmetro em

relação aos animais de 3, 6 e 9 meses. Esperava-se encontrar um aumento dos

níveis de glicemia nos últimos grupos devido a uma possível resistência à insulina

desenvolvida com a idade, mas o que ocorreu foi justamente o contrário.

Figura 7 – Glicemia de jejum (mg/dL) de camundongos fêmeas com 3 (n=10), 6 (n=9), 9

(n=7) e 12 (n=8) meses de idade. Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a]

3 meses; [b] 6 meses e; [c] 9 meses.

23

5.5 LIPIDOGRAMA

Houve variação dos níveis de triglicerídeo (Fig. 8A), em relação aos grupos

de 3, 6 e 9 meses para o grupo de 12 meses, que demonstrou uma queda em

relação aos mesmos. O colesterol HDL (Fig. 8C) sanguíneo diminuiu

significativamente nos grupos de 6, 9 e 12 meses em relação ao grupo de 3 meses,

enquanto o colesterol total (Fig. 8B) não apresentou diferença significativa entre os

grupos estudados.

Figura 8 – Resposta dos lipídios sanguíneos ao envelhecimento em camundongos fêmeas

com 3 (n=5), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de idade. A, Triglicerídeo (mg/dL); B, Colesterol total

(mg/dL); C, Colesterol HDL (mg/dL). Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs.

[a] 3 meses e; [b] 6 meses.

A B A B

C

24

5.6 FÍGADO

É possível observar que não houve um aumento significativo do peso

hepático com a idade (Fig. 9A), mesmo tendo havido um aumento da massa

corporal. Entretanto, identificamos um maior armazenamento de triglicerídeo no

fígado, como evidenciado na Fig. 9B, especialmente nos grupos 9 e 12 meses de

idade quando comparados ao grupo de 3 meses.

Figura 9 – Resposta do fígado ao envelhecimento em camundongos fêmeas com 3 (n=10),

6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de idade. A. Peso do fígado (g); B. Triglicerídeo hepático

(mg/dL/mg). Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses.

A

A B

25

5.7 MASSA DE TECIDO ADIPOSO

Houve um aumento significativo do depósito de TAB genital (gordura

visceral), indicando que o envelhecimento favorece a maior deposição de gordura

nessa região nas idades de 9 e 12 meses (Fig. 10A). Os depósitos de gordura

retroperitoneal (visceral) e inguinal (subcutâneo) também tiveram o mesmo

comportamento (Fig. 10B e 10C, respectivamente). Diferente do TAB, não houve um

aumento significativo na quantidade de gordura marrom subescapular entre as

idades estudadas (Fig. 10D).

A B

C D

Figura 10 – Resposta ao envelhecimento dos diferentes depósitos de gordura de

camundongos fêmeas. A, Gordura genital (mg) 3 (n=10), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de

idade; B, Gordura retroperitoneal (mg) 3 (n=9), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de idade; C,

Gordura inguinal (mg) 3 (n=10), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de idade; D, Gordura

marrom (mg) 3 (n=10), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de idade. Dados expressos em

média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses e; [b] 6 meses.

26

Também foi analisada a relação entre a Gordura Visceral e a Gordura

Subcutânea (a gordura inguinal foi dividida pelo resultado da soma das gorduras

genital [epididimal] e retroperitoneal). Foi observado que os grupos de 9 e 12 meses

apresentaram um aumento desta relação (Fig. 11A), indicando que durante o

envelhecimento a gordura visceral está presente em maior quantidade que a

subcutânea. Além disso, foi calculada a relação entre a Gordura Marrom e a

Gordura Branca, onde a gordura marrom foi dividida pela soma das gorduras genital,

retroperitoneal e inguinal. O grupo de 6 meses apresentou uma queda significativa

deste parâmetro quando comparado ao grupo de 3 meses de idade, e os grupos de

9 e 12 meses apresentaram queda em relação aos grupos iniciais de 3 e 6 meses

(Fig. 11B). Esse dado indica que a gordura marrom está sendo sobreposta por

gordura branca.

Figura 11 – Redistribuição da gordura corporal com o envelhecimento em camundongos

fêmeas com 3 (n=10), 6 (n=9), 9 (n=7) e 12 (n=8) meses de idade. A, Relação entre a massa de

Gordura Visceral e Gordura Subcutânea (mg/mg); B, Relação entre a massa de Gordura Marrom e a

Gordura Branca (mg/mg). Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3

meses e; [b] 6 meses.

A B

27


GENITAL

Foi realizada a quantificação do diâmetro dos adipócitos da gordura genital,

onde observou-se um aumento deste parâmetro no grupo de 9 meses em relação

aos grupos de 3 e 6 meses, além de o grupo de 12 meses apresentar um aumento

em relação a todos os outros grupos (Fig. 12A). Através das fotomicrografias é

possível observar claramente esse aumento do diâmetro dos adipócitos (Fig. 12B).

A

B

Figura 12 – A. Diâmetro dos

adipócitos da Gordura Genital (micrômetros)

dos grupos (n=6) de 3, 6, 9 e 12 meses.

Dados expressos em média±EPM. Quando

indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses; [b] 6

meses e; [c] 9 meses; B. Fotomicrografia

dos adipócitos da gordura genital dos grupos

[a] 3 meses; [b] 6 meses; [c] 9 meses e; [d]

12 meses de idade.

A

B

28


INGUINAL

Foi realizada a quantificação do diâmetro dos adipócitos da Gordura

Inguinal, onde foi observado um aumento deste parâmetro no grupo de 9 meses em

relação ao grupo de 3 meses, além de o grupo de 12 meses apresentar um aumento

em relação aos dois primeiros grupos (3 e 6 meses) (Fig. 13A-B).

B

A

Figura 13 – A. Diâmetro dos

adipócitos da Gordura Inguinal

(micrômetros) dos grupos (n=6) de 3, 6,

9 e 12 meses. Dados expressos em

média±EPM. Quando indicado, P<0,05

vs. [a] 3 meses; [b] 6 meses. B.

Fotomicrografia dos adipócitos da

gordura inguinal dos grupos [a] 3 meses;

[b] 6 meses; [c] 9 meses e; [d] 12 meses

de idade.

A

B

29


RETROPERITONEAL

A quantificação do diâmetro dos adipócitos da Gordura Retroperitoneal

demonstrou um aumento do diâmetro nos grupos de 9 e 12 meses em relação aos

grupos iniciais de 3 e 6 meses (Fig. 14A-B).

B

A Figura 14 – Diâmetro dos adipócitos

da Gordura Retroperitoneal (micrômetros) dos

grupos de 3 (n=4), 6 (n=6), 9 (n=6) e 12 (n=6)

meses. Dados expressos em média±EPM.

Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses; [b] 6

meses. B. Fotomicrografia dos adipócitos da

gordura retroperitoneal dos grupos [a] 3

meses; [b] 6 meses; [c] 9 meses e; [d] 12

meses de idade.

A

B

30

5.11 QUANTIFICAÇÃO DA GORDURA MARROM

A quantificação da Gordura Marrom foi feita em duas etapas. Primeiramente,

a imagem foi segmentada em preto e branco e através do histograma da imagem foi

observada a porcentagem de área de tecido ocupada por gotículas lipídicas (Fig.

16A). Foi visto um aumento considerável nos grupos de 6, 9 e 12 meses em relação

ao grupo de 3 meses, e ainda do de 12 meses em relação ao de 6 meses.

A segunda etapa consistiu em medir o diâmetro do adipócito marrom (Fig.

16B), onde constatou-se um aumento nos grupos de 6, 9 e 12 meses comparando-

os ao grupo de 3 meses, e dos grupos de 9 e 12 meses em relação ao de 6 meses.

Adicionalmente, foi medido o diâmetro das gotículas lipídicas presentes no

citoplasma do adipócito marrom (Fig. 16C). Os grupos de 6, 9 e 12 meses tiveram

um aumento em relação ao grupo com 3 meses, mostrando assim tanto uma

hipertrofia do adipócito, quanto de suas gotículas lipídicas. Imagens representativas

das alterações morfológicas quantificadas são apresentadas nas fotomicrografias da

prancha da Fig.15.

Figura 15 – Fotomicrografia dos adipócitos da gordura marrom dos grupos [a] 3

meses; [b] 6 meses; [c] 9 meses e; [d] 12 meses de idade.

31

Figura 16 – A. Porcentagem de Gotículas lipídicas dos grupos de 3 (n=6), 6 (n=6), 9 (n=4) e

12 meses (n=6). Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses; [b] 6

meses; B. Diâmetro das vesículas (micrômetros) dos grupos de 3 (n=6), 6 (n=6), 9 (n=4) e 12 meses

(n=6). Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses; [b] 6 meses; C.

Diâmetro das gotículas (micrômetros) dos grupos de 3 (n=6), 6 (n=6), 9 (n=4) e 12 meses (n=6).

Dados expressos em média±EPM. Quando indicado, P<0,05 vs. [a] 3 meses.

A B

C C

A B

32

5.12 INSULINA

Os níveis de insulina após jejum de 6 horas foram dosados e não observou-

se diferença estatística, apesar da tendência clara ao aumento deste parâmetro nos

animais com 9 e 12 meses de idade, quando comparados aos animais com 3 e 6

meses de idade (Fig. 17).

Figura 17 – Insulina de

jejum (mmol/L) dos camundongos

fêmeas com 3 (n=5), 6 (n=5), 9

(n=5) e 12 (n=6) meses. Dados

expressos em média±EPM.

33

5.13 TESTE DE TOLERÂNCIA ORAL À GLICOSE

Após o teste ser feito, a análise estatística foi realizada e observou-se que

não há resistência à insulina, as curvas glicêmicas se comportaram de maneira

adequada, mesmo tendo uma diferença visual, não houve diferença estatística (Fig.

18A-B).

Figura 18 – A. Área sob a curva (ASC) do teste oral de tolerância à glicose (TOTG) dos

camundongos fêmeas com 3 (n=5), 6 (n=6), 9 (n=6) e 12 (n=5) meses (mg/dl). Dados expressos em

média±EPM; B. Curva do TOTG dos camundongos fêmeas de 3 (n=5), 6 (n=6), 9 (n=6) e 12 (n=5)

meses.

A

B

A

B

34

5.14 HOMA-IR e HOMA-B

Para avaliar uma possível resistência à insulina foi calculado o HOMA-IR

através da seguinte fórmula: (insulina de jejum x glicemia de jejum)/ 22,5. A partir

desse cálculo foi possível observar que apesar de os grupos finais (9 e 12 meses)

aparentarem um aumento, não houve diferença estatística entre os grupos (Fig.

19A), indicando que a resistência à insulina esperada no início do estudo não

ocorreu.

Já em relação ao HOMA-B, foi visto que houve um aumento do grupo de 12

meses comparado aos grupos iniciais (3, 6 e 9 meses), o que indicaria um aumento

de função das células B pancreáticas (Fig. 19B).

Figura 19 – A. Avaliação resistência à insulina (HOMA-IR) em camundongos fêmeas (n=5)

com 3, 6, 9 e 12 meses. Dados expressos em média±EPM; B. Avaliação da função das células B

pancreáticas (HOMA-B%) (n=5); [a] 3 meses; [b] 6 meses; [c] 9 meses. Dados expressos em

média±EPM.

A B A B

35

6 DISCUSSÃO

Em humanos a massa corporal está associada com a idade, mostrando um

pico entre 40 e 70 anos dependendo da etnia e do gênero, após isso a massa

corporal permanece estável ou tem um pequeno declínio (Graja e Schulz, 2015).

Roedores se comportam da mesma forma também ganhando peso durante o

envelhecimento (Wu et al., 2007; Hemmeryckx et al., 2010; Sellayah e Sikder, 2014).

Muito se tem estudado sobre essa correlação entre envelhecimento e obesidade, e

como o tecido adiposo branco e marrom se comportam nessas diferentes situações,

nesse estudo visamos justamente a caracterização do remodelamento do tecido

adiposo tanto branco quanto marrom durante o envelhecimento em camundongos

C57BL/6 fêmeas.

Foi possível observar que com o aumento da idade não só a massa corporal

dos animais se tornou maior, como os depósitos de tecido adiposo branco também,

levando a uma redistribuição do depósito subcutâneo para o visceral, uma

característica do processo de envelhecimento (Rogers e Smith, 2012). Este

fenômeno pode representar um risco a saúde, já que a localização dos adipócitos

determina as diferentes características metabólicas que estes possuem. Além disso,

esta distribuição da gordura é um grande indicador da saúde metabólica, sendo a

adiposidade visceral a que apresenta maior impacto sobre a deterioração da

sensibilidade à insulina e do perfil lipídico, podendo resultar em uma síndrome

metabólica, e pode contribuir também para o desenvolvimento de doença arterial

coronariana em indivíduos não-obesos (Varlamov, Bethea e Roberts, 2014; Filho et

al., Abril 2006). O aumento da massa de tecido adiposo visceral também exerce um

fator mecânico, aumentando a pressão intra-abdominal, que sobre os rins ativariam

o sistema renina-angiotensina-aldosterona, contribuindo para a elevação da pressão

arterial, além disso a expressão de marcadores inflamatórios é maior na gordura

visceral do que na subcutânea (Filho et al., Abril 2006).

Todas essas mudanças não estão relacionadas a uma maior ingestão de

ração, nem a uma possível menopausa dos animais. A análise morfométrica também

evidenciou esse remodelamento dos depósitos mostrando que não só a massa de

tecido aumentou como também o diâmetro dos adipócitos.

36

O tecido adiposo marrom, tem um papel fundamental no controle da

termogênese, e é justamente por isso que tem sido um grande alvo para promover a

perda de peso (Harms e Seale, 2013). No presente estudo, foi visto que o peso do

depósito de gordura marrom não teve alteração ao longo dos meses, mas

interessantemente o remodelamento começou já aos 6 meses de idade. A

correlação feita com a gordura branca mostrou que com o envelhecimento ele vai

sendo interposto por gordura branca, fato também visto em um estudo onde animais

de 3 meses de idade apresentavam numerosos adipócitos marrons residindo no

tecido adiposo subcutâneo e alta expressão de UCP-1, no entanto com 6 meses já

foi observado uma menor quantidade desses adipócitos e de expressão de UCP-1.

Já aos 12 meses de idade, o depósito ganha uma aparência uniformemente branca

e com níveis de UCP-1 bem abaixo dos animais de 3 meses (Rogers e Smith, 2012),

Também foi visto na análise morfométrica do presente estudo que a

porcentagem de área ocupada por vesículas lipídicas, assim como o tamanho

destas aumentou no tecido marrom, da mesma forma que o tamanho do adipócito

marrom. Isto mostra que com o envelhecimento, o tecido adiposo marrom começa a

apresentar algumas características vistas no tecido adiposo branco. Foi mostrado

que grande parte da atividade do tecido marrom induzida pelo frio é perdida com o

envelhecimento, e essas características começam a serem vistas quando o tecido

adiposo marrom não é ativado adrenergicamente. Neste contexto, suas

propriedades morfológicas e moleculares se tornam similares as da gordura branca

e sua quantidade e ativação metabólica se tornam inversamente relacionadas ao

envelhecimento e a obesidade (Ravussin e Galgani, 2011).

A obesidade é um dos principais problemas de saúde pública do mundo,

caracterizada por um aumento da massa corporal resultante de um maior número

(hiperplasia) e/ou tamanho (hipertrofia) dos adipócitos. Isto se desenvolve por um

desbalanceamento entre o consumo energético e seu gasto (Graja e Schulz, 2015),

em ambos os tecidos, tanto branco quando marrom. Foi visto que com o

envelhecimento, os adipócitos tendem a se tornar maiores e esse aumento está

associado com várias mudanças nas funções metabólicas e no perfil lipídico. Além

disso, o aumento dos adipócitos no tecido subcutâneo é um grande fator de risco

para o desenvolvimento de diabetes do tipo 2 (Cartwright, Tchkonia e Kirkland, 2007;

Skurk et al., 2007). Um estudo in vitro identificou que a expressão e liberação de

vários fatores como a leptina, por exemplo, depende do tamanho dos adipócitos, não

37

só em humanos como em roedores (Jernås et al., 2006). Essa secreção diferenciada

pode promover a inflamação no tecido adiposo, que é uma característica da

obesidade, onde o tecido está infiltrado por macrófagos ativados que liberam

quantidades excessivas de citocinas pró-inflamatórias, como o fator-α de necrose

tumoral e interleucina-6. Recentemente foi visto que esses fatores secretados

prejudicam a diferenciação das células adiposas em humanos (Queiroz et al., 2009).

Arner sugere que a ocorrência de hiperplasia ou hipertrofia não é influenciada pelo

sexo ou peso corporal, levando a crer que pode ocorrer de forma igualmente comum

tanto em homens quanto mulheres, magros, com excesso de peso ou obesos da

população, porém foi visto que indivíduos obesos apresentam um maior número de

adipócitos adicionados por ano em relação a indivíduos magros (Arner et al., 2010) .

Observando o aspecto bioquímico do estudo, interessantemente foi visto que

os animais de 12 meses tiveram uma redução da glicemia, se aproximando mais dos

valores geralmente esperados, fato que tem maior chance de ocorrer aos 24 meses,

e se manter em níveis regulares até os 12 meses. Os níveis de insulina podem

apresentar uma queda a partir dos 12 meses, porém foi visto uma tendência ao

aumento desse parâmetro. A fim de explorar melhor esses resultados, também foi

realizado o HOMA-IR onde era esperada uma diminuição desse índice indicando

uma maior sensibilidade à insulina, que poderia explicar a redução da glicemia como

normalmente é visto aos 12 meses, atingindo a maior sensibilidade aos 24 meses,

mas na realidade foi apresentado uma tendência ao aumento desse índice que

talvez com um maior tempo de estudo poderia resultar numa diferença significativa,

o teste de tolerância oral à glicose ajudou a confirmar a ausência de resistência à

insulina até esse momento do estudo, já que a curva glicêmica se comportou da

maneira esperada. Ainda a fim de complementar esses dados, o HOMA-B foi

calculado e indicou que as células B pancreáticas tiveram a sua função aumentada,

podendo talvez explicar a tendência ao aumento da insulina (Hemmeryckx et al.,

2010; Spinelli et al., 2012).

Já ao observar o perfil lipídico, os níveis de triglicerídeo do grupo de 12

meses demonstraram uma queda, levando a crer que esse triglicerídeo estava

sendo estocado em grande quantidade, o que corrobora com o aumento dos

depósitos de gordura e a hipertrofia dos adipócitos. O colesterol HDL mostrou

diminuição nos grupos finais comparados ao de 3 meses, enquanto o colesterol total

não apresentou diferença significativa entre os grupos estudados. Os ácidos graxos

38

livres (vindos da lipólise dos adipócitos da gordura visceral) que são liberados em

grande quantidade na circulação apresentam um papel importante no

desenvolvimento da resistência tecidual à insulina, não só no fígado como em

tecidos periféricos (Filho et al., Abril 2006).

Outro fato interessante de ser notado é que o declínio associado à idade da

habilidade de armazenamento de lipídeos pode contribuir para a redistribuição de

gordura em outros tecidos (Cartwright, Tchkonia e Kirkland, 2007). Como foi visto no

presente estudo, o peso do fígado não teve alteração, porém o triglicerídeo hepático

aumentou nos dois grupos finais quando comparados ao grupo de 3 meses.

Esperava-se que com o aumento do triglicerídeo poderia também existir um

aumento do peso do fígado. Uma possível explicação para que isso não tenha

ocorrido é que pode ter havido morte celular, contrabalanceando o ganho de peso

que o triglicerídeo poderia ter acarretado. A gordura visceral vem sendo vista como o

principal fator para o depósito de gordura no fígado (Filho et al., Abril 2006),

podendo explicar o aumento observado.

39

7 CONCLUSÃO

O envelhecimento per si remodela os depósitos de gordura branca e marrom

em camundongos C57Bl/6 fêmeas, aumenta a adiposidade visceral e altera a

distribuição de gordura corporal. A partir dos dados obtidos, a hipótese inicial do

estudo de que o envelhecimento favorece uma maior deposição de tecido adiposo

branco é confirmada, uma vez que foi observado um aumento claro em todos os

depósitos de gordura branca estudados. Além disso, há acúmulo de triglicerídeos no

fígado, além de haver proporcionalmente menos gordura marrom. A quantificação da

gordura marrom demonstrou adipócitos marrom hipertrofiados e com maior

proporção de gotículas lipídicas em seu interior, mostrando assim que o tecido

adiposo sofre uma série de modificações durante o envelhecimento. Pela grande

capacidade que esse tecido possui de corrigir e influenciar desvios metabólicos, seu

estudo aprofundado se faz cada vez mais importante para auxiliar no combate a

obesidade e outras patologias associadas a degradação do metabolismo,

promovendo assim saúde e bem-estar a população.

40

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Serviço Público Federal

Universidade Federal Fluminense Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação

Comissão de Ética no Uso de Animais

Certificamos que o projeto n° 446, intitulado “Alterações morfológicas e

moleculares do tecido adiposo branco e marrom em camundongos C57Bl/6 durante

o envelhecimento”, sob a orientação da Profª. Drª. Caroline Fernandes dos Santos

do Polo Universitário de Nova Friburgo, está de acordo com os Princípios Éticos na

Experimentação Animal da SBCAL e obteve a aprovação da Comissão de Ética no

Uso de Animais em 13 de março de 2014. A quantidade total de animais aprovada

pela CEUA para este projeto foi de 64 (sessenta e quatro) camundongos, e este

certificado é válido por três anos após sua aprovação.

Niterói, 13 de março de 2014.

_________________________________________

Prof. Dr. Fabio Otero Ascoli

Coordenador da CEUA

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE LEIDYANNE … · A massa de tecido adiposo aumenta durante a meia...

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