UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE UFF FACULDADE DE … Mara Fernandes... · A equipe do Controle de...

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A

PRODUTOS PARA SAÚDE – PPG-CAPS

MARA FERNANDES RIBEIRO

ESTUDO DAS ATIVIDADES DO VENENO DA ARANHA

MARROM (LOXOSCELES INTERMEDIA)

Niterói

2014


AÇÃO DO VENENO DA ARANHA MARROM (LOXOSCELES

INTERMEDIA) EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a

Saúde da Universidade Federal Fluminense, como

Requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre.

Área de concentração: Interdisciplinar.

Orientadora: Profa. Dra. Sabrina Calil Elias – UFF

Niterói

2014


AÇÃO DO VENENO DA ARANHA MARROM (LOXOSCELES

INTERMEDIA) EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a

Saúde da Universidade Federal Fluminense, como

Requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre.

Área de concentração: Interdisciplinar.

Apresentada em 22 de julho de 2014

BANCA EXAMINADORA

Dra. Sabrina Calil-Elias – UFF

Orientadora

Dr. Paulo de Assis Melo – UFRJ

Dr. Luis Eduardo Menezes Quintas – UFRJ

Niterói

2014

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, aos meus irmãos, ao meu marido

Felipe, aos amigos do Instituto Vital Brazil e do

Laboratório de Farmacologia da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal Fluminense.

AGRADECIMENTOS

A Deus por sempre me conceder momentos de paz e serenidade, me guiando e me protegendo.

Ao meu pai Marco Antônio e a minha mãe Terezinha pelo amor, pelo incentivo e por todo o esforço

para que eu estudasse e buscasse meus maiores sonhos.

A minha irmã Milla, ao meu cunhado Rodrigo, a minha sobrinha Sara, ao meu irmão Milton, a minha

cunhada Bruna, a minha sogra Rosa e ao meu sogro Ademir, por me amarem tanto e por depositarem

tanta confiança em mim.

Ao meu marido príncipe Felipe, por todo amor, carinho, respeito e contribuição para o

desenvolvimento deste trabalho. Obrigada pelo constante incentivo, pelo exemplo e por me fazer

acreditar que eu podia fazer sempre melhor.

A minha orientadora Profa. Dra. Sabrina Calil-Elias, pela confiança e por ter me dado a

oportunidade de crescer na carreira científica. Obrigada por todo o ensinamento e dedicação a este

trabalho.

Ao meu orientador do Instituto Vital Brazil, Prof. Cláudio Maurício Vieira Souza. Obrigada por todos

os ensinamentos e pela intensa colaboração e contribuição para a realização deste trabalho.

As minhas chefes amigas do Instituto Vital Brazil, Celina e Isabela, pelo apoio, pela paciência, pelos

ensinamentos e por acreditarem sempre no meu potencial.

A equipe do Controle de Qualidade Físico-Químico do Instituto Vital Brazil pela amizade,

cumplicidade e enorme contribuição para meu crescimento profissional, em especial as amigas Aline,

Haline e Iara por “preencherem” a minha ausência e compartilharem comigo a expectativa dos

resultados a cada experimento.

A equipe do Aracnário do Instituto Vital Brazil pela enorme contribuição, paciência e dedicação,

essenciais para o desenvolvimento deste trabalho. Em especial Priscila e Sílvio, por participarem de

cada experimento, e Bianca, Jonathan, Robson, Thainá e Valmir por contribuírem no manejo e

cuidados com animais, reagentes e materiais necessários ao trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Farmacologia da Faculdade de Farmácia (UFF) pela amizade, pelo

constante aprendizado e por me ensinarem a importância de se trabalhar em equipe. Meu muito

obrigada especialmente para: Angélica, Artur, Gersica, Juliana, Mayara, Paula, Rafaela, Tainá,

Tarciana, Thaisa, Thiago e William.

A Profa. Dra. Carla Valéria Guilarducci Ferraz pelos ensinamentos, pela dedicação e intensa revisão

desta dissertação.

Ao Prof. Dr. Paulo de Assis Melo por aceitar o convite de participar desta banca de defesa de

mestrado e por colaborar na execução dos experimentos, para isso agradeço em especial ao seu

aluno Marcos Monteiro Machado pela enorme colaboração com este trabalho.

Ao Prof. Dr. Luis Eduardo Menezes Quintas por aceitar o convite de participar desta banca de defesa

de mestrado e contribuir para o desenvolvimento deste trabalho.

A Universidade Federal Fluminense, em especial a Faculdade de Farmácia, por oferecer um estudo

gratuito e de qualidade, e por contribuir para minha formação acadêmica.

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original”

Albert Einstein

RESUMO

Os acidentes causados por aranhas do gênero Loxosceles representam importante problema de

saúde pública no Brasil, sendo as principais espécies de importância médica L. intermedia, L.

laeta e L. gaucho. O veneno dessas aranhas promove grave dermonecrose no local da picada,

e menos comumente, doença sistêmica que pode ser fatal. O mecanismo de ação desse veneno

não está completamente elucidado, trata-se de um processo multifatorial, que envolve a ação

direta do veneno sobre os tecidos e a resposta do organismo a agressão causada pelo mesmo.

Os camundongos constituem o modelo experimental menos susceptível ao desenvolvimento

dos efeitos locais decorrentes do envenenamento por aranhas Loxosceles, dessa forma, sua

utilização representa grande interesse clínico, cujo objetivo é desvendar tal mecanismo de

proteção presente nestes animais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar as atividades

do veneno de Loxosceles intermedia, bem como avaliar as atividades in vivo deste veneno em

camundongos. A manipulação e os procedimentos com os animais obedeceram aos princípios

da CEUA/UFF (Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense).

Foi demonstrado, in vitro, que o veneno de L. intermedia não apresenta atividade

fosfolipásica A2, a atividade hialuronidásica e colágenásica foram dependente da

concentração do veneno enquanto que a atividade proteolítica e esfingomielinásica foram

observadas apenas em altas concentrações. Para descrever as ações do veneno de L.

intermedia em camundongos, foi proposta a utilização de três diferentes linhagens: BALB/c,

C57BL/6 e Suiço. A atividade edematogênica na pata dos camundongos inoculados com o

veneno foi observada para as três linhagens testadas, sendo persistente por 24 horas, apenas

para as linhagens BALB/c e C57BL/6. A análise histopatológica do local de inoculação

intradérmica do veneno no abdomen apresentou diferenças relevantes, como, intensa

congestão vascular em Suiços e presença de infiltrado inflamatório no local de inoculação na

pele de BALB/c e C57BL/6. A partir destes achados, investigou-se a mobilização de células

inflamatórias a partir da medula óssea, no baço e no sangue por citometria de fluxo, que

demonstrou resposta imunológica inata típica, com aumento da cinética de células mieloides e

linfócitos T citotóxicos para camundongos C57BL/6, e resposta tipicamente

adquirida/humoral, com aumento preferencial de linfócitos B convencionais e T auxiliar para

camundongos BALB/c. Desta forma, este trabalho demonstrou que modelos animais

semelhantes podem apresentar diferentes respostas a inoculação deste veneno. A presença do

infiltrado inflamatório no local de inoculação do veneno e a mobilização de células

inflamatórias a partir da medula óssea, baço e sangue revelaram que diferentes linhagens de

camundongos apresentam diferenças no tipo celular envolvido na resposta imunológica

decorrente do envenenamento ou esta diferença pode estar relacionada ao tempo e velocidade

da resposta em cada linhagem de camundongos. A partir destes resultados este trabalho

sugere que camundongos da linhagem BALB/c podem ser utilizados como modelo para

estudar a produção de IgM e IgG induzido pelo veneno, incluindo análise de citocinas,

quimiocinas e mecanismos moleculares, por outro lado camundongos C57BL/6 podem ser

utilizados para descrever a participação de células mielóides durante o envenenamento por

aranhas do gênero Loxosceles.

Palavras-chave: Loxosceles intermedia; Camundongos; Pele; Infiltrado inflamatório.

ABSTRACT

Accidents caused by spiders of the genus Loxosceles represent an important public health

problem in Brazil, being the major species of medical importance L. intermedia, L. laeta and

L. gaucho. The venom of these spiders induces an intense dermonecrosis at the bite site, and

less commonly, systemic disease that can be fatal. The mechanism of action of this venom is

not fully elucidated, it is a multifactorial process, which involves the direct action of the

venom on the tissues and the body's response to aggression caused by it. The mice are an

experimental model less susceptible to development the local effects of poisoning Loxosceles

spiders. Thus, their use is great clinical interest, whose goal is to unravel the mechanism of

this protection in these animals. This study aimed to characterize the activities of Loxosceles

intermedia venom, as well as evaluating the in vivo activity of this venom in mice.

Manipulation and procedures with animals obeyed the principles of CEUA / UFF (Ethics

Committee on Animal Use Universidade Federal Fluminense). It has been shown in vitro that

the venom of L. intermedia shows no phospholipase A2 activity and the hyaluronidase and

collagenase were dependent on the concentration of the poison and while the proteolytic and

sphingomyelinase activity were observed only at high concentrations. To describe the actions

of the venom of L. intermedia in mice, it was proposed to use three different strains: BALB/c,

C57BL/6 and Swiss. The activity in the paw edema of mice inoculated with the venom was

observed for the three strains tested, being persistent for 24 hours, only for the strains

BALB/c and C57BL/6. Histopathological analysis of the site of venom intradermal

inoculation in the abdomen showed significant differences, as intense vascular congestion in

Swiss and inflammatory infiltration at the site of inoculation in the skin of BALB/c and

C57BL/6. From these findings, we investigated the mobilization of inflammatory cells from

the bone marrow, spleen like effector organ, and migration into the blood by flow cytometry,

which showed a typical innate immune response, with increased kinetics of myeloid cells and

cytotoxic T lymphocytes to C57BL/6 mice, and response typically acquired / humoral, with a

preferential increase of conventional B lymphocytes and T helper to BALB/c mice. Thus, this

study demonstrated that similar animal models may have different responses to inoculation of

this venom. The presence of the inflammatory infiltrate at the site of inoculation of the venom

and the mobilization of inflammatory cells from the bone marrow, spleen and blood revealed

that different strains of mice differ in cell type involved in the immune response resulting

from poisoning and this difference can be related time and speed of response for each strain of

mice. From these results, this study suggests that BALB/c mice can be used as a model to

study the production of IgM and IgG induced by the venom, including analysis of cytokines,

chemokines and molecular mechanisms, on the other hand C57BL/6 mice can be used to

describe the involvement of myeloid cells during poisoning by spiders of the genus

Loxosceles.

Keywords: Loxosceles intermedia; mice; skin; Inflammatory infiltrate.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO, p.14

1.1 As aranhas do gênero Loxosceles: biologia e distribuição, p.14

1.2 Caracterização do veneno das aranhas Loxosceles, p.18

1.3 Loxoscelismo humano: Aspectos clínicos, p.19

1.4 Modelo experimental, p.22

2. OBJETIVOS, p.28

2.1 Objetivos Gerais, p.28

2.2 Objetivos Específicos, p.28

3. MATERIAIS E MÉTODOS, p.29

3.1 Materiais, p.29

3.2 Extração do veneno de Loxosceles intermédia, p.29

3.3 Caracterização do veneno das aranhas Loxosceles intermédia, p.30

3.3.1 DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD, P.30

3.3.2 ENSAIOS IN VITRO DAS ATIVIDADES DO VENENO, P.31

3.3.2.1 Atividade Fosfolipásica, p.31

3.3.2.2 Atividade Hialuronidásica, p.31

3.3.2.3 Atividade Proteolítica, p.32

3.3.2.4 Atividade Colagenásica, p.33

3.3.2.4 Atividade Esfingomielinásica, p.33

3.4 Efeitos do veneno das aranhas Loxosceles intermedia em camundongos, p.34

3.4.1 ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA, p.34

3.4.2 AÇÃO LOCAL, p.35

3.4.2.1 Processamento Histológico, p.35

3.5 Mobilização de Leucócitos, p.36

3.5.1 ANÁLISES POR CITOMETRIA DE FLUXO, p.36

3.5.1.1 Obtenção das amostras, p.36

3.5.1.2 Preparo da Suspensão Celular, p.37

3.5.1.3 Ajuste do Citômetro, Aquisição e Análise de dados, p.37

3.5.2 ANÁLISE DIFERENCIAL NO SANGUE, p.38

3.6 Análise Estatística, p.38

4. RESULTADOS, p.39

4.1 Caracterização do veneno das aranhas Loxosceles intermédia, p.39

4.1.1 DOSAGEM DE PROTEÍNAS DO VENENO, p.39

4.1.2 ENSAIOS IN VITRO DAS ATIVIDADES DO VENENO, p.42

4.1.2.1 Atividade Fosfolipásica, p.42

4.1.2.2 Atividade Hialuronidásica, p.42

4.1.2.3 Atividade Proteolítica, p.43

4.1.2.4 Atividade Colagenásica, p.44

4.1.2.4 Atividade Esfingomielinásica, p.45

4.3 Efeito do veneno das aranhas Loxosceles intermedia em camundongos, p.46

4.3.1 ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA, p.46

4.3.2 AÇÃO LOCAL, p.48

4.3.2.1 Análise Histológica da Pele, p.49

4.3.3 MOBILIZAÇÃO DE LEUCÓCITOS APÓS 24 HORAS, p.53

4.3.3.1 Celularidade, p.53

4.3.3.2 Contagem de Leucócitos no sangue, p.55

4.3.3.2.1 Células Mielóides, p.55

4.3.3.2.2 Linfócitos T, p.57 4.3.3.2.3 Linfócitos B, p.59

4.3.3.2.4 Lâminas de Sangue, p.61

4.3.3.3 Contagem de Leucócitos na Medula Óssea, p.62


4.3.3.2.2 Linfócitos T, p.64

4.3.3.2.3 Linfócitos B, p.66

4.3.3.4 Contagem de Leucócitos do Baço, p.68


4.3.3.2.2 Linfócitos T, p.70

4.3.3.2.3 Linfócitos B, p.72

5. DISCUSSÃO, p.75

6. CONCLUSÃO, p.82

REFERÊNCIAS, p.83

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Tabela 1. Notificações de ocorrência segundo o tipo de aranha, em alguns municípios do

Estado do Rio de Janeiro, no período compreendido entre 2007 e 2012, p.15

Figura 1. Morfologia externa da aranha marrom, p.16

Figura 2. Técnica de extração do veneno da aranha L.intermedia, p.30

Tabela 2. Dosagem de proteínas do veneno de aranhas Loxosceles intermedia em extrações

consecutivas, p.40

Tabela 3. Dosagem de proteínas do veneno de 6 diferentes aranhas Loxosceles intermedia,

p.40

Figura 3. Correlação linear entre o peso da aranha e a quantidade de veneno extraída, p.41

Figura 4. Avaliação da atividade fosfolipásica do veneno da aranha Loxosceles intermedia,

p.42

Figura 5. Avaliação da atividade hialuronidásica do veneno das aranhas Loxosceles

intermedia, p.43

Figura 6. Avaliação da atividade proteolítica do veneno das aranhas Loxosceles intermedia,

p.44

Figura 7. Avaliação da atividade colagenásica do veneno das aranhas Loxosceles intermedia,

p.45

Figura 8. Avaliação da atividade esfingomielinásica do veneno das aranhas Loxosceles

intermedia, p.46

Figura 9. Efeito edematogênico na pata de camundongos inoculados com veneno de

Loxosceles intermedia, p.47

Figura 10. Sobrevida de camundongos inoculados com 1,2 µg/g de veneno de Loxosceles

intermedia na pata, p.48

Figura 11. Efeito da inoculação de veneno das aranhas Loxosceles intermedia (1,2 μg/g) no

ventre, p.48

Figura 12. Cortes transversais da pele de camundongos da linhagem BALB/c 24h após a

inoculação do veneno da aranha L. intermedia na região ventral, p.50

Figura 13. Cortes transversais da pele de camundongos da linhagem C57BL/6 24h após a


Figura 14. Cortes transversais da pele de camundongos da linhagem Suiço 24h após a


Figura 15. Celularidade no sangue, medula óssea e baço de camundongos inoculados com

veneno da aranha Loxosceles intermedia, p.54

Figura 16. Quantificação de células mieloides no sangue de camundongos inoculados com


Figura 17. Quantificação de linfócitos T no sangue de camundongos inoculados com veneno

da aranha Loxosceles intermedia, p.58

Figura 18. Quantificação de linfócitos B no sangue de camundongos inoculados com veneno

da aranha Loxosceles intermedia, p.60

Figura 19. Análise do esfregaço sanguíneo de camundongos inoculados com veneno da

aranha Loxosceles intermedia, p.61

Figura 20. Quantificação de células mieloides na medula óssea de camundongos inoculados

com veneno da aranha Loxosceles intermedia, p.63

Figura 21. Quantificação de linfócitos T na medula óssea de camundongos inoculados com


Figura 22. Quantificação de linfócitos B na medula óssea de camundongos inoculados com


Figura 23. Quantificação de células mieloides no baço de camundongos inoculados com


Figura 24. Quantificação de linfócitos T no baço de camundongos inoculados com veneno da


Figura 25. Quantificação de linfócitos B no baço de camundongos inoculados com veneno da


Figura 26. Diferenciação de linfócitos B no baço de camundongos C57BL/6 inoculados com


LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ACK - Cloreto de potássio e amônio

APC - Aloficocianina

CaCl2 - Cloreto de Cálcio

CD4 - Cluster of differentiation 4






CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

FITC - Isotiocinato de Fluoresceína

FSC - Forward Scatter

H2O2 - Peróxido de Hidrogênio

IgG - Imunoglobulina G

IgM - Imunoglobulina M

IL-1β - Interleucina 1 beta

IL-6 - Interleucina 6

IVB - Instituto Vital Brazil

KC - Quimioatraente de queratinócitos

KCl - Cloreto de Potássio

LTB4 - Leucotrieno B4

MCP-1 - Proteína quimioatrente de monócitos

MgCl2 - Cloreto de Magnésio

NaCl - Cloreto de Sódio

NaH2PO4 - Fosfato de Sódio monobásico

NaOH - Hidróxido de Sódio

OMS - Organização Mundial da Saúde

PE - Ficoeritrina

PERCP - Proteína Peridina Clorofila

pH - Potencial Hidrogeniônico

PSS - Solução Salina Fisiológica

SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SSC - Side Scatter

TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa

Tris-HCl - Trisaminometano hidrocloreto

TXB2 - Tromboxano B2

UFF - Universidade Federal Fluminense

UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro

14

1. INTRODUÇÃO

1.1 As aranhas do gênero Loxosceles: biologia e distribuição

A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera apenas quatro gêneros de aranhas

(Latrodectus, Phoneutria, Atrax e Loxosceles) com espécies que podem causar

envenenamento grave no ser humano. As aranhas do gênero Loxosceles, comumente

denominadas “aranha marrom”, são encontradas no Brasil em oito espécies diferentes:

Loxosceles similis, Loxosceles amazonica, Loxosceles puortoi, Loxosceles hirsuta, Loxosceles

adelaida, Loxosceles gaucho e Loxosceles laeta e Loxosceles intermedia (CARDOSO et al.,

2003; MARQUES-DA-SILVA e FISCHER, 2005). Dentre os acidentes por aranhas no Brasil,

notificados ao Ministério da Saúde no período de 2007 a 2012, cerca de 43% destes foram

atribuídos as aranhas do gênero Loxosceles, sendo Loxosceles gaucho, Loxosceles laeta e

Loxosceles intermedia as principais espécies (CARDOSO et al., 2003; SINAN, 2012).

No Estado do Rio de Janeiro os acidentes por aranhas apresentam baixa incidência de

notificação (SINAN 2012). Acredita-se que a ocorrência de acidentes não corresponda a

quantidade de notificações, e ainda que casos notificados não forneçam todas as informações

sobre a aranha responsável pelo acidente. Por exemplo, no munícipio de Petrópolis no período

compreendido entre os anos de 2007 e 2012 foram registrados 502 acidentes por aranhas,

sendo que destes, 456 não tiveram o agente responsável devidamente identificado (Tabela 1).

Dentre os municípios que apresentam o maior número de acidentes, Nova Friburgo se destaca

com o maior número de acidentes por aranhas do gênero Loxosceles (Tabela 1).

As possíveis explicações para a ineficácia na identificação das aranhas, responsáveis

pelos acidentes registrados, estão baseadas no fato da pessoa acidentada não se preocupar em

capturar o animal peçonhento, ou ainda na falta de preparo técnico dos profissionais de saúde

em identificar este animal. Em ambos os casos, o maior acesso a informação sobre acidentes

por animais peçonhentos, sobretudo por aranhas, poderia contribuir para a eficiência dos

sistemas de notificação. Isto seria de extrema importância na prevenção, sobretudo, dos locais

de maior ocorrência de determinadas aranhas, possibilitando o melhor atendimento e proteção

a vida do acidentado. Enquanto isto não ocorre, os acidentes por aranhas continuam sendo

15

negligenciados por parte das autoridades sanitárias e governamentais, mesmo com registro

que chega a 115 acidentes por mês nos últimos cinco anos de notificação, apenas no Estado

do Rio de Janeiro (SINAN, 2012).

Tabela 1. Notificações de ocorrência de acidentes segundo o tipo de aranha, em alguns municípios do Estado do

Rio de Janeiro, no periodo compreendido entre 2007 e 2012 (SINAN, 2012).

Município de

Ocorrência

Casos

Ignorados

Phoneutria Loxosceles Latrodectus Outra

espécie

Total

Angra dos Reis 309 2 0 0 5 316

Araruama 68 1 1 0 1 71

Areal 161 3 7 0 7 178

Barra do Piraí 126 1 0 0 2 129

Barra Mansa 167 2 4 0 1 174

Bom Jardim 83 22 1 0 0 106

Magé 117 1 2 0 0 120

Niterói 38 0 0 0 0 38

Nova Friburgo 277 13 69 1 2 362

Paraíba do Sul 116 8 7 1 2 134

Parati 350 9 5 0 6 370

Petrópolis 456 25 11 0 10 502

Pinheiral 175 3 1 0 9 188

Piraí 121 10 3 0 8 142

Resende 67 7 5 0 2 81

Rio das Flores 171 3 6 0 3 183

Rio de Janeiro 574 11 28 0 11 624

São Fidélis 77 1 5 1 5 89

Teresópolis 194 26 4 0 6 230

Três Rios 87 0 2 0 0 89

Valença 91 1 2 0 5 99

Vassouras 69 6 1 0 3 79

Volta Redonda 133 6 6 1 6 152

Total 6382 210 199 6 136 6933

As aranhas do gênero Loxosceles são aranhas pequenas de 1 cm de corpo e até 5 cm de

comprimento total, com colorido marrom acinzentado (Figura 1A). Caracterizam-se pela

presença de seis olhos dispostos aos pares e de cor branca. Tem o corpo dividido em duas

partes: abdome (ou opistossoma) e cefalotórax (ou prossoma), com uma parte mais escura em

16

forma de violino na superfície dorsal (Figura 1B). O cefalotórax é baixo, não excedendo em

altura ao abdome e um par de quelíceras é soldado na base do cefalotórax, por onde é lançado

o veneno (Figura 1C). Tem hábitos noturnos vivendo em teias irregulares. Tem costume de

habitar fendas de barrancos, sob e juntos as raízes e cascas de árvores, em folhas caídas e

bambuzais. Sua característica criptozóica (preferência por viver em ambientes fechados)

favorece sua presença nas proximidades e dentro de residências, escondendo-se atrás de

móveis, no sótão, em garagens e porões, em entulho de telha e madeira. Não são aranhas

agressivas e picam somente quando pressionadas (WEN et al., 2009; CHAIM et al., 2011).

Fêmea Macho

Loxosceles intermedia

1 cm

Figura 1. Morfologia externa da aranha marrom adulta, Loxosceles intermedia (A); Formato de violino na

superfície dorsal do cefalotórax – seta, e seis olhos dispostos em pares formando um semicírculo – pontas de seta

(B); Veneno saindo das quelíceras na base do cefalotórax (C). Adaptado de CHAIM et al., 2011.

A ocorrência de aranhas do gênero Loxosceles no Brasil é registrada a partir de 1891

(KEYSERLING, 1891) e a primeira espécie nativa (Loxosceles similis) foi descrita por

Moenkhaus em 1898 (MOENKHAUS, 1898). Na América Latina, as aranhas do gênero

Loxosceles começaram a ser reconhecidas como de importância médica em 1937, quando

17

foram atribuídos a Loxosceles laeta casos de araneísmo cutâneo gangrenoso e hemolítico

ocorridos no Chile (MACCHIAVELLO, 1937). No Brasil, somente em 1954 as aranhas do

gênero Loxosceles foram imputadas como agente causador de acidente cutâneo necrótico

(ROSENFELD et al., 1957). Em 1988, implantou-se o sistema de notificações dos acidentes

araneídicos no Brasil. Desde então, observa-se que a maioria das notificações é proveniente

das Regiões Sul e Sudeste, sendo a maioria dos casos predominantes nos meses quentes do

ano (SINAN, 2012).

Desde a década de 90, os acidentes causados por aranhas do gênero Loxosceles são

considerados as formas mais importantes de araneísmo na América do Sul (WHITE et al.,

1995). Apesar da importância clínica deste acidente, menos de 50 % dos acidentados

registrados procuram atendimento médico em um período de até 12 horas após a picada

(SINAN, 2012). A picada geralmente ocorre no ambiente intradomiciliar, em circunstâncias

onde a aranha é comprimida contra o corpo do indivíduo, tais como ao vestir-se ou dormir.

Em consequência disso, o tronco e a região proximal dos membros são os segmentos do corpo

comumente acometidos (WEN et al., 2009).

É característica das aranhas a presença de glândulas de veneno associado as quelíceras.

Porém, nem todas são responsáveis por acidentes humanos graves, devido a diversos fatores

como: quantidade insuficiente de veneno injetado, quelíceras incapazes de perfurar a pele ou

pelo fato de habitarem locais pouco frequentados pelo homem (FOELIX, 2010). Devido ao

tamanho das quelíceras, as aranhas do gênero Loxosceles podem fazer somente pequenas

inoculações intradérmicas do seu veneno, mas quantidades ínfimas desse veneno são

suficientes para o desenvolvimento de edema e eritema no local da inoculação do veneno,

seguido de necrose do tecido. Na dependência da dose inoculada, o acidente pode restringir-se

a lesão local ou então evoluir para o envenenamento sistêmico, com febre, hemoglobinúria,

icterícia e falência renal, que pode determinar o óbito do paciente (FURLANETTO 1961;

MAJESKI e DURST 1976; CACY e MOLD 1999; FORKS 2000; DA SILVA et al. 2004;

WILSON et al. 2005; ISBISTER e FAN 2011).

18

1.2 Caracterização do veneno das aranhas Loxosceles

O veneno de aranhas do gênero Loxosceles é líquido, incolor e cristalino, formado por

uma mistura complexa de proteínas, glicoproteínas e peptídeos de baixo peso molecular, com

predomínio de toxinas com pesos moleculares que variam de 5 a 40 kDa (CHAIM et al.,

2011; GREMSKI et al., 2014).

A grande dificuldade em se trabalhar com o veneno de aranhas do gênero Loxosceles

está na mínima quantidade de veneno adquirido em cada processo de extração

(aproximadamente 20 a 200 microgramas de proteínas em poucos microlitros de veneno)

(SENFF-RIBEIRO et al., 2008). Para superar esta dificuldade, as extrações geralmente são

feitas em coleções de centenas ou milhares de aranhas e o veneno total mantido como único

estoque, liofilizado ou em solução (CHAIM et al., 2011). Outra técnica que vem sendo

bastante utilizada consiste na construção de uma biblioteca de DNA recombinante da glândula

de veneno das aranhas Loxosceles (CHAIM et al., 2011), a clonagem e a síntese de várias

toxinas recombinantes (RIBEIRO et al., 2007; APPEL et al., 2008) tem auxiliado na

elucidação dos mecanismos de ação do veneno destas aranhas.

Em relação à composição, o veneno loxoscélico é rico em proteases, fosfatase alcalina,

hialuronidases, fosfolipases, metaloproteases dentre outros componentes (TAMBOURGI et

al., 2000; BARBARO et al., 2005; DA SILVEIRA et al., 2007a; DA SILVEIRA et al., 2007b;

CHAIM et al., 2011). A atividade hialuronidásica atribuída ao veneno é considerada um dos

fatores responsáveis pelo espalhamento do veneno, fazendo com que a lesão dermonecrótica

se espalhe pela pele em sentido gravitacional (FUTRELL, 1992). A família das fosfolipases D

tem sido principalmente relacionada com a ocorrência de dermonecrose após a picada

(TAMBOURGI et al., 1998; KALAPOTHAKIS et al., 2007; APPEL et al., 2008). A

fosfolipase D é a molécula mais estudada do veneno, sendo referida na literatura como

esfingomielinase-D, devido a sua capacidade de hidrolisar a esfingomielina (TAMBOURGI et

al., 1998; DA SILVA et al., 2004; TAMBOURGI et al., 2005). O grande interesse nessa

proteína, em detrimento dos demais componentes do veneno, é devido à sua habilidade em

reproduzir efeitos necróticos do Loxoscelismo. Dentre as principais propriedades biológicas

descritas, pode-se destacar a ocorrência de dermonecrose no local da inoculação do veneno,

intensa resposta inflamatória com infiltração de neutrófilos e ativação do complemento,

19

hemólise, falência renal, toxicidade para diversos tipos de cultura de células e letalidade

animal (TAMBOURGI et al., 2005;APPEL et al., 2008; TAMBOURGI et al., 2010).

Ao longo dos últimos anos, muitas toxinas diferentes tiveram seu mecanismo de ação

descrito, tais toxinas podem ser relacionadas com a resposta inflamatória inicial, estimulando

a liberação de mediadores endógenos pró-inflamatórios que contribuem com a migração de

células inflamatórias e o consequente desenvolvimento da lesão (VEIGA et al., 2001;

ZANETTI et al., 2002; HOGAN et al., 2004). Toxinas deste veneno interagem com a

membrana celular, degradam componentes da matriz extracelular, induzem a ativação do

sistema complemento e o recrutamento de leucócitos polimorfonucleados e plaquetas, entre

outros eventos que contribuem para o estabelecimento da inflamação local (TAMBOURGI et

al., 1998; HOGAN et al., 2004; DA SILVA et al., 2004; NOWATZKI et al., 2010).

As toxinas dermonecróticas são compostas por complexa família de proteínas com

massa molecular semelhante, sendo sete isoformas identificadas com atividade fosfolipásica e

dermonecrótica (VUITIKA et al., 2013). Essas toxinas foram obtidas por meio de DNA

recombinante, empregando bibliotecas de cDNA montadas a partir da glândula da aranha da

espécie Loxosceles intermedia. Em particular, a toxina dermonecrótica recombinante

(LiRecDT1) apresenta estrutura tridimensional e atividade análoga a toxina dermonecrótica

selvagem (RIBEIRO et al., 2007). A maior parte dos efeitos tóxicos causados pelo veneno de

aranhas Loxosceles pode ser reproduzida experimentalmente através das toxinas

dermonecróticas (CHAIM et al., 2011).

1.3 Loxoscelismo humano: Aspectos clínicos

Loxoscelismo é a síndrome causada em humanos pela picada das aranhas do gênero

Loxosceles. O veneno dessas aranhas apresenta toxicidade variável, dependendo da espécie

responsável pelo acidente (BARBARO et al., 1996). Dentre as espécies de importância

médica, Loxosceles deserta, Loxosceles rufescens e Loxosceles arizonica são responsáveis por

lesões relativamente suaves (SAMS et al., 2001). Em geral, as espécies encontradas na

América do Sul apresentam alta incidência de eventos sistêmicos em humanos (SCHENONE

et al., 1989; RIBEIRO et al., 1990; SEZERINO et al., 1998; MALAQUE et al., 2002), sendo

20

o veneno da espécie Loxosceles intermedia relacionado a ocorrência de eventos clínicos mais

severos (BARBARO et al., 1996).

As manifestações clínicas do envenenamento loxoscélico caracterizam-se por

inflamação e dermonecrose no local da picada (HOGAN et al., 2004), embora em alguns

casos sejam observadas hemólises sistêmicas e falência renal aguda (ABDULKADER et al.,

2008). O mecanismo de ação desse veneno não está completamente elucidado, trata-se de um

processo multifatorial, que envolve a ação direta do veneno sobre os tecidos e a resposta do

organismo à agressão causada pelo mesmo. Acredita-se que a lesão dermonecrótica observada

seja decorrente de processo complexo inicialmente caracterizado pelo efeito direto do veneno

sobre componentes da membrana celular, da membrana basal e matriz extracelular

(GREMSKI et al., 2014). A interação inicial entre o veneno e os tecidos ativaria mecanismos

endógenos tais como: ativação do sistema complemento, migração e liberação de enzimas

proteolíticas pelos polimorfonucleados, agregação plaquetária, liberação de diversas citocinas

e quimiocinas, participação de enzimas hidrolíticas que contribuiriam para o aumento da

lesão, por meio de danos na microvascularização, perturbação do fluxo sanguíneo, indução de

edema e ação isquêmica (FUTRELL, 1992; TAMBOURGI et al., 1998; TAMBOURGI et al.,

2005). Isso levaria a degeneração celular e dano tecidual local. Por outro lado, a insuficiência

renal aguda seria resultado, entre outros fatores, da ação nefrotóxica e hemolítica do veneno

(WRIGHT et al., 1997).

O diagnóstico é fundamentalmente clínico-epidemiológico, contudo é realizado, na

maioria dos casos, quando o quadro clínico está instalado, além disso, poucos pacientes

capturam o agente causador do acidente (WEN et al., 2009). Como a picada é pouco dolorosa

e a lesão dermonecrótica é de progressão lenta, o tempo médio decorrido entre o acidente e o

primeiro atendimento médico varia de 12 a 48 horas e o desconhecimento por parte dos

profissionais da saúde das alterações induzidas pelo veneno tem contribuído para maior

retardo no diagnóstico (SEZERINO et al., 1998; HOGAN et al., 2004; SINAN, 2012).

Em casos confirmados de loxoscelismo, nas primeiras 6 horas surgem edema e eritema

no local da picada, que pode ser inicialmente interpretado como reação alérgica ou abscesso

em formação. Posteriormente, após cerca de 24 a 36 horas do acidente, a lesão evolui com

áreas equimóticas mescladas com palidez, cercada por eritema. Após cerca de 5 a 7 dias, a

21

lesão vai se delimitando até formar uma crosta necrótica seca, sendo incomum a presença de

infecção secundária. Após 2 a 3 semanas, a crosta necrótica se desprende deixando uma

úlcera. Além do quadro cutâneo, manifestações gerais inespecíficas como febre, mal estar,

fraqueza, náuseas e vômitos podem estar presentes na fase aguda (WEN et al., 2009). A

evolução do quadro clínico pode levar ao desenvolvimento da forma mais grave do

loxoscelismo, caracterizado pela hemólise intravascular associada a anemia aguda, icterícia

cutânea mucosa e hemoglobinúria em graus variáveis. Essas manifestações são observadas

mais frequentemente nos dois primeiros dias do acidente, mas podem ocorrer mais

tardiamente (WILSON et al., 2005). O óbito é raramente observado, mas pode ocorrer nos

casos em que o paciente evolui com insuficiência renal aguda (CACY e MOLD, 1999).

A terapêutica do loxoscelismo ainda é assunto controverso. Divergências quanto a

eficácia do soro antiaracnídico ou antiloxoscélico na neutralização dos efeitos locais fazem

que haja diferentes propostas terapêuticas (PAULI et al., 2006; PAULI et al., 2009). Além do

antiveneno, corticosteróides tem sido rotineiramente empregados no tratamento e a crosta

necrótica removida cirurgicamente após a sua delimitação (DELASOTTA et al., 2014). Sabe-

se que os primeiros danos teciduais ocorrem dentro de poucas horas após o envenenamento

(PAULI et al., 2009). Isto pode ser uma das causas que explicam a reduzida eficácia do

tratamento, inclusive da soroterapia, uma vez que a maioria dos pacientes procuram

atendimento médico após 12 horas do acidente (SINAN, 2012).

Devido às dificuldades na reversão dos efeitos desencadeados pelo veneno

loxoscélico, vários protocolos de tratamento têm sido propostos e testados. O mais aceito para

picada por aranha marrom é composto por dapsona, corticosteroide, antibióticos e soro

antiaracnídico ou antiloxoscélico. A dapsona, utilizada para o tratamento da hanseníase (e

várias formas de dermatite) é usada para limitar a migração e infiltração neutrofílica no local

da picada e por apresentar efeitos antimicrobianos (SWANSON e VETTER, 2005).

Corticosteróide é usado devido aos seus efeitos antiinflamatórios (DA SILVA et al., 2004).

Antibióticos são usados para prevenir infecções secundárias, ou como agentes quelantes para

inibir as proteínas do veneno (PAIXAO-CAVALCANTE et al., 2007). E o soro

antiaracnídico ou antiloxoscélico são os únicos tratamentos específicos para neutralizar a

atividade do veneno (PAULI et al., 2006; PAULI et al., 2009).

22

1.4 Modelo experimental

Os efeitos locais e sistêmicos do veneno das aranhas do gênero Loxosceles estão bem

descritos na literatura para coelhos, que constituem o melhor modelo experimental para

reprodução dos efeitos deste envenenamento observados em humanos (FURLANETTO,

1961; ELSTON et al., 2000; OSPEDAL et al., 2002; DA SILVA et al., 2003; TAVARES et

al., 2004; PAULI et al., 2009). Por outro lado,modelos murinos não desenvolvem lesão

dermonecrótica característica deste envenenamento, sendo utilizados apenas para análises de

eventos inflamatórios (BECKWITH et al., 1980; SUNDERKOTTER et al., 2001; BARBARO

et al., 2010).

Além de ser o melhor modelo animal para reprodução dos sinais de envenenamento, o

coelho é também o mais adequado para os ensaios de neutralização do veneno com os soros

antiaracnídico e antiloxoscélico. Em experimentos com neutralização in vivo, realizados com

injeções independentes de veneno de Loxosceles rufipes e soro na orelha de coelhos, foi

observada completa inibição da dermonecrose quando o antiveneno foi administrado

intravenosamente até 4 horas após a inoculação do veneno. Ainda, foi observada inibição

parcial até 8 horas depois, e redução da lesão dermonecrótica à metade do tamanho inicial

quando o antiveneno foi administrado até 16-24 horas (FURLANETTO, 1961). A redução

parcial da necrose em coelhos administrados com soro específico até 48 horas após o

envenenamento também foi observada, e pode ser atribuída a neutralização dos efeitos do

veneno responsáveis pelo desenvolvimento da necrose, porém sem inibição da reposta

inflamatória iniciada (PAULI et al., 2009). Dessa forma, o uso do soro específico contribui

para a recuperação do organismo submetido ao envenenamento, bem como reduz o tamanho

e, consequentemente, melhora a cicatrização da lesão gerada, sendo essencial sua

administração, mesmo que tardia.

A análise histológica da pele de coelhos, 24 horas após a administração do veneno de

Loxosceles gaucho, demonstra a presença maciça de leucócitos e plaquetas, hemorragia e

formação de trombos no local de inoculação do veneno (TAVARES et al., 2004). Sob tempos

de exposição prolongados, ocorre necrose das miofibrilas e infiltração de leucócitos no

músculo esquelético, sendo a destruição da integridade da epiderme e a necrose das fibras de

23

colágeno próximas a epiderme, sendo estes os últimos eventos observados durante o

desenvolvimento da lesão dermonecrótica em coelhos (GREMSKI et al., 2014).

A inoculação de veneno de Loxosceles reclusa induz a formação de vacúolos

subendoteliais e a deposição de fibrina e trombos intravascular (SMITH e MICKS 1970;

ELSTON et al. 2000). O veneno de Loxosceles intermedia desorganiza a membrana basal do

tecido conjuntivo e atua como potente agonista de células endoteliais, com espessamento

endotelial e vasodilatação, e ainda massivo acúmulo de leucócitos polimorfonucleados ao

redor dos vasos sanguíneos, o que ocorre dependendo do tempo e do local da picada (VEIGA

et al. 2001; ZANETTI et al. 2002). A exposição de células endoteliais, isoladas da aorta de

coelhos, às toxinas do veneno demonstrou alterações morfológicas tais como retração celular,

aumento da projeção de filopodos e perda da adesão a matriz extracelular (PALUDO et al.,

2006). Estes efeitos citotóxicos podem estar relacionados a ativação de plaquetas e a migração

de leucócitos, bem como a coagulação intravascular disseminada e ao aumento da

permeabilidade vascular (PALUDO et al., 2006; SENFF-RIBEIRO et al., 2008). Os

mecanismos envolvidos na atividade direta do veneno sobre as células endoteliais ainda não

estão completamente elucidados, sabe-se apenas que as toxinas do veneno se ligam a

superfície das células endoteliais e são internalizadas (NOWATZKI et al., 2010).

O veneno loxoscélico estimula a expressão de E-selectina e a liberação de grande

quantidade de interleucina-8 (IL-8), sendo esses marcadores responsáveis pela amplificação

da resposta inflamatória local e sistêmica do veneno (HOGAN et al., 2004). A IL-8 é uma

interleucina produzida por diferentes células relacionadas ao processo inflamatório

(monócitos, linfócitos, células do endotélio ou epitélio, fibroblastos) em resposta a diferentes

estímulos a fim de atuar como quimiotático e ativador de neutrófilos (MONTON et al., 1998).

As E-selectinas são glicoproteínas que aparecem nas células endoteliais após terem sido

ativadas por citocinas inflamatórias e, desta forma, participam do processo de adesão de

leucócitos ao endotélio vascular durante eventos iniciais que levam ao processo inflamatório,

inicialmente marcado pela migração de neutrófilos para o local da ocorrência de dano tecidual

(CEOLOTTO et al., 2014).

Alterações celulares ocorrem desde a medula óssea ao sangue periférico após a

exposição ao veneno de Loxosceles intermedia. Amostras de medula óssea e sangue periférico

24

de coelhos, colhidos antes do envenenamento, e em períodos que variaram de 4 horas a 30

dias após inoculação do veneno demonstram que a série vermelha não é afetada pelo veneno,

somente os eritroblastos apresentam decréscimo. Ainda, é possível observar depleção medular

de megacariócitos e trombocitopenia no sangue periférico, a qual está diretamente relacionada

aos achados histopatológicos, obtidos a partir de biópsias da pele dos coelhos. Outro achado

experimental, em coelhos submetidos ao envenenamento loxoscélico, consiste no aumento do

número de células mielóides na medula óssea, o que correlaciona-se significativamente com o

aumento no número de neutrófilos no sangue periférico (DA SILVA et al., 2003). A contagem

de células no sangue periférico através do hemograma, a função plaquetária, a coagulação

sanguínea e parâmetros bioquímicos dependentes do tempo de exposição também foram

estabelecidos em coelhos nos tempos 3, 24, 48, 72 e 120 horas após o envenenamento por

Loxosceles. Observou-se trombocitopenia e leucopenia inicial, seguida de aumento de

leucócitos, agregação plaquetária, fibrinogênio elevado e significativa diminuição do fator VII

da coagulação (TAVARES et al., 2004).

Dentre os eventos clínicos relacionados ao envenenamento por aranhas do gênero

Loxosceles a ocorrência de coagulação intravascular, causando oclusão de vênulas e arteríolas

em humanos e coelhos, adicionado a ocorrência de hipóxia tecidual (ZANETTI et al., 2002)

constitui um evento clínico preocupante. A coagulação intravascular também ocorre no

pulmão, fígado e rins quando o veneno atinge a circulação sistêmica (FUTRELL, 1992),

podendo evoluir para o óbito resultante de falência renal.

Em camundongos, as toxinas do veneno promovem danos no fígado, rins, coração e

sistema nervoso central com possível evolução para o óbito. Contudo, crises hemolíticas

descritas em humanos e coelhos após o envenenamento, não foram observadas em

camundongos inoculados com o veneno, inferindo que nestes animais, os efeitos sistêmicos,

em resposta ao veneno das aranhas do gênero Loxosceles, não envolve hemólise intravascular

disseminada (BABCOCK et al., 1981).

A atividade nefrotóxica direta do veneno de Loxosceles genus, em camundongos, foi

observada através das alterações nas estruturas glomerulares e tubulares. De modo geral, tanto

a porção medular quanto a cortical do tecido renal apresentam padrão difuso de citotoxicidade

e os animais testados apresentam concentração aumentada de uréia na urina (CHAIM et al.,

25

2006). Apesar do grande número de estudos realizados, os mecanismos envolvidos na

fisiopatologia do envenenamento e na ação específica do veneno, ainda não estão totalmente

elucidados (BECKWITH et al., 1980; BABCOCK et al., 1981; BABCOCK et al., 1986;

BARBARO et al., 1996; ABDULKADER et al., 2008; RATTMANN et al., 2008;

BARBARO et al., 2010).

O veneno das aranhas do gênero Loxosceles não induz dermonecrose em

camundongos (BABCOCK et al., 1981; FUTRELL, 1992), e a disponibilidade de

esfingomielina parece ser fator determinante para o desencadeamento ou não da

dermonecrose local entre as diferentes espécies de mamíferos (DOMINGOS et al., 2003). A

fim de comprovar a importância da esfingomielina para o desenvolvimento da lesão,

esfingomielina exógena foi utilizada, demonstrando que sua presença auxilia a retenção do

veneno no local da inoculação, evitando sua dispersão sistêmica, o que favorece a formação

da lesão local em camundongos, evitando o óbito precoce destes animais. A formação da

ferida na pele e a ocorrência de reação semelhante a um abscesso interno são resultados da

exacerbação da resposta inflamatória local decorrente da coadministração de esfingomielina e

veneno de Loxosceles gaucho por injeção intradérmica em camundongos, havendo maiores

níveis de veneno no local da inoculação (DOMINGOS et al., 2003). Estes resultados são

extremamente importantes para a compreensão do desenvolvimento da lesão dermonecrótica

em humanos. Em coelhos, como modelo experimental clássico, foi demonstrado que a extensa

inflamação dérmica está diretamente relacionada com a dispersão do veneno de Loxosceles

reclusa (GOMEZ et al., 2001).

Uma vez que o veneno das aranhas do gênero Loxosceles possui a enzima

esfingomielinase D (TAMBOURGI et al., 1998), que é capaz de clivar a esfingomielina em

colina e ceramida fosfato, a compreensão da importância destes substratos para o processo

inflamatório decorrente do envenenamento se faz necessário. As ceramidas são potentes

reguladores de vários processos biológicos, atuando na migração de neutrófilos, adesão

celular, fagocitose, liberação de mediadores inflamatórios e geração de espécies reativas de

oxigênio durante o processo inflamatório (BALLOU et al., 1996). Isso sugere que a ação do

veneno sobre a esfingomielina estimula o desenvolvimento da resposta inflamatória e a

migração de leucócitos, mantendo o veneno mais tempo no local da picada.

Histopatologicamente, o recrutamento de leucócitos é evento crucial para o início da resposta

26

imunológica contra as toxinas do veneno, sendo os neutrófilos as principais células

inflamatórias relacionadas ao desenvolvimento da lesão dermonecrótica (OSPEDAL et al.,

2002; BARBARO et al., 2010).

Coleman e colaboradores (1980) sugerem que a estrutura e o conteúdo de

esfingomielina na membrana celular varia entre as diferentes espécies animais, tendo sido

observadas diferenças funcionais em hemácias de diferentes espécies, correlacionadas com o

conteúdo de esfingomielina presente na membrana. Foi observado ainda, que a esfingomielina

presente em diversos tecidos de ratos e camundongos apresenta longa cadeia de ácido graxo

que não está presente na esfingomielina encontrada em humanos (BETTGER et al., 1998).

Embora muitos sintomas do envenenamento causado por aranhas Loxosceles estejam

bem caracterizados, em relação a formação da lesão dermonecrótica, várias perguntas visando

o entendimento dos mecanismos intracelulares envolvidos na reação imunológica aguda após

a picada ainda permanecem sem resposta. O envolvimento de mediadores pró-inflamatórios

clássicos como interleucina 1 beta (IL-1β), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), leucotrieno

B4 (LTB4) e tromboxano B2 (TXB2), não foi observado durante a resposta inflamatória ao

veneno de Loxosceles gaucho após inoculação na pata de camundongos, tendo sido observada

a liberação local de outros mediadores inflamatórios solúveis, tais como interleucina 6 (IL-6),

proteína quimioatrente de monócitos (MCP-1) e quimioatraente de queratinócitos (KC), sendo

estes mediadores responsáveis por desencadear a resposta inflamatória induzida por este

veneno (BARBARO et al., 2010).

O coelho como modelo de estudo clássico requer manejo diferencial e alto custo de

criação e manutenção. Visando simular os efeitos locais do envenenamento em modelos

experimentais murinos, a implantação subcutânea de esponjas em camundongos tem sido

usada, a fim de permitir a amplificação da resposta imunológica contra um corpo estranho,

que evolui com intensa granulação vascular. E assim vários componentes do tecido

subcutâneo podem ser analisados por parâmetros bioquímicos, funcionais e histológicos. A

inoculação do veneno de Loxosceles similis em camundongos implantados com esponja

permitiu a observação de eventos inflamatórios típicos, como infiltração neutrofílica, edema,

vasodilatação, hiperemia e severa hemorragia (PEREIRA et al., 2012; PEREIRA et al., 2014).

Desta forma, este modelo pode ser usado para o estudo das ações do veneno de Loxosceles em

27

camundongos, o que possibilita novo alvo de investigação, não apenas dos efeitos

inflamatórios do veneno, mas também dos mecanismos de injúria tecidual. A descrição da

patogênese do loxoscelismo cutâneo, utilizando o modelo implantado com esponjas

subcutâneas, permitiu ainda, observar a presença de trombos oclusivos, depleção celular,

degradação de fibras de colágeno, aumento do número de mastócitos e ocorrência de

degranulação em pequenos intervalos de tempo após a injeção do veneno (PEREIRA et al.,

2014).

Com base no que foi exposto, compreender o mecanismo de ação do veneno de

Loxosceles em diferentes animais se faz necessário, sobretudo a fim de demonstrar os

mecanismos diferenciais de ação quando se utiliza o camundongo como modelo experimental.

Os camundongos são referidos na literatura como o modelo menos susceptível ao

desenvolvimento dos efeitos locais decorrentes do envenenamento por aranhas Loxosceles

(MAJESKI e DURST, 1976; BECKWITH et al., 1980; BABCOCK et al., 1981; DOMINGOS

et al., 2003; BARBARO et al., 2010; PEREIRA et al., 2012; PEREIRA et al., 2014), dessa

forma, sua utilização representa grande interesse clínico, cujo objetivo é desvendar tal

mecanismo de proteção presente nestes animais.

28

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

Caracterizar a ação do veneno da aranha Loxosceles intermedia em camundongos.

2.2 Objetivos Específicos

Caracterização do veneno de Loxosceles intermedia:

Avaliar a atividade hialuronidásica in vitro

Avaliar a atividade proteolítica in vitro

Avaliar a atividade colagenásica in vitro

Avaliar a atividade fosfolipásica in vitro

Avaliar a atividade esfingomielinásica in vitro

Ação do veneno em camundongos:

Observar o desenvolvimento de edema durante 24 horas após a inoculação do

veneno de Loxosceles intermedia na pata de camundongos.

Caracterizar microscopicamente as alterações histopatológicas na pele 24 horas

após a inoculação intradérmica do veneno de Loxosceles intermedia em

camundongos.

Avaliar a mobilização de células inflamatórias através do sangue e a partir da

medula óssea e baço, após a inoculação do veneno de Loxosceles intermedia.

29

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

O veneno bruto da aranha Loxosceles intermedia foi extraído e cedido pelo Instituto

Vital Brazil (IVB-Niterói/RJ) em colaboração com o Prof. MSc Cláudio Maurício V. Souza, a

partir de um lote de aranhas capturadas naturalmente na cidade de Petrópolis/RJ. Os ensaios

in vitro da atividade do veneno foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Paulo A.

Melo do Laboratório de Farmacologia das Toxinas, localizado no Instituto de Ciências

Biomédicas, UFRJ. A análise por espectrofluorimetria foi realizada em colaboração com o

Prof. Dr. Ricardo Cassella do Instituto de Química, UFF. As análises por citometria de fluxo

foram realizadas em colaboração com o Prof. Dr. Felipe Leite de Oliveira do Laboratório de

Proliferação e Diferenciação Celular, localizado no Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ.

Todos os reagentes utilizados nos ensaios possuem grau analítico.

3.2 Extração do veneno de Loxosceles intermedia

A extração do veneno foi realizada através de procedimento padronizado pelo

aracnário do Instituto Vital Brazil, a saber: Primeiro aranhas fêmeas da espécie L. intermedia

foram mantidas em jejum por uma semana, após este período foram separadas para a extração

do veneno bruto; com auxílio de uma pinça, a aranha foi posicionada, sob a lupa, sendo uma

lâmina metálica inserida entre o lábio e a quelícera, a fim de evitar a contaminação do veneno

extraído com regurgitação gastroesofágica; em seguida, um capilar foi colocado sobre a

quelícera e a aranha recebeu uma eletroestimulação a 15 mV no cefalotórax. A partir deste

estímulo elétrico, o veneno foi lançado para dentro do capilar (Figura 2). Este capilar foi

colocado em solução salina fisiológica – PSS (NaCl 135 mMol; KCl 5 mMol; MgCl2 1

mMol; NaH2PO4 1 mMol) e, através de uma bomba de ar, o veneno foi expulso para dentro

desta solução.

30

Figura 2. Técnica de extração do veneno da aranha Loxosceles intermedia. CT: capilar; V: veneno; CH:

quelícera; VG: Glândula de veneno; E: Eletroestimulação; L: lábios; MF: lamínula. Fonte: Imagem cedida pelo

Aracnário – Instituto Vital Brazil.

3.3 Caracterização do veneno das aranhas Loxosceles intermedia

3.3.1 DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD

A dosagem de proteínas foi realizada a partir do Método de Bradford, 1976,

modificado. Para a preparação do reagente de Bradford, dissolveu-se 10 mg de Coomassie

Brilliant Blue G-250 em 5 mL de etanol 95 % e, em seguida, adicionou-se 10 mL de ácido

fosfórico 85 %. A solução foi avolumada para 100 mL com água destilada. Após filtração em

papel de filtro, a solução foi mantida em geladeira. As soluções-padrão diluídas foram

preparadas em tampão acetato de sódio 0,05 M em pH 4,8, adicionado de NaCl 0,15 M. O

tampão foi preparado titulando-se acetato de sódio 0,05 M com ácido acético até pH final de

4,8, e, em seguida, dissolveu-se o NaCl. A solução de albumina bovina foi então preparada

em NaCl 0,15M para concentração final de 1065 µg/mL, e a partir desta, foram preparadas

quatro diluições com as seguintes concentrações: 10,65 µg/mL; 26,63 µg/mL; 53,25 µg/mL;

79,88 µg/mL, para o estabelecimento da curva padrão de albumina utilizada para a dosagem

de proteínas do veneno. Em tubos de ensaio, 5 mL do reagente de Bradford foram misturados

a 0,1 mL de cada uma das diluições da solução de albumina. Em seguida, as respectivas

absorbâncias foram determinadas a 595 nm em espectrofotômetro, utilizando a solução

tampão acetato de sódio 0,05 M no lugar da solução padrão para o branco. Para a

determinação das absorbâncias das amostras de veneno também foi utilizado 0,1 mL da

diluição do veneno em tampão acetato de sódio 0,05 M, misturado a 5 mL do reagente de

Bradford.

31

3.3.2 ENSAIOS IN VITRO DAS ATIVIDADES DO VENENO

3.3.2.1 Atividade Fosfolipásica

A atividade fosfolipásica foi determinada através do método turbidimétrico adaptado

de Marinetti (1965). Utilizou-se como substrato uma suspensão de gema de ovo de galinha

que é rica em fosfatidilcolina. Para o preparo da solução estoque (SE), a gema de ovo fresca

foi separada da clara, coada e diluída em solução salina 0,9 % até o volume de 100 mL. A

partir da SE, foi preparada uma diluição a 20 % (v/v) chamada solução de trabalho (ST). A ST

foi diluída ou concentrada pela adição de solução salina 0,9% ou SE, respectivamente, de

forma que ao serem adicionados aos demais reagentes, obtenha-se leitura na faixa de

absorbância entre 0,600 – 0,700. Para tal avaliação realizou-se leitura a 925 nm de uma

amostra de 200 μL da ST e 800 μL de solução salina 0,9%. Para o preparo da solução de uso

(SU) foi adicionado 300 μL de ST, 20 μL de CaCl2 (0,5 M), 25 μL de taurocolato de sódio

(0,4%), 25 μL de tampão Tris-HCl (pH 7,5; 0,2 M) e 630 µL de solução salina 0,9% para o

volume final de 1,0 mL. A leitura foi realizada utilizando-se 180 μL da SU e 20 μL de solução

salina 0,9% (substrato). O volume correspondente ao veneno testado foi subtraído do volume

de solução salina para obtenção da concentração final. A reação ocorreu a 37 °C por 30

minutos, sendo as absorbâncias das soluções lidas em Elisa a 925 nm, através do software de

aquisição de dados “SoftmaxPro” nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos após a adição

do veneno. O veneno das aranhas L. intermedia foi utilizado na concentração de 100 µg/mL

(n=4) e como controle da reação foi utilizada a absorbância do próprio substrato. Os

resultados foram expressos como variação da absorbância das amostras contendo o veneno

em relação ao controle.

3.3.2.2 Atividade Hialuronidásica

A atividade hialuronidásica foi avaliada por turbidimetria através do método adaptado

de Di Ferrante (1956). O ácido hialurônico bovino foi utilizado como substrato (Fluka®, St.

Louis, EUA) para avaliar a degradação do mesmo através da diminuição da turbidez da

solução. O ácido hialurônico foi reconstituído com tampão acetato-ácido acético 0,2 M,

adicionado de NaCl 0,15 M, em pH 6,0 ajustado com solução de ácido acético glacial. O

32

equivalente a 50 µg/mL de ácido hialurônico foi adicionado a tubos plásticos e completado

com o tampão para o volume final de reação de 333,3 µL. O veneno de L. intermedia foi

utilizado em três diferentes concentrações, 10, 30 e 100 μg/mL (n=4/cada), sendo seus

volumes descontados do tampão. As soluções foram agitadas por 5 segundos e permaneceram

por 60 minutos em banho-maria a 37°C. Ao término, foi adicionado 666.7 µL de cetrimide

2,5 % e após 10 minutos em repouso a temperatura ambiente, realizou-se a leitura em

espectofotômetro a 400 nm. O tampão acetato-ácido acético foi utilizado como controle da

reação e os resultados expressos em função da variação da absorbância na presença do veneno

em relação ao controle.

3.3.2.3 Atividade Proteolítica

O estudo da atividade proteolítica foi realizado através do método adaptado por Garcia

e colaboradores (1978). O método consiste na digestão de azocaseína e leitura do grupamento

azo liberado para a solução, que gera coloração alaranjada. Uma solução de azocaseína 0,4 %

foi diluída em solução salina 0,9 % e NaOH 0,05 M (1:1). Em cada tubo de ensaio foi

adicionado 100 μL da solução de azocaseína a 0,4 %, 50 µL de tampão Tris-HCl (pH 7,5; 0,2

M), 4 μL de CaCl2 1M e água destilada em quantidade suficiente para volume final de 200

μL. O veneno da aranha L. intermedia foi utilizado em três diferentes concentrações, 10, 30 e

100 μg/mL (n=4/cada), sendo seus volumes descontados da água destilada. A reação ocorreu

durante 3 horas à temperatura de 37 ºC e foi interrompida pela adição de 100 µL de ácido

tricloroacético a 15%. Cada tubo de ensaio foi centrifugado a 5000 rpm, a 20 °C durante 5

minutos. Após esse processo, alíquotas de 150 µL do sobrenadante foram retiradas e, então,

adicionadas a 75 µL de NaOH 2 M. As leituras foram realizadas em ELISA a 420 nm, através

do software de aquisição de dados “SoftmaxPro”. Considerou-se como controle da reação a

leitura do substrato, correspondente à alíquota sem o veneno e os resultados foram expressos

como variação das absorbâncias registradas em relação ao controle.

33

3.3.2.4 Atividade Colagenásica

A avaliação da atividade colagenásica do veneno foi realizada pelo método

colorimétrico adaptado de Chavira e colaboradores (1984). Foi preparada uma solução 0,3 %

de colágeno impregnado com corante azo (Azocoll®, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA),

substrato que confere coloração lilás decorrente da sua degradação, e diluído em tampão Tris-

HCl (pH 7,5; 0,2 M) como diluente. Adicionou-se a cada tubo de ensaio 200 µL dessa solução

de Azocoll®, 4,4 µL de solução de CaCL2 a 1 M e água destilada em quantidade suficiente

para 220 µL. O veneno da aranha L. intermedia foi utilizado nas concentrações de 10, 30 e

100 µg/mL (n=4/cada), sendo seus volumes descontados da água destilada. Todos os tubos

foram mantidos a 37 °C por 3 horas e agitados levemente a cada 10 minutos. Ao término

desse período, cada tubo de ensaio foi centrifugado a 5000 rpm, a 20 °C durante 5 minutos.

Após esse processo, alíquotas de 170 µL do sobrenadante foram retiradas, e as leituras foram

realizadas em ELISA a 520 nm, através do software de aquisição de dados “SoftmaxPro”.

Considerou-se como controle da reação a leitura do substrato, correspondente à alíquota sem

o veneno e os resultados foram expressos em função da atividade colagenásica do veneno,

expressa pelo aumento da absorbância, em relação ao controle.

3.3.2.4 Atividade Esfingomielinásica

A atividade esfingomielinásica foi mensurada utilizando o kit Amplex Red (Molecular

Probes, Eugene, EUA). Neste ensaio, a atividade esfingomielinásica é monitorada usando 10-

acetil-3,7-dihidroxifenoxazine (reagente Amplex Red), reagente fluorogênico sensível para

H2O2. Primeiramente, a esfingomielinase hidrolisa a esfingomielina à ceramida-1-fosfato e

colina. A colina, por sua vez, é oxidada pela enzima colina oxidase à betaina e H2O2.

Finalmente, a H2O2, na presença da peroxidase reage com o Amplex Red

estequiometricamente (1:1), gerando um produto altamente fluorescente, o Resorufin (APPEL

et al., 2008). Para mensurar a atividade esfingomielinásica do veneno de Loxosceles

intermedia, este foi incubado com o Reagente Amplex Red, nas concentrações de 10, 30 e 100

μg/mL, à 37ºC por 30 minutos. Foi utilizada como controle positivo a enzima

esfingomielinase do próprio Kit, e como controle da reação apenas o Reagente Amplex Red

mais o tampão (0.5M Tris-HCl, 50 mM MgCl2, pH 7.4), ambos também à 37ºC por 30

34

minutos. A florescência foi mensurada em um espectrofluorímetro (Varian Cary Eclipse)

usando comprimento de onda de excitação em 570 nm e emissão em 590 nm.

3.4 Efeitos do veneno das aranhas Loxosceles intermedia em camundongos

O intrigante fato de modelos murinos não desenvolverem a lesão dermonecrótica

típica do envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles, estimulou o desenvolvimento

deste trabalho. A fim de investigar a razão para esta diferença na ação local do veneno, o

camundongo foi escolhido como modelo experimental. Para isso foram utilizados

camundongos de três linhagens diferentes: Suiço, BALB/c e C57BL/6, para verificar como

seria a resposta em modelos experimentais semelhantes, porém com características

morfológicas particulares. A manipulação e os procedimentos com os animais obedeceram

aos princípios da CEUA/UFF (Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade

Federal Fluminense). Os animais não receberam nenhum tipo de analgésico ou

antinflamatório após a administração do veneno. A razão para descartar o uso de analgésicos

opióides está baseada em dados da literatura (SEHGAL et al., 2011) que verificaram aumento

progressivo de receptores opióides periféricos durante a inflamação. Portanto, a administração

destas substâncias poderia interferir no resultado, pois o processo inflamatório se faz

fundamental para a avaliação dos mesmos.

3.4.1 ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA

Camundongos adultos machos de três diferentes linhagens, Suiços (n=4), BALB/c

(n=4) e C57BL/6 (n=4), pesando cerca de 25 ± 5 g, durante todo o experimento receberam

água e ração “ad libitum” e foram mantidos em ciclo de 12 horas claro-escuro à temperatura

de 22 ± 2 °C. Cada camundongo teve a pata esquerda inoculada por via intradérmica (ID)

com 100 µL de PSS (NaCl 135 mMol; KCl 5 mMol; MgCl2 1 mMol; NaH2PO4 1 mMol),

como controle do volume, e a pata direita inoculada por via ID com 1,2 µg/g de veneno de

Loxosceles intermedia em 100 µL de PSS. Cada camundongo inoculado teve as medidas da

altura e largura da pata, direita e esquerda, realizada antes da inoculação e nos seguintes

intervalos de tempo após a inoculação: 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas,

35

16 horas e 24 horas. Para tais medições foi utilizado paquímetro universal da marca

”Mitutoyo”. Os resultados foram expressos como área da pata em função do tempo.

3.4.2 AÇÃO LOCAL

Para avaliar as alterações histológicas decorrentes da inoculação do veneno de

Loxosceles intermedia na pele de camundongos, foram utilizados camundongos adultos

machos, pesando cerca de 25 ± 5 g. Durante todo o experimento receberam água e ração “ad

libitum” e foram mantidos em ciclo de 12 horas claro-escuro à temperatura de 22 ± 2 °C.

Foram testadas três diferentes linhagens de camundongos: Suiços (n=8), BALB/c (n=8) e

C57BL/6 (n=8). Cada linhagem foi dividida em dois grupos: O primeiro grupo recebeu 1,2

µg/g de veneno no ventre, por via intradérmica (ID), em 100µL de PSS (NaCl 135 mMol;

KCl 5 mMol; MgCl2 1 mMol; NaH2PO4 1 mMol). O segundo, grupo controle, recebeu

100µL de PSS por via ID no ventre. Após 24 horas, os animais foram eutanaziados com

sobredose de enflurano, e as peles dos animais do grupo veneno e do grupo controle foram

retiradas, sendo a área de inoculação cortada e processada para a análise histopatológica.

3.4.2.1 Processamento Histológico

As peles foram fixadas em solução de paraformaldeído à 10 % em tampão fosfato

(pH=7,4) por 48 horas, desidratadas em concentrações crescentes de álcool por 1 hora cada

passagem. Em seguida, incluídas em xilol (3 passagens de 1 hora), em parafina (dois banhos a

60ºC por 1 hora) e, emblocadas para obtenção de lâminas com cortes de 5 µm, coradas com

Hematoxilina-Eosina. As carcaças dos animais foram mantidas no freezer e posteriormente

recolhidas por equipe da Universidade Federal Fluminense para serem encaminhadas para a

firma de descarte.

36

3.5 Mobilização de Leucócitos

3.5.1 ANÁLISES POR CITOMETRIA DE FLUXO

3.5.1.1 Obtenção das amostras

Para avaliar a mobilização de leucócitos 24 horas após o envenenamento, foram

analisados sangue, baço e medula óssea de camundongos submetidos a inoculação do veneno

de Loxosceles intermedia. Para a obtenção do material, os camundongos das linhagens

BALB/c (n=6) e C57BL/6 (n=6), foram divididos em dois grupos experimentais, o primeiro

grupo recebeu 1,2 µg/g de veneno no ventre, por via intradérmica (ID), em 100µL de PSS

(NaCl 135 mMol; KCl 5 mMol; MgCl2 1 mMol; NaH2PO4 1 mMol) e o segundo, grupo

controle, recebeu 100µL de PSS por via ID no ventre. Os animais foram eutanaziados

conforme descrito anteriormente e passaram pelos procedimentos descritos abaixo:

Sangue – O sangue foi obtido através de punção intracardíaca, em seringa de 3mL

(22G-1) com heparina, para evitar a formação de coágulos. A quantidade de sangue extraída

foi de 1mL para cada animal. Posteriormente, as hemácias foram lisadas em solução

hipotônica ACK (Cloreto de potássio e amônio) durante 5 minutos e centrifugadas a 1200

rpm/5min. Em seguida, o precipitado celular foi centrifugado duas vezes em PSS (NaCl 135

mMol; KCl 5 mMol; MgCl2 1 mMol; NaH2PO4 1 mMol) e depois ressuspendido em 1 mL de

PSS. As células obtidas foram contadas em câmara de Neubauer.

Baço – O baço foi removido e mantido em meio de cultura DMEM (Dulbecco’s

Modified Eagle’s Medium). Posteriormente, o baço foi dissociado mecanicamente e a cápsula

removida. Em seguida, as hemácias foram lisadas em solução hipotônica ACK durante 5

minutos e centrifugadas a 1200 rpm/5min. Em seguida, o precipitado celular foi centrifugado

em PSS e depois ressuspendido em 1 mL de PSS (NaCl 135 mMol; KCl 5 mMol; MgCl2 1

mMol; NaH2PO4 1 mMol). As células obtidas foram contadas em câmara de Neubauer.

Medula Óssea (MO) – Um fêmur por animal foi removido e mantido em solução

salina. Imediatamente, as epífises do fêmur foram retiradas e a extração das células da medula

óssea foi realizada com o auxílio de uma seringa de 5 mL (22G-1), com 3 mL de meio de

37

cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) em seu interior. Posteriormente, a

medula óssea foi dissociada mecanicamente e a suspensão de células foi centrifugada a 1200

rpm/5min. Em seguida, o precipitado celular foi centrifugado em meio de cultura e depois

ressuspendido em 1 mL de PSS (NaCl 135 mMol; KCl 5 mMol; MgCl2 1 mMol; NaH2PO4 1

mMol). As células em suspensão foram contadas em câmara de Neubauer.

3.5.1.2 Preparo da Suspensão Celular

Para saturar os receptores Fc, todas as células foram incubadas com o bloqueador de

Fc (linhagem celular 2.4G2 - Banco de Células do Rio de Janeiro) por 15 minutos. Em

seguida, as células foram transferidas para uma placa de 96 poços, num volume máximo de

200 μL por poço. Então, centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos e o sobrenadante

desprezado. Os anticorpos monoclonais específicos foram adicionados em um volume de 40

μL, sendo previamente diluídos em PSS (1:400), e incubados por 30 minutos. Em seguida, a

placa foi novamente centrifugada, o sobrenadante desprezado e o precipitado celular

ressuspendido em 100 μL de PSS. As suspensões celulares foram então recolhidas em 400 μL

PSS, em tubos específicos de citometria para aquisição no citômetro. Os anticorpos

monoclonais utilizados são conjugados a moléculas fluorescentes, dessa maneira quando

encontram os antígenos de superfície celular se ligam e a molécula fluorescente é detectada

pelo citômetro. Para as marcações, os respectivos anticorpos foram utilizados: anti-Mac1,

anti-CD8 e anti-IgM FITC-conjugados; anti-CD19, anti-CD4 e anti-CD23 PE-conjugados;

anti-Gr1, anti-CD45 e anti-CD5 PERCP-conjugados; anti-B220 e anti-C-kit APC-conjugados

(todos sendo da BD Bioscience, CA/EUA).

3.5.1.3 Ajuste do Citômetro, Aquisição e Análise de dados

Previamente à leitura das amostras, o citômetro deve ser padronizado, para isso, foi

preparada uma amostra sem anticorpos (controle negativo), e outras quatro amostras contendo

células marcadas com apenas um dos anticorpos citados (FITC, PE, PERCP e APC). Estas

amostras são consideradas os controles, permitindo que se faça a retirada de interferência

entre as cores e também da auto-fluorescência das células. Primeiro foi feito o ajuste do

38

tamanho e densidade das células (Forward scatter - FSC x Side scatter - SSC) e depois, as

amostras marcadas com apenas um dos anticorpos foram analisadas para ajustar a

interferência de uma cor na outra. Os parâmetros de voltagem e amperagem também foram

estabelecidos e definidos para cada um dos experimentos. Após os ajustes feitos e com o

citômetro calibrado, o aparelho ainda foi ajustado de maneira a serem lidas apenas as células

desejadas – através da definição de uma região (gate) plotada no gráfico FSC x SSC. As

leituras das amostras foram realizadas em citômetro de fluxo (FACScalibur, BD Bioscience,

CA/EUA) utilizando o programa de aquisição “Cell Quest” e analisadas com auxílio do

programa de análises WinMDI 2.9.

3.5.2 ANÁLISE DIFERENCIAL NO SANGUE

Para análise diferencial de células foi feito esfregaço sanguíneo de camundongos das

duas linhagens selecionadas para estudo da mobilização de leucócitos, de todos os grupos

experimentais. As lâminas foram coradas pelo método de May-Grunwald e Giemsa.

3.6 Análise Estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão, e o teste t de Student utilizado para

análise contra dois grupos de dados. Para análise de vários grupos e em procedimentos temporais

foi utilizado ANOVA, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. Os valores de p < 0,05 foram

utilizados para indicar diferença significativa entre as médias. As regressões lineares foram

utilizadas para o delineamento das curvas.

39

4. RESULTADOS

4.1 Caracterização do veneno das aranhas Loxosceles intermedia

4.1.1 DOSAGEM DE PROTEÍNAS DO VENENO

A dosagem de proteínas do veneno teve por objetivo, permitir a padronização da dose

de veneno a ser utilizada. Desta forma, imediatamente após a extração do veneno das aranhas

Loxosceles intermedia o pool coletado em solução salina fisiológica (PSS) foi dosado

utilizando o Método de Bradford. A fim de avaliar se o método de extração utilizado preserva

a capacidade total de produção de veneno das aranhas, a coleta foi realizada, inicialmente,

com 200 aranhas e 30, 60 e 90 dias depois com as aranhas sobreviventes. Os resultados

apresentados demonstram que após a primeira extração, as aranhas não são capazes de

produzir a mesma quantidade de veneno com 30 dias de recuperação e que ao final de 4

extrações apenas 10 % das aranhas sobrevivem (Tabela 2). Ainda na tentativa de padronizar a

dose de veneno a ser utilizada, de acordo com o peso da aranha, realizou-se a extração de

veneno individual, utilizando-se seis aranhas de tamanhos e pesos diferentes (Tabela 3). Não

foi possível estabelecer relação entre peso da aranha e quantidade de proteína no veneno

liberado durante a extração. A quantidade de proteína liberada por cada aranha varia

independente de seu peso (Figura 3).

40

Tabela 2. Dosagem de proteínas do veneno de aranhas Loxosceles intermedia em extrações consecutivas.

Extração

(Dias)

Total Aranhas Dosagem

Proteínas (µg/mL)

Total Proteínas /

Aranha (µg)

0 200 5750,0 28,8

30 121 1020,5 8,4

60 40 316,2 7,9

90 23 204,6 8,9

Tabela 3. Dosagem de proteínas do veneno de 6 diferentes aranhas Loxosceles intermedia.

Aranha Peso (mg) Total Proteínas (µg)

1 285 148,95

2 221,4 72,715

3 274,5 83,765

4 314 178,45

5 351,4 97,575

6 203,4 97,6

41

150 200 250 300 350 4000

50

100

150

200

Peso da aranha (mg)

To

tal

Pro

teín

as (

ug

)

Number of XY Pairs 6

Pearson r 0,4364

95% confidence interval -0.5811 to 0.9216

P value (two-tailed) 0,3870

P value summary ns

Is the correlation significant?

(alpha=0.05) No

R squared 0,1904

Figura 3. Correlação linear entre o peso da aranha e a quantidade de veneno extraída. Não foi observada relação

direta entre o peso da aranha e a quantidade de proteína do veneno extraído (Prism 5).

42

4.1.2 ENSAIOS IN VITRO DAS ATIVIDADES DO VENENO

4.1.2.1 Atividade Fosfolipásica

O método escolhido para verificação da atividade fosfolipásica do veneno foi baseado

na atividade sobre um substrato rico em fosfatidilcolina, sobre o qual foi comprovada

atividade fosfolipásica A2 para outros venenos (STRAUCH et al., 2013; EL-KIK et al., 2013).

O veneno de Loxosceles intermedia, na concentração de 100 μg/mL, não apresentou atividade

fosfolipásica A2, uma vez que não foi observada qualquer redução do substrato do meio

reacional e diminuição da turbidez durante 30 minutos de reação. Como controle da reação foi

utilizado o próprio substrato (Figura 4).

Atividade Fosfolipásica

0 5 10 15 20 25 30

0.60

0.65

0.70

0.75Controle

Loxosceles intermedia

Tempo (min)

Ab

so

rbân

cia

(925n

m)

Figura 4. Avaliação da atividade fosfolipásica do veneno da aranha Loxosceles intermedia. O veneno não

apresentou atividade fosfolipásica na concentração de 100 μg/mL. ANOVA: p<0.05 considerado significativo.

n=4 amostras por grupo experimental.

4.1.2.2 Atividade Hialuronidásica

A atividade hialuronidásica medida através do método de Di Ferrante (1956)

modificado, permite avaliar a degradação do ácido hialurônico bovino, utilizado como

43

substrato, através da diminuição da turbidez da solução. Foram testadas três diferentes

concentrações do veneno (10, 30 e 100 μg/mL), sendo possível observar que o veneno

extraído das aranhas Loxosceles intermedia apresenta atividade hialuronidásica, sendo

observada grande redução do substrato do meio reacional após três horas de reação, em todas

as concentrações testadas, sendo esta maior com o aumento da concentração (Figura 5). Como

controle da reação, utilizou-se o tampão acetato-ácido acético.

Atividade Hialuronidásica

Contr

ole

LI 10

ug/mL

LI 30

ug/mL

LI 100

ug/m

L

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

**

*

*

Ab

so

rbân

cia

(400n

m)

Figura 5. Avaliação da atividade hialuronidásica do veneno das aranhas Loxosceles intermedia (LI). O veneno

apresenta atividade hialuronidásica dependente da concentração. ANOVA: p<0.05 considerado significativo.

n=4 amostras por grupo experimental.

4.1.2.3 Atividade Proteolítica

A avaliação da atividade proteolítica, realizada pelo método descrito por Garcia (1978)

modificado, consiste na digestão de azocaseína e liberação do grupamento azo para a solução,

que gera coloração alaranjada. Quanto maior a quantidade de grupamento azo livre, maior a

absorbância da solução e maior a atividade proteolítica do veneno testado. Foi possível

observar que o veneno de L. intermedia apresenta atividade proteolítica com o aumento da

concentração (30 e 100 µg/mL), não sendo observada atividade em nível mais baixo de

44

concentração (10 µg/mL), após três horas de reação (Figura 6). Como controle da reação foi

utilizado o próprio substrato.

Atividade Proteolítica

Contr

ole

LI 10

ug/mL

LI 30

ug/mL

LI 100

ug/m

L

0.00

0.05

0.10

0.15

*

*

Ab

so

rbân

cia

(420n

m)

Figura 6. Avaliação da atividade proteolítica do veneno das aranhas Loxosceles intermedia (LI). Observou-se

atividade proteolítica com aumento da concentração do veneno de L. intermedia (30 e 100 µg/mL). ANOVA:

p<0.05 considerado significativo. n=4 amostras por grupo experimental.

4.1.2.4 Atividade Colagenásica

A atividade colagenásica do veneno pode ser avaliada através da reação colorimétrica

que se desenvolve a partir da capacidade do veneno em clivar o azocolágeno e liberar o

grupamento azo, o que leva ao aumento da absorbância da solução, de acordo com o método

adaptado de Chavira, 1984. Foram testadas três diferentes concentrações do veneno (10, 30 e

100 μg/mL), sendo observada atividade dependente da concentração utilizada no ensaio, após

três horas de reação (Figura 7). Como controle da reação foi utilizado o substrato,

correspondente à alíquota sem o veneno.

45

Atividade Colagenásica

Contr

ole

LI 10

ug/mL

LI 30

ug/mL

LI 100

ug/m

L

0.00

0.05

0.10

0.15*

*

*

Ab

so

rbân

cia

(520n

m)

Figura 7. Avaliação da atividade colagenásica do veneno das aranhas Loxosceles intermedia (LI). O veneno

apresentou alta atividade colagenásica, sendo esta dependente da concentração. ANOVA: p<0.05 considerado

significativo. n=4 amostras por grupo experimental.

4.1.2.4 Atividade Esfingomielinásica

A atividade esfingomielinásica foi avaliada através do kit Amplex Red Assay à 37ºC

por 30 minutos, sendo o produto da reação determinado em 570 nm, com detecção de emissão

à 590 nm. Este método foi escolhido por apresentar eficiência comprovada para avaliar a

atividade das esfingomielinase-D do veneno de aranha-marrom (APPEL et al., 2008). Foram

testadas três diferentes concentrações do veneno (10, 30 e 100 μg/mL), sendo observado

aumento da intensidade de fluorescência apenas para a maior concentração testada, após trinta

minutos de reação (Figura 8). A enzima enfingomielinase (5 mM) do próprio kit, utilizada

como controle positivo, apresentou intensidade de fluorescência satisfatória. E o controle da

reação utilizado foi o reagente Amplex Red mais o tampão, sem adição do veneno.

46

Atividade Esfingomielinásica

Contr

ole

Esf

ingom

ielin

ase

LI 10

ug/mL

LI 30

ug/mL

LI 100

ug/m

L

0

50

100

150

200

250

*

*

Inte

nsid

ad

e d

e F

luo

rescên

cia

(Em

issão

590 n

m)

Figura 8. Avaliação da atividade esfingomielinásica do veneno das aranhas Loxosceles intermedia (LI).

Observou-se atividade esfingomielinásica apenas na maior concentração testada do veneno de L. intermedia (100

µg/mL). ANOVA: p<0.05 considerado significativo. n=4 amostras por grupo experimental.

4.3 Efeito do veneno das aranhas Loxosceles intermedia em camundongos

4.3.1 ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA

A avaliação do edema decorrente da ação local do veneno de Loxosceles intermedia

foi realizada na pata de três diferentes linhagens de camundongos: BALB/c, C57BL/6 e

Suiço. O veneno se mostrou capaz de induzir edema na pata de todos os camundongos quando

inoculado por via intradérmica. Para os três grupos experimentais o pico do edema ocorreu

após 60 minutos da inoculação de 1,2 µg do veneno. Este edema se manteve por até 24 horas

para o grupo de camundongos das linhagens BALB/c (Figura 9A) e C57BL/6 (Figura 9B) que

receberam veneno. Para os camundongos da linhagem Suiço (Figura 9C), o edema se manteve

por até 16 horas. A área sob a curva (Figura 9D) permite afirmar que o edema de pata

decorrente da inoculação do veneno de L. intermedia é significativo em relação ao grupo

controle, nas 3 linhagens testadas, para o período de 24 horas de observação. Todos os

47

animais continuaram sendo observados para avaliação da sobrevida após a inoculação do

veneno na pata (Figura 10).

Edema de pata - Suiço

00,

5 1 2 3 4 6 16 24

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10Suiço Controle

Suiço Veneno

*

*

**

* * *

Tempo (h)

Áre

a (

mm

2)

A B

C D

Edema de pata - BALB/c

00,

5 1 2 3 4 6 16 24

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09BALB/c Controle

BALB/c Veneno*

* *

*

* *

*

Tempo (h)

Áre

a (

mm

2)

Edema de pata - C57BL/6

00,

5 1 2 3 4 6 16 24

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09C57BL/6 Controle

C57BL/6 Veneno*

*

** *

* **

Tempo (h)

Áre

a (

mm

2)

Edema de pata - C57BL/6

00,

5 1 2 3 4 6 16 24

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09Controle

Veneno*

*

** *

* **

Tempo (h)

Áre

a (

mm

2)

Edema de pata - BALB/c

00,

5 1 2 3 4 6 16 24

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09Controle

Veneno*

* *

*

* *

*

Tempo (h)

Áre

a (

mm

2)

Edema de pata - Suiço

00,

5 1 2 3 4 6 16 24

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10Controle

Veneno

*

*

**

* * *

Tempo (h)

Áre

a (

mm

2)

Área sob curva

Suiç

o contr

ole

Suiç

o ven

eno

C57

BL/6

contr

ole

C57

BL/6

ven

eno

BALB

/c c

ontrole

BALB

/c v

enen

o

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0* * *

Áre

a (

mm

2/h

ora

)

Figura 9. Efeito edematogênico na pata de camundongos inoculados com 1,2 µg/g de veneno de Loxosceles

intermedia. Camundongos BALB/c (A) e C57BL/6 (B) inoculados apresentaram edema significativo em todos

os tempos de observação, durante 24 horas. Camundongos Suiços inoculados apresentaram edema significativo

durante 16 horas (C). Considerando a área sob a curva no período de 24 horas (D) é possível inferir que a área

por hora foi significativamente maior para os animais inoculados com veneno em relação aos seus controles.

ANOVA: p<0.05 considerado significativo. n=4 animais por grupo experimental para cada linhagem de

camundongos.

48

Edema de pata - Sobrevida

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

50

100

150Swiss

C57/BL6

Balb/C

Tempo (dia)

So

bre

vid

a (

%)

Figura 10. Sobrevida de camundongos inoculados com 1,2 µg/g de veneno de Loxosceles intermedia na pata. Os

camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 apresentaram óbito de 100% dos animais três e seis dias após a

inoculação do veneno, respectivamente. Enquanto que, os camundongos da linhagem Suiço não foram a óbito

após 10 dias de observação.

4.3.2 AÇÃO LOCAL

Para verificar o efeito sobre o local de inoculação do veneno das aranhas Loxosceles

intermedia em camundongos foram testadas três linhagens diferentes: BALB/c (n=8),

C57BL/6 (n=8) e Suiço (n=8). Após 24 horas da inoculação do veneno, nenhum dos

camundongos apresentava qualquer alteração local. Em contrapartida, foi possível observar a

formação da lesão dermonecrótica no coelho (n=1) como controle positivo (Figura 11).

A B C D

Figura 11. Efeito da inoculação de veneno das aranhas Loxosceles intermedia (1,2 μg/g) no ventre. Nenhuma

das três linhagens de camundongos testadas, BALB/c (A), C57BL/6 (B) e Suiço (C), apresentaram formação de

lesão local. O coelho (D), inoculado com a mesma dose, como controle positivo, apresentou formação de lesão

dermonecrótica.

49

4.3.2.1 Análise Histológica da Pele

As peles de todos os camundongos, das três linhagens testadas, foram retiradas 24

horas após a inoculação do veneno para avaliação histopatológica. Nos camundongos da

linhagem BALB/c foi observado intenso processo inflamatório no local da inoculação do

veneno (Figura 10), nos animais do grupo controle, inoculados com PSS não foram

observadas quaisquer alterações (Figura 12A/C). Para o grupo inoculado com veneno

observou-se a presença de folículos eosinofílicos, que podem indicar ocorrência de

inflamação (Figura 12B), e infiltrado inflamatório, sobretudo próximo à camada muscular e

hipoderme (Figura 12D). Nos camundongos da linhagem C57BL/6, não foram observadas

alterações histológicas para o grupo controle, inoculado com PSS (Figura 13A/C) e a

avaliação histopatológica do grupo inoculado com veneno permitiu observar características

típicas do processo inflamatório agudo (Figura 13B/D), dentre os quais se destacam: intensa

dilatação de vasos linfáticos (Figura 13B*), infiltrado inflamatório moderado, próximo a

camada muscular e hipoderme (Figura 13D) e marginalização de leucócitos intravascular e

diapedese (Figura 13D*). Nos camundongos da linhagem Suiço foi observada a presença

numerosa de folículos na derme tanto nos animais do grupo controle, inoculados com PSS

(Figura 14A/C), como nos animais do grupo veneno (Figura 14B/D), não sendo considerada

alteração histológica para nenhum dos dois grupos. Os animais inoculados com veneno

apresentaram intensa congestão vascular, não sendo esta característica observada para os

animais do grupo controle.

50

Controle – BALB/c Veneno –BALB/c

BA

C D

Figura 12. Cortes transversais da pele de camundongos da linhagem BALB/c 24 horas após a inoculação do

veneno da aranha L. intermedia na região ventral. Para os animais do grupo controle foi possível observar a

integridade das camadas da pele (A) e ausência de infiltrado inflamatório (C). Para os animais inoculados com

1,2 µg/g de veneno foi possível observar folículos eosinofílicos na derme (B ) e presença de infiltrado

inflamatório moderado a intenso no tecido muscular e hipoderme (D ). n=4 animais por grupo experimental.

51

Controle – C57BL/6 Veneno –C57BL/6

BA

C D

*

*

Figura 13. Cortes transversais da pele de camundongos da linhagem C57BL/6 24 horas após a inoculação do


integridade das camadas da pele (A) e ausência de infiltrado inflamatório (C). Para os animais inoculados com

1,2 µg/g de veneno foi possível observar dilatação de vasos linfáticos na derme (B* ) e presença de infiltrado

inflamatório moderado no tecido muscular (B/C ), bem como marginalização de leucócitos e diapedese a

partir dos vasos sanguíneos da hipoderme (D* ). n=4 animais por grupo experimental.

52

Controle – Suiço Veneno – Suiço

B

C D

A

Figura 14. Cortes transversais da pele de camundongos da linhagem Suiço 24 horas após a inoculação do


integridade das camadas da pele (A) e ausência de congestão vascular (C). Para os animais inoculados com 1,2

µg/g de veneno foi possível observar intensa congestão vascular (B/C ), sem marginalização de leucócitos e

infiltrado inflamatório ausente (D). n=6 animais por grupo experimental.

53

4.3.3 MOBILIZAÇÃO DE LEUCÓCITOS APÓS 24 HORAS

A presença do infiltrado inflamatório no local da inoculação do veneno de L.

intermedia após 24 horas despertou o interesse por compreender a mobilização de leucócitos

decorrente deste envenenamento. A partir desta compreensão é possível inferir sobre o tipo de

resposta imunológica envolvida neste envenenamento e compreender a dinâmica celular

desde o local da inoculação, até a produção pela medula óssea e ativação pelo baço. Para isso,

foram selecionadas duas linhagens de camundongos, BALB/c e C57BL/6, por apresentarem

resposta histopatológicas, no local de inoculação do veneno na pele, mais evidentes da

ocorrência do processo inflamatório dentre as três linhagens testadas.

4.3.3.1 Celularidade

O veneno de L. intermedia promoveu leucocitose nos animais BALB/c (Figura 15A –

Controle: 1,2 e Veneno: 2,1 x 105 leucócitos/mL) e C57BL/6 (Figura 15B – Controle: 1,2 e

Veneno: 2,7 x 105 leucócitos/mL) 24 horas após a inoculação, o que representa resposta

inflamatória aguda. A medula óssea dos animais C57BL/6 também respondeu prontamente a

inoculação do veneno, sendo possível observar aumento no número de células em relação aos

animais controle (Figura 15D – Controle: 14,6 e Veneno: 18,7 x 106 leucócitos/mL), fato não

observado nos camundongos BALB/c (Figura 15C – Controle: 17,9 e Veneno: 20,0 x 106

leucócitos/mL). O baço de ambas as linhagens de camundongos também respondeu a

inoculação do veneno com o aumento no número de células para BALB/c (Figura 15F –

Controle: 56,5 e Veneno: 73,6 x 106 leucócitos/mL) e C57BL/6 (Figura 15E – Controle: 43,3

e Veneno: 53,4 x 106 leucócitos/mL). Com base no aumento da celularidade do sangue,

medula óssea e baço dos animais inoculados com o veneno de Loxosceles intermedia, foram

investigados os tipos celulares envolvidos nesta resposta ao veneno.

54

C57BL/6 x

105

leu

cóci

tos/

mL

SAN

GU

E

x 10

6le

ucó

cito

s/m

L MED

ULA

ÓSSEA

x 10

6le

ucó

cito

s/m

L

BA

ÇO

BALB/c

0,0

10,0

20,0

30,0

PBS Venom

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

PBS Venom

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

PBS Venom

0

25

50

75

100

PBS Venom

A B

C D

E F

*

*

**

0

10

20

30

40

PBS Venom

0

1

2

3

4

5

PBS Venom

*

Controle Veneno

Controle VenenoControle Veneno


Controle Veneno

Figura 15. Celularidade no sangue, medula óssea e baço de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. O veneno induziu resposta celular após a inoculação de 1,2 µg/g na região ventral,

caracterizada por leucocitose nos camundongos C57BL/6 (A) e BALB/c (B). A medula óssea dos animais

C57BL/6, inoculados com o veneno, apresentou maior celularidade que o grupo controle (C), fato não observado

nos animais BALB/c (D). O veneno estimulou aumento da celularidade no baço dos camundongos C57BL/6 (E)

e BALB/c (F). Teste t: p<0.05 considerado significativo. n=3 animais por grupo experimental.

55

4.3.3.2 Contagem de Leucócitos no sangue

4.3.3.2.1 Células Mielóides

Com o objetivo de identificar as células relacionadas a leucocitose observada para as

duas linhagens de camundongos testadas, o padrão de distribuição de monócitos e neutrófilos

no sangue foi verificado 24 horas após a inoculação do veneno de Loxosceles intermedia

(Figura 16). O veneno proporcionou aumento no número de monócitos em relação ao controle

nos animais C57BL/6 (Figura 16E – Controle: 1,0 e Veneno: 3,1 x 105 células). Nestes

animais, o número de neutrófilos imaturos (Figura 16F – Controle: 0,3 e Veneno: 2,2 x 105

células) e maduros (Figura 16G – Controle: 2,1 e Veneno: 9,6 x 105 células) também estavam

aumentados após a inoculação do veneno. Estes resultados caracterizam resposta imunológica

inata aguda. Nos animais BALB/c, o veneno não modificou as populações mieloides após sua

inoculação. Os monócitos representaram 1,2 e 1,6 x 105 leucócitos, respectivamente, para os

grupos controle e veneno nos animais BALB/c (Figura 16H). Os neutrófilos imaturos

representaram 0,2 e 0,1 x 105 leucócitos, respectivamente, para os grupos controle e veneno

(Figura 16I). Para os neutrófilos maduros também não foi observada diferença entre os grupos

veneno e controle (Figura 16J – Controle: 2,1 e Veneno: 2,7 x 105 células).

56

Controle

R1

Veneno

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

A B

C D

C5

7B

L/6B

ALB

/c

C5

7B

L/6B

ALB

/c

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

PBS Venom

Monócitos

x 1

05

célu

las/

mL

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

PBS Venom

Neutrófilos

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

PBS Venom

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

PBS Venom

E F

H I

x 1

05

célu

las/

mL

**

Controle Veneno Controle Veneno


Neutrófilos imaturos

G

J

*

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1 2

0,0

2,0

4,0

6,0

1 2Controle Veneno

Controle Veneno

Figura 16. Quantificação de células mieloides no sangue de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu monocitose (E) e aumento de neutrófilos

imaturos (F) e maduros (G) no sangue dos camundongos C57BL/6. Para os camundongos BALB/c não foi

observada nenhuma diferença significativa entre os grupos controle e veneno. Dot-Plot (A/B;C/D): Monócitos

foram selecionados na região R1 (células Mac-1+Gr-1

-) e neutrófilos foram selecionados em R3 (células Mac-

1+Gr-1

+). Na região R2, foi selecionada população de neutrófilos imaturos (células Mac-1

+Gr-1

Low). Teste t:

p<0.05 considerado significativo. n=3 animais por grupo experimental.

57

4.3.3.2.2 Linfócitos T

A quantificação de linfócitos T no sangue dos animais inoculados com 1,2 µg/g de

veneno de L. intermedia foi realizada após 24 horas (Figura 17), a fim de avaliar o tipo de

resposta imunológica envolvida com o envenenamento. Para os camundongos C57BL/6, o

veneno induziu aumento da população de linfócitos T CD8+ (Figura 17E – Controle: 0,9 e

Veneno: 1,9 x 105 células) e CD4

+ (Figura 17F – Controle: 2,0 e Veneno: 3,2 x 10

5 células),

sendo proporcionalmente mais evidente nos linfócitos T CD8+, comparado ao grupo controle.

Nos animais BALB/c, o veneno proporcionou aumento nos dois tipos de células, tanto os

linfócitos T CD8+ (Figura 17G – Controle: 0,5 e Veneno: 1,0 x 10

5 células) quanto os CD4

+

(Figura 17H – Controle: 1,1 e Veneno: 5,0 x 105 células), comparado ao grupo controle. Os

resultados indicam que ambas as classes de linfócitos T, CD4+ e CD8

+, aumentaram no

sangue dos camundongos C57BL/6 e BALB/c após a inoculação do veneno, sendo

proporcionalmente mais evidente nos linfócitos T CD8+ para os animais C57BL/6 e nos

linfócitos T CD4+ para os BALB/c.

58

R2

R1

R2

R1

R1

R2 R2

R1

Controle VenenoA B

C D

C5

7B

L/6B

ALB

/c

C5

7B

L/6B

ALB

/c

T CD4+T CD8+

*

*

x 1

05

célu

las/

mL

x 1

05

célu

las/

mL

*

*

E F

G H0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

1 2Controle Veneno

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

1 2Controle Veneno

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

1 2Controle Veneno

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

1 2 Controle Veneno

Figura 17. Quantificação de linfócitos T no sangue de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu aumento de linfócitos T CD8+ (E) e CD4

+

(F) no sangue de camundongos C57BL/6. O mesmo resultado foi observado após a inoculação do veneno em

camundongos BALB/c, aumento de linfócitos T CD8+ (G) e T CD4

+ (H) no sangue. Dot-Plot (A/B;C/D):

Linfócitos T CD8+ foram selecionados na região R1 (células CD8

+ CD4

-) e linfócitos T CD4

+ foram

selecionados em R2 (células CD8-

CD4+). Teste t: p<0.05 considerado significativo. n=3 animais por grupo

experimental.

59

4.3.3.2.3 Linfócitos B

A quantificação de linfócitos B no sangue dos animais foi realizada 24 horas após a

inoculação do veneno de Loxosceles intermedia (Figura 18). Dois subtipos de linfócito B

foram identificados, os linfócitos B convencionais, relacionados a resposta imunológica

adquirida, e os linfócitos B1 relacionados a produção de anticorpos de baixa afinidade,

resposta imediata não específica a antígeno. Não houve aumento de linfócitos B

convencionais nos camundongos C57BL/6 inoculados com veneno (Figura 18E – Controle:

5,3 e Veneno: 6,9 x 105 células), porém, o veneno induziu aumento da população de linfócitos

B1 comparado ao grupo controle neste animais (Figura 18F – Controle: 0,2 e Veneno: 2,7 x

105 células). Nos animais BALB/c, o veneno proporcionou aumento da população de

linfócitos B convencionais (Figura 18G – Controle: 6,7 e Veneno: 11,7 x 105 células), e a

população de linfócitos B1 não apresentou alteração significativa (Figura 18H – Controle: 1,2

e Veneno: 1,1 x 105 células).

60

R1

R2

Controle

R1

Veneno

R2

R1

R2

R1

R2

A B

C D

BA

LB/c

C5

7B

L/6

BA

LB/c

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

PBS Venom

*

Linfócitos B1

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

PBS Venom

0,0

4,0

8,0

12,0

PBS Venom

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

PBS Venom

*

Linfócitos B convencionais

C5

7B

L/6

x 1

05

célu

las/

mL

x 1

05

célu

las/

mL

E F

G H



Figura 18. Quantificação de linfócitos B no sangue de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu aumento de linfócitos B1 em camundongos

C57BL/6 (F) e aumento de linfócitos B convencionais nos camundongos BALB/c (G). Dot-Plot (A/B;C/D):

Linfócitos B convencionais foram selecionados na região R1 do gráfico 14 (células B220high

IgMlow

) e linfócitos

B1 foram selecionados em R2 (células B220low

IgMhigh

). Teste t: p<0.05 considerado significativo. n=3 animais

por grupo experimental.

61

4.3.3.2.4 Lâminas de Sangue

Em relação a contagem de leucócitos no sangue, é possível inferir que os animais

C57BL/6 respondem ao veneno com elementos celulares envolvidos com a resposta imune

inata: Monócitos, Granulócitos, Linfócitos T CD8+ e Linfócitos B1. Em acordo com estes

resultados, a análise diferencial de células no sangue dos camundongos C57BL/6 inoculados

com veneno apresenta neutrófilos e monócitos ativados (Figura 19B), células não observadas

para o grupo controle (Figura 19A). Os animais BALB/c respondem ao veneno com

componentes majoritariamente presentes nas respostas humorais e/ou adaptativas: Linfócitos

T CD4+ e Linfócitos B convencionais, sendo possível observar a presença pouco aumentada

de neutrófilos no grupo veneno (Figura 19D) em relação ao grupo controle (Figura 19C). A

partir destes resultados, investigou-se a mobilização celular a partir da medula óssea (Tecido

de origem) e Baço (um dos órgãos efetores).

Lin

Neut

A

Lin

NeutNeut ativado

Monoc ativado

B

Lin

C

Lin

Neut

D

Controle Veneno

C5

7B

L/6

BA

LB

/c

Figura 19. Análise do esfregaço sanguíneo de camundongos inoculados com veneno da aranha Loxosceles

intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu aumento de neutrófilos e monócitos ativados no sangue

após a inoculação do veneno em camundongos C57BL/6 (B), células não observadas nas lâminas do grupo

controle em (A). Nos animais BALB/c foi observado aumento moderado de neutrófilos no grupo inoculado com

veneno (D) em relação ao grupo controle (C). n=3 animais por grupo experimental.

62

4.3.3.3 Contagem de Leucócitos na Medula Óssea


A mobilização de células mielóides a partir da medula óssea 24 horas após a

inoculação do veneno de Loxosceles intermedia foi verificada com o objetivo de identificar as

células recrutadas durante o envenenamento agudo (Figura 20). O veneno proporcionou

aumento no número de monócitos em relação ao controle nos animais C57BL/6 (Figura 20E –

Controle: 1,5 e Veneno: 2,6 x 106 células). Nestes animais, o número de neutrófilos também

estava aumentado após a inoculação do veneno (Figura 20G – Controle: 39,2 e Veneno: 56,4

x 106 células), entretanto demais granulócitos não apresentaram aumento significativo em

relação ao controle (Figura 20F – Controle: 15,4 e Veneno: 22,4 x 106 células). A partir destes

resultados, é possível afirmar que a medula óssea dos animais C57BL/6 apresentou intensa

mielopoese horas após a inoculação do veneno, o que poderia explicar o aumento das células

mieloides no sangue. Nos animais BALB/c, o veneno não modificou as populações mieloides

após a inoculação. Os monócitos representaram 2,7 x 105 leucócitos, para ambos os grupos,

controle e veneno (Figura 20H) e os neutrófilos representaram 59,2 e 57,4 x 105 leucócitos,

respectivamente, para os grupos controle e veneno nos animais BALB/c (Figura 20J). A

população de células mista, composta por outros granulócitos, foi reduzida após a inoculação

do veneno nos animais BALB/c (Figura 20I – Controle: 14,2 e Veneno: 4,7 x 106 células).

Estes resultados corroboram com aqueles encontrados no sangue destes animais, com o

número de monócitos e granulócitos semelhantes ao controle após a inoculação do veneno.

63

R1

R2 R3

R1

R2 R3

Controle VenenoA B

C D

R1

R2 R3

R1

R2 R3

C5

7B

L/6B

ALB

/c

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

PBS Venom

*

Monócitos

x 1

06

célu

las/

mL C

57

BL/6

BA

LB/c

E F

H IControle Veneno

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

PBS Venom

Outros Granulócitos

Controle Veneno

G

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

PBS Venom

*

Neutrófilos

x 1

06

célu

las/

mL

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

1 2

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

1 2Controle Veneno Controle Veneno

JControle Veneno

*0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

1 2Controle Veneno

Figura 20. Quantificação de células mieloides na medula óssea de camundongos inoculados com veneno da

aranha Loxosceles intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu monocitose (E) e aumento na

produção de neutrófilos (G) na medula óssea dos camundongos C57BL/6, sem aumento na produção de outros

granulócitos (F). Para os camundongos BALB/c não foi observada diferença significativa entre os grupos

controle e veneno com relação a produção de monócitos (H) e neutrófilos (J), contudo o veneno induziu redução

na população mista contendo outros granulócitos (I). Dot-Plot (A/B;C/D): Monócitos foram selecionados na

região R1 (células Mac-1+Gr-1

-) e neutrófilos foram selecionados em R3 (células Mac-1

+Gr-1

+). Na região R2,

foi selecionada população mista de outros granulócitos (células Mac-1+Gr-1

Low). Teste t: p<0.05 considerado

significativo. n=3 animais por grupo experimental.

64


A quantificação de linfócitos T na medula óssea foi realizada 24 horas após a

inoculação de 1,2 µg/g do veneno de Loxosceles intermedia (Figura 21). A medula óssea dos

camundongos C57BL/6 apresentou aumento no número de linfócitos T CD4+ (Figura 21E –

Controle: 2,3 e Veneno: 3,7 x 105 células) e T CD8+ (Figura 21F – Controle: 1,6 e Veneno:

5,0 x 105 células), sendo mais evidente para os linfócitos T CD8+. Nos animais BALB/c, o

veneno proporcionou aumento apenas dos linfócitos T CD4+ (Figura 21H – Controle: 0,9 e

Veneno: 2,3 x 105 células), não sendo observada diferença significativa para os linfócitos T

CD8+ (Fig. 21G – Controle: 0,6 e Veneno: 1,5 x 10

5 células), comparado ao grupo controle.

Os resultados demonstram que o recrutamento de linfócitos T, tanto CD4+ quanto CD8

+, a

partir da medula óssea, aumentou nos camundongos C57BL/6 após a inoculação do veneno,

sendo proporcionalmente mais evidente nos linfócitos T CD8+. Para os camundongos

BALB/c, foi possível observar apenas aumento da mobilização de linfócitos T CD4+ a partir

da medula óssea após a inoculação do veneno. Os resultados encontrados para ambas as

linhagens testadas corroboram com aqueles observados para o sangue, com aumento

preferencial de linfócitos T CD8+

para camundongos C57BL/6 e linfócitos T CD4+ para

camundongos BALB/c.

65

Controle Veneno

R1

R2

R1

R2

R1

R2

R2

R1

A B

C D

C5

7B

L/6B

ALB

/c

C57BL/6

Linfócitos T CD4+ Linfócitos T CD8+

* *

BALB/c*

x 106

célu

las/

mL



0,0

2,0

4,0

6,0

1 2

x 106

célu

las/

mL

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

1 2

0,0

2,0

4,0

6,0

1 2

0,0

2,0

4,0

6,0

1 2

E F

G H

Figura 21. Quantificação de linfócitos T na medula óssea de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu aumento de linfócitos T CD8+ (E) e T CD4

+

(F) na medula óssea de camundongos C57BL/6. Para os camundongos BALB/c o veneno não promoveu

alteração siginificativa no número de linfócitos T CD8+ (G), induziu aumento apenas de linfócitos T CD4

+ (H),

após a inoculação do veneno. Dot-Plot (A/B;C/D): Linfócitos T CD8+ foram selecionados na região R1 (células

CD8+

CD4-) e linfócitos T CD4

+ foram selecionados em R2 (células CD8

- CD4

+). Teste t: p<0.05 considerado


66


A diferenciação de linfócitos B na medula óssea dos animais foi verificada 24 horas

após inoculação com veneno de Loxosceles intermedia (Figura 22). Linfócitos B em três

diferentes etapas de diferenciação foram identificados, os linfócitos pré-pró B, uma fase de

transição e reposição de linfócitos B, os linfócitos B imaturos e os linfócitos B maduros. Para

os camundongos C57BL/6, o veneno reduziu a população de linfócitos pré-pró B (Figura 22E

– Controle: 3,5 e Veneno: 1,9 x 105 células) e aumentou os linfócitos B maduros (Figura 22G

– Controle: 0,7 e Veneno: 1,5 x 105 células), para os linfócitos B imaturos o veneno não

promoveu alteração, comparado ao grupo controle (Figura 22F – Controle: 0,8 e Veneno: 0,9

x 105 células). A diferenciação de linfócitos B na medula óssea dos camundongos BALB/c,

por sua vez, apresentou aumento da população de linfócitos B imaturos (Figura 22I –

Controle: 0,8 e Veneno: 1,4 x 105 células) e também de linfócitos B maduros (Figura 22J –

Controle: 0,3 e Veneno: 0,9 x 105 células), para os linfócitos pré-pró B não foi observada

nenhuma diferença nos animais inoculados com veneno, comparado ao grupo controle (Figura

22H – Controle: 0,8 e Veneno: 1,9 x 105 células).

67

R1

R3R2

R1

R3R2

R1

R3R2

Controle Veneno

A

C

B

D

R1

R3R2

C5

7B

L/6B

ALB

/c

C57BL/6BA

LB/c

E F G

x 10

5cé

lula

s/m

L

*

x 10

5cé

lula

s/m

L

Pré/Pró B B imaturos B maduros

0,0

2,0

4,0

6,0

1 2H I J

*

0,0

1,0

2,0

3,0

1 2

0,0

2,0

4,0

6,0

1 2

0,0

1,0

2,0

3,0

1 2

*

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1 2Controle Veneno Controle Veneno Controle Veneno

*

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1 2Controle Veneno Controle Veneno Controle Veneno

Figura 22. Quantificação de linfócitos B na medula óssea de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno reduziu a quantidade de linfócitos pré-pró B (E) e

induziu aumento de linfócitos B maduros (G) na medula óssea dos camundongos C57BL/6. Para os

camundongos BALB/c, houve aumento de linfócitos B imaturos (I) e maduros (J) após a inoculação do veneno.

Dot-Plot (A/B;C/D): Células Pré-Pró B foram selecionadas na região R1 (células B220low

IgM-), células B

imaturas foram selecionados na região R2 (células B220low

IgM+) e células B maduras foram selecionados em R3

(células B220high

IgM+). Teste t: p<0.05 considerado significativo. n=3 animais por grupo experimental.

68

4.3.3.4 Contagem de Leucócitos do Baço


A presença de células mielóides no baço 24 horas após a inoculação do veneno de

Loxosceles intermedia foi verificada com o objetivo de avaliar a taxa de ativação destas

células durante o envenenamento agudo (Figura 23). Nos animais C57BL/6, o veneno não

modificou as populações mielóides presentes no baço. Os monócitos representaram 0,7 e 0,5

x 105 leucócitos, respectivamente, para os grupos controle e veneno (Figura 23E). Os

neutrófilos representaram 1,1 e 1,2 x 105 leucócitos, respectivamente, para os grupos controle

e veneno nos animais C57BL/6 (Figura 23G), o mesmo foi observado para a população de

células mista, composta por outros granulócitos (Figura 23F – Controle: 0,8 e Veneno: 0,7 x

106 células). Os resultados obtidos também não apresentaram diferenças significativas para os

camundongos BALB/c após a inoculação do veneno, nem em relação aos monócitos (Figura

23H – Controle: 2,0 e Veneno: 1,6 x 106 células), nem aos neutrófilos (Figura 23J – Controle:

1,9 e Veneno: 1,5 x 106 células), tampouco foi observada diferença para a população mista

composta por outros granulócitos (Figura 23I – Controle: 0,5 e Veneno: 0,6 x 106 células),

comparado ao grupo controle.

69

R1

R2 R3

Controle VenenoA B

C D

R1

R2 R3

R1

R2 R3

R1

R2 R3

C5

7B

L/6B

ALB

/c

C5

7B

L/6B

ALB

/c

E F G

x 1

06

célu

las/

mL

Monócitos Outros Granulócitos

Neutrófilos

x 1

06

célu

las/

mL

H IControle Veneno Controle Veneno J Controle Veneno

Controle Veneno Controle Veneno Controle Veneno

0,0

1,0

2,0

3,0

1 2

0,0

1,0

2,0

3,0

1 2

0,0

1,0

2,0

3,0

1 2

0,0

1,0

2,0

3,0

1 2

0,0

1,0

2,0

3,0

1 20,0

1,0

2,0

3,0

1 2

Figura 23. Quantificação de células mieloides no baço de camundongos inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. Não foi observada diferença significativa em relação as células mieloides presentes no

baço dos camundongos inoculados com 1,2 µg/g de veneno, comparado ao grupo controle, tanto para os

camundongos C57BL/6, como para BALB/c. Dot-Plot (A/B;C/D): Monócitos foram selecionados na região R1

(células Mac-1+Gr-1

-) e neutrófilos foram selecionados em R3 (células Mac-1

+Gr-1

+). Na região R2, foi

selecionada população mista de outros granulócitos (células Mac-1+Gr-1

Low). Teste t: p<0.05 considerado


70


A presença de linfócitos T no baço pode representar o aumento da maturação destas

células 24 horas após a inoculação de 1,2 µg/g do veneno de Loxosceles intermedia (Figura

24). O baço dos camundongos C57BL/6 apresentou aumento no número de linfócitos T CD8+

(Figura 24E – Controle: 2,0 e Veneno: 4,8 x 105 células), não sendo observada diferença

significativa para os linfócitos T CD4+ (Figura 24F – Controle: 5,9 e Veneno: 5,5 x 10

5

células), comparado ao grupo controle. Nos animais Balb/C, o veneno proporcionou aumento

dos linfócitos T CD4+ (Figura 24H – Controle: 13,2 e Veneno: 21,4 x 10

5 células), não sendo

observada diferença significativa para os linfócitos T CD8+ (Figura 24G – Controle: 4,7 e

Veneno: 6,1 x 105 células), comparado ao grupo controle. Os resultados encontrados para

ambas as linhagens testadas corroboram com aqueles observados para o sangue e medula

óssea, com aumento preferencial de linfócitos T CD8+

para camundongos C57BL/6 e

linfócitos T CD4+ para camundongos Balb/C.

71

Controle Veneno

R1

R2

R1

R2

R1

R2

R2

R1

A B

C D

C5

7B

L/6B

ALB

/c

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

1 2

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

1 2

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

1 2

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

1 2

C57BL/6

Linfócitos T CD4+ Linfócitos T CD8+

*

BALB/c

*

x 106

célu

las/

mL



x 106

célu

las/

mL

E F

G H

Figura 24. Quantificação de linfócitos T no baço de camundongos inoculados com veneno da aranha Loxosceles

intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu aumento de linfócitos T CD8+ (E) no baço de

camundongos C57BL/6 e aumento de linfócitos T CD4+ (H) no baço de camundongos BALB/c. Dot-Plot

(A/B;C/D): Linfócitos T CD8+ foram selecionados na região R1 (células CD8

+ CD4

-) e linfócitos T CD4

+ foram

selecionados em R2 (células CD8-

CD4+). Teste t: p<0.05 considerado significativo. n=3 animais por grupo

experimental.

72


Os linfócitos B presentes no baço dos animais inoculados com veneno de Loxosceles

intermedia foram analisados após 24 horas (Figura 25). A maioria dos linfócitos B presentes

no baço estão ativados e disponíveis a ocorrência de respostas imunológicas a diferentes

antígenos. Para os camundongos C57BL/6, não foram observadas diferenças significativas

entre os grupos controle e veneno em relação aos linfócitos B convencionais (Figura 25E –

Controle: 18,7 e Veneno: 19,8 x 105 células). Em relação as populações de outros linfócitos

B, foi observado aumento no grupo veneno, comparado ao grupo controle (Figura 25F –

Controle: 7,2 e Veneno: 9,2 x 105 células). Para o total de linfócitos B também não foram

observadas diferenças significativas, entre os grupos controle e veneno (Figura 25G –

Controle: 25,9 e Veneno: 29,0 x 105 células). A presença de linfócitos B no baço dos

camundongos BALB/c, por sua vez, apresentou aumento de linfócitos B convencionais

(Figura 25H – Controle: 30,2 e Veneno: 38,5 x 105 células). Para os outros linfócitos B não

foi observada nenhuma diferença nos animais inoculados com veneno, comparado ao grupo

controle (Figura 25I – Controle: 6,4 e Veneno: 5,5 x 105 células). O total de linfócitos B, por

sua vez, apresentou aumento significativo em relação ao grupo controle (Figura 25J –

Controle: 36,6 e Veneno: 44,1 x 105 células). Estes resultados corroboram com aqueles

observados para o sangue, com aumento de outros linfócitos B para os camundongos

C57BL/6 e aumento de linfócitos B convencionais para os camundongos BALB/c.

73

R2

R1

R2

R1

R2

R1

R2

R1

Controle Veneno

A

C

B

D

C5

7B

L/6B

ALB

/c

C57BL/6BA

LB/c

E F G

x 10

5cé

lula

s/m

L

*

x 10

5cé

lula

s/m

L

Total de Linfócitos BLinfócitos B

convencionais

Outros Linfócitos B

0

20

40

60

PBS Venom0

20

40

60

PBS Venom

0

5

10

15

20

PBS VenomH I J

Controle VenenoControle Veneno Controle Veneno

0

20

40

60

PBS Venom

*

0

20

40

60

PBS Venom

0

20

40

60

PBS Venom Controle VenenoControle Veneno Controle Veneno

*

Figura 25. Quantificação de linfócitos B no baço de camundongos inoculados com veneno da aranha Loxosceles

intermedia. A inoculação de 1,2 µg/g de veneno induziu aumento de outros linfócitos B em camundongos

C57BL/6 (F) e aumento de linfócitos B convencionais (H) e no total de linfócitos B (J) nos camundongos

BALB/c. Dot-Plot (A/B;C/D): Linfócitos B convencionais foram selecionados na região R1 (células IgM+

CD23+) e outros linfócitos B foram selecionados na região R2 (células IgM

+ CD23

-), já o total de linfócitos foi

quantificado a partir da soma das regiões selecionadas R1 e R2. Teste t: p<0.05 considerado significativo. n=3

animais por grupo experimental.

74

Os camundongos C57BL/6 inoculados com veneno não apresentaram diferenças

significativas no total de linfócitos B no baço, porém, a população de linfócitos B (“Outros

linfócitos”) contendo linfócitos B1a, B1b ou linfócitos B da zona marginal (ZM) aumentou

em relação ao grupo controle. A fim de indentificar a população de linfócitos B responsável

por este aumento, outro marcador foi utilizado para diferenciar linfócitos B1a e B1b (e

também linfócitos ZM), sendo possível observar que a população aumentada constitui uma

fração mista contendo linfócitos B1b e linfócitos ZM (Figura 26), não sendo observado

aumento da população de linfócitos B1a.

Controle

R1

Veneno

R1

R2 R2

B1a B1a

B1b + ZM B1b + ZM

Figura 26. Diferenciação de linfócitos B no baço de camundongos C57BL/6 inoculados com veneno da aranha

Loxosceles intermedia. Linfócitos B selecionados na região R2 (células IgM+

CD23-) podem ser classificados

como B1a, B1b ou linfócito B de zona marginal (ZM), para diferenciá-los outro marcador foi utilizado, o CD5,

presente nos linfócitos B1a. Não foram observadas populações de linfócitos B1a dentre os linfócitos presentes no

baço dos camundongos C57/BL6, sendo possível afirmar que houve aumento de população mista contendo

linfócitos B1b e linfócitos ZM.

75

5. DISCUSSÃO

O veneno de Loxosceles intermedia não gera lesão dermonecrótica em camundongos,

contudo desencadeia intensa resposta inflamatória local e sistêmica. Apesar das diferenças em

relação ao loxoscelismo cutâneo descrito na literatura para humanos e outros modelos

experimentais (WRIGHT et al., 1997; ELSTON et al., 2000; OSPEDAL et al., 2002;

WILSON et al., 2005), a compreensão dos eventos decorrentes do envenenamento por

aranhas do gênero Loxosceles em camundongos pode contribuir para a compreensão dos

efeitos do veneno envolvidos no desenvolvimento desta lesão. Os resultados apresentados

neste trabalho visam contribuir para a descrição das ações do veneno de Loxosceles

intermedia neste modelo experimental, para isso foi proposta a utilização de camundongos de

três diferentes linhagens: BALB/c, C57BL/6 e Suiço. Foi possível observar diferenças

relevantes, tais como, intensa congestão vascular em Suiços e presença de infiltrado

inflamatório no local de inoculação na pele de camundongos BALB/c e C57BL/6. A partir

destes achados histopatológicos, investigou-se a mobilização de células inflamatórias a partir

da medula óssea, baço e sangue, o que demonstrou resposta imunológica inata típica, com

aumento da cinética de células mieloides e linfócitos T CD8+ citotóxicos, para os

camundongos C57BL/6, e resposta tipicamente adquirida, com aumento preferencial de

linfócitos B convencionais e T CD4+ auxiliar, para os camundongos BALB/c. Por outro lado,

o desenvolvimento de edema na pata dos camundongos inoculados com o veneno foi

observado para as três linhagens testadas, sendo persistente por 24 horas, apenas para as

linhagens BALB/c e C57BL/6.

As atividades in vitro do veneno de Loxosceles intermedia também foram avaliadas

com o objetivo de caracterizar o veneno utilizado. As aranhas foram naturalmente capturadas

na cidade de Petrópolis, e o veneno das aranhas da região serrana do Estado do Rio de Janeiro

não havia sido descrito anteriormente. O veneno loxoscélico é composto por fosfolipase-D,

hialuronidase, metaloproteases, serino proteases entre outros componentes (FUTRELL, 1992;

LEE e LYNCH, 2005; KALAPOTHAKIS et al., 2007; DA SILVEIRA et al., 2007a; DA

SILVEIRA et al., 2007b; DE ALMEIDA et al., 2008; SENFF-RIBEIRO et al., 2008;

VUITIKA et al., 2013). Entre estes a hialuronidase é responsável pelo espalhamento do

veneno (DA SILVEIRA et al. 2007a), e a fosfolipase D, referida na literatura como

76

esfingomielinase-D ou fosfodiesterase D, devido a sua capacidade de hidrolisar

esfingomielina (DA SILVA et al., 2004), são as principais enzimas descritas. Neste trabalho

demonstrou-se que o veneno de Loxosceles intermedia apresenta atividade esfingomielinásica

em altas concentrações, contudo não apresenta atividade fosfolipásica A2 sobre substrato rico

em fosfatidilcolina, como demonstrado para venenos de diferentes espécies de serpentes

(FULY et al., 2004; FULY et al., 2007; STRAUCH et al., 2013). Apesar da fosfatidilcolina

ser substrato também para a fosfolipase D, provavelmente as condições reacionais não

favoreceram a verificação da atividade desta enzima. A atividade hialuronidásica foi

observada, sendo intensa inclusive com baixas concentrações do veneno. A ação do veneno

sobre o colágeno também foi demonstrada como atividade dependente da concentração do

veneno, o que corrobora com a atividade sobre o colágeno descrita in vivo (PEREIRA et al.,

2014). Sabendo que este veneno apresenta diferentes proteases (VEIGA et al., 2000; CHAIM

et al., 2011) este trabalho demonstrou atividade proteolítica do veneno em altas concentrações

sobre substrato enriquecido com caseína. A avaliação destas atividades, sobretudo proteolítica

e colagenásica, não haviam sido descritas na literatura utilizando metodologias semelhantes

para o veneno de Loxosceles intermedia, dessa forma, estes resultados representam importante

contribuição para a caracterização deste veneno.

Embora muitas atividades do veneno dessas aranhas estejam sendo descritas, o

mecanismo de ação do veneno de Loxosceles ainda não está completamente elucidado, apesar

de alguns estudos indicarem a esfingomielinase D presente no veneno como o principal

componente responsável pelos efeitos locais e sistêmicos observados no loxoscelismo

(TAMBOURGI et al., 1998; TAMBOURGI et al., 2002; TAMBOURGI et al., 2005). A

quantidade e o tipo de esfingomielina presente no local de inoculação do veneno pode estar

relacionada com a evolução da necrose induzida pelo veneno de Loxosceles em humanos e

outros modelos experimentais, uma vez que foi observado desenvolvimento de lesão em

camundongos quando a esfingomielina foi adicionada ao local de inoculação do veneno

(DOMINGOS et al., 2003). Em acordo com esta observação, o modelo experimental

utilizando esponja implantada em camundongos (PEREIRA et al., 2012), demonstra que a

retenção do veneno no local da inoculação pode contribuir para a ocorrência dos eventos

inflamatórios também observados em modelos experimentais clássicos.

77

Camundongos BALB/c, C57BL/6 e Suiço pertencem a mesma espécie Mus musculus,

porém de linhagens diferentes. Quando presentes em diferentes linhagens, características

genéticas semelhantes podem resultar em fenótipos completamente distinta, de forma que o

mesmo estímulo pode induzir resposta completamente diferente. Dados na literatura

demonstram consequências funcionais influenciadas pela linhagem de camundongos, que

incluem: tolerância alcooólica (BOWERS et al., 1999), incidência de tumor (DONEHOWER

et al., 1995), secreção de insulina (ANDRIKOPOULOS et al., 2005), agregação de plaquetas ,

reparo tecidual (VAN DEN BORNE et al., 2009) e angiogênese fisiológica e fisiopatológica

(LIU et al., 2010).

A ocorrência do edema é um dos primeiros eventos durante a inflamação aguda, este

fenômeno, associado ao aumento da pressão hidrostática secundária à vasodilatação, resulta

em acentuada perda de líquidos e acúmulo no tecido intersticial (MA et al., 2013). As três

linhagens de camundongos testadas neste trabalho apresentaram edema siginificativo após a

inoculação do veneno. Contudo, é importante salientar que o edema de pata foi persistente

para as linhagens BALB/c e C57BL/6 durante 24 horas, sendo este resultado diferente do

observado para o veneno de Loxosceles gaucho inoculado na pata de camundongos BALB/c,

que persistiu por apenas duas horas após a inoculação (BARBARO et al., 2010).

Diversas alterações histológicas decorrentes da ação local do veneno da aranha

Loxosceles intermedia foram observadas. Alguns autores descrevem como principal alteração

tecidual, após o envenenamento em seres humanos, intensa infiltração de células inflamatórias

e geração de mediadores inflamatórios no local da picada (OSPEDAL et al., 2002;

DOMINGOS et al., 2003; BARBARO et al., 2010). O infiltrado de polimorfonucleados, em

parte recrutado por ativação indireta do sistema complemento, é considerado o principal

contribuinte ao dano tecidual (TAMBOURGI et al., 2005), por isso a maioria dos tratamentos

tem buscado reduzir a infiltração dos polimorfonucleados (PAIXAO-CAVALCANTE et al.,

2007; TAMBOURGI et al., 2010).

A análise histopatológica da pele de camundongos da linhagem BALB/c e C57BL/6

após a inoculação do veneno, permitiu a observação de intenso infiltrado inflamatório, mais

evidente na hipoderme e tecido muscular. A evolução do processo inflamatório local que

antecede o desenvolvimento da lesão dermonecrótica é caracterizado inicialmente pela

inflamação da camada muscular e posterior necrose do músculo, derme e epiderme

78

(OSPEDAL et al., 2002), o que corrobora com os resultados observados em camundongos,

que todavia, não evoluem para a inflamação da derme e necrose da epiderme, após dias de

observação. Ainda, em camundongos implantados com esponja, uma matriz sintética análoga

a biomateriais implantados, foi observado maior infiltrado de neutrófilos em BALB/c, quando

comparado as linhagens C57BL/6 e Suiço (MARQUES et al., 2011), o que corrobora com a

observação de maior infiltrado inflamatório nestes animais, posterior a inoculação do veneno.

Os camundongos da linhagem Suiço, por sua vez, apresentaram congestão vascular acentuada

sem infiltrado inflamatório na pele após inoculação do veneno. A congestão vascular pode

representar o ínicio da resposta inflamatória (SUNDERKOTTER et al., 2001), contudo não

foi observada a presença de leucócitos intravascular, tampouco infiltrado inflamatório

tecidual, o que pode indicar o início de uma resposta inflamatória tardia, em relação as demais

linhagens de camundongos estudadas.

Embora a modulação da atividade de leucócitos seja observada pela intensa infiltração

destas células nas camadas da pele, o veneno de Loxosceles reclusa não exerce efeito direto

sobre leucócitos em cultura (GOMEZ et al., 1999). A ativação de leucócitos representa efeito

indireto sobre células endoteliais e vasos sanguíneos expostos a toxinas do veneno,

estimulando a expressão de E-selectina e interleucina-8 pelas células endoteliais, e fator do

crescimento por queratinócitos (PATEL et al., 1994; DESAI et al., 2000). O veneno de

Loxosceles intermedia também atua sobre células endoteliais promovendo a adesão de

leucócitos ao endotélio (ZANETTI et al., 2002) e a internalização de toxinas do veneno que

culmina em morte celular e degradação do endotélio vascular (NOWATZKI et al., 2010).

Camundongos BALB/c, C57BL/6 e Suiço são utilizados em diferentes protocolos

experimentais e apresentam diferentes respostas, como por exemplo, durante infecção

experimental por Leishmania major. Beil e colaboradores (1992) demonstraram diferenças na

resposta a esta infecção, sendo camundongos BALB/c suscetíveis e C57BL/6 resistentes.

Além disso, o tipo de célula presente na lesão leishmaniótica foi diferente para estas duas

linhagens. No estágio inicial, os neutrófilos estão presentes no infiltrado inflamatório no

camundongo BALB/c, enquanto que nos C57BL/6, macrófagos e eosinófilos são as células

predominantes (BEIL et al., 1992). Neste trabalho, quando comparadas as alterações

histopatológicas em camundongos BALB/c, C57BL/6 e Suiços observou-se diferenças

significativas, como a intensidade do infiltrado inflamatório, maior em BALB/c e ausente em

79

Suiços, e eventos de resposta inflamatória aguda como marginalização de leucócitos e

diapedese em camundongos C57BL/6. As divergências entre estas linhagens de camundongos

estimularam a busca pela compreensão a cerca da mobilização de células inflamatórias

desencadeada pelo veneno nestes animais. Uma vez que camundongos Suiços não

apresentaram infiltrado inflamatório no tempo de observação proposto neste trabalho, não se

fez necessária a avaliação da cinética inflamatória nestes animais.

O infiltrado inflamatório depende da migração de células a partir do sangue periférico

para o tecido alvo da ação do veneno. A fim de compreender esta mobilização celular

relacionada a resposta inflamatória, foi investigada a produção destas células na medula

óssea, sua ativação no baço, e posterior migração para o sangue. Em acordo com a presença

do infiltrado na pele, foi observado aumento do número de leucócitos no sangue, tanto em

camundongos BALB/c como C57BL/6. Esta celularidade aumentada também foi observada

no baço de ambas as linhagens de camundongos analisadas. Em relação ao número de

leucócitos na medula óssea, foi observado aumento significativo para a linhagem C57BL/6, o

que representa resposta imunológica medular decorrente de maior recrutamento de leucócitos

pelo envenenamento nestes animais. A linhagem BALB/c não apresentou a mesma resposta

para a medula óssea, não havendo alteração da celularidade com a inoculação do veneno, esta

observação pode representar uma possível resposta acelerada destes animais, de forma que a

resposta máxima da medula óssea ao recrutamento de leucócitos seja mais rápida do que a

resposta observada para os camundongos C57BL/6.

As principais células envolvidas com a resposta imunológica inata pertencem a classe

das células mieloides, e são representadas por monócitos e granulócitos, que por sua vez

inclui neutrófilos, basófilos e eosinófilos (MEDZHITOV e JANEWAY, 2000; WICKS et al.,

2014). Para os camundongos C57BL/6 foi observado significativo aumento no número de

monócitos e neutrófilos no sangue e aumento da produção destas células pela medula óssea, o

que caracteriza resposta inflamatória inata. Estes resultados corroboram com outro achado

experimental, em coelhos submetidos ao envenenamento loxoscélico, que consiste no

aumento do número de células mielóides na medula óssea, correlacionado significativamente

com o aumento no número de neutrófilos no sangue periférico (DA SILVA et al., 2003). Estas

alterações não foram observadas para a linhagem BALB/c, demonstrando que a resposta

inflamatória nestes animais não apresenta perfil de resposta inata. Sendo assim, a leucocitose

80

observada nos camundongos BALB/c não pode ser atribuída ao aumento de células mieloides

no sangue.

As células linfóides consistem em outra classe celular importante durante a resposta

imunológica, dentre as quais destacam-se os linfócitos B e os linfócitos T (JOSEFOWICZ et

al., 2012; PIEPER et al., 2013). Linfócitos T estão presentes em duas subclasses, os linfócitos

T que expressam CD4+ e os que expressam CD8

+ na membrana, sendo cada uma destas

células relacionadas a diferentes vias de sinalização durante o desenvolvimento da resposta

inflamatória. Linfócitos T CD4+

ou linfócitos T auxiliares estão relacionados a resposta

imunológica adaptativa, através da ativação de linfócitos B e produção de anticorpos

específicos. Os linfócitos T CD8+

ou citotóxicos participam da resposta imunológica inata,

sendo a primeira resposta imunológica do organismo frente a um antígeno (JOSEFOWICZ et

al., 2012). A participação destas células durante o envenenamento por Loxosceles intermedia

em camundongos foi descrita neste trabalho, sendo observada resposta tipicamente inata com

aumento preferencial no número de linfócitos T CD8+

na medula óssea, baço e sangue de

camundongos C57BL/6 após a inoculação do veneno, que corrobora com o aumento de

células mieloides observado nestes camundongos. O aumento preferencial dos linfócitos T

CD4+

em camundongos BALB/c caracteriza resposta imunológica adaptativa decorrente da

inoculação do veneno nestes animais, o que pode representar uma segunda fase da resposta

imunológica nesta linhagem de camundongos ou ainda um tipo de resposta diferenciada entre

inata e adaptativa para cada linhagem testada.

O aumento de linfócitos T CD4+

em camundongos BALB/c havia sido demonstrado

durante o desenvolvimento experimental de atresia biliar, não sendo observado tal aumento

em camundongos C57BL/6. Para estes camundongos a incidência de atresia biliar foi

significativamente menor quando comparado aos camundongos BALB/c (LEONHARDT et

al., 2010). Estes resultados podem ser correlacionados com aqueles observados neste trabalho,

que apresentou o aumento desta classe de linfócitos T durante a resposta inflamatória

decorrente do envenenamento por Loxosceles intermedia em camundongos BALB/c.

Leonhardt e colaboradores (2010) demonstraram que a maior susceptibilidade ao

desenvolvimento de atresia biliar experimental foi associado ao aumento de células T CD4+

no fígado de camundongos BALB/c, enquanto que a resposta inflamatória no local de

81

inoculação do veneno de Loxosceles intermedia foi mais intensa nestes animais, o que

demonstra a importante participação destas células T durante a resposta inflamatória.

Em relação a presença de linfócitos B nos eventos inflamatórios desencadeados pela

inoculação do veneno de Loxosceles intermedia, observou-se que a diferenciação de linfócitos

B na medula óssea dos animais C57BL/6 é caracterizada pela redução das células pré-pró B

em função da produção de células B maduras, e por causa dessa rápida transição a quantidade

de células B imaturas permaneceu constante. Provavelmente, esta redução de células pré-pró

B ocorre devido a baixa reposição pela medula óssea que pode estar voltada para a produção

de células mielóides. Nos camundongos BALB/c foi possível observar o aumento de células

B imaturas e maduras, justificando o aumento de linfócitos B observados no sangue destes

animais. Sendo assim, é possível inferir que a resposta imunológica, decorrente da inoculação

de veneno de Loxosceles intermedia, em camundongos C57BL/6 não é imediatamente

dependente da ativação de linfócitos B. Nos camundongos BALB/C, o aumento no número de

linfócitos B convencionais no baço, sugere recrutamento deste tipo de célula na fase de

resposta aguda a este envenenamento, pois corrobora com os resultados obtidos na medula

óssea e no sangue, onde estes linfócitos B também estavam aumentados. Por outro lado, o

aumento no número de linfócitos B não convencionais no baço e linfócitos B1 no sangue de

camundongos C57BL/6 pode estar relacionado a resposta imunológica não específica ao

veneno inoculado. Linfócitos B1 estão relacionados a respostas não específicas com produção

de anticorpos de baixa afinidade (FAGARASAN et al., 2000). Os tipos predominantes de

linfócitos B presentes no baço após a inoculação do veneno nos camundongos C57BL/6

foram linfócitos B de zona marginal (ZM) e linfócitos B1b. Os linfócitos B ZM apresentam

resposta rápida e independente de ativação por linfócitos T, contudo os linfócitos B1b não

apresentam sua função durante a resposta imunológica bem definida (ALUGUPALLI, 2008).

Sendo assim, é possível inferir que a resposta imunológica ao veneno de Loxosceles

intermedia apresenta perfil de resposta inata, dependente de células B1 nos animais C57BL/6

e perfil de resposta imunológica humoral nos animais BALB/c.

Os resultados obtidos neste trabalho visam contribuir com o desenvolvimento de

metodologias e modelos experimentais que possam ser utilizados para estudo da ação do

veneno da aranha Loxosceles intermedia. As atividades in vitro do veneno contribuem para a

compreensão dos mecanismos envolvidos com a ação do veneno in vivo. A ação local deste

82

veneno em diferentes linhagens de camundongos revelou que modelos animais semelhantes

podem apresentar diferentes respostas a inoculação deste veneno, o que pode contribuir para a

descrição dos efeitos do veneno sobre o organismo alvo e a evolução da lesão. Por fim, a

presença do infiltrado inflamatório no local de inoculação do veneno e a mobilização de

células inflamatórias a partir da medula óssea, ativação no baço como órgão efetor e migração

para o sangue revelou que diferentes linhagens de camundongos apresentam diferenças no

tipo celular envolvido na resposta imunológica decorrente do envenenamento ou esta

diferença pode estar relacionada ao tempo e velocidade da resposta em cada linhagem de

camundongos.

6. CONCLUSÃO

O veneno de Loxosceles intermedia não apresentou atividade fosfolipásica A2, porém

as atividades hialuronidásica e colagenásica demonstraram efeito dependente da concentração

do veneno. As atividades proteolítica e esfingomielinásica, por sua vez, foram observadas

apenas na presença de alta concentração do veneno. Em relação as ações do veneno em

camundongos, este trabalho demonstrou o desenvolvimento de processo inflamatório, desde o

infiltrado na pele até o recrutamento na medula óssea, sendo possível afirmar que o veneno

induziu resposta celular supostamente inata nos animais C57BL/6 e adaptativa e/ou humoral

nos animais BALB/c. As alterações na medula óssea dos camundongos C57BL/6 são

indicativas de resposta imunológica voltada para a produção de células mieloides, enquanto

nos BALB/c, esta resposta foi caracterizada pelo aumento de precursores linfoides, com

predomínio de linfócitos T CD4 e linfócitos B convencionais, o que representa o

desenvolvimento de reposta imunológica específica dependente da ativação por linfócitos T.

O baço dos camundongos C57BL/6 apresentou aumento no grupo de células B1b ou células B

da zona marginal (ZM), o que representa resposta ao veneno independente da ativação por

linfócitos T, sendo essa resposta rápida e inespecífica. A partir destes resultados este trabalho

sugere que camundongos da linhagem BALB/c podem ser utilizados como modelo para

estudar a produção de IgM e IgG induzido pelo veneno, utilizados nas soroterapias, incluindo

analise de citocinas, quimiocinas e mecanismos moleculares.

83

REFERÊNCIAS

ABDULKADER, R. C., K. C. BARBARO, E. J. BARROS, AND E. A. BURDMANN.

Nephrotoxicity of insect and spider venoms in Latin America. Semin Nephrol 28 (4):373-382,

2008.

ALUGUPALLI, K. R. A distinct role for B1b lymphocytes in T cell-independent immunity.

Curr Top Microbiol Immunol 319:105-130, 2008.

ANDRIKOPOULOS, S., C. M. MASSA, K. ASTON-MOURNEY, A. FUNKAT, B. C. FAM,

R. L. HULL, S. E. KAHN, AND J. PROIETTO. Differential effect of inbred mouse strain

(C57BL/6, DBA/2, 129T2) on insulin secretory function in response to a high fat diet. J

Endocrinol 187 (1):45-53, 2005.

APPEL, M. H., R. B. DA SILVEIRA, O. M. CHAIM, K. S. PALUDO, D. T. SILVA, D. M.

CHAVES, P. H. DA SILVA, O. C. MANGILI, A. SENFF-RIBEIRO, W. GREMSKI, H. B.

Nader, and S. S. Veiga. Identification, cloning and functional characterization of a novel

dermonecrotic toxin (phospholipase D) from brown spider (Loxosceles intermedia) venom.

Biochim Biophys Acta 1780 (2):167-178, 2008.

BABCOCK, J. L., D. J. MARMER, AND R. W. STEELE. Immunotoxicology of brown

recluse spider (Loxosceles reclusa) venom. Toxicon 24 (8):783-790, 1986.

BABCOCK, J. L., R. L. SUBER, C. H. FRITH, AND C. R. GEREN. Systemic effect in mice

of venom apparatus extract and toxin from the brown recluse spider (Loxosceles reclusa).

Toxicon 19 (4):463-471, 1981.

BALLOU, L. R., S. J. LAULEDERKIND, E. F. ROSLONIEC, AND R. RAGHOW.

Ceramide signalling and the immune response. Biochim Biophys Acta 1301 (3):273-287,

1996.

BARBARO, K. C., M. L. FERREIRA, D. F. CARDOSO, V. R. EICKSTEDT, AND I.

MOTA. Identification and neutralization of biological activities in the venoms of Loxosceles

spiders. Braz J Med Biol Res 29 (11):1491-1497, 1996.

BARBARO, K. C., I. KNYSAK, R. MARTINS, C. HOGAN, AND K. WINKEL. Enzymatic

characterization, antigenic cross-reactivity and neutralization of dermonecrotic activity of five

Loxosceles spider venoms of medical importance in the Americas. Toxicon 45 (4):489-499,

2005.

BARBARO, K. C., M. S. LIRA, C. A. ARAUJO, A. PAREJA-SANTOS, B. C. TAVORA, J.

P. PREZOTTO-NETO, L. F. KIMURA, C. LIMA, M. LOPES-FERREIRA, AND M. L.

SANTORO. Inflammatory mediators generated at the site of inoculation of Loxosceles

gaucho spider venom. Toxicon 56 (6):972-979, 2010.

BECKWITH, M. L., J. L. BABCOCK, AND C. R. GEREN. Effects of antiserum on the

systemic response in mice caused by a component isolated from an extract of the brown

recluse spider (Loxosceles reclusa) venom apparatus. Toxicon 18 (5-6):663-666, 1980.

84

BEIL, W. J., G. MEINARDUS-HAGER, D. C. NEUGEBAUER, AND C. SORG.

Differences in the onset of the inflammatory response to cutaneous leishmaniasis in resistant

and susceptible mice. J Leukoc Biol 52 (2):135-142, 1992.

BETTGER, W. J., C. B. BLACKADAR, M. L. MCCORQUODALE, AND R. EWING. The

occurrence of Iso 24:0 (22-methyltricosanoic acid) fatty acid in sphingomyelin of rat tissues.

Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 119 (2):299-304, 1998.

BOWERS, B. J., E. H. OWEN, A. C. COLLINS, A. ABELIOVICH, S. TONEGAWA, AND

J. M. WEHNER. Decreased ethanol sensitivity and tolerance development in gamma-protein

kinase C null mutant mice is dependent on genetic background. Alcohol Clin Exp Res 23

(3):387-397, 1999.

BRADFORD, M. Analytical Biochemistry. 72, 248-254, 1976.

CACY, J., AND J. W. MOLD. The clinical characteristics of brown recluse spider bites

treated by family physicians: an OKPRN Study. Oklahoma Physicians Research Network. J

Fam Pract 48 (7):536-542, 1999.

CARDOSO, J. L. C., F. O. S. FRANÇA, F. H. WEN, C. M. S. MÁLAQUE, AND J. V.

HADDAD. Animais peçonhentos no Brasil: biologia, clínica e terapêutica dos acidentes.

Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo 45 (6):338, 2003.

CEOLOTTO, G., S. V. DE KREUTZENBERG, A. CATTELAN, A. S. FABRICIO, E.

SQUARCINA, M. GION, A. SEMPLICINI, G. P. FADINI, AND A. AVOGARO. Sirtuin 1

stabilization by HuR represses TNF-alpha and glucose induced E-Selectin release and

endothelial cell adhesiveness in vitro. Relevance to human metabolic syndrome. Clin Sci

(Lond), 2014.

CHAIM, O. M., Y. B. SADE, R. B. DA SILVEIRA, L. TOMA, E. KALAPOTHAKIS, C.

CHAVEZ-OLORTEGUI, O. C. MANGILI, W. GREMSKI, C. P. VON DIETRICH, H. B.

NADER, AND S. SANCHES VEIGA. Brown spider dermonecrotic toxin directly induces

nephrotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol 211 (1):64-77, 2006.

CHAIM, O. M., D. TREVISAN-SILVA, D. CHAVES-MOREIRA, A. C. WILLE, V. P.

FERRER, F. H. MATSUBARA, O. C. MANGILI, R. B. DA SILVEIRA, L. H. GREMSKI,

W. GREMSKI, A. SENFF-RIBEIRO, AND S. S. VEIGA. Brown spider (Loxosceles genus)

venom toxins: tools for biological purposes. Toxins (Basel) 3 (3):309-344, 2011.

CHAVIRA, R., JR., T. J. BURNETT, AND J. H. HAGEMAN. Assaying proteinases with

azocoll. Anal Biochem 136 (2):446-450, 1984.

CHEN, L., M. E. SCHREMENTI, M. J. RANZER, T. A. WILGUS, AND L. A. DIPIETRO.

Blockade of mast cell activation reduces cutaneous scar formation. PLoS One 9 (1):e85226,

2014.

COLEMAN, R., P. J. LOWE, AND D. BILLINGTON. Membrane lipid composition and

susceptibility to bile salt damage. Biochim Biophys Acta 599 (1):294-300, 1980.

85

DA SILVA, P. H., R. B. DA SILVEIRA, M. H. APPEL, O. C. MANGILI, W. GREMSKI,

AND S. S. VEIGA. Brown spiders and loxoscelism. Toxicon 44 (7):693-709, 2004.

DA SILVA, P. H., Y. HASHIMOTO, F. A. DOS SANTOS, O. C. MANGILI, W. GREMSKI,

AND S. S. VEIGA. Hematological cell findings in bone marrow and peripheral blood of

rabbits after experimental acute exposure to Loxosceles intermedia (brown spider) venom.

Toxicon 42 (2):155-161, 2003.

DA SILVEIRA, R. B., O. M. CHAIM, O. C. MANGILI, W. GREMSKI, C. P. DIETRICH,

H. B. NADER, AND S. S. VEIGA. Hyaluronidases in Loxosceles intermedia (Brown spider)

venom are endo-beta-N-acetyl-d-hexosaminidases hydrolases. Toxicon 49 (6):758-768,

2007a.

DA SILVEIRA, R. B., A. C. WILLE, O. M. CHAIM, M. H. APPEL, D. T. SILVA, C. R.

FRANCO, L. TOMA, O. C. MANGILI, W. GREMSKI, C. P. DIETRICH, H. B. NADER,

AND S. S. VEIGA. Identification, cloning, expression and functional characterization of an

astacin-like metalloprotease toxin from Loxosceles intermedia (brown spider) venom.

Biochem J 406 (2):355-363, 2007b.

DE ALMEIDA, D. M., F. FERNANDES-PEDROSA MDE, R. M. DE ANDRADE, J. R.

MARCELINO, H. GONDO-HIGASHI, L. DE AZEVEDO IDE, P. L. HO, C. VAN DEN

BERG, AND D. V. TAMBOURGI. A new anti-loxoscelic serum produced against

recombinant sphingomyelinase D: results of preclinical trials. Am J Trop Med Hyg 79

(3):463-470, 2008.

DELASOTTA, L. A., F. OROZCO, A. ONG, AND E. SHEIKH. Surgical treatment of a

brown recluse spider bite: a case study and literature review. J Foot Ankle Surg 53 (3):320-

323, 2014.

DESAI, A., H. A. LANKFORD, AND J. S. WARREN. Loxosceles deserta spider venom

induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in keratinocytes.

Inflammation 24 (1):1-9, 2000.

DI FERRANTE, N. Turbidimetric measurement of acid mucopolysaccharides and

hyaluronidase activity. J Biol Chem 220 (1):303-306, 1956.

DOMINGOS, M. O., K. C. BARBARO, W. TYNAN, J. PENNY, D. J. LEWIS, AND R. R.

New. Influence of sphingomyelin and TNF-alpha release on lethality and local inflammatory

reaction induced by Loxosceles gaucho spider venom in mice. Toxicon 42 (5):471-479, 2003.

DONEHOWER, L. A., M. HARVEY, H. VOGEL, M. J. MCARTHUR, C. A.

MONTGOMERY, JR., S. H. PARK, T. THOMPSON, R. J. FORD, AND A. BRADLEY.

Effects of genetic background on tumorigenesis in p53-deficient mice. Mol Carcinog 14

(1):16-22, 1995.

EL-KIK, C. Z., F. F. FERNANDES, M. A. TOMAZ, G. A. GABAN, T. F. FONSECA, S.

CALIL-ELIAS, S. D. OLIVEIRA, C. L. SILVA, A. M. MARTINEZ, AND P. A. MELO.

Neutralization of Apis mellifera bee venom activities by suramin. Toxicon 67:55-62, 2013.

86

ELSTON, D. M., J. S. EGGERS, W. E. SCHMIDT, A. B. STORROW, R. H. DOE, D.

MCGLASSON, AND J. R. FISCHER. Histological findings after brown recluse spider

envenomation. Am J Dermatopathol 22 (3):242-246, 2000.

FAGARASAN, S., N. WATANABE, AND T. HONJO. Generation, expansion, migration and

activation of mouse B1 cells. Immunol Rev 176:205-215, 2000.

FOELIX, R. Biology of Spiders. 3ª ed ed, 2010.

FORKS, T. P. Brown recluse spider bites. J Am Board Fam Pract 13 (6):415-423, 2000.

FULY, A. L., A. L. MACHADO, P. CASTRO, A. ABRAHAO, P. REDNER, U. G. LOPES,

J. A. GUIMARAES, AND V. L. KOATZ. Lysophosphatidylcholine produced by the

phospholipase A2 isolated from Lachesis muta snake venom modulates natural killer activity

as a protein kinase C effector. Toxicon 50 (3):400-410, 2007.

FULY, A. L., A. M. SOARES, S. MARCUSSI, J. R. GIGLIO, AND J. A. GUIMARAES.

Signal transduction pathways involved in the platelet aggregation induced by a D-49

phospholipase A2 isolated from Bothrops jararacussu snake venom. Biochimie 86 (9-10):731-

739, 2004.

FURLANETTO, R. Estudos sobre a preparação do soro antiloxoscélico, Universidade de São

Paulo, 1961.

FUTRELL, J. M. Loxoscelism. Am J Med Sci 304 (4):261-267, 1992.

GARCIA, E. S., J. A. GUIMARAES, AND J. L. PRADO. Purification and characterization of

a sulfhydryl-dependent protease from Rhodnius prolixus midgut. Arch Biochem Biophys 188

(2):315-322, 1978.

GOMEZ, H. F., D. M. GREENFIELD, M. J. MILLER, AND J. S. WARREN. Direct

correlation between diffusion of Loxosceles reclusa venom and extent of dermal

inflammation. Acad Emerg Med 8 (4):309-314, 2001.

GOMEZ, H. F., M. J. MILLER, A. DESAI, AND J. S. WARREN. Loxosceles spider venom

induces the production of alpha and beta chemokines: implications for the pathogenesis of

dermonecrotic arachnidism. Inflammation 23 (3):207-215, 1999.

GREMSKI, L. H., D. TREVISAN-SILVA, V. P. FERRER, F. H. MATSUBARA, G. O.

MEISSNER, A. C. WILLE, L. VUITIKA, C. DIAS-LOPES, A. ULLAH, F. R. DE

MORAES, C. CHAVEZ-OLORTEGUI, K. C. BARBARO, M. T. MURAKAMI, R. K.

ARNI, A. SENFF-RIBEIRO, O. M. CHAIM, AND S. S. VEIGA. Recent advances in the

understanding of brown spider venoms: From the biology of spiders to the molecular

mechanisms of toxins. Toxicon 83c:91-120, 2014.

HOGAN, C. J., K. C. BARBARO, AND K. WINKEL. Loxoscelism: old obstacles, new

directions. Ann Emerg Med 44 (6):608-624, 2004.

ISBISTER, G. K., AND H. W. FAN. Spider bite. Lancet 378 (9808):2039-2047, 2011.

87

JOSEFOWICZ, S. Z., L. F. LU, AND A. Y. RUDENSKY. Regulatory T cells: mechanisms of

differentiation and function. Annu Rev Immunol 30:531-564, 2012.

KALAPOTHAKIS, E., M. CHATZAKI, H. GONCALVES-DORNELAS, C. S. DE

CASTRO, F. G. SILVESTRE, F. V. LABORNE, J. F. DE MOURA, S. S. VEIGA, C.

CHAVEZ-OLORTEGUI, C. GRANIER, AND K. C. BARBARO. The Loxtox protein family

in Loxosceles intermedia (Mello-Leitao) venom. Toxicon 50 (7):938-946, 2007.

KEYSERLING GE. DIE SPINNEN AMERIKAS. BRASILIANISCHE SPINNEN.

NUREMBERG 167, REVISADO POR: BARBARO KC E CARDOSO JLC. Mecanismo de

Ação do Veneno de Loxosceles e Aspectos Clínicos do Loxoscelismo. Animais Peçonhentos

no Brasil 2ª ed., Sarvier 16:176-188, 2009.

LEE, S., AND K. R. LYNCH. Brown recluse spider (Loxosceles reclusa) venom

phospholipase D (PLD) generates lysophosphatidic acid (LPA). Biochem J 391 (Pt 2):317-

323, 2005.

LEONHARDT, J., J. F. KUEBLER, C. TUROWSKI, T. TSCHERNIG, R. GEFFERS, AND

C. PETERSEN. Susceptibility to experimental biliary atresia linked to different hepatic gene

expression profiles in two mouse strains. Hepatol Res 40 (2):196-203, 2010.

LIU, F., J. SMITH, Z. ZHANG, R. COLE, AND B. J. HERRON. Genetic heterogeneity of

skin microvasculature. Dev Biol 340 (2):480-489, 2010.

MA, Y., Y. LI, X. LI, AND Y. WU. Anti-inflammatory effects of 4-

methylcyclopentadecanone on edema models in mice. Int J Mol Sci 14 (12):23980-23992,

2013.

MACHIAVELLO A. La Loxosceles laeta. Causa del arachnoidismo cutâneo, a mancha

gangrenosa, de Chile. Rev Chil Hist Nat 11-41, 1937.

MAJESKI, J. A., AND G. G. DURST, SR. Necrotic arachnidism. South Med J 69 (7):887-

891, 1976.

MALAQUE, C. M., J. E. CASTRO-VALENCIA, J. L. CARDOSO, F. O. FRANCCA, K. C.

BARBARO, AND H. W. FAN. Clinical and epidemiological features of definitive and

presumed loxoscelism in Sao Paulo, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 44 (3):139-143,

2002.

MARINETTI, G. V. The action of phospholipase A on lipoproteins. Biochim Biophys Acta 98

(3):554-565, 1965.

MARQUES, S. M., P. P. CAMPOS, P. R. CASTRO, C. C. CARDOSO, M. A. FERREIRA,

AND S. P. ANDRADE. Genetic background determines mouse strain differences in

inflammatory angiogenesis. Microvasc Res 82 (3):246-252, 2011.

88

MARQUES-DA-SILVA, E., AND M. L. FISCHER. [Loxosceles Heinecken & Lowe, 1835

(Araneae; Sicariidae) species distribution in the State of Parana]. Rev Soc Bras Med Trop 38

(4):331-335, 2005.

MEDZHITOV, R., AND C. JANEWAY, JR. Innate immunity. N Engl J Med 343 (5):338-

344, 2000.

MOENKHAUS WJ. Contribuição para o conhecimento das aranhas de São Paulo. Ver Mus

Paul 3:77-112, 1898.

MONTON, C., A. RANO, AND A. TORRES. [Inflammatory response in pneumonia]. Arch

Bronconeumol 34 Suppl 2:11-16, 1998.

NOWATZKI, J., R. V. DE SENE, K. S. PALUDO, S. S. VEIGA, C. OLIVER, M. C.

JAMUR, H. B. NADER, E. S. TRINDADE, AND C. R. FRANCO. Brown spider venom

toxins interact with cell surface and are endocytosed by rabbit endothelial cells. Toxicon 56

(4):535-543, 2010.

OSPEDAL, K. Z., M. H. APPEL, J. FILLUS NETO, O. C. MANGILI, S. SANCHES

VEIGA, AND W. GREMSKI. Histopathological findings in rabbits after experimental acute

exposure to the Loxosceles intermedia (brown spider) venom. Int J Exp Pathol 83 (6):287-

294, 2002.

PAIXAO-CAVALCANTE, D., C. W. VAN DEN BERG, R. M. GONCALVES-DE-

ANDRADE, F. FERNANDES-PEDROSA MDE, C. K. OKAMOTO, AND D. V.

TAMBOURGI. Tetracycline protects against dermonecrosis induced by Loxosceles spider

venom. J Invest Dermatol 127 (6):1410-1418, 2007.

PALUDO, K. S., S. M. BISCAIA, O. M. CHAIM, M. F. OTUKI, K. NALIWAIKO, P. A.

DOMBROWSKI, C. R. FRANCO, AND S. S. VEIGA. Inflammatory events induced by

brown spider venom and its recombinant dermonecrotic toxin: a pharmacological

investigation. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 149 (3):323-333, 2009.

PALUDO, K. S., L. H. GREMSKI, S. S. VEIGA, O. M. CHAIM, W. GREMSKI, D. DE

FREITAS BUCHI, H. B. NADER, C. P. DIETRICH, AND C. R. FRANCO. The effect of

brown spider venom on endothelial cell morphology and adhesive structures. Toxicon 47

(8):844-853, 2006.

PATEL, K. D., V. MODUR, G. A. ZIMMERMAN, S. M. PRESCOTT, AND T. M.

MCINTYRE. The necrotic venom of the brown recluse spider induces dysregulated

endothelial cell-dependent neutrophil activation. Differential induction of GM-CSF, IL-8, and

E-selectin expression. J Clin Invest 94 (2):631-642, 1994.

PAULI, I., J. C. MINOZZO, P. H. DA SILVA, O. M. CHAIM, AND S. S. VEIGA. Analysis

of therapeutic benefits of antivenin at different time intervals after experimental

envenomation in rabbits by venom of the brown spider (Loxosceles intermedia). Toxicon 53

(6):660-671, 2009.

PAULI, I., J. PUKA, I. C. GUBERT, AND J. C. MINOZZO. The efficacy of antivenom in

loxoscelism treatment. Toxicon 48 (2):123-137, 2006.

89

PEREIRA, N. B., P. P. CAMPOS, T. DE JESUS OVIEDO SOCARRAS, T. S. PIMENTA, P.

M. PARREIRAS, S. S. SILVA, E. KALAPOTHAKIS, S. P. ANDRADE, AND L. MORO.

Sponge implant in Swiss mice as a model for studying loxoscelism. Toxicon 59 (7-8):672-

679, 2012.

PEREIRA, N. B., P. P. CAMPOS, P. M. PARREIRAS, H. CHIARINI-GARCIA, T. O.

SOCARRAS, E. KALAPOTHAKIS, S. P. ANDRADE, AND L. MORO. Apoptosis, mast cell

degranulation and collagen breakdown in the pathogenesis of loxoscelism in subcutaneously

implanted sponges. Toxicon 84c:7-18, 2014.

PIEPER, K., B. GRIMBACHER, AND H. EIBEL. B-cell biology and development. J Allergy

Clin Immunol 131 (4):959-971, 2013.

RATTMANN, Y. D., C. R. PEREIRA, Y. CURY, W. GREMSKI, M. C. MARQUES, AND

J. E. DA SILVA-SANTOS. Vascular permeability and vasodilation induced by the

Loxosceles intermedia venom in rats: involvement of mast cell degranulation, histamine and

5-HT receptors. Toxicon 51 (3):363-372, 2008.

RIBEIRO, L. A., M. T. JORGE, R. V. PIESCO, AND A. NISHIOKA SDE. Wolf spider bites

in Sao Paulo, Brazil: a clinical and epidemiological study of 515 cases. Toxicon 28 (6):715-

717, 1990.

RIBEIRO, R. O., O. M. CHAIM, R. B. DA SILVEIRA, L. H. GREMSKI, Y. B. SADE, K. S.

PALUDO, A. SENFF-RIBEIRO, J. DE MOURA, C. CHAVEZ-OLORTEGUI, W.

GREMSKI, H. B. NADER, AND S. S. VEIGA. Biological and structural comparison of

recombinant phospholipase D toxins from Loxosceles intermedia (brown spider) venom.

Toxicon 50 (8):1162-1174, 2007.

ROSENFELD G, NAHAS L, CILLO D, FLEURY C. Envenenamento por serpentes, aranhas

e escorpiões. Atualização Terapêutica 931-944, 1957.

SAMS, H. H., C. A. DUNNICK, M. L. SMITH, AND L. E. KING, JR. Necrotic arachnidism.

J Am Acad Dermatol 44 (4):561-573; quiz 573-566, 2001.

SCHENONE, H., T. SAAVEDRA, A. ROJAS, AND F. VILLARROEL. [Loxoscelism in

Chile. Epidemiologic, clinical and experimental studies]. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 31

(6):403-415, 1989.

SEHGAL, N., H. S. SMITH, AND L. MANCHIKANTI. Peripherally acting opioids and

clinical implications for pain control. Pain Physician 14 (3):249-258, 2011.

SENFF-RIBEIRO, A., P. HENRIQUE DA SILVA, O. M. CHAIM, L. H. GREMSKI, K. S.

PALUDO, R. BERTONI DA SILVEIRA, W. GREMSKI, O. C. MANGILI, AND S. S.

VEIGA. Biotechnological applications of brown spider (Loxosceles genus) venom toxins.

Biotechnol Adv 26 (3):210-218, 2008.

SEZERINO, U. M., M. ZANNIN, L. K. COELHO, J. GONCALVES JUNIOR, M.

GRANDO, S. G. MATTOSINHO, J. L. CARDOSO, V. R. VON EICKSTEDT, F. O.

FRANCA, K. C. BARBARO, AND H. W. FAN. A clinical and epidemiological study of

90

Loxosceles spider envenoming in Santa Catarina, Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 92

(5):546-548, 1998.

SINAN. Ministério da Saúde/SVS - Sistema de Informação de Agravos de Notificação -

Sinan Net, 2012.

SMITH, C. W., AND D. W. MICKS. The role of polymorphonuclear leukocytes in the lesion

caused by the venom of the brown spider, Loxosceles reclusa. Lab Invest 22 (1):90-93, 1970.

STRAUCH, M. A., M. A. TOMAZ, M. MONTEIRO-MACHADO, H. D. RICARDO, B. L.

CONS, F. F. FERNANDES, C. Z. EL-KIK, M. S. AZEVEDO, AND P. A. MELO.

Antiophidic activity of the extract of the Amazon plant Humirianthera ampla and constituents.

J Ethnopharmacol 145 (1):50-58, 2013.

SUNDERKOTTER, C., S. SEELIGER, F. SCHONLAU, J. ROTH, R. HALLMANN, T. A.

LUGER, C. SORG, AND G. KOLDE. Different pathways leading to cutaneous

leukocytoclastic vasculitis in mice. Exp Dermatol 10 (6):391-404, 2001.

SWANSON, D. L., AND R. S. VETTER. Bites of brown recluse spiders and suspected

necrotic arachnidism. N Engl J Med 352 (7):700-707, 2005.

TAMBOURGI, D. V., M. DE SOUSA DA SILVA, S. J. BILLINGTON, R. M.

GONCALVES DE ANDRADE, F. C. MAGNOLI, J. G. SONGER, AND C. W. VAN DEN

BERG. Mechanism of induction of complement susceptibility of erythrocytes by spider and

bacterial sphingomyelinases. Immunology 107 (1):93-101, 2002.

TAMBOURGI, D. V., R. M. GONCALVES-DE-ANDRADE, AND C. W. VAN DEN

BERG. Loxoscelism: From basic research to the proposal of new therapies. Toxicon 56

(7):1113-1119, 2010.

TAMBOURGI, D. V., F. C. MAGNOLI, C. W. VAN DEN BERG, B. P. MORGAN, P. S.

DE ARAUJO, E. W. ALVES, AND W. D. DA SILVA. Sphingomyelinases in the Venom of

the SpiderLoxosceles intermediaAre Responsible for both Dermonecrosis and Complement-

Dependent Hemolysis. Biochemical and Biophysical Research Communications 251 (1):366-

373, 1998.

TAMBOURGI, D. V., B. P. MORGAN, R. M. DE ANDRADE, F. C. MAGNOLI, AND C.

W. VAN DEN BERG. Loxosceles intermedia spider envenomation induces activation of an

endogenous metalloproteinase, resulting in cleavage of glycophorins from the erythrocyte

surface and facilitating complement-mediated lysis. Blood 95 (2):683-691, 2000.

TAMBOURGI, D. V., D. PAIXAO-CAVALCANTE, R. M. GONCALVES DE ANDRADE,

F. FERNANDES-PEDROSA MDE, F. C. MAGNOLI, B. PAUL MORGAN, AND C. W.

VAN DEN BERG. Loxosceles sphingomyelinase induces complement-dependent

dermonecrosis, neutrophil infiltration, and endogenous gelatinase expression. J Invest

Dermatol 124 (4):725-731, 2005.

TAVARES, F. L., M. C. SOUSA-E-SILVA, M. L. SANTORO, K. C. BARBARO, I. M.

REBECCHI, AND I. S. SANO-MARTINS. Changes in hematological, hemostatic and

91

biochemical parameters induced experimentally in rabbits by Loxosceles gaucho spider

venom. Hum Exp Toxicol 23 (10):477-486, 2004.

VAN DEN BORNE, S. W., V. A. VAN DE SCHANS, A. E. STRZELECKA, H. T.

VERVOORT-PETERS, P. M. LIJNEN, J. P. CLEUTJENS, J. F. SMITS, M. J. DAEMEN, B.

J. JANSSEN, AND W. M. BLANKESTEIJN. Mouse strain determines the outcome of wound

healing after myocardial infarction. Cardiovasc Res 84 (2):273-282, 2009.

VEIGA, S. S., R. B. DA SILVEIRA, J. L. DREYFUS, J. HAOACH, A. M. PEREIRA, O. C.

MANGILI, AND W. GREMSKI. Identification of high molecular weight serine-proteases in

Loxosceles intermedia (brown spider) venom. Toxicon 38 (6):825-839, 2000.

VEIGA, S. S., V. C. ZANETTI, A. BRAZ, O. C. MANGILI, AND W. GREMSKI.

Extracellular matrix molecules as targets for brown spider venom toxins. Braz J Med Biol Res

34 (7):843-850, 2001.

VUITIKA, L., L. H. GREMSKI, M. R. BELISARIO-FERRARI, D. CHAVES-MOREIRA,

V. P. FERRER, A. SENFF-RIBEIRO, O. M. CHAIM, AND S. S. VEIGA. Brown spider

phospholipase-D containing a conservative mutation (D233E) in the catalytic site:

identification and functional characterization. J Cell Biochem 114 (11):2479-2492, 2013.

WEN, F. H., F. O. D. S. FRANÇA, AND J. L. C. CARDOSO. Animais Peçonhentos no

Brasil. Edited by II:153-224. 2ª ed. ed, 2009.

WICKS, K., T. TORBICA, AND K. A. MACE. Myeloid cell dysfunction and the

pathogenesis of the diabetic chronic wound. Semin Immunol, 2014.

WILSON, J. R., C. O. HAGOOD, JR., AND I. D. PRATHER. Brown recluse spider bites: a

complex problem wound. A brief review and case study. Ostomy Wound Manage 51 (3):59-

66, 2005.

WHITE J, CARDOSO JL, FAN HW. Clinical toxicology of spider bites. Handbook of

clinical toxicology of animal venoms and poisons 261-329, 1995.

WRIGHT, S. W., K. D. WRENN, L. MURRAY, AND D. SEGER. Clinical presentation and

outcome of brown recluse spider bite. Ann Emerg Med 30 (1):28-32, 1997.

ZANETTI, V. C., R. B. DA SILVEIRA, J. L. DREYFUSS, J. HAOACH, O. C. MANGILI, S.

S. VEIGA, AND W. GREMSKI. Morphological and biochemical evidence of blood vessel

damage and fibrinogenolysis triggered by brown spider venom. Blood Coagul Fibrinolysis 13

(2):135-148, 2002.

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