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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Nathalie Zamagni Bessa COMPARAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO GENE MC1R EM INDIVÍDUOS CAUCASIANOS E NEGROS São Paulo 2014
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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Nathalie Zamagni Bessa
COMPARAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO GENE MC1R EM
INDIVÍDUOS CAUCASIANOS E NEGROS
São Paulo
2014
UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
NATHALIE ZAMAGNI BESSA
COMPARAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO GENE MC1R EM
INDIVÍDUOS CAUCASIANOS E NEGROS
Monografia apresentada ao Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde, da
Universidade Presbiteriana Mackenzie
como parte dos requisitos exigidos para a
conclusão do Curso de Ciências
Biológicas.
Orientadora Externa: Drª Cintia Fridman
Orientadora Interna: Drª Ana Paula Pimentel Costa
São Paulo
2014
NATHALIE ZAMAGNI BESSA
COMPARAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO GENE MC1R EM
INDIVÍDUOS CAUCASIANOS E NEGROS
Monografia apresentada ao Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde, da
Universidade Presbiteriana Mackenzie
como parte dos requisitos exigidos para a
conclusão do Curso de Ciências
Biológicas.
Aprovada em: ___________
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________________
Drª Ana Paula Pimentel Costa
_______________________________________________________________
Drª Cintia Fridman
_______________________________________________________________
Drª Fernada de Toledo Gonçalves
A minha mãe Agnes Zamagni, por todo
amor, carinho, confiança e dedicação.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Presbiteriana Mackenzie e ao Centro de Ciências Biológicas e da
Saúde pela formação de qualidade a mim oferecida;
A minha orientadora, Dra. Cintia Fridman, um agradecimento especial pela
oportunidade de estágio, disponibilidade, paciência, incentivo e ensinamentos
oferecidos durante todo o processo;
A Dra. Ana Paula Pimentel Costa por ter aceito o pedido de ser minha orientadora
interna, por toda ajuda, boa vontade e disponibilidade;
Aos professores do curso de Ciências Biológicas da Universidade Presbiteriana
Mackenzie, que são grandes pessoas, pela dedicação e boa vontade de repassar
seus conhecimentos;
A Doutora Fernanda de Toledo Gonçalves, pela boa vontade, apoio e
conhecimentos compartilhados;
As meninas do laboratório, Mari Cardena, Felícia Lima e Bruna Gabriela Tanzi,
pessoas maravilhosas e companheiras que tive o privilégio de conhecer, estando
sempre presentes e disponíveis, me ajudando e me incentivando. Obrigada pelos
ótimos momentos e ensinamentos que tanto contribuíram para minha formação
profissional e pessoal;
A minha mãe Agnes Zamagni, que acreditou na minha capacidade, me apoiando e
incentivando a todo momento. Sem você nada disso seria possível. Obrigada por ser
uma mãe maravilhosa, por todo amor, orgulho e carinho que tem por mim. Espero
um dia me tornar uma mulher tão impressionante e forte quanto você;
Ao meu pai, Mario Cesar Bessa, por acreditar na minha capacidade e me amar e
incentivar sempre. A você todo meu amor e respeito;
Aos meus familiares por estarem sempre presentes e me apoiando;
Aos meus amigos, Gabriela Wittner, Flávia Credidio e Alfredo Silva, por toda
paciência que tiveram comigo, me ajudando a todo momento, me fazendo acreditar
que eu era capaz e que no final tudo daria certo. Obrigada pelos momentos incríveis
que passei com vocês, e sem dúvida que vocês tornam meu dia muito mais alegre;
Por fim, a todos doadores voluntários desse projeto.
A mente que se abre a uma nova ideia
jamais voltará ao seu tamanho original.
(Albert Einstein)
RESUMO
A pigmentação humana é muito diversificada, podendo ser modificada por fatores
internos e externos. Os fatores internos responsáveis por esse controle são os
genes de pigmentação. Um dos principais genes é o receptor de melanocortina 1
(MC1R) que codifica uma proteína de mesmo nome, do tipo receptor acoplado a
proteína G (GPCR), que é expressa por melanócitos da pele desencadeando
respostas que ativam as vias determinantes no processo da pigmentação. O MC1R
responde a dois ligantes: ao agonista α-MSH que leva à síntese de eumelanina,
responsável pelo fenótipo escuro, e ao antagonista ASIP, que desencadeia a síntese
de feomelanina, associada ao fenótipo claro. A ocorrência de SNPs no gene MC1R
causa alterações no fenótipo, pois promovem modificações no receptor que alteram
a via da melanogênese. Estudos tem demostrado que a análise genotípica dos
polimorfismos dos genes de pigmentação pode ser útil nas ciências forenses, pois
pode permitir a predição de fenótipos como cor de pele, olhos e cabelo, auxiliando
na identificação humana. O objetivo desse trabalho foi verificar se há diferença de
frequência dos polimorfismos do gene MC1R em indivíduos brancos e negros da
população brasileira, e verificar a ocorrência de associações com a cor de pele.
Nesse estudo foram analisados 8 SNPs do gene MC1R em 41 indivíduos brasileiros,
20 autodeclarados brancos e 21 negros. Todas as variáveis estudadas mostraram
estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg e foi encontrada uma forte associação entre
o polimorfismo V60L e a cor de pele clara (OR: 10,77; IC: 1,18 - 98,00), em
heterozigose. Para os outros 7 SNPs estudados não foram encontradas associações
estaticamente significativas. O resultado analisado está de acordo com outros
estudos realizados em populações homogêneas, que verificaram alta frequência da
variante V60L em indivíduos europeus. Os resultados sugerem que futuramente, as
análises dos SNPs do gene MC1R podem servir como ferramenta para práticas
forenses, possibilitando a predição fenotípica. Porém é necessária a realização de
estudos adicionais em populações miscigenadas para que se estabeleça um padrão
que possibilite o uso prático e confiável.
Palavras-chave: MC1R, SNP, pigmentação, cor de pele, população Brasileira
ABSTRACT
Human pigmentation is very variable and can be modified by internal and external
factors. Pigmentation genes are the internal factors responsible for this control. One
of the major genes is the melanocortin 1 receptor (MC1R) encoding a protein of the
same name, which is a G-protein-coupled receptor (GPCR), expressed by
melanocytes in the skin, triggering responses that activate determinants pathways in
the pigmentation process. MC1R responds to two ligands: the agonist, α-MSH that
leads to the synthesis of eumelanin, responsible for the dark phenotype, and the
antagonist ASIP, which triggers the synthesis of pheomelanin, related to light
phenotype. The occurrence of SNPs in MC1R gene causes changes in phenotype,
because they promote changes in the receptor that alter the path of melanogenesis.
Studies have shown that genotypic analysis of polymorphisms in pigmentation genes
may be useful in forensic, since it may allow the prediction of phenotypes, such as
skin, eyes and hair color, helping human identification. The aim of this study was to
observe the differences in frequencies of polymorphisms of the MC1R gene in
individuals of Brazilian population with white and black skin color, and to verify the
occurrence of associations with the skin color. In this study, eight SNPs in the MC1R
gene were analyzed in 41 Brazilians, 20 self-declared as white and 21 as black. For
all the variants, no deviation was observed in the Hardy-Weinberg Proportions and a
strong association was found between the V60L heterozygous polymorphism and
light skin color (OR: 10.77; CI: 1.18 to 98.00). For the other seven SNPs studied, no
statistically significant associations were found. The results are in agreement with
other studies in homogeneous populations that found a high frequency of the variant
V60L in European individuals. The results suggest that future analysis of SNPs for
the MC1R gene may serve as a tool for forensic practice, allowing phenotypic
prediction. However additional studies in admixed populations in order to establish a
standard that enables the practical and reliable usage are required.
Key-words: MC1R, SNP, pigmentation, skin color, Brazilian population
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Alterações que ocorrem no receptor em relação às variantes genéticas do
MC1R ....................................................................................................................... 15
Tabela 2. Distribuição das frequências da ancestralidade de pais e avós informadas
pelos indivíduos autodeclarados brancos e negros ................................................. 24
Tabela 3. Distribuição das frequências dos pais brasileiros por regiões de
nascimento informadas pelos indivíduos autodeclarados brancos e negros ........... 25
Tabela 4. Distribuição das frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do
gene MC1R em indivíduos brancos ......................................................................... 26
Tabela 5. Distribuição das frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do
gene MC1R em indivíduos negros ........................................................................... 27
Tabela 6. Análise dos polimorfismos do gene MC1R em relação à cor de pele ..... 28
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ASIP – proteína sinalizadora de Agouti
cAMP – AMP cíclico ou monofosfato cíclico de adenosina
DNA - ácido desoxirribonucleico
DMSO - dimetilsulfóxido
dNTP - desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético
ELS – laços extracelulares
GPCR – receptor acoplado a proteína G
IC – intervalo de confiança
ILS – laços intracelulares
MC – melanocortinas
MC1R – receptor de melanocortina 1
MgCl2 – cloreto de magnésio
MITF – fator de transcrição associado à microfitalmia
ml – mililitro
mM - milimolar
ng/μl – nanograma por microlitro
nm - nanómetro
OR – Odds Ratio
pb – pares de base
PCR – reação em cadeia da polimerase
POMC – pró-opiomelanocortina
SNP – polimorfismo de base única
TE – tampão Tris-EDTA ou tampão hidroximetilaminometano - ácido etilenodiamino
tetra-acético
TYR – enzima tirosinase
UV – radiação ultravioleta
α-MSH – hormônio estimulante de α-melanócito
μl - microlitro
°C- graus Celsius
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 13
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 19
3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 20
3.1. Casuística .............................................................................................. 20
3.2. Questionário ........................................................................................... 20
3.3. Extração de DNA .................................................................................... 21
3.4. Amplificação dos polimorfismos do gene MC1R ................................... 21
3.5. Reação de sequenciamento .................................................................. 22
3.6. Análise dos polimorfismos do gene MC1R ............................................ 22
3.7. Análise estatística .................................................................................. 22
4. RESULTADOS .................................................................................................... 24
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 29
6. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 32
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 33
13
1. INTRODUÇÃO
A pigmentação humana é muito diversificada, podendo ser modificada por
fatores como idade, drogas, medicação, ambiente, e também pela pressão
evolutiva gerada pelos diferentes níveis de radiação ultravioleta (UV) que incide nas
várias latitudes geográficas (PNEUMAN et al., 2012; PÓSPIECH et al., 2014).
Como consequência, indivíduos negros apresentam o pigmento da pele de forma
concentrada, no qual confere proteção à radiação UV, e nos indivíduos de pele
clara houve um relaxamento da pressão evolutiva, fazendo com que os níveis de
vitamina D se mantivessem adequados, mesmo em regiões de alta latitude, onde
há menor incidência de raios UV para estimular a síntese dessa vitamina (SULEM
et al., 2007).
A coloração da pele se dá, principalmente, devido à presença do pigmento
melanina, que é produzida continuamente nos melanossomos, dentro dos
melanócitos. Os melanócitos são células dendríticas especializadas, derivadas da
crista neural durante o desenvolvimento embrionário, estando localizados na
camada basal da epiderme e rodeados por queratinócitos. Os melanossomos são
organelas compostas por membranas altamente especializadas produzidas pelo
complexo de Golgi e pelo retículo endoplasmático (SCHERER; KUMAR, 2010). A
síntese de melanina, denominada melanogênese, é controlada por uma cascata de
reações que envolvem várias enzimas, receptores, fatores de transcrição,
transportadores de canal iônico e genes que codificam ligantes (SCHERER;
KUMAR, 2010).
Um desses genes é o receptor de melanocortina 1 (MC1R), composto por 1
éxon de 951pb que codifica 317 aminoácidos (RANA et al., 1999), localizado no
cromossomo 16 (16q24.3) (IRA et al., 1994). O MC1R codifica uma proteína de
mesmo nome cuja resposta é mediada por ações fisiológicas dos seus ligantes, as
melanocortinas (MCs), pertencentes ao grupo de hormônios peptídicos sintetizados
na pituitária e pele (DOYLE et al., 2012), tendo como precursor a pró-
opiomelanocortina (POMC), que é clivado em α-MSH (hormônio estimulante de α-
melanócito) que age como agonista de MC1R (DOYLE et al., 2012).
O MC1R codifica uma proteína do tipo receptor acoplado a proteína G
(GPCR), expressa por melanócitos na pele (GARCÍA-BORRÓN; OLIVARES, 2013;
SWITONSKI et al., 2013) e destinada a receber mensagens químicas, como a luz,
14
e desencadear respostas que ativam as vias determinantes no processo de
pigmentação (GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-LAORDEN; JIMÉNEZ-CERVANTES,
2005). Essa proteína possui características estruturais específicas dos GPCRs,
como a presença de N-terminal extracelular, sete domínios transmembrana (TM),
estando conectados por três laços extracelulares (ELS) e intracelulares (ILS) e um
C-terminal intracelular (GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-LAORDEN; JIMÉNEZ-
CERVANTES, 2005; HITOSHI, 2013).
O receptor de melanocortina 1 responde a dois ligantes de moléculas
sinalizadoras, o agonista α-MSH e o antagonista ASIP (proteína sinalizadora de
Agouti) (HITOSHI, 2013). Ao se ligar ao α-MSH ocorre um acoplamento positivo
desencadeando a adenil ciclase e, subsequentemente, o aumento do nível
intracelular do cAMP (DOYLE et al., 2012) e ativação do fator de transcrição
associado à microftalmia (MITF). Dentro dos melanócitos várias enzimas são
ativadas, dentre elas a tirosinase (TYR), que é limitante da velocidade da reação
que cataliza a conversão da tirosina em dopaquinona. O produto dessa reação é
transportado para os melanossomos e oxidado, que devido ao maior estimulo
realizado pela TYR leva à síntese de eumelanina, sendo esse um pigmento
insolúvel e escuro (TULLY, 2007). Quando o MC1R interage com o ASIP ocorre
redução no nível de cAMP e, consequentemente, menor atividade da tirosinase,
que resulta na produção de cistenildopa devido a conjugação da dopaquinona com
o aminoácido cisteína, gerando um pigmento solúvel e avermelhado, a feomelanina
(SCHERER; KUMAR, 2010; HITOSHI, 2013).
A síntese de eumelanina resulta em um fenótipo escuro, ou seja, cor de pele,
olhos e cabelo preto/marrom (SCHERER; KUMAR, 2010). Já a produção de
feomelanina, gera um fenótipo claro, estando associado a indivíduos de pele
branca, cabelo vermelho ou loiro, baixa capacidade de bronzeamento em resposta
a radiação UV, e a presença de sardas (SCHERER; KUMAR, 2010; GARCÍA-
BORRÓN; OLIVARES, 2013; PUIG-BUTILLÉ et al., 2013).
Devido à ocorrência de polimorfismos de base única (SNPs) no MC1R
(HITOSHI, 2013), suas variantes alélicas podem afetar o fénotipo, pois podem
resultar em diversos eventos como a perda da função do receptor (SWOPE et al.,
2012); prejudicar ou inibir a ligação do agonista (α-MSH) ao receptor; promover a
redução da resposta após o estímulo; diminuir a eficiência do acoplamento;
interferir no tráfego intracelular; e gerar a retenção intracelular ou redução da
15
expressão do receptor (GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-LAORDEN; JIMÉNEZ-
CERVANTES, 2005, SCHERER; KUMAR, 2010; MARANO, 2011), o que culmina
na falta de estímulo da via do cAMP levando a síntese de feomelanina (DOYLE et
al., 2012). As alterações ocorridas no receptor, em relação às variantes genéticas
que as causam estão listadas na Tabela 1.
Tabela 1: Alterações que ocorrem no receptor em relação às variantes genéticas do MC1R.
Alterações no receptor Polimorfimos Referências
Diminuição da afinidade de
ligação com o agonista
D84E, R142H,
R151C, R160W
GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-
LAORDEN; JIMÉNEZ-CERVANTES,
2005
Retenção intracelular, ou
reduzida, da expressão do
receptor
V60L D84E,
R151C, I155T,
R160W
GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-
LAORDEN; JIMÉNEZ-CERVANTES,
2005; MARANO, 2011; DOYLE et al,
2012
Redução da resposta após
estímulo do agonista
V92M, R151C,
R160W
GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-
LAORDEN; JIMÉNEZ-CERVANTES,
2005
Diminuição da eficiência do
acoplamento R163Q MARANO, 2011
Tráfego intracelular
prejudicado R151C, R160W
GARCÍA-BARRÓN; SÁNCHEZ-
LAORDEN; JIMÉNEZ-CERVANTES,
2005
Perda da função do receptor R151C, R160W SWOPE et al., 2012
Os polimorfismos do MC1R descritos como possuindo associação genética
com o fenótipo claro são: V60L (rs1805005), D84E (rs1805006), V92M (rs2228479),
R142H (rs11547464), R151C (rs1805007), I155T (rs1110400) e R160W
(rs1805008) (BRANICKI et al., 2007; RAIMONDI et al., 2008; PÓSPIECH et al.,
2014).
O SNP V60L (Val60Leu) é caracterizado pela mudança da base nitrogenada
G (guanina) para T (timina) (GTG > TTG), que acarreta a alteração do aminoácido
valina para o aminoácido leucina na posição 60 da proteína. O polimorfismo D84E
(Asp84Glu) é a mudança, na posição 84 da cadeia proteica, do aminoácido
16
aspartato para o aminoácido glutamato, que ocorre devido a troca da base citosina
(C) para adenina (A) (CCT > ACT). A variante V92M (Val92Met) promove a
mudança da base nitrogenada guanina para adenina (GTG > ATG), que ocasiona a
alteração do aminoácido valina para o aminoácido metiolina, na posição 92 da
proteína.
O polimorfismo R142H (Arg142His) é caracterizado pela modificação da base
nitrogenada guanina para adenina (GCA > ACA), que acarreta, na posição 142 da
proteína, a substituição do aminoácido arginina pelo aminoácido histidina. A variante
R151C (Arg151Cys) gera, na posição 151 da cadeia proteica, a alteração do
aminoácido arginina para o aminoácido cisteina, sendo promovida pela troca da
base citosina para timina (CGC > TGC). O SNP I155T (Ile155Thr) é ocasionado pela
mudança do aminoácido isoleucina para o aminoácido treonina, causada pela troca
da base nitrogenada timina pela citosina (TCG > CCG), na posição 155 da proteína.
A variante R160W (Arg160Trp) é a modificação, na posição 160 da cadeia
proteica, da base citosina pela timina (CGG > TGG), que promove a substituição do
aminoácido arginina pelo aminoácido triptofano. O SNP R163Q (Arg163Gln) causa a
alteração do aminoácido arginina pelo aminoácido glutamato, na posição 163 da
proteína, ocasionada pela mudança da base nitrogenada guanina pela adenina
(GAG > AAG).
Acredita-se que as populações humanas ancestrais habitavam a região da
África, estando próximas à linha do Equador, apresentando pele, olhos e cabelos
escuros, pois esse tipo de pigmentação exerce função de proteção contra os raios
UV (SULEM et al., 2007; HOCHBERG; TEMPLETON, 2010). A migração de
indivíduos para regiões de maiores latitudes culminou no aumento gradual do
clareamento da pele (HOCHBERG; TEMPLETON, 2010; SCHERER; KUMAR,
2010), com os indivíduos de ascendência europeia e do Leste Asiático (SULEM et
al., 2007). Atualmente, pode-se notar também um padrão diferenciado da cor no
Hemisfério Norte e no Hemisfério Sul (SCHERER; KUMAR, 2010).
O clareamento da pele foi uma resposta adaptativa positiva, pois a síntese de
vitamina D é estimulada pela radiação UV (SCHERER; KUMAR, 2010), que devido
as variações nos genes de pigmentação, permitiu o nível adequado da síntese
mesmo em baixas quantidades de exposição à UV (SULEM et al., 2007). A
importância dessa vitamina se dá pelo fato do seu receptor ser um fator de
transcrição muito variável e potente, estando relacionado à absorção de cálcio,
17
desenvolvimento e mineralização do esqueleto, regulação do crescimento celular e
a inibição do crescimento de células cancerígenas (HOCHBERG; TEMPLETON,
2010).
A diferenciação geográfica da pigmentação humana nos dias atuais reflete
uma história adaptativa (SULEM et al., 2007), sendo interessante para avaliar
possíveis cenários evolutivos, que permite a compreensão do desenvolvimento
natural à partir das forças seletivas que atuam a longo prazo, tornando-se útil para
entender a natureza da adaptação, onde alterações moleculares como a alteração
de um aminoácido e da expressão gênica causam mudanças funcionais (HITOSHI,
2013).
É notada a ocorrência elevada de polimorfismos presentes no gene MC1R
em populações de origem caucasiana, o que causa impacto significativo no fenótipo
de pigmentação desse grupo (BRANICKI et al., 2007; PÓSPIECH, et al., 2014).
Na população do Norte da Europa os polimorfismos mais frequentemente
observados são: R142H, R151C e R160W, estando relacionados a 60% do fenótipo
claro sendo que, pelo menos um deles é encontrado em 30% dos indivíduos dessa
região (SCHERER; KUMAR, 2010). Na Europa Central, região da Polônia, as
variantes R151C e R160W são as mais significativas para as características de
cabelo ruivo e pele clara, presentes em 97,5% dos indivíduos com esse fenótipo
(BRANICKI et al., 2007). No Sul e Norte da Europa, assim como nos Estados
Unidos, o SNP mais significativo descrito é o V60L (SAVAGE et al., 2008). A maior
frequência do polimorfismo R142H também foi observada em indivíduos ruivos na
Polônia, Reino Unido e Estados Unidos. Já na Austrália, a maior frequência
observada foi da variante D84E (BRANICKI et al., 2007; SAVAGE et al., 2008).
Na região do Mediterrâneo os polimorfismos mais significativos são os
mesmos observados no Norte da Europa, com ocorrência de pelo menos uma
dessas variantes em 89% dos indivíduos de cabelo ruivo; também nessa população
foi analisada a associação do alelo R142H à cor de olhos verdes ou azuis (PUIG-
BUTILLÉ et al., 2013). Em populações de origem asiática a frequência da variante
R163Q é mais elevada quando comparada à indivíduos europeus, (PUIG-BUTILLÉ
et al., 2013), sendo identificada em 70% dos indivíduos do Leste/Sudestes asiático
(DOYLE et al., 2012).
Tem sido demonstrado, por meio de estudos, que a predição fenotípica a
partir da análise genotípica de polimorfismos existentes em genes de pigmentação,
18
como o MC1R, pode ser útil na ciência forense, permitindo a predição de
características físicas como, cor de olhos, pele e cabelo, de um indivíduo
(BRANICKI et al., 2007; CERQUEIRA et al., 2014). Desta maneira, torna possível o
direcionamento nas buscas de um suspeito de crime, podendo também auxiliar na
identificação de um agressor, vítima, corpo desconhecido, ou a diminuir o número
de indivíduos suspeitos (PÓSPIECH et al., 2014).
Considerando-se que a população brasileira é altamente miscigenada e
apresenta diferentes níveis de contribuições de grupos ancestrais (ameríndios,
europeus e africanos), são necessários estudos adicionais para averiguar possíveis
associações também nessa população.
19
2. OBJETIVO
O presente projeto teve por objetivo verificar se há diferença de frequência
entre polimorfismos no gene MC1R em indivíduos de pele clara e indivíduos de
pele negra da população brasileira e, portanto, avaliar se há associação desses
polimorfismos com a caracteristica cor de pele, para que possa ser usado como
parâmetro em casos de identificação humana.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Casuística
Nesse estudo foram analisados 41 indivíduos, sendo 20 caucasianos e 21
negros segundo autodeclaração em relação à cor de pele, todos voluntários sadios,
sem parentesco, de ambos os sexos, maiores de 18 anos e provenientes do
complexo HC-FMUSP e Fundação Faculdade de Medicina. Esse é um sub-projeto
de um projeto maior que consiste em avaliar diversos genes de pigmentação em
600 indivíduos da população brasileira para finalidade de identificação humana e
predição fenotípica, desenvolvido no Departamento de Medicina Legal, Ética
Médica e Medicina Social e do Trabalho da Faculdade de Medicina da USP.
Os voluntários assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
aprovado pela Comissão de Ética do Hospital das Clínicas.
3.2. Questionário
Os participantes responderam a um questionário que incluía questões sobre
informações sociodemográficas (sexo, idade, local de nascimento, grau de
escolaridade e renda), uso de cigarro e de álcool, de medicamentos, uso de filtro
solar e bronzeador, cor dos olhos, pele e cabelo, sensibilidade da pele ao sol e a
presença de sardas.
A classificação da coloração da pele foi realizada por meio da
autodeclaração, e também por meio da aferição da densidade de melanina, com
uso de espectrofotômetro na face interna do braço, por ser uma região com menor
capacidade de bronzeamento, mais acessível e por sofrer menos influência de
fatores externos. Antes de cada medição foi feita a calibração do equipamento
usando-se uma superfície de referência, uma preta e outra branca.
A densidade de melanina na pele foi medida pela refletância nos
comprimentos de onda de 400 e 420 nm, segundo a relação:
21
Na equação, testada em indivíduos caucasianos por Dwyer et al. (1998),
DM400 é uma estimativa da porcentagem da epiderme que contém melanina, e
R400 e R420 denotam a média de três medidas da refletância a 400 e a 420 nm
feitas nessa área anatômica.
Para obter o padrão da coloração do cabelo, os voluntários foram
questionados sobre a coloração original dos fios aos 15 anos de idade e,
posteriormente, foi apresentada uma grade de possíveis cores de cabelo para que
fosse apontada a cor mais próxima da que possuía dentre as opções.
Para obtenção da cor de olhos, os voluntários apontaram a cor de seus olhos
naturais em uma grade apresentada, retirada de um estudo que estabeleceu um
sistema de SNPs para predição de cor de olhos para finalidade forense (WALSH et
al., 2011). Após a classificação da coloração pelo voluntário, foi tirada uma
fotografia com câmera digital, apenas da região dos olhos, para que uma análise
posterior fosse realizada por dois pesquisadores envolvidos no estudo, uma vez
que a autoanálise pode apresentar subjetividade.
Para a finalidade desse trabalho, foram utilizados apenas os dados de
autodeclaração de cor de pele.
3.3. Extração de DNA
Foram coletadas amostras de sangue periférico (4ml) dos voluntários em
tubos contendo EDTA. A extração do DNA foi realizada pelo processo de Salting-
out, de acordo com o protocolo de Muller et al. (1988). O DNA extraído foi eluído
em tampão TE (Tris-EDTA), quantificado em espectrofotômetro Nanodrop 2000
(Thermo Scientific), aliquotado e armazenado em tubos do tipo eppendorf em
freezer -20°C para posterior genotipagem e análise de polimorfismos.
3.4. Amplificação dos polimorfismos do gene MC1R
As amostras de DNA foram amplificadas para a totalidade do gene MC1R,
para posterior análise dos polimorfismos nele presentes por meio de uma reação de
PCR, utilizando sequências de oligonucleotídeos descritas por Preising et. al
(2011). Os primers utilizados para amplificação dos 951pb do gene MC1R foram
MC1R-F 5′ ACTTAAAGCCGCGTGCACCG 3′ para a fita foward e MC1R-R 5′
22
AGGCCTCCAACGACTCCTTCCT 3′ para a fita reverse (PRESING et al., 2011) . As
reações de PCR foram conduzidas em um volume total de 25μl, sendo 2μl de DNA
genômico a 50ng/μl, 1,25μl de cada primer (10mM) e 0,5μl dNTP (10mM), 2,5μl de
buffer, 0,75μl de MgCl2, 5 unidades de Taq polimerase, 2,5μl de DMSO e 14μl de
água ultra pura. A ciclagem térmica foi realizada em termociclador Veriti da marca
Applied Biosystems, com condições de desnaturação inicial de 94°C por 5 minutos,
seguido de 35 ciclos de desnaturação de 94°C por 1 minuto, anelamento de 60°C
por 1 minuto e extensão de 72°C por 2 minutos. A extensão final foi de 72°C por 10
minutos.
3.5. Reação de sequenciamento
Os produtos de PCR foram sequenciados com a utilização do BigDye
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), conforme
protocolo do fabricante. Para sequenciamento do gene MC1R foi usado o mesmo
primer foward utilizado na reação de PCR (PRESING et al., 2011).
Após sequenciamento e precipitação das amostras com EDTA e etanol, foi
realizada eletroforese capilar com a utilização do sequenciador ABI3130 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) e os resultados foram analisados em software
específico denominado BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html).
3.6. Análise dos polimorfismos do gene MC1R
Foram avaliados oito polimorfismos do gene MC1R que já foram descritos na
literatura sendo relacionados com variações de pigmentação, sendo eles: V60L
(rs1805005), D84E (rs1805006), V92M (rs2228479), R142H (rs11547464), R151C
(rs1805007), I155T (rs1110400), R160W (rs1805008) e R163Q (rs885479).
3.7. Análise estatística
Foi calculado o equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada SNP avaliado e a
existência de desequilíbrio de ligação entre os sítios polimórficos analisados,
utilizando-se Monte Carlo’s Goodness-of-fit test. Visando assim verificar se as
variantes estavam, ou não, sofrendo pressão seletiva.
23
Para estimar as associações entre as características fenotípicas e genotípicas,
foram calculadas a Odds Ratio (OR) com intervalos de confiança de 95% (IC 95%).
O Odds Ratio é um parâmetro aplicado para estudos de associação, que
representa o risco de uma pessoa apresentar um determinado fenótipo considerado
quando possui o genótipo em questão. Nele é calculada a razão entre a
probabilidade de um indivíduo apresentar um fenótipo estabelecido ao possuir um
determinado genótipo, e a probabilidade desse fenótipo não ocorrer mesmo na
presença do genótipo.
A associação de cada SNP estudado com a cor de pele foi avaliada pelo Teste
exato de Fisher, com uso do sofware STATA 9.1 (StataCorp, College Station.
Texas, EUA).
24
4. RESULTADOS
Foi estudada uma amostra total de 41 indivíduos, dentre eles 20
autodeclarados como brancos e 21 como negros, com idade média de 35,44 (±
11,50) anos. Da amostra com pele clara, foram avaliados 14 indivíduos do sexo
feminino (70,0%) e 6 do sexo masculino (30,0%); nos indivíduos negros foram
analisadas 6 mulheres (28,57%) e 15 homens (71,43%).
Por meio da verificação dos dados informados pelos indivíduos estudados, foi
possível evidenciar a ancestralidade dos mesmos por meio do local de nascimento
de seus familiares (pais e avós). Salientamos que nem todos os indivíduos
estudados sabiam relatar a origem de seus pais e avós e, portanto, esses dados
foram avaliados em uma amostra com número diferente para cada categoria. Em
relação aos pais, os indivíduos negros possuem na sua totalidade pais de origem
brasileira (100%), sendo esses 48,78% provenientes da região Nordeste, 41,46% do
Sudeste, 4,88% do Centro-Oeste e 4,88% da região Sul (Tabelas 2 e 3).
Dos indivíduos brancos, 92,1% dos pais apresentam nacionalidade brasileira
e 7,9% europeia, sendo um proveniente da Itália, um de Portugal e um da Espanha.
Os pais brasileiros são 72,22% oriundos da região Sudeste, 11,11% do Nordeste,
11,11% do Sul e 5,56% da região Centro-Oeste. Não foram observados indivíduos
nativos da região Norte, tanto na amostra de pele escura quando na de pele clara
(Tabelas 2 e 3).
Ao analisar os avós da amostra autorreferida de negros, verificou-se que
98,57% dos avós possuem nacionalidade brasileira e 1,43% são de origem europeia
(Portugal). Já na amostra de brancos, 72,60% dos avós são brasileiros e 27,40%
são europeus, sendo provenientes da Itália (45%) Portugal (35%) e Espanha (20%)
(Tabela 2).
Tabela 2: Distribuição das frequências da ancestralidade de pais e avós informadas pelos
indivíduos autodeclarados brancos e negros.
Autodeclaração Parentesco Ancestralidade
Brasileiros n(%) Europeus n(%)
Brancos Pais 36 (92,1) 3 (7,9)
Avós 53 (72,6) 20 (27,4)
Negros Pais 41 (100) 0 (0,0)
Avós 69 (98,57) 1 (1,43)
25 Tabela 3: Distribuição das frequências dos pais brasileiros por regiões de nascimento
informadas pelos indivíduos autodeclarados brancos e negros.
Região do Brasil Autodeclaração
Brancos n(%) Negros n(%)
Norte 0 (0,0) 0 (0,0)
Nordeste 4 (11,11) 20 (48,48)
Centro-oeste 2 (5,56) 2 (4,88)
Sudeste 26 (72,22) 17 (41,46)
Sul 4 (11,11) 2 (4,88)
Dos loci analisados, foi observada a ocorrência de indivíduos negros
heterozigotos para os SNPs: V60L, V92M, R151C e R163Q. Na amostra de brancos,
as variantes em heterozigose foram: V60L, V92M, R160W, R163Q. Na população de
estudo, tanto de brancos quanto de negros, não ocorreu a presença de indivíduos
homozigotos com a variante.
A análise do Equilíbrio de Hardy-Weimberg, realizada para cada um dos oito
polimorfismos do gene MC1R, mostrou que todos os polimorfismos estão em
equilíbrio, não apresentando diferenças significativas dos valores estatísticos
encontrados em relação a frequência do genótipo esperado (Tabela 4 e 5).
Não foram verificadas associações estaticamente significativas dos loci
analisados em relação a característica de cor de pele, entre a amostra de indivíduos
brancos e negros, com exceção da variante V60L. O polimorfismo V60L (rs1805005)
demonstrou forte associação à cor de pele clara, quando em heterozigose (OR:
10,77; IC: 1,18 - 98,00) quando comparada ao observado em indivíduos de pele
escura (Tabela 6).
26 Tabela 4: Distribuição das frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do gene
MC1R em indivíduos brancos.
Frequências genotípicas Frequências alélicas
Polimorfismo Genótipo Observado Esperado X2 p Alelo Indivíduos Frequência
MC1R GG 13 (0,65) 13,61 (0,68) G 16,5 0,825
rs1805005 GT 7 (0,35) 5,77 (0,29) 0,044 0,834 T 3,5 0,175
(V60L) TT 0 0,61 (0,03)
rs1805006
(D84E)
CC 20 (1,0) 20 (1,0) C 20 1
CA 0 0 --- --- A 0 0
AA 0 0
rs2228479
(V92M)
GG 15 (0,75) 15,31 (0,76) G 17,5 0,875
GA 5 (0,25) 4,37 (0,22) 0,014 0,905 A 2,5 0,125
AA 0 0,31 (0,01)
rs11547464
(R142H)
GG 20 (1,0) 20 (1,0) G 20 1
GA 0 0 --- --- A 0 0
AA 0 0
rs1805007
(R151C)
CC 20 (1,0) 20 (1,0) C 20 1
CT 0 0 --- --- T 0 0
TT 0 0
rs1110400
(I155T)
TT 20 (1,0) 20 (1,0) T 20 1
TC 0 0 --- --- C 0 0
CC 0 0
rs1805008
(R160W)
CC 19 (0,95) 19,01 (0,95) C 19,5 0,975
CT 1 (0,05) 0,975 (0,05) 0,0001 0,992 T 0,5 0,025
TT 0 0,01 (0,0001)
rs885479
(R163Q)
GG 19 (0,95) 19,01 (0,95) G 19,5 0,975
GA 1 (0,05) 0,975 (0,05) 0,0001 0,992 A 0,5 0,025
AA 0 0,01 (0,0001)
27 Tabela 5: Distribuição das frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do gene
MC1R em indivíduos negros.
Frequências genotípicas Frequências alélica
Polimorfismo Genótipo Observado Esperado X2 p Alelo Indivíduos Frequência
MC1R GG 20 (0,95) 18,95 (0,90) G 20,5 0,976
rs1805005 GT 1 (0,05) 1,99 (0,09) 0,022 0,881 T 0,5 0,024
(V60L) TT 0 0,05 (0,002)
rs1805006
(D84E)
CC 21 (1,0) 21 (1,0) C 21 1
CA 0 0 --- --- A 0 0
AA 0 0
rs2228479
(V92M)
GG 20 (0,95) 18,95 (0,90) G 20,5 0,976
GA 1 (0,05) 1,99 (0,09) 0,022 0,881 A 0,5 0,024
AA 0 0,05 (0,002)
rs11547464
(R142H)
GG 21 (1,0) 21 (1,0) G 21 1
GA 0 0 --- --- A 0 0
AA 0 0
rs1805007
(R151C)
CC 20 (0,95) 18,95 (0,90) C 20,5 0,976
CT 1 (0,05) 1,99 (0,09) 0,022 0,881 T 0,5 0,024
TT 0 0,05 (0,002)
rs1110400
(I155T)
TT 21 (1,0) 21 (1,0) T 21 1
TC 0 0 --- --- C 0 0
CC 0 0
rs1805008
(R160W)
CC 21 (1,0) 21 (1,0) C 21 1
CT 0 0 --- --- T 0 0
TT 0 0
rs885479
(R163Q)
GG 17 (0,81) 17,2 (0,82) G 19 0,905
GA 4 (0,19) 3,61 (0,17) 0,011 0,915 A 2 0,095
AA 0 0,19 (0,009)
28 Tabela 6: Análise dos polimorfismos do gene MC1R em relação à cor de pele
Polimorfismo Genótipo Negros Brancos OR (IC) P
(ref) (%)
MC1R GG 20 (95,24) 13 (65,00) 1
rs1805005 GT 1 (4,76) 7 (35,00) 10,77 (1,18 - 98,00) 0,02
(V60L) TT 0 0 --- ---
rs1805006
(D84E)
CC 21 (100) 20 (100) 1
CA 0 0 --- ---
AA 0 0 --- ---
rs2228479
(V92M)
GG 20 (95,24) 15 (75,00) 1
GA 1 (4,76) 5 (25,00) 6,67 (0,70 - 63,22) 0,09
AA 0 0 --- ---
rs11547464
(R142H)
GG 21 (100) 20 (100) 1
GA 0 0 --- ---
AA 0 0 --- ---
rs1805007
(R151C)
CC 20 (95,24) 20 (100) 1
CT 1 (4,76) 0 --- ---
TT 0 0 --- ---
rs1110400
(I155T)
TT 21 (100) 20 (100) 1
TC 0 0 --- ---
CC 0 0 --- ---
rs1805008
(R160W)
CC 21 (100) 19 (95,00) 1
CT 0 1 (5,00) 3,31 (0,13 - 86,13) 0,49
TT 0 0 --- ---
rs885479
(R163Q)
GG 17 (80,95) 19 (95,00) 1
GA 4 (19,05) 1 (5,00) 0,22 (0,02 - 2,20) 0,34
AA 0 0 --- ---
29
5. DISCUSSÃO
O gene MC1R, relacionado à pigmentação da pele, possui um padrão
geoespacial de variação genética que está atrelado às distribuições geográficas,
sendo principalmente evidenciado em populações da Europa e Ásia. Já nas
populações africanas, é mantido em maior frequência o alelo ancestral, devido à
pressão ambiental existente na região equatorial (SHARON et al., 2008; MARTÍNES-
CANADES et al., 2013).
A análise dos 8 SNPs estudados revelou que apenas o polimorfismo V60L
(rs1805005) apresentou associação entre a presença da variante no genótipo com a
ocorrência do fenótipo claro. Nesse polimorfismo, a mudança do aminoácido valina
para o aminoácido leucina, na cadeia proteica, promove a retenção intracelular,
parcial ou total, dos receptores no retículo endoplasmático, fazendo com que a
concentração desses receptores esteja reduzida na superfície, o que resulta na
diminuição do acoplamento com o agonista e, consequentemente, ocorre a
produção de feomelanina, devido a queda do cAMP e da enzima tirosinase
(MARANO et al., 2013). Em indivíduos negros esse SNP apresentou-se estável,
sendo raramente observada a ocorrência dessa variante.
O resultado obtido está de acordo com os apresentados por Savage et al.,
(2008), que mostraram maior frequência da variante V60L em populações do Norte
(10,69%) e Sul (15,72%) da Europa, assim como nos Estados Unidos (13,21%),
sendo essas populações identificadas como de origem caucasiana.
O nosso achado também corrobora com o estudo realizado por Martines-
Canades et al. (2013), no qual a variante V60L foi observada com uma frequência de
aproximadamente 27,3% em populações europeias, evidenciando uma seleção
positiva, visto a necessidade de ajuste na síntese da vitamina D. Na pesquisa por
ele realizada, foi observada a associação desse polimorfismo com a ocorrência da
pele clara, cabelo ruivo e maior risco de desenvolver melanoma. É de conhecimento
que o melanoma ocorre, na grande maioria, em indivíduos de pele clara e com baixa
capacidade de bronzeamento (MARTÍNES-CANADES et al., 2013). Essa correlação
existente entre pele clara e o melanoma é causada pela diminuição da produção de
eumelanina, reduzindo a proteção da pele tornando-a mais suscetível à alterações
pelos raios UV (LYONS; BASTIAN; MCCORMICK, 2013).
30
É interessante notar a concordância entre o resultado encontrado da
associação da variante V60L com a pele clara e o fato de que 27,4% (n=20) dos
avós dos indivíduos brancos serem de origem européia, enquanto que apenas 1
indivíduo negro referiu um dos avós com essa origem.
A miscigenação da população brasileira foi iniciada no período colonial como
consequência dos cruzamentos inter étnicos entre europeus, africanos e índios, que
resultou na incorporação das novas características genotípicas e fenotípicas na
população, fazendo com que hoje seja uma das populações mais heterogêneas do
mundo. Devido ao extenso território, a distribuição desses grupos não ocorreu de
forma uniforme, evidenciando as diferenças das características físicas atuais que
são observadas nas diversas regiões do território nacional (CARDENA, 2013).
A partir dos dados informados quanto à nacionalidade de pais e avós, foi
observado que nas duas amostras, a grande maioria dos pais é de origem brasileira,
92,1% na amostra de brancos e 100% na amostra de negros. Em relação aos avós,
observou-se 27,4% de origem européia na amostra de indivíduos brancos, enquanto
que nos indivíduos negros, apenas 1,43% dos avós era dessa mesma origem. Em
relação aos pais brasileiros, foram analisados os dados geográficos de acordo com
a região de nascimento, tendo sido observado que os indivíduos brancos possuem a
maior parte dos pais vindos da região sudeste (72,22%), enquanto que os indivíduos
de pele escura, apresentaram pais provenientes, predominantemente, das regiões
nordeste (48,48%) e sudeste (41,46%). Esse evento pode ser explicado a partir dos
padrões de migração populacional que ocorreram ao longo do território brasileiro,
concentrando indivíduos brancos no Sul do país, e negros no Nordeste.
É de conhecimento que há dúvidas sobre a precisão da autodeclaração,
fazendo com que possam ocorrer erros nessa inferência. A incerteza ocorre
primeiramente devido ao grande número de opções de cores intermediárias
existentes entre o branco e o negro que é dada para a classificação, além da
autoreferência sofrer influência de variáveis como: posição social, percepção
subjetiva da cor, variações regionais, entre outros (CARDENA, 2013), sendo
necessários cálculos de densidade de melanina para comprovar qual a real cor da
pele.
Os resultados apresentados sugerem que a análise dos polimorfismos do
gene MC1R pode servir futuramente como ferramenta para aplicações forenses,
sendo útil como instrumento para predição de fenótipos. São necessários estudos
31
adicionais, com um número maior de indivíduos e SNPs analisados, para confirmar a
associação observada e detectar outras possíveis associações não vistas aqui,
possivelmente, devido ao baixo número de indivíduos analisados.
32
6. CONCLUSÃO
Esse estudo teve como objetivo avaliar as frequências dos polimorfismos do
gene MC1R em indivíduos brancos e negros e as possíveis associações entre essas
variantes e cor de pele. Esses resultados preliminares são os primeiros a mostrar um
resultado estatisticamente significativo da associação do SNP V60L com a
ocorrência da cor de pele clara, em indivíduos caucasianos da população brasileira.
Dado esse consistente com outros estudos realizados em populações homogêneas,
como a europeia, onde essa variação é comumente observada.
Tanto para a variante V60L, quanto para os outros 7 polimorfismos que não
mostraram associação na nossa amostra, são necessários estudos adicionais com
maior número de indivíduos analisados para que haja certeza da associação
encontrada, e também tornar possível a identificação de novos SNPs significativos,
uma vez que possam não ter sido suficientemente representados nessa amostra.
Seriam interessantes estudos com esses mesmos SNPs em outras regiões do
Brasil, visto que a miscigenação não ocorre de forma homogênea em todo território
nacional, podendo ser encontradas diferentes frequências dos polimorfismos nas
diferentes regiões. A partir disso, seria importante estabelecer um padrão que
possibilitasse o uso prático para fins forenses, em casos de buscas de suspeitos,
identificação de agressores, corpos desconhecidos, entre outros.
Esse estudo preliminar está inserido em um projeto maior, no qual tem por
objetivo a análise de diversos polimorfismos existentes em diferentes genes como:
ASIP, TRY, SLC24A5, SLC45A2 e o próprio MC1R, que estão relacionados a
variedade da pigmentação da pele, olhos e cabelo, em uma amostra de 600
indivíduos da população brasileira.
33
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Estou ciente do conteúdo do Trabalho de Conclusão de Curso “Comparação dos
polimorfismos do gene MC1R em indivíduos caucasianos e negros”
Dra. Ana Paula Pimentel Costa – Universidade Presbiteriana Mackenzie
Dra. Cintia Fridman – Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Nathalie Zamagni Bessa – TIA: 3116764-0
Trabalho a ser apresentado em dezembro de 2014.
