UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSSO

FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E

ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE NANOPARTÍCULAS DE

OURO NÃO MODIFICADA (AuNP) PARA DETECÇÃO DO

AGENTE DA PLEUROPNEUMONIA SUÍNA (Actinobaccilus

pleuropneumoniae)

Laila Natasha Santos Brandão

CUIABÁ-MT

2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSSO

FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E

ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE NANOPARTÍCULAS DE

OURO NÃO MODIFICADA (AuNP) PARA DETECÇÃO DO

AGENTE DA PLEUROPNEUMONIA SUÍNA (Actinobaccilus

pleuropneumoniae)

Autor: Laila Natasha Santos Brandão

Orientadora: Prof.ª Drª Valéria Dutra

Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato

Dissertação apresentada ao programa de pós-

graduação em Ciências Veterinárias, área de

concentração: Sanidade de animais Domésticos e

Selvagens, da Faculdade de Agronomia, Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato

Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciências

Veterinárias.

CUIABÁ-MT

2014

Aos que acreditaram

em mim quando eu não acreditava.

AGRADECIMENTOS

De maneira clichê, porém com o mesmo sentimento, agradeço primeiro a

Deus, pois sem ele eu não seria nem mesmo essência.

Agradeço a meus pais... com a mesma importância a ambos, mesmo em seus

papeis distintos. A minha mãe por sua força inabalável, pelas horas de lamentos ao

telefone e por saber como me conduzir a não desistir, por mais que eu quisesse!!!

Ao meu querido pai, atencioso em todos os momentos, carinhoso e que da mesma

forma ouvia sem reclamar meus lamentos. A ambos por em conjunto nunca terem

exigido mais do que eu podia suportar, sempre souberam meus limites melhor que

eu.

Agradeço a minha irmã pelos momentos em silêncio absoluto que

passávamos na sala, quando eu chegava em casa a ” beira da loucura”, parecia de

alguma maneira entender que eu só precisava me perder dentro de mim. E que

mesmo me irritando, me fazia lembrar que existiam outros problemas fora do

laboratório que precisavam de minha igual atenção.

Agradeço a Kércia Laís que nesses quase dois anos, teve paciência extrema

ao meu mau humor, soube me resgatar das garras de mim mesma e não cansou de

me ameaçar todas as veze que eu disse a palavra: DESISTIR. Obrigado por estar

comigo sempre e cuidar com tanto amor!!! Obrigado por cuidar do Bobbie “bobo”

sempre que necessário, tendo paciência com as mordidas e seu mau humor, que

nego veementemente ser semelhante a mim!!! P.S. Vou tentar melhorar meu

humor!

Agradeço Leticia Camara “Pitinininha”, pela sua força áspera. Obrigado por

ser forte e de uma maneira particular doce, obrigado por nunca passar a mão na

minha cabeça, se tivesse passado talvez a muito eu já tivesse desistido. Obrigado

por partilhar das minhas ideias e cair de cabeça nelas, mesmo sem muita certeza se

eram boas, obrigado por “brincar de partícula”, sem você não seria a mesma coisa e

mais uma coisa....desiste, eu sempre vou bagunçar a bancada!

Agradeço a Professora Doutora Valéria Dutra, o maior coração que eu

conheço, por não ter o compromisso de me levar por tantos anos, mas mesmo assim

o fazer, por te exigido até o limite de mim e às vezes um pouco mais, mas isso as

orelhas da minha mãe ao telefone e minhas companhias que sofreram. Agradeço,

pois mesmo em meio as broncas eu via em seus olhos que esperava o melhor, por

ter confiado a mim projetos. Por ter confiado em uma aluna de graduação do terceiro

semestre que nem era uma boa aluna, mas juro que me esforcei para melhorar,

espero ter conseguido. De alguma maneira me perdoe por ter querido do fundo do

coração desistir, mesmo que não seja do seu conhecimento....acho que todos tem o

direito de pensar sobre isso uma vez!!!

Ao Professor Doutor Luciano Nakazato, uma mente difícil de acompanhar, por

ter me explicado centenas de vezes a mesma coisa que eu insistia em não entender

e nem mesmo uma vez ter perdido a paciência. Obrigado por me ensinar a usar o

“bendito” Sambrook....obrigado por ter tornado coisas complexas em simples.

Sempre que achávamos que alguma coisa era um “bicho de sete cabeças” você

dizia... Fácil né!!!

Obrigado a Dona Edneia, por em dia de tristeza que ela nem sabia...me dizer

sabias palavra:” Não adianta sofrer, as coisas não vão mudar mesmo, é melhor viver

cada dia o mais feliz!” Obrigado por dizer isso no tempo certo, talvez tenha evitado

uma catástrofe, obrigado pelos bons dias dispensados a mim.

Aos meus colegas de laboratório, a esses obrigado por me mostrarem que um

dia pode ser desagradável ou não... vai depender de mim.

Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado e a Fundação de Àmparo a

Pesquisa do Estado de Mato Grosso (Fapemat) e ao Programa de pós-graduação

em Ciências Veterinárias (PPGVET).

RESUMO

UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE NANOPARTÍCULAS DE OURO NÃO

MODIFICADA (AuNP) PARA DETECÇÃO DO AGENTE DA PLEUROPNEUMONIA

SUÍNA (Actinobaccilus pleuropneumoniae)

A possibilidade de detecção de agentes patogênicos representou um grande passo

para a ciência. O desenvolvimento e melhorias nas técnicas de diagnóstico como a

técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), ao longo dos anos ainda requer

infraestrutura laboratorial, apesar de sua sensibilidade e custo decrescente,

investimentos em equipamentos e cuidados com fontes de contaminação externa.

Técnicas que possam ser executas com facilidade e pouca mão de obra ou

exigência de pessoas capacitadas, têm grande possibilidades de aplicabilidade.

Neste estudo desenvolveu-se uma técnica de rápida execução e baixo custo, para

detecção de um dos principais agentes causadores de pneumonias em granjas de

suínos o Actinobaccilus pleuropneumoniae, com sensibilidade 93,8% e

especificidade de 84,6% em amostras de pulmões com e sem lesão. O teste Kappa

entre a PCR e nanopartícula de ouro foi 0,684 representando boa concordância. A

técnica pode ser utilizada como alternativa aos testes convencionais, já que é de

fácil e rápida execução e não exige infraestrututra e mão de obra especializada.

Palavras-chave: Pneumonia suína, nanopartícula de ouro (AuNP), Actinobacillus

pleuropneumoniae.

ABSTRACT

STANDARDIZATION OF UNMODIFIED GOLD NANOPARTICLE (AuNPs) FOR

DETECTION OF Actinobacillus pleuropneumoniae IN SWINE LUNGS

The possibility of detection of pathogens was a major step for science as a whole,

developing and improving these techniques over the years to increase visibly. The

development of the technique of Polymerase Chain Reaction ( PCR ) , although its

sensitivity and decreasing cost over the years, it's still a handy little technique that

requires laboratory infrastructure, high investments in equipment and care with

sources of external contamination. Techniques that can be performed through the

ease and little manpower or requirement of skilled people, always have great scope

of applicability. This study develops a technique for quick and low- cost detection of a

major causative agent of pneumonia in swine herds the Actinobaccilus

pleuropneumoniae , with 93.8 % sensitivity and 84.6% specificity in samples of lungs

with and without injury, the Kappa test between PCR and gold nanoparticle was

0,684 representing good agreement . The technique can be used as an alternative to

conventional tests, since it is easy and quick to implement and does not require

infrastructure and skilled labor.

Idex terms: Swine pneumonia, gold nanoparticle (AuNP), Actinobacillus

pleuropneumoniae.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Limite de detecção de DNA de App pelo teste de AuNP’s.........................24

Figura 2: Especificidade do teste de AuNP’s............................................................ 24

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1: Primers e genes alvos utilizados na PCR e tamanhos de

amplicons.........................................................................................................22

Tabela 1: Relação do total de amostras, positivas e negativas, para cada agente

testado na PCR...............................................................................................25

Tabela 2: Número de amostras positivas e negativas nas AuNP’s........................... 25

Tabela 3: Diluições seriadas de DNA de App........................................................... 26

Tabela 4: Testes de Sensibilidade e Especificidade das amostras...........................26

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

% ------------------------------------------------------------------------------------------- porcentagem

°C--------------------------------------------------------------------------------------------graus celsius

µl--------------------------------------------------------------------------------------------------microlitro

µM--------------------------------------------------------------------------------------------- micromolar

App---------------------------------------------------------------Actinobaccilus pleuropneumoniae

ATCC--------------------------------------------------------------American type culture collection

AuNP--------------------------------------------------------------------------- nanopartícula de ouro

Cm -------------------------------------------------------------------------------------------- centímetro

CO2--------------------------------------------------------------------------------- dióxido de carbono

DNA------------------------------------------------------------------------ ácido desoxirribonucleico

DNTP------------------------------------------------------- desoxirribonucleosídeo(s) trifosfato(s)

EDTA------------------------------------------------------------ ácido etileno-diamino-tetra-acético

ELISA------------------------------------------------------------------------- Teste imunoenzimatico

g ------------------------------------------------------------------------------------- força gravitacional

HAuCL4 ----------------------------------------------------------------------------- Ácido cloroáurico IBGE-----------------------------------------------Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

Kg---------------------------------------------------------------------------------------------quilogramas

LPS-----------------------------------------------------------------------------------lipopolissacarídeo

M ----------------------------------------------------------------------------------------------------- molar

MgCl2------------------------------------------------------------------------------ cloreto de magnésio

Min------------------------------------------------------------------------------------------------- minutos

ml----------------------------------------------------------------------------------------------------mililitro

mm--------------------------------------------------------------------------------------------- milímetros

mM------------------------------------------------------------------------------------------------ milimolar

NaCl ------------------------------------------------------------------------------------Cloreto de sódio

NAD------------------------------------------------------Dinucleótido de nicotinamida e adenina

Ng--------------------------------------------------------------------------------------------- nanograma

nM-----------------------------------------------------------------------------------------------nanomolar

nm---------------------------------------------------------------------------------------------nanometros

O.D.-----------------------------------------------------------------------------------Densidade ópitica

Pb ---------------------------------------------------------------------------------------- pares de base

PCR------------------------------------------------------------ Reação em Cadeia da Polimerase

pg------------------------------------------------------------------------------------------------picograma

pMol------------------------------------------------------------------------------------------------ picomol

PPS-------------------------------------------------------------------------- Pleuropneumonia suína

qPCR—----------------------------------------------------------------- Real time PCR quantitativo

SDS---------------------------------------------------------------------------- dodecilsulfato de sódio

Tris ------------------------------------------------------- 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol

U-------------------------------------------------------------------------------------------------- unidades

V --------------------------------------------------------------------------------------------------------- volt

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 14

2.1 Doenças respiratórias ...................................................................................... 14

2.2 Actinobaccilus pleuropneumoniae .................................................................... 14

2.3 Patogenia ......................................................................................................... 15

2.3 Sinais Clínicos.................................................................................................. 16

2.5 Métodos Diagnósticos ...................................................................................... 16

2.6 Nanopartícula de ouro não modificada ............................................................ 18

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 20

3.1 Geral ................................................................................................................ 20

3.2 Específicos ....................................................................................................... 20

4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 21

AMOSTRAS ........................................................................................................... 21

EXTRAÇÃO DE DNA e PCR .............................................................................. 21

PREPARAÇÃO DA AuNPs ................................................................................. 23

TESTE DE AuNP ................................................................................................ 23

ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 23

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 24

6 DISCUSSÃO e CONCLUSÃO ................................................................................ 27

REFERÊNCIAS...................................................................................................... 30

APÊNDICE A – TABELA PULMÕES SEM LESÃO ................................................... 35

APÊNDICE B – TABELA PULMÕES COM LESÃO .................................................. 36

APÊNDICE C – ARTIGO SUBMETIDO .................................................................... 38

ANEXO A – PÁGINA DE SUBMISSÃO DO ARTIGO ................................................ 42

ANEXO B – PÁGINA WEBQUALIS QUE ATESTA A CLASSIFICAÇÃO DO

PERIÓDICO. ............................................................................................................. 43

12

1 INTRODUÇÃO

A produção de carne suína no Brasil é altamente tecnificada e com

certificação sanitária. Propriedades pequenas, médias e integradas a grandes

empresas são as formas mais comuns de criação. O rebanho brasileiro de suínos é

o quarto rebanho mundial, atingindo 38,9 milhões de cabeças em 2011. A produção

de carne suína está próxima a 3,4 milhões de toneladas/ano. O consumo per capita

em 2011 chegou á 14,88Kg, um aumento de 11,42% em relação ao ano de 2010 e o

número de animais abatidos nos primeiros dois trimestres de 2013 foi de 17.911

cabeças segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2013).

Dentre os complexos patológicos que afetam os suínos, as doenças

respiratórias apresentam destaque, devido à frequência e intensidade com que

atingem rebanhos (Rossi et al. 2013). Estas são consideradas doenças

multifatoriais, provocando significativas perdas econômicas, geralmente associadas

à produção intensiva, a fatores ambientais e de manejo (Hansen et al. 2010,

Opriessnig, Gimenez-Lirola, e Halbur 2011). O diagnóstico baseia-se no isolamento

do agente à partir de lesões suspeitas e principalmente em testes sorológicos para

estabelecimento de medidas de controle (Coelho et al. 2004, Xie et al. 2013).

A pleuropneumonia suína (PPS) causada pela bactéria Actinobacillus

pleuropneumoniae (App), provoca doença clínica caracterizada por pneumonia com

pleurisia fibrinosa, lesões pulmonares necrohemorrágicas, adesões pleurais

fibrinóticas e em casos severos a morte (Bosse et al. 2002). O contágio geralmente

ocorre após inalação de aerossóis ou contato direto, o microrganismo inalado

coloniza o tecido pulmonar aderindo-se ao muco, proteínas e a células hospedeiras

com posterior multiplicação no local (Chiers et al. 2010). O monitoramento do status

da doença em rebanhos, o controle e a erradicação são de fundamental importância

devido a características de contagio rápido, para impedir que animais portadores

sejam introduzidos em rebanhos saudáveis (Tremblay et al. 2013).

O cultivo das amostras de lesões típicas de pulmões e secreções nasais

podem ser definitivos do diagnóstico (Coelho et al. 2004). Apesar da alta

especificidade das técnicas de isolamento podem ocorrer falsos negativos devido a

fatores como carga bacteriana e tipo de transporte da amostra.

13

Testes indiretos são muito utilizados (Machado et al. 2001, Shin et al. 2011,

Eamens et al. 2012a, b, Gimenez-Lirola et al. 2014), como detecção simultânea de

anticorpos para toxinas com sensibilidade de 82,7% e especificidade de 100%

(Gimenez-Lirola et al. 2014) para monitoramento dos rebanhos.

As técnicas moleculares também têm sido utilizadas e apesar de

proporcionarem resultados rápidos, necessitam de investimentos em equipamentos

e infraestrutura laboratorial, sendo inviável a realização das mesmas a campo, o que

representa dificuldades como o envio de material em condições ideais.

Recentemente, métodos diagnósticos baseados em AuNPs tem sido

utilizados para uma rápida e sensível detecção direta de microrganismos, entre eles,

Mycobacterium sp. (Baptista et al. 2006, Liandris et al. 2009, Hussain, Samir, e

Azzazy 2013), Escherichia coli (Padmavathy, Vinoth Kumar, e Jaffar Ali 2012) e RNA

de vírus da dengue (Andreadou et al. 2014).

O presente trabalho objetivou a padronização da técnica de AuNPs para

detecção de App, em amostras clinicas de suínos com pneumonia.

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Doenças respiratórias

Dentre os complexos patológicos que afetam os suínos, as doenças

respiratórias apresentam destaque, devido à frequência e intensidade com que

atingem rebanhos (Rossi et al. 2013). São consideradas doenças multifatoriais,

provocando significativas perdas econômicas, geralmente associadas à produção

intensiva, a fatores ambientais e de manejo (Hansen et al. 2010, Opriessnig,

Gimenez-Lirola, e Halbur 2011).

Os principais membros da família Pasteurelaceae são isolados de animais de

sangue quente, particularmente de animais de rebanhos, sendo obrigatórios ou

comensais de vertebrados. Esses agentes colonizam em sua maioria o trato

respiratório superior, orofaringe, trato reprodutivo e possivelmente parte do trato

digestório, todavia pneumonia é a patogenia mais frequentemente associada a esta

família (Kuhnert e Christensen et al. 2008). Esta família possui três gêneros, de

importância clínica em suínos, Haemophillus, Pasteurella e Actinobacillus.

2.2 Actinobaccilus pleuropneumoniae

Os primeiros isolamentos do agente causador da PPS suína datam do ano

de 1957, nos Estados Unidos da América, realizado por Pattisson e em 1964 por

Shop na Argentina, sendo o nome proposto Haemophilus pleuropneumoniae ou

Haemophilus parahaemolyticus. Com os avanços dos estudos genéticos, à partir de

1983, propuseram a mudança de gênero para Actinobacillus (Coelho et al. 2004).

O Actinobaccilus pleuropneumoniae é considerado comensal do trato

respiratório suíno, comumente isolado de tonsilas, cavidade nasal e pulmões

infectados (Dom et al. 1994). São conhecidos 12 sorotipos do biovar 1 e 6 sorotipos

do biovar 2 (Schaller et al. 2001). Todos os sorotipos são hemolíticos e ureia

15

positivos (Bosse et al. 2002). São cocobacilos pequenos gram-negativos, imóveis, e

facultativamente anaeróbios.

O crescimento ótimo do microrganismo se dá aos 37°C, preferencialmente na

presença de CO2 (5%). As colônias cultivadas em ágar chocolate são arredondadas,

opacas acinzentadas, com diâmetro entre 1-2mm em 48 horas e sua capacidade

hemolítica está relacionada a ação sinérgica da ß-toxina de Staphylococcus aureus.

2.3 Patogenia

Há três etapas fundamentais na patogenia da doença: colonização,

mecanismos compensatórios do organismo e danos aos tecidos do hospedeiro.

(Bossé et al. 2012)

O App pode ser isolado a partir de tonsilas e cavidades nasais de suínos,

todavia as bactérias se ligam preferencialmente as células do trato respiratório

inferior. As partículas de aerossóis produzidas por espirros são suficientemente

pequenas para penetrar no trato respiratório inferior, evitando a necessidade de

colonização do trato respiratório superior. Fimbrias estão associadas à adesão de

bactérias no trato respiratório e o lipolissacarídio (LPS) também desempenha papel

na adesão. O estabelecimento da infecção depende da capacidade da bactéria em

adquirir todos os nutrientes essenciais para o crescimento. Diversos fatores como,

alta umidade do ar, ventilação insuficiente, transporte e quedas bruscas de

temperatura podem predispor o surgimento da doença. O ar é a principal forma de

dispersão do agente, que pode ocorrer por contato direto ou aerossóis a curta

distância.

A transmissão ocorre primariamente a partir de exsudatos, sendo que a

criação intensiva está intrinsicamente relacionada ao surgimento desta enfermidade.

16

2.3 Sinais Clínicos

A PPS se caracteriza como uma doença infectocontagiosa, que afeta, em sua

maioria, suínos nas fases de crescimento e terminação, se apresentando na forma

superaguda, aguda, subaguda e crônica. Ocorre uma pleurisia fibrinosa com lesões

pulmonares necrohemorrágicas e adesões pleurais fibrinóticas. Animais que

resistem à infecção se tornam cronicamente infectados e portadores do agente

(Bosse et al. 2002).

Animais com PPS superaguda apresentam temperatura corporal em torno de

41°C, dispneia, letargia, cianose e presença de exsudato espumoso e hemorrágico

nas narinas e boca culminando em morte súbita. Os sinais clínicos cursam com

insuficiência cardíaca e declínio da condição do animal após 24h do inicio da doença

(Vaz e Silva, 2004).

2.5 Métodos Diagnósticos

O diagnóstico deste tipo de pneumonia é feito à partir de anamnese e lesões

macro e microscópicas, sendo que a confirmação se faz através do isolamento do

agente. O diagnóstico diferencial deve ser feito para quadros clínicos de pneumonia

causados por outros agentes como Pasteurella multocida (P. multocida) e

Haemophilus parasuis (H. Parasuis), entre outros agentes (Coelho et al. 2004).

O cultivo das amostras de lesões típicas de pulmões e secreções nasais

podem ser definitivos do diagnóstico (Coelho et al. 2004). Apesar da alta

especificidade das técnicas de isolamento podem ocorrer falsos negativos devido a

fatores como carga bacteriana baixa e tipo de transporte da amostra.

Testes indiretos são muito utilizados (Machado et al. 2001, Shin et al. 2011, ,

Eamens et al. 2012a, b, Gimenez-Lirola et al. 2014), como detecção simultânea de

anticorpos para toxinas com sensibilidade de 82,7% e especificidade de 100%

(Gimenez-Lirola et al. 2014). São descritos testes de ELISA monovalentes e

polivalentes para sorotipos, com sensibilidade e especificidade variando de 88,3% a

17

96,6% (Machado et al. 2001). A importância de alta sensibilidade e especificidade

em testes diagnósticos é fundamental para monitoramento dos rebanhos.

Vários testes sorológicos baseados em ELISA são descritos na literatura

(Machado et al. 2001; Shin et al. 2011; Eamens et al. 2012a; b). Mais recentemente

com o uso das técnicas moleculares que exibem altos valores de sensibilidade e

especificidade testes mais precisos (Schaller et al. 2001; Souza et al. 2008;

Hricinova et al. 2010; Tobias et al. 2012; Rossi et al. 2013), baseados na detecção

direta do agente tem sido amplamente difundidos.

Várias técnicas moleculares têm sido empregadas nos últimos anos para a

detecção de App, como a PCR convencional e multiplex PCR (Schaller et al. 2001,

Souza et al. 2008, Hricinova et al. 2010, Rossi et al. 2013) assim como a qPCR

(Marois-Crehan et al. 2014) . Métodos que detectam o Ácido Desoxirribonucleico

(DNA), como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são altamente sensíveis e

de importância para diagnóstico, principalmente para microrganismos de cultivo

fastidioso.

No PCR para App os genes alvos geralmente selecionados para a técnica

apresentam intrínseca relação com outras espécie, como Actinobacillus sp, A.

equuli, A. lignieresii, e A. suis (Xiao et al. 2006). O gene especifico omlA em

diferentes grupos de App se assemelha ao gene Apx, ambos utilizados para a

identificação da espécie de App (Klein et al. 2003). O gene ApxIVA é especifico para

App, não sendo compartilhado nas demais espécies da família Pasteurellaceae

(Schaller et al. 2001). Apesar das técnicas moleculares proporcionarem resultados

rápidos, necessita de investimentos em equipamentos e infraestrutura laboratorial,

sendo inviável a realização das mesmas a campo, que representa dificuldades como

o envio de material em condições ideais, muitas vezes inviabilizando o cultivo do

agente, principalmente no caso das doenças respiratórias suínas.

Recentemente, métodos diagnósticos baseados em AuNPs tem sido

utilizados para uma rápida e sensível detecção direta de microrganismos.

(Andreadou et al. 2014; Hussain, Samir, and Azzazy 2013; Padmavathy, Vinoth

Kumar, and Jaffar Ali 2012; Liandris et al. 2009; Baptista et al. 2006; Rosa et al.

2013; Carter et al. 2013)

18

2.6 Nanopartícula de ouro não modificada

A nanociência possui inúmeras aplicações, como construção de sensores,

microeletrônica, catálise e ação bactericida. Soluções coloidais de metais podem ser

facilmente preparadas e modificadas quimicamente, uma diversidade de cores pode

ser observada relacionada às oscilações dos elétrons de condução em ressonância

a luz incidente, desde que haja elétrons livres de condução (Melo Jr et al. 2012). A

técnica de AuNPs tem sido utilizada para diagnóstico de Mycobaterium tuberculosis

(Hussain, Samir e Azzazy, 2013), câncer de bexiga (Nossier et al. 2014),

Leishmania sp.(Andreadou et al. 2014), vírus da dengue (Carter et al. 2013), entre

outros. A detecção do DNA é baseada na adsorção das bases nitrogenadas aos

oligonucleotídeos e a superfície das AuNps. A agregação ocorre devido a presença

de sal durante a hibridização, ocorrendo a atração e a agregação das AuNps devido

as carga negativas que interagem com os cátions do sal. A concentração e tamanho

dos iniciadores utilizados, concentração de sal, concentração de nanopartículas e

temperatura de anelamento dos iniciadores são fatores que podem interferir nos

resultados desta técnica (Hussain, Samir, and Azzazy 2013)

As aplicações da nanociência, particularmente em relação as nanopartícula

de ouro, são várias, desde identificação da presença de agentes infecciosos a

utilização como terapias de câncer (Baptista et al. 2006; Liandris et al. 2009;

Hussain, Samir, e Azzazy 2013; Carter et al. 2013; Nossier et al. 2014). O ouro

possui boa biocompatibilidade quando administrado em organismos vivos, síntese

simples e facilidade de modificação química de sua superfície. Propriedades

químicas e físicas estão relacionadas ao tamanho, composição, forma e natureza da

AuNP’s . A redução no tamanho da partícula está diretamente associada a variação

colorimétrica. Em escalas manométricas soluções de AuNP apresentam intensa

coloração vermelha, vinho ou arroxeada diferente do ouro metálico amarelo. (Melo Jr

et al. 2012)

O método de redução de citrato, em relação a outros métodos de preparação

das nanopartículas, apresenta-se mais vantajoso, já que é uma técnica pouco

onerosa e sem toxicidade. Os íons de citrato atuam na redução de AuNP, evitando

agregação devido a alta densidade de carga negativa proporcionado pelos grupos

19

carboxilatos ancorados na superfície. Soluções deste tipo são utilizadas quando se

desejam partículas com diâmetro entre 12-50nm (Grabar et al. 1995).

Os oligonucleotídeos tiol modificados vêm sendo utilizados em abordagens de

detecção de agentes infecciosos. Quando em ambiente ácido o DNA alvo estabiliza

a nanopartícula de ouro e permanece rosa, quando não há a presença do DNA alvo

perde-se esta estabilidade ocorrendo a agregação e tornando a solução roxa

(Padmavathy, Vinoth Kumar e Jaffar Ali, 2012).

Entretanto, modificações nos oligonucleotídeos representam aumento no

custo de síntese dos mesmos, em 2013 Hussain, propos a utilização de

oligonucleotídeos sem alteração para detecção de Mycobacterium sp. A detecção se

baseia na adsorção eletrostática das bases azotadas. Cada iniciador se hibridiza

com a sua cadeia complementar no DNA genômico, após a adição do preparado de

nanopartícula ocorre à agregação devido à presença de sal, que interage com os

íons negativos, levando a mudança visual de cor do rosa para o roxo. Quando não

há presença do DNA alvo as partículas permanecem dispersas na solução (Hussain,

Samir e Azzazy, 2013). Interferências comuns na técnica estão relacionadas

principalmente a diferenças iônicas geradas por fatores externos, como a

concentração de sal na reação, desenho dos oligonucleotídeos, nível de pureza e

temperatura de anelamento dos mesmos. A funcionalização da AuNPs com

oligonucleotídeos tiol modificados conduziu a primeira aplicação de AuNPs na

detecção de ácido nucléico. Técnicas para a detecção de outros agentes com o uso

de nanopartículas já foi previamente descrito como Mycobacterium sp. (Hussain,

Samir, e Azzazy 2013, Liandris et al. 2009, Baptista et al. 2006), Escherichia coli,

com detecção de 54 nanogramas (ng) de DNA não amplificado e com 100% de

sensibilidade (Padmavathy, Vinoth Kumar, e Jaffar Ali 2012), RNA de vírus da

dengue com detecção de 1 × 101 TCID50 unidade (Carter et al. 2013) e Leishmania

sp. com valores de detecção de 11,5ng à de 50 ng DNA e sensibilidade de 56% à

92% (Rosa et al. 2013 ,Andreadou et al. 2014), porém sintetizadas e funcionalizadas

com oligonucleotídeos de DNA modificados com um grupo tiol (nanossondas de

ouro), permitindo assim reconhecer uma sequência alvo de interesse.

20

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Desenvolver um teste diagnóstico para Actinobacillus pleuropneumoniae através da

técnica de nanopartículas de ouro não modificada (AuNP).

3.2 Específicos

Desenvolver e padronizar a técnica de AuNP para detecção de App em

amostras de pulmão de suínos

Comparar resultados obtidos à partir da detecção pela AuNP com

resultados obtidos por meio da PCR baseado na amplificação do gene

ApxIV de App

21

4 MATERIAL E MÉTODOS

AMOSTRAS

As amostras testadas são provenientes do Laboratório de Microbiologia e

Biologia Molecular Veterinária do Hospital Veterinário da Universidade Federal de

Mato Grosso e foram coletadas entre os anos de 2010 a 2013 originárias de

diferentes regiões do Estado do Mato Grosso. Foram testadas 70 amostras de

pulmões de suínos, sendo 53 com lesões macroscópicas características de

pneumonia (consolidação pulmonar, deposição de fibrina na pleura, pleurite ou

aderência) e 17 sem lesões macroscópicas de animais em fase de terminação e

abate.

Os controles positivos para a padronização do teste foram DNAs extraídos de

cultivos de App sorotipos 3 e 5 e H. parasuis, cedidos pelo Centro Nacional de

Suínos e Aves-Embrapa e Pasteurella multocida (P. multocida) proveniente de

cultura no Laboratório de Microbiologia Veterinária da Universidade Federal de Mato

Grosso confirmada por PCR e sequenciamento para o gene kmt1. Como controle

negativo utilizou-se o DNA de cepa ATCC de Escherichia coli e água ultra-pura.

EXTRAÇÃO DE DNA e PCR

A extração de DNA das amostras foi realizada segundo Sambrook e Russel

(2004) utilizando-se fenol e clorofórmio, com mínimas modificações. A realização

dos testes de PCR para os microrganismos foram realizadas de acordo com Xiao et

al. (2006) para App, Townsend et al. (2001) para P. multocida e Angen et al. (2007)

para H. parasuis. Os primers e tamanho dos amplicons encontram-se no quadro 1 .

A qualidade e integridade do DNA e os produtos de amplificação foram analisados

em eletroforese em gel agarose 1,0%, corados com Gel Red™ (Biotium®), a 100

Volts por centímetro e observados em

22

ChemiDoc™ XRS utilizando o software Image Lab™ Software . Como marcador de

massa molecular utilizou-se o padrão 100 pares de base (pb) de DNA Ladder™

(Fermentas ®).

Quadro 1 – Primers e genes alvos utilizados na PCR e tamanhos de amplicons

Agente Primer Sequência Gene alvo *(pb) Autores

App

apxIV F ATACGGTTAATGGCGGTAATGG

ApxIVA 346 (Xiao et al. 2006)

apxIV R ACCTGAGTGCTCACCAACG

H. parasuis

HP1F3 TATCGRGAGATGAAAGAC

16s rDNA

1090

(Angen et al.

2007)

HP2F2 GTAATGTCTAAGGACTAG

Revx CCTGGCTTCGTC

P. multocida

KMT1T7 ATCCGCTATTTACCCAGTGG

kmt1 460 (Townsend et al,

2001) KMT1SP6 GCTGTAAACGAACTCGCCAC

*pb: pares de bases

23

PREPARAÇÃO DA AuNPs

Seguiu-se o método de redução de citrato segundo descrito por Grabar et al.

(1995) que torna as partículas negativamente carregadas. Um volume de 250 ml de

cloreto de ouro (HAuCl4) a 1Mm foi levado à fervura sob agitação e posteriormente

foi acrescido nitrato de sódio na concentração de 38,8mM e mantido por agitação

continua durante 15 minutos (min). A solução estoque foi mantida a 4°C e a solução

em uso se manteve estável (sem precipitação) por três meses a temperatura

ambiente (~25°C).

TESTE DE AuNP

A hibridização foi realizada conforme descrito por Padmavathy, Vinoth Kumar,

e Jaffar Ali (2012), a desnaturação do DNA ocorreu a 95°C por 3min em solução

contendo 1,25 M de NaCl, 20 mM de Tris, 70pMol do oligonucleotídeo apxIV R, que

posteriormente foi resfriada a 50°C por 2 min para permitir a hibridização com o

iniciador. Imediatamente submeteu-se a reação ao resfriamento até que se atingisse

4°C e adicionou-se 50µl do preparado de AuNPs.

As leituras das amostras foram realizadas de acordo com Hussain, Samir, e

Azzazy (2013) sendo as amostras classificadas colorimetricamente (visualmente)

positivas como roxas e negativas como rosa. Leituras de densidade ótica (OD) com

o valores à partir de 0,5 na relação entre as leituras de ondas de 600/520nm foram

consideradas positivas, amostras com valores inferiores negativas. A visualização

macroscópica dos resultados foi possível 1 min após o acréscimo da AuNPs. Os

limites de detecção foram obtidos à partir de diluições seriadas dos DNAs de App

sorotipos 3 e 5 e o controle negativo consistiu em H2O ultra pura.

As imagens foram obtidas com câmera digital.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

24

A análise estatística foi realizada através do software R (R, 2011) para

determinação da sensibilidade e especificidade da técnica e o teste Kappa para

análise de concordância entre a técnica de PCR e as AuNPs.

5 RESULTADOS

O limite de detecção de DNA de amostras de App sorotipos 3 e 5 estão

descritos no tabela 1. O menor nível de detecção foi de 129ng de DNA pelas

avaliações macroscópica e relação OD520/600nm (0,55) (Figura 1). Não ocorreram

alterações de coloração macroscopicamente e na leitura de OD para DNA de outras

bactérias como P. multocida, H. parasuis e E. coli (Figura 2).

Fig. 1. Limite de detecção de DNA de App pelo teste de AuNP’s.

1)Água 2)649ng 3)129,8ng 4)25,6ng 5)5,19ng. Fig. 2. Especificidade do teste de AuNP com DNA

1)App 2)H.parasuis 3)Escherichia coli 4)P. multocida

Em relação a detecção dos patógenos bacterianos respiratórios das amostras

de pulmões pelo PCR, o resultado está descrito no tabela 2. A presença de App foi

detectada em 16 (22,85%) das 70 amostras testadas. Destas, 8 (50%) foram de

pulmões com lesão e 8 (50%) de pulmões sadios.

1 2 3 4 5

1 2 3 4

25

Tabela 1 - Diluições seriadas de DNA de App

*ng: nanogramas Tabela 2 – Relação do total de amostras, positivas e negativas, para cada agente testado na PCR.

Microrganismo Amostras PCR

**Negativo *(%) **Positivo *(%)

A. pleuropneumoniae

Com lesão

45

84,91

8

15,09

Sem lesão 9 52,95 8 47,05

TOTAL

54 77,15 16 22,85

H. parasuis

Com lesão 45 84,91 8 15,09

Sem lesão 9 52,95 8 47,05

TOTAL

54 77,15 16 22,85

P. multocida

Com lesão 40 75,47 13 24,52

Sem lesão 17 100 0 0

TOTAL 57 81,42 13 18,57

*porcentagem **valores absolutos

Na detecção de App pela técnica de AuNPs em pulmões, 23 amostras

(32,8%) foram positivas no teste, sendo 13 (24,5%) com lesões e 11(64,7%) sem

Diluições Concentração do DNA Macroscopia Relação da O.D.

1. Sorotipo 3 649 ng* Positivo 0,605

2. Sorotipo 3 129,8ng* Positivo 0,558

3. Sorotipo 3 25,6ng* Negativo 0,447

4. Sorotipo 3 5,192ng* Negativo 0,415

5. H2O - Negativo 0,415

26

lesões (Tabela 3). Utilizando-se a técnica de PCR como padrão ouro obteve-se uma

sensibilidade de 93,8% e uma especificidade de 84,6% para AuNPs. A concordância

entre PCR e AuNPs foi boa com índice Kappa de 0,684 (Tabela 4).

Tabela 3 – Número de amostras positivas e negativas nas AuNP’s

Macroscopia O.D. PCR App

Positivas Negativas Positivas Negativas Positiva Negativa

*N° **(%) *N° **(%) *N° **(%) *N° **(%) *N° **(%) *N° **(%)

Com

lesão

13

24,5

40

75,5

13

24,5

40

75,5

8

15,1

45

84,9

Sem

lesão

10 58,8 7 41,2 11 64,7 6 35,3 8 47,1 9 52,9

TOTAL 23 32,8 47 67,2 24 34,3 46 65,7 16 22,9 54 77,1

*N°: Valores absolutos **(%) : Porcentagem

Tabela 4 - Testes de Sensibilidade e Especificidade para todas as amostras.

Amostras Sensibilidade Especificidade Kappa

Com lesão 87,5% 86,7% 0,590 Sem lesão 100% 77,80% 0,767 TOTAL 93,8% 84,6% 0,684

27

6 DISCUSSÃO e CONCLUSÃO

A nanociência possui inúmeras aplicações, como construção de sensores,

microeletrônica, catálise e ação bactericida. Soluções coloidais de metais podem ser

facilmente preparadas e modificadas quimicamente, uma diversidade de cores pode

ser observada relacionada às oscilações dos elétrons de condução em ressonância

a luz incidente, desde que haja elétrons livres de condução (Melo Jr et al. 2012). A

técnica de AuNPs tem sido utilizada para diagnóstico de Mycobaterium tuberculosis

(Hussain, Samir, e Azzazy 2013), câncer de bexiga (Nossier et al. 2014), Leishmania

sp.(Andreadou et al. 2014) e vírus da dengue (Carter et al. 2013). A detecção do

DNA é baseada na adsorção das bases nitrogenadas aos oligonucleotídeos e a

superfície das AuNPs. A agregação ocorre devido a presença de sal durante a

hibridização, ocorrendo a atração e a agregação das AuNPs devido as carga

negativas que interagem com os cátions do sal. A coloração visual muda do

vermelho para o azul, na ausência do DNA alvo porque não ocorre a agregação

(Hussain, Samir, e Azzazy 2013). A concentração e tamanho dos iniciadores

utilizados, concentração de sal, concentração de nanopartículas e temperatura de

anelamento dos iniciadores são fatores que podem interferir nos resultados desta

técnica.

O limite mínimo de detecção das AuNPS foi de 129,8ng de DNA de App não

amplificado, sendo o limite mínimo de detecção na PCR com os mesmos

oligonucleotídeos de acordo com Xiao et al. (2006) de 0,01 ng para DNA

amplificado. Chan et al. (2014) obtiveram em amostras de PCR amplificado para

genes de resistência á meticilina em Staphylococcus aureus um valor para limite de

detecção das AuNPs de 500ng e Hussain, Samir, e Azzazy (2013) valores de DNA

não amplificado de 40 ng, utilizando a técnica de nanopartículas de ouro sem adição

do grupo tiol, um pequena modificação nos oligonucleotídeos. A maior concentração

de agentes no tecido estudado pode ser o motivo da maior sensibilidade encontrada

neste estudo e em trabalhos, como o de Andreadou et al. (2014) que descrevem

como valores mínimos de detecção de DNA de Leishmania sp. 11,5ng e

Padmavathy, Vinoth Kumar, e Jaffar Ali (2012) que encontraram valor mínimo de

detecção de 54 ng de DNA de E. coli,. A funcionalização da AuNPs com

oligonucleotídeos tiol modificados conduziu a primeira aplicação de AuNPs na

28

detecção de ácido nucleico. O uso de técnicas utilizando ouro para detecção de App

foi primeiramente descrito no ano de 2009, porém, o diagnóstico se baseava em

detecção por fluorescência de anticorpo especifico para a toxina ApxIV, com

sensibilidade de 87,5% e especificidade de 92,9% (Sheng et al. 2009).

Usando-se a detecção do DNA genômico não amplificado, extraído

diretamente do pulmão de suínos com e sem sinais clínicos o teste apresentou

sensibilidade de 93,8% e especificidade 84,6%, com valor kappa 0,684

demonstrando boa concordância. No grupo dos animais sem lesão macroscópica de

pneumonia, alcançou-se a sensibilidade de 100%, entretanto a especificidade foi

inferior a 80% e o teste kappa 0,767 indicando ótima concordância entre os testes

de PCR e AuNP. A concordância entre os testes nos animais com lesão foi de 0,590,

sendo considerada boa. Os valores de sensibilidade e especificidade foram de

87,5% e 86,7%, respectivamente. A utilização de DNA não amplificado pode gerar

interferências nos testes moleculares, porém as reações cruzadas são menos

frequentes do que nos testes sorológicos. Diante das semelhanças genéticas entre

os microrganismos que causam as doenças do complexo respiratório, pertencentes

à família Pasteurelacea, entre eles: App, H. parasuis e P. multocida (Fablet et al.

2012, Hansen et al. 2010) ainda os microrganismos Mycoplasma hyopneumoniae

(M. hyopneumoniae) e Streptococcus suis (S. suis), a escolha dos oligonucleotídeos

e dos genes alvos para os testes pode diminuir essas reações cruzadas.

A maior parte das técnicas moleculares e sorológicas exige algum grau de

tecnificação por parte do local de realização e mão de obra capacitada, entretanto a

técnica descrita neste trabalho pode ser aplicável em locais com menor

infraestrutura, onde o uso de termociclador pode ser substituído por equipamentos

mais simples e mais baratos, capazes de oscilar a temperatura como o banho-

maria. A preparação das nanopartículas deve ser realizada em laboratório,

entretanto apenas um agitador magnético com aquecimento se faz necessário. A

solução estoque se mantém estável, a 4°C em geladeiras convencionais, por tempo

indeterminado e a solução de uso pode ser mantida em temperatura ambiente em

torno de três meses, observando-se nesse tempo apenas a precipitação do soluto

que inviabiliza seu uso. O uso de kits comerciais de extração de DNA são facilmente

obtidos, com custos variados, e de fácil manuseio. A campo, a utilização desta

técnica representaria a possibilidade de detectar animais doentes com mais

agilidade, já que a disseminação do agente ocorre de forma rápida por aerossóis.

29

Agradecimentos - À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado e a Fundação de Àmparo a

Pesquisa do Estado de Mato Grosso (Fapemat)

30

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10.1371/journal.pone.0053600.

35

APÊNDICE A – TABELA PULMÕES SEM LESÃO

Tabela 1 – Amostras de pulmões sem lesão e seus respectivos resultados na PCR para H.

parasuis, P. multocida e App , análise macroscópica e valores de leitura ótica.

AMOSTRA PCR H. parasuis

PCR P. multocida

PCR App

MACRO* 520** 600** 600/520*** O.D.

10A 1 0 1 1 0,334 0,23 0,67 1

11A 1 0 1 1 0,30 0,22 0,74 1

12A 1 0 1 1 0,38 0,24 0,62 1

15A 1 0 1 1 0,34 0,18 0,52 1

16A 1 0 0 0 0,36 0,14 0,39 0

17A 0 0 0 0 0,35 0,13 0,37 0

26A 0 0 1 1 0,38 0,19 0,51 1

34A 0 0 0 1 0,26 0,23 0,86 1

35A 0 0 0 0 0,36 0,14 0,39 0

37A 0 0 0 0 0,37 0,18 0,48 0

39A 0 0 0 0 0,37 0,16 0,43 0

40A 0 0 0 0 0,36 0,15 0,42 0

45A 0 0 0 1 0,35 0,22 0,62 1

47A 1 0 1 1 0,38 0,21 0,56 1

51A 1 0 1 1 0,33 0,20 0,62 1

52A 1 0 1 1 0,39 0,22 0,56 1

54A 0 0 0 0 0,38 0,21 0,55 1

°TOTAL 8 0 8 10 11 11

MACRO* :análise visual da alteração de coloração, 1 para roxo e 0 para rosa **: comprimento de onda utilizado para leitura de densidade ótica ***:Relação entre os comprimentos de onda ° : Total de amostras positivas para cada análise. Demais colunas: 1 para positivo e 0 para negativo

36

APÊNDICE B – TABELA PULMÕES COM LESÃO

Tabela 2 – Amostras de pulmões com lesão e seus respectivos resultados na PCR para H.

parasuis, P. multocida e App , análise macroscópica e valores de leitura ótica.

AMOSTRA PCR

H. parasuis PCR

P. multocida PCR App

MACRO* 520** 600** 600/520*** O.D.

M106/12 A1 0 0 1 1 0,43 0,23 0,53 1

M106/12 A2 0 0 0 0 0,44 0,18 0,42 0

M106/12 A3 0 0 0 0 0,39 0,16 0,42 0

M1210/13 0 0 0 0 0,44 0,19 0,45 0

M131/12 A 0 0 0 0 0,38 0,17 0,45 0

M131/12 H 0 0 0 0 0,38 0,17 0,44 0

M167/13 A2 0 0 1 1 0,43 0,23 0,53 1

M167/13 A3 0 0 0 0 0,44 0,19 0,45 0

M23/10 2 0 0 0 0 0,43 0,18 0,42 0

M24/10 1 0 0 0 0 0,44 0,19 0,44 0

M24/10 2 0 0 0 0 0,44 0,18 0,42 0

M25/10 1 0 0 0 0 0,43 0,18 0,41 0

M25/10 2 0 0 0 0 0,43 0,18 0,42 0

M429/10 0 0 0 0 0,45 0,18 0,41 0

M430/10 0 0 0 0 0,43 0,19 0,43 0

M431/10 0 0 0 0 0,44 0,18 0,42 0

M432/10 0 0 0 0 0,44 0,18 0,41 0

M433/10 0 0 0 0 0,41 0,18 0,44 0

M434/10 0 0 0 0 0,43 0,19 0,44 0

M435/10 0 0 0 0 0,43 0,19 0,44 0

M436/10 0 0 0 0 0,43 0,19 0,43 0

M437/10 0 0 0 0 0,42 0,18 0,42 0

M438/10 0 0 0 0 0,43 0,19 0,45 0

M439/10 0 0 0 0 0,43 0,19 0,43 0

M440/10 0 0 0 0 0,42 0,17 0,41 0

M441/10 0 0 0 0 0,43 0,18 0,42 0

M442/10 0 0 0 0 0,44 0,18 0,42 0

M443/10 0 0 0 0 0,45 0,19 0,42 0

M444/10 0 0 0 0 0,41 0,18 0,43 0

M460/11 Pulm3

0 0 0 0 0,44 0,19 0,43 0

M495/12 1 0 0 0 0,43 0,18 0,43 0

M503/12 2 0 0 0 1 0,42 0,293 0,69 1

3B 1 0 1 0 0,43 0,18 0,41 0

6B 0 0 0 1 0,37 0,25 0,68 1

10B 1 0 0 0 0,41 0,18 0,44 0

11B 1 1 1 1 0,38 0,27 0,72 1

12B 1 1 1 1 0,38 0,27 0,70 1

13B 1 1 1 1 0,39 0,34 0,87 1

14B 0 0 0 1 0,30 0,19 0,65 1

37

15B 1 1 1 1 0,36 0,33 0,93 1

16B 1 1 1 1 0,36 0,32 0,89 1

21B 0 0 0 1 0,37 0,25 0,68 1

26B 0 0 0 0 0,43 0,18 0,42 0

27B 0 0 0 0 0,41 0,17 0,42 0

28B 0 0 0 0 0,39 0,17 0,43 0

30B 0 0 0 0 0,41 0,18 0,45 0

31B 0 0 0 0 0,40 0,18 0,45 0

32B 0 0 0 1 0,38 0,26 0,67 1

33B 0 0 0 1 0,42 0,26 0,61 1

35B 0 0 0 0 0,40 0,18 0,44 0

46B 0 1 0 0 0,41 0,17 0,41 0

47B 0 1 0 0 0,43 0,18 0,41 0

48B 0 1 0 0 0,43 0,16 0,37 0

° TOTAL 8 8 8 13

13 13

MACRO* :análise visual da alteração de coloração, 1 para roxo e 0 para rosa **: comprimento de onda utilizado para leitura de densidade ótica ***:Relação entre os comprimentos de onda ° : Total de amostras positivas para cada análise. Demais colunas: 1 para positivo e 0 para negativo

38

APÊNDICE C – ARTIGO SUBMETIDO

Padronização da técnica de nanopartícula de ouro não modificada (AuNPs) para detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae em Pulmões de Suínos1.

Laila Natasha S. Brandão2, Letícia C. Pitchenin2, Fernanda H. Maruyama2, Cristiane S. Chitarra2, Givago F. R. da Silva2, Cátia Klein3, Luciano Nakazato2 e Valéria Dutra2*

ABSTRACT- Brandão L.N.S, Pitchenin L.C. , Maruyama F.H, Chitarra C.S, Silva G. F. R., Klein C., Nakazato L., Dutra V. [Standardization of unmodified gold nanoparticle (AuNPs) for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in Swine Lungs.] Padronização da técnica de nanopartícula de ouro não modificada (AuNPs) para detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae em Pulmões de Suínos. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa, nº 2367 - Bairro Boa Esperança. Cuiabá - MT - 78060-900 *Autor para correspondência: valdutra@ufmt.br

Based diagnostic tests for the detection of nucleic acids without amplification through the use of gold nanoparticles (AuNPs) have been described for various diseases. This work aimed to develop a technique of unmodified gold nanoparticle (AuNPs) to detect Actinobacillus pleuropneumoniae. We used 70 lung samples from pigs, 17 with and 53 without lesions characteristic lesions of pneumonia, aiming at the detection of Actinobacillus pleuropneumoniae (App). The primer used was based on ApxIV gene. The AuNPs test had a sensitivity of 93.8% and specificity of 84.6% when compared with PCR detection. The results showed good agreement between the AuNPs and PCR testing, and the technique can be used as an alternative to conventional tests, since it is quick and easy and does not require implementation infrastructure and skilled labor.

IDEX TERMS: Swine pneumonia, gold nanoparticle (AuNP), Actinobacillus pleuropneumoniae.

RESUMO

Testes diagnósticos baseados na detecção de ácidos nucleicos sem amplificação prévia através da utilização de nanopartículas de ouro (AuNPs) tem sido descrito para várias enfermidades. Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma técnica de nanopartícula de ouro não modificada (AuNPs) para detecção Actinobacillus pleuropneumoniae (App), utilizando o oligonucleotídeo baseado no gene ApxIV. Utilizou-se 70 amostras de pulmão de suínos, 17 sem lesão e 53 com lesões características de pneumonia. O teste de AuNPs apresentou sensibilidade de 93,8% e especificidade de 84,6% quando comparados a detecção pela PCR. Os resultados mostraram boa concordância entre os testes de AuNPs e a PCR, sendo que a técnica de AuNP’s pode ser utilizada como alternativa aos testes convencionais, já que é de fácil e rápida execução e não exige infraestrututra e mão de obra especializada.

TERMOS DE INDEXAÇÃO: Pneumonia suína, nanopartícula de ouro (AuNP), Actinobacillus pleuropneumoniae.

INTRODUÇÃO

A produção de carne suína no Brasil é altamente tecnificada e com certificação sanitária. Propriedades pequenas, médias e integradas a grandes empresas são as formas mais comuns de criação. O rebanho brasileiro de suínos é o quarto rebanho mundial, atingindo 38,9 milhões de cabeças em 2011. A produção de carne suína está próxima a 3,4 milhões de toneladas/ano. O consumo per capita em 2011 chegou á 14,88Kg, um aumento de 11,42% em relação ao ano de 2010 e o número de animais abatidos nos primeiros dois trimestres de 2013 foi de 17.911 cabeças segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (2013).

Dentre os complexos patológicos que afetam os suínos, as doenças respiratórias apresentam destaque, devido à frequência e intensidade com que atingem rebanhos (Rossi et al. 2013). São

39

consideradas doenças multifatoriais, provocando significativas perdas econômicas, geralmente associadas à produção intensiva, a fatores ambientais e de manejo (Hansen et al. 2010, Opriessnig, Gimenez-Lirola, and Halbur 2011). O diagnóstico baseia-se no isolamento do agente à partir de lesões suspeitas, e principalmente em testes sorológicos para estabelecimento de medidas de controle (Xie et al. 2013, Coelho et al. 2004).

A pleuropneumonia suína (PPS) causada pela bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae (App), provoca doença clínica caracterizada por pneumonia com pleurisia fibrinosa, lesões pulmonares necrohemorrágicas, adesões pleurais fibrinóticas, e em casos severos a morte (Bosse et al. 2002). O contágio geralmente ocorre após inalação de aerossóis ou contato direto, o microrganismo inalado coloniza o tecido pulmonar aderindo-se ao muco, proteínas e a células hospedeiras com posterior multiplicação no local (Chiers et al. 2010). O monitoramento do status da doença em rebanhos, o controle e a erradicação são de fundamental importância devido a características de contagio rápido deste agente, para impedir que animais portadores sejam introduzidos em rebanhos saudáveis (Tremblay et al. 2013).

Testes indiretos são muito utilizados (Shin et al. 2011, Machado et al. 2001, Eamens et al. 2012a, b, Gimenez-Lirola et al. 2014), como detecção simultânea de anticorpos para toxinas com sensibilidade de 82,7% e especificidade de 100% (Gimenez-Lirola et al. 2014). São descritos testes de ELISA monovalentes e polivalentes para sorotipos, com sensibilidade e especificidade variando de 88,3% a 96,6% (Machado et al. 2001). A importância de alta sensibilidade e especificidade em testes diagnósticos é fundamental para monitoramento dos rebanhos.

Várias técnicas moleculares têm sido empregadas nos últimos anos para a detecção de App (Schaller et al. 2001, Souza et al. 2008, Hricinova et al. 2010, Rossi et al. 2013). Métodos que detectam o Ácido Desoxirribonucleico (DNA), como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são altamente sensíveis e de importância para diagnóstico, principalmente para microrganismos de cultivo fastidioso.

No PCR para App os genes alvos geralmente selecionados para a técnica apresentam intrínseca relação com outras espécie, como Actinobacillus sp, A. equuli, A. lignieresii, e A. suis (Xiao et al. 2006). O gene especifico omlA em diferentes grupos de App se assemelha ao gene Apx, ambos utilizados para a identificação da espécie de App (Klein et al. 2003). O gene ApxIVA é especifico para App, não sendo compartilhado nas demais espécies da família Pasteurellaceae (Schaller et al. 2001). Apesar das técnicas moleculares proporcionarem resultados rápidos, necessitam de investimentos em equipamentos e infraestrutura laboratorial, sendo inviável a realização das mesmas a campo, que representa dificuldades como o envio de material em condições ideais, muitas vezes inviabilizando o cultivo do agente, principalmente no caso das doenças respiratórias suínas.

Recentemente, métodos diagnósticos baseados em AuNPs tem sido utilizados para uma rápida e sensível detecção direta de microrganismos, entre eles, Mycobacterium sp. (Hussain, Samir, and Azzazy 2013, Liandris et al. 2009, Baptista et al. 2006), Escherichia coli, com detecção de 54 nanogramas (ng) de DNA não amplificado e com 100% de sensibilidade (Padmavathy, Vinoth Kumar, and Jaffar Ali 2012), RNA de vírus da dengue com detecção de 1 × 101 TCID50 unidade (Carter et al. 2013) e Leishmania sp com valores de detecção de 11,5ng de DNA e sensibilidade de 92% (Andreadou et al. 2014).

O presente trabalho objetivou a padronização da técnica de AuNPs para detecção de App, em amostras clinicas de suínos com pneumonia.

MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRAS

As amostras testadas são provenientes do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular Veterinária do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso e foram coletadas entre os anos de 2010 a 2013 originárias de diferentes regiões do Estado do MT. Foram testadas 70 amostras de pulmões de suínos, sendo 53 com lesões macroscópicas características de pneumonia (consolidação pulmonar, deposição de fibrina na pleura, pleurite ou aderência) e 17 sem lesões macroscópicas de animais em fase de terminação e abate.

Os controles positivos para a padronização do teste foram DNAs extraídos de cultivos de App sorotipos 3 e 5 e H. parasuis, cedidos pelo Centro Nacional de Suínos e Aves-Embrapa e Pasteurella multocida (P. multocida) proveniente de cultura no Laboratório de Microbiologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso confirmada por PCR e sequenciamento para o gene kmt1. Como controle negativo utilizou-se o DNA de cepa ATCC de Escherichia coli e água ultra-pura.

EXTRAÇÃO DE DNA e PCR

40

A extração de DNA das amostras foi realizada segundo Sambrook and Russel (2004) utilizando-se fenol e clorofórmio, com mínimas modificações. A realização dos testes de PCR para os microrganismos foram realizadas de acordo com Xiao et al. (2006) para App, Townsend et al. (2001) para P. multocida e Angen et al. (2007) para H. parasuis. Os primers e tamanho dos amplicons encontram-se no quadro 1 . A qualidade e integridade do DNA e os produtos de amplificação foram analisados em eletroforese em gel agarose 1,0%, corados com Gel Red™ (Biotium®), a 100 Volts por centímetro e observados em ChemiDoc™ XRS utilizando o software Image Lab™ Software . Como marcador de massa molecular utilizou-se o padrão 100 pares de base (pb) de DNA Ladder™ (Fermentas ®).

PREPARAÇÃO DA AuNPs

Seguiu-se o método de redução de citrato segundo descrito por Grabar et al. (1995) que torna as partículas negativamente carregadas. Um volume de 250 ml de cloreto de ouro (HAuCl4) a 1Mm foi levado à fervura sob agitação e posteriormente foi acrescido nitrato de sódio na concentração de 38,8mM e mantido por agitação continua durante 15 minutos (min). A solução estoque foi mantida a 4°C e a solução em uso se manteve estável por três meses a temperatura ambiente.

TESTE DE AuNP

A hibridização foi realizada conforme descrito por Padmavathy, Vinoth Kumar, and Jaffar Ali (2012), a desnaturação do DNA ocorreu a 95°C por 3min em solução contendo 1,25 M de NaCl, 20 mM de Tris, 70pMol do oligonucleotídeo apxIV R, que posteriormente foi resfriada a 50°C por 2 min para permitir a hibridização com o iniciador. Imediatamente submeteu-se a reação ao resfriamento até que se atingisse 4°C e adicionou-se 50µl do preparado de AuNPs.

As leituras das amostras foram realizadas de acordo com Hussain, Samir, and Azzazy (2013) sendo as amostras classificadas colorimetricamente (visualmente) positivas como roxas e negativas como rosa. Leituras de densidade ótica (OD) com o valores à partir de 0,5 na relação entre as leituras de ondas de 600/520nm foram consideradas positivas, amostras com valores inferiores negativas. A visualização macroscópica dos resultados foi possível 1 min após o acréscimo da AuNPs. Os limites de detecção foram obtidos à partir de diluições seriadas dos DNAs de App sorotipos 3 e 5 e o controle negativo consistiu em H2O ultra pura.

As imagens foram obtidas com câmera digital.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada através do software R (R, 2011) para determinação da sensibilidade e especificidade da técnica e o teste Kappa para análise de concordância entre a técnica de PCR e as AuNPs.

RESULTADOS

O limite de detecção de DNA de amostras de App sorotipos 3 e 5 estão descritos no quadro 4. O menor nível de detecção foi de 129ng de DNA pelas avaliações macroscópica e relação OD520/600nm (0,55) (Figura 1). Não ocorreram alterações de coloração macroscopicamente e na leitura de OD para DNA de outras bactérias como P. multocida, H. parasuis e E. coli (Figura 2).

Em relação a detecção dos patógenos bacterianos respiratórios das amostras de pulmões pelo PCR, o resultado está descrito no quadro 2. A presença de App foi detectada em 16 (22,85%) das 70 amostras testadas. Destas, 8 (50%) foram de pulmões com lesão e 8 (50%) de pulmões sadios.

Na detecção de App pela técnica de AuNPs em pulmões, 23 amostras (32,8%) foram positivas no teste, sendo 13 (24,5%) com lesões e 11(64,7%) sem lesões (Quadro 3). Utilizando-se a técnica de PCR como padrão ouro obteve-se uma sensibilidade de 93,8% e uma especificidade de 84,6% para AuNPs. A concordância entre PCR e AuNPs foi boa com índice Kappa de 0,684 (Quadro 5).

DISCUSSÃO e CONCLUSÃO

41

A nanociência possui inúmeras aplicações, como construção de sensores, microeletrônica, catálise e ação bactericida. Soluções coloidais de metais podem ser facilmente preparadas e modificadas quimicamente, uma diversidade de cores pode ser observada relacionada às oscilações dos elétrons de condução em ressonância a luz incidente, desde que haja elétrons livres de condução (Melo Jr et al. 2012). A técnica de AuNPs tem sido utilizada para diagnóstico de Mycobaterium tuberculosis (Hussain, Samir, and Azzazy 2013), câncer de bexiga (Nossier et al. 2014), Leishmania sp.(Andreadou et al. 2014) e vírus da dengue (Carter et al. 2013) A detecção do DNA é baseada na adsorção das bases nitrogenadas aos oligonucleotídeos e a superfície das AuNPs. A agregação ocorre devido a presença de sal durante a hibridização, ocorrendo a atração e a agregação das AuNPs devido as carga negativas que interagem com os cátions do sal. A coloração visual muda do vermelho para o azul, na ausência do DNA alvo porque não ocorre a agregação (Hussain, Samir, and Azzazy 2013). A concentração e tamanho dos iniciadores utilizados, concentração de sal, concentração de nanopartículas e temperatura de anelamento dos iniciadores são fatores que podem interferir nos resultados desta técnica.

O limite mínimo de detecção das AuNPS foi de 129,8ng de DNA de App não amplificado, sendo o limite mínimo de detecção na PCR com os mesmos oligonucleotídeos de acordo com Xiao et al. (2006) de 10 picogramas (pg) para DNA amplificado. Chan et al. (2014) obtiveram em amostras de PCR amplificado para genes de resistência á meticilina em Staphylococcus aureus um valor para limite de detecção das AuNPs de 500ng e Hussain, Samir, and Azzazy (2013) valores de DNA não amplificado de 40 ng, utilizando a técnica de nanopartículas de ouro sem adição do grupo tiol, um pequena modificação nos oligonucleotídeos. A maior concentração de agentes no tecido estudado pode ser o motivo da maior sensibilidade encontrada neste estudo e em trabalhos, como o de Andreadou et al. (2014) que descrevem como valores mínimos de detecção de DNA de Leishmania sp. 11,5ng e Padmavathy, Vinoth Kumar, and Jaffar Ali (2012) que encontraram valor mínimo de detecção de 54 ng de DNA de E. coli,. A funcionalização da AuNPs com oligonucleotídeos tiol modificados conduziu a primeira aplicação de AuNPs na detecção de ácido nucleico. O uso de técnicas utilizando ouro para detecção de App foi primeiramente descrito no ano de 2009, porém, o diagnóstico se baseava em detecção por fluorescência de anticorpo especifico para a toxina ApxIV, com sensibilidade de 87,5% e especificidade de 92,9% (Sheng et al. 2009).

Usando-se a detecção do DNA genômico não amplificado, extraído diretamente do pulmão de suínos com e sem sinais clínicos o teste apresentou sensibilidade de 93,8% e especificidade 84,6%, com valor kappa 0,684 demonstrando boa concordância. No grupo dos animais sem lesão macroscópica de pneumonia, alcançou-se a sensibilidade de 100%, entretanto a especificidade foi inferior a 80% e o teste kappa 0,767 indicando ótima concordância entre os testes de PCR e AuNP. A concordância entre os testes nos animais com lesão foi de 0,590, sendo considerada boa. Os valores de sensibilidade e especificidade foram de 87,5% e 86,7%, respectivamente. A utilização de DNA não amplificado pode gerar interferências nos testes moleculares, porém as reações cruzadas são menos frequentes do que nos testes sorológicos. Apesar das semelhanças genéticas entre os microrganismos que causam as doenças do complexo respiratório, pertencentes à família Pasteurelacea, entre eles: App, , H. parasuis e P. multocida (Fablet et al. 2012, Hansen et al. 2010) e ainda os microrganismos Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) e Streptococcus suis (S. suis), a escolha dos oligonucleotídeos e dos genes alvos para os testes pode diminuir essas reações cruzadas.

A maior parte das técnicas moleculares e sorológicas exige algum grau de tecnificação por parte do local de realização e mão de obra capacitada, entretanto a técnica descrita neste trabalho pode ser aplicável em locais com menor infraestrutura, onde o uso de termociclador pode ser substituído por equipamentos mais simples e mais baratos, capazes de oscilar a temperatura como o banho- maria. A preparação das nanopartículas deve ser realizada em laboratório, entretanto apenas um agitador magnético com aquecimento se faz necessário. A solução estoque se mantém estável, a 4°C em geladeiras convencionais, por tempo indeterminado e a solução de uso pode ser mantida em temperatura ambiente em torno de três meses, observando-se nesse tempo apenas a precipitação do soluto que inviabiliza seu uso. O uso de kits comerciais de extração de DNA são facilmente obtidos, com custos variados, e de fácil manuseio. A campo, a utilização desta técnica representaria a possibilidade de detectar animais doentes com mais agilidade, já que a disseminação do agente ocorre de forma rápida por aerossóis.

Agradecimentos - À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de mestrado e a Fundação de Àmparo a Pesquisa do Estado de Mato Grosso (Fapemat)

42

ANEXO A – PÁGINA DE SUBMISSÃO DO ARTIGO

43

ANEXO B – PÁGINA WEBQUALIS QUE ATESTA A CLASSIFICAÇÃO

DO PERIÓDICO.

http://qualis.capes.gov.br/webqualis/publico/pesquisaPublicaClassificacao.seam;jses

sionid=A838FF467DD11B70FE2E9FA63F2D6EED.qualismodcluster-node-66.

Acessado: 19 de Fevereiro de 2014