Validación de metodologías analíticas para la...

Validación de metodologías analíticas para la determinación de

productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

Nancy Yohanna Velandia Rodríguez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

Año 2013

Validación de metodologías analíticas para la determinación de

productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

Nancy Yohanna Velandia Rodríguez

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias - Química

Director:

Ph.D., Jairo Arturo Guerrero Dallos

Línea de Investigación:

Residualidad ambiental – Química analítica

Grupo de Investigación:

Residualidad y destino ambiental de plaguicidas en sistemas agrícolas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

Año 2013

A Cami Linares…Eres toda mi fuerza

Agradecimientos A Camila, mi brújula, mi fuerza, mi motivo, mi soporte y mi apoyo, mi mejor amiga y mi

compañía, gracias por entender, por ensañarme más de lo que yo te he enseñado a ti,

por abrazarme y darme tu apoyo y tus sabias palabras cuando más lo he necesitado

¡Eres mi ángel!.

A mi mami, la mujer a la que admiro, la persona más buena que conozco, quien me ha

puesto con sus tiernas manos, con su amor y su ayuda incondicionales en el lugar donde

estoy, sin ella no hubiera dado ni el primer paso.

A mi director, el profe Jairo, por haberme acogido en su equipo de trabajo y haberme

transmitido todo su conocimiento, por la paciencia, el apoyo, la confianza, la colaboración

y también por los regaños, que de vez en cuando, son útiles y necesarios.

A Julio César, mi mejor amigo, gracias por la compañía y por hacerme sonreir, vale

mucho más de lo que parece.

A mi Dianita, por estar allí en todos los momentos difíciles y con palabras sabias

ayudarme a levantar la cabeza. Gracias por hacerme ver que no hay que tener miedo,

incluso si las estrellas se desvanecen.

A mis amigos del LARP, Jamer, Darío, Danny y Alexander, gracias por enseñarme tanto,

por su colaboración durante mis primeros meses en el laboratorio y por hacerme sentir

como en casa.

A los profesores del departamento de Química, por haber contribuido en mi formación, la

misma que hoy continúa y culmina una nueva etapa.

VIII Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

A la Universidad Nacional y a la Facultad de Ciencias por su programa de becas de

exención y finalmente, al Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas – LARP y al

Organismo Internacional de Energía Atómica, por la colaboración y la financiación de

éste trabajo.

Resumen y Abstract IX

Resumen Los ditiocarbamatos son fungicidas ampliamente utilizados en la agricultura a nivel

mundial. La etilentiourea (ETU) y propilentiourea (PTU), los principales compuestos de

degradación del mancozeb y propineb, respectivamente son de especial importancia, ya

que están clasificados como carcinógenos y teratogénicos. El objetivo principal del

presente trabajo consistió en desarrollar y validar metodologías para la determinación de

ETU y PTU como productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos en frutas y

hortalizas y en suelos.

Para la determinación de los analitos en frutas y hortalizas se seleccionó y optimizó un

método de extracción utilizando una mezcla de MeOH: agua 3:1 y posterior limpieza con

partición liquido-líquido soportada sobre Extrelut. Así mismo se seleccionó una

metodología para el análisis de ETU y PTU en suelo, la cual consistió en una extracción

con agitación manual fuerte durante dos minutos utilizando 20 mL de agua y 10 g de

suelo previamente secado y homogenizado. En los dos casos, la determinación analítica

se llevó a cabo por HPLC – DAD.

Se realizó la validación en las dos matrices, encontrando que la metodología es

selectiva, específica, precisa, robusta y exacta, presentando límites de detección y

cuantificación adecuados para el análisis de ETU y PTU en frutas y hortalizas y en

suelos.

Utilizando las metodologías validadas se llevó a cabo la determinación de residuos en

algunas muestras de papa y tomate obtenidas en el mercado local y en una zona de

comercialización primaria, y suelos de cultivo de papa. Los análisis muestran la

presencia de PTU a nivel de trazas en una muestra de papa y de ETU en una muestra

de tomate. Las concentraciones determinadas se encuentran por debajo del límite

máximo de residuos de Sudáfirca, el cual el más estricto. Se encontró presencia de PTU

a nivel de trazas en una de las muestras de suelo analizadas.

Palabras clave: Ditiocarbamatos, etilentiourea, propilentiourea, frutas y horatlizas,

metabolitos, productos de degradación

X Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

Abstract Dithiocarbamates are widely used fungicides in agriculture worldwide. In Colombia,

Mancozeb and Propineb are some of the best-selling fungicides and they are applied in

main crops. Ethylenethiourea (ETU) and propylenethiourea (PTU), the main degradation

products of Mancozeb and Propineb, respectively, are particullary important because they

are classified as carcinogens and teratogenics. The aim of this study was to develop and

to validate methodologies in fruits and vegetables and in soils for determination of ETU

and PTU as degradation products of dithiocarbamate fungicides.

For the determination of analytes in fruits and vegetables were considered four methods

of extraction, and after evaluation process of the performance of each one, was selected

and optimized an extraction method using a mixture of MeOH: water 3:1 and subsequent

cleaning liquid-liquid partition supported on Extrelut. Similarly, was selected a

methodology for the analysis of ETU and PTU in soil, which consisted of extraction of 10

g of dry and homogenized soil during two minutes using 20 mL of water. In both cases,

the analytical determination was carried out by HPLC - DAD.

The Validation methodology was performed. In both cases, the methodology is selective,

specific, robust and accurate, showing limits of detection and quantification suitable for

the analysis of ETU and PTU in fruits and vegetables and soils.

Using validated methodologies, it was carried out the determination of residues in some

potato and tomato samples obtained in the local market and primary trading area, and

potato cropping soils. The analysis showed the presence of trace level of PTU in one

potato sample and the presence of ETU in one tomato sample. The determined

concentrations were below the maximum residue limit more stringent. The presence of

PTU was found at trace levels in one of the soil samples analyzed.

Keywords: palabras Dithiocarbamates, ethylenethiourea, porpylenethiourea, fruits and

vegetables, metabolites, degradation products.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen .............................................................................................................................. IX

Lista de figuras ................................................................................................................ XIV

Lista de tablas .................................................................................................................. XVI

Lista de gráficos ............................................................................................................ XVIII

Introducción ....................................................................................................................... 21

1. Capítulo 1. Estado del arte. ....................................................................................... 24 1.1 El problema con los plaguicidas ........................................................................ 27 1.2 Marco normativo ................................................................................................ 28

1.2.1 Límites máximos de residuos ................................................................. 30 1.3 Implicaciones toxicológicas y ambientales ....................................................... 31

1.3.1 Ditiocarbamatos y sus productos de degradación ................................. 31 1.3.2 ETU y PTU .............................................................................................. 33

1.4 Metodologías analíticas para la determinación de ETU y PTU a nivel de trazas35 1.4.1 Técnicas basadas en separación por cromatografía de gases ............. 36 1.4.2 Técnicas basadas en cromatografía líquida .......................................... 38

1.5 Justificación – planteamiento del problema ...................................................... 46

2. Capítulo 2. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en frutas y hortalizas ................................................... 49

2.1 Estándares de referencia, matrices de ensayo, equipos, materiales, solventes y reactivos ..................................................................................................................... 50

2.1.1 Estándares de referencia ....................................................................... 50 2.1.2 Matrices de ensayo ................................................................................ 50 2.1.3 Materiales y equipos ............................................................................... 51 2.1.4 Reactivos y solventes ............................................................................. 51

2.2 Sistema instrumental ......................................................................................... 52 2.3 Preparación y homogenización de la muestra .................................................. 52 2.4 Selección de la metodología – Parte experimental .......................................... 52

2.4.1 Extracción con solventes de baja polaridad (M1) .................................. 53 2.4.2 Dispersión de matriz en fase sólida (M2) ............................................... 54 2.4.3 Metodología QuEChERS (M3) ............................................................... 55 2.4.4 Extracción con solventes polares – Limpieza con partición (M4) ......... 57

2.5 Selección de la metodología - Resultados y discusión .................................... 58 2.5.1 Extracción con solventes de baja polaridad M1 .................................... 58 2.5.2 Dispersión de matriz en fase sólida M2 ................................................. 60

XII Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

2.5.3 Metodología QuEChERS M3 ................................................................. 65 2.5.4 Extracción con solventes polares M4 .................................................... 66

2.6 Optimización de la metodología – parte experimental ..................................... 70 2.6.1 Optimización de la etapa de limpieza .................................................... 70 2.6.2 Optimización de la etapa de extracción ................................................. 71

2.7 Optimización de la metodología - Resultados y discusión ............................... 71 2.8 Evaluación de la metodología con diferentes matrices – Parte experimental . 78 2.9 Evaluación de la metodología con diferentes matrices – Resultados .............. 79 2.10 Validación de la metodología – Parte experimental ......................................... 80

2.10.1 Especificidad-Selectividad ...................................................................... 80 2.10.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología....................... 80 2.10.3 Linealidad – Efecto matriz ...................................................................... 81 2.10.4 Exactitud ................................................................................................. 82 2.10.5 Precisión ................................................................................................. 83 2.10.6 Robustez de la metodología................................................................... 83

2.11 Validación de la metodología – Resultados ...................................................... 84 2.11.1 Especificidad-Selectividad ...................................................................... 85 2.11.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología....................... 86 2.11.3 Linealidad –Efecto matriz ....................................................................... 89 2.11.4 Exactitud ................................................................................................. 93 2.11.5 Precisión ................................................................................................. 95 2.11.6 Robustez de la metodología................................................................... 97

2.12 Cuantificación de los analitos en muestras comerciales ................................ 100 2.12.1 Análisis de muestras ............................................................................ 103

3. Capítulo 3. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en suelos ..................................................................... 107

3.1 Equipos, materiales, estándares de referencia, solventes y reactivos .......... 108 3.1.1 Estándares, solventes y reactivos ........................................................ 108 3.1.2 Matrices de ensayo .............................................................................. 108 3.1.3 Materiales y equipos ............................................................................. 109 3.1.4 Reactivos y solventes ........................................................................... 109 3.1.5 Sistema instrumental ............................................................................ 110

3.2 Preparación y homogenización de la muestra – Suelos de ensayo .............. 110 3.3 Selección de la metodología – Parte experimental ........................................ 110 3.4 Selección de la metodología – Resultados y discusión.................................. 112 3.5 Validación de la metodología – Parte experimental ....................................... 113

3.5.1 Especificidad-Selectividad .................................................................... 113 3.5.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología..................... 113 3.5.3 Linealidad – Efecto matriz .................................................................... 114 3.5.4 Precisión ............................................................................................... 116 3.5.5 Robustez de la metodología................................................................. 116

3.6 Validación de la metodología – Resultados y discusión ................................ 117 3.6.1 Especificidad-Selectividad .................................................................... 117 3.6.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología..................... 118 3.6.3 Linealidad –Efecto matriz ..................................................................... 121 3.6.4 Exactitud ............................................................................................... 124 3.6.5 Precisión ............................................................................................... 125 3.6.6 Robustez de la metodología................................................................. 127

3.7 Determinación de residuos de ETU y PTU en suelos de uso agrícola .......... 129

Contenido XIII

3.7.1 Zona de muestreo ................................................................................ 130

4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 135 4.1 Conclusiones ................................................................................................... 135 4.2 Recomendaciones ........................................................................................... 136

Anexo 1: Cálculos estadísticos ..................................................................................... 139

Anexo 2: Datos Validación ............................................................................................. 147

Anexo 3: Resultados análisis de muestras .................................................................. 158

Bibliografía ....................................................................................................................... 161

Contenido XIV

Lista de figuras Figura 1. Cromatogramas obtenidos en detector ECD y NPD para extracto blanco de manzana fortificado con ETU a 0.05mg/kg [15]. ................................................................ 37 Figura 2. Proceso de extracción en fase solida. [17] ......................................................... 39 Figura 3. Cromatogramas CL-EM en modo SIM para una solución estándar utilizando (A)APCI y (B) ESI. (1) ETU, 0.5 µgml−1; (2) PTU, 0.5 µgml−1; (3) dazomet, 1 µgml−1; (4) thiram, 1µgml-1; and (5) disulfiram, 1 µgml−1. [20] ........................................................... 41 Figura 4. Proceso general para la extracción mediante DMFS. ........................................ 42 Figura 5. Determinación simultanea de Maneb y sus Metabolitos de degradación (1) ETU; (2) EBIS; (3) EU; (4) Maneb. [22] ....................................................................................... 42 Figura 6. Fase estacionaria [24] utilizada para la separación de ETU por Tölgyesi et. al. [23] ...................................................................................................................................... 44 Figura 7. Cromatogramas obtenidos para blanco de tomate y blanco fortificado con ETU 0,007 mg/kg [23] ................................................................................................................. 44 Figura 8. Cromatograma del análisis de ETU a diferentes concentraciones. ................... 46 Figura 9. Procedimiento de extracción = M1. .................................................................... 54 Figura 10. Procedimiento para dispersión de matriz en fase sólida = (M2) ...................... 55 Figura 11. Procedimiento para metodología QuEChERS = M3.[23] ................................. 56 Figura 12. Procedimiento para extracción con solventes polares = M4 ............................ 57 Figura 13. Cromatograma blanco de matriz, estándar y blanco fortificado extracción M1 58 Figura 14. Estructura porosa del carbón activado. ............................................................ 60 Figura 15. Grupos superficiales presentes en la superficie del carbón activado. ............. 61 Figura 16 Efecto de la forma del soluto en la fuerza de retención sobre la superficie de carbón grafitizado ............................................................................................................... 62 Figura 17. Representación esquemática de la retención de un analito polar con a. Carga positiva y b. Carga negativa, aproximándose a la superficie del grafito. .......................... 62 Figura 18. Blanco de matriz, estándar y recuperado metodología M2 C18. ..................... 63 Figura 19. Blanco de matriz y estándar metodología M3 .................................................. 65 Figura 20. Estructura adsorbente PSA ............................................................................... 66 Figura 21. Estándar, blanco y blanco fortificado para el ensayo con la metodología M4 . 67 Figura 22. Esquema del proceso de partición líquido-líquido soportado sobre extrelut. .. 72 Figura 23. Tautomerismo tiona-tiol en ETU y PTU ............................................................ 73 Figura 24. Tautomeria tiona-tiol catalizada. ....................................................................... 74 Figura 25. Procedimiento para la determinación de ETU y PTU en frutas y hortalizas. ... 78 Figura 26. Cromatograma obtenido para blanco de matriz y mezcla de analitos. Especificidad de la metodología. ........................................................................................ 85

Contenido XV

Figura 27. Cromatograma obtenido al fortificar el extracto de matriz blanco con los analitos al límite de detección 0.003 mg/kg ETU y 0.006 mg/kg PTU. ............................. 88 Figura 28. Cromatograma de muestra de papa PTU en trazas. Confirmación de señal con adición estándar. ............................................................................................................... 104 Figura 29. Cromatograma de muestra de tomate ETU en trazas. Confirmación de señal con adición estándar ......................................................................................................... 105 Figura 30. Cromatograma obtenido para extracto de suelo blanco y mezcla de analitos. Especificidad de la metodología. ...................................................................................... 118 Figura 31. Cromatograma obtenido al fortificar el extracto de suelo blanco con los analitos al límite de detección 0.01 mg/kg ETU y 0.02 mg/kg PTU. ............................................. 120 Figura 32. Cromatograma de extractos de suelo blanco inyectados en columna C18 150 mm y C18 250 mm comparados con inyección de estándar en solvente. ...................... 129 Figura 33. Zonas de muestreo Cundinamarca. ............................................................... 131 Figura 34. Cromatogramas de análisis de muestra de suelo región de Ubaté (Cundinamarca) con presencia de PTU a nivel de trazas. Confirmación con adición de estándar. ........................................................................................................................... 132

XVI Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

Lista de tablas Pág.

Tabla 1. Plaguicidas más vendidos en Colombia en 2007 ................................................ 26 Tabla 2. Estructuras de ditiocarbamatos ............................................................................ 33 Tabla 3. Porcentajes de recuperación y coeficientes de variación para M1 ..................... 59 Tabla 4. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M1 ............. 59 Tabla 5. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M2 C18 ..... 64 Tabla 6. Exactitud y precisión para la metodología M4 ..................................................... 66 Tabla 7. Criterios de selección de la metodología. ............................................................ 69 Tabla 8. Concentraciones de los niveles de calibración .................................................... 81 Tabla 9. Criterios de aceptación linealidad ........................................................................ 82 Tabla 10. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método. ............ 83 Tabla 11. Diseño experimental para evaluación de la robustez. ....................................... 84 Tabla 12. Valores de altura de analitos individuales para estimación del límite de detección y cuantificación ................................................................................................... 86 Tabla 13. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación .............................................................................................. 87 Tabla 14. Límites de detección y cuantificación estimados ............................................... 87 Tabla 15. Recuperación al límite de cuantificación 0.010 mg/kg ETU y 0.020 mg/kg PTU............................................................................................................................................. 88 Tabla 16. Efecto matriz pata ETU. ..................................................................................... 90 Tabla 17. Efecto matriz para PTU. ..................................................................................... 90 Tabla 18. Resultados pruebas estadísticas de linealidad en solvente .............................. 93 Tabla 19. Resultados ensayo de exactitud (n=7) ............................................................... 94 Tabla 20. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad. ................................. 96 Tabla 21. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia ..................... 96 Tabla 22. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método ................................... 97 Tabla 23. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez. .................. 99 Tabla 24. Resultados de monitoreo de residuos de ETU y PTU en muestras de papa y tomate ............................................................................................................................... 103 Tabla 25. Propiedades fisicoquímicas de la calicata utilizada en la validación de la metodología ...................................................................................................................... 109 Tabla 26. Resultados selección de la metodología de extracción en suelos. ................. 112 Tabla 27. Concentraciones de los niveles de calibración ................................................ 115

Contenido XVII

Tabla 28. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método. .......... 116 Tabla 29. Diseño experimental para evaluación de la robustez. ..................................... 117 Tabla 30. Valores de altura de analitos individuales para estimación del límite de detección y cuantificación ................................................................................................. 118 Tabla 31. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación ............................................................................................ 119 Tabla 32. Límites de detección y cuantificación estimados ............................................. 119 Tabla 33. Recuperación al límite de cuantificación 0.020 mg/kg ETU y 0.040 mg/kg PTU .......................................................................................................................................... 120 Tabla 34. Efecto matriz pata ETU. ................................................................................... 121 Tabla 35. Efecto matriz para PTU. ................................................................................... 121 Tabla 36. Resultados pruebas estadísticas de linealidad en solvente ............................ 123 Tabla 37. Resultados ensayo de exactitud de la metodología n=7. ................................ 124 Tabla 38. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad. ............................... 125 Tabla 39. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia ................... 126 Tabla 40. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método ................................. 126 Tabla 41. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez. ................ 127 Tabla 42. Resultados de análisis de muestras de suelo de uso agrícola ....................... 131 Tabla 43. Linealidad ETU Solvente. Frutas y hortalizas. ................................................. 147 Tabla 44. Linealidad PTU Solvente. Frutas y hortalizas. ................................................. 148 Tabla 45. Linealidad ETU Matriz. Frutas y hortalizas. ..................................................... 149 Tabla 46. Linealidad PTU Matriz. Frutas y hortalizas. ..................................................... 150 Tabla 47. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en solvente. Frutas y hortalizas. ............................................................................................ 151 Tabla 48. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en matriz. Frutas y hortalizas. ............................................................................................... 151 Tabla 49. Análisis de varianza ETU solvente. Frutas y hortalizas................................... 152 Tabla 50. Análisis de varianza PTU solvente. Frutas y hortalizas................................... 152 Tabla 51. Linealidad ETU Solvente. Suelo. ..................................................................... 153 Tabla 52. Linealidad PTU Solvente. Suelo. ..................................................................... 154 Tabla 53. Linealidad ETU Matriz. Suelo. .......................................................................... 155 Tabla 54. Linealidad PTU Matriz. Suelo. .......................................................................... 155 Tabla 55. Resultados muestras de papa con señales en tiempo de retención PTU ...... 158 Tabla 56. Resultados confirmación de muestras de papa con señales, repetición de ensayo y adición estándar. ............................................................................................... 158 Tabla 57. Resultados muestras de tomate con señales en tiempo de retención ETU ... 159 Tabla 58. Resultados confirmación de muestras de tomate con señales en el tiempo de retención de ETU, repetición de ensayo y adición estándar. .......................................... 159

Contenido XVIII

Lista de gráficos Gráfico 1. Destino geográfico de plaguicidas en Colombia. [5] ......................................... 26 Gráfico 2. Efecto del pH en la recuperación en la etapa de limpieza. ............................... 75 Gráfico 3. Efecto de la adición de sal en la recuperación en la etapa de limpieza. .......... 76 Gráfico 4. Volumen de diclorometano necesario para le elución de los analitos. ............. 77 Gráfico 5. Efecto de la composición del extractante en la recuperación de la metodología.............................................................................................................................................. 77 Gráfico 6. Evaluación de la recuperación de la metodología optimizada para a. ETU y b. PTU en diferentes matrices. ............................................................................................... 79 Gráfico 7. Curvas de calibración en solvente y en matriz ETU. ........................................ 91 Gráfico 8. Curvas de calibración en solvente y en matriz PTU. ........................................ 92 Gráfico 9. Número de registros nacionales de productos que contienen mancozeb o propineb por tipo de cultivo. ............................................................................................. 101 Gráfico 10. Curvas de calibración en solvente y en matriz ETU. .................................... 122 Gráfico 11. Curvas de calibración en solvente y en matriz PTU. .................................... 123

Contenido XIX

21

Introducción De 1960 a 1990 la agricultura experimentó un gran incremento en la productividad en

muchas regiones del mundo, la producción de maíz, trigo, arroz y otros cultivos se

duplicó, logrando el suministro de alimentos y estabilización de sus precios. Este periodo

se denominó Revolución Verde y se caracterizó por el mejoramiento genético de los

cultivos, la innovación de nuevos plaguicidas, fertilizantes, grandes obras de irrigación,

asesoría técnica a los productores para fomentar el uso de nuevas tecnologías y la

mecanización de las labores agrícolas. A partir de 1990, los efectos negativos de la

Revolución Verde empezaron a reflejarse con la pérdida de la biodiversidad agrícola y el

uso indiscriminado de productos químicos. Hoy en día en las grandes regiones

productoras, los productores abandonaron las variedades locales por variedades

mejoradas provocando los monocultivos de maíz, trigo, sorgo y algodón, por citar algunos

cultivos. Asimismo, en cierto grado con los plaguicidas se han contaminado los suelos y

las fuentes de agua.

A pesar de lo anterior, el desafío actual de la agricultura es aumentar la producción de

alimentos y aunque la tendencia es hacia métodos alternativos que involucran el control

de plagas mediante manejo integrado y la implementación de agricultura orgánica, se

debe suplir la demanda de una población que crece de forma exponencial y que para

2050 probablemente superará los 9.000 millones de personas. En este escenario los

plaguicidas son de especial importancia, pues su utilización permite controlar las plagas

de una forma económica y eficiente para asegurar el abastecimiento de alimentos, pues

usarlos significa que hay un suministro abundante y variedad de productos de alta

calidad a precios razonables. La sociedad moderna exige alimentos nutritivos libres de

daños causados por las plagas lo cual sería muy difícil sin el uso de plaguicidas. Sin

embargo, dado que son sustancias sintéticas que han sido fabricadas para ser biocidas,

existe un riesgo potencial de que residuos de ésta moléculas queden como

contaminantes en los alimentos y su efecto detallado sobre la salud se desconoce.

22 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de

degradación de fungicidas ditiocarbamatos

Dentro del grupo de los plaguicidas, los fungicidas son de especial importancia pues son

usados ampliamente en la industria, la agricultura, el hogar y el jardín para múltiples

propósitos entre los cuales se incluyen la protección de semillas y granos durante su

almacenamiento, germinación y transporte; la protección de cultivos, eliminación de

mohos y hongos que atacan superficies, protección de alfombras y telas entre muchos

otros. Existen más de 100 especies de hongos que atacan los cultivos produciendo

enfermedades en las plantas, proliferando sobre los alimentos y causando su

descomposición o contaminándolos con toxinas. El 80% de las patologías vegetales se

debe a la presencia de hongos y se conocen más de 50 especies de estos que producen

daños de gran importancia comercial. Para combatirlos se han sintetizado cientos de

fungicidas y varias decenas de ellos tienen aplicación hoy para la agricultura, en forma de

pulverizaciones foliares, en gránulos para tratamiento del suelo, como recubrimiento para

semillas y para tratamiento de los frutos. Dado que existe una gran variedad de

moléculas empleadas como fungicidas, el potencial que tienen para causar efectos

adversos en los humanos varía enormemente. Históricamente, algunas de las epidemias

más trágicas de envenenamiento por fungicidas han ocurrido mediante el consumo de

semillas de granos que fueron tratadas con mercurio orgánico o hexaclorobenceno. Sin

embargo, es improbable que la mayoría de los fungicidas que se utilizan en la actualidad

causen severos envenenamientos frecuentes o sistémicos debido a varias razones. En

primer lugar, muchos de ellos tienen una toxicidad inherente baja para los mamíferos y

son absorbidos ineficazmente. En segundo lugar, muchos fungicidas se formulan en una

suspensión de polvos y gránulos absorbentes en agua, por lo cual una absorción rápida y

eficiente es improbable. En tercer lugar, los métodos de aplicación son tales que

relativamente son pocos los individuos que están altamente expuestos. Aparte de los

envenenamientos sistémicos, los fungicidas son responsables probablemente de un

número desproporcional de daños irritantes a la piel, las membranas mucosas y

sensibilización cutánea.

La biotransformación de los plaguicidas puede dar como resultado sustancias de

reducida toxicidad o químicamente inactivas, como ocurre con el metabolito final del

dimetoato. Por el contrario, pueden generarse sustancias tóxicamente más activas que el

compuesto original, como es el caso del carbosulfán al transformarse en carbofurán, o

del paratión que da origen al paraoxón, metabolitos con alta afinidad por el ADN y con

Capítulo 1 23

capacidad mutágena importante. Es el caso de los fungicidas ditiocarbamatos, que son

considerados como de baja toxicidad, sin embargo, sus principales metabolitos,

Etilentiourea y Propilentiourea presentan elevada toxicidad y alta movilidad en el

ambiente.

En Colombia los fungicidas ocupan un renglón importante en el mercado de

agroquímicos, siendo el Mancozeb el más vendido y aplicado. La presencia de productos

de degradación de elevada toxicidad como residuos en los productos agrícolas, tanto de

consumo interno como de exportación puede tener implicaciones en diferentes ámbitos.

Dado que en Colombia no se han desarrollado metodologías para la determinación de

ETU y PTU en matrices como suelo o frutas y hortalizas, este trabajo pretende optimizar

y validar metodologías analíticas para la determinación de estos productos de

degradación, optimizando el método de extracción y limpieza, así como la separación

cromatográfica y la detección de los analitos, con el fin de obtener porcentajes de

recuperación adecuados y bajos limites de cuantificación.



1. Capítulo 1. Estado del arte.

Según estudios de la FAO y de la división de población del departamento de asuntos

económicos y sociales de las Naciones Unidas, en el año 2050 la población mundial será

de 9 billones de personas, cifra dos veces superior a la registrada para 1980 [1],motivo

por el cual la producción de alimentos deberá ser casi el doble de la actual. Al mismo

tiempo, la disponibilidad de tierras para labranza disminuirá como resultado de la

urbanización. Resolver el problema implica la necesidad de elevar los rendimientos

agrícolas, proteger mejor a los cultivos y al ganado contra la agresión de las plagas,

incrementar la extensión de tierras cultivables y lograr que la gente disponga de más

dinero para la adquisición de alimentos. El aumento de la producción alimentaria

mediante la utilización de agroquímicos es de especial importancia, sobre todo para los

países en desarrollo.

Actualmente no es posible obtener altos rendimientos en la agricultura sin la utilización

de medidas de protección de plantas, entre las cuales los plaguicidas siguen teniendo

una participación considerable, aunque los enfoques han cambiado significativamente. Si

bien los plaguicidas ayudan a producir alimentos y fibras de manera más fácil,

abundante, económica y eficiente, su uso intensivo y desmedido ha traído como

consecuencia resultados bastante contradictorios. Por un lado, el uso de productos

fitosanitarios o agroquímicos han contribuido a incrementar la disponibilidad de alimentos

y el uso del insecticida DDT ha evitado que más de mil millones de individuos padezcan

de malaria. Así mismo, en países tropicales cuando no se protegen los cultivos, los

rendimientos bajan y con frecuencia son nulos debido a la pérdida que causan las

plagas. Pero por otro lado, los plaguicidas aún están causando efectos adversos para el

medio ambiente, la salud pública y los enemigos naturales, así como riesgo en la salud

Capítulo 1 25

humana. Según la UNESCO (2005) cada año resultan afectados por plaguicidas entre

3,5 y 5 millones de personas en el mundo. De la misma manera se hace notar que, por

ejemplo, en estados unidos, ¾ partes del agua subterránea de california se encuentra

contaminada por residuos de actividades agrícolas, entre ellos, los plaguicidas [2].

La utilización de plaguicidas dentro de una agricultura sostenible debe considerar los

mecanismos de control necesarios con el fin de garantizar que debido a ellos no existan

efectos adversos en la salud humana y el medio ambiente. Teniendo conciencia de la

problemática que representan los residuos de plaguicidas en los alimentos, se establecen

los límites máximos de residuos LMR con el fin de proteger la salud de los consumidores.

Así mismo, determinar la distribución del plaguicida en los diferentes compartimentos

ambientales permite adquirir conocimientos más exactos sobre su movilidad en el medio

ambiente, así como los procesos que afectan su persistencia y biodisponibilidad, con el

fin de evaluar el impacto ambiental real que puede tener su uso.

La determinación de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas, así como en

productos alimenticios es en la actualidad de gran importancia a nivel mundial, ya que es

un requisito de calidad que asegura la inocuidad del producto y en el cual se hace énfasis

en la normatividad de comercialización de productos agrícolas a nivel internacional.

En países industrializados el monitoreo de residuos de plaguicidas y de sus productos de

degradación de importancia toxicológica en alimentos se realiza continuamente. Aunque

el control de los plaguicidas es más eficaz en estos países, se han reportado alimentos,

tales como leche o frutas y verduras, con niveles residuales de plaguicidas por encima de

los límites máximos [3, 4]. Para sustentar los resultados de los análisis de residuos de

plaguicidas realizados en alimentos, es primordial emplear técnicas y metodologías

sistemáticas que permitan la extracción, separación, identificación y cuantificación.

Además, es importante validar los métodos considerando varios parámetros de calidad,

entre ellos, precisión (repetibilidad y reproducibilidad), límites de detección (LD) y límites

de cuantificación (LC) con el fin de demostrar de forma experimental y previamente a su

utilización, que el método es adecuado para el propósito que se ha fijado y que produce

resultados confiables y reproducibles.

Colombia es un país principalmente agrícola y el mercado de plaguicidas incluye

principalmente insecticidas, herbicidas y fungicidas, dominado principalmente por un gran

número de filiales y multinacionales. En la industria nacional principalmente existen

26

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Capítulo 1 27

Mancozeb y Propineb pertenecen a la familia química de los ditiocarbamatos (DTCs), que

son fungicidas no sistémicos utilizados considerablemente debido a su eficiencia frente a

un amplio espectro de hongos y enfermedades de las plantas asociadas a ellos.

Recientemente se ha incrementado la preocupación respecto a los peligros que pueden

causar los residuos de este tipo de compuestos y productos de transformación. La

etilentiourea (ETU) y propilentiourea (PTU), principales Metabolitos de degradación de

Mancozeb y Propineb, respectivamente, son de especial importancia debido a que los

estudios han mostrado que poseen efectos carcinógenos y teratogénicos [6].

1.1 El problema con los plaguicidas

La FAO define los plaguicidas como cualquier sustancia destinada a prevenir, destruir,

atraer, repeler o combatir cualquier plaga, incluidas las especies indeseadas de plantas o

animales, durante la producción, almacenamiento, transporte, distribución y elaboración

de alimentos, productos agrícolas o alimentos para animales, o que pueda administrarse

a los animales para combatir ectoparásitos. El término incluye las sustancias destinadas

a utilizarse como reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes,

agentes para reducir la densidad de fruta o inhibidores de la germinación, y las

sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger el

producto contra el deterioro durante el almacenamiento y transporte. El término no

incluye normalmente los fertilizantes, nutrientes de origen vegetal o animal, aditivos

alimentarios ni medicamentos para animales [7].

Cuando se habla de plaguicidas es estrictamente necesario citar la relación

riesgo/beneficio que su uso implica. En la actualidad no es posible desarrollar una

agricultura con altos rendimientos sin la utilización de medidas de protección de cultivos,

entre las cuales los plaguicidas químicos siguen teniendo una participación significativa.

El empleo sistemático de plaguicidas en la agricultura se inicio hace algo más de cien

años y su consumo ha ido aumentando. Es bien sabido que la utilización de plaguicidas

implica un peligro latente para los consumidores, debido a que tanto las sustancias como

sus productos de degradación o reacción pueden dejar residuos en los alimentos que

podrían generar efectos adversos para la salud pública, por lo cual, desde el punto de



vista toxicológico, resulta esencial mantener el nivel de residuos de plaguicidas en los

alimentos en niveles aceptables.

De la cantidad aplicada, la que toma contacto directo con el objetivo es solo un

porcentaje mínimo, por lo que es probable encontrar especies, comunidades o

ecosistemas completos con efectos colaterales indeseables. La contaminación de los

recursos hídricos es una de las preocupaciones más recientes y sobre la cual se ha

desarrollado un gran número de estudios con el fin de determinar la movilidad y el

destino ambiental de los plaguicidas, para conocer su distribución en los compartimentos

ambientales y así determinar si existe el riesgo de contaminación de aguas superficiales

o subterráneas.

A nivel mundial, los plaguicidas son controlados a través de un ciclo, en el cual se

consideran las etapas de producción, comercialización, transporte y mercadeo,

utilización, manejo de desechos y residualidad en el producto al consumidor y en el

medio ambiente. Para ello existen regulaciones internacionales que son acogidas por los

diferentes países del mundo. A nivel local, cada país crea su conjunto de normas de

acuerdo a su infraestructura y sus necesidades.

1.2 Marco normativo

A nivel internacional, acuerdos multilaterales se han suscrito con el fin de controlar la

producción y los mercados de plaguicidas, tales como el convenio de Róterdam para la

aplicación del procedimiento de consentimiento fundamentado previo a ciertos

plaguicidas y productos químicos peligrosos objeto del comercio internacional; el

Convenio de Basilea para el control de los desplazamientos transfronterizos de desechos

peligrosos y su eliminación por parte de los países generadores; el Convenio sobre los

contaminantes orgánicos persistentes –COPs- que reconoce que los contaminantes

orgánicos son un problema global, que se debe proveer asistencia técnica y tecnológica

a las Naciones en desarrollo para cumplir el convenio y señala la lista denominada “la

docena sucia”, que incluye igual número de químicos entre ellos el DDT. Para los países

Capítulo 1 29

andinos aplica la Resolución 630 de 2002 que es un manual técnico andino para el

registro y control de plaguicidas químicos de uso agrícola.

En cuanto al control de residuos de plaguicidas en alimentos y productos alimenticios, la

FAO y la OMS establecen la Comisión del Codex Alimentarius, que fue creada en 1963

para desarrollar normas alimentarias, reglamentos y otros textos relacionados tales como

códigos de prácticas bajo el Programa Conjunto FAO/OMS de Normas Alimentarias. Las

materias principales de este programa son la protección de la salud de los consumidores,

asegurar unas prácticas de comercio claras y promocionar la coordinación de todas las

normas alimentarias acordadas por las organizaciones gubernamentales y no

gubernamentales.

En Colombia se han creado mecanismos de regulación y control para todas las etapas

del ciclo de vida de un plaguicida, entre los cuales se tienen:

• Ley 9 de 1979: Código sanitario Nacional. Incluye normas generales sobre la

producción, formulación, almacenamiento, distribución, movilización y aplicación

aérea de los plaguicidas.

• Decreto 1843 de 1991. Reglamenta la Ley 9 de 1979 sobre uso y manejo de

plaguicidas con el objeto de evitar que afecten la salud de la comunidad, la

sanidad animal y vegetal o causen deterioro al medio ambiente

• Ley 430 de 1998. Regula la prohibición de introducir desechos peligrosos al país.

• Decisión 436 de 1998. Norma Andina para el Registro y Control de Plaguicidas

Químicos de Uso Agrícola

• Resolución 630 de 2002. Manual Técnico Andino para el Registro y Control de

Plaguicidas Químicos de Uso Agrícola.

• Resolución 00150 del 21 de enero de 2003 del ICA. Por la cual se adopta el

reglamento técnico de fertilizantes y acondicionadores de suelos para Colombia.

• Decreto 502 de 2003. Por el cual se reglamenta la decisión andina 436 de 1998

para el registro y control de plaguicidas químicos de uso agrícola.

• Resolución 770 de 2003. Por la cual se dictan disposiciones para el registro y

control de plaguicidas

• Resolución 3759 de 2003. Por la cual se dictan disposiciones sobre el Registro y

Control de los Plaguicidas Químicos de uso Agrícola



• Resolución 2906 de 2007. Por la cual se establecen los Límites Máximos de

Residuos de Plaguicidas – LMR en alimentos para consumo humano y en piensos

o forrajes.

Dentro de la legislación mencionada, es de especial importancia la resolución que

reglamenta los Límites máximos de residuos de plaguicidas en alimentos de consumo

humano. En su artículo 3 menciona que “los alimentos deberán cumplir con los límites

Máximos de Residuos de Plaguicidas –LMR- del Codex Alimentarius CAC/MRL 3,

actualizada al 2007”; cabe anotar que muchos de los productos agrícolas colombianos de

exportación corresponden a frutas exóticas, para las cuales no se tienen Límites

máximos de residuos; en este caso, la legislación de la unión europea, reglamenta un

LMR de 0.01 mg/kg por defecto. Sin embargo, la legislación estadounidense en sus

criterios de importación indica que si un producto presenta residualidad de un

contaminante para el cual no se tienen establecidos límites máximos de residuos

específicos en esa matriz, el producto debe ser rechazado, lo cual se convierte en una

barrera no arancelaria para la exportación colombiana.

1.2.1 Límites máximos de residuos

En general no pueden utilizarse productos fitosanitarios a menos que se haya establecido

científicamente que no producen efectos perjudiciales en los consumidores, agricultores

o terceros y que son suficientemente eficaces. Los alimentos deben de estar libres de

residuos de plaguicidas o las concentraciones halladas deben ser lo más bajas posibles,

pero se deben cumplir con los límites máximos de residuos. El límite máximo de residuos

LMR es la concentración máxima de residuos de un plaguicida (expresada en mg/kg),

legalmente aceptada en alimentos o piensos.

Los LMR se calculan con base en datos de residuos de plaguicidas en productos que han

sido sembrados y cosechados bajo los lineamientos de las buenas prácticas agrícolas

(BPA) y datos toxicológicos del plaguicida y tienen por objeto garantizar que los

alimentos sean seguros para el consumidor. Para asegurarse de que los LMR sean lo

más bajos posibles, quienes soliciten su establecimiento deben presentar información

Capítulo 1 31

científica bajo lineamientos de BPL sobre las cantidades mínimas de plaguicida

necesarias para proteger una cosecha y el nivel de residuos que quede en el producto

después de dicho tratamiento.

En la comunidad europea, Reglamento (CE) nº 396/2005 del Parlamento Europeo y del

Consejo, de 23 de febrero de 2005, relativo a los límites máximos de residuos de

plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal, compila en un solo texto y

armoniza los límites aplicables a los diferentes productos de alimentación humana o

animal, y fija un límite máximo aplicable por defecto para las sustancias no contempladas

en dicho reglamento. Mediante programas plurianuales comunitarios y nacionales

actualizados cada año, los Estados miembros realizan controles de los residuos de

plaguicidas para verificar el cumplimiento de los LMR. Dichos controles consisten, en

particular, en la toma de muestras, en la realización de análisis y en la identificación de

los plaguicidas presentes, así como sus niveles de residuos respectivos. Algunos países

de la comunidad europea desarrollan sus propios programas de evaluación para

establecer LMR propios del país, es el caso de Alemania y Países bajos.

Para nuestro país es de especial importancia la existencia de laboratorios de

investigación y prestación de servicios acreditados, en donde se lleve a cabo el

desarrollo de metodologías analíticas que permitan evaluar los residuos de plaguicidas y

sus compuestos de degradación a concentraciones, por lo menos, iguales a los LMR

establecidos en los países hacia los cuales se realizan las exportaciones de productos

agrícolas colombianos, con el fin de garantizar la inocuidad de los alimentos exportados,

dado que las legislaciones son, en muchos casos más estrictas que las nacionales.

1.3 Implicaciones toxicológicas y ambientales

1.3.1 Ditiocarbamatos y sus productos de degradación

Como familia química, los EBDCs son considerados como fungicidas con una amplia

gama de usos incluyendo el control de plagas tempranas y tardías para tratar

enfermedades en cultivos de vegetales, frutas y cereales.



Los ditiocarbamatos fueron patentados en los años 30, pero fueron los derivados del

acido dimetilditiocarbamico y etilenbisditiocarbamico los que se popularizaron en mayor

medida en los años 40. Los ditiocarbamatos N-monosustituidos incluyendo sales del

acido N,N-etilenbisditiocarbámico con manganeso (maneb), zinc (zineb) y mezcla

manganeso/zinc (Mancozeb) y propilenbisditiocarbamatos de zinc (Propineb) son de

amplia aplicación. En la Tabla 2 se observan las estructuras correspondientes a algunos

ditiocarbamatos. Las sales sódicas son fácilmente solubles en agua y no son adecuadas

para utilizar como fungicidas protectores superficiales debido al riesgo de fitotoxicidad y a

su poca fijación a la superficie de las plantas. Los ditiocarbamatos convertidos a

derivados de sales metálicas o derivados disulfuro son menos solubles y son usados

como protectores superficiales.Bajo condiciones acidas, los ditiocarbamatos se

descomponen en disulfuro de carbono y la amina correspondiente, lo cual significa que

los ácidos ditiocarbámicos son inestables y su aislamiento como ácidos libres es

imposible.

El Mancozeb, fungicida de mayor uso en Colombia, en cuanto al destino ambiental es

considerado como de baja persistencia, con un tiempo de vida media en suelo de 6 a 15

días, degradándose principalmente por fotólisis e hidrólisis. En el suelo se retiene

ligándose fuertemente a los coloides y el humus; es considerado de baja movilidad

debido a su elevado valor de Koc ( 363 - 2334 mL/g, [8] )

En agua es poco soluble, degradándose por hidrólisis; puede contaminar aguas

superficiales por aspersiones aéreas o terrestres propias del uso del producto, a través

del agua de irrigación o por movilización sobre agregados de suelo transportados por

erosión. Dado su alto coeficiente de adsorción tiene poca posibilidad de lixiviarse y

contaminar aguas subterráneas. Debido a su baja presión de vapor (<0,0075 mmHg) no

presenta efecto de contaminación del aire. Sin embargo, su principal metabolito de

degradación, la ETU, es un compuesto que aunque presenta un tiempo de vida media en

suelos no estériles menor a dos días, es soluble y estable en agua y presenta un bajo

coeficiente de adsorción (Kd 0,51-1,13 [8]), encontrándose en estudios realizados en

cinco tipos de suelos a 8 cm de la superficie al cabo de 21 días [9].

Capítulo 1 33

Tabla 2. Estructuras de ditiocarbamatos

Según dictámenes técnicos ambientales para producción e importación de Mancozeb

existe un límite para el contenido de ETU como impureza en el ingrediente activo,

máximo 2g/kg, pero no se concluye sobre el impacto ambiental y toxicológico de la ETU

como producto de degradación del Mancozeb en la emisión del dictamen técnico y

ambiental para los productos [10].

1.3.2 ETU y PTU

Recientemente se ha prestado mucha atención a la presencia de residuos de ETU en

muestras de alimentos tratados con EBDCs. La ETU puede encontrarse presente como

contaminante en el plaguicida, resultante de su proceso de fabricación, o puede provenir

Compuesto Estructura

Mancozeb

Maneb

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Propineb

Thiram



de la degradación del EBDC. De la misma manera, residuos de PTU pueden ser

encontrados en productos tratados con Propineb. Las cantidades presentes pueden

variar de una muestra a otra, ya que estudios han mostrado que la producción de ETU a

partir del bisditiocarbamato está influenciada por las condiciones de almacenamiento, en

especial, por variables como la temperatura, humedad y presencia de luz.

La cantidad de ETU formada por degradación de EBDCs depende de la estabilidad del

compuesto padre, del sustrato y de las condiciones de reacción. Bajo condiciones

neutras y alcalinas, incrementos en la temperatura promueven la formación de ETU.

Los estudios experimentales sobre la transformación de los ditiocarbamatos en los

cultivos y en el suelo, indican que éstos se metabolizan a ETU, o permanecen

inalterados, [11] y que los efectos de la degradación son favorecidos por las altas

temperaturas y la acción de los rayos solares, que aumentan la velocidad de

metabolización, sobre todo en el trópico.

La ETU es una molécula estable químicamente. Ensayos con ratas tratadas durante 90

días a altos niveles de ETU muestran que la acumulación de ésta produce trastornos

tiroideos e induce defectos congénitos [12]. Experimentos toxicológicos han mostrado

que causa varios efectos patológicos, entre los que se encuentran efectos mutagénicos y

teratogénicos [13] . Los estudios toxicológicos en trabajadores expuestos a EBDCs y a

ETU no han sido suficientes para demostrar la asociación entre la exposición a ETU y las

anormalidades de tiroides, evidenciadas en ensayos con animales de experimentación.

Se ha demostrado también que cuando los productos agrícolas que contienen residuos

de EBDCs son sometidos a calentamiento, ocurre un aumento en la velocidad de

degradación a ETU; los niveles de ETU en los productos elaborados no guardan relación

alguna con la concentración del compuesto en los productos sin elaborar, sino que

dependen de las concentraciones específicas de EBDC en ciertas fases determinantes

del proceso de elaboración en las que tenga lugar el calentamiento, así como la duración

de este y la temperatura alcanzada [3, 14].

En su revisión, Houeto, et.al. [6], hace una recopilación de estudios en los que se han

encontrado pequeños residuos de ETU en alimentos comprados en las tiendas locales,

en su presentación final al consumidor, entre los cuales se encuentran tomates, jugo,

Capítulo 1 35

sopa y salsa de tomates, papas, pepinos, calabazas y melones. Incluso en productos

como la cerveza y el tabaco, en cigarrillos, se han detectado residuos de este compuesto

en cantidades apreciables.

En el codex alimentarius no existe LMR en la actualidad para ETU, sin embargo se

encontraba establecido un límite de 0,05 mg/kg, el cual fu revocado en 1997 con el

argumento que los niveles encontrados en los alimentos no guardan relación con los

niveles esperados por aplicación del compuesto padre. Así mismo, en la Comunidad

Europea no se encuentra reportado LMR para ETU o PTU, sin embargo, en los

programas anuales de monitoreo es evaluada su presencia con el fin de determinar si se

requiere el establecimiento de límites, dada su elevada toxicidad. En contraste, países

que tienen su propio sistema de evaluación de LMRs tienen establecido un valor límite

para el contenido de estos metabolitos en los alimentos. (Alemania 0.05 mg/kg; Países

Bajos 0.02 mg/kg; Sudáfrica 0.01 mg/kg ).

1.4 Metodologías analíticas para la determinación de ETU y PTU a nivel de trazas

El método oficial de la FDA para la determinación de EBDCs se basa en la obtención de

disulfuro de carbono como producto de la degradación acida y su posterior análisis por

cromatografía de gases. La limitante de esta técnica es que no puede diferenciar entre

los residuos provenientes de los diferentes ditiocarbamatos. Existen metodologías

actuales por medio de las cuales se pueden separar y medir los residuos de

ditiocarbamatos individuales, pero los LMR aun no han sido establecidos en función de

las cantidades particulares.

Las metodologías para la determinación de ETU y PTU han sido desarrolladas más

activamente en la actualidad, debido a que la presencia de éstos compuestos como

residuo en los alimentos es de gran preocupación por su toxicidad y efectos sobre la

salud humana. La metodología de la FDA no permite evaluar residuos de ETU o PTU

dado que dichos compuestos no evolucionan a CS2 en medio acido, sin embargo gran

variedad de metodologías han sido desarrolladas.



1.4.1 Técnicas basadas en separación por cromatografía de

gases

La IUPAC presentó una comunicación en 1977 [3] en donde se hace una revisión de las

técnicas de análisis reportadas y utilizadas hasta esa fecha, entre las cuales se nombran

la cromatografía en capa fina, la polarografía y técnicas con isotopos radiomarcados. Sin

embargo, fue la cromatografía de gases la técnica que se utilizo más ampliamente en un

principio para el análisis de residuos de ETU, utilizando una derivatización pre columna

para convertir la ETU en un derivado volátil y térmicamente estable, características

necesarias para el análisis por cromatografía de gases. Acoples a diferentes detectores

como el de captura electrónica, detector de ionización de llama o termoiónico son

utilizados en diferentes estudios, obteniéndose los límites de detección más bajos con el

detector de captura electrónica.

En una publicación más reciente [15] se realiza la determinación de ETU en productos

alimenticios utilizando dos pasos de derivatización previa. Las muestras se separan por

cromatografía de gases y la detección de hace en paralelo por ECD y NPD. Los

porcentajes de recuperación son entre el 82 y el 92% en tomates, peras, manzanas y

alimento para bebes, y los limites de detección son cercanos a 0.001 mg/kg. En la Figura

1 se observan los cromatogramas obtenidos para un blanco fortificado de extracto de

manzana; se puede ver que la separación cromatográfica del derivado de la ETU es

adecuada.

Utilizando esta metodología, se obtienen bajos límites de detección y buena separación,

sin embargo, el proceso es bastante engorroso y costoso, ya que para los pasos de

derivatización se requiere cloruro de bencilo como primer reactivo derivatizante y además

la adición de 50 mL de metanol y 30 minutos de calentamiento con reflujo.

Posteriormente, se realizan dos extracciones con 10 mL de DICLOROMETANO cada

una, los cuales se descartan. Seguidamente se agregan 9 mL de solución de KOH y 10

mL más de DICLOROMETANO, para posteriormente llevar el extracto a sequedad y

someterlo a la segunda derivatización agregando 0,5 mL de anhídrido trifluoroacético al

10% en tolueno. Se deja en reposo 15 minutos a temperatura ambiente, se evapora a

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1.4.2 Técnicas basadas en cromatografía líquida

Dada la polaridad y la solubilidad en agua de la ETU, es posible pensar en su

determinación utilizando cromatografía liquida con el fin de realizar el análisis del

compuesto sin realizar pasos de derivatización precolumna, dado que esta técnica

permite el análisis de compuestos polares de poca volatilidad. Los primeros estudios que

se realizaron empleando cromatografía liquida tenían acoples al sistema cromatográfico

con un detector UV; posteriormente se encuentran reportes en los cuales se hace la

determinación en un detector de arreglo de diodos, pero recientemente se han publicado

un gran número de estudios en los cuales se utiliza el acople con el detector selectivo de

masas, el cual proporciona la valiosa herramienta de la identificación del analito, así

como mejoras en la separación dada su selectividad. El uso de este detector implica la

optimización de condiciones de ionización para minimizar el efecto de la matriz.

El desafío de la implementación de esta técnica involucra el procedimiento de extracción

y limpieza de la muestra. Variedad de tácticas analíticas han sido reportadas, y en la gran

mayoría la tendencia es llevar el consumo de solventes, la cantidad de muestra, el

tiempo y complejidad del procedimiento analítico al mínimo, en conjunto con la obtención

de porcentajes de recuperación cercanos al 100% y limites de detección cada vez

menores.

Para ello se han implementado metodologías como la extracción en fase sólida (EFS) y

la dispersión de matriz en fase sólida (DMFS), que son procesos con los cuales el

consumo de solventes es, por mucho, 10 veces menor que con las metodologías

tradicionales de extracción, como son la partición liquido-liquido, utilizando tan solo 10 o

15 mL de solventes y pasando de cantidades como 5 g de muestra, a tan solo 0,5 g

además de disminuir el tiempo de análisis en un 80%.

La EFS es una potente y simple técnica de extracción y limpieza de muestras que es, al

mismo tiempo, rápida y económica. Una columna de EFS consiste en un lecho

adsorbente de partículas gruesas mantenido entre dos discos porosos en un tubo

Capítulo 1 39

desechable. La EFS permite la pre-concentración de la muestra con un riesgo mínimo de

pérdida o contaminación de la misma. El componente de interés resulta retenido en una

fase sólida mientras que los contaminantes de la matriz se eluyen.

Inicialmente se realiza un paso de activación, en el que se utiliza un solvente orgánico

para humidificar la fase. Seguidamente, la fase estacionaria se acondiciona con el mismo

solvente de la matriz; esto permite adecuar las cadenas de fase estacionaria lejos de la

superficie de la sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria.

Cualquier solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, permitiendo que lo analitos

sean retenidos en la parte superior de la columna. Para maximizar las interacciones entre

loa analitos y la fase estacionaria, la mezcla (analitos + matriz) debe cargarse a

aproximadamente 3mL/min, así los componentes de interés han de retenerse en el

adsorbente mientras que la matriz y los contaminantes se eluyen y descartan. En estas

tres etapas debe mantenerse húmedo el adsorbente, puesto que el secado del mismo

acarrearía una pérdida de muestra.

Utilizando un solvente, o una serie de solventes de polaridad adecuada, pueden

eliminarse del adsorbente las interferencias hasta que solo los analitos de interés queden

atrapados, para por último realizar la elución de los analitos con un solvente adecuado

generalmente a 1mL/min. El adsorbente y la interacción analito-adsorbente determinan el

solvente final de elución. En la Figura 2 se observa el esquema para el procedimiento de

EFS.

Figura 2. Proceso de extracción en fase solida. [17]

En el análisis de residuos de plaguicidas la extracción en fase sólida ha tenido un amplio

uso, como lo reporta Brouwer et. al.[18], en una revisión sobre métodos de determinación

de plaguicidas y otros contaminantes en sistemas acuáticos. Las técnicas



cromatográficas acopladas on-line a la EFS proporcionan un aumento en la velocidad del

análisis, en la selectividad y sensibilidad, y una considerable disminución del uso de

solventes y de los límites de detección, así como en la cantidad de muestra usada.

Geerdink et.al. [19], realiza una reseña sobre la determinación de plaguicidas en agua,

donde se puede ver como se usa la EFS seguida de cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas para la determinación multiresiduo de 86 contaminantes en

agua de rio. Así mismo, la EFS con posterior análisis por cromatografía liquida acoplada

a espectrometría de masas se uso para realizar el monitoreo de la presencia de

plaguicidas en aguas superficiales y subterráneas.

En 2004, Blasco & Picó [20], realizaron un estudio interesante en el cual por medio de

cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas, determinaron

simultáneamente tres fungicidas ditiocarbamatos y sus productos de degradación, ETU y

PTU, comparando las técnicas de extracción EFS y DMFS, utilizando diferentes

sorbentes tales como sílica, alúmina, carbón, extrelut, C8 y C18 y realizando la elución

de las interferencias con agua y la de los analitos con acetonitrilo, encontrando

porcentajes de recuperación aceptables para los compuestos padre (69-89%), pero

insuficientes para los productos de degradación ETU y PTU. En la Figura 3 se muestran

los cromatogramas obtenidos en este estudio y se puede ver que para la ETU y PTU es

en modo de ionización APCI donde se obtienen los mejores resultados.

Aunque los porcentajes de recuperación para ETU y PTU obtenidos en este estudio son

muy bajos (<20%) se puede considerar la posibilidad de aplicar esta metodología para

los compuestos de interés, ya que se argumenta que las recuperaciones fueron bastante

pobres, o nulas en algunos casos, debido a que la ETU y PTU no fueron retenidas en

ninguna fase estacionaria, debido a su alta solubilidad en agua y alta polaridad y a que

se trabajó con fases desactivadas con el fin de retener los demás analitos que se tenían

como objetivo del estudio. Trabajar con fases estacionarias o dispersantes más polares,

como sílice o carbón activados en determinados porcentajes podría funcionar para la

retención de los analitos, así como la elución de las interferencias con un solvente de

menor polaridad y la de los analitos con el solvente más polar.

Capítulo 1 41

Paralelamente, Garcinuño et.al [21], realizó la determinación de ETU y EBIS

(Etilenbisisotiocianato sulfuro) en almendras, utilizando DMFS, donde utiliza arena como

fase dispersante y tan solo 0,4 g de muestra, con una subsecuente limpieza con EFS. En

primer lugar, a la muestra homogenizada por maceración con fase dispersante y

empacada en una columna, se le realiza un procedimiento de extracción de las grasas

eluyendo con NaOH 0.2 N; el eluato cae sobre una segunda columna que contiene

alúmina, donde se realiza la limpieza de la muestra por EFS. A esta segunda columna se

le hace una elución inicial de las interferencias con acetonitrilo y una posterior elución de

los analitos con metanol, obteniendo así porcentajes de recuperación entre 76 y 85% y

limites de detección entre 0,05 y 0,07 mg/kg realizando la separación en HPLC-DAD.

Figura 3. Cromatogramas CL-EM en modo SIM para una solución estándar utilizando (A)APCI y (B) ESI. (1) ETU, 0.5 µgml−1; (2) PTU, 0.5 µgml−1; (3) dazomet, 1 µgml−1; (4) thiram, 1µgml-1; and (5) disulfiram, 1 µgml−1. [20] .

Esta metodología presenta la ventaja de minimizar el uso de solventes y economizar

tiempo de análisis considerablemente, además de la obtención de bajos limites de

detección utilizando detector de arreglo de diodos. En este estudio se muestra que la

DMFS es una técnica aplicable a todo tipo de analitos y que requiere la optimización del

adsorbente y solventes de elución para proporcionar los resultados adecuados, siendo

una técnica lo suficientemente sensible para la determinación de ETU y PTU en

diferentes matrices. En la Figura 4 se observa el proceso general para la DMFS.



Figura 4. Proceso general para la extracción mediante DMFS.

Otra metodología analítica con marcadas diferencias se encuentra en un estudio en el

que se utiliza extracción liquido – liquido miniaturizada para extraer maneb y sus

productos de degradación en matriz de tomate, realizando a 1 g de muestra tres

extracciones consecutivas con 5 mL de una mezcla de solventes Acetonitrilo:

diclorometano:Cloroformo 1:1:1, cada una durante dos minutos de agitación mecánica.

Los extractos combinados se llevan a sequedad bajo corriente de argón para

posteriormente ser redisueltos en 500 µL de mezcla Acetonitrilo:Agua 1:1 e inyectados

en el sistema cromatográfico HPLC-DAD. La lectura de maneb se realiza a 280 nm,

mientras que sus Metabolitos se determinan a 232 nm. Los cromatogramas obtenidos se

muestran en laFigura 5. [22]

Figura 5. Determinación simultanea de Maneb y sus Metabolitos de degradación (1) ETU; (2) EBIS; (3) EU; (4) Maneb. [22]

Capítulo 1 43

Este procedimiento tiene como ventaja la minimización del uso de disolventes respecto a

las técnicas convencionales, ya que se requieren 15 mL de solvente para la preparación

de una muestra, además de presentar buena resolución de los picos cromatográficos y

limites de detección bajos con HPLC-DAD (0.04 mg/kg para ETU).

La EFS no solamente se puede usar como metodología de extracción, sino que puede

ser complemento del procedimiento analítico, aportando sus excepcionales

características en la etapa de limpieza del extracto. En numerosos estudios, se realiza la

extracción de los compuestos mediante DMFS para realizar una posterior limpieza con

un adsorbente en EFS.

Un estudio reciente muestra el uso de cromatografía liquida de interacción hidrofílica

acoplada a detección selectiva de masas (HILIC-MS) utilizando una extracción con

acetonitrilo y una limpieza en fase solida dispersiva con la metodología QuEChERS la

cual fue utilizada para la determinación de PTU en tomate. [23]

La cromatografía de interacción hidrofílica se ha practicado durante mucho tiempo,

aunque el término HILIC se ha empezado a utilizar de forma común recientemente. Los

analitos son compuestos muy polares como péptidos, hidratos de carbono o metabolitos

polares, grupo dentro del cual se encuentran los analitos de interés. La HILIC se puede

considerar una extensión de la cromatografía en fase normal en el ámbito de las fases

móviles acuosas. Las fases móviles son mezclas de agua o soluciones buffer (< 40%)

con eluyentes orgánicos. Las fases estacionarias son adsorbentes polares muy

hidrofílicos como la sílice, fases enlazadas polares, rellenos poliméricos polares e

intercambiadores iónicos. El factor común de todas estas fases estacionarias es que

pueden adsorber fácilmente agua, de ahí su clasificación como «hidrofílicas». En su

estudio Tölgyesi et. al. [23], realiza la separación de ETU en una columna ZORBAX

Eclipse Plus Phenyl-Hexyl RRHT (Figura 6) la cual contiene una fase químicamente

enlazada que forma una monocapa densa de fase estacionaria, sobre un soporte de

sílica porosa, diseñado para eliminar o reducir la fuerte adsorción de los compuestos

básicos o altamente polares. Como fase móvil se utilizó un gradiente de formiato de

amonio 0,1% y una mezcla de metanol:acetonitrilo 1:1. El sistema cromatográfico se

encontraba acoplado a detector de UV a 235 nm y a detector selectivo ESI-TOF MS.

44

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Capítulo 1 45

En cuanto a la determinación de ETU en suelos, se han realizado estudios en donde la

metodología analítica aplicada consiste en la extracción de 10 g de suelo con metanol

para posteriormente realizar el proceso de derivatización y análisis por cromatografía de

gases con detección NPD y ECD [25] con el fin de realizar el monitoreo del metabolito en

suelos y aguas en una región de producción bananera en México. Los límites de

detección obtenidos son bajos (0.01 mg/kg) y los porcentajes de recuperación son

mayores al 90%, sin embargo el consumo de tiempo, solventes y reactivos se evidencian

como desventajas de esta metodología analítica.

En este estudio se encontró ETU en el suelo como residuo no detectable o en

concentraciones a nivel de trazas, dada su capacidad de movilizarse por su alta

solubilidad en agua y poca retención. Sin embargo, altas concentraciones de ETU fueron

encontradas en aguas superficiales (Máximo 22,5 mg/kg), las cuales se encuentran por

encima del límite de seguridad para organismos acuáticos (1mg/kg), evidenciando un

nivel de contaminación preocupante para la vida acuática y la salud humana.

En la universidad de Antioquia se desarrolló un metodología para la determinación de

ETU en suelos cultivados con tomate chonto [26], que parte de un extracto acuoso del

suelo, dada la alta solubilidad del analito en agua, empleando 1,5 g de suelo al cual se le

agregaron 20 mL de agua a pH 10,5, realizando una posterior agitación en vortex durante

2 minutos, seguida de un calentamiento al baño maría a 70°C por 8 minutos.

Posteriormente se somete la muestra a ultrasonido durante 13 minutos y por último se

realiza una centrifugación para separar el sobrenadante y, sobre el residuo sólido,

realizar una segunda extracción; El extracto acuoso se inyecta en cromatografía liquida

utilizando una columna C18 de 250 x 4,6 mm y 5µ de diámetro interno. La detección se

realiza con UV a 232 nm y se usa una fase móvil compuesta por Agua:Acetonitrilo 98:2.

En la Figura 8 se observa el cromatograma obtenido bajo las condiciones mencionadas.

Los porcentajes de recuperación son elevados, cercanos al 90% lo cual muestra que es

una metodología adecuada para la determinación de ETU como residuo de degradación

de EBDCs en suelos. El procedimiento tiene la ventaja de no utilizar solventes orgánicos

para la extracción, lo cual supone una metodología ambiental y económicamente

amigable, además de utilizar tan solo un 2% de acetonitrilo en la separación

46

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Capítulo 1 47

separación y detección analítica, ya que muchas metodologías incluyen pasos de

transformación para poder analizarlas en un sistema de cromatografía de gases; por otra

parte, el análisis por cromatografía liquida de este tipo de moléculas es complicado

debido a que su alta polaridad evita que se retengan en un sistema de cromatografía en

fase reversa o hace que se queden retenidas por largos tiempos en un sistema

cromatográfico en fase normal. La extracción en matrices complejas como son los

suelos, frutas y hortalizas, implica el uso de solventes polares, los cuales extraen una

gran cantidad de interferentes, siendo necesario involucrar estratégicamente etapas de

limpieza que retire dichas interferencias sin dar lugar a pérdidas de los analitos de

interés.

En nuestro país no se han desarrollado metodologías para determinar ETU y PTU en

frutas y hortalizas ni existe legislación con respecto a su residualidad, así como no se

tienen estudios sobre su impacto en la salud de los consumidores y en el medio

ambiente. Es por esto que es necesario que el país genere, valide y aplique

metodologías rápidas y confiables que sirvan de base para posteriores estudios y que

permitan garantizar la inocuidad de los alimentos y así, el bienestar de los consumidores,

tanto Colombianos como del mundo, dado al incremento gradual que se ha observado en

la exportación de frutas tropicales y tubérculos hacia otros continentes.

49

2. Capítulo 2. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en frutas y hortalizas

Las metodologías multiresiduo presentan grandes ventajas, sin embargo existen

sustancias que por su elevada polaridad son excluidas de éste tipo de técnicas, pues no

son extraídas eficientemente o a que las interferencias coextraidas no pueden ser

retiradas en las etapas de limpieza realizadas. La etilentiourea y la propilentiourea se

encuentran dentro de este grupo de analitos polares y la importancia de su determinación

radica en que son productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos ampliamente

aplicados en Colombia y presentan elevada toxicidad. A nivel mundial, estas sustancias

son monitoreadas constantemente por las autoridades sanitarias internacionales y dado

que las frutas tropicales se han convertido en un producto de exportación de importancia

creciente se requiere contar con metodologías que garanticen que los productos de

consumo, tanto interno como de exportación se encuentren libres de residuos de estas

sustancias de toxicidad relevante.

Se han realizado variaciones metodológicas desde inicios de los años 70 como estrategia

para la determinación a nivel de trazas de éstos analitos, las cuales involucraron en un

principio, la extracción con solventes polares para posteriormente realizar una etapa de

derivatización, obteniendo así productos de reacción de menor polaridad y con volatilidad

adecuada para ser analizados por cromatografía de gases. Sin embargo, los bajos

rendimientos de reacción en la derivatización y el elevado consumo de tiempo,

materiales, reactivos y solventes obligaron a pensar en una nueva estrategia

metodológica para su análisis; es así como se involucró la cromatografía líquida como

método de separación, pues esta técnica es adecuada para el análisis de moléculas

pequeñas de elevada polaridad y baja volatilidad. El uso del detector de arreglo de

diodos implica como desafío la implementación de etapas de limpieza del extracto que



permitan retirar la mayor cantidad de sustancias coextraídas para evitar interferencias en

la detección. Con base en la revisión de literatura se seleccionaron cuatro metodologías

aplicables al análisis de ETU y PTU en frutas y hortalizas con el objetivo de determinar

una metodología para el análisis de éstos compuestos con la instrumentación disponible

en el laboratorio. Los resultados se muestran en el presente capitulo y con base en ello

se seleccionó, optimizó y validó la metodología que proporcionó los mejores resultados.

2.1 Estándares de referencia, matrices de ensayo, equipos, materiales, solventes y reactivos

2.1.1 Estándares de referencia

Los estándares de etilentiourea y propilentiourea empleados en este trabajo fueron

suministrados por Dr Ehrenstorfer con pureza mayor al 98%. Las soluciones madre

fueron preparadas en acetonitrilo y fueron almacenadas en frascos ambar a -20°C.

Diluciones de 50 µg/mL de ETU y 100 µg/mL de PTU fueron preparadas en acetonitrilo y

a partir de ellas se prepararon a diario los estándares de calibración para la inyección en

HPLC utilizando agua como disolvente.

2.1.2 Matrices de ensayo

Se utilizaron muestras de Uchuva (L, Physalis peruviana), granadilla (Passiflora ligularis),

pitaya (Hylocereus triangularis), banano bocadillo (Musa acuminata) y tomate (Solanum

lycopersicum) exentas de plaguicidas, obtenidas en supermercados de cadena y

certificadas como orgánicas. Se lavaron con abundante agua y se retiró el material ajeno

según las indicaciones del Codex Alimentarius [27]

Capítulo 2 51

2.1.3 Materiales y equipos Para la homogenización de las matrices de ensayo se contó con un homogenizador

Stephan Blender 2010 y una licuadora Waring. El pesaje de las muestras se llevó a cabo

en una balanza de platillo externo Mettler Toledo y los estándares de referencia se

pesaron en una balanza analítica Scaltec SAC22. Durante el proceso de extracción se

utilizó un evaporador rotatorio Heidolph, un ultrasonido marca Elma con una frecuencia

de 35 KHz y una centrifuga refrigerada marca Thermo. Se utilizó un sistema de filtración

de solventes marca Millipore para la filtración de los solventes a usar en HPLC. Para el

almacenamiento de las matrices de ensayo se utilizó un congelador Frigidaire de 200 L.

Se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia marca Agilent Technlogies con

bomba cuaternaria G1310A, detector de arreglo de diodos G1365B, compartimento

termostado para columna G1316A y sistema de desgasificación G1379A de la serie 1100

acoplado a un sistema de inyección automática G1329A de la serie 1200.

2.1.4 Reactivos y solventes

Todos los solventes utilizados en este estudio fueron marca J.T. Baker grado residuos y

grado HPLC. Previo a su uso en HPLC fueron filtrados a través de una membrana de

0.45 µm. Se utilizó Cloruro de sodio, Sulfato de sodio, Sulfato de Magnesio, Citrato

tribásico de sodio, Citrato dibásico de sodio sesquihdratado, hidróxido de sodio y cloruro

de amonio marca J.T. Baker. Para la limpieza bajo el método QuEChERS se utilizó PSA

marca Varian. Los ensayos de dispersión de matiz en fase sólida se utilizaron

adsorbentes C18 y Carbón grafitizado marca Agilent y carbón activado proporcionado por

el grupo de investigación de Carbones del Departamento de Química. La limpieza en el

método de extracción con solventes polares se realizó utilizando Extrelut bulk marca

Merck.



2.2 Sistema instrumental

Se realizó la inyección de soluciones de estándares individuales y en mezcla en

diferentes disolventes: acetonitrilo, metanol, agua y mezclas agua:metanol. Se realizaron

inyecciones de 20, 50 y 100 µL. La detección se realizó a 232 nm, temperatura de

columna 25°C y composición de la fase móvil Agua:Metanol 98:2, según referencias de

literatura. Se realizaron variaciones de flujo entre 1 y 1.3 mL/min para encontrar el flujo

óptimo. La separación se realizó en una columna analítica LiChrosphere RP-18, 250 x 4

mm., 5µm., con guardacolumna C18.

2.3 Preparación y homogenización de la muestra

1 kg de cada una de las matrices de ensayo fue introducido en el homogenizador

Stephan blender y homogenizado durante 3 minutos. Luego porciones de 400 g fueron

homogenizadas en la licuadora Waring durante 2 minutos. La totalidad de la muestra fue

mezclada para luego ser almacenada en bolsas plásticas con cierre en el congelador a -

20°C.

2.4 Selección de la metodología – Parte experimental

Con base en la revisión de literatura, fueron seleccionadas cuatro metodologías como

punto de partida con el fin de evaluar su desempeño en cuanto a la exactitud en la

recuperación de los analitos y en la capacidad de obtener limites de detección y

cuantificación cercanos a los 0.01 mg/kg; así mismo para la selección del método, se

consideró la posibilidad de ejecución como metodología de análisis de rutina en el

laboratorio.

Los ensayos para selección de la metodología se realizaron utilizando matriz blanco de

Uchuva homogenizada y congelada. Cada lote de ensayos estaba compuesto por tres

blancos de matriz y tres blancos fortificados con la mezcla de analitos de interés. En

todos los ensayos, la fortificación se llevó a cabo sobre la muestra homogenizada a

Capítulo 2 53

temperatura ambiente, se mezcló utilizando agitador vortex y se dejó en reposo por una

hora.

base en la revisión de literatura, fueron seleccionadas cuatro metodologías como punto

de partida con el fin de evaluar su desempeño en cuanto a la exactitud en la

recuperación de los analitos y en la capacidad de obtener limites de detección y

cuantificación cercanos a los 0.01 mg/kg; así mismo para la selección del método, se

consideró la posibilidad de ejecución como metodología de análisis de rutina en el

laboratorio.

Los ensayos para selección de la metodología se realizaron utilizando matriz blanco de

Uchuva homogenizada y congelada. Cada lote de ensayos estaba compuesto por tres

blancos de matriz y tres blancos fortificados con la mezcla de analitos de interés. En

todos los ensayos, la fortificación se llevó a cabo sobre la muestra homogenizada a

temperatura ambiente, se mezcló utilizando agitador vortex y se dejó en reposo por una

hora. 2.4.1.

2.4.1 Extracción con solventes de baja polaridad (M1)

1 g de matriz fue sometido a tres extracciones sucesivas con 3 mL de mezcla

ACN:CH2Cl2:CHCL3 (1:1:1). El extracto combinado fue concentrado en un evaporador

rotatorio hasta 0.5 mL, llevado a sequedad bajo una corriente de nitrógeno y finalmente

reconstituido con 0.5 mL de agua e inyectado en el sistema cromatográfico. En la Figura

9 se observa el esquema del procedimiento realizado. [22]

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adante fue

do en HPLC

11 se obser

10 g de m

2 mL de extr

Adición de 5de PSA y 150

de MgSO

nyección en

ción de me

e 5 minutos

cla de 50 m

dimiento pa

gitada en v

llevado a

C. En la

rva el esque

atriz

racto

50 mg 0 mg O4

HPLC

todologías

s. 2 mL de

mg de PSA y

ara metodo

vortex dura

sequedad

ema del pro

Extrm

Ce

Agita

Reco1

analíticas p

degra

el extracto

y 150 mg de

ología QuE

ante 2 minu

d y reconst

ocedimiento

racción con mL de ACN

entrifugació

ación en vor1 minuto

onstitución cmL de agua

para la dete

adación de f

fueron ad

e MgSO4.

EChERS = M

utos y lueg

tituido con

o realizado

10

n

rtex

con a

rminación d

fungicidas d

icionados e

M3.[23]

go centrifug

1 mL de

AdicióMgSO4,

1 g dtrisodiccitrat

Agitaci1 m

Cent

1 mL a

de producto

ditiocarbam

en un tubo

gada. 1 m

agua para

ón de 4 g de, 1g de NaCde Citrato co y 0,5 g deto disódico

ón vigorosaminuto

rifugación

a sequedad

os de

matos

o que

L del

a ser

l,

e

a

C

2

1

2

rp

lle

c

d

e

re

e

F

Capítulo 2

2.4.4 Extr(M4

0 g de mat

20 mL de un

pm durante

evaron a 1

olumna (5 m

onde perm

elución con

econstituido

esquema de

Figura 12. P

10

Conce

Adcolum

de sodi

Inyec

racción c4)

triz fueron e

na mezcla

e 5 minutos

1 ml con a

mm d.i.) for

aneció en

20 mL d

o en 1 ml de

el procedimi

Procedimie

g de matriz

entrar a 1 m

dicionar en mna con 0,5Sulfato de io y 0,5 g deExtrelut

cción en HPL

con solv

extraídos co

MeOH:Agu

s. 2 mL de

agua. La to

rmada por 0

equilibrio d

e DICLOR

e agua para

ento.

ento para e

mL

5 g

e

LC

ventes po

on agitación

a 3:1. Post

el sobrenad

otalidad de

0,5 g de ext

urante 20 m

ROMETAN

a ser inyect

xtracción c

Adición dde Meta

3

2 msobren

Repomin

Reconstcon 1 mL

olares –

n manual fu

teriormente

dante fuero

e la muestr

relut sobre

minutos, al

O. El extra

tado en HPL

con solven

de 20 mL nol:Agua:1

L de nadante

oso 20 utos

titución L de agua

Limpieza

uerte durant

e se centrifu

on concent

ra (1mL) se

0,5 g de su

cabo de lo

acto fue ll

LC. En la F

ntes polare

Ag

El

a con pa

te 2 minuto

ugó la mues

trados a 0,

e adicionó

ulfato de sod

os cuales s

evado a s

Figura 12 se

s = M4

gitación vig2 minuto

Centrifugac

lución con 2de DCM

Sequeda

57

artición

os utilizando

stra a 6000

5 mL y se

sobre una

dio anhidro

se realizó la

sequedad y

e observa e

gorosa os

ción

20 mL M

ad

7

o

0

e

a

,

a

y

l

58

2.5 S

2.5.1

Con ba

extracc

Como s

de rete

causad

no perm

Figura M1 Como s

Tabla 3

aceptac

Valida

Selecció

Extracci

ase en la pu

ión líquido-

se observa

nción de la

a por interf

miten que la

13. Croma

se muestra

3 los porce

ción sin em

ción de me

ón de la

ión con s

ublicación d

-líquido util

en la Figura

a PTU, pero

ferencias de

a señal se ó

atograma b

en la

entajes de r

bargo prese

todologías

a metod

solvente

de Garcinuñ

lizando me

a 13 , se ob

o en el caso

e la matriz q

óptima.

lanco de m

recuperació

entan alta d

analíticas p

degra

ología -

s de baja

ño et.al [22

ezcla de AC

btuvieron ex

o de la ETU

que aunque

matriz, está

ón promedio

dispersión.

para la dete

adación de f

- Result

a polarid

2] se llevó a

CN:CH2Cl2:

xtractos sin

U se tiene u

e se encuen

ándar y blan

o se encue

rminación d

fungicidas d

tados y

dad M1

a cabo el p

:CHCL3 en

interferenc

una deriva

ntran bien r

nco fortific

entran dent

de producto

ditiocarbam

discus

procedimien

partes igu

cias en el tie

de la línea

resueltas (R

cado extrac

tro del rang

os de

matos

sión

to de

uales.

empo

base

Rs<2)

cción

go de

Capítulo 2 59

Tabla 3. Porcentajes de recuperación y coeficientes de variación para M1

Ensayo % de recuperación

ETU PTU

R1 76,3 74,7

R2 53,7 68,7

R3 93,7 83,8

Promedio 74,6 75,8

CV 26,9 10,1

En su publicación, Garcinuño et.al [22], reporta resultados de ensayos de recuperación

utilizando los solventes individuales pero no menciona los porcentajes de recuperación

obtenidos con la mezcla de solventes, aunque indica que la proporción fue optimizada y

que es con la relación 1:1:1 que se obtienen los mejores resultados. La exactitud de la

metodología es adecuada, pues los porcentajes de recuperación promedio se encuentran

dentro de los rangos establecidos (70-120%); si bien el coeficiente de variación es alto,

un mayor número de ensayos a diferentes concentraciones de analito en la matriz y en

diferentes días podría mostrar la variabilidad real de la metodología.

Utilizando el método EPA para la determinación de límites críticos [29], se estimaron los

límites de detección y cuantificación y se relacionan a continuación en la

Tabla 4.

Tabla 4. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M1

Analito ETU PTU

LD (mg/kg) 0.03 0.06

LC (mg/kg) 0.10 0.20

Debido a la pequeña cantidad de muestra que se toma para el análisis (1g) y a los

interferentes presentes en la matriz, los límites de detección y cuantificación estimados

son algo elevados para el propósito de la metodología y tomar una cantidad de muestra

mayor aumentaría la carga de matriz en el inyectable, lo que tendría como consecuencia

el incremento en la intensidad de las interferencias.



2.5.2 Dispersión de matriz en fase sólida M2

Con base en los procedimientos utilizados en las publicaciones de Blasco et. al.,

Garcinuño et. al y Mojica et. al [20, 21, 28] , se seleccionaron los adsorbentes CA, CG y

C18. El objetivo del proceso de extracción utilizando dispersión de matriz en fase sólida

era retener los analitos en el sólido adsorbente al efectuar la maceración, para luego

eluirlos selectivamente con ACN evitando eluir las interferencias de la matriz. Contrario a

lo reportado por los autores mencionados, en este estudio utilizando CA y CG la

recuperación de los analitos es nula.

En la metodología M2 CA, con carbón activado, la retención total ocurre debido a que los

analitos, por su naturaleza polar y un pequeño tamaño se quedan retenidos por procesos

de fisiadsorcion en la superficie de elevada área superficial y altamente porosa (Figura

14), y de quimiadsorción en la superficie químicamente activa del carbón (Figura

15Figura 15).

Figura 14. Estructura porosa del carbón activado.

Experimentos preliminares de determinación de la química superficial del carbón utilizado

muestran que tiene una naturaleza ácida, por lo tanto los grupos superficiales

predominantes serán de tipo carboxilo o lactona (Figura 15). La presencia de estos

grupos oxigenados da lugar a centros primarios de adsorción de moléculas de agua que

a su vez adsorberán nuevas moléculas por formación de puentes de hidrógeno.

Capítulo 2 61

Figura 15. Grupos superficiales presentes en la superficie del carbón activado.

En el caso del método M2 CG, la retención de compuestos como la ETU y la PTU es total

dado que, aunque la superficie del carbón tiene carácter hidrofóbico, también tiene una

capacidad excepcional de retención de analitos polares.

A escala molecular, la superficie del grafito es plana y altamente cristalina. La retención

de sustancias polares está dada por la interacción de grupos polares o polarizables en

las moléculas de analito con la superficie del grafito. La fuerza de las interacciones

depende del área molecular en contacto con la superficie y de la naturaleza y tipo de los

grupos funcionales en los puntos de interacción. Moléculas de tipo planar tienen la

posibilidad de interactuar en mayor medida con la superficie, como es el caso de ETU y

PTU, y así tener un máximo de retención. Moléculas tridimensionales rígidas que tienen

pocos puntos de contacto con la superficie son menos retenidas en comparación con

moléculas planas de la misma masa molecular como se muestra en la Figura 16.

62

Figura de carb

Adicion

desloca

tienen p

de la su

molécu

Figura Carga p

Cuando

la serie

Valida

16 Efecto bón grafitiz

almente, la

alizados, qu

pares electr

uperficie de

las polares

17. Represpositiva y b

o se utiliza c

e eluotropica

ción de me

de la formazado

a superficie

ue proporci

rónicos no e

el grafito (Fig

pequeñas,

sentación b. Carga ne

carbón graf

a es depen

todologías

a del solut

del carbón

iona un me

enlazados,

gura 17) es

como la ET

esquemátiegativa, ap

fitizado com

ndiente del

analíticas p

degra

to en la fue

n grafitizado

ecanismo d

enlaces π o

s la clave pa

TU y la PTU

ica de la reproximándo

mo fase ads

analito; en

para la dete

adación de f

erza de rete

o presenta

de retenció

o anillos aro

ara entende

U quedan re

etención dose a la su

sorbente, la

general, s

rminación d

fungicidas d

ención sob

una nube

ón para las

omáticos. L

er el mecan

etenidas en

de un analiperficie de

a retención d

olventes co

de producto

ditiocarbam

bre la supe

de electron

s moléculas

a polarizab

nismo por e

su superfic

ito polar coel grafito.

de los anal

on capacida

os de

matos

rficie

nes π

s que

ilidad

l cual

cie.

on a.

itos y

ad de

C

ro

e

B

p

e

lo

e

B

in

e

m

p

c

F E

m

a

Capítulo 2

omper las

enlaces π pu

Blasco et al.

para los do

empleando p

os analitos

elevado deb

Blasco et,

ncrementa

estudio fue

mínima de in

para debilita

ual la recup

Figura 18. B

En contraste

mejores res

adsorbente,

interaccion

ueden tener

. [20], en su

os analitos

para la eluc

en buena

bido a la pre

al [20], ut

la especific

cambiar e

nterferencia

ar las interac

peración fue

Blanco de m

e, los ensa

sultados de

M2 C18, p

es de desl

r mayor fue

u estudio de

de interés

ción una me

proporción,

esencia de

ilizó HPLC

cidad y sel

l solvente

as, sin emb

cciones ent

e cero.

matriz, está

ayos con d

e recupera

ues la ETU

ocalización

rza para elu

etermino po

utilizando

ezcla diclor

, el límite d

interferenc

C con espe

lectividad e

de elución

argo, el ace

tre la super

ándar y rec

ispersión d

ación pued

U se recupe

n de carga,

uir analitos

orcentajes d

carbón gra

rometano:M

de cuantific

cias coeluida

ectrometría

en la detec

con el pro

etonitrilo res

rficie del car

cuperado m

de matriz e

den obtene

eró en un 76

con electr

polares.

de recupera

afitizado co

Metanol 80:2

cación repo

as. Adicion

de masas

cción. El ob

opósito de

sultó no ten

rbón y los a

metodologí

n fase sóli

erse utiliza

6.3 % y la P

rones no e

ación cerca

omo adsorb

20, y aunqu

rtado (0.25

almente en

s en tánde

bjetivo en e

extraer un

ner la fuerza

analitos obje

ía M2 C18.

da mostrar

ndo C18

PTU en un

63

enlazados o

anos al 50%

bente, pero

ue recuperó

5 mg/kg) es

n su estudio

em lo cua

el presente

na cantidad

a necesaria

etivo, por lo

ron que los

como fase

45,0 %, sin

3

o

%

o

ó

s

o

l

e

d

a

o

s

e

n



embargo, los cromatogramas que se observan en la Figura 18 muestran la presencia de

interferencias en tiempos de retención cercanos al de los analito, y se evidencia que que

el método cromatográfico no es capaz de resolverlas adecuadamente.

Usando C18 como fase estacionaria y acetonitilo como solvente de elución, se tiene un

sistema tipo fase reversa, en donde los analitos de elevada polaridad son poco retenidos

y el acetonitrilo, que tiene elevada fuerza de elución es capaz de vencer las pocas

interacciones de tipo hidrofóbico que se puedan dar entre las moléculas polares y la fase

estacionaria, recuperando en elevada proporción los compuestos de interés; Sin

embargo, moléculas estructuralmente similares sufren el mismo efecto, con lo que se

tiene gran cantidad de interferencias eluidas y dado que el sistema de separación en

HPLC es también de fase reversa, la separación cromatografica no da buenos

resultados.

Así mismo, la pequeña cantidad de muestra limita la capacidad del método para obtener

limites de detección y cuantificación adecuados, pues los estimados que se muestran en

la Tabla 5 son muy elevados para esta lograr el cumplimiento de los objetivos del

presente trabajo.

Tabla 5. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M2 C18

Analito ETU PTU

LD (mg/kg) 0.15 0.98

LC (mg/kg) 0.51 0.33

Además de la limitación en la sensibilidad de la técnica, el uso de pequeñas cantidades

de muestra en ensayos de rutina no es del todo apropiado debido a la representatividad

de la porción analítica.

C

2

E

[2

m

e

a

F

E

Q

s

q

p

p

g

d

a

Capítulo 2

2.5.3 Met

Esta técnica

23] y para l

masas en tá

extractos tie

analitos con

Figura 19. B

Esto ocurre

QuEChERS

ecundaria (

ue son dete

pues la PSA

pigmentos y

eneralment

etector de

analitos de lo

todología

a de extracc

a determin

ándem. Se

enen dema

el detector

Blanco de m

debido a q

, utiliza co

(PSA) (Figu

ectados en

A ha sido e

y otros com

te cromatog

arreglo de

os interfere

a QuECh

ción y limpi

ación de E

e realizó el

siadas inte

r de arreglo

matriz y es

ue la limpie

omo adsorb

ura 20), la c

HPLC DAD

empleada p

mpuestos e

grafía liquid

e diodos no

entes coextr

hERS M3

eza es utili

TU en papa

ensayo co

erferencias

de diodos.

stándar met

eza por extr

bente para

ual no es ca

D a tiempos

principalme

en metodolo

da o gaseos

o tiene la s

raidos de la

3

zada para

a y pepino

on esta me

(Figura 19

todología M

racción en f

retener int

apaz de ret

s de retenció

ente para la

ogías multi

sa acoplad

suficiente e

matriz.

la extracció

[30] utilizan

etodología y

9) que no p

M3

fase sólida

terferencias

tener los int

ón cercano

a remoción

iresiduo en

a a espectr

especificida

ón de PTU

ndo espectr

y se obser

permiten di

dispersiva

s una amin

terferentes d

s a los de E

de ácidos

n las cuales

rometría de

d para dife

65

en tomates

rometría de

rvó que los

istinguir los

del método

na primaria

de la matriz

ETU y PTU

orgánicos

s se utiliza

e masas. E

erenciar los

5

s

e

s

s

o

a

z

,

,

a

l

s



Figura 20. Estructura adsorbente PSA

2.5.4 Extracción con solventes polares M4

Con base en la publicación de Kontou et.al [31] se realizó un ensayo en donde se utiliza

la misma cantidad de muestra, pero se minimiza el consumo de solvente de extracción,

reactivos y solventes en la etapa de limpieza. En el análisis por cromatografía se

observan extractos sin interferencias en el tiempo de retención de los analitos (Figura

21), por lo cual la relación S/N es adecuada y los límites de detección estimados son

apropiados para el desarrollo de la metodología en el marco de los objetivos propuestos.

Los porcentajes de recuperación promedio para los dos analitos son aceptables (Tabla 6)

aunque para la PTU la recuperación se encuentra por debajo del rango deseado.

Tabla 6. Exactitud y precisión para la metodología M4

Ensayo % de recuperación

ETU PTU

R1 83.74 68.13

R2 80.70 66.54

R3 80.98 66.74

Promedio 80.79 66.64

CV 5.16 3.18

Kontou et.al en su publicación muestra resultados para determinación de ETU en tomate

y productos de tomate. Los porcentajes de recuperación son mayores al 70%, lo cual es

concordante con lo obtenido, pero no se reportan porcentajes de recuperación para la

PTU. Aunque las cantidades de muestra, reactivos y solventes empleados en dicho

estudio son 10 veces superiores a las empleadas para el presente ensayo, los resultados

finales no son dispares. Los cromatogramas son muy similares, presentando extractos

sin interferencias ni ruido en la línea base causado por la matriz, lo cual indica que gran

C

p

q

L

e

FM

U

e

Capítulo 2

parte de las

ue se incre

Los limites d

este experim

Figura 21. EM4

Una vez rea

en cuenta lo

• EXAC

dar l

en e

meto

el cu

deter

comp

La e

sustancias

emente la re

de detecció

mento, pues

Estándar, b

alizados los

os siguientes

CTITUD: Se

ugar a pérd

el docume

odologías de

ual es bas

rminar con

plejas, con

exactitud es

coextraida

elación S/N.

n reportado

s para los do

blanco y bl

ensayos c

s criterios p

e pretende

didas de an

ento SANC

e análisis d

tante ampl

ncentracione

gran cantid

s un parám

s son retira

.

os por Konto

os compues

lanco fortif

on cada un

para selecci

que la met

nalitos dura

CO indica

e residuos

lio debido

es muy b

dad de sus

metro impo

adas en la e

ou et.al son

stos son inf

ficado para

na de las m

ionar la más

todología se

ante su pro

que el p

de plaguici

a la eleva

bajas, a n

tancias pre

rtante, sin

etapa de lim

n acordes c

feriores a 0

a el ensayo

metodologías

s adecuada

eleccionada

ocedimiento

porcentaje

das debe e

ada variabil

iveles de

esentes en

embargo,

mpieza, perm

con los estim

.01 mg/kg.

o con la m

s elegidas,

a.

a pueda eje

. El rango

de recupe

estar entre 7

lidad que s

µg/kg, en

la solución

que el por

67

mitiendo as

mados para

etodología

se tuvieron

ecutarse sin

establecido

eración en

70 y 120 %

se tiene a

n muestras

a analizar

rcentaje de

7

í

a

a

n

n

o

n

,

l

s

.

e



recuperación se encuentre en dicho rango es deseable, mas no se convierte en

una exigencia, pues aunque la metodología presente bajos porcentajes de

recuperación, si la sensibilidad es adecuada para el propósito del método y la

dispersión de los resultados es baja, puede garantizarse que los resultados sean

confiables a través del tiempo y en su ejecución en diferentes escenarios.

• LIMITES CRITICOS: El objetivo es encontrar una metodología adecuada para la

determinación de ETU y PTU a nivel de trazas. La concentración requerida se

propone con base en la legislación internacional que reglamenta los límites

máximos de residuos de estos compuestos en los alimentos. Países como

Alemania y Holanda tienen establecidos límites máximos de residuos

generalizados para todos los alimentos en 0,05 y 0,02 mg de ETU por kg,

respectivamente. La legislación más estricta tiene como límite 0.01 mg de ETU

por kg para todas las matrices, por lo cual esta última, que es la más baja, se

establece como el objetivo de la metodología en cuanto al límite de detección.

• EJECUCION: Se requiere que la metodología seleccionada sea viable de aplicar

como método de análisis de rutina en el laboratorio, con miras hacia que en un

futuro puedan realizarse planes de monitoreo de la presencia de residuos de

éstos contaminantes en los alimentos de consumo interno en el país, o pueda

prestarse el servicio al sector productivo para garantizar la inocuidad de sus

productos en cuanto a estos residuos.

Para la evaluación de la posibilidad de ejecución, el tiempo y complejidad del análisis son

considerados, así como la representatividad de la porción analítica para minimizar la

incertidumbre en los resultados y garantizar que el dato obtenido en el laboratorio es fiel

a lo que se encuentra en la totalidad de la matriz de ensayo.

En cuanto a la exactitud, las metodologías M1, M2 C18 y M4 proporcionaron resultados

que son satisfactorios y pueden ser optimizados para lograr el mínimo de pérdidas de los

analitos o el máximo de recuperación durante la ejecución del análisis. La metodología

M3 no cumple con ninguno de los parámetros de evaluación para la selección, pues no

es posible observar los analitos a bajas concentraciones, por lo que no se puede evaluar

Capítulo 2 69

la recuperación y calcular limites críticos no tiene sentido práctico, pues con el elevado

ruido de la matriz, serian muy altos como para ser considerada como una metodología

aplicable para el objetivo propuesto.

La capacidad de la metodología para determinar los analitos a concentraciones cercanas

a 0.01 mg/kg es una característica que solo los métodos M1 y M4 poseen, pues los

limites de detección y cuantificación estimados para el método M3 son demasiado

elevados debido a las interferencias de la matriz y a la poca cantidad de muestra que se

toma para el ensayo.

Así mismo, para garantizar los resultados de cada ensayo y dar la posibilidad de ejecutar

la metodología como técnica de análisis de rutina en laboratorios acreditados bajo un

sistema de gestión de la calidad, es necesario garantizar la representatividad de la

porción analítica, con lo cual los métodos M3 y M4, en los que la muestra es de 10 g

tienen la mejor posibilidad.

Tabla 7. Criterios de selección de la metodología. Metodología Exactitud Límites críticos Ejecución

M1 M2 C18 M3

M4

En la Tabla 7 se resumen los criterios aplicados para la selección de la metodología;

como se puede observar, el método M4, extracción con solventes polares, es el que

presenta los mejores resultados abordando los tres parámetros propuestos, por lo cual es

el método seleccionado para continuar con la fase de optimización, pues se pretende

mejorar los porcentajes de recuperación.

70

2.6 O

En la F

metodo

seleccio

eluir los

individu

el utiliza

por tripl

medio d

Figura

2.6.1

En la e

volume

Valida

Optimiza

igura 16 se

ología con lo

onados fuer

s analitos

ualmente en

ado al eval

licado y las

de análisis d

17. Paráme

Optimiza

etapa de lim

n de DICLO

1. pH

4

9

ción de me

ación d

observa el

o cual se b

ron pH, adic

y composic

n el orden q

luar el efec

diferencias

de varianza

etros para

ación de

mpieza se i

OROMETA

2.

todologías

e la me

proceso ex

busca mejor

ción de sal,

ción de la

que se mues

cto del sigu

s entre los p

a con un niv

optimizaci

e la etapa

involucraron

ANO necesa

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0%

5%

10%

analíticas p

degra

etodolog

xperimental

rar los porc

, volumen d

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stra en la fi

iente factor

porcentajes

vel de confia

ión de la m

a de limp

n los siguie

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sal C

para la dete

adación de f

gía – pa

l para la opt

centajes de

de DICLOR

e extracción

gura y el ni

r. Los expe

s de recupe

anza del 95

metodología

pieza

entes práme

uir los analit

3. VolumenCH2Cl2 necepara eluir

analitos

5 m

7m

10m

rminación d

fungicidas d

arte exp

timización s

recuperaci

ROMETANO

n. Estos fu

vel óptimo

erimentos fu

eración se d

5%.

a

etros: pH, a

tos.

n de esario los s

L

L

mL

de producto

ditiocarbam

periment

sistemática

ón. Los fac

O necesario

ueron evalu

de cada un

ueron realiz

determinaro

adición de

4. Compode la mezextrac

MeO

MeO

H

os de

matos

tal

de la

ctores

o para

uados

no fue

zados

on por

sal y

osición zcla de ción

OH:H2O

3:1

OH:H2O

2:1

H2O

Capítulo 2 71

Para la evaluación del efecto del pH se tomaron 2 mL del extracto antes del proceso de

partición y se realizó el ajuste de pH a 4 y a 9 con solución de Cloruro de amonio 1N e

hidróxido de sodio 1 N, respectivamente, sin modificar las demás variables del proceso

original.

Para la evaluación del efecto de la adición de sal en el proceso de partición se ajustó el

pH a 9 con NaOH 1N a 2 mL de extracto y 0.0, 0.05 y 0.1 g de NaCl fueron adicionados

antes de la partición manteniendo las demás variables sin modificar.

Para evaluar el efecto del volumen de diclorometano necesario para eluir los analitos se

ajustó el pH a 9 y no se realizó adición de sal antes de la partición. Al realizar la elución

se recogieron las fracciones de 0-5, 5-7 y 7-10 mL, y se evaluó el porcentaje de

recuperación en cada una de ellas.

2.6.2 Optimización de la etapa de extracción

En la etapa de extracción se observó el efecto de la proporción de MeOH en la mezcla de

extracción utilizando como alternativas los siguientes extractantes: MeOH:Agua 3:1,

mezcla MeOH:Agua 2:1 y agua.

2.7 Optimización de la metodología - Resultados y discusión

Dada la dificultad instrumental para detectar los analitos en el extracto crudo, se optimizó

en primer lugar la etapa de limpieza. Tres parámetros fueron considerados en diseños

consecutivos completamente al azar utilizando análisis de varianza para determinar la

existencia de diferencias significativas (p<0.05) entre los grupos de datos y se utilizó la

prueba de comparación de medias de Tukey para determinar cuál era el mejor.

La etapa de limpieza realizada con extrelut es una técnica que reemplaza la extracción

liquido-liquido mediante la sustitución del embudo de decantación, la cual presenta

grandes ventajas, como el ahorro de solventes y la facilidad en la ejecución dado el poco

72

tiempo

adsorbe

encuen

inerte e

estacio

no son

halogen

Figura extrelu

Los an

dispers

ácidos

otros. M

mayoría

que se

mientra

afinidad

retirado

La efici

partícul

Valida

que consu

ente y se d

tra compue

en el rango

naria. Poste

n miscibles

nados (Figu

22. Esqut.

nalitos de

ables en a

orgánicos,

Muchos de

a de solven

encuentra

as otras po

d por solven

os de la fase

iencia de la

as de pequ

ción de me

ume. La m

distribuye e

esta de tie

o de pH de

eriormente

s con agu

ura 22)

ema del p

interés so

agua que se

carotenos

estos comp

ntes orgánic

distribuida

ocas sustan

ntes orgáni

e acuosa.

a partición

ueño tamañ

todologías

uestra acu

en forma de

erra de dia

e 1 a 13 y

la elución s

ua, como é

proceso d

n coextraid

e encuentra

s, carbohidr

puestos son

cos, por lo q

a en una d

ncias, entre

icos, polare

y la rapide

ño y gran á

analíticas p

degra

osa es apl

e una pelíc

atomáceas,

altamente

se lleva a ca

éter etílico

de partició

dos con m

an presente

ratos, flavo

n polares s

que van a q

delgada pel

e ellas los

es y aprotic

ez con la q

área superf

para la dete

adación de f

licada sobr

cula delgad

de natura

porosa, la

abo utilizand

o, acetato

n líquido-

muchas otr

es en la m

onoides, vit

olubles en

quedarse re

ícula sobre

compuest

cos, como e

que se real

ficial, se tie

rminación d

fungicidas d

re la colum

da sobre la

aleza silicea

cual actúa

do solvente

de etilo o

líquido so

ras sustanc

matriz, como

taminas y

agua pero

etenidos en

e la superfi

tos de inte

el diclorome

liza se bas

ene una gra

de producto

ditiocarbam

mna del ma

a matriz, qu

a químicam

como una

es orgánicos

o hidrocarb

oportado s

cias solubl

o son azuc

minerales

insolubles

n la fase acu

icie del ext

erés, que ti

etano, van

san que al

an superfic

os de

matos

aterial

ue se

mente

a fase

s que

buros

sobre

es o

cares,

entre

en la

uosa,

trelut,

ienen

a ser

tener

cie de

Capítulo 2 73

contacto entre las dos capas inmiscibles, permitiendo que se dé un gran número de

equilibrios de partición, con lo que la recuperación de los analitos resulta elevada.

Como primer parámetro para optimizar éste proceso, se evaluó el efecto del ajuste de pH

en la alícuota antes del proceso de partición. Este parámetro fue seleccionado debido a

que el pH afecta la estructura molecular de los compuestos de interés en solución.

ETU y PTU pertenecen a la familia química de las tioureas, sustancias susceptibles a

presentar tautomerismo tiona-tiol (Figura 23), análogo al tautomerismo ceto-enol

presentado en los compuestos carbonílicos que tienen hidrógenos en el carbono alfa al

carbonilo. En ETU y PTU, este equilibrio se encuentra desplazado hacia la forma tiona,

de menor polaridad.

S

NHNH

CH3

S

NHNH

S

NNH

H

CH3

NNH

SH

Tiona Tiol

Figura 23. Tautomerismo tiona-tiol en ETU y PTU

El desplazamiento hacia la forma tiol puede verse catalizado por la presencia de ácidos o

bases como se muestra en la Figura 24. Los extractos acuosos de las matrices

empleadas en este estudio presentan grandes variaciones en cuanto al pH, pues se

trabaja con matrices de elevada acidez, como la uchuva y el tomate, y otras cuyos

ETU

PTU



extractos son cercanos a la neutralidad, como el banano y la granadilla, por lo tanto se

requiere realizar un ajuste de pH con el fin de minimizar la variabilidad entre matrices.

S

NHNH

S

N-NH

OH-

NHNH

S-

H+

NNH

SHOH

-

OH-

Catálisis básica

Deprotonación del Nitrógeno alfaReprotonacion del S

Catálisis ácida

S

NHNH

SH+

NHNHNHNH

C+

SHH

+

NNH

SHOH

-

OH-

Protonación del S Deprotonacion en el Nitrogeno alfa

H+

Tiona TiolIon tiolato

Tiona TiolCarbonilo protonado

Figura 24. Tautomeria tiona-tiol catalizada.

ETU y PTU son estables en el rango de pH 4-9 [31] por lo tanto, valores extremos dentro

del rango de estabilidad fueron seleccionados como niveles del factor de prueba, con el

fin de evitar puntos extremos donde se viera favorecida la formación del tiol;

adicionalmente, a valores de pH extremadamente altos, en presencia de una base

suficientemente fuerte, tanto la forma tiona como el tiol pierden cuantitativamente un

protón. El resultado (ion tiolato) es el mismo y sólo difiere en el lugar donde está situada

la carga, siendo ambas estructuras formas resonantes y no especies en equilibrio. La

existencia de esta especie cargada no favorece la partición liquido-liquido, pues la

solubilidad en agua aumentaría y las moléculas no pasarían a la fase orgánica.

C

L

e

re

P

a

ti

e

n

G

C

fa

re

u

(p

A

fa

p

Capítulo 2

Los resultad

efecto signif

eportado po

PTU, encont

acido la PTU

ol y éste es

esta dado p

itrógeno.

Gráfico 2. E

Con el fin d

ase acuosa

emoción de

na partició

p>0.05) en

Al agregar u

ase acuosa

para interact

0

20

40

60

80

100

120

Porcen

taje de recupe

ración

(%)

dos se obse

ficativo en

or Kontou e

trándose m

U se recupe

s menos su

por la estab

Efecto del p

e modificar

a al diclorom

e las moléc

ón liquido-liq

la exactitud

una sal inorg

a de la mez

tuar con las

85

O

ervan en e

la recuper

et.al [31] si

mayor exacti

era en meno

usceptible d

bilidad que

pH en la rec

r la capacid

metano, se

culas de la

quido. Sin

d de la meto

gánica com

zcla, causa

s moléculas

5,99 90,87

ETU

Optimizació

el Gráfico 2

ración de la

in embargo

itud a valor

or proporció

de extraers

e le proporc

cuperación

dad de las m

evaluó el e

fase acuos

embargo n

odología pa

mo el cloruro

ando que e

s de analito

An

ón de la limp

pH

. Se obser

a ETU (p>

o hay signif

res de pH le

ón debido a

e con el di

ciona el me

n en la etap

moléculas d

efecto de la

sa, conocie

no se obse

ra ningún a

o de sodio s

el agua teng

o, con lo cu

nalito

pieza. Efect

4 pH 9

rva que el a

>0.05), lo c

ficancia en

evemente b

a que se fav

clorometan

etilo extra

pa de limpi

de ETU y P

a adición d

ndo que la

ervaron dif

analito al ad

se pretende

ga menos

al se tendrí

88,841

PTU

to del pH

ajuste de p

cual concue

la recuper

básicos (p<0

vorece la for

o; este favo

en la posic

ieza.

PTU para m

e sal para

a etapa de

ferencias s

dicionar sal

e que intera

moléculas

ía un increm

101,74

75

pH no tiene

erda con lo

ación de la

0.05). A pH

rmacion de

orecimiento

ción alfa a

migrar de la

propiciar la

limpieza es

ignificativas

(Gráfico 3).

actúe con la

disponibles

mento en la

5

e

o

a

H

l

o

l

a

a

s

s

.

a

s

a

76

movilida

darse d

que se

Gráfico

Con el

determi

El expe

obtenie

un aum

mayor

estadís

da deb

totalida

necesa

0

20

40

60

80

100

120

Porcen

taje de recupe

ración

(%)

Valida

ad de éstas

debido a la

está trabaja

o 3. Efecto

objetivo de

inó el volum

erimento se

endo como r

mento signif

el porcenta

ticamente i

ido a que

d de moléc

rio un volum

O

ción de me

s hacia el so

pequeña ca

ando a nive

de la adici

e minimizar

men mínimo

e realizó re

resultado ba

ficativo (p<0

aje de recu

gual (p>0.0

pequeños

culas distrib

men de al m

90,8777,6

ETU

Optimizació

todologías

olvente org

antidad de

el de trazas.

ón de sal e

la cantidad

o necesario

ecogiendo la

ajas recupe

0.05) cuand

uperación

05) al obten

volúmenes

buidas sobr

menos 10 m

6387,93

U

ón de la lim

0 mg

analíticas p

degra

ánico. Este

moléculas

.

en la recup

d de CH2Cl2 para eluir

as fraccion

eraciones e

do se comp

utilizando 1

nido utilizan

de solven

re la superf

mL para recu

Analito

pieza. Efect

50 mg

para la dete

adación de f

e efecto no

de analito

peración en

2 utilizado e

los analitos

es entre 0-

n las prime

pletan los

10 mL de

ndo 20 mL

te no son

ficie de las

uperarlas en

101,74

to de la adi

75 mg

rminación d

fungicidas d

es observa

presentes e

n la etapa d

en la etapa

s de la colu

-5 mL, 5-7

eras fraccion

10 mL de s

dicloromet

de diclorom

suficientes

partículas d

n mayor po

491,32

100,

PTU

ción de sal

de producto

ditiocarbam

ado y esto p

en la mezcl

de limpieza

de partició

mna de ext

mL y 7-10

nes (Gráfico

solvente, si

ano, el cu

metano. Es

para extra

de extrelut,

rcentaje.

10

os de

matos

puede

la, ya

a.

ón, se

trelut.

0 mL,

o 4) y

iendo

al es

sto se

aer la

y es

C

G

Gm

Capítulo 2

Gráfico 4. V

Gráfico 5. metodologí

0

20

40

60

80

100

120

Porcen

taje de recupe

racion

(%)

Op

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Porcen

taje de recupe

ración

(%)

O

Volumen de

Efecto deía.

ptimización

80,2

ptimización

M

e diclorome

e la compo

49,84

10,34

30,69

ETU

n de la limpi

4

49,85 52,4

ETU

n de la extra

etanol:Agua 3

etano nece

osición de

Analit

ieza. Efecto

5 mL 7

43

A

acción. Efec

3:1

esario para

el extracta

to

o del volume

7 mL 10

7

nalito

cto del solv

Metanol:Ag

a le elución

ante en la

67,35

3,75

30,64

PTU

en de solve

0 mL

77,90

58,51

PTU

vente de ext

gua 2:1

n de los ana

recuperac

ente

62,32

tracción

Agua

77

alitos.

ción de la

7

a

78

Una ve

recuper

muestra

Figura hortaliz

2.8 E–

La meto

y toma

recuper

10 g

Adicolumg desodio

E

Rem

Valida

ez evaluado

ración se

a a continua

25. Procezas.

Evaluac– Parte eodología op

ate realizan

ración a 0,0

g de matriz

icionar en mna con 0,5e Sulfato de o y 0,5 g deExtrelut

eposo 20 minutos

ción de me

o el efecto

determinó

ación en la

edimiento

ión de lexperimptimizada fu

ndo extracc

05 mg/kg po

5

e

todologías

de los pa

la metodo

Figura 25.

para la d

la metomental

ue evaluada

ciones de

or triplicado

Adición demL de

Metanol:A3:1

ConcentrarmL

Elución conmL de

dicloromet

analíticas p

degra

arámetros s

ología anal

determinac

dología

a en uchuv

un blanco

en cada un

e 20

Agua

r a 1

n 10

tano

para la dete

adación de f

seleccionad

ítica a val

ción de E

a con di

a, granadill

de cada

na.

Agitvigomin

Ajustacon Na

Sequ

rminación d

fungicidas d

os sobre e

idar. El pr

ETU y PT

ferente

a, pitaya, b

matriz y e

tación rosa 2 nutos

ar pH a 9 aOH 3 N

uedad

de producto

ditiocarbam

el porcentaj

rocedimient

U en frut

s matric

banano boc

experimento

Ce

so

Rec

In

os de

matos

je de

to se

as y

ces

cadillo

os de

entrifugació

2 mL de obrenadant

econstituciócon 1 mL de

agua

nyección enHPLC

ón

e

ón e

n

C

2

Gy C

p

la

p

c

Capítulo 2

2.9 Eval– Re

Gráfico 6. Ey b. PTU en

Como se ob

porcentajes

as diferente

pues se sele

ategoría en

0

20

40

60

80

100

Recupe

racion

(%)

0

20

40

60

80

100

Recupe

racion

(%)

luaciónesultado

Evaluación diferentes

bserva en

de recuper

es matrices,

eccionaron

n el codex a

89,8

0

0

0

0

0

0

a. Evalua

Uchu

87,

0

0

0

0

0

0

b. Evalua

Uchu

de la mos

de la recus matrices.

el Gráfico

ración al ap

, para ningu

matrices re

alimentarius

8781,

cion del porc

va Banano

25

75,

acion del por

va Banano

metodol

uperación d

6, no hub

plicar la me

uno de los d

epresentativ

s.

77

70,

Ma

centaje de rematr

Pitaya

,67 74,

Ma

rcentaje de remat

Pitaya

ogía co

de la metod

o diferenci

etodología

dos analitos

vas que se e

,83

89

atriz

ecuperacion rices

Granadilla

,56

87

atriz

ecuperaciontrices

Granadilla

on difere

dología op

as significa

para la ext

s. Este resu

encontraran

9,87

78

de ETU en d

Tomate

7,25

73

n de PTU en

Tomate

entes m

ptimizada p

ativas (p<0

tracción opt

ultado era e

n dentro de

8,56

diferentes

3,66

diferentes

79

matrices

para a. ETU

,05) en los

timizada en

el esperado

una misma

9

s

U

s

n

o

a



2.10 Validación de la metodología – Parte experimental

La validación fue realizada bajo los parámetros del documento SANCO [32]. Se utilizó

matriz blanco de uchuva, dado que no se encontraron diferencias significativas en la

recuperación entre las diferentes matrices.

2.10.1 Especificidad-Selectividad

Muestras blanco de granadilla, pitaya, banano bocadillo y tomate fueron extraídas y

analizadas por HPLC en conjunto con estándares de 0,02 µg/mL disueltos en agua. Se

inyectaron en una misma secuencia cromatográfica y se determinó la presencia o

ausencia de interferencias en el tiempo de retención de los analitos.

2.10.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología

Se calculó el ruido para inyecciones de extractos de matriz blanco realizadas en el

proceso de evaluación de especificidad-selectividad al tiempo de retención de los

analitos. En la misma secuencia se inyectó una mezcla de estándares de ETU (0,02

µg/mL) y PTU ((0,04 µg/mL). Utilizando la respuesta en altura de las inyecciones de los

estándares se estimaron los límites de detección LD y cuantificación LC.

3

10

Para corroborar la estimación del LD, se fortificó extracto de matriz blanco a dicha

concentración y se inyectó en el sistema cromatográfico. La respuesta de los analitos

debe ser mayor que 3 veces el promedio del ruido de los blancos.

Para corroborar la estimación del límite de cuantificación, se realizó un experimento de

recuperación por triplicado a la concentración equivalente al límite de cuantificación, para

evaluar su exactitud y precisión.

Capítulo 2 81

2.10.3 Linealidad – Efecto matriz

Se prepararon e inyectaron en una misma secuencia los niveles 1, 3 y 5 de la curva de

calibración (Tabla 8) en solvente y en extracto de matriz blanco. Se calculó el efecto

matriz como se muestra a continuación:

%

100

Si en alguno de los niveles el porcentaje de efecto matriz supera el 120%, se considera

que existe efecto matriz y las curvas de calibración y la cuantificación deben hacerse con

estándares preparados en extracto blanco de matriz.

Se evaluó la respuesta del sistema a cinco diferentes niveles de concentración según la

Tabla 8.

Tabla 8. Concentraciones de los niveles de calibración

Nivel ETU PTU

(µg/mL) (mg/kg) (µg/mL) (mg/kg) 1 6,67 0,010 13,33 0,020

2 13,33 0,020 26,67 0,040

3 33,33 0,050 66,67 0,100

4 66,67 0,100 133,33 0,200

5 166,67 0,250 333,33 0,500

Se determinó estadísticamente el coeficiente de correlación lineal y la ecuación

correspondiente al ajuste lineal. Se evaluó el valor estadístico t Student para la

pendiente, el intercepto y la correlación. Utilizando el método estadístico ANOVA se

evaluaron los parámetros F para regresión y ajuste de linealidad. En el Anexo 1 se

presenta las ecuaciones correspondientes.



Tabla 9. Criterios de aceptación linealidad

Parámetro Aceptación

Pendiente La pendiente es estadísticamente diferente de cero

Intercepto El intercepto es estadísticamente igual a cero

Correlación entre X y Y Existe correlación entre la respuesta y la concentración

Regresión entre X y Y Existe regresión lineal entre la respuesta y la concentración

Desvío a la linealidad No se presenta desvió de la linealidad

2.10.4 Exactitud

Se evaluó a los niveles 1, 3 y 5 de la curva de calibración. Muestras blanco de matriz

fueron fortificadas a los niveles de evaluación (mg/kg). Se realizó el procedimiento

analítico sobre la matriz fortificada (n=4). Se prepararon estándares de calibración a los

niveles de evaluación (µg/mL). En una misma secuencia fueron inyectados estándares y

recuperados y se calculó el porcentaje de recuperación así:

%

100

Se calculó la homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Cochran (Anexo 1).

El G calculado debe ser menor al G teórico, con un nivel de confianza del 95 %. Esta

condición acepta que el nivel de concentración no afecta la variabilidad de los

porcentajes de recuperación, por tal motivo se pueden expresar el porcentaje de

recuperación y el coeficiente de variación típico.

Capítulo 2 83

2.10.5 Precisión

• Repetibilidad

En un mismo día, se hicieron ensayos de recuperación (n=4) de muestras fortificadas a

cada uno de los niveles de evaluación y se inyectaron en una misma secuencia

cromatográfica. Se calculó el porcentaje de recuperación para cada ensayo (%R) y la

desviación estándar de la población (Sn-1), el porcentaje de recuperación promedio de

cada nivel (%Rprom) y el coeficiente de variación CV.

• Precisión intermedia

Se realizaron ensayos de recuperación en cuatro días diferentes (D1, D2, D3 y D4, n=4,

uno cada dia), de cada uno de los niveles de evaluación. Se calculó el porcentaje de

recuperación para cada ensayo (%R) y la desviación estándar de la población (Sn-1), el

porcentaje de recuperación promedio de cada nivel (%Rprom) y el coeficiente de

variación CV.

2.10.6 Robustez de la metodología

Siete variables fueron seleccionadas (Tabla 10) para la evaluación de la robustez

utilizando un diseño de Youden-Steiner como se muestra en la Tabla 11.

Tabla 10. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método. Valor nominal Valor Alterado

Variable Denominación Valor Denominación Valor Tiempo de agitación (min) A 2,0 a 1,5

Modo de agitación B manual b Vortex

Temperatura de evaporación(°C) C 35 c 33

Masa de extrelut (g) D 0,5 d 0,6

Tiempo de contacto (min) E 20 e 25

Longitud de onda (nm) F 232 f 240

Fase móvil (Composición) G 98:2 g 99:1



Tabla 11. Diseño experimental para evaluación de la robustez.

Variable 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo de agitación (min) A A A a a a a A

Modo de agitación B b b B B b b B

Temperatura de evaporación(°C) c C c C c C c C

Masa de extrelut (g) D d d d d D D D

Tiempo de contacto (min) e E e e E e E E

Longitud de onda (nm) f f F F f f F F

Fase móvil (Composición) g g G g G G g G

2.11 Validación de la metodología – Resultados

La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los

resultados entregados por dicho método son confiables. Es necesario realizar

experimentos encaminados a obtener evidencia objetiva que permita demostrar, con

fundamentos estadísticos que el método es adecuado para los fines previstos. El objetivo

principal de desarrollar un proceso de validación es evaluar las capacidades del método y

confirmar la concordancia de éstas con el objetivo que se ha propuesto para su

ejecución.

En este proceso se encuentra implícito que los ensayos y experimentos se han realizado

utilizando equipos dentro de especificaciones de correcto funcionamiento, calibrados y

verificados y que han sido ejecutados por personal idóneo. La validación del método está

estrechamente ligada al desarrollo y optimización que se han desarrollado previamente.

A continuación se muestran los resultados de validación para los parámetros

considerados en el DOCUMENTO SANCO y explicados previamente.

C

2

L

p

c

m

e

E

lo

ti

p

d

FE L

u

Capítulo 2

2.11.1

La selectivid

presencia de

ondiciones

matrices fue

en el sistema

En la Figura

os analitos

empos de r

permitiendo

e la matriz.

Figura 26. Especificida

Los resultad

na señal cla

Espec

dad es el gr

e otras sust

de ejecució

eron sometid

a cromatog

a 26 se mue

de interés

retención de

analizar ET

Cromatograd de la me

dos muestra

ara, diferen

ificidad-S

rado en que

tancias, end

ón del méto

dos a la me

ráfico.

estra un cro

s inyectado

e los analito

TU y PTU i

rama obteetodología

an que el si

nciada y res

Selectivi

e un método

dógenas o e

odo. Para e

etodología d

omatograma

os en solve

os, por lo ta

individualm

nido para a.

istema es e

suelta para c

idad

o puede cu

exógenas, e

evaluar la se

de análisis

a típico de b

ente; no se

anto la meto

ente en pre

blanco de

específico y

cada uno d

uantificar o i

en una mue

electividad,

y los extrac

blanco de m

e observan

odología es

esencia de

e matriz y

y selectivo,

e los compo

identificar a

estra de ma

blancos de

ctos fueron

matriz super

interferenc

selectiva y

las demás

mezcla d

pues es ca

onentes de

85

al analito en

triz bajo las

e diferentes

inyectados

rpuesto con

cias en los

y especifica

sustancias

e analitos

apaz de dar

interés.

5

n

s

s

s

n

s

,

s

.

r



2.11.2 Limites de detección y cuantificación de la

metodología

El límite de detección es la concentración mínima de analito que puede ser detectada e

identificada con un determinado grado de confianza (95%). Así mismo, el límite de

cuantificación es la concentración mínima de analito que puede ser cuantificada por la

metodología con precisión y exactitud aceptables.

Para estimar el límite de detección pueden usarse varios métodos, todos ellos dependen

del análisis de blancos de procedimiento y de la determinación de la relación entre la

señal y el ruido. En este caso se utilizó el método “Aproximación de dos pasos” descrito

por Corley en [29], mediante el cual se realiza la estimación de los límites de detección y

cuantificación del método con base en la respuesta instrumental ante la inyección de

soluciones estándar y la determinación del ruido en el tiempo de retención de los analitos

al inyectar blancos de procedimiento. Posteriormente, dichos límites estimados son

puestos a prueba mediante la inyección de blancos fortificados al límite de detección y la

ejecución de ensayos de recuperación en blancos de matriz fortificados al límite de

cuantificación. A partir de la inyección de estándares de bajas concentraciones (Tabla

12), se determino la altura correspondiente a cada pico.

Tabla 12. Valores de altura de analitos individuales para estimación del límite de detección y cuantificación

Rango tr H (mUA) Concentración (µg/L)

ETU 3,4-3,7 0,44 0,0063

PTU 6,1-6,5 0,55 0.0125

Realizando extracciones de matrices blanco de banano, granadilla, pitaya, Uchuva y

tomate se calcularon los ruidos en el rango del tiempo de retención de los analitos según

se observa en la Tabla 13.

Capítulo 2 87

Tabla 13. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación

Ruido (mUA) 3Ruido (mUA) 10 Ruido (mUA)

Matriz ETU PTU ETU PTU ETU PTU Banano 3,34E-02 2,48E-02 1,00E-01 7,44E-02 0,334 0,248

Granadilla 3,26E-02 7,79E-02 9,78E-02 2,34E-01 0,326 0,779

Pitaya 3,19E-02 3,18E-02 9,57E-02 9,54E-02 0,319 0,318

Uchuva 3,30E-02 9,81E-02 9,90E-02 2,94E-01 0,33 0,981

Banano 2,67E-02 4,38E-02 8,01E-02 1,31E-01 0,267 0,438

Tomate 2,39E-02 2,58E-02 7,17E-02 7,74E-02 0,239 0,258

Promedio 9,08E-02 1,51E-01 3,03E-01 5,04E-01

Utilizando el promedio del ruido y los valores de altura de los estándares y sus

concentraciones se estimaron los límites de detección y cuantificación y se reportan en la

Tabla 14.

Tabla 14. Límites de detección y cuantificación estimados ETU PTU

LD Est (µg/mL) 0,0015 0,0034

LC Est (µg/mL) 0,0043 0,0115

LD Est (mg/kg) 0,002 0,005 LC Est (mg/kg) 0,006 0,017

Se realizó la inyección del blanco fortificado a las concentraciones estimadas como límite

de detección. Los picos de los analitos no presentaron la respuesta esperada, por lo que

se decide aumentar la cantidad fortificada; a esa concentración se obtuvo un valor de

altura del pico aceptable y diferenciable del ruido y se decide establecerla como límite de

detección. El cromatograma se observa en la Figura 27. Estos valores corresponden a

0.003 mg/kg de ETU y 0.006 mg/kg de PTU.

88

Figura analito

El límite

PTU; co

exactitu

Tabla 1PTU

Los po

permite

Valida

27. Cromas al límite d

e de cuant

on éstos va

ud y precisió

15. Recupe

orcentajes d

en establece

ción de me

atograma ode detecció

ificación se

alores se lle

ón a ésta co

eración al l

Pr

de recuper

er que a pa

todologías

obtenido alón 0.003 m

e establece

evan a cabo

oncentració

límite de c

R1 R2 R3

romedioCV

ración (70-

artir de ésto

analíticas p

degra

fortificar emg/kg ETU y

en 0.010

o los exper

ón; los resul

cuantificaci

ETU %rec

77,94

76,47

70,59

75,00

5,19

120%) y lo

os valores d

para la dete

adación de f

el extracto y 0.006 mg

mg/kg para

imentos de

tados se m

ión 0.010 m

PTU %rec

82,30

93,65

88,10

88,02

6,45

os coeficie

de concent

rminación d

fungicidas d

de matriz g/kg PTU.

a ETU y 0.

e recuperac

uestran en

mg/kg ETU

entes de va

ración se p

de producto

ditiocarbam

blanco co

020 mg/kg

ión para ev

la Tabla 15

U y 0.020 m

ariación (<

puede cuan

os de

matos

n los

para

valuar

5.

mg/kg

20%)

tificar

Capítulo 2 89

dichos analitos en una muestra. Se establece que el nivel más bajo de calibración

corresponde a éstos valores.

Cabe anotar que detectar concentraciones tan bajas solo es posible gracias a que la

metodología involucra una etapa de limpieza con extrelut, la cual es extraordinariamente

eficiente en la remoción de interferencias de los analitos de interés, ya que el extracto

blanco de matriz antes de la limpieza presenta una gran cantidad de compuestos

coextraidos de elevada polaridad y de elución temprana en HPLC, y que por lo tanto

interfieren en la detección de los analitos de interés. El cambio después de la limpieza

con extrelut es dramático, pues retira un elevado porcentaje de interferencias permitiendo

disminuir en gran proporción la relación señal/ruido y así poder detectar los analitos a

bajas concentraciones.

2.11.3 Linealidad –Efecto matriz

El documento SANCO define el efecto matriz como la influencia de uno o más

componentes no detectados de la muestra en la medición de la concentración de analito.

La respuesta de algunos sistemas, como la cromatografía de gases o la cromatografia

líquida acoplada a espectrometría de masas , a ciertos analitos, puede verse afectada

por la presencia de sustancias coextraidas o coeluidas de la matriz. Estos efectos de

matriz se pueden presentar como un incremento o una disminución de la respuesta del

analito disuelto en el extracto de la matriz en comparación con el analito en solvente

puro. El efecto matriz provoca un error sistemático que puede ser dependiente de la

concentración del analito en la muestra.

La presencia o ausencia de tales efectos puede evaluarse mediante la comparación de la

respuesta del analito disuelto en un solvente puro, con la obtenida en la presencia del

extracto de la matriz a partir de la misma cantidad de analito.

Los efectos de matriz pueden ser muy variados e imprevisibles, pues dependen de

muchos factores, como de la estructura y propiedades fisicoquimicas, tanto del

componente de interés como de todas las demás sustancias presentes en la matriz, asi

como de la técnica analítica utilizada, aunque técnicas como la utilizada en este estudio,



HPLC con detección UV o DAD son inherentemente menos propensas a ser

influenciadas por dicho efecto. Realizar las curvas de calibración o los estándares de

cuantificación en extracto de matriz blanco, es una forma de compensar los efectos de la

matriz, sin embargo, no elimina la causa.

La evaluación del efecto matriz puede hacerse mediante diferentes técnicas estadísticas,

como porcentaje de efecto matriz, prueba pareada, métodos de regresión y análisis de

covarianza. Dado que la cromatografía líquida con detector de arreglo de diodos no es

una técnica cuyos resultados puedan verse influenciados por dicho efecto, el cálculo del

porcentaje de efecto matriz es apto para evaluar este efecto.

En la Tabla 16 y en la

Tabla 17 se muestran los resultados del cálculo del porcentaje de efecto matriz para los

dos analitos en los cinco niveles de calibración.

Tabla 16. Efecto matriz pata ETU.

Nivel Concentración

(µg/mL) Solvente

(mUA/min)Matriz

(mUA/min)EM %

1 10,0 3,6 3,6 100,93

2 20,0 7,6 7,8 102,63

3 50,0 18,9 18,8 99,30

4 100,0 40,6 41,0 100,99

5 250,0 102,2 104,2 101,96

Tabla 17. Efecto matriz para PTU.

Nivel Concentracion

(µg/L) Solvente

(mUA/min)Matriz

(mUA/min)EM %

1 20,0 6,2 6,2 100,00

2 40,0 13,7 13,8 101,22

3 100,0 35,5 36,9 103,85

4 200,0 76,8 77,0 100,26

C

D

p

h

G L

in

c

C

c

la

m

p

c

A

Capítulo 2

Dado que no

para ninguno

acerse prep

Gráfico 7. C

La linealidad

ntervalo, de

antidad del

Con el fin de

oeficiente d

a variable r

máximos qu

positiva per

orrelación a

‐20,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0,000

Area

5

o existe efe

o de los do

parando es

Curvas de c

d es la ca

e dar una re

analito a d

e determina

de correlaci

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ue puede a

rfecta (entre

alguna, inde

0,020

CC ETU So

500,0

ecto matiz (

os analitos,

tándares de

calibración

apacidad de

espuesta o

eterminar e

ar el rango

ón indica e

(Y) de la c

lcanzar son

e X e Y)

ependencia

0,040 0,

olvente

20

(%EM <120

la cuantific

e calibració

n en solven

e un méto

resultados

en una mue

lineal de la

l grado de r

curva de ca

n –1 y 1. E

con una p

a total de lo

,060 0,08

Concen

Curva de ca

LC ETU So

02,7

0) en ningun

cación y la e

n en solven

nte y en ma

do de aná

instrumenta

stra problem

a metodolog

relación ent

alibración, e

El valor máx

pendiente p

os valores X

y = 618,18xR² = 0,9Solve

80 0,100

ntración (µg/m

alibración E

lvente

214,1

no de los n

evaluación

nte.

atriz ETU.

álisis, dentr

ales que se

ma.

gía se realiz

tre la variab

en este ca

ximo de 1

positiva. C

X e Y. En la

x ‐ 0,86259997nte

y = 630R²

0,120

mL)

ETU

CC ETU Mat

105,66

iveles de c

de la lineal

ro de un d

ean proporc

zaron las c

ble concent

aso, área. L

indica una

uando r=0

a práctica s

0,75x ‐ 1,0829= 0,9989Matriz

0,140 0

triz LC

91

alibración y

lidad puede

determinado

ionales a la

urvas de E

ración (X) y

Los valores

correlación

, no existe

si r tiene un

9

0,160 0,1

C ETU Matriz

1

y

e

o

a

l

y

s

n

e

n

180

92

valor ce

Para u

obtenid

igual o

observa

respues

Gráfico

Se real

misma

Student

indicado

Student

varianz

entre a

en la re

‐20,

30,

80,

130,

180,

230,

Area

Valida

ercano a u

una curva

o sea may

mayor que

an en la T

sta

o 8. Curvas

izó una eva

curva de ca

t para interc

or del mode

t, se realiz

a (ANOVA)

rea y conce

egresión line

0

0

0

0

0

0

0,0

CC ETU

ción de me

no (1) sign

de calibrac

or o igual a

e 0.99. En

Tabla 18, m

medid

s de calibra

aluación de

alibración, c

cepto, pend

elo lineal. P

zó un análi

), en donde

entración y

eal.

0,1

U Solvente

todologías

nifica que e

ción es re

a 0.999, au

n éste caso

muestran u

da

ación en so

curva de ca

con lo que s

diente y cor

Para comple

isis estadís

e se determ

se separa

0,1

Curv

LC ET

analíticas p

degra

existe corre

comendabl

unque para

o, los coefi

una elevad

y

olvente y e

alibración g

se obtuvo u

rrelación a u

ementar los

stico de los

mina estadí

y calcula la

0,2

Concentra

va de calibra

TU Solvente

para la dete

adación de f

elación con

e que el

el caso de

cientes de

da correspo

la

n matriz PT

global, utiliz

na evaluac

un 95 % de

s resultados

s residuale

ísticamente

a influencia

y = 616,5R² = 0Solv

0,2

ción (µg/mL

ación PTU

CC ET

rminación d

fungicidas d

una proba

coeficiente

e trazas se

correlación

ondencia e

TU.

ando tres in

ción estadíst

e confianza

s obtenidos

es mediante

la existenc

del desvío

5x ‐ 3,73860,9996vente

y

0,3

TU Matriz

de producto

ditiocarbam

abilidad elev

de correl

admite un

n lineal, qu

entre la va

concentra

nyecciones

tica de prue

, como un m

por la prue

e análisis d

cia de regr

o de la linea

= 652x ‐ 5,16R² = 0,9987Solvente

0,3

LC ETU

os de

matos

vada.

ación

valor

ue se

riable

ación.

de la

eba t-

mejor

eba t-

de la

resión

alidad

89

0,4

Matriz

Capítulo 2 93

En la Tabla 18 se observan los resultados de la aplicación de las pruebas estadísticas a

las curvas de linealidad para ETU y PTU. Para los dos analitos el intercepto es

significativamente diferente de cero, lo cual indica que debe usarse la ecuación de la

curva de calibración para el cálculo de las concentraciones en una muestra problema,

incluyendo el valor del intercepto; la pendiente, para los dos analitos, es diferente de

cero, existe correlación lineal entre el área y la concentración al igual que regresión y no

hay desvíos significativos de la linealidad en el rango evaluado.

Tabla 18. Resultados pruebas estadísticas de linealidad en solvente ETU PTU Conclusiones linealidad

Pendiente 618,2 616,5 La pendiente es significativamente

diferente de cero

Intercepto -0,86 -3,74 El intercepto es significativamente

diferente de cero

Correlación 0,9997 0,9997 Existe correlación entre área y

concentración

Regresión S(*) S(*) Existe regresión entre el área y la

concentración

Desvío NS(**) NS(**) No hay desvío significativo de la

linealidad

(*) Estadístico F en ANOVA de linealidad no significativo para H0= no existe regresión entre X e Y, H

1= existe regresión entre X e Y.

(**)Estadístico F en ANOVA de linealidad significativo para H0= no existe desvio de la linealidad, H

1= existe desvio de la linealidad.

2.11.4 Exactitud

El documento SANCO define la exactitud como la diferencia entre el valor promedio

medido y el valor real. El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados

de un ensayo, y supone una combinación de componentes aleatorios y un componente

común de error sistemático o sesgo.



Para la validación del método la exactitud fue evaluada como porcentaje de recuperación

a tres niveles de concentración: un nivel mínimo, equivalente al límite de cuantificación,

uno intermedio y uno máximo en el rango de linealidad establecido. En la Tabla 19 se

observan los resultados de exactitud de la metodología.

Para evaluar la significancia en la diferencia del porcentaje de recuperación con el 100 %

se realiza una prueba t (95% confianza, n=4) de comparación con un valor fijo. Las

ecuaciones pueden verse en el anexo 1. En la Tabla 19 se observa que para la mayoría

de los ensayos realizados (más del 80%) se obtienen porcentajes de recuperación que

se encuentran dentro del rango de aceptación de 70-120 % y todos los promedios

cumplen con encontrarse dentro de éste rango deseable.

Tabla 19. Resultados ensayo de exactitud (n=7) Analito ETU PTU

N1 N3 N5 N1 N3 N5

1 76,94 67,37 82,01 102,76 69,43 82,64

2 71,67 77,98 78,21 70,13 88,29 90,40

3 79,72 74,80 86,54 100,49 80,57 93,71

4 78,13 63,13 77,39 75,09 82,57 83,87

5 78,12 75,00 80,11 75,06 81,17 84,57

6 83,87 76,19 83,89 77,41 82,35 84,90

7 84,85 74,31 84,07 86,89 77,08 85,53

Promedio por

nivel 79,04 72,68 81,75 83,97 80,21 86,52

Promedio metodología

77,82 83,57

Así mismo, no existen diferencias significativas entre las varianzas para la recuperación

en los diferentes niveles de concentración de los analitos en matriz como lo muestra la

prueba de Cochran (No significativa); sin embargo, la prueba t de comparación con un

valor especificado, utilizada para determinar la diferencia estadística entre el porcentaje

de recuperación promedio y el 100% presenta diferencias significativas para los dos

analitos en todos los niveles de concentración, excepto para PTU al nivel del límite de

Capítulo 2 95

cuantificación. Dada esta significancia, se sugiere que los resultados de cuantificación en

muestras reales sean corregidos con el porcentaje de recuperación.

2.11.5 Precisión

La precisión mide el grado de concordancia entre los resultados analíticos obtenidos de

una serie de mediciones repetidas del mismo analito realizadas en las condiciones

previstas en el método. La precisión refleja los errores aleatorios que se producen

cuando se utiliza un método. Las condiciones en que se mide la precisión se dividen,

según opinión general, en condiciones repetibles y condiciones reproducibles.

La repetibilidad de las condiciones existe cuando el mismo analista analiza muestras el

mismo día y con el mismo instrumento o utilizando los mismos materiales, como

reactivos o solventes, y ejecutando el ensayo en el mismo laboratorio. Cualquier cambio

de estas condiciones, por ejemplo, diferentes analistas, diferentes días, diferentes

instrumentos, diferentes laboratorios, implica que las condiciones de precisión intermedia

o reproducibilidad.

La precisión normalmente se mide en términos de coeficiente de variación o desviación

estándar relativa, en este caso, del porcentaje de recuperación calculado para ensayos

de recuperación. La precisión depende de la concentración y debe medirse con

concentraciones diferentes dentro del rango aceptado, normalmente en la parte baja,

media y alta de éste. Una precisión aceptable en el nivel inferior de concentración es del

20%. Con concentraciones más altas la precisión debe ser mayor, sin embargo, según el

documento SANCO, para la determinación de residuos de plaguicidas y sus metabolitos

se tiene un máximo de variabilidad del 20%. La precisión fue evaluada a tres niveles de

concentración, N1, N3 y N5 de la curva de calibración como repetibilidad y como

precisión intermedia.

• Repetibilidad

Los resultados de la ejecución de experimentos de recuperación (n=4) a cada uno de los

niveles de calibración mencionados y su coeficiente de variación se muestran a



continuación en la Tabla 20. Los coeficientes de variación se encuentran por debajo del

máximo permitido para bajas concentraciones (<20%) en todos los niveles y para los dos

analitos.

Tabla 20. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad.

% Recuperación

Promedio (n=4) CV

ETU PTU ETU PTU

N1 76,61 87,12 4,55 19,40

N3 70,82 80,21 9,58 9,85

N5 81,04 87,66 5,16 6,02


Se llevaron a cabo ensayos de recuperación en diferentes días para evaluar éste

parámetro. Los resultados se muestran en la

Tabla 21.

Tabla 21. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia

% Recuperación Promedio (n=4)

CV

ETU PTU ETU PTU

N1 79,63 77,38 7,64 9,08

N3 75,87 82,22 2,12 5,63

N5 80,56 86,35 5,14 3,16

Los anteriores resultados muestran en general una disminución del coeficiente de

variación, que expresa la variabilidad de la metodología, cuando se aumenta el nivel de

concentración, lo cual es de esperarse, pues a menores concentraciones la incertidumbre

en la medida es mayor.

Capítulo 2 97

Al comparar la dispersión de los datos obtenidos en los experimentos de repetibilidad y

precisión intermedia, es de esperarse que se observe una mayor variabilidad en los

resultados obtenidos en el ensayo de precisión intermedia, pues es realizado en días

diferentes y posiblemente hay mayores variaciones; sin embargo se observa que no hay

variaciones tan grandes entre los ensayos en días diferentes comparándolos con los

realizados el mismo día.

Como se mencionó anteriormente, se realizó la prueba estadística de Cochran y se

determinó que es posible calcular un porcentaje de recuperación típico. A partir de este

dato, se puede también obtener un coeficiente de variación típico de la metodología

como se muestra a continuación. Los resultados se observan en la

Tabla 22.

í %

Tabla 22. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método

% Recuperación Típico

CV Típico

ETU PTU ETU PTU

77,82 83,57 7,38 10,25

Los parámetros típicos de desempeño de la metodología en cuanto a exactitud y

precisión se encuentran dentro de los rangos establecidos.


La capacidad del método de permanecer inalterado ante variaciones hechas

deliberadamente según se planteó en la Tabla 11, provee un indicio de su veracidad

durante el uso como método de rutina. Se seleccionaron variables que podrían influenciar

el resultado si fuesen modificadas. Entre ellas se incluyen los tiempos de extracción,

pues de ser disminuidos podrían afectar negativamente la extracción de los compuestos;

la cantidad de extrelut o el tiempo de contacto, pues cantidades o tiempos superiores a



los establecidos podrían resultar en una mayor retención de los compuestos y la

temperatura de evaporación del metanol previa a la etapa de limpieza, pues podría

afectar la estabilidad de los analitos. Otras variables seleccionadas estaban enfocadas

hacia la evaluación de la ejecución de la metodología en el escenario instrumental, como

modificaciones en la longitud de onda de lectura o en la composición de la fase móvil,

pues influencian la separación y detección de los compuestos.

Para la evaluación de este parámetro es común emplear diseños experimentales

factoriales, que permitan evaluar el efecto de muchos factores modificados

simultáneamente. El procedimiento de Youden y Steiner es muy eficaz, ya que puede ser

evaluado el efecto de siete variables con sólo ocho experimentos. En primer lugar se

seleccionaron estratégicamente las variables que podrían influir en la recuperación de los

analitos, como se mencionó anteriormente y como se muestra en la Tabla 10. Cada

variable se estudio mediante un valor (o cualidades cuando esto no es posible)

establecido (A, B,...,G) y otro alterado (a, b,...,g) y se diseñaron ocho experimentos

(Tabla 10). Los resultados encontrados se representan con las letras s hasta la z.

A partir de los resultados se calculó el efecto de cada una de las variables promediando

los cuatro análisis que contienen la variable en su valor establecido (mayúsculas) y

aquellas que corresponden al valor alterado (minúsculas). Así, para evaluar el efecto de

la primera variable se tiene:

4 44

4 44

Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivale a “A” porque las seis

restantes variables presentes en estos cuatro resultados se anulan entre sí como

consecuencia de que existen siempre dos mayúsculas y dos minúsculas de cada

variable. Análogamente, la media de los resultados (w + x + y + z) equivalen a “a”. Al

comparar estos dos valores medios conocemos la influencia de la variable en estudio.

Estableciendo las siete comparaciones posibles (A – a,...,G – g) puede conocerse el

efecto de cada variable: Cuanto mayor sea la diferencia mayor influencia tendrá dicha

variable en el método analítico.

Capítulo 2 99

A partir de los resultados se calculó el valor absoluto de la diferencia de la media para

cada parámetro de forma individual y se comparó con el producto de la desviación

estándar del estudio de precisión como repetibilidad y la raíz de 2. Si la diferencia de la

media es menor que el valor del producto no hay diferencia significativa siendo robusto a

las modificaciones en la variable evaluada. En la

Tabla 23 se observa el efecto de las variables evaluadas sobre la robustez de la

metodología.

Tabla 23. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez.

Variable D

%R Diferencia de

las medias Influencia(*)

ETU PTU ETU PTU ETU PTU

1 Tiempo de agitación

(min) t 91,67 98,50 2,81 4,60 NS NS

2 Modo de agitación u 83,33 97,74 5,71 2,22 NS NS

3 Temperatura de

evaporación(°C) v 77,78 81,53 0,40 0,76 NS NS

4 Masa de extrelut (g) w 90,58 93,63 7,30 7,06 NS NS

5 Tiempo de contacto

(min) x 76,33 99,28 4,27 7,76 NS NS

6 Longitud de onda (nm) y 74,05 97,12 8,62 3,17 NS NS

7 Fase móvil

(Composición) z 96,04

105,4

7 9,50 4,52 NS NS

8 s 95,47 99,32 (*) Comparación con valor de comparación S√2 ETU: 9,60; PTU: 11,17.

Como se muestra en la

Tabla 23, la modificación de las variables seleccionadas no causa cambios significativos

en el porcentaje de recuperación de los analitos, por lo tanto, la metodología es robusta

para todos los parámetros evaluados. Sin embargo, existen variables para las cuales el

efecto es comparativamente elevado, como son la masa de extrelut y el tiempo de

contacto, en el caso de la PTU, lo que indica que modificaciones mayores podrían

resultar en cambios significativos en la recuperación de los analitos. Es de esperarse que



al tener una masa mayor de extrelut, las moléculas de analito se distribuyan sobre la

totalidad de la superficie en el proceso de partición liquido-liquido, haciendo que la

cantidad de diclorometano utilizado para la elución no sea suficiente para extraer todo el

analito. Así mismo, un mayor tiempo de contacto entre la fase acuosa y el adsorbente

resultaría en una retención mayor de los analitos, por lo tanto es recomendable mantener

las cantidades y tiempos establecidos en la metodología validada, no obstante, con las

variaciones realizadas el efecto es estadísticamente no significativo.

2.12 Cuantificación de los analitos en muestras comerciales

Colombia es un país agrícola en el cual el uso de plaguicidas es una herramienta

indispensable para controlar enfermedades en los cultivos. Sin embargo, el uso

inadecuado, particularmente excesivo, la aplicación en tiempos inapropiados y en cultivos

no registrados hace del uso de estas sustancias un riesgo potencial a la salud. A ello

debe sumarse que la aplicación indiscriminada causada por la práctica de monocultivo no

tecnificado y el bajo nivel educativo de las personas que manejan el producto en el

campo ocasionan un incremento en el nivel de riesgo para los agricultores y para los

consumidores finales.

En este estudio se realizó un monitoreo para determinar la presencia de ETU y PTU en

muestras de consumo. La selección del cultivo a evaluar se efectuó realizando una

revisión de la base de datos del ICA respecto a los registros nacionales de plaguicidas en

el año 2012. [33]

Como se observa en el Gráfico 9, el cultivo que tiene mayor número de productos

comerciales que contienen mancozeb o propineb registrados ante el ICA corresponde al

cultivo de papa, seguido por tomate y rosas.

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L

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Capítulo 2

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Otro aspecto que ha propiciado la expansión del tomate en el país ha sido la

especialización de unas regiones en la producción de este alimento, teniendo en cuenta

que las características del suelo sean favorables para la siembra de una determinada

variedad, lo que ha conducido a departamentos como Boyacá y Norte de Santander a ser

abanderados en la producción de este alimento.

Son dos escenarios contrastantes, pues el cultivo de la papa tiende a mantenerse de

forma artesanal mientras que el tomate migra hacia la tecnificación y empleo de nuevas

técnicas de cultivo que permiten al productor colombiano entrar en mercados

internacionales. No obstante, es bien sabido que, en ambos cultivos, un alto porcentaje

de costos de producción se encuentra relacionado con el uso de fungicidas para la

protección del cultivo y que muchas veces son sobredosificados como una manera de

hacer frente al riesgo que implica la presencia cada vez más activa de plagas y

enfermedades como una forma de asegurar la elevada inversión económica por hectárea

cultivada.

Con base en lo mencionado anteriormente, se decidió realizar el monitoreo de ETU y

PTU en muestras de papa y tomate, considerando el elevado número de productos para

protección de cultivos que contienen mancozeb o propineb y que se encuentran

registrados. Adicionalmente, dado el manejo del cultivo y la cadena productiva, es posible

que se encuentren residuos de ETU y PTU como productos de transformacion de

ditiocarbamatos, por lo tanto se decidió realizar el análisis de muestras obtenidas en el

mercado local.

Para la papa el muestreo se realizó tomando cuatro muestras ubicadas en la segunda

instancia de la cadena productiva siendo obtenidas en el mercado local, mientras que

una de las muestras fue obtenida en el mercado de Ubaté (Cuindinamarca), ubicado en

la zona cundiboyacesnse, reconocida por la producción de éste tubérculo, y la cual

corresponde a eslabón primario. En el caso del tomate, las cinco muestras evaluadas

fueron obtenidas en tiendas comercializadoras minoristas en el mercado local.

Capítulo 2 103

2.12.1 Análisis de muestras

Los resultados de los análisis de las muestras se observan en la Tabla 24. Los datos

detallados se muestran en el anexo 3.

Tabla 24. Resultados de monitoreo de residuos de ETU y PTU en muestras de papa y tomate

Muestra N° Papa Tomate

ETU PTU ETU PTU

1 < LD < LD Trazas < LD

2 < LD < LD < LD < LD

3 < LD < LD < LD < LD

4 < LD < LD < LD < LD

5 < LD Trazas < LD < LD

Como puede observarse, ninguna muestra de papa presento residuos de ETU pero se

encontró PTU a nivel de trazas en una de las muestras evaluadas (Cromatograma en la

Figura 28) , correspondiente a la obtenida en el primer eslabón de la cadena productiva;

para este caso en particular, fue posible hablar con el agricultor e indagar en cuanto a los

productos aplicados para la protección del cultivo y se encontró que el agricultor utilizó

FITORAZ ® aproximadamente 20 días antes de la cosecha, pero no se confirmó un dato

preciso de la cantidad aplicada. Este producto es un fungicida protectante y curativo

desarrollado para el control de enfermedades causadas por los hongos que está

compuesto por una mezcla de propineb al 70% y cimoxanil al 6%.

La presencia de residuos puede darse si el agricultor no tuvo en cuenta el periodo de

carencia necesario para llevar su producto al mercado local, que para la mayoría de

productos que contienen propineb al 70%, como es el caso del FITORAZ® es de 14 dias.

Otra explicación para encontrar dicho metabolito en la papa es que residuos de PTU o

propineb hayan quedado adheridos al suelo y se hayan transferido a la papa durante su

transporte y almacenamiento. Cabe resaltar que el número de muestras tomadas en este

estudio es muy reducido como para sacar una conclusión definitiva.

104

Figura señal c

El cultiv

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Es de especial importancia resaltar que las concentraciones determinadas se encuentran

por debajo del límite máximo de residuos más estricto a nivel mundial (0.01 mg/kg) y que

se requiere establecer un programa de monitoreo representativo y estructurado para

obtener datos concluyentes. Así mismo, la detección de los analitos ha sido realizada en

sistema de detección universal, como lo es el DAD por lo que los resultados obtenidos

para muestras positivas deben ser confirmados en un sistema cromatográfico con

detector selectivo de masas.

107

3. Capítulo 3. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en suelos

La evaluación del grado de contaminación del suelo por plaguicidas o sus productos de

transformación es de particular importancia debido a la transferencia de estos

contaminantes a los alimentos y a la posibilidad de migración de los mismos hacia otros

compartimentos ambientales. Así mismo, la fertilidad del suelo depende de la fauna y

flora presentes en éste, la cual puede verse afectada por sustancias exógenas

provenientes de la actividad agrícola.

Los plaguicidas o sus productos de transformación pueden cambiar las propiedades

químicas del suelo, ya que algunos se acumulan y pueden causar diversas alteraciones.

Dependiendo las propiedades fisicoquímicas, el compuesto puede sufrir diversos

procesos. La movilidad en el ambiente puede darse pos arrastre del contaminante a

través de la superficie del suelo por acción de aguas lluvias o agua de riego del cultivo,

por deriva causada en el momento de la aplicación por corrientes de viento que

depositen el plaguicida en fuentes de agua cercanas al sitio de aplicación. En el suelo,

las moléculas pueden sufrir variados procesos, tales como adsorción, absorción,

degradación, lixiviación, entre otros que pueden modificar su acción biológica y su

persistencia, así como las características fisicoquímicas del suelo alterando la fauna y

flora del mismo, y así su fertilidad.

El mancozeb y el propineb son compuestos de baja persistencia en suelos con tiempos

de vida media de entre 1 y 7 días, sin embargo, sus metabolitos, ETU y PTU pueden

persistir en el suelo de 5 a 10 semanas [25]. La importancia de su determinación radica

en que dada su elevada solubilidad y movilidad en agua, pueden potencialmente migrar

hacia aguas subterráneas. Estudios han determinado que, tras aplicaciones sucesivas de



mancozeb, la ETU puede encontrarse en bajas concentraciones en suelo, pero puede

movilizarse a cuerpos de agua superficiales y subsuperficiales por encima de los límites

de seguridad, siendo un riesgo potencial para la salud y la seguridad de los

consumidores próximos.

En este capítulo se muestran los resultados de selección y validación de una

metodología rápida, económica y ambientalmente amigable para la determinación de

ETU y PTU a nivel de trazas en suelos de uso agrícola, la cual puede ser utilizada en un

futuro como parte de programas de monitoreo para el estudio del destino ambiental de

dichos compuestos en suelos tropicales.

3.1 Equipos, materiales, estándares de referencia, solventes y reactivos

3.1.1 Estándares, solventes y reactivos

Los estándares de etilentiourea y propilentiourea empleados fueron suministrados por Dr

Ehrenstorfer con pureza mayor al 98%. Las soluciones madre fueron preparadas en

acetonitrilo y fueron almacenadas en frascos ambar a -20°C. Diluciones de 50 µg/mL de

ETU y 100 µg/mL de PTU fueron preparadas en acetonitrilo y a partir de ellas se

prepararon a diario los estándares de calibración para la inyección en HPLC utilizando

agua como disolvente.

3.1.2 Matrices de ensayo

Los suelos empleados como blancos de procedimiento fueron obtenidos en la vereda la

Hoya del departamento de Boyacá; son suelos de uso agrícola que han sido utilizados

principalmente para el cultivo de papa y arveja. En el muestreo se realizó una calicata de

un metro de profundidad tomando muestras cada 20 cm. Las propiedades del suelo

muestreado a cada profundidad se encuentran reportadas en la Tabla 25.

Capítulo 3 109

Tabla 25. Propiedades fisicoquímicas de la calicata utilizada en la validación de la metodología

Profundidad (cm)

% CO %Humedad higroscópi

ca pH

AI meq/100 g

CIC meq/100 g

%N %Arci

llas %Lim

os %Arenas

Textura

0-20 7,45 9,53 4,87 4,56 38,2 0,56 26 24 50 FArA

20-40 7,61 10,61 4,89 4,57 38,4 0,57 26 24 50 FArA

40-60 4,58 15,08 5,00 2,31 34,9 0,34 24 4 72 FArA

60-80 2,31 7,16 4,57 3,22 27,2 0,13 62 12 26 Ar

80-100 2,14 6,26 4,11 4,17 21,7 0,07 70 18 12 Ar

3.1.3 Materiales y equipos

El pesaje de las muestras se llevó a cabo en una balanza de platillo externo Mettler

Toledo y los estándares de referencia se pesaron en una balanza analítica Scaltec

SAC22. Para la optimización de la extracción se utilizó un ultrasonido marca Elma con

una frecuencia de 35 KHz, una centrifuga refrigerada marca Thermo y un agitador vortex

marca Heidolph. Se utilizó un sistema de filtración de solventes marca Millipore para la

filtración de los solventes a usar en HPLC. Para el almacenamiento de los blancos de

suelo se utilizó un congelador Frigidaire de 200 L.

Se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia marca Agilent Technlogies con

bomba cuaternaria G1310A, detector de arreglo de diodos G1365B, compartimento

termostado para columna G1316A y sistema de desgasificación G1379A de la serie 1100

acoplado a un sistema de inyección automática G1329A de la serie 1200.

3.1.4 Reactivos y solventes

Todos los solventes utilizados en este estudio fueron marca J.T. Baker grado residuos y

grado HPLC. Previo a su uso en HPLC fueron filtrados a través de una membrana de

0.45 µm. Se utilizó agua ultrapura filtrada a través de un equipo de purificación marca

Millipore.



3.1.5 Sistema instrumental

La inyección se llevó a cabo utilizando agua como solvente. La separación se realizó en

una columna analítica LiChrosphere RP-18, 250 x 4 mm., 5µm., con guardacolumna C18

utilizando una fase móvil compuesta de agua:acetonitrilo 98:2 en modo isocrático a 1.2

mL/min y 25°C. Se inyectaron 100 µL de la muestra y la detección se llevó a cabo a 232

nm.

3.2 Preparación y homogenización de la muestra – Suelos de ensayo

Las muestras blanco de suelo fueron tomadas en campo realizando calicatas de 1 m2.

Fueron secadas a temperatura ambiente, trituradas, tamizadas y almacenadas a -20°C.

3.3 Selección de la metodología – Parte experimental

Las interacciones de contaminantes con el suelo pueden ser muy variadas y

principalmente se dan con la fracción coloidal, minerales de arcilla y materia orgánica;

así, es posible predecir el comportamiento de un compuesto determinado en función de

su estructura y de las características del suelo. La ETU y la PTU son sustancias polares,

muy solubles en agua, débilmente básicas y capaces de formar puentes de hidrógeno.

Su adsorción o fijación sobre la fracción arcillosa es poco probable, dado que no tienen

características catiónicas que le permitan intercambiarse con los cationes inorgánicos de

la arcilla, como ocurre con los herbicidas parquat o diquat, aunque su pequeño tamaño

posibilita la penetración en la interlámina. En la materia orgánica, las moléculas de ETU y

PTU pueden fijarse débilmente por medio de enlaces de hidrógeno y fuerzas de vander

waals.

En cuanto a la determinación de los compuestos de interés en suelo, se han publicado

principalmente, estudios en los que se usan radiotrazadores para evaluar la presencia y

Capítulo 3 111

distribución en diferentes compartimentos ambientales ; Johannesen et.al [11] utilizó una

metodología para evaluar la degradación de ETU en suelos arenosos superficiales y sub-

superficiales de Dinamarca, en la cual empleó radiotrazadores para determinar los

tiempos de mineralización de ETU realizando una extracción con solución de cloruro de

calcio 0.01 M en relación 2:1 con la cantidad de suelo. Realizando dicho proceso obtuvo

un porcentaje de recuperación de 71.5%. Por otro lado, Violette et.al. [25], en su estudio

utilizó una metodología de extracción y derivatización precolumna con inyección en

cromatografía de gases para realizar monitoreo de ETU en suelo y agua de regiones de

producción bananera, sin embargo, este procedimiento tiene desventajas inherentes.

Este trabajo propone evaluar una nueva metodología que sea de fácil ejecución, rápida y

económica.

Para realizar el proceso de extracción es necesario considerar los factores mencionados

previamente, pues es necesario vencer las interacciones que se presentan entre las

moléculas de los compuestos de interés y el suelo para transferirlas al solvente de

extracción. Se requiere entonces un solvente de alta polaridad y capaz de formar puentes

de hidrógeno, en el cual los analitos tengan elevada solubilidad; podría realizarse la

extracción con metanol, etanol o agua; se consideró la posibilidad de utilizar mezclas

agua:metanol, puesto que dieron los mejores resultados para la extracción en frutas y

hortalizas, sin embargo, el metanol o el etanol, dada su naturaleza orgánica podrían

extraer una mayor cantidad de interferencias polares provenientes de la materia

orgánica, las cuales podrían afectar la separación en cromatografía líquida, requiriendo

involucrar una etapa de limpieza del extracto. Así pues, el solvente seleccionado fue

agua, debido a la polaridad y solubilidad de ETU y PTU y a que minimiza la posibilidad de

extraer sustancias orgánicas no deseadas.

La extracción se realizó utilizando agua como solvente de extracción y evaluando cuatro

diferentes modos de agitación con el fin de seleccionar el que proporcionara los mejores

resultados de porcentajes de recuperación de los analitos, desde el punto de vista

cuantitativo, y los extractos con menos interferencias desde el punto de vista cualitativo.

Se seleccionaron metodologías de extracción fuerte y activa como la agitación vortex o

agitación manual ejecutadas en tiempos relativamente cortos, 2 minutos, en comparación

con técnicas pasivas pero con la posibilidad de ejecución en lote, como la agitación

rotativa o la aplicación de ultrasonido, ejecutadas en tiempos más largos, 20 minutos.



Se utilizaron 20 mL de agua para realizar la extracción de los analitos a partir de 10 g de

suelo. Posteriormente se centrifugó la mezcla a 5000 rpm durante 10 minutos. 2 mL del

sobrenadante fueron filtrados a través de una membrana de 0,22 µm de tamaño de poro

para ser posteriormente inyectados en el sistema cromatográfico.

Se realizó la extracción de muestras de suelo fortificadas a 0,05 mg/kg de ETU y 0,10

mg/kg de PTU por triplicado, utilizando los cuatro modos de agitación mencionados. Se

utilizó análisis de varianza al 95 % de confianza para determinar las diferencias y prueba

de comparación de medias de tukey para seleccionar la metodología que proporcionaba

los mejores porcentajes de recuperación.

3.4 Selección de la metodología – Resultados y discusión

En la Tabla 26 se observan los resultados de porcentaje de recuperación y coeficiente de

variación para el ensayo de selección de la metodología. El análisis de varianza muestra

diferencias significativas (p<0,05) entre los cuatro grupos de datos, y la prueba de

comparación de medias de tukey evidencia que realizando la extracción con agitación

con vortex se obtienen porcentajes de recuperación estadísticamente superiores.

Tabla 26. Resultados selección de la metodología de extracción en suelos.

Modo de agitación % Recuperación CV

ETU PTU ETU PTURotativa 60,34 74,25 10,89 5,84Vortex 74,91 76,00 1,01 2,65Manual 64,57 74,40 0,65 5,62Ultrasonido 62,62 68,61 10,55 0,91

Así mismo, se puede observar que los coeficientes de variación de ETU en los ensayos

de extracción con agitación rotativa y utilizado ultrasonido son más elevados; esto debido

a la dificultad en la integración de los picos, pues se observan mas interferencias

cromatrográficas que no se resuelven de forma adecuada; estas metodologías de

Capítulo 3 113

extracción se evaluaron poniendo en contacto la muestra con el solvente de extracción

un mayor tiempo con el fin de dar la posibilidad a los analitos de migrar a la fase acuosa.

Sin embargo, el efecto logrado fue el de transferir mas interferencias al extracto, lo cual

se evidencia en los cromatogramas. La agitación rotativa tiene la gran ventaja de ofrecer

la posibilidad de hacer lotes de muestras, lo que economiza tiempo y esfuerzo, sin

embargo el porcentaje de recuperación de la ETU el más bajo; la extracción con

agitación manual y con agitador vortex presentan coeficientes de variación bajos pero

con vortex se obtienen los mejores porcentajes de recuperación, por lo que se selecciona

como metodología de extracción para la validación del método.

3.5 Validación de la metodología – Parte experimental

Se utilizó matriz blanco de suelo correspondiente al primer nivel (0-20 cm) de la calicata,

de textura Francoarcilloarenosa. Se evaluaron los parámetros mencionados a

continuación. Para todos los ensayos de recuperación, muestras blanco de suelo fueron

fortificadas al nivel de evaluación y dejadas en reposo durante una hora antes de

continuar con el proceso analítico.


Extractos de muestras blanco de suelo recolectadas entre 0 y 20 cm de profundidad

fueron inyectados en HPLC en conjunto con estándares de 0,05 µg/mL de ETU y 0.10

µg/mL de PTU disueltos en agua. Se inyectaron en una misma secuencia cromatográfica

y se determinó la presencia o ausencia de interferencias en el tiempo de retención de los

analitos.

3.5.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología

Se calculó el ruido para inyecciones de extractos de matriz blanco realizadas en el

proceso de evaluación de especificidad-selectividad al tiempo de retención de los

analitos. En la misma secuencia se inyectó una mezcla de estándares de ETU (0,05



µg/mL) y PTU (0,10µg/mL). Utilizando la respuesta en altura de las inyecciones de los

estándares se estimaron los límites de detección LD y cuantificación LC.

3

10

Para corroborar la estimación del LD, se fortificó extracto de suelo blanco a dicha

concentración y se inyectó en el sistema cromatográfico. La respuesta de los analitos

debe ser mayor que 3 veces el promedio del ruido de los blancos. Para corroborar la

estimación del límite de cuantificación, se realizó un experimento de recuperación por

triplicado a la concentración equivalente al límite de cuantificación, para evaluar su

exactitud y precisión.

3.5.3 Linealidad – Efecto matriz

Se prepararon e inyectaron en una misma secuencia los niveles 1, 3 y 5 de la curva de

calibración en solvente y en extracto de suelo blanco. Se calculó el efecto matriz como se

muestra a continuación:

%

100

Si en alguno de los niveles el porcentaje de efecto matriz supera el 120%, se considera

que existe efecto matriz y las curvas de calibración y la cuantificación deben hacerse con

estándares preparados en extracto blanco de matriz.

Se evaluó la respuesta del sistema a cinco diferentes niveles de concentración según la

Tabla 27.

Capítulo 3 115

Tabla 27. Concentraciones de los niveles de calibración

Nivel ETU (µg/mL)

ETU (mg/kg)

PTU (µg/mL)

PTU (mg/kg)

1 0.01 0.02 0.02 0.04

2 0.02 0.04 0.04 0.08

3 0.05 0.10 0.10 0.20

4 0.10 0.20 0.20 0.40

5 0.25 0.50 0.50 1.00

Se determinó estadísticamente el coeficiente de correlación lineal y la ecuación

correspondiente al ajuste lineal. Se evaluó el valor estadístico t Student para la

pendiente, el intercepto y la correlación. Utilizando el método estadístico ANOVA se

evaluaron los parámetros F para regresión y ajuste de linealidad. Los parámetros de

aceptación se encuentran consignados en la Tabla 9.

1.1.1. Exactitud

Se evaluó a los niveles 1, 3 y 5 de la curva de calibración. Muestras de suelo blanco

fueron fortificadas a los niveles de evaluación (mg/kg). Se realizó el procedimiento

analítico sobre la matriz fortificada (n=7). Se prepararon estándares de calibración a los

niveles de evaluación (µg/mL) y se calculó el porcentaje de recuperación así:

%

100

Se calculó la homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Cochran (Anexo 1).

El G calculado debe ser menor al G teórico, con un nivel de confianza del 95 %. Esta

condición acepta que el nivel de concentración no afecta la variabilidad de los

porcentajes de recuperación, por tal motivo se puede expresar el porcentaje de

recuperación típico.



3.5.4 Precisión

• Repetibilidad En un mismo día, se hicieron ensayos de recuperación (n=4) de blancos de suelo

fortificados a cada uno de los niveles de evaluación y se inyectaron en una misma

secuencia cromatográfica. Se calculó el porcentaje de recuperación para cada ensayo

(%R) el porcentaje de recuperación promedio de cada nivel (%Rprom) y el coeficiente de

variación CV.


Se realizaron ensayos de recuperación en cuatro días diferentes (D1, D2, D3 y D4, n=4,

uno cada dia), de cada uno de los niveles de evaluación. Se calculó el porcentaje de

recuperación para cada ensayo (%R), el porcentaje de recuperación promedio de cada

nivel (%Rprom) y el coeficiente de variación CV.


Siete variables fueron seleccionadas (

Tabla 28) para la evaluación de la robustez utilizando un diseño de Youden-Steiner como

se muestra en la Tabla 29.

Tabla 28. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método.

Valor nominal Valor Alterado

Variable Denominación Valor Denominación Valor Tipo de suelo A 0-20 a 80-100

Tiempo de fortificación (horas) B 1 b 72

Tiempo de Agitación (minutos) C 2 c 1

Tiempo de inyección (horas) D 2,0 d 48

Longitud de onda (nm) E 232 e 240

Fase Móvil F 98:2 f 99:1

Flujo (mL/min) G 1,2 g 1

Capítulo 3 117

Tabla 29. Diseño experimental para evaluación de la robustez.

Variable 1 2 3 4 5 6 7 8

Tipo de suelo A A A a a a a A

Tiempo de fortificación (horas) B b b B B b b B

Tiempo de Agitación (minutos) c C c C c C c C

Tiempo de inyección (horas) D d d d d D D D

Longitud de onda (nm) e E e e E e E E

Fase Móvil f f F F f f F F

Flujo (mL/min) g g G g G G g G

3.6 Validación de la metodología – Resultados y discusión

A continuación se muestran los resultados de evaluación de los parámetros de validación

para la metodología de extracción y determinación de ETU y PTU en suelo. La

metodología seleccionada es rápida, sencilla y económica de ejecutar en el laboratorio

en cuanto a tiempo e insumos y es ambientalmente amigable, pues utiliza únicamente

agua para la extracción y 98 % de agua en la separación cromatográfica.


Para evaluar la capacidad del método de responder ante los analitos objetivo en

presencia de otras sustancias coextraidas de la matriz se inyectaron extractos de suelo

blanco y se comparó la respuesta con la de la mezcla de analitos en solvente.

En la Figura 30 se muestra un cromatograma caracteristico de blanco de matriz

superpuesto con los analitos de interés inyectados en solvente; no se observan

interferencias en los tiempos de retención de los analitos, por lo tanto la metodología es

selectiva y especifica, permitiendo analizar ETU y PTU individualmente en presencia de

las demás sustancias de la matriz.

118

Figura

analito

Los res

una señ

3.6.2

A partir

la altura

Tabla 3detecc

Valida

30. Crom

s. Especifi

sultados mu

ñal clara, dif

Limites

r de la inyec

a correspon

30. Valoresión y cuan

ción de me

atograma

cidad de la

uestran que

ferenciada

de detec

cción de est

ndiente a ca

s de alturatificación

Analito

ETU PTU

todologías

obtenido

a metodolo

e el sistema

y resuelta p

cción y c

tándares de

ada pico.

a de analito

o Rango t

3,5-3,8

6,0-6,5

analíticas p

degra

para extra

ogía.

a es específ

para cada u

cuantifica

e bajas con

os individu

tr H (mUA

8 0,57

5 0,61

para la dete

adación de f

acto de su

fico y selec

uno de los c

ación de

ncentracione

uales para

A) Conc. µ

0,006

0,012

rminación d

fungicidas d

uelo blanco

ctivo, pues e

componente

la metod

es (Tabla 3

estimació

µg/L

63

25

de producto

ditiocarbam

o y mezcl

es capaz d

es de interé

dología

0), se deter

ón del límit

os de

matos

la de

e dar

s.

rmino

te de

Capítulo 3 119

Realizando extracciones de suelo blanco se calcularon los ruidos en el rango del tiempo

de retención de los analitos según se observa en la Tabla 31.

Tabla 31. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación

Ruido (mUA) 3Ruido (mUA) 10 Ruido (mUA)

Matriz ETU PTU ETU PTU ETU PTU B1 7,90E-02 7,00E-02 2,37E-01 2,10E-01 0,790 0,700

B2 4,30E-02 8,10E-02 1,29E-01 2,43E-01 0,430 0,810

B3 7,49E-02 7,76E-02 2,25E-01 2,33E-01 0,749 0,776

B4 7,91E-02 7,81E-02 2,37E-01 2,34E-01 0,791 0,781

B5 6,56E-02 4,56E-02 1,97E-01 1,37E-01 0,656 0,456

Promedio 2,05E-01 2,11E-01 6,83E-01 7,05E-01

Utilizando el promedio del ruido y los valores de altura de los estándares y sus

concentraciones se estimaron los límites de detección y cuantificación y se reportan en la

Tabla 32

Tabla 32. Límites de detección y cuantificación estimados

ETU PTU

LD Est (µg/mL) 0,002 0,004

LC Est (µg/mL) 0,007 0,014

LD Est (mg/kg) 0,004 0,009 LC Est (mg/kg) 0,015 0,029

Realizando la fortificación del extracto de suelo blanco se determinó que se hizo una

subestimación del límite de detección, pues la señal no es claramente diferenciable del

ruido, por tanto, se determinó que la concentración que proporciona una señal mayor a

tres veces el promedio del ruido corresponde a la equivalente 0.01 mg/kg de ETU y 0.02

mg/kg de PTU. El cromatograma se observa en la Figura 31.

Se realizaron los experimentos de recuperación para evaluar la exactitud y precisión y

establecer los límites de cuantificación. Los resultados se muestran en la Tabla 33.

120

Figura analito

Tabla 3PTU

Las con

cuantific

dispers

Valida

31. Cromas al límite d

33. Recupe

ncentracion

cación pue

ión de los r

ción de me

atograma ode detecció

eración al l

R1R2R3PrCV

es 0,020 m

esto que p

resultados.

todologías

obtenido alón 0.01 mg

límite de c

E%

1 7

2 7

3 8

romedio 7V 2

mg/kg ETU y

resentan b

analíticas p

degra

l fortificar g/kg ETU y

cuantificaci

ETU %rec

76,85

76,30

80,56

77,90 2,97

y 0,040 mg/

buenos los

para la dete

adación de f

el extracto0.02 mg/kg

ión 0.020 m

PTU %rec

67,13

68,52

75,00

70,22 5,98

/kg PTU se

porcentaje

rminación d

fungicidas d

o de suelo g PTU.

mg/kg ETU

e establecen

es de recup

de producto

ditiocarbam

blanco co

U y 0.040 m

n como lími

peración y

os de

matos

n los

mg/kg

ite de

baja

Capítulo 3 121

3.6.3 Linealidad –Efecto matriz En la Tabla 16Tabla 34 y en la Tabla 35 se muestran los resultados del cálculo del

porcentaje de efecto matriz para los dos analitos en los cinco niveles de calibración.

Tabla 34. Efecto matriz pata ETU.


(µg/mL) Solvente

(mUA/min)Matriz

(mUA/min)EM %

1 0,010 5,4 5,4 100,62

2 0,020 12,0 12,6 104,38

3 0,050 29,8 32,3 108,27

4 0,100 62,6 62,8 100,27

5 0,200 120,6 122,8 101,88

Tabla 35. Efecto matriz para PTU.


(µg/L)

Solvente

(mUA/min)

Matriz

(mUA/min)EM %

1 0,020 11,0 11,0 100,00

2 0,040 22,4 22,6 101,06

3 0,100 57,8 59,0 102,13

4 0,200 121,5 118,1 97,23

5 0,400 230,5 236,4 102,56

Dado que no existe efecto matiz (%EM <120) en ninguno de los niveles de calibración y

para ninguno de los dos analitos, la cuantificación puede hacerse preparando estándares

de calibración en solvente, así como la evaluación de la linealidad.

Para la determinación del rango lineal se realizaron las curvas de calibración graficando

la respuesta como área en función de la concentración y se muestran en el Gráfico 10

para la ETU y en el Gráfico 11 para la PTU. La concentración determinada como límite

122

de cuan

y para l

Gráfico

Una ve

evaluar

correlac

de la ex

Tabla 3

‐20,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

0

Area

Valida

ntificación f

a evaluació

o 10. Curva

ez establec

ron los esti

ción lineal,

xistencia de

36.

0,0

CC ETU

ción de me

fue establec

ón del rango

as de calibr

cida la varia

madores de

así como lo

e regresión

0,1

Solvente

todologías

cida como e

o lineal.

ración en s

ación de la

e la regres

os parámetr

y desvío de

Co

Curva d

LC CC ETU

analíticas p

degra

el nivel más

solvente y e

a respuesta

ión lineal: p

ros de anál

e la linealida

y = 61R

0,1

oncentración (m

de calibració

U Solvente

para la dete

adación de f

s bajo de d

en matriz E

a en funció

pendiente,

isis de vari

ad. Los resu

15,17x + 0,4341R² = 0,9996Matriz

mg/L)

n ETU

CC ETU M

rminación d

fungicidas d

ichas curva

ETU.

ón de la co

intercepto

anza para l

ultados se o

y = 607,35x ‐R² = 0,99Solven

1

0,2

Matriz

de producto

ditiocarbam

as de calibr

oncentració

y coeficien

la determin

observan en

‐ 0,0623994 te

0,2

LC ETU Matriz

os de

matos

ración

ón se

te de

ación

n la

z

C

G T

(*)

(**

A

Capítulo 3

Gráfico 11.

Tabla 36. Re

Valor de la

Pendiente

Valor del

Intercepto

Correlación

Regresión

Desvío

) Estadístico F en

*)Estadístico F en

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

0,0

Area

Curvas de

esultados

E

a

e 60

o -0

n 0,9

n S

NS

ANOVA de lineal

n ANOVA de linea

0,0 0

calibració

pruebas es

TU

07,3

0,06

9990

S(*)

S(**)

lidad no significati

alidad significativo

0,1 0,1

CC ETU Solven

ón en solve

stadísticas

PTU

580,8

0,34

0,9990

S(*)

NS(**)

ivo para H0= no e

para H0= no exis

1 0,2

Concent

Curva de ca

nte

ente y en m

s de linealid

La p

El in

Ex

Exis

No

existe regresión en

ste desvio de la lin

y = 593,4R²M

0,2

tración (mg/L)

alibración PT

CC ETU Matriz

matriz PTU.

dad en solv

Conclusio

pendiente es

diferen

ntercepto es

diferen

xiste correla

conce

ste regresió

conce

hay desvío

linentre X e Y, H

1= ex

nealidad, H1= exis

4x ‐ 0,7622² = 1

Matriz

0,3

TU

z LC

vente

ones lineali

s significativ

nte de cero

s significativ

nte de cero

ación entre

entración

ón entre el á

entración

o significativ

ealidad xiste regresión en

ste desvio de la lin

y = 580,8R² = Solv

0,3

C ETU Matriz

123

dad

vamente

vamente

área y

área y la

vo de la

tre X e Y.

nealidad.

85x + 0,3450,999vente

0,4

3

0,4



Se observan que para los dos analitos el intercepto es significativamente diferente de

cero, por lo que debe considerarse al cuantificar; la pendiente, para los dos analitos, es

diferente de cero indicando una respuesta instrumental ante el aumento de concentración

de los analitos; existe correlación lineal entre el área y la concentración al igual que

regresión lineal y no hay desvíos significativos de la linealidad en el rango evaluado.

3.6.4 Exactitud

La exactitud, evaluada como porcentaje de recuperación se determinó a tres niveles de

concentración, un nivel mínimo, equivalente al límite de cuantificación, uno intermedio y

uno máximo en el rango de linealidad establecido tanto para el ensayo de repetibilidad

como para el de precisión intermedia. En la Tabla 37 se observan los resultados de

exactitud de la metodología.

Tabla 37. Resultados ensayo de exactitud de la metodología n=7. Analito ETU PTU

n N1 N3 N5 N1 N3 N5

1 76,85 78,52 73,13 66,20 71,62 72,08

2 76,30 80,83 77,77 68,52 79,26 75,07

3 80,56 78,28 77,52 75,00 75,05 76,57

4 79,63 77,49 79,23 72,40 68,82 77,40

5 70,45 72,45 71,30 72,40 70,50 70,51

6 91,67 81,76 73,45 87,19 79,55 78,21

7 74,05 98,41 77,31 86,35 82,51 82,05

Promedio por

nivel 78,50 81,11 75,67 75,44 75,33 75,98

Promedio metodología

76,69 72,66

Para evaluar la significancia en la diferencia del porcentaje de recuperación con el 100 %

se realiza una prueba t (95% confianza, n=7) de comparación con un valor fijo. Las

ecuaciones pueden verse en el anexo 1.

Capítulo 3 125

En la Tabla 37 se observa que para la mayoría de los ensayos realizados se obtienen

porcentajes de recuperación que se encuentran por encima del 70% al igual que los

promedios. La prueba de Cochran es no significativa, por lo que se puede expresar el

porcentaje de recuperación y el coeficiente de variación típicos de la metodología. La

prueba t de comparación con un valor especificado, utilizada para determinar la

diferencia estadística entre el porcentaje de recuperación promedio y el 100% presenta

diferencias significativas para los dos analitos en todos los niveles de concentración, por

lo cual los resultados de cuantificación en muestras reales deben ser corregidos con el

porcentaje de recuperación.

3.6.5 Precisión

• Repetibilidad

El rango de concordancia entre los resultados en la ejecución de experimentos de

recuperación (n=4) a cada uno de los niveles de calibración mencionados y su

coeficiente de variación se muestran a continuación en laTabla 38. El grado de dispersión

de los resultados es bajo en todos los niveles y para los dos analitos.

Tabla 38. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad.

% Recuperación

Promedio CV

ETU PTU ETU PTU

N1 78,33 70,76 2,65 5,09

N3 78,78 73,69 1,82 6,11

N5 76,91 75,28 3,43 3,11


Se llevaron a cabo ensayos de recuperación en diferentes días (n=4) para evaluar éste

parámetro. Los resultados se muestran en la Tabla 39



Tabla 39. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia

% Recuperación

Promedio CV

ETU PTU ETU PTU

N1 78,12 78,61 11,97 12,16

N3 83,36 77,96 13,04 6,65

N5 76,46 76,46 4,60 6,39

Se observa una disminución del coeficiente de variación para los niveles de

concentración más altos, lo cual es esperado, pues la incertidumbre en la medida de

concentraciones mayores es menor.

Se observa también un aumento en la variabilidad del experimento de precisión

intermedia con respecto al de repetibilidad, evidenciada en mayores valores de

coeficiente de variación, lo cual está relacionado con el aumento de variables o de

factores no homogenizados en la prueba de reproducibilidad, pues se realiza el ensayo

en días diferentes, con preparación de estándares diferentes.

Dada la no significancia en la prueba de Chocran, se puede obtener un coeficiente de

variación típico de la metodología como se muestra a continuación. Los resultados se

observan en la Tabla 40

í %

Tabla 40. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método % Recuperación

Típico CV Típico

ETU PTU ETU PTU

78,43 75,58 8,22 7,63

Capítulo 3 127

Se observa que con la metodología propuesta se obtienen buenos porcentajes de

recuperación y la dispersión entre los datos es bastante baja, considerando el rango de

concentraciones de trabajo. los valores de porcentaje de recuperación son comparables

con los obtenidos por Johannesen et.al [11], en su estudio de degradación de ETU en

suelos, en donde se utilizó cloruro de calcio 0,01M para llevar a cabo la extracción.


Se ejecutó el experimento planteado en la Tabla 11 para evidenciar la capacidad del

método de permanecer invariable ante dichos cambios. Se evaluó el efecto del tipo de

suelo sobre el porcentaje de recuperación para determinar la variabilidad al cambiar las

características fisicoquímicas del suelo, pues pueden dificultar la extracción afectando la

recuperación. Así mismo, se ensayó el tiempo de fortificación, con el fin de asegurar que

los analitos no se quedan retenidos en gran porcentaje en el suelo por procesos de

adsorción sobre las arcillas o la materia orgánica.

Tabla 41. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez.

Ex

p Variable

Denomin

ación

%R tcalculado Influencia(*)

ETU PTU ETU PTU ETU PTU

1 Tipo de suelo t 74,19 74,22 1,222 0,490 NS NS

2 Tiempo de fortificación

(horas) u 71,00 70,48 3,497 4,596 NS NS

3 Tiempo de Agitación

(minutos) v 71,56 71,62 3,412 6,125 NS NS

4 Tiempo de inyección

(horas) w 64,67 60,90 3,199 3,273 NS NS

5 Longitud de onda (nm) x 68,45 72,99 0,074 1,061 NS NS

6 Fase Móvil y 71,81 73,68 1,690 4,414 NS NS

7 Flujo (mL/min) z 74,70 75,96 1,244 0,490 NS NS

8 s 67,77 65,24 (*) Comparación con valor de t calculado ETU: 3,73; PTU: 6,37



El tiempo de agitación en la extracción fue evaluado así como el tiempo transcurrido

entre la extracción de la muestra y la inyección del extracto, para garantizar la estabilidad

de los analitos en el extracto en condiciones de refrigeración. Parámetros instrumentales

fueron también evaluados para tener en cuenta variaciones en los equipos que pueden

presentarse en otros laboratorios que ejecuten el ensayo.

Como se muestra en la Tabla 41, la modificación de las variables seleccionadas no

causa cambios significativos en el porcentaje de recuperación de los analitos, por lo

tanto, la metodología es robusta para todos los parámetros evaluados.

Se observa que los analitos no se quedan significativamente retenidos después de 72

horas de fortificación, lo que se explica por los bajos coeficientes de adsorción que

poseen. El tipo de suelo tampoco afecta la recuperación de los analitos dada su elevada

solubilidad en agua y a que la extracción se realiza con agua a pH neutro, con lo que

aparentemente se reduce el número de interferencias en comparación a una extracción

con agua basificada, en la que pueden tenerse ácidos húmicos y fúlvicos del suelo [26].

El tiempo de inyección no afecta la recuperación de los analitos, lo cual indica que los

extractos pueden ser almacenados e inyectados, máximo, 48 horas después de ser

preparados, ya que éste fue el tiempo de evaluación. Los parámetros instrumentales

como la composición de la fase móvil, la longitud de onda de la fase móvil y el flujo no

afectan la recuperación de los analitos.

Sin embargo, cabe anotar que se realizó un experimento fuera del ensayo de robustez,

en el que se pretendía utilizar una columna de la misma fase estacionaria, C18, un poco

más corta, de 150 mm, pues se suponía que no afectaría notablemente la detección o

determinación de los analitos, sin embargo, la interferencia de la matriz cercana al tiempo

de retención de la ETU, que en la columna C18 de 250 mm se encuentra bien resuelta,

se superpone completamente con la ETU, impidiendo que se pueda realizar la

determinación.

Esta observación es de gran importancia dado que restringe la separación de los analitos

de interés a una columna de 250 mm, ya que dadas las condiciones de polaridad elevada

C

s

d

e

E

e

m

2

F1

3

E

s

b

d

Capítulo 3

e requiere u

e los interfe

evidente que

En la Figura

extracto de

mm la interf

250 mm, con

Figura 32. C50 mm y C

3.7 Detede u

En cuanto a

on muy va

biológicame

ías, sin em

una mayor

erentes de

e 150 mm n

a 32 se o

suelo blanc

ferencia no

n lo cual im

CromatograC18 250 mm

erminacuso agrí

al destino y

riados. Sue

nte degrad

mbargo, ot

longitud de

la matriz, c

no son sufic

bservan los

co en las d

se resuelv

posibilita la

ama de extm comparad

ción de ícola

permanenc

e [35], en s

ada con tie

tras publica

e lecho crom

como de los

cientes para

s cromatog

dos columna

ve y tiene u

a determinac

tractos de dos con in

residuo

cia de ETU

su revisión

empos de

aciones co

matográfico

s analitos, p

a lograrlo.

gramas cor

as; puede v

una mayor

ción de ETU

suelo blanyección de

os de ET

y PTU en

reporta qu

vida media

omo la de

para permi

para así log

rrespondien

verse que e

respuesta q

U.

nco inyectae estándar

TU y PT

suelos, los

e la ETU e

a cortos, de

Johannese

itir la intera

rar la separ

ntes a inye

en la colum

que en la c

ados en coen solvent

TU en su

resultados

en suelo es

e aproxima

en et.al [1

129

cción, tanto

ración, y es

ecciones de

mna de 150

columna de

lumna C18te.

uelos

publicados

s química y

adamente 7

1]., reporta

9

o

s

e

0

e

8

s

y

7

a



tiempos de descomposición de ETU en suelo a diferentes profundidades, que van desde

2 horas hasta 109 días, siendo mayor el tiempo de vida media a mayores profundidades,

potenciando así el riesgo de contaminación de aguas sub-superficiales y subterráneas.

En el suelo, la ETU se convierte a etilenurea (EU); ETU y EU pueden ser biológicamente

mineralizadas y convertidas en CO2 en suelos no estériles; el tiempo de vida media por

mineralización es de alrededor de 22 dias. Debido a su bajo coeficiente de adsorción y

elevada solubilidad en agua, ETU y PTU pueden ser lixiviadas o moverse a través del

perfil del suelo con facilidad en suelos húmedos, sin embargo, pueden quedarse

inmovilizadas en suelos secos.

Debido a la posibilidad de contaminación de los alimentos, principalmente de los

tuberculos como la papa, que está en contacto directo y permanente con el suelo, se

planteó la necesidad evaluar la presencia de ETU y PTU en suelos utilizados en cultivo

de papa.

Se recolectaron cuatro muestras en dos zonas de cultivo: una en el departamento de

Boyacá y tres en el departamento de Cundinamarca. Las muestras fueron tomadas en la

zona superficial del suelo, de 0 a 10 cm, transportadas, secadas a temperatura ambiente

para inmovilizar los compuestos y eliminar la presencia de microorganismos,

minimizando la posibilidad de degradación, y posteriormente fueron almacenadas a -

20ºC.

3.7.1 Zona de muestreo

Las muestras fueron recolectadas en zonas que han sido utilizadas para el cultivo de

papa y arveja alternadamente en los departamentos de Boyacá y Cundinamarca. En el

departamento de Cundinamarca la zona de cultivo fue dividida en tres parcelas debido a

las diferentes características geográficas del terreno (Figura 33). En las zonas 1 y 3, el

suelo es de características similares, por su apariencia, posee un elevado contenido de

materia orgánica y retiene bastante agua, mientras que el suelo de la zona 2, que

corresponde a una ladera, tiene características muy diferentes, pues su color amarillento

Capítulo 3 131

y grisáceo es evidencia inicial de su naturaleza arcillosa. En esta zona de cultivo se llevó

a cabo una aplicación de Fitoraz ® 20 días antes de la fecha de muestreo y dos días

antes se presentó un episodio de lluvia fuerte.

Figura 33. Zonas de muestreo Cundinamarca. El suelo recolectado en el departamento de Boyacá se tomó de una parcela individual

homogénea e igualmente se reportó una aplicación reciente de Fitoraz®.

Se llevó a cabo la determinación de residuos de ETU y PTU en las muestras

recolectadas utilizando la metodología validada. Los resultados se muestran en la Tabla

42. Los datos detallados se muestran en el anexo 3.

Tabla 42. Resultados de análisis de muestras de suelo de uso agrícola Muestra N° ETU PTU

1 < LD < LD

2 < LD < LD

3 < LD < LD

4 < LD Trazas

Como puede observase, ninguna de las muestras analizadas presento residuos de ETU

en concentraciones por encima del límite de detección de la metodología; sin embargo,

para una de las muestras analizadas se encontró una señal en el tiempo de retención de

la PTU determinando su concentración nivel de trazas.

132

Figura (Cundide está

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PTU po

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or la aplicac

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gión de Uión con ad

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bientales o

suelo y agu

estreado en

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Ubaté ición

contró

tados

pineb

nte se

%, sin

tó un

o por

hacia

ua en

n las

mg/kg,

Capítulo 3 133

apenas por encima del límite de detección de su metodología; el muestreo se llevó a

cabo durante la estación seca y se realizó en una zona donde semanalmente se hace

una aplicación de mancozeb por aspersión. No obstante, concentraciones elevadas de

ETU, por encima de los límites de seguridad fueron encontradas en aguas superficiales y

sub superficiales, lo que indica que este compuesto puede movilizase a través de los

diferentes compartimentos ambientales, incluso si no se tienen eventos de lluvia. Entre

los procesos que pueden estar involucrados se encuentran la movilización sobre

partículas de suelo causada por la erosión de partículas de suelo en las que pudiera

estar adsorbido mancozeb, o procesos de escorrentía superficial, descartando los

procesos de lixiviación a través del perfil del suelo, debido a que en aguas subterráneas

la ETU no se encontró por encima de los límites de detección.

En zonas de cultivo de papa, donde se practica el monocultivo y se aplican cantidades

elevadas de productos que contienen propineb en elevados porcentajes es necesario

realizar monitoreos para establecer la presencia de ETU y PTU en los diferentes

compartimentos ambientales, puesto que puede movilizarse por diferentes procesos.

135

4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones Con el fin de seleccionar una metodología a validar para el análisis de ETU y PTU en

frutas y hortalizas a nivel de trazas, se evaluaron cuatro metodologías con diferentes

enfoques: extracción con solventes de baja polaridad, dispersión de matriz en fase solida,

método QuEChERS y extracción con solventes polares y posterior limpieza con partición

liquido-liquido. Para la selección se tuvo en cuenta la exactitud en la recuperación de los

analitos, la sensibilidad para la detección de bajas concentraciones y la confiabilidad para

su ejecución como método de rutina. La metodología de extracción con solventes polares

y posterior limpieza con partición liquido-liquido cumplió con todos los parámetros de

evaluación, por lo tanto fue seleccionada para la optimización.

En el proceso de optimización cuatro parámetros fueron evaluados para obtener los

mejores porcentajes de recuperación: el efecto del pH, la adición de sal y el volumen de

diclorometano requerido para eluir los analitos en la etapa de limpieza, y la composición

del extractante en la etapa de extracción. El pH no tiene efecto significativo en la

recuperación de ETU, pero afecta la recuperación de PTU, siendo mayores los

porcentajes de recuperación a pH 9. La adición de sal no tiene efecto y el volumen

mínimo necesario para eluir los analitos en la partición fue de 10 mL. Se observaron

diferencias significativas al disminuir o eliminar el metanol en el extractante, obteniendo

los mayores porcentajes de recuperación con la relación MeOH:H2O 3:1.

La metodología optimizada fue validada y se determinó que es específica, selectiva,

precisa y exacta, con porcentajes de recuperación de 77,82% para ETU y 83,57% para

PTU, y coeficientes de variación de 7,38% y 10,25% respectivamente. Se determinó que

la técnica presenta respuesta lineal en el rango de 0.01 – 0.25 µg/mL para ETU y 0.02 –

0.50 µg/mL para PTU, siendo la concentración más baja la equivalente al límite de



cuantificación de la metodología (0.01 mg/kg ETU y 0.02 mg/kg PTU). La metodología es

robusta para las variables evaluadas y no se observó efecto matriz en la respuesta para

ningún analito en todo el rango de concentración evaluado. Los límites de detección

establecidos son 0.003 mg/kg ETU y 0.006 mg/kg PTU, con lo cual se concluye que la

metodología es adecuada para el objetivo propuesto.

Así mismo, con base en las propiedades fisicoquímicas de ETU y PTU se seleccionó

agua como solvente para realizar la extracción de dichos analitos en muestras de suelo,

realizando una posterior filtración e inyección en HPLC. Cuatro diferentes modos de

agitación fueron puestos a prueba, siendo la agitación con vortex durante 2 minutos la

que proporcionó los mejores resultados.

La metodología fue validada y resultó ser específica y selectiva para los analitos de

interés. Los limites de detección determinados fueron 0.01 mg/kg para ETU y 0.02 mg/kg

para PTU, los cuales son apropiados para la utilización como metodología en estudios de

monitoreo ambiental. La concentración más baja a partir de la cual se obtienen

resultados de cuantificación precisos y exactos es de 0.02 mg/kg para ETU y 0.04 mg/kg

para PTU, y el rango lineal fue evaluado hasta 0.20 mg/kg de ETU y 0.40 mg/kg de PTU.

La exactitud, medida como porcentaje de recuperación corresponde a 78.43% para ETU

y 75.58 % para PTU con una variación del 8.22% y 7.63 % respectivamente. La

metodología fue puesta a prueba para verificar su robustez, siendo evaluados

parámetros como el tiempo de agitación en la extracción, el tiempo transcurrido entre la

extracción y la inyección y el transcurrido entre la fortificación y la inyección, encontrando

que la metodología es robusta a todos los factores avaluados, presentando un efecto

neto no significativo para cada uno de ellos.

4.2 Recomendaciones

Utilizando la metodología validada se efectuó la determinación de residuos de ETU y

PTU en muestras de papa y tomate de consumo interno, encontrando la presencia de

Conclusiones 137

PTU a nivel de trazas en una muestra de papa correspondiente a la comercialización

primaria, además de la presencia de ETU a nivel de trazas en una muestra de tomate. Se

realizó la confirmación de la presencia de señales con adición estándar. Se sugiere

plantear un programa de monitoreo más extenso para obtener resultados concluyentes

en cuanto a la exposición de los consumidores colombianos a estos compuestos de

toxicidad apreciable. Así mismo, se realizó la determinación de la concentración de ETU

y PTU en muestras de suelo de uso agrícola empleado para el cultivo de papa,

determinando que para los cuatro suelos evaluados ETU y PTU se encontraron por

debajo del límite de detección de la metodología. Sin embargo, es recomendable realizar

un programa de monitoreo que involucre muestreos a lo largo del perfil del suelo y

muestras de los cuerpos de agua aledaños al cultivo, para evaluar la movilidad de estos

analitos potencialmente peligrosos.

139

Anexo 1: Cálculos estadísticos

1.1. Regresión por mínimos cuadrados ordinaria

Promedios

Sumas de cuadrados

Modelo de regresión

Estimadores de a y b

Varianza residual 2

Desviación estándar residual 2



Varianza de la pendiente y del intercepto

1

Desviación estándar de la pendiente

Desviación estándar del intercepto

Varianza de un estimado Y(x) 1

Límites de confianza para un estimado Y(x) ,

Varianza para un estimado X 1 1

Límites de confianza para un estimado X ,

Notación:

Las sumatorias tienen en cuenta todos los términos, i= 1, 2 ,…,n

n= número de puntos de calibración

xi= Concentración conocida(u otra variable independiente)

yi= Señal medida a xi

Sxx= Suma de los residuales cuadrados de x

Anexos 141

141

Syy= Suma de los residuales cuadrados de y

Sxy= Suma de los residuales del producto curzado de x*y

t(f,p)= factor t de student (dos colas) para n‐2 grados de libertad y probabilidad p

m= numero de replicas

y*= valor de la señal y/o promedio de señales yk para k=1…n, donde:

Y=valor esperado para un xi

X=concentración estimada para un y*

1.2. Pruebas de hipótesis

1.2.1. Test de student para la pendiente

H0= La pendiente es estadísticamente igual a cero

β=0

H1= La pendiente es estadísticamente diferente de cero

β≠0

Estimación t calculado:

Decisión: Si el valor de t(gl;p) <tc, entonces la hipótesis nula se rechaza y la pendiente es significativamente diferente de cero.



1.2.2. Test de student para el intercepto

H0= El intercepto es significativamente igual a cero

α=0

H1= El intercepto es significativamente diferente de cero

α≠0

Estimación t calculado:

Decisión: Si el valor de tc, <t(gl;p) entonces la hipótesis nula se acepta, el intercepto es estadísticamente igual a cero.

1.2.3. Coeficiente de correlación

Estimación t calculado | |√

√

H0: No existe correlación significativa entre x y y (concentración y respuesta)

H1: Existe correlación entre x y y (concentración y respuesta)

1.3. Análisis de varianza ANOVA

Suma de cuadrados en x ∑

Anexos 143

143

Suma de cuadrados en y ∑

Sumas de cuadrados de la regresión

Suma de cuadrados entre concentraciones ∑ ∑ ∑

Suma de cuadrados del error puro ∑ ∑

Suma de cuadrados para linealidad

Notación

n= Numero de puntos de calibración

m= Numero de repeticiones por nivel

k=

xi= Concentración conocida(u otra variable independiente)

yi= Señal medida a xi

1.4.1. Determinación de coeficientes f ANOVA

FV GL SC CM Fc Ft

Regresión 1 SCR (1;n‐k;α)

Linealidad k‐2 SCL (k‐2;n‐k;α)



Error puro n‐k SCEp

Hipótesis para regresión:

H0= No hay regresión significativa en la curva de calibración

H1= Hay regresión significativa en la curva de calibración

Si Ft <Fc se rechaza Ho, es decir, existe regresión

Hipótesis para desvío de linealidad

H0= No hay desvío de la linealidad

H1= Hay desvío de la linealidad

Si Fc< Ft se acepta H0,es decir, la curva no presenta desvío de la linealidad.

1.5. Determinación del coeficiente de correlación lineal

1.6. Determinación de Homogeneidad de varianza Cochcran.

Anexos 145

145

Esta prueba mide la variabilidad de la exactitud en el rango de concentración escogido para la validación.

Tiene como hipótesis Nula (Ho) = El nivel de concentración no afecta la variabilidad en los resultados de los porcentajes de recuperación.

Si Gcalc<Gtab, La exactitud del sistema no se ve afectada por el nivel de calibración.

La ecuación para calcular del factor G es:

1 2 3 4 5

Donde

S2mayor= es la varianza mayor

S2(1‐5)=son las varianzas para cada concentración

147

Anexo 2: Datos Validación

Tabla 43. Linealidad ETU Solvente. Frutas y hortalizas.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X

) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-

Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro

m Yj Yj2

N1 1 3,6 10,0 100 13 36 3,259 0,341260 0,116458 -76 5776 10,4721

5776 3,567 11 114 N1 2 3,6 10,0 100 13 36 3,259 0,341260 0,116458 -76 5776 10,4721

N1 3 3,5 10,0 100 12 35 3,259 0,241260 0,058206 -76 5776 7,4035

N2 1 7,6 20,0 400 58 152 7,380 0,220042 0,048418 -66 4356 2,9816

4356 7,600 23 520 N2 2 7,6 20,0 400 58 152 7,380 0,220042 0,048418 -66 4356 2,9816

N2 3 7,6 20,0 400 58 152 7,380 0,220042 0,048418 -66 4356 2,9816

N3 1 18,9 50,0 2500 357 945 19,744 -0,843614 0,711684 -36 1296 -4,2728

1296 18,933 57 322

6 N3 2 18,9 50,0 2500 357 945 19,744 -0,843614 0,711684 -36 1296 -4,2728

N3 3 19 50,0 2500 361 950 19,744 -0,743614 0,552961 -36 1296 -3,7664

N4 1 40,5 100,0 10000 1640 4050 40,350 0,150294 0,022588 14 196 0,3725

196 40,600 122 148

35 N4 2 40,5 100,0 10000 1640 4050 40,350 0,150294 0,022588 14 196 0,3725

N4 3 40,8 100,0 10000 1665 4080 40,350 0,450294 0,202765 14 196 1,1160

N5 1 100,8 250,0 62500 10161 25200 102,168 -1,367982 1,871375 164 26896 -1,3390

26896 102,200 307 940

04 N5 2 102,9 250,0 62500 10588 25725 102,168 0,732018 0,535850 164 26896 0,7165

N5 3 102,9 250,0 62500 10588 25725 102,168 0,732018 0,535850 164 26896 0,7165



Sum

a 5,19E+02 1290,00 226500 3,76E+04 9,22E+04 5,19E+02 -9,24E-14 5,60E+00 0,00E+00 1,16E+05 2,69E+01 3,85E+04 1,73E+02

5,19E+02

1,13E+0

5 Promed

io 3,46E+01 86,00 15100 2,50E+03 6,15E+03 3,46E+01 -6,16E-15 3,74E-01 0,00E+00 7,70E+03 1,80E+00 7,70E+03 3,46

E+01 1,04E+02

2,25E+0

4

Tabla 44. Linealidad PTU Solvente. Frutas y hortalizas.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X



m Yj Yj2

N1 1 6,2 20 400 38 124 4,481 1,719 2,954 -152 23104 38,3492

4356 6,167 19 342 N1 2 6,1 20 400 37 122 4,481 1,619 2,620 -152 23104 36,1178

N1 3 6,2 20 400 38 124 4,481 1,719 2,954 -152 23104 38,3492

N2 1 13,5 40 1600 182 540 12,701 0,799 0,638 -132 17424 6,2875

2116 13,667 41 168

1 N2 2 13,7 40 1600 188 548 12,701 0,999 0,997 -132 17424 7,8621

N2 3 13,8 40 1600 190 552 12,701 1,099 1,207 -132 17424 8,6494

N3 1 35,1 100 10000 1232 3510 37,361 -2,261 5,114 -72 5184 -6,0527

196 35,500 107 113

42 N3 2 35,4 100 10000 1253 3540 37,361 -1,961 3,847 -72 5184 -5,2497

N3 3 36 100 10000 1296 3600 37,361 -1,361 1,853 -72 5184 -3,6438

N4 1 76,5 200 40000 5852 15300 78,461 -1,961 3,847 28 784 -2,4997

12996 76,767 230 530

38 N4 2 76,9 200 40000 5914 15380 78,461 -1,561 2,438 28 784 -1,9899

N4 3 76,9 200 40000 5914 15380 78,461 -1,561 2,438 28 784 -1,9899

N5 1 198 500 250000 39204 99000 201,761 -3,761 14,146 328 107584 -1,8642

171396 202,667 608 369

664 N5 2 200 500 250000 40000 100000 201,761 -1,761 3,102 328 107584 -0,8729

N5 3 210 500 250000 44100 105000 201,761 8,239 67,878 328 107584 4,0835

Suma 1,00E+03 2580 906000 1,45E+05 362720 1,00E+03 0,000 116,032 0 4,62E+05 1,16E+02 191060 3,35

E+02 1,00E+03

4,36E+0

5 Promed

io 6,70E+01 172 60400 9,70E+03 24181 6,70E+01 0,000 7,735 0 3,08E+04 7,70E+00 38212 6,70

E+01 2,01E+02

8,72E+0

4

Anexos 149

149

Tabla 45. Linealidad ETU Matriz. Frutas y hortalizas.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X



m Yj Yj2

N1 1 3,6 10,00 100 13 36 3,122 0,48 0,23 -76 5776 15,31

5776 3,60 11 117 N1 2 3,6 10,00 100 13 36 3,122 0,48 0,23 -76 5776 15,31

N1 3 3,6 10,00 100 13 36 3,122 0,48 0,23 -76 5776 15,31

N2 1 7,8 20,00 400 61 156 7,327 0,47 0,22 -66 4356 6,45

4356 7,80 23 548 N2 2 7,8 20,00 400 61 156 7,327 0,47 0,22 -66 4356 6,45

N2 3 7,8 20,00 400 61 156 7,327 0,47 0,22 -66 4356 6,45

N3 1 18,8 50,00 2500 353 940 19,942 -1,14 1,30 -36 1296 -5,73

1296 18,80 56 3181 N3 2 18,8 50,00 2500 353 940 19,942 -1,14 1,30 -36 1296 -5,73

N3 3 18,8 50,00 2500 353 940 19,942 -1,14 1,30 -36 1296 -5,73

N4 1 41 100,00 10000 1681 4100 40,967 0,03 0,00 14 196 0,08

196 41,00 123 15129 N4 2 41,1 100,00 10000 1689 4110 40,967 0,13 0,02 14 196 0,32

N4 3 40,9 100,00 10000 1673 4090 40,967 -0,07 0,00 14 196 -0,16

N5 1 105,9 250,00 62500 11215 26475 104,042 1,86 3,45 164 26896 1,79

26896 104,20 313 977

19 N5 2 100,9 250,00 62500 10181 25225 104,042 -3,14 9,87 164 26896 -3,02

N5 3 105,8 250,00 62500 11194 26450 104,042 1,76 3,09 164 26896 1,69

Suma 5,26E+02 1290,00 226500 3,89E+04 93846 5,26E+02 0,00 21,71 0 115560 48,80 38520 175,4

0 5,26E+02

1,17E+0

5 Promed

io 3,51E+01 86,00 15100 2,59E+03 6256 3,51E+01 5,95E-15 1,45E+00 0 7704 3,25 7704 35,08 1,05

E+02

2,33E+0

4



Tabla 46. Linealidad PTU Matriz. Frutas y hortalizas.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X



m Yj Yj2

N1 1 6,1 20,00 400 37 122 3,524 2,576 6,63 -152 23104 73,08

4356 6,17 19 342 N1 2 6 20,00 400 36 120 3,524 2,476 6,13 -152 23104 70,24

N1 3 6,4 20,00 400 41 128 3,524 2,876 8,27 -152 23104 81,59

N2 1 13,7 40,00 1600 188 548 12,218 1,482 2,20 -132 17424 12,13

2116 13,83 42 1722 N2 2 13,9 40,00 1600 193 556 12,218 1,682 2,83 -132 17424 13,77

N2 3 13,9 40,00 1600 193 556 12,218 1,682 2,83 -132 17424 13,77

N3 1 36,9 100,00 10000 1362 3690 38,298 -1,398 1,95 -72 5184 -3,65

196 36,87 111 12232 N3 2 37,1 100,00 10000 1376 3710 38,298 -1,198 1,43 -72 5184 -3,13

N3 3 36,6 100,00 10000 1340 3660 38,298 -1,698 2,88 -72 5184 -4,43

N4 1 78,1 200,00 40000 6100 15620 81,764 -3,664 13,42 28 784 -4,48

12996 76,97 231 53315 N4 2 76,9 200,00 40000 5914 15380 81,764 -4,864 23,66 28 784 -5,95

N4 3 75,9 200,00 40000 5761 15180 81,764 -5,864 34,39 28 784 -7,17

N5 1 206,1 500,00 250000 42477 103050 212,163 -6,063 36,76 328 107584 -2,86

171396 214,13 642 412

678 N5 2 216,4 500,00 250000 46829 108200 212,163 4,237 17,95 328 107584 2,00

N5 3 219,9 500,00 250000 48356 109950 212,163 7,737 59,86 328 107584 3,65

Suma 1,04E+03 2580,00 906000 1,60E+05 380470 1,04E+03 0,000 221,20 0 4,62E+05 238,56 191060 347,9

7 1,04E+03

4,80E+0

5 Promed

io 6,96E+01 172,00 60400 1,07E+04 25365 6,96E+01 0,000 14,75 0 3,08E+04 15,90 38212 69,59 2,09

E+02

9,61E+0

4

Anexos 151

151

Tabla 47. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en solvente. Frutas y hortalizas.

Compuesto Sy/X2 Sy/x Sa Sb tCalculado

a tteorico

a Ho tCalculado b

tteorico b Ho tCalculado

r tteorico

r Ho

PTU 8,93 2,99 1,08 0,004 3,46 2,16 Rechazada 93,53 2,16 Rechazada 93,53 2,16 Rechazada

ETU 0,43 0,66 0,24 0,002 3,63 2,16 Rechazada 213,38 2,16 Rechazada 213,38 2,16 Rechazada

Tabla 48. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en matriz. Frutas y hortalizas.

Compuesto Sy/X2 Sy/x Sa Sb tCalculado

a tteorico

a Ho tCalculado b

tteorico b Ho tCalculado

r tteorico

r Ho

PTU 17,02 4,12 1,49 0,006 3,47 2,16 Rechazada 71,64 2,16 Rechazada 71,64 2,16 Rechazada

ETU 1,67 1,29 0,47 0,004 2,32 2,16 Rechazada 110,62 2,16 Rechazada 110,62 2,16 Rechazada



Tabla 49. Análisis de varianza ETU solvente. Frutas y hortalizas.

Fuente de Variación Grados

de Libertad

Suma de Cuadrados

Media de Cuadrados Fcalculado Fteorico Resultado

Regresión 1 19627,22 19627,22 65134,58 4,96 Rechazada

Error 13 5,60

Desvío de linealidad 3 2,59 0,86 2,87 3,71 Aceptada

Error puro 10 3,01 Total 14 47624,8

Tabla 50. Análisis de varianza PTU solvente. Frutas y hortalizas.

Fuente de Variación Grados

de Libertad

Suma de Cuadrados

Media de Cuadrados Fcalculado Fteorico Resultado

Regresión 1 78081,85 78081,85 9379,58 4,96 Rechazada

Error 13 116,03

Desvío de linealidad 3 32,78 10,93 1,31 3,71 Aceptada

Error puro 10 83,25 Total 14 189980,4

Anexos 153

153

Tabla 51. Linealidad ETU Solvente. Suelo.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X



m Yj Yj2

N1 1 5,3 10,00 100 28 53 6,011 -0,71 0,51 -66 4356 -11,83

4356,00 5,40 16,20 262,44 N1 2 5,6 10,00 100 31 56 6,011 -0,41 0,17 -66 4356 -6,84

N1 3 5,3 10,00 100 28 53 6,011 -0,71 0,51 -66 4356 -11,83

N2 1 12,2 20,00 400 149 244 12,085 0,12 0,01 -56 3136 0,95

3136,00 12,03 36,10 1303,21 N2 2 11,9 20,00 400 142 238 12,085 -0,18 0,03 -56 3136 -1,53

N2 3 12 20,00 400 144 240 12,085 -0,08 0,01 -56 3136 -0,70

N3 1 29,8 50,00 2500 888 1490 30,305 -0,51 0,26 -26 676 -1,67

676,00 29,83 89,50 8010,25 N3 2 30,1 50,00 2500 906 1505 30,305 -0,21 0,04 -26 676 -0,68

N3 3 29,6 50,00 2500 876 1480 30,305 -0,71 0,50 -26 676 -2,33

N4 1 60,2 100,00 10000 3624 6020 60,672 -0,47 0,22 24 576 -0,78

576,00 62,63 187,90

35306,4

1 N4 2 63,8 100,00 10000 4070 6380 60,672 3,13 9,78 24 576 5,16

N4 3 63,9 100,00 10000 4083 6390 60,672 3,23 10,42 24 576 5,32

N5 1 119,8 200,00 40000 14352 23960 121,407 -1,61 2,58 124 15376 -1,32

15376,00 120,58

361,74

130855,83

N5 2 120,9 200,00 40000 14617 24180 121,407 -0,51 0,26 124 15376 -0,42

N5 3 121,04 200,00 40000 14651 24208 121,407 -0,37 0,13 124 15376 -0,30

Suma 6,91E+02 1140,00 159000 5,86E+04 96497 6,91E+02 0,00 25,43 0 7,24E+04 -28,79 24120,00 230,4

8 691,4

4

175738,14

Promed

io 4,61E+01 76,00 10600 3,91E+03 6433 4,61E+01 0,00 1,70 0 4,82E+03 -1,92 4824,00 46,10 138,2

9

35147,6

3



Tabla 52. Linealidad PTU Solvente. Suelo.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X



m Yj Yj2

N1 1 10,8 20,00 400 125 224 12 -0,76 0,58 -132 17424 -6,37

3136 11 33 1082 N1 2 11,2 20,00 400 117 216 12 -1,16 1,35 -132 17424 -9,71

N1 3 10,9 20,00 400 119 218 12 -1,06 1,13 -132 17424 -8,88

N2 1 22,4 40,00 1600 502 896 24 -1,18 1,39 -112 12544 -5,00

1296 22 67 4517 N2 2 21,6 40,00 1600 467 864 24 -1,98 3,92 -112 12544 -8,39

N2 3 23,21 40,00 1600 539 928 24 -0,37 0,14 -112 12544 -1,56

N3 1 58 100,00 10000 3364 5800 58 -0,43 0,18 -52 2704 -0,74

576 58 173 30068 N3 2 57,8 100,00 10000 3341 5780 58 -0,63 0,40 -52 2704 -1,08

N3 3 57,6 100,00 10000 3318 5760 58 -0,83 0,69 -52 2704 -1,42

N4 1 122,1 200,00 40000 14908 24420 117 5,59 31,20 48 2304 4,79

15376 121 364 132787 N4 2 120 200,00 40000 14400 24000 117 3,49 12,15 48 2304 2,99

N4 3 122,3 200,00 40000 14957 24460 117 5,79 33,47 48 2304 4,97

N5 1 230,7 400,00 160000 53222 92280 233 -1,98 3,94 248 61504 -0,85

104976 231 692 478311 N5 2 229,9 400,00 160000 52854 91960 233 -2,78 7,75 248 61504 -1,20

N5 3 231 400,00 160000 53361 92400 233 -1,68 2,84 248 61504 -0,72

Suma 1,33E+03 2280,00 636000 215594 370206 1330 0,00 101,11 0 289440 -33,18 125360 443 1330 646

765 Promed

io 8,86E+01 152,00 42400 14373 24680 89 0,00 6,74 0 19296 -2,21 25072 89 266 129

353

Anexos 155

155

Tabla 53. Linealidad ETU Matriz. Suelo.

Nivel Area (Y)

Conc (µg/L)(X



m Yj Yj2

N1 1 4,5 10,00 100 20 45 49,245 -44,7 2002,1 -12 144 -90,86

144,00 5,43 16 266 N1 2 6,2 10,00 100 38 62 49,245 -43,0 1852,9 -12 144 -87,41

N1 3 5,6 10,00 100 31 56 49,245 -43,6 1904,9 -12 144 -88,63

N2 1 12,56 20,00 400 158 251 47,530 -35,0 1222,9 -2 4 -73,57

4,00 12,56 38 1420 N2 2 12,12 20,00 400 147 242 47,530 -35,4 1253,9 -2 4 -74,50

N2 3 13 20,00 400 169 260 47,530 -34,5 1192,3 -2 4 -72,65

N3 1 32,7 50,00 2500 1069 1635 42,386 -9,7 93,8 28 784 -22,85

784,00 32,30 97 9390 N3 2 32,1 50,00 2500 1030 1605 42,386 -10,3 105,8 28 784 -24,27

N3 3 32,1 50,00 2500 1030 1605 42,386 -10,3 105,8 28 784 -24,27

N4 1 64,3 10,00 100 4134 643 49,245 15,1 226,6 -12 144 30,57

144,00 62,80 188 35495 N4 2 62,8 10,00 100 3944 628 49,245 13,6 183,7 -12 144 27,53

N4 3 61,3 10,00 100 3758 613 49,245 12,1 145,3 -12 144 24,48

N5 1 123,4 20,00 400 15228 2468 47,530 75,9 5756,2 -2 4 159,62

4,00 122,84 369 135

814 N5 2 123,02 20,00 400 15134 2460 47,530 75,5 5698,7 -2 4 158,82

N5 3 122,11 20,00 400 14911 2442 47,530 74,6 5562,1 -2 4 156,91

Suma 7,08E+02 330,00 10500 6,08E+04 15016 7,08E+02 0,0 27307,2 0 3,24E+03 -1,08 1080,00 235,9

4 7,08E+02

1,82E+0

5 Promed

io 4,72E+01 22,00 700 4,05E+03 1001 4,72E+01 0,0 1820,5 0 2,16E+02 -0,07 216,00 47,19 1,42

E+02

3,65E+0

4

Tabla 54. Linealidad PTU Matriz. Suelo.



Nive

l Area (Y) Conc

(µg/L)(X)

X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-Ycal)/Ycal

(Xi-XP)2 Ypro

m Yj Yj2

N1 1 11,20 20,00 400 125 224 94,035 -82,8 6861,6 -24 576 -88,09

4,00 10,97 33 1082 N1 2 10,80 20,00 400 117 216 94,035 -83,2 6928,0 -24 576 -88,51

N1 3 10,90 20,00 400 119 218 94,035 -83,1 6911,4 -24 576 -88,41

N2 1 22,32 40,00 1600 498 893 90,201 -67,9 4607,9 -4 16 -75,26

324,00 22,64 68 4613 N2 2 22,70 40,00 1600 515 908 90,201 -67,5 4556,4 -4 16 -74,83

N2 3 22,90 40,00 1600 524 916 90,201 -67,3 4529,5 -4 16 -74,61

N3 1 59,90 100,00 10000 3588 5990 78,701 -18,8 353,5 56 3136 -23,89

6084,00 59,03 177 31364 N3 2 59,30 100,00 10000 3516 5930 78,701 -19,4 376,4 56 3136 -24,65

N3 3 57,90 100,00 10000 3352 5790 78,701 -20,8 432,7 56 3136 -26,43

N4 1 118,40 20,00 400 14019 2368 94,035 24,4 593,7 -24 576 25,91

4,00 118,10 354 125

528 N4 2 118,10 20,00 400 13948 2362 94,035 24,1 579,1 -24 576 25,59

N4 3 117,80 20,00 400 13877 2356 94,035 23,8 564,8 -24 576 25,27

N5 1 237,50 40,00 1600 56406 9500 90,201 147,3 21696,9 -4 16 163,30

324,00 236,43 709 503

106 N5 2 233,90 40,00 1600 54709 9356 90,201 143,7 20649,3 -4 16 159,31

N5 3 237,90 40,00 1600 56596 9516 90,201 147,7 21814,9 -4 16 163,74

Suma 1341,52 660,00 42000 2,22E+05 56543 1,34E+03 0,0 101456,0 0 1,30E+04 -1,56 6740,00 447,1

7 1,34E+03

6,66E+0

5 Promed

io 89,43 44,00 2800 1,48E+04 3770 8,94E+01 0,0 6763,7 0 8,64E+02 -0,10 1348,00 89,43 2,68

E+02

1,33E+0

5

158

Anexo 3: Resultados análisis de muestras

Tabla 55. Resultados muestras de papa con señales en tiempo de retención PTU

N3 ETU PTU Area ug/mL PTU

30,4 54,3 0,1 Factor 1,5

Area PTU ug/mL ug/kg NJVR004 (1) 2,06 0,0038 0,006 NJVR004 (2) 2,03 0,0037 0,006

NJVR005 (1) 4,53 0,0083 0,013

NJVR005 (2) 4,84 0,0089 0,013

Tabla 56. Resultados confirmación de muestras de papa con señales, repetición de ensayo y adición estándar.

N3 Area ETU PTU ug/mL PTU 27 50,3 0,1

Factor 1,5 Area PTU ug/mL ug/kg

NJVR004 (3) 1,10000 0,002 0,003 NJVR004 (4) 1,05000 0,002 0,003

NJVR005 (3) 3,52000 0,006 0,010

NJVR005 (4) 5,67000 0,010 0,016 NJVR005 (4) AE 7,83000 0,014 0,022 NJVR005 (4) AE 10,83000 0,020 0,030

Anexos 159

159

Tabla 57. Resultados muestras de tomate con señales en tiempo de retención ETU

N3 Area ETU ug/mL

30 0,05 Factor 1,5

Area ETU ug/mL ug/kg NJVR006 (1) 2,93 0,005 0,007

NJVR006 (2) 2,90 0,005 0,007

NJVR007 (1) 0,00 0,000 0,000

NJVR007 (2) 1,90 0,003 0,005

NJVR010 (1) 2,74 0,005 0,007 NJVR010 (2) 0,00 0,000 0,000

Tabla 58. Resultados confirmación de muestras de tomate con señales en el tiempo de retención de ETU, repetición de ensayo y adición estándar.

N3 ETU Area ug/mL

27 0,05 Factor 1,5

Area ETU ug/mL ug/kg NJVR006 (3) 2,10 0,004 0,006

NJVR006 (4) 1,97 0,004 0,005

NJVR006 (3) AE 4,80 0,009 0,014 NJVR007 (3) 0,00 0,000 0,000 NJVR007 (4) 0,00 0,000 0,000

NJVR010 (1) 0,00 0,000 0,000 NJVR010 (2) 0,00 0,000 0,000

161

Bibliografía

United Nations. World population to 2300. 2004; Available from: http://www.un.org/esa/population/publications/longrange2/longrange2.htm.

2. UNESCO. Inminencia de una crisis del Agua. 2002; Available from: http://www.unesco.org/bpi/eng/unescopress/2002/Agua-01s.shtml.

3. IUPAC, Ethylenethyourea. Pure & Applied Chemistry, 1977. 49: p. 675-689. 4. EFSA, Reasoned opinion on the modification of the existing MRLs for

dithiocarbamates (expressed as carbon disulfide) in bulb vegetables, cucurbits and asparagus. EFSA Journal, 2012. 12(7): p. 2846.

5. PROEXPORT, Industria Agroquímica. 2008. 6. Houeto, P., G. Bindoula, and J. Hoffman, Ethylenebisdithiocarbamates and

Ethylenethiourea: Possible Human Health Hazards. Environmental Healt Perspectives, 1995.

7. FAO. Definiciones para los fines del Codex Alimentarius. Available from: http://www.fao.org/docrep/w5975s/w5975s08.htm.

8. Pesticide properties data base. Available from: http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/es/index.htm.

9. JMPR, ETHYLENETHIOUREA, ETU 108, FAO, Editor. 1993. 10. Resolución N° 2135 de 21 de diciembre de 2005. Ministerio del medio ambiente y

desarrollo territorial. 2005: Republica de Colombia. 11. Johannesen, H., et al., Degradation of [14C]ethylenethiourea in surface and

subsurface soil. Science of The Total Environment, 1996. 191(3): p. 271-276. 12. O'Neil, W.M. and W.D. Marshall, Goitrogenic effects of ethylenethiourea on rat

thyroid. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1984. 21(1): p. 92-101. 13. Teramoto, S., et al., Mutagenicity testing on ethylenethiourea. Mutation

Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 1977. 56(2): p. 121-129.

14. Keikotlhaile, B.M., P. Spanoghe, and W. Steurbaut, Effects of food processing on pesticide residues in fruits and vegetables: A meta-analysis approach. Food and Chemical Toxicology, 2010. 48(1): p. 1-6.

15. Dubey, J.K., T. Heberer, and H.J. Stan, Determination of ethylenethiourea in food commodities by a two-step derivatization method and gas chromatography with electron-capture and nitrogen-phosphorus detection. Journal of Chromatography A, 1997. 765(1): p. 31-38.

16. Hatrík, S. and J. Tekel, Extraction methodology and chromatography for the determination of residual pesticides in water. Journal of Chromatography A, 1996. 733(1-2): p. 217-233.

17. SUPELCO, Guide to Solid Phase Extraction. 1998.

162 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos

18. Brouwer, E.R., S. Kofman, and U.A.T. Brinkman, Selected procedures for the monitoring of polar pesticides and related microcontaminants in aquatic samples. Journal of Chromatography A, 1995. 703(1-2): p. 167-190.

19. Geerdink, R.B., W.M.A. Niessen, and U.A.T. Brinkman, Trace-level determination of pesticides in water by means of liquid and gas chromatography. Journal of Chromatography A, 2002. 970(1-2): p. 65-93.

20. Blasco, C., G. Font, and Y. Picó, Determination of dithiocarbamates and metabolites in plants by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2004. 1028(2): p. 267-276.

21. Garcinuño, R.M., et al., Optimization of a matrix solid-phase dispersion method with subsequent clean-up for the determination of ethylene bisdithiocarbamate residues in almond samples. Journal of Chromatography A, 2004. 1041(1-2): p. 35-41.

22. Garcinuño, R.M., P. Fernández-Hernando, and C. Cámara, Simultaneous determination of maneb and its main metabolites in tomatoes by liquid chromatography using diode array ultraviolet absorbance detection. Journal of Chromatography A, 2004. 1043(2): p. 225-229.

23. Tölgyesi, L., P. Kele, and K. Torkos, Determination of Propylenethiourea, the Main Metabolite of Propineb, in Tomato by HILIC-MS. Chromatographia, 2010. 71(0): p. 75-80.

24. Phenomenex. 2012 [cited 2012; Available from: http://www.phenomenex.com/Products/HPLCDetail/Luna/Phenyl-Hexyl.

25. Geissen, V., et al., Soil and Water Pollution in a Banana Production Region in Tropical Mexico. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2010. 85(4): p. 407-413.

26. Domínguez, M.C., G. Peñuela, and M.T. Flórez, Método analítico para la determinación de etilentiourea (etu) subproducto del Mancozeb en un Andisol del Oriente Antioqueño Rev. Fac. Ing. Univ. Antioquia N.° 49. pp. 42-49. Septiembre, 2009, 2009. 49. : p. 42-49.

27. FAO, Codex alimentarius, ed. WHO/FAO. 1996, Roma. 28. Mojica, A., et al., Carbon material in the determination of pesticides in water by

solid phase extraction (SPE) and UFLC/MS, in 3rd latinoamerican pesticide residue workshop. 2011: Montevideo, Uruguay.

29. Corley, J., Best practices in establishing detection and quantification limits for pesticide residues in foods, in Handbook of Residue Analytical Methods for Agrochemicals, J.W.S. Ltd, Editor. 2003: NJ, USA.

30. Zhou, L., et al., A rapid determination method for ethylenethiourea in potato and cucumber by modified QuEChERS – High performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Food Chemistry, 2013. 138(2–3): p. 1355-1359.

31. Kontou, S., et al., Determination of ETU in Tomatoes and Tomato Products by HPLC-PDA. Evaluation of Cleanup Procedures. J. Agric. Food Chem. , 2001. 49: p. 1090-1097.

32. COMMISSION, E. and H.C.P. DIRECTORATE-GENERAL, METHOD VALIDATION AND QUALITY CONTROL PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED in Analytical method validation and performance criteria. 2011.

Bibliografía 163

163

33. ICA. Listado de registros nacionales de plaguicidas de uso agrícola. 2012; Available from: http://www.ica.gov.co/getdoc/d3612ebf-a5a6-4702-8d4b-8427c1cdaeb1/REGISTROS-NACIONALES-PQUA-15-04-09.aspx.

34. Report on surveilleance of infant food for pesticide residues. 2006, Food Safety, Authotity ir Ireland.

35. Sue, X., Environmental fate of ethylenethiourea, in Environmental, monitoring and pest management. 2000.

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