UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA "LUIZ DE QUEIROZ"

VARIAÇÃO DAS ESTRUTURAS DAS COMUNIDADES E DIVERSIDADE DE

BACTÉRIAS E ARQUEAS NA RIZOSFERA DE ESPÉCIES ARBÓREAS

DO PARQUE ESTADUAL DE CARLOS BOTELHO

PROJETO DE PÓS-DOUTORADO

Dr. Hélio Mitoshi Kamida

candidato

Prof. Dr. Márcio Rodrigues Lambais

supervisor

PIRACICABA

JUNHO DE 2004

1. RESUMO

O plano de trabalho desta linha de pesquisa está inserido no projeto

tématico "Diversidade, dinâmica e conservação em Florestas do Estado de São

Paulo: 40ha de parcelas permanentes", coordenado pelo Prof. Dr. Ricardo

Ribeiro Rodrigues (ESALQ-USP), o qual está sendo desenvolvido em quatro

Unidades de Conservação representando as principais formações florestais do

Estado de São Paulo. A bioprospecção da flora destes ambientes, conta com

recursos auxiliares como o levantamento planialtimétrico, o mapeamento

detalhado do solo e a caracterização continuada do clima, do regime de luz e

das flutuações do lençol freático para o entendimento da dinâmica e inter-

relação dos organismos presentes nas regiões amostradas. Na

complementação dos propósitos deste projeto temático, o presente projeto tem

por objetivo, realizar um levantamento da diversidade de microrganismos dos

Domínios Bacteria e Archaea associados às raízes de algumas espécies de

plantas localizadas no Parque Estadual de Carlos Botelho (SP), e estabelecer

uma relação entre as estruturas das comunidades e diversidade microbianas e

a filogenia das espécies vegetais. Essas informações poderão contribuir para a

compreensão da ecofisiologia de espécies vegetais de interesse, e para a

identificação de microrganismos com possível potencial biotecnológico. A

diversidade microbiana será avaliada através da cinética de reassociação de

DNA e a estrutura das comunidades de bactérias e arqueas será determinada

através de eletroforese em géis de poliacrilamida com gradiente desnaturante

(DGGE) de amplicons da região V3 do rDNA 16S.

2. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A mata atlântica é considerada um dos refúgios de biodiversidade mais

significativos do mundo e declarada pela UNESCO como Reserva da Biosfera,

sendo abrigo de muitas espécies que só ocorrem nesse ambiente. Sua

ocorrência beneficia a qualidade do ar, a retenção da água e o equilíbrio do

clima. Joly et al. (1990), citado por Born (1992), constata o alto nível de

endemismo da floresta pluvial tropical atlântica, sendo 55% das espécies

arbóreas e 40% não-arbóreas. A mata atlântica ainda é a terceira maior

formação vegetal do Brasil (depois da Amazônia e do Cerrado), ocupando 13%

do território nacional, e a segunda com maior diversidade biológica, depois da

região Amazônica. Análise do "World Wildlife Fund" divide esse "hotspot" em 2

ecorregiões principais, a Floresta Atlântica Costeira e a Floresta Atlântica

Interior (Mittermeier et al., 2000).

A microbiota dos solos têm sido caracterizada em diferentes níveis,

sobretudo em ecossistemas de clima temperado. Através da análise da cinética

de reassociação de DNA, tem sido estimado que o solo pode conter mais de

10.000 genomas microbianos (Torsvik et al., 1998), e que mais de 95% dos

microrganismos do solo não podem ser cultivados (Torsvik et al., 1990).

Segundo Kennedy & Smith (1995), o estudo da diversidade microbiana

dos solos é essencial para: a) aumentar nosso conhecimento dos recursos

genéticos disponíveis e entendimento da distribuição da diversidade sobre a

Terra; b) aumentar nosso conhecimento do papel funcional dos microrganismos

do solo e c) identificar alterações na diversidade microbiana associadas com

distúrbios ou técnicas de manejo específicas.

Estudos sobre o levantamento da diversidade microbiana são

considerados de extrema importância, o Dr. Vanderlei Perez Canhos, o qual

realizou uma revisão taxonômica preliminar nesta área que serviu como

subsídio para as discussões do "Workshop: Bases para a Conservação da

Biodiversidade do Estado de São Paulo", realizado em Serra Negra em 1997, e

representava o conhecimento existentes antes da criação do Biota-FAPESP,

relata que o conhecimento sobre a diversidade microbiana dos diferentes

ecossistemas do Estado de São Paulo é incompleto e fragmentado, e que

muitos trabalhos abordam principalmente a ecologia e sistemática de

microrganismos de relevância agrícola e associados a doenças de plantas de

interesse econômico, necessitando portanto de estudos em ecossistemas

florestais. Esta situação ainda persiste no cenário atual, pois o Relatório da 4a

avaliação do programa Biota-FAPESP, referente ao balanço do programa

realizado pelo Comitê de Consultoria Científica, aponta que o estudo de

microrganismos em ecossistemas não-impactados, bem como em

ecossistemas impactados por ação antrópica, deveria ser uma das prioridades

do Programa Biota.

O solo é um meio natural complexo que influencia o crescimento,

multiplicação, sobrevivência e outras atividades dos organismos (Rangaswami

& Oblisami, 1967). Os microrganismos não vivem no solo na forma de culturas

puras, mas sim, na forma de uma comunidade complexa, onde uma grande

variedade de interações ecológicas se estabelecem em microssítios

específicos.

A rizosfera, região do solo sob influência direta das raízes, é um dos

microssítios mais abundantes , e onde ocorre a maior parte das interações

entre diferentes microrganismos e entre microrganismos e plantas (Lynch,

1982; Foster, 1986).

A rizosfera apresenta uma grande variabilidade temporal e espacial,

sendo que a sua composição química e as estruturas das comunidades de

microrganismos nela presentes são determinadas principalmente pelo

desenvolvimento e metabolismo vegetal. Os exsudatos radiculares contém uma

miscelânea de açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, vitaminas e outros

compostos biologicamente ativos que podem servir de fontes de carbono e/ou

energia para os microrganismos. Estima-se que do total de massa seca

produzida pela planta, de 1 a 20% é liberado pelas raízes na forma de

exsudatos (Mench et al., 1988).

Grayston et al. (1998) realizaram um levantamento da diversidade

microbiana da rizosfera de trigo, centeio e trevo cultivadas em dois tipos de

solos diferentes, e verificaram que somente o tipo de planta influenciou na

estrutura das comunidades de microrganismos, devido ao fato destas

produzirem exsudatos com características particulares a sua espécie.

Resultados semelhantes foram obtidos por Miethling et al. (2003), os quais

investigaram a variação da estrutura das comunidades microbianas da

rizosfera de alfafa, feijão e trevo em microcosmo contendo o mesmo tipo de

solo, e observaram a presença de microrganismos específicos na rizosfera das

diferentes plantas.

Adicionalmente, estudos para avaliar a interação entre a microbiota do

solo e plantas em ecossistemas agrícolas e florestais localizados no Distrito do

Lago Bornhöved (Alemanha), demonstraram que a estrutura da comunidade

bacteriana parece ser profundamente influenciada pelas plantas (Dilly et al.,

2000). Outro trabalho que demonstra o fato da diversidade da comunidade

bacteriana da rizosfera ser afetada pelo tipo de planta foi realizado por Johnson

et al. (2003), os quais estudaram a influência de duas gramíneas (Carex flacca

e Festuca ovina), cultivadas em microcosmos contendo o mesmo tipo de solo,

na análise da estrutura da comunidade bacteriana da rizosfera, verificaram que

a diversidade foi maior em solo cultivado com C. flacca do que em solo

cultivado com F. ovina.

Marschner et al. (2001) examinaram a variação da estrutura das

comunidades bacterianas da rizosfera, em função das espécies de plantas, do

tipo do solo e da zona da raiz, através de PCR-DGGE de amplicons do rDNA

16S. Foram estudadas três espécies de plantas (grão-de-bico, rabanete e

grama sudão) cultivadas em três tipos de solos da Califórnia (arenoso, barro-

arenoso e argiloso). Após sete semanas e meia, o DNA foi extraído do solo

aderido a extremidades das raízes e às zonas mais maduras. Foi observado

que a diversidade de espécies bacterianas foi maior nas zonas maduras das

raízes das plantas cultivadas em solo arenoso e argiloso, do que em solo

barro-arenoso. A estrutura da comunidade bacteriana da rizosfera de grão-de-

bico foi influenciada principalmente pelo tipo de solo, enquanto que a zona da

raiz da qual o DNA foi extraído foi menos importante na determinação da

estrutura da comunidade de bactérias. Já, as comunidades das rizosferas de

rabanete e grama sudão foram influenciadas mais pela zona da raiz ao qual o

solo estava aderido do que pelo tipo de solo. Silva & Nahas (2002) avaliaram

as alterações na diversidade de isolados bacterianos em um mesmo tipo de

solo, em função do tipo de planta (Brachiaria ruziziensis e Cajanus cajan) e da

fertilização com compostos a base de fosfato, e verificaram que solos

cultivados com B. ruziziensis favoreceram as bactérias Gram-positivas não-

esporuladas e as Gram-negativas em forma de bastonete, comparado ao solo

com C. cajan. Em amostras de solos não-fertilizados, um maior número de

cocos Gram-positivos e bastonetes Gram-negativos foram observados, quando

comparado com solos fertilizados. Os resultados desses trabalhos sugerem

que a estrutura da comunidade bacteriana da rizosfera é afetada por uma

interação complexa entre as características da rizosfera, determinadas pela

espécie vegetal e seu estádio de desenvolvimento, e fatores edáficos.

Se as informações sobre a diversidade e alterações da estrura de

comunidades de bactérias em ecossistemas naturais são limitadas, as

informações sobre microrganismos do domínio Archaea são praticamente

inexistentes. Os organismos pertencentes ao Domínio Archaea estão

distribuídos em uma variedade excepcional de habitats, desde solos florestais e

lagoas de água doce, até nascentes de águas quentes de origem vulcânica e

abismos mais profundos dos oceanos (Pace, 1997). Devido ao sucesso

limitado no isolamento de arqueas, o qual está restrito a Euryarchaeota e

alguns Crenarchaeota termofílicos, o conhecimento sobre a riqueza de

espécies e fisiologia destes organismos ainda são escassos (Garcia et al.,

2000). Entretanto, técnicas moleculares como a amplificação por PCR e análise

das seqüências de nucleotídeos do rDNA 16S, têm permitido detectar arqueas

em diversos ambientes. O grupo mais abundante, encontrado tanto em solos

cultivados como em solos sob florestas, pertence à Divisão Crenarchaeota,

perfazendo de 1 a 2% das seqüências de rDNA 16S analisadas (Buckley et al.,

1998).

A variação da estrutrura das comunidades de arqueas na rizosfera de

diferentes plantas é pouco conhecida. O trabalho de Bomberg et al. (2003)

sugere que a estrutura das comunidades de arqueas depende da espécie

vegetal e da presença de micorrizas, já que as comunidades de arqueas de

micorrizosferas de pinheiros diferiram expressivamente daquelas de rizosferas

de tomate e milho.

A relação que existe entre a estrutura das comunidades microbianas da

rizosfera de diferentes plantas ainda não está esclarecida. O entendimento de

como os microrganismos se organizam na rizosfera e de como essa

organização é afetada pela planta, solo e condições ambientais, é essencial

para o desenvolvimento de técnicas mais precisas de manipulação da

microbiota da rizosfera para o aumento da absorção de nutrientes limitantes ao

desenvolvimento vegetal e controle biológico de doenças. A caracterização

detalhada das comunidades microbianas da rizosfera de plantas tropicais

poderá auxiliar na identificação de microrganismos ainda desconhecidos,

contribuindo para a melhor caracterização da biodiversidade microbiana de

ecossistemas florestais.

3. OBJETIVOS

Os objetivos desse trabalho são:

• determinar a variabilidade temporal e espacial das comunidades de

bactérias e arqueas associadas à rizosfera de diferentes espécies

arbóreas;

• estabelecer uma relação entre estrutura das comunidades de bactérias e

arqueas e filogenia das espécies vegetais;

• estimar a diversidade genética de procariotos da rizosfera com base na

cinética de reassociação de DNA total extraído de solo rizosférico.

4. HIPÓTESES DE TRABALHO

• as estruturas das comunidades de bactérias e arqueas da rizosfera de

espécies arbóreas mais próximas filogeneticamente são mais similares

entre si do que entre espécies mais distantes;

• a distribuição espacial das espécies arbóreas tem maior influência na

estrutura das comunidades microbianas da rizosfera do que a época de

amnostragem.

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Local de coleta e execução do projeto

As amostras de solo serão coletadas no Parque Estadual de Carlos

Botelho (PECB), localizado na região Sul do Estado de São Paulo (24 00' a 24

15' S, 47 15' a 48 10' W). O PECB possui área total de 37.793,63 ha e engloba

parte dos Municípios de São Miguel Arcanjo, Capão Bonito e Sete Barras, com

altitudes que variam de 30 a 1003 m. Nesta região ocorre uma Floresta

Ombrófila Densa Submontana/Montana, na qual foram realizados

levantamentos florísticos (Custódio Filho et al., 1992) e fitossociológicos (Dias,

1993). A execução do projeto será realizada no Laboratório de Microbiologia

Molecular do Departamento de Solos e Nutrição de Plantas (ESALQ-USP).

5.2 Amostragem

As amostras de solo (em triplicata) serão coletadas próximas às raízes

(rizosfera) de 8 espécies arbóreas (Tabela 1), sendo três árvores de cada

espécie em três locais diferentes. Estas serão acondicionadas em tubos de

polipropileno esterilizados e armazenadas em caixas térmicas com gelo

durante o transporte até o laboratório, onde serão congeladas em nitrogênio

líquido e conservadas a -80°C, para posterior análise. Os locais de

amostragem serão georreferenciados, de acordo com as exigências do

programa Biota-FAPESP.

Tabela 1 - Espécies vegetais cujas rizosferas serão estudadas.

Ordem Família Gênero Espécie

Arecales Arecaceae Euterpe E. edulis

Lamiales Bignoniaceae Tabebuia T. serratifolia

Laurales Lauraceae Ocotea O. dispersa

Laurales Lauraceae Ocotea O. telliandra

Laurales Monimiaceae Mollinedia M. schottiana

Laurales Monimiaceae Mollinedia M. uleana

Myrtales Myrtaceae Eugenia E. cuprea

Myrtales Myrtaceae Eugenia E. melanogyna

5.3 Extração do DNA total do solo

Para a extração do DNA, será utilizado o kit FastDNA Spin for Soil

(Qbiogene). Em microtubos contendo granada finamente moída, será

adicionado 0,5 g de solo, 978 µL de tampão fosfato e 122 µL de tampão MT.

Estes tubos serão agitados horizontalmente por 30 s a 4 m s-1, em um FP120

FastPrep Cell Disruptor (Qbiogene,). Em seguida, será centrifugado por 1 min

a 13000g. O sobrenadante será transferido para um tubo limpo. À essa solução

será adicionado 250 µL de tampão PPS, agitando-se os tubos 10 vezes por

inversão. Os tubos serão centrifugados por 10 min a 13000g e o sobrenadante

coletado e transferido para um microtubo limpo. Ao sobrenadante será

adicionado 1 mL de matriz de ligação, agitando-se o tubos durante 2 min por

inversão. Em seguida os tubos serão incubados por 3 min, a matriz de ligação

será transferida para um filtro acoplado a um microtubo (Spin Filter, Qbiogene),

e os tubos centrifugados por 2 min a 13000g. A matriz de ligação retida no filtro

será lavada com 500 µL de uma solução (SEWS), e o filtro centrifugado 2

vezes por 2 min a 13000g. Após 5 min de incubação à temperatura ambiente,

serão adicionados 50 µL de água ultrapura ao filtro e centrifugado por 2 min a

13000g. O DNA puro será recolhido em um tubo limpo e sua quantificação feita

por densitometria, após eletroforese em gel de agarose 1,5%-0,5xTBE (1xTBE:

44 mM Tris-borato, 1 mM EDTA pH 8,0), utilizando-se um densitômetro laser

FluorImager (Amershan Biosciences) e o programa Fragment Analysis

(Amershan Biosciences). Como padrão de tamanho e quantidade de DNA será

utilizado o marcador de massa DNA Mass Ladder (Invitrogen).

5.4 Amplificação do rDNA 16S

Para amplificação de fragmentos específicos do rDNA 16S de Bacteria

será utilizado o seguinte conjunto de iniciadores: BA338fGC e UN518r (Ovreas

et al., 1997). A amplificação será realizada em solução contendo: 2,5 µL de

tampão para PCR 10 X; 0,2 mM dNTP; 3,0 mM MgCl2; 1 U de Taq DNA

polimerase recombinante (Invitrogen); 10 ng de DNA total; 5 pmol de cada

primer; água Milli-Q esterilizada para um volume final de 25 µL. A amplificação

será realizada em um termociclador (Mastercycler Gradient, Eppendorf), nas

seguintes condições: desnaturação inicial durante 5 min a 95°C; 30 ciclos de

desnaturação a 95°C por 1 min, pareamento à 55°C por 1 min e extensão a

72°C durante 1 min; extensão final à 72°C durante 10 min. A quantificação dos

amplicons resultantes será realizada por densitometria, após eletroforese em

gel de agarose 1,5%-0,5xTBE, utilizando-se um densitômetro laser FluorImager

(Amershan Biosciences) e o programa Fragment Analysis (Amershan

Biosciences). Como padrão de tamanho e quantidade de DNA será utilizado o

marcador de massa DNA Mass Ladder (Invitrogen).

Para amplificação inicial de fragmentos específicos do rDNA 16S de

Archaea será utilizado o seguinte conjunto de iniciadores: Arch21F e Arch958R

(Moyer et al., 1998). Os amplicons resultantes desta amplificação serão

utilizados como molde para uma nova amplificação com o seguinte conjunto de

iniciadores: Arch340FGC e Arch519R (Ovreas et al., 1997). As amplificações

serão realizadas em solução contendo: 2,5 µL de tampão para PCR 10 X; 0,2

mM dNTP; 3,0 mM MgCl2; 1 U de Taq DNA polimerase recombinante

(Invitrogen); 10 ng de DNA; 5 pmol de cada primer; água Milli-Q esterilizada

para um volume final de 25 µL. A reação será realizada em um termociclador

(Mastercycler Gradient, Eppendorf), nas seguintes condições: 95°C por 5 min,

30 ciclos de 95°C por 30 seg, 53°C por 30 seg e 72°C por 1 min; 72°C por 6

min. A quantificação dos amplicons resultantes será realizada como descrito

anteriormente.

5.5 Análise dos amplicons do rDNA 16S por DGGE

Os amplicons do rDNA 16S serão separados por eletroforese em gel de

poliacrilamida com gradiente desnaturante (DGGE). Os géis de

acrilamina:bisacrilamida (37,5 : 1; m:m) 8%, serão preparados com gradiente

desnaturante variando de 15 a 55%, utilizando duas soluções: solução 100%

de desnaturação contendo 40% (v/v) formamida e 7 M uréia e solução 0% de

desnaturação em uréia ou formamida (Ovreas et al., 1997). A eletroforese será

realizada a 60°C e 200 V constantes, por 3 h, em um sistema de eletroforese

vertical DCode (BioRad), utilizando solução tampão 0,5 X TAE (10 mM Tris-

acetato, 0,5 mM EDTA pH 8,0). Após eletroforese, o gel será fixado em uma

solução 10% de ácido acético glacial por 15 min. Em seguida, o gel será lavado

três vezes com água destilada, imerso em solução de metano 50% por 15 min,

lavado três vezes com água destilada e imerso em solução de SYBR-Green I

(1:10000; v/v) (Molecular Probes) por 30 min. Após a coloração, o gel será

lavado três vezes com água destilada e analisado por densitometria, utilizando-

se o densitômetro laser FluorImager e o programa Fragment Analysis

(Amershan Biosciences).

5.6 Construção das bibliotecas de amplicons do rDNA 16S

Os produtos da PCR serão purificados utilizando-se o kit S.N.A.P.

Purification System (Invitrogen) antes da ligação em vetores de clonagem. A

clonagem será realizada em One Shot E. coli INV F, utilizando o kit de

clonagem TOPO TA (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. Após o

plaqueamento em meio Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina e X-Gal,

colônias de transformantes serão transferidas para 5 mL de meio de cultivo LB

e incubadas por aproximadamente 16 h. O plasmídeo será extraído por lise

alcalina, digerido com EcoRI e analisado por eletroforese em gel de agarose

1,0%-0,5X TBE, para determinar o tamanho do inserto.

5.7 Seqüenciamento de amplicons do rDNA 16S

A amplificação dos insertos por PCR será realizada com a enzima

AmpliTaq polimerase e "BigDye terminator" (Applied Biosystems) conforme as

recomendações do fabricante, utilizando-se o iniciador M13r. O

seqüenciamento será realizado em seqüenciador capilar Applied Biosystems

3100, conforme recomendações do fabricante.

5.8 Cinética de reassociação de DNA

A diversidade de procariotos, com base na complexidade do DNA

isolado de procariotos do solo será determinada através da cinética de

reassociação do DNA fragmentando e termicamente desnaturado, em

soluções, sob condições definidas (Britten & Kohne, 1968). O DNA usado para

análise de reassociação deverá estar livre de DNA de eucariotos, sendo para

isso utilizado o método de centrifugação fracionada do solo antes da lise das

células (Faegri et al., 1977). Após a lise das células procarióticas, o extrato de

DNA bruto será purificado através de cromatografia, utilizando-se coluna de

hidroxiapatita (Torsvik, 1980).

O DNA será inicialmente fragmentando em pedaços com

aproximadamente 650 pares de base (pb) utilizando-se uma prensa francesa

(20.000 psi) e a reassociação do DNA de fita simples será realizada em

solução contendo 6 x SSC e DMSO à temperatura de 25°C. A reassociação do

DNA será avaliada pelo decréscimo da absorbância à 260 ou 275 nm,

conforme descrito por Torsvik et al. (1995).

A constante de reassociação será expressa em 1/Cot1/2, onde Co é a

concentração molar de nucleotídeos das fitas simples de DNA no início da

reassociação e t1/2 é o tempo em segundos para que ocorra 50% de

reassociação. Em condições definidas, Cot1/2 é proporcional à complexidade do

DNA total (Britten & Kohne, 1968). Como padrão, será utilizado DNA genômico

de E. coli.

6. FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS

6.1 Similaridade entre as estruturas das comunidades microbianas

Os perfis de amplicons, após separação por DGGE, serão comparados

utilizando-se o coeficiente de similaridade de concordância simples (simple

matching), definido por:

Cs = (a + d) (a + b + c + d)-1

Onde:

Cs = índice de similariedade entre a amostra i e j,

a = número de amplicons comuns às amostras i e j,

b = número de amplicons presentes na amostra i,

c = número de amplicons presentes na amostra j,

d = número de amplicons diferentes nas amostras i e j.

A análise de variância do número de amplicons será realizada utilizando-

se o procedimento General Linear Models do SAS (1998), e as médias serão

comparadas pelo teste t (p<0,05).

Dados binários, com base na presença ou ausência dos amplicons

detectados nas diferentes amostras, serão utilizados para a análise de

agrupamento hierárquico, através do programa SYSTAT 8.0, utilizando-se o

algoritmo de Ward para ligação e distância em porcentagem como unidade de

medida.

6.2 Processamento das seqüências de rDNA 16S e filogenia

As seqüências de nucleotídeos dos amplicons de rDNA 16S obtidas

serão processadas para remoção de vetor contaminante e bases de baixa

qualidade (índice de qualidade < 20) utilizando-se os programas Phred/Phrap.

As seqüências serão agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (UTO)

utilizando-se o programa CAP3, segundo parâmetros definidos em nosso

laboratório. A seqüência consenso de cada UTO será comparada com

seqüências depositadas em bancos de dados públicos (Ribossomal Database

Project) para identificação das espécies microbianas (Bacteria e Archaea). A

análise filogenética será realizada através do programa PHYLIP

(www.rdp.msu.edu/html).

A análise de rarefação será realizada utilizando-se o programa

RAREFACTION CALCULATOR (www.biology.valberte.ca). A análise de

freqüência de UTOs será realizada através do pacote estatístico SYSTAT 8.0.

7. PLANO DE TRABALHO E CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO

Atividades 09-1

0/04

11

-12/

04

01-0

2/05

03

-04/

05

05-0

6/05

07

-08/

05

09-1

0/05

11

-12/

05

01-0

2/06

03

-04/

06

05-0

6/06

07

-08/

06

Estudo do local de coleta e

planejamento experimental

x

Primeira coleta de amostras x

Segunda coleta de amostras x

Extração DNA solo x x x x x x

Análise dos amplicons do

rDNA 16S por DGGE

x x x x x x

Construção biblioteca de

amplicons do rDNA 16S

x x x x

Sequenciamento de

amplicons do rDNA 16S

x x x x

Avaliação da cinética de

reassociação de DNA

x x x x

Relatório x x

Preparação de artigo para publicação

x x x x

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOMBERG, M.; JURGENS, G.; SAANO, A.; SEM, R.; TIMONEN, S. Nested

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